JPH1053536A - 抗ｉｌ−８抗体を有効成分として含有する心筋梗塞治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規な心筋梗塞治療剤の提供。 【解決手段】 抗IL-8抗体を有効成分として含有する心
筋梗塞の治療剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は抗インターロイキン
-8（IL-8）抗体を有効成分として含有する心筋梗塞治療
剤に関する。また、本発明は抗IL-8抗体を有効成分とし
て含有する不安定狭心症治療剤に関する。さらに、本発
明は抗IL-8抗体を有効成分として含有する心筋虚血再灌
流障害治療剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】IL-8は、C-X-C ケモカインサブファミリ
ーに属する蛋白質であり、以前は単球由来好中球遊走因
子（monocyte-derived neutrophil chemotactic facto
r）、好中球活性化蛋白−１（neutrophil attractant/a
ctivation protein-1）、好中球活性化因子（neutrophi
l activating factor）等と呼称されていた。IL-8は、
好中球を活性化させ好中球に遊走能を獲得させる因子で
あり、IL-1βやTNF-α等の炎症性サイトカイン（Koch,
A. E. et al., J.Investig. Med. (1995) 43, 28-38 ；
Larsen, C. G. et al., Immunology (1989) 68, 31-36
）やPMA ，LPS 等のマイトゲン（Yoshimura, T. et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., (1987)84, 9233-
9237 ）、さらにはカドミウム等の重金属（Horiguchi,
H. et al., Lymphokine Cytokine Res. (1993) 12, 421
-428 ）等の刺激によって様々な細胞から産生される。
また、低酸素状態に置かれたヒト臍帯静脈内皮細胞がIL
-8を発現することも知られている（Karakurum, M. et a
l., J. Clin. Invest. (1994) 93, 1564-1570 ）。

【０００３】心筋梗塞、狭心症等の虚血性心疾患、ある
いは心−肺バイパス術施術時、人為的心停止を行う手術
時、心臓移植時における冠血流量の低下あるいは途絶に
よる酸素供給量の低下は、心筋細胞のエネルギー産生を
阻害し、心機能の低下、さらには心筋細胞の不可逆的な
細胞傷害をもたらす。

【０００４】そのため、虚血性心疾患発症時には速やか
な血行の回復が求められる。しかし、虚血後に冠血管の
血行回復を求めて再灌流を行って酸素供給を再開させた
時、不整脈が生じること（Manning, A. S. and Hearse,
D. J., J. Mol. Cell Cardiol. (1984) 16, 497-51
8）、あるいは心筋壊死や気絶心筋の様な心筋傷害がむ
しろ増悪されることもよく知られている（Opie, L., Ca
rdiovasc. Res. (1992) 26, 20-24 ；Hearse, D. J. an
d Bolli, R., Cardiovasc. Res. (1992) 26, 101-10
8）。このような現象は一般に虚血再灌流障害と呼ばれ
ている。虚血性心疾患患者に対して血流を回復させる目
的で、冠動脈血栓溶解療法、経皮的冠動脈形成術（PTC
A）、あるいは冠動脈バイパス術（CABG）などの再灌流
療法が普及しており、現在、虚血再灌流障害は臨床的に
も重要な問題と認識されつつある。

【０００５】心−肺バイパス術施術後の動脈血（Finn,
A. et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. (1993) 10
5, 234-241 ）、および心臓移植後の冠静脈洞の血液中
（Oz,M. C. et al., Circulation (1995) 92, suppl II
428-432 ）にIL-8が検出されており、IL-8がその炎症
過程に関与する事が示唆されているが、それぞれの虚血
再灌流障害の病態形成に対する正確な役割は不明であ
る。

【０００６】肺虚血再灌流障害の動物実験モデルにおい
ては、２時間の肺虚血後、再灌流時に抗IL-8抗体を投与
することにより、肺組織傷害が抑制されたことが既に報
告されている（Sekido, N. et al., Nature (1993) 36
5, 654-657)。一方、心筋虚血再灌流障害モデルにおい
ては、再灌流後の心筋組織でのIL-8発現については報告
されているものの（Ivey, C. L. et al., J. Clin. Inv
est . (1995) 95, 2720-2728；Kukielka, G. L. et a
l., J. Clin. Invest. (1995) 95, 89-103）、IL-8を中
和することによる効果については不明であった。むし
ろ、再灌流によって増加するIL-8自身を再灌流前に投与
することにより、心筋梗塞巣の形成が抑制されたことが
報告されている（Lefer, A.M. et al., Br. J. Pharmac
ol. (1991) 103, 1153-1159 ）。また、補体成分のC5a
（Ivey, C. L. et al., J. Clin. Invest. (1995) 95,
2720-2728 ）、あるいはロイコトリエンＢ４（Katori,
M. et al., Japan. J. Pharmacol. (1989) 50, 234-23
8）等のIL-8以外の好中球遊走因子が心筋虚血再灌流モ
デルで好中球の心筋梗塞巣への遊走に関与しており、そ
れぞれの活性を失わせることで梗塞巣形成抑制効果が得
られている。さらに、心筋梗塞患者の末梢血中にはIL-8
が検出されなかったことから、心筋梗塞におけるIL-8の
関与を否定する考えもある（Siminiak, T. et al., Bas
ic Res Cardiol. (1993) 88, 150-154）。従って、心筋
梗塞などを含む心筋虚血再灌流障害においては、抗IL-8
抗体の投与により心筋梗塞巣の形成が抑制されるか否か
不明であった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】これまで心筋梗塞に対
し冠血管拡張や心負荷軽減の目的で亜硝酸剤、カルシウ
ム拮抗薬、ベータ受容体拮抗薬等、また再発予防的に抗
血小板薬が用いられてきた。また、血栓溶解療法やPTC
A、CABGなどの再灌流療法も最近では一般的である。し
かし、再灌流療法に伴う心筋傷害に対して直接改善作用
を有するとされる薬剤は現在認められていない。また、
心−肺バイパス術施術後、心停止を行う手術後、心臓移
植後の虚血再灌流障害に対する有効な治療薬も存在しな
い。このように、心筋梗塞、不安定狭心症および心筋虚
血再灌流障害のための有効な治療剤はまだなく、その開
発が要望されていた。本発明の目的は、かかる疾患のた
めの新しい治療剤を提供することである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる治
療剤を提供すべく鋭意研究を重ねた結果、抗IL-8抗体に
より、所期の目的が達成されることを見出し、本発明を
完成するに至った。すなわち、本発明は、抗IL-8抗体を
有効成分として含有する心筋梗塞治療剤を提供する。本
発明はまた、抗IL-8抗体を有効成分として含有する急性
心筋梗塞治療剤を提供する。本発明はまた、抗IL-8抗体
を有効成分として含有する不安定狭心症治療剤を提供す
る。本発明はまた、抗IL-8抗体を有効成分として含有す
る心筋虚血再灌流障害治療剤を提供する。

【０００９】本発明はまた、抗IL-8抗体を有効成分とし
て含有する心−肺バイパス術施術に伴う心筋虚血再灌流
障害治療剤を提供する。本発明はまた、抗IL-8抗体を有
効成分として含有する人為的心停止を行う手術に伴う心
筋虚血再灌流障害治療剤を提供する。本発明はまた、抗
IL-8抗体を有効成分として含有する心臓移植に伴う心筋
虚血再灌流障害治療剤を提供する。本発明はまた、抗IL
-8モノクローナル抗体を有効成分として含有する心筋梗
塞治療剤、不安定狭心症治療剤、または心筋虚血再灌流
障害治療剤を提供する。

【００１０】本発明はまた、哺乳類のIL-8に対する抗体
を有効成分として含有する心筋梗塞治療剤、不安定狭心
症治療剤、または心筋虚血再灌流障害治療剤を提供す
る。本発明はまた、ヒトIL-8に対する抗体を有効成分と
して含有する心筋梗塞治療剤、不安定狭心症治療剤、ま
たは心筋虚血再灌流障害治療剤を提供する。本発明はま
た、WS-4抗体を有効成分として含有する心筋梗塞治療
剤、不安定狭心症治療剤、または心筋虚血再灌流障害治
療剤を提供する。本発明はまた、ヒト型化またはキメラ
化された抗IL-8抗体を有効成分として含有する心筋梗塞
治療剤、不安定狭心症治療剤、または心筋虚血再灌流障
害治療剤を提供する。本発明はさらに、ヒト型化WS-4抗
体を有効成分として含有する心筋梗塞治療剤、不安定狭
心症治療剤、または心筋虚血再灌流障害治療剤を提供す
る。

【００１１】

【発明の実施の形態】

１. 抗IL-8抗体 本発明で使用される抗IL-8抗体は、心筋梗塞、不安定狭
心症および心筋虚血再灌流障害の治療効果を有するもの
であれば、その由来、種類（モノクローナル、ポリクロ
ーナル）および形状を問わない。

【００１２】本発明で使用される抗IL-8抗体は、公知の
手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体
として得ることができる。本発明で使用される抗IL-8抗
体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好
ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、
ハイブリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的
手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換し
た宿主に産生されるものがある。この抗体はIL-8と結合
することにより、好中球等に発現されているIL-8レセプ
ターへの結合を阻害してIL-8のシグナル伝達を遮断し、
IL-8の生物学的活性を阻害する抗体である。

【００１３】このような抗体としては、WS-4抗体（Ko,
Y. et al., J. Immunol. Methods (1992) 149, 227-23
5）やDM/C7 抗体（Mulligan, M. S. et al., J. Immuno
l. (1993) 150, 5585-5595 ），Pep-1 抗体およびPep-3
抗体（国際特許出願公開番号WO 92/04372 ）または6G
4.2.5 抗体およびA5.12.14抗体（国際特許出願公開番号
WO 95/23865 ；Boylan, A.M. et al., J. Clin. Inves
t. (1992) 89, 1257-1267）等が挙げられる。これらの
うちで、特に好ましい抗体としてWS-4抗体が挙げられ
る。なお、WS-4抗体産生ハイブリドーマ細胞株は、Mous
e hybridoma WS-4として、工業技術院生命工学工業技術
研究所（茨城県つくば市東1 丁目1 番3 号）に、平成8
年4 月17日に、FERM BP-5507としてブダペスト条約に基
づき国際寄託されている。

【００１４】２. 抗体産生ハイブリドーマ モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、基本
的には公知技術を使用し、以下のようにして作製でき
る。すなわち、IL-8を感作抗原として使用して、これを
通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞
を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、
通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体
産生細胞をスクリーニングすることによって作製でき
る。

【００１５】具体的には、モノクローナル抗体を作製す
るには次のようにすればよい。例えば、抗体取得の感作
抗原として使用されるIL-8は、ヒトIL-8については、Ma
tsushima, K. et al., J. Exp. Med. (1988) 167, 1883
-1893 に、ウサギIL-8についてはHarada, A.et al., In
t. Immunol. (1993) 5, 681-690 に、イヌIL-8について
はIshikawa, J. et al., Gene (1993) 131, 305-306
に、ヒツジIL-8についてはSeow, H.F. et al., Immuno
l. Cell Biol. (1994) 72, 398-405 に、サルIL-8につ
いてはVillinger, F. et al., J. Immunol. (1995) 15
5, 3946-3954 に、モルモットIL-8については Yoshimur
a, T. and Johnson, D. G., J. Immunol . (1993) 15
1, 6225-6236に、ブタIL-8についてはGoodman, R. B.
et al., Biochemistry (1992) 31, 10483-10490 に開示
された、それぞれのIL-8遺伝子／アミノ酸配列を用いる
ことによって得られる。

【００１６】ヒトIL-8は、種々の細胞で産生され、N 末
端において異なるプロセシングを受けることが報告され
ている（Leonard, E. J. et al., Am. J. Respir. Cel
l. Mol. Biol. (1990) 2, 479-486）。これまでに、7
9，77，72，71，70および69のアミノ酸残基数を有するI
L-8が知られているが、本発明で使用される抗IL-8抗体
取得のための抗原として使用され得る限りそのアミノ酸
残基数を問わない。IL-8の遺伝子配列を公知の発現ベク
ター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、
その宿主細胞中または、培養上清中から目的のIL-8タン
パク質を公知の方法で精製し、この精製IL-8タンパク質
を感作抗原として用いればよい。

【００１７】感作抗原で免疫される哺乳動物としては、
特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親
細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般
的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハム
スター等が使用される。感作抗原を動物に免疫するに
は、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的
方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または、皮下
に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原
をPBS （Phosphate-Buffered Saline ）や生理食塩水等
で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジ
ュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量
混合し、乳化後、哺乳動物に4-21日毎に数回投与するの
が好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用
することができる。

【００１８】このように免疫し、血清中に所望の抗体レ
ベルが上昇するのを常法により確認した後に、哺乳動物
から免疫細胞が取り出され、細胞融合に付されるが、好
ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。前
記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物
のミエローマ細胞としては、既に公知の種々の細胞株、
例えば、P3（P3x63Ag8.653）（Kearney, J.F. et al.,
J. Immnol. (1979) 123, 1548-1550 ），P3x63Ag8U.1
（Yelton, D.E. et al., Current Topics in Microbio
logy and Immunology (1978) 81, 1-7 ），NS-1（Kohle
r, G. and Milstein, C., Eur. J. Immunol. (1976) 6,
511-519 ），MPC-11（Margulies, D. H. et al., Cell
(1976) 8, 405-415 ），SP2/0 （Shulman, M. et al.,
Nature (1978) 276, 269-270），FO（de St. Groth,S.
F. and Scheidegger, D., J. Immunol. Methods (198
0) 35, 1-21），S194（Trowbridge, I. S., J. Exp. Me
d. (1978) 148, 313-323 ），R210（Galfre, G.et al.,
Nature (1979) 277, 131-133 ）等が好適に使用され
る。

【００１９】前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合
は基本的には公知の方法、例えば、ミルステインらの方
法（Galfre, G. and Milstein, C. ，Methods Enzymol.
(1981) 73, 3-46）等に準じて行うことができる。より
具体的には、前記細胞融合は例えば、細胞融合促進剤の
存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤
としては例えば、ポリエチレングリコール（PEG ）、セ
ンダイウィルス（HVJ ）等が使用され、更に所望により
融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助
剤を添加使用することもできる。

【００２０】免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合
は、例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を1-10倍
とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液とし
ては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なRP
MI1640培養液、MEM 培養液、その他、この種の細胞培養
に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、
牛胎児血清（FCS ）等の血清補液を併用することもでき
る。細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所
定量を前記培養液中でよく混合し、予め、37℃程度に加
温したPEG 溶液、例えば、平均分子量1000-6000 程度の
PEG 溶液を通常、30-60%（w/v ）の濃度で添加し、混合
することによって目的とする融合細胞（ハイブリドー
マ）が形成される。続いて、適当な培養液を逐次添加
し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことにより
ハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除
去できる。

【００２１】当該ハイブリドーマは、通常の選択培養
液、例えば、HAT 培養液（ヒポキサンチン、アミノプテ
リンおよびチミジンを含む培養液）で培養することによ
り選択される。当該HAT 培養液での培養は、目的とする
ハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するの
に十分な時間、通常数日〜数週間継続する。ついで、通
常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハ
イブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニング
が行われる。

【００２２】また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上
記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をin vitro
でIL-8に感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能
を有するミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、IL-8
への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもでき
る（特公平1-59878 参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の
レパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原と
なるIL-8を免疫して抗IL-8抗体産生細胞を取得し、これ
を不死化させた細胞を用いてIL-8に対するヒト抗体を取
得してもよい（国際特許出願公開番号WO 92/03918 ，WO
93/12227 ，WO94/02602 ，WO 94/25585 ，WO 96/33735
およびWO 96/34096 参照）。

【００２３】このようにして作製されるモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継
代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期
保存することが可能である。当該ハイブリドーマからモ
ノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマ
を通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得
る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある
哺乳動物に移植して増殖させ、その腹水として得る方法
などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得る
のに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産
に適している。

【００２４】３. 組換え型抗体 モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドー
マからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、
これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生さ
せた組換え型抗体を本発明に用いることができる（例え
ば、Borrebaeck, C.A.K. and W. Larrick,J.W., THERAP
EUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the Unit
ed Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参
照）。

【００２５】具体的には、抗IL-8抗体を産生するハイブ
リドーマから、抗IL-8抗体の可変領域（V 領域）をコー
ドするmRNAを単離する。mRNAの単離は、公知の方法、例
えば、グアニジン超遠心法（Chirgwin, J. M. et al.,
Biochemistry (1979) 18, 5294-5299 ）、AGPC法（Chom
czynski, P. and Sacchi, N., Anal. Biochem. (1987)
162, 156-159）等により全RNA を調製し、mRNA Purific
ation Kit （Pharmacia ）等を使用して全RNA からmRNA
を精製する。また、QuickPrep mRNA Purification Kit
（Pharmacia ）を用いることによりmRNAを直接調製する
こともできる。

【００２６】得られたmRNAから逆転写酵素を用いて抗体
V 領域のcDNAを合成する。cDNAの合成は、AMV Reverse
Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit （生
化学工業）等を用いて行うことができる。また、cDNAの
合成および増幅を行うには5'-Ampli FINDER RACE Kit
（Clontech）およびポリメラーゼ連鎖反応（polymerase
chain reaction ；PCR ）を用いた5'-RACE 法（Frohma
n, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (19
88) 85, 8998-9002 ；Belyavsky,A. et al., Nucleic A
cids Res. (1989) 17, 2919-2932）を使用することがで
きる。

【００２７】得られたPCR 産物から目的とするDNA 断片
を精製し、ベクターDNA と連結する。さらに、これより
組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニー
を選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とす
るDNA の塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシヌ
クレオチドチェインターミネーション法により確認す
る。目的とする抗IL-8抗体のV 領域をコードするDNA が
得られれば、これを所望の抗体定常領域（C 領域）をコ
ードするDNA と連結し、これを発現ベクターへ組み込
む。または、抗体のV 領域をコードするDNA を、抗体C
領域のDNA を既に含む発現ベクターに組み込んでもよ
い。

【００２８】本発明で使用される抗IL-8抗体を製造する
には、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサ
ー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベク
ターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細
胞を形質転換し、抗体を発現させる。抗体遺伝子の発現
は、抗体の重鎖（H 鎖）または軽鎖（L 鎖）をコードす
るDNA を別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同
時形質転換させてもよいし、あるいはH 鎖およびL 鎖を
コードするDNA を単一の発現ベクターに組み込んで、宿
主細胞を形質転換させてもよい（国際特許出願公開番号
WO 94/11523 参照）。

【００２９】４. 改変抗体 本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること
等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、
例えば、キメラ（Chimeric）抗体、ヒト型化（Humanize
d ）抗体を使用できる。これらの改変抗体は、既知の方
法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、前記
のようにして得た、ヒト抗体以外の抗体V 領域をコード
するDNA をヒト抗体C 領域をコードするDNA と連結し、
これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させ
ることにより得られる（欧州特許出願公開番号EP 12502
3 、国際特許出願公開番号WO 96/02576 参照）。この既
知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得るこ
とができる。

【００３０】なお、キメラWS-4抗体のL 鎖またはH 鎖を
含むプラスミドを有する大腸菌は、各々Escherichia co
li DH5α（HEF-chWS4L-gκ）およびEscherichia coli J
M109（HEF-chWS4H-gγ1 ）として、工業技術院生命工学
工業技術研究所（茨城県つくば市東1 丁目1 番3 号）
に、平成6 年7 月12日に、各々FERM BP-4739およびFERM
BP-4740としてブダペスト条約に基づき国際寄託されて
いる。ヒト型化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体と
も称され、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相
補性決定領域（complementarity determining region；
CDR ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであ
り、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧
州特許出願公開番号EP 125023 、国際特許出願公開番号
WO 96/02576 参照）。

【００３１】具体的には、マウス抗体のCDR とヒト抗体
のフレームワーク領域（frameworkregion；FR）を連結
するように設計したDNA 配列を、末端部で互いにオーバ
ーラップする部分を有する数本のオリゴヌクレオチドに
分割して合成し、PCR 法により一本に統合したDNA に合
成する。得られたDNA をヒト抗体C 領域をコードするDN
A と連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを
宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許
出願公開番号EP 239400 、国際特許出願公開番号WO 96/
02576 参照）。

【００３２】CDR を介して連結されるヒト抗体のFRは、
CDR が良好な抗原結合部位を形成するものが選択され
る。必要に応じ、ヒト型化抗体の相補性決定領域が適切
な抗原結合部位を形成するように抗体のV 領域のFRのア
ミノ酸を置換してもよい（Sato, K. et al., Cancer Re
s. (1993) 53, 851-856 ）。キメラ抗体ならびにヒト型
化抗体には、目的によってヒト抗体C 領域が使用され、
例えば、 Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4 を使用することがで
きる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するた
めに、ヒト抗体C 領域を修飾してもよい。例えば、抗体
のサブクラスをIgG4に選択する場合、IgG4のヒンジ領域
の一部のアミノ酸配列CPSCP をIgG1のヒンジ領域のアミ
ノ酸配列CPPCP に変換する事により、IgG4の構造的不安
定性を解消できる（Angal, S. et al., Mol. Immunol.
(1993)30, 105-108）。

【００３３】キメラ抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体
のV 領域とヒト抗体由来のC 領域からなり、ヒト型化抗
体はヒト以外の哺乳動物由来抗体のCDR とヒト抗体由来
のFRおよびC 領域からなり、ヒト以外の哺乳動物由来の
アミノ酸配列が最小限度に減少しているため、ヒト体内
における抗原性が低下し、本発明の治療剤の有効成分と
して有用である。

【００３４】本発明に使用できるヒト型化抗体の好まし
い具体例としては、ヒト型化WS-4抗体が挙げられる（国
際特許出願公開番号WO 96/02576 参照）。ヒト型化WS-4
抗体は、マウス由来のWS-4抗体のCDR を、L 鎖について
はヒト抗体REI のFRと、H 鎖についてはヒト抗体VDH26
のFR1-3 およびヒト抗体4B4 のFR4 と連結し、抗原結合
活性を有するようにFRのアミノ酸残基を一部置換したも
のである。なお、ヒト型化WS-4抗体のL 鎖またはH 鎖を
含むプラスミドを有する大腸菌は、各々Escherichia co
li DH5α（HEF-RVLa-gκ）およびEscherichia coli JM1
09（HEF-RVHg-gγ1 ）として、工業技術院生命工学工業
技術研究所（茨城県つくば市東1 丁目1 番3 号）に、平
成6 年7 月12日に、各々FERM BP-4738およびFERM BP-47
41としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。

【００３５】５. 抗体修飾物 本発明で使用される抗体は、IL-8に結合し、IL-8の活性
を阻害するかぎり、抗体の断片やその修飾物であってよ
い。例えば、抗体の断片としては、Fab ，F(ab')2 ，Fv
またはH 鎖とL 鎖のFvを適当なリンカーで連結させたシ
ングルチェインFv（scFv）が挙げられる。具体的には、
抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体
断片を生成させるか、または、これら抗体断片をコード
する遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した
後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Co, M. S.
et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976 ；Bette
r, M.and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 1
78, 476-496 ；Pluckthun, A. and Skerra, A., Method
s Enzymol. (1989) 178, 497-515；Lamoyi, E., Method
s Enzymol. (1986) 121, 652-663；Rousseaux, J. et a
l., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669 ；Bird,
R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991)
9, 132-137 参照）。

【００３６】scFvは、抗体のH 鎖V 領域とL 鎖V 領域を
連結することにより得られる。このscFvにおいて、H 鎖
V 領域とL 鎖V 領域はリンカー、好ましくは、ペプチド
リンカーを介して連結される（Huston, J. S. et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-588
3）。scFvにおけるH 鎖V 領域およびL 鎖V 領域は、上
記抗体として記載されたもののいずれの由来であっても
よい。V 領域を連結するペプチドリンカーとしては、例
えばアミノ酸12-19 残基からなる任意の一本鎖ペプチド
が用いられる。

【００３７】scFvをコードするDNA は、前記抗体のH 鎖
または、H 鎖V 領域をコードするDNA 、およびL 鎖また
は、L 鎖V 領域をコードするDNA を鋳型とし、それらの
配列のうちの所望のアミノ酸配列をコードするDNA 部分
を、その両端を規定するプライマー対を用いてPCR 法に
より増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコ
ードするDNA およびその両端を各々H 鎖、L 鎖と連結さ
れるように規定するプライマー対を組み合せて増幅する
ことにより得られる。また、一旦scFvをコードするDNA
が作製されれば、それらを含有する発現ベクター、およ
び該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従
って得ることができ、また、その宿主を用いて常法に従
って、scFvを得ることができる。

【００３８】これら抗体の断片は、前記と同様にしてそ
の遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させること
ができる。本願特許請求の範囲でいう「抗体」にはこれ
らの抗体の断片も包含される。抗体の修飾物として、ポ
リエチレングリコール（PEG ）等の各種分子と結合した
抗IL-8抗体を使用することもできる。本願特許請求の範
囲でいう「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含され
る。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に
化学的な修飾を施すことによって得ることができる。こ
れらの方法はこの分野において既に確立されている。

【００３９】６. 組換え型抗体または改変抗体の発現お
よび産生 前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により
発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、
常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝
子、その3'側下流にポリA シグナルを機能的に結合させ
たDNA を含む発現ベクターにて発現させることができ
る。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒト
サイトメガロウィルス前期プロモーター／エンハンサー
（human cytomegalovirus immediate early promoter/e
nhancer ）を挙げることができる。

【００４０】また、その他に本発明で使用される抗体発
現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レ
トロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、
シミアンウィルス40（SV 40 ）等のウィルスプロモータ
ー／エンハンサーやヒトエロンゲーションファクター1
α（HEF1α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エ
ンハンサーを用いればよい。例えば、SV 40 プロモータ
ー／エンハンサーを使用する場合、Mulligan, R. C. ら
の方法（Nature (1979) 277, 108-114）、また、HEF1α
プロモーター／エンハンサーを使用する場合、Mizushim
a, Sらの方法（Nucleic Acids Res. (1990)18, 5322）
に従えば容易に実施することができる。

【００４１】大腸菌の場合、常用される有用なプロモー
ター、抗体分泌のためのシグナル配列、発現させる抗体
遺伝子を機能的に結合させて発現させることができる。
例えばプロモーターとしては、laczプロモーター、araB
プロモーターを挙げることができる。laczプロモーター
を使用する場合、Ward, E. S. らの方法（Nature (198
9) 341, 544-546；FASEB J. (1992) 6, 2422-2427 ）
に、またaraB、プロモーターを使用する場合、Better,
M.らの方法（Science (1988) 240, 1041-1043 ）に従え
ばよい。抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸
菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列
（Lei, S. P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 437
9-4383）を使用すればよい。ペリプラズムに産生された
抗体を分離した後、抗体の構造を適切に組み直して（re
fold）使用する（例えば、国際特許出願公開番号WO 96/
30394 参照）。

【００４２】複製起源としては、SV 40 、ポリオーマウ
ィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（BP
V ）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主
細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選
択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラー
ゼ（APH ）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大
腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラ
ーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）
遺伝子等を含むことができる。本発明で使用される抗体
の製造のために、任意の産生系を使用することができ、
抗体製造のための産生系は、in vitroおよびin vivo の
産生系がある。in vitroの産生系としては、真核細胞を
使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられ
る。

【００４３】真核細胞を使用する場合、動物細胞、植物
細胞、真菌細胞を用いる産生系がある。動物細胞として
は、（１）哺乳類細胞、例えば、CHO 、COS 、ミエロー
マ、BHK （baby hamster kidney ）、HeLa、Vero、
（２）両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細
胞、あるいは（３）昆虫細胞、例えば、sf9 、sf21、Tn
5が知られている。植物細胞としては、例えば、ニコテ
ィアナ（Nicotiana ）属、詳しくは、ニコティアナ・タ
バカム（Nicotiana tabacum ）由来の細胞が知られてお
り、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、
（１）酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces
）属、詳しくは、サッカロミセス・セレビジエ（Sacch
aromyces cerevisiae）、あるいは（２）糸状菌、例え
ば、アスペルギルス（Aspergillus ）属、詳しくは、ア
スペルギルス・ニガー（Aspergillus niger ）が知られ
ている。

【００４４】原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用い
る産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Escheric
hia coli）、枯草菌が知られている。これらの細胞に、
目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転
換された細胞をin vitroで培養することにより抗体が得
られる。培養は、公知の方法に従い行う。例えば、哺乳
類細胞用の培養液として、DMEM、MEM 、RPMI1640、IMDM
等を使用することができ、牛胎児血清（FCS ）等の血清
補液を併用することもできる。また、抗体遺伝子を導入
した細胞を動物の腹腔等へ移植することにより、in viv
o にて抗体を産生してもよい。

【００４５】更なるin vivo の産生系としては、動物を
使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。
動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系
がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マ
ウス、ウシを用いることができる（Glaser, V., SPECTR
UM Biotechnology Applications, 1993 ）。また、昆虫
としては、カイコを用いることができる。植物を使用す
る場合、例えばタバコを用いることができる。

【００４６】これらの動物または植物に抗体遺伝子を導
入し、動物または植物の体内で抗体を産生させ、回収す
る。例えば、抗体遺伝子をヤギβカゼインのような乳汁
中に固有に産生される蛋白質をコードする遺伝子の途中
に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿
入された融合遺伝子を含むDNA 断片をヤギの胚へ注入
し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギか
ら生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産
生する乳汁から所望の抗体を得る。トランスジェニック
ヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させ
るために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使
用してもよい。（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology
(1994) 12, 699-702 ）。

【００４７】また、カイコを用いる場合、目的の抗体遺
伝子を挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させ、
このカイコの体液より所望の抗体を得る（Maeda, S. et
al., Nature (1985) 315, 592-594）。さらに、タバコ
を用いる場合、目的の抗体遺伝子を植物発現用ベクタ
ー、例えばpMON 530に挿入し、このベクターをアグロバ
クテリウム チューメファシエンス（Agrobacterium tu
mefaciens ）のようなバクテリアに導入する。このバク
テリアをタバコ、例えばニコティアナ タバカム（Nico
tiana tabacum ）に感染させ、本タバコの葉より所望の
抗体を得る（Ma,J. K. et al., Eur. J. Immunol. (199
4) 24, 131-138 ）。

【００４８】上述のようにin vitroまたはin vivo の産
生系にて抗体を産生する場合、抗体H 鎖またはL 鎖をコ
ードするDNA を別々に発現ベクターに組み込んで宿主を
同時形質転換させてもよいし、あるいはH 鎖およびL 鎖
をコードするDNA を単一の発現ベクターに組み込んで、
宿主を形質転換させてもよい（国際特許出願公開番号WO
94/11523 参照）。

【００４９】７. 抗体の分離、精製 前記のように発現、産生された抗体は、細胞内外、宿主
から分離し均一にまで精製することができる。本発明で
使用される抗体の分離、精製はアフィニティークロマト
グラフィーにより行うことができる。アフィニティーク
ロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、プ
ロテインA カラム、プロテインG カラムが挙げられる。
例えば、プロテインA カラムを用いたカラムとして、Hy
per D 、POROS 、Sepharose F.F.（Pharmacia ）等が挙
げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている
分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるもの
ではない。

【００５０】例えば、上記アフィニティークロマトグラ
フィー以外のクロマトグラフィーカラム、フィルター、
限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせれば、
抗体を分離、精製することができる（Antibodies：A La
boratory Manual. Ed Harlowand David Lane, Cold Spr
ing Harbor Laboratory, 1988 ）。アフィニティークロ
マトグラフィー以外のクロマトグラフィーとしては、例
えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグ
ラフィー、ゲル濾過等が挙げられる（Strategies for P
rotein Purification and Characterization: A Labora
tory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., C
old Spring Harbor Laboratory Press,1996）。

【００５１】８. 抗体の濃度測定 ７で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定または酵素
結合免疫吸着検定法（enzyme-linked immunosorbent as
say ；ELISA ）等により行うことができる。すなわち、
吸光度の測定による場合には、得られた抗体をPBS で適
当に希釈した後、280 nmの吸光度を測定し、種およびサ
ブクラスにより吸光係数は異なるが、ヒト抗体の場合1
mg/ml を1.4 ODとして算出する。また、ELISA による場
合は以下のように測定することができる。すなわち、0.
1M重炭酸緩衝液（pH9.6 ）で1 μg/mlに希釈したヤギ抗
ヒトIgG 抗体100 μl を96穴プレート（Nunc）に加え、
４℃で一晩インキュベーションし、抗体を固相化する。

【００５２】ブロッキングの後、適宜希釈した本発明で
使用される抗体または抗体を含むサンプル、あるいは濃
度標準品として既知の濃度のヒトIgG100μl を添加し、
室温にて１時間インキュベーションする。洗浄後、5000
倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒトIgG 抗
体100 μl を加え、室温にて１時間インキュベートす
る。洗浄後、基質溶液を加えインキュベーションの後、
MICROPLATE READER Model 3550（Bio-Rad ）を用いて40
5nm での吸光度を測定し、目的の抗体の濃度を濃度標準
ヒトIgG の吸光度より算出する。

【００５３】９. 抗体の活性の確認 本発明で使用される抗体の抗原結合活性（Antibodies:
A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane, Cold
Spring Harbor Laboratory, 1988）、リガンドレセプ
ター結合阻害活性（Harada, A. et al., Int. Immunol.
(1993) 5, 681-690）の測定には公知の手段を使用する
ことができる。

【００５４】本発明で使用される抗IL-8抗体の抗原結合
活性を測定する方法として、ELISA，EIA （酵素免疫測
定法）、RIA （放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を
用いることができる。例えば、ELISA を用いる場合、IL
-8に対するポリクローナル抗体を固相化した96穴プレー
トにIL-8を添加し、次いで目的の抗IL-8抗体を含む試
料、例えば、抗IL-8抗体産生細胞の培養上清や精製抗体
を加える。アルカリフォスファターゼ等の酵素で標識し
た目的の抗IL-8抗体を認識する二次抗体を添加し、プレ
ートをインキュベーション、洗浄した後、p-ニトロフェ
ニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定すること
で抗原結合活性を評価することができる。

【００５５】本発明で使用される抗IL-8抗体のリガンド
レセプター結合阻害活性を測定する方法としては、通常
のCell ELISA、あるいは、リガンドレセプター結合アッ
セイを用いることができる。例えば、Cell ELISA法の場
合、IL-8レセプターを発現する血液細胞あるいは癌細
胞、例えば、好中球を96穴プレートで培養して接着さ
せ、パラホルムアルデヒドなどで固定化する。あるい
は、IL-8レセプターを発現する細胞の膜分画を調製して
固相化した96穴プレートを作製する。これに、目的の抗
IL-8抗体を含む試料、例えば、抗IL-8抗体産生細胞の培
養上清や精製抗体と、放射性同位元素、例えば、¹²⁵I等
で標識したIL-8を添加し、プレートをインキュベーショ
ン、洗浄した後、放射活性を測定することでIL-8レセプ
ターに結合したIL-8量を測定でき、抗IL-8抗体のリガン
ドレセプター結合阻害活性を評価することができる。

【００５６】例えば、細胞上のIL-8レセプターに対する
IL-8の結合阻害アッセイには、IL-8レセプターを発現す
る血液細胞あるいは癌細胞、例えば好中球を遠心分離等
の手段で分離した後、細胞懸濁液として調製する。放射
性同位元素、例えば、¹²⁵I等で標識したIL-8溶液、ある
いは非標識のIL-8と標識IL-8の混合溶液と、濃度調製し
た抗IL-8抗体を含む溶液を細胞懸濁液に添加する。一定
時間の後、細胞を分離し、細胞上に結合した標識IL-8の
放射活性を測定すればよい。また、本発明で使用される
抗IL-8抗体の好中球遊走（ケモタキシス；chemotaxis）
に対する阻害能を測定する方法として、公知の通常知ら
れている方法、例えば、Grob, P.M. らの方法（J. Bio
l. Chem. (1990) 265, 8311-8316）を用いることができ
る。

【００５７】具体的には、市販されているケモタキシス
チャンバーを用い、抗IL-8抗体を培養液、例えば、RPMI
1640 、DMEM、MEM 、IMDM等で希釈した後、IL-8を加
え、これをフィルターで仕切られたチャンバー下層に分
注する。次いで、調製した細胞懸濁液、例えば好中球懸
濁液をチャンバー上層に添加し、一定時間放置する。遊
走する細胞はチャンバーに装着されたフィルター下面に
付着するので、その細胞の数を染色液あるいは蛍光抗体
等を用いた方法で測定すればよい。また、顕微鏡下での
肉眼による判定や計測器を用いた自動測定も可能であ
る。

【００５８】１０. 投与方法および製剤 本発明の抗IL-8抗体を有効成分として含有する治療剤
は、非経口的に、例えば、点滴等の静脈内注射、筋肉内
注射、腹腔内注射、皮下注射等により全身あるいは局部
的に投与することができる。また、患者の年齢、症状に
より適宜投与方法を選択することができる。本発明の抗
IL-8抗体を有効成分として含有する治療剤は、病気に既
に悩まされる患者に、病気およびその合併症の症状を治
癒するか、あるいは少なくとも部分的に阻止するために
十分な量で投与される。例えば、有効投与量は、一回に
つき体重1kg あたり0.01mgから1000mgの範囲で選ばれ
る。あるいは、患者あたり5-2000mg/body の投与量を選
ぶことができる。しかしながら、本発明の抗IL-8抗体を
含有する治療剤はこれらの投与量に制限されるものでは
ない。

【００５９】また、投与時期としては、心筋梗塞、不安
定狭心症または心筋虚血再灌流障害が生じてから投与し
てもよいし、あるいは、一時的に血流が遮断された後の
再灌流時や血栓溶解剤の使用あるいはPTCA施術後で再灌
流が予測される時に投与してもよい。本発明の抗IL-8抗
体を有効成分として含有する治療剤は、常法にしたがっ
て製剤化することができ（Remington's Pharmaceutical
Science, latest edition,Mark Publishing Company,
Easton, 米国）、医薬的に許容される担体や添加物を
共に含むものであってもよい。

【００６０】このような担体および医薬添加物の例とし
て、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポ
リビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキ
シビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリ
ウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウ
ム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナ
トリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロ
ース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒
天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリ
ン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ス
テアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミ
ン（HSA ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトー
ス、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げら
れる。

【００６１】実際の添加物は、本発明治療剤の剤形に応
じて上記の中から適宜あるいは組み合わせて選ばれる
が、もちろんこれらに限定するものではない。例えば、
注射用剤として使用する場合、精製された抗IL-8抗体を
溶剤、例えば、生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等に
溶解し、それに、吸着防止剤、例えば、Tween 80、Twee
n 20、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを
使用することができる。または、使用前に溶解再構成す
るために凍結乾燥したものであってもよく、凍結乾燥の
ための賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ
糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。

【００６２】心筋梗塞、不安定狭心症あるいは心筋虚血
再灌流障害などにより心筋細胞への血液供給が低下また
は途絶すると、心筋細胞が傷害を受ける。その際、傷害
を受けた心筋細胞から血中へクレアチンキナーゼ（CK）
やラクテートデヒドロゲナーゼ（LDH ）が遊離し、血中
のそれらの酵素活性が増加することが知られている。そ
のため、これらは上記疾患の障害の程度を表すための指
標として臨床的に使用されている。後述の実施例に示し
たように、本発明の抗IL-8抗体またはその断片を有効成
分として含有する治療剤は、上記疾患の実験系として知
られているウサギ冠動脈左回旋枝結紮モデルにおいて血
中CK活性およびLDH 活性のレベルを低下させた。したが
って、本発明の抗IL-8抗体またはその断片を有効成分と
して含有する治療剤は、心筋梗塞、不安定狭心症および
心筋虚血再灌流障害の治療剤として有用である。

【００６３】

【実施例】以下、実施例、参考例および実験例により本
発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定され
るものではない。参考例１ . ヒトIL-8に対するモノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマの作製 ヒトIL-8を常法によりBALB/cマウスに免疫し、免疫が成
立したマウスより脾細胞を採取した。ポリエチレングリ
コールを使用する常法によりこの脾細胞をマウス骨髄腫
細胞P3X63Ag8.653と融合させ、ヒトIL-8に対するマウス
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製し
た。ヒトIL-8に対する結合活性を指標としてスクリーニ
ングを行った結果、ハイブリドーマ細胞株WS-4を得た。
また、ハイブリドーマWS-4が産生する抗体は、ヒトIL-8
の好中球への結合を阻害し中和活性を有していた。（K
o, Y. et al., J. Immunol. Methods (1992) 149, 227
-235 ）。

【００６４】ハイブリドーマWS-4が産生する抗体のH 鎖
およびL 鎖のアイソタイプを、マウスモノクローナル抗
体アイソタイピングキットを用いて調べた。その結果、
ハイブリドーマWS-4が産生する抗体は、マウスκ型L 鎖
およびマウスγ１型H 鎖を有することが明らかになっ
た。なお、ハイブリドーマ細胞株WS-4は、Mouse hybrid
oma WS-4として、工業技術院生命工学工業技術研究所
（茨城県つくば市東1 丁目1 番3 号）に、平成8 年4月1
7日に、FERM BP-5507としてブダペスト条約に基づき国
際寄託された。

【００６５】参考例２. ヒトIL-8に対するヒト型化抗体
の作製 ヒト型化WS-4抗体を国際特許出願公開番号WO 96-02576
に記載の方法により作製した。参考例１で作製されたハ
イブリドーマWS-4から、常法により全RNA を調製し、こ
れより一本鎖cDNAを合成した。PCR 法により、マウスWS
-4抗体のH 鎖ならびにL 鎖のV 領域をコードするDNA を
増幅した。PCR 法に使用したプライマーは、Jones, S.
T. and Bendig, M. M., Bio/Technology (1991) 9, 88-
89に記載されているプライマーを用いた。PCR 法で増幅
したDNA 断片を精製し、マウスWS-4抗体L 鎖V 領域をコ
ードする遺伝子を含むDNA 断片およびマウスWS-4抗体H
鎖V 領域をコードする遺伝子を含むDNA 断片を単離し
た。これらのDNA 断片を各々プラスミドpUC 系クローニ
ングベクターに連結し、大腸菌コンピテント細胞に導入
して大腸菌形質転換体を得た。

【００６６】この形質転換体を常法により培養し、得ら
れた菌体から上記DNA 断片を含むプラスミドを精製し
た。プラスミド中のV 領域をコードするDNA の塩基配列
を常法に従って決定し、そのアミノ酸配列から各々のV
領域のCDR を特定した。キメラWS-4抗体を発現するベク
ターを作製するため、マウスWS-4抗体のL 鎖およびH 鎖
のV 領域をコードするcDNAを、予めヒトC 領域をコード
するDNA を連結してあるHEF ベクターにそれぞれ別に挿
入した。ヒト型化WS-4抗体を作製するために、CDR 移植
法による遺伝子工学的手法を用いてマウスWS-4抗体のV
領域CDR をヒト抗体へ移植した。適切な抗原結合部位を
形成させるため、CDR を移植した抗体のV 領域のFRのア
ミノ酸を一部置換する為のDNA 配列の置換をおこなっ
た。

【００６７】このようにして作製したヒト型化WS-4抗体
のL 鎖およびH 鎖のV 領域を、抗体として哺乳類細胞で
発現させるために、各々をコードするDNA をHEF ベクタ
ーに別々に挿入し、ヒト型化WS-4抗体のL 鎖またはH 鎖
を発現するベクターを作製した。これら二つの発現ベク
ターをCOS 細胞に同時に挿入することにより、ヒト型化
WS-4抗体を産生する細胞株を樹立した。この細胞株を培
養して得られたヒト型化WS-4抗体のIL-8への結合能およ
びIL-8中和能を、各々ELISA およびIL-8/ 好中球結合阻
害試験にて調べた。その結果、ヒト型化WS-4抗体は、マ
ウスWS-4抗体と同程度に、ヒトIL-8に結合してIL-8の好
中球への結合を阻害することが判明した。

【００６８】なお、ヒト型化WS-4抗体のL 鎖およびH 鎖
を含むプラスミドを有する大腸菌は、各々Escherichia
coli DH5α（HEF-RVLa-gκ）およびEscherichia coli J
M109（HEF-RVHg-gγ1 ）として、工業技術院生命工学工
業技術研究所（茨城県つくば市東1 丁目1 番3 号）に、
平成6 年7 月12日に、各々FERM BP-4738およびFERM BP-
4741としてブダペスト条約に基づき国際寄託された。

【００６９】実施例１.ニュージーランド白色種ウサギ
（1 群n=3 、雄）をネンブタール（ダイナボット、投与
量25-30mg/kg体重）を耳介静脈より投与して麻酔し、仰
臥位に保定後、前頚部・胸部・左右大腿部を剃毛した。
左大腿部を切開後、大腿動脈を確保、カテーテルを留置
して血圧モニター（日本光電）に接続し血圧を実験終了
まで連続的に測定した。右大腿部を切開後、大腿動脈な
らびに大腿静脈を確保し、それぞれにカテーテルを留置
して採血と投与に使用した。

【００７０】前頚部縦切開にて気管を露出、気管切開に
より気管内挿管チューブを挿入し、人工呼吸下で電気メ
ス及び開胸器を用い開胸した。その際、血中酸素分圧を
130-140mmHg に保持するため、吸気に混合ガス（酸素95
% 、二酸化炭素5%）を約0.2l/min 付加した。心臓露
出、心嚢膜切開後、冠動脈左回旋枝に糸をかけ、心電図
計（日本光電）の電極を四肢にセット後、1 時間静置し
た。CK活性およびLDH 活性の測定のため、大腿静脈より
ヘパリン（シミズ）採血により0.5ml の血液を採取し、
以降経時的に同様の処置を施した。ポリエチレンチュー
ブ（ヒビキsize6）及び改造を加えた動脈クレンメ（ナ
ツメ）を用い冠動脈左回旋枝を結紮して、虚血部の変色
と心電図上のSTセグメント上昇を確認して虚血状態とし
た。

【００７１】結紮24分後から1 分間かけて、濃度5mg/ml
（溶媒：Na-Na リン酸緩衝液pH6.0）のヒトIL-8に対す
るマウスWS-4抗体（投与量5mg/kg体重、1ml/kg体重）、
あるいは陰性対照として溶媒（1ml/kg体重）を大腿静脈
より投与した。5 分後（結紮30分後）に結紮を解き再灌
流とした。5 時間再灌流した後、0.5ml ヘパリン溶液及
び10ml飽和塩化カリウムを大腿静脈より投与し犠牲死さ
せた。経時的に採取した血液中のCK活性及びLDH 活性
を、測定キット（ナックルCK [NAC-810]：ヤトロン、LD
H [NAC-228] ：SIGMA DIAGNOSTICS ）を用いて測定し
た。血中CK活性の経時的変化を表１ならびに図１に、ま
た、LDH 活性の経時的変化を表２ならびに図２にそれぞ
れ示す。

【００７２】

【表１】

【００７３】

【表２】

【００７４】血中CK活性の推移は、溶媒投与群の平均値
は再灌流する事により急激に上昇し、その後時間経過と
ともに漸増した。しかしながら、WS-4抗体投与群のそれ
は、再灌流する事により急激に上昇したものの、溶媒投
与群の平均値よりも低く、その後は一定値を保持し上昇
を抑制した。このことから、WS-4抗体の投与により心筋
細胞障害の指標である血中CK活性の増加が抑制される事
が示された（図１）。

【００７５】血中LDH 活性の推移は、溶媒投与群の平均
値は再灌流する事により急激に上昇し、その後時間経過
とともに漸減した。しかしながら、WS-4抗体投与群のそ
れは、再灌流する事により急激に上昇したものの、その
値は溶媒投与群よりも低く、その後の減少の度合いも溶
媒投与群より強かった。このことから、WS-4抗体の投与
により心筋細胞障害の指標である血中LDH 活性の増加が
抑制される事が示された（図２）。これらの結果は、虚
血再灌流により心筋細胞が傷害を受けて生じるCKならび
にLDH の血中への遊離を、WS-4抗体が抑制したこと示し
ており、WS-4抗体が虚血再灌流障害に対して心筋細胞を
保護した事を意味している。従って、心筋梗塞などを含
めた心筋虚血再灌流障害に対する治療薬として有用であ
ることが示された。

【００７６】実施例２.犠牲死後に心臓を摘出し、以下
の処理を施すことにより梗塞巣の定量が可能である。摘
出心臓の大動脈より逆行性に生理食塩水（大塚製薬）10
mlを注入して血液を除去し、続いて、左回旋枝に留置し
ておいた虚血に用いた糸を再び結紮し大動脈より逆行性
に1%エバンスブルー溶液（溶媒：生理食塩水）5ml を注
入する。摘出心臓をエバンスブルーで染色された正常灌
流部とエバンスブルーで染色されない虚血領域に分離
し、虚血領域は37℃の1%トリフェニルテトラゾリウムク
ロライド（シグマ、TTC ）溶液中で10分間インキュベー
トする。その後、更にTTC で染色された虚血領域非壊死
部とTTC で染色されない虚血領域壊死部に分離する。そ
の後、正常灌流部位、虚血領域非壊死部、虚血領域壊死
部の各々の組織重量を測定することにより、梗塞巣の定
量が可能である。

【００７７】

【発明の効果】抗IL-8抗体の投与によりCK活性並びにLD
H 活性の血中レベルが低下された。この事実は、抗IL-8
抗体が心筋梗塞、不安定狭心症および心筋虚血再灌流障
害の治療剤として有用であることを示す。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ウサギ心筋梗塞モデルにおける血漿中
のCK活性を経時的に測定し、WS-4抗体投与群の平均値を
陰性対照である溶媒投与群の平均値と比較したグラフで
ある。

【図２】図２は、ウサギ心筋梗塞モデルにおける血漿中
のLDH 活性を経時的に測定し、WS-4抗体投与群の平均値
を陰性対照である溶媒投与群の平均値と比較したグラフ
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ０７Ｋ 16/24 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 抗IL-8抗体を有効成分として含有する心
   筋梗塞治療剤。
2. 【請求項２】 心筋梗塞が急性心筋梗塞であることを特
   徴とする、請求項１に記載の治療剤。
3. 【請求項３】 抗IL-8抗体を有効成分として含有する不
   安定狭心症治療剤。
4. 【請求項４】 抗IL-8抗体を有効成分として含有する心
   筋虚血再灌流障害治療剤。
5. 【請求項５】 心筋虚血再灌流障害が心−肺バイパス術
   施術に伴うことを特徴とする、請求項４に記載の治療
   剤。
6. 【請求項６】 心筋虚血再灌流障害が人為的心停止を行
   う手術に伴うことを特徴とする、請求項４に記載の治療
   剤。
7. 【請求項７】 心筋虚血再灌流障害が心臓移植に伴うこ
   とを特徴とする、請求項４に記載の治療剤。
8. 【請求項８】 抗IL-8抗体がモノクローナル抗体である
   ことを特徴とする請求項１，３あるいは４に記載の治療
   剤。
9. 【請求項９】 抗IL-8抗体が哺乳類のIL-8に対する抗体
   であることを特徴とする請求項１，３あるいは４に記載
   の治療剤。
10. 【請求項１０】 抗IL-8抗体がヒトIL-8に対する抗体で
    あることを特徴とする請求項１，３あるいは４に記載の
    治療剤。
11. 【請求項１１】 抗IL-8抗体がWS-4抗体であることを特
    徴とする請求項１，３あるいは４に記載の治療剤。
12. 【請求項１２】 抗IL-8抗体がヒト型化またはキメラ化
    された抗体であることを特徴とする請求項１，３あるい
    は４に記載の治療剤。
13. 【請求項１３】 抗IL-8抗体がヒト型化WS-4抗体である
    ことを特徴とする請求項１，３あるいは４に記載の治療
    剤。