JP5566108B2 - 抗ｉｌ−６レセプター抗体 - Google Patents

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Description

本発明は、抗IL-6レセプター抗体を有効成分として含有する医薬組成物、および、その製造法等に関する。
抗体は血漿中（血中）での安定性が高く、副作用も少ないことから医薬品として注目されている。中でもIgG型の抗体医薬は多数上市されており、現在も数多くの抗体医薬が開発されている（非特許文献１、非特許文献２）。
IL-6は様々な自己免疫疾患に関与するサイトカインであり（非特許文献３）、ヒト化抗IL-6レセプターIgG1抗体であるTOCILIZUMABはIL-6レセプターに特異的に結合し、その生物学的作用を中和することで、関節リウマチ等のIL-6が関連する疾患の治療薬として利用可能であると考えられている（特許文献１、２、３、非特許文献４）。実際、TOCILIZUMABはすでにキャッスルマン病の治療薬として日本で承認されている（非特許文献５）。
第2世代の抗体医薬に適用可能な技術として様々な技術が開発されており、エフェクター機能、抗原結合能、血漿中滞留性（血中滞留性）、安定性を増強させる、あるいは、免疫原性（抗原性）リスクを低減させる技術等が報告されている。
薬効を増強させる、あるいは、投与量を低減させる方法として、IgG抗体のFc領域のアミノ酸置換により抗体依存性細胞障害活性（ADCC活性）や補体依存性細胞障害活性（CDC活性）を増強させる技術が報告されている（非特許文献６）。また、抗原結合能、抗原中和能を増強させる技術として、アフィニティーマチュレーション技術（非特許文献７）が報告されており、可変領域のCDR領域などのアミノ酸に変異を導入することで抗原への結合活性を増強することが可能である。抗原結合能の増強によりin vitroの生物活性を向上させる、あるいは投与量を低減することが可能であり、さらにin vivoでの薬効を向上させることも可能である（非特許文献８）。現在、抗RSV抗体の第一世代薬であるPalivizumabより優れた効果を発揮するとされるMotavizumab（affinity maturationにより作製）の臨床試験が行われている（非特許文献９）。また異なるエピトープに結合することでより優れた効果を出すことも可能である。例えば抗CD20抗体であるRituximabとは異なるエピトープを認識するOftamumabはin vivoでRituximabより優れた効果を発揮することが報告されており、現在臨床試験が行われている（非特許文献１０）。抗IL-6レセプター抗体においては、これまでに1nMより強いアフィニティーを有するヒト抗体あるいはヒト化抗体あるいはキメラ抗体の報告は無い。
現在の抗体医薬が抱える問題として、投与タンパク量が非常に大きいことによる高い製造コストが挙げられる。ヒト化抗IL-6レセプターIgG1抗体であるTOCILIZUMABにおいても投与量は8mg/kg/month程度の静脈内注射が想定されている（非特許文献４）。また投与形態については、慢性的な自己免疫疾患の場合は皮下投与製剤が望ましいとされている。一般的に皮下投与製剤は高濃度製剤であることが必要であり、IgGタイプの抗体製剤の場合、安定性等の点から一般的には100mg/mL程度の製剤が限度であると考えられる（非特許文献１１）。持続的な治療効果を発揮できるよう抗体の血漿中半減期を長くすることで投与タンパク量を小さくし、高濃度製剤が可能な程度に高い安定性を付与することによって、長い投与間隔での皮下投与を可能にし、低コスト且つ利便性の高い第２世代の抗体医薬を提供することが可能である。
抗体の血漿中半減期を向上させる方法として、定常領域の人工的なアミノ酸置換が報告されている（非特許文献１２、１３）が、免疫原性リスクの観点から定常領域に天然に存在しない配列を導入することは好ましくない。また、免疫原性の観点からは定常領域よりも可変領域にアミノ酸置換を行うほうが望ましいが、これまでに可変領域のアミノ酸置換により抗体の血漿中半減期を向上させた報告は無く、ヒト、あるいは、ヒト化、あるいは、キメラIL-6レセプター抗体において血漿中半減期を向上させた報告は無い。
安定性を改善する方法として、可変領域のフレームワークのアミノ酸置換やシャッフリングによる物理化学的安定性（熱変性中間温度）の向上（非特許文献１４、１５）が報告されているが、これまでにこれらのアミノ酸置換により100mg/mLを越える高濃度製剤において安定性を改善した（会合体生成を抑制した）報告はなく、ヒト、あるいは、ヒト化IL-6レセプター抗体においても100mg/mLを越える高濃度製剤において安定な抗体分子に関する報告は無い。
バイオ医薬品を開発するにあたってもうひとつの重要な問題は免疫原性である。一般的にマウス抗体はヒト化することによって免疫原性が低減される。ヒト化する際のテンプレートフレームワークにジャームライン配列を用いることにより、免疫原性のリスクはさらに軽減できるとされている（非特許文献１６）。しかしながら、完全ヒト抗TNF抗体であるAdalimumabであっても１３〜１７％と高頻度で免疫原性が出現し、免疫原性が出現した患者においては治療効果の低減が見られている（非特許文献１７、１８）。ヒト抗体であってもCDR領域にT-cell epitopeが存在する可能性があり、CDR上のT-cell epitopeが免疫原性の原因となっている可能性がある。T-cellエピトープをin silicoあるいはin vivoで予測する方法が報告されているが（非特許文献１９、２０）、これらの方法を用いて予測されるT-cellエピトープを除去することで、免疫原性リスクを低減することが可能であると考えられる（非特許文献２１）。ヒト化抗IL-6レセプターIgG1抗体であるTOCILIZUMABは、マウスPM1抗体をヒト化したIgG1抗体である。H鎖、L鎖それぞれNEW、REIのヒト配列をテンプレートフレームワークとして用いてCDRグラフティングを行っているが、活性保持に重要なアミノ酸として５アミノ酸がマウス配列としてフレームワークに残存している（非特許文献２２）。これまでヒト化抗体であるTOCILIZUMABのフレームワークに残存するマウス配列を活性を低下させること無くヒト配列に置換した報告は無い。また、TOCILIZUMABのCDR配列はマウス配列であり、Adalimumab同様CDR領域にT-cell epitopeが存在する可能性があり、免疫原性のリスクは否定できない。さらにTOCILIZUMABはIgG1サブクラスであることから、Fcγレセプターに結合可能である。Fcγレセプターは抗原提示細胞に発現していることから、Fcγレセプターに結合する分子は抗原提示されやすくなり、IgG1のFc部分にタンパク質やペプチドを結合することによって免疫原性が増強する（させることが可能である）ことが報告されている（非特許文献２３、特許文献４）。TOCILIZUMABの臨床試験において、薬効用量である8mg/kgにおいて抗TOCILIZUMAB抗体の出現は認められていないが、4mg/kgおよび2mg/kgにおいては免疫原性が認められている（特許文献５）。これらのことから、ヒト化抗IL-6レセプターIgG1抗体であるTOCILIZUMABの免疫原性については改善の余地があると考えられる。しかしながら、これまでにアミノ酸置換により免疫原性リスクを改善させたTOCILIZUMAB(ヒト化PM-1抗体)に関する報告は無い。
また近年、抗体医薬の安全性が非常に重要視されている。TGN1412のPhaseI臨床試験で見られた重大な副作用の原因の一つとして、抗体のFc部分とFcγレセプターの相互作用が考えられている（非特許文献２４）。抗原の生物学的作用を中和することが目的の抗体医薬においてはFc領域のADCC等のエフェクター機能に重要なFcγレセプターへの結合は不必要である。また、上述の通り、免疫原性や副作用の点から考えると、Fcγレセプターへの結合は好ましくない可能性も考えられる。
Fcγレセプターへの結合を完全に無くすことは出来ないが低下させる方法としては、IgG抗体のアイソタイプをIgG1からIgG2あるいはIgG4に変える方法が考えられる（非特許文献２５）。Fcγレセプターへの結合を完全に無くす方法としては、人工的な改変をFc領域に導入する方法が報告されている。例えば、抗CD3抗体や抗CD4抗体は抗体のエフェクター機能が副作用を惹起する。そこで、Fc領域のFcγレセプター結合部分に野生型配列には存在しないアミノ酸変異（非特許文献２６、２７）を導入したFcγレセプター非結合型の抗CD3抗体や抗CD4抗体の臨床試験が現在行われている（非特許文献２４、２８）。また、IgG1のFcγR結合部位（EUナンバリング：２３３、２３４、２３５、２３６、３２７、３３０、３３１番目）をIgG2およびIgG4の配列にすることでFcγレセプター非結合型抗体を作製することが可能である（非特許文献２９、特許文献６）。しかしながら、これらの分子はいずれも天然には存在しないT-cellエピトープペプチドとなりうる９〜１２アミノ酸の新しいペプチド配列が出現しており、免疫原性のリスクが考えられる。このような課題を解決したFcγレセプター非結合型抗体の報告はこれまでにない。
一方、抗体を医薬品として開発するにあたり、そのタンパク質の物性、中でも均一性と安定性は極めて重要である。IgG2のアイソタイプは、ヒンジ領域のジスルフィド結合に由来するヘテロジェニティーが報告されている（非特許文献３０）。これに由来する目的物質/関連物質のヘテロジェニティーの製造間差を維持しつつ医薬品として大量に製造することは難しい。医薬品として開発する抗体分子は、可能な限り単一物質であることが望まれる。
また、IgG2およびIgG4は酸性条件下での安定性に乏しい。一般にIgGタイプの抗体はプロテインAを用いた精製工程およびウィルス不活化工程において酸性条件下に暴露されることから、IgG2およびIgG4は同工程においては会合化・変性する可能性がある。そのため医薬品として開発する抗体分子は望ましくは酸性条件下においても安定であったほうがよい。天然型のIgG2およびIgG4、および、IgG2およびIgG4をベースにしたFcγレセプター非結合型抗体（非特許文献２５、２６、特許文献６）においては、これらの課題があり、医薬品として開発する上では解決されることが望まれる。
IgG1タイプの抗体は酸性条件下で比較的安定であり、ヒンジ領域のジスルフィド結合に由来するヘテロジェニティーも少ないが、製剤保存中にヒンジ領域のペプチド結合が非酵素的に溶液中で分解が進行し、不純物としてFab断片が生成することが報告されている（非特許文献３１）。医薬品として開発するには不純物の生成は解決されることが望ましい。
また、抗体のC末端配列のヘテロジェニティーとして、C末端アミノ酸のLys残基の欠損、および、C末端の２アミノ酸のGly、Lysの欠損によるC末端アミノ基のアミド化が報告されており（非特許文献３２）、医薬品として開発する上にはこれらのヘテロジェニティーは存在しないことが望ましい。
このように抗原を中和することが目的の抗体医薬の定常領域は、これらの課題を全て解決した定常領域配列が望ましいが、これらの条件を全て満たす定常領域の報告はこれまでにない。
これまでに、第１世代の分子と比較して抗原中和能を増強させつつ、投与頻度を少なくし持続的に治療効果を発揮し、且つ、免疫原性、安全性、物性を改善させた第2世代の分子の開発は報告されていない。また、ヒト化抗IL-6レセプターIgG1抗体であるTOCILIZUMABの可変領域および定常領域のアミノ酸配列を改変することで、上述した項目においてより優れた第2世代のTOCILIZUMABに関する報告もない。
なお、本発明の先行技術文献を以下に示す。
Monoclonal antibody successes in the clinic, Janice M Reichert, Clark J Rosensweig, Laura B Faden & Matthew C Dewitz, Nature Biotechnology 23, 1073 - 1078 (2005) Pavlou AK, Belsey MJ., The therapeutic antibodies market to 2008., Eur J Pharm Biopharm. 2005 Apr;59(3):389-96. Nishimoto N, Kishimoto T., Interleukin 6: from bench to bedside., Nat Clin Pract Rheumatol. 2006 Nov;2(11):619-26. 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本発明はこのような状況に鑑みて為されたものであり、その目的は、ヒト化抗IL-6レセプターIgG1抗体であるTOCILIZUMABの可変領域および定常領域のアミノ酸配列を改変することで、抗原中和能を増強させつつ、薬物動態を向上（血漿中滞留性を向上）させることで投与頻度を少なくし持続的に治療効果を発揮し、且つ、免疫原性、安全性、物性を改善させ、TOCILIZUMABより優れた第2世代の分子からなる医薬組成物、並びに、それらの医薬組成物の製造方法を提供することにある。
本発明者らは、第１世代のヒト化抗IL-6レセプターIgG1抗体であるTOCILIZUMABの可変領域および定常領域のアミノ酸配列を改変することで、薬効を増強させつつ、薬物動態を向上させることで投与頻度を少なくし持続的に治療効果を発揮し、且つ、免疫原性、安全性、物性（安定性および均一性）を改善させ、TOCILIZUMABより優れた第2世代の分子の創製に向けて、鋭意研究を行った。その結果、本発明者らは、TOCILIZUMABの可変領域において、抗原への結合能（アフィニティー）を向上させるCDR変異を複数見出しその組み合わせにより大幅にアフィニティーを向上させることに成功した。また本発明者らは、可変領域配列の等電点を低下させる改変を導入することで薬物動態を向上させることに成功した。また本発明者らは、TOCILIZUMABのフレームワークに残存するマウス由来の配列および可変領域においてin silicoで予測されたT-cellエピトープペプチドの数を低減させ免疫原性リスクを低減させることに成功した。また、同時に高濃度における安定性を向上させることにも成功した。さらに本発明者らは、TOCILIZUMABの定常領域において、新しいT-cellエピトープペプチドの出現を最小限にしつつ、Fcγレセプターに結合を示さず、酸性条件下での安定性、ヒンジ領域のジスルフィドに由来するヘテロジェニティー、H鎖C末端に由来するヘテロジェニティー、高濃度製剤における安定性を改善させた新規な定常領域配列を見出すことに成功した。これらCDR領域アミノ酸配列の改変、可変領域アミノ酸配列の改変、定常領域アミノ酸配列の改変を組み合わせることでTOCILIZUMABより優れた第2世代の分子の創製に成功した。
本発明は、ヒト化抗IL-6レセプターIgG1抗体であるTOCILIZUMABの可変領域および定常領域のアミノ酸配列の改変により、より優れた抗原（IL-6レセプター）への結合能を有し、より優れた血漿中滞留性を有し、より優れた安全性・免疫原性リスク・物性（安定性、均一性）を有するヒト化抗IL-6レセプターIgG抗体からなる医薬組成物、並びに、それらの医薬組成物の製造方法に関する。より具体的には、下記〔１〕〜〔４１〕を提供するものである。
〔１〕以下の(a)〜(y)いずれかに記載の抗IL-6レセプター抗体；
(a) 配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１番目のSerが他のアミノ酸に置換されているCDR1を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(b) 配列番号：１に記載のアミノ酸配列において5番目のTrpが他のアミノ酸に置換されているCDR1を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(c) 配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１番目のTyrが他のアミノ酸に置換されているCDR2を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(d) 配列番号：２に記載のアミノ酸配列において８番目のThrが他のアミノ酸に置換されているCDR2を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(e) 配列番号：２に記載のアミノ酸配列において９番目のThrが他のアミノ酸に置換されているCDR2を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(f) 配列番号：３に記載のアミノ酸配列において１番目のSerが他のアミノ酸に置換されているCDR3を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(g) 配列番号：３に記載のアミノ酸配列において２番目のLeuが他のアミノ酸に置換されているCDR3を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(h) 配列番号：３に記載のアミノ酸配列において５番目のThrが他のアミノ酸に置換されているCDR3を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(i) 配列番号：３に記載のアミノ酸配列において７番目のAlaが他のアミノ酸に置換されているCDR3を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(j) 配列番号：３に記載のアミノ酸配列において８番目のMetが他のアミノ酸に置換されているCDR3を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(k) 配列番号：３に記載のアミノ酸配列において１番目のSerおよび５番目のThrが他のアミノ酸に置換されているCDR3を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(l) 配列番号：３に記載のアミノ酸配列において２番目のLeu、７番目のAlaおよび８番目のMetが他のアミノ酸に置換されているCDR3を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(m) 配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１番目のArgが他のアミノ酸に置換されているCDR1を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(n) 配列番号：４に記載のアミノ酸配列において４番目のGlnが他のアミノ酸に置換されているCDR1を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(o) 配列番号：４に記載のアミノ酸配列において９番目のTyrが他のアミノ酸に置換されているCDR1を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(p) 配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１１番目のAsnが他のアミノ酸に置換されているCDR1を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(q) 配列番号：５に記載のアミノ酸配列において２番目のThrが他のアミノ酸に置換されているCDR2を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(r) 配列番号：６に記載のアミノ酸配列において１番目のGlnが他のアミノ酸に置換されているCDR3を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(s) 配列番号：６に記載のアミノ酸配列において３番目のGlyが他のアミノ酸に置換されているCDR3を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(t) 配列番号：４に記載のアミノ酸配列において９番目のTyrが他のアミノ酸に置換されているCDR1及び配列番号：６に記載のアミノ酸配列において３番目のGlyが他のアミノ酸に置換されているCDR3を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(u) 配列番号：６に記載のアミノ酸配列において5番目のThrが他のアミノ酸に置換されているCDR3を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(v) 配列番号：６に記載のアミノ酸配列において１番目のGlnおよび５番目のThrが他のアミノ酸に置換されているCDR3を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(w) 配列番号：２に記載のアミノ酸配列において９番目のThrが他のアミノ酸に置換されているCDR2、および配列番号：３に記載のアミノ酸配列において１番目のSerおよび５番目のThrが他のアミノ酸に置換されているCDR3を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(x) (k)に記載の重鎖可変領域および(v)に記載の軽鎖可変領域を含む抗体、又は
(y) (e)のCDR2をさらに含む(x)に記載の抗体、
〔２〕配列番号：５に記載のアミノ酸配列において２番目のThrが他のアミノ酸に置換されているCDR2を有する軽鎖可変領域を含む抗IL-6レセプター抗体、
〔３〕以下の(a)〜(y)いずれかに記載の抗IL-6レセプター抗体；
(a) 配列番号：７に記載のアミノ酸配列において１３番目のArgが他のアミノ酸に置換されたFR1を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(b) 配列番号：７に記載のアミノ酸配列において１６番目のGlnが他のアミノ酸に置換されたFR1を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(c) 配列番号：７に記載のアミノ酸破裂において２３番目のThrが他のアミノ酸に置換されたFR1を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(d) 配列番号：７に記載のアミノ酸配列において３０番目のThrが他のアミノ酸に置換されたFR1を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(e) 配列番号：７に記載のアミノ酸配列において１３番目のArg、１６番目のGln、２３番目のThrおよび３０番目のThrが他のアミノ酸に置換されたFR1を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(f) 配列番号：８に記載のアミノ酸配列において８番目のArgが他のアミノ酸に置換されたFR2を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(g) 配列番号：９に記載のアミノ酸配列において４番目のMetが他のアミノ酸に置換されたFR3を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(h) 配列番号：９に記載のアミノ酸配列において５番目のLeuが他のアミノ酸に置換されたFR3を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(i) 配列番号：９に記載のアミノ酸配列において１６番目のArgが他のアミノ酸に置換されたFR3を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(j) 配列番号：９に記載のアミノ酸配列において２７番目のValが他のアミノ酸に置換されたFR3を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(k) 配列番号：９に記載のアミノ酸配列において４番目のMet、５番目のLeu、１６番目のArgおよび２７番目のValが他のアミノ酸に置換されたFR3を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(l) 配列番号：１０に記載のアミノ酸配列において３番目のGlnが他のアミノ酸に置換されたFR4を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(m) 配列番号：１１に記載のアミノ酸配列において１８番目のArgが他のアミノ酸に置換されたFR1を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(n) 配列番号：１２に記載のアミノ酸配列において１１番目のLysが他のアミノ酸に置換されたFR2を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(o) 配列番号：１３に記載のアミノ酸配列において２３番目のGlnが他のアミノ酸に置換されたFR3を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(p) 配列番号：１３に記載のアミノ酸配列において２４番目のProが他のアミノ酸に置換されたFR3を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(q) 配列番号：１３に記載のアミノ酸配列において２７番目のIleが他のアミノ酸に置換されたFR3を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(r) 配列番号：１３に記載のアミノ酸配列において２３番目のGln、２４番目のProおよび２７番目のIleが他のアミノ酸に置換されたFR3を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(s) 配列番号：１４に記載のアミノ酸配列において１０番目のLysが他のアミノ酸に置換されたFR4を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(t) 配列番号：１０に記載のアミノ酸配列において５番目のSerが他のアミノ酸に置換されたFR4を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(u) 配列番号：１０に記載のアミノ酸配列において３番目のGlnおよび５番目のSerが他のアミノ酸に置換されたFR4を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(v) 配列番号：１８４に記載のアミノ酸配列を有するFR3を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(w) (e)に記載のFR1、(f)に記載のFR2、(k)に記載のFR3および(l)または(u)に記載のFR4を含む重鎖可変領域を含む抗体、
(x) (m)に記載のFR1、(n)に記載のFR2、(r)に記載のFR3および(s)に記載のFR4を含む軽鎖可変領域を含む抗体、又は
(y) (w)に記載の重鎖可変領域、および、(x)に記載の軽鎖可変領域を含む抗体、
〔４〕以下の(a)〜(l)いずれかに記載の抗IL-6レセプター抗体；
(a) 配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１番目のSerが他のアミノ酸に置換されたCDR1を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(b) 配列番号：２に記載のアミノ酸配列において９番目のThrが他のアミノ酸に置換されたCDR2を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(c) 配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１６番目のSerが他のアミノ酸に置換されたCDR2を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(d) 配列番号：２に記載のアミノ酸配列において９番目のThrおよび１６番目のSerが他のアミノ酸に置換されたCDR2を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(e) 配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１番目のArgが他のアミノ酸に置換されたCDR1を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(f) 配列番号：５に記載のアミノ酸配列において２番目のThrが他のアミノ酸に置換されたCDR2を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(g) 配列番号：５に記載のアミノ酸配列において４番目のArgが他のアミノ酸に置換されたCDR2を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(h) 配列番号：５に記載のアミノ酸配列において２番目のThrおよび４番目のArgが他のアミノ酸に置換されたCDR2を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(i) 配列番号：６に記載のアミノ酸配列において５番目のThrが他のアミノ酸に置換されたCDR3を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(j) (a)に記載のCDR1、(d)に記載のCDR2および配列番号：３に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体、
(k) (e)に記載のCDR1、(h)に記載のCDR2および(i)に記載のCDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体、又は
(l) (j)に記載の重鎖可変領域、および、(k)に記載の軽鎖可変領域を含む抗体、
〔５〕以下の(a)〜(f)いずれかに記載の抗IL-6レセプター抗体；
(a) 配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１番目のSerが他のアミノ酸配列に置換されたCDR1、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において９番目のThrおよび１６番目のSerが他のアミノ酸に置換されたCDR2、および配列番号：３に記載のアミノ酸配列において１番目のSerおよび５番目のThrが他のアミノ酸に置換されたCDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体、
(b) 配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１番目のArgが他のアミノ酸に置換されたCDR1、配列番号：５に記載のアミノ酸配列において２番目のThrおよび４番目のArgが他のアミノ酸に置換されたCDR2、および配列番号：６に記載のアミノ酸配列において１番目のGlnおよび５番目のThrが他のアミノ酸に置換されたCDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体、
(c) 配列番号：２２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(d) 配列番号：２３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(e) (a)に記載の重鎖可変領域および(b)に記載の軽鎖可変領域を含む抗体、
又は
(f) (c)に記載の重鎖可変領域および(d)に記載の軽鎖可変領域を含む抗体、
〔６〕以下の(a)〜(c)いずれかに記載のヒト抗体定常領域；
(a) 配列番号：１９に記載のアミノ酸配列において、３２９番目（EUナンバリング446番目）のGlyと３３０番目（EUナンバリング447番目）のLysが両方欠損していることを特徴とする、ヒト抗体定常領域、
(b) 配列番号：２０に記載のアミノ酸配列において、３２５番目（EUナンバリング446番目）のGlyと３２６番目（EUナンバリング447番目）のLysが両方欠損していることを特徴とする、ヒト抗体定常領域、
(c) 配列番号：２１に記載のアミノ酸配列において、３２６番目（EUナンバリング446番目）のGlyと３２７番目（EUナンバリング447番目）のLysが両方欠損していることを特徴とする、ヒト抗体定常領域、
〔７〕配列番号：２０に記載のアミノ酸配列において、２０９番目（EUナンバリング330番目）、２１０番目（EUナンバリング331番目）および２１８番目（EUナンバリング339番目）のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたIgG2定常領域、
〔８〕配列番号：２０に記載のアミノ酸配列において、２７６番目（EUナンバリング397番目）のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたIgG2定常領域、
〔９〕配列番号：２０に記載のアミノ酸配列において、１４番目（EUナンバリング131番目）、１０２番目（EUナンバリング219番目）、および／または１６番目（EUナンバリング133番目）のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたIgG2定常領域、
〔１０〕配列番号：２０に記載のアミノ酸配列において、２０番目（EUナンバリング137番目）および２１番目（EUナンバリング138番目）のアミノ酸がさらに他のアミノ酸に置換されていることを特徴とする、〔９〕に記載のIgG2定常領域、
〔１１〕配列番号：２０に記載のアミノ酸配列において、１４７番目（EUナンバリングの２６８番目）のHis、２３４番目（EUナンバリングの３５５番目）のArgおよび／または２９８番目（EUナンバリングの４１９番目）のGlnが他のアミノ酸に置換されたIgG2定常領域、
〔１２〕配列番号：２０に記載のアミノ酸配列において、２０９番目（EUナンバリング330番目）、２１０番目（EUナンバリング331番目）、２１８番目（EUナンバリング339番目）、２７６番目（EUナンバリング397番目）、１４番目（EUナンバリング131番目）、１６番目（EUナンバリング133番目）、１０２番目（EUナンバリング219番目）、２０番目（EUナンバリング137番目）および２１番目（EUナンバリング138番目）のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有するIgG2定常領域、
〔１３〕〔１２〕に記載のIgG2定常領域において、さらに３２５番目（EUナンバリング446番目）のGlyおよび３２６番目（EUナンバリング447番目）のLysが欠損したアミノ酸配列を有するIgG2定常領域、
〔１４〕配列番号：２０に記載のアミノ酸配列において、２７６番目（EUナンバリング397番目）、１４番目（EUナンバリング131番目）、１６番目（EUナンバリング133番目）、１０２番目（EUナンバリング219番目）、２０番目（EUナンバリング137番目）および２１番目（EUナンバリング138番目）のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有するIgG2定常領域、
〔１５〕〔１４〕に記載のIgG2定常領域において、さらに３２５番目（EUナンバリング446番目）のGlyおよび３２６番目（EUナンバリング447番目）のLysが欠損したアミノ酸配列を有するIgG2定常領域、
〔１６〕配列番号：２０に記載のアミノ酸配列において、１４番目（EUナンバリング１３１番目）のCys、１６番目（EUナンバリング１３３番目）のArg、１０２番目（EUナンバリング２１９番目）のCys、２０番目の（EUナンバリング１３７番目）のGlu、２１番目（EUナンバリング１３８番目）のSer、１４７番目（EUナンバリング２６８番目）のHis、２３４番目（EUナンバリング３５５番目）のArgおよび２９８番目（EUナンバリング４１９番目）のGlnが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有するIgG2定常領域、
〔１７〕〔１６〕に記載のIgG2定常領域において、さらに３２５番目（EUナンバリング４４６番目）のGlyおよび３２６番目（EUナンバリング４４７番目）のLysが欠損したアミノ酸配列を有するIgG2定常領域、
〔１８〕配列番号：２０に記載のアミノ酸配列において、１４番目（EUナンバリング１３１番目）のCys、１６番目（EUナンバリング１３３番目）のArg、１０２番目（EUナンバリング２１９番目）のCys、２０番目の（EUナンバリング１３７番目）のGlu、２１番目（EUナンバリング１３８番目）のSer、１４７番目（EUナンバリング２６８番目）のHis、２３４番目（EUナンバリング３５５番目）のArg、２９８番目（EUナンバリング４１９番目）のGln、および３１３番目（EUナンバリング４３４番目）のAsnが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有するIgG2定常領域、
〔１９〕〔１８〕に記載のIgG2定常領域において、さらに３２５番目（EUナンバリング４４６番目）のGlyおよび３２６番目（EUナンバリング４４７番目）のLysが欠損したアミノ酸配列を有するIgG2定常領域、
〔２０〕配列番号：２１に記載のアミノ酸配列において、２８９番目（EUナンバリング409番目）のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されていることを特徴とするIgG4定常領域、
〔２１〕配列番号：２１に記載のアミノ酸配列において、２８９番目（EUナンバリング409番目）、１４番目、１６番目、２０番目、２１番目、９７番目、１００番目、１０２番目、１０３番目、１０４番目および１０５番目（EUナンバリング131,133,137,138,214,217,219,220,221,222番目）、１１３番目、１１４番目および１１５番目（EUナンバリング233,234,235番目）のアミノ酸が他のアミノ酸に置換され、かつ116番目（EUナンバリング236番目）のアミノ酸が欠損したアミノ酸配列を有するIgG4定常領域、
〔２２〕〔２１〕に記載のIgG4定常領域において、さらに３２６番目（EUナンバリング446番目）のGlyと３２７番目（EUナンバリング447番目）のLysが欠失したIgG4定常領域、
〔２３〕配列番号：２０に記載のアミノ酸配列において、２０９番目（EUナンバリングの330番目）のAla、２１０番目（EUナンバリングの331番目）のPro、２１８番目（EUナンバリングの339番目）のThr、１４番目（EUナンバリングの131番目）のCys、１６番目（EUナンバリングの133番目）のArg、１０２番目（EUナンバリングの219番目）のCys、２０番目（EUナンバリングの137番目）のGlu、２１番目（EUナンバリングの138番目）のSerが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有するIgG2定常領域、
〔２４〕〔２３〕に記載のIgG2定常領域において、さらに３２５番目（EUナンバリング446番目）のGlyおよび３２６番目（EUナンバリング447番目）のLysが欠損したアミノ酸配列を有するIgG2定常領域、
〔２５〕配列番号：２０に記載のアミノ酸配列において、１４番目（EUナンバリング１３１）のCys、１６番目（EUナンバリング１３３）のArg、１０２番目（EUナンバリング２１９）のCys、２０番目（EUナンバリング１３７）のGlu、２１番目の（EUナンバリング１３８）のSerが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有するIgG2定常領域、
〔２６〕〔２５〕に記載のIgG2定常領域において、さらに３２５番目（EUナンバリング446番目）のGlyおよび３２６番目（EUナンバリング447番目）のLysが欠損したアミノ酸配列を有するIgG2定常領域、
〔２７〕配列番号：２４に記載のアミノ酸配列を有する定常領域、
〔２８〕配列番号：１１８に記載のアミノ酸配列を有する定常領域、
〔２９〕配列番号：２５に記載のアミノ酸配列を有する定常領域、
〔３０〕配列番号：１５１に記載のアミノ酸配列を有する定常領域、
〔３１〕配列番号：１５２に記載のアミノ酸配列を有する定常領域、
〔３２〕配列番号：１５３に記載のアミノ酸配列を有する定常領域、
〔３３〕配列番号：１６４に記載のアミノ酸配列を有する定常領域、
〔３４〕配列番号：１９４（M40ΔGK）に記載のアミノ酸配列を有するヒト抗体定常領域、
〔３５〕配列番号：１９２（M86ΔGK）に記載のアミノ酸配列を有するヒト抗体定常領域、
〔３６〕〔６〕〜〔３５〕のいずれかに記載の定常領域を有する抗体、
〔３７〕IL-6レセプターに結合することを特徴とする、〔３６〕に記載の抗体、
〔３８〕IL-6レセプターへの結合活性が1nM以下である抗ヒトIL-6受容体抗体、
〔３９〕全長抗体の実測等電点が7.0以下または可変領域の理論等電点が5.0以下である抗ヒトIL-6レセプター抗体、
〔４０〕20mM Histidine-HCl, 150mM NaCl, pH6.5〜7.0の緩衝液下で抗体濃度が100mg/mLである条件下において、25℃で1ヶ月経過後の抗体の会合体比率の増加が0.3%以下であることを特徴とする抗IL-6レセプター抗体、
〔４１〕〔３６〕〜〔４０〕のいずれかに記載の抗体を含む医薬組成物。
WTと RD_6 のBaF/gp130中和活性を示すグラフである。 rhIL-s6R (R&D systems) と WT の相互作用のセンサーグラムを示すグラフである。 rhIL-s6R (R&D systems) と RD_6 の相互作用のセンサーグラムを示すグラフである。 WTと比較してアフィニティー・中和活性が向上するCDR変異のリストを示す図である。 図４−１の続きを示す図である。 組み合わせによりアフィニティー・中和活性が向上するCDR変異のリストを示す図である。 WTと RDC23 のBaF/gp130中和活性を示すグラフである。 rhIL-s6R (R&D systems) と RDC23 の相互作用のセンサーグラムを示すグラフである。 rhsIL-6Rと WT の相互作用のセンサーグラムを示すグラフである。 rhsIL-6Rと RDC23 の相互作用のセンサーグラムを示すグラフである。 SR344 と WT の相互作用のセンサーグラムを示すグラフである。 SR344 と RDC23 の相互作用のセンサーグラムを示すグラフである。 WTと H53L28 のBaF/gp130中和活性を示すグラフである。 SR344 と H53/L28 の相互作用のセンサーグラムを示すグラフである。 WT、H53/L28をマウスに静脈内投与後の血漿中濃度推移を示したグラフである。 WT、H53/L28をマウスに皮下投与後の血漿中濃度推移を示したグラフである。 WTと PF1のBaF/gp130中和活性を示すグラフである。 SR344 と PF1 の相互作用のセンサーグラムを示すグラフである。 WT、PF1の高濃度安定性試験結果を示すグラフである。 WT、PF1をヒトIL-6レセプタートランスジェニックマウスに静脈内投与後の血漿中濃度推移を示すグラフである。 WT、PF1をヒトIL-6レセプタートランスジェニックマウスに静脈内投与後の非結合型のヒト可溶型IL-6レセプター濃度推移を示したグラフである。 塩酸溶出法により精製したWT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4、IgG2-M397V、IgG4-R409Kのゲルろ過クロマトグラフィーによる会合体含量の分析結果を示すグラフである。 WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4の陽イオン交換クロマトグラフィー（IEC）分析結果を示す図である。 WT-IgG2のヒンジ領域の推定ジスルフィド結合様式を示す図である。 WT-IgG2-SKSCのヒンジ領域の推定ジスルフィド結合様式を示す図である。 WT-IgG2とIgG2-SKSCの陽イオン交換クロマトグラフィー（IEC）分析結果を示す図である。 ヒト化PM1抗体、H鎖C末端ΔK抗体、H鎖C末端ΔGK抗体の陽イオン交換クロマトグラフィー（IEC）分析結果を示す図である。 WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4、WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGKの FcγRI に対する結合量の比較を示す図である。 WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4、WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGKの FcγRIIa に対する結合量の比較を示すグラフである。 WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4、WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGKの FcγRIIb に対する結合量の比較を示すグラフである。 WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4、WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGKの FcγRIIIa (Val) に対する結合量の比較を示すグラフである。 WT-IgG1、WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGKの高濃度安定性試験における会合体増加量を示すグラフである。 WT-IgG1、WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGKの高濃度安定性試験におけるFab断片増加量を示すグラフである。 WT-IgG2とWT-M14ΔGKとWT-M31ΔGKの陽イオン交換クロマトグラフィー（IEC）分析結果を示す図である。 WTとF2H/L39-IgG1のBaF/gp130中和活性を示すグラフである。 カニクイザルにおいてWTとＰＦ１とF2H/L39-IgG1を1.0mg/kg皮下投与した時の抗体血漿中濃度推移を示すグラフである。 カニクイザルにおけるWTとF2H/L39-IgG1投与群のCRP濃度推移を示すグラフである。 カニクイザルにおけるWTとF2H/L39-IgG1投与群の非結合型カニクイザルIL-6レセプター濃度推移を示すグラフである。 WT-IgG1およびWT-M14をヒトFcRnトランスジェニックマウスに静脈内投与後の血漿中濃度推移を示したグラフである。 WT-IgG1、WT-M14およびWT-M58をヒトFcRnトランスジェニックマウスに静脈内投与後の血漿中濃度推移を示したグラフである。 WT-IgG1、WT-M44、WT-M58、WT-M73のヒトFcRnトランスジェニックマウスに静脈内投与後の血漿中濃度推移を示したグラフである。 抗IL-6レセプター抗体WT、抗IL-6レセプター抗体F2H/L39、抗IL-31レセプター抗体Ｈ０Ｌ０、抗RANKL抗体であるDNSの定常領域の及ぼすヘテロジェニティーへの影響を陽イオン交換クロマトグラフィーにより評価した図である。 抗IL-6レセプター抗体WT、抗IL-6レセプター抗体F2H/L39のCH1ドメインのシステインの及ぼすヘテロジェニティーへの影響を陽イオン交換クロマトグラフィーにより評価した図である。 抗IL-6レセプター抗体WTのCH1ドメインのシステインの及ぼす変性ピークへの影響をDSCにより評価した図である。 TOCILIZUMAB、コントロールおよびFv5-M83のBaF/gp130における中和活性を示すグラフである。 TOCILIZUMAB、Fv3-M73およびFv4-M73のBaF/gp130における中和活性を示すグラフである。 TOCILIZUMAB、コントロール、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83をカニクイザルに静脈内投与後の血漿中濃度推移を示したグラフである。 TOCILIZUMAB、コントロール、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83をカニクイザルに静脈内投与後のCRP濃度推移を示したグラフである。 TOCILIZUMAB、コントロール、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83をカニクイザルに静脈内投与後の可溶型IL-6レセプターの中和率の推移を示したグラフである。
〔発明の実施の形態〕
本発明は、ヒト化抗IL-6レセプターIgG1抗体であるTOCILIZUMABの可変領域および定常領域のアミノ酸配列を改変することで、薬効を増強させつつ、薬物動態を向上させることで投与頻度を少なくし持続的に治療効果を発揮し、且つ、免疫原性、安全性、物性を改善させ、TOCILIZUMABより優れた第2世代の分子からなる医薬組成物、並びに、それらの医薬組成物の製造方法を提供する。さらに本発明は、医薬品として用いるのに適した抗体定常領域を提供する。
本発明は優れた抗原結合活性、中和活性、血漿中滞留性、安定性および／または均一性を有し、免疫原性リスクを低減させた抗IL-6レセプター抗体に関する。
好ましくは、抗IL-6レセプター抗体はヒト化PM-1抗体（TOCILIZUMAB）である。より具体的には本発明は、アミノ酸置換により抗原結合活性が増強したヒト化PM-1抗体、中和活性が増強したヒト化PM-1抗体、薬物動態が向上したヒト化PM-1抗体、免疫原性リスクが低下したヒト化PM-1抗体、安定性が向上したヒト化PM-1抗体、及び均一性が向上したヒト化PM-1抗体を提供する。
ヒト化PM-1抗体はヒトIL-6レセプターに結合し、ヒトIL-6とヒトIL-6レセプターの結合を阻害する。本明細書において、ヒト化PM-1抗体のアミノ酸配列と配列表の配列番号の対応は以下の通りである。
重鎖アミノ酸配列 配列番号：１５
軽鎖アミノ酸配列 配列番号：１６
重鎖可変領域のアミノ酸配列 配列番号：１７
軽鎖可変領域のアミノ酸配列 配列番号：１８
重鎖CDR1(HCDR1)のアミノ酸配列 配列番号：１
重鎖CDR2(HCDR2)のアミノ酸配列 配列番号：２
重鎖CDR3(HCDR3)のアミノ酸配列 配列番号：３
重鎖FR1（HFR1）のアミノ酸配列 配列番号：７
重鎖FR2（HFR2）のアミノ酸配列 配列番号：８
重鎖FR3（HFR3）のアミノ酸配列 配列番号：９
重鎖FR4（HFR4）のアミノ酸配列 配列番号：１０
軽鎖CDR1（LCDR1）のアミノ酸配列を配列番号：４
軽鎖CDR2（LCDR2）のアミノ酸配列を配列番号：５
軽鎖CDR3（LCDR3）のアミノ酸配列を配列番号：６
軽鎖FR1（LFR1）のアミノ酸配列を配列番号：１１
軽鎖FR2（LFR2）のアミノ酸配列を配列番号：１２
軽鎖FR3（LFR3）のアミノ酸配列を配列番号：１３
軽鎖FR4（LFR4）のアミノ酸配列を配列番号：１４
<アフィニティー・中和活性増強抗体>
本発明はヒトIL-6レセプターに対する結合活性および／または中和活性が高い抗ヒトIL-6レセプター抗体を提供する。より具体的には、本発明は以下(a)〜(y)に記載の抗体、及び該抗体の製造方法を提供する。
(a) 配列番号：１に記載のアミノ酸配列（HCDR1）において１番目のSerが他のアミノ酸に置換された重鎖CDR1を有する抗ヒトIL-6レセプター抗体。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、Trp（RD_68）、Thr（RD_37）、Asp（RD_8）、Asn（RD_11）、Arg（RD_31）、Val（RD_32）、Phe（RD_33）、Ala（RD_34）、Gln（RD_35）、Tyr（RD_36）、Leu（RD_38）、His（RD_42）、Glu（RD_45）またはCys（RD_46）への置換が好ましい。
配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１番目のSerがTrpへ置換された配列を配列番号：２６に示す。
配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１番目のSerがThrへ置換された配列を配列番号：２７に示す。
配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１番目のSerがAspへ置換された配列を配列番号：２８に示す。
配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１番目のSerがAsnへ置換された配列を配列番号：２９に示す。
配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１番目のSerがArgへ置換された配列を配列番号：３０に示す。
配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１番目のSerがValへ置換された配列を配列番号：３１に示す。
配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１番目のSerがPheへ置換された配列を配列番号：３２に示す。
配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１番目のSerがAlaへ置換された配列を配列番号：３３に示す。
配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１番目のSerがGlnへ置換された配列を配列番号：３４に示す。
配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１番目のSerがTyrへ置換された配列を配列番号：３５に示す。
配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１番目のSerがLeuへ置換された配列を配列番号：３６に示す。
配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１番目のSerがHisへ置換された配列を配列番号：３７に示す。
配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１番目のSerがGluへ置換された配列を配列番号：３８に示す。
配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１番目のSerがCysへ置換された配列を配列番号：３９に示す。
(b) 配列番号：１に記載のアミノ酸配列（HCDR1）において５番目のTrpが他のアミノ酸に置換された重鎖CDR1を有する抗ヒトIL-6レセプター抗体。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、Ile（RD_9）またはVal（RD_30）への置換が好ましい。
配列番号：１に記載のアミノ酸配列において５番目のTrpがIleへ置換された配列を配列番号：４０に示す。
配列番号：１に記載のアミノ酸配列において５番目のTrpがValへ置換された配列を配列番号：４１に示す。
(c) 配列番号：２に記載のアミノ酸配列（HCDR2）において１番目のTyrが他のアミノ酸に置換された重鎖CDR2を有する抗ヒトIL-6レセプター抗体。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、Phe(RD_82)への置換が好ましい。
配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１番目のTyrがPheへ置換された配列を配列番号：４２に示す。
(d) 配列番号：２に記載のアミノ酸配列（HCDR2）において８番目のThrが他のアミノ酸に置換された重鎖CDR2を有する抗ヒトIL-6レセプター抗体。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、Arg(RD_79)への置換が好ましい。
配列番号：２に記載のアミノ酸配列において８番目のThrがArgへ置換された配列を配列番号：４３に示す。
(e) 配列番号：２に記載のアミノ酸配列（HCDR2）において９番目のThrが他のアミノ酸に置換された重鎖CDR2を有する抗ヒトIL-6レセプター抗体。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、Ser(RD_12)又はAsn(RD_61)への置換が好ましい。
配列番号：２に記載のアミノ酸配列において９番目のThrがSerへ置換された配列を配列番号：４４に示す。
配列番号：２に記載のアミノ酸配列において９番目のThrがAsnへ置換された配列を配列番号：４５に示す。
(f) 配列番号：３に記載のアミノ酸配列（HCDR3）において１番目のSerが他のアミノ酸に置換された重鎖CDR3を有する抗ヒトIL-6レセプター抗体。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、Ile(RD_2)、Val(RD_4)、Thr(RD_80)又はLeu（RD_5）への置換が好ましい。
配列番号：３に記載のアミノ酸配列において１番目のSerがIleへ置換された配列を配列番号：４６に示す。
配列番号：３に記載のアミノ酸配列において１番目のSerがValへ置換された配列を配列番号：４７に示す。
配列番号：３に記載のアミノ酸配列において１番目のSerがThrへ置換された配列を配列番号：４８に示す。
配列番号：３に記載のアミノ酸配列において１番目のSerがLeuへ置換された配列を配列番号：４９に示す。
(g) 配列番号：３に記載のアミノ酸配列（HCDR3）において２番目のLeuが他のアミノ酸に置換された重鎖CDR3を有する抗ヒトIL-6レセプター抗体。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、Thr(RD_84)への置換が好ましい。
配列番号：３に記載のアミノ酸配列において２番目のLeuがThrへ置換された配列を配列番号：５０に示す。
(h) 配列番号：３に記載のアミノ酸配列（HCDR3）において５番目のThrが他のアミノ酸に置換された重鎖CDR3を有する抗ヒトIL-6レセプター抗体。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、Ala(RD_3)又はIle(RD_83)への置換が好ましい。他の好ましい置換としては5番目のThrのSer(RDC_14H)への置換が挙げられる。
配列番号：３に記載のアミノ酸配列において５番目のThrがAlaへ置換された配列を配列番号：５１に示す。
配列番号：３に記載のアミノ酸配列において５番目のThrがIleへ置換された配列を配列番号：５２に示す。
配列番号：３に記載のアミノ酸配列において５番目のThrがSerへ置換された配列を配列番号：５３に示す。
(i) 配列番号：３に記載のアミノ酸配列（HCDR3）において７番目のAlaが他のアミノ酸に置換された重鎖CDR3を有する抗ヒトIL-6レセプター抗体。
置換後のアミノ酸配列は特に限定されないがSer(RD_81)又はVal(PF_3H)への置換が好ましい。
配列番号：３に記載のアミノ酸配列において７番目のAlaがSerへ置換された配列を配列番号：５４に示す。
配列番号：３に記載のアミノ酸配列において7番目のAlaがValへ置換された配列を配列番号：５５に示す。
(j) 配列番号：３に記載のアミノ酸配列（HCDR3）において８番目のMetが他のアミノ酸に置換された重鎖CDR3を有する抗ヒトIL-6受容体抗体。
置換後のアミノ酸配列は特に限定されないがLeu(PF_4H)への置換が好ましい。
配列番号：３に記載のアミノ酸配列において８番目のMetがLeuへ置換された配列を配列番号：５６に示す。
(k) 配列番号：３に記載のアミノ酸配列（HCDR3）において１番目のSerおよび５番目のThrが他のアミノ酸に置換された重鎖CDR3を有する抗ヒトIL-6レセプター抗体。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、1番目のSerをLeuに、５番目のThrをAlaに置換することが好ましい(RD_6)。又、他の好ましい置換として、１番目のSerのValへの置換及び5番目のThrのAlaへの置換(RDC_2H)、１番目のSerのIleへの置換及び5番目のThrのへAlaの置換(RDC_3H)、１番目のSerのThrへの置換及び5番目のThrのAlaへの置換(RDC_4H)、１番目のSerのValへの置換及び5番目のThrのIleへの置換(RDC_5H)、１番目のSerのIleへの置換及び5番目のThrのIleへの置換(RDC_6H)、１番目のSerのThrへの置換及び5番目のThrのIleへの置換(RDC_7H)、または１番目のSerのLeuへの置換及び5番目のThrのIleへの置換(RDC_8H)を挙げることができる。
配列番号：３に記載のアミノ酸配列において1番目のSerがLeuに、５番目のThrがAlaに置換された配列を配列番号：５７に示す。
配列番号：３に記載のアミノ酸配列において1番目のSerがValに、５番目のThrがAlaに置換された配列を配列番号：５８に示す。
配列番号：３に記載のアミノ酸配列において1番目のSerがIleに、５番目のThrがAlaに置換された配列を配列番号：５９に示す。
配列番号：３に記載のアミノ酸配列において1番目のSerがThrに、５番目のThrがAlaに置換された配列を配列番号：６０に示す。
配列番号：３に記載のアミノ酸配列において1番目のSerがValに、５番目のThrがIleに置換された配列を配列番号：６１に示す。
配列番号：３に記載のアミノ酸配列において1番目のSerがIleに、５番目のThrがIleに置換された配列を配列番号：６２に示す。
配列番号：３に記載のアミノ酸配列において1番目のSerがThrに、５番目のThrがIleに置換された配列を配列番号：６３に示す。
配列番号：３に記載のアミノ酸配列において1番目のSerがLeuに、５番目のThrがIleに置換された配列を配列番号：６４に示す。
(l) 配列番号：３に記載のアミノ酸配列（HCDR3）において２番目のLeu、７番目のAlaおよび８番目のMetが他のアミノ酸に置換された重鎖CDR3を有する抗ヒトIL-6レセプター抗体。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、2番目のLeuをThrに、7番目のAlaをValに、8番目のMetをLeuに置換することが好ましい(RD_78)。
配列番号：３に記載のアミノ酸配列において2番目のLeuがThrに、7番目のAlaがValに、8番目のMetがLeuに置換された配列を配列番号：６５に示す。
(m) 配列番号：４に記載のアミノ酸配列（LCDR1）において１番目のArgが他のアミノ酸に置換された軽鎖CDR1を有する抗ヒトIL-6レセプター抗体。
置換後のアミノ酸配列は特に限定されないがPhe(RD_18)への置換が好ましい。
配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１番目のArgがPheに置換された配列を配列番号：６６に示す。
(n) 配列番号：４に記載のアミノ酸配列（LCDR1）において４番目のGlnが他のアミノ酸に置換された軽鎖CDR1を有する抗ヒトIL-6レセプター抗体。
置換後のアミノ酸配列は特に限定されないがArg(RD_26)またはThr(RD_20)への置換が好ましい。
配列番号：４に記載のアミノ酸配列において４番目のGlnがArgに置換された配列を配列番号：６７に示す。
配列番号：４に記載のアミノ酸配列において４番目のGlnがThrに置換された配列を配列番号：６８に示す。
(o) 配列番号：４に記載のアミノ酸配列（LCDR1）において９番目のTyrが他のアミノ酸に置換された軽鎖CDR1を有する抗ヒトIL-6レセプター抗体。
置換後のアミノ酸は特に限定されないがPhe(RD_73)への置換が好ましい。
配列番号：４に記載のアミノ酸配列において９番目のTyrがPheに置換された配列を配列番号：６９に示す。
(p) 配列番号：４に記載のアミノ酸配列（LCDR1）において１１番目のAsnが他のアミノ酸に置換された軽鎖CDR1を有する抗ヒトIL-6レセプター抗体。
置換後のアミノ酸配列は特に限定されないがSer(RD_27)への置換が好ましい。
配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１１番目のAsnがSerに置換された配列を配列番号：７０に示す。
(q) 配列番号：５に記載のアミノ酸配列（LCDR2）において２番目のThrが他のアミノ酸に置換された軽鎖CDR2を有する抗ヒトIL-6レセプター抗体。
置換後のアミノ酸配列は特に限定されないがGlyへの置換が好ましい。
配列番号：５に記載のアミノ酸配列において２番目のThrがGlyに置換された配列を配列番号：７１に示す。
(r) 配列番号：６に記載のアミノ酸配列（LCDR3）において１番目のGlnが他のアミノ酸に置換された軽鎖CDR3を有する抗ヒトIL-6レセプター抗体。
置換後のアミノ酸配列は特に限定されないがGly(RD_28)、Asn(RD_29)またはSer(RDC_15L)への置換が好ましい。
配列番号：６に記載のアミノ酸配列において１番目のGlnがGlyに置換された配列を配列番号：７２に示す。
配列番号：６に記載のアミノ酸配列において１番目のGlnがAsnに置換された配列を配列番号：７３に示す。
配列番号：６に記載のアミノ酸配列において１番目のGlnがSerに置換された配列を配列番号：７４に示す。
(s) 配列番号：６に記載のアミノ酸配列において３番目のGlyが他のアミノ酸に置換された軽鎖CDR3を有する抗ヒトIL-6レセプター抗体。
置換後のアミノ酸配列は特に限定されないがSerへの置換が好ましい。
配列番号：６に記載のアミノ酸配列において３番目のGlyがSerに置換された配列を配列番号：７５に示す。
(t) 配列番号：４に記載のアミノ酸配列（LCDR1）において９番目のTyrが他のアミノ酸に置換された軽鎖CDR1、かつ配列番号：６に記載のアミノ酸配列（LCDR3）において３番目のGlyが他のアミノ酸に置換された軽鎖CDR3を有する抗ヒトIL-6レセプター抗体。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、配列番号：４に記載のアミノ酸配列（LCDR1）における９番目のTyrはPheに置換されることが好ましく、配列番号：６に記載のアミノ酸配列（LCDR3）における３番目のGlyはSerに置換されることが好ましい(RD_72)。
(u) 配列番号：６に記載のアミノ酸配列（LCDR3）において5番目のThrが他のアミノ酸に置換された軽鎖CDR3を有する抗ヒトIL-6レセプター抗体。
置換後のアミノ酸は特に限定されないがArg(RD_23)またはSerへの置換が好ましい。
配列番号：６に記載のアミノ酸配列において5番目のThrがArgに置換された配列を配列番号：７６に示す。
配列番号：６に記載のアミノ酸配列において５番目のThrがSerに置換された配列を配列番号：７７に示す。
(v) 配列番号：６に記載のアミノ酸配列（LCDR3）において１番目のGlnおよび５番目のThrが他のアミノ酸に置換された軽鎖CDR3を有する抗IL-6レセプター抗体。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが1番目のGlnをGlyに、5番目のThrをSerに置換することが好ましい(RD_22)。又、他の好ましい置換として１番目のGlnのGlyへの置換及び5番目のThrのArgへの置換を挙げることができる(RDC_11L)。
配列番号：６に記載のアミノ酸配列において１番目のGlnがGlyに、５番目のThrがSerに置換された配列を配列番号：７８に示す。
配列番号：６に記載のアミノ酸配列において１番目のGlnがGlyに、５番目のThrがArgに置換された配列を配列番号：７９に示す。
(w) 配列番号：２に記載のアミノ酸配列（HCDR2）において９番目のThrが他のアミノ酸に置換された重鎖CDR2、配列番号：３に記載のアミノ酸配列（HCDR3）において１番目のSerおよび５番目のThrが他のアミノ酸に置換された重鎖CDR3を含む抗IL-6レセプター抗体。
配列番号：２に記載のアミノ酸配列(HCDR2)における9番目のThrはAsnに置換されていることが好ましい。又、配列番号：３に記載のアミノ酸配列(HCDR3)における１番目のSerおよび5番目のThrの置換後のアミノ酸の好ましい組み合わせとして、LeuおよびAla(RDC_27H)、ValおよびAla(RDC_28H)、IleおよびAla(RDC_30H)、ThrおよびAla(RDC_4H)、ValおよびIle(RDC_29H)、IleおよびIle(RDC_32H)、ThrおよびIle(RDC_7H)、LeuおよびIle(RDC_8H)を挙げることができる。
(x) (k)に記載の重鎖CDR3を有する可変領域および(v)に記載の軽鎖CDR3を有する可変領域を含む抗体。
(y) (e)に記載の重鎖CDR2をさらに含む(x)に記載の抗体。
本発明は少なくとも上述の(a)〜(y)のいずれかに記載のアミノ酸置換を含む抗体及び該抗体の製造方法を提供する。従って本発明の抗体には、上述の(a)〜(y)のいずれかに記載のアミノ酸置換に加え、上述の(a)〜(y)に記載のアミノ酸置換以外のアミノ酸置換を含む抗体も含まれる。また本発明の抗体には、上述の(a)〜(y)のいずれかに記載のアミノ酸置換が複数組み合わされた抗体も含まれる。上述の(a)〜(y)に記載のアミノ酸置換としては、上述のCDRアミノ酸配列の他アミノ酸への置換が挙げられる。上述の(a)〜(y)に記載のアミノ酸置換以外のアミノ酸置換としては、例えば、他CDR部分のアミノ酸配列の置換、欠失、付加および／または挿入等が挙げられる。また、FRのアミノ酸配列の置換、欠失、付加および／または挿入等が挙げられる。また、定常領域のアミノ酸配列の置換、欠失、付加および／または挿入等が挙げられる。
また本発明の抗体には、本発明で見出された高アフィニティーCDRを、ヒト化PM-1抗体以外の如何なるフレームワークに移植した抗体も含まれる。また本発明の抗体には、本発明で見出された高アフィニティーCDRをヒト化PM-1抗体以外のフレームワークに移植した結果アフィニティーが低下した抗体において、元のアフィニティーの抗体を得るためにフレームワーク部分に変異が導入（例えば、Curr Opin Biotechnol. 1994 Aug;5(4):428-33参照）された抗体、および、元のアフィニティーの抗体を得るためにCDR部分に変異が導入（例えば、US2006/0122377参照）された抗体が含まれる。
本発明においては、上述の(a)〜(y)のいずれかに記載のアミノ酸置換は、ヒト化PM-1抗体に対して行うことが好ましい。ヒト化PM-1抗体において、上述の(a)〜(y)のいずれかに記載のアミノ酸置換が行われた抗体は、IL-6レセプターに対する高い中和活性を有する。ヒト化PM-1抗体において、上述の(a)〜(y)のいずれかに記載のアミノ酸置換が行われた抗体は、IL-6が関連する関節リウマチ等の炎症性疾患などの治療薬として有効である。
なお、上述の(a)〜(y)のいずれかに記載のアミノ酸置換を含む抗体は、例えば下記（１）又は（２）ように表現することも出来る。ここでは（a）の抗体を例に記載するが、(b)〜(y)の抗体についても同様に表現することが出来る。
（１）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１番目のSerが他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を有するCDR1を有する重鎖可変領域を含む抗体
（２）CDR1として、配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１番目のSerが他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体
<結合活性が増強した抗体>
本発明はさらにIL-6レセプターへの結合活性が高い抗IL-6レセプター抗体を提供する。本発明においてIL-6レセプターへの結合活性が高い抗IL-6レセプター抗体とは、通常、生理条件下、37℃において測定されるアフィニティーが1nM以下の抗体であり、好ましくはアフィニティーが0.1nM以下の抗体であり、さらに好ましくはアフィニティーが0.04nM以下の抗体である。このようなIL-6レセプターへの結合活性が高い抗IL-6レセプター抗体は、抗原の生物的作用の中和能が向上していると考えられる。
本発明のIL-6レセプターへの結合活性が高い抗IL-6レセプター抗体において、導入されるアミノ酸置換は特に限定されないが、例えば上述のアミノ酸置換が挙げられる。
IL-6レセプターは特に限定されないが、ヒトIL-6レセプターが好ましい。
結合活性の測定は当業者に公知の方法により行うことが可能であり、例えばSPRを用いたBiacore(BIACORE)等により測定することが可能である。
<CDR配列の免疫原性リスクを低下させた抗体>
また本発明は、免疫原性が低下した抗IL-6レセプター抗体、特にヒト化PM-1抗体を提供する。抗体配列中にHLAに結合するT-cellエピトープが存在すると抗体の免疫原性が高くなると考えられている。従って、抗体の配列を置換して抗体配列中に存在するT-cellエピトープを除去することにより抗体の免疫原性リスクを低下させることができる。
本発明は抗体のアミノ酸配列、特にCDR配列中のアミノ酸を他のアミノ酸に置換することによりT-cellエピトープが除去され、免疫原性が低下したヒト化抗ヒトIL-6レセプター抗体、特にヒト化PM-1軽鎖可変領域を提供する。また本発明は、該軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。
より具体的には本発明は、配列番号：５に記載のアミノ酸配列（LCDR2）において２番目のThrが他のアミノ酸に置換さた軽鎖CDR2を提供する。また、本発明は該軽鎖CDR2を含む軽鎖可変領域を提供する。また本発明は、該軽鎖可変領域を含む抗IL-6レセプター抗体を提供する。置換後のアミノ酸配列は特に限定されないが、Glyへの置換が好ましい。配列番号：５に記載のアミノ酸配列において２番目のThrがGlyに置換された配列を配列番号：７１に示す。該アミノ酸置換はヒト化PM-1抗体の軽鎖可変領域において行われることが好ましい。
<H53/L28のFRおよびCDR>
本発明はまた、薬物動態、安定性および／または免疫原性が改善された抗ヒトIL-6レセプター抗体を提供する。IgGにおいては、同一のFc領域を有するIgGの血漿中半減期がpIと高い相関係数で相関することが見出されている。そこで、異なる抗原に対する2種類の抗体において可変領域のpIを改変することを試みたところ、抗原の種類に関係なくFc領域を改変することなく血漿中半減期を制御することに成功した。抗体の内皮細胞への非特異的な取り込みの速度は、負電荷を帯びた細胞表面とIgGの物理化学的なクーロン相互作用に依存すると考えられる。IgGのpIを低下させることでクーロン相互作用が低減し、内皮細胞への非特異的な取り込みが減少し、結果として内皮細胞における代謝を減少させることで薬物動態を向上させることが可能となる。
即ち本発明は、抗IL-6レセプター抗体、特にヒト化PM-1抗体のアミノ酸配列を置換することにより、等電点を低下させ、薬物動態を向上させた抗ヒトIL-6レセプター抗体を提供する。具体的には、Kabatナンバリング(Kabat EA et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest. NIH)において、ヒト化PM-1のH13（配列番号：７の１３番目のアミノ酸）、H16（配列番号：７の１６番目のアミノ酸）、H43（配列番号：８の８番目のアミノ酸）、H81（配列番号：９の１６番目のアミノ酸）、H105（配列番号：１０の３番目のアミノ酸）、L18（配列番号：１１の１８番目のアミノ酸）、L45（配列番号：１２の１１番目のアミノ酸）、L79（配列番号：１３の２３番目のアミノ酸）、L107（配列番号：１４の１０番目のアミノ酸）、H31（配列番号：１の１番目のアミノ酸）、L24（配列番号：４の１番目のアミノ酸）および／またはL53（配列番号：５の４番目のアミノ酸）を等電点が低下する他のアミノ酸に置換する。このことにより、ヒト化PM-1の結合活性や安定性に影響を与えることなく等電点を低下させることが可能である。またヒト化PM-1抗体では、マウス配列をヒト化する際に、結合活性保持の為に幾つかのアミノ酸残基がマウス配列のまま残されている。具体的には、上述のKabatナンバリングにおいて、ヒト化PM-1抗体中のH27（配列番号：７の２７番目のアミノ酸）、H28（配列番号：７の２８番目のアミノ酸）、H29（配列番号：７の２９番目のアミノ酸）、H30（配列番号：７の３０番目のアミノ酸）およびH71はマウス配列がそのまま利用されている。HFR1に関してはH13、H16、H23、H30を置換することによりHFR1としてヒト配列に変換することが可能で、ヒト化抗体PM-1よりさらに免疫原性リスクが低下した抗体を作製することが可能と考えられる。さらに、ヒト化PM-1は、CDRグラフティングによりヒト化された抗体であることから、安定性に関しては改善の余地があると考えられる。例えば、抗体の可変領域において表面に露出しているアミノ酸残基を親水性のアミノ酸に置換することにより、抗体を安定化することが可能であると考えられる。さらにCDR配列をコンセンサス配列に改変することによっても、抗体を安定化することが可能である。ヒト化PM-1抗体においては、上述のKabatナンバリングにおいて、H69 (配列番号：９の4番目のアミノ酸)のMetからIleへの置換（疎水コア構造の安定化）、H70（配列番号：９の５番目のアミノ酸）のLeuからSerへの置換（表面露出残基の親水化）、H58（配列番号：２の９番目のアミノ酸）のThrからAsnへの置換（重鎖CDR2のコンセンサス配列への改変）、H65（配列番号：２の１６番目のアミノ酸）のSerからGlyへの置換（βターン部分へのGlyへの置換、重鎖CDR2のコンセンサス配列への改変）、またはL93（配列番号：６の５番目のアミノ酸）のThrからSerへの置換（表面露出残基の親水化）により抗体を安定化することが可能である。また、上述のLCDR2（配列番号：５）の2番目であるL51のThrをGlyに置換することで、結合活性や安定性に影響を与えることなくin silicoで予測されたT-cellエピトープを除去することによる免疫原性リスクを低下させることが可能である。これらのアミノ酸置換を組み合わせて、抗体の薬物動態、免疫原性、安定性が改善した抗IL-6レセプター抗体を得ることが可能である。
このような抗体の例として、下記（１）〜（３７）のいずれかに記載の抗体が挙げられる。
（１）配列番号：７に記載のアミノ酸配列において１３番目のArgが他のアミノ酸に置換されたFR1を有する重鎖可変領域を含む抗体。
置換後のアミノ酸配列は特に限定されないがLysへの置換が好ましい。
配列番号：７に記載のアミノ酸配列において１３番目のArgがLysへ置換された配列を配列番号:８０に示す。
（２）配列番号：７に記載のアミノ酸配列において１６番目のGlnが他のアミノ酸に置換されたFR1を有する重鎖可変領域を含む抗体。
置換後のアミノ酸配列は特に限定されないがGluへの置換が好ましい。
配列番号：７に記載のアミノ酸配列において１６番目のGlnがGluへ置換された配列を配列番号：８１に示す。
（３）配列番号：７に記載のアミノ酸配列において２３番目のThrが他のアミノ酸に置換されたFR1を有する重鎖可変領域を含む抗体。
置換後のアミノ酸配列は特に限定されないがAlaへの置換が好ましい。
配列番号：７に記載のアミノ酸配列において２３番目のThrがAlaへ置換された配列を配列番号：８２に示す。
（４）配列番号：７に記載のアミノ酸配列において３０番目のThrが他のアミノ酸に置換されたFR1を有する重鎖可変領域を含む抗体。
置換後のアミノ酸配列は特に限定されないがSerへの置換が好ましい。
配列番号：７に記載のアミノ酸配列において３０番目のThrがSerへ置換された配列を配列番号：８３に示す。
（５）配列番号：７に記載のアミノ酸配列において１３番目のArg、１６番目のGln、２３番目のThrおよび３０番目のThrが他のアミノ酸に置換されたFR1を有する重鎖可変領域を含む抗体。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、１３番目のArgはLys、１６番目のGlnはGlu、２３番目のThrはAla、３０番目のThrはSerへの置換が好ましい。
配列番号：７に記載のアミノ酸配列において１３番目のArgがLys、１６番目のGlnがGlu、２３番目のThrがAla、３０番目のThrがSerへ置換された配列を配列番号：８４に示す。
（６）配列番号：８に記載のアミノ酸配列において８番目のArgが他のアミノ酸に置換されたFR2を有する重鎖可変領域を含む抗体。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、Gluへの置換が好ましい。
配列番号：８に記載のアミノ酸配列において８番目のArgがGluへ置換された配列を配列番号：８５に示す。
（７）配列番号：９に記載のアミノ酸配列において４番目のMetが他のアミノ酸に置換されたFR3を有する重鎖可変領域を含む抗体。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、Ileへの置換が好ましい。
配列番号：９に記載のアミノ酸配列において４番目のMetがIleへ置換された配列を配列番号：８６に示す。
（８）配列番号：９に記載のアミノ酸配列において５番目のLeuが他のアミノ酸に置換されたFR3を有する重鎖可変領域を含む抗体。
置換後のアミノ酸配列は特に限定されないが、Serへの置換が好ましい。
配列番号：９に記載のアミノ酸配列において５番目のLeuがSerへ置換された配列を配列番号：８７に示す。
（９）配列番号：９に記載のアミノ酸配列において１６番目のArgが他のアミノ酸に置換されたFR3を有する重鎖可変領域を含む抗体。
置換後のアミノ酸は特に限定されないがLysへの置換が好ましい。
配列番号：９に記載のアミノ酸配列において１６番目のArgがLysへ置換された配列を配列番号：８８に示す。
（１０）配列番号：９に記載のアミノ酸配列において２７番目のValが他のアミノ酸に置換されたFR3を有する重鎖可変領域を含む抗体。
置換後のアミノ酸配列は特に限定されないがAlaへの置換が好ましい。
配列番号：９に記載のアミノ酸配列において２７番目のValがAlaへ置換された配列を配列番号：８９に示す。
（１１）配列番号：９に記載（HFR3）のアミノ酸配列において４番目のMet、５番目のLeu、１６番目のArgおよび２７番目のValが他のアミノ酸に置換されたFR3を有する重鎖可変領域を含む抗体。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、４番目のMetはIle、５番目のLeuはSer、１６番目のArgはLys、２７番目のValはAlaへの置換が好ましい。
配列番号：９に記載のアミノ酸配列において４番目のMetがIle、５番目のLeuがSer、１６番目のArgがLys、２７番目のValがAlaへ置換された配列を配列番号：９０に示す。
（１２）配列番号：１０に記載（HFR4）のアミノ酸配列において３番目のGlnが他のアミノ酸に置換されたFR4を有する重鎖可変領域を含む抗体。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、Gluへの置換が好ましい。
配列番号：１０に記載のアミノ酸配列において３番目のGlnがGluへ置換された配列を配列番号：９１に示す。
（１３）配列番号：１１に記載（LFR1）のアミノ酸配列において１８番目のArgが他のアミノ酸に置換されたFR1を有する軽鎖可変領域を含む抗体。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、Serへの置換が好ましい。
配列番号：１１に記載のアミノ酸配列において１８番目のArgがSerへ置換された配列を配列番号：９２に示す。
（１４）配列番号：１２に記載（LFR2）のアミノ酸配列において１１番目のLysが他のアミノ酸に置換されたFR2を有する軽鎖可変領域を含む抗体。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、Gluへの置換が好ましい。
配列番号：１２に記載のアミノ酸配列において１１番目のLysがGluへ置換された配列を配列番号：９３に示す。
（１５）配列番号：１３に記載のアミノ酸配列において２３番目のGlnが他のアミノ酸に置換されたFR3を有する軽鎖可変領域を含む抗体。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、Gluへの置換が好ましい。
配列番号：１３に記載のアミノ酸配列において２３番目のGlnがGluへ置換された配列を配列番号：９４に示す。
（１６）配列番号：１３に記載のアミノ酸配列において２４番目のProが他のアミノ酸に置換されたFR3を有する軽鎖可変領域を含む抗体。
置換後のアミノ酸配列は特に限定されないがAlaへの置換が好ましい。
配列番号：１３に記載のアミノ酸配列において２４番目のProがAlaへ置換された配列を配列番号：９５に示す。
（１７）配列番号：１３に記載のアミノ酸配列において２７番目のIleが他のアミノ酸に置換されたFR3を有する軽鎖可変領域を含む抗体。
置換後のアミノ酸配列は特に限定されないがAlaへの置換が好ましい。
配列番号：１３に記載のアミノ酸配列において２７番目のIleがAlaへ置換された配列を配列番号：９６に示す。
（１８）配列番号：１３に記載（LFR3）のアミノ酸配列において２３番目のGln、２４番目のProおよび２７番目のIleが他のアミノ酸に置換されたFR3を有する軽鎖可変領域を含む抗体。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、２３番目のGlnはGlu、２４番目のProはAla、２７番目のIleはAlaへの置換が好ましい。
配列番号：１３に記載のアミノ酸配列において２３番目のGlnがGlu、２４番目のProがAla、２７番目のIleがAlaへ置換された配列を配列番号：９７に示す。
（１９）配列番号：１４に記載（LFR4）のアミノ酸配列において１０番目のLysが他のアミノ酸に置換されたFR4を有する軽鎖可変領域を含む抗体。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、Gluへの置換が好ましい。
配列番号：１４に記載のアミノ酸配列において１０番目のLysがGluへ置換された配列を配列番号：９８に示す。
（２０）配列番号：１０に記載（HFR4）のアミノ酸配列において５番目のSerが他のアミノ酸に置換されたFR4を有する重鎖可変領域を含む抗体。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、Thrへの置換が好ましい。
配列番号：１０に記載のアミノ酸配列において５番目のSerがThrに置換された配列を配列番号：１３２に示す。
（２１) 配列番号：１０に記載(HFR4)のアミノ酸配列において３番目のGlnおよび５番目のSerが他のアミノ酸に置換されたFR4を有する重鎖可変領域を含む抗体。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、３番目のGlnはGlu、５番目のSerはThrへの置換が好ましい。
配列番号：１０に記載のアミノ酸配列において３番目のGlnがGluへ、５番目のSerがThrへ置換された配列を配列番号：１３３に示す。
（２２）（５）、（６）、（１１）および（２１）に記載のアミノ酸置換が行われたヒト化PM-1重鎖可変領域を含む抗体。
（２３）（１３）、（１４）、（１８）および（１９）に記載のアミノ酸置換が行われたヒト化PM-1軽鎖可変領域を含む抗体。
（２４）（２２）に記載の重鎖可変領域および（２３）に記載の軽鎖可変領域を含む抗体。
（２５）配列番号：１に記載（HCDR1）のアミノ酸配列において１番目のSerが他のアミノ酸に置換されたCDR1を有する重鎖可変領域を含む抗体。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、Aspへの置換が好ましい。
配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１番目のSerがAspへ置換された配列を配列番号：２８に示す。
（２６）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１６番目のSerが他のアミノ酸に置換されたCDR2を有する重鎖可変領域を含む抗体。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、Glyへの置換が好ましい。
配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１６番目のSerがGlyへ置換された配列を配列番号：９９に示す。
（２７）配列番号：２に記載（HCDR2）のアミノ酸配列において９番目のThrおよび１６番目のSerが他のアミノ酸に置換されたCDR2を有する重鎖可変領域を含む抗体。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、９番目のThrはAsn、１６番目のSerはGlyへの置換が好ましい。
配列番号：２に記載のアミノ酸配列において９番目のThrがAsn、１６番目のSerがGlyへ置換された配列を配列番号：１００に示す。
（２８）配列番号：４に記載（LCDR1）のアミノ酸配列において１番目のArgが他のアミノ酸に置換されたCDR1を有する軽鎖可変領域を含む抗体。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、Glnへの置換が好ましい。
配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１番目のArgがGlnへ置換された配列を配列番号：１０１に示す。
（２９）配列番号：５に記載のアミノ酸配列において４番目のArgが他のアミノ酸に置換されたCDR2を有する軽鎖可変領域を含む抗体。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、Gluへの置換が好ましい。
配列番号：５に記載のアミノ酸配列において４番目のArgがGluへ置換された配列を配列番号：１０２に示す。
（３０）配列番号：５に記載（LCDR2）のアミノ酸配列において２番目のThrおよび４番目のArgが他のアミノ酸に置換されたCDR2を有する軽鎖可変領域を含む抗体。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、２番目のThrはGly、４番目のArgはGluへの置換が好ましい。
配列番号：５に記載のアミノ酸配列において２番目のThrがGly、４番目のArgがGluへ置換された配列を配列番号：１０３に示す。
（３１）配列番号：６に記載（LCDR3）のアミノ酸配列において５番目のThrが他のアミノ酸に置換されたCDR3を有する軽鎖可変領域を含む抗体。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、Serへの置換が好ましい。
配列番号：６に記載のアミノ酸配列において５番目のThrがSerへ置換された配列を配列番号：７７に示す。
（３２）(２５）および（２７）に記載のアミノ酸置換が行われた重鎖可変領域を含む抗体。
（３３）（２８）、（３０）および（３１）に記載のアミノ酸置換が行われた軽鎖可変領域を含む抗体。
（３４）(３２)に記載の重鎖可変領域と（３３）に記載の軽鎖可変領域を含む抗体。
（３５）配列番号：１０４に記載（H53/L28のVH）のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む抗体。
（３６）配列番号：１０５に記載（H53/L28のVL）のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体。
（３７）(３５)に記載の重鎖可変領域および(３６)に記載の軽鎖可変領域を有する抗体。
上述の（１）〜（３７）のいずれかに記載のアミノ酸置換はヒト化PM-1抗体に対して行われることが好ましい。本発明は少なくとも上述の（１）〜（３７）のいずれかに記載のアミノ酸置換を含む抗体及び該抗体の製造方法を提供する。従って本発明の抗体には、上述の（１）〜（３７）のいずれかに記載のアミノ酸置換に加え、上述の（１）〜（３７）に記載のアミノ酸置換以外のアミノ酸置換を含む抗体も含まれる。また本発明の抗体には、上述の（１）〜（３７）のいずれかに記載のアミノ酸置換が複数組み合わされた抗体も含まれる。上述の（１）〜（３７）に記載のアミノ酸置換としては、例えば、上述のFRおよびCDRのアミノ酸配列の置換が挙げられる。上述の（１）〜（３７）に記載のアミノ酸置換以外のアミノ酸置換としては、上述以外のFRおよびCDR配列の置換、欠失、付加および／または挿入等が挙げられる。また、定常領域のアミノ酸配列の置換、欠失、付加および／または挿入等が挙げられる。
さらに、上述のアミノ酸改変以外の、抗IL-6レセプター抗体の活性を低下させることなく等電点を低下させる改変としては、例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１５番目のLysおよび／または１６番目のSerを他のアミノ酸に置換する改変が挙げられる。置換後のアミノ酸は特に限定されないが、１５番目のLysはGlnに、１６番目のSerはAspに置換することが好ましい。配列番号：２のアミノ酸配列において１５番目のLysがGlnに、１６番目のSerがAspに置換された配列を配列番号：１２１に示す。又、このようなアミノ酸置換は配列番号：１００に記載のアミノ酸配列に対して行われてもよい。配列番号：１００のアミノ酸配列において、１５番目のLysがGlnに、１６番目のGlyがAspに置換された配列を配列番号：１２２に示す。従って、本発明は配列番号：２または配列番号１００のアミノ酸配列において１５番目のLysおよび／または１６番目のSerが他のアミノ酸に置換されたCDR2を有する重鎖可変領域を含む抗体を提供する。
さらに、等電点を低下させる他の改変としては、配列番号：４に記載のアミノ酸配列において4番目のGlnを他のアミノ酸に置換する改変が挙げられる。置換後のアミノ酸は特に限定されないがGluへの置換が好ましい。配列番号：４のアミノ酸配列において、４番目のGlnがGluに置換されたアミノ酸配列を配列番号：１２３に示す。又、このアミノ酸置換は配列番号：１０１のアミノ酸配列に対して行われてもよい。配列番号：１０１のアミノ酸配列において４番目のGlnがGluに置換されたアミノ酸配列を配列番号：１２４に示す。従って、本発明は配列番号：４または配列番号１０１のアミノ酸配列において４番目のGlnが他のアミノ酸に置換されたCDR1を有する軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。
さらに、等電点を低下させる他の改変として、配列番号：５に記載のアミノ酸配列において6番目のHisを他のアミノ酸に置換する改変が上げられる。置換後のアミノ酸は特に限定されないがGluへの置換が好ましい。配列番号：５に記載のアミノ酸配列において６番目のHisがGluに置換されたアミノ酸配列を配列番号：１２５に示す。又、このアミノ酸置換は配列番号：１０３のアミノ酸配列に対して行われてもよい。配列番号：１０３のアミノ酸配列において６番目のHisがGluに置換されたアミノ酸配列を配列番号：１２６に示す。従って、本発明は配列番号：５または配列番号：１０３のアミノ酸配列において６番目のHisが他のアミノ酸に置換されたCDR2を有する軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。
さらに、配列番号：９０に記載の重鎖FR3のアミノ酸配列において、免疫原性リスクを低減させる改変として、２７番目（KabatナンバリングH89）のAlaをValに置換する改変を挙げることができる。配列番号：９０に記載のアミノ酸配列において２７番目のAlaがValに置換されたアミノ酸配列を配列番号：１２７に示す。従って、本発明は配列番号：９０のアミノ酸配列において２７番目のAlaがValに置換されたFR3を有する重鎖可変領域を含む抗体を提供する。
また、配列番号：９または配列番号：９０に記載の重鎖FR3のアミノ酸配列において唯一残存するマウス配列である６番目（KabatナンバリングH71）のArgに関して、H71がArgで保存されているヒトVH1サブクラス（配列番号：１２８）、あるいは、ヒトVH3サブクラス（配列番号：１２９）のヒト配列をFR3配列として用いることで、フレームワークとしては完全にヒト配列である抗ヒトIL-6レセプター抗体を作製可能であると考えられる。従って、本発明は配列番号：１２８または配列番号：１２９に記載のFR3を有する重鎖可変領域を含む抗体を提供する。
さらに、配列番号：１０に記載の重鎖FR4のアミノ酸配列において、安定性を向上させる改変として、５番目（KabatナンバリングH107）のSerをIleに置換する改変を挙げることができる。配列番号：１０に記載のアミノ酸配列において５番目のSerがIleに置換されたアミノ酸配列を配列番号：１３０に示す。又、このアミノ酸配列は配列番号：９１のアミノ酸配列に対して行われてもよい。配列番号：９１に記載のアミノ酸配列において５番目のSerがIleに置換されたアミノ酸配列を配列番号：１３１に示す。従って、本発明は配列番号：１０または配列番号：９１のアミノ酸配列において５番目のSerがIleに置換されたFR4を有する重鎖可変領域を含む抗体を提供する。
このようなアミノ酸置換はヒト化PM-1抗体、H53/L28（配列番号：１０４の重鎖可変領域、配列番号：１０５の軽鎖可変領域を含む抗体）、あるいはPF1抗体（配列番号：２２の重鎖可変領域、配列番号：２３の軽鎖可変領域を含む抗体）に対して行われることが好ましい。本発明は少なくともこのようなアミノ酸置換を含む抗体及び該抗体の製造方法を提供する。従って本発明の抗体には、このようなアミノ酸置換に加え、上述の（１）〜（３７）に記載のアミノ酸置換および／または上述の（１）〜（３７）以外のアミノ酸置換を含む抗体も含まれる。上述の（１）〜（３７）に記載のアミノ酸置換以外のアミノ酸置換としては、上述以外のFRおよびCDR配列の置換、欠失、付加および／または挿入等が挙げられる。また、定常領域のアミノ酸配列の置換、欠失、付加および／または挿入等が挙げられる。
<等電点の低い抗ヒトIL-6レセプター抗体>
本発明はさらに等電点の低い抗IL-6レセプター抗体を提供する。本発明の等電点の低い抗体には全長抗体の実測等電点の低い抗体および可変領域（VH/VL）の理論等電点の低い抗体が含まれる。
本発明において全長抗体の実測等電点の低い抗IL-6レセプター抗体とは、通常、実測等電点が7.5以下の抗体であり、好ましくは実測等電点が7.0以下の抗体であり、さらに好ましくは実測等電点が6.0以下の抗体である。実測等電点は当業者に公知の方法で測定することが可能であり、例えば、非変性ゲル等電点電気泳動やキャピラリー等電点電気泳動等の方法により測定することが可能である。
本発明において可変領域の理論等電点の低い抗IL-6レセプター抗体とは、通常、理論等電点が5.5以下の抗体であり、好ましくは理論等電点が5.0以下の抗体であり、さらに好ましくは理論等電点が4.0以下の抗体である。理論等電点は当業者に公知の方法により算出することが可能であり、例えば、GENETYX(GENETYX CORPORATION)等のソフトを用いることにより可変領域のVHおよびVLの理論等電点を算出することが可能である。
本発明の等電点が低い抗IL-6レセプター抗体において、導入されるアミノ酸置換は特に限定されないが、例えば、上述のアミノ酸置換が挙げられる。このような等電点が低い抗IL-6レセプター抗体は薬物動態が向上していると考えられる。
IL-6レセプターは特に限定されないが、ヒトIL-6レセプターが好ましい。
<高濃度において安定な抗ヒトIL-6レセプター抗体>
さらに本発明は高濃度において安定な抗IL-6レセプター抗体を提供する。
本発明において"高濃度において安定"とは、皮下投与に適したpH6.5〜7.0の範囲内の適切に選択された緩衝液条件（例えば、20mM histidine-HCl, 150mM NaCl）において、抗IL-6レセプター抗体100mg/mLの高濃度抗体溶液の25℃での1ヶ月あたりの会合体比率（ゲルろ過クロマトグラフィー上の会合体ピークエリア／トータルピークエリア×１００）の増加が0.3%以下、好ましくは0.2%以下、さらに好ましくは0.1%以下であることを意味する。なお、抗IL-6レセプター抗体の濃度は100mg/mL以上であればよく、例えば、200mg/mLや300mg/mLなどであってもよい。
本発明の高濃度において安定な抗IL-6レセプター抗体は、特に限定されないが、例えば上述のアミノ酸置換等により作製することが可能である。
IL-6レセプターは特に限定されないが、ヒトIL-6レセプターが好ましい。
本発明はまた、上述の（１）〜（３７）のいずれかに記載のアミノ酸置換が行われたヒト化PM-1抗体に、さらに上述の(a)〜(y)のいずれかに記載の結合活性および／または中和活性を向上させるアミノ酸置換を行った抗体を提供する。このような抗体の一態様としては、配列番号：２２に記載（PF1_H）のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号：２３に記載（PF1_L）のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体（PF1）が挙げられるが、これに限定されない。
さらに本発明は以下の抗体の(A)〜（I）いずれかに記載の抗IL-6受容体抗体を提供する。
(A) 配列番号：１６５に記載のアミノ酸配列（VH5-M83のCDR1）を有するCDR1、配列番号：１６６に記載のアミノ酸配列(VH5-M83のCDR2）を有するCDR2、配列番号：１６７に記載のアミノ酸配列(VH5-M83のCDR3）を有するCDR3を有する重鎖可変領域、
(B) 配列番号：１０１に記載のアミノ酸配列（VL5のCDR1）を有するCDR1、配列番号：１６８に記載のアミノ酸配列(VL5のCDR2）を有するCDR2、配列番号：７９に記載のアミノ酸配列(VL5のCDR3）を有するCDR3を有する軽鎖可変領域、
(C) (A)の重鎖可変領域および(B)の軽鎖可変領域を含む抗体、
(D) 配列番号：１６９に記載のアミノ酸配列（VH3-M73のCDR1）を有するCDR1、配列番号：１７０に記載のアミノ酸配列(VH3-M73のCDR2）を有するCDR2、配列番号：１７１に記載のアミノ酸配列(VH3-M73のCDR3）を有するCDR3を有する重鎖可変領域、
(E) 配列番号：１７２に記載のアミノ酸配列（VL3のCDR1）を有するCDR1、配列番号：１７３に記載のアミノ酸配列(VL3のCDR2）を有するCDR2、配列番号：７９に記載のアミノ酸配列(VL3のCDR3）を有するCDR3を有する軽鎖可変領域、
(F) (D)の重鎖可変領域および(E)の軽鎖可変領域を有する含む抗体、
(G) 配列番号：１６９に記載のアミノ酸配列（VH4-M73のCDR1）を有するCDR1、配列番号：１７４に記載のアミノ酸配列(VH4-M73のCDR2）を有するCDR2、配列番号：１７１に記載のアミノ酸配列(VH4-M73のCDR3）を有するCDR3を有する重鎖可変領域、
(H) 配列番号：１７５に記載のアミノ酸配列（VL1のCDR1）を有するCDR1、配列番号：１７３に記載のアミノ酸配列（VL1のCDR2）を有するCDR2、配列番号：７９に記載のアミノ酸配列(VL1のCDR3)を有するCDR3を有する軽鎖可変領域、
(I) (G)の重鎖可変領域および(H)の軽鎖可変領域を含む抗体。
さらに本発明は以下の(a)〜(q)いずれかに記載の抗IL-6受容体抗体を提供する。
(a) 配列番号：１５９に記載のアミノ酸配列(H96-IgG1可変領域)を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(b) 配列番号：１５９に記載のアミノ酸配列(H96-IgG1可変領域)において、35番目のTrp、51番目のTyr、63番目のSer、65番目のLys、66番目のGly、99番目のVal、103番目のIle、108番目のTyr、111番目のGlu、113番目のThrのうち少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(c) 配列番号：１５９に記載のアミノ酸配列(H96-IgG1可変領域)において、65番目のLys、66番目のGly、99番目のVal、103番目のIle、111番目のGlu、113番目のThrが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(d) 配列番号：１５９に記載のアミノ酸配列(H96-IgG1可変領域)において、35番目のTrp、51番目のTyr、63番目のSer、65番目のLys、66番目のGly、99番目のVal、103番目のIle、108番目のTyrが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(e) 配列番号：１６０に記載のアミノ酸配列(F2H-IgG1可変領域)を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(f) 配列番号：１６１に記載のアミノ酸配列(VH5-M83可変領域)を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(g) 配列番号：２３に記載のアミノ酸配列(PF1L)において27番目のGln及び／又は55番目のHisが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体、
(h) 配列番号：１６２に記載のアミノ酸配列(L39可変領域)を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(i) 配列番号：１６３に記載のアミノ酸配列(VL5-kappa可変領域)を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(j) 配列番号：１７６に記載のアミノ酸配列（VH3-M73可変領域）を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(k) 配列番号：１７８に記載のアミノ酸配列（VH4-M73可変領域）を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(l) 配列番号：１７７に記載のアミノ酸配列（VL3-kappa可変領域）を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(m) 配列番号：１７９に記載のアミノ酸配列（VL1-kappa可変領域）を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(n) (e)の重鎖可変領域と(h)の軽鎖可変領域を含む抗体、
(o) (f)の重鎖可変領域と(i)の軽鎖可変領域を含む抗体(FV5-M83の可変領域組み合わせ)、
(p) (j)の重鎖可変領域と(l)の軽鎖可変領域を含む抗体（FV4-M73の可変領域組み合わせ）、
(q) (k)の重鎖可変領域と(m)の軽鎖可変領域を含む抗体(FV3-M73の可変領域組み合わせ)。
上述の(a)〜(d)の重鎖可変領域のアミノ酸置換において、置換後のアミノ酸は特に限定されないが、35番目のTrpはVal、51番目のTyrはPhe、63番目のSerはThr、65番目のLysはGln、66番目のGlyはAsp、99番目のValはLeu、103番目のIleはAla、108番目のTyrはVal、111番目のGluはGln、113番目のThrはIleに置換されることが好ましい。又、上述の(g)の軽鎖可変領域のアミノ酸置換において、置換後のアミノ酸は特に限定されないが、27番目のGlnはGluに、55番目のHisはGluに置換されることが好ましい。又、上述のアミノ酸置換以外のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加などが行われてもよい。
本発明の抗体の定常領域は特に限定されず、如何なる定常領域が用いられてもよい。例えば、IgG1、IgG2、IgG4などの天然配列を有する定常領域や、天然配列を有する定常領域中のアミノ酸の置換、欠失、付加及び／又は挿入などを行うことにより作製された改変型の定常領域などを用いることができる。改変型の定常領域の例としては、後述する定常領域を挙げることができる。
又、上述の本発明の可変領域を用いた抗体の例として、以下の抗体を挙げることができる。
(1) 配列番号：１３４に記載のアミノ酸配列(H96-IgG1)を有する重鎖を含む抗体、
(2) 配列番号：１３５に記載のアミノ酸配列(F2H-IgG1)を有する重鎖を含む抗体、
(3) 配列番号：１３７に記載のアミノ酸配列(VH5-IgG1)を有する重鎖を含む抗体、
(4) 配列番号：１３９に記載のアミノ酸配列(VH5-M83)を有する重鎖を含む抗体、
(5) 配列番号：１３６に記載のアミノ酸配列(L39)を有する軽鎖を含む抗体、
(6) 配列番号：１３８に記載のアミノ酸配列(VL5-kappa)を有する軽鎖を含む抗体、
(7) 配列番号：１８０に記載のアミノ酸配列（VH3-M73）を有する重鎖を含む抗体、
(8) 配列番号：１８２に記載のアミノ酸配列（VH4-M73）を有する重鎖を含む抗体、
(9) 配列番号：１８１に記載のアミノ酸配列（VL3-kappa）を有する軽鎖を含む抗体、
(10) 配列番号：１８３に記載のアミノ酸配列（VL1-kappa）を有する軽鎖を含む抗体、
(11) (2)の重鎖と(5)の軽鎖を含む抗体、
(12) (3)の重鎖と(6)の軽鎖を含む抗体、
(13) (4)の重鎖と(6)の軽鎖を含む抗体（FV5-M83）、
(14) (7)の重鎖と(9)の軽鎖を含む抗体(FV4-M73)、
(15) (8)の重鎖と(10)の軽鎖を含む抗体(FV3-M73)、
(16) (1)〜(15)いずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体。
ここで、「同等の活性を有する」とは抗原への結合活性及び／又は中和活性が同等であることを言う。本発明において同等の活性とは必ずしも同一の活性である必要はなく、例えば50%以上の活性、好ましくは70%以上の活性、さらに好ましくは90%以上の活性を有していることをいう。
さらに、本発明は以下の(i)〜(xxii)いずれかに記載のCDRまたはFRを提供する。
(i) 配列番号：８４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖FR1（VH5の重鎖FR1）、
(ii) 配列番号：１８６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖FR1（VH3、VH4の重鎖FR1）、
(iii) 配列番号：８５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖FR2（VH3、VH4、VH5の重鎖FR2）、
(iv) 配列番号：１８４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖FR3（VH3、VH4、VH5の重鎖FR3）、
(v) 配列番号：１３３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖FR4（VH3、VH4、VH5の重鎖FR4）、
(vi) 配列番号：９２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖FR1（VL1、VL3、VL5の軽鎖FR1）、
(vii) 配列番号：９３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖FR2（VL1、VL3、VL5の軽鎖FR2）、
(viii) 配列番号：９７に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖FR3（VL1、VL3、VL5の軽鎖FR3）、
(ix) 配列番号：９８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖FR4（VL1、VL3、VL5の軽鎖FR4）、
(x) 配列番号：１６９に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1（VH3、VH4の重鎖CDR1）、
(xi) 配列番号：１６５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1（VH5の重鎖CDR1）、
(xii) 配列番号：１７０に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2（VH3の重鎖CDR2）、
(xiii) 配列番号：１７４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2（VH4の重鎖CDR2）、
(xiv) 配列番号：１６６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2（VH5の重鎖CDR2）、
(xv) 配列番号：１７１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3（VH3、VH4の重鎖CDR3）、
(xvi) 配列番号：１６７に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3（VH5の重鎖CDR3）、
(xvii) 配列番号：１７５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1（VL1の軽鎖CDR1）、
(xviii) 配列番号：１７２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1（VL3の軽鎖CDR1）、
(xix) 配列番号：１０１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1（VL5の軽鎖CDR1）、
(xx) 配列番号：１７３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2（VL1、VL3の軽鎖CDR2）、
(xxi) 配列番号：１６８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2（VL5の軽鎖CDR2）、
(xxii) 配列番号：７９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR３（VL1、VL3、VL5の軽鎖CDR3）。
また本発明の抗体には、上述のいずれかに記載のアミノ酸置換を含む抗体の断片やその修飾物も含まれる。例えば、抗体の断片としては、Fab、F(ab')2、Fv又はH鎖とL鎖のFvを適当なリンカーで連結させたシングルチェインFv（scFv）、H鎖単独ドメインやL鎖単独ドメイン（例えば、Nat Biotechnol. 2005 Sep;23(9):1126-36.）、Unibody(WO2007059782 A1)、SMIP(WO2007014278 A2)が挙げられる。また抗体の由来としては、特に限定されないが、ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体などを挙げることができる。又、本発明の抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト化抗体等であってもよい。
具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Co, M.S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976、Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496 、Pluckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, 497-515 、Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663 、Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1989) 121, 663-66、Bird, R. E. et al., TIBTECH (1991) 9, 132-137参照）。
scFvは、抗体のH鎖V領域とL鎖V領域を連結することにより得られる。このscFvにおいて、H鎖V領域とL鎖V領域はリンカー、好ましくは、ペプチドリンカーを介して連結される（Huston, J. S. et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883）。scFvにおけるH鎖V領域およびL鎖V領域は、上記抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。V領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸12-19残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
<抗体定常領域>
本発明はまた、以下（ｉ）〜（ｘｘi）のいずれかに記載のアミノ酸が置換され改良された抗体定常領域を提供する。定常領域とはIgG1、IgG2、IgG4タイプの定常領域のことを意味する。ヒトIgG1定常領域、ヒトIgG2定常領域およびヒトIgG4定常領域のアミノ酸配列は公知である（ヒトIgG1定常領域：配列番号：１９、ヒトIgG2定常領域：配列番号：２０、ヒトIgG4定常領域：配列番号：２１）。なお、ヒトIgG4定常領域は、ヒンジ部分の安定性を改善するための改変（Mol Immunol. 1993 Jan;30(1):105-8.）を導入した配列である。さらに本発明は、該アミノ酸が置換された抗体定常領域を含む抗体を提供する。抗体定常領域は好ましくはヒト抗体定常領域である。
なお本発明のアミノ酸が置換された抗体定常領域は、下記（ｉ）〜（ｘｘｉ）のいずれかに記載のアミノ酸置換を含むものである限り、他のアミノ酸置換や修飾を含んでもよい。従って、本発明においては、配列番号：２０に記載のアミノ酸配列から既に１又は複数のアミノ酸が置換および／または修飾されたIgG2定常領域に対して本発明のアミノ酸置換を行う場合、又は本発明のアミノ酸置換を行った後に１または複数のアミノ酸を置換および／または修飾する場合も、配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を有するIgG2定常領域に本発明のアミノ酸置換が行われたIgG2定常領域に該当する。配列番号：１９に記載のアミノ酸配列を有するIgG1定常領域、配列番号：２１に記載のIgG4定常領域についても同様である。
またEUナンバリング（Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242 を参照）の297番目の糖鎖は如何なる糖鎖構造であってもよく、また糖鎖が結合していなくてもよい（例えば大腸菌など、糖鎖が付加されない宿主細胞で生産された定常領域など）。
（ｉ）IgG2定常領域の酸性での安定性改善
本発明のアミノ酸が置換されたIgG2定常領域の一態様としては、配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を有するIgG2定常領域において、２７６番目（EUナンバリングの397番目）のMetが他のアミノ酸に置換されたIgG2定常領域が挙げられる。置換後のアミノ酸は特に限定されないが、Valへの置換であることが好ましい。配列番号：２０に記載のアミノ酸配列において２７６番目（EUナンバリングの397番目）のMetを他のアミノ酸に置換することにより、抗体の酸性条件化での安定性を向上させることが可能である。
（ｉｉ）IgG2定常領域のヘテロジェニティーの改善
また本発明のアミノ酸が置換されたIgG2定常領域の一態様としては、配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を有するIgG2定常領域において、１４番目（EUナンバリング131番目）のCys、１６番目（EUナンバリングの133番目）のArg、および、102番目（EUナンバリングの219番目）のCysが他のアミノ酸に置換されたIgG2定常領域が挙げられる。置換後のアミノ酸は特に限定されないが、１４番目（EUナンバリング131番目）のCysはSerに置換されることが好ましく、１６番目（EUナンバリングの133番目）のArgはLysに置換されることが好ましく、１０２番目（EUナンバリングの219番目）のCysはSerに置換されることが好ましい（IgG2-SKSC）。
これらの置換を行うことにより、IgG2のヒンジ領域に由来するヘテロジェニティーを低減することが可能である。本発明のアミノ酸が置換されたIgG2定常領域には、上記3種類のアミノ酸置換のうち少なくとも1種類のアミノ酸が置換されたIgG2定常領域が含まれるが、１４番目のCysと102番目のCysが他のアミノ酸に置換されていること、又は上記3種類全てのアミノ酸が置換されていることが好ましい。
（ｉｉｉ）IgG2定常領域のFcγRへの結合低減
また本発明のアミノ酸が置換されたIgG2定常領域の一態様として、配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を有するIgG2定常領域において、２０９番目（EU330）のAlaがSerに、２１０番目（EU331）のProがSerに、および／または２１８番目（EU339）のThrがAlaに置換されたIgG2定常領域を提供する。２０９番目（EU330）のAla、２１０番目（EU331）のProの置換によりFcγレセプターへの結合を低下させることが可能であることはすでに報告されているが（Eur J Immunol. 1999 Aug;29(8):2613-24.）、この改変ではT-cellエピトープになりうる非ヒト由来のペプチドが出現するため、免疫原性リスクの点からは好ましくない。そこで、２１８番目（EU339）のThrのAlaへの置換を同時に行うことにより、T-cellエピトープになりうる９〜１２アミノ酸としてはヒト由来のペプチドのみを用いたままIgG2のFcγレセプターへの結合を低下させることが可能である。
本発明のアミノ酸が置換されたIgG2定常領域は、上述の3箇所のアミノ酸置換のうち少なくとも1箇所のアミノ酸が置換されていればよいが、好ましくは上述の3箇所全てのアミノ酸が置換されていることが好ましい。従って、本発明のアミノ酸が置換されたIgG2定常領域の好ましい態様として、配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を有するIgG2定常領域において、２０９番目（EU330）のAlaがSerに置換され、２１０番目（EU331）のProがSerに置換され、かつ２１８番目（EU339）のThrがAlaに置換されたIgG2定常領域を挙げることができる。
（ｉｖ）IgG2定常領域のC末端ヘテロジェニティーの改善
本発明は、配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を有するIgG2定常領域において、３２５番目（EUナンバリングの４４６番目）のGlyおよび３２６番目（EUナンバリングの４４７番目）のLysが欠損したIgG2定常領域を提供する。これらのアミノ酸を両方欠損させることにより、初めて抗体のH鎖C末端に由来するヘテロジェニティーを低減することが可能である。
（ｖ）IgG2定常領域の改変による薬物動態の向上
また本発明のアミノ酸が置換されたIgG2定常領域の一態様として、配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を有するIgG2定常領域において、１４７番目（EUナンバリングの２６８番目）のHis、２３４番目（EUナンバリングの３５５番目）のArg、２９８番目（EUナンバリングの４１９番目）のGlnを他のアミノ酸に置換されたIgG2定常領域が挙げられる。これらのアミノ酸置換により抗体の薬物動態を向上することが可能である。置換後のアミノ酸は特に限定されないが、１４７番目（EUナンバリング２６８番目）のHisはGlnに置換されることが好ましく、２３４番目（EUナンバリングの３５５番目）のArgはGlnに置換されることが好ましく、２９８番目（EUナンバリングの４１９番目）のGlnはGluに置換されることが好ましい。本発明のアミノ酸が置換されたIgG2定常領域には、上記3種類のアミノ酸置換のうち少なくとも1種類のアミノ酸が置換されたIgG2定常領域が含まれるが、上記3種類全てのアミノ酸が置換されていることが好ましい。
（ｖｉ）IgG4定常領域の酸性での安定性改善
本発明は、配列番号：２１に記載のアミノ酸配列を有するIgG4定常領域において、２８９番目（EUナンバリング409番目）のArgが他のアミノ酸に置換されたIgG4定常領域を提供する。置換後のアミノ酸は特に限定されないが、Lysへの置換であることが好ましい。配列番号：２１に記載のアミノ酸配列において２８９番目（EUナンバリングの409番目）のArgを他のアミノ酸に置換することにより、抗体の酸性条件化での安定性を向上させることが可能である。
（ｖｉｉ）IgG4定常領域のC末端ヘテロジェニティーの改善
本発明は、配列番号：２１に記載のアミノ酸配列を有するIgG4定常領域において、３２６番目（EUナンバリングの４４６番目）のGlyおよび３２７番目（EUナンバリングの４４７番目）のLysが欠損したIgG4定常領域を提供する。これらのアミノ酸を両方欠損させることにより、初めて抗体のH鎖C末端に由来するヘテロジェニティーを低減することが可能である。
（ｖｉｉｉ）IgG1定常領域のC末端ヘテロジェニティーの改善
本発明は、配列番号：１９に記載のアミノ酸配列を有するIgG1定常領域において、３２９番目（EUナンバリングの４４６番目）のGlyおよび３３０番目（EUナンバリングの４４７番目）のLysが欠損したIgG1定常領域を提供する。これらのアミノ酸を両方欠損させることにより、初めて抗体のH鎖C末端に由来するヘテロジェニティーを低減することが可能である。
（ｉｘ）
本発明は、配列番号：１９に記載のアミノ酸配列を有するIgG1定常領域において、３１７番目（EUナンバリングの４３４番目）のAsnが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有するIgG1定常領域を提供する。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、Alaへの置換が好ましい。
（ｘ）
本発明は、配列番号：２０に記載のアミノ酸配列において、２０９番目（EUナンバリング330番目）のAla、２１０番目（EUナンバリング331番目）のPro、２１８番目（EUナンバリング339番目）のThr、２７６番目（EUナンバリング397番目）のMet、１４番目（EUナンバリング131番目）のCys、１６番目（EUナンバリング133番目）のArg、１０２番目（EUナンバリング219番目）のCys、２０番目（EUナンバリング137番目）のGluおよび２１番目（EUナンバリング138番目）のSerが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有するIgG2定常領域を提供する。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、２０９番目のAlaはSerに、２１０番目のProはSerに、２１８番目のThrはAlaに、２７６番目のMetはValに、１４番目のCysはSerに、１６番目のArgはLysに、１０２番目のCysはSerに、２０番目のGluはGlyに、２１番目のSerはGlyに置換することが好ましい。
（ｘｉ）
本発明は、配列番号：２０に記載のアミノ酸配列において、２０９番目（EUナンバリング330番目）のAla、２１０番目（EUナンバリング331番目）のPro、２１８番目（EUナンバリング339番目）のThr、２７６番目（EUナンバリング397番目）のMet、１４番目（EUナンバリング131番目）のCys、１６番目（EUナンバリング133番目）のArg、１０２番目（EUナンバリング219番目）のCys、２０番目（EUナンバリング137番目）のGluおよび２１番目（EUナンバリング138番目）のSerが他のアミノ酸に置換され、かつ３２５番目（EUナンバリング446番目）のGlyおよび３２６番目（EUナンバリング447番目）のLysが欠損したアミノ酸配列を有するIgG2定常領域を提供する。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、２０９番目のAlaはSerに、２１０番目のProはSerに、２１８番目のThrはAlaに、２７６番目のMetはValに、１４番目のCysはSerに、１６番目のArgはLysに、１０２番目のCysはSerに、２０番目のGluはGlyに、２１番目のSerはGlyに置換することが好ましい。
（ｘｉｉ）
本発明は、配列番号：２０に記載のアミノ酸配列において、２７６番目（EUナンバリング397番目）のMet、１４番目（EUナンバリング131番目）のCys、１６番目（EUナンバリング133番目）のArg、１０２番目（EUナンバリング219番目）のCys、２０番目（EUナンバリング137番目）のGluおよび２１番目（EUナンバリング138番目）のSerが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有するIgG2定常領域を提供する。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、２７６番目のMetはValに、１４番目のCysはSerに、１６番目のArgはLysに、１０２番目のCysはSerに、２０番目のGluはGlyに、２１番目のSerはGlyに置換することが好ましい。
（ｘｉｉｉ）
本発明は、配列番号：２０に記載のアミノ酸配列において、２７６番目（EUナンバリング397番目）のMet、１４番目（EUナンバリング131番目）のCys、１６番目（EUナンバリング133番目）のArg、１０２番目（EUナンバリング219番目）のCys、２０番目（EUナンバリング137番目）のGluおよび２１番目（EUナンバリング138番目）のSerが他のアミノ酸に置換され、かつ３２５番目（EUナンバリング446番目）のGlyおよび３２６番目（EUナンバリング447番目）のLysが欠損したアミノ酸配列を有するIgG2定常領域を提供する。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、２７６番目のMetはValに、１４番目のCysはSerに、１６番目のArgはLysに、１０２番目のCysはSerに、２０番目のGluはGlyに、２１番目のSerはGlyに置換することが好ましい。
（ｘｉｖ）
本発明は、配列番号：２０に記載のアミノ酸配列において、１４番目（EUナンバリング131番目）のCys、１６番目（EUナンバリング133番目）のArg、１０２番目（EUナンバリング219番目）のCys、２０番目（EUナンバリング137番目）のGlu、２１番目（EUナンバリング138番目）のSer、１４７番目（EUナンバリング２６８番目）のHis、２３４番目（EUナンバリング３５５番目）のArgおよび２９８番目（EUナンバリング４１９番目）のGlnが他のアミノ酸に置換され、かつ３２５番目（EUナンバリング446番目）のGlyおよび３２６番目（EUナンバリング447番目）のLysが欠損したアミノ酸配列を有するIgG2定常領域を提供する。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、１４番目のCysはSerに、１６番目のArgはLysに、１０２番目のCysはSerに、２０番目のGluはGlyに、２１番目のSerはGlyに、１４７番目のHisはGlnに、２３４番目のArgはGlnに、２９８番目のGlnはGluに置換することが好ましい。
（ｘｖ）
本発明は、配列番号：２０に記載のアミノ酸配列において、１４番目（EUナンバリング131番目）のCys、１６番目（EUナンバリング133番目）のArg、１０２番目（EUナンバリング219番目）のCys、２０番目（EUナンバリング137番目）のGlu、２１番目（EUナンバリング138番目）のSer、１４７番目（EUナンバリング２６８番目）のHis、２３４番目（EUナンバリング３５５番目）のArg、２９８番目（EUナンバリング４１９番目）のGln、および３１３番目（EUナンバリング４３４番目）のAsnが他のアミノ酸に置換され、かつ３２５番目（EUナンバリング446番目）のGlyおよび３２６番目（EUナンバリング447番目）のLysが欠損したアミノ酸配列を有するIgG2定常領域を提供する。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、１４番目のCysはSerに、１６番目のArgはLysに、１０２番目のCysはSerに、２０番目のGluはGlyに、２１番目のSerはGlyに、１４７番目のHisはGlnに、２３４番目のArgはGlnに、２９８番目のGlnはGluに、３１３番目のAsnはAlaに置換されることが好ましい。
（ｘｖｉ）
本発明は、配列番号：２１に記載のアミノ酸配列において、２８９番目（EUナンバリング409番目）のArg、１４番目のCys、１６番目のArg、２０番目のGlu、２１番目のSer、９７番目のArg、１００番目のSer、１０２番目のTyr、１０３番目のGly、１０４番目のProおよび１０５番目のPro（EUナンバリング131,133,137,138,214,217,219,220,221,222番目）、１１３番目のGlu、１１４番目のPheおよび１１５番目（EUナンバリング233,234,235番目）のLeuが他のアミノ酸に置換され、かつ116番目（EUナンバリング236番目）のGlyが欠損したアミノ酸配列を有するIgG4定常領域を提供する。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、１４番目（EUナンバリング１３１）のCysはSerへ、１６番目（EUナンバリング１３３）のArgはLysへ、２０番目（EUナンバリング１３７）のGluはGlyへ、２１番目（EUナンバリング１３８）のSerはGlyへ、９７番目（EUナンバリング２１４）のArgはThrへ、１００番目（EUナンバリング２１７）のSerはArgへ、１０２番目（EUナンバリング２１９）のTyrはSerへ、１０３番目（EUナンバリング２２０）のGlyはCysへ、１０４番目（EUナンバリング２２１）のProはValへ、１０５番目（EUナンバリング２２２）のProはGluへ、１１３番目（EUナンバリング２３３）のGluはProへ、１１４番目（EUナンバリング２３４）のPheはValへ、１１５番目（EUナンバリング２３５）のLeuはAlaへ、２８９番目（EUナンバリング４０９）のArgはLysへの置換が好ましい。
（ｘｖｉｉ）
本発明は、配列番号：２１に記載のアミノ酸配列において、２８９番目（EUナンバリング409番目）のArg、１４番目のCys、１６番目のArg、２０番目のGlu、２１番目のSer、９７番目のArg、１００番目のSer、１０２番目のTyr、１０３番目のGly、１０４番目のProおよび１０５番目のPro（EUナンバリング131,133,137,138,214,217,219,220,221,222番目）、１１３番目のGlu、１１４番目のPheおよび１１５番目のLeu（EUナンバリング233,234,235番目）が他のアミノ酸に置換され、かつ116番目（EUナンバリング236番目）のGly、３２６番目（EUナンバリング446番目）のGlyおよび３２７番目（EUナンバリング447番目）のLysが欠損したアミノ酸配列を有するIgG4定常領域を提供する。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、１４番目（EUナンバリング１３１）のCysはSerへ、１６番目（EUナンバリング１３３）のArgはLysへ、２０番目（EUナンバリング１３７）のGluはGlyへ、２１番目（EUナンバリング１３８）のSerはGlyへ、９７番目（EUナンバリング２１４）のArgはThrへ、１００番目（EUナンバリング２１７）のSerはArgへ、１０２番目（EUナンバリング２１９）のTyrはSerへ、１０３番目（EUナンバリング２２０）のGlyはCysへ、１０４番目（EUナンバリング２２１）のProはValへ、１０５番目（EUナンバリング２２２）のProはGluへ、１１３番目（EUナンバリング２３３）のGluはProへ、１１４番目（EUナンバリング２３４）のPheはValへ、１１５番目（EUナンバリング２３５）のLeuはAlaへ、２８９番目（EUナンバリング４０９）のArgはLysへの置換が好ましい。
（ｘｖｉｉｉ）
本発明は、配列番号：１９に記載のアミノ酸配列を有するIgG1定常領域において、３１７番目（EUナンバリングの４３４番目）のAsnが他のアミノ酸に置換され、かつ３２９番目（EUナンバリングの４４６番目）のGlyおよび３３０番目（EUナンバリングの４４７番目）のLysが欠損したアミノ酸配列を有するIgG1定常領域を提供する。
３１７番目（EUナンバリングの４３４番目）のAsnの置換後のアミノ酸は特に限定されないが、Alaへの置換が好ましい。
（ｘｉｘ）
さらに本発明はヒンジ領域のヘテロジェニティーが改善され、および／またはFcγレセプターへの結合活性が低減したIgG2の好ましい態様として以下のIgG2を挙げることができる。
配列番号：２０に記載のアミノ酸配列からなる定常領域を有するIgG2において、２０９番目のAla、２１０番目のPro、２１８番目のThr、１４番目のCys、１６番目のArg、１０２番目のCys、２０番目Glu、２１番目のSerが他のアミノ酸に置換された抗体。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、２０９番目（EUナンバリング３３０）のAlaをSer、２１０番目（EUナンバリング３３１）のProをSer、２１８番目（EUナンバリング３３９）のThrをAla、１４番目（EUナンバリング１３１）のCysをSer、１６番目（EUナンバリング１３３）のArgをLys、１０２番目（EUナンバリング２１９）のCysをSer、２０番目（EUナンバリング１３７）のGluをGly、２１番目（EUナンバリング１３８）のSerをGlyに置換することが好ましい。
このようなIgG2定常領域の例として、配列番号：１９１（M86）のアミノ酸配列を有するIgG2定常領域を挙げることができる。
又、本発明のIgG2定常領域の他の好ましい態様として、上述のIgG2定常領域において、C末端のヘテロジェニティーを低減させるためにさらに３２５番目のGlyおよび３２６番目のLysが欠損したIgG2定常領域を挙げることができる。このような抗体の例として、配列番号：１９２（M86ΔGK）のアミノ酸配列からなる定常領域を有するIgG2を挙げることができる。
（ｘｘ）
さらに本発明はヒンジ領域のヘテロジェニティーが改善されたIgG2定常領域の好ましい態様として以下のIgG2定常領域を挙げることができる。
配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を有するIgG2定常領域において、１４番目のCys、１６番目のArg、１０２番目のCys、２０番目のGlu、２１番目のSerが他のアミノ酸に置換されたIgG2定常領域。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、１４番目（EUナンバリング１３１）のCysをSer、１６番目（EUナンバリング１３３）のArgをLys、１０２番目（EUナンバリング２１９）のCysをSer、２０番目（EUナンバリング１３７）のGluをGly、２１番目の（EUナンバリング１３８）のSerをGlyに置換することが好ましい。
このようなIgG2定常領域の例として、配列番号：１９３（M40）のアミノ酸配列を有するIgG2定常領域を挙げることができる。
又、本発明のIgG2定常領域の他の好ましい態様として、上述のIgG2定常領域において、さらに３２５番目のGlyおよび３２６番目のLysが欠損したIgG2定常領域を挙げることができる。このような抗体の例として、配列番号：１９４（M40ΔGK）のアミノ酸配列を有するIgG2定常領域を挙げることができる。
（ｘｘｉ）M14ΔGK、M17ΔGK、M11ΔGK、M31ΔGK、M58、M73、M83、M86ΔGK、M40ΔGK
本発明はまた、配列番号：２４に記載のアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M14ΔGK）を提供する。さらに本発明は配列番号：１１６に記載のアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M17ΔGK）を提供する。さらに本発明は配列番号：２５に記載のアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M11ΔGK）を提供する。さらに本発明は配列番号：１１８に記載のアミノ酸配列を有する定常領域（M31ΔGK）を提供する。さらに本発明は配列番号：１５１に記載のアミノ酸配列を有する定常領域（M58）を提供する。さらに本発明は配列番号：１５３に記載のアミノ酸配列を有する定常領域を提供する（M73）。さらに本発明は配列番号：１６４に記載のアミノ酸配列を有する定常領域を提供する（M83）。さらに本発明は配列番号：１９２に記載のアミノ酸配列を有する定常領域を提供する（M86ΔGK）。さらに本発明は配列番号：１９４に記載のアミノ酸配列を有する定常領域を提供する（M40ΔGK）。これらの抗体定常領域は、Fcγレセプターへの結合活性の低下、免疫原性リスクの低減、酸性条件下での安定性の向上、ヘテロジェニティーの低減、薬物動態の向上および／または、IgG1定常領域と比較した製剤中での高い安定性という性質を有する、最適化された抗体定常領域である。
本発明は上記（ｉ）〜（ｘｘｉ）のいずれかに記載の抗体定常領域を含む抗体を提供する。上述の抗体定常領域を有する限り、抗原の種類、抗体の由来などは限定されず、いかなる抗体でもよい。好ましい抗体の例としては、IL-6レセプターに結合する抗体を挙げることができる。又、他の好ましい抗体の例としてヒト化抗体を挙げることができる。このような抗体の例として、ヒト化PM1抗体の可変領域を有する抗体を挙げることができる。ヒト化PM1抗体の可変領域は上述のアミノ酸置換が行われていてもよいし、その他のアミノ酸の置換、欠失、付加および／または挿入が行われていてもよい。具体的な置換例としては、上述の（ａ）〜（ｙ）のアフィニティーを向上させる改変、（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）の等電点を低下させる改変、（α）〜（ζ）の安定性を向上させる改変、免疫原性を低下させる改変が挙げられるが、これらに限定されることはない。
このような抗体の一態様としては、配列番号：１１３に記載（PF_1+M14ΔGK）のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号：２３に記載（PF1_L）のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体（PF1）が挙げられるが(軽鎖定常領域はkappaであってもlamdaであってもそれらの改変体であってもよい)、これに限定されない。
また、上述の抗体定常領域および／または上述の抗体定常領域を含む抗体分子は、抗体様結合分子（scaffold分子）、生理活性ペプチド、結合ペプチド等をFc融合分子として結合させることも可能である。
本発明の抗体は、実施例に記載の方法に加えて、例えば以下のようにして取得することも出来る。本発明の抗体を取得する一つの態様においては、まず、当業者に公知の抗IL-6レセプター抗体のCDR領域、FR領域、及び定常領域からなる群より選択される少なくとも１つの領域において、１又は複数のアミノ酸残基を、目的の他のアミノ酸に置換する。当業者に公知の抗IL-6レセプター抗体の取得方法に制限はない。CDR領域、FR領域、及び定常領域からなる群より選択される少なくとも１つの領域において、１又は複数のアミノ酸残基を目的の他のアミノ酸に置換する方法としては、例えば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors.Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer,W, Drutsa,V, Jansen,HW, Kramer,B, Pflugfelder,M, and Fritz,HJ(1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 488-492）が挙げられる。該方法を用いて、抗体の所望のアミノ酸を目的の他のアミノ酸に置換することができる。他のアミノ酸に置換する方法としては、フレームワークシャッフリング（Mol Immunol. 2007 Apr;44(11):3049-60）およびCDR repair（US2006/0122377）等のライブラリー技術を用いることにより、適切なフレームワークおよびCDRにアミノ酸置換することができる。
抗体を取得する為の別の態様としては、まず、当業者に周知な方法によって、IL-6レセプターに結合する抗体を得る。取得された抗体が非ヒト動物抗体であれば、ヒト化することもできる。次いで、取得された抗体が中和活性を有するか否かを当業者に周知な方法によって判定する。抗体の結合活性または中和活性は、例えば実施例に記載の方法で測定することができるが、この方法に限定されない。次いで、抗体のCDR領域、FR領域、及び定常領域からなる群より選択される少なくとも１つの領域中の１又は複数のアミノ酸残基を、目的の他のアミノ酸に置換する。
より具体的には、本発明は、以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、中和活性が増強された、結合活性が増強した、安定性が向上した、または免疫原性が低下した抗体の製造方法に関する。
（ａ）CDR領域、FR領域、及び定常領域からなる群より選択される少なくとも１つの領域中の1又は複数のアミノ酸残基が目的の他のアミノ酸に置換されたH鎖をコードするDNA、及びCDR領域及びFR領域からなる群より選択される少なくとも１つの領域中の1又は複数のアミノ酸残基が目的の他のアミノ酸に置換されたL鎖をコードするDNAを発現させる工程
（ｂ）工程（ａ）の発現産物を回収する工程
本発明の製造方法においては、まず、抗IL-6レセプター抗体の変異体のH鎖をコードするDNAであって、CDR領域、FR領域、及び定常領域からなる群より選択される少なくとも１つの領域中の1又は複数のアミノ酸残基が目的の他のアミノ酸に置換されたH鎖をコードするDNA、および抗IL-6レセプター抗体のL鎖をコードするDNAであって、CDR領域及びFR領域からなる群より選択される少なくとも１つの領域中の1又は複数のアミノ酸残基が目的の他のアミノ酸に置換されたL鎖をコードするDNAを発現させる。CDR領域、FR領域、及び定常領域からなる群より選択される少なくとも１つの領域中の1又は複数のアミノ酸残基が目的の他のアミノ酸に置換されたH鎖をコードするDNAは、例えば、野生型のH鎖をコードするDNAのCDR領域、FR領域、又は定常領域部分を取得し、該CDR領域、FR領域、及び定常領域からなる群より選択される少なくとも１つの領域中の特定のアミノ酸をコードするコドンが目的の他のアミノ酸をコードするよう、適宜置換を導入することによって得ることが出来る。また、CDR領域及びFR領域からなる群より選択される少なくとも１つの領域中の1又は複数のアミノ酸残基が目的の他のアミノ酸に置換されたL鎖をコードするDNAは、例えば、野生型のL鎖をコードするDNAのCDR領域及び/又はFR領域を取得し、該CDR領域、FR領域中の特定のアミノ酸をコードするコドンが目的の他のアミノ酸をコードするよう、適宜置換を導入することによって得ることが出来る。
また、あらかじめ、野生型H鎖のCDR領域、FR領域、及び定常領域からなる群より選択される少なくとも１つの領域中の1又は複数のアミノ酸残基が目的の他のアミノ酸に置換されたタンパク質をコードするDNAを設計し、該DNAを化学的に合成することによって、CDR領域、FR領域、及び定常領域からなる群より選択される少なくとも１つの領域中の1又は複数のアミノ酸残基が目的の他のアミノ酸に置換されたH鎖をコードするDNAを得ることも可能である。またL鎖についても、野生型L鎖のCDR領域及び/又はFR領域の1又は複数のアミノ酸残基が目的の他のアミノ酸に置換されたタンパク質をコードするDNAを設計し、該DNAを化学的に合成することによって、CDR領域及び/又はFR領域の1又は複数のアミノ酸残基が目的の他のアミノ酸に置換されたL鎖をコードするDNAを得ることも可能である。
アミノ酸置換の種類としては、これに限定されるものではないが、本明細書に記載の置換が挙げられる。
また、CDR領域、FR領域、及び定常領域からなる群より選択される少なくとも１つの領域中において、1又は複数のアミノ酸残基が目的の他のアミノ酸に置換されたH鎖をコードするDNAは、部分DNAに分けて製造することができる。部分DNAの組み合わせとしては、例えば、可変領域をコードするDNAと定常領域をコードするDNA、あるいはFab領域をコードするDNAとFc領域をコードするDNAなどが挙げられるが、これら組み合わせに限定されるものではない。L鎖をコードするDNAもまた、同様に部分DNAに分けて製造することができる。
上記DNAを発現させる方法としては、以下の方法が挙げられる。例えば、H鎖可変領域をコードするDNAを、H鎖定常領域をコードするDNAとともに発現ベクターに組み込みH鎖発現ベクターを構築する。同様に、L鎖可変領域をコードするDNAを、L鎖定常領域をコードするDNAとともに発現ベクターに組み込みL鎖発現ベクターを構築する。これらのH鎖、L鎖の遺伝子を単一のベクターに組み込むことも出来る。発現ベクターとしては例えばSV40 virus basedベクター、EB virus basedベクター、BPV（パピローマウイルス）basedベクターなどを用いることができるが、これらに限定されるものではない。
以上の方法で作製された抗体発現ベクターにより宿主細胞を共形質転換する。宿主細胞としてはCHO細胞(チャイニーズハムスター卵巣)等上述の細胞の他にも大腸菌、酵母や枯草菌などの微生物や動植物の個体が用いられる（Nature Biotechnology 25, 563 - 565 (2007)、Nature Biotechnology 16, 773 - 777 (1998)、Biochemical and Biophysical Research Communications 255, 444-450 (1999)、Nature Biotechnology 23, 1159 - 1169 (2005)、Journal of Virology 75, 2803-2809 (2001)、Biochemical and Biophysical Research Communications 308, 94-100 (2003)）。また、形質転換にはリポフェクチン法(R.W.Malone et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,6077 (1989), P.L.Felgner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,7413 (1987)、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法(F.L.Graham & A.J.van der Eb,Virology 52,456-467(1973))、DEAE-Dextran法等が好適に用いられる。
抗体の製造においては、次に、工程（ａ）で得られた発現産物を回収する。発現産物の回収は、例えば、形質転換体を培養した後、形質転換体の細胞内又は培養液より分離することによって行うことが出来る。抗体の分離、精製には、遠心分離、硫安分画、塩析、限外濾過、１ｑ、ＦｃＲｎ、プロテインA、プロテインGカラム、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて行うことができる。
なお、本発明の定常領域は、当業者であれば抗体の取得方法に準じて適宜行うことが出来る。
さらに本発明は、以下の(A)〜(X)からなる群より選択される少なくとも１つの工程を含む、抗IL-6レセプター抗体のIL-6レセプターへの結合活性又は中和活性を増強する方法に関する。
(A) 配列番号：１に記載のアミノ酸配列（HCDR1）において１番目のSerを他のアミノ酸に置換する工程
(B) 配列番号：１に記載のアミノ酸配列（HCDR1）において５番目のTrpを他のアミノ酸に置換する工程
(C) 配列番号：２に記載のアミノ酸配列（HCDR2）において１番目のTyrを他のアミノ酸に置換する工程
(D) 配列番号：２に記載のアミノ酸配列（HCDR2）において８番目のThrを他のアミノ酸に置換する工程
(E) 配列番号：２に記載のアミノ酸配列（HCDR2）において９番目のThrを他のアミノ酸に置換する工程
(F) 配列番号：３に記載のアミノ酸配列（HCDR3）において１番目のSerを他のアミノ酸に置換する工程
(G) 配列番号：３に記載のアミノ酸配列（HCDR3）において２番目のLeuを他のアミノ酸に置換する工程
(H) 配列番号：３に記載のアミノ酸配列（HCDR3）において５番目のThrを他のアミノ酸に置換する工程
(I) 配列番号：３に記載のアミノ酸配列（HCDR3）において７番目のAlaを他のアミノ酸に置換する工程
(J) 配列番号：３に記載のアミノ酸配列（HCDR3）において８番目のMetを他のアミノ酸に置換する工程
(K) 配列番号：３に記載のアミノ酸配列（HCDR3）において１番目のSerおよび５番目のThrを他のアミノ酸に置換する工程
(L) 配列番号：３に記載のアミノ酸配列（HCDR3）において２番目のLeu、７番目のAlaおよび８番目のMetを他のアミノ酸に置換する工程
(M) 配列番号：４に記載のアミノ酸配列（LCDR1）において１番目のArgを他のアミノ酸に置換する工程
(N) 配列番号：４に記載のアミノ酸配列（LCDR1）において４番目のGlnを他のアミノ酸に置換する工程
(O) 配列番号：４に記載のアミノ酸配列（LCDR1）において９番目のTyrを他のアミノ酸に置換する工程
(P) 配列番号：４に記載のアミノ酸配列（LCDR1）において１１番目のAsnを他のアミノ酸に置換する工程
(Q) 配列番号：５に記載のアミノ酸配列（LCDR2）において２番目のThrを他のアミノ酸に置換する工程
(R) 配列番号：６に記載のアミノ酸配列（LCDR3）において１番目のGlnを他のアミノ酸に置換する工程
(S) 配列番号：６に記載のアミノ酸配列（LCDR3）において３番目のGlyを他のアミノ酸に置換する工程
(T) 配列番号：４に記載のアミノ酸配列（LCDR1）において９番目のTyrを他のアミノ酸に置換する工程および配列番号：６に記載のアミノ酸配列（LCDR3）において３番目のGlyを他のアミノ酸に置換する工程
(U) 配列番号：６に記載のアミノ酸配列（LCDR3）において5番目のThrを他のアミノ酸に置換する工程
(V) 配列番号：６に記載のアミノ酸配列（LCDR3）において１番目のGlnおよび５番目のThrを他のアミノ酸に置換する工程
(W) 配列番号：２に記載のアミノ酸配列（HCDR2）において９番目のThrを他のアミノ酸に置換する工程および配列番号：３に記載のアミノ酸配列（HCDR3）において１番目のSerおよび５番目のThrを他のアミノ酸に置換する工程
(X) (V)及び(W)に記載の工程。
上記(A)において、置換後のアミノ酸はアフィニティーが向上する限り特に限定されないが、Trp、Thr、またはAsp、Asn、Arg、Val、Phe、Ala、Gln、Tyr、Leu、His、GluまたはCysへの置換が好ましい。
上記(B)において、置換後のアミノ酸はアフィニティーが向上する限り特に限定されないが、IleまたはValへの置換が好ましい。
上記(C)において、置換後のアミノ酸はアフィニティーが向上する限り特に限定されないが、Pheへの置換が好ましい。
上記(D)において、置換後のアミノ酸はアフィニティーが向上する限り特に限定されないが、Argへの置換が好ましい。
上記(E)において、置換後のアミノ酸はアフィニティーが向上する限り特に限定されないが、Ser又はAsnへの置換が好ましい。
上記(F)において、置換後のアミノ酸はアフィニティーが向上する限り特に限定されないが、Ile、Val、ThrまたはLeuへの置換が好ましい。
上記(G)において、置換後のアミノ酸はアフィニティーが向上する限り特に限定されないが、Thrへの置換が好ましい。
上記(H)において、置換後のアミノ酸はアフィニティーが向上する限り特に限定されないが、Ala、IleまたはSerへの置換が好ましい。他の好ましい置換としては5番目のThrのSerへの置換が挙げられる。
上記(I)において、置換後のアミノ酸はアフィニティーが向上する限り特に限定されないが、SerまたはValへの置換が好ましい。
上記(J)において、置換後のアミノ酸はアフィニティーが向上する限り特に限定されないが、Leuへの置換が好ましい。
上記(K)において、置換後のアミノ酸はアフィニティーが向上する限り特に限定されないが、1番目のSerをLeuに、５番目のThrをAlaに置換することが好ましい。 又、他の好ましい置換として、１番目のSerのValへの置換及び5番目のThrのAlaへの置換、１番目のSerのIleへの置換及び5番目のThrのAlaへの置換、１番目のSerのThrへの置換及び5番目のThrのAlaへの置換、１番目のSerのValへの置換及び5番目のThrのIleへの置換、１番目のSerのIleへの置換及び5番目のThrのIleへの置換、１番目のSerのThrへの置換及び5番目のThrのIleへの置換、または１番目のSerのLeuへの置換及び5番目のThrのIleへの置換を挙げることができる。
上記(L)において、置換後のアミノ酸はアフィニティーが向上する限り特に限定されないが、2番目のLeuをThrに、7番目のAlaをValに、8番目のMetをLeuに置換することが好ましい。
上記(M)において、置換後のアミノ酸はアフィニティーが向上する限り特に限定されないが、Pheへの置換が好ましい。
上記(N)において、置換後のアミノ酸はアフィニティーが向上する限り特に限定されないが、ArgまたはThrへの置換が好ましい。
上記(O)において、置換後のアミノ酸はアフィニティーが向上する限り特に限定されないが、Pheへの置換が好ましい。
上記(P)において、置換後のアミノ酸はアフィニティーが向上する限り特に限定されないが、Serへの置換が好ましい。
上記(Q)において、置換後のアミノ酸はアフィニティーが向上する限り特に限定されないが、Glyへの置換が好ましい。
上記(R)において、置換後のアミノ酸はアフィニティーが向上する限り特に限定されないが、Gly、AsnまたはSerへの置換が好ましい。
上記(S)において、置換後のアミノ酸はアフィニティーが向上する限り特に限定されないが、Serへの置換が好ましい。
上記(T)において、置換後のアミノ酸はアフィニティーが向上する限り特に限定されないが、配列番号:４に記載のアミノ酸配列（LCDR1）のTyrはPheに置換に置換されることが好ましく、配列番号:６に記載のアミノ酸配列（LCDR3）のGlyはSerに置換されることが好ましい。
上記(U)において、置換後のアミノ酸はアフィニティーが向上する限り特に限定されないが、ArgまたはSerへの置換が好ましい。
上記(V)において、置換後のアミノ酸はアフィニティーが向上する限り特に限定されないが、1番目のGlnをGlyに、5番目のThrをSerに置換することが好ましい。又、他の好ましい置換として１番目のGlnのGlyへの置換及び5番目のThrのArgへの置換を挙げることができる。
上記(W)において、配列番号:２に記載のアミノ酸配列(HCDR2)の9番目のThrはAsnに置換されていることが好ましい。又、配列番号:３に記載のアミノ酸配列(HCDR3)の１番目のSerおよび5番目のThrの置換後のアミノ酸の好ましい組み合わせとして、LeuおよびAla、ValおよびAla、IleおよびAla、ThrおよびAla、ValおよびIle、IleおよびIle、ThrおよびIle、またはLeuおよびIleを挙げることができる。
上述の(A)〜(X)の工程において、アミノ酸の置換を行う方法は特に限定されないが、例えば上述の部位特異的変異誘発法や実施例に記載の方法によって行うことが出来る。アミノ酸置換が重鎖可変領域に対して行われる場合には置換前の基となる重鎖可変領域のアミノ酸配列はヒト化PM-1の重鎖可変領域のアミノ酸配列であることが好ましく、アミノ酸置換が軽鎖可変領域に対して行われる場合には置換前の基となる軽鎖可変領域のアミノ酸配列はヒト化PM-1の軽鎖可変領域のアミノ酸配列であることが好ましい。又、上述の(A)〜(X)の工程に記載のアミノ酸置換はヒト化PM-1抗体に対して行われることが好ましい。
本発明の抗IL-6レセプター抗体の結合活性または中和活性を増強する方法は、少なくとも、上述の(A)〜(X)のいずれかに記載の工程を含むものであればよい。即ち本発明の方法は、上述の(A)〜(X)のいずれかに記載の工程のうち、2以上の工程を含んでもよい。さらに、上述の(A)〜(X)のいずれかに記載の工程が含まれる限り、他の工程（例えば、上述の(A)〜(X)以外のアミノ酸の置換、欠失、付加および／または挿入など）が含まれていてもよい。また例えば、FRのアミノ酸配列の置換、欠失、付加および／または挿入等が行われていてもよいし、定常領域のアミノ酸配列の置換、欠失、付加および／または挿入等が行われていてもよい。上述のアミノ酸置換はヒト化PM-1抗体に対して行われることが好ましい。
<抗IL-6レセプター抗体免疫原性リスクを低減させる方法>
また本発明は、配列番号：５に記載のアミノ酸配列（LCDR2）において2番目のThrをGlyに置換する工程を含む、抗IL-6レセプター抗体の免疫原性を低下させる方法に関する。本発明の抗IL-6レセプター抗体の免疫原性を低下させる方法は、配列番号：５に記載のアミノ酸配列（LCDR2）において2番目のThrをGlyに置換する工程を含む限り、他のアミノ酸置換を含むものであってもよい。アミノ酸置換の方法は特に限定されるものではないが、例えば上述の部位特異的変異誘発法や実施例の記載の方法によって行うことが出来る。
上述のアミノ酸置換はヒト化PM-1抗体、またはその改変（置換、欠損、挿入）体に対して行われることが好ましい。
<抗IL-6レセプター抗体の等電点を低下させる方法>
また本発明は、以下の(i)〜(xv)からなる群より選択される少なくとも１つの工程を含む、抗IL-6レセプター抗体の等電点を低下させる方法に関する。
(i) 配列番号：７に記載のアミノ酸配列（HFR1）において16番目のGlnを他のアミノ酸に置換する工程
(ii) 配列番号：８に記載のアミノ酸配列（HFR2）において8番目のArgを他のアミノ酸に置換する工程
(iii) 配列番号：９に記載のアミノ酸配列（HFR3）において16番目のArgを他のアミノ酸に置換する工程
(iv) 配列番号：１０に記載のアミノ酸配列（HFR4）において3番目のGlnを他のアミノ酸に置換する工程
(v) 配列番号：１１に記載のアミノ酸配列（LFR1）において18番目のArgを他のアミノ酸に置換する工程
(vi) 配列番号：１２に記載のアミノ酸配列（LFR2）において11番目のLysを他のアミノ酸に置換する工程
(vii) 配列番号：１３に記載のアミノ酸配列（LFR3）において23番目のGlnを他のアミノ酸に置換する工程
(viii) 配列番号：１４に記載のアミノ酸配列（LFR4）において10番目のLysを他のアミノ酸に置換する工程
(ix) 配列番号：1に記載のアミノ酸配列（HCDR1）において1番目のSerを他のアミノ酸に置換する工程
(x) 配列番号：4に記載のアミノ酸配列（LCDR1）において1番目のArgを他のアミノ酸に置換する工程
(xi) 配列番号：5に記載のアミノ酸配列（LCDR2）において4番目のArgを他のアミノ酸に置換する工程
(xii) 配列番号：７に記載のアミノ酸配列（HFR1）において13番目のArgを他のアミノ酸に置換する工程
(xiii) 配列番号：２に記載のアミノ酸配列（HFR1）または配列番号：１００に記載のアミノ酸配列において１５番目のLysおよび／または１６番目のSerを他のアミノ酸に置換する工程
(xiv) 配列番号：４に記載のアミノ酸配列（LCDR1）または配列番号：１０１に記載のアミノ酸配列において４番目のGlnを他のアミノ酸に置換する工程
(xv) 配列番号：５に記載のアミノ酸配列（LCDR2）または配列番号：１０３に記載のアミノ酸配列において６番目のHisを他のアミノ酸に置換する工程
上記(i)において、置換後のアミノ酸は等電点が低下する限り特に限定されないが、Gluへの置換が好ましい。
上記(ii)において、置換後のアミノ酸は等電点が低下する限り特に限定されないが、Gluへの置換が好ましい。
上記(iii)において、置換後のアミノ酸は等電点が低下する限り特に限定されないが、Lysへの置換が好ましい。
上記(iv)において、置換後のアミノ酸は等電点が低下する限り特に限定されないが、Gluへの置換が好ましい。
上記(v)において、置換後のアミノ酸は等電点が低下する限り特に限定されないが、Serへの置換が好ましい。
上記(vi)において、置換後のアミノ酸は等電点が低下する限り特に限定されないが、Gluへの置換が好ましい。
上記(vii)において、置換後のアミノ酸は等電点が低下する限り特に限定されないが、Gluへの置換が好ましい。
上記(viii)において、置換後のアミノ酸は等電点が低下する限り特に限定されないが、Gluへの置換が好ましい。
上記(ix)において、置換後のアミノ酸は等電点が低下する限り特に限定されないが、Aspへの置換が好ましい。
上記(x)において、置換後のアミノ酸は等電点が低下する限り特に限定されないが、Glnへの置換が好ましい。
上記(xi)において、置換後のアミノ酸は等電点が低下する限り特に限定されないが、Gluへの置換が好ましい。
上記(xii)において、置換後のアミノ酸は等電点が低下する限り特に限定されないが、Lysへの置換が好ましい。
上記(xiii)において、置換後のアミノ酸は等電点が低下する限り特に限定されないが、１５番目のLysはGlnへ、１６番目のSerはAspへの置換が好ましい。
上記(xiv)において、置換後のアミノ酸は等電点が低下する限り特に限定されないが、Gluへの置換が好ましい。
上記(xv)において、置換後のアミノ酸は等電点が低下する限り特に限定されないが、Gluへの置換が好ましい。
上述の(i)〜(xv)の工程において、アミノ酸の置換の方法は特に限定されないが、例えば上述の部位特異的変異誘発法や実施例に記載の方法によって行うことが出来る。アミノ酸置換が重鎖可変領域に対して行われる場合には置換前の基となる重鎖可変領域のアミノ酸配列はヒト化PM-1の重鎖可変領域のアミノ酸配列であることが好ましく、アミノ酸置換が軽鎖可変領域に対して行われる場合には置換前の基となる軽鎖可変領域のアミノ酸配列はヒト化PM-1の軽鎖可変領域のアミノ酸配列であることが好ましい。又、上述の(i)〜(xv)の工程に記載のアミノ酸置換はヒト化PM-1抗体に対して行われることが好ましい。
本発明の抗IL-6レセプター抗体の等電点を低下する方法は、少なくとも、上述の(i)〜(xv)のいずれかに記載の工程を含むものであればよい。即ち本発明の方法は、上述の(i)〜(xv)に記載の工程のうち、2以上の工程を含んでもよい。さらに、上述の(i)〜(xv)のいずれかに記載の工程が含まれる限り、他の工程（例えば、上述の(i)〜(xv)以外のアミノ酸の置換、欠失、付加および／または挿入など）が含まれていてもよい。また例えば、定常領域のアミノ酸配列の置換、欠失、付加および／または挿入等が行われていてもよい。
<抗IL-6レセプター抗体安定性を向上させる方法>
また本発明は、以下の(α)〜(ζ)からなる群より選択される少なくとも１つの工程を含む、抗IL-6レセプター抗体の安定性を増加させる方法に関する。
(α) 配列番号：９に記載のアミノ酸配列（HFR3）において4番目のMetを他のアミノ酸に置換する工程。
(β) 配列番号：９に記載のアミノ酸配列（HFR3）において5番目のLeuを他のアミノ酸に置換する工程。
(γ) 配列番号：２に記載のアミノ酸配列（HCDR2）において9番目のThrを他のアミノ酸に置換する工程。
(δ) 配列番号：６に記載のアミノ酸配列（LCDR3）において5番目のThrを他のアミノ酸に置換する工程。
(ε) 配列番号：２に記載のアミノ酸配列（HCDR2）において16番目のSerを他のアミノ酸に置換する工程。
(ζ) 配列番号：１０に記載のアミノ酸配列（FR4）において5番目のSerを他のアミノ酸に置換する工程。
上記(α)において、置換後のアミノ酸は安定性が増加する限り特に限定されないが、Ileへの置換が好ましい。
上記(β)において、置換後のアミノ酸は安定性が増加する限り特に限定されないが、Serへの置換が好ましい。
上記(γ)において、置換後のアミノ酸は安定性が増加する限り特に限定されないが、Asnへの置換が好ましい。
上記(δ)において、置換後のアミノ酸は安定性が増加する限り特に限定されないが、Serへの置換が好ましい。
上記(ε)において、置換後のアミノ酸は安定性が増加する限り特に限定されないが、Glyへの置換が好ましい。
上記(ζ)において、置換後のアミノ酸は安定性が増加する限り特に限定されないが、Ileへの置換が好ましい。
上述の(α)〜(ζ)の工程において、アミノ酸の置換の方法は特に限定されないが、例えば上述の部位特異的変異誘発法や実施例に記載の方法によって行うことが出来る。アミノ酸置換が重鎖可変領域に対して行われる場合には置換前の基となる重鎖可変領域のアミノ酸配列はヒト化PM-1の重鎖可変領域のアミノ酸配列であることが好ましく、アミノ酸置換が軽鎖可変領域に対して行われる場合には置換前の基となる軽鎖可変領域のアミノ酸配列はヒト化PM-1の軽鎖可変領域のアミノ酸配列であることが好ましい。又、上述の(α)〜(ζ)のアミノ酸置換はヒト化PM-1抗体に対して行われることが好ましい。
本発明の抗IL-6レセプター抗体の安定性を増加する方法は、少なくとも、上述の(α)〜(ζ)のいずれかに記載の工程を含むものであればよい。即ち本発明の方法は、上述の(α)〜(ζ)に記載の工程のうち、2以上の工程を含んでもよい。さらに、上述の(α)〜(ζ)のいずれかに記載の工程が含まれる限り、他の工程（例えば、上述の(α)〜(ζ)以外のアミノ酸の置換、欠失、付加および／または挿入など）が含まれていてもよい。また例えば、定常領域のアミノ酸配列の置換、欠失、付加および／または挿入等が行われていてもよい。
<抗IL-6レセプター抗体の免疫原性を低下させる方法>
さらに本発明は配列番号：７に記載のアミノ酸配列（HFR1）において13番目のArgをLysに、16番目のGlnをGluに、23番目のThrをAlaに、及び／または30番目のThrをSerに置換する工程を含む、抗IL-6レセプター抗体、特にヒト化PM-1抗体の免疫原性を低下させる方法に関する。本発明の抗IL-6レセプター抗体の免疫原性を低下させる方法は、配列番号：７に記載のアミノ酸配列（HFR1）において30番目のThrをSerに置換する工程を含む限り、他のアミノ酸置換を含むものであってもよい。
さらに本発明は配列番号：９０に記載のアミノ酸配列（HFR3）において２７番目のAlaをValに置換する工程を含む、抗IL-6レセプター抗体、特にヒト化PM-1抗体の免疫原性を低下させる方法に関する。本発明の抗IL-6レセプター抗体の免疫原性を低下させる方法は、配列番号：９０に記載のアミノ酸配列（HFR3）において２７番目のAlaをValに置換する工程を含む限り、他のアミノ酸置換を含むものであってもよい。
アミノ酸置換の方法は特に限定されるものではないが、例えば上述の部位特異的変異誘発法や実施例の記載の方法によって行うことが出来る。
さらに本発明は抗IL-6レセプター抗体、特にヒト化PM-1抗体、H53/L28、あるいはPF1抗体のFR3を配列番号：１２８または配列番号：１２９のアミノ酸配列を有するFR3とすることにより抗体の免疫原性を低下させる方法に関する。
<抗体の酸性条件下における安定性を向上させる方法>
また本発明は、配列番号：２０に記載のアミノ酸配列（IgG2）において、２７６番目（EUナンバリングの397番目）のMetを他のアミノ酸に置換する工程を含む、抗体の酸性条件下における安定性を向上させる方法に関する。本発明の抗体の酸性条件下における安定性を向上させる方法は、配列番号：２０に記載のアミノ酸配列（IgG2）において２７６番目（EUナンバリングの397番目）のMetを他のアミノ酸に置換する工程を含む限り、他のアミノ酸置換を含むものであってもよい。置換後のアミノ酸は特に限定されないがValへの置換が好ましい。アミノ酸置換の方法は特に限定されるものではないが、例えば上述の部位特異的変異誘発法や実施例に記載の方法によって行うことが出来る。
対象となる抗体は特に限定されないが、抗ヒトIL-6レセプター抗体であることが好ましく、さらにヒト化PM-1抗体、またはその改変（置換、欠損、挿入）体であることが好ましい。
<IgG2定常領域のヒンジ部分に由来するヘテロジェニティーを改善する方法>
また本発明は、配列番号：２０に記載のアミノ酸配列（IgG2）において、１４番目（EUナンバリング131番目）のCysを他のアミノ酸に置換する工程、１６番目（EUナンバリングの133番目）のArgを他のアミノ酸に置換する工程、および／または１０２番目（EUナンバリングの219番目）のCysを他のアミノ酸に置換する工程を含む、抗体のヘテロジェニティーを改善する方法に関する。置換後のアミノ酸は特に限定されないが、１４番目のCysはSerに、１６番目のArgはLysに、１０２番目のCysはSerに置換されることが好ましい。本発明の抗体のヘテロジェニティーを改善する方法は、配列番号：２０に記載のアミノ酸配列（IgG2）において、１４番目（EUナンバリング131番目）のCysを置換する工程、１６番目（EUナンバリングの133番目）のArgを置換する工程、および／または１０２番目（EUナンバリングの219番目）のCysを置換する工程を含む限り、他のアミノ酸置換を含むものであってもよい。アミノ酸置換の方法は特に限定されるものではないが、例えば上述の部位特異的変異誘発法や実施例の記載の方法によって行うことが出来る。置換されるアミノ酸は上述の３つのアミノ酸全てが置換されてもよいし、１又は２（例えば14番目と102番目、など）のアミノ酸が置換されてもよい。
対象となる抗体は特に限定されないが、抗ヒトIL-6レセプター抗体であることが好ましく、さらにヒト化PM-1抗体、またはその改変（置換、欠損、挿入）体であることが好ましい。
<IgG2定常領域のC末端アミノ酸欠損に由来するヘテロジェニティーを低減させる方法>
また本発明は、配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を有するIgG2定常領域において、３２５番目（EUナンバリングの４４６番目）のGlyおよび３２６番目（EUナンバリングの４４７番目）のLysを欠損させる工程を含む、抗体のヘテロジェニティーを改善する方法に関する。本発明の抗体のヘテロジェニティーを改善する方法は、配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を有するIgG2定常領域において、３２５番目（EUナンバリングの４４６番目）のGlyおよび３２６番目（EUナンバリングの４４７番目）のLysを欠損させる工程を含む限り、他のアミノ酸置換を含んでもよい。アミノ酸置換の方法は特に限定されるものではないが、例えば上述の部位特異的変異誘発法や実施例の記載の方法によって行うことが出来る。
対象となる抗体は特に限定されないが、抗ヒトIL-6レセプター抗体であることが好ましく、さらにヒト化PM-1抗体、またはその改変（置換、欠損、挿入）体であることが好ましい。
<IgG2定常領域のヒト配列を維持したままFcγRへの結合を低減させる方法>
また本発明は、配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を有するIgG2定常領域において、２０９番目（EU330）のAlaをSerに置換する工程、２１０番目（EU331）のProをSerに置換する工程、および２１８番目（EU339）のThrをAlaに置換する工程を含む、抗体のFcγRへの結合を低減させる方法に関する。本発明の抗体のFcγRへの結合を低減させる方法は、配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を有するIgG2定常領域において、２０９番目（EU330）のAlaをSerに置換する工程、２１０番目（EU331）のProをSerに置換する工程、および２１８番目（EU339）のThrをAlaに置換する工程を含む限り、他のアミノ酸置換を含むものであってもよい。アミノ酸置換の方法は特に限定されるものではないが、例えば上述の部位特異的変異誘発法や実施例の記載の方法によって行うことが出来る。
<IgG2定常領域のアミノ酸を置換することにより薬物動態を向上する方法>
また本発明は、配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を有するIgG2定常領域において、147番目(EU268)のHis、234番目(EU355)のArg及び／又は298番目(EU419)のGlnを他のアミノ酸に置換する工程を含む、抗体の薬物動態を向上する方法に関する。本発明の薬物動態を向上する方法は、上述の工程を含む限り、他のアミノ酸置換を含むものであってもよい。置換後のアミノ酸は特に限定されないが、147番目(EU268)のHisはGlnに、234番目(EU355)のArgはGlnに、298番目(EU419)のGlnはGluに置換されることが好ましい。
また本発明は、配列番号：２０又は配列番号：１５１（M58）のアミノ酸配列を有するIgG2定常領域において、313番目(EU434)のAsnを他のアミノ酸に置換する工程を含む、抗体の薬物動態を向上する方法に関する。置換後のアミノ酸は特に限定されないが、Alaへの置換が好ましい。本発明の薬物動態を向上する方法は、上述の工程を含む限り、他のアミノ酸置換を含むものであってもよい。
対象となる抗体は特に限定されないが、抗ヒトIL-6レセプター抗体であることが好ましく、さらにヒト化PM-1抗体、またはその改変（置換、欠損、挿入）体であることが好ましい。
また本発明は、配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を有するIgG2定常領域において、下記に記載の工程を含む、IgG2のヒンジ部分に由来するヘテロジェニティーを低減させる方法、酸性条件下での安定性を向上させる方法、C末端に由来するヘテロジェニティーを低減させる方法および／または抗体のFcγRへの結合を低減させる方法に関する（M14ΔGK）。
（ａ）配列番号：２０の２０９番目（EUナンバリング３３０）のAlaをSerに置換する工程、
（ｂ）配列番号：２０の２１０番目（EUナンバリング３３１）のProをSerに置換する工程、
（ｃ）配列番号：２０の２１８番目（EUナンバリング３３９）のThrをAlaに置換する工程、
（ｄ）配列番号：２０の２７６番目（EUナンバリング３９７）のMetをValに置換する工程、
（ｅ）配列番号：２０の１４番目（EUナンバリング１３１）のCysをSerに置換する工程、
（ｆ）配列番号：２０の１６番目（EUナンバリング１３３）のArgをLysに置換する工程、
（ｇ）配列番号：２０の１０２番目（EUナンバリング２１９）のCysをSerに置換する工程、
（ｈ）配列番号：２０の２０番目（EUナンバリング１３７）のGluをGlyに置換する工程、
（ｉ）配列番号：２０の２１番目（EUナンバリング１３８）のSerをGlyに置換する工程、
及び
（ｊ）配列番号：２０の３２５番目のGly及び３２６番目のLys（EUナンバリング４４６および４４７）を欠損させる工程。
本発明の方法は、上記工程を含む限り、他のアミノ酸置換や欠損、その他工程を含むものであってもよい。アミノ酸の置換や欠損の方法は特に限定されるものではないが、例えば上述の部位特異的変異誘発法や実施例の記載の方法によって行うことが出来る。
対象となる抗体は特に限定されないが、抗ヒトIL-6レセプター抗体であることが好ましく、さらにヒト化PM-1抗体、またはその改変（置換、欠損、挿入）体であることが好ましい。
また本発明は、配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を有するIgG2定常領域において、下記に記載の工程を含む、IgG2のヒンジ部分に由来するヘテロジェニティーを低減させる方法、酸性条件下での安定性を向上させる方法、および／またはC末端に由来するヘテロジェニティーを低減させる方法に関する（M31ΔGK）。
（ａ）配列番号：２０の２７６番目（EUナンバリング３９７）のMetをValに置換する工程、
（ｂ）配列番号：２０の１４番目（EUナンバリング１３１）のCysをSerに置換する工程、
（ｃ）配列番号：２０の１６番目（EUナンバリング１３３）のArgをLysに置換する工程、
（ｄ）配列番号：２０の１０２番目（EUナンバリング２１９）のCysをSerに置換する工程、
（ｅ）配列番号：２０の２０番目（EUナンバリング１３７）のGluをGlyに置換する工程、
（ｆ）配列番号：２０の２１番目（EUナンバリング１３８）のSerをGlyに置換する工程、
及び
（ｇ）配列番号：２０の３２５番目のGly及び３２６番目のLys（EUナンバリング４４６および４４７）を欠損させる工程。
また本発明は配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を有するIgG2定常領域において、下記に記載の工程を含む、IgG2のヒンジ部分に由来するヘテロジェニティーを低減させる方法、薬物動態を向上する方法および／またはC末端に由来するヘテロジェニティーを低減させる方法に関する（Ｍ５８）。
（ａ）配列番号：２０の１４番目（EUナンバリング131番目）のCysをSerに置換する工程、
（ｂ）配列番号：２０の１６番目（EUナンバリング133番目）のArgをLysに置換する工程、
（ｃ）配列番号：２０の１０２番目（EUナンバリング219番目）のCysをSerに置換する工程、
（ｄ）配列番号：２０の２０番目（EUナンバリング137番目）のGluをGlyに置換する工程、
（ｅ）配列番号：２０の２１番目（EUナンバリング138番目）のSerをGlyに置換する工程、
（ｆ）配列番号：２０の１４７番目（EUナンバリング２６８番目）のHisをGlnに置換する工程、
（ｇ）配列番号：２０の２３４番目（EUナンバリング３５５番目）のArgをGlnに置換する工程、
（ｈ）配列番号：２０の２９８番目（EUナンバリング４１９番目）のGlnをGluに置換する工程、
（ｉ）配列番号：２０の３２５番目（EUナンバリング446番目）のGlyおよび３２６番目（EUナンバリング447番目）のLysを欠損させる工程。
また本発明は配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有するIgG2定常領域において、下記に記載の工程を含む、IgG2のヒンジ部分に由来するヘテロジェニティーを低減させる方法、薬物動態を向上する方法および／またはC末端に由来するヘテロジェニティーを低減させる方法に関する（Ｍ７３）。
（ａ）配列番号：２０の１４番目（EUナンバリング131番目）のCysをSerに置換する工程、
（ｂ）配列番号：２０の１６番目（EUナンバリング133番目）のArgをLysに置換する工程、
（ｃ）配列番号：２０の１０２番目（EUナンバリング219番目）のCysをSerに置換する工程、
（ｄ）配列番号：２０の２０番目（EUナンバリング137番目）のGluをGlyに置換する工程、
（ｅ）配列番号：２０の２１番目（EUナンバリング138番目）のSerをGlyに置換する工程、
（ｆ）配列番号：２０の１４７番目（EUナンバリング２６８番目）のHisをGlnに置換する工程、
（ｇ）配列番号：２０の２３４番目（EUナンバリング３５５番目）のArgをGlnに置換する工程、
（ｈ）配列番号：２０の２９８番目（EUナンバリング４１９番目）のGlnをGluに置換する工程、
（ｉ）配列番号：２０の３１３番目（EUナンバリング４３４番目）のAsnをAlaに置換する工程、
（ｊ）配列番号：２０の３２５番目（EUナンバリング446番目）のGlyおよび３２６番目（EUナンバリング447番目）のLysを欠損させる工程。
また本発明は、配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を有するIgG2定常領域において、下記に記載の工程を含む、IgG2のヒンジ部分に由来するヘテロジェニティーを低減させる方法、C末端に由来するヘテロジェニティーを低減させる方法および／または抗体のFcγRへの結合を低減させる方法に関する（M86ΔGK）。
（ａ）配列番号：２０の２０９番目（EUナンバリング３３０）のAlaを他のアミノ酸に置換する工程、
（ｂ）配列番号：２０の２１０番目（EUナンバリング３３１）のProを他のアミノ酸に置換する工程、
（ｃ）配列番号：２０の２１８番目（EUナンバリング３３９）のThrを他のアミノ酸に置換する工程、
（ｄ）配列番号：２０の１４番目（EUナンバリング１３１）のCysを他のアミノ酸に置換する工程、
（ｅ）配列番号：２０の１６番目（EUナンバリング１３３）のArgを他のアミノ酸に置換する工程、
（ｆ）配列番号：２０の１０２番目（EUナンバリング２１９）のCysを他のアミノ酸に置換する工程、
（ｇ）配列番号：２０の２０番目（EUナンバリング１３７）のGluを他のアミノ酸に置換する工程、
（ｈ）配列番号：２０の２１番目（EUナンバリング１３８）のSerを他のアミノ酸に置換する工程、
及び
（ｉ）配列番号：２０の３２５番目のGly及び３２６番目のLys（EUナンバリング４４６および４４７）を欠損させる工程。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、２０９番目（EUナンバリング３３０）のAlaをSer、２１０番目（EUナンバリング３３１）のProをSer、２１８番目（EUナンバリング３３９）のThrをAla、１４番目（EUナンバリング１３１）のCysをSer、１６番目（EUナンバリング１３３）のArgをLys、１０２番目（EUナンバリング２１９）のCysをSer、２０番目（EUナンバリング１３７）のGluをGly、２１番目（EUナンバリング１３８）のSerをGlyに置換することが好ましい。
さらに本発明は、配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を有するIgG2定常領域において、下記に記載の工程を含む、IgG2のヒンジ部分に由来するヘテロジェニティーを低減させる方法および／またはC末端に由来するヘテロジェニティーを低減させる方法に関する（M40ΔGK）。
（ａ）配列番号：２０の１４番目（EUナンバリング１３１）のCysを他のアミノ酸に置換する工程、
（ｂ）配列番号：２０の１６番目（EUナンバリング１３３）のArgを他のアミノ酸に置換する工程、
（ｃ）配列番号：２０の１０２番目（EUナンバリング２１９）のCysを他のアミノ酸に置換する工程、
（ｄ）配列番号：２０の２０番目（EUナンバリング１３７）のGluを他のアミノ酸に置換する工程、
（ｅ）配列番号：２０の２１番目（EUナンバリング１３８）のSerを他のアミノ酸に置換する工程、
及び
（ｆ）配列番号：２０の３２５番目のGly及び３２６番目のLys（EUナンバリング４４６および４４７）を欠損させる工程。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、１４番目（EUナンバリング１３１）のCysをSer、１６番目（EUナンバリング１３３）のArgをLys、１０２番目（EUナンバリング２１９）のCysをSer、２０番目（EUナンバリング１３７）のGluをGly、２１番目（EUナンバリング１３８）のSerをGlyに置換することが好ましい。
本発明の方法は、上記工程を含む限り、他のアミノ酸置換や欠損、その他工程を含むものであってもよい。アミノ酸の置換や欠損の方法は特に限定されるものではないが、例えば上述の部位特異的変異誘発法や実施例の記載の方法によって行うことが出来る。
対象となる抗体は特に限定されないが、抗ヒトIL-6レセプター抗体であることが好ましく、さらにヒト化PM-1抗体、またはその改変（置換、欠損、挿入）体であることが好ましい。
<IgG4定常領域の酸性条件下における安定性を向上させる方法>
本発明はまた、配列番号：２１に記載のアミノ酸配列を有するIgG4定常領域（Mol Immunol. 1993 Jan;30(1):105-8.）において、２８９番目（EUナンバリング409番目）のArgを他のアミノ酸に置換する工程を含む、抗体の酸性条件下における安定性を向上させる方法に関する。本発明の抗体の酸性条件下における安定性を向上させる方法は、配列番号：２１に記載のアミノ酸配列（ヒトIgG4定常領域）において２８９番目（EUナンバリング409番目）のArgを他のアミノ酸に置換する工程を含む限り、他のアミノ酸置換を含んでもよい。置換後のアミノ酸は特に限定されないが、Lysへの置換が好ましい。アミノ酸置換の方法は特に限定されるものではないが、例えば上述の部位特異的変異誘発法や実施例の記載の方法によって行うことが出来る。
対象となる抗体は特に限定されないが、抗ヒトIL-6レセプター抗体であることが好ましく、さらにヒト化PM-1抗体、またはその改変（置換、欠損、挿入）体であることが好ましい。
<IgG4定常領域のC末端アミノ酸欠損に由来するヘテロジェニティーを低減させる方法>
また本発明は、配列番号：２１に記載のアミノ酸配列を有するIgG4定常領域（Mol Immunol. 1993 Jan;30(1):105-8.）において、３２６番目（EUナンバリングの４４６番目）のGlyおよび３２７番目（EUナンバリングの４４７番目）のLysを欠損させる工程を含む、抗体のヘテロジェニティーを改善する方法に関する。本発明のヘテロジェニティーを改善する方法は、配列番号：２１に記載のアミノ酸配列を有するIgG4定常領域（Mol Immunol. 1993 Jan;30(1):105-8.）において、３２７番目（EUナンバリングの４４７番目）のLysおよび／または３２６番目（EUナンバリングの４４６番目）のGlyを欠損させる工程を含む限り、他のアミノ酸置換を含んでもよい。アミノ酸置換の方法は特に限定されるものではないが、例えば上述の部位特異的変異誘発法や実施例の記載の方法によって行うことが出来る。
対象となる抗体は特に限定されないが、抗ヒトIL-6レセプター抗体であることが好ましく、さらにヒト化PM-1抗体、またはその改変（置換、欠損、挿入）体であることが好ましい。
また本発明は、配列番号：２１に記載のアミノ酸配列を有するIgG4定常領域（Mol Immunol. 1993 Jan;30(1):105-8.）において、下記に記載の工程を含む、IgG4の酸性条件下での安定性を向上させる方法、C末端に由来するヘテロジェニティーを低減させる方法、抗体のFcγRへの結合を低減させる方法に関する（M11ΔGK）。
（ａ）配列番号：２１の１４番目（EUナンバリング１３１）のCysをSerに置換する工程、
（ｂ）配列番号：２１の１６番目（EUナンバリング１３３）のArgをLysに置換する工程、
（ｃ）配列番号：２１の２０番目（EUナンバリング１３７）のGluをGlyに置換する工程、
（ｄ）配列番号：２１の２１番目（EUナンバリング１３８）のSerをGlyに置換する工程、
（ｅ）配列番号：２１の９７番目（EUナンバリング２１４）のArgをThrに置換する工程、
（ｆ）配列番号：２１の１００番目（EUナンバリング２１７）のSerをArgに置換する工程、
（ｇ）配列番号：２１の１０２番目（EUナンバリング２１９）のTyrをSerに置換する工程、
（ｈ）配列番号：２１の１０３番目（EUナンバリング２２０）のGlyをCysに置換する工程、
（ｉ）配列番号：２１の１０４番目（EUナンバリング２２１）のProをValに置換する工程、
（ｊ）配列番号：２１の１０５番目（EUナンバリング２２２）のProをGluに置換する工程、
（ｋ）配列番号：２１の１１３番目（EUナンバリング２３３）のGluをProに置換する工程、
（ｌ）配列番号：２１の１１４番目（EUナンバリング２３４）のPheをValに置換する工程、
（ｍ）配列番号：２１の１１５番目（EUナンバリング２３５）のLeuをAlaに置換する工程、
（ｎ）配列番号：２１の１１６番目（EUナンバリング２３６）のGlyを欠損する工程、
（ｏ）配列番号：２１の２８９番目（EUナンバリング４０９）のArgをLysに置換する工程、及び
（ｐ）配列番号：２１の３２６番目（EUナンバリング４４６）のGlyおよび３２７番目（EUナンバリング４４７）のLysを欠損させる工程。
本発明の方法は、上記工程を含む限り、他のアミノ酸置換や欠損、その他工程を含むものであってもよい。アミノ酸の置換や欠損の方法は特に限定されるものではないが、例えば上述の部位特異的変異誘発法や実施例の記載の方法によって行うことが出来る。
対象となる抗体は特に限定されないが、抗ヒトIL-6レセプター抗体であることが好ましく、さらにヒト化PM-1抗体、またはその改変（置換、欠損、挿入）体であることが好ましい。
<IgG1定常領域のC末端アミノ酸欠損に由来するヘテロジェニティーを低減させる方法>
また本発明は、配列番号：１９に記載のアミノ酸配列を有するIgG1定常領域において、３２９番目（EUナンバリングの４４６番目）のGlyおよび３３０番目（EUナンバリングの４４７番目）のLysを欠損させる工程を含む、抗体のヘテロジェニティーを改善する方法に関する。本発明の抗体のヘテロジェニティーを改善する方法は、配列番号：１９に記載のアミノ酸配列を有するIgG1定常領域において、３３０番目（EUナンバリングの４４７番目）のLysおよび３２９番目（EUナンバリングの４４６番目）のGlyを欠損させる工程を含む限り、他のアミノ酸置換を含んでもよい。アミノ酸置換の方法は特に限定されるものではないが、例えば上述の部位特異的変異誘発法や実施例の記載の方法によって行うことが出来る。
<IgG1定常領域のアミノ酸を置換することにより薬物動態を向上する方法>
また本発明は、配列番号：１９に記載のアミノ酸配列を有するIgG1定常領域において、３１７番目(EU434)のAsnを他のアミノ酸に置換する工程を含む、抗体の薬物動態を向上する方法に関する。置換後のアミノ酸は特に限定されないが、Alaへの置換が好ましい。本発明の薬物動態を向上する方法は、上述の工程を含む限り、他のアミノ酸置換を含むものであってもよい。
また本発明は配列番号：１９に記載のアミノ酸配列を有するIgG1定常領域において、下記に記載の工程を含む薬物動態を向上する方法及び／又はC末端に由来するヘテロジェニティーを低減させる方法に関する。（M83）
（ａ）配列番号：１９の３１７番目(EU434)のAsnを他のAlaに置換する工程、
（ｂ）配列番号：１９の３３０番目（EUナンバリングの447番目）のLysおよび３２９番目（EUナンバリングの446番目）のGlyを欠損させる工程。
対象となる抗体は特に限定されないが、抗ヒトIL-6レセプター抗体であることが好ましく、さらにヒト化PM-1抗体、またはその改変（置換、欠損、挿入）体であることが好ましい。
上述の本発明の定常領域は如何なる抗体由来の可変領域とも組み合わせることが可能であるが、好ましくはヒトIL-6レセプターに対する抗体由来の可変領域と組み合わせられる。ヒトIL-6レセプターに対する抗体の可変領域の例としては、ヒト化PM-1抗体の可変領域を挙げることができる。ヒト化PM-1抗体の可変領域はアミノ酸置換などが行われていない可変領域でもよし、上述のアミノ酸置換などが行われた可変領域でもよい。
本発明は、本発明の抗体を含む、医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、関節リウマチ等のIL-6が関連する疾患の治療において有用である。
本発明の医薬組成物は、抗体に加えて医薬的に許容し得る担体を導入し、公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート80（TM）、HCO-50と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
投与は好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。
また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。抗体または抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物の投与量としては、例えば、一回につき体重1kgあたり0.0001mgから1000mgの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり0.001から100000mg/bodyの範囲で投与量を選ぶことができるが、これらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
本明細書で用いられているアミノ酸の3文字表記と1文字表記の対応は以下の通りである。
アラニン：Ala：A
アルギニン：Arg：R
アスパラギン：Asn：N
アスパラギン酸：Asp：D
システイン：Cys：C
グルタミン：Gln：Q
グルタミン酸：Glu：E
グリシン：Gly：G
ヒスチジン：His：H
イソロイシン：Ile：I
ロイシン：Leu：L
リジン：Lys：K
メチオニン：Met：M
フェニルアラニン：Phe：F
プロリン：Pro：P
セリン：Ser：S
スレオニン：Thr：T
トリプトファン：Trp：W
チロシン：Tyr：Y
バリン：Val：V
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕アフィニティーマチュレーション技術を用いたCDR改変による抗原結合能の向上
SR344の調製
J.Biochem. 108, 673-676 (1990)で報告されているN末端側１番目から344番目のアミノ酸配列からなる可溶性ヒトIL-6R（以下、SR344）（Yamasakiら、Science 1988；241：825-828 (GenBank # X12830)）のCHO細胞定常発現株を作製した。
SR344発現CHO細胞から得られた培養上清から、Blue Sepharose 6 FFカラムクロマトグラフィー、SR344に対する特異抗体を固定したカラムによるアフィニティクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーの3つのカラムクロマトグラフィーにより、SR344を精製した。
20 mM トリス−塩酸緩衝液、pH 8.0で平衡化したBlue Sepharose 6 FF column（GEヘルスケアバイオサイエンス）に培養上清をそのまま添加し、同緩衝液で非吸着の画分を完全に洗い流した。この後、カラムは300 mMのKClを含む同緩衝液で洗浄した。さらに、300 mM KCl存在下の同緩衝液中で、0 Mから0.5 MまでのKSCNの直線濃度勾配により、吸着した蛋白を溶出した。KSCNの濃度勾配で溶出した画分を、SR344に特異的な抗体を用いたWestern Blottingで分析し、SR344を含む画分を集めた。
SR344に対する特異抗体を固定したカラムは、あらかじめTBS（Tris-Buffered-Saline）で平衡化しておいた。これに第一工程で得られたSR344画分を、Amicon Ultra-15（MILLIPORE、分子量カットオフ 10 kDa）による限外ろ過で濃縮し、TBSで2倍希釈してから添加した。TBSでカラムを洗浄後、100 mM グリシン−塩酸緩衝液、pH 2.5で、吸着した蛋白を溶出した。溶出した画分は、1 M Tris、pH 8.1を添加してpHを中性に戻した。得られた画分をSDS-PAGEで分析し、SR344が含まれる画分を集めた。
第二工程で得られた画分は、Amicon Ultra-15（分子量カットオフ 10 kDa）で濃縮し、PBSで平衡化したSuperdex200カラム（GEヘルスケアバイオサイエンス）に添加した。メインピークとして溶出した画分を、SR344の最終精製品とした。
ヒトgp130発現BaF3細胞株の樹立
IL-6依存増殖性を示す細胞株を得るために、以下に示すとおり、ヒトgp130を発現したBaF3細胞株の樹立を行った。
全長ヒトgp130 cDNA (Hibiら、Cell 1990；63：1149-1157 (GenBank # NM_002184))をPCRにより増幅し、pCHOI (Hirataら、FEBS Letter 1994；356：244-248)のDHFR遺伝子発現部位を除去し、Zeocin耐性遺伝子発現部位を挿入した発現ベクターpCOS2Zeoにクローニングし、pCOS2Zeo/gp130を構築した。全長ヒトIL-6R cDNAをPCRにより増幅し、pcDNA3.1(+) (Invitrogen)にクローニングし、hIL-6R/pcDNA3.1(+)を構築した。
10 μgのpCOS2Zeo/gp130をPBSに懸濁したBaF3細胞（0.8x107 cells）に混合し、Gene Pulser (Bio-Rad)を用いて0.33 kV, 950μFDの容量でパルスを加えた。エレクトロポーレーション処理により遺伝子導入したBaF3細胞を0.2 ng/mLのmouse interleukin-3（Peprotech）、10% Fetal Bovine Serum（以下FBS、HyClone）を含むRPMI1640培地（Invitrogen）で一昼夜培養し、100 ng/mLのhuman interleukin-6 (R&D systems)、100 ng/mL のhuman interleukin-6 soluble receptor (R&D systems)および10％ FBSを含むRPMI1640培地を加えて選抜し、ヒトgp130発現BaF3細胞株（以下、BaF3/gp130）を樹立した。このBaF/gp130は、human interleukin-6 (R&D systems)およびSR344存在下で増殖することから、抗IL-6レセプター抗体の増殖阻害活性（すなわちIL-6レセプター中和活性）の評価に使用することが可能である。
CDR改変ライブラリーの構築
まず始めに、ヒト化PM1抗体（Cancer Res. 1993 Feb 15;53(4):851-6）の scFv 化を行った。VH、VL領域をPCRによって増幅し、リンカー配列GGGGSGGGGSGGGGS（配列番号：１０６）をVH、VLの間に持つヒト化PM1 HL scFvを作製した。
作製したヒト化PM1 HL scFv DNAを鋳型にしたPCRにより、各CDRアミノ酸のうちの一つのアミノ酸がXとなるターゲットライブラリー、及びCDR中のHot Spot配列のみをランダム配列にしたライブラリーを作製した。各CDRアミノ酸のうちの一つのアミノ酸がXとなるターゲットライブラリーについては、ライブラリー化したいアミノ酸をNNSとしたプライマーを用いたPCR反応によってライブラリー部分を構築、それ以外の部分を通常のPCRによって作製し、assembly PCR法により連結して構築した。この際、一つのCDRのみがライブラリー化されるようにした（J.Mol.Biol 1996 ; 256 : 77-88参考）。また、Hot Spot配列のみをランダム配列にしたライブラリーについては、Hot Spotアミノ酸全てをNNSとしたプライマーを用いたPCRにより同様に構築した。この際、VHのHot Spotのみがライブラリー化されたライブラリー、VLのHot Spotのみがライブラリー化されたライブラリーを構築した（Nature Biotechnology 1999 June;17:568-572参考）。
これらのライブラリーを用い、J. Immunological Methods 1999 ;231:119-135に習い、ribosome display用ライブラリーを構築した。大腸菌無細胞系in vitro translationを行うために、SDA配列(ribosome binding site)、T7 promoterを5’側に付加し、ribosome display用のリンカーとして3’側にgene3部分配列をSfi Iを用いてligationした。
Ribosome displayによる高アフィニティーscFvの取得
Nature Biotechnology 2000 Dec ; 18 : 1287-1292 に習い、ribosome displayによるパンニングを行った。調製されたSR344を、NHS-PEO4-Biotin (Pierce)を用いてbiotin化し抗原とした。アフィニティーの高いscFvを効率的に取得するために、JBC 2004 ; 279(18) : 18870-18877を参考にし、off-rate selectionを行った。Biotin化抗原量を1 nM、競合抗原量を1 uM、4th roundでの競合時間を10 O/Nとした。
scFvのphagemideへの挿入と抗原結合性、配列解析
4th roundで得られたDNA poolを鋳型とし、特異的プライマーを用いてPCRすることによりHL scFvを復元した。Sfi Iで消化し、同様にSfi Iで消化したphagemideベクターpELBG lacIベクターに挿入し、XL1-Blue (stratagene)にtransformした。得られたコロニーを用い、phage ELISAによる抗原結合性評価とHL scFv配列解析を行った。J.Mol.Biol 1992 ; 227 : 381-388に習い、SR344を1 ug/mLでcoatingしたプレートを用いたphage-ELISAを行った。SR344への結合性が認められたクローンについて、特異的プライマーを用い、配列解析を行った。
scFvからのIgG化とIgG発現及び精製
動物細胞発現用ベクターを用いてIgGの発現を行った。変異箇所の濃縮が認められたクローンについて、VH、および、VLをそれぞれPCRによって増幅し、XhoI/NheI消化およびEcoRI消化により動物細胞発現用ベクターに挿入した。各DNA断片の塩基配列は、BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）を用い、DNAシークエンサーABI PRISM 3730xL DNA SequencerまたはABI PRISM 3700 DNA Sequencer（Applied Biosystems）にて、添付説明書記載の方法に従い決定した。
IgG化した抗体の発現
抗体の発現は以下の方法を用いて行った。ヒト胎児腎癌細胞由来HEK293H株（Invitrogen）を10 % Fetal Bovine Serum (Invitrogen)を含むDMEM培地(Invitrogen)へ懸濁し、5〜6 × 105個 /mLの細胞密度で接着細胞用ディッシュ（直径10 cm, CORNING）の各ディッシュへ10 mLずつ蒔きこみCO2インキュベーター（37℃、5 % CO2）内で一昼夜培養した後に、培地を吸引除去し、CHO-S-SFM-II（Invitrogen）培地6.9 mLを添加した。調製したプラスミドDNA混合液（合計13.8μg）を1μg/mL Polyethylenimine (Polysciences Inc.) 20.7μLとCHO-S-SFMII培地 690μLと混合して室温10分間静置したものを各ディッシュの細胞へ投入し、4〜5時間、CO2インキュベーター（37℃にて5 % CO2）内でインキュベートした。その後、CHO-S-SFM-II（Invitrogen）培地6.9 mLを添加して、3日間 CO2インキュベーター内で培養した。培養上清を回収した後、遠心分離（約2000 g、5分間、室温）して細胞を除去し、さらに0.22μmフィルターMILLEX(登録商標)-GV（Millipore）を通して滅菌した。該サンプルは使用するまで4℃で保存した。
IgG化した抗体の精製
得られた培養上清にTBS中に懸濁させた50μLのrProtein A SepharoseTM Fast Flow（Amersham Biosciences）を添加し、4℃で4時間以上転倒混和した。その溶液を0.22μmのフィルターカップUltrafree(登録商標)-MC（Millipore）に移し、TBS 500μLにて3回洗浄後、rProtein A SepharoseTM樹脂に100μLの50 mM 酢酸ナトリウム水溶液, pH 3.3に懸濁して2分間静置したのち、抗体を溶出させた。直ちに、6.7μLの1.5M Tris-HCl , pH 7.8を加えて中和した。溶出は2回行い、200μLの精製抗体を得た。抗体を含む溶液2μLをND-1000 Spectrophotometer（NanoDrop）、あるいは50μLを分光光度計DU-600（BECKMAN）に供し、280 nmでの吸光度を測定した。得られた値から以下の式を用いて抗体濃度を算出した。
抗体濃度（mg/mL）＝吸光度×希釈倍率÷14.6×10
IgG化したクローンのヒトIL-6レセプター中和活性評価
IL-6/IL-6レセプター依存性増殖を示すBaF3/gp130を用いて、IL-6レセプター中和活性を評価した。BaF3/gp130を10% FBSを含むRPMI1640培地で3回洗浄した後に、5x104 cells/mLとなるように60 ng/mLのhuman interleukin-6 (TORAY)、60 ng/mL の組換え可溶性ヒトIL-6レセプター（SR344）および10% FBSを含むRPMI1640培地に懸濁し、96 well-plate (CORNING)の各wellに50μLずつ分注した。次に、精製した抗体を10% FBSを含むRPMI1640に希釈して、各wellに50μLずつ混合した。37℃、5% CO2条件下で、3日間培養し、PBSで2倍に希釈したWST-8試薬（Cell Counting Kit-8、株式会社同仁化学研究所）を20μL/wellで加え、直後にSUNRISE CLASSIC(TECAN)を用いて450 nmの吸光度（参照波長620 nm）を測定した。2時間培養した後に、再度450 nmの吸光度（参照波長620 nm）を測定し、2時間の吸光度変化を指標にIL-6レセプター中和活性を評価した。
その結果、ヒト化PM1抗体（野生型：WT）と比較して活性の高い抗体が複数得られた。WTよりも高い活性を示す抗体の変異箇所を図４に示した。例えば図１に示すとおり、RD_6はWTより100％阻害濃度として約50倍程度高い中和活性を示すことが分かった。
IgG化したクローンのBiacoreによるアフィニティー解析
活性が野生型よりも高かったものについてBiacore T100 (BIACORE) を用いて、抗原抗体反応の速度論的解析を行った。センサーチップ上に rec-Protein A (ZYMED) (以下、Protein A)を1800RUから2600RU固定化し、そこに種々の抗体を結合させ、そこに抗原をアナライトとして流し、抗体と抗原の相互作用を測定した。抗原には種々の濃度に調整した recombinant human IL-6R sR(R&D systems)（以下rhIL-6sR）を用いた。測定は全て25℃で行った。測定で得られたセンサーグラムから、カイネティクスパラメーターである結合速度定数 ka (1/Ms) 、および解離速度定数 kd (1/s) を算出し、その値をもとに KD (M) を算出した。各パラメーターの算出には Biacore T100 Evaluation Software (BIACORE)を用いた。
その結果、ヒト化PM1抗体（野生型：WT）と比較しアフィニティーの高い抗体が複数得られた。例えば、野生型（WT）とRD_6のセンサーグラムを図２及び３に示した。カイネティクスパラメーター解析結果より、RD_6はWTより約50倍高いアフィニティーを示すことが分かった（表１）。他にも数10倍高いアフィニティーを持つ抗体が得られた。WTよりも高いアフィニティーを示す変異箇所を図４に示した。
Figure 0005566108
〔実施例２〕各CDR改変の組み合わせによる抗原結合能の向上
活性及びアフィニティーが高い変異箇所については、変異箇所の融合を行い、より高活性、高アフィニティーの抗体作製を行った。
改変抗体の作製・発現・精製
選定された箇所について改変抗体を作製するためのアミノ酸改変を行った。具体的には、QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)を用いて、添付説明書記載の方法で、作製したH(WT)可変領域（H(WT)、塩基配列番号：１０７）、および、L(WT)鎖可変領域（L(WT)、塩基配列番号：１０８）に変異を導入した。目的のヒト化抗体可変領域遺伝子配列であることが確認されたH鎖抗体遺伝子断片挿入プラスミドをXhoIおよびNotIで消化した後に、L鎖抗体遺伝子断片挿入プラスミドをEcoRIで消化した後に、反応液を1 %アガローズゲル電気泳動に供した。目的のサイズ（約400 bp）のDNA断片をQIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いて添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水30μlで溶出した。その後、動物細胞発現用ベクターに H鎖抗体遺伝子断片を挿入し、目的のH鎖発現ベクターを作製した。また、同様にしてL鎖発現ベクターを作製した。連結反応はRapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics)を用い、大腸菌DH5α株 (東洋紡績)を形質転換した。各DNA断片の塩基配列は、BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）を用い、DNAシークエンサーABI PRISM 3730xL DNA SequencerまたはABI PRISM 3700 DNA Sequencer（Applied Biosystems）にて、添付説明書記載の方法に従い決定した。作製した発現ベクターを用いて実施例１に記した方法で発現、精製を行った。
ヒトIL-6レセプター中和活性評価
精製した抗体の中和活性の評価を実施例１に示す方法で行った。ただし、human interleukin-6 (TORAY)濃度を600 ng/mLにして中和活性の評価を行った。WTと比較して高い活性を示す新規抗体が複数得られ、それらのCDR配列を図５に示した。その中でも高い活性を示した抗体としてH鎖にRDC_5H、L鎖にRDC_11Lを用いた抗体（RDC_23とする）の中和活性を図６に示した。RDC_23はWTと比較して100％阻害濃度として約100倍高い活性を持つことが明らかになった。H鎖にRDC_5H、L鎖にRDC_11Lを用いた抗体であるRDC_23のみならず、H鎖にRDC_2H、RDC_3H、RDC_4H、RDC_5H、RDC_6H、RDC_7H、RDC_8H、RDC_27H、RDC_28H、RDC_29H、RDC_30H、RDC_32H、L鎖にL(WT)を用いた抗体(それぞれ、RDC_2、RDC_3、RDC_4、RDC_5、RDC_6、RDC_7、RDC_8、RDC_27、RDC_28、RDC_29、RDC_30、RDC_32とする)、および、H鎖にH(WT)、L鎖にRDC_11Lを用いた抗体(RDC_11とする)においても中和活性の向上が確認され、アフィニティーマチュレーションで見出された変異箇所を組み合わせることで、より高い中和活性を有する抗体が取得可能であることが明らかとなった。また、これら変異箇所を組み合わせた抗体は中和活性が向上していることから、アフィニティーも向上していると考えられた。
ProteinAを用いたBiacoreによるアフィニティー解析
そこで、中和活性が向上した抗体のうちRDC_2、RDC_3、RDC_4、RDC_5、RDC_6、RDC_7、RDC_8、RDC_11、RDC_23について Biacore T100 (BIACORE) を用いて、抗原抗体反応の速度論的解析を行った。センサーチップ上にアミンカップリング法で rec-Protein A (ZYMED) を 4400 RU から 5000 RU 固定化し、そこに種々の抗体を結合させ、そこに抗原をアナライトとして流し、抗体と抗原の相互作用を測定した。抗原には種々の濃度に調整した rhIL-6sRを用いた。測定は全て25℃で行った。測定で得られたセンサーグラムから、カイネティクスパラメーターである結合速度定数 ka (1/Ms)、および解離速度定数 kd (1/s) を算出し、その値をもとに KD (M) を算出した。各パラメーターの算出には Biacore T100 Evaluation Software (BIACORE)を用いた。その結果、変異箇所を組み合わせたRDC_2、RDC_3、RDC_4、RDC_5、RDC_6、RDC_7、RDC_8、RDC_11、RDC_23 は同時に測定した 変異箇所が1ヶ所であるRD_28 よりも小さい KD 値を有していた (表２)。その中でも高いアフィニティーを示したRDC_23に関して図７にセンサーグラムを示した。
Figure 0005566108
 このことから、これらの抗体のアフィニティーは変異箇所の組み合わせ前の抗体よりも強いと考えられた。中和活性と同様、アフィニティーマチュレーションで見出された変異箇所を組み合わせることで、より高いアフィニティーを有する抗体が取得可能であることが明らかとなった。WTと比較して高い活性あるいはアフィニティーを示す変異体のアミノ酸配列は以下のとおりである（WTからの変異箇所に下線）。
（HCDR2）
配列番号：４５ YISYSGITNYNPSLKS
（HCDR3）
配列番号：５７ LLARATAMDY
配列番号：５８ VLARATAMDY
配列番号：５９ ILARATAMDY
配列番号：６０ TLARATAMDY
配列番号：６１ VLARITAMDY
配列番号：６２ ILARITAMDY
配列番号：６３ TLARITAMDY
配列番号：６４ LLARITAMDY
（LCDR3）
配列番号：７９ GQGNRLPYT
すなわち、HCDR2の９番目のアミノ酸がAsnであり、HCDR3の1番目のアミノ酸がLeu、Val、Ile、Thrのいずれかから選択され、HCDR3の5番目のアミノ酸がAla、Ileのいずれかから選択され、LCDR3の1番目のアミノ酸がGlyであり、LCDR3の5番目のアミノ酸がArgである抗体を作製することで、WTよりも中和活性、およびアフィニティーが著しく向上した抗IL-6レセプター抗体を作製することが可能である。
Protein A/Gを用いたBiacoreによるアフィニティー解析
Biacore T100 (BIACORE) を用いて、WTおよびRDC_23の抗原抗体反応の速度論的解析を行った。センサーチップ上にPurified Recomb Protein A/G (Pierce) (以下、Protein A/G) を固定化し、そこに種々の抗体を結合させ、そこに抗原をアナライトとして流し、抗体と抗原の相互作用を測定した。抗原には種々の濃度に調整したrhIL-6sR (R&D systems)、および、組換え可溶型IL-6レセプター（実施例１において調製したSR344）を用いた。バキュロウィルス感染昆虫細胞より産生されたrhIL-6sRは糖鎖構造がハイマンノース型であるのに対して、CHO細胞より産生されたSR344は糖鎖構造が複合型糖鎖であり末端にシアル酸が結合していると考えられる。実際のヒト生体内の可溶型IL-6レセプターの糖鎖構造が複合型糖鎖であり末端にシアル酸が結合していると考えられることから、SR344のほうがヒト生体内の可溶型IL-6レセプターの構造に近いと考え、本実験ではrhIL-6sRとSR344の比較試験を実施した。
測定で得られたセンサーグラムから、カイネティクスパラメーターである結合速度定数 ka (1/Ms) 、および解離速度定数 kd (1/s) を算出し、その値をもとに KD (M) を算出した。各パラメーターの算出には Biacore T100 Evaluation Software(BIACORE) を用いた。
センサーチップは、アミンカップリング法により Protein A/G をCM5 (BIACORE) に約 3000 RU 固定化することで作製した。作製したセンサーチップを用いて、Protein A/G に結合させた抗体 (WT と RDC_23) と rhIL-6sR および SR344 の2種類の可溶型IL-6レセプターとの相互作用の速度論的解析を行った。ランニングバッファーには HBS-EP+ を用い、流速は 20 μL/min とした。各抗体は Protein A/G に約 100 RU 結合するよう調製した。アナライトとして用いた rhIL-6sR は HBS-EP+ を用いて、0、0.156、0.313、0.625 μg/mL に調製し、SR344 は 0、0.0654、0.131、0.261 μg/mL に調整した。測定はまず目的の抗体である WT と RDC_23 をProtein A/G に結合させ、そこへアナライト溶液を 3 分間相互作用させ、その後 HBS-EP+(BIACORE) に切り替え 10 分間解離相を測定した。解離相の測定終了後、10 μL の 10 mM glycine-HCl (pH1.5) で洗浄し、センサーチップを再生した。この結合・解離・再生を分析の 1 サイクルとした。実験は全て 37 ℃で行った。
WT と RDC_23 それぞれについてこのサイクルに従って測定を行い、rhIL-6sR および SR344 の2種類の可溶型IL-6レセプターについて得られたセンサーグラムを図８、図９、図１０、および、図１１に示した。得られたセンサーグラムについて、Biacore 専用のデータ解析ソフトウェアである Biacore T100 Evaluation Softwareを用いて速度論的な解析を行った(表３)。その結果、rhIL-6sRとSR344の比較において、WTおよびRDC_23ともにSR344を用いたほうが得られるアフィニティーが２〜３倍弱くなることが明らかとなった。RDC_23はrhIL-6sRとSR344の両方に対して、WTと比較して４０〜６０倍程度アフィニティーが向上しており、アフィニティーマチュレーションにより得られた各CDR改変の組み合わせにより、ヒト生体内の可溶型IL-6レセプターの構造に近いと考えられるSR344に対しても、WTと比較して非常に強いアフィニティーを示すことが明らかとなった。以降の実施例においては、測定は全て37℃において、SR344およびprotein A/Gを用いた抗原抗体反応の速度論的解析を行うこととする。
Figure 0005566108
〔実施例３〕CDRおよびフレームワーク改変による薬物動態の向上と免疫原性リスクを低減させたH53/L28の創製
Cancer Res. 1993 Feb 15;53(4):851-6においてヒト化されたマウスPM1抗体（以降Wild type、WTと略、H鎖WTをH(WT)とし、L鎖WTをL(WT)とする）の薬物動態の向上、免疫原性リスクの低減、および安定性の向上を目指して以下のように改変を実施した。薬物動態を向上させるために、WTのH鎖可変領域およびL鎖可変領域配列に等電点を低下させる改変の導入を行った。
ヒト化PM1抗体の立体構造モデルの作製
はじめにヒト化PM1抗体(H(WT)/L(WT))の可変領域表面に露出するアミノ酸残基を確認するために、MOEソフトウェア（Chemical Computing Group Inc．）を用いて、ホモロジーモデリングによりヒト化されたマウスPM1抗体のFv領域モデルを作製した。
ヒト化PM1抗体の等電点低下のための改変箇所の選定
作製したモデルの詳細な解析により、等電点を低下させる改変導入箇所としてFR配列においては表面に露出するアミノ酸の中で、H16、H43、H81、H105、L18、L45、L79、L107（Kabatナンバリング、Kabat EA et al． 1991． Sequences of Proteins of Immunological Interest．NIH）が、CDR配列としてはH31、H64、H65、L24、L27、L53、L55が、活性や安定性を低下させること無く、等電点を低下させることができる候補になると考えられた。
ヒト化PM1抗体に残存するマウス配列の除去
ヒト化PM1抗体はマウスPM1抗体をヒト化した抗体配列である（Cancer Res. 1993 Feb 15;53(4):851-6）。ヒト化PM1抗体のH鎖は、ヒト抗体可変領域であるNEWのフレームワークにCDRグラフティングしているが、H鎖のH27、H28、H29、H30、H71は活性保持のためマウス配列をそのまま利用している。免疫原性のリスクを考えるとマウス配列は少なければ少ないほど良いと考えられるため、H27、H28、H29、H30をヒト配列にするための配列を探索した。
ヒト化PM1抗体の安定性向上を目指した改変箇所の選定
ヒト化PM1抗体(H(WT)/L(WT))の可変領域において、H65のセリンからグリシンへの置換（ターン構造の安定化、HCDR2のコンセンサス配列への改変することで安定化）、H69のメチオニンからイソロイシンへの置換（疎水コア構造を安定化）、および、H70のロイシンからセリンへの置換（表面露出残基を親水化することで安定化）、H58のスレオニンからアスパラギンへの置換（HCDR2のコンセンサス配列への改変することで安定化）、L93のスレオニンからセリンへの置換（表面露出残基を親水化することで安定化）、H107のセリンからイソロイシン（βシートの安定化）を行うことで安定性を向上させること可能と考え、これらの改変は安定性を向上させる候補になると考えられた。
ヒト化PM1抗体のIn silicoで予測されたT-cellエピトープの除去
はじめにヒト化PM1抗体(H(WT)/L(WT))の可変領域をTEPITOPE（Methods. 2004 Dec;34(4):468-75）を用いて解析を行った。その結果、L鎖CDR2に、多くのHLAに結合するT-cellエピトープが存在することが示された。そこで、TEPITOPE解析においてL鎖CDR2の免疫原性リスクを低減させつつ、安定性、結合活性、中和活性を低下させない改変を検討した。その結果、L鎖CDR2のL51のスレオニンをグリシンに置換することで、安定性、結合活性、中和活性を低下させずにHLAに結合するT-cellエピトープを除去できることが明らかとなった。
各フレームワーク配列の選定
一般公開されているKabat Database (ftp://ftp．ebi．ac．uk/pub/databases/kabat/) およびIMGT Database (http://imgt．cines．fr/)よりヒト抗体アミノ酸配列データを入手し、構築したデータベースを用いることで、各フレームに分けてホモロジー検索が可能である。ヒトフレームワークの選定にあたり、等電点の低下、残存するマウス配列の除去、安定性の向上の観点から上述した各項目の改変を有するヒトフレームワーク配列をデータベースにて検討を行った。その結果、以下に示すとおり改変抗体H53/L28の各フレームワークを以下の配列にすることで結合活性、中和活性を低下させることなく、上述した項目を満たすことが明らかになった。Sourceはそのヒト配列の由来であり、配列のうち下線部のアミノ酸残基がWTと比較して改変を導入したアミノ酸である。
Figure 0005566108
 また、上述のH53のFR3は非ヒト配列が存在しているため、さらに免疫原性リスクを低減することが望ましい。免疫原性リスクを低減する改変として、H89のAlaをValに置換した配列（配列番号：１２７）にすることが可能と考えられる。さらにH53のFR3のH71のArgは結合活性に重要であるため（Cancer Res. 1993 Feb 15;53(4):851-6）、H71がArgで保存されているヒトVH1サブクラスのFR3配列（配列番号：１２８）、あるいは、ヒトVH3サブクラスのFR3配列（配列番号：１２９）を用いることで、H鎖、L鎖ともにフレームワークとしては完全にヒト配列である抗ヒトIL-6レセプター抗体を作製可能であると考えられる。
各CDR配列の選定
CDR配列にあたり、第一に結合活性、中和活性を低下させることなく、等電点の低下、安定性の向上、T-cellエピトープの除去の観点からH53/L28の各CDR配列を以下のように選定した。
Figure 0005566108
改変抗体の発現ベクター作製・発現・精製
改変した抗体の発現ベクター作製・発現・精製は、実施例１に記した方法で行った。ヒト化されたマウスPM1抗体のH(WT)変異導入用ベクター、L(WT)変異導入用ベクターに選定されたフレームワーク配列、CDR配列になるように順次改変を導入した。最終的に得られた定されたフレームワーク配列、CDR配列を有するH53/L28（抗体アミノ酸配列 H53 配列番号：１０４、L28 配列番号：１０５）をコードする動物細胞発現用ベクターを用いて、H53/L28の発現・精製を行い、以下の評価に使用した。
改変抗体H53/L28の等電点電気泳動による等電点評価
可変領域のアミノ酸改変による全長抗体の等電点の変化について評価するために、WTと改変抗体H53/L28の等電点電気泳動による分析を実施した。等電点電気泳動は以下のとおり行った。Phastsystem Cassette (Amersham Biosciences社製) を用いて以下の膨潤液で30 minほどPhast-Gel Dry IEF (Amersham Biosciences社製)ゲルを膨潤させた。
ミリＱ水 1.5 mL
Pharmalyte 5-8 for IEF (Amersham Biosciences社製) 50μL
Pharmalyte 8-10.5 for IEF (Amersham Biosciences社製) 50μL
膨潤したゲルを用いてPhastSystem(Amersham Biosciences社製)により以下のプログラムで電気泳動を行った。サンプルはStep 2でゲルに添加した。pIマーカーとして、Calibration Kit for pI(Amersham Biosciences社製)を使用した。
Step 1: 2000 V 2.5 mA 3.5 W 15℃ 75 Vh
Step 2: 200 V 2.5 mA 3.5 W 15℃ 15 Vh
Step 3: 2000 V 2.5 mA 3.5 W 15℃ 410 Vh
泳動後のゲルは20 ％ TCAで固定した後、Silver staining Kit, protein(Amersham Biosciences社製)を用い、キットに添付されているプロトコールに従い銀染色を行った。染色後、pIマーカーの既知等電点からサンプル（全長抗体）の等電点を算出した。その結果、WTの等電点は約9.3であり、改変抗体H53/L28の等電点は約6.5〜6.7であり、WTからアミノ酸置換により等電点を約2.7低下したH53/L28が得られた。また、このH53/L28の可変領域（VH、VL配列）の理論等電点をGENETYX(GENETYX CORPORATION)により計算したところ、理論等電点は4.52であった。WTの理論等電点が9.20であることから、WTからアミノ酸置換により可変領域の理論等電点を約4.7低下したH53/L28が得られた。
H53/L28のヒトIL-6レセプター中和活性評価
WTとH53/L28を実施例１に示す方法で実施した。結果を図１２に示した。その結果、改変抗体H53/L28はWTと比較して、BaF/gp130の中和活性が数倍向上していることが明らかとなった。すなわち、H53/L28はWTと比較して、等電点を低下させつつ、中和活性を向上させることが出来た。
BiacoreによるH53/L28のヒトIL-6レセプターに対するアフィニティー解析
WTとH53/L28のヒトIL-6レセプターへの親和性評価は、Biacore T100 (BIACORE) を用いて速度論的解析を行った。センサーチップ上にPurified Recomb Protein A/G (Pierce) (以下、Protein A/G) を固定化し、そこに種々の抗体を結合させ、そこに抗原をアナライトとして流し、抗体と抗原の相互作用を測定した。抗原には種々の濃度に調整した組換え可溶型IL-6レセプター（SR344）を用いた。測定条件は実施例２と同じ条件で実施した。
得られたWTとH53/L28のセンサーグラムを図１３に示した。Biacore 専用のデータ解析ソフトウェアである Biacore T100 Evaluation Softwareを用いて速度論的な解析を行った結果を表６に示した。その結果、H53/L28はWTと比較してKDが6倍程度低下しており、アフィニティーが6倍程度向上していることが見出された。すなわちH53/L28はWTと比較して、等電点を低下させつつ、6倍程度アフィニティーを向上させることが出来た。詳細な検討の結果、affinityの向上に寄与しているアミノ酸変異はL51のスレオニンをグリシンに置換した変異であることが考えられた。すなわち、L51のスレオニンをグリシンに置換することでアフィニティーを向上させることが可能であること考えられた。
Figure 0005566108
H53/L28のTEPITOPEによるT-cellエピトープ予測
H53/L28のTEPITOPE解析（Methods. 2004 Dec;34(4):468-75）を実施した。その結果、WTに比べて、HLAに結合する可能性のあるペプチド数が大幅に減少していることが分かり、ヒトにおける免疫原性リスクが低減されたと考えられた。
〔実施例４〕H53/L28の血漿中滞留性評価
改変抗体H53/L28の正常マウス血漿中動態評価
等電点を低下させた改変抗体H53/L28の血漿中滞留性を評価するために、WTと改変抗体H53/L28の正常マウスにおける血漿中動態の比較を行った。
WTおよびH53/L28をマウス（C57BL/6J、日本チャールズリバー）に1 mg/kgで静脈内および皮下に単回投与し投与前および投与後15分間、2時間、8時間、1日間、2日間、5日間、7日間、14日間、21日間、28日間で採血を行った。ただし投与後15分間は静脈内投与群のみから採血した。採取した血液は直ちに4℃、15,000 rpmで15分間遠心分離し、血漿を得た。分離した血漿は、測定を実施するまで-20℃以下に設定された冷凍庫に保存した。
マウス血漿中濃度測定はELISA法にて測定した。まずRecombinant Human IL-6 sR (R&D Systems社製) をEZ-LinkTM Sulfo-NFS-Biotinylation Kit (PIERCE社製) を用いてBiotin化した。このBiotin化human-sIL-6RをReacti-Bind Streptavidin High Binding Capacity (HBC) Coated Plates (PIERCE社製)に分注し、室温で1時間以上静値しhuman-sIL-6R固相化プレートを作成した。血漿中濃度として3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05μg/mLの検量線試料とマウス血漿測定試料を調製し、human-sIL-6R固相化プレートに分注し室温で1時間静置した。その後Anti-human IgG-AP (SIGMA社製)を反応させ、BluePhos Microwell Phosphatase Substrates System(Kirkegaard & Perry Laboratories社製)を基質として用い発色反応を行い、マイクロプレートリーダーにて650 nmの吸光度を測定した。マウス血漿中濃度は検量線の吸光度から解析ソフトウェアSOFTmax PRO（Molecular Devices社製）を用いて算出した。WTおよびH53/L28の静脈内投与後の血漿中濃度推移を図１４に、皮下投与後の血漿中濃度推移を図１５に示した。
得られた血漿中濃度推移のデータを薬物動態解析ソフトWinNonlin（Pharsight社製）で非モデル依存的解析を行い薬物動態学的パラメーター（AUC、クリアランス（CL）、半減期(T1/2)）を算出した。T1/2は最終の3点もしくはWinNonlin が自動設定した最終相の血漿中濃度から算出した。BAは静脈内投与後のAUCに対する皮下投与後のAUCの比から算出した。得られた薬物動態的パラメーターを表７に示した。
Figure 0005566108
 H53/L28の静脈内投与後の血漿中半減期(T1/2)はWTの約1.3倍に延長し、クリアランスが約1.7倍低下した。H53/L28の皮下投与後のT1/2はWTの約2倍に延長し、クリアランスが約2.1倍低下した。このようにWTの等電点を低下させることによって、H53/L28の薬物動態を大幅に向上させることが出来た。
H53/L28は、ヒト化PM-1抗体（WT）と比較して、結合活性、中和活性を向上させ、免疫原性リスクを低減させつつ、薬物動態を大幅に向上させたヒト化抗IL-6レセプター抗体であることから、医薬品として開発する上でH53/L28で適用した改変は極めて有用であると考えられた。
〔実施例５〕PF1抗体の作製
ヒト化PM1抗体の発現ベクターおよび変異導入ベクターの作製
実施例４で作成したH53/L28に実施例２で見出されたRDC_23のアフィニティーを向上させるH鎖2ヶ所、L鎖2ヶ所、合計4ヶ所のCDRの変異を導入した。H53/L28にRDC_23の変異を導入したH鎖をPF1_Hとし、H53/L28にRDC_23の変異を導入したL鎖をPF1_Lとし、改変抗体を作製・発現・精製は実施例１に記した方法で実施した。PF1_Hのアミノ酸配列を配列番号：２２に、PF1_Lのアミノ酸配列を配列番号：２３に示す。
ヒトIL-6レセプター中和活性評価
精製したPF1抗体の中和活性の評価を実施例１に示す方法で行った。ただし、human interleukin-6 (TORAY)濃度を600 ng/mLにして中和活性の評価を行った。WTとPF1の中和活性を図１６に示した。PF1はWTと比較して100％阻害濃度として約１００〜１０００倍の活性を持つことが明らかになった。
Biacoreによる PF1 抗体のヒトIL-6レセプターに対するアフィニティー解析
本測定は実施例２と同様の条件で行った。ランニングバッファーには HBS-EP+ を用い、流速は 20 μL/minとした。各抗体は Protein A/G に約 100 RU 結合するよう調製した。アナライトとして用いた SR344 は HBS-EP+ を用いて 0、0.065、0.131、0.261 μg/mL に調整した。測定はまず抗体溶液をProtein A/G に結合させ、そこへアナライト溶液を 3 分間相互作用させ、その後 HBS-EP+ に切り替え 10もしくは 15 分間解離相を測定した。解離相の測定終了後、10 μL の 10 mM glycine-HCl (pH1.5) で洗浄し、センサーチップを再生した。この結合・解離・再生を分析の 1 サイクルとした。各種抗体についてこのサイクルに従って測定を行った。
得られたPF1のセンサーグラムを図１７に示した。得られたセンサーグラムについて、Biacore 専用のデータ解析ソフトウェアである Biacore T100 Evaluation Softwareを用いて速度論的な解析を行った結果をWTとH53/L28の結果と合わせてを表８に示した。その結果、PF1のアフィニティーはWTと比較して、約150倍向上していることが明らかとなった。アフィニティーマチュレーションの組み合わせにより得られた高アフィニティーのRDC_23、および、薬物動態を向上させ且つアフィニティーが向上したH53/L28を組み合わせたことにより、PF1のアフィニティーは相加効果によりこれらよりも高いものが得られた。
Figure 0005566108
PF1抗体の示走差査型熱量測定（DSC）による熱安定性評価
PF1抗体の熱安定性の評価を実施するために示走差査型熱量測定（DSC）による熱変性中間温度（Tm値）の評価を行った。WTとPF1の精製抗体を20mM sodium acetate, 150mM NaCl, pH6.0の溶液に対して透析(EasySEP, TOMY)を行い、約0.1mg/mLのタンパク質濃度で、40℃から100℃まで1℃/minの昇温速度でDSC測定を行った。その結果、WTのFab部分のTm値は約94℃であり、PF1のFab部分のTm値は91℃であることが分かった。一般的なIgG1タイプの抗体分子のFab部分のTm値は約60℃〜85℃の範囲にあることから（Biochem Biophys Res Commun. 2007 Apr 13;355(3):751-7.、Mol Immunol. 2007 Apr;44(11):3049-60）、得られたPF1抗体の熱安定性は一般的なIgG1分子と比較して極めて高いことが示された。
PF1抗体の高濃度安定性評価
PF1抗体の高濃度製剤における安定性の評価を行った。WTとPF1の精製抗体を20mM histidine chloride, 150mM NaCl, pH6.5の溶液に対して透析(EasySEP, TOMY)を行い、その後限外ろ過膜により濃縮し、高濃度安定性試験を行った。条件は以下のとおりである。
抗体：WTおよびPF1
緩衝液：20mM histidine chloride, 150mM NaCl, pH6.0
濃度:145mg/mL
保存温度と期間：25℃-2週、25℃-4週、25℃-7週
会合体評価法：システム Waters Alliance
カラム G3000SWxl(TOSOH)
移動相 50mM sodium phosphate, 300mM KCl, pH7.0
流速・波長 0.5ml/min、220nm
サンプルを1/100に希釈して分析
Initial（製剤調製直後）および各条件で保存後の製剤の会合体含有量を上述のゲルろ過クロマトグラフィー法により評価し、initialから会合体含量の変化量（増加量）について図１８に示した。その結果、WTおよびPF1はともに非常に高い安定性を示し、25℃-7週の会合体量増加量はWTで約0.7%程度、PF1で約0.3%であることが分かり、それぞれ25℃-1ヶ月あたりの会合体増加量はそれぞれ約0.4%と約0.17%であり、PF1は特に高濃度において極めて高い安定性を示すことが分かった。WO 2003/039485において、IgGの高濃度製剤としてすでに上市されているDaclizumabの100mg/mL製剤の25℃における安定性データが示されているが、Daclizumabの100mg/mL製剤は25℃-1ヶ月あたりの会合体増加量は約0.3%であり、PF1はDaclizumabと比較しても高濃度における安定性が極めて優れており、医薬品として高濃度の溶液製剤を開発する上では、会合体の増加は大きな課題であるが、PF1抗体は高濃度における会合体の増加が極めて少ないことが示された。
PF1は、WTに対して、抗原結合能の向上、等電点の低下による薬物動態の向上、残存するマウス配列の除去とT-cellエピトープの除去による免疫原性リスクの低減、安定性の向上を目的に改変を加えた分子であるが、実際に100mg/mL以上の高濃度製剤における安定性もWTと比較しても非常に高いことが明らかとなり、このような分子を用いることで安定且つ利便性の高い高濃度皮下投与製剤を提供することが可能である。
〔実施例６〕PF1抗体のヒトIL-6レセプタートランスジェニックマウスによるPK/PD試験
ヒトIL-6レセプタートランスジェニックマウスを用いた体内動態試験
WTおよび実施例５で作成したPF1について、ヒトIL-6レセプタートランスジェニックマウス（hIL-6R tg マウス、Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 May 23;92(11):4862-6）における体内動態およびヒト可溶型IL-6レセプターのvivoでの中和能を評価した。WTおよびPF1をhIL-6R tgマウスに10mg/kgで静脈内に単回投与し投与前および投与後15分間、2時間、4時間、8時間、1日間、2日間、4日間、7日間で採血を行った。採取した血液は直ちに4℃、15,000 rpmで15分間遠心分離し、血漿を得た。分離した血漿は、測定を実施するまで-20℃以下に設定された冷凍庫に保存した。
マウス血漿中濃度測定はELISA法にて測定した。血漿中濃度として6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1μg/mLの検量線試料を調整した。検量線試料およびマウス血漿測定試料をAnti-human IgG(γ-chain specific) F(ab')2(Sigma社製)で固相化したイムノプレート（Nunc-Immuno Plate,MaxiSorp(Nalge nunc International社製)）に分注し、室温で1時間静置後、Goat Anti-Human IgG-BIOT(Southern Biotechnology Associates社製)およびStreptavidin-alkaline phosphatase conjugate (Roche Diagnostics社製)を順次反応させ、BluePhos Microwell Phosphatase Substrates System(Kirkegaard & Perry Laboratories社製)を基質として用い発色反応を行い、マイクロプレートリーダーにて650 nmの吸光度を測定した。マウス血漿中濃度は検量線の吸光度から解析ソフトウェアSOFTmax PRO（Molecular Devices社製）を用いて算出した。WTおよびPF1の血漿中濃度推移を図１９に示した。PF1の投与4日間後の血漿中濃度はWTと比較して約5倍高い値であったことから、PF1はWTと比較してヒトIL-6レセプタートランスジェニックマウスにおいて薬物動態が向上していることが明らかとなった。
ヒトIL-6レセプタートランスジェニックマウスは、血漿中にヒト可溶型IL-6レセプターを産生することが分かっている。そのため、ヒトIL-6レセプタートランスジェニックマウスに抗ヒトIL-6レセプター抗体を投与することによって、血漿中に存在するヒト可溶型IL-6レセプターの中和効果を評価することが可能である。
WTあるいはPF1の投与によって、ヒト可溶型IL-6レセプターがどの程度中和されているかを評価するために、マウス血漿中の非結合型のヒト可溶型IL-6レセプター濃度の測定を測定した。マウスの血漿6μLをBSAを含有する希釈バッファーで2倍に希釈し、0.22μmのフィルターカップ（Millipore）において乾燥させた適量のrProtein A Sepharose Fast Flow (GE Healthcare)樹脂に添加することで血漿中に存在する全てのIgG型抗体（マウスIgG、抗ヒトIL-6レセプター抗体および抗ヒトIL-6レセプター抗体-ヒト可溶型IL-6レセプター複合体）をproteinAに吸着させた。その後、高速遠心機でスピンダウンし、パス溶液を回収した。パス溶液にはproteinAに結合した抗ヒトIL-6レセプター抗体-ヒト可溶型IL-6レセプター複合体は含まれないため、パス溶液中のヒト可溶型IL-6レセプター濃度を測定することによって、非結合型の可溶型IL-6レセプター濃度を測定可能である。可溶型IL-6レセプター濃度は、Quantikine Human IL-6 sR (R&D Systems)を使用した。WTおよびPF1投与マウスの4時間後、8時間後、24時間後、48時間後、96時間後、168時間後の非結合型の可溶型IL-6レセプター濃度の測定を添付説明書に従って実施した。
結果を図２０に示した。WTおよびPF1を10mg/kgで静脈内に単回投与した4時間後、8時間後まではWTおよびPF1ともに非結合型の可溶型IL-6レセプター濃度は10ng/mL以下であり、ヒト可溶型IL-6レセプターが中和されていることが確認された。しかし、24時間後のWTの非結合型の可溶型IL-6レセプター濃度は500ng/mL程度であったのに対して、PF1の非結合型の可溶型IL-6レセプター濃度は10ng/mL以下であったことから、PF1はWTよりも持続的にヒト可溶型IL-6レセプターが中和していることが見出された。
PF1は、アフィニティーマチュレーションで見出されたRDC_23と薬物動態等を改善させたH53/L28を組み合わせたものであり、in vivoで長い血漿中滞留性と高い中和活性を発揮することが可能であると考えられた。実際、ヒト可溶型IL-6レセプターを産生するヒトIL-6レセプタートランスジェニックマウスにおいて、PF1は中和効果と血漿中濃度がWTよりも持続することが示された。
PF1は高濃度製剤における安定性および免疫原性リスクにおいてもWT(ヒト化PM-1抗体)よりも優れており、またヒトIL-6レセプタートランスジェニックマウスにおいてもIL-6レセプター中和効果と血漿中滞留性が優れていることから、医薬品として開発する上でPF1で適用した改変は極めて有用であると考えられた。
〔実施例７〕IgG2およびIgG4の酸性条件下における安定性の向上
IgG2、IgG4化ヒト化IL-6レセプター抗体発現ベクターの作製・発現
Fcγレセプターへの結合性を低下させるためにヒト化PM1抗体（Cancer Res. 1993 Feb 15;53(4):851-6）の定常領域はIgG1アイソタイプであるが、定常領域をIgG2に置換した分子（WT-IgG2、配列番号：１０９）、および、IgG4（Mol Immunol. 1993 Jan;30(1):105-8.）に置換した分子（WT-IgG4、配列番号：１１０）を作製した。IgGの発現には動物細胞発現用ベクターを使用した。実施例１で使用しているヒト化PM1抗体（IgG1）の定常領域部分のNheI/NotI消化とligationにより定常領域をIgG2あるいはIgG4に置換した発現ベクターを構築した。各DNA断片の塩基配列は、BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）を用い、DNAシークエンサーABI PRISM 3730xL DNA SequencerまたはABI PRISM 3700 DNA Sequencer（Applied Biosystems）にて、添付説明書記載の方法に従い決定した。L鎖としてWTを用い、WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4の発現は実施例１に記した方法で実施した。
(1) ヒト化PM1抗体(WT-IgG1)Ｈ鎖：配列番号：１５（アミノ酸配列）
(2) WT-IgG2Ｈ鎖：配列番号：１０９（アミノ酸配列）
(3) WT-IgG4Ｈ鎖：配列番号：１１０（アミノ酸配列）
WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4のプロテインA塩酸溶出による精製
得られた培養上清にTBS中に懸濁させた50μLのrProtein A SepharoseTM Fast Flow（Amersham Biosciences）を添加し、4℃で4時間以上転倒混和した。その溶液を0.22μmのフィルターカップUltrafree(登録商標)-MC（Millipore）に移し、TBS 500μLにて3回洗浄後、rProtein A SepharoseTM樹脂に100μLの10mM HCl, 150mM NaCl, pH2.0に懸濁して2分間静置したのち、抗体を溶出させた（塩酸溶出法）。直ちに、6.7μLの1.5M Tris-HCl , pH 7.8を加えて中和した。溶出は2回行い、200μLの精製抗体を得た。
塩酸溶出法により精製したWT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4のゲルろ過クロマトグラフィー分析
塩酸溶出法により得られた精製品の会合体含量を評価するためにゲルろ過クロマトグラフィー分析を行った。
会合体評価法：システム Waters Alliance
カラム G3000SWxl(TOSOH)
移動相 50mM sodium phosphate, 300mM KCl, pH7.0
流速・波長 0.5ml/min、220nm
結果を図２１に示した。WT-IgG1の精製後の会合体含量は２％程度であったのに対して、WT-IgG2、および、WT-IgG4の精製後の会合体含量は２５％程度であった。このことから、IgG1は塩酸溶出時の酸に対して安定であるが、IgG2およびIgG4は塩酸溶出時の酸に対して不安定であり変性・会合化が進行したと考えられ、IgG2およびIgG4は、IgG1と比較して酸性条件下における安定性が低いことが明らかとなった。IgG分子の精製においては、プロテインAが多用されるが、IgG分子のプロテインAからの溶出は酸性条件下で行われる。またIgG分子を医薬品として開発する上で必要なウィルス不活化は、一般に酸性条件下において行われる。これらのことから、IgG分子の酸性条件下における安定性は高いほうが望ましいが、IgG2およびIgG4分子は酸性条件下における安定性がIgG1よりも劣ることが分かり、医薬品として開発するには酸性条件下での変性・会合化という課題が存在することが初めて明らかとなった。医薬品として開発するには変性・会合化という課題が解決されることが望ましいと考えられたが、これまでにアミノ酸置換によりこれを解決する方法は報告されていない。
WT-IgG2、WT-IgG4のCH3ドメイン改変体の作製と評価
IgG2およびIgG4分子は酸性条件下における安定性がIgG1よりも劣ることが示されたため、IgG2およびIgG4分子の酸性条件下での安定性を改善させる改変体を検討した。IgG2およびIgG4分子の定常領域のモデルより、酸性条件下における不安定要因として、CH3ドメインにおけるCH3/CH3界面の不安定性が考えられ、様々な検討を行った結果、IgG2においてはEUナンバリングの397番目のメチオニン、IgG4においてはEUナンバリングの409番目のアルギニンがそれぞれIgG2およびIgG4のCH3/CH3界面を不安定化していると考えられた。そこで、IgG2 のEUナンバリングの397番目のメチオニンをバリンに改変した抗体（IgG2-M397V 配列番号：１１１（アミノ酸配列）、および、IgG4のEUナンバリングの409番目のアルギニンをリジンに改変した抗体（IgG4-R409K 配列番号：１１２（アミノ酸配列）を作製した。
目的の抗体の発現ベクターの作製・発現・精製は、上述の塩酸溶出の方法を用いて行った。Protein Aからの塩酸溶出法により得られた精製品の会合体含量を評価するためにゲルろ過クロマトグラフィー分析を行った。
会合体評価法：システム Waters Alliance
カラム G3000SWxl(TOSOH)
移動相 50mM sodium phosphate, 300mM KCl, pH7.0
流速・波長 0.5ml/min、220nm
結果を図２１に示した。WT-IgG1の精製後の会合体含量は２％程度であったのに対して、WT-IgG2、および、WT-IgG4の精製後の会合体含量は２５％程度であった。それに対して、CH3ドメイン改変体であるIgG2-M397V、および、IgG4-R409Kの会合体含量がIgG1と同等レベルの２％程度であった。IgG2 のEUナンバリングの397番目のメチオニンをバリンに改変することで、あるいは、IgG4のEUナンバリングの409番目のアルギニンをリジンに改変することで、IgG2抗体およびIgG4抗体の酸性条件下における安定性を向上させることが可能であることが明らかになった。また、実施例５と同様の方法で、WT-IgG2、WT-IgG4、IgG2-M397V、および、IgG4-R409Kの熱変性中間温度を測定した結果、WT-IgG2、WT-IgG4に比べてIgG2-M397V、IgG4-R409Kはそれぞれ改変を導入したCH3ドメインのTm値が高いことが分かった。このことから、IgG2-M397V、IgG4-R409KはそれぞれWT-IgG2、WT-IgG4に比べて熱安定性においても優れていることが分かった。
IgG2およびIgG4はプロテインAを用いた精製工程およびウィルス不活化工程において酸性条件下に暴露されることから、同工程における変性・会合化が課題であったが、IgG2及びIgG4の定常領域配列として、IgG2-M397VおよびIgG4-R409Kを使用することによって、その課題を解決することが可能であることが明らかになり、同改変はIgG2及びIgG4抗体を医薬品として開発する上で極めて有用であることが分かった。また、IgG2-M397VおよびIgG4-R409Kは熱安定性にも優れている点からも有用であることが分かった。
〔実施例８〕IgG2のジスルフィド結合由来のヘテロジェニティーの改善
WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4のプロテインA酢酸溶出による精製
実施例７で得られた培養上清にTBS中に懸濁させた50μLのrProtein A SepharoseTM Fast Flow（Amersham Biosciences）を添加し、4℃で4時間以上転倒混和した。その溶液を0.22μmのフィルターカップUltrafree(登録商標)-MC（Millipore）に移し、TBS 500μLにて3回洗浄後、rProtein A SepharoseTM樹脂に100μLの50 mM 酢酸ナトリウム水溶液, pH 3.3に懸濁して2分間静置したのち、抗体を溶出させた。直ちに、6.7μLの1.5M Tris-HCl, pH 7.8を加えて中和した。溶出は2回行い、200μLの精製抗体を得た。
WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4の陽イオン交換クロマトグラフィー（IEC）分析
精製されたWT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4の均一性を評価するために陽イオン交換クロマトグラフィーによる分析を行った。
IEC評価法：システム Waters Alliance
カラム ProPac WCX-10 (Dionex)
移動相 A : 25mM MES-NaOH, pH6.1
B : 25mM MES-NaOH, 250mM Na-Acetate, pH6.1
流速・波長 0.5ml/min、280nm
グラジエント B : 50%-75% (75min) WT-IgG1分析時
B : 30%-55% (75min) WT-IgG2、WT-IgG4分析時
結果を図２２に示した。WT-IgG1、WT-IgG4はイオン交換分析でシングルピークであったが、WT-IgG2は複数のピークが存在していることが分かり、IgG2分子は、IgG1やIgG4と比較してヘテロジェニティーが多いことが分かった。実際、IgG2のアイソタイプは、ヒンジ領域のジスルフィド結合に由来するヘテロジェニティー（不均一性）が報告されており（非特許文献３０）、図２２に示されたIgG2のヘテロピークもこれに由来する目的物質/関連物質と考えられる。目的物質/関連物質のヘテロジェニティーの製造間差を維持しつつ医薬品として大量に製造することは難しく、医薬品として開発する抗体分子は望ましくは可能な限り均一な（ヘテロジェニティーが少ない）物質であったほうがよい。よって野生型IgG2は、抗体を医薬品として開発するにあたって重要な均一性に課題があると考えられた。実際、US20060194280(A1)において、天然型IgG2はイオン交換クロマトグラフィー分析においてジスルフィド結合に由来する様々なヘテロピークが観察されており、これらのピーク間では生物活性が異なることも報告されている。このヘテロピークを単一化する方法として、US20060194280(A1)においては精製工程におけるリフォールディングが報告されているが、製造においてこれらの工程を用いることはコストがかかり煩雑であるため、好ましくはアミノ酸置換によりヘテロピークを単一化する方法が望ましい。医薬品として開発するにはヒンジ領域のジスルフィド結合に由来するヘテロジェニティーが解決されることが望ましいと考えられたが、これまでにアミノ酸置換によりこれを解決する方法は報告されていない。
WT-IgG2のCH１ドメイン、ヒンジ領域の改変体の作製と評価
図２３に示すとおりIgG2分子に関しては様々なジスルフィド結合パターンが考えられる。IgG2のヒンジ領域に由来するヘテロジェニティーの原因として、ジスルフィド結合の掛け違い、および、フリーのシステインの存在が考えられた。IgG2はupper hinge領域に２つのシステインを有し（EUナンバリング219番目と220番目、このupper hingeの２つのシステインに隣接するシステインとして、H鎖のCH1ドメインに存在するEUナンバリング131番目のシステインとL鎖のC末端のシステイン、および、2量化する相手H鎖の同じupper hingeの２つのシステインが挙げられる。すなわち、IgG2のupper hinge周辺にはH2L2の会合した状態では合計8個のシステインが隣接しており、これにより、ジスルフィド結合の掛け違い、および、フリーのシステインによる様々なヘテロジェニティーが存在することが考えられる。
IgG2のヒンジ領域に由来するヘテロジェニティーを低減することを目的にIgG2のヒンジ領域配列とCH1ドメインの改変を行った。IgG2においてジスルフィド結合の掛け違い、および、フリーのシステインによるヘテロジェニティーを回避するための検討を行った。各種改変体の検討の結果、野生型IgG2定常領域配列のうち、H鎖のCH1ドメインに存在するEUナンバリング131番目のシステインと133番目のアルギニンをそれぞれセリンとリジンに改変し、H鎖のupper hingeに存在するEUナンバリング219番目のシステインをセリンに改変する(以下、IgG2-SKSC）（IgG2-SKSC：配列番号：１２０）ことによって、熱安定性を低下させることなくヘテロジェニティーを回避することが可能であると考えられた。これにより、IgG2-SKSCのH鎖とL鎖の共有結合は、EUナンバリング220番目のシステインとL鎖のC末端のシステインでジスルフィド結合により均一に形成されると考えられる（図２４）。
IgG2-SKSCの発現ベクターの作製、発現、精製は実施例１に記した方法で実施した。精製されたIgG2-SKSCおよび野生型IgG2（WT-IgG2）の均一性を評価するために陽イオン交換クロマトグラフィーによる分析を行った。
IEC評価法：システム Waters Alliance
カラム ProPac WCX-10 (Dionex)
移動相 A : 25mM MES-NaOH, pH5.6
B : 25mM MES-NaOH, 250mM Na-Acetate, pH5.6
流速・波長 0.5ml/min、280nm
グラジエント B : 50%-100% (75min)
結果を図２５示した。上述のとおり、WT-IgG2は複数のピークが存在しているが、IgG2-SKSCはシングルピークとして溶出することが分かった。IgG2のヒンジ領域のジスルフィド結合に由来するヘテロジェニティーは、EUナンバリング220番目のシステインとL鎖のC末端のシステインで単一のジスルフィド結合を形成するようなIgG2-SKSCの改変を導入することで回避できることが示された。また、実施例５と同様の方法で、WT-IgG1、WT-IgG2およびIgG2-SKSCの熱変性中間温度を測定した結果、WT-IgG2はWT-IgG1に比べて低いTm値を示すFabドメインのピークが観察されたが、IgG2-SKSCにおいてはそのピークが認められなかった。このことから、IgG2-SKSCはWT-IgG2と比較して熱安定性においても優れていることが分かった。
野生型IgG2は、抗体を医薬品として開発するにあたって重要な均一性に課題があると考えられたが、IgG2-SKSCをIgG2の定常領域配列として使用することにより、この課題を解決することが可能であることが明らかになり、IgG2を医薬品として開発する上で極めて有用であることが分かった。また、IgG2-SKSCは熱安定性にも優れている点からも有用であることが分かった。
〔実施例９〕IgG分子のC末端ヘテロジェニティーの改善
WT-IgG1のH鎖C末端ΔGK抗体の発現ベクター構築
抗体のC末端配列のヘテロジェニティーとして、C末端アミノ酸のリジン残基の欠損、および、C末端の２アミノ酸のグリシン、リジンの欠損によるC末端アミノ基のアミド化が報告されており（非特許文献３２）、医薬品として開発する上ではこれらのヘテロジェニティーは存在しないことが望ましい。実際、ヒト化PM-1抗体であるTOCILIZUMABにおいても、その主成分は塩基配列上存在するC末端アミノ酸のリジンが翻訳後修飾により欠損した配列であるが、リジンが残存している副成分もヘテロジェニティーとして存在する。そこで、C末端アミノ酸のヘテロジェニティーを低減させることを目的にC末端アミノ酸の改変を行った。具体的には、野生型IgG1のH鎖定常領域のC末端のリジンおよびグリシンを塩基配列上あらかじめ欠損させることで、C末端の２アミノ酸のグリシン、リジンの欠損によるC末端アミノ基のアミド化を抑制することが可能かどうかを検討した。
実施例1で得たヒト化PM1抗体（WT）のpB-CHベクターを用いてH鎖C末端配列に変異を導入した。QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)を用いて、添付説明書記載の方法でEUナンバリング４４７番目のLysおよび／またはEUナンバリング４４６番目のGlyをコードする塩基配列について、これを終止コドンとする変異を導入した。これにより、C末端の１アミノ酸のリジン（EUナンバリング４４７）をあらかじめ欠損させた抗体、C末端の２アミノ酸のグリシン（EUナンバリング４４６）、リジン（EUナンバリング４４７）をあらかじめ欠損させた抗体の発現ベクターを作製した。ヒト化PM1抗体のL鎖と発現させることでH鎖C末端ΔK抗体、および、H鎖C末端ΔGK抗体を得た。発現・精製は実施例１で記した方法で実施した。
精製したH鎖C末端ΔGK抗体の陽イオン交換クロマトグラフィー分析を以下のとおりに行った。精製したH鎖C末端ΔGK抗体を用いて以下の方法で陽イオン交換クロマトグラフィーによる分析を行い、C末端欠損がヘテロジェニティーに及ぼす影響を評価した。陽イオン交換クロマトグラフィー分析条件は以下のとおりであり、ヒト化PM1抗体、H鎖C末端ΔK抗体、H鎖C末端ΔGK抗体のクロマトグラムを比較した。
カラム：ProPac WCX-10, 4×250 mm (Dionex)
移動相：A: 25 mmol/L MES/NaOH, pH 6.1
B: 25 mmol/L MES/NaOH, 250 mmol/L NaCl, pH 6.1
流速：0.5 mL/min
グラジエント：25 %B(5 min)→(105 min)→67 %B→(1 min)→100 %B (5 min)
検出：280 nm
未改変ヒト化PM-1抗体、H鎖C末端ΔKおよびH鎖C末端ΔGK抗体の分析結果を図２６に示す。非特許文献３０から、主ピークよりも保持が遅い塩基性ピークにH鎖C末端449番目のLys残存体、447番目のProアミド体が含まれるが、H鎖C末端ΔK では認められなかった塩基性ピークの大幅な減少がH鎖C末端ΔGK抗体では認めたことから、H鎖C末端の2アミノ酸を欠損させることによって初めてH鎖C末端ヘテロジェニティーを軽減することが可能であると分かった。
H鎖C末端の2残基の欠損の及ぼす熱安定性への影響を評価するために、DSCによるH鎖C末端ΔGK抗体の熱変性温度測定を行った。DSC測定用として150 mM NaClを含む20 mM 酢酸緩衝液、pH6.0に透析することで緩衝液を置換した。ヒト化PM1抗体、H鎖C末端ΔGK抗体およびリファレンス溶液(透析外液)を十分に脱気した後、これらをそれぞれ熱量計セルに封入し40℃での熱平衡化を十分に行った。次にDSC走査を40℃〜100℃で約1K/分走査速度で行った。得られた変性ピークについて、非特許文献（Rodolfoら、Immunology Letters、1999年、p47-52）を参考にピークアサインを行ったところ、C末端欠損はCH3ドメインの熱変性温度に影響しないことを確認した。
これにより、H鎖定常領域のC末端のリジンおよびグリシンを塩基配列上あらかじめ欠損させることで、抗体の熱安定性に影響を与えることなく、C末アミノ酸のヘテロジェニティーを低減させることが可能となった。ヒト抗体定常領域IgG1、IgG2、IgG4において、C末端配列はいずれもEUナンバリング４４７番目がLys、EUナンバリング４４６番目がGlyになっていることから、本件等で見出されたC末アミノ酸のヘテロジェニティーを低減させる方法はIgG2定常領域とIgG4定常領域、あるいはそれらの改変体にも適用可能であると考えられる。
〔実施例１０〕新規最適化定常領域M14ΔGK配列の作製
抗原を中和することが目的の抗体医薬においてはFc領域の有するADCC等のエフェクター機能は必要ではなく、従って、Fcγレセプターへの結合は不必要である。免疫原性や副作用の点から考えるとFcγレセプターへの結合は好ましくないと考えられる（非特許文献２４，２５）。ヒト化抗IL-6レセプターIgG1抗体であるTOCILIZUMABはIL-6レセプターに特異的に結合し、その生物学的作用を中和することで、関節リウマチ等のIL-6が関連する疾患の治療薬として利用可能であり、Fcγレセプターへの結合は不必要である。
Fcγレセプター非結合の最適化定常領域M14ΔGKの作製と評価
Fcγレセプターへの結合を低下させる方法としては、IgG抗体のアイソタイプをIgG1からIgG2あるいはIgG4アイソタイプに変える方法が考えられる（Ann Hematol. 1998 Jun;76(6):231-48.）。Fcγレセプターへの結合を完全に無くす方法としては、人工的な改変をFc領域に導入する方法が報告されている。例えば、抗CD3抗体や抗CD4抗体は抗体のエフェクター機能が副作用を惹起するため、Fc領域のFcγレセプター結合部分に野生型配列には存在しないアミノ酸変異（非特許文献２６、２７）を導入したFcγレセプター非結合型の抗CD3抗体や抗CD4抗体の臨床試験が行われている（非特許文献２４、２８）。また、IgG1のFcγR結合部位（EUナンバリング：２３３、２３４、２３５、２３６、３２７、３３０、３３１番目）をIgG2（EUナンバリング：２３３、２３４、２３５、２３６）およびIgG4（EUナンバリング：３２７、３３０、３３１番目）の配列にすることでFcγレセプター非結合型抗体を作製することが可能であると報告されている（特許文献６）。しかしながら、IgG1にこれらの変異を全て導入すると、天然には存在しないT-cellエピトープペプチドとなりうる９アミノ酸の新しいペプチド配列が出現し免疫原性のリスクが上昇する。医薬品として開発する上では、免疫原性リスクは極力低いことが望ましい。
上述の課題を解決するために、IgG2の定常領域への改変を検討した。IgG2の定常領域はFcγR結合部位のうちEUナンバリング：２３３、２３４、２３５、２３６が非結合型であるが、FcγR結合部位のうちEUナンバリング：３２７、３３０、３３１番目は非結合型のIgG4とは異なる配列であるため、EUナンバリング：３２７、３３０、３３１番目のアミノ酸をIgG4の配列に改変する必要がある（Eur J Immunol. 1999 Aug;29(8):2613-24におけるG2Δa）。しかしながら、IgG4はEUナンバリング：３３９番目のアミノ酸がアラニンであるのに対して、IgG2はスレオニンであるため、EUナンバリング：３２７、３３０、３３１番目のアミノ酸をIgG4の配列に改変しただけでは天然には存在しないT-cellエピトープペプチドとなりうる９アミノ酸の新しいペプチド配列が出現してしまい、免疫原性リスクが上昇するため好ましくない。そこで、上述の改変に加えて新たにIgG2のEUナンバリング：３３９番目のスレオニンをアラニンに改変することで、新しいペプチド配列の出現を防ぐことが可能であることを見出した。
これらの変異に加えて、実施例７で見出したIgG2の酸性条件下での安定性を向上させるIgG2 のEUナンバリングの397番目のメチオニンからバリンへの変異、実施例８で見出されたヒンジ領域のジスルフィド結合に由来するヘテロジェニティーを改善させるEUナンバリングの131番目のシステインからセリンへの変異、133番目のアルギニンからリジンへの変異、219番目のシステインからセリンへの変異を導入した。さらに131番目と133番目の変異導入に伴い天然には存在しないT-cellエピトープペプチドとなりうる９アミノ酸の新しいペプチド配列が出現してしまい免疫原性リスクが生じることから、EUナンバリングの137番目のグルタミン酸からグリシンへの変異、138番目のセリンからグリシンへの変異を導入することで、131番目から139番目付近のペプチド配列を天然に存在するヒト配列と同一のものとした。さらに、C末端に由来するヘテロジェニティーを低減させるためにH鎖C末端のEUナンバリングの４４６、４４７番目のグリシンおよびリジンを欠損させた。これらの変異を全て導入した定常領域配列をM14ΔGKとした（M14ΔGK：配列番号：２４）。M14ΔGKはT-cellエピトープペプチドとなりうる９アミノ酸の新しいペプチド配列として219番目のシステインからセリンへの変異を導入した1ヶ所が存在するが、システインとセリンはアミノ酸配列としての性質が似ていることから免疫原性のリスクは極めて小さいと考えられ、TEPITOPEによる免疫原性予測においても免疫原性の変化は認められなかった。
可変領域配列としてWTを有し、定常領域配列としてM14ΔGKを有するH鎖抗体配列（M14ΔGK：配列番号：２４、WT-M14ΔGK：配列番号：１１３）の発現ベクターを実施例１に記された方法で作製し、H鎖としてWT-M14ΔGK、L鎖としてWTを用いて実施例１に記した方法で発現・精製した。
また、同様の方法で、IgG1定常領域にFcγレセプターへの結合を低下させるためにEUナンバリング：２３３、２３４、２３５、２３６、３２７、３３０、３３１、３３９番目に変異を導入し（Eur J Immunol. 1999 Aug;29(8):2613-24におけるG1Δab）、さらにC末端のヘテロジェニティーを低下させるためにEUナンバリング４４６番目と４４７番目を欠損させた（実施例９）WT-M17ΔGK（M17ΔGK：配列番号：１１６、WT-M17ΔGK：配列番号：１１５）を作製した。IgG4定常領域にFcγレセプターへの結合を低下させるためにEUナンバリング：２３３、２３４、２３５、２３６番目に変異を導入し（Eur J Immunol. 1999 Aug;29(8):2613-24におけるG4Δb、この改変においては新しい非ヒト配列が生じるため免疫原性リスクが上昇する）、免疫原性リスクを低減させるために上述の改変に加えてヒンジ領域のジスルフィド結合様式をM14ΔGKと同じにするためにEUナンバリング：１３１、１３３、１３７、１３８、２１４、２１７、２１９、２２０、２２１、２２２番目に変異を導入し、さらに酸性条件下での安定性を向上させるためにEUナンバリング４０９番目に変異を導入し（実施例７）、C末端のヘテロジェニティーを低下させるためにEUナンバリング４４６番目と４４７番目を欠損させた（実施例９）WT-M11ΔGK（M11ΔGK：配列番号：２５、WT-M11ΔGK：配列番号：１１４）の発現ベクターを作製した。H鎖としてWT-M17ΔGKあるいはWT-M11ΔGK、L鎖としてWTを用いて実施例１に記した方法で発現・精製した。
WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGKのFcγレセプター結合性の評価
FcγRIへの結合評価は以下のとおりに行った。Biacore T100 を用いて、センサーチップに固定化したヒト由来 Fcγ receptor I (以下、FcγRI) と、アナライトとして用いたIgG1、IgG2、IgG4、M11ΔGK、M14ΔGK、M1ΔGK 7を相互作用させ、その結合量を比較した。ヒト由来の FcγRI としては Recombinant Human FcRIA / CD64 (R&D systems) を用い、サンプルとして IgG1、IgG2、IgG4 、M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK を用いて測定を行った。アミンカップリング法によりセンサーチップ CM5 (BIACORE) に FcγRIを固定化した。最終的なhFcγRIの固定量は、約13000 RU(resonance units) であった。ランニングバッファーとしてHBS-EP+を用い、流速は20 μL/minとした。サンプルをHBS-EP+を用いて100 μg/mLの濃度に調整した。分析は、抗体溶液の10 μLをインジェクトする2分間を結合相とし、その後HBS-EP+に切り換え、4分間の解離相とした。解離相終了後、20 μLの5 mM水酸化ナトリウムをインジェクトすることにより、センサーチップを再生した。この結合・解離・再生を分析の１サイクルとし、各種抗体溶液をインジェクトし、センサーグラムを得た。アナライトはそれぞれ IgG4、IgG2、IgG1、M11、M14、M17 の順に流し、それを 2 回繰り返した。測定した結合量データを比較した結果を図２７に示した。その結果、結合量は IgG1 > IgG4 >> IgG2 = M11ΔGK = M14 ΔGK = M17ΔGK の順に減少しており、野生型のIgG2、M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK は野生型のIgG1、IgG4 よりも FcγRIに対して結合が弱いことが明らかとなった。
FcγRIIaへの結合評価は以下のとおりに行った。Biacore T100 を用いて、センサーチップに固定化したヒト由来 Fcγ receptor IIa (以下、FcγRIIa) と、アナライトとして用いたIgG1、IgG2、IgG4 、M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGKを相互作用させ、その結合量を比較した。ヒト由来の FcγRIIa としては Recombinant Human FcRIIA/CD32a (R&D systems) を用い、サンプルとして IgG1、IgG2、IgG4 、M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK を用いて測定を行った。アミンカップリング法によりセンサーチップ CM5 (BIACORE) に FcγRIIa を固定化した。最終的に約 3300 RU の FcγRIIa を固定化した。ランニングバッファーとしてHBS-EP+を用い、流速は20 μL/minとした。その後、ベースラインが安定になるまでランニングバッファーを流し、測定はベースラインが安定してから行った。固定化した FcγRIIa に対して、アナライトとして各 IgGアイソタイプ (IgG1, IgG2, IgG4) および変異を導入した抗体 (M11ΔGK, M14ΔGK, M17ΔGK) を相互作用させ、その結合量を観察した。ランニングバッファーには HBS-EP+ を用い、流速は 20 μL/min 、測定温度は 25℃ とした。各 IgG および 改変体は 100 μg/mL に調整し、アナライトとして 20 μL 流し、固定化した FcγRIIa と相互作用させた。相互作用後は 200 μL のランニングバッファーを流すことで FcγRIIa からアナライトを解離させ、センサーチップを再生させた。アナライトはそれぞれ IgG4、IgG2、IgG1、M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK の順に流し、それを 2 回繰り返した。測定した結合量データを比較した結果を図２８に示した。その結果、結合量は IgG1 > IgG2 = IgG4 > M11ΔGK = M14ΔGK = M17ΔGK の順に減少しており、M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK は野生型のIgG1、IgG2、IgG4 のいずれよりも FcγRIIa に対して結合が弱いことが明らかとなった。
FcγRIIbへの結合評価は以下のとおりに行った。Biacore T100 を用いて、センサーチップに固定化したヒト由来 Fcγ receptor IIb(以下、FcγRIIb) と、アナライトとして用いたIgG1、IgG2、IgG4 、M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGKを相互作用させ、その結合量を比較した。ヒト由来の FcγRIIb としては Recombinant Human FcRIIB/C (R&D systems) を用い、サンプルとして IgG1、IgG2、IgG4、M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK を用いて測定を行った。アミンカップリング法によりセンサーチップ CM5 (BIACORE) に FcγRIIb を固定化した。最終的に約 4300 RU の FcγRIIb を固定化した。その後、ベースラインが安定になるまでランニングバッファーを流し、測定はベースラインが安定してから行った。固定化した FcγRIIb に対して、アナライトとして各 IgGアイソタイプ (IgG1, IgG2, IgG4) および変異を導入した抗体 (M11ΔGK, M14ΔGK, M17ΔGK) を相互作用させ、その結合量を観察した。ランニングバッファーには HBS-EP+ (10 mM HEPES, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% v/v Surfactant P20)を用い、流速は 20 μL/min 、測定温度は 25℃ とした。各 IgG および 改変体は 200 μg/mL に調整し、アナライトとして 20 μL 流し、固定化した FcγRIIb と相互作用させた。相互作用後は 200 μL のランニングバッファーを流すことで FcγRIIb からアナライトを解離させ、センサーチップを再生させた。アナライトはそれぞれ IgG4、IgG2、IgG1、M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK の順に流し、それを 2 回繰り返した。測定した結合量データを比較した結果を図２９に示した。その結果、結合量は IgG4 > IgG1 > IgG2 > M11ΔGK = M14ΔGK = M17ΔGK の順に減少しており、M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK は野生型のIgG1、IgG2、IgG4 のいずれよりも FcγRIIb に対して結合が弱いことが明らかとなった。
FcγRIIIaへの結合評価は以下のとおりに行った。Biacore T100 を用いて、センサーチップに固定化したヒト由来 Fcγ receptor IIIa(以下、FcγRIIIa) と、アナライトとして用いたIgG1、IgG2、IgG4 、M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGKを相互作用させ、その結合量を比較した。ヒト由来の FcγRIIIa としてはhFcγRIIIaV-His6（組み換えhFcγRIIIaV-His6：社内調製品）を用い、サンプルとして IgG1、IgG2、IgG4 、M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK を用いて測定を行った。アミンカップリング法によりセンサーチップ CM5 (BIACORE) に FcγRIIIaを固定化した。最終的なhFcγRIIIaV-His6の固定量は、約8200 RU(resonance units) であった。ランニングバッファーとしてHBS-EP+を用い、流速は5 μL/minとした。サンプルを、HBS-EP+を用いて250 μg/mLの濃度に調製した。分析は、抗体溶液の10μLをインジェクトする2分間を結合相とし、その後HBS-EP+に切り換え、4分間の解離相とした。解離相終了後、20 μLの5 mM塩酸をインジェクトすることにより、センサーチップを再生した。この結合・解離・再生を分析の１サイクルとし、各種抗体溶液をインジェクトし、センサーグラムを得た。アナライトはそれぞれ IgG4、IgG2、IgG1、M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK の順に流した。測定した結合量データを比較した結果を図３０に示した。その結果、結合量は IgG1 >> IgG4 > IgG2 > M17ΔGK > M11ΔGK = M14ΔGK の順に減少しており、M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK は野生型のIgG1、IgG2、IgG4 よりも FcγRIIIa に対して結合が弱いことが明らかとなった。また、Eur J Immunol. 1999 Aug;29(8):2613-24に報告されているG1Δabの変異を含むM17ΔGKと比較して、M11ΔGK、M14ΔGKのほうがさらに弱い結合であることが明らかとなった。
以上より、WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGKの各種Fcγレセプターへの結合は野生型のIgG1と比較して著しく低下していることが確認された。WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGKを定常領域として使用することで、Fcγレセプターを介したAPCへの取り込みに由来する免疫原性リスクやADCC等のエフェクター機能に由来する副作用を回避することが可能であり、抗原を中和することが目的の抗体医薬の定常領域配列として有用である。
WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGKの高濃度安定性試験
WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGKの高濃度製剤における安定性の評価を行った。WT-IgG1、WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGKの精製抗体を20mM histidine chloride, 150mM NaCl, pH6.5の溶液に対して透析(EasySEP, TOMY)を行い、その後限外ろ過膜により濃縮し、高濃度安定性試験を行った。条件は以下のとおりである。
抗体：WT-IgG1、WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGK
緩衝液：20mM histidine chloride, 150mM NaCl, pH6.5
濃度:61mg/mL
保存温度と期間：40℃-2W、40℃-1M、40℃-2M
会合体評価法：システム Waters Alliance
カラム G3000SWxl(TOSOH)
移動相 50mM sodium phosphate, 300mM KCl, pH7.0
流速・波長 0.5ml/min、220nm
サンプルを1/100に希釈して分析
Initial（製剤調製直後）および各条件で保存後の製剤の会合体含有量を上述のゲルろ過クロマトグラフィー法により評価し、initialから会合体含量の変化量について図３１に示した。その結果、WT-IgG1と比較してWT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGKの会合体増加量は低く、WTの会合体増加量の約1/2であった。また、図３２に示すようにFab断片の増加量に関しては、WT-IgG1とWT-M17ΔGKは同程度であったが、WT-M14ΔGKとWT-M11ΔGKはWTのFab断片増加量の約1/4であった。IgGタイプの抗体製剤の劣化経路として、WO 2003/039485に記されているように、会合体の生成とFab分解物の生成が主に挙げられる。WT-M14ΔGKとWT-M11ΔGKは、WT-IgG1と比較して会合体とFab断片の生成の2つの点で製剤的安定性に優れていることが見出された。これにより、IgG1定常領域では安定性が十分ではなく、医薬品として開発可能な高濃度溶液製剤が作れなかった抗体においても、定常領域としてWT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGKを用いることがより高い安定性を有する高濃度溶液製剤が作製可能になると考えられた。
特にM14ΔGKは、本来IgG2分子が有する酸性条件下での不安定性を向上させ、ヒンジ領域のジスルフィド結合に由来するヘテロジェニティーを改善し、Fcγレセプターに結合せず、T-cellエピトープペプチドとなりうる９アミノ酸の新しいペプチド配列を最小限に抑え、且つ、高濃度製剤における安定性がIgG1よりも優れた新規な定常領域配列として極めて有用であると考えられた。
〔実施例１１〕PF1-M14ΔGK抗体の作製
実施例５で作製したPF1（定常領域はIgG1）の可変領域部分をXhoI/NheIで切り出し、実施例７で作製したM14ΔGK（可変領域はWT）の定常領域部分をNheI/NotIで切り出し、動物細胞発現用ベクターに2つのH鎖抗体遺伝子断片を挿入し、目的のPF1-M14ΔGKのH鎖発現ベクターを作製した（PF1_H-M14ΔGK：配列番号：１１７）。L鎖はPF1_Lを用い、実施例１で記した方法でPF1-M14ΔGK抗体の発現・精製を実施した。
PF1-M14ΔGK抗体は、抗IL-6レセプター抗体の医薬品として様々な点でWT（ヒト化PM-1抗体）よりも優れており、極めて有用であると考えられた。
〔実施例１２〕M31ΔGKの作製と評価
実施例１０で作製したM14ΔGKに対し、EUナンバリング：３３０、３３１、３３９番目をIgG2の配列に改変したM31ΔGKを作製した（M31ΔGK：配列番号：１１８）。可変領域配列としてWTを有し、定常領域配列としてM31ΔGKを有するH鎖抗体配列（WT-M31ΔGK：配列番号：１１９）の発現ベクターを実施例１に記された方法で作製し、H鎖としてWT-M31ΔGK、L鎖としてWTを用いて、WT-M31を実施例１に記した方法で発現・精製した。
WT-M31に加えて、同時に発現・精製したWT−IgG2およびWT-M14ΔGKの陽イオン交換クロマトグラフィー分析を以下のとおりに行った。陽イオン交換クロマトグラフィー分析条件は以下のとおりであり、WT-IgG2、WT-M14ΔGK、WT-M31ΔGKのクロマトグラムを比較した。
カラム：ProPac WCX-10, 4×250 mm (Dionex)
移動相：A: 25 mmol/L MES/NaOH, pH 6.1
B: 25 mmol/L MES/NaOH, 250 mmol/L NaCl, pH 6.1
流速：0.5 mL/min
グラジエント：0 %B(5 min)→(65 min)→100 %B→(1 min)
検出：280 nm
WT-IgG2、WT-M14ΔGK、WT-M31ΔGKの分析結果を図３３に示す。WT-IgG2は複数のピークが存在しているが、WT-M31ΔGKはWT-M14ΔGKと同様シングルピークとして溶出することが分かった。WT-M31ΔGKにおいてもIgG2のヒンジ領域のジスルフィド結合に由来するヘテロジェニティーは回避できることが示された。
〔実施例１３〕完全ヒト化抗体F2H/L39-IgG1の作製
PF1抗体のフレームワーク配列の完全ヒト化
実施例５で作製したPF1_Hには、71番（Kabatナンバリング、Kabat EA et al． 1991． Sequences of Proteins of Immunological Interest．NIH））のアルギニンのみが、マウス配列のまま残存しているため免疫原性の観点からは好ましくない。一般にH鎖の71番目の残基はHCDR2の構造を決める重要な配列であり、実際ヒト化PM1抗体を作製する際にマウスPM1抗体の結合活性に重要であることが報告されており、71番目をアルギニンからバリンに置換すると結合活性が大幅に低下することが明らかになっている(Cancer Research 53, 851-856, 1993)。同様にPF1_Hはヒト生殖系列遺伝子のVH4ファミリーに分類されるが、VH4ファミリーにおける71番はバリンとして高度に保存されており、71番のアルギニンをバリンに置換すると中和活性の大幅な低下が確認された。
そこで、71番をアルギニン残基のままでマウス配列を完全に除去するため、ヒト生殖系列遺伝子および報告されているヒト抗体の配列を調査し、71番がアルギニンであり、且つ、抗体の立体構造の維持に重要である残基が保存されている配列を探索した。その結果、表９に示すPF1_Hとはホモロジーは低いが重要な残基が保存されている候補配列を見出した。
Figure 0005566108
 PF1_H-IgG1に対し、Kabatナンバリング66番から94番を上記の候補配列に置換することにより、H96-IgG1（配列番号：１３４アミノ酸配列））を設計した。抗体可変領域については、合成オリゴDNAを組み合わせたPCR法(assembly PCR)により作製した。定常領域については、IgG1の発現ベクターからPCR法により増幅した。Assembly PCR法により抗体可変領域と定常領域を結合させ、動物細胞発現用ベクターへ挿入した。H96/PF1L-IgG1の発現、精製を実施例１に記載した方法により行なった。
フレームワーク完全ヒト化抗体H96/PF1L-IgG1の評価
精製したH96/PF1L-IgG1を用いて、実施例５に記載の方法でTm値の測定を行なった。 アフィニティーの測定は原則として実施例５と同様の条件で測定を行った。ただし、SR344の濃度は0、0.36、1.4 μg/mLに調整し、また15分間解離相を測定した。
その結果、H96/PF1L-IgG1は、PF1-IgG1とほぼ同等のTm値およびアフィニティーを示した（表１０）。
Figure 0005566108
 以上より、PF1抗体のH鎖をH96にすることで、Tm値およびアフィニティーを維持したままで、PF1抗体に残されていたマウス配列を完全に除去し、PF1抗体のフレームワークを完全ヒト化した抗体が得られた。H96/PF1L-IgG1は、フレームワーク配列にマウス由来配列が存在しないことから、免疫原性の観点で特に優れていると考えられた。
pI低下および免疫原性リスクを低減させたF2H/L39-IgG1の作製
実施例４で示されたとおり、抗体の可変領域のアミノ酸を改変しpIを低下させることで薬物動態を向上できることが明らかとなっている。そこで上記で作製したH96-IgG1に対し、さらに以下のアミノ酸置換を導入した。pIを低下させることを目的に64番のリジンのグルタミンへの置換、および65番のグリシンのアスパラギン酸への置換を導入した。また、免疫原性リスクの低減のため、105番のグルタミン酸のグルタミンへの置換、107番のスレオニンのイソロイシンへの置換を導入した。さらに、実施例２で得られたアフィニティー増強の改変である、95番のバリンのロイシンへの置換、99番のイソロインシンのアラニンへの置換を導入した。これらのアミノ酸置換をH96-IgG1に対して導入したF2H-IgG1（配列番号：１３５（アミノ酸配列））を実施例１記載の方法で作製した。
またPF1Lに対し以下のアミノ酸置換を導入した。pIを低下させることを目的に27番のグルタミンのグルタミン酸への置換、および55番のロイシンのグルタミン酸への置換を導入した。これらのアミノ酸置換をPF1Lに対して導入したL39（配列番号：１３６（アミノ酸配列））を実施例１記載の方法で作製した。F2H/L39-IgG1の発現、精製を実施例１に記載した方法により行なった。
Biacoreによる F2H/L39-IgG1のヒトIL-6レセプターに対するアフィニティー解析
ヒト化PM1抗体(野生型、WT)、PF1抗体（実施例５で作製）、および、F2H/L39-IgG1のアフィニティー測定を行なった。本測定は原則として実施例4と同様の条件で測定を行った。ただし、SR344の濃度は0、0.36、1.4 μg/mLに調整し、また15分間解離相を測定した（表１１）。
Figure 0005566108
 その結果、F2H/L39-IgG1は、KD値としては10-11オーダーを維持しており、極めて強いアフィニティーを有しているが、kaがPF1-IgG1と比較して1/2程度に低下していることが分かった。
F2H/L39-IgG1のヒトIL-6レセプター中和活性評価
ヒト化PM1抗体(野生型、WT)、および、F2H/L39-IgG1の中和活性の評価を実施例１に示す方法で行った。但し、human interleukin-6(TORAY)濃度を600 ng/mLにして中和活性の評価を行った。図３４に示すとおり、WTと比較してF2H/L39-IgG1は100％阻害濃度として１００倍以上の極めて強い活性を持つことが明らかになった。
F2H/L39-IgG1の等電点電気泳動による等電点評価
F2H/L39-IgG1の等電点を実施例３に記した方法で測定した。F2H/L39-IgG1の等電点は5.5であり、実施例５で作製したPF1抗体と比較してさらに等電点が低下することで薬物動態がさらに改善していると考えられた。
また、このF2H/L39の可変領域（VH、VL配列）の理論等電点をGENETYX(GENETYX CORPORATION)により計算したところ、理論等電点は4.3であった。WTの理論等電点が9.20であることから、WTからアミノ酸置換により可変領域の理論等電点を約4.9低下したF2H/L39が得られた。
F2H/L39-IgG1のカニクイザルによるPK/PD試験
ヒト化PM1抗体（野生型、WT）、PF1抗体およびF2H/L39-IgG1のカニクイザルにおける薬物動態(PK)および薬効(PD)を評価した。WT、PF1およびF2H/L39-IgG1を1.0mg/kgで皮下に単回投与し、投与前および経時的に採血した。実施例６と同様に各抗体の血漿中濃度の測定を行った。WT、PF1およびF2H/L39-IgG1の血漿中濃度推移を図３５に示した。カニクイザル膜型IL-6レセプターがどの程度中和されているかの薬効を評価するために、抗体投与後3日目(day3)から10日目(day10)までカニクイザルIL-6 5μg/kgを腰背部に連日皮下投与し、24時間後の各個体のCRP濃度を測定した。ＷＴおよびF2H/L39投与時のCRP濃度推移を図３６に示した。カニクイザル可溶型IL-6レセプターがどの程度中和されているかの薬効を評価するために、カニクイザル血漿中の非結合型のカニクイザル可溶型IL-6レセプター濃度を測定した。ＷＴおよびF2H/L39投与時の非結合型のカニクイザル可溶型IL-6レセプター濃度推移を図３７に示した。
これらの結果から、WTとPF１はほぼ同等の血漿中濃度推移を示したのに対して、よりpIを低下させたF2H/L39-IgG1はこれらより抗体血漿中濃度が高く維持された。また、IL-6レセプターに対するアフィニティーが強いF2H/L39-IgG1は、WTと比較してCRP濃度および非結合型のカニクイザル可溶型IL-6レセプター濃度がより低く維持されていることが見出された。
〔実施例１４〕WT-M14の血漿中滞留性評価
ヒトにおける血漿中滞留性の予測方法
IgG分子の血漿中滞留性が長い（消失が遅い）のは、IgG分子のサルベージレセプターとして知られているFcRnが機能しているためである（Nat Rev Immunol. 2007 Sep;7(9):715-25）。ピノサイトーシスによってエンドソームに取り込まれたIgG分子は、エンドソーム内の酸性条件下(pH6.0付近)においてエンドソーム内に発現しているFcRnに結合する。FcRnに結合できなかったIgG分子はライソソームへ進みライソソームで分解されるが、FcRnへ結合したIgG分子は細胞表面へ移行し血漿中の中性条件下(pH7.4付近)においてFcRnから解離することで再び血漿中に戻る。
IgGタイプの抗体として、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4のアイソタイプが知られているが、これらのヒトでの血漿中半減期は、IgG1、IgG2が約３６日、IgG3が約２９日、IgG4が１６日であることが報告されており（Nat Biotechnol. 2007 Dec;25(12):1369-72.）、IgG1およびIgG2の血漿中滞留性が最も長いと考えられている。一般に抗体医薬のアイソタイプはIgG1、IgG2、IgG4であるが、これらのIgG抗体の薬物動態をさらに向上する方法として、IgGの定常領域の配列を改変することで上述のヒトFcRnへの結合性を向上させる方法が報告されている（J Biol Chem. 2007 Jan 19;282(3):1709-17、J Immunol. 2006 Jan 1;176(1):346-56）。
マウスFcRnとヒトFcRnでは種差が存在することから（Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Dec 5;103(49):18709-14）、定常領域の配列を改変したIgG抗体のヒトにおける血漿中滞留性を予測するためには、ヒトFcRnへの結合評価およびヒトFcRnトランスジェニックマウスにおいて血漿中滞留性を評価することが望ましいと考えられた（Int Immunol. 2006 Dec;18(12):1759-69）。
ヒトFcRnへの結合評価
FcRnはFcRnとβ2-microglobulinの複合体である。公開されているヒトFcRn遺伝子配列（J. Exp. Med. 180 (6), 2377-2381 (1994)）を元に、オリゴDNAプライマーを作製した。ヒトcDNA(Human Placenta Marathon-Ready cDNA, Clontech)を鋳型とし、作製したプライマーを用いPCR法により遺伝子全長をコードするDNA断片を調整した。得られたDNA断片を鋳型に、PCR法によりシグナル領域を含む細胞外領域(Met1-Leu290)をコードするDNA断片を増幅し、動物細胞発現ベクターへ挿入した（ヒトFcRnアミノ酸配列 配列番号：１４０）。同様に、公開されているヒトβ2-microglobulin遺伝子配列（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26), 16899-16903 (2002)）を元に、オリゴDNAプライマーを作製した。ヒトcDNA(Hu-Placenta Marathon-Ready cDNA, CLONTECH)を鋳型とし、作製したプライマーを用いPCR法により遺伝子全長をコードするDNA断片を調製した。得られたDNA断片を鋳型に、PCR法によりシグナル領域を含むβ2-microglobulin全長(Met1-Met119)をコードするDNA断片を増幅し、動物細胞発現ベクターへ挿入した（ヒトβ2-microglobulinアミノ酸配列 配列番号：１４１）。
可溶型ヒトFcRnの発現は以下の手順で行った。調製したヒトFcRnおよびヒトβ2-microglobulinのプラスミドを、10 % Fetal Bovine Serum (Invitrogen)を用いたlipofection法により、ヒト胎児腎癌細胞由来HEK293H株（Invitrogen）の細胞へ導入した。得られた培養上清を回収した後、IgG Sepharose 6 Fast Flow（Amersham Biosciences）を用い、（J Immunol. 2002 Nov 1;169(9):5171-80.）の方法に従い精製を行った。その後、HiTrap Q HP（GE Healthcare）により精製を行った。
ヒトFcRnへの結合評価にはBiacore 3000 を用い、センサーチップに固定化したProtein Lあるいはウサギ抗ヒトIgG Kappa chain抗体へ結合させた抗体に、アナライトとしてヒトFcRnを相互作用させた際のヒトFcRnの結合量よりaffinity（KD）を算出した。具体的には、ランニングバッファーとして150mM NaClを含む50mM Na-phosphate buffer、pH6.0を用い、アミンカップリング法によりセンサーチップ CM5 (BIACORE) にProtein Lあるいはウサギ抗ヒトIgG Kappa chain抗体を固定化した。その後、抗体を0.02% Tween20を含むランニングバッファーで希釈してインジェクトしチップに抗体を結合させた後、ヒトFcRnをインジェクトし、ヒトFcRnの抗体への結合性[0]を評価した。
Affinityの算出にはソフトウエア、BIAevaluationを用いた。得られたセンサーグラムより、ヒトFcRnインジェクト終了直前の抗体へのhFcRn結合量を求め、これをsteady state affinity法でフィッティングしてヒトFcRnに対する抗体のaffinityを算出した。
ヒト FcRnトランスジェニックマウスにおける血漿中滞留性の評価
ヒト FcRnトランスジェニックマウス（B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg line 276 +/+ マウス、Jackson Laboratories）における体内動態の評価は以下の通り行った。抗体をマウスに1 mg/kgの投与量で静脈内に単回投与し適時採血を行った。採取した血液は直ちに4℃、15,000 rpmで15分間遠心分離し、血漿を得た。分離した血漿は、測定を実施するまで-20℃以下に設定された冷凍庫に保存した。血漿中濃度はELISA法を用いて測定した。
WT-M14のヒトにおける血漿中滞留性の予測評価
WT-IgG1とWT-M14のヒトFcRnへの結合性の評価をBIAcoreにより行った結果、表１２に示すとおり、WT-M14の結合性のほうが僅かにWT-IgG1よりも優れていた。
Figure 0005566108
 しかしながら、WT-IgG1とWT-M14のヒトFcRnトランスジェニックマウスにおける血漿中滞留性の評価を行った結果、図３８に示すとおり、WT-IgG1とWT-M14は同等の血漿中滞留性を示したことから、M14の定常領域はヒトにおいてもIgG1の定常領域と同等の血漿中滞留性を示すと考えられた。
〔実施例１５〕薬物動態を向上させたWT-M44、WT-M58、WT-M73の作製
WT-M58分子の作製
実施例１４に示したとおり、WT-M14のヒト FcRnトランスジェニックマウスにおける血漿中滞留性はWT-IgG1と同等であった。薬物動態を向上させる方法として、抗体の等電点を低下させる方法とFcRnへの結合性を増強する方法が知られているが、WT-M14の薬物動態を向上させることを目的に以下の改変を導入した。具体的には、実施例４においてWT-M14から作製したWT-M31ΔGKのEUナンバリング３９７番目のバリンをメチオニンに改変し、２６８番ヒスチジンをグルタミンへ改変し、３５５番アルギニンをグルタミンへ改変し、４１９番グルタミンをグルタミン酸へ改変した。これら４箇所の改変をWT-M31ΔGK に導入し、WT-M58（配列番号：１４２（アミノ酸配列））を作製した。発現ベクターの作製は、実施例１の方法で作製し、H鎖としてWT-M58を使用し、L鎖としてL（WT）を用いたWT-M58の発現・精製は実施例１に記載した方法で行った。
WT-M73分子の作製
一方、IgG1に対して、EUナンバリング：４３４番目をアラニンに置換したWT-M44（配列番号：１４３（アミノ酸配列））を作製した。さらにM44に対してH鎖C末端のヘテロジェニティーを低減するために４４６番目のグリシンおよび４４７番目のリジンを欠損させたWT-M83（配列番号：１８５（アミノ酸配列））を作製した。また、WT-M58に対して、EUナンバリング：４３４番目をアラニンに置換したWT-M73（配列番号：１４４（アミノ酸配列））を作製した。
これらの発現ベクターの作製は、実施例１の方法で作製し、H鎖としてWT-M44あるいはWT-M58あるいはWT-M73を使用し、L鎖としてL（WT）を用いたWT-M44およびWT-M58およびWT-M73の発現・精製は実施例１に記載した方法で行った。
WT-M44、WT-M58、WT-M73のヒトにおける血漿中滞留性の予測評価
WT-IgG1、WT-M44、WT-M58およびWT-M73のヒトFcRnへの結合性の評価をBIAcoreにより行った結果、表１３に示すとおり、WT-M44、WT-M58およびWT-M73の結合性はWT-IgG1よりもそれぞれ約2.7倍、約1.4倍および約3.8倍程度優れていた。
Figure 0005566108
 WT-IgG1、WT-M44、およびWT-M58のヒトFcRnトランスジェニックマウスにおける血漿中滞留性の評価を行った結果、図３９に示すとおり、WT-M58はWT-IgG1およびWT-M44と比較して薬物動態の向上が確認された。さらに、WT-IgG1、WT-M44、WT-M58およびWT-M73のヒトFcRnトランスジェニックマウスにおける血漿中滞留性の評価を行った結果、図４０に示すとおり、WT-M44、WT-M58およびWT-M73はいずれもWT-IgG1と比較して薬物動態の改善が確認され、その薬物動態の改善効果はヒトFcRnへの結合能と相関した。なかでもWT-M73に関しては、WT-IgG1と比較して２８日後の血漿中濃度が約１６倍改善していたことから、ヒトにおいてもM73の定常領域を有する抗体はIgG1の定常領域を有する抗体と比較して大幅に薬物動態が向上すると考えられた。
〔実施例１６〕様々な抗体における新規定常領域M14およびM58によるヘテロジェニティー低減効果
実施例８に示すとおり、抗IL-6レセプター抗体であるヒト化PM1抗体(WT)において、定常領域をIgG2からM14に変換することにより、IgG2のヒンジ領域に由来するヘテロジェニティーを低減できることが確認された。そこで、ヒト化PM1抗体以外IgG2タイプの抗体に対しても、定常領域をM14あるいはM58に変換することでヘテロジェニティーを低減できるかどうかを検討した。
ヒト化PM1抗体以外の抗体として、抗IL-6レセプター抗体であるF2H/L39（F2H/L39_VHアミノ酸配列 配列番号：１４５、F2H/L39 VLアミノ酸配列 配列番号：１４６）、抗IL-31レセプター抗体であるH0L0（H0L0_VHアミノ酸配列 配列番号：１４７、H0L0_VLアミノ酸配列 配列番号：１４８）、抗RANKL抗体であるDNS（DNS_VHアミノ酸配列 配列番号：１４９、DNS_VLアミノ酸配列 配列番号：１５０）を使用した。それぞれの抗体に対して、定常領域をIgG1（配列番号：１９）、IgG2（配列番号：２０）、および、M14（配列番号：２４）あるいはM58（配列番号：１５１）にしたものを作製した。
ヘテロジェニティーの評価方法として、陽イオン交換クロマトグラフィーによる評価を行った。作製した抗体のヘテロジェニティーの評価は、カラムとしてProPac WCX-10 (Dionex)を用い、移動相Ａとして20mM Sodium Acetate, pH5.0、移動相Ｂとして20mM Sodium Acetate, 1M NaCl, pH5.0を使用し、適切な流速およびグラジエントを用いて実施した。陽イオン交換クロマトグラフィー(IEC)による評価を行った結果を図４１示した。
図４１に示したとおり、抗IL-6レセプター抗体であるヒト化PM1抗体(WT)だけでなく、抗IL-6レセプター抗体であるF2H/L39、抗IL-31レセプター抗体であるH0L0、抗RANKL抗体であるDNSにおいても、定常領域をIgG1からIgG2に変換することでヘテロジェニティーが増大し、定常領域をM14あるいはM58に変換することでいずれの抗体においてもヘテロジェニティーを低減できることが確認された。これより、H鎖のCH1ドメインに存在するEUナンバリング131番目のシステインとH鎖のupper hingeに存在するEUナンバリング219番目のシステインをセリンに改変することにより、可変領域の抗体配列および抗原の種類に関わらず、天然型IgG2に由来するヘテロジェニティーを低減できることが示された。
〔実施例１７〕様々な抗体における新規定常領域M58による薬物動態改善効果
実施例１５に示したとおり、抗IL-6レセプター抗体であるヒト化PM1抗体(WT)において、定常領域をIgG1からM58に変換することにより、ヒトFcRnへの結合性が向上し、ヒトFcRnトランスジェニックマウスにおいて薬物動態が向上することが見出された。そこで、ヒト化PM1抗体以外のIgG1抗体に対しても、定常領域をM58に変換することで薬物動態を向上できるかどうかを検討した。
ヒト化PM1抗体(WT)以外の抗体として、抗IL-31レセプター抗体であるH0L0（H0L0_VHアミノ酸配列 配列番号：１４７、H0L0_VLアミノ酸配列 配列番号：１４８）、抗RANKL抗体であるDNS（DNS_VHアミノ酸配列 配列番号：１４９、DNS_VLアミノ酸配列 配列番号：１５０）を使用した。それぞれの抗体に対して、定常領域をIgG1（配列番号：１９）およびM58（配列番号：１５１）にしたものを作製し、実施例１４に示した方法でヒトFcRnへの結合性を評価した。その結果を表１４に示した。
Figure 0005566108
 表１４に示したとおり、抗IL-31レセプター抗体であるH0L0、抗RANKL抗体であるDNSにおいても、定常領域をIgG1からM58に変換することで、抗IL-6レセプター抗体であるWT同様、ヒトFcRnへの結合性が向上することが確認された。これより、可変領域の抗体配列および抗原の種類に関わらず、定常領域をIgG1からM58に変換することでヒトにおける薬物動態が向上する可能性が示された。
〔実施例１８〕CH1ドメインのシステインの及ぼすヘテロジェニティーおよび安定性への影響
実施例８に示したとおり、天然型IgG2のヘテロジェニティーを低減することを目的にIgG2のヒンジ部分のシステインおよびCH1ドメインに存在するシステインの改変を行った。各種改変体の検討の結果、野生型IgG2定常領域配列のうち、H鎖のCH1ドメインに存在するEUナンバリング131番目のシステインと133番目のアルギニンをそれぞれセリンとリジンに改変し、H鎖のupper hingeに存在するEUナンバリング219番目のシステインをセリンに改変した定常領域であるSKSC（配列番号：１５４）によって、安定性を低下させることなくヘテロジェニティーを低減することが可能であるとことが見出された。
一方、ヘテロジェニティーを低減する方法として、H鎖のupper hingeに存在するEUナンバリング219番目のシステインのみをセリンに改変する方法、および、220番目のシステインのみをセリンに改変する方法が考えられる。IgG2のEUナンバリング219番目のシステインをセリンに改変した定常領域であるSC（配列番号：１５５）、および、IgG2のEUナンバリング220番目のシステインをセリンに改変した定常領域であるCS（配列番号：１５６）を定常領域と有するWT-SC（配列番号：１５７）およびWT-CS（配列番号：１５８）を作製し、WT-IgG1、WT-IgG2、WT-SKSCおよびWT-M58とのヘテロジェニティーおよび熱安定性の比較を行った。また、WT以外の抗体として、異なる抗IL-6レセプター抗体であるF2H/L39（F2H/L39_VHアミノ酸配列 配列番号：１４５、F2H/L39_VLアミノ酸配列 配列番号：１４６）に対して、定常領域をそれぞれIgG1（配列番号：１９）、IgG2（配列番号：２０）、SC（配列番号：１５５）、CS（配列番号：１５６）、SKSC（配列番号：１５４）、M14（配列番号：２４）にしたF2H/L39-IgG1、F2H/L39-IgG2、F2H/L39-SC、F2H/L39-CS、F2H/L39-SKSC、F2H/L39-M14を作製し、ヘテロジェニティーおよび安定性の比較を行った。
WT-IgG1、WT-IgG2、WT-SC、WT-CS、WT-SKSC、WT-M58およびF2H/L39-IgG1、F2H/L39-IgG2、F2H/L39-SC、F2H/L39-CS、F2H/L39-SKSC、F2H/L39-M14のヘテロジェニティーの評価方法として、陽イオン交換クロマトグラフィーによる評価を行った。カラムとしてProPac WCX-10 (Dionex)を用い、移動相Ａとして20mM Sodium Acetate, pH5.0、移動相Ｂとして20mM Sodium Acetate, 1M NaCl, pH5.0を使用し、適切な流量およびグラジエントを用いて実施した。陽イオン交換クロマトグラフィーによる評価を行った結果を図４２に示した。
その結果、図４２に示すとおり、WTとF2H/L39のいずれにおいても、定常領域をIgG1からIgG2に変換することでヘテロジェニティーが増大したが、定常領域をSKSCおよびM14あるいはM58に変換することでヘテロジェニティーが大幅に低減された。一方、定常領域をSCにした場合は定常領域をSKSCとした場合と同様にヘテロジェニティーが大幅に低減されたが、定常領域をCSにした場合は十分にヘテロジェニティーが改善しなかった。
一般に抗体を医薬品として開発するためにはヘテロジェニティーが少ないことに加えて、安定な製剤を調製するため高い安定性を有することが望ましい。そこで安定性の評価方法として、示走差査型熱量測定（DSC）による熱変性中間温度（Tm値）の評価を行った（VP-DSC、Microcal社製）。熱変性中間温度（Tm値）は安定性の指標であり、医薬品として安定な製剤を作製するためには、熱変性中間温度（Tm値）が高いことが望ましい（J Pharm Sci. 2008 Apr;97(4):1414-26.）。WT-IgG1、WT-IgG2、WT-SC、WT-CS、WT-SKSC、WT-M58を20mM sodium acetate, 150mM NaCl, pH6.0の溶液に対して透析(EasySEP, TOMY)を行い、約0.1mg/mLのタンパク質濃度で、40℃から100℃まで1℃/minの昇温速度でDSC測定を行った。得られたDSCの変性曲線を図４３に、Fab部分のTm値を以下の表１５に示した。
Figure 0005566108
 WT-IgG1およびWT-IgG2のTm値はほぼ同等で約94℃程度（IgG2のほうが約1℃低い）であったのに対して、WT-SCおよびWT-CSのTm値は約86℃であり、WT-IgG1およびWT-IgG2と比較して著しくTm値が低下していた。一方、WT-M58、WT-SKSCのTm値は約94℃であり、ほぼWT-IgG1およびWT-IgG2と同等であった。WT-SCおよびWT-CSは安定性がIgG2と比較して著しく低いことから、医薬品として開発するためには、CH1ドメインのシステインもセリンに改変したWT-SKSCおよびWT-M58のほうが好ましいと考えられた。WT-SCおよびWT-CSのTm値がIgG2と比較して大幅に低下した理由として、WT-SCおよびWT-CSはIgG2のジスルフィド結合パターンとは異なる様式を取っているためと考えられた。
また、DSC変性曲線を比較した場合、WT-IgG1、WT-SKSC、WT-M58のFab部分の変性ピークはシャープかつ単一であったのに対して、WT-SCおよびWT-CSはこれらと比較して、Fab部分の変性ピークがブロードであり、WT-IgG2はFab部分の変性ピークの低温側にショルダーピークが認められた。DSCの変性ピークは単一成分の場合は通常シャープな変性ピークを示すが、Tmが異なる複数成分（つまりヘテロジェニティー）が存在する場合、変性ピークはブロードになると考えられる。すなわち、WT-IgG2、WT-SCおよびWT-CSには複数成分存在し、WT-SCおよびWT-CSは、天然型IgG2のヘテロジェニティーが十分低減されていない可能性が示唆された。このことから、野生型IgG2のヘテロジェニティーはヒンジ部分のシステインのみならず、CH1ドメインに存在するシステインの両方が関与していると考えられ、DSC上のヘテロジェニティーを低減するためにはヒンジ部分のシステインのみならず、CH1ドメインのシステインも改変する必要があると考えられた。また、上述のとおり、ヒンジ部分のシステインのみならず、CH1ドメインのシステインを改変することで初めて野生型IgG2と同等の安定性を有することが可能である。
以上より、IgG2のヒンジ領域に由来するヘテロジェニティーを低減した定常領域として、ヒンジ部分のシステインのみをセリンに置換した定常領域であるSCとCSはヘテロジェニティーおよび安定性の観点で不十分であると考えられ、ヒンジ部分のシステインに加えてCH1ドメインに存在するEUナンバリング131番目のシステインもセリンに置換することで初めてIgG2と同等の安定性を維持しつつヘテロジェニティーを大幅に低減することが可能であることが見出された。そのような定常領域としては、上述のM14、M31、M58、M73等が挙げられ、特にM58およびM73は薬物動態が向上し、安定性が高く、ヘテロジェニティーが低減されていることから、抗体医薬品の定常領域として非常に有用であると考えられた。
〔実施例１９〕PK/PDが改善した完全ヒト化IL-6レセプター抗体の作製
TOCILIZUMAB(H鎖 WT-IgG1（配列番号：１５）、L鎖 WT（配列番号：１０５）)に対して、PK/PDが改善した完全ヒト化IL-6レセプター抗体の作製するために以下に示す分子を作製した。
F2H-IgG1のka向上のため、実施例２で得られたアフィニティー増強の改変である、35番のトリプトファンのバリンへの置換、および50番のチロシンのフェニルアラニンへの置換、62番のセリンのスレオニンへの置換を行なった。また、免疫原性リスクを上昇させることなくpIを低下させるため、102番のチロシンをバリンへと置換、105番のグルタミンをグルタミン酸へと置換、107番のイソロイシンをスレオニンへと置換し、定常領域をIgG1からM83に置換したものとして、VH5-M83（配列番号：１３９（アミノ酸配列））を作製した。また、L39のka向上のため、27番のグルタミン酸をグルタミンに置換したVL5-kappa（配列番号：１８１（アミノ酸配列））を作製した。さらに上記実施例で見出されたTOCILIZUMABの可変領域および定常領域の変異、および、新たに見出された変異を複数組み合わせたTOCILIZUMAB改変体を作製し、各種スクリーニングを実施した結果、完全ヒト化IL-6レセプター抗体として、Fv3-M73（H鎖 VH4-M73 配列番号：１８２、L鎖 VL1-kappa 配列番号：１８３）、Fv4-M73（H鎖 VH3-M73 配列番号：１８０、L鎖 VL3-kappa 配列番号：１８１）、Fv5-M83（H鎖 VH5-M83 配列番号：１３９、L鎖 VL5-kappa 配列番号：１３８）を見出した。
作製したFv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83のIL-6レセプターへのアフィニティーをTOCILIZUMABと比較した（方法は参考例参照）。これらの抗体のIL-6レセプターへのアフィニティーを測定した結果を表１６に示した。また、BaF/gp130の中和活性をTOCILIZUMABおよびコントロール（参考例の公知の高親和性高IL-6レセプター抗体、US 2007/0280945におけるVQ8F11-21 hIgG1）と比較した（方法は参考例参照）。これらの抗体のBaF/gp130による生物活性を測定した結果を図４４（IL-6終濃度 300 ng/mL：TOCILIZUMAB、コントロール、Fv5-M83）および図４５（IL-6終濃度 30 ng/mL：TOCILIZUMAB、Fv3-M73、Fv4-M73）に示した。表１６に示すとおり、Fv3-M73、Fv4-M73は、TOCILIZUMABと比較して２〜３倍程度強いアフィニティーを有し、Fv5-M83はTOCILIZUMABと比較して１００倍程度強いアフィニティーを示した（Fv5-M83ではアフィニティーの測定が困難であったため、定常領域をIgG1にしたFv5-IgG1を用いてアフィニティーを測定した、定常領域は一般にアフィニティーに影響しないと考えられる）。また、図４５に示すとおりFv3-M73、Fv4-M73は、TOCILIZUMABと比較してやや強い活性を示し、図４４に示すとおりFv5-M83はTOCILIZUMABと比較して50％阻害濃度として１００倍以上の極めて強い活性を有し、且つ、公知の高親和性高IL-6レセプター抗体であるコントロールと比較しても50％阻害濃度として約1０倍程度高い中和活性を示した。
Figure 0005566108
 TOCILIZUMAB、コントロール、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83の等電点を当業者公知の方法により等電点電気泳動により測定した結果、TOCILIZUMABの等電点は約9.3、コントロールは約8.4〜8.5、Fv3-M73は約5.7〜5.8、Fv4-M73は約5.6〜5.7、Fv5-M83は5.4〜5.5であり、いずれの抗体もTOCILIZUMABおよびコントロールと比較して等電点が大幅に低下した。また、可変領域VH/VLの理論等電点をGENETYX(GENETYX CORPORATION)により計算したところ、TOCILIZUMABの理論等電点は9.20、コントロールは7.79、Fv3-M73は5.49、Fv4-M73は5.01、Fv5-M83は4.27であり、いずれの抗体もTOCILIZUMABおよびコントロールと比較して等電点が大幅に低下した。よって、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83はTOCILIZUMABおよびコントロールと比較して薬物動態が向上していると考えられた。
TOCILIZUMAB、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83の可変領域配列に存在するT-cellエピトープをTEPITOPE（Methods. 2004 Dec;34(4):468-75）を用いて解析を行った。その結果、TOCILIZUMABは多くの配列がHLAに結合するT-cellエピトープが存在すると予測されたが、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83はT-cellエピトープに結合すると予測された配列が大幅に減少した。また、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83はフレームワークにマウス配列が残存せず完全ヒト化されている。これらのことから、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83の免疫原性はTOCILIZUMABと比較して大幅に免疫原性リスクが低減されている可能性が示唆された。
〔実施例２０〕完全ヒト化IL-6レセプター抗体のサルPK/PD試験
TOCILIZUMAB、コントロール、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83をカニクイザルに1 mg/kgで静脈内に単回投与し血漿中濃度推移を評価した（方法は参考例参照）。TOCILIZUMAB、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83の静脈内投与後の血漿中濃度推移を図４６に示した。その結果、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83はいずれもTOCILIZUMABおよびコントロールと比較してカニクイザルにおいて大幅に血漿中滞留性が改善した。なかでも、Fv3-M73とFv4-M73の血漿中滞留性はTOCILIZUMABと比較して大幅に改善した。
カニクイザル膜型IL-6レセプターがどの程度中和されているかの薬効を評価するために、抗体投与6日目から18日目(TOCILIZUMABに関しては3日目から10日目)までカニクイザルIL-6 5μg/kgを腰背部に連日皮下投与し、24時間後の各個体のCRP濃度を測定した（方法は参考例参照）。各抗体投与時のCRP濃度推移を図４７に示した。カニクイザル可溶型IL-6レセプターがどの程度中和されているかの薬効を評価するために、カニクイザル血漿中の非結合型のカニクイザル可溶型IL-6レセプター濃度を測定し、可溶型IL-6レセプターの中和率を計算した（方法は参考例参照）。各抗体投与時の可溶型IL-6レセプターの中和率の推移を図４８に示した。
Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83はいずれもTOCILIZUMABおよび公知の高親和性抗IL-6レセプター抗体であるコントロールと比較してカニクイザル膜型IL-6レセプターをより持続的に中和しCRPの増加を長期間抑制した。また、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83はいずれもTOCILIZUMABおよびコントロールと比較してカニクイザル可溶型IL-6レセプターをより持続的に中和し非結合型のカニクイザル可溶型IL-6レセプターの増加を長期間抑制した。これより膜型IL-6レセプターおよび可溶型IL-6レセプターの中和の持続性に関しては、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83はいずれもTOCILIZUMABおよびコントロールよりも優れていることが見出された。なかでもFv3-M73とFv4-M73の中和の持続性は極めて優れていた。一方、Fv5-M83のほうがFv3-M73とFv4-M73よりCRPおよび非結合型カニクイザル可溶型IL-6レセプターを低く抑制していることから、Fv5-M83は膜型IL-6レセプターおよび可溶型IL-6レセプターをFv3-M73とFv4-M73および公知の高親和性抗IL-6レセプター抗体であるコントロールよりも強力に中和していると考えられた。これはFv5-M83がコントロールよりもIL-6レセプターへのアフィニティーが強く、且つ、BaF/gp130における生物活性が強いことがカニクイザルのin vivoにおいて反映された結果であると考えられる。
これらのことから、TOCILIZUMABおよびコントロールと比較して、Fv3-M73とFv4-M73は抗IL-6レセプター中和抗体として作用の持続性が極めて優れており投与頻度および投与量を大幅に低減することが可能であり、また、Fv5-M83は抗IL-6レセプター中和抗体として作用の強さに極めて優れており、また作用の持続性にも優れていることが見出された。よってFv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83はIL-6アンタゴニストとしての医薬品として有用であると考えられる。
〔参考例〕
組み換えカニクイザル可溶型IL-6レセプター（cIL-6R）の調製
公開されているアカゲザルIL-6レセプター遺伝子配列 (Birney et al, Ensembl 2006, Nucleic Acids Res. 2006 Jan 1;34(Database issue):D556-61.) を元にオリゴDNAプライマーを作製し、カニクイザル膵臓から調製されたcDNAを鋳型とし、プライマーを用いて、PCR法によりカニクイザルIL-6レセプター遺伝子全長をコードするDNA断片を調製した。得られたDNA断片を動物細胞発現ベクターへ挿入し、これを用いてCHO定常発現株（cyno.sIL-6R産生CHO細胞）を作製した。cyno.sIL-6R産生CHO細胞の培養液をHisTrapカラム(GEヘルスケアバイオサイエンス) で精製後、Amicon Ultra-15 Ultracel-10k(Millipore)を用いて濃縮し、Superdex200pg16/60ゲルろ過カラム(GEヘルスケアバイオサイエンス)でさらに精製を行い、可溶型カニクイザルIL-6レセプター（以下、cIL-6R）の最終精製品とした。
組み換えカニクイザルIL-6(cIL-6)の調製
カニクイザルIL-6は以下のように調製した。SWISSPROT Accession No.P79341に登録されている212アミノ酸をコードする塩基配列を作成し、動物細胞発現ベクターにクローニングし、CHO細胞に導入することで定常発現細胞株を作製した（cyno.IL-6産生CHO細胞）。cyno.IL-6産生CHO細胞の培養液をSP-Sepharose/FFカラム(GEヘルスケアバイオサイエンス) で精製後、Amicon Ultra-15 Ultracel-5k(Millipore)を用いて濃縮し、Superdex75pg26/60ゲルろ過カラム(GEヘルスケアバイオサイエンス)でさらに精製を行い、Amicon Ultra-15 Ultracel-5k(Millipore)を用いて濃縮し、カニクイザルIL-6(以下、cIL-6)の最終精製品とした。
公知高親和性抗IL-6レセプター抗体の作製
公知の高親和性抗IL-6レセプター抗体として、US 2007/0280945 A1に記載されている高親和性抗IL-6レセプター抗体であるVQ8F11-21 hIgG1(US 2007/0280945 A1, H鎖アミノ酸配列：配列番号：１９、L鎖アミノ酸配列：配列番号：２７)を発現させるため、動物細胞発現用ベクターを構築した。抗体可変領域については、合成オリゴDNAを組み合わせたPCR法(assembly PCR)により作製し、定常領域についてはIgG1を使用した。Assembly PCR法により抗体可変領域と定常領域を結合させ、動物発現用ベクターへ挿入し、目的のH鎖発現ベクターおよびL鎖発現ベクターを作製した。得られた発現ベクターの塩基配列は当業者公知の方法で決定した。作製した発現ベクターを用い、発現・精製を行った。発現・精製は実施例1に記載した方法で行い、高親和性抗IL-6レセプター抗体(以降、コントロール、と記す)を得た。
BiacoreによるIL-6レセプターへの結合評価
Biacore T100 (GE Healthcare) を用いて、抗原抗体反応の速度論的解析を行った。センサーチップ上にアミンカップリング法でanti-IgG（γ-chain specific）F(ab’)2を適当量固定化し、次にpH7.4において目的の抗体を結合させ、さらにpH7.4において種々の濃度に調整したIL-6レセプターであるSR344をアナライトとして流し、抗体とSR344の相互作用を測定した。測定は全て37℃で実施した。測定で得られたセンサーグラムから、カイネティクスパラメーターである結合速度定数 ka (1/Ms)、および解離速度定数 kd (1/s) を算出し、その値をもとに KD (M) を算出した。各パラメーターの算出には Biacore T100 Evaluation Software (GE Healthcare)を用いた。
サルPK/PD試験による抗体血漿中濃度、CRP濃度、非結合型可溶型IL-6レセプターの測定
カニクイザル血漿中濃度測定はELISA法にて当業者公知の方法で測定した。
CRP濃度はサイアス R CRP (関東化学株式会社)にて、自動分析装置（TBA-120FR、東芝メディカルシステムズ株式会社）を用いて測定した。
カニクイザル血漿中の非結合型のカニクイザル可溶型IL-6レセプター濃度を以下の通り測定した。カニクイザルの血漿30μLを0.22 μmのフィルターカップ（Millipore）において乾燥させた適量のrProtein A Sepharose Fast Flow (GE Healthcare)樹脂に添加することで血漿中に存在する全てのIgG型抗体（カニクイザルIgG、抗ヒトIL-6レセプター抗体および抗ヒトIL-6レセプター抗体-カニクイザル可溶型IL-6レセプター複合体）をProteinAに吸着させた。その後、高速遠心機でスピンダウンし、パス溶液を回収した。パス溶液にはproteinAに結合した抗ヒトIL-6レセプター抗体-カニクイザル可溶型IL-6レセプター複合体は含まれないため、proteinAパス溶液中のカニクイザル可溶型IL-6レセプター濃度を測定することによって、非結合型の可溶型IL-6レセプター濃度を測定可能である。カニクイザル可溶型IL-6レセプター濃度は、上記で作製したカニクイザル可溶型IL-6レセプター（cIL-6R）をスタンダードに用いて、ヒトIL-6レセプター濃度を測定する当業者公知の方法で測定した。可溶型IL-6レセプターの中和率は以下の計算式によって計算した。
（抗体投与後の非結合型の可溶性IL-6レセプター濃度÷抗体投与前の可溶性IL-6レセプター濃度）×100
本発明により、ヒト化抗IL-6レセプターIgG1抗体であるTOCILIZUMABの可変領域および定常領域のアミノ酸配列を改変することで、抗原中和能を増強させつつ、薬物動態を向上させることで投与頻度を少なくし持続的に治療効果を発揮し、且つ、免疫原性、安全性、物性を改善させ、TOCILIZUMABより優れた第2世代の分子が提供された。さらに、医薬品として適した抗体定常領域が提供された。

Claims (5)

  1. 以下の(1)〜(6)に記載のH鎖可変領域のCDR1、CDR2、CDR3及びL鎖可変領域のCDR1、CDR2、CDR3を含む抗IL-6レセプター抗体であって、
    H鎖可変領域のCDR1、CDR2、CDR3として配列番号：1、2、3に記載のアミノ酸配列、L鎖可変領域のCDR1、CDR2、CDR3として配列番号：4、5、6に記載のアミノ酸配列を有する抗体において少なくとも1つのアミノ酸が改変された抗体；
    (1)以下(a)及び(b)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるH鎖可変領域のCDR1:
    (a)配列番号：1に記載のアミノ酸配列、及び
    (b)配列番号：1に記載のアミノ酸配列において1番目のSerがAspに置換されているアミノ酸配列
    (2)以下(a)から(c)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるH鎖可変領域のCDR2:
    (a)配列番号：2に記載のアミノ酸配列、
    (b)配列番号：2に記載のアミノ酸配列において9番目のThr及び16番目のSerがそれぞれAsn及びGlyに置換されているアミノ酸配列、及び
    (c)配列番号：122に記載のアミノ酸配列
    (3)以下(a)から(c)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるH鎖可変領域のCDR3:
    (a)配列番号：3に記載のアミノ酸配列、
    (b)配列番号：3に記載のアミノ酸配列において1番目のSer及び5番目のThrがそれぞれVal及びIleに置換されているアミノ酸配列、及び
    (c)配列番号：3に記載のアミノ酸配列において1番目のSer及び5番目のThrがそれぞれLeu及びAlaに置換されているアミノ酸配列
    (4)以下(a)から(c)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるL鎖可変領域のCDR1:
    (a)配列番号：4に記載のアミノ酸配列、
    (b) 配列番号：4に記載のアミノ酸配列において1番目のArgがGlnに置換されているアミノ酸配列、及び
    (c)配列番号：4に記載のアミノ酸配列において1番目のArg及び4番目のGlnがそれぞれGln及びGluに置換されているアミノ酸配列
    (5)以下(a)から(c)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるL鎖可変領域のCDR2:
    (a)配列番号：5に記載のアミノ酸配列、
    (b)配列番号：5に記載のアミノ酸配列において2番目のThr及び4番目のArgがそれぞれGly及びGluに置換されているアミノ酸配列、及び
    (c)配列番号：126に記載のアミノ酸配列
    (6)以下(a)から(c)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるL鎖可変領域のCDR3:
    (a)配列番号：6に記載のアミノ酸配列、
    (b) 配列番号：6に記載のアミノ酸配列において5番目のThrがSerに置換されているアミノ酸配列、及び
    (c)配列番号：6に記載のアミノ酸配列において1番目のGlnおよび5番目のThrがそれぞれGly及びArgに置換されているアミノ酸配列。
  2. 請求項1に記載の抗IL-6レセプター抗体であって、以下の(7)〜(14)に記載のH鎖可変領域のFR1、FR2、FR3、FR4及びL鎖可変領域のFR1、FR2、FR3、FR4を有する抗体；
    (7)以下(a)及び(b)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるH鎖可変領域のFR1:
    (a)配列番号：7に記載のアミノ酸配列、及び
    (b)配列番号：7に記載のアミノ酸配列において13番目のArg、16番目のGln、23番目のThr及び30番目のThrがそれぞれLys、Glu、Ala及びSerに置換されたアミノ酸配列
    (8)以下(a)及び(b)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるH鎖可変領域のFR2:
    (a)配列番号：8に記載のアミノ酸配列、及び
    (b)配列番号：8に記載のアミノ酸配列において8番目のArgがGluに置換されたアミノ酸配列
    (9)以下(a)から(c)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるH鎖可変領域のFR3:
    (a)配列番号：9に記載のアミノ酸配列、
    (b)配列番号：9に記載のアミノ酸配列において4番目のMet、5番目のLeu、16番目のArg及び27番目のValがそれぞれIle、Ser、Lys及びAlaに置換されたアミノ酸配列、及び
    (c)配列番号：184に記載のアミノ酸配列
    (10)以下(a)から(c)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるH鎖可変領域のFR4:
    (a)配列番号：10に記載のアミノ酸配列、
    (b)配列番号：10に記載のアミノ酸配列において3番目のGln及び5番目のSerがそれぞれGlu及びThrに置換されたアミノ酸配列、及び
    (c)配列番号：10に記載のアミノ酸配列において5番目のSerがIleに置換されたアミノ酸配列
    (11)以下(a)及び(b)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるL鎖可変領域のFR1:
    (a)配列番号：11に記載のアミノ酸配列、及び
    (b)配列番号：11に記載のアミノ酸配列において18番目のArgがSerに置換されたアミノ酸配列
    (12)以下(a)及び(b)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるL鎖可変領域のFR2:
    (a)配列番号：12に記載のアミノ酸配列、及び
    (b)配列番号：12に記載のアミノ酸配列において11番目のLysがGluに置換されたアミノ酸配列
    (13)以下(a)及び(b)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるL鎖可変領域のFR3:
    (a)配列番号：13に記載のアミノ酸配列、及び
    (b)配列番号：13に記載のアミノ酸配列において23番目のGln、24番目のPro及び27番目のIleがそれぞれGlu、Ala及びAlaに置換されたアミノ酸配列
    (14)以下(a)及び(b)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるL鎖可変領域のFR4:
    (a)配列番号：14に記載のアミノ酸配列、及び
    (b)配列番号：14に記載のアミノ酸配列において10番目のLysがGluに置換されたアミノ酸配列。
  3. 全長抗体の実測等電点が7.0以下または可変領域の理論等電点が5.0以下である、請求項1又は2に記載の抗IL-6レセプター抗体。
  4. 20mM Histidine-HCl, 150mM NaCl, pH6.5〜7.0の緩衝液下で抗体濃度が100mg/mLである条件下において、25℃で1ヶ月経過後の抗体の会合体比率の増加が0.3%以下であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の抗IL-6レセプター抗体。
  5. 請求項1〜4のいずれかに記載の抗体を含む医薬組成物。
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