KR20070094945A - Ｎｋｇ2ａ에 대한 단클론 항체 - Google Patents

Ｎｋｇ2ａ에 대한 단클론 항체 Download PDF

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알레쌍드로 모레따
에마누엘라 마르체나로
프랑수와 호마뉴
빠스꺌 앙드레
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이나뜨 파르마
위니베르시따 디 제노바
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Abstract

본 발명은 면역 질환, 특히 자가 면역 질환 또는 염증 질환의 치료방법 및 상기 질환의 치료에 치료학적으로 사용되기 위한 항체 및 다른 화합물의 제조 방법에 관한 것이다. 통상, 본 발명의 방법은 NK 세포상의 NKG2A 수용체의 자극을 방지하는 항체 또는 기타 화합물을 사용하여 상기 질환의 병인에 기여하는 수지상 세포의 용해하게 한다.
자가 면역 질환, 염증 질환, NK 세포, NKG2A 수용체

Description

ＮＫＧ2Ａ에 대한 단클론 항체{MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST NKG2A}
본 발명은 NK 세포 표면 수용체 NKG2A에 대한 단클론 항체 및 그 단편(fragment), 상기 항체의 제조 및 평가방법에 관한 것이다. 본 발명의 단클론 항체 및 그 단편은 면역질환, 특히 자가면역질환의 치료 및 조절된 NK 세포 기능이 요구되는 기타 질환의 치료에 유용하다. 통상적으로 본 발명의 방법은 항체 또는 그 단편을 사용하여 NK 세포상의 NKG2A 수용체의 자극을 방지함으로써, 치료 대상 질환의 병리를 구성하는 수지상 세포(dendritic cells)나 활성화된 T 세포 등과 같은 HLA-E 또는 Qa1 b발현 세포를 용해시킨다.
자가면역반응의 유발 없이 효과적인 면역감시(immune surveillance)를 유지하기 위해서는 효과 T 세포(effector T cell)의 정확한 역가 측정이 요구된다. 자가면역질환은 면역 시스템이 자가-항원(Ludewig 등. (1999) Immunol Rev. 169:45-54 참조)에 대하여 면역반응을 일으킬 때 유발된다. 자가면역반응의 유발과 유지에 관련된 기전은 명확하진 않지만, 이전 면역적으로 무시된 항원의 2차 림프 기관에 의 출현이 관련된 것으로 보인다.
수지상 세포(DC)는 골수 유래의 항원제시세포(APCs)이며, 이는 면역 반응에서 중요한 역할을 한다(O'Neill 등. (2004) Blood 104:2235-2246 참조). DC는 포식작용, 세포내 이입 및 음세포작용 등을 통하여 박테리아, 바이러스, 죽어가는 세포 및 다양한 복합체 분자들을 내재화한다. 함입된 단백질은 펩타이드로 분해되고, 이후 이들은 MHC 클래스 I 및 클래스 II 분자들과 함께 DC 세포 표면에 제시된다. MHC 클래스 I 분자에 로딩된 항원은 통상 내재성 단백질 유래이며, CD8+ T 세포에 의하여 인식되는 반면, 클래스 II 분자에 로딩된 항원은 통상 외인성 단백질 유래이며 CD4+ T 세포에 의하여 인식된다. 항원 포착후, 미성숙 DC 세포는 성숙 DC세포로 되며, 성숙 DC세포는 포식작용의 감소를 나타내며, 림프 조직으로 이동하고, 증강된 T 세포 자극능을 가진다.
림프 조직에서, DC는 미경험 T 세포(naive T cell)을 초회 감작하고, 그 클론 확장 및 분화를 자극하며, 또한 B 세포와 NK 세포 등을 포함하는 내재면역시스템의 세포들과 상호작용할 수 있다. 활성화된 NK 세포는 성숙 DC 세포가 아닌 미성숙 DC 세포를 살해할 수 있다. 항원 전달 및 T 림프구의 초기 감작은 주로 항원제시 수지상세포에 의하여 매개 되기 때문에, 수지상 세포에 의한 부적절한 자가항원의 제시는 적어도 자가면역질환의 일부분으로 작용할 것이다.
자연살해(NK)세포는 비양식화된 면역(non-conventional immunity)에 관여하는 하위 집단의 림프구이다. NK 세포는 효과적인 면역감시기전을 제공하며, 이로써 종양이나 바이러스에 감염된 세포와 같은 바람직하지 못한 세포들이 제거될 수 있 다. NK 세포의 활성은 활성시그널 및 억제시그널 양자가 관련하는 복잡한 기전에 의하여 조절된다(Moretta 등. (2001) Annu Rev Immunol 19:197-223; Moretta 등. (2003) EMBO J EPub Dec 18; Ravetch 등. (2000) Science 290:84-89; Zambello 등. (2003) Blood 102:1797-805; Moretta 등. (1997) Curr Opin Immunol 9:694-701 참조; 이상의 문헌에 개시된 모든 내용은 본 출원에 참조로 포함된다).
수개의 구별되는 NK-특이적 수용체가 동정 되었으며, 이들은 NK 세포 매개 인식 및 HLA 클래스 I 결핍 표적 세포의 살해에 중요한 역할을 한다. NKp30, NKp46 및 NKp44로 명명되는 이들 수용체들은 Ig 슈퍼패밀리의 일원이다. 특정 mAbs에 의해 유도되는 이들의 교차결합은 세포내 Ca++ 수준의 증가, 세포독성의 유발 및 림포카인의 방출을 일으키는 강력한 NK 세포 활성화를 초래한다. 특히, mAbs-매개 NKp30, NKp46 및/또는 NKp44 의 활성화는 다양한 형태의 표적 세포에 대해 NK 세포독성의 활성화를 결과한다. 이러한 발견은 자연 세포독성에 있어 이들 수용체가 중요한 역할을 하는 것을 입증한다.
NK 세포는 주조직적합복합체(major histocompatibility complex; MHC) 클래스 I-특이적 억제성 수용체에 의하여 음성적으로 조절된다(Karre 등. (1986) Nature 319:675-8; Ohlen 등, (1989) Science 246:666-8 참조). 이들 특이적 수용체는 주조직적합복합체(MHC) 클래스 I 분자 또는 HLA의 다형성 결정자(polymorphic determinants)에 결합하고 NK 세포 용해를 억제한다. 사람의 경우, 킬러 Ig-양 수용체(KIRs)로 명명되는 어떤 수용체 군은 HLA 클래스 I 대립자(alleles)그룹을 인 식한다(Yawata 등. (2002) Crit Rev Immunol 22:463-82; Martin 등. (2000) Immunogenetics. 51:268-80; Lanier (1998) Annu Rev Immunol. 16:359-93 참조; 이상의 문헌에 개시된 모든 내용은 본 출원에 참조로 포함된다).
NK 세포상의 또 다른 중요한 억제성 수용체는 CD94-NKG2A이며, 이는 비전형적 MHC 클래스 I 분자 HLA-E와 상호작용한다.(Braud 등. (1998) Nature 391:795-799; Lee 등. (1998) PNAS 95:5199-5204; Vance 등. (2002) PNAS 99:868-873; Brooks 등. (1999) J Immunol 162:305-313; Miller 등. J Immunol (2003) 171:1369-75; Brooks 등. (1997) J Exp Med 185:795-800; Van Beneden 등. (2001) 4302-4311 ; U.S. 특허출원 제20030095965호 참조; 이상의 문헌에 개시된 모든 내용은 본 출원에 참조로 포함된다). 이들 수용체중 일부는 T 세포 항원 수용체-의존적 T 세포 활성화의 역가를 조절할 수 있다. 억제성 수용체가 드물게 결핍된 경우, 활성화 아이소형(isoform)들이 T 세포 효과 기능을 확대시키고 자가면역의 병리를 구성할 수 있다. NKG2A의 아미노산 배열은 영장류를 포함하여 포유동물에 따라 다양하다. 예를 들면, 인간 및 레시우스 원숭이의 NKG2A 단백질은 리간드 결합 도메인내에서 약 86％의 상동성을 포함하여 90％이하의 상동성을 가진다.
NKG2A를 조절하려는 치료적 노력, 본질적으로 염증 예방을 위한 치료적 노력들은 비전형적 MHC 클래스 I 분자들, 인간 수용체에 대한 HLA-E 및 마우스 수용체에 대한 Qa-Ib의 연구에 주로 촛점이 맞춰져 왔다. 세포 표면 발현에서, 이들 MHC 분자들은 다른 MHC 클래스 I 분자들의 시그널 펩타이드에서 유래되는 펩타이드에 우선적으로 결합한다. 다른 MHC 클래스 I 분자들의 발현은 HLA-E의 발현을 조절할 수 있고, 이로써 NK 세포가 잠재적인 표적 세포에서의 MHC 클래스 I 의존적 항원 제시경로 상태를 모니터링할 수 있게 한다. 세포 표면의 HLA-E 수준은 종양 세포 및 바이러스 감염 세포에 대한 NK 세포의 세포독성에 중요하다. HLA-E 발현 또는 기능을 조절하는 치료적 전략은 일반적으로 HLA-I 또는 HSP60 펩타이드를 사용하여 NK 세포가 활성화되지 않도록 즉 염증 예방을 위한 보호 상태를 유도하는 것이다.
미국특허공개 제20030095965호는 NKG2A, NKG2C 및 NKG2E에 결합하는 항원 3S9를 개시하고 있다. 3S9는 상기 수용체들을 교차결합시키고, 이에 수반하여 NK 세포 -매개 용해를 억제하는 것으로 주장되고 있다. 공유 국제출원 WO 2005/105849 호는 NKG2A를 포함하는 NK 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 NK-타입 과립림프구림프증식질환(NK-LDGL)으로 고통받는 환자의 치료에 사용하는 것을 개시하고 있다. 상기 항체들은 NK 세포 활성을 억제한다.
단클론항체가 각종 질환의 진단 및 치료에 매우 유용한 것이 입증되어 있다. 치료적 단클론항체들은 상이한 기전들을 통하여 작용한다. 리투산(Rituxan)과 같은 항체는 종양 세포와 같은 병적 세포 표면에 제시되어 있는 항원(리투산의 경우 CD20)을 인식하고, 면역 시스템으로 하여금 인식된 세포를 파괴하도록 한다. 벡사(Bexxar), 온코림(Oncolym), 또는 즈발린(Zevalin)과 같은 항체들은 방사성동위원소, 화학요법제 또는 독소(toxin)과 결합하여 상기 항체와 결합되어 있는 세포를 직접 살해하게 한다. 또한 바실리시맙(Basiliximab) 및 다클리즈맙(Daclizumab)(IL-2 차단), IgE 차단 오마리즈맙(Omalizumab) 및 에팔즈맙(efaluzimab)과 같은 항체는 특정 단백질의 활성을 차단한다. 항체 기반 치료법 은 본 기술분야에서 잘 알려져 있으며 하기 문헌에서 검토된 바 있다(Gatto (2004) Curr Med Chem Anti - Cane Agents 4(5):411-4, Casadevall 등. (2004) Nat Rev Microbiol. 2(9):695-703, Hinoda 등. (2004) Cancer Sci . 95(8):621-5, Olszewski 등. (2004) Sci STKE. JuI 06(241):pe30, Coiffier (2004) Hematol J. Suppl 3 :S 154-8, Roque 등. (2004) Biotechnol Prog. 20(3):639-54 참조; 이상의 문헌에 개시된 모든 내용은 본 출원에 참조로 포함된다).
항체를 사람에게 치료적 용도로 사용하거나 또는 임상 실험에 들어가기전에, 항체는 반드시 사람이 아닌 동물에서 전임상 연구를 거쳐 그 독성, 생체내 효능, 생체이용율, 반감기 등의 다양한 파라미터와 기타 약물운동학적 및 약동학적 파라미터들을 평가하여야 한다. 이러한 검사는 통상 포유류, 바람직하게는 항체가 생물화학적 활성을 갖는 즉 mAb가 종 내 호몰로그(homolog) 분자와 반응하여 인간과 생리학적으로 가장 유사한 것으로 기대되는 포유류를 대상으로 하여 수행된다. 그러나 만약 항체가 인간 단백질에만 결합하고 그 표적 단백질의 비인간 동물의 호몰로그와는 결합하지 않는 경우, 비인간 영장류에서의 연구는 지체될 수 있다. 반면, 교차반응성이 존재하는 경우는 항체의 생체내 효능을 그 동물에서 테스트할 수 있을 뿐 아니라 부작용, 독성 또는 동력학적 성질과 같은 항체의 표적 단백질과의 결합과 관련된 다른 이슈들도 연구가능하다. 용이하게 입수가능한 영장류는 "센터 드 프리마톨로지" (CDP : ULP5 Fort Foch, 67207 Niederhausbergen, France)에서 입수가능한 시노몰거스 원숭이(Macaca mulatta), 레시우스 원숭이(Macacus mulatta), 아프라카 그린 원숭이(Chlorocebus aethiops), 마모셋(Callithrix jacchus), 사이 미리(Saimiri sciureus) 및 "스테이션 드 프리마톨로지 시엔알에스"(CD56, 13790 Rousset/Arc, France)에서 입수가능한 바분 등과 같은 신세계 원숭이 및 구세계 원숭이를 포함한다. 일반적으로 후보 약물의 테스트에 침팬지와 에이프(apes)을 사용할 수 있지만, 그런 경우는 드물고 테스트할 다른 방법이 없거나 소진된 경우에만 시행된다.
항체는 그들 표적의 특정 3차원적 형태에 결합하기 때문에, 표적 단백질의 아미노산배열이 조금만 바뀌어도 결합력이 같이 소실될 수 있다. 따라서 어떤 종의 단백질과 결합하는 주어진 항체가, 그 서열 중 일부는 공유하나 완전히 동일하지는 않는 동종 단백질에도 역시 결합할 것인지 여부는 예측할 수 없게 된다. 예를 들어 인간 단백질에는 결합하는 항체가 매우 가까운 종에서의 호몰로그와는 결합하지 않는 경우가 많다. 예를 들어 인간과 레시우스 원숭이의 CD4 단백질은 거의 94％의 상동성을 나타냄에도, 어떤 인간 CD4 단백질에 대한 항체는 원숭이 호몰로그에는 결합하지 않는다(Genbank IDs GLl 16013 및 20981680; Sharma 등. (2000) JPET 293:33-41, 2000 참조, 이상의 문헌에 개시된 모든 내용은 본 출원에 참조로 포함된다). 다른 예로는 항원 개발에 대한 약학적 표적으로 광범위하게 연구되어 온 인간 CD3에 대한 수개의 항체들; 원숭이 CD3 단백질과는 상호작용하지 않는 개발에 적절한 특성을 갖는 예를 들면 UCHT2 등의 항체들을 포함한다.
많은 자가면역 질환들이 심각하고 현저한 점, 자가-항원에 대한 면역반응의 조율에 있어서의 성숙 수지상 세포의 역할을 고려할 때, 이러한 질환의 기초가 되는 수지상 세포의 수준 또는 활성을 조절하는 새롭고 효과적인 치료법이 강력하게 요구되고 있다. 또한 면역 시스템에 의한 파괴로부터 자신을 방어할 수 있는 이상 세포들(예를 들어 종양세포 또는 바이러스 감염 세포)로 특징 되는 질환에 대한 치료법이 요구되고 있다. 또한 최종적으로 NKG2A에 대한 단클론 항체의 인간에 있어서 치료적 효능을 판단할 수 있는 유효한 생체내 시험 시스템의 개발이 요구되고 있다.
본 발명은 NKG2A 수용체에 대한 단클론 항체 및 그 단편를 제공한다. 본 발명의 단클론 항체 및 그 단편은 NK 세포가 통상적으로는 감수성(susceptible)인 표적 세포를 용해하는 능력을 억제하거나("NK 세포 억제성 항체") 또는 NK 세포가 달리는 보호되는 표적 세포를 용해하도록 재구성(reconstitution)할 수 있다("NK 세포 활성화 항체). 본 발명의 단클론 항체 및 그 단편의 기능은 Fc 수용체에 결합하는 능력에 의존한다.
Fc 감마 수용체와 같은 Fc 수용체들은 백혈구의 표면에 발현되어 있다. 이들 수용체는 면역글로불린(Ig)의 Fc 부분에 결합하는데, 예를 들면 Fc 감마 수용체는 IgG의 Fc 부분에 결합한다. 이 결합은 항체에 의한 항원의 인식을 세포-기반의 작동 기전과 연결시킴으로써 면역기능에 기여한다. 상이한 면역글로불린 Fc 부위와 면역 세포상의 특정 Fc 수용체(FcRs)와의 상호작용을 통하여, 상이한 면역글로불린 클래스는 상이한 작동 기전을 유발시킨다. 활성화 Fc 감마 수용체는 Fc 감마 RI, Fc 감마 RIIA, Fc 감마 RIIC 및 Fc 감마 RIII A를 포함한다. Fc 감마 RIIB는 억제성 Fc 감마수용체로 간주된다(Woof 등. (2004) Nat Rev Immunol. 4(2):89-99; Baumann 등. (2003) Arch Immunol Ther Exp ( Warsz ) 51(6):399-406; Pan 등.(2003) Chin Med J (Engl) 116(4):487-94; Takai 등. (1994) Cell 76:519-529; Ravetch 등. (2001) Annu Rev Immunol 19:275-290, 상기 문헌에 개시된 전체 내용은 본 출원에 참조로서 통합된다).
이론에 구애받음 없이 본 발명자들은 본 발명의 항체 및 그 단편의 Fc 수용체 결합 영역의 존재가, Fc 수용체를 갖는 세포 존재시 NK 세포 용해의 억제를 유발하는 것으로 믿는다. Fc 수용체 결합 영역이 결핍된 항체 및 단편들은 세포 표면에 HLA-E 또는 QaIb 를 갖는 표적 세포의 NK 세포 용해를 재구성할 수 있다. 이러한 표적 세포는 통상적으로는 HLA-E 또는 QaIb과 NKG2A 수용체와의 상호작용을 통하여 NK 세포 용해로부터 보호된다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 그 단편을 포함하는 조성물을 제공하며, 또한 상기 조성물을 상이한 질환 및 질병의 치료에 사용하는 치료방법을 제공한다. 본 발명은 또한 비인간 영장류를 사용하여 인간 NKG2A에 대한 항체 또는 단편의 활성, 독성 및 올바른 투약 요법(dosing regimen)을 평가하고 특성화하는 방법을 제공한다.
제1 측면으로, 본 발명은
a) NKG2A에 특이적으로 결합하고; b) Fc 수용체에 특이적으로 결합하지 않으며; 및 c) 인간 NK 세포상의 NKG2A에 결합된 경우, 상기 NK 세포가 그 표면에 HLA-E 또는 QaIb를 갖는 표적 인간 세포와 접촉시, 상기 NK 세포가 상기 표적세포를 용해시키는 것을 특징으로 하는 단클론 항체 또는 그 단편인 활성화 항체를 제공한다. 바람직하게는 상기 단클론 항체 또는 단편은 기타 인간 NKG2 수용체와는 결합하지 않으며, 특히 활성화 수용체 NKG2C 또는 NKG2E와 결합하지 않는다. 더욱 바람직하게는 상기 항체 또는 단편은 Zl99 또는 Z270에서 선택되는 항-NKG2 단클론과 완전 경합한다.
바람직한 일 태양으로서, 상기 단클론 항체 또는 그 단편은 비인간 영장류 NKG2A에 결합할 수 있다. 더욱 바람직하게는 비인간 영장류 NK 세포상의 NKG2A에 결합된 경우, 그 표면에 HLA-E를 갖는 표적 비인간 영장류 세포가 NK 세포와 접촉시, 상기 NK 세포가 상기 표적세포를 용해시키도록 재구성하는 능력을 가진다.
또 다른 바람직한 태양으로서, 상기 단클론 항체 또는 그 단편은 Z270의 가변중쇄영역 또는 Z270의 가변경쇄영역의 아미노산서열을 포함한다. 또는 Z199의 가변중쇄영역 또는 Z199의 가변경쇄영역의 아미노산서열을 포함한다.
다른 바람직한 태양에서 상기 단클론항체 또는 그 단편은 Fc 수용체와 결합하지 않도록 개질된 마우스 또는 인간 IgG1 일정영역(constant region) 또는 인간 IgG4 일정영역를 포함한다.
또 다른 바람직한 태양으로서, 상기 항체 또는 단편은 키메라 항체 또는 인간화 항체이다.
가장 바람직하게는 ch270VK 또는 ch270VH를 포함하는 항체 또는 단편이다.
또 다른 태양으로서, 상기 항체 또는 그 단편은 유도체화되어 생체내에서의 안정성 또는 생체이용성이 증강된 것이다. 또 다른 태양으로서, 항체는 PEG로 유도체화된다.
본 발명의 활성화 항체 및 단편은 정상적으로는 NK 세포-매개 용해에 저항성인 특정 표적 세포를 용해하도록 재구성하는데 유용하다. 따라서, 다른 태양으로서 본 발명은 NK 세포 및 표적 세포를 포함하고, 상기 NK 세포는 그 표면에 NKG2A를 가지며, 상기 표적 세포는 그 표면에 HLA-E 또는 QaIb가 존재하는 것을 특징으로 하는 집단에서 표적 세포의 NK 세포-매개 용해를 재구성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 NK 세포에 전술한 단클론 항체 또는 단편을 접촉시키는 단계를 포함한다. 바람직하게는 상기 표적세포는 인간 세포이며, 보다 바람직하게는 수지상 세포("DC"), 암 세포 또는 바이러스-감염 세포이다. 가장 바람직하게는 성숙 수지상세포("mDC")이다.
상기 활성화 항체 및 그 단편은 추가적으로 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물로 제형화될 수 있다. 이러한 조성물은 약학적 용도로 제형화될 수 있다. 약학적 조성물은 선택적으로 치료하고자 하는 특정 질환 또는 상태에 유용한 제2 치료제를 포함할 수 있다. 이러한 모든 조성물은 본 발명에 속한다.
본 발명의 활성화 항체 조성물은 자가면역질환 또는 염증 질환 또는 면역 반응의 치료 또는 예방에 사용될 수 있으며; 또는 그 표면에 HLA-E 또는 QaIb를 발현하는 암세포가 존재하는 것을 특징으로 하는 암, 또는 그 표면에 HLA-E 또는 QaIb를 발현하는 바이러스 감염 세포가 존재하는 것을 특징으로 하는 바이러스 질환의 치료에 사용될 수 있다. 본 방법은 추가적으로 환자에 치료할 특정 질환 또는 상태에 유용한 제2 치료제를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 제2 치료제는 개별 투여 형태(separate dosage form) 또는 상기 조성물의 일부분으로 투여될 수 있다.
일 태양으로서, 본 발명의 활성화 항체 또는 그 단편을 포함하는 조성물 및 방법에서 상기 제2 치료제는 NKp30, NKp44, 및 NKp46과 같은 활성화 NK 세포 수용체에 작용하는 화합물이다. 또 다른 태양으로, 상기 치료제는 KIR 수용체 억제제와 같은 억제성 NK 세포 수용체의 길항제이다. 다른 태양에서, 제2 치료제는 TGF-beta 1의 길항제이다. 또 다른 태양에서, 제2 치료제는 사이토킨 억제제, 조혈성장인자, 진통제, 인슐린, 항염증제, 및 면역억제제로 이루어진 군에서 선택된다. 다른 태양에서, 제2 치료제는 항암제 및 항구토제이다. 다른 태양에서 제2 치료제는 항바이러스제이다.
다른 태양에서 예방 또는 치료될 자가면역질환 또는 염증질환은 자가면역 용혈성 빈혈(autoimmune hemolytic anemia), 악성빈혈(pernicious anemia), 결절다발동맥염(polyarteritis nodosa), 전신홍반루푸스(systemic lupus erythematosus), 베게너 육아종(Wegener's granulomatosis), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 자가면역 간염(autoimmune hepatitis), 베체트병(Behcet's disease), 크론병(Crohn's disease), 원발성 담관성간경화(primary bilary cirrhosis), 피부경화증cleroderma), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 제1형 당뇨병(Type 1 diabetes mellitus), 포도막염(uveitis), 그레이브스 병(Graves' disease), 갑상선염(thyroiditis), 제1형 당뇨병(Type 1 diabetes mellitus), 심근염(myocarditis), 류머티스열(rheumatic fever), 피부경화증(scleroderma), 강직척추염(ankylosing spondylitis), 류머티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 사구체신염(glomerulonephritis), 사르코이드증(sarcoidosis), 피부근육염(dermatomyositis), 중증근육무력증(myasthenia gravis), 다발근육염(polymyositis), 급성특발다발신경염(Guillain-Barre syndrome), 다발경화증(multiple sclerosis), 원형탈모증(alopecia areata), 천포창/유사천포창(pemphigus/pemphigoid), 건선(psoriasis), 및 백반증(vitiligo)으로 이루어지는 군에서 선택된다.
다른 측면에서, 본 발명은 a) NKG2A에 특이적으로 결합하고; b) Fc 수용체에 특이적으로 결합하며; c) NKG2C 또는 NKG2E에 결합하지 않고; d) Z270 또는 Zl99와 완전 경합하며; e) NK 세포의 NK 세포-감수성 표적 세포 용해를 억제할 수 있으며, 상기 교차 결합 단클론 항체가 Zl99가 아닌 것을 특징으로 하는 억제성 단클론항체 또는 그 억제성 단편을 제공한다. 바람직한 태양으로서, 상기 억제성 항체는 비인간 영장류 NKG2A와 결합한다.
보다 바람직한 태양으로서, 상기 억제성 항체 또는 그 단편은 Z270의 가변경쇄영역 또는 Z270의 가변중쇄영역의 아미노산서열을 포함한다. 가장 바람직한 태양으로는 항체는 Z270이다.
또 다른 바람직한 태양으로서, 상기 억제성 항체 또는 단편은 키메라 항체 또는 인간화 항체이다. 가장 바람직하게는 ch270VK 또는 ch270VH를 포함하는 항체 또는 단편이다. 가장 바람직하게는 항체가 chZ270 또는 Z270이다.
또 다른 태양으로서, 본 발명은 유효량의 상기 억제성 항체 또는 억제성 단편, 또는 Z199; 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다. 이러한 억제성 항체 조성물은 바람직하게는 약학적 용도로 제형화된다.
본 발명의 억제성 항체 조성물은 선택적으로 바람직하지 않은 다른 세포의 NK-세포 매개 용해, 과잉활성의 NK 세포 활성, 또는 원하지 않는 NK 세포 증식을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료에 유용한 제2 치료제를 포함한다. 그러한 제2 치료제는 예를 들면, 사이토킨, 항암제(화학요법제, 항혈관신생제, 아폽토시스촉진제, 호르몬제, DNA 복제 억제 화합물, 유사분열 억제 화합물 및/또는 염색체분리 억제 화합물, 폴리뉴클레오티드 전구체의 합성 및 정확도를 파괴하는 약제), 보조화합물(adjunct compound), 억제성 NK 세포 수용체를 자극할 수 있는 화합물(예를 들면, 천연 리간드, 항체, CD94/NKG2A 수용체 또는 KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR3DL1, 및 KIR3DL2 등의 억제성 KIR 수용체의 활성을 자극하는 소분자들), 또는 활성화 NK 세포 수용체의 억제제(NKp30, NKp44, 또는 NKp46 등)에서 선택될 수 있다.
본 발명의 억제성 항체 및 그 단편은 NK 세포 매개의 세포 용해를 감소시키는 방법에 사용될 수 있다. 또는 본 발명의 억제성 항체 및 그 단편은 세포 집단에서 NK 세포수를 감소시키는 방법에 사용될 수 있다. 양 방법은 NK 세포를 억제제 단클론 항체 또는 단편과 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 억제성 항체를 포함하는 약제학적으로 적합한 조성물은 바람직하지 않은 NK 세포-매개 타 세포 용해, 과잉활성의 NK 세포 활성, 또는 원하지 않는 NK 세포 증식을 특징으로 하는 질병 또는 상태로 고통받는 환자의 치료 또는 예방 방법에 사용될 수 있으며, 상기 방법은 상기 조성물을 상기 환자에 투여하는 단계를 포함한다. 상기 상태 중 하나는 NK-LDGL이다. NK-LDGL(NK-타입 과립림프구림프증식질환; 또는 NK-LGL로도 호칭됨)은 NK 세포 또는 NK-양 세포 즉 특징적인 조합의 표면 항원 발현을 나타내는 대과립림프구(예를 들면 CD3-, CD56+, CD16+ 등; Loughran (1993) Blood 82:1 참조)의 클론 증식에 의하여 유발되는 증식성 질환의 한 클래스를 지칭한다.
대체 실시예에서, 본 발명의 억제성 항체를 사용하는 모든 방법은 추가적으로 환자에게 제2 치료제를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 제2 치료제는 통상적으로 바람직하지 않은 NK 세포-매개 타 세포 용해, 과잉활의성 NK 세포 활성, 또는 원하지 않는 NK 세포 증식을 특징으로 하는 질병 또는 상태를 치료하는 약제이다. 이러한 약제의 예시는 전술된 바와 같다. 제2 치료제는 개별적 투여 형태 또는 억제성 항체 또는 단편의 조성물의 한 부분으로서 투여될 수 있다.
또 다른 측면으로, 본 발명은 하나 이상의 상기 기재된 항체 또는 그 단편을 포함하는 키트를 제공한다. 통상적으로 상기 키트는 본 발명의 방법에 따른 항체 사용 지시문을 포함한다. 관련 구현예로서 상기 키트는 별개의 용기에 다양한 질병이나 상태의 치료 또는 예방에 있어서 활성화 또는 억제성 항체 또는 단편과 관련하여 사용되는 전술한 것과 같은 제2 치료제를 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 인간 NKG2A에 대한 항체 평가 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) 그 표면에 NKG2A를 갖는 것을 특징으로 하는 비인간 영장류 세포 또는 비인간 영장류 NKG2A 폴리펩티드를 항체에 접촉시키는 단계; 및 b) 상기 항체의 상기 세포 또는 폴리펩티드에의 결합 및 그들의 활성에 영향을 주는 능력을 평가하는 단계를 포함한다. 관련 구현예로서, 상기 방법은 활성 항체를 평가하는데 사용되며; 상기 항체를 비인간 영장류 NK 세포 및 표적 세포를 포함하는 세포 집단과 접촉시키고, 상기 NK 세포는 그 표면에 NKG2A가 있으며, 상기 표적 세포는 그 표면에 HLA-E가 있는 것을 특징으로 하며; 상기 평가 단계는 상기 표적 세포가 용해되는지 여부를 결정하는 것이다.
또 다른 측면으로, 본 발명은 인간에서의 질병 치료에 사용되기에 적합한 항체의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) 인간 NKG2A를 포함하는 조성물로 비인간 포유동물을 면역하는 단계; b) NKG2A에는 결합하나, NKG2C 또는 NKG2E에는 결합하지 않는 단클론 항체를 선택하는 단계; c) 상기 항체를 인간에서 사용하기 적합하게 하는 단계; d) 상기 항체를 비인간 영장류에 투여하는 단계; 및 e) 상기 항체의 상기 영장류에서의 생체 내 NKG2A에 대한 결합능 및 상기 영장류의 상기 항체에 대한 내성을 평가하는 단계;를 포함하고, 상기 항체가 결합하고, 비인간영장류가 내성이다는 평가는 상기 항체가 인간에서의 질병 치료에 사용되기에 적당한 것임을 나타내는 것을 의미한다. 바람직한 태양으로 상기 방법은 상기 d) 단계 전에 상기 항체를 Fc 수용체에 결합하지 않도록 개질하는 단계를 추가적으로 포함한다.
본 발명은 상기 방법으로 제조되는 항체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 인간 NKG2A에 대한 치료적 항체에 대해 적절한 투여 요법을 동정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) 항체의 투여량 또는 투여빈도를 다양하게 한 일련의 투여 요법을 사용하여 비인간 영장류에 상기 항체를 투여하는 단계; 및 b) 각 투여 요법에 대한 상기 영장류의 내성 및 상기 비인간 영장류에서의 NKG2A-발현 세포의 활성을 결정하는 단계를 포함한다. 어떤 투여 요법에 상기 영장류가 내성이고, NKG2A-발현 세포의 활성에 검출가능한 조절이 있는 경우, 상기 투여 요법은 인간에서 사용하기에 적절한 것으로 간주된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 a) 억제성 또는 활성화 항체, 및 b) 세포 독성제(cytotoxic agent)를 포함하는 콘쥬게이트(conjugate)를 제공한다. 상기 생성되는 콘쥬게이트는 NK 세포를 살해하는데 사용될 수 있다. 따라서, 활성화 항체 단독에 의해서는 NK 세포를 활성화하게 되는 것과 반대로, 활성화 항체와 세포 독성제의 복합은 NK 세포를 살해할 수 있는 분자를 제조하게 된다. 본 발명의 세포 독소/항체 복합체는 조성물로 제형화될 수 있으며, 본 발명의 억제성 항체에서와 유사한 방식으로 각 방법들에 사용될 수 있다.
서론
본 발명은 그 표면에 HLA-E 또는 QaIb 를 발현하는 세포의 존재를 특징으로 하는 표적 세포의 NK 세포-매개 용해를 활성화하는 NKG2A에 대한 신규한 항체, 그 제조 방법, 상기 항체의 치료적 사용에 대한 평가 방법 및 특징화 방법; 및 상기 항체 포함 조성물 및 상기 항체를 수지상 세포와 같이 그 세포 표면에 HLA-E 또는 QaIb 를 발현하는 세포의 존재를 특징으로 하는 자가면역질환 또는 염증 질환 및 기타 상태에 대한 치료에 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 NKG2A가 많은 NK 세포에 의한 성숙 수지상 세포의 용해를 억제하는 일차적인 책임을 진다는 놀라운 발견에 기초한 것이다. 성숙 수지상 세포는 상당한 수준의 HLA-E를 발현하며, 이 HLA-E는 NK 세포상에 존재하는 NKG2A 수용체를 통하여 세포상 세포의 표적화를 방해한다. 따라서, 하기 이론에 매임없이, NK 세포의 NKG2A-매개 억제를 차단함으로써, NK 세포에 의한 수지상 세포의 표적화를 증가시키고, 따라서 면역질환 또는 염증 질환 또는 수지상 세포의 활성, 특히 실질적으로 성숙 수지상 세포의 활성을 감소시킴으로써 경감 또는 치료될 수 있는 어떠한 상태에 대해서도 효과적으로 치료할 수 있다. 본 발명은 요컨대, 보다 일반적으로 포유동물에서 수지상 세포, 바람직하게는 성숙 수지상 세포의 수를 억제 또는 감소시키고, 또한 면역 반응, 바람직하게는 자가반응적 면역 반응을 일반적으로 감소시키는 방법을 제공한다.
역으로, 본 발명은 또한 표적 세포의 NK 세포-매개 용해를 억제시키는 NKG2A에 대한 신규한 항체, 그 제조 방법 및 상기 항체의 치료적 사용에 대한 평가 및 특징화 방법; 및 상기 항체를 포함하는 조성물 및 상기 항체를 자가면역질환 또는 이식 거부에 대한 치료에 사용하는 방법을 제공한다.
정의
본 명세서에서 하기의 용어는 달리 특정되지 않는 한 하기의 의미로 사용된다.
본 명세서에서, "NK 세포"는 비양식화된 면역에 관련된 림프구의 하부 집단이다. NK 세포는 CD16, CD56 및/또는 CD57을 포함하는 특이적 세포 항원의 발현, 세포 표면에 알파/베타 또는 감마/델타 TCR 복합체의 비존재 등과 같은 어떤 특성 및 생물학적 성질, 특정 세포용해성 효소의 활성화에 의하여 "자기"MHC/HLA 항원을 발현하지 않는 세포와 결합하여 살해하는 능력, 종양 세포 또는 NK 활성화 수용체에 대한 리간드를 발현하는 기타 병적 세포를 살해하는 능력, 및 면역 반응을 자극하거나 억제하는 사이토킨으로 불리우는 단백질 분자를 방출하는 능력 등에 의하여 동정될 수 있다. 이들 특성 및 활성들은 당업계에 공지 방법에 따라 NK 세포를 동정하는데 사용될 수 있다.
수지상 세포(Dendritic cells)은 골수에서 만들어지는 이질적 면역 세포의 집단이다(O'Neill 등. (2004) Blood 104:2235-2246, Mohamadzadeh 등. (2004) J Immune Based Ther Vaccines. 2004; 2: 1; 상기 문헌의 모든 내용은 본 명세서에서 참조로 통합된다). 본 명세서에서, DCs는 DC 전구체, 비성숙 DCs 및 성숙 DCs 모두를 포함한다. DC 전구체 및 미성숙 DCs는 음성 계통(CD3- CD14- CD19- CD56-) HLA-DR+ 단핵성 세포이다. 이들 세포들은 나아가 골수성 수지상 세포 및 혈질세포상 수지상 세포의 두 집단으로 분류된다. 골수성 DCs는 CDl1c+ 및 CD123 1ow 이고, 단핵구와 같은 외양을 가지며, 혈질세포상 DCs는 CDlIc- 및 CD 123 high이며, 그 형태는 플라즈마 세포와 유사하다. 항원 포획에 이어 DCs는 성숙 과정이 진행되며, 이 성숙 과정에서 포획된 항원은 펩타이드로 프로세싱되고 세포 표면에 제시되기 위해 MHC 클래스 I 또는 II에 로딩된다. 성숙 DCs는 낮은 포식 작용을 나타내며, 베일(veils)로 지칭되는 세포질적 확장을 나타내며, 림프 조직으로 유주하며, CD83 및 DC-LAMP와 같은 특징적인 마커를 발현한다. TLRs 또한 DCs에 발현되는데, 상이한 DC 타입은 상이한 TLR 마커를 발현한다(O'Neill 등. (2004) 참조)
NKG2A (OMIM 161555, 개시된 모든 내용은 참조로 통합됨)은 NKG2 그룹 전사체(transcripts)의 한 구성원이다(Houchins, 등. (1991) J. Exp . Med . 173:1017-1020). NKG2A는 상이한 절단을 보이는 스팬 25 kb의 7개의 엑손으로 코딩되어 있다. NKG2A은 NK 세포 표면에서 발견되는 억제성 수용체로, 억제성 KIR 수용체처럼, 세포질 도메인에 ITIM을 갖고 있다. 본 명세서에서, "NKG2A"는 NKG2A 유전자 또는 그 코딩 단백질의 아이소형(isoform), 유도체 또는 각종 변이체들을 지칭한다. 또한 야생형 전장 NKG2A의 하나 이상의 생물학적 특성 또는 기능을 공유하고, 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 핵산 또는 아미노산 상동성을 갖는 모든 핵산 또는 단백질 서열을 포함한다. NKG2A는 본 명세서에서 "NKG2A 수용체"로도 지칭된다.
NKG2C (OMIM 602891, 개시된 모든 내용은 참조로 통합됨) 및 NKG2E (OMIM 602892, 개시된 모든 내용은 참조로 통합됨)은 NKG2 그룹 전사체의 또 다른 두 구성원이다(Gilenke, 등. (1998) Immunogenetics 48:163-173). NKG2C 및 NKG2E는 NK 세포 표면에서 발견되는 활성화 수용체(activating receptors)이다. 본 명세서에서 "NKG2C" 및 "NKG2E"는 각각 NKG2C 또는 NKG2E 유전자 또는 그 코딩 단백질의 아이소형, 유도체 또는 각종 변이체들을 지칭한다. 또한 야생형 전장 NKG2C 또는 NKG2E의 하나 이상의 생물학적 특성 또는 기능을 공유하고, 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 핵산 또는 아미노산 상동성을 갖는 모든 핵산 또는 단백질 서열을 포함한다.
CD94 (OMIM 602894, 개시된 모든 내용은 참조로 통합됨)는 NK 세포상에 우선적으로 발현되는 항원이다(Chang 등. (1995) Europ . J. Immun. 25: 2433-2437). CD94는 NK 세포 라인에서 0.8, 1.8, 및 3.5 kb의 3개의 메이저 전사체 및 5.5 kb의 마이너 전사체로 발현되며, 147-아미노산 세포외 도메인과 C-타입 렉틴(C-type lectins) 특성의 수개의 모티프를 갖는 단백질을 코딩한다. CD94의 아미노산 서열은 NKG2 패밀리 구성원 NKG2A, NKG2C, NKG2D, 및 NKG2E과 27 내지 32%의 상동성을 갖는다. 세포질 도메인이 없기 때문에 CD94는 NKG2A, NKG2C, 및 NKG2E과 이황화결합 이형이량체를 형성하는 다른 수용체와 결합하여야 한다(Lazetic 등. (1996) J. Immun. 157: 4741-4745). 본 명세서에서, "CD94"는 CD94 유전자 또는 그 코딩 단백질의 아이소형, 유도체 또는 각종 변이체들을 지칭한다. 또한 야생형 전장 CD94의 하나 이상의 생물학적 특성 또는 기능을 공유하고, 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 핵산 또는 아미노산 상동성을 갖는 모든 핵산 또는 단백질 서열을 포함한다.
HLA-E (OMIM 143010, 개시된 모든 내용은 참조로 통합됨)는 비전형적 MHC 분자로서, 세포 표면에 발현되고, 다른 MHC 클래스 I 분자의 신호 서열 유래의 펩티드의 결합에 의해 조절된다. HLA-E는 자연 살해 세포(NK) 및 몇몇 T 세포와 결합하며, 특히 CD94/NKG2A, CD94/NKG2B, 및 CD94/NKG2C과 결합하고 억제성 KIR 수용체와는 결합하지 않는다(OMIM 604936 참조, 개시된 모든 내용은 참조로 통합됨) (Braud 등. (1998) Nature 391:795-799, 개시된 모든 내용은 참조로 통합됨). HLA-E의 표면 발현은 표적 세포가 CD94/NKG2A+ NK 세포 클론에 의해 용해되는 것을 충분히 막을 수 있다. 본 명세서에서, "HLA-E"는 HLA-E 유전자 또는 그 코딩 단백질의 아이소형, 유도체 또는 각종 변이체들을 지칭한다. 또한 야생형 전장 HLA-E의 하나 이상의 생물학적 특성 또는 기능을 공유하고, 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 핵산 또는 아미노산 상동성을 갖는 모든 핵산 또는 단백질 서열을 포함한다.
QaIb는 마우스 세포 표면 항원으로서, NKG2A에 대한 생리학적 리간드이다. "QaIb"는 QaIb 유전자 또는 그 코딩 단백질의 아이소형, 유도체 또는 각종 변이체들을 지칭한다. 또한 야생형 전장 유전자 또는 그 코딩 단백질의 동형, 유도체 또는 각종 변이체들을 지칭한다. 또한 야생형 전장 QaIb의 하나 이상의 생물학적 특성 또는 기능을 공유하고, 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 핵산 또는 아미노산 상동성을 갖는 모든 핵산 또는 단백질 서열을 포함한다.
"자가면역" 질환은 면역 시스템이 자기 세포 또는 조직에 대하여 반응을 상승시키는 모든 질환, 상태 또는 질병을 포함하는 것으로, 이는 자기를 비자기 또는 기타로부터 구별할 수 있는 능력의 상실에서 기인되는 것이다. 자가면역질환의 예로는 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 악성빈혈, 아디슨병(Addison's disease), 제1형 당뇨병, 류마티스성 관절염, 전신홍반루푸스, 피부근육염, 쇼그렌 증후군, 홍반 루프스, 다발경화증, 중증근육무력증, 라이터 증후군(Reiter's syndrome), 그레이브스병, 다발근육염, 급성특발다발신경염, 베게너 육아종, 결절다발동맥염, 류마티스성 다발성 근육통(polymyalgia rheumatica), 측두동맥염(temporal arteritis), 베체트병, 초그-스토라우스 증후군(Churg-Strauss syndrome), 타카야수 동맥염(Takayasu's arteritis), 및 기타 질환을 포함한다. "염증질환(inflammatory disorder)"은 원하지 않는 면역반응을 특징으로 하는 어떠한 질환도 포함한다. 자가면역질환 및 염증질환은 면역계의 어떤 구성요소와 관련될 수 있으며, 체내 모든 세포 또는 조직 형태를 표적할 수 있다.
NKG2A 활성과 관련하여 "억제하는", "감소하는", "차단하는", "하향조절하는", 등의 용어는 세포상의, 바람직하게는 NK 세포상의 NKG2A 수용체의 자극 또는 발현을 지연, 감소, 반전 또는 어떠한 식이든지 부정적으로 영향을 미치는 모든 과정, 방법, 또는 화합물을 지칭한다. 이러한 용어들은 리간드에 의한 NKG2A의 자극을 억제하는 화합물을 지칭할 수도 있는데, 이들은 리간드가 존재하지 않는 경우 길항적으로 작용하여 수용체의 활성을 감소시키거나, 수용체의 발현 수준을 감소시키거나, NKG2A-유발 시그널링 또는 유전자 발현을 차단하거나, NKG2A 활성화로 기인되는 세포의 다른 활성을 차단한다. 바람직한 태양에서, 억제성 화합물 또는 방법은 리간드 예를 들면 HLA-E에 의한 수용체 결합을 방지한다. NKG2A 수용체 분자수 또는 전술한 활성들은 본 명세서에 기재된 방법과 같은 표준 방법으로 측정가능하다.
본 발명에서 "항체"는 다클론항체 및 단클론항체를 지칭한다. 중쇄의 일정 도메인의 형태에 따라, 항체는 하기 5개의 주요 클래스로 분류된다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM. 이들은 다시 IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, 등과 같은 하위클래스 또는 개별형(isotype)으로 분류된다. 예시적인 면역글로불린(항체)의 구조적 단위는 테트라머를 포함한다. 각 테트라머는 두개의 동일한 폴리펩티드 사슬 짝으로 구성되며, 각 짝은 하나의 "경쇄" (약 25 kDa) 및 하나의 "중쇄"(약 50-70 kDa)을 갖는다. 각 사슬의 N-말단은 주로 항체 인식을 담당하는 약 100 내지 110 이상의 아미노산으로 되는 가변 영역(variable region)을 이룬다. "가변 경쇄(variable light chain; VL)" 및 "가변 중쇄(variable heavy chain; VH)"는 각각 경쇄 및 중쇄의 가변 영역를 지칭한다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 일정 도메인은 각각 "알파", "델타", "엡실론", "감마", 및 "뮤"로 지칭된다. 상이한 클레스의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원적 형상은 공지되어 있다. IgG 및/또는 IgM는 본 발명에서 사용되는 바람직한 항체 클래스이며, IgG가 특히 바람직한데, 생리학적 상태에서 가장 흔한 항체이고 실험실 세팅에서 가장 쉽게 제조될 수 있기 때문이다.
본 발명에서 바람직한 항체는 단클론 항체이다. 특히 바람직하게는, 인간화 항체, 키메라 항체, 인간 항체 또는 다른방식으로 인간에 적당하게 된 항체이다. 본 명세서에서 "항체"는 예를 들어 "항체 또는 그 단편"과 같이 그 포함하였을 경우 불필요한 중복을 초래하는 경우가 아니라면, 본 명세서에서 개시된 항체의 어떠한 단편 또는 유도체도 포함한다. 한 바람직한 태양에서, 상기 항체는 NK 세포와 결합하여 NKG2A의 자극을 방해하지만(HLA-E 또는 QaIb 를 그 표면에 갖는 세포의 용해를 초래하는), NKG2A 발현 세포는 살해하지 않는 것을 의미하는 비-고갈 항체(non-depleting antibodies)이다. 비-고갈 항체 또는 항체 단편은 IgG4 항체와 같이 Fc 수용체에 의하여 인식되지 않거나 극히 조금 인식되거나, Fc 부분이 없는 항체 단편, 또는 Fc 꼬리가 Fc 수용체에 결합 되지 않도록 또는 그 결합이 경감되도록 개질되어 있는 기타 항체를 의미한다. (WO03101485호 참조, 개시된 모든 내용은 참조로 통합됨).
다른 바람직한 태양에서, 항체 또는 항체 단편은 Fc 수용체와 결합한다. 이러한 항체 및 단편은 NKG2A 분자의 교차 결합(cross-linking)을 유발시켜, NK 세포 활성을 억제하고, 경우에 따라서는 NK 세포를 살해한다.
"특이적으로 결합하는"은 항체가 바람직하게는 경합 결합 시험(competitive binding assay)에서 분리된 NK 세포 또는 기타 세포의 표면에 존재하는 천연 단백질 또는 단백질의 재조합 형태, 그 에피토프를 사용하여 평가하였을 때, NKG2A와 같은 결합 상대와 결합할 수 있는 것을 의미한다. 경합 결합시험 및 기타 특이적 결합을 결정하는 기타 방법은 아래에서 추가적으로 기술되며 본 기술분야에서 잘 알려져 있다.
"인간에게 적당한 항체" 는 예를 들어 본 명세서에 기재되어 있는 치료적 방법 등을 위하여 인간에게 안전하게 사용될 수 있는 모든 항체, 유도화된 항체 또는 항체 단편을 지칭한다. 상기 항체는 모든 형태의 인간화 항체, 키메라 항체, 완전 인간 항체 또는 적어도 항체의 일부분이 인간 유래이거나 개질되어 천연 비인간 항체가 사용될 경우 통상적으로 일어나는 면역반응을 피할 수 있는 모든 항체를 포함한다.
본 발명에 있어서, "인간화 항체"는 하나 이상의 인간 면역글로불린의 일정 및 가변 골격 영역이 동물 면역글로불린의 결합 영역 예를 들면 CDR과 융합된 항체를 지칭한다. 이러한 인간화 항체는 비인간 항체에 대한 면역 반응의 유발없이 그 결합 영역이 유래된 비인간 항체의 결합 특이성을 유지시키도록 디자인된다.
"키메라 항체"는 (a) 일정 영역(constant region), 또는 그 일부가 변경, 대체 또는 교환되어, 항원 결합 영역(가변 영역)가 상이하거나 변형된 클래스, 효과 기능(effector function) 및/또는 종의 일정 영역과 결합되어 또는 키메라 항체에 새로운 성질을 부여하는 완전히 상이한 분자 예를 들어 효소, 독소, 호르몬, 성장 인자, 약 등과 같이 결합된 항체; 또는 (b) 가변 영역, 또는 그 일부가 상이하거나 변경된 항원 특이성을 갖는 가변 영역으로 변경, 대체 또는 교환되어 있는 항체이다.
"인간항체"는 항원 챌린지(antigenic challenge)에 반응하여 특이적인 인간 항체를 생산하는 트랜스제닉 마우스 또는 기타 동물로부터 수득되는 항체이다(Green 등 (1994) Nature Genet 7:13; Lonberg 등. (1994) Nature 368:856; Taylor 등. (1994) Int Immun 6:579, 상기 문헌의 모든 교시내용은 본 명세서에 참조로 통합된다). 완전 인간 항체는 또한 본 기술분야에 공지된 유전 또는 염색체 트랜스펙션 (genetic or chromosomal transfection methods) 및 파지 디스플레이 기술(phage display technology)로 구축될 수 있다(McCafferty 등. (1990) Nature 348:552-553). 인간 항체는 또한 생체외에서 활성화된 B 세포에서 생산할 수도 있다(미국 특허제 5,567,610호 및 제5,229,275호, 본 명세서에 참조로서 통합된다).
본 발명에서, "활성" 또는 "활성화된(activated)" NK 세포는 생물학적으로 활성인 NK 세포, 특히 표적 세포를 용해하는 활성을 갖는 NK 세포를 지칭한다.예를들어 "활성 NK 세포"는 NK 활성화 수용체-리간드를 발현하고, "자기 MHC/HLA 항원"을 발현하지 않는 세포(KIR-부적합성 세포)를 살해할 수 있다. 이러한 세포를 본 명세서에서는 "NK 세포-감수성 표적 세포" 로 지칭한다. 그러한 표적 세포의 예로서, P815 및 K562 세포가 있으며, 리다이렉트 살해 시험(redirected killing assay)에 사용하기 적합하다. 그러나 다른 세포 형태도 사용될 수 있으며 이는 본 기술분야에서 잘 알려져 있다(Sivori 등 (1997) J. Exp . Med . 186: 1129- 1136; Vitale 등. (1998) J. Exp . Med. 187: 2065-2072; Pessino 등. (1998) J. Exp . Med. 188: 953-960; Neri 등. (2001) Clin . Diag . Lab . Immun . 8:1131-1135). "활성" 또는 "활성화된" 세포는 또한 NK 활성과 관련된 것으로 본 분야에서 공지되어 있는 다른 성질 또는 활성, 예를 들면 자유 세포내 칼슘 수준에서 사이토킨(예. IFN-γ 및 TNF-α) 생산 증가 등에 의해 동정될 수도 있다. 본 발명에서, 활성화된 NK 세포는 이상적으로는 NKG2A 수용체는 자극되지 않고, NCR, 바람직하게는 NKp30은 자극되어 성숙 수지상 세포에 대하여 세포 독성을 나타내는 NK 세포를 지칭한다.
"NKG2A 자극"은 본 명세서에서, 예를 들면 NK 세포와 같이 NKG2A를 갖는 세포에서 NKG2A가 그 천연 리간드(예를 들면, HLA-E 또는 QaIb) 또는 그 기능적 단편과 결합하였을 때 일어나는 과정을 지칭한다. NKG2A는 억제성 수용체이므로, 이러한 결합은 NK 세포 활성을 억제를 유발한다. 따라서, "NKG2A 자극의 억제"는 NKG2A의 천연 리간드 또는 그 기능적 단편과의 결합이 억제되거나 방지되어, 결합이 일어나도 NK 세포 활성의 억제를 일으키지 않는 과정을 지칭한다.
따라서, "활성화 항체"는 본 명세서에서 NKG2A에 대한 항체로서, NK 세포상의 NKG2A와의 결합을 통해 NKG2A와 표적 세포상의 천연 리간드(예를 들면, HLA-E 또는 QaIb) 과의 결합을 방지하거나, 또는 HLA-E 양성 표적에 의해 정상적으로 매개되는 NKG2A 의존성 신호전달을 방지하여, 요컨대 NKG2A와 리간드의 결합에 의해 발생되는 NK 세포에 의한 표적 세포의 용해의 억제를 반전하는 항체를 의미하는 것으로 사용된다. 따라서, 활성화 항체는 NKG2A자극의 억제를 유발한다.
"억제성 항체" 는 본 명세서에서 NKG2A에 대한 항체로서, NK 세포상의 NKG2A와의 결합을 통해 다른 경우에서는 용해되었을 세포에 대하여 이 세포를 용해하는 NK 세포의 능력을 억제를 유발하는 항체를 의미하는 것으로 사용된다. 본 발명에서 억제성 항체는 통상적으로는 NK 세포에서 NKG2A 분자의 교차 결합을 유발하여 NK 세포를 억제하고 때로는 살해한다. 본 발명의 NKG2A에 대한 억제성 항체는 NKG2A와 그 천연 리간드 또는 그 활성 단편과의 결합을 방해할 수 있으나, NK 세포의 세포 용해 능력이 항체에 의하여 이미 억제되어 있기 때문에 천연 리간드를 갖는 세포의 용해는 일어나지 않는 점에 주목하여야 한다.
"분리된", "정제된" 또는 "생물학적으로 순수한"은 통상적으로 자연 상태에서 수반되는 것으로 발견되는 성분들이 실질적으로 또는 본질적으로 배제된 물질을 의미한다. 순도 및 동종성은 통상 폴리아미드겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 분석 화학 기술을 사용하여 결정한다. 제조시 존재하는 주된 종의 단백질은 실질적으로 순수하다.
"생물학적 시료"는 본 명세서에서 생물학적 유체(예를 들면, 혈청, 림프액, 혈액), 세포 시료 또는 조직 시료(예를 들면 골수)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
"폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 본 명세서에서 상호호환적으로 사용되며, 아미노산 잔기의 폴리머를 지칭한다. 상기 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 천연 아미노산에 상응하는 인공적인 화학적 모방물인 아미노산 폴리머, 천연 아미노산 폴리머 및 비천연 아미노산 폴리머 모두를 지칭한다.
"재조합" 이라는 용어가 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터 등과 같이 사용될 때, 이는 상기 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종성 핵산 또는 단백질의 도입 또는 천연 핵산 또는 단백질의 변경에 의하여 개질되었거나, 상기 세포가 그렇게 변경된 세포로부터 유래 되었다는 것을 의미한다. 따라서 예를 들면 재조합 세포는 그 세포의 천연(비재조합) 형태에서는 발견되지 않는 유전자를 발현하거나 또는 다른 경우라면 비정상적으로 발현되거나 저발현되거나 전혀 발현되지 않는 천연 유전자를 발현한다.
특정 단클론 항체(예를 들어, Zl99 또는 Z270)를 지시하면서 "~와 경합한다" 는 것은 재조합 NKG2A 분자 또는 표면 발현 NKG2A 분자를 이용한 결합 시험에서 시험되는 항체 또는 그 단편이 NKG2A에 대한 지시 단클론 항체(reference monoclonal antibody, 예를 들어, Zl99 또는 Z270)의 결합을 감소시킨다는 것을 의미한다(지시 항체 및 NKG2A는 포함하나 시험 항체는 포함하고 있지 않은 대조군에 비교하여 볼때). 예를 들어, 만약 결합 시험에서 어떤 항체가 Z270의 인간 NKG2A 분자에의 결합을 감소시킨다면, 그 항체는 인간 NKG2A에 대한 결합에 있어서 Z270과 경합한다.
"완전히 경합한다"는 용어는 본 명세서에서 시험 항체가 실질적 또는 본질적으로 지시 단클론 항체와 동일한 에피토프에 결합한다는 것을 의미한다.
본 명세서에서, "유효량"은 원하는 결과를 얻거나 촉진하는데 필요하거나 충분한 정도의 양을 의미한다. 어떤 경우 유효량은 치료학적 유효량을 의미한다. 치료학적 유효량이란 개체에서 원하는 생물학적 반응을 얻거나 촉진하는데 필요하거나 충분한 정도의 양을 의미한다. 어떤 특정한 응용에 대한 유효량은 치료 대상 질환 또는 상태, 투여되는 특정 약제, 개체의 크기 또는 질병 또는 상태의 심각도 등의 인자에 따라 달라질 수 있다. 본 기술분야의 당업자는 과도한 실험없이 특정 약제의 유효량을 경험적으로 결정할 수 있다.
"비인간 영장류(non-human primates)"는 에이프(ape), 신세계 원숭이(New World monkeys), 구세계 원숭이(Old World monkeys), 프로시미안(prosimians), 퐁고 피그마우스 피그마우스(Pongo pygmaeus pygmaeus; 보르네오 오랑우탄), 퐁고피그마우스 아벨리(Pongo pygmaeus abelii; 수마트란 오랑우탄), 고릴라 고릴라(Gorilla gorilla, 웨스턴 로랜드 고릴라), 판 파니스쿠스(Pan paniscus; 보노보), 판 트로글로디테스(Pan troglodytes; 침판지), 판 트로글로다테스 베루스(Pan troglodytes verus; 침판지), 레무 풀부스(Lemur fulvus; 갈색여우 원숭이), 사귀누스 푸스시콜리스(Saguinus fuscicollis; 흰입술타마린), 사귀누스 라비아투스(Saguinus labiatus; 붉은배타마린), 칼리세부스 몰로크 팔레스센스(Callicebus molloch pallescens; 파라구아얀 티티), 사이미리 사이우레우스(Saimiri sciureus ;다람쥐 원숭이), 아테레스 지오프로이(Ateles geoffroyi; 검은손 거미 원숭이), 라고트릭스 라고트리차(Lagothrix lagotricha; 울리 원숭이), 마카카 아크토이데스(Macaca arctoides; 대머리 원숭이), 마카카 파쉬쿨라리스(Macaca fascicularis; 게잡이 원숭이), 마카카 푸스카타(Macaca fuscata; 일본원숭이), 마카카 뮬라타(Macaca mulatta; (레시우스 원숭이), 마카카 네메스트리나(Macaca nemestrina;돼지꼬리 원숭이), 마카카 니그라(Macaca nigra;세레베스 원숭이), 에리로세부스 파타스(Erythrocebus patas; 파타스 원숭이), 바분(baboons), 마모셋(marmosets), 카푸틴(capuchins), 시놀몰거스(cynomolgus), 하울러(howlers), 거미 원숭이(Spider monkeys), 만드릴(m및rills), 거농(guenon), 판타스원숭이(patas monkeys), 콜로부스(colobus), 지봉(gibbons), 여우원숭이(lemurs), 아이아이(aye-ayes), 로리스(loris), 부시베이비(bushbabies), 및 안경 원숭이(tarsiers)를 포함하는 영장류계의 모든 포유동물을 포함한다. 바람직한 태양으로서, 본 발명에서 사용되는 비인간 영장류는 에이프가 아닌, 예컨대 침판지, 고릴라, 오랑우탄 또는 지봉을 제외한 비인간 영장류이다. 본 발명에서 상기 시험은 비인간 영장류를 사용하여 수행되며, 항체가 영장류에 투여되는 생체내 시험(in vivo assay), 영장류로부터 채취한 세포를 항체로 처리하고 이를 다시 영장류에 넣은 엑스 비보 시험(ex-vivo assay) 및 영장류로부터 채취한 세포, 단백질 또는 조직과 관련되는 생체외 시험(in vitro assays)을 포함한다.
만약 비인간 영장류와 같은 포유동물이 항-NKG2A 항체의 투여에 "내성"이 있다고 하는 것은 투여에 의하여 그 동물이 치사에 이르지 않으며, 어떠한 심각한 부작용도 나타내지 않는다는 것을 의미하며, 비록 부작용이 있더라도 심각하지 않으며, 일반적으로 투여에 의한 치료적 잇점이 상회하는 것을 의미한다.
NKG2A 에 특이적으로 결합하는 화합물의 수득 방법
본 발명은 면역 세포 특히 NK 세포 상의 NKG2A에 결합하는 활성화 항체 및 억제성 항체와 이들의 동정, 생산, 평가 및 사용에 관한 것이다. 상기 항체를 동정하는 일 방법은 NKG2A에 결합할 수 있는 항체를 찾는 것이다. 일단 특이적으로 결합하는 항체가 동정되면 예를 들어 NK 세포상의 NKG2A를 억제하는지 또는 활성화하는지를 시험할 수 있다. 그러나 이러한 결합 시험을 수행하는 것은 본 발명을 실행하는데 있어 필수적인 것은 아니다.
다양한 시험법이 항체의 NKG2A에의 결합을 평가하는데 사용될 수 있다. 엘리사(ELISA) 기반 프로토콜, 방사면역측정법(radioimmunoassays), 웨스턴블롯법, 비아코어법(BIACORE), 및 기타 경합 시험(competition assays) 등이 사용될 수 있으며, 이는 본 기술분야에서 잘 알려져 있다.
예를 들어, 간단한 결합 시험이 사용될 수 있으며, 상기 시험에서 표적 단백질 또는 에피토프(예를 들면 NKG2A 또는 그 부분)의 존재하에 항체를 인큐베이션하고, 결합하지 않은 항체는 세척해내고, 결합 항체의 존재는 방사성표지, 또는 질량 스펙트럼, 유세포 분석(FACScan)을 사용한 직접 또는 간접 형광 표지 검출법 등의 물리적 방법으로 평가하며, 이들 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있다. 대조 비특이적 항체 이상의 결합량을 나타내는 경우, 상기 항체가 표적에 특이적으로 결합하는 것을 의미한다.
이러한 시험에서, 시험 항체의 표적 세포 또는 인간 NKG2A에의 결합 능력은 (음성) 대조 단백질, 예를 들면 구조적으로 관련되어 있지 않은 항원에 대해 발생하는 항원 또는 비-Ig 펩티드 또는 단백질이 동일한 표적에 결합하는 능력과 비교될 수 있다. 어떤 적합한 시험에서, 항체 또는 단편이 표적 세포 또는 NKG2A에 결합하는 대조 단백질에 비하여 25%, 50%, 100%, 200%, 1000%, 또는 그 이상의 증강된 친화력을 나타내는 경우 상기 항체 또는 단편은 표적에 "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 상호작용"하는 것이며, 이들 항체 또는 단편은 하기에 기술되는 치료학적 방법에서 사용되기에 바람직하다.
한 태양에서, NKG2A에 대한 (양성) 대조 항체, 예를 들어 3S9, 20d5, Z270 또는 Z199, 또는 이들의 유도체의 NKG2A에 대한 결합에 영향을 미치는 시험 항체의 능력이 평가된다. 다른 태양에서, NKG2A에 대한 천연 리간드, 예를 들면 HLA-E의 NKG2A에 대한 결합에 미치는 시험 항체의 능력이 측정된다. 3S9는 미국 특허 공개번호 제20030095965호에 개시되어 있으며, 상기 개시는 본 명세서에 참조로서 통합된다. 3S9는 NKG2A 뿐 아니라 NKG2C, NKG2E에 결합한다. 20d5는 상업적으로 입수 가능한 항체이다(BD Biosciences Pharmingen, Catalog No. 550518, USA). 20d5는 마우스 NKG2A, NKG2E 및 NKG2C에 결합한다. Zl99 또한 상업적으로 입수가능한 항체이다(Beckman Coulter, Inc., Product No. IM2750, USA). Z270는 본 명세서에서 자세히 개시된다. Z270는 인간 NKG2A와는 결합하나, 인간 NKG2C 또는 NKG2E에는 결합하지 않는다.
추가적으로, 간단한 경합시험이 사용될 수 있으며, 상기 시험에서는 대조 항체(예를 들어 3S9, Z270 또는 Z199) 및 시험 항체가 혼합된 후(또는 미리 흡착된다) NKG2A 함유 시료에 적용된다. 한 태양에서, 대조 항체와 다양한 양의 시험 항체(예를 들어 1:10 또는 1:100)를 NKG2A-함유 시료에 적용하기 전에 일정 시간 동안 미리 혼합한다. 다른 태양에서, 대조군 및 다양한 양의 시험 항체는 항체/표적 시료에 노출되는 동안 단순히 혼합될 수 있다. 결합 항체를 자유 항체로부터 구분하고(예를 들어 비결합 항체를 제거하는 분리 또는 세척 기술을 사용하여), 시료 항체로부터 대조 항체를 구분할 수 있는 한(예를 들어 종-특이적, 또는 개별형-특이적 2차 항체를 사용하거나, 검출가능한 표지로 대조 항체를 특이적으로 표지하거나, 또는 상이한 화합물을 구분하는 질량 분석법과 같은 물리적 방법을 사용하거나 등의 방법으로), 시험 항체가 항원에 대한 대조 항체의 결합을 감소시키는지를 결정할 수 있으며, 이는 시험 항체가 실질적으로 대조 항체와 동일한 에피토프를 인식하는 것을 나타낸다.
전술한 경합 시험에서, (표지된) 대조 항체의 결합은 전적으로 관련성이 없는 항체의 존재하에서는 높은 대조값을 나타낸다. 낮은 대조값은 표지된 (양성) 대조항체 (예를 들면, 3S9, Z270 또는 Zl99)를 표지 되지 않은 동일한 항체(예를 들면 3S9, Z270 또는 Z199)와 인큐베이션되어, 경합이 일어나 표지된 항체의 결합이 감소된 경우에 얻어진다.
시험에서, 시험 항체의 존재하에서 표지된 항체의 반응성이 심각하게 감소된 것은 시험 항체가 동일한 에피토프를 인식하는 것, 즉 표지된 대조 항체와 "교차-반응"함을 나타낸다. 1:10 내지 약 1:100의 대조:시험 항체 또는 화합물 비율 중 어느 비율에서든지, 시험 항체 또는 시험 화합물이 표지된 대조의 항원/표적에의 결합을 적어도 50% 이상, 보다 바람직하게는 70%이상으로 감소시키는 경우, 이 항체 또는 화합물은 대조군과 실질적으로 동일한 에피토프 또는 결정자와 결합하는 것으로 간주된다. 바람직하게는 그러한 항체 또는 화합물은 대조군의 항원/표적에 대한 결합을 적어도 90% 감소시킨다. 그럼에도 불구하고, 대조 항체의 결합을 측정 가능한 정도로 감소시키는 항체 또는 화합물은 본 발명에서 사용될 수 있다.
문제의 단클론 항체와 동일한 에피토프에 실질적으로 결합하는 하나 이상의 항체의 동정은 항체 경합을 평가하는 각종 면역학적 스크리닝 시험 중 하나를 사용하여 용이하게 결정할 수 있다. 이러한 시험은 본 기술분야에서 통상적으로 시행되는 것이다(미국 특허 제5,660,827호 참조, 상기 특허는 본 명세서에 참조로서 통합된다). 문제의 단클론 항체와 동일 또는 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 동정하기 위해, 항체가 결합하는 에피토프를 실제로 결정하는 것은 어떤 식으로 든지 필요치 않음은 쉽게 이해될 것이다.
한 태양에서, 경합은 유세포 시험법(Flow Cytometry test)에 의하여 평가된다. 예를 들면 NKG2A/CD94 수용체를 갖는 세포를 먼저 상기 수용체와 특이적으로 결합하는 것으로 알려져 있는 대조 항체(예를 들어 3S9, Z270 또는 Z199)와 인큐베이션하고, 이후 형광 크롬 (Fluorochrome) 또는 비오틴으로 표지된 시험 항체와 인큐베이션한다. 만약 포화량의 대조 항체로 미리 인큐베이션하여 얻은 항체의 결합이 대조 항체와 미리 인큐베이션하지 않은 상태에서 항체에 의해 얻어지는 결합(평균 형광)의 80%, 바람직하게는 50%, 또는 40% 이하인 경우, 상기 시험 항체는 대조 항체와 경합한다고 말한다. 또는 포화량의 시험 항체로 미리 인큐베이션한 후 세포상에 표지된 대조 항체(형광 크롬 또는 비오틴으로)의 결합이 상기 항체로 미리 인큐베이션하지 않고 얻어진 결합의 80%, 바람직하게는 50%, 또는 40% 이하인 경우, 시험 항체는 대조 항체와 경합한다고 말한다.
바람직한 일실시예에서, 항체 결합용 기재 예를 들면 3S9와 결합하는 것으로 알려져 있는 NKG2A/CD94 수용체, 또는 그 에피토프-함유 부분을 고정화한 표면에 시험항체를 미리 흡착시키고, 포화농도로 적용하는 간단한 경합 시험을 사용할 수 있다. 상기 표면은 바람직하게는 이후 대조항체(예를 들면 3S9, Z270 또는 Zl99)를 상기 기재-포화농도로 상기 표면에 접촉시키고, 대조항체의 기재 표면 결합 정도를 측정한다. 시험항체의 비존재하에의 대조항체의 결합과 대조항체의 기재-함유 표면에의 결합과 비교한다. 검사에서, 시험항체 존재하에 기재-함유 표면에의 대조항체의 결합이 상당한 정도로 감소하면, 이는 시험항체가 동일한 에피토프를 인식함, 즉 대조항체와 "교차-반응"하는 것임을 나타낸다. 대조항체의 항원-함유 기재에의 결합을 적어도 30% 이상, 보다 바람직하게는 40% 이상 감소키는 시험항체는 실질적으로 대조항체와 동일한 에피토프 또는 결정자에 결합하는 것으로 간주된다. 바람직하게는 시험항체는 대조항체의 기재에의 결합을 적어도 50% 감소시킬 것이다. 대조항체와 시험항체의 순서는 바뀔 수 있으며, 즉 대조항체가 먼저 표면에 결합하고 그 이후 시험항체가 상기 표면에 접촉될 수 있다. 바람직하게는 기재 항원에 대해 더 큰 친화성을 보이는 항체를 기재-함유 표면에 우선 결합하는 게 좋은데, 이는 제2항체(항체들이 교차-반응성으로 가정하고)에 의한 결합이 더 큰 값으로 감소될 것으로 예상되기 때문이다. 이러한 시험의 예시는 Saunal 등 (1995) J. Immunol . Meth 183: 33-41(개시 내용은 모두 참조로서 통합된다)에 잘 개시되어 있다.
바람직하게는 본 발명의 NKG2A를 인식하는 단클론항체는 자가면역질환 또는 염증질환을 앓고 있는 환자의 NK 세포의 상당한 부분에 존재하는 에피토프와 반응하며, 다른 세포 즉 NKG2A를 발현하지 않는 면역 또는 비면역 세포와는 반응하지 않는다. 따라서, 일단 항체가 NK 세포, 바람직하게는 인간 NK 세포와 같은 세포상의 NKG2A를 특이적으로 인식하는 것으로 동정되면, 이를 자가면역 또는 염증 질환 환자에서 채취한 NK 세포에의 결합 친화성을 검사할 수 있다. 유사하게, 본 발명의 방법은 복수 항체, 예를 들면 NKG2A의 자극을 최대한으로 억제하도록 디자인되어 있는 NKG2A의 상이한 에포포프서 아이소형(epitopesor isoform)에 대한 항체를 사용하여 시행할 수 있다. 한 실시예에서, 항체 또는 화합물을 투여하기 전에 환자로부터 NK 세포 및 수지상 세포를 채취하고, 수지상 세포의 NKG2A-매개 용해 억제를 극복할 수 있는 시험항체의 능력을 검사한다.
다른 항체에 대한 특이적인 결합 또는 특이적 결합의 비존재(예를 들면 다른 종의 NKG2A, NKG2C, NKG2E, Fc receptor)를 측정하여야 하는 경우, 전술한 시험법에서 NKG2A에 대한 적합한 항원으로 대체하고, 결합 검사의 대상 항원에 특이적인 대조항체를 사용하여 유사하게 검사할 수 있다. 이러한 항원 및 대조항체는 본 기술분야에 잘 공지되어 있고, 상업적으로 입수 가능하다.
NKG2A 자극을 억제하는 항체 능력의 평가
HLA-E 또는 Qalb에 의한 NKG2A/CD94 자극을 억제할 수 있는 본 발명의 활성화 항체의 동정은 통상적으로 시험 항체의 존재하에 NKG2A 활성을 평가하는 세포-기반 검사를 사용한다. 여러 실시예에서, 후보 항체는 먼저 전술한 바와 같은 NKG2A에 대한 결합능에 기초하여 동정한다. 다른 실시예에서는 상기 결합능과 상관없이, 세포-기반 스크리닝을 수행하여 NKG2A 자극을 억제할 수 있는 항체를 직접적으로 동정한다.
한 태양으로, NKG2A 조절자(modulators)는 미국공개특허공보 제 20030171280호, Braud 등(1998) Nature 391:795-799; Lee 등. (1998) PNAS 95:5199-5204; Vance 등. (2002) PNAS 99:868- 873; Brooks 등. (1999) J Immunol 162:305-313; Miller 등. J Immunol (2003) 171:1369-75; Brooks 등. (1997) J Exp Med 185:795-800; Van Beneden 등. (2001) 4302-4311; 미국 공개특허공보 제20030095965호에 기재된 방법 또는 시험법에 의하여 동정된다(상기 문헌의 전 개시내용은 본 명세서에서 참조로 통합된다).
한 태양으로, 본 발명의 활성화 항체는 리간드에 의한 NKG2A 수용체 자극을 억제할 수 있는 능력이 평가된다. 다수의 분자 또는 세포-기반 시험법 및 동물-기반의 모델이 사용될 수 있다. 통상 세포-기반 검사가 사용되며, 이 검사에서는 예를 들어 NK 세포와 같이 NKG2A 발현 세포를 NKG2A 리간드 (또는 상기 리간드를 발현하는 세포), 바람직하게는 HLA-E에 노출시키고, 상기 수용체의 자극을 억제할 수 있는 항체의 능력을 평가한다.
유전자 발현-기반 활성을 포함하여 NKG2A 활성을 평가하는데 사용되는 어떤 세포-기반 검사법도 사용가능하며, 세포독성-기반 검사 및 증식 검사 등을 포함한다. 어떤 태양에서, 생체외 검사는 자가면역 또는 염증질환 환자로부터 채취한 NK 세포 등의 세포를 사용하나, 일반적으로는 YTS 또는 NK-92와 같은 NK 세포주를 포함하여(ATCC로부터 입수 가능), 어떠한 NKG2A-발현 세포도 사용할 수 있다. 예를 들면, 발현 수용체의 자극으로 인하여 예를 들어, 신호 전달 경로를 활성화시키거나, 증식에 영향을 미치거나, 또는 세포의 세포독성을 변화시키는 등 세포의 활성 또는 성질을 검출할 수 있는 정도로 변경시키는 한, 세포주를 NKG2A-코딩 트랜스유전자(NKG2A-encoding transgene)으로 감염시켜서 본 검사에 사용할 수 있다. 이러한 시험에서, 모든 아이소형의 NKG2A, CD94, 또는 HLA-E (OMIM refs. 161555, 602894, 및 143010 참조, 상기 문헌의 전 개시내용은 본 명세서에서 참조로 통합된다)이 사용될 수 있다(또는 본 발명에서 개시하고 있는 NKG2A 관련 기타 다른 시험 또는 방법에서).
바람직한 태양으로서, NKG2A-발현 세포, 예를 들면 NK 세포를 HLA-E와 같은NKG2A 리간드 또는 NKG2A 리간드 발현 세포, 바람직하게는 수지상 세포와 인큐베이션하고, 시험 화합물의 NK 세포 억제를 차단하는 능력을 평가하는 세포 검사가 시행된다. 이러한 검사에서, 수지상 세포의 용해 그 자체가 NK 세포 활성의 반영으로서 측정될 수 있다.
한 태양에서, 자가면역 또는 염증질환 환자로부터 수거한 NK 세포를 사용하여 세포주를 확립한다. 많은 구현예에서, 비인간 세포 또는 비인간 NKG2A/CD94, 예를 들어 NKG2A/CD94 발현하는 비인간 영장류 세포, 또는 마우스 또는 인간 NKG2A/CD94를 발현하는 마우스 세포를 적합한 리간드로 함입시켜(예컨대 마우스의 경우, Qa-I) 시험에 사용한다.
NKG2A가 적합한 리간드에 결합할 경우, NKG2A를 갖는 세포에 수많은 생리적인 변화를 일으킨다. 이러한 변화는 유전자 발현, 세포 성장, 세포 증식, pH, Ca2 +, IP3, cGMP, 또는 cAMP 등과 같은 세포내 2차 메신저, 사이토킨 생성, 또는 세포독성활성과 같은 활성 등의 변화를 포함한다. 이러한 변화는 본 명세서에서 "NKG2A 활성"으로 지칭된다. NKG2A 리간드 존재하의 이러한 변화의 모든 반전은 시험항체의 유용성을 평가하는데 사용될 수 있다. 이러한 반전은 본 명세서에서 "NKG2A 활성의 억제"로 지칭된다. 한 태양에서, NKG2A 활성은 NKG2A-반응성 유전자 또는 단백질, 예를 들어 SHP-I 또는 SHP-2 또는 그들의 표적의 발현 또는 활성을 검출함으로써 평가한다(Le Drean 등. (1998) Eur J Immunol 28:264-276, Augugliaro 등. (2003) Eur J Immunol 33:1235-141 참조;상기 문헌의 전 개시내용은 본 명세서에서 참조로 통합된다).
본 명세서에서 개시한 모든 시험에서, 세포내 NKG2A 활성의 검출값이 5%, 10%, 20%, 바람직하게는 30%, 40%, 50%, 가장 바람직하게는 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상 감소하는 경우 시험항체는 본 방법에 사용하기에 적합한 후보물질이 된다.
결합이외에도, NK 세포가 NKG2A 리간드를 갖는 표적 세포, 예를 들어 수지상세포, 종양 세포 또는 바이러스 감염세포 등의 증식 또는 활성화를 억제하게 하거나, 또는 바람직하게는 살해하게 하는 항체 또는 화합물의 능력을 평가할 수 있다. 한 태양에서, NKG2A 수용체를 발현하는 인간 NK 세포를 NKG2A 리간드를 갖는 표적 세포와 함께 플레이트상 예를 들어 96-웰 플레이트 등에 도입시키고 다양한 양의 시험항체에 노출시킨다. AlamarBlue (BioSource International, Camarillo, CA) 등과 같은 생체 염료(vital dye)를 완전 세포(intact cell)에 가하고, 세척하여 과량의 염료를 제거한 후, 광학 밀도를 측정하여 살아있는 세포의 숫자를 측정한다(항체에 의하여 세포가 많이 살해될수록, 광학 밀도는 낮아진다)(Connolly 등. (2001) J Pharm Exp Ther 298:25-33 참조, 상기 문헌의 개시 내용은 본 명세서에 참조로 통합된다).
가장 바람직하게는 본 발명의 활성화 항체는 Fc 수용체에 대한 실질적인 특이 결합을 나타내지 않는다. 이러한 항체는 Fc 수용체에 결합하지 않는 것으로 알려진 다양한 중쇄의 일정 영역을 포함할 수 있다. 한 예로 IgG4 일정 영역이다. 또는 Fab 또는 F(ab')2 단편과 같이 일정 영역을 포함하지 않는 항체 단편을 사용하여 Fc 수용체에의 결합을 피할 수 있다. Fc 수용체 결합은 예를 들어 BIACORE 검사법으로 항체의 Fc 수용체 결합을 시험하는 것을 포함하여 본 기술분야에서 공지된 방법에 따라 평가할 수 있다. 또한 Fc 부분이 Fc 수용체에 결합하는 것을 최소화하거나 없애도록 개질되어 있는 어떠한 형태의 항체도 사용될 수 있다(WO03101485 참조, 상기 문헌의 개시 내용은 본 명세서에 참조로 통합됨). Fc 수용체 결합을 평가하는 시험법 예를 들어 세포 기반 시험법 등은 본 분야에 공지되어 있으며, WO03101485 등에 잘 기술되어있다.
바람직하게는 본 발명의 활성화 단클론 항체는 Fc 수용체에의 결합이 감소되도록 개질된 Fc 영역, 바람직하게는 IgG4 또는 G2 서브타입의 Fc 영역, 또는 IgGl 또는 G3 서브타입의 Fc 영역를 포함한다. 가장 바람직하게는 G4 또는 G2의 Fc 영역이 Fc 수용체에의 결합을 최소화 또는 완전히 없도록 개질된 것이다(Angal 등. (1993) Molecular Immunology 30:105-108, 상기 문헌의 개시 내용은 본 명세서에 참조로 통합됨).
IgG4 개별형은 Fc 결합 친화력이 완전히 없는 것이 아니므로, Fc 감마 ("Fcg") 수용체에 약간의 결합을 나타낸다(Newman 등. (2001) Clin . Immunol. (98(2):164-174). 개질되지 않은 IgG4 단클론항체는 생체내에서 세포 고갈(cell depletion)을 유발한다(Isaacs 등, (1996) Clin . Exp . Immunol. 106, 427). Fcg 수용체에의 결합을 일차적으로 담당하는 것으로 알려진 서열은 LLGGPS로 규명되었다(Burton 등, (1992) Adv . Immunol. 51:1). 이 서열은 중쇄 CH2 영역의 N-말단에 위치하며(EU numbering 234-239) 인간 IgGl, IgG3, 및 마우스 IgG2a 개별형(murine IgG2a isotypes)에 보존되어 있으며, Fcg 수용체에 강하게 결합한다. IgG4 개별형의 야생형 서열은 234위치에 페닐알라닌을 포함하고 있으며, FLGGPS 모티프를 나타낸다 마우스 IgG2b 동형 역시 Fcg 수용체에 약하게 결합하며, LEGGPS 서열을 포함하고 있다. Newman 등은(2001) 마우스 IgG2b 관련 글루타민 잔기를 인간 야생형 IgG4 CH2 도메인에 삽입시켜 FEGGPS 서열을 만들었고, 이는 CDC 및 ADCC 활성을 더 감소시켰으며, 생체외에서 FcgRI 및 FcgRII에 거의 결합하지 않는다. 글루타민산의 도입이외에도 228의 세린을 프롤린으로 대체하여 야생형 IgG4보다 안정한 분자를 생성하였다. 상기 IgG4 분자는 힌지 영역(hinge region)에서 비효율적인 사슬간 이황화결합의 형성을 나타내는 경향이 있다. 228 위치의 세린의 존재는 이웃하는 시스테인 분자에 의한 사슬간 이황화 결합보다 사슬내 결합이 우선적으로 결합되도록 촉진시키는 것으로 알려져 있으며, 프롤린의 도입으로써 힌지 영역에 강도를 제공하고, 보다 효율적인 사슬간 결합을 촉진시킨다. 본 발명의 항체는 상기에 전술한 바와 같은 개질 뿐 아니라 다른 변경이 가해질 수 있다.
많은 경우, 본 발명의 억제성 항체는 Fc 수용체에 대한 결합능을 거의 모두제거함으로써 본 발명의 활성화 항체로 전환될 수 있다.
NK 세포 활성을 억제하는, NKG2A 에 대한 항체의 능력 평가
NKG2A와 결합하여 NK 세포 활성을 억제할 수 있는 본 발명의 억제성 항체의 동정 특히 NK 세포에 의한 세포 용해는 세포 기반 시험법을 사용하여 수행된다.
통상적으로, NKG2A를 갖는 세포, 예를 들어 NK 세포는 다양한 양의 시험항체의 존재하에 RMA5, RMA의 TAP-2 유도체, P815 및 K562와 같은 NK-감수성 세포와 접촉된다. 시험항체의 존재하에 살해된 NK-감수성 세포의 퍼센트는 항체 부존재하의 퍼센트와 비교된다.
본 발명의 억제성 항체에 대한 다른 시험법에서는, 다양한 양의 시험항체의 존재하에 NK 세포를 인큐베이션한 후, 항체의 직접적인 NK 세포 살해에 대한 효과를 항체 비존재하에서의 NK 세포사(cell death)와 비교한다. NK 세포 살해는 NK-감수성 세포의 존재를 포함하는 시험법에서도 측정될 수 있다.
전술한 시험법에서 NK-감수성 세포 살해의 5%, 10%, 20%, 바람직하게는 30%, 40%, 50%, 가장 바람직하게는 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 감소 및/또는 NK 세포사의 5%, 10%, 20%, 바람직하게는 30%, 40%, 50%, 가장 바람직하게는 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 증가는 시험 항체가 본 발명의 억제성 항체임을 나타낸다.
영장류 종( primate speices )간의 NKG2A 의 교차-반응성
인간 및 비인간 영장류 NKG2A간에 교차반응성이 있음이 밝혀져 있다. 따라서, 항-NKG2A 항체의 수용체 활성에 대한 효과를 평가하는 시험은 어떠한 영장류 유래 NKG2A 폴리펩티드를 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 이러한 시험은 생체외에서 비인간 영장류 NK 세포를 이용하여 수행되거나 또는 항체를 비인간 영장류에 투여하고, NKG2A 활성을 조절하는 능력을 예를 들어 NK 세포 활성의 변경 등으로 측정할 수 있다.
항체의 제조
본 발명의 항체는 본 기술 분야에서 공지된 다양한 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 통상적으로는 비인간 동물, 바람직하게는 마우스를 T 세포, NK 세포 또는 수지상 세포와 같이 세포 표면에 NKG2A (또는 CD94, HLA-E) 수용체를 포함하는 면역원으로 면역시킴으로써 제조한다. 상기 수용체는 전체 세포 또는 세포막, NKG2A (또는 CD94 등)전장 서열, 또는 단편 또는 NKG2A 유도체, 통상 면역원성 단편, 즉 상기 수용체를 발현하는 세포 표면에 노출된 에피토프를 포함하는 폴리펩티드 부분 등을 포함할 수 있다. 어떠한 NKG2A의 아이소형 또는 접합 단편(splicing fragment)도 사용 가능하다(OMIM 161555 참조; 상기 문헌의 개시 내용은 본 명세서에 참조로 통합됨). 이러한 단편은 통상 적어도 성숙 폴리펩티드 서열의 7개의 연속적인 아미노산을 포함하며, 더욱 바람직하게는 10개의 연속적인 아미노산을 포함한다. 이들은 본질적으로 수용체의 세포외 도메인에서 유래된다. 바람직한 태양에서, 항체 생성에 사용되는 NKG2A 수용체는 인간 수용체이다. 어떤 태양에서, NKG2는 예를 들어 CD94와 함께 이형이량체로 존재하며, 항체를 생성하는데 사용된다.
가장 바람직한 태양에서, 면역원은 통상 세포 표면에 지질막내 야생형 인간 NKG2A 수용체 펩티드를 포함한다. 특정 태양에서, 상기 면역원은 완전 NK 세포, 특히 선택적으로 처리되거나 용해된 완전 인간 NK 세포이다. 바람직하게는 상기 면역원은 자가면역 또는 염증 질환 환자로부터 채취된 NK 세포이다.
한 태양에서, 상기 항체는 NKG2A를 인식하는 하나 이상의 기존 단클론 항체, 예를 들면 Zl99(Delia Chiesa 등, (2003) Eur . J. Immunol. 33:1657-1666), Z270, 3S9 (미국 특허출원 제0030095965호), 또는 20D5 (Vance 등, (1990) J. Exp . Med. 190(12): 1801-1812)(상기 문헌들의 개시 내용은 본 명세서에 참조로 통합됨)로부터 유도될 수 있다. 어떤 응용에서, 상기 항체는 자가 면역 또는 염증 질환 환자에서 채취한 세포, 바람직하게는 NK 세포 상의 NKG2A의 존재를 확인하기 위한 진단 항체로서 사용되기 위하여 직접 또는 간접적으로 표지된다(즉, 표지된 제2항체와 사용). 또한 항체는 본 발명의 치료 방법에 사용되기 위하여 본 명세서에 기술된 바와 같이 인간에 투여되기에 적합한 형태로 만들어 질 수 있다.
본 발명의 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 또는 유도체일 수 있다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 및 Fv 단편; 이체(diabodies); 단쇄 Fv (scFv) 분자; 중쇄 부분의 결합 없이 오직 하나의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 단쇄 폴리펩티드, 또는 경쇄 가변도메인의 세개의 CDRs을 포함하는 단편; 경쇄 부분의 결합 없이 오직 하나의 중쇄 가변 영역을 포함하는 단쇄 폴리펩티드, 또는 중쇄 가변영역의 세개의 CDRs을 포함하는 단편; 및 항체 단편으로부터 형성되는 복수특이적 항체(multispecific antibodies) 등을 포함할 수 있다. 이러한 단편 및 유도체 및 그 제조 방법은 본 분야에서 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 펩신으로 항체를 소화시키면, 아래 힌지 영역의 아래 이황화 결합이 파괴되어 경쇄가 이황화 결합으로 VH-CH1 과 결합된 Fab 이량체 F(ab)'2를 생산할 수 있다. F(ab)'2를 온화한 조건하에서 환원시켜 힌지 영역에 이황화 결합을 파괴시켜 F(ab)'2를 Fab' 단량체로 전환시킬 수 있다. The Fab' 단량체는 본질적으로 힌지 영역의 일 부위와 Fab로 되어 있다(Fundamental Immunology (Paul ed., 3d ed. 1993) 참조). 다양한 항체 단편이 완전 항체의 소화의 측면에서 잘 정의되어 있어, 당업자는 그러한 단편들이 화학적인 방법 또는 재조합 DNA 방법으로 드 노보(de novo) 합성될 수 있음을 알 수 있다.
바람직한 태양에서, 활성화 항체는 비-고갈성 항체(non-depleting antibody)이며, 이는 NK 세포와 결합하여 NKG2A 자극을 억제하나, NKG2A 발현세포를 살해에 이르지는 않는 것을 의미한다. NKG2A 발현 세포를 살해하는 능력은 표준 방법을 사용하여 평가할 수 있으며, 이는 항체가 직접적으로 결합 세포를 살해하는 세포독성이 없음을 확인하는 생체외 시험 및 항체 투여시 NKG2A 발현세포의 수준 및 활성을 평가하는 생체내 시험을 포함한다. 특히 바람직한 태양으로서, 전술한 바와 같이 Fc 수용체에 의하여 인식되지 않는(또는 거의 인식되지 않는) 항체를 사용한다. 따라서, 바람직한 항체는 IgG4, Fab or F(ab')2과 같은 단편, 또는 기타 다른 Fc 부분이 Fc 수용체에 의한 결합이 감소되거나 없도록 개질된 IgG, IgE, IgM 등을 포함한다(WO03101485 참조, 상기 문헌들의 개시 내용은 본 명세서에 참조로 통합됨).
단클론 또는 다클론 항체의 제조는 본 기술분야에서 잘 알려져 있으며, 어떤 가능한 기술도 사용될 수 있다(Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor 등., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole 등., pp. 77-96 in Monoclonal antibodies 및 Cancer Therapy (1985)). 단쇄 항체의 제조 기술(미국 특허 제 4,946,778호)도 원하는 폴리펩티드 예를 들면 NKG2A에 대한 항체의 제조에 사용될 수 있다. 형질전환 마우스, 또는 기타 포유 동물과 같은 유기물(organisms) 또한 인간화, 키메라 또는 유사하게 개질된 항체를 발현시키는 데 사용될 수 있다. 또한디스플레이 기술을 사용하여 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체 및 이형 Fab 단편을 동정할 수 있다(McCafferty 등., Nature 348:552-554 (1990); Marks 등., Biotechnology 10:779-783 (1992) 참조). 한 태양에서, 상기 방법은 라이버러리 또는 레퍼토리에서 NKG2A 수용체 폴리펩티드와 교차 반응하는 단클론 항체 또는 그 단편 또는 유도체를 선택하는 단계를 포함한다. 예를 들면 상기 레퍼토리는 모든(재조합) 항체 또는 그 단편의 레퍼토리일 수 있고, 선택적으로 어떤 적합한 구조(예를 들면, 파지(phage), 박테리아, 합성 복합물(synthetic complex) 등)에 의해 디스플레이된다.
비인간 포유류를 항원으로 면역화시키는 단계는 본 기술분야의 공지된 방법에 의해 실행될 수 있다(예를 들어, E. Harlow 및 D. Lane, 항체들: 실험 매뉴얼., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY(1988)를 참조). 통상 면역원을 임의적으로 완전 Freund's 보조제(complete Freund's adjuvant)와 같은 보조제와 함께 버퍼액에 부유시키거나 용해시킨다. 면역원의 양, 버퍼액의 타입 및 보조제의 양을 결정하는 방법은 관련 분야의 숙련된 자에게 잘 알려져 있고 본 발명에서 어떤 방식으로든지 제한되지 않는다.
유사하게, 항체의 생산을 자극하기에 충분한 면역화 위치 및 빈도는 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. 일반적인 면역화 프로토콜에서, 비인간 동물은 첫날 항원으로 복강내 주사되고 약 1 주일 후 다시 복강내 주사된다. 임의적으로 불완전한 Freund's 보조제와 같은 보조제와 함께 항원을 약 20일 경에 다시 주입한다. 이러한 주입은 정맥내로 실행되고 며칠간 연속적으로 반복될 수 있다. 약 40일 경 후에 일반적으로 보조제 없이 정맥 내 또는 복강 내로 증폭 주입이 실행된다. 이러한 프로토콜에 의하여 약 40일 후에 항원 특이적인 항체 생산 B 세포가 제조된다. 다른 프로토콜 또한 면역화에서 사용되는 항원에 대하여 항체를 발현하는 B 세포의 생산을 유발하는 한 사용될 수 있다.
다른 실시예에서, 면역되지 않은 비인간 동물로부터 림프구를 분리하여, 생체외에서 배양한 다음 세포 배양에서 면역원에 노출시킨다. 이후 상기 림프구를 수확하고 이하에서 기술될 융합 단계를 실행한다.
본 발명의 목적에 바람직한 단클론 항체를 생산하기 위한 다음 단계는 면역화된 비인간 포유류로부터 상기 림프구, 스플레노사이트(splenocytes) 또는 B 세포와 같은 세포를 분리하고 이어 림프구, 스플레노사이트 또는 B 세포 등을 불멸화 세포와 혼합하여 융합시켜 항체 형성 히브리도마(hybridoma)를 형성하는 단계이다. 따라서, 본 발명에 있어서 "면역화된 동물에서 항체를 생산하는"이라는 용어는 면역화된 동물에서 B 세포/스플레노사이트/림프구를 얻는 것과 이들 세포를 사용하여 항체를 발현하는 히브리도마를 제조하는 것뿐 아니라 면역화된 동물의 혈청에서 직접 항체를 얻는 것을 포함한다. 예를 들어 비인간 포유동물에서 스플레노사이트를 분리하는 것은 본 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 마취된 비인간 포유류에서 비장(spleen)을 절단하고, 그것을 작은 조각으로 잘라 그 비장 캡슐에서 스플레노사이트를 나일론 메쉬의 세포 스트레이너를 통해 적절한 버퍼액내로 짜내어 단일 세포 부유액을 얻는 과정을 포함한다. 세포들을 세척하고, 원심분리하며 적혈구를 용해하는 버퍼액에 재부유시킨다. 그 용액을 다시 원심분리하고 펠렛에 존재하는 잔류 림프구를 마지막으로 신선한 버퍼액에 재부유시킨다.
일단 분리된 단일 세포 부유액내 항체-형성 세포는 불멸화 세포주에 융합된다. 히브리도마를 만드는 데 유용한 많은 다른 불멸화 세포계가 관련 분야에 알려져 있으나, 일반적으로 마우스 골수종 세포주(mouse myeloma cell line)를 사용한다. 바람직한 쥐과 골수종 세포계는 비제한적으로 Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calf. U.S.A에서 입수 가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양에서 유래된 것 또는 American Type Culture Collection, Rockville, Maryland U.S.A에서 입수가능한 X63 Ag8653 및 SP-2 세포로부터 유래된 것들이다. 상기 융합은 폴리에틸렌글리콜 등을 사용하여 시행한다. 생성되는 히브리도마는 융합되지 않은 모체 골수종 세포의 성장 또는 생존을 저해하는 하나 이상의 물질을 포함하는 선택적인 배지에서 배양된다. 예를 들어, 만약 모체 골수종 세포가 효소 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼레이즈(hypoxanthin-guanine phosphoribosyl transferase: HGPRT 또는 HPRT)가 결핍되어 있다면, 히브라도마를 위한 배양 배지는 일반적으로 하이포크산틴(hypoxanthine), 아미노프테린(aminopterin) 및 티미딘(thymidine)를 포함할 것이고(HAT 배지), 이러한 물질들은 HGPRT가 결핍된 세포의 성장을 막는다.
히브리도마는 일반적으로 대식세포의 피더층(feeder layer)에서 자란다. 대식세포는 바람직하게는 스플레노사이트를 분리하는데 사용되는 비인간 포유류의 한 배(littlemate)에서 나온 것이고 일반적으로 히브리도마를 평판 배양하기 며칠 전에 불완전 Freund's 보조제로 프라이밍된다. 융합 방법은 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된 Goding, "단클론 항체:원리 및 실제(Monoclonal antibodies: Principles 및 Practice)", pp.59-103(Academic Press, 1986)에 기술되어 있다.
세포들은 선택 배지에서 콜로니 형성 및 항체 생산을 위해 충분한 시간 동안 배양된다. 대개 7일에서 14일 사이이다. 이후 히브리도마 콜로니는 원하는 기재 예를 들어 NKG2A를 특이적으로 인식하는 항체 생산을 생산하는지 여부가 시험된다. 상기 시험으로서 히브리도마가 배양되는 웰에 적합하게 된 어떠한 시험법도 사용될 수 있으나, 주로 비색 엘리사(ELISA)-타입 시험법이 일반적으로 사용된다. 다른 시험법으로 면역 침강(immunoprecipitation) 및 방사성면역시험(radioimmunoassay)을 포함한다. 원하는 항체 생산에 있어 양성을 나타내는 웰은 하나 이상의 다른 콜로니가 존재하는지를 결정하기 위해 시험된다. 만약 하나 이상의 콜로니가 존재한다면, 상기 세포들은 재클로닝하고 배양되어 오직 단일 세포가 원하는 항체를 생산하는 콜로니로 되도록 한다. 단일의 확실한 콜로니를 가진 양성 웰은 통상 재클로닝되어 오직 하나의 단클론 항체가 검출되고 생산되는지 여부를 확인하는 재시험을 시행한다
본 발명의 단클론 항체를 생산하는 것이 확인된 히브리도마는 이후 DMEM 또는 RPMI-1640과 같은 적합한 배지에서 더 많은 양으로 배양한다. 선택적으로, 히브리도마 세포는 동물에서 복수(ascites) 종양으로서 생체 내에서 배양시킬 수 있다.
원하는 단클론 항체를 생산할 만큼 충분히 성장한 후에, 단클론 항체(또는 복수(ascites) 유체)를 포함하는 성장 배지를 세포에서 분리시키고 거기에 존재하는 단클론 항체를 정제한다. 상기 정제는 일반적으로 겔 전기영동, 투석, 단백질 A 또는 단백질 G-세파로오스(Sepharose)를 사용하는 크로마토그래피, 또는 아가로스 또는 세파로오스 비드와 같은 고체 지지체에 결합된 항-마우스 Ig로 시행한다(예를 들어, Amersham Biosciences, publication No.18-1037-46, Edition AC, 항체 정제 핸드북에 기술되어 있으며, 상기 개시 내용은 본 명세서에 참조로 통합됨). 결합된 항체는 통상 항체 포함 분획이 즉시 중화되면서 낮은 pH 버퍼액(pH 3.0 이하의 글리신 또는 아세테이트 버퍼)을 사용하여 단백질 A/단백질 G 컬럼에서 용출된다. 이 분획은 필요에 따라 모아지고, 투석되며 농축된다.
바람직한 실시예에서, 히브리도마에서 NKG2A 면역원상에 존재하는 결정자와 결합하는 항체를 코딩하는 DNA를 분리하고, 적합한 숙주에 이식하기 위해 적절한 발현 벡터에 위치시킨다. 이후 상기 숙주 세포를 사용하여 항체의 항원 인식부를 포함하는 항체, 그 변이체, 그 활성 단편 또는 인간화 또는 키메라 항체를 재조합으로 생산한다. 바람직하게는, 상기 실시예에서 사용되는 DNA는 자가면역 또는 염증 질환 환자로부터 채취한 NK 세포와 같은 NK 세포상의 NKG2A 수용체에 존재하는 결정자를 인식하는 항체를 코딩한다.
본 발명의 단클론 항체를 코딩하는 DNA는 종래 방법(예를 들어, 마우스 항체의 중쇄 및 경쇄(light chain)를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브(probe)를 사용함)을 사용하여 쉽게 분리되고 서열화된다. 일단 분리되면, 상기 DNA는 발현 벡터에 위치할 수 있고 이후 상기 벡터는 상기 벡터가 이식되지 않으면 면역 글로불린 단백질을 생산하지 않는 대장균 세포, 유인원 COS 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO) 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포에 도입되며, 상기 재조합 숙주 세포에서 단클론 항체의 합성이 달성된다. 항체를 코딩하는 DNA의 박테리아에서 재조합 발현은 관련 분야에 잘 알려져 있다(예를 들어, Skerra 등, Curr . Opinion in Immunol ., 5, pp.256(1993); 및 Pluckthun, Immunol . Revs ., 130. pp.151(1992) 참조). 항체는 또는 예를 들어 Ward 등. (1989) Nature 341:544 에 개시된 바와 같이, 면역 글로불린의 조합 라이브러리를 선택하여 제조할 수 있다.
특정 태양에서, 항체는 본질적으로 단클론항체 Z199 또는 Z270 중 하나와 동일한 에피토프 또는 결정자에 결합한다. 바람직한 한 태양에서, 단클론항체는 Z270의 Fab 또는 F(ab')2 부분을 포함한다. 또 다른 바람직한 태양에서, 단클론 항체는 Z270의 중쇄가변영역의 세 CDR을 포함한다(CDRl = 서열 번호:2의 31-35의 아미노산; CDR2 = 서열 번호:2의 50-66의 아미노산; CDR3 = 서열 번호:2의 99-108의 아미노산). 보다 바람직하게는 Z270의 중쇄가변영역(Z270VH; 서열 번호:2)를 포함하는 단클론항체이다. 더욱 바람직하게는 Z270의 중쇄가변영역을 포함하고, chZ270VH (서열 번호:3)를 포함하는 핵산서열로부터 전사되고 번역되는 단클론 항체이다. 또 다른 바람직한 태양에 따르면, 단클론항체는 Z270의 경쇄가변영역의 세 CDR을 포함한다(CDRl = 서열 번호:6의 24-34의 아미노산 ; CDR2 = 서열 번호:6의 50-56의 아미노산; CDR3 = 서열 번호:6의 89-95의 아미노산). 보다 바람직하기로는 Z270의 경쇄가변영역(서열 번호:6)을 포함하는 단클론항체이다. 더욱 바람직하기로는 Z270의 경쇄가변영역을 포함하고 chZ270VK(서열 번호:7)를 포함하는 핵산 서열로부터 전사되고 번역되는 단클론항체이다. 또 다른 바람직한 태양으로는 항체 Z270이다. Z270은 기탁번호 1-3549로 2005년 12월 22일 프랑스 파리의 "the Collection Nationale de Culture de Microorganismes(CNCM), Institute Pasteur, 25, Rue du Docteur Roux, F-75725 Paris, France"에 기탁되었다.
NKG2A에 대한 활성화 및 억제성 단클론항체 양자는 통상 인간에 사용하기에 적당하도록 개질된다. 예를 들어, 본 분야에 공지되어 있는 방법을 이용하여 인간화, 키메라화 되거나 인간 항체 라이브러리에서 선택될 수 있다. 이러한 인간에 적합한 항체는 본 치료 방법에 직접 사용되거나, 후술되는 바와 같이, 본 방법에 사용되기 위한 세포독성 항체로 더 유도화될 수 있다.
다른 바람직한 태양에서, 본 발명의 항체, 예를 들어 실질적으로 Z199 또는 Z270과 동일한 에피토프와 결합하는 항체를 생산하는 히브리도마의 DNA는 발현 벡터에 삽입되기에 앞서 개질될 수 있는데, 예를 들어 동종의 비인간 서열 대신 인간 중쇄- 및 경쇄- 일정 도메인을 코딩하는 서열로 치환하거나(예를 들어, Morrison 등 (1984) PNAS 81:6851) 또는 비-면역 글로불린 폴리펩티드를 코딩하는 서열의 전부 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유 결합시킴으로써 행한다. 이러한 식으로, 최초 항체의 결합 특이성을 갖는 "키메라" 또는 "히브리드" 항체를 제조한다. 일반적으로, 이러한 비-면역 글로불린 폴리펩티드는 본 발명 항체의 일정 도메인을 위해 치환된다.
바람직한 태양에서, 본 발명의 항체는 인간 중쇄일정영역에 융합된 Z270의 중쇄가변영역(서열 번호:2)을 포함한다. 바람직한 일 태양에서, 인간 중쇄일정영역은 IgG4 일정영역이다. 또 다른 바람직한 태양에서, 인간중쇄일정영역은 IgGl 일정영역, 바람직하게는 인간 IgGlm(-l, -2, -3)일정영역이다. 바람직하게는, 이러한 인간중쇄일정영역-함유 항체는 chZ270VH (서열 번호:3)를 포함하는 핵산서열로부터 전사 및 번역된다.
또 다른 바람직한 태양에서, 본 발명의 항체는 인간 경쇄일정영역에 융합된 Z270의 경쇄가변영역(서열 번호:6)을 포함한다. 보다 바람직하게는, 인간 카파(k3)경쇄일정영역에 융합된 Z270의 경쇄가변영역을 포함하는 항체이다. 바람직하게는 이러한 인간경쇄일정영역-함유 항체는 chZ270VK (서열 번호:7)를 포함하는 핵산서열로부터 전사 및 번역된다.
더욱 바람직하게는 270VK가 인간경쇄일정영역에 융합되고, 270VK가 인간중쇄일정영역에 융합된 양자를 포함하는 항체이다. 바람직하게는 경쇄일정부위는 카파(k3)일정영역이며, 중쇄일정영역은 IgG4 또는 IgGlm(-l, -2, -3)에서 선택된다. 또한 바람직하게는 항체의 중쇄 및 경쇄가 각각 chZ270VH (서열 번호:3) 및 chZ270VK (서열 번호:7)을 포함하는 핵산서열에서 전사되는 것이다.
다른 바람직한 태양에서, 본 발명의 항체는 인간화된다. 본 발명에 따른 항체의 "인간화" 형태는 쥐과 또는 기타 비인간 면역 글로불린에서 유래된 최소한의 서열을 포함하는 특정 키메라 면역글로불린, 그 면역글로불린 사슬 또는 단편(예를 들어 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 기타 항원-결합 서열)이다. 대부분의 경우, 인간화 항체들은 수용자(recipient)의 상보성결정영역(CDR) 잔기가 최초 항체의 바람직한 특이성, 친화력 및 능력을 유지하면서 최초 항체(공여자 항체)의 CDR 잔기로 치환된 사람 면역 글로불린(수용자 항체)이다. 몇몇 경우에, 사람 면역 글로불린의 Fv 골격 잔기(framework residue)는 대응하는 비인간 잔기로 치환될 수 있다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 이입된 CDR 또는 골격 서열에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 개질들은 항체의 능력을 더 좋게 하고 최적화하기위해 만들어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 가변 도메인을 적어도 하나, 일반적으로 둘을 실질적으로 포함하며, 여기에서 CDR 영역 전부 또는 실질적으로 전부가 최초 항체의 CDR 영역에 대응하고 FR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부가 사람 면역 글로불린 보존 서열의 FR 영역이다. 보다 구체적인 것은 Jones 등., (1986) Nature 321: 522; Reichmann 등. (1988) Nature 332: 323; Verhoeyen 등. (1988) Science 239:1534 (1988); Presta (1992) Curr . Op . Struct . Biol. 2:593;을 참조할 수 있으며, 각 문헌은 본 명세서에 참조로 통합된다.
인간화 항체를 만드는데 사용되는 인간 가변 도메인, 즉 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 둘 다의 선택은 항원성을 줄이는데 매우 중요하다. 소위 "가장 적합한" 방법에 따르면, 본 발명의 항체의 가변 도메인의 서열은 알려진 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대하여 스크리닝된다. 이후 마우스의 서열에 가장 근접한 사람 서열이 인간화 항체를 위한 인간 골격(FR)으로 선택된다(Sims 등., J. Immun., 151:2296; Chothia 및 Lesk (1987) J. MoI . Biol . 196:901). 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 서브그룹의 모든 인간 항체의 보존 서열에서 온 특정 골격을 사용한다. 상기 동일한 골격은 여러 다른 인간화 항체에 사용될 수 있다(Carter 등. (1992) PNAS 89:4285; Presta 등. (1993) J. Immunol. 51:1993)).
또한 NKG2A, 바람직하게는 인간 및 비인간 영장류 NKG2A에 대한 높은 친화력 및 다른 유익한 생물학적 특성을 보유한 채로 항체를 인간화하는 것이 중요하다. 이러한 목표를 달성하기 위해, 바람직한 방법에 따르면, 인간화 항체는 모서열의 분석 과정 및 모서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용한 각종 개념적인 인간화 산물의 분석 과정을 통해 제조한다. 3차원 면역글로불린 모델은 쉽게 입수가능하고 관련 분야의 숙련된 자에게 친숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 형상 구조를 표시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램도 입수 가능하다. 이러한 디스플레이들을 점검하여 잔기들의 후보 면역글로불린 서열의 기능에서의 역할 즉 후보 면역글로불린이 그 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 식으로, 원하는 항체 특성 예컨대 표적 항원에의 증가된 친화력과 같은 원하는 항체특성을 가질 수 있도록, FR 잔기는 보전서열 및 이입서열중에서 선택되고 결합될 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 대하여 직접적이고 가장 실질적으로 영향을 미친다.
바람직한 태양에서, 본 발명은 적어도 5, 6, 8, 9, 10, 15 또는 20일의 반감기를 갖는 인간 또는 인간화 활성화 항-NKG2A 항체를 제공하며, 이들은 실질적으로 인간 Fc감마RIIIa (CD 16)에 결합하지 않는다. 보다 바람직하게는 활성화 항-NKG2A 항체는 인간 NKG2A에 결합에 있어 Zl99 또는 Z270 항체와 완전히 경합하는 인간화 항체이다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 바람직한 항체를 예시하기 위하여 Zl99 또는 Z270 항체가 인간화 항체를 제조하는데 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 인간화 항체는 인간 골격, 하나 이상의 비인간 항체 유래의 CDR을 포함하며, 상기 항체에 존재하는 모든 일정영역은 실질적으로 인간 면역글로불린 일정영역과 동일하며, 예를 들어 60-90% 이상, 바람직하게는 95% 이상 상동성을 갖는다. 따라서, 인간화 항체는 CDR 영역을 제외한 거의 모든 부분이 하나 이상의 천연 인간 항체 서열의 대응 부분과 실질적으로 동일하다. 몇몇 경우에 있어서, 인간화 항체는 비인간 항체 유래의 CDR이외에도 인간 골격 영역에 부가적인 비인간 잔기를 포함할 수 있다.
인간화 항체의 디자인은 다음과 같이 수행될 수 있다. 아미노산이 하기 카테고리에 해당하면, 사용될 인간 항체(수용자 항체)의 아미노산 골격이 CDR-제공 비인간 항체(공여자 항체)에서 온 골격 아미노산으로 대체된다:(a) 수용자 항체의 인간 골격 영역의 아미노산이 그 위치에서 인간 항체를 위해 예외적인 반면, 공여자 항체의 대응하는 아미노산은 그 위치에서 인간 항체를 위해 통상적인 경우; (b) 아미노산의 위치가 CDR 중 하나와 바로 인접하는 경우; 또는 (c) 3차 구조 항체 모델에서 아미노산이 CDR과 상호 작용할 수 있는 경우(C. Queen 등. Proc . Natl. Acad . Sci . USA 86, 10029 (1989), 및 Co 등., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 88, 2869 (1991) 참조, 상기 문헌의 개시내용은 본 명세서에 참조로 통합됨).
인간화 항체의 제조에 대한 보다 자세한 내용은 상기 Queen 등., 및 Co 등, 및 U.S. 특허 제5,585,089호; 5,693,762, 5,693,761, 및 5,530,101에 개시되어 있으며, 상기 문헌의 개시내용은 본 명세서에 참조로 통합된다. 통상 인간화 항체의 CDR 영역은 그 유래된 마우스 항체의 대응하는 CDR 영역과 실질적으로 동일하고, 보다 일반적으로는 동일하다. 통상적으로 바람직한 것은 아니지만, 때때로 생성되는 인간화 항체의 결합력에 영향을 미침없이, CDR 잔기에 하나 이상의 보존적인 아미노산 치환을 할 수 있다. 때때로 CDR 영역을 치환함으로써 결합력을 증강시킬 수 있다. 전술한 특정 아미노산 치환을 제외하고는 인간화 항체의 골격 영역은 그것이 유래된 인간 항체의 골격 영역과 실질적으로 동일하거나 보다 통상적으로는 동일하다. 물론 많은 골격 영역내의 아미노산은 항체의 특이성 또는 친화성에 직접적인 영향을 거의 미치지 않는다. 따라서, 많은 개별적인 골격 잔기의 보존적인 치환은 생성되는 인간화 항체의 특이성이나 결합성에 거의 영향을 미치지 않고 시행될 수 있다. 인간화 항체(비인간 부분)의 항원결합영역은 공여자항체로 지칭되는 비인간 기원의 항체로부터 유래되며, NKG2A에 대해 특이성을 갖는다. 예를 들면 적합한 항원결합영역은 Zl99 또는 Z270 단클론항체로부터 유래될 수 있다. 다른 공급원으로서는 설치류(예, 마우스 및 래트), 토끼, 돼지, 염소 또는 비인간 영장류(예, 원숭이) 또는 낙타류(예, 낙타 및 라마)와 같은 비인간 공급원으로부터 수득 되는 NKG2A-특이적(차단) 항체를 포함한다. 또한 Zl99 또는 Z270 항체와 동일 ㄸ또는 유사한 에피토프에 결합하는 항체와 같은 기타 다클론 또는 단클론항체도 제조할 수 있다(Kohler 등., Nature, 256:495-497 (1975); Harlow 등., 1988, antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor, N. Y.); 및 Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2 (Supplement 27, Summer '94), Ausubel 등., Eds..(John Wiley & Sons: New York, N. Y.), Chapter 11 (1991) 참조).
한 태양에서, 인간 및 비인간 영장류 NKG2A에 대한 결합 특이성을 갖는 인간화 항체는 하나 이상의 비인간 기원 CDR을 포함한다. 예를 들어, 인간 및 비인간 영장류 NKG2A에 대한 결합 특이성을 갖는 인간화 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 상기 경쇄는 NKG2A와 결합하는 비인간 기원의 항체에서 유래된 CDR 및 인간 기원의 경쇄에서 유래된 FR을 포함한다. 예를 들어, 상기 경쇄는 Zl99 또는 Z270 항체 중 하나의 각 CDR과 유사 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지는 CDRl, CDR2 및/또는 CDR3을 포함할 수 있어, 상기 항체는 인간 및 비인간 영장류 NKG2A과 특이적으로 결합한다. 상기 중쇄는 NKG2A와 결합하는 비인간 기원의 항체에서 유래된 CDR 및 인간 기원의 중쇄에서 유래된 FR을 포함한다. 예를 들어, 상기 중쇄는 하기 기재의 아미노산 서열 또는 Zl99 또는 Z270 항체의 각 CDR과 유사 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDRl, CDR2 및 CDR3을 포함할 수 있어, 상기 항체는 인간 및 비인간 영장류 NKG2A에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 한 태양은 인간 및 비인간 영장류 NKG2A에 특이적으로 결합하고, Zl99 또는 Z270 항체에서의 세개의 경쇄 CDR 및 인간 항체 경쇄에서의 경쇄가변영역 골격서열을 포함하는 인간화 경쇄를 포함하는 인간화 항체이다. 또한 본 발명은 Z199 또는 Z270 항체에서의 세개의 중쇄 CDR 및 인간 항체 중쇄에서의 중쇄가변영역 골격서열을 포함하는 인간화 중쇄를 포함한다.
인간화 항체 또는 항체 사슬의 인간 기원 부분(인간 부분)은 적합한 어떠한 항체 또는 항체 사슬로부터 유래될 수 있다. 예를 들어 인간 일정영역 또는 그 일부는, 존재한다면, 인간 항체의 카파 또는 람다 경쇄 및/또는 감마(예, 감마 1, 감마 2, 감마 3, 감마 4), μ, 알파 (예 알파 l, 알파 2), 델타 또는 입실론 중쇄 및 그들의 대립변이체(allelic variants)에서 유래될 수 있다. IgG2b 또는 IgG4와 같은 특정 일정 영역, 이들의 변이체 또는 부분을 선택하여 효과 기능(effector function)에 맞도록 할 수 있다. IgG4 일정 영역, 또는 그 부분이 특히 바람직한데, 이들은 NK 세포 상의 Fc감마IIIa 수용체(CD 16)에 실질적으로 결합하지 않아 본 발명의 항-NKG2A 항체가 결합된 NK 효과세포의 ADCC 매개 용해를 실질적으로 유발하지 않기 때문이다. 예를 들어, "변이체"로 지칭되는 변이된 일정영역을 융합 단백질내로 삽입하여 Fc 수용체에 대한 결합력 및/또는 보체를 고정시키는 능력을 최소화시킬 수 있다(Winter 등., 미국 특허 제5,648,260호; Morrison 등., WO 89/07142; Morgan 등., WO 94/29351 참조). 또한, 천연 Fc 영역에 비해 세포 분열 반응(mitogenic response)을 감소시킨 변이 IgG2 Fc 도메인을 만들 수 있다(Tso 등., 미국특허 제5,834,597호 참조, 상기 특허의 모든 교시는 본 명세서에 참조로 통합된다). 존재한다면, 인간 FR은 공여자의 항원결합영역과 유사 또는 등가영역에 서열 유사성을 나타내는 인간 항체 가변영역에서 유래되는 것이 바람직하다. 인간화 항체의 인간기원 부분을 위한 기타 FR 공급원은 인간 가변보존서열을 포함한다(Kettleborough, C. A. 등., Protein Engineering 4:773-783 (1991); Queen 등., 미국특허 제5,585,089호, 제5,693,762호 및 제5,693,761호 참조, 상기 문헌의 모든 교시는 본 명세서에 참조로 통합된다). 예를 들어, 비인간 부분을 얻기 위해 사용된 항체 또는 가변영역의 서열은 Kabat, E. A., 등., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health 및 Human Services, U.S. Government Printing Office (1991)에 기재된 바와 같이 인간 서열과 비교될 수 있다. 바람직한 태양에서, 인간화 항체 사슬의 FR은 비인간 공여자의 가변영역(예, Zl99 또는 Z270 항체)과 비교시, 전체적으로 약 60% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 인간 가변영역으로부터 유래된다.
두개의 핵산 또는 폴리펩티드(예, 인간화 항체를 코딩하는 DNA 또는 인간화 항체의 아미노산 서열)에 있어서 "실질적으로 동일한"은, 두 개 이상의 서열 또는 하위서열이 최대로 대응되도록 정렬되고 비교될 때, 하기 서열 비교 방법 및/또는 시각적 검사법에 의하여 측정시 적어도 약 80% 이상, 가장 바람직하게는 90-95% 이상의 핵산 또는 아미노산 잔기 상동성을 가지는 것을 말한다. 이러한 "실질적으로 동일한" 서열은 전형적으로 동종적인 것으로 간주된다. 바람직하게는 "실질적인 상동성"이 길이 방향으로 약 50 잔기 이상의 서열 영역, 바람직하게는 약 100 잔기의 서열 영역에 존재하며, 가장 바람직하게는 비교되는 두 서열의 전 길이에서 서열 상동성이 존재한다. 하기에 기술되는 바와 같이, 모든 두 항체 서열은 Kabat의 번호 목록을 사용하여 오직 한 방향으로만 정렬될 수 있다. 따라서, 항체에 있어서 상동성 퍼센트는 유일하고 잘 특정된 의미를 갖는다.
항체의 성숙한 중쇄 및 경쇄의 가변영역으로부터의 아미노산은 각각 Hx 및 Lx로 표기되며, 여기에서 x는 Kabat의 목록(Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 및 1991))에 따른 아미노산의 위치를 표기하는 숫자이다. Kabat는 다양한 각 하위그룹에 대한 항체 서열을 목록화하였으며, 각 하위그룹에서 각 잔기 위치에 대해 가장 빈번하게 발생되는 아미노산을 목록화하였다. Kabat은 목록화된 서열에서 각 아미노산에 잔기 번호를 할당하는 방법을 사용하였으며, 이러한 잔기 번호 할당법법은 관련 분야에서 표준이 되었다. Kabat의 목록은 그 일람표에 포함되어 있지 않는 항체에 대해서도 확장될 수 있는데, 상기 항체를 그 일람표에 있는 보존 서열중 하나와 정렬시킴으로써 가능하다. Kabat 번호 시스템을 사용함으로써 상이한 항체내 동등한 위치에 있는 아미노산을 쉽게 동정할 수 있다. 예를 들면, 인간 항체의 L50 위치의 아미노산은 마우스 항체의 L50 위치의 아미노산과 동등한 위치를 점한다. N-말단에서 C-말단까지 경쇄 및 중쇄 가변영역 모두는 교대의 골격 및 (CDRs)" FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4을 포함한다. 아미노산의 각 영역에의 할당은 앞서 기술된 Kabat의 정의(1987 및 1991) 및/또는 Chothia & Lesk, J. MoL Biol. 196:901-917 (1987); Chothia 등., Nature 342:878-883 (1989)의 정의에 따른 것이다.
결합 및/또는 부착 시험 또는 기타 적당한 방법을 사용하여 요구하는 특이성을 갖는 인간화 항체를 분리(예, 라이브러리에서) 및/또는 동정할 수 있다(예, 경합 시험 등).
본 발명에 사용되기 위한 항체의 비인간 및 인간 기원 부분은 경쇄, 중쇄, 및 경쇄 및 중쇄의 부분을 포함한다. 이러한 항체 부분은 항체에서 수득하거나 유래되거나(예를 들면, 부분에 대한 드 노보 합성에 의해), 또는 원하는 성질(예, NKG2A 결합, 예를 들면 Zl99 또는 Z270과의 서열 유사성)이 생성되거나 발현되는 항체 또는 그 사슬을 코딩하는 핵산에서 수득하거나 유래될 수 있다. 인간 및 비인간 유래의 원하는 부분(예, 항체 결합 영역,CDR, FR, C 영역)을 포함하는 인간화 항체는 합성 및/또는 원하는 인간화된 사슬을 코딩하는 유전자(예, cDNA)를 생산하는 재조합 핵산을 사용하여 제조할 수 있다.
사슬의 부분을 제조하기 위하여, 하나 이상의 종지 코돈을 원하는 위치에 도입할 수 있다. 예를 들면, 새로이 디자인된 인간화 가변영역을 코딩하는 핵산서열은 존재하는 DNA 서열을 변경하는 PCR 돌연변이 유발법을 사용하여 구축할 수 있다(Kamman, M., 등., Nucl . Acids Res. 17:5404 (1989)). 새로운 CDR을 코딩하는 PCR 프라이머를 동일 또는 매우 유사한 인간 가변영역에 기초한 기존 인간화 가변영역의 DNA 주형에 혼성화시킬 수 있다(Sato, K., 등., Cancer Research 53:851-856 (1993)). 만약 주형으로 사용할 수 있는 유사한 DNA 서열을 입수할 수 없는 경우에는, 가변영역서열을 코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 합성 올리고핵산으로부터 구축할 수 있다(Kolbinger, F., Protein Engineering 8:971-980 (1993)). 시그널 펩티드를 코딩하는 서열도 상기 핵산에 삽입시킬 수 있다(예, 합성시 또는 벡타 삽입시). 천연의 시그널 펩티드 서열을 입수할 수 없는 경우에는, 다른 항체로부터의 시그널 펩티드 서열을 사용할 수 있다(Kettleborough, C. A., Protein Engineering 4:773-783 (1991)). 이러한 방법 즉 본 명세서 기재 방법 및 기타 적당한 방법을 사용하여, 변이체를 용이하게 제조할 수 있다. 한 태양에서, 클로닝된 가변영역은 변이될 수 있고, 원하는 특이성을 갖는 변이체를 코딩하는 서열을 선택할 수 있다(예를 들면, 파지 라이브러리에서, Krebber 등., 미국특허제5,514,548호; Hoogengoom 등., WO 93/06213, 1993, 4월 1일 공개 참조).
본 발명은 또한 본 발명의 인간화 항체 또는 인간화 항체 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 분리된 핵산 및/또는 재조합 핵산(본질적으로 순수한 것을 포함)에 관한 것이다.
인간 항체는 또한 다른 다양한 기술에 의하여 제조할 수 있으며, 상기 기술의 예로는 인간 항체 레퍼토리를 발현하도록 제조된 다른 형질전환 동물을 면역에 사용하는 방법 등이다. 이 기술에서, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 요소는 내인성중쇄 및 경쇄 유전자가 의도적으로 파괴된 마우스 또는 다른 동물에 도입된다(Jakobovitz 등. (1993) Nature 362:255; Green 등. (1994) Nature Genet. 7:13; Lonberg 등. (1994) Nature 368:856; Taylor 등. (1994) Int . Immun. 6:579, 상기 문헌의 모든 개시내용은 참조로 통합된다). 또는 인간 항체는 유전자 또는 염색체 트랜스팩션 또는 파지 디스플레이법을 사용한 항체 레퍼토리의 선택을 통해 구축될 수 있다. 이 기술에서 항체 가변 도메인 유전자는 필라멘트성 박테리오파지의 주 외피 단백질 또는 부 외피단백질 유전자내로 프레임 내 (in-frame)클로닝 되며, 파지 입자의 표면에서 기능적 항체 단편으로서 디스플레이된다. 필라멘트성 입자는 파지 게놈의 단일가닥 DNA 카피를 포함하고 있기 때문에, 항체의 기능적 성질에 기초한 선택은 또한 이러한 성질을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자를 선택을 결과한다. 이러한 방법으로, 파지는 B 세포의 일부 성질을 흉내낸다(Johnson 등. (1993) Curr Op Struct Biol 3:5564-571; McCafferty 등. (1990) Nature 348:552-553, 모든 개시내용은 본 명세서에 참조로 통합된다). 인간 항체는 또한 생체외에서 활성화된 B 세포에 의해 생성될 수 있다(미국 특허 제5,567,610호 및 제 5,229,275호, 모든 개시내용은 본 명세서에 참조로 통합된다).
한 태양에서, "인간화" 단클론 항체는 면역화를 위해 XenoMouse®(Abgenix,Fremont,CA)와 같은 동물을 사용하여 제조한다. XenoMouse®는 기능적인 사람 면역 글로불린 유전자로 치환된 면역 글로불린 유전자를 가진 쥐과 숙주이다. 따라서, 이러한 마우스 또는 이러한 마우스의 B 세포로부터 만들어진 히브리도마에서 생산된 항체들은 이미 인간화된 것이다. 상기 XenoMouse®는 여기서 참조를 위해 통합된 미국 특허 제6,162,963호에 기술되어 있다. 유사하게 HuMAb-Mouse™(Medarex)를 사용하여 달성할 수 있다.
본 발명의 항체는 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, "키메라" 항체(면역 글로불린) 및 이러한 항체의 단편으로 유도될 수 있는데, 상기 항체에서는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 최초 항체와 동일하거나 또는 대응하는 서열에 동종적이고, 상기 사슬의 나머지는 다른 종 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에서 유래된 항체와 동일하거나 또는 대응하는 서열에 동종적이다(Morrison 등. (1984) PNAS 81:6851; 미국 특허 제 4,816,567호 참조).
본 발명의 다른 태양에서, 세포독성제에 콘쥬게이트된 상기 기재 항체 또는 그 단편(활성화 또는 억제성을 불문)을 제공한다. "세포독성제"는 본 명세서에서 그 표면에 NKG2A 수용체를 갖는 세포를 살해할 수 있는 분자를 지칭한다. 본 명세서에서 "콘쥬게이트된"은 두 제제가 서로 공유결합 및/또는 비공유결합으로 결합; 또는 매어지거나(tethered) 또는 다른 방식으로 서로 직접 또는 결합 부분(moiety)에 의하여 연결된 것을 의미한다.
모든 다양한 독성 부분 또는 전략이 이러한 세포독성항체콘쥬게이트를 제조하는데 사용될 수 있다. 한 바람직한 태양에서, 항체는 방사성동위원소(radioisotopes) 또는 기타 독성 화합물로 직접 유도체화된다. 이 경우, 표지된 모노특이적 항-NKG2A 항체를 환자에 주입하고, 이것이 표적 항원을 발현하는 세포, 특히 NK 세포와 결합하여 살해하며, 비결합된 항체는 단순히 체내에서 제거된다. 간접적인 전략 또한 사용될 수 있으며, 예를 들면 "Affinity Enhancement System" (AES)이다(미국 특허 제5,256,395호; Barbet 등., (1999) Cancer Biother Radiopharm 14:153-166; 모든 개시 내용은 본 명세서에 참조로 통합된다). 이러한 특별한 접근은 방사성표지된 합텐 및 NK 세포 수용체와 방사능 합텐 양자를 인식할 수 있는 항체를 사용하는 것을 포함한다. 이경우, 항체는 우선 환자에 주입되어 표적세포에 결합하고, 이후 비결합된 항체가 혈류로부터 제거되면, 방사성표지된 합텐이 투여된다. 합텐은 과잉증식된 LGL 세포(예, NK 세포 또는 T 세포)상의 항체-항원 복합체와 결합하여, 살해시키며, 비결합된 합텐은 체내에서 제거된다.
어떠한 형태의 세포독성 또는 세포억제효과를 갖는 물질(moiety)가 본 발명의 항체에 콘쥬게이트되어 본 발명의 세포독성콘쥬게이트를 형성하여, 특이적 NK 수용체 발현 세포를 억제하거나 살해할 수 있으며, 상기 물질은 방사성 동위원소, 독성 단백질, 약물과 같은 독성 소분자(toxic small molecules), 독소, 면역조절제, 호르몬, 호르몬 길항제, 효소, 올리고핵산, 효소억제제, 치료용 방사성핵종, 혈관신생억제제, 화학요법제, 빈카알칼로이드, 안트라사이클린, 에피도필로톡신, 탁산계, 대사길항제, 알킬화제, 항생제, COX-2 억제제, SN-38, 항유사분열제(항mitotics), 항혈관신생 및 아폽토시스제, 특히 독소루비신, 메토트렉세이트, 탁솔, CPT-11, 캄토테칸(camptothecans), 질소 마스타드(Nitrogen mustards), 젬시타빈, 알킬설폰네이트, 니트로소유리아, 트리아젠, 엽산 아날로그, 피리미딘 아날로그, 퓨린 아날로그, 백금배위복합체, 슈도모나스엑소톡신, 리신(ricin), 아브린(abrin), 5-플루오유리딘(fluorouridine), 리보뉴클레아제(RNase), DNase I, 스타필로코컬 엔테로톡신-A, 포키위드항바이러스단백질(pokeweed antiviral protein), 젤로닌(gelonin), 디프테리아톡신, 슈도모나스엑소톡신, 및 슈도모나스엔도톡신 및 기타를 포함한다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Ed. (Mack Publishing Co. 1995); Goodman 및 Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics (McGraw Hill, 2001); Pastan 등. (1986) Cell 47:641; Goldenberg (1994) Cancer Journal for Clinicians 44:43; 미국 특허 제6,077,499호; 상기 문헌들의 모든 개시는 본 명세서에 참조로 통합됨). 독소는 동물, 식물, 곰팡이 또는 미생물로부터 유래되거나, 화학적 합성법으로 드 누보 생산될 수 있다.
상기 독소 또는 기타 화합물은 다양한 가능한 방법으로 상기 항체와 직접 또는 간접으로 연결될 수 있다. 예를 들면, 상기 물질은 감소된 항체 구성요소의 힌지 영역에 이황화 결합을 형성하여 부착될 수 있는데, 이때 N-숙시닐 3-(2-피리딜디티오)프로프리오네이트(N-succinyl 3-(2-pyridyldithio)proprionate; SPDP)와 같은 교차결합제를 사용하거나, 항체의 Fc 영역의 탄수화물 부분(moiety)을 경유하여 부착될 수 있다.(Yu 등. (1994) Int . J. Cancer 56: 244; Wong, Chemistry of Protein Conjugation 및 Cross - linking (CRC Press 1991); Upeslacis 등., "Modification of antibodies by Chemical Methods," in Monoclonal antibodies: principles 및 applications, Birch 등. (eds.), pages 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, "Production 및 Characterization of Synthetic Peptide- Derived antibodies," in Monoclonal antibodies: Production, engineering 및 clinical application, Ritter 등. (eds.), pages 60-84 (Cambridge University Press 1995), Cartel 등. (1989) Chemistry today 7:51-58, Delprino 등. (1993) J. Pharm . Sci 82:699-704; Arpicco 등. (1997) Bioconjugate Chemistry 8:3; Reisfeld 등. (1989) Antibody , Immunicon . Radiopharrn. 2:217; 상기 문헌의 전 개시내용은 본 명세서에 참조로서 통합됨).
하나의 바람직한 태양에서, 항체는 I-131와 같은 방사성동위원소로 유도체화된다. 기타 다양한 적합한 방사성동위원소가 사용될 수 있으며, Indium-111, Lutetium-171, Bismuth-212, Bismuth-213, Astatine-211, Copper-62, Copper-64, Copper-67, Yttrium-90, Iodine-125, Iodine-131, Phosphorus-32, Phosphorus-33, Scandium-47, Silver-111, Gallium-67, Praseodymium-142, Samarium-153, Terbium-161, Dysprosium-166, Holmium-166, Rhenium-186, Rhenium-188, Rhenium-189, Lead-212, Radium-223, Actinium-225, Iron-59, Selenium-75, Arsenic-77, Strontium-89, Molybdenum-99, Rhodium-105, Palladium-109, Praseodymium-143, Promethiurn-149, Erbium-169, Iridium-194, Gold-198, Gold-199, 및 Lead-211을 포함하며, 이에 제한되지 않는다. 통상, 상기 방사성 핵종은 오거 방출기(Auger emitter)에 대해서는 바람직하게는 20 내지 6,000 keV, 보다 바람직하게는 60 내지 200 keV 범위, 베타 방출기(beta emitter)에 대해서는 100 내지 2,500 keV 및 알파 방출기(alpha emitter)에 대해서는 4,000 내지 6,000 keV 범위의 붕괴 에너지를 가진다. 또한 실질적으로 알파 입자를 생성하며 붕괴하는 방사성 핵종이 바람직하다.
본 발명의 세포독성 조성물의 항-NKG2A 항체에 콘쥬게이션하기위한 세포독성 물질을 선택함에 있어서, 상기 물질이 심장, 신장, 뇌, 간, 골수, 대장, 유방, 전립선, 갑상선, 담낭, 폐, 부신, 근육, 신경섬유, 이자, 피부 또는 기타 인간 체내에서 생명유지기관 또는 조직에서 선택되는 하나 이상의 조직과 같은 생명을 유지하는 통상의 조직에 대해 생체내에서 심각한 부작용을 나타내지 않아야 한다. 본 명세서에서 "심각한 부작용을 일으키지 않는다"는 항체, 리간드 또는 항체 콘쥬게이트가 생체내로 투여될 때, 화학요법중에 통상적으로 일어날 수 있는 무시할만한 또는 임상적으로 처리가능한 부작용만을 일으키는 것을 의미한다.
관련된 태양에서, 본 발명은 본 발명의 항체가 검출가능한 마커에 콘쥬게이트된 것을 제공한다. "검출가능한 마커"는 본 명세서에서 정량적 또는 정성적으로 관찰 또는 측정될 수 있는 모든 분자를 지칭한다. 본 발명의 콘쥬게이트된 항체에 유용한 검출가능한 마커의 예는 방사성동위원소, 형광성 염료 또는 상보적인 결합 짝, 예를 들면 다음 중 하나:항체/항원(NKG2A에 대한 항체가 아닌), 렉틴/탄수화물, 아비딘/비오틴, 수용체/리간드 또는 분자적으로 프린트된 폴리머/프린트 분자 시스템(molecularly imprinted polymer/print molecule systems)이다.
본 발명의 항체에 콘쥬게이트된 검출가능한 마커는 생체외 또는 생체내에서 NKG2A에 대한 항체의 결합을 검출하는데 사용될 수 있다. 이러한 콘쥬게이트는 또한 경합-형태의 시험에서 NKG2A에 대한 다른 분자의 결합을 검출하는데 사용될 수 있다. 생체내 세팅에서, 본 발명의 검출가능한 마커-항체 콘쥬게이트는 검출가능한 마커의 엑스비보 검출(예, 전신체 스캔 등), 또는 환자에서 채취된 생물학적 시료에서의 검출(예, 혈액, 생검된 조직, 기타 체액, 피부 스크랩핑물(skin scrapings) 등)을 통하여 환자 치료에 있어 본 발명의 NKG2A 항체 조성물의 효능을 모니터하는데 사용할 수 있다. 다양한 생물학적 물질에 있는 마커의 검출은 상기 물질내 치료적 항체의 존재와 서로 연관되어 질 것이다.
관련 태양에서, 본 발명은 또한 검출가능한 마커-항 NKG2A 항체 콘쥬게이트; 및 NKG2A-함유 물질을 분리된 용기에 포함하는 키트를 제공한다. NKG2A-함유 물질은 본 발명의 항NKG2A 항체가 결합하는 에피토프를 함유하는 분리된 NKG2A, NKG2A 단편 또는그 세포 표면에 NKG2A를 발현하는 세포일 수 있다.
비인간 영장류에서의 항-인간 NKG2A 항체의 평가
일련의 바람직한 태양에서, 본 발명의 항-NKG2A 항체의 활성이 비인간 영장류의 생체내에서 평가된다. 이러한 평가는 다양한 이유에서 수행된다. 인간 NKG2A와 비인간 영장류의 NKG2A간의 교차 반응성의 측면에서, 및 영장류에서의 생리적 유사성의 측면에서, 인간 NKG2A를 인식하는 항체를 비인간 영장류에 투여하는 것은 상기 항체가 생체내에서 많은 측면으로 평가될 수 있도록 하며, 예컨대, NKG2A 발현 세포(예, NK 세포)의 활성을 조절할 수 있는 능력. 일어나는 부작용, 약물 동력학, 약물 속도학, 생체이용율, 반감기, 투여 적량 또는 투여빈도, 항체의 효능, 항체의 안정성, 또는 항체의 적절한 투여를 결정하기 위해 투여되는 기타 다른 치료제 또는 다른 성질과의 조합을 포함하는 적절한 포뮬레이션 등을 포함하며, 이에 제한되지 않는다. 후보 치료 화합물을 생체내에서 평가하는 방법은 본 기술분야에 잘 공지되어 있고, 예를 들어 참조로 통합되는 The Merck Manual of Diagnosis 및 Therapy, 17th edition 및 Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th edition 등에 잘 개시되어 있다.
어떠한 비인간 영장류도 본 발명의 방법에 사용될 수 있으며, 이는 에이프, 원숭이 및 프로시미안을 포함한다. 바람직한 영장류는 레시우스 원숭이((Macacus mulatta), 아프리카 녹색 원숭이 (Chlorocebus aethiops), 마모셋 (Callithrix jacchus), 사이미리 (Saimiri sciureus), 시놀몰거스, 및 바분 (Papio hamadryas)을 포함한다. 다른 바람직한 태양에서, 상기 영장류는 에이프가 아닌 즉 침판지이외의 영장류이다. 비인간 영장류는 일반적으로 인간 치료를 위한 후보물질로서 그 안정성 및 효능 시험에 자주 사용되며, 그 돌봄, 투여, 생물학적 특성 및 기타 다른 관련된 특성은 본 관련 분야에 잘 공지되어 있다. 한 태양에서, 비인간 영장류에 항체를 투여하기 전에(또는 어떤 검사에서든 비인간 영장류로부터의 조직, 세포 또는 단백질을 사용하기 전에), 후보 항-인간 NKG2A 항체와 비인간 영장류에서의 NKG2A 사이의 교차 반응성이 확인된다.
어떤 태양에서, 비인간 영장류는 NKG2A-조절 화합물에 의해 치료가능한 질병 또는 상태에 대한 모델로서 작용한다. 예를 들면, 자가면역 질환, 알레르기, 암, 또는 감염성 질환 모델이 사용되어, 항체가 상기 질환 또는 상태의 증상을 치료 또는 경감시킬 수 있는 지를 평가한다. 본 발명의 실행에 있어 어떠한 식으로든 제한하지 않으나, 어떤 비인간 영장류는 특정 형태의 질환 또는 상태의 연구에 특히 유용하다. 예를 들면 마모셋은 면역 및 심혈관계 질환의 연구에 모델 동물로서 사용되고 있으며, 사이미리는 감염질환의 연구에, 마카커스(레시우스 원숭이 포함)는 특정 화합물의 약물학 및 독성학 연구에 모델 동물로서 사용되며, 바분은 외과적 연구, 이식 및 생체 물질에 대한 모델로서 사용된다.
한 태양에서, 항-NKG2A 항체를 비인간 영장류에 투여하여, NKG2A에의 결합 및/또는 그 활성 조절에 있어서의 항체의 효능을 평가한다. 이러한 예에서, 항체는 어떠한 용량, 빈도 또는 제형 등으로 투여될 수 있으며, 실지로 이러한 인자는 다양하게 하여 그 효능에 있어 각각의 영향을 평가한다. 항체의 효능은 다양한 방법으로 평가될 수 있다. 예를 들면, 항체의 NKG2A 또는 NKG2A-발현 세포에 대한 생체내 결합, NK 세포와 같은 세포상의 NKG2A 발현에 미치는 항체의 생체내 효과, 또는 NKG2A 활성에 대한 항체의 생체내 영향 등을 NK 세포 활성에 대한 본 명세서 기재 시험중 어떤 것을 사용하여 측정하는 등으로 평가할 수 있다. 이러한 태양에서, 항체는 통상 비인간 영장류에 투여되며, 그 효과는 비인간 영장류에서 채취할 수 있는 생물학적 시료 등으로 검출한다. 또한 검사되는 비인간 영장류에서 채취한 NKG2A-발현세포 등에 대한 항체의 효과를 생체외 시험을 통해 수행할 수도 있다.
항-인간 NKG2A 항체의 결합을 평가하기 위하여, 항체는 직접 또는 간접적으로 표지될 수 있다. 예를 들면, 항체는 방사성동위원소로 표지된 후 동물에 투여되고, 투여후 상이한 시간에 채취한 각종 생물학적 시료(예, 혈액, 각종 조직 또는 기관, 골수, 비장, 림프계 구성성분과 같은 면역 관련 조직, 또는 기타)를 검사하여 동물내 그 국재화(localization)를 평가할 수 있다. 한 바람직한 태양에서, PBL를 얻고, 예컨대 형광표지된 제2항체를 사용하여, 그 결합 항체를 FACS 분석 등을 통해 검출함으로써, NK 세포에 대한 항체의 결합을 측정할 수 있다.
유사하게, 항체를 비인간 영장류에 투여하고 NKG2A 활성에 대한 그 효과를 평가한다. 예를 들면, NK 세포를 항-NKG2A 항체 투여전 또는 투여직후에 수득하고, 그 활성, NKG2A 발현, 및/또는 두(또는 그 이상) 세트의 세포의 수를 표준 방법에 의하여 평가된다. 본 발명의 NKG2A 자극을 차단하는 활성화 항체(따라서, 수용체를 통한 NK 세포 억제를 차단한다)는 NK 세포 활성을 증가시킬 것이다. 본 발명의 NKG2A 수용체를 교차 결합하는 억제성 항체는 NK 세포 활성을 감소시키고 살아있는 NK 세포수를 감소시킨다. 비인간 영장류에서 NK 세포 활성의 변경을 유발하는 두 형태의 항체는, 인간에서 NK 세포 활성의 증가 또는 감소가 필요한 질환을 치료하는데 사용하기 적합하다.
또 다른 태양에서, 항-NKG2A 항체는 항체 안전성 뿐 아니라 그들의 다양한 약물 속도학 및 약물 동력학적 성질을 평가하기 위하여 비인간 영장류에 투여된다. 안전성은 다양한 방법으로 평가될 수 있다. 예를 들면, 항체의 전체적인 독성은 통상 mg/kg으로 표시되는 그들의 LD 50을 측정함으로써 평가할 수 있으며, 50이라는 수치는 시험중 동물 중 치사된 퍼센트를 의미한다. LD50의 측정 뿐 아니라 안전성은 투여에 대한 검출 가능한 반응 예를 들어 행동학적, 물리적 또는 심박수, 혈압 등과 같은 생리학적 변화 등을 포함하는 반응을 보이는지를 모니터링하여 평가할 수도 있다. 반응은 혈액 또는 다른 실험실 기초 테스트를 사용하여 신장 기능에 대한 크레아티닌 또는 BUN, 프로트롬빈, 빌리루빈, 알부민 또는 다양한 간장 기능 평가를 위한 효소 등과 같은 기관의 기능을 나타내는 마커들을 검사하여 체크할 수 있다(The Merck Manual of Diagnosis 및 Therapy, 17th edition, 본 명세서에 참조로서 통합된다).
생체내에서 항체의 약물 속도학 및 약물동력학적 평가 방법은 본 기술분야에 공지되어 있으며, 표준화되어 있다(He 등., (1998) J. Immunol. 160:1029-1035; Alyanakian 등. (2003) Vox Sanguinis 84:188-192, Sharma 등. (2000) JPET 293:33-41, 모든 개시 내용은 본 명세서에 참조로 통합됨). 이러한 시험은 통상 항-NKG2A 항체를 비인간 영장류에 투여하는 단계 및 투여후 다양한 시간에 그 레벨(혈장 및 다른 조직에서), 분포, 결합, 안전성 및 항체의 기타 성질을 조사하는 단계를 포함한다. 이러한 검사는 전임상연구의 필수적 구성요소이며, 항체의 생체내 반감기, 분포, 생체이용율 등을 결정함으로써, 치료학적 창(therapeutic window)을 결정하도록 도와주며 따라서 적절한 투여 요법(예, 투여 빈도 및 투여량)을 수립하도록 도와주며, 이로써 투여된 항체에 의한 NK 발현 세포의 적정한 표적화가 가능하다.
항-NKG2A 항체의 효능, 안전성, 약물동력학 및 약물운동학 연구와 관련하여, 다양한 제형화 및 투여 요법이 조직적으로 테스트될 수 있으며, 이로써 항-인간 NKG2A 항체를 위한 적정한 효능 및 안정성을 확보할 수 있다. 예를 들어, 치료학적 창(치료적 성공 가능성을 높이는 항체의 혈장 농도 범위) 및 생체내에서 NKG2A를 표적화하고 NK 세포 활성을 조절하는데 적정하게 효과적이며 안정적인 요법 및 제형화를 결정할 수 있게 한다. 예를 들면, 주어진 항체를 매 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 일마다 또는 매 1, 2, 3, 또는 4 주마다 등으로 투여할 수 있으며, 그 안전성, 효능, 운동학적 파라미터 등을 조사할 수 있다. 유사하게, 어떤 일 시점에서 투여된 항체량을 다양하게 한 후, 동일한 파라미터를 조사하거나 또는 투여량과 빈도의 조합을 테스트할 수 있다. 나아가, 상이한 제형, 예를 들면 상이한 부형제를 포함하는 조성물, 상이한 조합의 항-NKG2A 항체, 또는 상이한 조합의 NKG2A 항체 및 기타 치료제(치료될 상태에 따라, 예를 들면 암 치료를 위한 화학요법제 등)이 비인간 영장류에서 테스트될 수 있다. 또한 상이한 투여 루트(예를 들면, 정맥, 폐, 국소투여 등)를 비교할 수 있다. 투여 파라미터를 다양하게 하는 이러한 방법은 본 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다.
약학적 조성물
본 발명은 적합한 매체에 유효량으로 함유되어 있는 본 발명의 항체, 그 단편 및 유도체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물 등의 조성물을 제공한다.
본 조성물에서 사용가능한 약학적으로 허용가능한 담체는, 비제한적 예로서, 이온 교환제, 알루미나, 스테아르산 알루미늄, 레시틴, 사람 혈청 알부민과 같은 혈청 단백질, 인산염과 같은 버퍼 물질, 글리신, 소르브산, 소르브산 칼륨, 포화된 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물, 물, 황산 프로타민, 수소인산나트륨, 수소인산칼륨, 염화나트륨과 같은 전해질, 아연염, 콜로이드성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로오스에 기초한 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 폴리머, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지(wool fat)를 포함한다.
본 발명의 조성물은 경구, 비경구, 흡입 스프레이, 직장, 비강, 구강, 질 또는 이식 저장기를 통하여 투여될 수 있다. 여기서 사용되는 "비경구"라는 용어는 피하, 정맥 내, 근육 내, 관절 내, 활액 내(intra-synovial), 흉골 내(intrasternal), 척추강 내(intrathecal), 간 내, 병소 내(intralesional) 및 두개 내(intracranial) 주사 또는 주입 기술을 포함한다. RA와 같은 국재화된 질환에는 통상 국소적으로, 예를 들면 염증이 있는 관절로 투여된다.
본 발명의 조성물의 살균 주입 형태는 수용성 또는 유성 현탁액일 수 있다. 이러한 현탁액은 적절한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 관련 분야의 알려진 기술에 따라 제형화될 수 있다. 살균 주사제는 1,3-부탄디올용액과 같은 비독성의 주사가능한 희석제 또는 용매에 용해 또는 현탁시킨 살균 주입가능한 액상 또는 현탁액일 수 있다. 사용가능한 매체 및 용매들 중에서는 물, 링거액 및 염화 나트륨 등장(等張)액이 있다. 또한, 살균한 고정 오일(fixed oil)은 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로 사용된다. 이러한 목적을 위하여, 어떤 혼합된 고정 오일도 사용가능하며, 합성 모노- 또는 디글리세리드를 포함한다. 올레산과 같은 지방산 및 그 글리세리드 유도체는 주사제 제조에 유용하고, 특히 폴리옥시에틸레이트화된(polyoxyethylated) 올리브유 또는 피마자유와 같은 천연의 허용가능한 오일도 유용하다. 이러한 오일 용액 또는 현탁액은 또한 카르복시메틸 셀룰로오스 또는 에멀션 및 현탁액을 포함하는 제약적으로 허용가능한 투여 형태의 제형화에 통상적으로 사용되는 분산제와 같은 장쇄 알콜 희석제 또는 분산제를 포함할 수 있다. 트윈, 스판 등의 계면활성제 및 기타 유화제 또는 약학적으로 허용가능한 고형, 액상 또는 다른 투여 형태의 제조에 통상적으로 사용되는 생체이용성 증강제 등도 제형화에 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 비제한적으로 캡슐, 정제, 수용성 현탁액 또는 용액을 포함하는 경구적으로 허용가능한 투여 형태로 경구 투여될 수 있다. 경구 투여를 위한 정제의 경우, 일반적으로 사용되는 락토오스 및 옥수수 녹말 등의 담체를 포함한다. 스테아르산 마그네슘과 같은 활택제는 또한 일반적으로 첨가된다. 캡슐 형태의 경구 투여를 위해, 유용한 희석제는 락토오스 및 건조된 옥수수 녹말을 포함한다. 경구 투여를 위해 수용성 현탁액이 필요한 경우, 활성 성분을 유화제 및 현탁제와 결합한다. 필요한 경우, 감미료, 향료 또는 착색제가 또한 첨가될 수 있다.
선택적으로, 본 발명의 조성물은 직장(rectal) 투여를 위한 좌약의 형태로 투여될 수 있다. 이는 실온에서는 고체이나 직장에서는 액체여서 직장에서 녹아 약물을 방출하는 적절한 비-자극적 부형제와 약제를 혼합함으로써 제조될 수 있다. 이러한 물질은 코코아 버터, 비왁스 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 이러한 조성물은 약제학 제형 분야의 공지 기술에 따라 제조한다.
본 발명의 조성물은 국소적으로 투여될 수 있으며, 특히 치료 표적이 국소적 투여에 의해 용이하게 접근가능한 부위 또는 기관을 포함하는 경우로서, 눈, 피부, 관절 또는 하부 장관 등에 질환이 있는 경우이다. 적절한 국소 제형은 이러한 각 부위 및 기관을 위해 쉽게 제조될 수 있다. 하부 장관에 대한 국소 적용은 직장 좌약 제형(상기 참조) 또는 적절한 관장 제형으로 시행한다. 국소적인 경피성 패취 역시 사용될 수 있다.
국소 적용을 위해, 상기 조성물은 하나 이상의 담체에 분산되거나 용해된 활성 성분을 포함하는 적절한 연고로 제형화될 수 있다. 본 발명의 화합물의 국소 투여를 위한 담체는 비제한적 예로서, 미네랄 오일, 액체 바셀린, 백색 바셀린, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌 화합물, 에멀션화 왁스 및 물을 포함한다. 또는, 본 조성물은 하나 이상의 제약적으로 허용가능한 담체에 분산되거나 용해된 활성 성분을 포함하는 적절한 로션 또는 크림으로 제형화할 수 있다. 적절한 담체는 비제한적 예로서, 미네랄 오일, 솔비탄모노스테아레이트, 폴리소르베이트 60, 세틸 에스테르 왁스, 시테아릴 알콜, 2-옥틸도데카놀, 벤질 알콜 및 물을 포함한다.
눈에 사용하기 위해, 본 조성물은 pH가 조절된 살균 염수 등장액 또는 더 바람직하게는 염화 벤질알코니움(benzylalkonium chloride)과 같은 방부제를 포함하거나 그렇지 않은 pH가 조절된 살균 염수 등장액에서 미분화된 현탁액으로 제형화될 수 있다. 선택적으로, 눈에 사용하기 위해, 본 조성물은 바셀린과 같은 연고로 제형화될 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 비강 에어로졸 또는 흡입제로서 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 제약의 제형 분야에서 잘 알려진 기술에 따라 제조되고 벤질 알콜 또는 다른 적절한 방부제, 생체이용성을 향상시키기 위한 흡수 촉진제, 탄화플루오르, 및/또는 종래의 다른 가용화제 또는 분산제를 사용하여, 식염수에 용해시킨 용액으로 제조될 수 있다.
한 실시예에서 본 발명의 항체 또는 치료적 화합물은 리포좀(항체의 경우, "면역 리포좀")에 단독 또는 환자 또는 동물에의 표적 수송을 위한 기타 물질과 조합하여 삽입시킬 수 있다. 이러한 기타 물질은 유전자 치료용 유전자 수송에 사용되는 핵산, 안티센스 RNA, NK 세포 활성화 또는 성숙 수지상 세포의 억제를 위한 RNAi 또는 siRNA, 또는 다른 방법을 통해 NK 세포 활성화(또는 수지상 세포의 억제)를 위한 독소 또는 약물, 또는 본 발명의 목적에 유용한 본 명세서 기재의 기타 제제를 포함한다.
다른 태양에서, 본 발명의 항체 또는 기타 화합물은 그 생체 이용율, 생체내 반감기 등을 개선하기 위하여 변경될 수 있다. 예를 들면, 항체 및 기타 화합물은 다양한 형태의 폴리에틸렌 글리콜 및 관련 기술분야의 공지된 부착 방법을 사용하여 페질레이션(pegylation)될 수 있다(Lee 등. (2003) Bioconjug Chem . 14(3):546-53; Harris 등. (2003) Nat Rev Drug Discov. 2(3):214-21 ; Deckert 등 (2000) Int J Cancer. 87(3):382-90 참조).
투여방법 및 투여빈도의 결정
전술된 바와 같이, 본 발명의 중요한 부분은 안전하고 유효한 투여량과 투여빈도를 결정하기 위해 비인간 영장류에서 항-NKG2A 항체를 테스트하는 것이다. 적절한 시작 투여요법은 기존의 개발된 치료적 단클론항체로 검사한 경험에 의해 결정될 수 있다. 리투산(Rituximab), 헤르셉틴(Trastuzumab), 졸레르(Omalizumab), 박사(Tositumomab), 캠파쓰 (Alemtuzumab), 지발린(Zevalin), 온콜린(Oncolym)과 같은 여러 단클론 항체들은 임상에서 효과적인 것으로 나타났고, 유사한 투여 요법(즉, 제형 및/또는 복용량 및/또는 투여 프로토콜)이 본 발명의 항체에서 사용될 수 있다. 투여 일정 및 투여량은 이러한 제품에 대한 공지 방법에 따라, 예를 들면 제조자의 지시를 이용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 단클론 항체는 100㎎(10mL) 또는 500㎎(50mL) 일회용 바이알에 10㎎/mL 농도로 공급될 수 있다. 제품은 염화 나트륨 9.0㎎/mL, 구연산 나트륨 2수화물 7.35㎎/mL, 폴리소르베이트 80 0.7㎎/mL 및 주입을 위한 살균수로 Ⅳ 투여를 위해 제형화된다. 그 pH는 6.5로 조절된다. 본 발명의 항체를 위한 예시적 적절 투여 범위는 약 10 ㎎/m2 내지 500 ㎎/m2 이다. 그러나, 이러한 일정은 단지 예시적인 것이고 최적의 일정 및 투약 요법은 임상 시험 또는 전임상 시험에서 결정되어야 하는 항체의 친화력 및 항-NKG2A 활성 및 내성(tolerance)을 고려하여 조절될 수 있다. 24시간, 48시간, 72시간 또는 일 주 또는 한 달 동안 세포를 포화시키는 NKG2A에 대한 항체의 주입 분량 및 일정은 항체의 친화력 및 약동학적 변수를 고려하여 결정될 것이다.
그러나, 이러한 일정은 단지 예시적인 것이고, 항체의 결합성 및 최적의 일정 및 투약 요법은 임상 시험 또는 전임상 시험에서 결정되어야 하는 항체의 친화력 및 항-NKG2A 활성 및 내성을 고려하여 조절될 수 있다. NK 세포를 24시간, 48시간, 72시간 또는 일 주 또는 한 달 동안 포화시키는 NKG2A에 대한 항체의 주입 분량 및 요법은 항체의 친화력 및 약동학적 변수를 고려하여 결정될 것이다.
본 발명의 방법에 있어서 환자 또는 비인간 영장류에의 투여량은 개체에 있어서 시간에 따라 유익한 반응을 나타내기에 충분하여야 한다. 투여량은 사용되는 특정 조절제의 활성, 개체의 상태, 체중 및 치료 대상 부위의 표면적 등을 고려하여 결정된다. 투여량은 또한 특정 개체에의 투여에 수반될 수 있는 부작용의 존재, 성질 및 정도도 고려되어 결정된다. 특정 환자에 있어 투여될 화합물의 유효량을 결정함에 있어서, 의사는 화합물의 혈중 순환 농도, 화합물의 독성 및 항-화합물 항체의 생성 등을 평가할 수 있다. 통상, 화합물의 투여량은 통상적인 개체에 대하여 약 1 ng/kg 내지 10 mg/kg이다. 투여는 단일 투여 또는 분복(divided doses)으로 시행될 수 있다.
인간 및 비인간 영장류 NKG2A 수용체 양자에 모두 결합하는 본 발명의 항체는 투여량 및 빈도를 결정하는데 유익하게 사용될 수 있다. 항-NKG2A 항체 치료를 위한 적정한 치료적 창의 선택은 비인간 영장류에 항체를 투여하는 것에 기초하여 달성될 수 있다. 짧은 기간(24 시간 공배양) 동안의 NK 세포 활성화가 골수세포(BMC) 독성을 피하기 위하여 제안되었으며, 더 긴 기간 동안의 NK 세포 활성화(골수 세포와 활성화 NK 세포의 48시간 공배양)는 조혈 재구성에 부정적인 영향을 미침이 밝혀져 있다(Koh 등. (2002) Biol . Blood Marrow Transplant. 8:17- 25). 그러나, 보다 긴 기간 예컨대 24시간이나 48시간 이상 동안 각 개인의 NK 세포를 NK 세포 활성 항-NKG2A 항체에 노출시킬 수 있는 투여 요법을 사용하는 것도 가치가 있다. 이론에 매이지 않고, 항-NKG2A가 24시간이나 48시간보다 더 긴 시간 동안 존재하게 하는 투여 요법은 항-NKG2A 항체가 개체 내의 보다 충분한 숫자의 NK 세포와 접촉하고 이를 활성화시켜 표적 세포(예, 암세포, 감염세포, 염증세포)에 대해 치료적 효과를 나타내도록 할 수 있다. 따라서 본 발명자들은 개체에 항-NKG2A 항체를 24시간 이상, 보다 바람직하게는 48시간 보다 더 긴 기간 동안 노출시키는 단계를 포함하는 항-NKG2A 항체로 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 가장 바람직하게는 혈장 반감기가 24시간, 또는 48시간 이상, 보다 바람직하게는 5, 6, 7, 10, 14 또는 20 일 이상으로 항-NKG2A-항체를 개체에 투여하는 것을 포함한다. 가장 바람직하게는 Fc 부분, 바람직하게는 G2 또는 G4 타입의 Fc 부분을 포함하는 항-NKG2A-항체를 개체에 투여하는 것을 포함한다. 계속 논의하겠지만, NKG2A 기능을 차단할 수 있는 어떠한 적합한 항체도 사용될 수 있으며, Z199 또는 Z270의 결합 특이성을 갖는 항체가 예가 될 수 있다. 바람직한 태양에서, 항체는 두번째 또는 그 이상의 투여로 투여될 수 있으며, 항체는 키메라 항체, CDR 이식 항체, 인간 항체 또는 인간화 항체이다.
본 발명은 인간 NKG2A에 대한 치료적 항체의 적합한 투여 요법을 동정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 투여 요법, 바람직하게는 항체의 투여량 또는 빈도가 다양한 일련의 투여요법을 사용하여 비인간 영장류에 항체를 투여하는 단계, 및 비인간 영장류에서 NKG2A- 발현 세포의 활성을 결정하는 단계 및 특정 투여 요법에 대한 영장류의 골수 세포(BMC) 및/또는 조혈세포, 특히 골수세포 재구성(myeloid cell reconstitution)에 대한 효과를 결정하는 단계를 포함한다. 바람직하게는 상기 방법은 항-NKG2A 항체 투여에 따르는 골수세포 재구성을 평가하는 것을 더 포함하며, 상기 단계는 통상 골수세포 재구성이 정상화되는데, 즉 항-NKG2A 치료를 받기 전의 수준 또는 예정된 최소 수준으로 돌아가는데 필요한 일수를 측정하는 것을 포함한다. 이로써 골수세포 재구성이 정상화될 수 있게 하는 투여 요법을 동정하거나 선택하는 것이 가능하다.
본 발명의 방법은 비인간 영장류에서의 NKG2A-발현 세포의 활성을 측정하는 단계 및/또는 NKG2A-발현 세포의 활성을 검출할 수 있는 정도로 조절하는 투여 요법을 동정하거나 선택하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 투여 요법은 예를 들어 NK 세포를 활성화하는 항-NKG2A 항체의 개체에의 노출 기간 및 항체 투여 빈도로 표현할 수 있다. 이러한 파라미터에 기초하여, 투여 빈도 및 투여량은 사용된 특정 항체에 의존하여 예를 들어 항체의 혈장 반감기, 친화성, 생체이용율(또는 피크 혈청 농도에 이르는 시간) 등을 고려하여 조정될 수 있다.
투여 요법이 영장류에 의해 골수세포 재구성이 부분적으로 또는 완전히 회복되거나 정상화되게 하고, NKG2A-발현 세포의 활성을 검출가능한 정도로 조절한다고 결정되면 상기 투여 요법은 인간에서 사용하기에 적합하다.
내인성 인간 면역글로불린의 대사율은 잘 규명되어 있다. IgG의 반감기는 개별형에 따라 다양한데, IgGl, IgG2, 및 IgG4는 약 3주이며, IgG3는 약 1주이다. 항원결합 또는 항원성에 의하여 약동학이 변경되지 않는다면, 완전 인간 IgG 단클론항체는 내인성 IgG와 유사한 약동학을 나타낼 것이다. 전술한 바와 같이 인간 IgGl, IgG2, 및 IgG4 개별형의 놀랄만한 긴 반감기는 FcRn에 의한 대사 방어 덕분이다. FcRn는 간세포, 내피세포 및 세망내피시스템(RES)의 포식 세포상에 발현된다. IgG가 세포내 이입될 때, 엔도좀의 낮은 pH가 IgG Fc 도메인의 FcRn에의 결합을 촉진시키고, 이는 IgG를 세포 표면으로 리사이클시켜 IgG가 리소좀에 의한 분해를 받지 않도록 한다. 다른 IgG 이형에 비하여 IgG3이 짧은 반감기를 나타내는 것은 FcRn 결합 도메인에 단일 아미노산 상이성(435위치에 히스티딘 대신 아르기닌 존재) 때문이다.
완전 마우스(murine) IgGl 및 IgG2 항체의 제거는 대응하는 인간 개별형에 비하여 보다 빠르다. 마우스 항체의 반감기는 인간에서 12 내지 48시간이다. 인간에서의 마우스 항체의 짧은 반감기는 인간 FcRn에 대한 마우스 Fc 도메인의 낮은 친화성 때문이다. 인간 FcRn는 인간, 토끼, 및 기니픽의 IgG에는 결합하나, 래트, 소, 양, 또는 마우스의 IgG에는 그다지 결합하지 않는다; 마우스 FcRn는 모든 종 유래의 IgG에 결합한다. F(a')2, Fab, 및 scFV를 포함하는 항체 단편은 Fc 도메인이 결핍되어 있고, FcRn과 결합하지 않는다. 따라서, 이들 단편의 반감기는 실질적으로 완전 IgG의 반감기보다 짧으며, 그 반감기는 주로 분자량으로 결정된다. 저분자량 Fab 및 scFv 단편은 신장에서 제거되어, 그 제거가 가속화된다. F(ab')2 단편은 11 내지 27 시간의 반감기가 보고되어 있고, Fab 단편은 0.5 내지 21 시간으로 보고되어 있다. 일가 및 다가 scFv 구축물은 수분 또는 수시간의 반감기를 나타낸다.
항원결합은 항체의 약동학에 지대한 영향을 미친다. 항체가 내재화된 세포막항원 또는 분비된 항원과 형성된 면역복합체에 결합하면 순환혈액에서 효율적으로 제거되며, 항원은 항체 제거에 있어 "싱크(sink)"로 작용한다. 항원싱크는 용량-의존적인 약동학을 나타낸다. 만약 용량 수준이 항원풀(antigen pool)을 포화시키는데 충분하지 않으면, 항원-매개 제거가 현저하게 되고 항원 반감기는 내인성 IgG 의 반감기보다 짧아지게 된다; 항원을 포화시키는 용량수준에서는, RES-매개 제거가 현저하게 되고 반감기는 내인성 IgG 의 반감기와 유사하게 된다.
본 발명의 바람직한 태양은 항-NKG2A 항체가 초회 투여되는 투약 요법을 기술한다. 항-NKG2A 항체의 초회 투여는 NK 세포를 활성화시키고, NK 세포 활성화에 의해 간접적으로 개체내에서의 골수 세포 재구성이 억제될 수 있다. 항-NKG2A 항체의 제2 투여는 골수세포 재구성 회복의 약동학적 프로파일과 일치하도록 투여된다. 예를 들면 개체의 골수세포 재구성의 속도가 최소한 부분적으로 회복된 것으로 기대되는 시점에 투여된다. 따라서, 인간 및 비인간 영장류에서 수용체와 교차 반응하는 항-NKG2A 항체를 사용함으로써 본 발명자들은 24시간보다 더 긴 기간 동안 NK 세포를 항-NKG2A 항체와 접촉시키는 방법을 제공하며, 상기 기간동안 골수세포 재구성이 영향을 받지 않는 것으로 보고되고 있다.
바람직한 태양에서, 항-NKG2A 항체의 제2 투여는 초회 투여후 적어도 6, 7, 8, 9 또는 10일에 투여되며, 바람직하게는 초회 투여후 적어도 14, 15, 16, 또는 20일에 투여된다. 가장 바람직하게는 항-NKG2A 항체의 제2 투여는 항-NKG2A 항체의 개체내 혈청 농도가 초회(투여시) 농도의 반에 도달하는 것으로 추정되는 때(날) 후 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일에, 또는 적어도 14, 15, 16, 또는 20일에 투여되며, 바람직하게는 적어도 한 항-NKG2A 항체의 혈장 반감기가 지속된 후 적어도 6-10일 또는 적어도 15-20일에 투여하는 것이다. 또는 상기 방법은 항-NKG2A 항체의 피크 혈청 농도에 의해 표현될 수 있는데, 항-NKG2A 항체의 제2 투여는 개체내에서의 항-NKG2A 항체의 혈청농도가 개체에서의 피크 혈청 농도의 반에 도달하는 날 후 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 또는 적어도 14, 15, 16, 또는 20일에 투여한다.
추가예에서, 항-NKG2A 항체의 제2 투여는 개체에서의 항-NKG2A 항체의 혈정 농도가 검출되지 않는 정도의 농도에 도달한 날로부터 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 또는 적어도 14, 15, 16, 또는 20일에, 바람직하게는 항-NKG2A 항체의 혈청 반감기의 2, 3, 4일 이상이 지속 된 후 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 또는 적어도 14, 15, 16, 또는 20일에 투여하는 것이다.
바람직한 태양에서, G2b 보다 바람직하게는 G4 서브타입의 Fc 영역을 포함하는 항체에 대한 투여 요법이 기술된다(IgG2b 또는 IgG4 각각). 바람직하게 상기 항체는 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20, 21일, 보다 바람직하게는 약 10 내지 15일의 혈장 반감기를 갖는다. 바람직하게 상기 항체는 NK 세포상의 Fc 수용체(CD 16)와 실질적으로 결합하지 않는 Fc 영역을 포함한다. 상기 항체는 초회 및제2회 투여, 및/또는 후속 투여되고, 상기 제2 투여 및/또는 후속 투여는 항체가 그 초기 농도의 반에 도달한 날로부터 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 14, 15, 16, 또는 20일에 투여된다. 상기 제2 투여 및/또는 후속 투여는 또한 투여후 후속되는 절대적인 일수로 표현될 수 있는데, 예를 들면 초회 투여후 6, 7, 8, 9 또는 10일, 바람직하게는 초회 투여후 14, 15, 16, 20, 21, 24, 28, 30 또는 35일 등이다. 상기 항체는 천연 Fc 부분, 바람직하게는 천연 인간 Fc 부분을 포함하는 항체이며, 보다 바람직하게는 항체의 혈장 반감기를 증가시키거나 및/또는 예컨대 Fcn 수용체에 대한 결합을 증가시켜 혈장 반감기를 증가시키거나 또는 Fc감마IIIa에 대한 결합을 감소시켜 NK 세포에 대한 원하지 않는 독성(ADCC)을 감소시키는 등과 같이 Fc 수용체에 대한 결합을 개질하는 하나이상의 아미노산 치환과 같은 변경을 포함하는 것이다. 이러한 변경은 본 관련 기술분야에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있으며, 그 중 몇 가지의 변경은 후술된다.
다른 바람직한 태양에서, 항체 단편, 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜 등으로 개질된 F(ab')2 단편에 대한 투여요법을 기술하며, 상기 항체는 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20, 21일의 혈장 반감기를 갖는다. 상기 항체는 바람직하게는 초회 투여, 및 제2 투여, 및/또는 후속 투여되고, 상기 제2 및/또는 후속 투여는 항체가 그 초기 농도의 반에 도달한 날로부터 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 14, 15, 16, 또는 20일에 투여된다. 상기 제2 투여 및/또는 후속 투여는 또한 투여 후 후속되는 절대적인 일수로 표현될 수 있는데, 예를 들면 초회 투여 후 적어도 6, 7, 8, 9 또는 10일, 바람직하게는 초회 투여 후 14, 15, 16, 20, 21, 24, 28, 30 또는 35일 등이다.
약학적 조합
본 발명의 다른 중요한 태양에 따라, 항-NKG2A 항체 및/또는 기타 화합물은 하나 이상의 추가적인 치료제와 함께 제형화될 수 있으며, 상기 치료제는 통상 본 발명의 항체 또는 화합물이 투여되는 특정 치료 목적에 사용되는 제제이다. 추가적인 치료제는 일반적으로 치료될 특정 질병 또는 상태를 위해 단독 요법에서 사용되는 양으로 투여된다. 이러한 치료제는 암의 치료에 사용되는 치료제("항암 화합물"; 화학요법용 화합물, 호르몬, 혈관신생 억제제, 아폽토시스제 등); 감염성 질병의 치료에 사용되는 치료제(항 바이러스제포함); 자가면역 질환, 염증질환 및 이식거부질환 등과 같은 다른 면역요법에서 사용되는 치료제; 사이토킨; 면역조절제; 보조 화합물(adjunct compound); 활성화 또는 억제성 NK 세포 수용체 양자 모두에 대한 기타 항체 및 그 단편을 포함한다. 달리 기재하지 않는 한 본 발명의 조합 조성물은 본 발명의 활성화 항체, 억제성 항체 또는 세포독소-항체 콘쥬게이트를 포함할 수 있다.
암 치료제는 화학요법제(DNA 복제 억제제, 유사분열 억제제 및 염색체 분리 억제제 및 폴리핵산 전구체의 합성 및 정확성 방해제), 호르몬치료제, 항-혈관신생제 및 아폽토시스 유도제 등을 포함한다.
화학요법제는 예시적으로 다음과 같은 약물들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다; 알킬화제, 대사길항제, 세포 독성 항생제, 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid), 예를 들어 아드리아마이신, 닥티노마이신, 미토마이신, 카르미오마이신, 다우노마이신, 독소루비신, 타목시펜, 탁솔, 택소티어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈(vinorelbine), 에토포사이드(VP-16), 5-플루오르우라실(5FU), 시토신 아라비노사이드, 시클로포스파미드, 티오테파, 메토트렉세이트 , 캄포테신, 악티노마이신-D, 미토마이신 C, 시스플라틴(CDDP), 아미노프테린, 컴브레테스테틴(combretastatin(s)) 및 그 유도체 및 프로드러그(prodrug)를 포함한다.
호르몬제는 비제한적으로, 예를 들어 루프로렐린(leuprorelin), 고세렐린(goserelin), 트립토렐린(triptorelin), 및 부세렐린(buserelin)과 같은 LHRH 작동제; 타목시펜 및 토레미펜(toremifene)과 같은 항-에스트로젠 제제; 플루타미드, 닐루타미드(nilutamide), 시프로테론 및 비칼루타미드와 같은 항-안드로젠 제제; 애너스트로졸(anastrozole), 엑스메스탄(exemestane), 레트로졸(letrozole) 및 파드로졸(fadrozole)과 같은 아로마테이즈(aromatase) 억제제; 메드록시, 클로르마디논(chlormadinone) 및 메게스트롤(megestrol)과 같은 프로게스타젠(progestagens) 제제를 포함한다.
조합 치료를 위한 다수의 대표적인 화학 요법제는 미국 특허 제6,524,583호의 표 C에 기술되어 있으며, 개시된 제제와 그 적응증은 본 명세서에 참조로 통합된다. 상기 표에 기술된 각각의 제제는 예시적인 것이며 이에 제한되지 않는다. 숙련된 기술자는 "Remington's Pharmaceutical Science" 15th Edition, chapter 33, 특히 페이지 624-652를 참조할 수 있다. 투여량은 치료하고자 하는 상태에 따라 변경할 수 있다. 치료 의사는 개개의 개체에 대하여 적합한 투여량을 결정할 수 있다.
항-혈관신생제의 예시로는 중화 항체, 안티센스 RNA, siRNA, RNAi, VEGF 또는 VEGF 수용체에 대한 각 RNA 압타머(aptamer) 및 리보자임(미국 특허 제6,524,583호, 상기 개시 내용은 참조로 통합됨). 본 명세서에 참조로 통합되는 WO 98/16551에 개시된 바 대로 길항효과를 갖는 VEGF 변이체 또한 사용될 수 있다. 추가적인 예시 항-혈관신생제는 미국특허 제6,524,583호의 표 D에 기술되어 있으며, 개시된 제제와 그 적응증은 본 명세서에 참조로 통합된다.
예시적인 아폽토시스제는 비제한적으로, bcr-abl, bcl-2(bcl-1, cyclin D1과 구분됨; GenBank accession numbers M14745, X06487; 미국 특허 제5,650,491호 및 제5,539,094호; 각각은 참조로 통합됨) 및 Bcl-x1, Mcl-1, Bak, A1 및 A20을 포함하는 패밀리 구성원을 포함한다. bcl-2의 과잉 발현이 T 세포 림프종에서 처음으로 발견되었다. 종양 유전자 bcl-2는 Bax 즉 아폽토시스 경로단백질과 결합하고 불활성화시킴으로써 기능한다. bcl-2의 기능의 억제는 Bax의 불활성화를 방지하고, 아폽토시스 경로가 진행되도록 한다. 예를 들어, 안티센스 뉴클레오티드 서열, RNAi, siRNA 또는 소분자화합물을 사용하여 이 클래스의 종양 유전자를 억제하는 것은 보다 증강된 아폽토시스를 위해 본 발명에서 그 사용을 고려해 볼 수 있다(미국 특허 제5,650,491호; 제5,539,094호; 및 제5,583,034호; 각각은 참조로 여기에 통합됨).
유용한 항바이러스제제 또한 본 발명의 분자와 조합하여 사용될 수 있는 바, 그 비제한적인 예로서, 프로테아제 억제제, 뉴클레오시드역전사효소억제제, 비-뉴클레오시드역전사효소억제제 및 뉴클레오시드 아날로그 등을 포함한다. 항바이러스 제제의 예로는 지도부딘(zidovudine), 아시클로비어(acyclovir), 강시클로비어(gangcyclovir),비다라빈(vidarabine), 이독수리딘(idoxuridine), 트리플루리딘(trifluridine), 리바비린(ribavirin), 포스카네트(foscarnet), 아만타딘(amantadine), 리만타딘(rimantadine), 사키나비어(saquinavir), 인디나비어(indinavir), 암프레나비어(amprenavir), 로피나비어(lopinavir), 리토나비어(ritonavir), 알파-인터페론, 아데포비어(adefovir), 클레바딘(clevadine), 엔터카비어(entecavir), 및 플레코나릴(pleconaril) 등을 포함한다.
자가면역질환 또는 염증 질환의 치료를 위해, 하나 이상의 자가면역 또는 염증 질환 또는 그 증상 또는 그 특징에 효과가 있는 것으로 알려진 어떤 기타 화합물도 사용가능하며, 그 중 특히 아자티오프린(azathioprine, 예: 이뮤란), 클로로람부실(chlorambucil, 예: 류케란), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide 예:시토산), 사이클로스포린(cyclosporine, 예: 산디문, 네오랄), 메토트렉세이트(methotrexate 예: 류마트렉스), 코티코스테로이드, 프레드니손(예 델타손, 메티코텐), 에타너셉트(Etanercept, 예: 엔브렐), 인플리시맙(infliximab 예: 레미카드), TNF 억제제, FK-506, 라파마이신(rapamycin), 미코페놀레이트모페틸(mycophenolate mofetil), 레플루노마이드(leflunomide), 항-림프구 글로불린(anti-lymphocyte globulin), 데옥시스페구알린(deoxyspergualin) 또는 OKT 등이다.
바람직한 면역조절 화합물의 예로서는 사이토킨을 포함한다. 다른 예는 NK 세포 활성에 효과가 있는, 바람직하게는 활성화하거나 증강하는 효과 또는 NK 세포의 증식을 유도하거나 지지하는 효과가 있는 화합물을 포함한다. 이러한 면역 조절 화합물의 예로는 NOD 및 PKR 수용체의 리간드, TLR (Toll-양 수용체)작용제, 예를 들어 TLR3 작용제 (dsRNA, poly I:C 및 poly A:U), TLR4 작용제(ANA380, 이사토토리빈(isatoribine), LPS 및 MPL과 같은 모방제), TLR7 작용제(올리고뉴클레오티드, ssRNA), TLR9 작용제(CpGs와 같은 올리고뉴클레오티드), Akira 및 Takeda에 기재된 예시 화합물((2004) Nature Reviews 4: 499), 및 NK 세포 상의 억제성 수용체를 차단하는 항체(예를 들어 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3 활성을 억제) 또는 NK 세포 활성화 수용체에 작용제로 작용하는 항체(예를 들어 NCR 수용체 NKp30, NKp44 또는 NK046와 교차 결합하는 항체) 등을 포함하며, 이에 제한되지 않는다. 다양한 사이토킨이 본 발명에 따른 조합적인 접근에 사용될 수 있다. 본 발명의 조합에 유용한 사이토킨의 예로는 IL-lalpha, IL-lbeta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-IO, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-21, TGF-beta, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, TNF-alpha, TNF-beta, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGF, IFN-alpha, IFN-beta, IFN-감마 등이 있다. 본 발명의 조성물 또는 조합 치료에 사용되는 사이토킨은 표준 투여요법에 의하여 투여되며, 환자의 상태 및 사이토킨의 상대적인 독성과 같은 임상적 지시와 일치하도록 투여된다.
보조 화합물(adjunct compound) 은 예시로서, 세로토닌 길항제와 같은 항-구토제 및 페노티아진, 치환 벤자미드, 항히스타민제, 부티로페논, 코티코스테로이드, 벤조디아제핀 및 카나비노사이드; 졸레드론산 및 파미드론산과 같은 바이포스포네이트제; 및 에리쓰로포이에틴 및 G-CSF와 같은 조혈성장인자, 예로써 필그라스팀(filgrastim), 레노그라스팀(lenograstim) 및 다베포이에틴(darbepoietin) 등을 포함한다.
본 발명의 활성화 항-NKG2A 항체와 제형화될 수 있는 기타 치료제는 NK 세포를 활성화할 수 있는 기타 화합물을 포함한다. 예를 들어, NKp30, NKp44, 및 NKp46와 같은 NCR을 자극하는 화합물이 사용될 수 있다(PCT WO 01/36630, Vitale 등. (1998) J. Exp . Med. 187:2065-2072, Sivori 등. (1997) J. Exp . Med. 186:1129-1136; Pessino 등. (1998) J. Exp . Med. 188:953-960; Pessino 등. (1998) J. Exp Med. 188:953-960; 상기 문헌의 전 개시내용은 본 명세서에 참조로 통합됨). 또한, KIR 억제성 수용체의 억제제(Yawata 등. (2002) Crit Rev Immunol 22:463-82; Martin 등. (2000) Immunogenetics. 51 :268-80; Lanier (1998) Annu Rev Immunol. 16:359-93;상기 문헌의 전 개시내용은 본 명세서에 참조로 통합됨) 또한 사용될 수있다. 바람직하게는 NKp30의 활성화제, 예를 들어 NKp30의 천연 리간드 또는 활성화 항체들이 사용될 수 있다. 한 태양에서, TGF-beta 1 억제제가 사용되었는 바, TGF-beta l 은 NKp30을 하향조절할 수 있기 때문이다(Castriconi 등. (2004) CR . Biologies 327:533-537,상기 문헌의 전 개시내용은 본 명세서에 참조로 통합됨).
본 발명의 억제성 항-NKG2A 항체와 제형화될 수 있는 치료제는 NK 세포를 억제할 수 있는 기타 화합물을 포함한다. 이러한 화합물은 예를 들어, NKp30, NKp44, 및 NKp46와 같은 NCR의 억제제, 활성화 NKG2 수용체(예, NKG2C)의 억제제; 억제성 KIR 수용체의 활성화제 또는 억제성 Ly49 수용체의 활성화제 등을 포함한다.
본 발명의 활성화 항체는 또한 내성이 요구되는 항원과 함께 제형화될 수 있다. 본 발명의 활성화 항체에 의하여 야기되는 수지상세포 살해의 증가는 그 때 면역 시스템에 제시된 항원에 대하여 내성을 유발할 것으로 생각된다. 이러한 조성물은 자가면역질환 뿐 아니라 알레르기를 치료하는데 유용하다. 본 발명의 활성화 항체와 제형화될 수 있는 항원의 예로는 미엘린기초 단백질(mylein basic protein), 두드러기쑥(ragweed) 및 기타 꽃가루 및 식물 알레르겐, 애완물 알레르기를 유발하는 알레르겐, 음식 알레르기를 유발하는 알레르겐(땅콩 및 기타 너트 알레르겐, 낙농 제품 알레르겐, 참깨 및 다른 종자 알레르겐 등) 또는 곤충 알레르겐 등을 포함한다.
동물과 인간에 대한 투여량에 대한 상호관계(체표면적 m2 당 mg 기초)는 Freireich 등., (1966) Cancer Chemother Rep 50: 219에 기재되어 있다. 체표면적은 환자의 키와 체중에서 대략적으로 결정할 수 있다(Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardley, N. Y., 1970, 537 참조). 본 발명 화합물의 유효량은 약 0.001 mg/kg ~ 1000 mg/kg, 보다 바람직하게는 약 0.01 mg/kg ~ 100 mg/kg, 더욱 바람직하게는 약 0.1 mg/kg ~ 10 mg/kg이며; 또는, 범위의 하한이 0.001 mg/kg ~ 900 mg/kg 이고 상한이 0.1 mg/kg ~ 1000 mg/kg (예, 0.005 mg/kg ~ 200 mg/kg, 0.5 mg/kg ~ 20 mg/kg)이다. 유효량은 본 분야의 당업자가 인식하고 있는 것과 같이, 치료 질병, 투여 경로, 부형제 사용, 및 다른 약제의 사용과 같이 다른 치료제와 함께 사용될 가능성 등을 고려하여 변경될 수 있다.
추가적 치료제를 포함하는 약학적 조성물에서는, 추가적 치료제제의 유효량은 오직 그 추가적 치료제만을 사용하는 단독치료 요법에서 통상 사용되는 용량의 약 20% 내지 100%이다. 바람직하게는 유효량은 통상적인 단독 치료 용량의 약 70% 내지 100%이다. 이들 추가적 치료제의 통상적인 단독 요법시 용량은 본 분야에 잘 알려져 있다(Wells 등., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2.sup.nd Edition, Appleton 및 Lange, Stamford, Conn. (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, Calif. (2000) 참조, 상기 문헌은 전적으로 본 명세서에 참조로 통합된다).
상기 기재된 추가적인 치료제들 중 일부는 본 발명의 화합물과 상승적으로 작용할 것이 기대된다. 상승작용이 일어날 경우, 추가적인 치료제 및/또는 본 발명의 화합물의 유효량은 단독요법에서 요구되는 양보다 감소시켜 사용할 수 있다. 이는 추가적인 치료제 또는 본 발명의 치료제 양쪽 모두의 독성 부작용을 최소화할 수 있는 장점이 있으며, 상승적인 효능 개선, 투여 또는 사용 편이성이 증진되며, 화합물 생산 또는 제형화의 전체 경비가 감소되는 장점이 있다.
본 분야의 숙련자는 전술한 치료제가 두개 이상의 카테고리에 속하는 것을 인식할 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여 이러한 치료제는 각 치료적 카테고리의 각각의 구성원으로서 간주되며, 어떤 치료제가 특정 카테고리에 속한다고 하여 그 치료제가 다른 특정 카테고리에 속하는 것을 배제하지 않는다.
다른 태양에서, 본 발명은 본 발명의 항체 및 제2 치료제 또는 알레르겐을 포함하는 조성물을 제공하며, 이때 상기 제2 치료제 또는 알레르겐은 전술한 모든 약제 및 알레르겐에서 선택되며, 상기 항체 및 제2 제제는 개별 투여 형태이지만, 서로 관련되어 있다. 여기서 "서로 관련되어 있다"는 것은 개별 투여 형태가 같이 포장되어 있거나 또는 서로 부착되어 있어서 개별 투여 형태가 동일 투여 요법의 일부로서 판매되고 투여되도록 의도되었다는 것이 명백하게 알 수 있는 것을 의미한다. 약제와 항체는 바람직하게는 블리스트팩 또는 기타 다중 챔버 패키지 또는 사용자에 의하여 분리될 수 있는(예를 들면, 두 용기 사이의 스코아 라인을 찢어서) 연결된 분리 밀봉 용기(예, 호일 파우치 등) 등으로 함께 포장된다.
다른 태양에서, 본 발명은 a) 본 발명의 항체; 및 b) 제2 치료제 또는 알레르겐을 분리된 용기에 포함하는 키트를 제공한다. 전술된 모든 치료제 또는 알레르겐은 이러한 키트로 존재할 수 있다.
항- NKG2A 항체 및 조성물의 치료적 사용
본 발명의 활성화 항체는 NK 세포가 그 세포 표면에 HLA-E 또는 QaIb 를 갖는 표적 세포와 접촉할 때 상기 표적 세포를 용해시킬 수 있게 한다. 따라서, 한 태양에 따라, 본 발명은 NK 세포와 표적 세포로 이루어진 집단에서 표적 세포의 NK 세포-매개 용해를 재구성(reconstitution)하는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 NK 세포는 그 표면에 NKG2A를 가지며, 상기 표적 세포는 그 표면에 HLA-E 또는 QaIb 를 갖는 것을 특징으로 하며, 상기 방법은 상기 NK 세포를 전술한 활성화 단클론 항체 또는 그 단편에 접촉시키는 단계를 포함한다.
상기 활성은 특히 그 세포 포면에 HLA-E 또는 QaIb를 발현하는 유해한 세포를 특징으로 하는 상태 및 질환의 치료에 유용하다. 이러한 세포 형태 중 하나는 수지상 세포이며, 바람직하게는 성숙 수지상 세포이다. 따라서, 본 발명은 적어도 부분적으로 수지상 세포의 과잉, 또는 과잉활성 수지상 세포에 의해 유발되는 자가면역질환 또는 염증 질환 또는 기타 다른 질환의 치료 방법을 제공한다. 이러한 질환 치료방법은 환자에 본 발명의 활성화 항체를 포함하는 비-세포독성 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법으로 치료 가능한 예시적인 자가 면역 질환은 특히 용혈성 빈혈, 악성빈혈, 결절다발동맥염, 전신홍반루푸스, 베게너 육아종, 자가면역 간염, 베체트병, 크론병, 원발성 담관성간경화, 피부경화증, 궤양성 대장염, 쇼그렌 증후군 제1형 당뇨병, 포도막염, 그레이브스 병, 갑상선염(thyroiditis), 알츠하이머병, 갑상선염, 심근염, 류머티스열, 피부경화증, 강직척추염, 류머티스성 관절염, 사구체신염, 사르코이드증, 피부근육염, 중증근육무력증, 다발근육염, 급성특발다발신경염, 다발경화증, 원형탈모증, 천포창/유사천포창, 수포성 유천포창(Bullous pemphigoid), 하시모토 갑상선염, 건선, 및 백반증을 포함한다.
본 발명의 방법으로 치료될 수 있는 염증 질환의 예로는 부신염(adrenalitis), 폐포염(alveolitis), 담관 및 담낭염(angiocholecystitis), 충수염(appendicitis), 귀두염(balanitis), 눈꺼풀염(blepharitis), 기관지염(bronchitis), 주머니염(bursitis), 심장염(carditis), 연조직염(cellulitis), 자궁경부염(cervicitis), 담낭염(cholecystitis), 성대염(chorditis), 달팽이염( cochlitis), 대장염(colitis), 결막염(conjunctivitis), 방광염(cystitis), 피부염(dermatitis), 게실염(diverticulitis), 뇌염(encephalitis), 심내막염(endocarditis), 식도염(esophagitis), 이관염(eustachitis), 섬유조직염(fibrositis), 모낭염(folliculitis), 위염(gastritis), 위창자염(gastroenteritis), 치은염(gingivitis), 설염(glossitis), 간비장염( hepatosplenitis), 각막염(keratitis), 내이염(labyrinthitis), 후두염(laryngitis), 림프관염(lymphangitis), 유방염(mastitis), 중이염(media otitis), 수막염(meningitis), 자궁근염(metritis), 점막염(mucitis), 심근염(myocarditis), 심장근육염(myosititis), 고막염(myringitis), 신장염(nephritis), 신경염(neuritis), 고환염(orchitis), 골연골염(osteochondritis), 중이염(otitis), 심장막염(pericarditis), 건초염(peritendonitis), 복막염(peritonitis), 인두염(pharyngitis), 정맥염(phlebitis), 회색질척수염(poliomyelitis), 전립샘염(prostatitis), 치수염(pulpitis), 망막염(retinitis), 비염(rhinitis), 난관염(salpingitis), 공막염(scleritis), 공막맥락막염(selerochoroiditis), 음낭염(scrotitis), 부비동염(sinusitis), 척추염( spondylitis), 지방조직염(steatitis), 구내염(stomatitis), 윤활막염(synovitis), 이관염(syringitis), 건염(tendonitis), 편도염(tonsillitis), 요도염(urethritis), 및 질염(vaginitis)을 포함하여 이에 제한되지 않는다.
또한 동종반응성(alloreactive) NK 세포의 수지상 세포의 살해가 골수 이식에서의 조혈성 세포의 생착(engraftment)을 개선시키는 것이 알려져 있다.(L. Ruggeri 등., Science, 2002, 295:2097-2100). 따라서, 다른 태양에서, 본 발명은 환자에서의 조혈 세포의 생착을 개선하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 활성화 항체를 포함하는 본 발명의 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함한다. 생착의 개선은 이식편대숙주 질환(graft versus host disease)의 발병 빈도 또는 심각성의 경감, 증가된 이식편의 생존, 또는 이식에 의해 치료되는 질환(예, 조혈성 암)의 증상의 감소 또는 제거 등으로 나타난다. 본 방법은 바람직하게는 백혈병의 치료에 사용된다.
암세포는 그 표면의 HLA-E로 인하여 살해되지 않는 것으로 알려져 있다. HLA-E는 외과적으로 제거된 아교모세포종 검사물(glioblastoma specimens), 신경아교종(glioma) 세포주 및 아교모세포종 세포 배양물((J. Wischhusen 등., J Neuropathol Exp Neurol. 2005; 64(6):523-8); 및 백혈병 유래 세포주, 흑색종, 흑색종 유래 세포주 및 자궁경부암(R Marin 등., Immunogenetics. 2003; 54(11):767-75)에서 검출된다. 따라서, 다른 태양에서, 본 발명은 암 환자 치료방법을 제공하며, 상기 암은 HLA-E 발현 세포를 가지며, 상기 방법은 활성화 항체를 포함하는 본 발명의 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법에 의해 치료 가능한 암의 예시로는 편평상피세포암종을 포함하여 방광, 유방, 결장, 신장, 간, 폐, 난소, 전립선, 췌장, 위, 자궁경부, 갑상선 및 피부의 암종(carcinoma); 백혈병을 포함하여 림프구 계통 조혈성 종양, 급성 림프성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 털세포 림프종 및 Burketts 림프종; 급성 및 만성 골수성 백혈병 및 전골수성 백혈병을 포함하여 골수 계통의 조혈성 종양; 섬유육종 (fibrosarcoma) 및 횡문근종육종(rhabdomyoscarcoma)를 포함하는 중간엽(mesenchymal) 기관의 종양; 흑색종, 정상피종, 기형암종(teratocarcinoma), 신경아세포종(neuroblastoma) 및 신경아교종(glioma)를 포함하는 기타 종양; 성상세포종(astrocytoma), 신경아세포종, 신경아교종 및 신경집종(schwannomas)을 포함하는 중추신경계 및 말초신경계의 종양; 섬유육종, 횡문근종육종 및 골육종(osteosarcoma)을 포함하는 중간엽 기관의 종양; 흑색종, 색소성건피증(xeroderma pigmentosum), 각화극세포종(keratocanthoma), 정상피종, 여포상갑상선암(follicular thyroid cancer) 및 기형암종을 포함하는 기타 종양이 포함되며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따라 치료 가능한 바람직한 암은 신경아교종, 아교모세포종, 백혈병, 흑색종 및 자궁경부암을 포함한다.
바이러스 감염 세포 또한 HLA-E 발현을 NK 세포에 의한 살해를 피하는 기전으로 사용하고 있다. HLA-E 발현이 C형 바이러스 감염 세포(J. Mattermann 등, American Journal of Pathology. 2005;166:443-453); 및 시토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 감염세포(C. Cerboni 등., Eur J Immunol. 2001; 31(10):2926- 35)에 수반된다. 따라서, 다른 태양에서, 본 발명은 바이러스 감염 환자를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 바이러스 감염은 바이러스 감염된 HLA-E 발현 세포를 가지며, 상기 방법은 활성화 항체를 포함하는 본 발명의 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명으로 치료가능한 바이러스 감염의 예시로는 레트로바이러스 패밀리(예, HIV-I (HTLV-III, LAV 또는 HTLV-III/LAV, 또는 HIV-III; 및 HIV-LP와 같은 기타 분리물)로도 지칭됨)와 같은 인간 면역 결핍 바이러스; 피코나바이러스 패밀리(예, 폴리오 바이러스, A형 간염 바이러스; 엔테로 바이러스, 인간 코사키 바이러스, 리노바이러스, 에코 바이러스); 칼시바이러스 패밀리(예, 위장관염을 일으키는 균주(strain)); 토가바이러스 패밀리 (예, 말뇌염바이러스, 루벨라 바이러스); 플라비바이러스 패밀리(예, 댕기 바이러스, 뇌염 바이러스, 황열바이러스); 코로나바이러스 패밀리 (예, 코로나 바이러스); 랍도바이러스(예, 소수포성 구내염 바이러스, 광견병 바이러스); 필로바이러스 패밀리(예, 에볼라 바이러스); 파라믹소바이러스 패밀리(예, 파라인플루엔자 바이러스, 멈프스 바이러스, 홍역바이러스, 호흡기 신시티아 바이러스);오르토믹소바이러스 패밀리(예, 인플루엔자 바이러스) 또는 조류독감바이러스(H5N1 또는 관련 바이러스); 분가바이러스 패밀리(예, 한탄바이러스, 분가바이러스, 페보바이러스(phleboviruses) 및 나이로바이러스(Nairo viruses); 아레나바이러스 패밀리(출혈열바이러스(hemorrhagic fever viruses)); 레오바이러스 패밀리(예, 레오바이러스, 오르비바이러스 및 로타바이러스); 버나바이러스 패밀리(Birnaviridae); 헤파드나바이러스 패밀리(B형 간염 바이러스); 파보바이러스 패밀리 (파보바이러스); 파포바바이러스패밀리 (파필로마바이러스, 폴리오마바이러스); 아데노바이러스 패밀리 (대부분 아데노 바이러스); 헤르페스바이러스 패밀리 (단순포진바이러스 (HSV) 1 및 2, 바리셀라조스터바이러스, 시토메갈로바이러스 (CMV)); 폭스바이러스 패밀리 (두창바이러스, 백시나바이러스, 폭스바이러스); 이리도바이러스 패밀리 (예, 아프리카돼지콜레라바이러스); 및 미분류바이러스 (예, 해면상 뇌증(spongiform encephalopathies)의 병원체. 델타 간염의 원인체(B형 간염 결손 위성으로 생각됨), 비A형 비B형 간염 병원체(클래스 l=내부 전파; 클래스 2= 장관외전파(parenterally transmitted; 예, C형 간염); 노르월크 및 관련 바이러스 및 아스트로바이러스)에 의해 유발된 감염이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
가장 바람직하게는, 치료 대상 바이러스 질환은 C형 간염 바이러스 감염 또는 시토메갈로바이러스 감염이다.
본 발명의 활성화 항체는 또한 항원에 대한 내성을 유도하는데 사용될 수 있다. 따라서, 다른 태양에 따라, 본 발명은 환자에 있어서 항원에 대한 내성을 유도하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 활성화 항체를 포함하는 본 발명의 조성물을 환자에 투여하는 단계; 및 내성이 요망되는 항원을 상기 환자에 투여하는 단계를 포함한다. 이 방법은 바람직하게는 알레르기 치료에 사용되며, 이때 항원은 알레르겐이다. 항원은 전술한 바 있는 본 발명의 활성화 항체 및 항원을 포함하는 조합 조성물로부터 선택할 수 있다.
본 발명의 억제성 항체 또는 세포독소-항체 콘쥬게이트를 포함하는 조성물은 NK 세포의 살해, NK 세포의 활성의 경감, NK 세포의 증식의 감소, NK 세포에 의한 용해에 감수성 있는 세포의 용해 방지, 집단내 NK 세포수의 감소에 유용하다. 한 태양에서, 본 발명은 NK 세포 활성 감소, NK 세포 증식 감소, NK 세포 용해에 감수성 있는 세포의 용해 방지, 또는 집단 내 NK 세포수 감소 방법을 제공하며, 상기 방법은 억제성 항체 또는 세포독소-항체 콘쥬게이트를 포함하는 본 발명의 조성물을 NK 세포에 접촉시키는 단계를 포함한다. 이 방법은 특히 NK 과잉활성 및/또는 과잉증식을 특징으로 하는 질병에 유용하다.
예를 들어, 본 발명자가 같이 출원한 PCT 공개 WO2005/105849는 각종 NK 세포 수용체에 대한 항체를 사용하여 NK-타입 LDGL를 치료하는 방법에 대하여 기술하고 있다. PCT 공개 WO 2005/115517는 NK 세포 과잉활성이 이자섬(pancreatic islet) 자가면역의 존재, 진행, 스테이지 및/또는 공격성과 관련되어 있으며, I형 당뇨병에서 중요한 역할을 함이 개시되어 있다. 따라서, 한 태양에서 본 발명은 NK 세포 과잉활성 또는 NK 세포 과잉 증식의 특징을 나타내는 상태의 환자의 치료방법을 제공하는데, 상기 방법은 억제성 항체 또는 세포독소-항체 콘쥬게이트를 포함하는 본 발명의 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함한다. 바람직한 태양으로서, 상기 상태는 NK-타입 LDGL 또는 I형 당뇨병이다.
전술한 치료적 방법은 어느 것이나 치료하고자 하는 상태에 적합한 제2 치료제를 환자에 투여하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 환자에게 투여 가능한 제2 치료제 종류는 사이토킨, 사이토킨 억제제, 조혈성장인자, 인슐린, 항염증제, 면역억제제, 항암제(화학요법제, 항-혈관신생제, 아폽토시스-촉진제, 호르몬제, DNA 복제 억제제, 유사분열 억제제 및/또는 염색체 분리 억제제, 또는 폴리핵산 전구체의 합성 및 정확성 방해제 등), 보조제(진통제 또는 항구토제), 활성화 NK 수용체(NKp30, NKp44, 및 NKp46)의 작동제(agonist), 억제성 NK 수용체(억제성 KIR 수용체 등)의 길항제(antagonist), TGF-beta 1 길항제, 억제성 NK cell 수용체를 자극시킬 수 있는 화합물(천연리간드, CD94/NKG2A 수용체 활성을 자극할 수 있는 항체 또는 소분자, 또는 KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR3DL1, 및 KIR3DL2와 같은 억제성 KIR 수용체의 활성을 자극할 수 있는 항체 또는 소분자), 또는 활성화 NK 세포 수용체 (예, NKρ30, NKp44, 또는 NKp46)의 억제제 등이다.
전술한 화합물 클래스의 특정 예는 약학적 조합 편에 기재되어 있으며, 이들 클래스의 치료제 중 특정 화합물 및 다른 구성원도 본 발명의 방법에서 환자에 투여될 수 있다. 사용할 치료제의 선택은 의학분야의 숙련가에 의해 쉽게 이루어질 수 있으며, 치료 또는 예방되어야 할 상태의 성질, 상태의 심각성, 치료받는 환자의 전체적인 건강 상체 및 치료 의사의 판단에 따라 이루어진다.
제2 치료제는 본 발명의 항-NKG2A 조성물과 동시에 또는 투여 전 또는 투여 직후 투여될 수 있다. 동시에 투여하는 경우에는, 상기 제2 치료제는 분리 제형 조성물의 상태로(즉 복수 투여형), 또는 항체-함유 조성물의 일부분으로 투여될 수 있다.
어떤 태양에서, 본 발명의 NKG2A 항체 조성물을 투여하기 전에, NK 세포상의 NKG2A 및 가능한 다른 단백질의 발현이 평가되며, 및/또는 수지상 세포(바람직하게는 성숙 수지상세포)의 수 또는 활성 및/또는 기타 세포상의 NKG2A 리간드(예, HLA-E 또는 Qalb)의 존재를 측정한다. 이는 환자에서 NK 또는 수지상 세포의 시료를 얻고, NK 세포에 대하여 예를 들어 면역 시험법 등을 사용하여 세포상의 KIR 수용체, 기타 NKG2 수용체, 또는 NCR(예, NKp30, NKp44, NKp46)과 같은 마커의 상대적인 현저성을 측정하는 것으로 수행될 수 있다. 다른 방법 또한 이들 단백질의 발현을 검출하는데 사용될 수 있는데, 예컨대 RT-PCR과 같은 RNA-기초 방법, 또는 노던블롯팅 등을 들 수 있다. 환자에서 NKG2A를 발현하는 NK 세포의 검출은 본 방법이 환자의 치료에 사용되기에 아주 적합하다는 것을 나타낸다.
치료는 복수 라운드(multiple rounds)로 항체를 사용하여 시행할 수 있다. 예를 들면, 첫 라운드 투여에 뒤이어, NKG2A-발현 NK 세포의 수준 및/또는 활성, 및/또는 그 표면에 NKG2A 또는 HLA-E, 또는 QaIb를 발현하는 수지상 세포 또는 기타 세포의 수준 및/또는 활성을 다시 측정하고, 적합한 경우 추가적인 라운드의 투여가 시행될 수 있다. 이런 식으로 복수 라운드의 수용체/세포/리간드 검출 및 항체 조성물의 투여를 예컨대 질병이 조절가능해질 때까지 시행할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서 하나 이상의 항체를 생산 및/또는 사용할 수 있다. 예를 들면, NKG2A의 상이한 에피토프에 대한 항체들의 조합, 상이한 조합의 NKG2A, CD94, 또는 HLA-E에 대한 항체들의 조합, 또는 각 개체에 존재할 수 있는 이들 세 단백질 중 어느 하나에 대한 상이한 아이소형에 대한 항체들의 조합을 사용하여 이상적인 수준으로 NKG2A 자극을 억제 또는 NK 세포 활성을 억제하는데 적당한 정도로 일반적으로 또는 어떤 개별 환자에 있어서 사용할 수 있다(예, 적합한 치료 요법을 결정하기 위해 환자에서 NKG2A-발현 세포의 분석에 뒤따라).
특정 치료적 접근이 환자의 상태에 유해한 것으로 알려지지 않는 한, 또한 NKG2A 항체-치료 효과를 심각하게 방해하지 않는 한, 상기 접근은 본 발명의 방법과 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명은 수술 등과 같은 고전적인 접근과 조합하여 사용될 수 있다. 하나 이상의 제2 치료제 또는 접근이 본 발명의 치료와 조합되어 사용될 때, 조합 결과가 각 치료법이 개별적으로 수행될 때 관찰되는 효과의 합이 될 필요는 없다. 물론 적어도 부가적인 효과가 통상 바람직하지만, 본 발명의 항체 조성물이 NK 세포를 억제하거나 활성화하는데 효과적인 한 본 발명의 방법은 제2 치료제 또는 다른 치료법의 사용을 부가적으로 포함할 수 있다. 또한, 조합치료가 반드시 상승효과를 보일 필요는 없지만, 상승효과는 틀림없이 가능하며 유리할 것이다. NKG2A 항체 -기초 치료는 예컨대 몇 분 또는 몇 주 또는 몇 달 범위로 간격을 두어 다른 치료에 선행하거나 뒤따라 이루어질 수 있다. 또한 하나 이상의 본 발명의 항-NKG2A 조성물을 투여할 수 있다. 제2 치료제 또는 다른 접근법은 본 발명의 NKG2A 조성물과 함께 격일 또는 격주로 상호 호환되어 투여될 수 있으며; 또는 한 사이클의 항-NKG2A 치료를 하고 뒤이어 한 사이클의 다른 치료제 또는 접근법에 의해 치료할 수 있다. 어떤 경우에도 제2 치료제를 환자에 투여하는 단계를 추가적으로 포함하고 있는 방법에서 요구되는 것은 투여 시간에 상관없이 제2 치료제 및 본 발명의 항체 양자가 치료적으로 유리한 효과를 나타내기에 효과적인 조합량으로 송달되어야 한다는 것이다.
본 발명의 항체 및 조성물을 환자에 투여하는 방법은 동물 치료 또는 본 명세서 기재 방법 또는 조성물의 인간 질병 치료를 위한 동물 모델에서의 효능 테스트에 사용될 수 있다. 본 명세서에서 "환자"는 온혈 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 영장류 및 가장 바람직하게는 인간을 의미한다.
본 발명은 이하 실시예에 의하여 보다 상세히 설명되며, 상기 실시예는 단지 예시적인 것으로서, 본 발명을 제한하지 않는다.
도 1은 다양한 비율의 NK 세포 대 PHA 블라스트(blasts)에서, 세 상이한 농도의 Z270이 NK 세포의 HLA-E 발현 PHA 블라스트 용해에 미치는 효과를 도시한 것이다.
도 2는 다양한 비율의 NK 세포 대 PHA 블라스트(blasts)에서, 세 상이한 농도의 Z199가 NK 세포의 HLA-E 발현 PHA 블라스트 용해에 미치는 효과를 도시한 것이다.
도 3은 NK 세포의 HLA-E 발현 PHA 블라스트 용해에 대한 Z270의 F(ab')2 단편의 효과를 도시한 것이다.
도 4는 항체 Z270, IgGl, 및 항-CD 16의 시노몰거스 원숭이 NK 세포에 대한 결합을 도시한 것이며, 이로부터 Z270가 시노몰거스 원숭이 NK 세포와 결합하는 것을 알 수 있다. 마카나 뮬라타 및 바분에 대한 결합도 도시하였다.
실시예 1. 자가 iDC 세포의 살해는 CD94 / NKG2A + KIR - NK 세포 하위세트에 의해 매개된다 .
외인성 IL-2 존재하에 배양된 다클론 NK 세포가 iDC에 대하여 강력한 세포용 해 활성을 나타내는 것을 이전에 보인바 있다. 따라서, 본 연구에서는 공여자 AM, AC 및 DB에서 분리한 다클론 NK 세포 집단이 자가(autologous) iDC 및 동종이형(allogenic)의 iDC 양자를 효율적으로 살해하였다. 그러나, 자가 iDC에 대한 세포용해 활성은 적합한 항-HLA 클래스 I mAb가 존재할 때 증가되었다.
이러한 결과는 DC 상의 자기 HLA 클래스 I와 NK 세포상의 억제성 수용체간에 일어나는 억제성 상호작용이 붕괴된 결과였을 수 있다. 이 결과에 기초하여, 본 발명자들은 전체 NK 세포풀 중 오직 일 분획만이 iDC에 대해 자발적인 세포독성을 나타내고 반면 다른 NK 세포는 그 수용체와 HLA 클래스 I 분자간의 효과적인 억제성 상호작용으로 인하여 세포독성을 나타내지 않는다는 가설을 세웠다. 이러한 가능성을 분석하기 위하여 공여자 AM, AC 및 DB 에서 분리한 NK 세포 클론의 패널에 대해 자가(및 동형이형의)iDC 에 대한 세포 용해 활성을 분석하였다. 우리의 가설에 일치하게, 오직 일 부분의 NK 세포 클론만이 자가 iDC를 용해하였다. 다른 클론은 거의 또는 전혀 세포 독성을 나타내지 않았다. 또한 세포 용해성 클론의 퍼센트는 표적 세포가 동형이형의 iDC인 경우 약간 증가되었다(이하 참조).
어떤 NK 세포 클론이 iDC를 용해할 수 없는 것이 그들의 억제성 NKR과 HLA 클래스 I 분자간의 상호작용을 반영한 것인가를 검증하기 위하여, 이들 클론들에 대하여 항-HLA 클래스 I mAb의 존재하(즉 억제성 상호작용을 붕괴하는 조건하) 및 비존재하에서 자가 iDC를 용해하는 능력을 분석하였다. 이 실험 결과를 기초로 NK 세포 클론을 세개의 상이한 기능적 카테고리로 분류하였으며, 또한 킬러 Ig-양 수용체 (KIR)2DL, KIR3DL1 및 CD94/NKG2A를 포함하는 HLA 클래스 I-특이적 억제성 수 용체(즉 인간에서의 주요 MHC 클래스 I-특이적 억제성 수용체)의 발현을 분석하였다.
첫번째 그룹(그룹 A)의 NK 클론은 iDC에 대한 높은 자발적 세포용해활성의 특징을 가진다. 이들 세포용해활성의 정도는 항-HLA 클래스 I mAb의 존재에 의하여 증가되지 않으며, 설사 증가된다고 하더라도 극히 적다. 이들 클론은 억제성 수용체의 발현에 있어 다소 동종적이며, CD94/NKG2A은 발현하나, 자기-HLA 클래스 I 대립자(alleles)에 반응하는 KIR2DL 및 KIR3DL1은 결핍되어 있다. 두번째 그룹의 NK 세포 클론(그룹 B) 또한 iDC에 대해 자발적인 살해 능력을 보이는 특징이 있다. 그러나, 그룹 A의 클론과 달리 이들 세포독성은 항-HLA 클래스 I mAb의 존재시 증가된다. 이는 NK-세포 매개 세포용해를 제한하긴 하나 완전히 폐기하지는 않는 억제성 상호작용의 발생을 제안하였다. 이 그룹 또한 CD94/NKG2A+ 클론으로 구성되어 있으며 자기-HLA 클래스 I 대립자에 반응성인 KIR은 결핍되어 있다. 특이하게, 그룹 B 클론의 세포용해 활성은 항-CD94 mAb의 존재시 더 증가되었으며, 이는 세포독성의 (부분적인) 억제는 실제 CD94/NKG2A에 의해 매개되는 것을 가리킨다.
세번째 그룹(그룹 C)에 속하는 NK 클론은 자가 iDC에 대하여 세포독성을 나타내지 않는다. 그러나 항-HLA 클래스 I mAb의 존재시, iDC는 효율적으로 용해되며, 이는 강력한 억제성 상호작용의 발생을 제안하였다. 이러한 NK 클론은 억제성 수용체의 발현에 있어 보다 이질적이었다. 특이하게, 자기-HLA 클래스 I 대립자(alleles)에 특이적인 KIR2DL 또는 KIR3DL1을 발현하는 실질적인 모든 NK 클론은 이 그룹에 속해있었다. 또한 이들 클론 중에 몇몇은 단일 KIR을 발현하는 특징이 있고, 반면 다른 것들은 다른 특이성을 갖는 복수 KIR을 발현하였다. iDC에 대한 세포용해 활성의 재구성은 항-HLA 클래스 I mAb mAb뿐 아니라 항-KIR mAb에 의해 얻을 수 있었다 (이하 참조).
최종적으로 그룹 C의 NK 세포 클론의 부차적 분획(minor fraction)은 KIR-CD94/NKG2A+이었다. 이들의 세포독성은 CD94의 mAb-매개 차단 또는 항-HLA 클래스 I mAb에 의해 재구성될 수 있다. 이러한 결과는 다음을 의미한다:(a) 모든 NK 세포가 자가 iDC를 살해할 수 있는 것은 아니다(비록 모든 NK 세포가 항-HLA 클래스 I mAb 존재하에서는 iDC를 용해할 수 있지만);(b) iDC에 대하여 자발적인 세포용해 활성을 나타내는 클론은 CD94/NKG2A+KIR- 표면 표현형을 특징으로 하는 NK 하부세트에 한정된다(그룹 A 및 B); (c) 자기-HLA 클래스 I 대립자에 특이적인 KIR2DL 또는 KIR3DL1을 발현하는 클론은 자가 iDC를 살해하지 않는다(그룹 C).
어떤 NK 클론은 자기반응성 KIR 및 CD94/NKG2A 양자를 발현하였다. 모든 경우에서 이들은 그룹 C에 포함되었으며 그들의 세포용해 활성은 항-HLA 클래스 I 및 항-KIR mAb 양자에 의하여 재구성될 수 있었으며, 반면 항-CD94 mAb는 거의 효과를 나타내지 않았다. 최종적으로 KIR+NKG2A- 클론은 iDC가 동종이형(KIR 불일치)의 개체에서 유래된 실험에서만 iDC에 대해 세포용해활성을 나타내는 것이 밝혀졌다. 이 경우 KIR+NKG2A- 세포는 동종반응성(alloreactivity)을 나타내며, 이는 발현된 KIR이 동종이형 DC상의 HLA 클래스 I대립자를 인식하지 못하기 때문이다. 대표적인 NK 클론 AM4 (KIR3DL1+)는 자가 iDC (BW4+BW6-)를 살해할 수 없었던 반면, 이들은 동종이형의 KIR 불일치(BW4-BW6+) iDC는 용해하였다. 자가 iDC의 살해는 항-HLA 클래 스 I mAb의 존재하에서는 재구성될 수 있었으나, 동종이형의 iDC의 살해는 그다지 개선되지 않았다.
KIR가 자가 iDC 및 동종이형의 KIR 불일치 iDC를 구분하는 능력을 가지는 것을 가리키는 다른 예가 클론 DB3에 의해 제공되는데, 이 클론은 KIR2DL1 및 KIR2DL2을 공발현한다. 이 클론은 "비-동종반응성"으로 정의되는데, 이는 그들의 KIR 표현형에 기초해 볼때 모든 상이한 HLA-C 대립자(그룹 1 및 그룹 2 양자)을 인식하기 때문이다. 실제로 이들 클론은 자가 또는 동종이형의 iDC를 살해하지 않는 반면 두 표적에 대한 용해는 항-HLA 클래스 I mAb에 의해 효율적으로 재구성될 수 있다. 또한 용해의 재구성은 자가 (CW1/CW3) iDC에 대한 항-KIR2DL2 mAb 및 동종이형 (CW2/CW4) iDC에 대한 항-KIR2DLl mAb에 의해 얻어질 수 있었다. 최종적으로 예상했던 바와 같이 NKG2A+KIR- 클론은 자가 또는 동형이형 iDC를 살해하는 능력에 있어서 실질적인 차이를 나타내지 않았다.
실시예 2. NK - 매개세포독성에 대한 iDC 의 감수성은 HLA -E 클래스 I 분자의 하향조절을 반영한다.
이전 연구에서 iDC 및 mDC는 HLA 클래스 I 표면 발현에 있어 상당한 차이점을 나타내는 것이 밝혀졌다. 요컨대, HLA-A, B, C 및 E 분자의 단형성 결정자에 특이적인 mAb의 사용에 의해, 성숙 과정의 DC는 그 세포 표면상에 HLA 클래스 I 발현을 상당히 상향 조절함이 밝혀졌다. 또한 HLA 클래스 I의 상향조절이 mDC이 NK-세 포-매개 용해에 저항성을 갖게 하는 결정적인 기전이다.
상이한 DC 성숙단계를 대표하는 세포상 다양한 HLA 클래스 I 분자 발현을 직접적으로 평가하기 위하여, 동일 개체 유래의 단핵구, iDC 및 mDC 상의 HLA-A, B, C 및 E의 발현을 비교하여 분석하였다. 모든 HLA 클래스 I분자는 iDC에 비하여 mDC에서 높게 상향 조절되었다. 특이하게, 이들은 단핵구(즉 iDC의 전구체)에 비하여 iDC에서 명백하게 하향-조절되었다. 요컨대 단핵구에서 iDC가 생성될 때 새로운 표면 분자(예를 들어 CDIa) 및 기능들을 취득(또는 상향 조절)될 뿐아니라 CD14, 및 HLA-A, B, C 및 E 분자를 포함하는 각종 분자의 발현의 소실(또는 하향 조절)을 초래하는 것으로 보인다. 이는 HLA 클래스 I 하향 조절의 정도가 iDC로 하여금 특정 하부세트의 NK 세포(CD94/NKG2A+KIR-)에 매개된 용해에 예민하게 되도록 하는 수준으로 조절되는 것을 의미한다.
이와 같이, KIR+ NK 세포는 iDC를 살해할 수 없으므로, iDC에 의해 발현되는 HLA-B 또는 HLAC 분자의 량은 KIR 교차 결합 및 억제성 시그널의 전달을 일으키는데 충분하다고 생각된다. 다른 한편 HLA-E의 하향 조절은 KIR-NKG2A+ NK 세포 분획이 iDC를 살해할 수 있게 하는데 충분하다. 실제 HLA-E(HLA-E-특이적 3D12 mAb에 의해 검출)는 iDC에서는 거의 검출이 되지 않은 반면, mDC상에서는 오직 부분적으로나마 재발현되었다. 그러나 모든 경우에서, mDC에서의 HLA-E 발현은 동일 개체 유래의 단핵구 또는 PBL과 비교하여볼 때 더 낮았다. 놀랍게도, 비록 HLA-A, B 및 C 분자가 PHA 블라스트(blasts)에 의한 것보다 더 높은 수준으로 mDC에 의해 발현된다하더라도, HLA-E의 표면 발현은 PHA 블라스트에서보다 mDC에서 일관되게 더 낮 았다. 이러한 정황에서 이전 연구는 자가 PHA 블라스트가 효과 NK 세포의 KIR/NKG2A 표현형에 관계없이 NK 용해에 저항성이 높음을 명백하게 입증한다.
실시예 3. 소분획의 NK 클론이 mDC 의 살해를 매개한다.
다클론 NK 세포가 mDC를 효율적으로 살해하지 못한다는 이전 연구 결과와 일치하게, 본 발명자들은 대부분의 iDC를 용해하는 NK 세포 클론이 mDC를 살해하지 못한다는 것을 보였다. 그러나 흥미롭게도, mDC는 그룹 A에 속하는 부차적 부분의 NK 클론(즉, 항-HLA 클래스 I mAb에 의해 증가되지 않는 자발적인 항-iDC 세포용해활성을 나타내는 클론)에 의해 용해되었다. 자가 mDC의 용해는 iDC에 비해 더 낮았으며, 항-HLA 클래스 I mAb의 존재에 의해 증가되었다. 이는 iDC에 비해 mDC에서 HLA-E 발현의 더 높은 발현이 더 효과적인 CD94/NKG2A을 통한 시그널링을 초래한다는 것을 의미한다(이는 또한 항-CD94 mAb의 그 용해를 증가시킬 수 있는 능력에 의해서도 확인될 수 있을 것이다). 그룹 B의 NK 클론(즉, iDC를 죽일 수 있고 그 용해가 항-HLA 클래스 I mAb에 의해 증가될 수 있는 클론)은 mDC에 대해서 세포용해활성을 나타내지 않았다. 그러나 항-HLA 클래스 I 또는 항-CD94 mAb의 존재시에는 세포용해활성을 나타낸다. 그룹 C 에 속하는 클론(거의 모든 경우 KIR+)은 iDC를 살해할 수 없었으며, 또한 mDC도 살해하지 않았다. mDC에 대한 세포독성은 오직 mAb 매개의 HLA 클래스 I과 KIR간 상호작용의 붕괴가 있는 경우에만 검출되었다.
실시예 4. DC 살해능에 있어서 KIR - NKG2A + NK 세포의 이종성
전술한 바와 같이, 그룹 A 및 그룹 B에 속하는 NK 세포 클론은 동종성 KIR-NKG2A+ 표면 표현형을 특징으로 하는 반면, 그룹 C는 KIR+ NKG2A- 또는 KIR-NKG2A+ 클론(또는 가끔, KIR+NKG2A+ 클론)을 포함한다.
KIR을 경유한 음성 시그널링이 NKG2A를 경유한 것보다 더 효과적인 것으로 가정한다면(시그널링 능력에 있어서 본질적인 차이 또는 DC 상의 특이적 HLA 클래스 I 리간드의 상이한 이용성에 기인), 왜 KIR-NKG2A+ 세포가 모든 세 그룹의 NK 클론에서 검출되는지가 규명되어야 한다. 주어진 NK 세포 클론의 세포용해 활성은 억제성 수용체(KIR, NKG2A) 및 유발성 수용체(NCR, NKG2D)의 차이로부터 결과된 것이므로, 세개의 상이한 그룹의 NK 클론내 이들 분자의 발현 수준을 분석하였다. 특히 NKG2A 및 NKp30 (즉, NK-세포 매개 iDC 및 mDC의 용해를 유도하는데 주된 역할을 하는 유발 NCR)의 발현을 유의 깊게 분석하였다.
먼저, 그룹 A, B, 및 C에 속하는 NKG2A+KIR- 클론에 대해 NKG2A 표면 발현 수준을 평가하였다. 그룹 C에 속하는 NK 클론은 그룹 A 및 B에 비하여 매우 높은 수준으로 NKG2A를 발현하였다. 또한 그룹 A 클론은 그룹 B 클론에 비해 더 낮은 NKG2A 발현을 특징으로 하였다. 이러한 결과는 NKG2A 발현 수준과 iDC (및 mDC) 살해능간에는 역관계가 있음을 의미한다. iDC에서 발현되는 낮은 량의 HLA-E 분자는 높거나 낮은 수준의 NKG2A를 발현하는 NK 세포들에 의하여 상이하게 인지될 수 있는 반면, mDC (고 수준의 HLA-E를 발현하는)는 오직 매우 낮은 NKG2A 표면 밀도를 특징으로 하는 NK 클론에 의한 용해에만 감수성이 있다. NKp30 발현은 대부분의 분석된 NKG2A+ 클론에서 유사하였다. 이들 결과와 일치되게 항-HLA 클래스 I mAb 존재하에서의(즉 억제성 상호작용이 없는 경우), 그 iDC 살해능은 유의적인 차이를 나타내지 않았다.
논의. NKG2A+KIR- 세포들 사이에서 조차도 세포용해활성의 크기에는 이종성이 존재하였다. 이는 NKGA2의 표면 밀도와 역관계로 나타났다. 따라서, 저수준의 NKG2A를 발현하는 NK 클론(그룹 A)는 iDC 및 mDC 양자를 용해하는 반면, 고수준의 NKG2A를 발현하는 NK 클론은 오직, iDC 만을 살해하고, 몇몇 경우(NKG2Abright) iDC 및 mDC 모두 살해하지 못하였다.
특이하게, iDC에서의 HLA-E의 표면발현이 단핵구에 비하여 급격하게 감소되었으며, 반면 mDC에서는 부분적으로 회복되었다. 상반되게, iDC에서의 감소된 HLA-B 및 HLA-C의 표면 수준은 여전히 효과적으로 KIR3DL1 과 KIR2DL을 관여시키는데 충분하였다.
예기치않게 그룹 A에 속하는 작은 하부세트의 NK 세포 클론(5-10%)이 자가 mDC를 살해할 수 있음을 발견하였다. 이들 NK 클론은 자기반응성 KIR을 발현하지 않고 저 수준의 NKG2A를 특징으로 한다. 이로 인해 고수준의 NKG2A를 발현하는 NK 세포와 비하여, 이들 세포는 표적 세포상에서의 HLA-E의 하향 조절을 용이하게 인지할 수 있게 된다. 따라서 NKG2A를 저수준으로 갖는 NK 세포의 iDC에 대한 세포용해 활성은 항-HLA 클래스 I mAb의 존재하에서 증가되지 않는다. 한편, mDC의 경우(고수준의 HLA-E 발현), 항-HLA 클래스 I mAb의 첨가로 인하여 세포용해활성이 증 가되는데, 이는 만약 충분한 량의 수용체-리간드 상호작용이 있다면, 그룹 A 클론에 의해 발현되는 NKG2A 분자도 용해를 방해할 수 있다는 것을 가리킨다. mDC에서 어떤 정도의 이종성이 HLA-E 발현에 있어 존재하고, 가능하게 NKp30의 리간드의 발현에 있어서도 존재하는 것을 알 수 있다. NK 세포의 일 분획이 상이한 양의 HLA-E를 발현하는 세포들을 서로 분간할 수 있는 능력이 있다면, mDC 중에서 오직 일부라도 특정 하위 세트의 NK 세포에 대한 저항성을 부여하기에 충분한 표면 밀도의 HLA-E를 발현하는 것이 가능하다.
실시예 5. Z270 항- NKG2A mAb 은 NK 세포주의 미성숙 수지상세포에 대한 용해활성을 증가시킨다.
Z270는 NKG2A에 대한 마우스 IgG1 단클론항체이다. 그 아미노산 서열은 서열: 에 기재되어 있다. Z270은 마우스 항체이기 때문에, 인간 Fc 수용체와 결합하지 않으며, 따라서 인간 세포 시스템 또는 마우스 Fc 수용체를 갖는 세포가 없는 모든 시스템에서 본 발명의 활성화 항체로서 작용한다. 대조적으로, 마우스 Fc 수용체를 갖는 세포를 포함하는 시스템에서는 Z270는 그 IgGl 일정영역이 상기 Fc 수용체들과 결합하기 때문에, 본 발명의 억제성 항체로 작용한다.
NKG2A를 발현하는 인간 NK 세포 클론 및 미성숙 수지상세포(혈질세포상 수지상세포(plasmacytoid dendritic cells) 또는 골수성 수지상세포)는 표준 방법을 사용하여 제조하였다. 생성된 인간 NK 세포 클론 BH3, BHl 8 및 BH34의 용해활성을 자가 미성숙 수지상세포에 대해 테스트하였다. 각 클론들의 iDC에 대한 용해활성은 CD94 (IgM) 및 NKG2A (Z270, IgGl)에 대한 단클론 항체의 존재 또는 비존재하에 평행 시험하였다. 비교를 위해, 항-HLA 클래스 I 항체 존재 및 대조 IgGl(항-2B4 항체)의 존재하의 용해활성 또한 테스트하였다.
하기 표 1에 나타낸 바와 같이, NK 클론들은 항체 비존재 또는 대조항체 항-2B4 mAb의 존재하에서는 iDC를 용해하지 않았다. 그러나, 자가 iDC의 살해는 항-CD94, 항-NKG2A mAb Z270 또는 항-HLA 클래스 I mAb에 의하여 재구성될 수 있었다. 이 결과는 NKG2A 기능의 방해가 NK 세포의 iDC 용해를 재구성하는 것을 보여준다. 또한 단클론 Z270의 NKG2A 결합영역이 NKG2A의 억제성 기능을 차단할 수 있음을 보여준다.
[표 1] 자가 iDC의 용해
NK 클론 BH3 BH18 BH34
대조 용해 257 382 318
항 CD94 1341 2455 2376
항-NKG2A(Z270) 984 1977 2108
항-HLA 클래스 I 1397 2603 2498
항-2B4(대조 IgG1) 236 353 292
실시예 6. 항- NKG2A 항체를 사용한 자가 표적 세포 용해의 재구성
HLA-E을 발현하는 자가 PHA 블라스트 표적 세포에 대한 인간 NK 벌크 세포(NK bulk cells)의 세포용해활성을 항체 비존재, mAbZ199 존재하 또는 mAbZ270 존재하에서 테스트하였다. 세포용해 활성은 표준 4 시간 51Cr 방출시험으로 평가하였다. 모든 표적 세포는 마이트로적정플레이트의 각 웰에 3000 세포로 사용하였다. NK 세포수를 다양하게 하여 도 1에 나타낸 바와 같이 효과(effector)/표적(target) 비율(E/T 비율)이 약 0.01 - 100이 되도록 하였다.
항체 비존재시에는 NK 세포는 HLA-E를 발현하는 표적 세포에 대하여 어떠한세포용해활성도 나타내지 않았다. 그러나, 항-NKG2A 항체 Z270 (mlgGl 일정 영역을가짐) 또는 Z199 (mIgG2b 일정영역을 가짐)의 존재하에서는 NK 클론은 그들의 HLA-E 리간드를 인식할 수 없게 되어 PHA 블라스트 표적에 대하여 강력한 세포용해활성을 나타내었다. Z270는 마우스 IgGl 일정영역 및 Z199는 마우스 IgG2b 일정영역을 갖는다. 이들 중 어느 항체도 인간 Fc 수용체에 대해서는 그다지 결합하지 않는다.
유사하게, NK 벌크 세포의 HLA-E 양성 자가 PHA 블라스트 세포에 대한 살해 억제는 Z270 F(ab')2 단편을 이용하여 용이하게 반전되었으며(도 2), KIR2DL1 및 KIR2DL2,3을 통한 시글널링을 차단하는 항-KIR mAb DF200 또는 pan2D 또는 항체 W6/32에 의해 반전될 수 있었다. 또한 테스트된 조건(E/T ratio=l, 50μg/ml mAb)하에서 PHA 블라스트 세포는 NK 벌크 세포에 의해 살해되지 않았으나, 이 억제는 Z270 mAb 또는Z270 Fab 단편을 사용하여 반전될 수 있었다.
실시예 7. 사용 물질 및 방법
mAb . 하기 mAb을 자체 실험실에서 제조하여 사용하였다: JT3A(IgG2a, 항-CD3), AZ20 및 F252(각각 IgGl 및 IgM, 항-NKp30), cl27(IgGl, 항-CD16), c218 (IgGl, 항-CD56), EB6b (IgGl, 항-KIR2DLl 및 KIR2DS1), GL183(IgGl, 항-KIR2DL2, KIR2DL3 및 KIR2DS2), FES172 (IgG2a, 항-KIR2DS4), Z27(IgGl, 항-KIR3DLl), XA185 (IgGl, 항-CD94), Z199, Z270(IgG2b, 항-NKG2A), A6-136(IgM, 항-HLA 클래스 I), 131(IgGl, A3, All 및 A24을 포함하는 항-HLA-A 대립자) 및 E59/53(IgG2a, 항-HLA-A) [Ciccone 등, (1990) PNAS USA 87:9794-9797; Pende 등, (1998) J Immunol. 28:2384-2394]. mAb F4/326(IgG, 항-HLA-C) [Marsh 등, (1990) Tissue Antigens 36: 180-186], 116-5-28 (IgG2a, 항-HLA-Bw4 대립자) 및 126-39 (IgG3, 항-HLA-Bw6 대립자)[Dr K. Gelsthorpe로부터 제공받음, Sheffield, GB] (XII International HLA Workshop) 및 3D12(IgGl, 항-HLA-E) [Lee 등. (1998) J. Immunol. 160:4951 -4960][Dr. Daniel Geraghty로부터 제공받음, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA].
항-CDla(IgGl-PE), 항-CD14(IgG2a), 항-CD83(IgG2b) 및 항-CD86(IgG2b-PE) 는 Immunotech(Marseille, France)에서 구매하였다. D 1.12(IgG2a, 항-HLA-DR)mAb는 Dr R. S. Accolla(Pavia, Italy)로부터 제공받았으며, HP2.6(IgG2a, 항-CD4) mAb는 Dr P. Sanchez-Madrid(Madrid, Spain)로부터 제공받았다.
다클론 또는 단클론 NK 세포 집단의 제조.
PBL을 수득하기 위해, PBMC를 피콜-히파크 농도구획(Ficoll-Hypaque gradients)으로 분리하고 플라스틱 접착성 세포(plastic adherent cells)를 제거하였다. PBL을 항-CD3(JT3A), 항-CD4(HP2.6) 및 항-HLA-DR(D 1.12)mAb와 인큐베이션하고(4°C에서 30분), 이어 염소 항-마우스로 코팅된 디나비드(Dynal, Oslo, Norway)와 인큐베이션하고(4°C에서 30분) 및 면역자기적 제거(immunomagnetic depletion)를 시행하여 강화된 NK 세포를 분리하였다. CD3-CD4-HLA-DR-세포를 100 U/ml rIL-2(Proleukin, Chiron Corp., Emeryville, CA) 및 1.5 ng/ml PHA (Gibco Ltd, Paisley, GB)존재하에 방사선조사피더셀에서 배양하여 다클론 NK 세포 집단을 수득하였으며, 한계희석법(limiting dilution)에 의해 NK 세포 클론을 수득하였다.
DC 의 생성
PBMC는 건강한 공여자로부터 얻었으며, 플라스틱 접착성 세포를 IL-4 및 GMCSF (Peprotech, London, GB)의 존재하에서(최종 농도 각각 20 ng/ml 및 50 ng/ml)배양하였다. 배양 6일후 세포는 iDC에 해당하는 CD14-CDla+CD83- 표현형으로 특징되었다. CD14-CDla +CD83+CD86+ mDC를 생성하기 위하여, iDC를 최종 농도 1 ug/ml의 LPS (Sigma- Aldrich, St. Louis, MI)로 2일간 자극하였다.
유세포 분석 및 세포용해활성
한색상 또는 두색상의 유세포 분석((FACSCalibur, Becton Dickinson 및 Co., Mountain View, CA)을 위해, 세포를 적합한 mAb로 염색하고 이후 PE- or FITC-콘쥬게이트 개별형 특이적 염소 항-마우스 제2 시약으로 염색하였다(Southern Biotechnology Associated, Birmingham). 다클론 및 클론 NK 세포집단의 자가 DC 또는 이종 DC에 대한 세포용해활성을 4-시간[51Cr] -방출시험으로 테스트하였다. 마스킹 실험에서 첨가된 각종 mAb의 농도는 10 ug/ml이었다. E:T비는 지시된 대로 하였다.
실시예 8. Z270 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 키메라화
마우스 히브리도마주, Z270의 동결 세포 펠렛을 해동하고, the RNeasy Midi 키트(Qiagen cat. No. 75142)로 프로세싱하여 71μg의 전체 RNA를 분리하였다. 약 5 마이크로그램의 Z270 RNA를 Amersham Biosciences 1st strand synthesis 키트(Amersham Biosciences, Cat. No. 27-9261-01)로 역전사하여 Z270 cDNA를 제조하였다. 어떤 프라이머 짝이 가장 PCR에 적합한지를 결정하기 위하여, 다수의 상이한 IgH 프라이머를 일정영역 프라이머와 조합 사용하여 면역글로불린중쇄가변영역(VH) cDNA를 PCR로 증폭하였다. 유사하게 면역글로불린 카파쇄 가변영역(VK)도 카파 일정영역프라이머와 조합한 복수의 IgK 프라이머를 사용하여 증폭하였다.
각 중쇄 및 경쇄가변영역에 대한 적합한 프라이머를 동정하고, 대장균 TPOlO 박테리아로의 전환, 증폭 및 시퀀싱을 위해 개별적으로 pCR2.1®-TOPO vectors®에 리게이션하였다(BigDye® Terminator v3.0 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (ABI)사용). 중쇄가변영역의 DNA 서열(Z270 VH) 및 대응하는 아미노산서열을 서열 번호:1 및 서열 번호:2에 각각 기재하였다. 경쇄가변영역의 DNA 서열(Z270 VK) 및 대응하는 아미노산서열을 서열 번호:3 및 서열 번호:4에 각각 기재하였다.
Z270 VK의 키메라화를 위해 적합한 프라이머 및 PCR을 통하여 Hind III 제한부위, Kozak 번역개시부위 및 K2A/RFT2 kappa 리더서열을 5' 말단 및 스플라이스 도너 부위 및 Bam HI 제한부위를 Z270 VK DNA 서열의 3' 말단에 도입하였다. 생성되는 PCR 산물을 인간 카파 경쇄의 일정영역을 코딩하는 벡터에 클로닝하여 Z270 경쇄의 가변영역을 포함하는 전장 키메라경쇄를 코딩하도록 하였다. 생성되는 chZ270VK의 DNA 서열 및 대응하는 아미노산 서열을 각각 서열 번호:5 및 서열 번호:6에 기재하였다.
Z270 VH의 키메라화를 위해 적합한 프라이머 및 PCR을 통하여 Hind III 제한부위, Kozak 번역개시부위 및 A003 리더서열을 5' 말단에 도입하고, 천연 Apa I 제한 부위를 포함한 감마l C 영역의 5'말단을 Z270 VH DNA 서열의 3' 말단에 도입하였다. 생성되는 PCR 산물을 인간 IgGl 중쇄의 일정영역을 코딩하는 벡터에 클로닝하여 Z270 중쇄의 가변영역을 포함하는 전장 키메라 IgGl중쇄를 코딩하도록 하였다. 생성되는 chZ270VH의 DNA 서열 및 대응하는 아미노산 서열을 각각 서열 번호:7 및 서열 번호:8에 기재하였다.
생성된 중쇄 및 경쇄 함유 플라즈미드를 동시에 COS 7 세포에 전기천공으로 도입하여 Z270의 인간 IgGl -카파 키메라 구축물을 생산하였다.
실시예 9. 새로운 mAbs 의 생성
mAbs는 5 주령 BaIb C 마우스 NK 클론 SA260(CD94bright)를 면역하여 생성하였다. 상이한 세포 융합 후, 우선 mAbs Zl99 및 Z270를 Moretta 등., (1994) J. Exp. Med. 180:545에 기재된 대로 선택하였다. 휴지기 또는 활성화된 NK 세포 집단의 CD94 분자의 분포를 분석하기 위해 하나- 또는 두색상 형광 유세포 분석을 Moretta 등. (1994)에 기재된 대로 시행하였다.
NK 클론에 의한 용해 재구성 능력을 갖는 양성 단클론 항체를 스크리닝하였다. NK 클론의 세포용해활성은 표준 4시간 51Cr 방출시험으로 평가하였으며, 효과 NK 세포는 각종 HLA 클래스 I 유전자로 감염되거나 감염되지 않은 P815 마우스 세포주 또는 ClR 인간 세포주에 대해 테스트하였다. 다른 사용 표적 세포로서는 각종 HLA 클래스로 감염 되거나 감염되지 않은 인간 HLA-클래스 I-LCL 721.221 세포주이며 이는 Sivori 등. (1996) Eur . J. Immunol. 26: 2487-2492에 기재된 바와 같다.
실시예 10. PBL 의 정제 및 단클론 또는 클론 NK 세포주의 생성
PBL은 건강한 공여자로부터 피콜-히파크 농도구획하고, 플라스틱 접착성 세 포를 제거하여 수득하였다. 강화 NK 세포를 수득하기 위하여, PBL을 항-CD3, 항-CD4 및 항-HLA-DR mAb와 인큐베이션하고(4°C에서 30분), 이후 염소 항-마우스마그네틱 비드(Dynal) (4°C에서 30분)로 인큐베이션하고 관련 기술분야의 공지 방법으로 면역자기적 선택을 시행하였다(Pende 등., 1999). CD3-, CD4-, DR- 세포를 방사성조사 피더 세포 및 100 U/ml 인터루킨 2(Proleukin, Chiron Corporation) 및 1.5 ng/ml Phytohemagglutinin A(Gibco BRL)로 배양하여 다클론 NK 세포집단을 얻었다. 한계 희석법으로 NK 세포를 클로닝하고, NK 세포 클론에 대해 그 표면 수용체 발현을 유세포 분석법으로 분석하였다.
실시예 11. 항- NKG2a mAb 에 결합하는 개별적 수용체 발현을 동정하기 위한 원숭이 유래의 전혈의 염색.
물질
원숭이 혈액: 레시우스 및 시노몰거스 원숭이 혈액은 Centre de Primatologie, ULP, Strasbourg에서 구입하였다. 바분 원숭이 혈액은 Centre de Primatologie, CNRS, Station Rousset에서 구입하였다. 원숭이 혈액은 EDTA 및 소듐시트레이트 함유 "진공용기(vacutainer)"튜브에 수거하였다. 혈액은 수거후 24시간내 처리하였으며 실온 보관하였다.
항체: FITC-CD3, -CD4, -CD14,-CD20, 및 CyCr-CD45은 BD Pharmingen에서 구 입하였고, PC7-CD16는 Beckman Coulter에서 구입하였다; 이 모든 클론들은 원숭이 PBMC와 교차반응성이다. PE-GaM(Goat F(ab')2 단편 항-Mouse IgG(H+L)- PE), 및 OptiLyse® C 는 Beckman Coulter에서 구입하였다. 항-NKG2a mAb(clone Z270, mouse IgGl)는 lμg/ml로 사용하였다.
기타 시약: PBS (IX)는 Gibco Invitrogen에서; 마우스 혈청은 NMRI에서, 마우스는 Janvier에서; 포름알데하이드 37% 는 Sigma에서 구입하였다.
방법:
세포염색은 하기 프로토콜에 따라 시행하였다:
- lOOμl의 혈액 + lOμl의 1OX 정제 mAb
- 실온에서 30분간 진탕하면서 인큐베이션
- 3ml의 PBS로 세척 (1400 RPM lO분 실온)
- lOOμl의 PE-GaM 또는 PE-GaH 첨가, 최종 1:200, 볼텍싱
- 실온에서 30분간 진탕하면서 인큐베이션
- 3ml의 PBS로 세척 (1400 RPM lO분 실온)
- 50μl의 20% 마우스 혈청 첨가, 볼텍싱 및 10분간 인큐베이션
- 30μl 내지 60μl의 FITC-CD3,(-CD4,-CD14,-CD20), PC7-CD16, CyCr-CD45 혼합물 또는 lOμl의 각각의 대응되는 개별형 대조(isotypic control) 첨가
- 실온에서 30분간 진탕하면서 인큐베이션
- 500μl의 OptiLyse® C 첨가, 볼텍싱 및 10분간 인큐베이션
- 500μl의 PBS 첨가, 볼텍싱 및 10분간 인큐베이션
- 3ml의 PBS로 세척 (1400 RPM lO분 실온)
- 세포펠렛을 300μl PBS + 0.2% 포름알데하이드에 재현탁.
유세포 분석은 하기의 프로토콜에 따라 시행하였다:
-시료를 XL/MCL cytometer (Beckman Coulter)에 건다. 획득 및 분석은 EXPO™ 32 vl.2 software (Beckman Coulter)로 시행한다.
- 분석은 FSC 및 SSC 특징으로 동정되는 림프구에 촛점을 둔다.
- T 세포 또는 NK 세포 컴파트먼트의 분석:
T cells= CD3+ 림포구는 항-CD3 염색 히스토그램 Ly상 게이트의 양성세포로 정의.
NK cells= CD3-CD56+ 림포구는 CD3/CD56 dot plot의 CD3-CD56+ 게이트에 대응(4분면의 상부 좌측 파트).
결과
NKG2A 단클론 항체 Z270의 레시우스 원숭이, 시노몰거스 원숭이 및 바분에 대한 결합을 평가하였다. 시노몰거스 원숭이 벌크 NK 세포(16일, 300uml을 mAb (lμg/ml)와 4℃에서 30분간 인큐베이션하고, 세척한 후 PE-GaM로 4℃에서 20분간 표지하였다. 도 1은 시노몰거스 원숭이 NK 세포에 대한 결합 및 IgGl 및 항-CD 16 결 합을 보이며, Z270가 시노몰거스 원숭이 NK 세포에 결합함을 나타낸다. 마카카 뮬라타(레시우스 원숭이) NK 세포(전혈에서)를 mAb와 인큐베이션하고 세척하고 PE-GaM로 표지하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었으며, 클론 Z270가 레시우스 원숭이 NK 세포에 결합함을 나타낸다. 마지막으로 바분 NK 세포(전혈에서)를 mAb와 인큐베이션하고 세척하고 PE-GaM로 표지하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었으며, 클론 Z270가 바분 NK 세포에 결합함을 나타낸다.
실시예 12. 항- NKG2a mAb 에 결합하는 개별적 수용체 발현을 동정하기 위한 원숭이 유래의 전혈의 염색.
물질
레시우스 및 시노몰거스 원숭이에서 채취한 원숭이 혈액을 EDTA 및 소듐시트레이트 함유 튜브에 수거하였다. 항체: FITC-CD3, -CD4, -CD14,-CD20, 및 CyCr-CD45은 BD Pharmingen에서 구입하였고, PC7-CD16는 Beckman Coulter에서 구입하였다; 이 모든 클론들은 원숭이 PBMC와 교차반응성이다. PE-GaM (Goat F(ab')2 단편 항-Mouse IgG (H+L)- PE), 및 OptiLyse® C 는 Beckman Coulter에서 구입하였다. 기타 시약: PBS (IX)는 Gibco Invitrogen에서; 포름알데하이드 37% 는 Sigma에서 구입하였다.
방법:
세포염색은 하기 프로토콜에 따라 시행하였다:
lOOμl의 전혈(EDTA) + l1μl의 mAb 용액, Z270 또는 Z199 (lOμg/ml) 또는 개별형 대조, 실온에서 30분간 인큐베이션
● PBS로 세척, lOOμl의 PE- 또는 FITC GaM (최종 1/200) 첨가 및 실온에서 30분간 방치
● PBS로 세척, 50μl 마우스 혈청 20% 첨가, 60μl의 FITC-항-CD3,- CD4, -CD14, -CD20, CyCr-CD45, PC7-CD16 첨가 및 실온에서 30분간 방치
● 500μl의 optilyseC 첨가, 실온에서 10분간 방치
● 500μl의 PBS 첨가 및 실온에서 10분간 방치
● PBS 및 0.2% Formaldehyde로 세척
● CD45bright 소세포 (CD45/SSC)에 대해 포커스 분석한 후 CD16+ CD3-CD4- CD14-CD20- 세포 포커스 분석
결과
NKG2A 단클론 항체 Z270 및 Z199의 레시우스 원숭이 NK 세포 및 시노몰거스 원숭이 NK 세포에 대한 결합을 평가하고 비교하였다. 시노몰거스 원숭이 벌크 NK 세포(16일, 300uml을 mAb (lμg/ml)와 4℃에서 30분간 인큐베이션하고, 세척한 후 PE-GaM로 4℃에서 20분간 표지하였다. 표 4는 Z199 및 Z270 모두 시노몰거스 원숭이 NK 세포에 대해 결합함을 보여주며, IgGl 및 항-CD 16 결합도 보이며, Z199 및Z270 양자 모두 시노몰거스 원숭이 NK 세포에 결합함을 보여준다. 마카카 뮬라타 (레시우스 원숭이) NK 세포(전혈에서)를 mAb와 인큐베이션하고 세척하고 PE-GaM로 표지하였다. 그 결과를 표 5에 나타내었으며, 클론 Z199 및 Z270 모두가 레시우스 원숭이 NK 세포에 결합함을 나타낸다. Z199가 시노몰거스 원숭이 NKG2A 뿐 아니라 NKG2C에도 결합하는 것이 보고된 바 있고(Biassoni 등, (2005) J. Immunol. 174: 5695-5705, 도 5 및 6 참조), 또한 여기에서 이 mAb가 재시행된 살해 시험에서 P815 표적 세포 용해의 증가를 초래함이 발견되었다. 상기 표적세포 용해 증가는 인간 NK 세포에서 관찰된 것과 상반되며 억제성 수용체 NKG2A에 대한 예상 결과와도 상반되었다. 요컨대 이론에 구애받음 없이 본 발명자들은 Zl99가 시노몰거스 원숭이에서 활성화 수용체 NKG2C를 통해 작용하는 것을 제안한다. Z270 또한 시노몰거스 원숭이 세포와 결합하며 재시행된 살해시험에서 P815 표적세포의 용해 증가를 초래하였는데, 이는 Z270 역시 시노몰거스 원숭이의 NKG2C를 인식하는 것을 의미한다.
그러나, 염색된 세포 퍼센트 및 형광의 강도 모두에서 상기 두 mAbs의 동일종(예를 들어 시노몰거스)에서의 결합 수준은 매우 상이하였다. 이는 두 항체가 NKG2A 에피토프에 상이하게 결합함을 의미한다.
[표 2]
Figure 112007055174845-PCT00001
[표 3]
Figure 112007055174845-PCT00002
[표 4] 레시우스 원숭이의 말초 전혈에서 수득한 NK 세포 하부세트의 분석
Figure 112007055174845-PCT00003
[표 5] 시노몰거스 원숭이의 말초 전혈에서 수득한 NK 세포 하부세트의 분석
Figure 112007055174845-PCT00004
본 명세서에 인용된 모든 간행물과 특허출원은 본 명세서에서 각각이 특별히 그리고 개별적으로 참조로서 삽입되는 것과 동일하게 참조로서 삽입된다.
본 발명은 명확한 이해를 위하여 도시 및 실시예로 기재하였으나, 본 발명의 교시는 본 발명의 정신 및 첨부되는 범위의 범위에 입각하여 약간의 변경 및 개선이 이루어질 수 있음은 본 분야의 숙련자에 명백할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> INNATE PHARMA S.A. UNIVERSITA DI GENOVA <120> Monoclonal antibodies against NKG2A <130> IP2007940/FR <150> US 60/639,832 <151> 2004-12-28 <150> US 60/639,465 <151> 2004-12-28 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 396 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(372) <400> 1 cag gtc caa ctg cag cag cct ggg gct gag ctg gtg agg cct ggg gct 48 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag ctg tcc tgc aag gct tct ggc tac acg ttc acc agc tac 96 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 tgg atg aac tgg gtt aag cag agg cct gag caa ggc ctt cag tgg att 144 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Gln Trp Ile 35 40 45 gga agg att gat cct tac gat agt gaa act cac tac agt caa aag ttc 192 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 aag gac aag gcc ata ttg act gta gac aaa tcc tcc agc aca gcc tac 240 Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg cga ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct gcg gtc tat tac tgt 288 Met Arg Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga ggg ggc tat gat ttc gac gta gga act ctc tac tgg ttc ttc 336 Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe 100 105 110 gat gtc tgg ggc gca ggg acc acg gtc acc gtc tcc tcagcctcca 382 Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 ccaagggccc atcg 396 <210> 2 <211> 124 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Gln Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Arg Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe 100 105 110 Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 <210> 3 <211> 472 <212> DNA <213> synthetic <220> <221> CDS <222> (2)..(448) <400> 3 c gcc aag ctt gcc gcc acc atg gga tgg aac tat atc atc ctc ttc ttg 49 Ala Lys Leu Ala Ala Thr Met Gly Trp Asn Tyr Ile Ile Leu Phe Leu 1 5 10 15 tta gca aca gct aca tgt gtc cac tcc cag gtc caa ctg cag cag cct 97 Leu Ala Thr Ala Thr Cys Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro 20 25 30 ggg gct gag ctg gtg agg cct ggg gct tca gtg aag ctg tcc tgc aag 145 Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys 35 40 45 gct tct ggc tac acg ttc acc agc tac tgg atg aac tgg gtt aag cag 193 Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln 50 55 60 agg cct gag caa ggc ctt cag tgg att gga agg att gat cct tac gat 241 Arg Pro Glu Gln Gly Leu Gln Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp 65 70 75 80 agt gaa act cac tac agt caa aag ttc aag gac aag gcc ata ttg act 289 Ser Glu Thr His Tyr Ser Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr 85 90 95 gta gac aaa tcc tcc agc aca gcc tac atg cga ctc agc agc ctg aca 337 Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Arg Leu Ser Ser Leu Thr 100 105 110 tct gag gac tct gcg gtc tat tac tgt gca aga ggg ggc tat gat ttc 385 Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe 115 120 125 gac gta gga act ctc tac tgg ttc ttc gat gtc tgg ggc gca ggg acc 433 Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr 130 135 140 acg gtc acc gtc tcc tcagcctcca ccaagggccc atcg 472 Thr Val Thr Val Ser 145 <210> 4 <211> 149 <212> PRT <213> synthetic <400> 4 Ala Lys Leu Ala Ala Thr Met Gly Trp Asn Tyr Ile Ile Leu Phe Leu 1 5 10 15 Leu Ala Thr Ala Thr Cys Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro 20 25 30 Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys 35 40 45 Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln 50 55 60 Arg Pro Glu Gln Gly Leu Gln Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp 65 70 75 80 Ser Glu Thr His Tyr Ser Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr 85 90 95 Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Arg Leu Ser Ser Leu Thr 100 105 110 Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe 115 120 125 Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr 130 135 140 Thr Val Thr Val Ser 145 <210> 5 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 5 gac atc cag atg act cag tct cca gcc tcc cta tct gca tct gtg gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gaa act gtc acc atc aca tgt cga gca agt gag aat att tac agt tat 96 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 tta gca tgg tat cag cag aaa cag gga aaa tct cct cag ttc ttg gtc 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Phe Leu Val 35 40 45 tat aat gca aaa acc tta gca gaa ggt gtg cca tca agg ttc agt ggc 192 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tca ggc aca cag ttt tct ctg aag atc aac agc ctg cag cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt ggg agt tat tac tgt caa cat cac tat ggt act cct cgg 288 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Arg 85 90 95 acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa cgtgagtgga tcccg 336 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 6 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Phe Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 7 <211> 415 <212> DNA <213> synthetic <220> <221> CDS <222> (2)..(400) <400> 7 c gcc aag ctt gcc gcc acc atg agt gtg ctc act cag gtc ctg gcg ttg 49 Ala Lys Leu Ala Ala Thr Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu 1 5 10 15 ctg ctg ctg tgg ctt aca ggt gcc aga tgt gac atc cag atg tct cag 97 Leu Leu Leu Trp Leu Thr Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Ser Gln 20 25 30 act cca gcc tcc cta tct gca tct gtg gga gaa act gtc acc atc aca 145 Thr Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr 35 40 45 tgt cga gca agt gag aat att tac agt tat tta gca tgg tat cag cag 193 Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 aaa cag gga aaa tct cct cag ttc ttg gtc tat aat gca aaa acc tta 241 Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Phe Leu Val Tyr Asn Ala Lys Thr Leu 65 70 75 80 gca gaa ggt gtg cca tca agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca cag 289 Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln 85 90 95 ttt tct ctg aag atc aac agc ctg cag cct gaa gat ttt ggg agt tat 337 Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr 100 105 110 tac tgt caa cat cac tat ggt act cct cgg acg ttc ggt gga ggc acc 385 Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr 115 120 125 aag ctg gaa atc aaa cgtgagtgga tcccg 415 Lys Leu Glu Ile Lys 130 <210> 8 <211> 133 <212> PRT <213> synthetic <400> 8 Ala Lys Leu Ala Ala Thr Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Trp Leu Thr Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Ser Gln 20 25 30 Thr Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr 35 40 45 Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Phe Leu Val Tyr Asn Ala Lys Thr Leu 65 70 75 80 Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln 85 90 95 Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr 100 105 110 Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr 115 120 125 Lys Leu Glu Ile Lys 130

Claims (58)

  1. a) NKG2A에 특이적으로 결합하고;
    b) Fc 수용체에 특이적으로 결합하지 않으며; 및
    c) 인간 NK 세포상의 NKG2A에 결합된 경우, 상기 NK 세포가 그 표면에 HLA-E 또는 QaIb를 갖는 표적 인간 세포와 접촉시, 상기 NK 세포가 상기 표적세포를 용해시키는 것을 특징으로 하는 단클론 항체 또는 그 단편.
  2. 제1항에 있어서, NKG2C 또는 NKG2E에는 특이적으로 결합하지 않는 것을 특징으로 하는 단클론 항체 또는 그 단편.
  3. 제2항에 있어서, NKG2A에의 결합에 있어서 Z199 또는 Z270와 완전 경합하는 것을 특징으로 하는 단클론 항체 또는 그 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 영장류 NKG2A에 결합하는 것을 특징으로 하는 단클론 항체 또는 그 단편.
  5. 제4항에 있어서, 비인간 영장류 NK 세포상의 NKG2A에 결합된 경우, 상기 NK 세포가 그 표면에 HLA-E를 갖는 표적 비인간 영장류 세포와 접촉시, 상기 NK 세포 가 상기 표적 세포를 용해시키는 것을 특징으로 하는 단클론 항체 및 그 단편.
  6. 제3항에 있어서, 서열 번호:2의 아미노산서열을 포함하는 단클론 항체 또는 그 단편.
  7. 제3항에 있어서, 서열 번호:6의 아미노산서열을 포함하는 단클론 항체 또는 그 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 Fc 수용체에 결합하지 않도록 개질된 마우스 또는 인간 IgG1 영역을 포함하는 단클론 항체 또는 그 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 항체 또는 인간화 항체인 단클론 항체 또는 그 단편.
  10. 제9항에 있어서, 상기 항체가 인간 IgG4 일정 영역을 포함하는 단클론 항체 또는 그 단편.
  11. 제9항에 있어서, 서열 번호:3을 포함하는 핵산 서열에서 제조되는 것인 단클론 항체 또는 그 단편.
  12. 제9항에 있어서, 서열 번호:7을 포함하는 핵산 서열에서 제조되는 것인 단클론 항체 또는 그 단편.
  13. a) 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 단클론 항체 또는 그 단편; 및
    b) 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제;를 포함하는 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 단클론 항체 또는 그 단편이 NKG2C 또는 NKG2E에 특이적으로 결합하지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 조성물이 약학적 용도로 제형화된 것인 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 화학요법제, 호르몬제, 혈관신생억제제 또는 아폽토시스제를 포함하는 암치료에 사용되는 치료제; 항바이러스 화합물을 포함하는 염증질환 치료에 사용되는 치료제; 자가면역질환, 염증질환 및 이식거부의 치료와 같은 기타 면역치료에 사용되는 치료제; 사이토킨; 사이토킨 억제제; 면역조절제; 보조화합물; 조혈성장인자; 활성화 NK 세포 수용제에 대한 작용제, 또는 억제성 NK 세포 수용체에 대한 길항제에서 선택되는 제2 치료제를 추가적으로 포함하는 조성물.
  17. 그 표면에 NKG2A를 갖는 것을 특징으로 하는 NK 세포 및 그 표면에 HLA-E 또는 QaIb 를 갖는 것을 특징으로 하는 표적 세포를 포함하는 집단에서 NK 세포-매개 표적 세포 용해를 재구성하는 방법으로서,
    제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 단클론 항체 또는 그 단편을 상기 NK 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는, NK 세포-매개 표적 세포 용해를 재구성하는 방법.
  18. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 NK 세포가 인간 세포이며, 상기 표적 세포가 수지상 세포, 암세포, 바이러스 감염 세포로 이루어진 군에서 선택되는 인간 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제15항에 따른 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 환자에 있어 자가면역 질환 또는 염증 질환을 치료하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 면역억제제, 코티코스테로이드, TNF 억제제, NCR 자극 화합물, KIR 억제성 수용체의 억제제, TGF-beta 1 억제제, 사이토킨 억제제, 조혈성장인자, 진통제 또는 항염증제에서 선택된 제2 치료제를 투여하는 단계를 추가적으로 포함하고,
    상기 제2 치료제는 개별 투여 형태 또는 상기 조성물의 일부분으로서 투여되는, 자가면역 질환 또는 염증 질환을 치료하는 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 자가면역 또는 염증질환은 자가면역 용혈성 빈혈, 악성빈혈, 결절다발동맥염, 전신홍반루푸스, 베게너 육아종, 자가면역 간염, 베체트병, 크론병, 원발성 담관성 간경화, 피부경화증, 궤양성 대장염, 쇼그렌 증후군, 제1형 당뇨병, 포도막염, 그레이브스 병, 갑상선염, 제1형 당뇨병, 심근염, 류머티스열, 피부경화증, 강직척추염, 류머티스성 관절염, 사구체신염, 사르코이드증, 피부근육염, 중증근육무력증, 다발근육염, 급성특발다발신경염, 다발경화증, 원형탈모증, 천포창/유사천포창, 건선, 및 백반증으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  22. 환자에 있어 암을 치료하는 방법으로서, 상기 암은 그 표면에 HLA-E 또는 QaIb 를 발현하는 암세포의 존재를 특징으로 하고, 상기 방법은 상기 환자에 제15항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법.
  23. 제22항에 있어서, 항암제 또는 항구토제에서 선택되는 제2 치료제를 상기 환자에 투여하는 단계를 더 포함하고, 상기 제2 치료제는 개별 투여 형태 또는 상기 조성물의 일부분으로서 투여되는, 암 치료 방법.
  24. 환자에 있어 바이러스 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 바이러스 질환은 그 표면에 HLA-E 또는 QaIb 를 발현하는 바이러스 감염 세포의 존재를 특징으로 하고, 상기 방법은 상기 환자에 제15항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 바이러스 질환 치료 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 환자에게 항바이러스제를 투여하는 단계를 더 포함하고, 상기 항바이러스제는 개별 투여 형태 또는 상기 조성물의 일부분으로서 투여되는, 바이러스 질환 치료 방법.
  26. a) 환자에 제15항에 따른 조성물을 환자에 투여하는 단계; 및
    b) 상기 환자에 항원을 투여하는 단계;를 포함하는 환자에 항원에 대한 내성 을 유발하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 자가 면역 질환 또는 알레르기에서 선택되는 질환을 치료하는데 사용되는 것인, 환자에 항원에 대한 내성 유발 방법.
  28. 제15항에 따른 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 조혈세포의 생착을 개선하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 환자에게 항암제, 또는 조혈성장인자에서 선택되는 제2 치료제를 투여하는 단계를 더 포함하고, 상기 제2 치료제는 개별 투여 형태 또는 상기 조성물의 일부분으로서 투여되는, 환자에서 조혈세포의 생착을 개선하는 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 환자는 백혈병 환자인, 환자에서 조혈세포의 생착을 개선하는 방법.
  31. a) 그 표면에 NKG2A를 갖는 것을 특징으로 하는 비인간 영장류 세포 또는 비인간 영장류 NKG2A 폴리펩티드에 항체를 접촉시키는 단계; 및
    b) 상기 항체의 상기 세포 또는 폴리펩티드에의 결합 및 그들의 활성에 영향을 주는 능력을 평가하는 단계;를 포함하는, 인간 NKG2A에 대한 항체 평가 방법.
  32. 제31항에 있어서,
    a) 그 표면에 NKG2A를 갖는 것을 특징으로 하는 비인간 영장류 NK 세포 및 그 표면에 HLA-E가 존재하는 것을 특징으로 하는 표적세포를 포함하는 세포 집단에 항체를 접촉시키는 단계; 및
    b) 상기 표적 세포가 용해되었는지를 결정하는 평가 단계;를 포함하는, 인간 NKG2A에 대한 항체 평가 방법.
  33. a) 인간 NKG2A를 포함하는 조성물로 비인간 포유동물을 면역하는 단계;
    b) NKG2A에는 결합하나, NKG2C 또는 NKG2E에는 결합하지 않는 단클론 항체를 선택하는 단계;
    c) 상기 항체를 인간에서 사용하기 적합하게 하는 단계;
    d) 상기 항체를 비인간 영장류에 투여하는 단계; 및
    e) 상기 항체의 상기 영장류에서의 생체 내 NKG2A에 대한 결합능 및 상기 영장류의 상기 항체에 대한 내성을 평가하는 단계;를 포함하고,
    상기 항체가 결합하고, 비인간영장류가 내성이다는 평가는 상기 항체가 인간에서의 질병 치료에 사용되기에 적당한 것임을 나타내는 것인, 인간에서의 질병 치료에 사용되기에 적합한 항체의 제조 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 d) 단계 전에 상기 항체를 Fc 수용체에 결합할 수 없도록 개질시키는 단계를 추가적으로 포함하는, 인간에서의 질병 치료에 사용되기에 적합한 항체의 제조 방법.
  35. 제33항 또는 제34항에 따른 방법으로 제조되는 항체.
  36. a) 항체의 투여량 또는 투여빈도를 다양하게 한 일련의 투여 요법을 사용하여 비인간 영장류에 상기 항체를 투여하는 단계; 및
    b) 각 투여 요법에 대한 상기 영장류의 내성 및 상기 비인간 영장류에서의 NKG2A-발현 세포의 활성을 결정하는 단계;를 포함하고, 상기 요법에 상기 영장류가 내성이고, NKG2A-발현 세포의 활성에 검출가능한 조절이 초래된다는 결정은 상기 투여요법이 인간에서 사용되기에 적합한 것임을 나타내는 것인, 인간 NKG2A에 대한 치료적 항체에 대해 적합한 투여 요법을 동정하는 방법.
  37. a) 인간 NKG2A에 특이적으로 결합하고;
    b) Fc 수용체에 특이적으로 결합하며;
    c) 인간 NKG2C 또는 인간 NKG2E에 결합하지 않으며,
    d) Z270 또는 Zl99와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하고;
    e) NK 세포의 NK 세포-감수성인 표적 세포의 용해를 억제할 수 있으며,
    Zl99가 아닌 것을 특징으로 하는, 단클론 항체 또는 그 단편.
  38. 제37항에 있어서, 비인간 영장류 NKG2A에 결합하는 것을 특징으로 하는 단클론 항체 또는 그 단편.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 서열 번호:2의 아미노산서열을 포함하는 단클론 항체 또는 단편.
  40. 제37항 또는 제38항에 있어서, 서열 번호:6의 아미노산서열을 포함하는 단클론 항체 또는 단편.
  41. 제37 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 항체 또는 인간화 항체인 단클론 항체 또는 단편.
  42. 제41항에 있어서, 서열 번호:3을 포함하는 핵산서열로부터 제조되는 것인 단클론 항체 또는 그 단편.
  43. 제41항에 있어서, 서열 번호:7을 포함하는 핵산서열로부터 제조되는 것인 단클론 항체 또는 그 단편.
  44. 제41항에 있어서, 상기 항체는
    a) 서열 번호:2의 아미노산서열이 인간 IgGl쇄 일정영역에 융합된 중쇄; 및
    b) 서열 번호:6의 아미노산서열이 인간 카파쇄 일정영역에 융합된 경쇄;를 포함하는 단클론 항체.
  45. 제40항에 있어서, 상기 항체가 Z270인 단클론 항체.
  46. 제1항 내지 제12항, 제37항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 항체; 및 세포독성제를 포함하는 콘쥬게이트.
  47. a) 제37항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 단클론 항체 또는 그 단편, Z199 또는 46항에 따른 콘쥬게이트에서 선택되는 유효량의 단클론 항체 또는 그 단편, 및
    b) 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물.
  48. 제47항에 있어서, 약학적 용도로 제형화된 것인 조성물.
  49. 제48항에 있어서, 화학요법제, 호르몬제, 혈관신생억제제 또는 아폽토시스제를 포함하는 암치료에 사용되는 치료제; 항바이러스 화합물을 포함하는 염증질환 치료에 사용되는 치료제; 자가면역질환, 염증질환 및 이식거부의 치료와 같은 기타 면역치료에 사용되는 치료제; 사이토킨; 사이토킨 억제제; 인슐린; 면역조절제; 보조화합물; 활성화 NK 세포 수용제에 대한 길항제; 또는 억제성 NK 세포 수용체에 대한 작용제에서 선택되는 제2 치료제를 추가적으로 포함하는 조성물.
  50. 제37 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 단클론 항체 또는 그 단편, 또는 제46항에 따른 콘쥬게이트를 NK 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는, NK 세포 살해, NK 세포 활성 감소, NK 세포 증식 감소, NK 세포 용해에 감수성인 세포 용해 방지, 또는 집단내 NK 세포수 감소 방법.
  51. 제48항에 따른 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함하는, NK 세포 과잉활 성 또는 NK 세포 과잉 증식을 특징으로 하는 질환으로 고통받는 환자의 치료 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 질환이 NK-타입 LDGL인 치료 방법.
  53. 제48항에 따른 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함하는, I형 당뇨병으로 고통받는 환자의 치료 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 환자에 인슐린을 투여하는 단계를 추가적으로 포함하며, 상기 인슐린은 개별 투여 형태 또는 상기 조성물의 일부분으로서 투여되는 치료 방법.
  55. 제1항 내지 제12항, 제37항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 항체; 및 검출가능한 마커를 포함하는 콘쥬게이트.
  56. 제55항에 있어서, 상기 검출가능한 마커가 방사성 동위원소, 형광성 염료, 항체-항원 짝(NKG2A에 대한 항체를 제외)의 일 구성원, 렉틴-탄수화물 짝의 일 구성원, 아비딘, 비오틴, 수용체-리간드 짝의 일 구성원, 또는 분자적으로 프린트된 폴리머-프린트 분자 시스템의 일 구성원에서 선택되는 것인 콘쥬게이트.
  57. a) 제55항에 따른 콘쥬게이트; 및
    b) NKG2A-함유 물질;을 포함하는 키트.
  58. a) 제55항에 따른 콘쥬게이트를 NKG2A-함유 물질에 접촉시키는 단계;
    b) 상기 NKG2 A-함유 물질에 결합된 검출가능한 마커의 양을 정량하는 단계;
    c) 제55항의 콘쥬게이트 및 항체를 상기 NKG2A-함유 물질에 접촉시키는 단계;
    d) 상기 항체 존재하에서 상기 NKG2A-함유 물질에 결합된 검출가능한 마커의 양을 정량하는 단계;
    e) 상기 b) 단계에서 정량된 검출 가능한 마커의 양과 상기 d) 단계에서 정량된 양을 비교하여 상기 항체가 상기 NKG2A-함유 물질과 결합하는지 여부를 결정하는 단계;를 포함하는, 항체의 NKG2A에 대한 결합을 검출하는 방법.
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