KR20060130604A

KR20060130604A - Ｆｃ 영역 변이체

Info

Publication number: KR20060130604A
Application number: KR1020067013897A
Authority: KR
Inventors: 바레트 더블유. 알란; 데이비드 매튜 마르퀴스; 잉 탕; 제프리 딘 와트킨스
Original assignee: 어플라이드 몰리큘라 에볼류션, 인코포레이티드
Priority date: 2004-01-12
Filing date: 2005-01-10
Publication date: 2006-12-19
Also published as: DK1706424T3; ES2328369T3; CA2552788C; EP1706424A1; PL1706424T3; CY1109382T1; US20080089892A1; JP2008502590A; EP1706424B1; UA86605C2; DE602005015542D1; AU2005206473A1; NO339745B1; EA200601313A1; BRPI0506771A; EP2154157A2; PT1706424E; SI1706424T1; EA009746B1; NO20063624L

Abstract

본 발명은 폴리펩티드 Fc 영역 변이체 및 Fc 영역 변이체를 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 구체적으로 언급하면, 본 발명은 신규한 Fc 영역 변이체를 포함하는 조성물; 유용한 Fc 영역 변이체를 확인하는 방법; 및 질환을 치료하기 위해 Fc 영역 변이체를 이용하는 방법을 제공한다.

Fc 영역 변이체, 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC), 보체-의존성 세포독성 (CDC)

Description

Ｆｃ 영역 변이체 {Fc region variants}

본 발명은 폴리펩티드 Fc 영역 변이체 및 Fc 영역 변이체를 암호화하는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 구체적으로 언급하면, 본 발명은 신규한 Fc 영역 변이체를 포함하는 조성물; 유용한 Fc 영역 변이체를 확인하는 방법; 및 (예를 들어, 질환을 치료하기 위해) Fc 영역 변이체를 이용하는 방법을 제공한다.

인간에게는 5가지 유형의 면역글로불린이 있다. 이들 군은 IgG, IgM, IgD, IgA, 및 IgE로서 공지되어 있고 중쇄 유전자의 이소형 (각각, 감마, 뮤, 델타, 알파 및 엡실론)을 기준으로 하여 구별한다. 가장 흔한 이소형이 IgG이며, 이는 2개의 동일한 중쇄 폴리펩티드와 2개의 동일한 경쇄 폴리펩티드로 구성된다 (도 1 참고). 2개의 중쇄는 디설파이드 결합에 의해 서로 공유적으로 결합되고, 각 경쇄는 디설파이드 결합에 의해 중쇄에 연결되어 있다 (도 1 참고). 각 중쇄는 대략 445개 아미노산 잔기를 함유하고, 각 경쇄는 대략 215개 아미노산 잔기를 함유한다.

각 중쇄는 일반적으로 가변 도메인 (VH), 불변 중쇄 도메인 1 (CH1), 불변 중쇄 도메인 2 (CH2), 및 불변 중쇄 도메인 3 (CH3)으로서 지칭되는 4개의 별개의 도메인을 함유하고 있다 (도 1 참고). CH1 도메인과 CH2 도메인은 Ig에 가요성을 제공해 주는 힌지 (hinge) 영역 (도메인간 부문)에 의해 연결되어 있다. 각 경쇄 는 일반적으로 가변 경쇄 (VL) 및 불변 경쇄 (CL)로서 지칭되는 2개의 별개의 도메인을 함유하고 있다.

중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 직접 결합하고, Igs의 다양성과 특이성에 대해 책임이 있다. 각 VL 및 VH는 3개의 상보성-결정 영역 (CDRs; 초가변 영역으로서 공지되기도 함)을 갖는다. VL과 VH가 중쇄 및 경쇄의 상호 작용을 통하여 연합되는 경우에는, CDRs이 항원과 접촉하게 되는 결합성 표면을 형성한다.

가변 영역은 항원 결합에 관여하는 반면, 중쇄 불변 도메인, 주로 CH2 및 CH3은 비-항원 결합 기능에 관여한다. 일반적으로 Fc 영역으로서 공지된 상기 영역은 중요한 많은 기능을 나타낸다. 예를 들어, Fc 영역은 포식작용 (phagocytosis) 또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 촉발시킬 수 있는 보체와 결합한다. Fc 영역은 또한, 포식작용 또는 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 촉발시킬 수 있는 Fc 수용체와 결합하기도 한다. Fc 영역은 또한, 순환시 면역글로불린을 유지시키는데 도움을 주는 역할을 하고, 면역글로불린을 정제시키기 위해 통상 사용되고 있는 단백질 A와 상호 작용한다.

최근에는 항체의 항원 결합성 특징과 면역원성 특성을 개선시키고자 하는 노력들이 있었다. 예를 들어, 면역요법에 사용하기 위한 모노클로날, 키메라 및 인간화 항체가 개발되었다. 인간 면역요법에 사용하도록 승인된 항체의 예가 상응하는(해당) 질환과 함께 다음과 같이 기재된다: RITUXAN (림프종), SYNAGIS (감염성 질환), ZENEPAX (신장 이식술), REMICADE [크론병 (Crohn's disease) 및 류마티스성 관절염], HERCEPTIN (유방 암종), 및 EDRECOLOMAB (결장암). 그러나, 임상 시 도에 참여시킨 수 많은 항체는 효능이 없었거나 기타 관련 문제점으로 인해 승인을 받지 못하였다.

부가의 치료적 항체의 효능을 개선시키고 이의 승인을 촉진시키기 위해 필요한 것은, 특성이 개선된 변이체 폴리펩티드를 생성시키도록 Fc 영역을 변경시키기 위한 조성물 및 방법이다.

발명의 요약

본 발명은 폴리펩티드 Fc 영역 변이체, 및 Fc 영역 변이체 및 그의 일부를 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 구체적으로 언급하면, 본 발명은 신규한 Fc 영역 변이체를 포함하는 조성물; 유용한 Fc 영역 변이체를 확인하는 방법; 및 Fc 영역 변이체를 이용하는 방법을 제공한다.

몇몇 양태에서, 본 발명은 Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체 (또는 이러한 변이체를 암호화하는 핵산 서열)를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변이체는 효과기 (effector) 세포의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 247에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 특정 양태에서는, 변이체가 항체 (예: 항-CD20 항체)를 포함한다. 바람직한 양태에서는, 아미노산 변형이 P247L이다.

기타 양태에서, 본 발명은 Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체 (또는 이러한 변이체를 암호화하는 핵산 서열)를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변이체는 효과기 세포의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으 로 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 251에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 특정 양태에서는, 변이체가 항체 (예: 항-CD20 항체)를 포함한다. 바람직한 양태에서는, 아미노산 변형이 L251F이다.

기타 양태에서, 본 발명은 Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체 (또는 이러한 변이체를 암호화하는 핵산 서열)를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변이체는 효과기 세포의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 256에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 특정 양태에서는, 변이체가 항체 (예: 항-CD20 항체)를 포함한다. 바람직한 양태에서는, 아미노산 변형이 T256M이다.

기타 양태에서, 본 발명은 Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체 (또는 이러한 변이체를 암호화하는 핵산 서열)를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변이체는 효과기 세포의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 268에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 특정 양태에서는, 변이체가 항체 (예: 항-CD20 항체)를 포함한다. 바람직한 양태에서는, 아미노산 변형이 H268E이다.

기타 양태에서, 본 발명은 Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체 (또는 이러한 변이체를 암호화하는 핵산 서열)를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변이체는 효과기 세포의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 280에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 특정 양태에서는, 변이체가 항체 (예: 항-CD20 항체)를 포함한다. 바람직한 양태에서는, 아미노산 변형이 D280A이다.

기타 양태에서, 본 발명은 Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체 (또는 이러한 변이체를 암호화하는 핵산 서열)를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변이체는 효과기 세포의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 330에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 특정 양태에서는, 변이체가 항체 (예: 항-CD20 항체)를 포함한다. 바람직한 양태에서는, 아미노산 변형이 A330K이다.

기타 양태에서, 본 발명은 Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체 (또는 이러한 변이체를 암호화하는 핵산 서열)를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변이체는 효과기 세포의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 332에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 특정 양태에서는, 변이체가 항체 (예: 항-CD20 항체)를 포함한다. 바람직한 양태에서는, 아미노산 변형이 I332E이다.

기타 양태에서, 본 발명은 Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체 (또는 이러한 변이체를 암호화하는 핵산 서열)를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변이체는 효과기 세포의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 339에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 특정 양태에서는, 변이체가 항체 (예: 항-CD20 항체)를 포함한다. 바람직한 양태에서는, 아미노산 변형이 A339T이다.

기타 양태에서, 본 발명은 Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체 (또는 이러한 변이체를 암호화하는 핵산 서열)를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변이체는 전혈 검정에서 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 표적 세포 (예: B 세포)의 고갈을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 378에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 특정 양태에서는, 변이체가 항체 (예: 항-CD20 항체)를 포함한다. 바람직한 양태에서는, 아미노산 변형이 A378D이다.

기타 양태에서, 본 발명은 Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체 (또는 이러한 변이체를 암호화하는 핵산 서열)를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변이체는 효과기 세포의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 440에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 특정 양태에서는, 변이체가 항체 (예: 항-CD20 항체)를 포함한다. 바람직한 양태에서는, 아미노산 변형이 S440Y이다.

몇몇 양태에서, 본 발명은 서열 15에 나타낸 서열을 포함하는 펩티드 (P247L 아미노산 변형을 함유함)를 제공한다. 기타 양태에서, 본 발명은 P247L 변형을 수반한 CH2 영역을 암호화하는 핵산 서열 (예: 서열 40)을 제공한다. 몇몇 양태에서, 본 발명은 서열 15를 포함하는 P247L 변형을 수반한 CH2 영역을 암호화하는 아미노산 서열을 제공한다. 특정 양태에서, 본 발명은 서열 16에 나타낸 서열을 포함하는 펩티드 (L251F 변형을 함유함)를 제공한다. 부가 양태에서, 본 발명은 L251F 변형을 수반한 CH2 영역을 암호화하는 핵산 서열 (예: 서열 41)을 제공한다. 부가 양태에서, 본 발명은 서열 16을 포함하는 L251F 변형을 수반한 CH2 영역을 암호화하는 아미노산 서열을 제공한다.

몇몇 양태에서, 본 발명은 서열 17에 나타낸 서열을 포함하는 펩티드 (T256M 아미노산 변형을 함유함)를 제공한다. 기타 양태에서, 본 발명은 T256M 변형을 수반한 CH2 영역을 암호화하는 핵산 서열 (예: 서열 42)을 제공한다. 몇몇 양태에서, 본 발명은 서열 17을 포함하는 T256M 변형을 수반한 CH2 영역을 암호화하는 아미노산 서열을 제공한다. 특정 양태에서, 본 발명은 서열 20에 나타낸 서열을 포함하는 펩티드 (H268E 변형을 함유함)를 제공한다. 부가 양태에서, 본 발명은 H268E 변형을 수반한 CH2 영역을 암호화하는 핵산 서열 (예: 서열 45)을 제공한다. 부가 양태에서, 본 발명은 서열 20을 포함하는 H268E 변형을 수반한 CH2 영역을 암호화하는 아미노산 서열을 제공한다.

몇몇 양태에서, 본 발명은 서열 21에 나타낸 서열을 포함하는 펩티드 (D280A 아미노산 변형을 함유함)를 제공한다. 기타 양태에서, 본 발명은 D280A 변형을 수반한 CH2 영역을 암호화하는 핵산 서열 (예: 서열 46)을 제공한다. 몇몇 양태에서, 본 발명은 서열 21을 포함하는 D280A 변형을 수반한 CH2 영역을 암호화하는 아미노산 서열을 제공한다. 특정 양태에서, 본 발명은 서열 23에 나타낸 서열을 포함하는 펩티드 (A330K 변형을 함유함)를 제공한다. 부가 양태에서, 본 발명은 A330K 변형을 수반한 CH2 영역을 암호화하는 핵산 서열 (예: 서열 48)을 제공한다. 부가 양태에서, 본 발명은 서열 23을 포함하는 A330K 변형을 수반한 CH2 영역을 암호화하는 아미노산 서열을 제공한다.

몇몇 양태에서, 본 발명은 서열 26에 나타낸 서열을 포함하는 펩티드 (I332E 아미노산 변형을 함유함)를 제공한다. 기타 양태에서, 본 발명은 I332E 변형을 수 반한 CH2 영역을 암호화하는 핵산 서열 (예: 서열 51)을 제공한다. 몇몇 양태에서, 본 발명은 서열 26을 포함하는 I332E 변형을 수반한 CH2 영역을 암호화하는 아미노산 서열을 제공한다. 특정 양태에서, 본 발명은 서열 29에 나타낸 서열을 포함하는 펩티드 (A339T 변형을 함유함)를 제공한다. 부가 양태에서, 본 발명은 A339T 변형을 수반한 CH2 영역을 암호화하는 핵산 서열 (예: 서열 54)을 제공한다. 부가 양태에서, 본 발명은 서열 29를 포함하는 A339T 변형을 수반한 CH2 영역을 암호화하는 아미노산 서열을 제공한다.

몇몇 양태에서, 본 발명은 서열 30에 나타낸 서열을 포함하는 펩티드 (A378D 아미노산 변형을 함유함)를 제공한다. 기타 양태에서, 본 발명은 A378D 변형을 수반한 CH2 영역을 암호화하는 핵산 서열 (예: 서열 55)을 제공한다. 몇몇 양태에서, 본 발명은 서열 30을 포함하는 A378D 변형을 수반한 CH2 영역을 암호화하는 아미노산 서열을 제공한다.

몇몇 양태에서, 본 발명은 서열 31에 나타낸 서열을 포함하는 펩티드 (S440Y 아미노산 변형을 함유함)를 제공한다. 기타 양태에서, 본 발명은 S440Y 변형을 수반한 CH2 영역을 암호화하는 핵산 서열 (예: 서열 56)을 제공한다. 몇몇 양태에서, 본 발명은 서열 31을 포함하는 S440Y 변형을 수반한 CH2 영역을 암호화하는 아미노산 서열을 제공한다.

몇몇 양태에서, 본 발명은 Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체 (또는 이러한 변이체를 암호화하는 핵산 서열)를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변이체는 P247H, P247I 및 P247L 중에서 선택된, Fc 영역 내의 위치 247에서의 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 기타 양태에서, 본 발명은 Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체 (또는 이러한 변이체를 암호화하는 핵산 서열)를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변이체는 L251F 중에서 선택된, Fc 영역 내의 위치 251에서의 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 기타 양태에서, 본 발명은 Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체 (또는 이러한 변이체를 암호화하는 핵산 서열)를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변이체는 T256M 및 T256P 중에서 선택된, Fc 영역 내의 위치 256에서의 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 기타 양태에서, 본 발명은 Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체 (또는 이러한 변이체를 암호화하는 핵산 서열)를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변이체는 H268D 및 H268E 중에서 선택된, Fc 영역 내의 위치 268에서의 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 기타 양태에서, 본 발명은 Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체 (또는 이러한 변이체를 암호화하는 핵산 서열)를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변이체는 D280A 및 D280K 중에서 선택된, Fc 영역 내의 위치 280에서의 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 기타 양태에서, 본 발명은 Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체 (또는 이러한 변이체를 암호화하는 핵산 서열)를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변이체는 A330K 및 A330R 중에서 선택된, Fc 영역 내의 위치 330에서의 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 기타 양태에서, 본 발명은 Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체 (또는 이러한 변이체를 암호화하는 핵산 서열)를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변 이체는 I332D 및 I332E 중에서 선택된, Fc 영역 내의 위치 332에서의 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 기타 양태에서, 본 발명은 Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체 (또는 이러한 변이체를 암호화하는 핵산 서열)를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변이체는 A339T 중에서 선택된, Fc 영역 내의 위치 339에서의 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 기타 양태에서, 본 발명은 Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체 (또는 이러한 변이체를 암호화하는 핵산 서열)를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변이체는 A378D 중에서 선택된, Fc 영역 내의 위치 378에서의 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 기타 양태에서, 본 발명은 Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체 (또는 이러한 변이체를 암호화하는 핵산 서열)를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변이체는 S440Y 중에서 선택된, Fc 영역 내의 위치 440에서의 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다.

몇몇 양태에서, 본 발명은 Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변이체는 효과기 세포의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 247에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 기타 양태에서, 본 발명은 a) i) Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체 (이러한 변이체는 효과기 세포의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 247에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다)를 포함하는 조성물; 및 ii) 특정 질 환의 한 가지 이상 증상을 나타내는 대상체를 제공하는 단계; 및 b) 이들 증상 중의 적어도 한 가지가 저하되도록 하는 조건 하에 상기 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서는, 변이체가 항체 또는 면역부착인자를 포함하고, 대상체가 항체 또는 면역부착인자 반응성 질환 증상을 나타낸다.

특정 양태에서는, 변이체가 Fc 영역의 적어도 일부 (예: 아미노산 변형을 함유하는 Fc 영역의 40%, 50%, 60%, 80% 또는 90% 이상)를 포함한다. 몇몇 양태에서는, 폴리펩티드 변이체가 CH2 또는 CH3 영역을 포함한다. 추가 양태에서는, 조성물이 서열 13을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 양태에서는, 조성물이 서열 14를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 양태에서는, 조성물이 서열 15를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태에서는, 조성물이 서열 38 및/또는 서열 39 및/또는 서열 40을 포함하는 핵산 서열 또는 그의 보체, 또는 고도로 엄격한 조건 하에 서열 38, 39 또는 40과 결합하는 서열을 포함한다. 추가 양태에서, 본 발명은 서열 38 및/또는 서열 39 및/또는 서열 40을 포함하는 숙주 세포 (예: CHO 세포) 및 벡터를 제공한다. 특정 양태에서, 본 발명은 서열 13, 14, 15, 38, 39 또는 40의 표현물을 암호화하는 컴퓨터 판독 가능한 매체를 제공한다.

특정 양태에서는, 폴리펩티드 변이체가 효과기 세포의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개한다. 몇몇 양태에서는, 폴리펩티드 변이체가 항체 또는 항체 단편 (예: 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 Fc 단편)을 포함한다. 몇몇 양태에서는, 모 폴리펩티드가 인간 IgG Fc 영역을 포함한다. 부가 양태에서는, 모 폴리펩티드가 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역을 포함한다. 기타 양태에서는, 모 폴리펩티드가 서열 1 내지 12 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다.

바람직한 양태에서는, 아미노산 변형이 P247H, P247I 또는 P247L이다. 특정 양태에서는, 폴리펩티드 변이체가 Fc 영역 내에 제2, 제3, 제4 등의 아미노산 변형을 포함한다 (표 1 참고). 몇몇 양태에서는, 변이체가 CHO-발현된 폴리펩티드이다.

몇몇 양태에서, 본 발명은 Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변이체는 효과기 세포의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 251에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 기타 양태에서, 본 발명은 a) i) Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체 (이러한 변이체는 효과기 세포의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 251에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다)를 포함하는 조성물; 및 ii) 특정 질환의 한 가지 이상 증상을 나타내는 대상체를 제공하는 단계; 및 b) 이들 증상 중의 적어도 한 가지가 저하되도록 하는 조건 하에 상기 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서는, 변이체가 항체 또는 면역부착인자를 포함하고, 대상체가 항체 또는 면역부착인자 반응성 질환 증상을 나타낸다.

특정 양태에서는, 변이체가 Fc 영역의 적어도 일부 (예: 아미노산 변형을 함유하는 Fc 영역의 40%, 50%, 60%, 80% 또는 90% 이상)를 포함한다. 몇몇 양태에서는, 폴리펩티드 변이체가 CH2 또는 CH3 영역을 포함한다. 추가 양태에서는, 조성물이 서열 16을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태에서는, 조성물이 서열 41을 포함하는 핵산 서열 또는 그의 보체, 또는 고도로 엄격한 조건 하에 서열 41과 결합하는 서열을 포함한다. 추가 양태에서, 본 발명은 서열 41을 포함하는 숙주 세포 (예: CHO 세포) 및 벡터를 제공한다. 특정 양태에서, 본 발명은 서열 16 또는 41의 표현물을 암호화하는 컴퓨터 판독 가능한 매체를 제공한다.

바람직한 양태에서는, 아미노산 변형이 L251F이다. 특정 양태에서는, 폴리펩티드 변이체가 Fc 영역 내에 제2, 제3, 제4 등의 아미노산 변형을 포함한다 (표 1 참고). 몇몇 양태에서는, 변이체가 CHO-발현된 폴리펩티드이다.

몇몇 양태에서, 본 발명은 Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변이체는 효과기 세포의 존재 하 에, 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 256에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 기타 양태에서, 본 발명은 a) i) Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체 (이러한 변이체는 효과기 세포의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 256에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다)를 포함하는 조성물; 및 ii) 특정 질환의 한 가지 이상 증상을 나타내는 대상체를 제공하는 단계; 및 b) 이들 증상 중의 적어도 한 가지가 저하되도록 하는 조건 하에 상기 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서는, 변이체가 항체 또는 면역부착인자를 포함하고, 대상체가 항체 또는 면역부착인자 반응성 질환 증상을 나타낸다.

특정 양태에서는, 변이체가 Fc 영역의 적어도 일부 (예: 아미노산 변형을 함유하는 Fc 영역의 40%, 50%, 60%, 80% 또는 90% 이상)를 포함한다. 몇몇 양태에서는, 폴리펩티드 변이체가 CH2 또는 CH3 영역을 포함한다. 추가 양태에서는, 조성물이 서열 17을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 양태에서는, 조성물이 서열 18을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태에서는, 조성물이 서열 42 및/또는 서열 43을 포함하는 핵산 서열 또는 그의 보체, 또는 고도로 엄격한 조건 하에 서열 42 또는 43과 결합하는 서열을 포함한다. 추가 양태에서, 본 발명은 서열 42 및/또는 서열 43을 포함하는 숙주 세포 (예: CHO 세포) 및 벡터를 제공한다. 특정 양태에서, 본 발명은 서열 17, 18, 42 또는 43의 표현물을 암호화하는 컴퓨터 판독 가능한 매체를 제공한다.

바람직한 양태에서는, 아미노산 변형이 T256M 또는 T256P이다. 특정 양태에서는, 폴리펩티드 변이체가 Fc 영역 내에 제2, 제3, 제4 등의 아미노산 변형을 포함한다 (표 1 참고). 몇몇 양태에서는, 변이체가 CHO-발현된 폴리펩티드이다.

몇몇 양태에서, 본 발명은 Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변이체는 효과기 세포의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 268에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 기타 양태에서, 본 발명은 a) i) Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체 (이러한 변이체는 효과기 세포의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 268에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다)를 포함하는 조성물; 및 ii) 특정 질환의 한 가지 이상 증상을 나타내는 대상체를 제공하는 단계; 및 b) 이들 증상 중 의 적어도 한 가지가 저하되도록 하는 조건 하에 상기 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서는, 변이체가 항체 또는 면역부착인자를 포함하고, 대상체가 항체 또는 면역부착인자 반응성 질환 증상을 나타낸다.

특정 양태에서는, 변이체가 Fc 영역의 적어도 일부 (예: 아미노산 변형을 함유하는 Fc 영역의 40%, 50%, 60%, 80% 또는 90% 이상)를 포함한다. 몇몇 양태에서는, 폴리펩티드 변이체가 CH2 또는 CH3 영역을 포함한다. 추가 양태에서는, 조성물이 서열 19를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 양태에서는, 조성물이 서열 20을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태에서는, 조성물이 서열 44 및/또는 서열 45를 포함하는 핵산 서열 또는 그의 보체, 또는 고도로 엄격한 조건 하에 서열 44 또는 45와 결합하는 서열을 포함한다. 추가 양태에서, 본 발명은 서열 44 및/또는 서열 45를 포함하는 숙주 세포 (예: CHO 세포) 및 벡터를 제공한다. 특정 양태에서, 본 발명은 서열 19, 20, 44 또는 45의 표현물을 암호화하는 컴퓨터 판독 가능한 매체를 제공한다.

몇몇 양태에서, 본 발명은 Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변이체는 효과기 세포의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 332에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 특정 양태에서는, 하나 이상의 아미노산 변형이 I332K 또는 I332R이다.

특정 양태에서는, 폴리펩티드 변이체가 효과기 세포의 존재 하에, 모 폴리펩 티드 보다 더 효과적으로 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개한다. 몇몇 양태에서는, 폴리펩티드 변이체가 항체 또는 항체 단편 (예: 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 Fc 단편)을 포함한다. 몇몇 양태에서는, 모 폴리펩티드가 인간 IgG Fc 영역을 포함한다. 부가 양태에서는, 모 폴리펩티드가 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역을 포함한다. 기타 양태에서는, 모 폴리펩티드가 서열 1 내지 12 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다.

바람직한 양태에서는, 아미노산 변형이 H268D 또는 H268E이다. 특정 양태에서는, 폴리펩티드 변이체가 Fc 영역 내에 제2, 제3, 제4 등의 아미노산 변형을 포함한다 (표 1 참고). 몇몇 양태에서는, 변이체가 CHO-발현된 폴리펩티드이다.

몇몇 양태에서, 본 발명은 Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변이체는 효과기 세포의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 280에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 기타 양태에서, 본 발명은 a) i) Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체 (이러한 변이체는 효과기 세포의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 280에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다)를 포함하는 조성물; 및 ii) 특정 질환의 한 가지 이상 증상을 나타내는 대상체를 제공하는 단계; 및 b) 이들 증상 중의 적어도 한 가지가 저하되도록 하는 조건 하에 상기 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서는, 변이체가 항체 또는 면역 부착인자를 포함하고, 대상체가 항체 또는 면역부착인자 반응성 질환 증상을 나타낸다.

특정 양태에서는, 변이체가 Fc 영역의 적어도 일부 (예: 아미노산 변형을 함유하는 Fc 영역의 40%, 50%, 60%, 80% 또는 90% 이상)를 포함한다. 몇몇 양태에서는, 폴리펩티드 변이체가 CH2 또는 CH3 영역을 포함한다. 추가 양태에서는, 조성물이 서열 21을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 양태에서는, 조성물이 서열 22를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태에서는, 조성물이 서열 46 및/또는 서열 47을 포함하는 핵산 서열 또는 그의 보체, 또는 고도로 엄격한 조건 하에 서열 46 또는 47과 결합하는 서열을 포함한다. 추가 양태에서, 본 발명은 서열 46 및/또는 서열 47을 포함하는 숙주 세포 (예: CHO 세포) 및 벡터를 제공한다. 특정 양태에서, 본 발명은 서열 21, 22, 46 및 47의 표현물을 암호화하는 컴퓨터 판독 가능한 매체를 제공한다.

바람직한 양태에서는, 아미노산 변형이 D280A 또는 D280K이다. 특정 양태에 서는, 폴리펩티드 변이체가 Fc 영역 내에 제2, 제3, 제4 등의 아미노산 변형을 포함한다 (표 1 참고). 몇몇 양태에서는, 변이체가 CHO-발현된 폴리펩티드이다.

몇몇 양태에서, 본 발명은 Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변이체는 효과기 세포의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 330에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 기타 양태에서, 본 발명은 a) i) Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체 (이러한 변이체는 효과기 세포의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 330에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다)를 포함하는 조성물; 및 ii) 특정 질환의 한 가지 이상 증상을 나타내는 대상체를 제공하는 단계; 및 b) 이들 증상 중의 적어도 한 가지가 저하되도록 하는 조건 하에 상기 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서는, 변이체가 항체 또는 면역부착인자를 포함하고, 대상체가 항체 또는 면역부착인자 반응성 질환 증상을 나타낸다.

특정 양태에서는, 변이체가 Fc 영역의 적어도 일부 (예: 아미노산 변형을 함유하는 Fc 영역의 40%, 50%, 60%, 80% 또는 90% 이상)를 포함한다. 몇몇 양태에서는, 폴리펩티드 변이체가 CH2 또는 CH3 영역을 포함한다. 추가 양태에서는, 조성물이 서열 23을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 양태에서는, 조성물이 서열 24를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태에서는, 조성물이 서열 48 및/또는 서열 49를 포함하는 핵산 서열 또는 그의 보체, 또는 고도로 엄격한 조건 하에 서열 48 또는 49와 결합하는 서열을 포함한다. 추가 양태에서, 본 발명은 서열 48 및/또는 서열 49를 포함하는 숙주 세포 (예: CHO 세포) 및 벡터를 제공한다. 특정 양태에서, 본 발명은 서열 23, 24, 48 및 49의 표현물을 암호화하는 컴퓨터 판독 가능한 매체를 제공한다.

바람직한 양태에서는, 아미노산 변형이 A330K 또는 A330R이다. 특정 양태에서는, 폴리펩티드 변이체가 Fc 영역 내에 제2, 제3, 제4 등의 아미노산 변형을 포함한다 (표 1 참고). 몇몇 양태에서는, 변이체가 CHO-발현된 폴리펩티드이다.

몇몇 양태에서, 본 발명은 Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변이체는 효과기 세포의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 332에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 기타 양태에서, 본 발명은 a) i) Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체 (이러한 변이체는 효과기 세포의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 332에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다)를 포함하는 조성물; 및 ii) 특정 질환의 한 가지 이상 증상을 나타내는 대상체를 제공하는 단계; 및 b) 이들 증상 중의 적어도 한 가지가 저하되도록 하는 조건 하에 상기 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서는, 변이체가 항체 또는 면역부착인자를 포함하고, 대상체가 항체 또는 면역부착인자 반응성 질환 증상을 나타낸다.

특정 양태에서는, 변이체가 Fc 영역의 적어도 일부 (예: 아미노산 변형을 함유하는 Fc 영역의 40%, 50%, 60%, 80% 또는 90% 이상)를 포함한다. 몇몇 양태에서는, 폴리펩티드 변이체가 CH2 또는 CH3 영역을 포함한다. 추가 양태에서는, 조성물이 서열 25를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 양태에서는, 조성물이 서열 26을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태에서는, 조성물이 서열 50 및/또는 서열 51을 포함하는 핵산 서열 또는 그의 보체, 또는 고도로 엄격한 조건 하에 서열 50 또는 51과 결합하는 서열을 포함한다. 추가 양태에서, 본 발명은 서열 50 및/또는 서열 51을 포함하는 숙주 세포 (예: CHO 세포) 및 벡터를 제공한다. 특정 양태에서, 본 발명은 서열 25, 26, 50 및 51의 표현물을 암호화하는 컴퓨터 판독 가능한 매체를 제공한다.

바람직한 양태에서는, 아미노산 변형이 I332D 또는 I332E이다. 특정 양태에서는, 폴리펩티드 변이체가 Fc 영역 내에 제2, 제3, 제4 등의 아미노산 변형을 포함한다 (표 1 참고). 몇몇 양태에서는, 변이체가 CHO-발현된 폴리펩티드이다.

몇몇 양태에서, 본 발명은 Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변이체는 효과기 세포의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 339에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 기타 양태에서, 본 발명은 a) i) Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체 (이러한 변이체는 효과기 세포의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 339에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다)를 포함하는 조성물; 및 ii) 특정 질환의 한 가지 이상 증상을 나타내는 대상체를 제공하는 단계; 및 b) 이들 증상 중의 적어도 한 가지가 저하되도록 하는 조건 하에 상기 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서는, 변이체가 항체 또는 면역부착인자를 포함하고, 대상체가 항체 또는 면역부착인자 반응성 질환 증상을 나타 낸다.

특정 양태에서는, 변이체가 Fc 영역의 적어도 일부 (예: 아미노산 변형을 함유하는 Fc 영역의 40%, 50%, 60%, 80% 또는 90% 이상)를 포함한다. 몇몇 양태에서는, 폴리펩티드 변이체가 CH2 또는 CH3 영역을 포함한다. 추가 양태에서는, 조성물이 서열 29를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태에서는, 조성물이 서열 54를 포함하는 핵산 서열 또는 그의 보체, 또는 고도로 엄격한 조건 하에 서열 54와 결합하는 서열을 포함한다. 추가 양태에서, 본 발명은 서열 54를 포함하는 숙주 세포 (예: CHO 세포) 및 벡터를 제공한다. 특정 양태에서, 본 발명은 서열 29 또는 54의 표현물을 암호화하는 컴퓨터 판독 가능한 매체를 제공한다.

바람직한 양태에서는, 아미노산 변형이 A339T이다. 특정 양태에서는, 폴리펩티드 변이체가 Fc 영역 내에 제2, 제3, 제4 등의 아미노산 변형을 포함한다 (표 1 참고). 몇몇 양태에서는, 변이체가 CHO-발현된 폴리펩티드이다.

몇몇 양태에서, 본 발명은 Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변이체는 전혈 검정에서 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 표적 세포의 고갈을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 378에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 기타 양태에서, 본 발명은 a) i) Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체 (이러한 변이체는 전혈 검정에서 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 표적 세포의 고갈을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 378에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다)를 포함하는 조성물; 및 ii) 특정 질환의 한 가지 이상 증상을 나타내는 대상체를 제공하는 단계; 및 b) 이들 증상 중의 적어도 한 가지가 저하되도록 하는 조건 하에 상기 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서는, 변이체가 항체 또는 면역부착인자를 포함하고, 대상체가 항체 또는 면역부착인자 반응성 질환 증상을 나타낸다.

특정 양태에서는, 변이체가 Fc 영역의 적어도 일부 (예: 아미노산 변형을 함유하는 Fc 영역의 40%, 50%, 60%, 80% 또는 90% 이상)를 포함한다. 몇몇 양태에서는, 폴리펩티드 변이체가 CH2 또는 CH3 영역을 포함한다. 추가 양태에서는, 조성물이 서열 30을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태에서는, 조성물이 서열 55를 포함하는 핵산 서열 또는 그의 보체, 또는 고도로 엄격한 조건 하에 서열 55와 결합하는 서열을 포함한다. 추가 양태에서, 본 발명은 서열 55를 포함하는 숙주 세포 (예: CHO 세포) 및 벡터를 제공한다. 특정 양태에서, 본 발명은 서열 30 또는 55의 표현물을 암호화하는 컴퓨터 판독 가능한 매체를 제공한다.

특정 양태에서는, 폴리펩티드 변이체가 전혈 검정에서 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 표적 세포의 고갈을 매개한다. 몇몇 양태에서는, 폴리펩티드 변이체가 항체 또는 항체 단편 (예: 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 Fc 단편)을 포함한다. 몇몇 양태에서는, 모 폴리펩티드가 인간 IgG Fc 영역을 포함한다. 부가 양태에서는, 모 폴리펩티드가 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역을 포함한다. 기타 양태에서는, 모 폴리펩티드가 서열 1 내지 12 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 양태에서는, 아미노산 변형이 A378D이다. 특정 양태에서는, 폴리펩티드 변이체가 Fc 영역 내에 제2, 제3, 제4 등의 아미노산 변형을 포함한다 (표 1 참고). 몇몇 양태에서는, 변이체가 CHO-발현된 폴리펩티드이다.

몇몇 양태에서, 본 발명은 Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변이체는 효과기 세포의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 440에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 기타 양태에서, 본 발명은 a) i) Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체 (이러한 변이체는 효과기 세포의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 440에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다)를 포함하는 조성물; 및 ii) 특정 질환의 한 가지 이상 증상을 나타내는 대상체를 제공하는 단계; 및 b) 이들 증상 중의 적어도 한 가지가 저하되도록 하는 조건 하에 상기 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서는, 변이체가 항체 또는 면역 부착인자를 포함하고, 대상체가 항체 또는 면역부착인자 반응성 질환 증상을 나타낸다.

특정 양태에서는, 변이체가 Fc 영역의 적어도 일부 (예: 아미노산 변형을 함유하는 Fc 영역의 40%, 50%, 60%, 80% 또는 90% 이상)를 포함한다. 몇몇 양태에서는, 폴리펩티드 변이체가 CH2 또는 CH3 영역을 포함한다. 추가 양태에서는, 조성물이 서열 31을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태에서는, 조성물이 서열 56을 포함하는 핵산 서열 또는 그의 보체, 또는 고도로 엄격한 조건 하에 서열 56과 결합하는 서열을 포함한다. 추가 양태에서, 본 발명은 서열 56을 포함하는 숙주 세포 (예: CHO 세포) 및 벡터를 제공한다. 특정 양태에서, 본 발명은 서열 31 또는 56의 표현물을 암호화하는 컴퓨터 판독 가능한 매체를 제공한다.

바람직한 양태에서는, 아미노산 변형이 S440Y이다. 특정 양태에서는, 폴리펩티드 변이체가 Fc 영역 내에 제2, 제3, 제4 등의 아미노산 변형을 포함한다 (표 1 참고). 몇몇 양태에서는, 변이체가 CHO-발현된 폴리펩티드이다.

추가 양태에서는, 조성물이 Fc 영역의 적어도 일부를 포함하는 모 폴리펩티드의 변이체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는데, 이러한 변이체는 효과기 세포의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 247, 251, 256, 268, 280, 330, 332, 339, 378 또는 440, 또는 그의 조합 위치에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 몇몇 양태에서는, 조성물이 효과기 세포의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하는 변이체 Fc 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는데, 이러한 변이체 Fc 폴리펩티드는 아미노산 위치 247, 251, 256, 268, 280, 330, 332, 339, 378 또는 440, 또는 그의 조합 위치에서 아미노산 변형을 포함한다.

추가 양태에서는, 조성물이 Fc 영역의 적어도 일부를 포함하는 모 폴리펩티드의 변이체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는데, 이러한 변이체는 전혈 검정에서 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 표적 세포의 고갈을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 247, 251, 256, 268, 280, 330, 332, 339, 378 또는 440, 또는 그의 조합 위치에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 몇몇 양태에서는, 조성물이 전혈 검정에서 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 표적 세포의 고갈을 매개하는 변이체 Fc 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는데, 이러한 변이체 Fc 폴리펩티드는 아미노산 위치 247, 251, 256, 268, 280, 330, 332, 339, 378 또는 440, 또는 그의 조합 위치에서 아미노산 변형을 포함한다.

특정 양태에서, 본 발명의 변이체, 및 이러한 변이체를 암호화하는 핵산 서 열은 한 가지 이상의 기타 성분과 함께 키트에 제공된다. 예를 들어, 키트는 한 가지 이상 유형의 변이체와, 이러한 변이체를 사용하는 것에 관한 서면 지시사항을 포함할 수 있다. 키트는 완충제, 및 기타 유용한 시약을 함유할 수도 있다.

몇몇 양태에서, 본 발명은 a) i) 표적 항원 (예: CD20)을 발현하는 세포, ii) Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체 (이러한 변이체는 Fc 영역 내에 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다)를 포함하는 조성물; 및 iii) 효과기 세포 (예를 들어, 인간 공여자(들)로부터의 강화 PBMCs)를 제공하는 단계; b) (예를 들어, 세포 표면 상에 발현된 리간드를 통하여) 상기 변이체가 표적 세포와 결합하도록 하는 조건 하에 표적 세포를 상기 조성물 및 효과기 세포와 접촉시키는 단계; 및 c) 표적 세포의 사멸(률) (예를 들어, LDH 또는 크롬 51의 방출)을 측정하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

기타 양태에서, 본 발명은 a) i) 표적 항원을 발현하는 세포 (예를 들어, CD20을 발현하는 B 세포)를 함유하는 전혈 샘플 및 ii) Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 변이체 (이러한 변이체는 Fc 영역 내에 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다)를 포함하는 조성물을 제공하는 단계; b) (예를 들어, 세포 표면 상에 발현된 CD20 리간드를 통하여) 상기 변이체가 표적 세포와 결합하도록 하는 조건 하에 표적 세포를 상기 조성물과 접촉시키는 단계; 및 c) 표적 세포의 소멸(률)을 측정하는 단계 (예를 들어, CD19와 같은 기타 B 세포 마커를 이용한 Facs 분석)를 포함하는 방법을 제공한다.

몇몇 양태에서, 본 발명은 a) i) 표적 세포, ii) Fc 영역을 갖는 모 폴리펩 티드의 후보 변이체 (이러한 후보 변이체는 Fc 영역 내에 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하고, 후보 변이체는 제1 종의 효과기 세포의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 표적 세포 세포독성을 매개한다)를 포함하는 조성물; 및 iii) 제2 종 효과기 세포를 제공하는 단계; b) 후보 변이체가 표적 세포와 결합함으로써 후보 변이체 결합된 표적 세포가 생성되도록 하는 조건 하에 상기 조성물을 표적 세포와 함께 항온 배양하는 단계; c) 제2 종 효과기 세포와 후보 변이체 결합된 표적 세포를 혼합하는 단계; d) (예를 들어, 후보 변이체에 의해 매개된) 표적 세포 세포독성을 측정하는 단계; 및 e) 후보 변이체가 제2 종 효과기 세포의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 표적 세포 세포독성을 매개하는지를 결정하는 단계를 포함하여, 이중-종 (dual-species) 개선된 변이체를 확인 (동정)하는 방법을 제공한다. 몇몇 양태에서는, 상기 방법이 제2 종 효과기 세포를 이용하여 동일한 방식으로 모 폴리펩티드를 스크리닝하는 단계를 추가로 포함한다. 추가 양태에서는, 단계 b) 및 c)를 동시에 수행한다. 특정한 양태에서는, 상기 방법이 f) 제2 종 효과기 세포의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 표적 세포 세포독성을 매개하는 이중-종 개선된 변이체로서 후보 변이체를 확인 (동정)하는 단계를 추가로 포함한다. 기타 양태에서는, 상기 방법이 f) 제2 종 효과기 세포의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 약 1.2배 (또는 약 1.5배, 5배 또는 약 10배) 더 효과적으로 표적 세포 세포독성을 매개하는 (예를 들어, 약 1.2배 더 많은 표적 세포 용해가 관찰된다) 이중-종 개선된 변이체로서 후보 변이체를 확인 (동정)하는 단계를 추가로 포함한다.

기타 양태에서, 본 발명은 a) i) 표적 세포, ii) Fc 영역을 갖는 모 폴리펩티드의 후보 변이체 (이러한 후보 변이체는 Fc 영역 내에 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다)를 포함하는 조성물; iii) 제1 종 효과기 세포; 및 iv) 제2 종 효과기 세포를 제공하는 단계; b) 후보 변이체가 표적 세포와 결합함으로써 후보 변이체 결합된 표적 세포가 생성되도록 하는 조건 하에 상기 조성물을 표적 세포와 함께 항온 배양하는 단계; c) 제1 종 효과기 세포와 후보 변이체 결합된 표적 세포를 혼합하는 단계; d) (예를 들어, 후보 변이체에 의해 매개된) 표적 세포 세포독성을 측정하는 단계; e) 후보 변이체가 제1 종 효과기 세포의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 표적 세포 세포독성을 매개하는지를 결정하는 단계; f) 제2 종 효과기 세포와 후보 변이체 결합된 표적 세포 (예를 들어, 단계 b)에서 생성된 바와 같음)를 혼합하는 단계; g) (예를 들어, 후보 변이체에 의해 매개된) 표적 세포 세포독성을 측정하는 단계; 및 h) 후보 변이체가 제2 종 효과기 세포의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 표적 세포 세포독성을 매개하는지를 결정하는 단계를 포함하여, 이중-종 개선된 변이체를 확인 (동정)하는 방법을 제공한다.

특정 양태에서는, 상기 방법이 제1 종 및/또는 제2 종의 존재 하에 표적 세포 세포독성을 매개할 수 있는 모 폴리펩티드의 능력을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 상기 방법은 제1 종 또는 제2 종 효과기 세포를 모 폴리펩티드 결합된 표적 세포와 혼합한 다음, 표적 세포 세포독성을 측정하는 (예를 들어, 대항한 변이체를 비교하기 위해 존재하는 특정 값을 결정하는) 것을 추가로 포함할 수 있다.

특정 양태에서는, 상기 방법이 g) 이중-종 개선된 변이체를 시험 동물 (이러한 시험 동물은 제2 종의 구성원이다)에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 기타 양태에서는, 상기 방법이 단계 a)에 앞서, 후보 변이체를 Fc 수용체 (FcR) 결합 검정에서 스크리닝하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 양태에서는, FcR 결합 검정이 Fc 신생아 수용체 (FcRn) 결합 검정이다.

몇몇 양태에서는, 상기 방법이 단계 a)에 앞서, 후보 변이체를 CDC 검정에서 스크리닝하는 단계를 추가로 포함한다 (하기 섹션 IV 참고). 몇몇 양태에서는, 제1 종의 효과기 세포가 인간 말초혈 단핵 세포 (PBMCs)이다. 기타 양태에서는, 제1 종의 효과기 세포가 마우스 PBMCs 또는 랫트 PBMCs이다. 특정 양태에서는, 제2 종의 효과기 세포가 마우스 PBMCs 또는 랫트 PBMCs이다. 특정한 양태에서는, 제2 종의 효과기 세포가 인간 PBMCs이다.

몇몇 양태에서, 본 발명은 a) i) Fc 영역을 갖는 모 폴리펩티드의 후보 변이체 (이러한 후보 변이체는 Fc 영역 내에 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하고, 후보 변이체는 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 CDC를 매개한다)를 포함하는 조성물; 및 ii) 보체의 제2 종 공급원을 제공하는 단계; b) 상기 조성물을 제2 종의 보체와 함께 항온 배양하는 단계; 및 c) 후보 변이체가 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 CDC를 매개하는지를 결정하는 단계를 포함하여, 이중-종 개선된 변이체를 확인하는 방법을 제공한다. 특정한 양태에서는, 상기 방법이 d) 후보 변이체를 이중-종 개선된 변이체로서 확인 (동정)하는 단계를 추가로 포함한다.

몇몇 양태에서는, 표적 세포가, 예를 들어 다음 종양-관련 항원들 중의 하나 이상을 과발현하는 인간 세포이다: CD20, CD22, CD33, CD40, CD63, EGF 수용체, her-2 수용체, 전립선-특이적 막 항원, 루이스 (Lewis) Y 탄수화물, GD₂ 및 GD₃ 강글리오시드, lamp-1, CO-029, L6, 및 ephA2. 특정 양태에서는, 변이체가 표적 세포에 대해 특이적인 항체 또는 그의 일부를 포함한다. 기타 양태에서는, 후보 변이체가 제1 종의 효과기 세포의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 약 1.2배 더 효과적으로 표적 세포 세포독성을 매개한다. 몇몇 양태에서는, 단계 e)가 모 폴리펩티드와의 대조군 반응을 수행하는 것을 포함한다. 부가 양태에서는, 측정 단계가 표적 세포 사멸 또는 표적 세포 용해를 정량화하는 것을 포함한다. 기타 양태에서는, 표적 세포를 바이러스 (예: HIV, CMV, B형 간염, 또는 RSV) 또는 미생물성 유기체 [예: 스타필로코쿠스 (Staphylococcus), 스트렙토코쿠스 (Streptococcus), 슈도모나스 (Pseudomonas) 등]으로 감염시켰다. 특정 양태에서는, 표적 세포가 미생물성 유기체 [예: 스타필로코쿠스, 스트렙토코쿠스, 슈도모나스 등]이다. 몇몇 양태에서는, 표적 세포를 바이러스 (예: HIV, CMV, B형 간염, 또는 RSV)로 대체시킨다.

몇몇 양태에서, 본 발명은 CD20 결합성 분자, 또는 CD20 결합성 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 CD20 결합성 분자는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열 57에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다. 기타 양태에서, 본 발명은 CD20 결합성 분자, 또는 CD20 결합성 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 CD20 결합성 분자 는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열 58에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태에서, 본 발명은 CD20 결합성 분자, 또는 CD20 결합성 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조성물을 제공하는데 (도 16 참고), 이러한 CD20 결합성 분자는 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열 57에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고 (도 15 참고), 중쇄 가변 영역은 서열 58에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다 (도 15 참고).

몇몇 양태에서, 본 발명은 i) 변형되지 않은 인간 골격 (예를 들어, 천연 발생적 인간 골격에 대한 어떠한 변경도 이루어지지 않았다) 및 ii) 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 양태에서는, 변형되지 않은 인간 골격이 인간 생식세포계 (germline) 골격이다. 기타 양태에서, 본 발명은 i) 하나 이상의 무작위화 CDR 서열 및 ii) 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 추가 양태에서, 본 발명은 i) 변형되지 않은 인간 골격 (예: 인간 생식세포계 골격), ii) 하나 이상의 무작위화 CDR 서열 및 iii) 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다.

도 1은 표지된 각종 영역과 부문을 지닌 IgG 분자를 도식적으로 표시한 것이다.

도 2는 인간 IgG1 [제시된 a 동종이형 (allotype) 및 비-a 동종이형 (서열 1)을 수반함], 인간 IgG2 (서열 2), 인간 IgG3 (서열 3), 인간 IgG4 (서열 4), 뮤린 IgGl (서열 5), 뮤린 IgG2A (서열 6), 뮤린 IgG2B (서열 7), 및 뮤린 IgG3 (서 열 8)을 포함한, 각종 모 Fc 아미노산 서열의 정렬을 도시한 것이다.

도 3은 인간 IgG1의 CH2 영역 (서열 9), 및 CH3 영역 (서열 10) 뿐만 아니라 CH1, 힌지, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 인간 IgG1의 f 동종이형 (서열 11) 및 a,z 동종이형 (서열 12) 서열을 포함한, 각종 아미노산 서열을 도시한 것이다.

도 4는 국소 주변 서열 맥락에서 변이체의 변경된 아미노산 서열을 도시한 것이다.

도 5는 모 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 도시한 것이다.

도 6은 국소 주변 핵산 서열 맥락에서 변이체의 변경된 핵산 서열을 도시한 것이다.

도 7A는 야생형 Fc 영역과 A330K, A330R, I332E 및 위치 330과 332 둘 다에서의 돌연변이 조합물을 비교한 ADCC 검정 결과를 도시한 것이다.

도 7B는 Fc 영역 아미노산 변이체 I332D 및 I332E를 Fc 영역 글리칸 변형 변이체 33 (GnTIII)과 비교한 ADCC 검정 결과와, ADCC 활성에 대한 아미노산 플러스 글리칸 변형 33 (I332E + GnTIII)의 효과를 도시한 것이다.

도 8은 정제된 변이체 IgG를 사용하여 수득된 대표적인 ADCC 데이터를 나타낸 것이다.

도 9는 Wil-2 (A) 또는 SKW6.4 (B) 표적 세포주에 대항한 CD20 항원에 대한 친화성이 낮은 가변 영역 변이체 (6F1) 및 친화성이 비교적 높은 가변 영역 변이체 (33 및 5)의 ADCC 활성을 도시한 것이다.

도 10은 Fc-영역 변이체 IgG에 대한 FcγRI 결합의 적정 곡선을 도시한 것이 다.

도 1lA, B, 및 C는 인간 보체 및 라모스 (Ramos) 표적 세포를 사용하여 Fc-영역 변이체의 적정으로부터 수득한 대표적인 CDC 데이터를 나타낸 것이다.

도 12는 FcγRIIIa 수용체의 VV (고 친화성) 유전자형을 함유하는 전혈 샘플을 사용하여, AME-133 (I332E Fc 변이체 서열을 수반한 가변 영역 33), 리툭산 (Rituxan) 및 비-특이적 IgG를 이용한 경우의 대표적인 B 세포 고갈을 도시한 것이다.

도 13은 FcγRIIIa 수용체의 FF (저 친화성) 유전자형을 함유하는 전혈 샘플을 사용하여, AME-133 (I332E Fc 변이체 서열을 수반한 가변 영역 33), 리툭산 및 비-특이적 IgG를 이용한 경우의 대표적인 B 세포 고갈을 도시한 것이다.

도 14는 전혈 샘플을 사용하여, 리툭산, 비-특이적 IgG, 및 변이체 A378D 및 T256P, I332E을 이용한 경우의 대표적인 B 세포 고갈을 도시한 것이다.

도 15는 AME-133 (I332E Fc 변이체 서열을 수반한 가변 영역 33)의 경쇄 (서열 57) 및 중쇄 (서열 58)의 아미노산 서열을 도시한 것이다.

도 16은 AME-133 (I332E Fc 변이체 서열을 수반한 가변 영역 33)의 경쇄 (서열 59) 및 중쇄 (서열 60)의 뉴클레오티드 서열을 도시한 것이다.

정의

본 발명의 이해를 돕기 위해, 수 많은 용어가 다음과 같이 정의된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "대상체" 및 "환자"는 모든 동물, 예를 들어 개, 고양이, 가축류와 같은 포유류, 바람직하게는 인간 (예: 질환이 있는 인간)을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "~을 암호화하는 핵산 분자", "~을 암호화하는 DNA 분자" 및 "~을 암호화하는 DNA"는 데옥시리보핵산의 가닥을 따라 존재하는 데옥시리보뉴클레오티드의 서열 또는 순위를 지칭한다. 이들 데옥시리보뉴클레오티드의 순위가 폴리펩티드 (단백질) 쇄를 따라 존재하는 아미노산의 순위를 결정한다. 따라서, DNA 서열은 아미노산 서열을 암호화한다.

하나의 모노뉴클레오티드 펜토스 환의 5' 포스페이트가 포스포디에스테르 연쇄를 통하여 한 방향으로 그의 이웃의 3' 산소에 부착되는 방식으로, 모노뉴클레오티드가 반응하여 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 형성하기 때문에, DNA 분자는 "5' 말단" 및 "3' 말단"을 갖는 것으로 여겨진다. 따라서, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 말단은, 그의 5' 포스페이트가 모노뉴클레오티드 펜토스 환의 3' 산소에 연결되지 않을 경우에는 "5' 말단"으로서 지칭되고, 그의 3' 산소가 후속 모노뉴클레오티드 펜토스 환의 5' 포스페이트에 연결되지 않을 경우에는, "3' 말단"으로서 지칭된다. 본원에 사용된 바와 같은 핵산 서열이 보다 큰 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드에 대해 내부에 존재하는 경우일지라도, 이러한 서열은 5' 및 3' 말단을 가질 수 있다. 선형 또는 환상 DNA 분자에서는, 별개의 요소가 "상단" 또는 5' 요소, 또는 "하단" 또는 3' 요소로서 지칭된다. 이러한 용어는 전사가 DNA 가닥을 따라 5'에서 3' 방향으로 진행된다는 사실을 반영해준다. 연결된 유전자의 전사를 지시하는 프로모터 및 증강인자 요소는 일반적으로, 암호화 영역의 5' 또는 상단에 위치한다. 그러나, 증강인자 요소는 프로모 터 요소 및 암호화 영역의 3'에 위치한 경우 일지라도 자신의 효과를 발휘할 수 있다. 전사 종결 및 폴리아데닐화 신호가 암호화 영역의 3' 또는 하단에 위치한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "코돈" 또는 "삼중자"는 폴리펩티드 생합성시 발견되는 20개의 천연 발생적 아미노산 중의 하나를 명시하는 3개의 인접한 뉴클레오티드 단량체의 집합체 (tuplet)를 지칭한다. 상기 용어에는 어느 아미노산도 명시하지 않는 넌센스 코돈이 포함되기도 한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드", "폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드" 및 "폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열"은 특정한 폴리펩티드의 암호화 영역을 포함하는 핵산 서열을 의미한다. 암호화 영역은 cDNA, 게놈 DNA, 또는 RNA 형태로 존재할 수 있다. DNA 형태로 존재하는 경우, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 (즉, 센스 가닥) 또는 이중 가닥일 수 있다. 적합한 제어 요소, 예를 들어, 증강인자/프로모터, 스플라이스 연결부, 폴리아데닐화 신호 등은, 전사의 적절한 개시를 허용하고/하거나 일차 RNA 전사체의 프로세싱을 교정하기 위해 필요한 경우에는 유전자의 암호화 영역에 아주 근접하여 위치할 수 있다. 또 다른 한편, 본 발명의 발현 벡터에 활용된 암호화 영역은 내인성 증강인자/프로모터, 스플라이스 연결부, 간섭 서열, 폴리아데닐화 신호 등, 또는 내인성 제어 요소와 외인성 제어 요소의 조합물을 함유할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "상보적" 또는 "상보성"은 염기 짝짓기 규칙에 의해 관계를 맺은 폴리뉴클레오티드 (즉, 뉴클레오티드 서열)와 관련하여 사용 된다. 예를 들어, 서열 "A-G-T"의 경우, 이는 서열 "T-C-A"에 대해 상보적이다. 상보성은 핵산의 염기들 중의 일부 만이 염기 짝짓기 규칙에 따라서 매칭된다는 점에서 "부분적"일 수 있다. 핵산들 간에 "완전한" 또는 "전체" 상보성이 존재할 수도 있다. 핵산 가닥들 간의 상보성 정도는 핵산 가닥들 간의 혼성화 효율과 세기에 상당한 영향을 미친다. 이는 증폭 반응 뿐만 아니라 핵산 간의 결합에 좌우되는 탐지 방법에 있어서도 특히 중요하다.

본원에 사용된 바와 같은, 소정의 서열의 "보체"는 그의 전체 길이 전반에 걸쳐 완전히 상보적인 서열과 관련하여 사용된다. 예를 들어, 서열 A-G-T-A는 서열 T-C-A-T의 "보체"이다.

(핵산 서열과 관련한 경우의) 용어 "상동성"은 상보성 정도를 지칭한다. 부분적으로 상동성이거나 또는 완전히 상동성 (즉, 동일성)일 수 있다. 부분적으로 상보적인 서열은 완전히 상보적인 서열이 표적 핵산과 혼성화하는 것을 적어도 부분적으로 억제시키는 것이며, 이는 기능적 용어 "실질적으로 상동성인"을 이용하여 지칭된다. 핵산 결합과 관련하여 사용된 경우의 용어 "결합의 억제"는 표적 서열에 대한 결합을 놓고 상동성 서열들의 경쟁에 의해 유발된 결합 억제를 지칭한다. 완전히 상보적인 서열이 표적 서열과 혼성화하는 것의 억제는 엄격도가 낮은 조건 하에 혼성화 검정 [서던 (Southern) 또는 노던 (Northern) 블롯, 용액 혼성화 등]을 이용하여 검사할 수 있다. 실질적으로 상동성인 서열 또는 프로브는 엄격도가 낮은 조건 하에 표적에 대한 완전히 상동성인 서열의 결합 (즉, 혼성화)를 놓고 경쟁하여, 이러한 결합을 억제시킬 것이다. 엄격도가 낮은 조건이 비-특이적 결합을 허용하는 조건이라고 말할 수는 없지만, 엄격도가 낮은 조건은 두 서열들 간의 결합이 특이적 (즉, 선택적) 상호 작용이어야 한다. 비-특이적 결합이 존재하지 않는 다는 것은 부분 상보성 정도 조차도 결여된 (예를 들어, 동일률이 약 30% 미만임) 제2 표적을 사용함으로써 시험할 수 있는데; 비-특이적 결합의 부재 하에서는 프로브가 제2의 비-상보적 표적과 혼성화하지 않을 것이다.

엄격도가 낮은 조건을 포함하는 수 많은 등가 조건을 이용할 수 있다는 것이 당해 분야에 널리 공지되어 있고; 프로브의 길이 및 특성 (DNA, RNA, 염기 조성) 및 표적의 특성 (DNA, RNA, 염기 조성, 용액 또는 고정화 대상물 내에 존재하는지의 여부 등), 및 염의 농도 및 기타 성분 (예: 포름아미드, 덱스트란 설페이트, 폴리에틸렌 글리콜의 존재 또는 부재) 등의 요인들이 고려되며, 혼성화 용액을 다양하게 하여 상기 열거된 조건들과 상이하지만, 등가의 낮은 엄격도 혼성화 조건을 만들 수 있다. 또한, 당해 분야에는 고도로 엄격한 조건 하에 혼성화를 촉진시키는 조건 (예를 들어, 혼성화 온도를 상승시키고/시키거나 세척 단계를 증가시키며, 혼성화 용액 중에 포름아미드를 사용하는 등의 조건)이 공지되어 있다.

(예를 들어, 변이체 Fc 영역 또는 그의 일부를 암호화하는) 핵산 서열은 일차 RNA 전사체를 시차 스플라이싱함으로써 발생된 다중 RNA 종을 생성시킬 수 있다. 동일한 유전자의 스플라이스 변이체인 cDNAs는 서열 동일하거나 완전히 상동성인 영역 (이는 양 cDNAs 상에 동일한 엑손 또는 동일한 엑손 일부가 존재하는 것을 나타낸다), 및 완전히 동일하지 않은 영역 (이는, 예를 들어 cDNA 1 상에는 엑손 "A"가 존재하고, cDNA 2는 엑손 "B"를 함유한다는 것을 나타낸다)을 함유할 것 이다. 이러한 2개의 cDNAs가 서열 동일성 영역을 함유하기 때문에, 양 cDNAs 상에서 발견된 서열을 함유하는 전체 유전자 또는 이러한 유전자의 일부로부터 유래된 프로브와 둘 다 혼성화할 것이므로; 2개의 스플라이스 변이체는 이러한 프로브와 실질적으로 상동성이며 서로에 대해서도 실질적으로 상동성이다.

단일 가닥 핵산 서열과 관련하여 사용된 경우의 용어 "실질적으로 상동성"은 엄격도가 낮은 조건 하에 단일 가닥 핵산 서열과 혼성화할 수 있는 (즉, 그의 보체인) 모든 프로브를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "혼성화"는 상보적 핵산의 짝짓기와 관련하여 사용된다. 혼성화 및 혼성화 세기 (즉, 핵산들 간의 연합 세기)는 핵산들 간의 상보성 정도, 이에 관여한 조건의 세기, 형성된 하이브리드의 Tm, 및 핵산 내의 G:C 비율과 같은 요인들에 의해 영향을 받는다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "Tm"은 융점과 관련하여 사용된다. 융점은 이중 가닥 핵산 분자 집단이 대략 반으로 분리되어 단일 가닥이 되는 온도이다. 핵산의 Tm을 계산하는 방정식은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 표준 기준에 의해 지시된 바와 같이, 간단한 Tm 추정치는 다음 방정식에 의해 계산할 수 있다: Tm = 81.5 + 0.41 (% G + C). 여기서, 핵산은 1 M NaCl 하의 수용액 중에 있다 [참고: Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization (1985)]. 기타 기준에는 Tm을 계산하기 위해 구조적 특징 뿐만 아니라 서열 특징을 고려하는 보다 복잡한 연산처리가 포함되는데, 몇몇 경우에는 계산된 Tm으로 시작하여 온도의 작은 상승 또는 하강을 시험하고 핵산 분자 집단에 대한 효과를 검사함으로써 Tm을 실험적으로 결정할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "엄격도"는 핵산 혼성화를 수행하는 온도, 이온 세기 및 기타 화합물 (예: 유기 용매)의 존재 조건과 관련하여 사용되고 있다. 당업자는 바로 앞서 기재된 파라미터들을 개별적으로 또는 동시에 변화시킴으로써 "엄격도" 조건을 변경시킬 수 있다는 것을 인식할 것이다. "고도로 엄격한" 조건의 경우에는, 상보적 염기 서열 빈도가 높은 핵산 단편들 간에서만 핵산 염기 짝짓기가 일어날 것이다 (예를 들어, "고도로 엄격한" 조건 하에서의 혼성화는 동일률이 약 85 내지 100%, 바람직하게는 약 70 내지 100%인 상동체들 간에 일어날 수 있다). 중간 수준의 엄격한 조건의 경우에는, 상보적 염기 서열 빈도가 중간 수준인 핵산들 간에 핵산 염기 짝짓기가 일어날 것이다 (예를 들어, "중간 수준의 엄격한" 조건 하에서의 혼성화는 동일률이 약 50 내지 70%인 상동체들 간에 일어날 수 있다). 따라서, 엄격도가 "약한" 또는 "낮은" 조건은 상보적 염기 빈도가 통상적으로 낮기 때문에, 유전적으로 다양한 유기체로부터 유래되는 핵산을 종종 요구한다.

핵산 혼성화와 관련하여 사용된 경우의 "고도로 엄격한 조건"은 길이가 약 500개 뉴클레오티드인 프로브가 이용된 경우, 5X SSPE (43.8 g/l NaCl, 6.9 g/1 NaH₂P0₄·H₂O 및 1.85 g/1 EDTA, NaOH를 이용하여 7.4가 되도록 조정된 pH), 0.5% SDS, 5X 덴하르츠 (Denhardt) 시약 및 100 ㎍/ml 변성 연어 정액 DNA로 이루어진 용액 중에서 42℃ 하에 결합 또는 혼성화시킨 다음, 0.1X SSPE, 1.0% SDS를 포함하는 용액 중에서 42℃ 하에 세척하는 조건을 포함한다.

핵산 혼성화와 관련하여 사용된 경우의 "중간 수준의 엄격한 조건"은 길이가 약 500개 뉴클레오티드인 프로브가 이용된 경우, 5X SSPE (43.8 g/l NaCl, 6.9 g/1 NaH₂P0₄·H₂O 및 1.85 g/1 EDTA, NaOH를 이용하여 7.4가 되도록 조정된 pH), 0.5% SDS, 5X 덴하르츠 시약 및 100 ㎍/ml 변성 연어 정액 DNA로 이루어진 용액 중에서 42℃ 하에 결합 또는 혼성화시킨 다음, 1.0X SSPE, 1.0% SDS를 포함하는 용액 중에서 42℃ 하에 세척하는 조건을 포함한다.

"엄격도가 낮은 조건"은 길이가 약 500개 뉴클레오티드인 프로브가 이용된 경우, 5X SSPE (43.8 g/l NaCl, 6.9 g/1 NaH₂P0₄·H₂O 및 1.85 g/1 EDTA, NaOH를 이용하여 7.4가 되도록 조정된 pH), 0.1% SDS, 5X 덴하르츠 시약 [50X 덴하르츠 시약은 500 ml당 5 g 피콜 (Ficoll) (유형 400; 공급처: Pharmacia), 5 g BSA (분획 V; 공급처: Sigma)를 함유한다] 및 100 g/ml 변성 연어 정액 DNA로 이루어진 용액 중에서 42℃ 하에 결합 또는 혼성화시킨 다음, 5X SSPE, 0.1% SDS를 포함하는 용액 중에서 42℃ 하에 세척하는 조건을 포함한다.

다음 용어는 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 간의 서열 상관 관계를 기재하기 위해 사용된다: "기준 서열", "서열 동일성" 및 "서열 동일률(%)". "기준 서열"은 서열 비교를 위한 기준물로서 사용된 규정 서열이고; 기준 서열은 보다 큰 서열의 아세트일 수 있는데, 예를 들어 서열 목록에 제시된 완전한 길이의 cDNA 서열의 절편으로서 존재할 수 있거나 또는 완전한 유전자 서열을 포함할 수 있다. 일반적으로, 기준 서열은 길이가 20개 이상의 뉴클레오티드, 종종 25개 이상의 뉴클레오티 드, 더욱 종종 50개 이상의 뉴클레오티드이다 (예를 들어, 서열 32 내지 37 중의 어느 하나가 기준 서열로서 사용될 수 있다). 2개의 폴리뉴클레오티드는 각각 (1) 이러한 2개의 폴리뉴클레오티드 간에 유사한 서열 (즉, 완전한 폴리뉴클레오티드 서열의 일부)를 포함할 수 있고, (2) 2개의 폴리뉴클레오티드 간의 서로 다른 서열을 추가로 포함할 수 있으며, 2개 (이상)의 폴리뉴클레오티드 간의 서열 비교는 전형적으로, 이들 2개의 폴리뉴클레오티드 서열을 "비교 창" 전반에 걸쳐 비교하여 서열 유사성 국소 영역을 확인 및 비교함으로써 수행한다. 본원에 사용된 바와 같은 "비교 창"은 20개 이상의 연속된 뉴클레오티드 위치들의 개념적 절편을 지칭하는데, 여기서 폴리뉴클레오티드 서열을 20개 이상 연속된 뉴클레오티드의 기준 서열과 비교할 수 있고, 비교 창 내의 폴리뉴클레오티드 서열 일부는 두 서열의 최적 정렬을 위해 기준 서열 (부가물 또는 결실물을 포함하지 않음)과 비교해서 20% 이하의 부가물 또는 결실물 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 비교 창 정렬을 위해 서열을 최적으로 정렬시키는 것은 국소 상동성 알고리듬 [참고: Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)], 상동성 정렬 알고리듬 [참고: Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)], 유사성을 알아보기 위한 조사 방법 [참고: Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 85: 2444 (1988)], 이들 알고리듬의 컴퓨터 이용한 이행 [Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group (575 Science Dr., Madison, Wis.) 내의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA], 또는 검사에 의해 수행할 수 있고; 다양한 방법에 의해 야기된 가장 우수한 정렬 (즉, 비교 창 전반에 걸쳐 가장 높은 상동률을 가져다 준다)을 선별한다. 용어 "서열 동일성"은 2개의 폴리뉴클레오티드 서열이 비교 창 전반에 걸쳐 동일하다 (즉, 뉴클레오티드-대-뉴클레오티드에 근거함)는 것을 의미한다. 용어 "서열 동일률"은 최적으로 정렬된 2개의 서열을 비교 창 전반에 걸쳐 비교하고, 동일한 핵산 염기 (예: A, T, C, G, U, 또는 I)가 양 서열에 존재하는 위치 수를 결정하여 매칭된 위치 수를 산출하고, 매칭된 위치 수를 비교 창 내의 위치 총수 (즉, 창 크기)로 나눈 다음, 이에 100을 곱하여 서열 동일률을 산출함으로써 계산한다. 본원에 사용된 바와 같은 비교 창은 인용된 기준 서열의 전체 길이이다 (즉, 서열 33이 기준 서열로서 인용된 경우, 서열 동일률은 서열 33의 전체 길이 전반에 걸쳐 비교한 것이다).

본원에 사용된 바와 같은 용어 "프로브"는 정제된 제한 분해물에서와 같이 천연적으로 발생되든지 아니면 합성적, 재조합적 또는 PCR 증폭에 의해 생성되든지 간에, 관심있는 또 다른 올리고뉴클레오티드와 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 (즉, 뉴클레오티드 서열)를 지칭한다. 프로브는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 프로브는 특정한 유전자 서열의 탐지, 확인 (동정) 및 분리에 유용하다. 본 발명에 사용된 모든 프로브는 "리포터 (reporter) 분자"로 표지시킬 수 있기 때문에, 어떠한 탐지 시스템에서도 탐지 가능하다는 것을 고려해야 하며, 이에는 효소 (예: ELISA 뿐만 아니라 효소에 의거한 조직화학적 검정), 형광성, 방사성 및 발광성 시스템이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명은 특정한 어떠한 탐지 시스템이나 표지로 제한되지 않는다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "폴리머라제 연쇄 반응" ("PCR")은 본원에 참 고로 도입된 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,965,188호에 기재된 방법을 지칭하는데, 이에는 클로닝 또는 정제를 수행하지 않고서 게놈 DNA의 혼합물 중의 표적 서열 절편 농도를 증가시키는 방법이라고 기재되어 있다. 이러한 표적 서열 증폭 공정은 큰 과량의 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를, 목적하는 표적 서열을 함유하는 DNA 혼합물 내로 도입한 다음, DNA 폴리머라제의 존재 하에 정확한 서열을 열 사이클링하는 것으로 이루어진다. 2개의 프라이머는 이중 가닥 표적 서열의 그들 각각의 가닥에 대해 상보적이다. 증폭을 수행하기 위해서는, 상기 혼합물을 변성시킨 다음, 프라이머를 표적 분자 내의 그들의 상보적 서열과 어닐링시킨다. 어닐링시킨 후, 프라이머를 폴리머라제로 연장시켜 새로운 상보적 가닥 쌍을 형성하도록 한다. 변성 단계, 프라이머 어닐링 단계 및 폴리머라제 연장 단계를 수회 반복하여 (즉, 변성, 어닐링 및 연장은 하나의 "사이클"을 구성하는데, 수 많은 "사이클"이 있을 수 있다) 목적하는 표적 서열의 증폭된 절편을 고 농도로 수득할 수 있다. 목적하는 표적 서열의 증폭된 절편 길이는 프라이머들 서로에 대한 상대적 위치에 의해 결정되므로, 이러한 길이는 제어 가능한 파라이터이다. 공정을 반복할 수 있기 때문에, 상기 방법이 "폴리머라제 연쇄 반응" ("PCR"로 후술됨)으로서 지칭된다. 목적하는 표적 서열의 증폭된 절편이 혼합물 내에 우세한 서열 (농도 측면에서)이 되기 때문에, 이것이 "PCR 증폭된" 것으로 간주된다.

PCR을 이용하여, 게놈 DNA 중의 특이적 표적 서열의 단일 카피 (copy)를 몇 가지 상이한 방법론 (예: 표지된 프로브를 이용한 혼성화 방법; 바이오티닐화 프라 이머를 혼입한 다음 아비딘-효소 접합체를 탐지하는 방법; ³²P-표지된 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트, 예를 들어 dCTP 또는 dATP를 증폭된 절편 내로 혼입시키는 방법)에 의해 탐지 가능한 수준으로 증폭시키는 것이 가능하다. 게놈 DNA 이외에도, 적당한 프라이머 분자 세트를 이용하여 어떠한 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열도 증폭시킬 수 있다. 특히, PCR 공정 자체에 의해 창출된 증폭 단편은 스스로, 후속 PCR 증폭에 있어 효율적인 주형이 된다.

"분리된 올리고뉴클레오티드" 또는 "분리된 폴리뉴클레오티드"에서와 같이, 핵산과 관련하여 사용된 경우의 용어 "분리된"이란 그의 천연 공급원에서 통상적으로 연합되는 한 가지 이상 오염성 핵산으로부터 확인 및 격리시킨 핵산 서열을 지칭한다. 분리된 핵산은 천연적으로 발견되는 것과는 상이한 형태 또는 세팅으로 존재한다. 따라서, 분리된 핵산 분자는 천연 세포 내에 존재하는 바와 같은 핵산 분자와는 구별된다. 그러나, 분리된 핵산 분자에는 폴리펩티드를 통상 발현하는 세포 내에 함유된 핵산 분자가 포함되는데, 여기서는 예를 들어, 핵산 분자가 천연 세포와는 상이한 염색체상 위치에 존재한다. 분리된 핵산, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재할 수 있다. 분리된 핵산, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 특정 단백질 발현을 위해 활용하고자 하는 경우에는, 이러한 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 최소한 센스 또는 암호화 가닥을 함유할 것이지만 (즉, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥일 수 있다), 센스 가닥과 안티-센스 가닥 둘 다를 함유 할 수도 있다 (즉, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥일 수 있다).

본원에 사용된 바와 같은, ("소정의 뉴클레오티드 서열의 일부"에서와 같이) 뉴클레오티드 서열과 관련하여 사용된 경우의 용어 "일부"는 해당 서열의 단편을 지칭한다. 이러한 단편은 크기가 10개 뉴클레오티드서부터 전체 뉴클레오티드 서열 마이너스 1개 뉴클레오티드 (예: 10개 뉴클레오티드, 20, 30, 40, 50, 100, 200개 등)까지의 범위일 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, ("소정의 아미노산 서열의 일부"에서와 같은) 아미노산 서열과 관련하여 사용된 경우의 용어 "일부"는 해당 서열의 단편을 지칭한다. 이러한 단편은 크기가 6개 아미노산에서부터 전체 아미노산 서열 마이너스 1개 아미노산 (예: 6개 아미노산, 10, 20, 30, 40, 75, 200개 등)까지의 범위일 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "정제된" 또는 "정제"는 특정 샘플로부터 오염물질을 제거하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 항원 특이적 항체는 오염성 비-면역글로불린 단백질을 제거함으로써 정제할 수 있고; 동일한 항원과 결합하지 않는 면역글로불린을 제거함으로써 정제하기도 한다. 비-면역글로불린 단백질을 제거하고/하거나 특정한 항원과 결합하지 않는 면역글로불린을 제거하면, 샘플 중의 항원 특이적 면역글로불린의 비율이 증가하게 된다. 또 다른 예에서는, 재조합 항원 특이적 폴리펩티드를 세균성 숙주 세포에서 발현시키고, 숙주 세포 단백질을 제거함으로써 폴리펩티드를 정제하는데, 이로써 샘플 중의 재조합 항원 특이적 폴리펩티 드의 비율이 증가된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "재조합 DNA 분자"는 분자 생물학 기술을 통하여 함께 연결된 DNA 절편으로 구성되는 DNA 분자를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "재조합 단백질" 또는 "재조합 폴리펩티드"는 재조합 DNA 분자로부터 발현되는 단백질 분자를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "본래의 단백질"은 특정 단백질이 벡터 서열에 의해 암호화된 아미노산 잔기를 함유하지 않는다는 것을 지시하는데, 즉 본래의 단백질은 천연적으로 존재하는 바와 같은 단백질에서 발견된 아미노산 만을 함유한다. 본래의 단백질은 재조합 수단에 의해 생성될 수 있거나 또는 천연 발생적 공급원으로부터 분리할 수 있다.

용어 "서던 블롯"은 DNA를 아가로스 또는 아크릴아미드 겔 상에서 분석하여 DNA를 크기에 따라 분획화한 다음, 이러한 DNA를 겔로부터 고형 지지체, 예를 들어 니트로셀룰로스 또는 나일론 막으로 전이시키는 것을 지칭한다. 그 다음, 고정화된 DNA를 표지된 프로브로 프로빙하여, 사용된 프로브에 대해 상보적인 DNA 종을 탐지한다. DNA를 제한 효소로 절단시킨 다음 전기영동할 수 있다. 전기영동 후, DNA를 고형 지지체로 전이시키기 이전 또는 전이시키는 동안, 부분적으로 퓨린 제거시키고 변성시킬 수 있다. 서던 블롯은 분자 생물학자의 표준 도구이다 [참고: J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY, pp 9.31-9.58 (1989)].

본원에 사용된 바와 같은 용어 "노던 블롯"은 RNA를 아가로스 겔 상에서 전 기영동시킴으로써 RNA를 분석하여 RNA를 크기에 따라 분획화한 다음, 이러한 RNA를 겔로부터 고형 지지체, 예를 들어 니트로셀룰로스 또는 나일론 막으로 전이시키는 것을 지칭한다. 그 다음, 고정화된 RNA를 표지된 프로브로 프로빙하여, 사용된 프로브에 대해 상보적인 RNA 종을 탐지한다. 노던 블롯은 분자 생물학자의 표준 도구이다 [참고: J. Sambrook et al., 상기 참고, pp 7.39-7.52 (1989)].

용어 "웨스턴 블롯"은 특정 지지체 (예: 니트로셀룰로스 또는 막) 상으로 고정화시킨 단백질(들) (또는 폴리펩티드)을 분석하는 것을 지칭한다. 단백질을 아크릴아미드 겔 상에서 수행하여 단백질을 격리시킨 다음, 이러한 단백질을 겔로부터 고형 지지체, 예를 들어 니트로셀룰로스 또는 나일론 막으로 전이시킨다. 그 다음, 고정화된 단백질을, 관심있는 항원에 대항하여 반응성을 나타내는 항체에 노출시킨다. 항체의 결합성은 방사성표지된 항체의 사용을 포함한 각종 방법에 의해 탐지할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "항원 결정기"는 특정한 항체와 접촉하게 되는 항원의 일부 (즉, 에피토프)를 지칭한다. 단백질 또는 단백질 단편을 사용하여 숙주 동물을 면역시킨 경우에는, 수 많은 단백질 영역이 단백질 상의 소정의 영역 또는 3차원 구조와 특이적으로 결합하는 항체의 생산을 유도시킬 수 있고, 이러한 영역 또는 구조가 항원 결정기로서 지칭된다. 항원 결정기는 항체와의 결합을 놓고 본래의 항원 (즉, 면역 반응을 유도시키기 위해 사용된 "면역원")과 경쟁할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "트랜스유전자 (transgene)"는 외래, 이종 또 는 자기 유래 유전자를 새로운 수정란 또는 초기 배아 내로 도입함으로써 유기체 내로 위치시킨 상기 외래, 이종 또는 자기 유래 유전자를 지칭한다. 용어 "외래 유전자"는 실험적 조작에 의해 동물 게놈 내로 도입되는 모든 핵산 (예: 유전자 서열)을 지칭하고, 이에는 도입된 유전자가 천연 발생적 유전자와 동일한 위치 내에 거주하지 않는 한은 상기 동물에서 발견된 유전자 서열이 포함될 수 있다. 용어 "자기 유래 유전자"는 천연 발생적 유전자의 변이체 (예: 다형체 또는 돌연변이체)를 포괄한다. 따라서, 용어 트랜스유전자는 천연 발생적 유전자를 변이체 형태의 유전자로 대체시킨 것을 포괄한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 DNA 절편(들)을 한 세포에서 또 다른 세포로 전이시키는 핵산 분자와 관련하여 사용된다. 용어 "비히클"은 종종, "벡터"와 상호 교환적으로 사용된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "발현 벡터"는 특정한 숙주 유기체 내에서 작동적으로 연결된 암호화 서열을 발현하는데 필요한 적당한 핵산 서열과 목적하는 암호화 서열을 함유하는 재조합 DNA 분자를 지칭한다. 원핵 생물에서 발현시키는데 필요한 핵산 서열은 통상적으로, 종종 기타 서열과 함께 프로모터, 작동인자 (임의), 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵성 세포는 프로모터, 증강인자, 및 종결 및 폴리아데닐화 신호를 활용하는 것으로 공지되어 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "숙주 세포"는 시험관 내에 위치하든 아니면 생체 내에 위치하든지 간에, 모든 진핵성 또는 원핵성 세포를 지칭한다 [예를 들어, 세균성 세포, 예를 들면, 이. 콜라이 (E. coli), CHO 세포, 효모 세포, 포유류 세포, 조류 세포, 양서류 세포, 식물 세포, 어류 세포 및 곤충 세포]. 예를 들어, 숙주 세포가 트랜스제닉 (transgenic) 동물 내에 위치할 수도 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "형질감염" 및 "형질전환"은 외래 DNA를 세포 (예: 진핵성 및 원핵성 세포) 내로 도입하는 것을 지칭한다. 형질감염은 인산칼슘-DNA 공침전, DEAE-덱스트란-매개성 형질감염, 폴리브렌-매개성 형질감염, 전기천공, 미세주사, 리포솜 융합, 리포펙션 (lipofection), 원형질 융합, 레트로바이러스성 감염 및 바이오리스틱스 (biolistics)를 포함한, 당해 분야에 공지된 각종 수단에 의해 수행할 수 있다.

용어 "안정한 형질감염" 또는 "안정적으로 형질감염된"이란 외래 DNA를 형질감염된 세포의 게놈 내로 도입 및 통합시키는 것을 지칭한다. 용어 "안정한 형질감염체"는 게놈 DNA 내로 안정적으로 통합된 외래 DNA를 갖는 세포를 지칭한다.

용어 "일시적 형질감염" 또는 "일시적으로 형질감염된"이란 외래 DNA를 세포 내로 도입하였는데, 여기서 외래 DNA가 형질감염된 세포의 게놈 내로 통합되지 못한 것을 지칭한다. 외래 DNA는 형질감염된 세포의 핵에 수 일 동안 존속한다. 이 동안에, 외래 DNA는 조절성 제어되어 염색체에서의 내인성 유전자 발현이 통제된다. 용어 "일시적 형질감염체"는 외래 DNA는 흡수하였지만, 이러한 DNA를 통합하지 못할 수 있는 세포를 지칭한다.

용어 "인산칼슘 공침전"은 핵산을 세포 내로 도입하기 위한 기술을 지칭한다. 세포에 의한 핵산의 흡수는, 핵산이 인산칼슘-핵산 공침전물로서 존재하는 경우에 증강된다. 본래의 기술 [참고: Graham and van der Eb, Virol., 52: 456 (1973)]은 특정한 유형의 세포에 대한 조건을 최적화시키기 위한 여러 그룹에 의해 변형되었다. 당해 분야에는 이러한 수 많은 변형들이 잘 알려져 있다.

본원에 사용된 바와 같은 "소정의 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 조성물"은 광범위하게, 소정의 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 모든 조성물을 지칭한다. 이러한 조성물은 수용액을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 변이체 Fc 영역 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물을 혼성화 프로브로서 이용할 수 있다. 이러한 경우, 변이체 Fc 영역 암호화 폴리뉴클레오티드 서열은 전형적으로, 염 (예: NaCl), 세정제 (예: SDS), 및 기타 성분 (예: 덴하르츠 용액, 분유, 연어 정액 DNA 등)을 함유하는 수용액에 이용된다.

용어 "시험 화합물" 또는 "후보 화합물"은 신체 기능 질환, 질병, 병, 또는 장애를 치료 또는 예방하거나, 또는 그 밖에 특정 샘플의 생리학적 또는 세포성 상태를 변경시키기 위해 사용될 수 있는 모든 화학적 실체, 제약, 약물 등을 지칭한다. 시험 화합물은 공지된 치료적 화합물과 잠재적 치료적 화합물 둘 다를 포함한다. 시험 화합물은 본 발명의 스크리닝 방법을 사용하여 스크리닝함으로써 치료적인 것으로 결정할 수 있다. "공지된 치료적 화합물"은 (예를 들어, 동물 시도를 통하거나 인간에 대한 기존의 투여 경험을 통하여) 치료 또는 예방에 유효한 것으로 밝혀진 치료적 화합물을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은, 검정에 관련하여 사용된 경우의 용어 "반응"은 탐지 가능한 신호의 발생 (예: 리포터 단백질의 축적, 이온 농도의 증가, 탐지 가능한 화학 생성물의 축적)을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "리포터 유전자"는 검정될 수 있는 단백질을 암호화하는 유전자를 지칭한다. 리포터 유전자의 예에는 루시퍼라제 [참고: deWet et al., Mol. Cell. Biol. 7: 725 (1987) and U.S. Pat Nos., 6,074,859; 본원에 참고로 도입됨], 그린 형광성 단백질 [예: 유전자은행 승인 번호 U43284; 수 많은 GFP 변이체가 CLONTECH Laboratories (Palo Alto, CA)로부터 시판되고 있다], 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제, β-갈락토시다제, 알칼리성 포스파타제, 및 서양고추냉이 퍼옥시다제가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "컴퓨터 메모리" 및 "컴퓨터 메모리 장치"는 컴퓨터 프로세서에 의해 판독 가능한 모든 저장 매체를 지칭한다. 컴퓨터 메모리의 예에는 RAM, ROM, 컴퓨터 칩, 디지털 비디오 디스크 (DVDs), 컴팩트 디스크 (CDs), 하드 디스크 드라이브 (HDD), 및 자기 테이트가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "컴퓨터 판독 가능한 매체"는 정보 (예: 데이터 및 지시사항)를 컴퓨터 프로세서에 저장 및 공급하기 위한 모든 장치 또는 시스템을 지칭한다. 컴퓨터 판독 가능한 매체의 예에는 매체를 네트워크 상으로 스트리밍하기 위한 DVDs, CDs, 하드 디스크 드라이브, 자기 테이프 및 서버가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용된 바와 같은, 핵산 또는 아미노산 서열의 "표시물을 컴퓨터 판독 가능한 매체가 암호화하는" 것은 프로세서에 전달될 때, 핵산 서열 또는 아미노산 서열이 사용자에게 표시될 수 있게 해주는 (예를 들어, 프린트되거나 표시 스크 린 상에 제시된다) 정보를 저장하고 있는 컴퓨터 판독 가능한 매체를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "프로세서" 및 "중앙 처리 장치" 또는 "CPU"는 상호 교환적으로 사용되고, 컴퓨터 메모리로부터 프로그램을 판독할 수 있고 (예: ROM 또는 기타 컴퓨터 메모리) 이러한 프로그램에 따른 일련의 단계들을 수행할 수 있는 장치를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은, 면역글로불린 중쇄 내에서의 아미노산 잔기 넘버링은 문헌 [참고: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991); 본원에 참고로 도입된다]에 기재된 같은 EU 인덱스 포맷을 이용하고 있다. 카바트 (Kabat)의 문헌에 기재된 같은 "EU 인덱스 포맷"은 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 "모 폴리펩티드"는 변이체를 생성시키기 위해 변화 또는 변경시킬 수 있는 아미노산 서열 (예: 아미노산 치환, 부가 또는 결실이 이루어진다)을 포함하는 폴리펩티드이다. 바람직한 양태에서는, 모 폴리펩티드가 천연 발생적 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변형 (예: 부가, 결실 및/또는 치환)을 수반한 Fc 영역의 적어도 일부를 포함한다. 몇몇 양태에서는, 모 폴리펩티드 보다 더 짧거나 긴 변이체가 구체적으로 고려된다. 특히 바람직한 양태에서는, 모 폴리펩티드가 변이체와 비교해서 기능 면에서 (예: 효과기 기능, 결합 등) 상이하다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "모 폴리펩티드의 변이체"는 하나 이상의 아미노산 변형에 의해 모 폴리펩티드와 상이한 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 지칭한다. 특정 양태에서는, 변이체가 Fc 영역의 적어도 일부 (예: 40%, 50%, 75% 또는 90% 이상, 또는 Fc 영역)을 포함한다. 바람직한 양태에서는, 변이체가 하나 이상의 아미노산 변형을 수반한 모 폴리펩티드의 Fc 영역을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "Fc 영역"은 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 지칭한다 (예를 들어, 도 1에 도시된 바와 같음). "Fc 영역"은 본래 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 일반적으로 허용된 면역글로불린 중쇄 Fc 영역의 경계가 다양할 수도 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 위치 Cys226에서의 아미노산 잔기 또는 Pro230으로부터 그의 카복실-말단까지의 연장물로 통상 규정된다. 몇몇 양태에서는, 변이체가 Fc 영역의 일부 만을 포함하고, 카복실-말단을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 면역글로불린의 Fc 영역은 일반적으로, 예를 들어 도 1에 도시된 바와 같은 2개의 불변 도메인 CH2와 CH3을 포함한다. 몇몇 양태에서는, 불변 도메인 중의 하나 이상을 갖는 변이체가 고려된다. 기타 양태에서는, 이러한 불변 도메인을 갖지 않거나 (불변 도메인의 일부 만을 갖는) 변이체가 고려된다.

본원에 사용된 바와 같은, "CH2 도메인" ("Cγ2" 도메인으로 지칭되기도 함)은 일반적으로, Fc 영역 (예: 인간 IgG Fc 영역)에서 약 아미노산 231부터 약 아미노산 340까지 연장되는 잔기 연장물을 포함한다. CH2 도메인은 또 다른 도메인과 근접하게 짝짓기하지 않는다는 점에서 독특하다. 오히려, 2개의 N-연결된 분지된 탄수화물 쇄가 타고난 본래 IgG 분자의 2개 CH2 도메인 사이에 삽입된다.

본원에 사용된 바와 같은, "CH3 도메인" ("Cγ3" 도메인으로 지칭되기도 함) 은 일반적으로, Fc 영역에서 CH2 도메인에 대한 C-말단 잔기의 연장물 (예: 인간 IgG Fc 영역의 약 아미노산 잔기 341부터 약 아미노산 잔기 447까지의 연장물)을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은, Fc 영역은 (예를 들어, 특정 대상체에게서의) 생물학적 활성을 활성화 또는 감소시키는데 책임이 있는 "효과기 기능"을 보유할 수 있다. 효과기 기능의 예에는 Clq 결합; 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC); 포식작용; 세포 표면 수용체 (예: B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 효과기 기능은 Fc 영역이 결합 도메인 (예: 항체 가변 도메인)과 결합되는 것을 요구할 수 있고, 이는 각종 검정 (예: Fc 결합 검정, ADCC 검정, CDC 검정, 전혈 또는 분획화 혈액 샘플로부터의 표적 세포 고갈 등)을 이용하여 평가할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "본래 서열 Fc 영역" 또는 "야생형 Fc 영역"은 흔히 천연상 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 지칭한다. 본래 서열 인간 Fc 영역의 예가 도 2에 나타나 있고, 이에는 본래 서열 인간 IgG1 Fc 영역 (f 및 a,z 동종이형); 본래 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 본래 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 본래 서열 인간 IgG4 Fc 영역 뿐만 아니라 그의 천연 발생적 변이체가 포함된다. 본래 서열 뮤린 Fc 영역이 도 2에 도시되기도 한다. 기타 서열이 고려되고, 이는 각종 웹 사이트 (예: NCBI의 웹 사이트)로부터 용이하게 수득된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "변이체 Fc 영역"은 하나 이상의 아미노산 변형 (예: 치환, 삽입 또는 결실)을 통하여 본래 서열 Fc 영역 (또는 그의 일부)와 상이한 아미노산 서열을 지칭하는데, 이에는 중쇄 소단위 서열이 서로 상이할 수 있는 이종-이량체성 변이체가 포함된다. 바람직한 양태에서는, 변이체 Fc 영역이 본래 서열 Fc 영역과 비교해서 하나 이상의 아미노산 치환물 (예: 본래 서열 Fc 영역에서 약 1개 내지 약 10개 아미노산 치환물, 바람직하게는 약 1개 내지 약 5개 아미노산 치환물)을 갖는다. 바람직한 양태에서는, 변이체 Fc 영역이 본래 서열 Fc 영역과 약 80% 이상 상동률, 바람직하게는 약 90% 이상 상동률, 보다 바람직하게는 약 95% 이상 상동률을 나타낼 것이다.

본원에 사용된 바와 같은, 아미노산 서열과 관련하여 사용된 경우의 용어 "상동성(률)"은 최대 상동률을 달성하기 위해 서열들을 정렬하고, 필요한 경우 갭을 도입한 후, 본래의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열 변이체 내의 잔기 비율을 지칭한다.

용어 "Fc 영역-함유 폴리펩티드"는 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드, 예를 들어 항체 또는 면역부착인자 (하기 정의 참고)를 지칭한다.

용어 "Fc 수용체" 및 "FcR"은 Fc 영역 (예: 항체 또는 항체 단편의 Fc 영역)과 결합하는 수용체를 기재하기 위해 사용된다. 상기 용어에는 모계 IgGs를 태아에게 전이시키는데 책임이 있는 신생아 수용체 FcRn이 포함된다.

본원에 사용된 바와 같은, "항체-의존성 세포-매개성 세포독성" 및 "ADCC"는 FcRs를 발현하는 세포독성 세포 (예: 비-특이적) [예: 천연 킬러 (NK) 세포, 호중 구 및 대식세포]가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하여, 연속해서 이러한 표적 세포의 용해를 유발시키는 세포-매개성 반응을 지칭한다. ADCC를 매개하기 위한 일차 세포인 NK 세포는 FcγRIII를 발현하는 반면, 단구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다.

본원에 사용된 바와 같은, "효과기 세포"는 하나 이상의 FcRs를 발현하고 효과기 기능을 수행하는 백혈구를 지칭한다. 바람직하게는, 상기 세포가 적어도 FcγRIII를 발현하고 ADCC 효과기 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 백혈구의 예에는 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 천연 킬러 (NK) 세포, 단구, 세포독성 T 세포 및 호중구가 포함된다. 효과기 세포를 본래 공급원 (예: 혈액)으로부터 분리시킬 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, "전혈"은 분획화되지 않은 혈액 샘플을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은, "변경된" FcR 결합 친화성 또는 ADCC 활성을 지닌 폴리펩티드 변이체는 모 폴리펩티드 또는 본래 서열 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교해서 증강 (즉, 증가) 또는 저하된 (즉, 감소된) FcR 결합 활성 및/또는 ADCC 활성을 나타내는 것이다. FcR에 대하여 "증가된 결합을 표시하는" 폴리펩티드 변이체는 모 폴리펩티드 보다 더 우수한 친화도로 하나 이상의 FcR과 결합한다. FcR에 대하여 "감소된 결합을 표시하는" 폴리펩티드 변이체는 모 폴리펩티드 보다 더 열악한 친화도로 하나 이상의 FcR과 결합한다. 이와 같이 FcR에 대하여 감소된 결합을 표시하는 변이체는 FcR에 대한 인지할 만한 결합이 거의 또는 전혀 없을 수 있는데, 예를 들어 모 폴리펩티드와 비교해서 FcR에 대한 결합이 0 내지 20%일 수 있다. 모 폴리펩티드 보다 "더 우수한 친화도"로 FcR과 결합하는 폴리펩티드 변이체는, 결합 검정에서 폴리펩티드 변이체와 모 폴리펩티드의 양이 본질적으로 동일하고 기타 모든 조건이 동일한 경우에, 모 항체 보다 더 높은 결합 친화도로 상기 확인된 FcRs 중의 하나 이상과 결합하는 것이다. 예를 들어, 개선된 FcR 결합 친화도를 나타내는 폴리펩티드 변이체는, FcR 결합 친화도를 예를 들어, ELISA 검정에서 결정하는 경우에, 모 폴리펩티드와 비교해서 FcR 결합 친화도에서 약 1.10배 내지 약 100배 (보다 전형적으로, 약 1.2 내지 약 50배) 개선 (즉, 증가)를 표시할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, "아미노산 변형"은 소정의 아미노산 서열의 아미노산 서열 상의 변화를 지칭한다. 변형의 예에는 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 바람직한 양태에서는, 아미노산 변형이 (예를 들어, 모 폴리펩티드의 Fc 영역에서의) 치환이다.

본원에 사용된 바와 같은, 명시된 위치 (예: Fc 영역 내의 위치)에서의 "아미노산 변형"은 명시된 잔기를 치환 또는 결실시키거나, 또는 명시된 잔기에 인접하게 하나 이상 아미노산 잔기를 삽입하는 것을 지칭한다. 명시된 잔기에 "인접하게" 삽입하는 것은, 그의 1개 또는 2개 잔기 내에 삽입하는 것을 의미한다. 이러한 삽입은 명시된 잔기에 대해 N-말단 또는 C-말단일 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, "아미노산 치환"은 소정의 아미노산 서열 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산 잔기를 또 다른 상이한 "대체" 아미노산 잔기로 대체시키는 것을 지칭한다. 이러한 대체 잔기(들)는 "천연 발생적 아미노산 잔기" ( 즉, 유전자 암호에 의해 암호화됨)일 수 있고, 이는 다음 중에서 선택된다: 알라닌 (Ala); 아르기닌 (Arg); 아스파라긴 (Asn); 아스파르트산 (Asp); 시스테인 (Cys); 글루타민 (Gln); 글루탐산 (Glu); 글리신 (Gly); 히스티딘 (His); 이소루이신 (Ile); 루이신 (Leu); 리신 (Lys); 메티오닌 (Met); 페닐알라닌 (Phe); 프롤린 (Pro); 세린 (Ser); 트레오닌 (Thr); 트립토판 (Trp); 티로신 (Tyr); 및 발린 (Val). 하나 이상의 비-천연 발생적 아미노산 잔기로의 치환 역시 본원의 아미노산 치환의 정의에 포괄된다. "비-천연 발생적 아미노산 잔기"는 폴리펩티드 쇄 내의 인접한 아미노산 잔기(들)와 공유적으로 결합할 수 있는, 상기 열거된 천연 발생적 아미노산 잔기 이외의 잔기를 지칭한다. 비-천연 발생적 아미노산 잔기의 예에는 노르루이신, 오르니틴, 노르발린, 호모세린 및 다음 문헌에 기재된 바와 같은 기타 아미노산 잔기 유사체가 포함된다 [참고: Ellman et al. Meth. Enzym. 202: 301-336 (1991); 본원에 참고로 도입된다].

본원에 사용된 바와 같은, "아미노산 삽입"은 하나 이상의 아미노산을 소정의 아미노산 서열 내로 혼입하는 것을 지칭한다. 바람직한 양태에서는, 삽입이 통상적으로, 1개 또는 2개 아미노산 잔기의 삽입일 것이다. 기타 양태에서는, 보다 큰 펩티드 삽입 (예를 들어, 약 3개 내지 약 5개 또는 심지어 약 10개 이하 아미노산 잔기의 삽입)이 포함된다.

본원에 사용된 바와 같은, "아미노산 결실"은 하나 이상의 아미노산 잔기를 소정의 아미노산 서열로부터 제거하는 것을 지칭한다.

용어 "검정 신호"는 비색 검정으로부터의 흡광도 측정, 형광 세기, 또는 분 당 붕해도를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 단백질-단백질 상호 작용을 탐지하는 모든 방법으로부터의 출력 (산출)을 지칭한다. 검정 포맷에는 ELISA, facs, 또는 기타 방법이 포함될 수 있다. "검정 신호" 상의 변화는 세포 생육성 상의 변화 및/또는 동력학적 이탈 속도, 동력학적 작동 속도, 또는 둘 다 상의 변화를 반영해줄 수 있다. "보다 높은 검정 신호"는 측정된 출력 수가 또 다른 수 보다 더 큰 것을 지칭한다 (예를 들어, 변이체는 모 폴리펩티드와 비교해서 ELISA 검정에서 보다 높은 (보다 큰) 측정 수를 나타낼 수 있다). "보다 낮은" 검정 신호는 측정된 출력 수가 또 다른 수 보다 더 작은 것을 지칭한다 (예를 들어, 변이체는 모 폴리펩티드와 비교해서 ELISA 검정에서 보다 낮은 (보다 작은) 측정 수를 나타낼 수 있다).

용어 "결합 친화도"는 각 Fc 수용체-Fc 결합 상호 작용과 연관된 평형 해리 상수 (농도 단위로 표현됨)를 지칭한다. 결합 친화도는 동력학적 이탈 속도 (일반적으로 역 시간 단위, 예를 들어 sec^-1로 보고됨)를 동력학적 작동 속도 (일반적으로 단위 시간당 농도 단위, 예를 들어 molar/sec로 보고됨)을 나눈 비율과 직접 관계가 있다. 일반적으로, 작동 속도 및 이탈 속도와 같은 파라미터 각각을 (예를 들어, BIACORE 또는 SAPIDYNE 측정에 의해) 실험적으로 결정하지 않는 경우에는, 평형 해리 상수의 변화가 이들 작동 속도, 이탈 속도, 또는 둘 다에 있어서의 차이에 기인된 것인지를 명료하게 언급하는 것은 가능하지 않다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "힌지 영역"은 인간 IgGl의 Glu216에서부터 Pro230까지 연장되는 인간 IgGl 내의 아미노산 연장물을 지칭한다. 기타 IgG 이소 형의 힌지 영역은 동일한 위치에 중쇄 간 S-S 결합을 형성하는 첫 번째 시스테인과 마지막 시스테인을 놓아둠으로써 IgGl 서열과 정렬시킬 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, Fc 영역의 "보다 낮은 힌지 영역"은 힌지 영역에 대한 C-말단 바로 가까이에 있는 아미노산 잔기 연장물을 지칭한다 (예: IgGl의 Fc 영역의 잔기 233 내지 239).

"Clq"는 면역글로불린의 Fc 영역에 대한 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드이다. Clq는 2개의 세린 프로테아제인 Clr 및 Cls와 함께, 복합체 C1을 형성하는데, 이는 보체 의존성 세포독성 (CDC) 경로의 제1 성분이다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "항체"는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 구체적으로 언급하면 모노클로날 항체 (완전한 길이의 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다중-특이적 항체 (예: 이중-특이적 항체) 및 항체 단편을 포괄하는데, 단 이들은 목적하는 생물학적 활성을 나타내야 한다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "항체 단편"은 본래 항체의 일부를 지칭한다. 항체 단편의 예에는 선형 항체; 단일 쇄 항체 분자; Fc 또는 Fc' 펩티드, Fab 및 Fab 단편, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중-특이적 항체가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 항체 단편은 바람직하게, IgG 중쇄의 힌지 영역 및 임의의 CH1 영역의 적어도 일부를 보유하고 있다. 기타 바람직한 양태에서는, 항체 단편이 CH2 영역의 적어도 일부 또는 전체 CH2 영역을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은, 모노클로날 항체와 관련하여 사용된 경우의 용어 "기능적 단편"은 기능적 활성을 여전히 보유하고 있는 모노클로날 항체의 일부를 지칭한다. 기능적 활성은, 예를 들어 항원 결합 활성 또는 특이성일 수 있다. 모노클로날 항체 기능적 단편에는, 예를 들어 개개의 중쇄 또는 경쇄 및 그의 단편, 예를 들면, VL, VH 및 Fd; 1가 단편, 예를 들면, Fv, Fab, 및 Fab'; 2가 단편, 예를 들면, F(ab')₂; 단일 쇄 Fv (scFv); 및 Fc 단편이 포함된다. 이러한 용어는, 예를 들어 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Harlowe and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Myers, R.A. (ed.), New York: VCH Publisher, Inc.); Huston et al., Cell Biophysics, 22: 189-224 (1993); Pluckthun and Skerra, Meth. Enzymol., 178: 497-515 (1989) and in Day, E. D., Advanced Immunochemistry, Second Ed., Wiley-Liss, Inc., New York, NY (1990); 이들 문헌 전부는 본원에 참고로 도입된다]. 용어 기능적 단편에는 예를 들어, 모노클로날 항체의 프로테아제 분해 또는 환원에 의해 생성된 단편, 및 당업자에게 공지된 재조합 DNA 방법에 의해 생성된 단편이 포함된다.

본원에 사용된 바와 같은, 비-인간 (예: 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 서열을 최소한 함유하거나 전혀 함유하지 않는 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기를, 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 지니고 있는 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 랫트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역 (공여자 항체)으로부터의 잔기로 대체시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 몇몇 경우에 있어, 인간 면역 글로불린의 Fv 골격 영역 (FR) 잔기를 상응하는 비-인간 잔기로 대체시킨다. 더우기, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 일반적으로, 항체 성능을 추가로 개선시키기 위해 만들어진 것이다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 전부 포함할 것인데, 초가변 루프의 전부 또는 실질적으로 전부는 비-인간 면역글로불린에 상응하고 FR 잔기의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수도 있다. 인간화 항체를 생성시키기 위해 사용된 방법의 예가 미국 특허 제5,225,539호 (Winter et al.) (본원에 참고도 도입된다)에 기재되어 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "초가변 영역"은 항원 결합에 대해 책임이 있는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 [즉, 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), 및 중쇄 가변 도메인 내의 잔기 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3); 참고: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 및/또는 "초가변 루프"로부터의 아미노산 잔기 [즉, 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3), 및 중쇄 가변 도메인 내의 잔기 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); 참고: Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917]을 포함한다. "골격 영역" 또는 "FR" 잔기는 본원에 규정된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "면역부착인자"는 이종 "부착인자" 단백질 (예: 수용체, 리간드 또는 효소)의 결합 도메인을 면역글로불린 불변 도메인과 결합시킨 항체-유사 분자를 지칭한다. 구조적으로, 면역부착인자는 (즉, "이종"인) 항체의 항원 인식 및 결합 부위 (항원 결합 부위) 이외의 목적하는 결합 특이성을 지닌 부착인자 아미노산 서열과, 면역글로불린 불변 도메인 서열의 융합물을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "리간드 결합 도메인"은 모든 본래 수용체, 또는 상응하는 본래 수용체의 최소한 정성적 리간드 결합 능력을 보유하고 있는 그의 모든 영역 또는 유도체를 지칭한다. 특정 양태에서는, 리간드가 면역글로불린 슈퍼유전자계열의 구성원에 대해 동종인 세포외 도메인을 갖는 세포-표면 폴리펩티드로부터의 것이다. 면역글로불린 슈퍼유전자계열의 구성원은 아니지만, 그럼에도 불구하고 상기 정의에 구체적으로 포괄되는 기타 수용체는 사이토킨에 대한 수용체, 및 특히 티로신 키나제 활성을 지닌 수용체 (수용체 티로신 키나제), 헤마토포이에틴 및 신경 성장 인자 수용체 슈펴계열의 구성원, 및 세포 부착 분자 (예: E-, L-, 및 P-셀렉신)이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "수용체 결합 도메인"은 특정 수용체에 대한 모든 본래 리간드를 지칭하는데, 이에는 세포 부착 분자, 또는 상응하는 본래 리간드의 최소한 정성적 수용체 결합 능력을 보유하고 있는 본래 리간드의 모든 영역 또는 유도체가 포함된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체-면역부착인자 키메라"는 항체의 하나 이상의 결합 도메인을 하나 이상의 면역부착인자와 결합시킨 분자를 포함한다. 이의 예에는 문헌 [참고: Berg et al., PNAS (USA) 88: 4723-4727 (1991) and Charnow et al., J. Immunol., 153: 4268 (1994); 이들 문헌 둘 다 본원에 참고로 도입된다]에 기재된 이중-특이적 CD4-IgG 키메라가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "분리된" 폴리펩티드는 그의 천연 환경 성분으로부터 확인하고 격리 및/또는 회수한 것이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 폴리펩티드에 대한 진단적 또는 치료적 용도를 방해할 수도 있는 물질이며, 이에는 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질이 포함될 수 있다. 특정 양태에서는, 분리된 폴리펩티드가 (1) 로우리 (Lowry) 방법에 의해 결정된 바와 같이 폴리펩티드의 95 중량% 초과, 바람직하게는 99 중량% 이상이 되도록 정제하거나, (2) 스피닝 컵 (spinning cup) 서열 분석기를 사용함으로써 내부 아미노산 서열 또는 N-말단의 15개 이상 잔기를 수득하기에 충분한 정도로 정제하거나, 또는 (3) 쿠마시 블루 (Coomassie blue) 또는 은 염색을 이용하여 환원성 또는 비-환원성 조건 하에 SDS-page에 의해 균질해지도록 정제한다. 분리된 폴리펩티드에는 폴리펩티드의 천연 환경의 적어도 한 가지 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내의 계내 폴리펩티드가 포함된다. 그러나, 통상적으로 분리된 폴리펩티드는 한 가지 이상 정제 단계에 의해 제조될 것이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료 (처치)"는 치료적 처치 및 예방적 처치 둘 다를 지칭한다. 처치를 필요로 하는 대상체에는 이미 해당 질환을 앓고 있는 대상체 뿐만 아니라 이러한 질환을 예방하고자 하는 대상체가 포함된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "질환"은 폴리펩티드 변이체를 이용한 처치로부터 이득을 얻을 수 있는 모든 상태를 지칭하는데, 이에는 만성 및 급성 질환 또는 질병 (예: 환자가 특정 질환에 걸리기 쉽게 하는 병리학적 상태)이 포함된다. 특정 양태에서는, 질환이 암이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징적으로 나타내는 포유류의 생리적 상태를 지칭하거나 이를 기재한 것이다. 암의 예에는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예에는 편평 세포암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평 암종, 복막암, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선 암, 간 암종 및 각종 유형의 두경부암이 포함된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "HER2-발현성 암"은 세포 표면에 존재하는 HER2 수용체 단백질 (예: 유전자은행 승인 번호 X03363)을 갖는 세포를 포함하는 것이기 때문에, 항-HER2 항체는 이러한 암과 결합할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "표지"는 폴리펩티드에 직접 또는 간접적으로 접합되는 탐지 가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 표지 그 자체가 탐지 가능할 수 있거나 (예: 방사성 동위원소 표지 또는 형광성 표지), 또는 효소적 표지의 경우에는 탐지 가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "제어 요소", "제어 서열" 및 "조절성 요소"는 핵산 서열 발현의 몇몇 국면을 제어하는 유전 요소를 지칭한다. 예를 들어, 프로모터는 작동적으로 연결된 암호화 영역의 전사 개시를 촉진시켜 주는 조절성 요소이다. 기타 조절성 요소에는 스플라이싱 신호, 폴리아데닐화 신호, 종결 신호 등이 포함된다. 예를 들어, 원핵 생물에 적합한 제어 요소에는 프로모터, 임의로 작동인자 서열, 및 리보솜 결합 부위가 포함된다. 진핵성 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 증강인자를 활용하는 것으로 공지되어 있다.

본원에 사용된 바와 같은, 핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 상관 관계를 이루고 있을 때 "작동적으로 연결"된다. 예를 들어, 프리서열 (presequence) 또는 분비성 리더에 대한 DNA는, 그것이 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프리단백질로서 발현되는 경우에는 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동적으로 연결되거나; 프로모터 또는 증강인자는, 그것이 서열 전사에 영향을 미치는 경우에는 암호화 서열에 작동적으로 연결되거나; 또는 리보솜 결합 부위는, 그것이 해독을 촉진시키도록 위치된 경우에는 암호화 서열에 작동적으로 연결된다. 바람직한 양태에서, "작동적으로 연결된"이란 연결되는 DNA 서열이 연속되고, 분비성 리더의 경우에는 판독 프레임 내에 연속된다는 것을 의미한다. 그러나, 예를 들어 증강인자는 연속되지 않는다. 연결은, 예를 들어 편리한 제한 부위에서 연결함으로써 수행할 수 있다. 이러한 부위가 존재하지 않는 다면, 합성 올리고뉴클레오티드 적응인자 또는 링커를 통상적인 실시에 따라서 사용할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호 교환적으로 사용되고 이러한 명칭 모두에는 자손이 포함된다. 따라서, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"에는 일차 대상 세포, 및 전이 횟수에 상관없이 그로부터 유래된 배양물이 포함된다. 모든 자손이 고의적이거나 우연한 돌연변이로 인해 DNA 내용에 있어 정확하게 동일하지 않을 수 있다는 것을 인지해야 한다. 본래의 형질전환된 세포에 대해 스크리닝된 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 지닌 돌연변이체 자손이 포함된다. 별개의 명칭을 사용한 경우에는, 다음 기재 내용으로부터 명백히 알 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, "분석물"은 분석하고자 하는 물질을 지칭한다. 바람직한 분석물은 Fc 수용체와 결합할 수 있는 능력을 알아보기 위해 분석하고자 하는 Fc 영역 함유 폴리펩티드이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "수용체"는 하나 이상의 리간드와 결합할 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다. 바람직한 수용체는 세포외 리간드-결합 도메인, 및 임의로 기타 도메인 [예: 막관통 도메인, 세포내 도메인 및/또는 막 앵커 (anchor)]를 갖는 세포-표면 또는 가용성 수용체이다. 본원에 기재된 검정에서 평가하고자 하는 수용체는 본래 수용체 또는 그의 단편 또는 유도체 (예: 하나 이상의 이종 폴리펩티드와 융합된 수용체의 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질)일 수 있다. 더우기, 그의 결합 특성을 알아보기 위해 평가하고자 하는 수용체는 특정 세포에 존재할 수 있거나, 검정 판 또는 몇몇 기타 고체 상에서 분리 및 임의로 피복시키거나, 또는 직접 표지시킨 다음 프로브로서 사용할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "CHO-발현된 폴리펩티드"는 중국산 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 재조합적으로 발현시킨 폴리펩티드를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체 반응성 질환"은 적어도 부분적으로는 항체 요법을 이용하여 치료 가능한 것으로 밝혀진 모든 질환 또는 의학적 상태를 지칭한다. 이러한 질환 및 의학적 상태의 예에는 림프종 (RITUXAN을 이용하여 치료 가능한 것으로 밝혀짐), 감염성 질환 (SYNAGIS을 이용하여 치료 가능한 것으로 밝혀짐), 신장 이식술 (ZENAPAX이 도움이 되는 것으로 밝혀짐), 크론병 및 류마티스성 관절염 (REMICADE을 이용하여 치료 가능한 것으로 밝혀짐), 유방 암종 (HERCEPTIN을 이용하여 치료 가능한 것으로 밝혀짐), 및 결장암 (EDRECOLOMAB을 이용하여 치료 가능한 것으로 밝혀짐)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "면역부착인자 반응성 질환"은 적어도 부분적으로는 면역부착인자 요법을 이용하여 치료 가능한 것을 밝혀진 모든 질환 또는 의학적 상태를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은, "인간 효과기 세포의 존재 하에, 모 항체 보다 더 효과적으로 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하는" 폴리펩티드 변이체는 검정에 사용된 폴리펩티드 변이체와 모 항체의 양이 본질적으로 동일한 경우에, 시험관내 또는 생체 내에서 ADCC를 매개하는데 있어 실질적으로 더 효과적인 것이다. 예를 들어, 이러한 변이체는 소정의 ADCC 검정에서 모 폴리펩티드 보다 더 많은 양의 표적 세포를 용해시킨다. 상기 변이체는, 예를 들어 ADCC 검정을 이용하여 확인할 수 있지만, ADCC 활성을 결정하기 위한 기타 검정 또는 방법을 이용 할 수도 있다 (예: 동물 모델). 바람직한 양태에서는, 폴리펩티드 변이체가 ADCC를 매개하는데 있어서 모 폴리펩티드 보다 약 1.2배, 1.5배, 50배, 100배, 약 500배, 또는 약 1000배 더 효과적이다.

본원에 사용된 바와 같은, 모 항체 보다 "더 효과적으로 전혈로부터의 항체-의존성 B 세포 고갈을 매개하는" 폴리펩티드 변이체는 검정에 사용된 폴리펩티드 변이체와 모 항체의 양이 본질적으로 동일한 경우에, 시험관내 또는 생체 내에서 B 세포 고갈을 매개하는데 있어 실질적으로 더 효과적인 것이다. 예를 들어, 이러한 변이체는 소정의 검정에서 모 폴리펩티드 보다 더 높은 정도로 B 세포 고갈을 유발시킨다. 또한, 상기 변이체는 동일한 검정에서 모 폴리펩티드에 요구되는 바와 동일한 정도이긴 하지만, 이 보다 낮은 농도에서 B 세포를 고갈시킬 수 있다. 상기 변이체는, 예를 들어 ADCC 검정을 이용하여 확인할 수 있지만, ADCC 활성을 결정하기 위한 기타 검정 또는 방법을 이용할 수도 있다 (예: 동물 모델). 바람직한 양태에서는, 모 폴리펩티드와 비교해서 고갈을 증강시키는 것은 위치 158 (V 또는 F)에서의 FcRIIIa 유전자형 및 위치 131 (H 또는 R)에서의 FcRIIa 유전자형과 독립적 (비-의존성)이며, 폴리펩티드 변이체는 B 세포 고갈을 매개하는데 있어서 모 폴리펩티드 보다 약 1.2배, 1.5배, 50배, 100배, 약 500배, 또는 약 1000배 더 효과적이다.

"항체 또는 면역부착인자 반응성 질환 증상"은 특정한 질환과 일반적으로 연관된 증상들을 지칭한다. 예를 들어, 크론병과 통상 연관된 증상에는 복통, 설사, 직장 출혈, 체중 감소, 발열, 식욕 감퇴, 탈수, 빈혈, 팽만, 섬유증, 염증성 장 및 영양실조가 포함된다.

"증상이 저하되도록 하는 조건 하에"란 항체 또는 면역부착인자 반응성 질환의 탐지 가능한 증상에 있어 정성적 또는 정량적 저하 정도를 지칭하는데, 이에는 질환으로부터의 회복 속도 (예: 체중 증가 속도)에 탐지 가능한 수준으로 영향을 미치거나, 또는 특정한 질환과 통상적으로 연관된 한 가지 이상 증상 저하 (예를 들어, 항체 또는 면역부착인자 반응성 질환이 크론병인 경우, 다음 증상들 중의 한 가지 이상 증상 저하: 복통, 설사, 직장 출혈, 체중 감소, 발열, 식욕 감퇴, 탈수, 빈혈, 팽만, 섬유증, 염증성 장 및 영양실조)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 폴리펩티드 Fc 영역 변이체, 및 Fc 영역 변이체를 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 구체적으로 언급하면, 본 발명은 신규한 Fc 영역 변이체를 포함하는 조성물; 유용한 Fc 영역 변이체를 확인하는 방법; 및 질환을 치료하기 위해 Fc 영역 변이체를 이용하는 방법을 제공한다. 본 발명의 상세한 설명은 다음 섹션으로 제공된다: I.) 항체 Fc 영역; II.) 변이체 Fc 영역; III.) 조합 변이체; IV.) 변이체 폴리펩티드 검정; V.) 예시적인 변이체 Fc 영역 함유 분자; VI.) Fc 영역 변이체를 암호화하는 핵산 서열; VII.) 치료적 용도 및 제형화; VIII.) 부가의 변이체 Fc 영역 용도.

I. 항체 Fc 영역

상기 언급된 바와 같이, 항체는 비-항원 결합 기능에 관여하는 영역, 주로 CH2 및 CH3 영역을 갖는다. 이들 영역은 함께, 일반적으로 Fc 영역으로서 공지되어 있고, 효과기 분자의 결합에 의해 매개된 몇 가지 효과기 기능을 지닌다.

항체 Fc 영역에 의해 매개된 효과기 기능은 다음 2가지 카테고리로 나눠질 수 있다: (1) 항원에 대한 항체 결합 후에 작동하는 효과기 기능 [이러한 기능은 예를 들어, 보체 케스테이드 또는 Fc 수용체 (FcR)-보유 세포의 참여와 관련이 있다]; 및 (2) 항원 결합과 독립적으로 작동하는 효과기 기능 [이러한 기능은 예를 들어, 순환시 존속할 수 있게 해주고 트랜스사이토시스 (transcytosis)에 의해 세포 장벽을 가로질러 전이될 수 있는 능력을 부여해준다]. 예를 들어, 보체의 Cl 성분이 항체와 결합되면, 보체 시스템이 활성화된다. 옵소닌화 (opsonization) 후, 보체 활성화가 세포 병원체의 용해에 있어 중요하다. 보체 활성화는 염증성 반응을 자극하기도 하고 자가면역 과민증에 관여할 수도 있다. 추가로, 항체는 Fc 영역을 통하여 세포와 결합하는데, 항체 Fc 영역 상의 Fc 수용체 결합 부위가 특정 세포 상의 Fc 수용체 (FcR)와 결합한다. 상이한 부류의 항체에 대해 특이적인 수 많은 Fc 수용체가 있는데, 이에는 IgG (감마 수용체), IgE (에타 수용체), IgA (알파 수용체) 및 IgM (뮤 수용체)가 포함된다. 본 발명이 특정한 어떠한 기전으로도 제한되지 않지만, 세포 표면 상의 Fc 수용체에 대한 항체의 결합은 중요하고도 다양한 수 많은 생물학적 반응을 촉발시키는데, 이러한 반응에는 항체-피복된 입자를 빨아들여 파괴시키고; 면역 복합체를 제거(청소)하며; 항체-피복된 표적 세포를 킬러 세포에 의해 용해시키고 (항체-의존성 세포-매개성 세포독성, 또는 ADCC로 불리운다); 염증성 매개인자를 방출시키며; 태반 이동시키고; 면역글로불린 생산을 제어하는 것이 포함된다.

몇 가지 항체 효과기 기능은 항체의 Fc 영역과 결합하는 Fc 수용체 (FcRs)에 의해 매개된다. FcRs는 면역글로불린 이소형에 대한 그들의 특이성에 의해 규정되는데; IgG 항체에 대한 Fc 수용체는 FcγR로서 지칭되고, IgE 항체에 대한 Fc 수용체는 FcεR로서 지칭되며, IgA항체에 대한 Fc 수용체는 FcαR로서 지칭된다. 3가지 아부류의 FcγR이 확인 (동정)되었다: FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16).

각 FcγR 아부류는 2개 또는 3개의 유전자에 의해 암호화되고, 대체 RNA 스플라이싱은 다중 전사체를 유발시키기 때문에, FcγR 이소형에 있어 광범위한 다양성이 존재한다. FcγRI 아부류 (FcγRIA, FcγRIB 및 FcγRIC)를 암호화하는 3개의 유전자는 제1번 염색체 장완 (long arm)의 영역 lq21.1에 군집되어 있고; FcγRII 이소형 (FcγRIIA, FcγRIIB 및 FcγRIIC)을 암호화하는 유전자와, FcγRIII (FcγRIIIA 및 FcγRIIIB)를 암호화하는 2개의 유전자는 모두 영역 lq22에 군집되어 있다. 이들 상이한 FcR 아유형은 상이한 세포 유형 상에 발현된다 [참고: Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991)]. 예를 들어, 인간에서는 FcγRIIIB가 호중구에서만 발견되는 반면, FcγRIIIA는 대식세포, 단구, 천연 킬러 (NK) 세포, 및 T-세포의 아집단 상에서 발견된다. 특히, FcγRIIIA는 NK 세포 상에 존재하는데, 이는 ADCC에 영향을 미친 세포 유형들 중의 하나이다.

인간 FcγRIIIA (CD16) 수용체는, 위치 158에서 페닐알라닌 또는 발린을 암호화하는 그의 세포외 도메인 내의 상기 위치 158에서 통상의 다형성을 나타낸다. FcγRIIIA의 V 대립 유전자는 인간 IgGl에 대한 친화도가 F 대립 유전자 보다 더 높다. V158 대립 유전자는 ADCC를 보다 효율적으로 매개하기도 한다. 임상 데이터는 리툭산 (Rituxan) 처치를 진행중인 환자에서의 FcγRIIIA 수용체의 유전자형과 치료적 반응 간에는 상관이 있다는 사실을 제시하였다. 임상 및 분자 반응과 진행 시간 둘 다는 FcγRIIIA-158V 유전자형에 대해 동형접합성인 환자에게서 탁월한 것으로 밝혀졌다 (집단의 대략 20%). 이와는 달리, 보다 낮은 친화도 FcγRIIIA-158F 유전자형에 대해 동형접합성 또는 이형접합성인 환자 (집단의 대략 80%)는 보다 불량하게 반응한다. 이들 데이터는 158F 운반체의 ADCC 활성을 증강시키는 Fc 돌연변이가, 항체에 의거한 암 요법의 임상 효능을 증강시킬 수도 있다는 것을 제안하고 있다. 위치 131에서 히스티딘 (H) 또는 아르기닌 (R)을 암호화하는 그의 세포외 도메인 내의 상기 위치 131에서의 인간 FcγRIIA (CD32) 수용체 내에 유전적 다형성이 존재하기도 한다. 위치 131에서의 다형성은 인간 IgG와 결합할 수 있는 그의 능력에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 최근의 데이터는 또한, FcγRIIA 위치 131 다형성과 리툭산에 대한 임상 반응 간에는 상관이 있다는 사실을 보여준다. H131 대립 유전자에 대해 동형접합성인 환자는 기타 2개 군 보다 상당히 더 높은 반응 속도를 나타내었다.

FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII은 면역글로불린 슈퍼계열 (IgSF) 수용체인데; FcγRI은 그의 세포외 도메인 내에 3개의 IgSF 도메인을 갖고 있는 반면, FcγRII 및 FcγRIII은 그들의 세포외 도메인 내에 단지 2개의 IgSF 도메인 만을 갖고 있다.

또 다른 유형의 Fc 수용체는 신생아 Fc 수용체 (FcRn)이다. FcRn는 주요 조직적합성 복합체 (MHC)와 구조적으로 유사하고, β2-마이크로글로빈과 비-공유적으로 결합된 α-쇄로 이루어진다.

II. 변이체 Fc 영역

본 발명은 폴리펩티드 변이체, 이러한 폴리펩티드 변이체를 암호화하는 핵산 서열, 및 폴리펩티드 변이체의 생성 방법을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드 변이체가 하나 이상의 아미노산 변형에 의해 모 폴리펩티드와 상이하다. "모", "야생형", "출발" 또는 "비-변이체" 폴리펩티드는 바람직하게, 항체 Fc 영역의 적어도 일부를 포함하고, 이는 Fc 영역 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드를 생성시키기 위해 당해 분야에서 이용 가능한 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 바람직한 양태에서는, 모 폴리펩티드가 항체이다. 그러나, 모 폴리펩티드는 Fc 영역의 적어도 일부를 포함하는 기타 모든 폴리펩티드 (예: 면역부착인자)일 수 있다. 특정 양태에서는, 변이체 Fc 영역을 생성시킬 수 있고 (예를 들어, 본원에 기재된 방법에 따라서 생성시킴), 이를 선택된 이종 폴리펩티드, 예를 들어 항체 가변 도메인, 또는 수용체 또는 리간드의 결합 도메인과 융합시킬 수 있다.

바람직한 양태에서는, 모 폴리펩티드가 Fc 영역 또는 그의 기능적 부분을 포함한다. 일반적으로, 모 폴리펩티드의 Fc 영역은 본래 서열 Fc 영역, 바람직하게는 인간 본래 서열 Fc 영역을 포함할 것이다. 그러나, 모 폴리펩티드의 Fc 영역은 본래 서열 Fc 영역으로부터 하나 이상의 기존의 아미노산 서열 변경 또는 변형을 가질 수 있다. 예를 들어, Fc 영역의 Clq 결합 활성은 이미 변경시켰을 수도 있거나 Fc 영역의 FcγR 결합 친화성을 변경시켰을 수도 있다. 추가 양태에서는, 모 폴리펩티드 Fc 영역이 개념적이고 (예를 들어, 정신적 사고이거나 컴퓨터 또는 종이 상의 가시적 표시물), 이것이 물리적으로 존재하지 않는다 할지라도, 항체 엔지니어는 목적하는 변이체 Fc 영역 아미노산 서열을 결정할 수 있고, 이러한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 목적하는 변이체 Fc 영역 아미노산 서열을 암호화하는 DNA를 생성시킬 수 있다. 그러나, 바람직한 양태에서는 모 폴리펩티드의 Fc 영역을 암호화하는 핵산이 입수 가능하고, 이러한 핵산 서열을 변경시켜 Fc 영역 변이체를 암호화하는 변이체 핵산 서열을 생성시킨다.

모 폴리펩티드의 변이체를 암호화하는 핵산은 특정한 서열에 대한 본 명세서의 지침을 이용하여 당해 분야에 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 이러한 방법에는 앞서 제조된, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 부위-지시된 (또는 올리고뉴클레오티드-매개된) 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발 및 카세트 돌연변이 유발에 의한 제조가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 부위-지시된 돌연변이 유발이 변이체를 제조하는데 바람직한 방법이다. 이러한 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있다 [참고: Carter et al. Nucleic Acids Res. 13: 4431-4443 (1985) and Kunkel et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488 (1987); 이들 문헌 둘 다 본원에 참고로 도입된다]. 간략하게 언급하면, DNA의 부위 지시된 돌연변이 유발을 수행하는데 있어서, 출발 DNA를 먼저, 목적하는 돌연변이물(들)을 암호화하는 1개 또는 수 개의 올리고뉴클레오티드(들)를 출발 DNA의 단일 가닥과 동시에 혼성화시킴으로써 변경시킨다. 혼성화한 후, 프라이머로서 상기 혼성화된 올리고뉴클레오티드(들)를 사용하고 주형으로서 출발 DNA의 단일 가닥을 사용하여, DNA 폴리머라제를 이용하여 완전한 제2 가닥을 합성하며, DNA 리가제를 이용하여 제2 가닥을 연결시켜 환상의 이중 가닥 DNA를 형성시킨다. 이로써, 목적하는 돌연변이물을 암호화하는 올리고뉴클레오티드가, 상기 생성된 이중 가닥 DNA에 혼입된다.

PCR 돌연변이 유발은 출발 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체를 제조하는데 적합하기도 하다 [참고: Vallette et al., Nuc. Acids Res. 17: 723-733 (1989); 본원에 참고로 도입된다]. 간략하게 언급하면, PCR 내의 출발 물질로서 소량의 주형 DNA를 사용하는 경우, 주형 DNA 내의 상응하는 영역과 서열 면에서 약간 상이한 프라이머를 이용하여, 프라이머가 주형과 상이한 위치에서만 주형 서열과 상이한 특이적 DNA 단편을 비교적 다량 생성시킬 수 있다.

변이체를 제조하기 위한 또 다른 방법인 카세트 돌연변이 유발은 문헌 [참고: Wells et al., Gene 34: 315-323 (1985); 본원에 참고로 도입된다]에 기재된 기술에 의거한다. 출발 물질은 돌연변이될 출발 폴리펩티드 DNA을 포함하는 플라스미드 (또는 벡터)이다. 돌연변이될 출발 DNA 내의 코돈(들)을 확인한다. 이와 같이 확인한 돌연변이 부위(들)의 각 측면에는 독특한 제한 엔도뉴클레아제가 존재해야만 한다. 이러한 제한 부위가 존재하지 않는 경우에는, 이를 출발 폴리펩티드 DNA 내의 적당한 위치에 도입하기 위해 상기 언급된 올리고뉴클레오티드-매개된 돌연변이 유발 방법을 이용하여 생성시킬 수 있다. 플라스미드 DNA를 이들 부위에서 절단하여 선형화시킨다. 목적하는 돌연변이물(들)을 함유하는, 제한 부위들 사이의 DNA 서열을 암호화하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 표준 과정을 이용하여 합성하는데, 여기서는 올리고뉴클레오티드의 2개 가닥을 개별적으로 합성한 다음, 표준 기술을 이용하여 함께 혼성화한다. 이러한 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드가 카세트로서 지칭된다. 이러한 카세트는 선형화 플라스미드의 말단들과 화합성인 5' 및 3' 말단을 갖도록 고안되어, 플라스미드에 직접 연결시킬 수 있다. 이러한 플라스미드는 현재, 돌연변이된 DNA 서열을 함유하고 있다.

또 다른 한편, 또는 부가적으로, 폴리펩티드 변이체를 암호화하는 목적 아미노산 서열을 결정할 수 있고, 이러한 아미노산 서열 변이체를 암호화하는 핵산 서열을 합성적으로 생성시킬 수 있다.

모 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변형시켜, 시험관내 및/또는 생체 내에서 Fc 수용체 결합 친화성 또는 활성이 변경되고/되거나 시험관내 및/또는 생체 내에서 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC) 활성이 변경된 변이체 Fc 영역을 생성시킬 수 있다. 모 폴리펩티드의 아미노산 서열을 또한 변형시켜, 보체 결합 특성 및/또는 순환 반감기가 변경된 변이체 Fc 영역을 생성시킬 수 있다.

Fc 영역의 생물학적 특성에 있어서의 상당한 변형은 (a) 치환 부위 내의 폴리펩티드 주쇄 구조, 예를 들어, 시트 또는 나선형 입체 형태로서의 구조를 변경시키거나, (b) 표적 부위에서의 분자의 전하 또는 소수성, 또는 측쇄의 벌크를 변경시키거나, (d) 탄수화물과의 상호 작용을 변경시키거나, 또는 (e) 도메인 이동 가요성을 변경시키는데 있어서의 그들의 효과 면에서 상당히 상이한 치환을 선택함으로써 수행할 수 있다. 천연 발생적 잔기는 공통의 측쇄 특성을 근거로 하여 다음 부류로 나눈다:

(1) 소수성: 노르루이신, met, ala, val, leu, ile;

(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;

(3) 산성: asp, glu;

(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;

(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및

(6) 방향족: trp, tyr, phe.

비-보존적 치환은 이들 부류 중의 하나의 구성원을 또 다른 부류의 구성원으로 교환하는 것을 수반할 것이다. 보존적 치환은 이들 부류 중의 하나의 구성원을 동일한 부류의 또 다른 구성원으로 교환하는 것을 수반할 것이다.

다음 실시예에서 입증되는 바와 같이, 변경된 활성 (효과기 기능(들) 및 약동학)을 지닌 Fc 영역 변이체를 설계할 수 있다. 예를 들어, ADCC 활성을 변경 (예; 증가 또는 감소)시키기 위해 Fc 영역의 하나 이상 아미노산 잔기를 변형시킬 수 있다. 바람직한 양태에서는, 변형이 본원에서 확인된 하나 이상의 Fc 영역 잔기를 포함한다 [예를 들어, 실시예 2, 및 본원에 참고로 도입된 WO0042072 참고]. 일반적으로, Fc 영역 변이체를 생성시키기 위해 ADCC 활성에 효과적인 것으로 본원에서 확인된 하나 이상의 Fc 영역 잔기에서 아미노산 치환을 만들 수 있다. 바람직한 양태에서는, 1개 이하 내지 약 10개 Fc 영역 잔기가 결실되거나 치환될 것이다. 하나 이상의 아미노산 변형 (예: 치환)을 포함하는 본원의 Fc 영역은 바람직하게, 모 Fc 영역 서열 또는 본래 서열 인간 Fc 영역의 약 80% 이상, 바람직하게 약 90% 이상, 가장 바람직하게 약 95% 이상을 보유할 것이다.

변경된 효과기 기능을 나타내는 아미노산 삽입 Fc 영역 변이체를 제조할 수도 있다. 예를 들어, FcR 결합에 영향을 미치는 것으로 본원에서 확인된 Fc 영역 위치들 중의 하나 이상에 인접하게 1개 이상 아미노산 잔기 (예: 1개 또는 2개 아미노산 잔기, 일반적으로 10개 이하 잔기)를 도입할 수 있다. "인접하게"란 본원에서 확인된 Fc 영역 잔기의 1개 내지 2개 아미노산 잔기 내를 의미한다. 이러한 Fc 영역 변이체는 모 분자와 비교해서 증강 또는 감소된 FcR 결합 및/또는 ADCC 활성을 표시할 수 있다. 이러한 삽입 변이체를 생성시키기 위해, FcR의 결합 영역 (예: 관심있는 FcR의 세포외 도메인)과, 아미노산 잔기(들)이 삽입되어야 하는 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드의 공-결정 구조를 평가하여 [참고: Sondermann et al. Nature 406: 267(2000); Deisenhofer, Biochemistry 20 (9): 2361-2370(1981); and Burmeister et al., Nature 342: 379-383, (1994); 이들 모두 본원에 참고로 도입된다], 개선된 FcR 결합 능력을 수반하는 Fc 영역 변이체를 합리적으로 고안할 수 있다. 바람직한 양태에서는, 이러한 삽입(들)이 Fc 영역 루프에서는 이루어지지만, Fc 영역의 2차 구조 (즉, β-가닥)에서는 이루어지지 않는다.

적당한 아미노산 서열 변형을 모 Fc 영역에 도입함으로써, (a) 인간 효과기 세포의 존재 하에 다소 효과적으로 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하고/하거나 (b) 인간 보체의 존재 하에 다소 효과적으로 보체-의존성 세포독성 (CDC)을 매개하고/하거나 (c) 모 폴리펩티드 보다 상이한 pHs에서 목적하는 친화성을 나타내는 Fc 감마 수용체 (FcγR) 또는 Fc 신생아 수용체 (FcRn)와 결합하는 변이체 Fc 영역을 생성시킬 수 있다. 이러한 Fc 영역 변이체는 일반적으로, Fc 영역 내에 하나 이상의 아미노산 변형을 포함할 것이다.

바람직한 양태에서는, 모 폴리펩티드 Fc 영역이 인간 Fc 영역, 예를 들어 본래 인간 Fc 영역 인간 IgG1 (f 및 a,z 동종이형), IgG2, IgG3, IgG4, 및 모든 종으로부터 공지되거나 밝혀진 모든 동종이형이다. 이러한 영역은 도 2에 나타낸 바와 같은 서열 (서열 1 내지 8), 도 3에 나타낸 바와 같은 서열 (서열 9 내지 12) 및 도 5에 나타낸 바와 같은 서열 (서열 32 내지 37)을 갖는다.

특정 양태에서는, 개선된 ADCC 활성을 지닌 Fc 영역을 생성시키기 위해, 모 폴리펩티드가 바람직하게는, 기존의 ADCC 활성을 지닌다 (예를 들어, 모 폴리펩티드가 인간 IgG1 또는 인간 IgG3 Fc 영역을 포함한다). 몇몇 양태에서는, 개선된 ADCC 활성을 지닌 변이체가 본래 서열 IgG1 또는 IgG3 Fc 영역을 수반한 항체 보다 실질적으로 더 효과적으로 ADCC를 매개한다 (예: P247L 및 I332E 변이체).

바람직한 양태에서는, 아미노산 변형(들)을 Fc 영역의 CH2 및/또는 CH3 도메인 내로 도입한다. 변경된 ADCC 활성을 나타내는 변이체 IgG Fc 영역을 생성시키기 위한 변형에 유용한 아미노산 위치에는 다음 아미노산 위치들 중의 어느 하나 이상이 포함된다: Fc 영역의 247, 251, 256, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 305, 307, 309, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438, 439, 또는 440. 바람직한 양태에서는, 이러한 변이체를 생성시키기 위한 주형으로서 사용된 모 Fc 영역이 인간 IgG Fc 영역을 포함한다.

특정 양태에서, 본 발명은 Fc 영역을 갖는 모 폴리펩티드의 변이체를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변이체는 효과기 세포의 존재 하에 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 247에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 특정 양태에서는, 아미노산 변형이 P247L이다. 기타 양태에서는, 아미노산 변형이 P247I 또는 P247H이다.

몇몇 양태에서, 본 발명은 Fc 영역을 갖는 모 폴리펩티드의 변이체를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변이체는 효과기 세포의 존재 하에 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 251에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 특정 양태에서는, 아미노산 변형이 L251F이다.

특정한 양태에서, 본 발명은 Fc 영역을 갖는 모 폴리펩티드의 변이체를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변이체는 효과기 세포의 존재 하에 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 256에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 특정 양태에서는, 아미노산 변형이 T256M 또는 T256P이다.

특정한 양태에서, 본 발명은 Fc 영역을 갖는 모 폴리펩티드의 변이체를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변이체는 효과기 세포의 존재 하에 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 268에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 특정 양태에서는, 아미노산 변형이 H268D 또는 H268E이다.

특정한 양태에서, 본 발명은 Fc 영역을 갖는 모 폴리펩티드의 변이체를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변이체는 효과기 세포의 존재 하에 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 280에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 특정 양태에서는, 아미노산 변형이 D280A 또는 D280K이다.

특정한 양태에서, 본 발명은 Fc 영역을 갖는 모 폴리펩티드의 변이체를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변이체는 효과기 세포의 존재 하에 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 330에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 특정 양태에서는, 아미노산 변형이 A330K 또는 A330R이다.

특정한 양태에서, 본 발명은 Fc 영역을 갖는 모 폴리펩티드의 변이체를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변이체는 효과기 세포의 존재 하에 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 332에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 특정 양태에서는, 아미노산 변형이 I332D, I332E, I332K 또는 I332R이다.

특정한 양태에서, 본 발명은 Fc 영역을 갖는 모 폴리펩티드의 변이체를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변이체는 효과기 세포의 존재 하에 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 339에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 특정 양태에서는, 아미노산 변형이 A339T이다.

특정한 양태에서, 본 발명은 Fc 영역을 갖는 모 폴리펩티드의 변이체를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변이체는 효과기 세포의 존재 하에 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 378에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 특정 양태에서는, 아미노산 변형이 A378D이다.

특정한 양태에서, 본 발명은 Fc 영역을 갖는 모 폴리펩티드의 변이체를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변이체는 효과기 세포의 존재 하에 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하고 Fc 영역 내의 위치 440에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 특정 양태에서는, 아미노산 변형이 S440Y이다.

상기 언급된 폴리펩티드 변이체를 대상으로 하여, 폴리펩티드의 목적하는 또는 의도한 용도에 따라서 추가로 변형시킬 수 있다. 이러한 변형에는, 예를 들어 아미노산 서열의 추가 변경 (아미노산 잔기의 치환, 삽입 및/또는 결실), 탄수화물 변형, 이종 폴리펩티드(들)와의 융합 및/또는 공유 변형이 포함될 수 있다. 추가 변형은 Fc 수용체 결합 및/또는 ADCC 활성을 변경시켜 주는 상기 언급된 아미노산 변형(들)에 앞서, 동시에 또는 후에 수행할 수 있다.

또 다른 한편, 또는 부가적으로, 아미노산 변형을, Fc 영역의 C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 기능을 변경시켜 주는 하나 이상의 추가 아미노산 변형과 병용하는 것이 유용할 수 있다. 본원에서 특히 관심있는 출발 폴리펩티드는 Clq와 결합하고 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 표시하는 것이다. 본원에 기재된 아미노산 치환물은 Clq와 결합할 수 있는 출발 폴리펩티드의 능력을 변경시키고/시키거나 그의 보체 의존성 세포독성 기능을 변형시키는 (예: 이들 효과기 기능을 저하시키고, 바람직하게는 이러한 기능을 없앤다) 작용을 할 수 있다. 그러나, 개선된 Clq 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC) 기능을 나타내는, 언급된 위치들 중의 하나 이상에서의 치환을 포함하는 폴리펩티드가 본원에 고려된다. 예를 들어, 출발 폴리펩티드는 Clq와 결합할 수 없고/없거나 CDC를 매개할 수 없으며, 이러한 추가의 효과기 기능을 획득하도록 본원의 교시에 따라서 변형시킬 수 있다. 더우기, 기존 Clq 결합 활성을 지니고 있고, 임으로 CDC를 매개할 수 있는 능력을 추가로 보유하고 있는 폴리펩티드는, 이들 활성 중의 한 가지 또는 둘 다가 증강되도록 변형시킬 수 있다. Clq를 변경시키고/시키거나 그의 보체 의존성 세포독성 기능을 변형시키는 아미노산 변형이, 예를 들어 W00042072 (본원에 참고로 도입된다)에 기재되어 있다.

상기 언급된 바와 같이, 예를 들어 CDC 활성 및/또는 ADCC 활성을 변형시킴으로써 변경된 효과기 기능을 나타내는 Fc 영역 또는 그의 일부를 고안할 수 있다. 예를 들어, 개선된 CDC 활성 및 개선된 ADCC 활성을 나타내는 (예를 들어, 개선된 ADCC 활성과 개선된 CDC 활성 둘 다를 지닌) 변이체 Fc 영역을 생성시킬 수 있다. 또 다른 한편, 효과기 기능을 저하 또는 경감시키고자 하는 경우에는, CDC 활성이 저하되고/되거나 ADCC 활성이 저하된 변이체 Fc 영역을 설계할 수 있다. 기타 양태에서는, 이들 활성 중의 한 가지 만을 증가시키고, 임의로는 기타 활성을 저하시켜, 예를 들어 개선된 ADCC 활성을 나타내지만 CDC 활성이 저하된 Fc 영역 변이체, 또는 그 반대로 개선된 CDC 활성을 나타내지만 ADCC 활성이 저하된 Fc 영역 변이체를 생성시킬 수 있다. 부가적으로, FcRn, 단백질 A, 및/또는 기타 Fc 결합 단백질에 대한 결합 친화도가 변형된 변이체 Fc 영역을 설계할 수 있다.

또 다른 유형의 아미노산 치환은 폴리펩티드의 당화 패턴을 변경시키는 작용을 한다. 이는, 예를 들어 폴리펩티드 내에 발견된 하나 이상의 탄수화물 잔기를 결실시키고/시키거나 폴리펩티드 내에 존재하지 않는 하나 이상의 당화 부위를 부가함으로써 달성할 수 있다. 또 다른 한편, 이는 당화 부위 이외의 아미노산을 변경시키거나 또는 세포를 공학적으로 처리함으로써 간접적으로 달성할 수 있다. 폴리펩티드의 당화는 전형적으로, N-연결되거나 O-연결된다. N-연결된이란 탄수화물 잔기가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착되는 것을 지칭한다. 펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 모든 아미노산이다)은 탄수화물 잔기를 아스파라긴 측쇄에 효소적으로 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이들 펩티드 서열 중의 어느 하나가 폴리펩티드에 존재하게 되면, 잠재적 당화 부위가 창출된다. O-연결된 당화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중의 하나를 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 것을 지칭하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신을 사용할 수도 있다.

폴리펩티드에 당화 부위를 부가하는 것은, 상기 언급된 트리펩티드 서열 중의 하나 이상을 함유하도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 수행하는 것이 편리하다 (N-연결된 당화 부위의 경우). 이러한 변경은 또한, 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 본래의 폴리펩티드 서열에 부가하거나 이러한 잔기로 치환함으로써 이루어질 수 있다 (O-연결된 당화 부위의 경우). 예시되는 당화 변이체는 중쇄의 잔기 Asn 297의 아미노산 치환을 갖는다.

몇몇 양태에서, 본 발명은 Fc 영역을 갖는 모 폴리펩티드의 변이체를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변이체는 하나 이상의 표면 잔기 아미노산 변형을 포함한다 [참고: Deisenhofer, Biochemistry, 28; 20(9):2361-70, April 1981, and W00042072; 이들 모두 본원에 참고로 도입된다]. 기타 양태에서, 본 발명은 Fc 영역을 갖는 모 폴리펩티드의 변이체를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이러한 변이체는 하나 이상의 비-표면 잔기 아미노산 변형을 포함한다. 추가 양태에서, 본 발명은 Fc 영역을 갖는 모 폴리펩티드의 변이체를 포함하는데, 이러한 변이체는 하나 이상의 표면 아미노산 변형과 하나 이상의 비-표면 아미노산 변형을 포함한다.

III. 조합 변이체

몇몇 양태에서는, 본 발명의 변이체가 둘 이상의 아미노산 변형 (예: 치환)을 포함한다. 이러한 조합 변이체는, 예를 들어 상기 상세히 언급한 아미노산 변형들 중의 둘 이상을 선택함으로써 생성시킬 수 있다. 다음 표 1은 둘 이상 아미노산 치환의 예시적인 조합을 제공하고 있다. 예를 들어, 표 1의 제1 열은 P247H와 위치 251, 256, 268, 280, 330, 332, 339, 378 및 440에서의 기타 아미노산 치환물과의 가능한 조합을 나타낸다 (예를 들어, 상기 제1 열은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10가지 아미노산 변형 조합을 나타낸다).

** 주: 상기 표는 카바트에서와 같은 EU 넘버링을 이용하고 있다.

표 1에 나타낸 조합 변이체와 기타 조합 변이체 (예를 들어, W00042072에 기재된 조합 변이체)를 대상으로 하여, 각종 검정 (하기 섹션 IV 참고)에서 소정의 활성 (예: FcR 결합 활성, ADCC 활성 및 CDC 활성)에 대해 시험할 수 있다. 이와 관련하여, 유용한 조합 변이체를 확인할 수 있다.

특정의 바람직한 양태에서, 본 발명의 조합 변이체는 ADCC 활성을 증가시키는 하나의 아미노산 변형과, 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 결합 활성 (예를 들어, pH 7.0 또는 7.4가 아닌 pH 6.0에서)을 증가시키는 하나의 아미노산 변형을 지닌다. 기타 양태에서, 본 발명의 조합 변이체는 하나의 표면 아미노산 변형과, 하나의 비-표면 아미노산 변형을 지닌다. 부가의 조합 변이체는 본원에 기재된 아미노산 변형들 중의 둘 이상, 또는 본원에 기재된 아미노산 변형들 중의 하나 이상을 W00042072에 기재된 것과 조합함으로써 생성시킬 수 있다.

IV. 변이체 폴리펩티드 검정

본 발명은 Fc 영역 변이체를 스크리닝하기 위한 각종 검정을 제공한다. 스크리닝 방법을 이용하여, 유용한 변이체를 밝혀내거나 확인할 수 있다. 예를 들어, 조합 변이체 (표 1 참고)를 스크리닝하여 변경된 FcR 결합성, 및/또는 변경된 ADCC 및/또는 변경된 CDC 활성 (예: 증가되거나 감소된 ADCC 또는 CDC 활성) 및/또는 전혈로부터 표적 세포 (예: B 세포)를 고갈시킬 수 있는 변형된 능력을 지닌 변이체를 밝혀낼 수 있다. 또한, 다음에 기재되는 바와 같이, 본 발명의 검정을 이용하여, 특정 대상체 (예: 항체 또는 면역부착인자 반응성 질환 증상을 수반하는 인간)에게서 유익한 치료적 활성을 지니는 변이체를 밝혀내거나 확인할 수 있다. 각종 검정 유형을 이용하여, 모 폴리펩티드와 비교해서 변이체 내에서의 모든 변화를 평가할 수 있다 [본원에 참고로 도입된 W00042072에 제공된 스크리닝 검정 참고]. 추가의 예시적인 검정이 다음에 기재되어 있다.

바람직한 양태에서, 본 발명의 변이체는 비-변이체 (모) 폴리펩티드와 비교해서 (변형되지 않은 항원 결합 영역 또는 변형된 항원 결합 영역을 통하여) 항원과 결합할 수 있는 능력을 본질적으로 보유하고 있는 항체이다 (예를 들어, 결합 능력은 바람직하게, 비-변이체 폴리펩티드의 결합 능력의 약 20배 정도 또는 약 5배 정도이다). 항원에 대한 폴리펩티드 변이체의 결합 능력은, 예를 들어, ELISA, 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석, 방사성면역침전 (RIA) 등의 기술을 이용하여 결정할 수 있다.

Fc 수용체 (FcR) 결합 검정을 이용하여 본 발명의 변이체를 평가할 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체, 예를 들면, FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIII, FcRn 등의 결합성은 폴리펩티드 변이체를 적정하고, ELISA 포맷에서 폴리펩티드 변이체와 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 결합된 폴리펩티드 변이체를 측정함으로써 측정할 수 있다 (하기 실시예 참고). 예를 들어, 항체를 포함하는 변이체는 표준 ELISA 검정에서 스크리닝하여 pH 6.0 및 pH 7.0 또는 7.4에서 FcRn에 대한 결합성을 결정할 수 있다. 스트렙타비딘 또는 뉴트라비딘 (Neutravidin)으로 피복시킨 고형 표면을 사용하여, 모든 종 (예: 마우스 또는 인간)으로부터 바이오틴 표지된 FcRn을 포획할 수 있다. 차단시킨 후, 포획 수용체를 pH 6.0 또는 pH 7.0 하의 완충액에 희석시킨 변이체 폴리펩티드 (항체)와 함께 항온 배양할 수 있다. 다음 단계에서는, 인간 항체에 특이적인 분자 [예: 효소와 접합된 고우트 (goat) (Fab')2 항-인간-Fab]를 가한다. 그 후 기질을 가하여, pH 6.0 또는 pH 7.0 또는 7.4에서 고정화 FcRn에 대한 변이체 폴리펩티드의 결합 양을 결정할 수 있다. 이러한 검정 결과를 동일한 FcR과 결합할 수 있는 모 (비-변이체) 폴리펩티드의 능력과 비교할 수 있다. 기타 바람직한 양태에서는, 변이체를 스크리닝하기 위해 (예를 들어, FcRn을 이용하여) ELISA를 수행하기 위한 성분들을 키트 내에 패키징한다 (이는 예를 들어, 사용에 대한 지시사항을 수반하고 있다).

항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 검정을 또한 이용하여 본 발명의 변이체를 스크리닝할 수 있다. ADCC 검정을 시험관내 또는 생체 내에서 수행할 수 있다. 폴리펩티드 변이체의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 다양한 효과기:표적 비를 이용하여 시험관내 ADCC 검정을 수행할 수 있다. 예시적인 ADCC 검정은 다음 표적 항원들 중의 어느 것을 발현하는 표적 세포주를 이용할 수 있다: CD20, CD22, CD33, CD40, CD63, EGF 수용체, her-2 수용체, 전립선-특이적 막 항원, 루이스 Y 탄수화물, GD₂ 및 GD₃ 강글리오시드, lamp-1, CO-029, L6, 및 ephA2. 효과기 세포는 건강한 공여자로부터 수득할 수 있고 (예를 들어, 실험 당일에 수득함), 히스토파크 (Histopaque) (공급처: Sigma)를 사용하여 PBMC를 정제할 수 있다. 그 다음, 표적 세포를, 예를 들어 0.1 내지 1,000 ng/ml 하에 IgG 변이체와 함께 약 30분 동안 예비항온 배양한 후, 효과기 세포와 40:1, 20:1 및 10:1 등의 효과기:표적 비로 혼합한다. 이어서, 손상된 세포의 시토졸로부터 상등액 내로 방출된 락테이트 데히드로게나제 (LDH) 활성 측정치를 근거로 하여 세포 사멸과 용해를 정량화하기 위해 세포독성 탐지용 키트 (공급처: Roche Molecular Biochemicals)를 사용하여 ADCC 활성을 비색 분석하여 측정할 수 있다. ADCC 활성은 크롬 51 부하된 표적 세포 검정의 경우, 크롬 51 방출 량을 측정함으로써 측정할 수도 있다. 항체 비-의존성 세포성 세포독성은 항체의 부재 하에 표적 및 효과기 세포로부터 LDH 활성을 측정함으로써 결정할 수 있다. 총 방출량은 1% 트리톤 (Triton) X-100을 표적 세포와 효과기 세포의 혼합물에 부가한 후에 측정할 수 있다. 표적 세포와 효과기 세포의 항온 배양은 5.0% CO₂ 중에서 37℃ 하에 최적 시간 (0.54 내지 18 시간) 동안 수행한 다음, 검정 판을 원심분리시킬 수 있다. 이어서, 상등액을 96 웰 판에 옮기고, 25℃ 하에 30분 동안 LDH 탐지 시약과 함께 항온 배양할 수 있다. 그 다음, 미세판 판독기를 이용하여 샘플 흡광도를 490 nm에서 측정할 수 있다. 이어서, 다음 방정식을 이용하여 세포독성 비율(%)을 계산할 수 있다: % 세포독성 = 실험치 - 저 대조군/고 대조군 - 저 대조군 X 100%. 항-CD20 및 변이체의 세포독성 %를 등량의 RITUXAN과 직접 비교하여 상대적 효력 측정치를 제공할 수 있다. 예시적인 ADCC 검정은 표적 세포의 공급원으로서 CD20 항원을 과발현하는 SKW6.4 세포 [예를 들어, American Type Culture Collection로부터 구입함]를 이용할 수 있다. 이러한 검정의 많은 변이가 당해 분야에 공지되어 있다 [참고: Zuckerman et al., CRC Crit Rev Microbiol 1978; 7(1): 1-26; 본원에 참고로 도입된다].

이러한 검정에 유용한 효과기 세포에는 천연 킬러 (NK) 세포, 대식세포, 및 기타 말초혈 단핵 세포 (PBMC)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 또 다른 한편, 또는 부가적으로, 본 발명의 폴리펩티드 변이체의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들어 문헌 [참고: Clynes et al. PNAS (USA) 95: 652-656 (1998); 본원에 참고로 도입된다]에 기재된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다. 본 발명의 변이체를 대상으로 하여, 보체 활성화에 대해 스크리닝할 수도 있다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 보체 의존성 세포독성 (CDC) 검정을 수행할 수 있다 [참고: Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202: 163 (1996); 본원에 참고로 도입된다]. 예를 들어, 각종 농도의 폴리펩티드 변이체 및 인간 보체를 완충액으로 희석시킬 수 있다. 폴리펩티드 변이체와 결합하는 항원을 발현하는 세포를 대략 1 x 10⁶개 세포/ml의 밀도가 되도록 희석시킬 수 있다. 폴리펩티드 변이체, 희석된 인간 보체, 및 항원을 발현하는 세포의 혼합물을 편평한 바닥 조직 배양 96 웰 판에 가하고, 37℃ 및 5% CO₂ 하에 2시간 동안 항온 배양하여 보체 매개성 세포 용해를 촉진시킬 수 있다. 50 ㎕의 알라마르 블루 (alamar blue) (공급처: Accumed International)를 각 웰에 가하고 37℃ 하에 밤새 항온 배양할 수 있다. 530 nm에서의 여기 및 590 nm에서의 방출을 수반한 96-웰 형광계를 사용하여 흡광도를 측정할 수 있다. 그 결과를 상대 형광 단위 (RFU)로 표현할 수 있다. 샘플 농도를 표준 곡선으로부터 컴퓨터로 계산할 수 있고, 비-변이체 폴리펩티드와 비교한 활성 %를, 관심있는 폴리펩티드 변이체에 대해 보고할 수 있다.

특정 양태에서는, 본 발명의 변이체가 보체를 활성화시키지 않는다. 예를 들어, 폴리펩티드 변이체는 돌연변이되지 않은 IgG1 Fc 영역을 갖는 대조군 항체와 비교해서 상기 검정에서 약 0 내지 10% CDC 활성을 표시한다. 바람직하게는, 본 발명의 변이체가 상기 CDC 검정에서 어떠한 CDC 활성 (예: 배경 이상)도 나타내지 않는 것으로 보인다. 기타 양태에서, 본 발명의 변이체는 모 폴리펩티드와 비교해서 증강된 CDC를 나타내는 것으로 밝혀졌다 (예를 들어, IC50 값을 비교할 경우에, 시험관내 또는 생체 내에서 CDC 활성 상의 약 2배 내지 약 100배 (이상) 개선을 표시한다).

본 발명의 변이체를 대상으로 하여, 전혈 검정에서 표적 세포 고갈에 대해 스크리닝할 수도 있다. 예를 들어, CD20 표적 특이성을 지닌 각종 농도의 폴리펩티드 변이체를 대상으로 하여, facs을 사용하여 전혈 검정에서 B 세포 고갈에 대해 스크리닝할 수 있다 [참고: Vugmeyster et al., 2003 Cytometry 52A, 101-109]. 신선하게 채집한 혈액을 37℃ 및 5% CO₂ 하에 4시간 동안 (시간은 다양하게 할 수 있다) 각종 농도의 폴리펩티드 변이체와 함께 항온 배양한다. 항온 배양 후, 적혈구를 제조업자의 지시에 따라서 염화암모늄 시약 (공급처: Beckton-Dickinson cat.#555899)으로 용해시키고, B 세포에 대해 특이적인 형광성-표지된 항체 (예: 항-CD19)를 이용하여 facs함으로서 B 세포를 탐지한다. 그 결과를, 처리되지 않은 샘플 또는 무관한 (비-고갈성) 항체와 함께 항온 배양한 샘플과 비교한 B 세포의 고갈 %로서 표현할 수 있다.

바람직한 양태에서는, 변이체가 모 폴리펩티드 보다 B 세포를 더 효과적으로 고갈시킨다. 변이체는 B 세포를, 예를 들어 약 2배 이상 정도, 바람직하게는 약 5배 이상 정도 고갈시킬 수 있다. 또한, 변이체는 B 세포를 고갈시키는데 있어 보다 큰 효력을 표시할 수 있다. 예를 들어, 변이체는 모 폴리펩티드와 비교해서 동일한 비율의 B 세포를 고갈시킬 수 있지만, 약 5배 더 적은, 바람직하게는 약 10배 더 적은 항체를 활용한다. 변이체에 의해 매개된 표적 세포 고갈은 모 폴리펩티드와 비교해서 약 5배 내지 약 100배, 바람직하게는 약 5배 내지 약 1000배 개선될 수 있다.

본 발명의 변이체를 생체 내에서 스크리닝할 수도 있다. 어떠한 유형의 생체내 검정도 이용할 수 있다. 한 가지 유형의 검정에 대한 특정한 예가 다음에 제공된다. 이러한 예시적인 검정은 Fc 변이체를 생체 내에서 예비임상 평가할 수 있게 해준다. 시험하고자 하는 변이체를 동일한 활성을 지니는 것으로 공지된 특정한 항체의 Fc 영역 내로 혼입할 수 있다. 예를 들어, 변이체를 돌연변이 유발에 의해 항-CD20 IgG의 Fc 영역 내로 혼입할 수 있다. 이로써, 모 IgG 및 Fc 변이체 IgG를 RITUXAN (종양 퇴행을 촉진시키는 것으로 공지됨)과 직접적으로 비교할 수 있다. 예비임상 평가를 2가지 상 (약동학적 및 약력학적 상)으로 수행할 수 있다. 제I 상 약동학적 연구의 목표은 Fc 변이체 IgG의 청소율 (제거율)과 공지된 생체내 활성을 지닌 항체 (예: RITUXAN)의 청소율 간에 차이가 있는지를 결정하는 것이다. 청소율 상의 차이는 혈청 중의 IgG의 정상 상태 수준 상의 차이를 유발시킬 수 있다. 따라서, 정상 상태 농도에 있어 차이가 탐지된다면, 이를 표준화시켜 정확한 비교가 이루어지도록 해야 한다. 제II 상 약력학적 연구의 목표는 본 경우에 종양 성장에 대한 Fc 돌연변이물의 효과를 결정하는 것이다. RITUXAN를 이용한 기존의 연구는 종양 성장을 완전히 억제시키는 단일 용량을 이용하였다. 이러한 단일 용량으로는 정량적 차이를 측정할 수 없기 때문에, 일정 용량 범위를 이용해야 한다.

Fc 변이체, 야생형 모 Fc, 및 RITUXAN의 제I 상 약동학적 비교를 다음 방식으로 수행할 수 있다. 먼저, 동물 1마리당 40 ㎍을 정맥내 주사하고, IgG의 혈장 수준을 0, 0.25, 0.5, 1, 24, 48, 72, 96, 120, 168, 및 336 시간째에 정량화하였다. 예를 들어, 청소율을 수득하기 위해 제로 래그 2 구획 약동학적 모델을 이용하여 약동학적 프로그램 (WinNonLin)을 사용하여 데이터를 맞출 수 있다. 청소율을 이용하여 다음 방정식에 따라 정상 상태 혈장 수준을 규정할 수 있다: C = 용량/(청소율 Xτ) [여기서, τ는 용량들 간의 간격이고, C는 정상 상태에서의 혈장 수준이다]. 약동학적 실험을 비-종양 보유 마우스에서 수행할 수 있는데, 예를 들어 한번에 최소 5마리 마우스를 이용한다.

그 다음 상을 위해 동물 모델을 다음 방식으로 이용할 수 있다: CB17-SCID 마우스의 우측 옆구리에 10⁶개 라지 (Raji) 세포를 피하 이식할 수 있다. Fc 변이체, 야생형 Fc, 및 RITUXAN의 정맥내 거환은 이식 직후에 작용하기 시작하여, 종양 크기가 2 cm 초과 직경이 될 때까지 지속할 수 있다. 캘리퍼를 사용하여 종양의 길이, 폭 및 깊이를 측정함으로써 종양 용적을 월요일, 수요일 및 금요일 마다 결정할 수 있다 (종양 용적 = W x L x D). 종양 용적 대 시간의 플롯은 약력학적 계산을 위한 종양 성장 속도를 제공할 것이다. 한 무리당 최소한 대략 10마리 동물을 사용해야 한다.

Fc 변이체, 야생형 Fc, 및 RITUXAN의 제II 상 약력학적 비교를 다음 방식으로 수행할 수 있다. 공개된 데이터를 기초로 하여, RITUXAN을 매주 10 ㎍/g 투여하면 생체내 종양 성장이 완전히 억제되었다는 것을 알 수 있다 [참고: Clynes et al., Nat. Med. 2000 Apr; 6(4): 443-6,2000; 본원에 참고로 도입된다]. 따라서, 매주 10 ㎍/g, 5 ㎍/g, 1 ㎍/g, 0.5 ㎍/g 및 0 ㎍/g의 용량 범위를 시험할 수 있다. 종양 성장 속도를 50% 정도 억제시키는 정상 상태 혈장 수준은 정상 상태 혈장 수준과 효능 간의 상관 관계에 의해 그래프 상으로 결정할 수 있다. 정상 상태 혈장 수준은 상기 언급된 바와 같이 계산할 수 있다. 필요한 경우, RITUXAN과 거의 동등한 수준의 정상 상태 혈장 수준을 달성하기 위해 그들의 약동학적 특성에 따라서 각 Fc 변이체 및 Fc 야생형에 대한 τ를 조정할 수 있다. 모 폴리펩티드 (예: Fc 야생형) 및 RITUXAN과 비교해서 통계적으로 개선된 Fc 변이체의 약동학적 값은 일반적으로, Fc 변이체가 개선된 생체내 활성을 부여해준다는 지표일 것이다.

Fc 변이체, 야생형 Fc, 및 RITUXAN에 대한 부가의 약력학적 비교를 기존에 보고된 바와 같이 시노몰고우스 (cynomolgous) 원숭이에서 수행할 수 있다 [참고: Reff et al., Blood 83, 435-445, 1994]. 말초 B 세포 및 림프절 B 세포 고갈에 대한 용량 반응을 사용하여, 정맥내 및/또는 피하 투여된 야생형 Fc 및 RITUXAN과 Fc 변이체의 상대적 효력을 비교할 수 있다. 모 폴리펩티드 (예: Fc 야생형) 및 RITUXAN과 비교해서 통계적으로 개선된 Fc 변이체의 약력학적 값은 일반적으로, Fc 변이체가 개선된 생체내 활성을 부여해준다는 지표일 것이다.

추가 양태에서, 본 발명의 변이체를 대상으로 스크리닝하여, 적어도 2가지 종에서 치료적으로 사용하기에 유용한 변이체를 확인 (동정)한다. 이러한 변이체는 본원에서 "이중-종 개선된 변이체"로서 지칭되고, 인간에게서 치료적이며 또한 동물 모델에서 효능을 입증해주는 (또는 입증해줄 것으로 예상되는) 변이체를 확인하는데 특히 유용하다. 이와 관련하여, 본 발명은 동물 모델 데이터가 정부 규제 기관 (예: 미국 식품 의약국)에서 정한 인간 시험 적용 규정을 뒷받침해줄 것으로 예상되기 때문에 인간 임상 시험에 대해서도 승인될 확률이 높은 변이체를 확인하는 방법을 제공한다.

특정 양태에서는, 이중-종 개선된 변이체를 먼저, 인간 효과기 세포를 이용하여 ADCC 검정을 수행하여 개선된 변이체를 밝혀낸 다음, 마우스, 랫트 또는 비-인간 영장류 효과기 세포를 이용하여 제2의 ADCC 검정을 수행하여, 이중-종 개선된 변이체인 개선된 변이체의 아세트를 확인함으로써 확인한다. 몇몇 양태에서, 본 발명은 a) i) 표적 세포, ii) Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 후보 변이체 (이러한 후보 변이체는 Fc 영역 내에 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하고, 후보 변이체는 제1 종 (예: 인간)의 효과기 세포의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 표적 세포 세포독성을 매개한다)를 포함하는 조성물; 및 iii) 제2 종 (예: 마우스, 랫트 또는 비-인간 영장류) 효과기 세포를 제공하는 단계; b) 후보 변이체가 표적 세포와 결합함으로써 후보 변이체 결합된 표적 세포가 생성되도록 하는 조건 하에 상기 조성물을 표적 세포와 함께 항온 배양하는 단계; c) 제2 종 효과기 세포와 후보 변이체 결합된 표적 세포를 혼합하는 단계; 및 d) 후보 변이체에 의해 매개된 표적 세포 세포독성을 측정하는 단계를 포함하여, 이중-종 개선된 변이체를 확인 (동정)하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서는, 상기 방법이 e) 후보 변이체가 제2 종 효과기 세포의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 표적 세포 세포독성을 매개하는지를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 양태에서는, 상기 방법이 f) 제2 종 효과기 세포의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 표적 세포 세포독성을 매개하는 이중-종 개선된 변이체로서 후보 변이체를 확인하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직한 양태에서는, 이와 같이 확인된 이중-종 변이체를 하나 이상의 동물 검정에서 생체내 스크리닝한다.

특정 양태에서는, 이중-종 개선된 변이체를 먼저, 인간 혈액을 이용하여 전혈 검정을 수행하여 개선된 변이체를 밝혀낸 다음, 마우스, 랫트 또는 비-인간 영장류 혈액을 이용하여 제2의 전혈 검정을 수행하여, 이중-종 개선된 변이체인 개선된 변이체의 아세트를 확인함으로써 확인한다. 몇몇 양태에서, 본 발명은 a) i) 표적 세포, ii) Fc 영역의 적어도 일부를 갖는 모 폴리펩티드의 후보 변이체 (이러한 후보 변이체는 Fc 영역 내에 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하고, 후보 변이체는 제1 종 (예: 인간) 혈액의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 표적 세포 고갈을 매개한다)를 포함하는 조성물; 및 iii) 제2 종 (예: 마우스, 랫트 또는 비-인간 영장류) 혈액을 제공하는 단계; b) 후보 변이체가 표적 세포와 결합함으로써 후보 변이체 결합된 표적 세포가 생성되도록 하는 조건 하에 상기 조성물을 표적 세포와 함께 항온 배양하는 단계; c) 제2 종 혈액과 후보 변이체 결합된 표적 세포를 혼합하는 단계; 및 d) 후보 변이체에 의해 매개된 표적 세포 고갈을 측정하는 단계를 포함하여, 이중-종 개선된 변이체를 확인 (동정)하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서는, 상기 방법이 e) 후보 변이체가 제2 종 혈액의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 표적 세포 고갈을 매개하는지를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 양태에서는, 상기 방법이 f) 제2 종 혈액의 존재 하에, 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 표적 세포 고갈을 매개하는 이중-종 개선된 변이체로서 후보 변이체를 확인하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직한 양태에서는, 이와 같이 확인된 이중-종 변이체를 하나 이상의 동물 검정에서 생체내 스크리닝한다.

특정 양태에서, 이중-종 개선된 변이체는, 인간 성분 (예: 인간 세포, 인간 Fc 수용체 등)을 사용하여 상기 검정들을 수행하여 개선된 변이체를 확인한 다음, 비-인간 동물 성분 (예: 마우스 세포, 마우스 Fc 수용체 등)을 사용하여 동일한 검정 (또는 상이한 검정)을 수행함으로써 확인한다. 이와 관련하여, 인간에 의거한 검정과 제2 종에 의거한 검정 둘 다에서 소정의 기준에 따라서 잘 수행되는 변이체 아세트를 확인할 수 있다.

이중-종 개선된 변이체를 확인하기 위한 예시적 방법은 다음과 같다: 먼저, IgG Fc 영역의 적어도 일부를 암호화하는 핵산 서열을 돌연변이시켜, 발현된 아미노산 서열이 하나 이상의 아미노산 변화를 지님으로써 변이체가 생성되도록 한다. 이어서, 이와 같이 발현된 IgG 변이체를, 인간 PBMCs 또는 아세트 (예: NK 세포 또는 대식세포)를 이용하여 ADCC 검정에서 성상 확인한다. ADCC 활성 증강이 밝혀진 경우에는, 마우스 또는 랫트 PBMCs를 사용하여 변이체를 제2의 ADCC 검정에서 스크리닝한다. 또 다른 한편, 또는 또한, 클로닝된 설치류 수용체 또는 세포주에 대한 결합을 알아보기 위해 상기 변이체를 이용하여 검정을 수행할 수 있다. 최종적으로, 변이체가 제2 검정에서도 개선된 것으로 밝혀져, 이중-개선된 변이체가 되면, 이러한 변이체를 마우스 또는 랫트에서 생체내 스크리닝한다.

V. 예시적인 변이체 Fc 영역 함유 분자

본 발명의 변이체 Fc 영역은 보다 큰 분자의 일부일 수 있다. 보다 큰 분자는, 예를 들어 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 이중-특이적 항체, 면역부착인자 등일 수 있다. 따라서, 본 발명의 변이체 Fc 영역에 대한 광범위한 적용 분야가 존재한다는 것은 명백한 일이다.

A. 변이체 Fc 영역을 함유하는 항체

바람직한 양태에서는, 변이체 Fc 영역 함유 분자 (예: 폴리펩티드)가 항체이다. 항체을 생성하기 위한 기술이 다음에 기재되어 있다.

(i) 항원 선별 및 제조

일반적으로, 변이체 Fc 영역 함유 분자가 항체인 경우, 이러한 항체는 관심있는 항원에 대항하여 지시된다. 바람직하게는, 항원이 폴리펩티드이고, 항체를 특정 질환이나 질병으로 고통받고 있는 포유류에게 투여하면, 이러한 포유류에게서 치료적 이득이 생길 수 있다. 그러나, 비-폴리펩티드 항원 [예: 종양 관련 당지질 항원; 본원에 참고로 도입된 미국 특허 제5,091,178호 참고]에 대항하여 지시된 항체를 이용할 수도 있다.

항원의 예에는 분자, 예를 들어 레닌; 성장 호르몬, 예를 들어 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지단백질; 알파-1-항트립신; 인슐린 A-쇄; 인슐린 B-쇄; 프로인슐린; 난포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체 형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자, 예를 들어 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자 (TF), 및 폰 빌레브란츠 (von Willebrands) 인자; 항-응고 인자, 예를 들어 단백질 C; 심방 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성인자, 예를 들어 유로키나제 또는 인간 뇨 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성인자 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 엔케팔리나제; RANTES (정상적으로 T-세포 발현되고 분비된 활성화시 조절됨); 인간 대식세포 염증성 단백질 (MIP-1-알파); 혈청 알부민, 예를 들어 인간 혈청 알부민; 뮐러의 (Muellerian) 억제성 물질; 렐락신 A-쇄; 렐락신 B-쇄; 프로렐락신; 마우스 성선자극 호르몬 관련 펩티드; 미생물성 단백질, 예를 들어 베타-락타마제; DNase; IgE; 세포독성 T-림프구 관련 항원 (CTLA), 예를 들어 CTLA-4; 인히빈 (inhibin); 악티빈 (activin); 혈관성 내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 단백질 A 또는 D; 류마티스성 인자; 향신경성 인자, 예를 들어 뼈-유래된 향신경성 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자; 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF); 섬유아세포 성장 인자, 예를 들어 αFGF 및 βFGF; 표피 성장 인자 (EGF); 전환 성장 인자 (TGF), 예를 들어 TGF-알파 및 TGF-베타 (TGF-1, TGF-2, TGF-3, TGF-4, 또는 TGF-5 포함); 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); des (1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합성 단백질; CD 단백질, 예를 들어 CD3, CD4, CD8, CD19 및 CD20; 에리트로포이에틴; 골유도성 인자; 면역독소; 골 형성 단백질 (BMP); 인터페론, 예를 들어 인터페론-알파, -베타 및 -감마; 집락 자극 인자 (CSFs), 예를 들어 M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF; 인터루킨 (ILs), 예를 들어 IL-1 내지 IL-10; 슈퍼옥사이드 디스무타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 가속 인자; 바이러스성 항원, 예를 들어 AIDS 외피의 일부; 수송 단백질; 귀소 (homing) 수용체; 아드레신; 조절성 단백질; 인테그린, 예를 들어 CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 종양 관련 항원, 예를 들어 HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 세포소멸 경로의 구성원; 및 상기 언급된 모든 폴리펩티드의 단편이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

바람직한 항원에는 CD 단백질, 예를 들어 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 및 CD34; ErbB 수용체 계열의 구성원, 예를 들어 EGF 수용체, HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 세포 부착 분자, 예를 들어 LFA-1, Mac1, p150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, a4/p7 인테그린, 및 (a 또는 그의 소단위를 포함한, Xv/p3 인테그린) (예: 항-CD11a, 항-CD18 또는 항-CD11b 항체); 성장 인자, 예를 들어 VEGF; 조직 인자 (TF); 알파 인터페론 (a-IFN); 인터루킨, 예를 들어 IL-8; IgE; 혈액군 항원; flk2/flt3 수용체; 비만 (OB) 수용체; mpl 수용체; CTLA-4; 단백질 C 등이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

기타 분자와 임의로 접합된 가용성 항원 또는 그의 단편이 항체를 생성하기 위한 면역원으로서 사용될 수 있다. 막관통 분자 (예: 수용체)의 경우에는, 이들의 단편 (예: 수용체의 세포외 도메인)을 면역원으로서 사용할 수 있다. 또 다른 한편, 막관통 분자를 발현하는 세포를 면역원으로서 사용할 수 있다. 이러한 세포는 천연 공급원 (예: 암 세포주)으로부터 유래될 수 있거나, 또는 막관통 분자를 발현하도록 재조합 기술에 의해 형질전환시킨 세포일 수 있다. 항체를 제조하는데 유용한 기타 항원 및 그의 형태가 당업자에게 명백할 것이다.

(ii) 폴리클로날 항체

본 발명은 변이체 Fc 영역을 수반한 폴리클로날 항체를 제공한다. 예를 들어, 변형된 G1 불변 영역을 함유하는 인간 면역글로불린 레퍼토리 (repertoire)를 면역글로불린-불활성화 마우스 내로 이식하면, 변형된 Fc 영역을 함유하는 IgG 레퍼토리를 발현하는 마우스가 생성될 수 있다 [참고: Mendez, MJ et al., Nature Genetics 15: 146 (1997); 본원에 참고로 도입된다]. 관련 항원 및 아주반트 (adjuvant)를 수회 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사함으로써 동물에게서 폴리클로날 항체를 생성시키는 것이 바람직하다. 이관능성 작용제 또는 유도체화제 [예: 시스테인 잔기를 통하여 접합하기 위한 말레이미도벤조일 설포석신이미드 에스테르, 리신 잔기를 통하여 접합하기 위한 N-히드록시석신이미드, 글루타르알데히드, 석신산 무수물, SOC1₂, 또는 R1N=C=NR (여기서, R 및 R1은 상이한 알킬기이다)]를 사용하여, 면역시키고자 하는 종에서 면역원성인 단백질 [예: 키홀 림펫 헤모시아닌 (keyhole limpet hemocyanin), 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제]에 관련 항원을 접합시키는 것이 유용할 수 있다.

토끼 및 마우스에 대한 일반적인 면역화 프로토콜의 예는 다음과 같다: 예를 들어, 100 ㎍ 또는 5 ㎍의 단백질 또는 접합체 (예: 각각 토끼 또는 마우스용으로 사용함)를 3 용적의 프로인트 완전 아주반트와 합한 다음, 이 용액을 여러 부위에 피내 주사함으로써, 동물을 항원, 면역원성 접합체 또는 유도체에 대항하여 면역시킨다. 1개월 후, 프로인트 완전 아주반트 중의 펩티드 또는 접합체 본래 량의 1/5 또는 1/10을 여러 부위에 피하 주사함으로써 상기 동물을 추가 면역시킨다. 7일 내지 14일 후, 동물을 방혈시키고 혈청을 대상으로 하여 항체 역가를 검정한다. 역가가 안정 수준에 도달할 때까지 동물을 추가 면역시킨다. 바람직하게는, 동일한 항원의 접합체이긴 하지만, 상이한 단백질에 접합되고/되거나 상이한 가교 결합 시약을 통하여 접합된 접합체를 이용하여 동물을 추가 면역시킨다. 접합체는 단백질 융합물로서 재조합 세포 배양물에서 만들 수도 있다. 또한, 응집제 (예: 백반)를 사용하여 면역 반응을 증강시키는 것이 적합하다.

(iii) 모노클로날 항체

본 발명은 변이체 Fc 영역을 수반한 모노클로날 항체를 제공한다. 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법 [참고: Kohler et al., Nature, 256: 495, 1975; 본원에 참고로 도입된다] 또는 재조합 DNA 방법 [본원에 참고로 도입된 미국 특허 제4,816,567호 참고]을 포함한 수 많은 방식으로 만들 수 있다.

하이브리도마 방법에서는, 마우스 또는 기타 적당한 숙주 동물 [예: 햄스터 또는 짧은 꼬리원숭이 (macaque)]을 면역시켜, 면역에 사용된 단백질과 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도시킨다. 또 다른 한편, 림프구를 시험관 내에서 면역시킬 수 있다. 그 다음, 적합한 융합제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 림프구를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다. 이로써 제조된 하이브리도마 세포를 시딩하고, 융합되지 않은 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제시키는 하나 이상의 물질을 바람직하게 함유하고 있는 적합한 배양 배지에서 성장시킨다. 예를 들어, 모 골수종 세포에 효소 히포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결여된 경우에는, 하이브리도마에 대한 배양 배지가 전형적으로, 히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)를 포함할 것인데, 이들 물질은 HGPRT-결핍성 세포의 성장을 억제한다.

바람직한 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선별된 항체-생산 세포에 의한 안정적인 고 수준의 항체 생산을 뒷받침해주며, HAT 배지와 같은 배지에 대해 민감한 세포이다. 이들 중에서 바람직한 골수종 세포주는 뮤린 골수종 주, 예를 들어, MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래된 것 [공급처: Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA], 및 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포 [공급처: American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA]이다. 인간 모노클로날 항체를 생산하는 인간 골수종 및 마우스-인간 이종-골수종 세포주가 또한 보고되었다 [참고: Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); 본원에 참고로 도입된다].

하이브리도마 세포가 성장하고 있는 배양 배지를 대상으로 하여, 항원에 대항하여 지시된 모노클로날 항체의 생성에 대해 검정한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전에 의해, 또는 시험관내 결합 검정, 예를 들어 방사성 면역검정 (RIA) 또는 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 결정한다. 목적하는 특이성, 친화성 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 클론을 제한 희석 과정에 의해 아클로닝하고 표준 방법에 의해 성장시킨다. 이러한 목적에 적합한 배양 배지에는 예를 들어, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지가 포함된다. 또한, 하이브리도마 세포를 특정 동물에서 복수 종양으로서 생체내 성장시킬 수 있다. 아클론에 의해 분비된 모노클로날 항체를 통상적인 면역글로불린 정제 과정, 예를 들어 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수 또는 혈청으로부터 격리시키는 것이 적합하다.

모노클로날 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 과정을 이용하여 (예를 들어, 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써) 용이하게 분리 및 서열 분석할 수 있다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 제공된다. 일단 분리되면, DNA를 발현 벡터 내에 놓아둔 다음, 다른 방식으로는 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포 [예: 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 중국산 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포] 내로 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성을 수득한다. 항체의 재조합적 생성은 다음에 보다 상세히 기재된다.

몇몇 양태에서는, 항체 또는 항체 단편을, 예를 들어 문헌 [참고: McCafferty et al., Nature, 348: 552554 (1990)]에 기재된 기술을 이용하여 생성된 항체 파아지 라이브러리로부터 분리시킨다. 문헌 [참고: Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]에는 파아지 라이브러리를 사용하여 뮤린 및 인간 항체를 각각 분리하는 방법이 기재되어 있다. 후속 공개 문헌에는 연쇄 셔플링에 의한 고 친화성 (nM 범위) 인간 항체의 생성 방법 [참고: Marks et al., BioTechnology, 10: 779-783(1992)] 뿐만 아니라 매우 큰 파아지 라이브러리를 구축하기 위한 전략으로서 생체내 재조합 및 조합 감염이 기재되어 있다 [참고: Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993)]. 따라서, 이들 기술 및 유사한 기술은 모노클로날 항체를 분리하기 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 실용적인 대안이다.

또한, 예를 들어 동종 뮤린 서열 대신 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 암호화 서열로 치환하거나 [참고: U.S. Patent No. 4,816,567, and Morrison, et al., Proc. Nat. Acad. Sci USA, 81: 6851 (1984); 둘다 본원에 참고로 도입된다], 또는 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 암호화 영역의 전부 또는 일부를 면역글로불린 암호화 서열에 공유적으로 연결함으로써, DNA를 변형시킬 수 있다.

전형적으로, 항체의 불변 도메인을 상기 비-면역글로불린 폴리펩티드로 치환시키거나, 또는 항체의 하나의 항원-결합 부위의 가변 도메인을 상기 비-면역글로불린 폴리펩티드로 치환시켜, 특정 항원에 대한 특이성을 지닌 하나의 항원-결합 부위와, 상이한 항원에 대한 특이성을 지닌 또 다른 항원-결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 창출시킨다.

(iv) 인간화 및 인간 항체

본 발명은 변이체 Fc 영역을 수반한 인간화 및 인간 항체를 제공한다. 바람직한 양태에서는, 인간화 항체가 인간 항체 아미노산 서열을, 인간 항체로부터 유래되지 않은 아미노산 잔기와 함께 포함한다. 몇몇 양태에서는, 인간화 항체 내의 인간 서열이 골격 영역 (FRs)을 포함하고, 인간 항체로부터 유래되지 않은 서열 또는 잔기가 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDRs)을 포함한다.

FRs과 CDRs를 중쇄 및 경쇄 가변 영역 내의 아미노산 넘버링에 기초하여 규정할 수 있는 것은 아무런 가치가 없다. 용어 상보성 결정 영역, 또는 CDR은 중쇄와 경쇄 폴리펩티드 둘 다의 가변 영역 내에 발견된 비-연속된 항원 결합 부위를 의미한다. 이들 영역은 문헌 [참고: Kabat et al. (J. Biol. Chem. 252: 6609-6616 (1977) and Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest (1991); "Kabat"), Chothia et al. (J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987); "Chothia") and MacCallum et al. (J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996); "MacCallum"]에 규정되었는데, 여기서 보고된 정의에는 서로에 대항하여 비교한 경우 아미노산 잔기의 아세트 또는 중복 영역이 포함된다. 그럼에도 불구하고, 항체 (인간화 항체 포함)의 CDR을 지칭하기 위해 이들 정의 중의 어느 것을 단독으로 [예를 들면, 카바트 (Kabat) 정의] 또는 조합하여 [예를 들자면, 카바트와 초치아 (Chothia)의 조합 정의] 적용하는 것이, 본 발명에 정의되고 사용된 바와 같은 용어의 범위 내에 속한다. 상기 언급된 참고 문헌 각각에 의해 정의된 바와 같은 CDRs를 포괄하는 아미노산 잔기가 다음 표 6에 비교로서 기재되어 있다:

또한, 항체 가변 영역과 관련하여 사용된 경우의 용어 "골격"은 항체의 가변 영역 내의 CDR 영역 외부의 모든 아미노산 잔기를 의미한다. 따라서, 가변 영역 골격은 길이가 약 100 내지 120개 아미노산이지만, CDRs 외부의 아미노산 만을 기준으로 한 것이다. 용어 "골격 영역"은 CDRs에 의해 격리되는 각 골격 도메인을 의미한다. 따라서, 중쇄 가변 영역의 구체적인 예, 및 카바트에 의해 규정된 바와 같은 CDRs의 경우, 골격 영역 1 (FR1)은 아미노산 1 내지 30을 포괄하는 가변 영역 도메인에 상응하고; 영역 2 (FR2)는 아미노산 36 내지 49를 포괄하는 가변 영역 도메인에 상응하며; 영역 3 (FR3)은 아미노산 66 내지 94를 포괄하는 가변 영역 도메인에 상응하고; 영역 4 (FR4)는 아미노산 103에서부터 가변 영역의 말단까지의 가변 영역 도메인에 상응한다. 경쇄에 대한 골격 영역은 경쇄 가변 영역 CDRs 각각에 의해 유사하게 격리된다. 유사하게, 초치아 또는 맥칼룸에 의한 CDRs의 정의, 또는 모든 CDR 조합 정의를 이용하여, 골격 경계를 상기 언급된 바와 같이 각각의 CDR 말단에 의해 격리시킨다. CDRs의 복합적인 정의에도 불구하고, 몇몇 양태에서는 카바트 정의를 이용하여 CDRs를 정의하는 것이 바람직하다.

인간 항체로부터 유래되지 않는 인간화 항체 내의 잔기는 또 다른 종 (이에는 마우스가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다)으로부터 유입되거나 유래된 잔기 또는 서열일 수 있거나, 또는 이들 서열은 인간화 항체 서열 내로 삽입되는 무작위 아미노산 서열 (예: 무작위화 핵산 서열로부터 생성됨)일 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 인간화 항체 내의 인간 아미노산 서열은 바람직하게 골격 영역인 반면, 인간 항체로부터 유래되지 않는 잔기 (이것이 또 다른 종으로부터 유래되거나 아니면 무작위 아미노산 서열이든지 간에)는 바람직하게 CDRs에 상응한다. 그러나, 몇몇 양태에서는, 하나 이상의 골격 영역이 하나 이상의 비-인간 아미노산 잔기를 함유할 수 있다. 그 밖에 인간 골격에 대한 변경 또는 변형의 경우에는 (예를 들어, 비-인간 잔기를 도입함으로써 이루어짐), 이와 같이 변경되거나 변형된 골격 영역이 또 다른 종으로부터의 변형된 CDR 또는 무작위 CDR 서열에 인접하는 것이 가능한 반면, 기타 양태에서는, 변경된 골격 영역이 또 다른 종으로부터의 변경된 CDR 서열 또는 무작위 CDR 서열과 인접하지 않는다. 몇몇 양태에서는, 인간화 항체의 골격 서열이 완전히 인간이다 (즉, 인간 골격에 대한 골격 상의 변화가 전혀 이루어지지 않는다). 바람직한 양태에서는, 인간화 항체의 골격 서열이 완전히 인간 생식세포계이다 (즉, 인간 생식세포계 골격에 대한 골격 상의 변화가 전혀 이루어지지 않는다).

또 다른 종으로부터의 비-인간 아미노산 잔기, 또는 무작위 서열은 종종 "유입 (내수송)" 잔기로서 지칭되는데, 이는 전형적으로 "유입" 가변 도메인으로부터 취한다. 인간화는 본질적으로, 인간 항체의 상응하는 서열을 설치류 (또는 기타 포유류) CDRs 또는 CDR 서열로 치환시킴으로써, 다음 문헌의 방법에 따라서 수행할 수 있다 [참고: Winter and co-workers (e. g., Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988); 이들 모두는 본원에 참고로 도입된다]. 또한, 본래 인간 가변 도메인보다 실질적으로 적은 부분을 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환시킨 항체를 생성시킬 수도 있다 [예를 들어, 본원에 참고도 도입된 미국 특허 제4,816,567호 참고]. 실제적으로, 인간화 항체는 전형적으로, 몇몇 CDR 잔기와 가능하게는 몇몇 FR 잔기를 설치류 항체에서의 유사한 부위로부터의 잔기에 의해 치환시키거나, 또는 앞서 인지된 바와 같이 CDR 서열을 무작위 서열에 의해 치환시킨 인간 항체이다. 비-제한적 예로써, 공여자 CDR 결합 친화성을 항체 수용자 가변 영역 골격 내로 부여하는 방법이 WO 01/27160 Al 및 미국 특허원 제09/434,870호 및 제09/982,464호 [이들 모두가 본원에 참고로 도입된다]에 기재되어 있다.

인간화 항체를 제조하는데 사용될 인간 가변 도메인 (경쇄 및 중쇄 둘 다)을 선택하는 것은 항원성을 저하시키는데 있어 중요하다. 소위 "적합도 (best-fit)" 방법에 따라서, 인간화시키고자 하는 설치류 항체의 가변 도메인 서열을 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대항하여 스크리닝한다. 이때, 설치류 서열에 가장 근접한 인간 서열을 인간화 항체에 대한 인간 골격 (FR)으로서 허용한다 [참고: Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993), and Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987); 이들 문헌 둘 다가 본원에 참고로 도입된다]. 또 다른 방법은 특정한 경쇄 또는 중쇄 아군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정한 골격을 이용한다. 동일한 골격을 여러 가지 상이한 인간화 항체에 사용할 수 있다 [참고: Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151: 2623 (1993); 이들 문헌 둘 다가 본원에 참고로 도입된다].

기타 양태에서는, 특정한 인간 항체 골격을 "예비-선별"할 필요가 없다 (즉, 인간화시키고자 하는 소정의 후보 항체와 가장 근접한 상동성 또는 서열 동일성을 나타내는 인간 골격을 선별할 필요가 없다). 이들 양태에서는, 통상의 또는 만능 인간 골격을 사용하여 하나 이상의 비-인간 CDRs을 허용할 수 있다. 바람직한 양태에서는, 단일 만능의 완전한 인간 골격을, 후보 항체의 골격 서열(들)에 대한 그의 상동성에 상관없이, 인간화시키고자 하는 모든 항체에 대한 골격으로서 사용한다. 이와 관련하여, 골격 영역에 있어 어떠한 변화도 만들지 않으면서 인간화 항체를 생성시킬 수 있다. 이때, 이러한 만능의 완전한 인간 골격이 하나 이상의 CDR 서열을 허용할 수 있다. 한 양태에서는, 하나 이상의 CDR 서열이, 기타 종으로부터의 본래 항체 내의 상응하는 CDR과 비교해서 변형시킨 또 다른 종 (예: 마우스 또는 랫트)로부터 유래한 항체로부터의 CDR 서열이다 (즉, 만능 인간 골격 내로 도입되는 CDR의 변형과 CDR의 도입이 동시에 이루어진다). 이러한 변형은 기타 종으로부터의 본래 항체 내의 상응하는 CDR과 비교해서 (변형된 CDR)에서의 하나 이상의 아미노산 변화에 상응한다. 한 양태에서는, CDR 내의 모든 아미노산 잔기가 라이브러리 내에 포함되는 반면, 기타 양태에서는 CDR 아미노산 잔기 전부가 라이브러리에 포함되는 것은 아니다. 또 다른 양태에서는, 하나 이상의 CDR 서열이 무작위 서열이고, 이것이 CDR 서열을 대체한다.

바람직한 양태에서는, 항원에 대한 높은 친화성과 기타 바람직한 생물학적 특성을 보유하도록 항체를 인간화시킨다. 몇몇 양태에서는, 항원에 대한 인간화 항체의 친화성이 상응하는 비-인간화된 본래 항체 또는 그의 단편 또는 일부 (예: 후보 설치류 항체) 보다 더 높다. 이와 관련하에, 몇몇 양태에서는 모 서열과 인간화 서열의 3차원적 모델을 이용하여 모 서열 및 각종 개념적 인간화 생성물을 분석하는 공정에 의해 인간화 항체를 제조한다. 3차원적 면역글로불린 모델은 통상적으로 입수 가능하고 당업자에게 잘 알려져 있다. 선별된 후보 면역글로불린 서열의 추정 가능한 3차원의 입체 형태적 구조를 예시 및 표시하는 컴퓨터 프로그램이 입수 가능하다. 이들 표시물을 검사하여, 후보 면역글로불린 서열의 기능에 있어서의 상기 잔기의 예상 역할을 분석할 수 있는데, 즉 그의 항원과 결합할 수 있는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방식으로, 수용자 및 유입 서열로부터 FR 잔기를 선별 및 조합하여, 목적하는 항체 특징, 예를 들어, 표적 항원(들)에 대한 친화성 증가 등이 달성된다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합성에 영향을 미치는데 있어 직접적이고 가장 실질적으로 관여한다.

당업자에게 널리 공지된 각종 구체적 방법을 이용하여, 항체 CDRs (또는 항체 CDRs을 대체하는 무작위 서열)을 항체 골격 내로 도입할 수 있다 [예를 들어, 미국 특허원 제09/434,879호 및 제09/982,464호 참고]. 몇몇 양태에서는, 중복 올리고를 사용하여 항체 유전자 또는 그의 일부 (예: 인간화 항체를 암호화하는 유전자)를 합성할 수 있다. 기타 양태에서는, 예를 들어 쿤켈 (Kunkel) (하기 참고)의 방법을 사용하여 항체 주형의 돌연변이 유발을 수행하여, 변형된 CDR 또는 무작위 서열을 도입하여 CDR을 대체시킬 수 있다. 몇몇 양태에서는, 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 별개로 인간화한 다음, 인간화 가변 영역으로서 동시-발현시킨다. 기타 양태에서는, 인간화 가변 영역이 본래 항체의 가변 영역을 구성한다. 몇몇 양태에서는, 인간화 가변 영역을 포함하는 본래 항체의 Fc 영역을 변형시켰다 (예를 들어, 하나 이상의 아미노산 변형이 Fc 영역에서 이루어졌다). 예를 들어, 무작위화 CDR로 인간화시키고 골격 변화가 전혀 없는 항체는 Fc 영역에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함할 수 있다.

기타 양태에서는, 면역시 내인성 면역글로불린 생성의 부재 하에 완전한 인간 항체 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예: 마우스)을 이용한다. 예를 들어, 키메라 및 생식세포계 돌연변이체 마우스에서 항체 중쇄 결합 영역 (JH) 유전자가 동형접합성 결실되면, 내인성 항체 생산이 완전히 억제된다고 보고되었다. 이러한 생식세포계 돌연변이체 마우스에서 인간 생식세포계 면역글로불린 유전자 어레이를 전이시키면, 항원 챌린지시 인간 항체가 생성될 것이다 [참고: Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993), and Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); 이들 문헌 둘다가 본원에 참고로 도입된다]. 인간 항체는 또한, 파아지-표시 라이브러리로부터 유래될 수 있다 [참고: Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227: 381 (1991), and Vaughan et al. Nature Biotech 14: 309 (1996); 이들 문헌 둘다가 본원에 참고로 도입된다].

본 발명은 (Fc 영역을 갖는 모 폴리펩티드와 비교해서) Fc 영역에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 인간화 항체 (및 항체 단편)를 생성시키는 방법을 제공한다. 다음에 논의된 것은 이러한 인간화 항체를 생성시키는 부가의 방법이다. 본 발명은 또한, 이들 방법에 의해 생성된 항체 및 항체 단편을 포함하는 조성물을 제공한다. 중요하게는, 다음에 논의된 인간화 방법, 및 기타 인간화 방법 (예를 들어, 상기 논의된 바와 같음)을 본 발명의 Fc 변이체와 조합할 수 있다. 이와 관련하여, 변경된 독특한 Fc 영역을 갖는 인간화 항체를 본 발명에 따라서 구축할 수 있다.

몇몇 양태에서는, a) 제1 및 제2 기준 아미노산 서열의 표시물을 제공하는데, 이러한 제1 기준 서열은 공여자 중쇄 가변 영역의 서열을 포함하고, 공여자 가변 영역은 i) 골격 영역 및 ii) 카바트와 초치아의 조합 정의에 의해 규정된 바와 같은 3개의 상보성 결정 영역을 포함하며; 제2 기준 서열은 골격 영역을 포함하는 수용자 중쇄 가변 영역의 서열을 포함하는 단계; b) a) 수용자 중쇄 가변 영역의 골격 영역의 일부 (이러한 골격 영역의 일부는 제2 기준 서열과 비교해서 변형되지 않은 것이다)를 암호화하는 제1 올리고뉴클레오티드를 합성하고; b) 각각 i) 변형시킨 제1 상보성 결정 영역의 적어도 일부를 암호화하고 (제1 상보성 결정 영역은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로 이루어진 군 중에서 선택되고, 변형된 제1 상보성 결정 영역은 제1 기준 서열의 상응하는 공여자 상보성 결정 영역과 비교해서 하나 이상의 위치에서 상이한 아미노산을 포함한다) ii) 제1 올리고뉴클레오티드와 혼성화할 수 있는 변형되지 않은 골격 영역의 하나 이상의 일부를 암호화하는 제2 올리고뉴클레오티드 집단을 합성하는 단계; c) 제1 올리고뉴클레오티드와 제2 올리고뉴클레오티드 집단을 혼합하여 중복 올리고뉴클레오티드를 창출시키는 단계; 및 d) 변경된 중쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단이 구축되도록 하는 조건 하에 중복 올리고뉴클레오티드를 처리하는 단계 [이러한 변경된 중쇄 가변 영역 암호화 핵산에 의해 암호화된 골격 영역은 제2 기준 서열과 비교해서 변형되지 않은 것이다]를 포함하여, 변경된 중쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단을 구축하는 방법이 제공된다.

몇몇 양태에서는, 제1 기준 서열과 제2 기준 서열의 표시물이 전자 형태이다. 몇몇 양태에서는, 상기 방법이 (E) 변경된 헤테로메릭 (heteromeric) 가변 영역의 다양한 집단을 생산하도록, 변경된 중쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단과 경쇄 가변 영역 암호화 핵산을 동시-발현시키는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 양태에서는, 상기 합성 단계가 화학적으로 합성하는 것을 포함한다. 몇몇 양태에서는, 수용자가 인간이다. 몇몇 양태에서는, 처리 단계 (D)가 폴리머라제에 의한 연장을 포함한다.

기타 양태에서는, a) 제1 및 제2 기준 아미노산 서열의 표시물을 제공하는데, 이러한 제1 기준 서열은 공여자 경쇄 가변 영역의 서열을 포함하고, 공여자 가변 영역은 i) 골격 영역 및 ii) 카바트와 초치아의 조합 정의에 의해 규정된 바와 같은 3개의 상보성 결정 영역을 포함하며; 제2 기준 서열은 골격 영역을 포함하는 수용자 경쇄 가변 영역의 서열을 포함하는 단계; b) a) 수용자 경쇄 가변 영역의 골격 영역의 일부 (이러한 골격 영역의 일부는 제2 기준 서열과 비교해서 변형되지 않은 것이다)를 암호화하는 제1 올리고뉴클레오티드를 합성하고; b) 각각 i) 변형시킨 제1 상보성 결정 영역의 적어도 일부를 암호화하고 (제1 상보성 결정 영역은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로 이루어진 군 중에서 선택되고, 변형된 제1 상보성 결정 영역은 제1 기준 서열의 상응하는 공여자 상보성 결정 영역과 비교해서 하나 이상의 위치에서 상이한 아미노산을 포함한다) ii) 제1 올리고뉴클레오티드와 혼성화할 수 있는 변형되지 않은 골격 영역의 하나 이상의 일부를 암호화하는 제2 올리고뉴클레오티드 집단을 합성하는 단계; c) 제1 올리고뉴클레오티드와 제2 올리고뉴클레오티드 집단을 혼합하여 중복 올리고뉴클레오티드를 창출시키는 단계; 및 d) 변경된 경쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단이 구축되도록 하는 조건 하에 중복 올리고뉴클레오티드를 처리하는 단계 [이러한 변경된 경쇄 가변 영역 암호화 핵산에 의해 암호화된 골격 영역은 제2 기준 서열과 비교해서 변형되지 않은 것이다]를 포함하여, 변경된 경쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단을 구축하는 방법이 제공된다.

몇몇 양태에서는, 제1 기준 서열과 제2 기준 서열의 표시물이 전자 형태이다. 몇몇 양태에서는, 상기 방법이 (E) 변경된 헤테로메릭 가변 영역의 다양한 집단을 생산하도록, 변경된 경쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단과 중쇄 가변 영역 암호화 핵산을 동시-발현시키는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 양태에서는, 상기 합성 단계가 화학적으로 합성하는 것을 포함한다. 몇몇 양태에서는, 수용자가 인간이다. 몇몇 양태에서는, 처리 단계 (D)가 폴리머라제에 의한 연장을 포함한다.

몇몇 양태에서는, A) 제1 및 제2 기준 아미노산 서열의 표시물을 제공하는데, 이러한 제1 기준 서열은 공여자 중쇄 가변 영역의 서열을 포함하고, 공여자 가변 영역은 i) 골격 영역 및 ii) 카바트와 초치아의 조합 정의에 의해 규정된 바와 같은 3개의 상보성 결정 영역을 포함하며; 제2 기준 서열은 골격 영역을 포함하는 수용자 중쇄 가변 영역의 서열을 포함하는 단계; B) a) 각각, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3로 이루어진 군 중에서 선택된 제1 상보성 결정 영역의 적어도 일부를 암호화하는 제1 올리고뉴클레오티드 집단 (여기서, 변형된 제1 상보성 결정 영역은 제1 기준 서열의 상응하는 공여자 상보성 결정 영역과 비교해서 하나 이상의 위치에서 상이한 아미노산을 포함한다)를 합성하고; b) i) 수용자 중쇄 가변 영역의 골격 영역의 일부 (이러한 골격 영역의 일부는 기준 서열과 비교해서 변형되지 않은 것이다)를 암호화하고 ii) 제1 올리고뉴클레오티드 집단과 혼성화할 수 있는 상보성 결정 영역의 하나 이상의 일부를 암호화하는 제2 올리고뉴클레오티드를 합성하는 단계; C) 제1 올리고뉴클레오티드 집단과 제2 올리고뉴클레오티드를 혼합하여 중복 올리고뉴클레오티드를 창출시키는 단계; 및 D) 변경된 중쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단이 구축되도록 하는 조건 하에 중복 올리고뉴클레오티드를 처리하는 단계 [이러한 변경된 중쇄 가변 영역 암호화 핵산에 의해 암호화된 골격 영역은 제2 기준 서열과 비교해서 변형되지 않은 것이다]를 포함하여, 변경된 중쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단을 구축하는 방법이 제공된다.

몇몇 양태에서는, 제1 기준 서열과 제2 기준 서열의 표시물이 전자 형태이다. 몇몇 양태에서는, 상기 방법이 (E) 변경된 헤테로메릭 가변 영역의 다양한 집단을 생산하도록, 변경된 중쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단과 경쇄 가변 영역 암호화 핵산을 동시-발현시키는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 양태에서는, 상기 합성 단계가 화학적으로 합성하는 것을 포함한다. 몇몇 양태에서는, 수용자가 인간이다. 몇몇 양태에서는, 처리 단계 (D)가 폴리머라제에 의한 연장을 포함한다.

기타 양태에서는, A) 제1 및 제2 기준 아미노산 서열의 표시물을 제공하는데, 이러한 제1 기준 서열은 공여자 경쇄 가변 영역의 서열을 포함하고, 공여자 가변 영역은 i) 골격 영역 및 ii) 카바트와 초치아의 조합 정의에 의해 규정된 바와 같은 3개의 상보성 결정 영역을 포함하며; 제2 기준 서열은 골격 영역을 포함하는 수용자 경쇄 가변 영역의 서열을 포함하는 단계; B) a) 각각, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3로 이루어진 군 중에서 선택된 제1 상보성 결정 영역의 적어도 일부를 암호화하는 제1 올리고뉴클레오티드 집단 (여기서, 변형된 제1 상보성 결정 영역은 제1 기준 서열의 상응하는 공여자 상보성 결정 영역과 비교해서 하나 이상의 위치에서 상이한 아미노산을 포함한다)를 합성하고; b) i) 수용자 경쇄 가변 영역의 골격 영역의 일부 (이러한 골격 영역의 일부는 기준 서열과 비교해서 변형되지 않은 것이다)를 암호화하고 ii) 제1 올리고뉴클레오티드 집단과 혼성화할 수 있는 상보성 결정 영역의 하나 이상의 일부를 암호화하는 제2 올리고뉴클레오티드를 합성하는 단계; C) 제1 올리고뉴클레오티드 집단과 제2 올리고뉴클레오티드를 혼합하여 중복 올리고뉴클레오티드를 창출시키는 단계; 및 D) 변경된 경쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단이 구축되도록 하는 조건 하에 중복 올리고뉴클레오티드를 처리하는 단계 [이러한 변경된 경쇄 가변 영역 암호화 핵산에 의해 암호화된 골격 영역은 제2 기준 서열과 비교해서 변형되지 않은 것이다]를 포함하여, 변경된 경쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단을 구축하는 방법이 제공된다.

기타 양태에서는, a) 제1 및 제2 기준 아미노산 서열의 표시물을 제공하는데, 이러한 제1 기준 서열은 공여자 중쇄 가변 영역의 서열을 포함하고, 공여자 가변 영역은 i) 골격 영역 및 ii) 3개의 상보성 결정 영역을 포함하며; 제2 기준 서열은 중쇄 가변 영역을 포함하는 단계; b) 변경된 중쇄 가변 영역 항체 유전자 서열 집단을 합성하는 단계 (여기서, 변경된 중쇄 가변 영역의 골격 영역은 제2 기준 서열의 골격 영역과 동일하고, 변경된 항체 가변 영역의 적어도 제1 CDR을 변형시켰으며, 변형된 제1 CDR은 제1 기준 서열의 상응하는 공여자 CDR과 비교해서 하나 이상의 위치에서 상이한 아미노산을 포함한다)를 포함하여, 변경된 중쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단을 구축하는 방법이 고려된다.

몇몇 양태에서는, 제1 기준 서열과 제2 기준 서열의 표시물이 전자 형태이다. 몇몇 양태에서는, 상기 방법이 (E) 변경된 헤테로메릭 가변 영역의 다양한 집단을 생산하도록, 변경된 중쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단과 경쇄 가변 영역 암호화 핵산을 동시-발현시키는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 양태에서는, 수용자가 인간이다. 몇몇 양태에서는, 합성 단계가 중복 올리고뉴클레오티드의 사용을 포함한다. 몇몇 양태에서는, CDRs가 카바트 정의에 의해 규정된다.

몇몇 양태에서는, a) 제1 및 제2 기준 아미노산 서열의 표시물을 제공하는데, 이러한 제1 기준 서열은 공여자 경쇄 가변 영역의 서열을 포함하고, 공여자 가변 영역은 i) 골격 영역 및 ii) 3개의 상보성 결정 영역을 포함하며; 제2 기준 서열은 골격 영역을 포함하는 수용자 경쇄 가변 영역의 서열을 포함하는 단계; b) 변경된 경쇄 가변 영역 항체 유전자 서열 집단을 합성하는 단계 (여기서, 변경된 경쇄 가변 영역의 골격 영역은 제2 기준 서열의 골격 영역과 동일하고, 변경된 항체 경쇄 가변 영역의 적어도 제1 CDR을 변형시켰으며, 변형된 제1 CDR은 제1 기준 서열의 상응하는 공여자 CDR과 비교해서 하나 이상의 위치에서 상이한 아미노산을 포함한다)를 포함하여, 변경된 경쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단을 구축하는 방법이 고려된다.

몇몇 양태에서는, 제1 기준 서열과 제2 기준 서열의 표시물이 전자 형태이다. 몇몇 양태에서는, 상기 방법이 (E) 변경된 헤테로메릭 가변 영역의 다양한 집단을 생산하도록, 변경된 경쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단과 중쇄 가변 영역 암호화 핵산을 동시-발현시키는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 양태에서는, 수용자가 인간이다. 몇몇 양태에서는, 합성 단계가 중복 올리고뉴클레오티드의 사용을 포함한다.

기타 양태에서는, a) 기준 아미노산 서열의 표시물을 제공하는데, 이러한 기준 서열은 골격 영역을 포함하는 수용자 중쇄 가변 영역의 서열을 포함하는 단계; b) 변경된 중쇄 가변 영역 항체 유전자 서열 집단을 합성하는 단계 (여기서, 변경된 중쇄 가변 영역의 골격 영역은 기준 서열의 골격 영역과 동일하고, 변경된 항체 가변 영역의 적어도 제1 CDR은 무작위 아미노산 서열을 포함한다)를 포함하여, 변경된 중쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단을 구축하는 방법이 고려된다.

몇몇 양태에서는, 기준 서열의 표시물이 전자 형태이다. 몇몇 양태에서는, 상기 방법이 (E) 변경된 헤테로메릭 가변 영역의 다양한 집단을 생산하도록, 변경된 중쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단과 경쇄 가변 영역 암호화 핵산을 동시-발현시키는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 양태에서는, 수용자가 인간이다. 몇몇 양태에서는, 합성 단계가 중복 올리고뉴클레오티드의 사용을 포함한다. 몇몇 양태에서는, CDRs가 카바트 정의에 의해 규정된다.

기타 양태에서는, a) 기준 아미노산 서열의 표시물을 제공하는데, 이러한 기준 서열은 골격 영역을 포함하는 수용자 경쇄 가변 영역의 서열을 포함하는 단계; b) 변경된 경쇄 가변 영역 항체 유전자 서열 집단을 합성하는 단계 (여기서, 변경된 경쇄 가변 영역의 골격 영역은 기준 서열의 골격 영역과 동일하고, 변경된 항체 경쇄 가변 영역의 적어도 제1 CDR은 무작위 아미노산 서열을 포함한다)를 포함하여, 변경된 경쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단을 구축하는 방법이 고려된다.

몇몇 양태에서는, 기준 서열의 표시물이 전자 형태이다. 몇몇 양태에서는, 상기 방법이 (E) 변경된 헤테로메릭 가변 영역의 다양한 집단을 생산하도록, 변경된 경쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단과 중쇄 가변 영역 암호화 핵산을 동시-발현시키는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 양태에서는, 수용자가 인간이다. 몇몇 양태에서는, 합성 단계가 중복 올리고뉴클레오티드의 사용을 포함한다. 몇몇 양태에서는, CDRs가 카바트 정의에 의해 규정된다.

기타 양태에서는, a) 기준 아미노산 서열의 표시물을 제공하는데, 이러한 기준 서열은 골격 영역을 포함하는 인간 수용자 중쇄 가변 영역의 서열을 포함하는 단계; b) 변경된 중쇄 가변 영역 항체 유전자 서열 집단을 합성하는 단계 (여기서, 변경된 중쇄 가변 영역의 골격 영역은 인간 기준 서열의 골격 영역과 동일하고, 변경된 항체 가변 영역의 적어도 제1 CDR은 무작위 아미노산 서열을 포함한다)를 포함하여, 변경된 중쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단을 구축하는 방법이 고려된다. 몇몇 양태에서는, 인간 기준 서열의 표시물이 전자 형태이다. 몇몇 양태에서는, 상기 방법이 (E) 변경된 헤테로메릭 가변 영역의 다양한 집단을 생산하도록, 변경된 중쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단과 경쇄 가변 영역 암호화 핵산을 동시-발현시키는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 양태에서는, 합성 단계가 중복 올리고뉴클레오티드의 사용을 포함한다. 몇몇 양태에서는, CDRs가 카바트 정의에 의해 규정된다.

기타 양태에서는, a) 기준 아미노산 서열의 표시물을 제공하는데, 이러한 기준 서열은 골격 영역을 포함하는 인간 수용자 경쇄 가변 영역의 서열을 포함하는 단계; b) 변경된 경쇄 가변 영역 항체 유전자 서열 집단을 합성하는 단계 (여기서, 변경된 경쇄 가변 영역의 골격 영역은 인간 기준 서열의 골격 영역과 동일하고, 변경된 항체 경쇄 가변 영역의 적어도 제1 CDR은 무작위 아미노산 서열을 포함한다)를 포함하여, 변경된 경쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단을 구축하는 방법이 고려된다.

몇몇 양태에서는, 기준 서열의 표시물이 전자 형태이다. 몇몇 양태에서는, 상기 방법이 (E) 변경된 헤테로메릭 가변 영역의 다양한 집단을 생산하도록, 변경된 경쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단과 중쇄 가변 영역 암호화 핵산을 동시-발현시키는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 양태에서는, 합성 단계가 중복 올리고뉴클레오티드의 사용을 포함한다. 몇몇 양태에서는, CDRs가 카바트 정의에 의해 규정된다.

몇몇 양태에서는, 하나 이상 골격 영역을, 하나 이상 변형된 CDRs의 도입과 동시에 변형시킨다. 기타 양태에서는, 변형된 골격이 변형된 CDRs에 인접해있다.

몇몇 양태에서, 본 발명은 a) 제1 및 제2 기준 아미노산 서열의 표시물을 제공하는데, 이러한 제1 기준 아미노산 서열은 공여자 중쇄 가변 영역의 서열을 포함하고, 공여자 가변 영역은 i) 골격 영역 및 ii) 카바트와 초치아의 조합 정의에 의해 규정된 바와 같은 3개의 상보성 결정 영역을 포함하며; 제2 기준 아미노산 서열은 골격 영역을 포함하는 수용자 중쇄 가변 영역의 서열을 포함하는 단계; b) a) 변형된 중쇄 가변 영역 골격 영역 또는 그의 일부를 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 (여기서, 중쇄 가변 영역 골격 영역 또는 그의 일부는, 수용자 골격 영역 기준 서열과 비교해서 하나 이상의 위치에서 복수 개의 변화된 아미노산을 함유하고, 변화되는 골격 위치는 제1 기준 서열의 공여자 골격 위치와 비교해서 상응하는 위치에서 상이한 제2 기준 서열의 수용자 골격 위치들 중에서 선택된다) 제1 올리고뉴클레오티드 집단을 합성하고; b) 각각 i) 하나 이상의 변형된 상보성 결정 영역 또는 그의 일부를 암호화하고 (변형된 상보성 결정 영역 또는 그의 일부는 상응하는 공여자 상보성 결정 영역 아미노산 기준 서열과 비교해서 하나 이상의 위치에서 상이한 아미노산을 포함한다) ii) 제1 올리고뉴클레오티드 집단과 혼성화할 수 있는 인접한 골격 영역의 하나 이상의 일부를 암호화하는 제2 올리고뉴클레오티드 집단을 합성하는 단계; c) 제1 올리고뉴클레오티드 집단과 제2 올리고뉴클레오티드 집단을 혼합하여 중복 올리고뉴클레오티드를 창출시키는 단계; 및 d) 변경된 중쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단이 구축되도록 하는 조건 하에 중복 올리고뉴클레오티드를 처리하는 단계를 포함하여, 변경된 중쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단을 구축하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서는, 제1 기준 서열과 제2 기준 서열의 표시물이 전자 형태이다. 기타 양태에서는, 상기 방법이 (e) 변경된 헤테로메릭 가변 영역의 다양한 집단을 생산하도록, 변경된 중쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단과 경쇄 가변 영역 암호화 핵산을 동시-발현시키는 단계를 추가로 포함한다. 부가 양태에서는, 상기 합성 단계가 화학적으로 합성하는 것을 포함한다. 몇몇 양태에서는, 수용자가 인간이다. 바람직한 양태에서는, 변경된 헤테로메릭 가변 영역의 다양한 집단 중의 하나 이상이 Fc 영역을 포함하는 항체의 일부이고, 이러한 Fc 영역은 Fc 영역을 갖는 모 폴리펩티드와 비교해서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다.

기타 양태에서, 본 발명은 a) 제1 및 제2 기준 아미노산 서열의 표시물을 제공하는데, 이러한 제1 기준 아미노산 서열은 공여자 경쇄 가변 영역의 서열을 포함하고, 공여자 가변 영역은 i) 골격 영역 및 ii) 카바트와 초치아의 조합 정의에 의해 규정된 바와 같은 3개의 상보성 결정 영역을 포함하며; 제2 기준 아미노산 서열은 골격 영역을 포함하는 수용자 경쇄 가변 영역의 서열을 포함하는 단계; b) a) 변형된 경쇄 가변 영역 골격 영역 또는 그의 일부를 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 (여기서, 경쇄 가변 영역 골격 영역 또는 그의 일부는, 수용자 골격 영역 기준 서열과 비교해서 하나 이상의 위치에서 복수 개의 변화된 아미노산을 함유하고, 변화되는 골격 위치는 제1 기준 서열의 공여자 골격 위치와 비교해서 상응하는 위치에서 상이한 제2 기준 서열의 수용자 골격 위치들 중에서 선택된다) 제1 올리고뉴클레오티드 집단을 합성하고; b) 각각 i) 하나 이상의 변형된 상보성 결정 영역 또는 그의 일부를 암호화하고 (변형된 상보성 결정 영역 또는 그의 일부는 상응하는 공여자 상보성 결정 영역 아미노산 기준 서열과 비교해서 하나 이상의 위치에서 상이한 아미노산을 포함한다) ii) 제1 올리고뉴클레오티드 집단과 혼성화할 수 있는 인접한 골격 영역의 하나 이상의 일부를 암호화하는 제2 올리고뉴클레오티드 집단을 합성하는 단계; c) 제1 올리고뉴클레오티드 집단과 제2 올리고뉴클레오티드 집단을 혼합하여 중복 올리고뉴클레오티드를 창출시키는 단계; 및 d) 변경된 경쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단이 구축되도록 하는 조건 하에 중복 올리고뉴클레오티드를 처리하는 단계를 포함하여, 변경된 경쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단을 구축하는 방법을 제공한다. 기타 양태에서는, 제1 기준 서열과 제2 기준 서열의 표시물이 전자 형태이다. 부가 양태에서는, 상기 방법이 (e) 변경된 헤테로메릭 가변 영역의 다양한 집단을 생산하도록, 변경된 경쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단과 중쇄 가변 영역 암호화 핵산을 동시-발현시키는 단계를 추가로 포함한다.

몇몇 양태에서는, 상기 방법이 a) 제1 및 제2 기준 아미노산 서열의 표시물을 제공하는데, 이러한 제1 기준 아미노산 서열은 공여자 중쇄 가변 영역의 서열을 포함하고, 공여자 가변 영역은 i) 골격 영역 및 ii) 카바트와 초치아의 조합 정의에 의해 규정된 바와 같은 3개의 상보성 결정 영역을 포함하며; 제2 기준 아미노산 서열은 골격 영역을 포함하는 수용자 중쇄 가변 영역의 서열을 포함하는 단계; b) a) 변형된 중쇄 가변 영역 골격 영역 또는 그의 일부를 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 (여기서, 중쇄 가변 영역 골격 영역 또는 그의 일부는, 수용자 골격 영역 기준 서열과 비교해서 하나 이상의 위치에서 복수 개의 변화된 아미노산을 함유하고, 변화되는 골격 위치는 제1 기준 서열의 공여자 골격 위치와 비교해서 상응하는 위치에서 상이한 제2 기준 서열의 수용자 골격 위치들 중에서 선택된다) 제1 올리고뉴클레오티드 집단을 합성하고; b) 각각 i) 하나 이상의 변형된 상보성 결정 영역 또는 그의 일부를 암호화하고 (변형된 상보성 결정 영역 또는 그의 일부는 상응하는 공여자 상보성 결정 영역 아미노산 기준 서열과 비교해서 하나 이상의 위치에서 상이한 아미노산을 포함한다) ii) 제1 올리고뉴클레오티드 집단과 혼성화할 수 있는 인접한 골격 영역의 하나 이상의 일부를 암호화하는 제2 올리고뉴클레오티드 집단을 합성하는 단계; c) 제1 올리고뉴클레오티드 집단과 제2 올리고뉴클레오티드 집단을 혼합하여 중복 올리고뉴클레오티드를 창출시키는 단계; 및 d) 변경된 중쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단이 구축되도록 하는 조건 하에 중복 올리고뉴클레오티드를 DNA 폴리머라제로 연장시키는 단계를 포함한다.

기타 양태에서, 본 발명은 a) 제1 및 제2 기준 아미노산 서열의 표시물을 제공하는데, 이러한 제1 기준 아미노산 서열은 공여자 경쇄 가변 영역의 서열을 포함하고, 공여자 가변 영역은 i) 골격 영역 및 ii) 카바트와 초치아의 조합 정의에 의해 규정된 바와 같은 3개의 상보성 결정 영역을 포함하며; 제2 기준 아미노산 서열은 골격 영역을 포함하는 수용자 경쇄 가변 영역의 서열을 포함하는 단계; b) a) 변형된 경쇄 가변 영역 골격 영역 또는 그의 일부를 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 (여기서, 경쇄 가변 영역 골격 영역 또는 그의 일부는, 수용자 골격 영역 기준 서열과 비교해서 하나 이상의 위치에서 복수 개의 변화된 아미노산을 함유하고, 변화되는 골격 위치는 제1 기준 서열의 공여자 골격 위치와 비교해서 상응하는 위치에서 상이한 제2 기준 서열의 수용자 골격 위치들 중에서 선택된다) 제1 올리고뉴클레오티드 집단을 합성하고; b) 각각 i) 하나 이상의 변형된 상보성 결정 영역 또는 그의 일부를 암호화하고 (변형된 상보성 결정 영역 또는 그의 일부는 상응하는 공여자 상보성 결정 영역 아미노산 기준 서열과 비교해서 하나 이상의 위치에서 상이한 아미노산을 포함한다) ii) 제1 올리고뉴클레오티드 집단과 혼성화할 수 있는 인접한 골격 영역의 하나 이상의 일부를 암호화하는 제2 올리고뉴클레오티드 집단을 합성하는 단계; c) 제1 올리고뉴클레오티드 집단과 제2 올리고뉴클레오티드 집단을 혼합하여 중복 올리고뉴클레오티드를 창출시키는 단계; 및 d) 변경된 경쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단이 구축되도록 하는 조건 하에 중복 올리고뉴클레오티드를 DNA 폴리머라제로 연장시키는 단계를 포함하여, 변경된 경쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단을 구축하는 방법을 제공한다.

몇몇 양태에서는, 하나 이상의 변형을 하나 이상의 변형된 CDRs의 도입과 동시에 골격 내로 도입한다. 변형된 CDRs는 기준 서열의 상응하는 CDR과 비교해서 하나 이상의 아미노산 변경을 포함할 수 있다. 특정 양태에서는, 변경된 중쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단을 구축하는 방법이 a) 제1 및 제2 기준 아미노산 서열의 표시물을 제공하는데, 이러한 제1 기준 아미노산 서열은 공여자 중쇄 가변 영역의 서열을 포함하고, 공여자 가변 영역은 i) 골격 영역 및 ii) 카바트와 초치아의 조합 정의에 의해 규정된 바와 같은 3개의 상보성 결정 영역을 포함하며; 제2 기준 아미노산 서열은 골격 영역을 포함하는 수용자 중쇄 가변 영역의 서열을 포함하는 단계; b) i) 각각, 하나 이상의 변형된 상보성 결정 영역을 암호화하는 (여기서, 변형된 상보성 결정 영역은 상응하는 공여자 상보성 결정 영역 아미노산 기준 서열과 비교해서 하나 이상의 위치에서 상이한 아미노산을 포함한다) 제1 올리고뉴클레오티드 집단을 합성하고; b) 중쇄 가변 영역 골격 영역의 변형된 부분을 암호화하는 (이러한 변형된 부분은 수용자 골격 영역 기준 서열과 비교해서 하나 이상의 위치에서 복수 개의 변화된 아미노산을 함유하고, 변화되는 골격 위치는 제1 기준 서열의 공여자 골격 위치와 비교해서 상응하는 위치에서 상이한 제2 기준 서열의 수용자 골격 위치들 중에서 선택된다) 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제2 올리고뉴클레오티드 집단을 합성하는 단계; c) 제1 올리고뉴클레오티드 집단과 제2 올리고뉴클레오티드 집단을, 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부가 혼성화되도록 하는 조건 하에 혼합하여 중복 올리고뉴클레오티드를 창출시키는 단계; 및 d) 변경된 중쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단이 구축되도록 하는 조건 하에 중복 올리고뉴클레오티드를 처리하는 단계를 포함한다. 특정 양태에서는, 제1 기준 서열과 제2 기준 서열의 표시물이 전자 형태이다. 추가 양태에서는, 상기 방법이 (e) 변경된 헤테로메릭 가변 영역의 다양한 집단을 생산하도록, 변경된 중쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단과 경쇄 가변 영역 암호화 핵산을 동시-발현시키는 단계를 추가로 포함한다. 기타 양태에서는, 수용자가 인간이다.

기타 양태에서, 본 발명은 a) 제1 및 제2 기준 아미노산 서열의 표시물을 제공하는데, 이러한 제1 기준 아미노산 서열은 공여자 경쇄 가변 영역의 서열을 포함하고, 공여자 가변 영역은 i) 골격 영역 및 ii) 카바트와 초치아의 조합 정의에 의해 규정된 바와 같은 3개의 상보성 결정 영역을 포함하며; 제2 기준 아미노산 서열은 골격 영역을 포함하는 수용자 경쇄 가변 영역의 서열을 포함하는 단계; b) i) 각각, 하나 이상의 변형된 상보성 결정 영역을 암호화하는 (여기서, 변형된 상보성 결정 영역은 상응하는 공여자 상보성 결정 영역 아미노산 기준 서열과 비교해서 하나 이상의 위치에서 상이한 아미노산을 포함한다) 제1 올리고뉴클레오티드 집단을 합성하고; b) 경쇄 가변 영역 골격의 변형된 부분을 암호화하는 (이러한 변형된 부분은 수용자 골격 영역 기준 서열과 비교해서 하나 이상의 위치에서 복수 개의 변화된 아미노산을 함유하고, 변화되는 골격 위치는 제1 기준 서열의 공여자 골격 위치와 비교해서 상응하는 위치에서 상이한 제2 기준 서열의 수용자 골격 위치들 중에서 선택된다) 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제2 올리고뉴클레오티드 집단을 합성하는 단계; c) 제1 올리고뉴클레오티드 집단과 제2 올리고뉴클레오티드 집단을, 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부가 혼성화되도록 하는 조건 하에 혼합하여 중복 올리고뉴클레오티드를 창출시키는 단계; 및 d) 변경된 경쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단이 구축되도록 하는 조건 하에 중복 올리고뉴클레오티드를 처리하는 단계를 포함하여, 변경된 경쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단을 구축하는 방법을 제공한다.

특정 양태에서는, Fc 변이체 및 변경된 중쇄 변이체 영역을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 몇몇 양태에서, 본 발명은 a) 제1 및 제2 기준 아미노산 서열의 표시물을 제공하는데, 이러한 제1 기준 서열은 공여자 중쇄 가변 영역의 서열을 포함하고, 공여자 가변 영역은 i) 골격 영역 및 ii) 카바트와 초치아의 조합 정의에 의해 규정된 바와 같은 3개의 상보성 결정 영역을 포함하며; 제2 기준 서열은 골격 영역을 포함하는 수용자 중쇄 가변 영역의 서열을 포함하는 단계; b) A) 수용자 중쇄 가변 영역의 골격 영역의 일부 (이러한 골격 영역의 일부는 제2 기준 서열과 비교해서 변형되지 않은 것이다)를 암호화하는 제1 올리고뉴클레오티드를 합성하고; B) 각각 i) 변형시킨 제1 상보성 결정 영역의 적어도 일부를 암호화하고 (제1 상보성 결정 영역은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로 이루어진 군 중에서 선택되고, 변형된 제1 상보성 결정 영역은 제1 기준 서열의 상응하는 공여자 상보성 결정 영역과 비교해서 하나 이상의 위치에서 상이한 아미노산을 포함한다) ii) 제1 올리고뉴클레오티드와 혼성화할 수 있는 변형되지 않은 골격 영역의 하나 이상의 일부를 암호화하는 제2 올리고뉴클레오티드 집단을 합성하는 단계; c) 제1 올리고뉴클레오티드와 제2 올리고뉴클레오티드 집단을 혼합하여 중복 올리고뉴클레오티드를 창출시키는 단계; 및 d) 변경된 중쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단이 구축되도록 하는 조건 하에 중복 올리고뉴클레오티드를 처리하는 단계 [이러한 변경된 중쇄 가변 영역 암호화 핵산에 의해 암호화된 골격 영역은 제2 기준 서열과 비교해서 변형되지 않은 것이다]를 포함하여, 변경된 중쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단을 구축하는 방법을 제공한다. 몇몇 양태에서는, 상기 방법이 (E) 변경된 헤테로메릭 가변 영역의 다양한 집단을 생산하도록, 변경된 중쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단과 경쇄 가변 영역 암호화 핵산을 동시-발현시키는 단계를 추가로 포함한다.

기타 양태에서, 본 발명은 a) 제1 및 제2 기준 아미노산 서열의 표시물을 제공하는데, 이러한 제1 기준 서열은 공여자 경쇄 가변 영역의 서열을 포함하고, 공여자 가변 영역은 i) 골격 영역 및 ii) 카바트와 초치아의 조합 정의에 의해 규정된 바와 같은 3개의 상보성 결정 영역을 포함하며; 제2 기준 서열은 골격 영역을 포함하는 수용자 경쇄 가변 영역의 서열을 포함하는 단계; b) a) 수용자 경쇄 가변 영역의 골격 영역의 일부 (이러한 골격 영역의 일부는 제2 기준 서열과 비교해서 변형되지 않은 것이다)를 암호화하는 제1 올리고뉴클레오티드를 합성하고; b) 각각 i) 변형시킨 제1 상보성 결정 영역의 적어도 일부를 암호화하고 (제1 상보성 결정 영역은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로 이루어진 군 중에서 선택되고, 변형된 제1 상보성 결정 영역은 제1 기준 서열의 상응하는 공여자 상보성 결정 영역과 비교해서 하나 이상의 위치에서 상이한 아미노산을 포함한다) ii) 제1 올리고뉴클레오티드와 혼성화할 수 있는 변형되지 않은 골격 영역의 하나 이상의 일부를 암호화하는 제2 올리고뉴클레오티드 집단을 합성하는 단계; c) 제1 올리고뉴클레오티드와 제2 올리고뉴클레오티드 집단을 혼합하여 중복 올리고뉴클레오티드를 창출시키는 단계; 및 d) 변경된 경쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단이 구축되도록 하는 조건 하에 중복 올리고뉴클레오티드를 처리하는 단계 [이러한 변경된 경쇄 가변 영역 암호화 핵산에 의해 암호화된 골격 영역은 제2 기준 서열과 비교해서 변형되지 않은 것이다]를 포함하여, 변경된 경쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단을 구축하는 방법을 제공한다.

기타 양태에서, 본 발명은 A) 제1 및 제2 기준 아미노산 서열의 표시물을 제공하는데, 이러한 제1 기준 서열은 공여자 중쇄 가변 영역의 서열을 포함하고, 공여자 가변 영역은 i) 골격 영역 및 ii) 카바트와 초치아의 조합 정의에 의해 규정된 바와 같은 3개의 상보성 결정 영역을 포함하며; 제2 기준 서열은 골격 영역을 포함하는 수용자 중쇄 가변 영역의 서열을 포함하는 단계; B) a) 각각, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로 이루어진 군 중에서 선택된 제1 상보성 결정 영역의 적어도 일부를 암호화하는 제1 올리고뉴클레오티드 집단 (여기서, 변형된 제1 상보성 결정 영역은 제1 기준 서열의 상응하는 공여자 상보성 결정 영역과 비교해서 하나 이상의 위치에서 상이한 아미노산을 포함한다)를 합성하고; b) i) 수용자 중쇄 가변 영역의 골격 영역의 일부 (이러한 골격 영역의 일부는 기준 서열과 비교해서 변형되지 않은 것이다)를 암호화하고 ii) 제1 올리고뉴클레오티드 집단과 혼성화할 수 있는 상보성 결정 영역의 하나 이상의 일부를 암호화하는 제2 올리고뉴클레오티드를 합성하는 단계; C) 제1 올리고뉴클레오티드 집단과 제2 올리고뉴클레오티드를 혼합하여 중복 올리고뉴클레오티드를 창출시키는 단계; 및 D) 변경된 중쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단이 구축되도록 하는 조건 하에 중복 올리고뉴클레오티드를 처리하는 단계 [이러한 변경된 중쇄 가변 영역 암호화 핵산에 의해 암호화된 골격 영역은 제2 기준 서열과 비교해서 변형되지 않은 것이다]를 포함하여, 변경된 중쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단을 구축하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서는, 상기 방법이 (E) 변경된 헤테로메릭 가변 영역의 다양한 집단을 생산하도록, 변경된 중쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단과 경쇄 가변 영역 암호화 핵산을 동시-발현시키는 단계를 추가로 포함한다.

기타 양태에서, 본 발명은 A) 제1 및 제2 기준 아미노산 서열의 표시물을 제공하는데, 이러한 제1 기준 서열은 공여자 경쇄 가변 영역의 서열을 포함하고, 공여자 가변 영역은 i) 골격 영역 및 ii) 카바트와 초치아의 조합 정의에 의해 규정된 바와 같은 3개의 상보성 결정 영역을 포함하며; 제2 기준 서열은 골격 영역을 포함하는 수용자 경쇄 가변 영역의 서열을 포함하는 단계; B) a) 각각, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로 이루어진 군 중에서 선택된 제1 상보성 결정 영역의 적어도 일부를 암호화하는 제1 올리고뉴클레오티드 집단 (여기서, 변형된 제1 상보성 결정 영역은 제1 기준 서열의 상응하는 공여자 상보성 결정 영역과 비교해서 하나 이상의 위치에서 상이한 아미노산을 포함한다)를 합성하고; b) i) 수용자 경쇄 가변 영역의 골격 영역의 일부 (이러한 골격 영역의 일부는 기준 서열과 비교해서 변형되지 않은 것이다)를 암호화하고 ii) 제1 올리고뉴클레오티드 집단과 혼성화할 수 있는 상보성 결정 영역의 하나 이상의 일부를 암호화하는 제2 올리고뉴클레오티드를 합성하는 단계; C) 제1 올리고뉴클레오티드 집단과 제2 올리고뉴클레오티드를 혼합하여 중복 올리고뉴클레오티드를 창출시키는 단계; 및 D) 변경된 경쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단이 구축되도록 하는 조건 하에 중복 올리고뉴클레오티드를 처리하는 단계 [이러한 변경된 경쇄 가변 영역 암호화 핵산에 의해 암호화된 골격 영역은 제2 기준 서열과 비교해서 변형되지 않은 것이다]를 포함하여, 변경된 경쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단을 구축하는 방법을 제공한다.

기타 양태에서, 본 발명은 a) 제1 돌연변이된 인간화 항체 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열을 제공하는데, 이러한 돌연변이된 가변 영역은 (i) 야생형 인간 항체 골격, (ii) 3개의 비-인간 중쇄 상보성 결정 영역 및 (iii) 3개의 비-인간 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 단계 [이러한 상보성 결정 영역은 카바트와 초치아의 조합 정의에 의해 규정되며, 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역은 상응하는 야생형 비-인간 상보성 결정 영역과 비교해서 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 상이한 아미노산을 포함하는 돌연변이-함유 경쇄 상보성 결정 영역이고, 제1 돌연변이된 항체 가변 영역은 상응하는 비-돌연변이된 항체 가변 영역 보다 더 높은 결합 친화성을 지닌다]; b) 제2 돌연변이된 인간화 항체 가변 영역이 암호화되도록 하는 조건 하에, 제1 돌연변이된 항체 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열을 돌연변이시키는 단계 [이러한 제2 돌연변이된 인간화 항체 가변 영역은 돌연변이-함유 경쇄 상보성 결정 영역 내의 하나 이상의 위치에서 하나 이상 부가의 상이한 아미노산을 포함하고, 제1 돌연변이와 조합하여 부가 돌연변이시키면, 보다 높은 결합 친화성이 수득된다]를 포함하여, 돌연변이된 인간화 항체 가변 영역의 결합 친화성을 개선시키는 방법을 제공한다. 몇몇 양태에서는, 제1 돌연변이된 인간화 항체 가변 영역의 돌연변이-함유 경쇄 상보성 결정 영역이 상보성 결정 영역 3 (LCDR3)이다. 기타 양태에서는, 제1 돌연변이된 인간화 항체 가변 영역의 비-인간 중쇄 상보성 결정 영역 중의 하나 이상이, 상응하는 야생형 비-인간 상보성 결정 영역과 비교해서 하나 이상의 위치에서 상이한 아미노산이 암호화되도록 하는 돌연변이를 포함한다. 부가 양태에서는, 중쇄 상보성 결정 영역 돌연변이가 HCDR3에서 이루어진다.

몇몇 양태에서, 본 발명은 a) 제1 및 제2 기준 아미노산 서열의 표시물을 제공하는데, 이러한 제1 기준 아미노산 서열은 공여자 중쇄 가변 영역의 서열을 포함하고, 공여자 가변 영역은 i) 4개의 골격 영역 및 ii) 카바트와 초치아의 조합 정의에 의해 규정된 바와 같은 3개의 상보성 결정 영역을 포함하며; 제2 기준 아미노산 서열은 카바트와 초치아의 조합 정의에 의해 규정된 바와 같은, 4개의 골격 영역을 포함하는 수용자 중쇄 가변 영역의 서열을 포함하는 단계; b) i) 모든 골격 영역을 변형시키고자 하는 경우에는, 각각 변형된 골격 영역 또는 그의 일부를 암호화하는 (여기서, 변형된 골격 영역 또는 그의 일부는, 수용자 중쇄 가변 영역 기준 서열 내의 상응하는 골격 영역과 비교해서 하나 이상의 위치에서 복수 개의 변화된 아미노산을 함유하고, 변화되는 골격 영역 위치는 제1 기준 서열의 공여자 골격 영역 위치와 비교해서 상응하는 위치에서 상이한 제2 기준 서열의 수용자 골격 위치들 중에서 선택된다) 올리고뉴클레오티드 집단을 합성하고; ii) 모든 상보성 결정 영역을 변형시키고자 하는 경우에는, 각각 변형된 상보성 결정 영역 또는 그의 일부를 암호화하는 (여기서, 변형된 상보성 결정 영역은, 상응하는 공여자 상보성 결정 영역 아미노산 기준 서열과 비교해서 하나 이상의 위치에서 상이한 아미노산을 포함한다) 올리고뉴클레오티드 집단을 합성하며; iii) 나머지 모든 골격 영역과 변형되지 않은 골격 영역 각각의 경우에는, 제2 기준 수용자 서열의 상응하는 골격 영역과 동일한 서열을 갖는, 골격 영역 또는 그의 일부를 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 합성하고; iv) 나머지 모든 상보성 결정 영역과 변형되지 않은 상보성 결정 영역 각각의 경우에는, 제1 기준 공여자 서열의 상응하는 상보성 결정 영역과 동일한 서열을 갖는, 상보성 결정 영역 또는 그의 일부를 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 합성하는 단계 [중쇄 가변 영역의 인접한 부분을 암호화하는 (i) 내지 (iv)로부터의 개개의 올리고뉴클레오티드는 그들의 말단에 중복 서열을 갖는다]; c) 단계 b)에서 합성된 올리고뉴클레오티드 집단과 올리고뉴클레오티드를, 개개 올리고뉴클레오티드의 중복 서열이 혼성화되도록 하는 조건 하에 혼합하여 중복 올리고뉴클레오티드를 창출시키는 단계; 및 d) 변경된 중쇄 가변 영역 암호화 뉴클레오티드 집단이 형성되도록 하는 조건 하에 중복 올리고뉴클레오티드를 처리하는 단계를 포함하여, 변경된 중쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단을 구축하는 동안, 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR) 및 하나 이상의 골격 영역 (FR)을 동시에 변형시키는 방법을 제공한다. 특정 양태에서는, 제1 기준 서열과 제2 기준 서열의 표시물이 전자 형태이다. 추가 양태에서는, 변형시키고자 하는 골격 영역이 HFR1, HFR2 및 HFR3으로 이루어진 군 중에서 선택된다. 기타 양태에서는, 변형시키고자 하는 상보성 결정 영역이 HCDR3이다. 기타 양태에서는, 상기 방법이 (e) 변경된 헤테로메릭 가변 영역의 다양한 집단을 생산하도록, 중쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단과 경쇄 가변 영역 암호화 핵산을 동시-발현시키는 단계를 추가로 포함한다. 상이한 양태에서는, 상기 방법이 (e) 변경된 헤테로메릭 가변 영역의 다양한 집단을 생산하도록, 중쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단과 경쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단을 동시-발현시키는 단계를 추가로 포함한다.

기타 양태에서, 변경된 경쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단을 구축하는 동안, 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR) 및 하나 이상의 골격 영역 (FR)을 동시에 변형시키는 방법을 이용하는데, 이러한 방법은 a) 제1 및 제2 기준 아미노산 서열의 표시물을 제공하는데, 이러한 제1 기준 아미노산 서열은 공여자 경쇄 가변 영역의 서열을 포함하고, 공여자 가변 영역은 i) 4개의 골격 영역 및 ii) 카바트와 초치아의 조합 정의에 의해 규정된 바와 같은 3개의 상보성 결정 영역을 포함하며; 제2 기준 아미노산 서열은 카바트와 초치아의 조합 정의에 의해 규정된 바와 같은, 4개의 골격 영역을 포함하는 수용자 경쇄 가변 영역의 서열을 포함하는 단계; b) i) 모든 골격 영역을 변형시키고자 하는 경우에는, 각각 변형된 골격 영역 또는 그의 일부를 암호화하는 (여기서, 변형된 골격 영역 또는 그의 일부는, 수용자 경쇄 가변 영역 기준 서열 내의 상응하는 골격 영역과 비교해서 하나 이상의 위치에서 복수 개의 변화된 아미노산을 함유하고, 변화되는 골격 영역 위치는 제1 기준 서열의 공여자 골격 영역 위치와 비교해서 상응하는 위치에서 상이한 제2 기준 서열의 수용자 골격 위치들 중에서 선택된다) 올리고뉴클레오티드 집단을 합성하고; ii) 모든 상보성 결정 영역을 변형시키고자 하는 경우에는, 각각 변형된 상보성 결정 영역 또는 그의 일부를 암호화하는 (여기서, 변형된 상보성 결정 영역은, 상응하는 공여자 상보성 결정 영역 아미노산 기준 서열과 비교해서 하나 이상의 위치에서 상이한 아미노산을 포함한다) 올리고뉴클레오티드 집단을 합성하며; iii) 나머지 모든 골격 영역과 변형되지 않은 골격 영역 각각의 경우에는, 제2 기준 수용자 서열의 상응하는 골격 영역과 동일한 서열을 갖는, 골격 영역 또는 그의 일부를 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 합성하고; iv) 나머지 모든 상보성 결정 영역과 변형되지 않은 상보성 결정 영역 각각의 경우에는, 제1 기준 공여자 서열의 상응하는 상보성 결정 영역과 동일한 서열을 갖는, 상보성 결정 영역 또는 그의 일부를 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 합성하는 단계 [경쇄 가변 영역의 인접한 부분을 암호화하는 (i) 내지 (iv)로부터의 개개의 올리고뉴클레오티드는 그들의 말단에 중복 서열을 갖는다]; c) 단계 b)에서 합성된 올리고뉴클레오티드 집단과 올리고뉴클레오티드를, 개개 올리고뉴클레오티드의 중복 서열이 혼성화되도록 하는 조건 하에 혼합하여 중복 올리고뉴클레오티드를 창출시키는 단계; 및 d) 변경된 경쇄 가변 영역 암호화 뉴클레오티드 집단이 형성되도록 하는 조건 하에 중복 올리고뉴클레오티드를 처리하는 단계를 포함한다. 특정 양태에서는, 상기 방법이 (e) 변경된 헤테로메릭 가변 영역의 다양한 집단을 생산하도록, 경쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단과 중쇄 가변 영역 암호화 핵산 집단을 동시-발현시키는 단계를 추가로 포함한다.

(v) 다중-특이적 항체

본 발명은 변이체 Fc 영역을 포함하는 다중-특이적 항체를 제공한다. 다중-특이적 항체는 2개 이상의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 지닌다. 이러한 분자가 2개의 항원하고만 결합할 것이긴 하지만 (즉, 이중 특이적 항체 BsAbs), 부가의 특이성을 지닌 항체, 예를 들어 삼중-특이적 항체가 본원에 사용될 경우 이러한 표현에 포괄된다. BsAbs의 예에는 종양 세포 항원에 대항하여 지시된 1개의 암 (arm)과, 세포독성 촉발 분자에 대항하여 지시된 다른 암을 수반하는 BsAbs, 예를 들면, 항-FcγRI/항-CD15, 항-pl85HER2/FcγRIII (CD16), 항-CD3/항-악성 B-세포 (1D10), 항-CD3/항-pl85HER2, 항-CD3/항-p97, 항-CD3/항-신세포 암종, 항-CD3/항-OVCAR-3, 항-CD3/L-D1 (항-결장 암종), 항-CD3/항-멜라닌세포 자극 호르몬 유사체, 항-EGF 수용체/항-CD3, 항-CD3/항-CAMA1, 항-CD3/항-CD19, 항-CD3/MoV18, 항-중성 세포 부착 분자 (NCAM)/항-CD3, 항-엽산 결합성 단백질 (FBP)/항-CD3, 항-팬 (pan) 암종 관련 항원 (AMOC-31)/항-CD3; 종양 항원과 특이적으로 결합하는 1개 암과 독소와 결합하는 1개 암을 수반한 BsAbs, 예를 들면, 항-사포린/항-id-1, 항-CD22/항-사포린, 항-CD7/항-사포린, 항-CD38/항-사포린, 항-CEA/항-리신 A 쇄, 항-인터페론-a (IFN-a)/항-하이브리도마 유전형, 항-CEA/항-빈카 알카로이드; 전환 효소 활성화 프로-드럭 (prodrug)에 대한 BsAbs, 예를 들면, 항-CD30/항-알칼리성 포스파타제 (이는 미토마이신 포스페이트 프로-드럭이 미토마이신 알코올로 전환되는 것을 촉매한다); 섬유성 용해제로서 사용될 수 있는 BsAbs, 예를 들면, 항-피브린/항-조직 플라스미노겐 활성인자 (tPA), 항-피브린/항유로키나제-유형 플라스미노겐 활성인자 (uPA); 면역 복합체를 세포 표면 수용체에 대해 표적화시키기 위한 BsAbs, 예를 들면, 항-저밀도 지단백질 (LDL)/항-Fc 수용체 (예: FcγRI, FcγRII 또는 FcγRIII); 감염성 질환 요법에 사용하기 위한 BsAbs, 예를 들면, 항-CD3/항-단순 포진 바이러스 (HSV), 항-T-세포 수용체:CD3 복합체/항-인플루엔자, 항-FcyR/항-HIV; 시험관내 또는 생체 내에서 종양 탐지하기 위한 BsAbs, 예를 들면, 항-CEA/항-EOTUBE, 항-CEA/항-DPTA, 항-p185HER2/항-합텐; 백신 아주반트로서의 BsAbs; 및 진단 도구로서의 BsAbs, 예를 들면, 항-토끼 IgG/항-페리틴, 항-서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)/항-호르몬, 항-소마토스타틴/항-물질 P, 항-HRP/항-FITC, 항-CEA/항-p-갈락토시다제가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 삼중-특이적 항체의 예에는 항-CD3/항-CD4/항-CD37, 항-CD3/항-CD5/항-CD37, 및 항-CD3/항-CD8/항-CD37이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 이중-특이적 항체는 완전한 길이의 항체 또는 항체 단편으로서 제조할 수 있다 [예: F(ab')2 이중 특이적 항체].

이중-특이적 항체를 제조하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 완전한 길이의 이중-특이적 항체의 전통적인 생성은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 동시 발현하는 것에 기초하는데, 상기 2개의 쇄는 상이한 특이성을 지닌다 [참고: Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1983); 본원에 참고로 도입된다]. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 조합(편성)으로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마: quadroma)는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생성시키는데, 이중 1개 만이 정확한 이중-특이적 구조를 갖는다. 정확한 분자의 정제는 친화 크로마토그래피 단계에 의해 수행할 수 있다. 유사한 과정이 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: WO 93/08829, and in Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991); 이들 문헌 둘 다가 본원에 참고로 도입된다].

또 다른 접근법에서는, 목적하는 결합 특이성을 지닌 항체 가변 도메인 (항체-항원 결합 부위)을 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킨다. 이러한 융합물은 바람직하게, 힌지, CH2, 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는, 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 수반한다. 하나 이상의 융합물에 존재하는, 경쇄 결합을 위해 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합물과, 경우에 따라 면역글로불린 경쇄를 암호화하는 DNAs를 별개의 발현 벡터 내로 삽입하고, 적합한 숙주 유기체 내로 동시-형질감염시킨다. 이는 구축에 사용된 동등하지 않은 비율의 3개의 폴리펩티드 쇄가 최적의 수율을 제공해주는 경우의 양태에서 3개 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 있어서 보다 큰 융통성을 제공해준다. 그러나, 2개 이상의 폴리펩티드 쇄를 동등한 비율로 발현시키면 높은 수율이 제공되거나 이러한 비율이 특별히 중요하지 않는 경우에는, 2개 또는 3개 모든 폴리펩티드 쇄에 대한 암호화 서열을 1개 발현 벡터에 삽입하는 것이 가능하다. 이러한 접근법의 바람직한 양태에서는, 이중-특이적 항체가 1개의 암에 제1 결합 특이성을 지닌 하이브리드 면역글로불린 중쇄와, 다른 암에 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성을 제공함)으로 구성된다 [본원에 참고도 도입된 WO 94/04690 참고]. W0 96/27011 (본원에 참고로 도입됨)에 기재된 또 다른 접근법에 따르면, 항체 분자 쌍 간의 계면을 공학적으로 처리하여 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종-이량체의 비율을 최대화할 수 있다. 이중-특이적 항체에는 가교결합되거나 "이종-접합체" 항체가 포함되기도 한다. 예를 들어, 이종-접합체 내의 항체 중의 하나가 아비딘과 커플링될 수 있고, 다른 하나는 바이오틴과 커플링될 수 있다.

B. 면역부착인자 분자

본 발명은 또한, 변이체 Fc 영역을 포함하는 면역부착인자 분자를 제공한다. 한 가지 유형의 면역부착인자 기획은 부착인자의 결합 도메인(들) [예: 수용체의 세포외 도메인 (ECD)]을 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역 (예: 변이체 Fc 영역)과 결합시키는 것이다. 통상적으로, 본 발명의 면역부착인자를 제조하는 경우, 부착인자의 결합 도메인을 암호화하는 핵산을 면역글로불린 불변 도메인 서열의 N-말단을 암호화한는 핵산에 C-말단적으로 융합시킬 것이지만, N-말단 융합도 가능하다.

전형적으로, 이러한 융합물에서는 암호화된 키메라 폴리펩티드가 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 적어도 기능적 활성 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 보유할 것이다. 융합은 또한, 불변 도메인의 Fc 부분의 C-말단, 또는 중쇄의 CH1에 대한 바로 N-말단, 또는 경쇄의 상응하는 영역에서 이루어진다. 융합이 이루어지는 정확한 부위는 중요하지 않으며, 특정한 부위는 널리 공지되어 있고, 면역부착인자의 생물학적 활성, 분비 또는 결합 특징을 최적화하기 위해 선택될 수 있다.

몇몇 양태에서는, 부착인자 서열을 면역글로불린 G_l의 변이체 Fc 영역의 N-말단에 융합시킨다. 완전한 중쇄 불변 영역을 부착인자 서열에 융합시키는 것이 가능하다. 그러나, 바람직한 양태에서는 IgG Fc를 화학적으로 규정하는 파파인 절단 부위 바로 상단에 있는 힌지 영역에서 시작하는 서열 (즉, 중쇄 불변 영역의 제1 잔기가 114인 것을 고려하면, 잔기 216), 또는 기타 면역글로불린의 유사 부위가 융합에 사용된다. 특정의 바람직한 양태에서는, 부착인자 아미노산 서열을 (a) IgG 중쇄의 힌지 영역 및 CH2 및 CH3에 융합시키거나 또는 (b) IgG 중쇄의 CH1, 힌지, CH2 및 CH3 도메인에 융합시킨다. 몇몇 양태에서는, 면역부착인자가 이중-특이적이다.

또 다른 한편, 부착인자 서열을 면역글로불린 중쇄 서열과 경쇄 서열 사이에 삽입하여, 키메라 중쇄를 포함하는 면역글로불린이 수득되도록 할 수 있다. 이러한 양태에서는, 부착인자 서열을 힌지와 CH2 도메인 사이, 또는 CH2 도메인과 CH3 도메인 사이의, 면역글로불린의 각 암에서 면역글로불린 중쇄의 3' 말단에 융합시킬 수 있다 [참고: Hoogenboom et al., Mol. Immunol. 28: 1027-1037 (1991); 본원에 참고로 도입된다].

본 발명의 면역부착인자에는 면역글로불린 경쇄가 존재하는 것이 요구되지는 않지만, 면역글로불린 경쇄는 부착인자-면역글로불린 중쇄 융합 폴리펩티드에 공유적으로 연합된 채로 존재하거나 또는 부착인자에 직접 융합될 수 있다. 전자의 경우에는, 면역글로불린 경쇄를 암호화하는 DNA가 전형적으로, 부착인자-면역글로불린 중쇄 융합 단백질을 암호화하는 DNA와 함께 동시-발현된다. 분비시, 하이브리드 중쇄와 경쇄는 공유적으로 연합하여 2개의 디설파이드-결합된 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 포함하는 면역글로불린-유사 구조를 제공할 것이다. 이러한 구조를 제조하는데 적합한 방법은, 예를 들어 미국 특허 제4,816,567호 (본원에 참고로 도입된다)에 기재되어 있다.

바람직한 양태에서는, 부착인자 부분을 동일 프레임 내에서 암호화하는 cDNA 서열을 면역글로불린 cDNA 서열에 융합시킴으로써 면역부착인자를 구축한다. 그러나, 게놈 면역글로불린 단편에 대한 융합을 이용할 수도 있다. 일반적으로, 후자 유형의 융합을 위해서는, 발현을 위한 Ig 조절성 서열이 존재해야 한다. IgG 중쇄 불변 영역을 암호화하는 cDNAs는 혼성화 또는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 기술에 의해, 비장 또는 말초혈 림프구로부터 유래된 cDNA 라이브러리로부터 공개된 서열에 기초하여 분리할 수 있다. 면역부착인자의 면역글로불린 부분 및 "부착인자"를 암호화하는 cDNAs를, 선택된 숙주 세포에서의 효율적인 발현을 지시하는 플라스미드 벡터 내로 직렬식으로 삽입할 수 있다.

VI. Fc 영역 변이체를 암호화하는 핵산 서열

본 발명은 또한, Fc 영역 변이체를 암호화하는 핵산 서열 뿐만 아니라 Fc 영역 변이체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조성물, 벡터 및 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 또한, Fc 영역 변이체를 제조하는 재조합 방법을 제공한다.

일반적으로, 변이체를 제조합적으로 제조하기 위해서는 이러한 변이체를 암호화하는 핵산을 분리한 다음, 이를 벡터에 삽입한다. 숙주 세포를 이러한 벡터로 형질감염시킴으로써, 핵산 서열을 증폭시킬 수 있고/있거나 변이체 펩티드를 생성시킬 수 있다. 본 발명의 펩티드 변이체를 암호화하는 핵산 서열을 분리한 다음, 통상적인 과정을 이용하여 서열 분석할 수 있다 (예를 들어, 변이체를 암호화하는 핵산과 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함). 일반적으로, 변이체를 암호화하는 핵산 서열을 기타 요소, 예를 들어 신호 서열 (예: 분비성 신호 서열), 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 증강인자, 프로모터, 또는 전사 종결인자에 작동적으로 연결시킨다. 특정 양태에서는 숙주 세포를, 변이체를 암호화하는 핵산 서열로 안정적으로 형질감염시켜 특정한 변이체를 발현하는 세포주를 생성시킨다. 바람직한 양태에서는, 변이체를 CHO, NSO, Sp2/0, PER.C6, 또는 HEK293 세포에서 발현시킨다. 재조합 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.

변이체 Fc 영역이 생성될 수 있도록 핵산 서열을 돌연변이시킬 수 있다. 예를 들어, 모 Fc 영역을 암호화하는 핵산 서열 (예: 서열 32)은, 이러한 핵산 서열이 발현되는 경우에 하나 이상의 아미노산 변화가 발생하도록 돌연변이시킬 수 있다. 또한, 모 Fc 영역의 적어도 일부를 암호화하는 핵산 서열을 돌연변이시켜 Fc 영역 변이체의 적어도 일부를 포함하는 아미노산 서열을 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 서열 32를 돌연변이시켜 하나 이상의 아미노산 서열이 생성되도록 할 수 있다 [예를 들어, 서열 38, 서열 39, 서열 40, 서열 41, 서열 42, 서열 43, 서열 44, 서열 45, 서열 46, 서열 47, 서열 48, 서열 49, 서열 50, 서열 51, 서열 52, 서열 53, 서열 54, 서열 55 및 서열 56 참고].

특정 양태에서는, 코돈에 의거한 합성을 이용하여 돌연변이된 서열을 생성시킨다. 코돈에 의거한 합성의 예에는, 예를 들어 미국 특허 제5,264,563호, 제5,523,388호 및 제5,808,022호 [이들 모두가 본원에 참고로 도입된다]에 기재된 것이 포함된다. 간략하게 언급하면, 코돈에 의거한 합성은 별개의 지지체 상에서 단량체들을 순차적으로 커플링시켜 적어도 2개의 상이한 집합체를 형성시킴으로써 수행할 수 있다. 이러한 커플링을 별개의 반응 용기 내에서 수행한 다음, 반응 용기로부터의 지지체를 혼합하고, 혼합된 지지체를 2개 이상의 별개의 반응 용기 내로 나누고, 커플링, 혼합 및 분할 단계를 반응 용기 내에서 1회 이상 반복하고, 혼합 또는 분할 단계로 종결시킨다. 부가적으로, 지지체로부터 올리고뉴클레오티드를 절단할 수 있다.

VII. 치료적 용도 및 제형화

몇몇 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 변이체를 포함하는 치료적 제형을 제공한다. 본 발명이 특정한 종류의 치료적 조성물에 의해 제한되지 않는다. 예를 들어, 이러한 조성물은 생리적으로 허용되는 액상물, 겔, 고형 담체, 희석제, 아주반트 및 부형제, 및 이들의 조합물과 함께 제공되는, 폴리펩티드 변이체 (또는 그의 일부)를 포함할 수 있다 [참고: Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980); 본원에 참고로 도입된다].

또한, 폴리펩티드 변이체를 기타 치료제와 함께 사용할 수 있는데, 이러한 치료제에는 살리실레이트, 스테로이드, 면역억제제, 항체 또는 항생제가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 변이체와 함께 사용될 수 있는 특정한 치료제에는 다음 작용제가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다: 아조벤젠 화합물 [본원에 참고로 도입된 미국 특허 제4,312,806호 참고], 벤질-치환된 로다민 유도체 [본원에 참고로 도입된 미국 특허 제5,216,002호 참고], 아연 L-카르노신 염 [본원에 참고로 도입된 미국 특허 제5,238,931호 참고], 3-페닐-5-카복시피라졸 및 이소티아졸 [본원에 참고로 도입된 미국 특허 제5,294,630호 참고], IL-10 [본원에 참고로 도입된 미국 특허 제5,368,854호 참고], 퀴놀린 류코트리엔 합성 억제제 [본원에 참고로 도입된 미국 특허 제5,391,555호 참고], 2'-할로-2'데옥시 아데노신 [본원에 참고로 도입된 미국 특허 제5,506,213호 참고], 페놀 및 벤자미드 화합물 [본원에 참고로 도입된 미국 특허 제5,552,439호 참고], 트리부티린 [본원에 참고로 도입된 미국 특허 제5,569,680호 참고], 특정 펩티드 [본원에 참고로 도입된 미국 특허 제5,756,449호 참고], 오메가-3 다가불포화 산 [본원에 참고로 도입된 미국 특허 제5,792,795호 참고], VLA-4 차단제 [본원에 참고로 도입된 미국 특허 제5,932,214호 참고], 프레드니솔론 메타설포벤조에이트 [본원에 참고로 도입된 미국 특허 제5,834,021호 참고], 사이토킨 제어제 [본원에 참고로 도입된 미국 특허 제5,888,969호 참고], 및 니코틴 [본원에 참고로 도입된 미국 특허 제5,889,028호 참고].

폴리펩티드 변이체를, 특정 세포의 생육성 또는 증식 능력을 저하시키는 작용제와 함께 사용할 수 있다. 특정 세포의 생육성 또는 증식 능력을 저하시키는 작용제는, 예를 들어 DNA 합성 억제, 세포 분할 억제, 세포소멸 유도, 또는 비-세포소멸성 세포 사멸 유도를 포함한 각종 방식으로 기능할 수 있다. 세포독성제 및 세조증식 억제제의 구체적인 예에는 억새풀 (pokeweed) 항바이러스성 단백질, 아브린, 리신 및 각각의 그들의 A 쇄, 독소루비신, 시스플라틴, 요오드-131, 이트륨-90, 루테늄-188, 비스무트-212, 탁솔, 5-플루오로우라실 VP-16, 블레오마이신, 메토트렉세이트, 빈데신, 아드리아마이신, 빈크리스틴, 빈블라스틴, BCNU, 미토마이신 및 시클로포스파미드, 및 특정의 사이토킨, 예를 들어 TNF-α 및 TNF-β가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 따라서, 세포독성제 또는 세포증식 억제제에는, 예를 들어 방사성핵종, 화학요법제, 단백질 및 렉틴이 포함될 수 있다.

치료적 조성물은, 예를 들어 제약 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등의 결합제, 충전제, 담체, 방부제, 안정화제, 유화제, 완충제 및 부형제와 같이 통상적으로 이용되고 있는 첨가제를 함유할 수 있다. 이들 조성물은 활성 성분을 전형적으로 1 내지 95%, 바람직하게는 2 내지 70% 함유한다.

본 발명의 폴리펩티드 변이체는 화합성이고 생리학적으로 허용되는 희석제 또는 부형제와 혼합할 수도 있다. 적합한 희석제 및 부형제는, 예를 들어 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤 등 및 이들의 조합물이다. 또한, 경우에 따라, 조성물은 미량의 보조 물질, 예를 들어 습윤제 또는 유화제, 안정화제 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다.

몇몇 양태에서, 본 발명의 치료적 조성물은 액상 용제 또는 현탁제로서, 스프레이로서 또는 고형 형태로 제조한다. 경구용 제형은 통상적으로, 예를 들어 제약 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등의 결합제, 충전제, 담체, 방부제, 안정화제, 유화제, 완충제 및 부형제와 같이 통상적으로 이용되고 있는 첨가제를 포함한다. 이들 조성물은 용제, 현탁제, 정제, 환제, 캅셀제, 지속 방출형 제형 또는 산제 형태를 취하고, 활성 성분을 전형적으로 1 내지 95%, 바람직하게는 2 내지 70% 함유한다. 본 발명의 치료적 조성물을 전달하는데 유용한 경구 조성물의 한 예가 미국 특허 제5,643,602호 (본원에 참고로 도입된다)에 기재되어 있다.

기타 투여 방식, 예를 들어 국소 투여에 적합한 부가의 제형에는 연고, 팅그제 (tincture), 크림, 로션, 경피용 패치 및 좌제가 포함된다. 연고 및 크림의 경우에는, 전통적인 결합제, 담체 및 부형제, 예를 들어 폴리알킬렌 글리콜 또는 트리글리세라이드가 포함될 수 있다. 국소 전달 방법의 한 예가 미국 특허 제5,834,016호 (본원에 참고로 도입된다)에 기재되어 있다. 기타 리포솜 전달 방법을 이용할 수도 있다 [참고: 미국 특허 제5,851,548호 및 제5,711,964호; 이들 모두가 본원에 참고로 도입된다].

제형은 치료하고자 하는 특정한 적응증에 필요한 경우 한 가지 이상의 활성 성분, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 지닌 활성 화합물을 함유할 수도 있다. 이러한 분자들은 의도한 목적에 유효한 양으로 조합하여 존재하는 것이 적합하다.

지속 방출형 제제를 제조할 수도 있다. 지속 방출형 제형의 적합한 예에는 본 발명의 폴리펩티드 변이체를 함유하는 고형의 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되는데, 이러한 매트릭스는 조형품, 예를 들어 필름 또는 미소캡슐 형태이다. 지속 방출형 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 히드로겔 [예: 폴리 (2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리 (비닐알코올)], 폴리락티드, L-글루탐산과 y-에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들면, LUPRON DEPOT (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사용 미소구), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 이상에 걸쳐 분자를 방출시킬 수 있지만, 특정의 히드로겔은 보다 단기간 동안 단백질을 방출시킨다.

본 발명의 폴리펩티드 변이체를 사용하여 특정 대상체를 치료 (처치)할 수 있다. 이러한 치료는 특정 질환이 있는 대상체에게 투여할 수 있거나, 또는 특정 대상체 (예: 질환에 걸리기 쉬운 대상체)에게 예방적으로 투여할 수 있다. 치료될 수 있는 질환의 예에는 암 [예: 본 발명의 폴리펩티드 변이체가 HER2 수용체, CD20 또는 혈관성 내피 성장 인자 (VEGF)와 결합하는 경우]; 알레르기성 질환, 예를 들어 천식 (항-IgE 항체를 이용함); 및 LFA-1-매개형 질환 (예: 폴리펩티드 변이체가 항-LFA-1 또는 항-ICAM-1 항체인 경우) 등이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

바람직한 양태에서는, 대상체를 치료하는데 사용된 변이체가 항체 또는 면역부착인자를 포함한다. 또한 바람직한 양태에서는, 치료되는 질환이 항체 또는 면역부착인자 반응성 질환이다. 항체 반응성 질환의 예에는 다음과 같은 질환 및 의학적 상태가 포함된다: 림프종 (항-CD20 항체인 RITUXAN을 이용하여 치료 가능한 것으로 밝혀짐), 감염성 질환 (호흡기 합포체 바이러스의 F 단백질에 대해 지시된 항체인 SYNAGIS을 이용하여 치료 가능한 것으로 밝혀짐), 신장 이식술 (항-IL-2 수용체 항체인 ZENAPAX이 도움이 되는 것으로 밝혀짐), 크론병 및 류마티스성 관절염 (항-TNF 알파 항체인 REMICADE을 이용하여 치료 가능한 것으로 밝혀짐), 유방 암종 (항-HER2 항체인 HERCEPTIN을 이용하여 치료 가능한 것으로 밝혀짐), 및 결장암 (항-17-1A 항체인 EDRECOLOMAB을 이용하여 치료 가능한 것으로 밝혀짐).

몇몇 양태에서는, 개선된 ADCC 활성을 지닌 폴리펩티드 변이체 (예: P247L 또는 I332E 변이체)가, 조직 또는 외래 미생물의 파괴 또는 제거가 요망되는 질환 또는 질병을 치료하는데 이용된다. 예를 들어, 상기 변이체를 사용하여 암; 염증성 질환; 감염증 (예: 세균성, 바이러스성, 진균성 또는 효모 감염증); 및 조직의 제거가 요망되는 기타 질환 (예: 갑상선종)을 치료할 수 있다. 기타 양태에서는, 폴리펩티드 변이체가 저하된 ADCC 활성을 지닌다 (예: I332R 또는 I332K 변이체). 이러한 변이체를 사용하여, 반감기가 긴 Fc 영역 함유 폴리펩티드가 요망되긴 하지만 이러한 폴리펩티드가 바람직하게는, 바람직하지 못한 효과기 기능을 나타내지 않는 질환 또는 질병을 치료할 수 있다. 예를 들어, Fc 영역 함유 폴리펩티드는 항-조직 인자 (TF) 항체; 항-IgE 항체; 및 항-인테그린 항체 (예: 항-α4β7 항체)일 수 있다. 이러한 Fc 영역 함유 폴리펩티드의 목적하는 작용 기전은 리간드-수용체 결합 쌍을 차단시킬 수 있다. 더우기, 저하된 ADCC 활성을 지닌 Fc 영역 함유 폴리펩티드는 작동제 (효능제) 항체일 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드 변이체는 비경구, 피하, 국소, 복강내, 폐내 및 비내 투여, 및 병변내 투여 (예: 국소 면역억제 치료법의 경우)를 포함한 적합한 어떠한 수단에 의해서도 투여할 수 있다. 비경구 주입에는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여가 포함된다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드 변이체는 펄스 주입, 특히 폴리펩티드 변이체의 용량을 감소시키면서 펄스 주입함으로써 투여하는 것이 적합하다. 바람직하게는, 부분적으로 투여가 단시간내에 이루어지는지 아니면 만성적으로 이루어지는지에 따라서, 투약을 주사, 가장 바람직하게는 정맥내 또는 피하 주사함으로써 수행한다.

질환을 예방 또는 치료하는데 적합한 폴리펩티드 변이체의 투여량은 치료하고자 하는 질환의 유형, 질환의 중증도 및 경과 상태, 폴리펩티드 변이체가 예방 목적으로 투여되는지 아니면 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 기존의 요법, 환자의 임상 병력 및 폴리펩티드 변이체에 대한 반응, 및 담당의의 판단에 좌우될 것이다. 폴리펩티드 변이체는 환자에게 한번에 투여하거나 일련의 치료 전반에 걸쳐 투여하는 것이 적합하다.

예를 들어, 질환의 유형과 중증도에 따라서, 예를 들어 1회 이상 별개로 투여하는지 아니면 연속해서 주입하든지 간에, 초기에 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg (예: 0.120 mg/kg) 투여량의 폴리펩티드 변이체를 환자에게 투여한다. 전형적인 1일 투여량 범위는 상기 언급된 요인들에 따라서 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 이상일 수 있다. 질환 상태에 따라서 수 일에 걸쳐 반복해서 투여하는 경우에는, 증상이 충분히 저하 또는 제거될 때까지 지속적으로 치료한다. 이러한 요법의 진행 과정은 통상적인 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링하고, 이를 이용하여 치료 효과를 달성하기 위한 투여량을 조정할 수 있다.

투여될 폴리펩티드 변이체의 치료적 유효량은 치료하고자 하는 질환 증상이 저하되도록 환자에게 요구되는 투여량 수준이다. 문제의 질환을 예방 또는 치료하기 위해 현재 사용되고 있는 한 가지 이상 작용제를 본 발명의 폴리펩티드 변이체와 함께 반드시 제형화할 필요는 없지만, 임의로 제형화한다. 이러한 기타 작용제의 유효량은 제형 내에 존재하는 폴리펩티드 변이체의 양, 질환 또는 치료 유형, 및 상기 논의된 기타 요인들에 의해 좌우된다.

VIII. 부가의 변이체 Fc 영역 용도

본 발명의 변이체, 및 변이체를 암호화하는 핵산 서열은 수 많은 방식으로 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 변이체를 약물 스크리닝 검정에 사용할 수 있다. 예를 들어, 후보 화합물을 대상으로 하여, 변이체를 후보 화합물과 접촉시키고 변이체에 대한 후보 화합물의 결합성을 결정함으로써 Fc 효과기 기능을 방해하거나 변경시킬 수 있는 후보 화합물의 능력을 평가할 수 있다. 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들어, GST-변이체 융합 단백질을 글루타치온 함유 중합체성 비드에 결합시킴으로써, 변이체를 고정화시킬 수 있다. 관심있는 변이체를 암호화하는 DNA를 GST의 카복실 말단을 암호화하는 DNA에 융합시킴으로써, GST 융합 단백질을 암호화하는 키메라 유전자를 구축한다 [참고: Smith et al., Gene 67: 31 (1988)]. 이어서, 융합 구조물을 적합한 발현 시스템 (예: 이. 콜라이 XA90) 내로 형질전환시키는데, 여기서는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG)를 이용하여 GST 융합 단백질의 발현을 유도시킬 수 있다. IPTG를 이용한 유도로 인해, 가용성의 세포성 단백질의 주요 구성분으로서 융합 단백질이 생성되어야만 한다. 이러한 융합 단백질은 글루타치온 친화 크로마토그래피에 의한 정제를 포함한, 당업자에게 공지된 방법에 의해 정제할 수 있다. 후보 화합물이 변이체에 결합되는 것은 하나 이상의 효과기 기능을 붕괴시킬 수 있는 화합물의 능력과 상관이 있다.

또 다른 스크리닝 방법에서는, 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들어 플라스틱 미세역가 판 상에 흡착시키거나 또는 GST-융합 단백질을 글루타치온 함유 중합체성 비드에 특이적으로 결합시킴으로써, 변이체 또는 선별된 FcR을 고정화시킨다. 예를 들어, GST-변이체를 글루타치온-세파로스 비드에 결합시킨다. 그 다음, 이와 같이 고정화된 변이체를 Fc 수용체 및 후보 화합물과 접촉시킨다. 이어서, 결합되지 않은 펩티드를 제거하고, 복합체를 가용화시킨 다음, 분석하여 결합되고 표지된 펩티드의 양을 결정한다. 결합량 감소는 후보 화합물이 변이체와 Fc 수용체와의 상호 작용을 억제한다는 지표이다. 이러한 스크리닝 방법은 증가된 수준의 Fc 수용체 결합을 나타내는 본 발명의 변이체를 이용하는 경우에 특히 유용하다 (이는 예를 들어, 많은 모 Fc 수용체, 예를 들면, FcγRIII, FcγRIIb, 및 FcγRIIa가 저 친화성 수용체이기 때문이다). 이러한 방법을 변동시키면, 기존에 형성된 변이체/Fc 수용체 복합체를 붕괴시킬 수 있는 화합물을 스크리닝할 수 있다. 예를 들어 몇몇 양태에서는, Fc 수용체와 결합된 변이체를 포함하는 복합체를 상기 언급된 바와 같이 고정화시키고, 이를 후보 화합물과 접촉시킨다. 후보 화합물에 의한 복합체의 용해는 시험되고 있는 변이체와 존재하는 Fc 수용체 간의 상호 작용을 붕괴 또는 억제시킬 수 있는 화합물의 능력과 상관이 있다. 이와 관련하여, (예를 들어, 인간에게서) 치료적 능력을 지닌 화합물 (예를 들어, 인간 질환, 예를 들면, 자가면역 질환을 치료하는데 유용한 화합물)을 확인할 수 있다.

약물 스크리닝하기 위한 또 다른 기술은 변이체 펩티드에 대한 적합한 결합 친화성을 지닌 화합물에 대한 고 처리량 스크리닝을 제공하고, 이는 본원에 참고로 도입된 WO 84/03564에 상세히 기재되어 있다. 간략하게 언급하면, 다수의 상이한 작은 펩티드 시험 화합물을 고형 기판, 예를 들어 플라스틱 핀 또는 몇몇 기타 표면 상에서 합성한다. 그 다음, 펩티드 시험 화합물을 변이체 펩티드와 반응시키고 세척한다. 이어서, 결합된 변이체 펩티드를 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 탐지한다.

또 다른 기술은 변이체 펩티드에 대해 지시된 항체를 이용한다. 변이체 펩티드와 특이적으로 결합할 수 있는 상기 항체는 소정의 변이체와의 결합을 놓고 시험 화합물과 경쟁한다. 이러한 방식으로 항체를 사용하여, 변이체 펩티드의 하나 이상의 항원성 결정기를 공유하고 있는 모든 펩티드의 존재 여부를 탐지할 수 있다.

본 발명은 화합물을 스크리닝하기 위한 기타 모든 수단을 고려한다. 상기 제공된 예는 이용 가능한 특정 범위의 기술을 예시하기 위해 제시된 것이다. 당업자는 수 많은 기타 스크리닝 방법을 사용할 수 있다는 것을 인지할 것이다.

특히, 본 발명은 특히 조합 라이브러리 (예: 10⁴개 초과 화합물을 함유하는 라이브러리)로부터 화합물을 고 처리량 스크리닝하기 위한 활성을 알아보기 위해 화합물을 스크리닝하기 위해, 하나 이상의 Fc 영역 변이체를 암호화하는 핵산으로 형질감염시킨 세포주를 사용하는 것을 고려한다. 본 발명의 세포주는 각종 스크리닝 방법에 사용할 수 있다.

본 발명의 변이체를 친화성 정제 작용제로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 변이체를 당해 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여, 세파덱스 수지 또는 여과지와 같은 고형 상에 고정화시킬 수 있다. 이어서, 이와 같이 고정화시킨 변이체를, 정제하고자 하는 항원을 함유하는 샘플과 접촉시킨 후, 지지체를 적합한 용매로 세척하여, 고정화 폴리펩티드 변이체와 결합되는 정제하고자 하는 항원을 제외하고는 샘플 내의 실질적으로 모든 물질을 제거한다. 최종적으로, 지지체를 또 다른 적합한 용매, 예를 들어 글리신 완충액 (pH 5.)으로 세척하여, 폴리펩티드 변이체로부터 항원을 방출시킨다.

본 발명의 폴리펩티드 변이체는 진단 검정 (예: 특이적 세포, 조직 또는 혈청 중에서의 관심있는 항원의 발현을 탐지함)에 유용할 수도 있다. 진단적으로 적용하는 경우에는, 변이체를 전형적으로, 탐지 가능한 잔기로 표지시킬 것이다 (이러한 표지는 상기 언급된 Fc 영역 검정에도 유용하다). 수 많은 표지가 이용 가능하고, 이에는 방사성 동위원소 (예: ³⁵S, ^l4C, ¹²⁵I, ³H, 및 ¹³¹I), 형광성 표지 [예: 희토류 킬레이트 (에우로퓸 킬레이트) 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 리사민, 피코에리트린 및 텍사스 레드 (Texas Red)], 및 각종 효소-기질 표지 [본원에 참고로 도입된 미국 특허 제4,275,149호 참고; 예를 들어, 루시퍼라제, 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 말레이트 데히드로게나제, 우레아제, 퍼옥시다제, 예를 들면, 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 당류 옥시다제 (예: 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제), 헤테로사이클릭 옥시다제 (예: 우리카제 및 크산틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 미크로퍼옥시다제 등]이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 효소-기질 조합물의 예에는, 예를 들어 다음이 포함된다: (i) 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO)와 기질로서의 수소 퍼옥시다제의 조합물 [여기서는, 수소 퍼옥시다제가 염료 전구체 (예: 오르토페닐렌 디아민 (OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 히드로클로라이드 (TMB))를 산화시킨다]; (ii) 알칼리성 포스파타제 (AP)와 발색 기질로서의 파라-니트로페닐 포스페이트의 조합물; 및 (iii) -D-갈락토시다제 (R-D-Gai)와 발색 기질 또는 형광발생 기질의 조합물.

본 발명의 변이체는 생체내 진단 검정에 사용할 수도 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 변이체를 방사성 핵종으로 표지시켜, 항원 또는 이를 발현하는 세포를 면역신티오그래프 (immunoscintiography)를 이용하여 국재시킬 수 있도록 한다.

실험

본 발명의 특정의 바람직한 양태와 국면을 입증하고 추가로 예시하기 위해 다음 실시예가 제공되지만, 본 발명의 범위가 이로써 제한되지 않는다.

다음 실험에서는, 다음과 같은 약어가 적용된다: N (노말); M (몰); mM (밀리몰); μM (마이크로몰); mol (몰); mmol (밀리몰); μmol (마이크로몰); nmol (나노몰); pmol (피코몰); g (그램); mg (밀리그램); ㎍ (마이크로그램); ng (나노그램); l 또는 L (리터); ml (밀리리터); ㎕ (마이크로리터); cm (센티미터); mm (밀리미터); ㎛ (마이크로미터); nm (나노미터); DS (덱스트란 설페이트); 및 C (℃).

실시예 1

ADCC 검정에서의 변이체 스크리닝

본 실시예에는 변이체를 ADCC 검정에서 어떻게 스크리닝하였는지가 기재되어 있다. 스크리닝된 모든 변이체는 항-CD20 항체이다 (가변 영역 특이성에 기초함).

i. PBMC (말초혈 단핵 세포) 분리

약 50 mL의 말초혈을 건강한 공여자로부터 수득하고, 이를 인산염 완충 식염수 (PBS), pH 7.0로 1:2로 희석시켰다. 튜브를 조심스럽게 와동시킴으로써 용액을 혼합하였다. 이와 같이 희석시킨 혈액 샘플 아래에 약 12 mL의 히스토파크 (Histopaque)-1077 (Sigma Cat. No. 1077-1)을 조심스럽게 층 형성시킨 다음, 브레이크를 작동시키지 않은 채 10분 동안 1000 rmp으로 버켓 (bucket) 회전자를 와동시키면서 소르발 (Sorvall) RT6000B 원심분리기로 원심분리시켰다. 구배 상부 층을 흡인 경사 제거하고, 백색으로 착색된 PBMC-함유 간기 (interphase)를 수집한 다음, 한크스 밸런스 염 용액 (Gibco Cat. No. 14025-092)으로 3회 세척하였다. 이와 같이 세척한 세포 펠릿을, 10% 태아 소 혈청 (FBS)을 함유하는 약 20 mL RPMI 1640 배지 (Omega Scientific Cat. No. FB-01)에 현탁시켰다. 재현탁시킨 PBMCs를 2개의 T-175 배양 플라스크에 분할하고, 10% FBS를 함유하는 30 mL의 RPMI를 각 플라스크에 가한 다음, 37℃ 5% C0₂ 항온 배양기에서 밤새 항온 배양하였다. 그 다음 날, 흡착되지 않은 PBMCs를 50 mL 팔콘 (Falcon) 튜브에 수집하고, 상기와 같이 원심분리시킨 다음, 페놀 레드가 결여된 1% FBS를 함유하는 RPMI에 재현탁시켰다. 이와 같이 재현탁된 세포의 작은 부분을 10배 희석시키고, 혈구계를 이용하여 계수하였다. 잔여 PBMCs를 필요할 때까지 항온 배양기에 놓아두었다.

ii. 표적 세포주 (이들은 항-CD20 ADCC 검정에 대해 특이적이다)

Wil.2 및 SKW6.4 CD20-발현성 B-세포주를 ATCC로부터 수득하고, 권장된 바와 같이 성장시켰다. 사용하기 전날, 세포를 2배 분할시켰다. 그 다음날, 세포수를 4 X 10⁵개 세포/mL로 조정하고, 50 ㎕ 분취량 (20,000개 세포/웰)을 96-웰 조직 배양 판에 가하였다.

iii. IgG 희석물

스크리닝하기에 앞서, IgG 변이체를 발현시키고 표준 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA)을 이용하여 정량화하였다. 일차 단일점 ADCC 스크리닝을 위해, IgG 변이체를, 페놀 레드가 결여된 1% FBS를 함유하는 RPMI 배지에서 40 ng/mL가 되도록 희석시켰다. 본 검정에서의 최종 IgG 농도는 4배 정도 희석될 것이다 (즉, 10 ng/mL 최종 농도). 50 마이크로리터 분취량의 IgG를 표적 세포에 가하고, 37℃ 하에 약 15분 동안 항온 배양한 다음, 효과기 세포를 옵소닌화 표적 세포에 가하였다.

IgG 적정을 수행한 경우에는, IgG 농도를 약 0.0001 내지 1 ㎍/mL 범위로 다양하게 하였다. 샘플을, 페놀 레드가 결여된 1% FBS를 함유하는 RPMI에서 희석시킴으로써 96-웰 미세역가 판을 이용하여 IgG 희석물을 제조하였다. 그 다음, 이와 같이 희석된 IgG 샘플을, 표적 세포를 함유하는 검정 판에 가하였다.

iv. 효과기 세포

효과기 대 표적 비가 10 내지 20:1 (즉, 2 내지 4 X 10⁶개 세포/mL)이 되도록 PBMCs의 농도를 조정하였다. 100 마이크로리터의 재현탁된 PBMCs를 옵소닌화 표적 세포의 각 웰에 가하였다. 판을 5% C0₂의 존재 하에 3 내지 4시간 동안 37℃ 하에 항온 배양하였다.

v. 락테이트-데히드로게나제 (LDH)-방출 탐지

락테이트 데히드로게나제가 손상된 세포의 세포질로부터 배양 상등액 내로 방출되는 것을 탐지함으로써 표적 세포 용해를 측정하였다. 옵소닌화 표적 세포를 효과기 세포와 함께 항온 배양한 후, 검정 판을 5분 동안 2000 rpm으로 원심분리시켰다. 펠릿화 세포와 부스러기를 피하면서, 약 75 ㎕의 세포 배양 상등액을 조심스럽게 제거한다. 이 상등액을 미세역가 판에 직접 가하고, 이에 75 ㎕의 LDH 탐지 시약 (Roche Cat. No. 1 644 793)을 가하였다. 그 다음, 상기 판을 대략 15 내지 30분 동안 항온 배양하고, 다음 판독기 (Molecular Devices Vmax Kinetic Microplate Reader)를 이용하여 490 nm에서의 흡광도를 판독하였다.

vi. 데이터 분석

모든 단일점 ADCC 스크리닝 검정을 두 번 되풀이하여 수행하였다. 각 검정 판은 자발적 표적 용해, IgG의 부재 하에서 자발적 효과기 플러스 표적 용해, 및 표적 세포 총 용해에 대한 대조군를 함유하고 있다. 표적 세포 총 용해는 1% 트리톤 X-100을 표적 세포에 부가함으로써 달성하였다. 3개의 야생형 대조군이 각 검정 판 상에 포함되어 있고, ADCC 검정 신호를 평균내었다. 자발적 용해 대조군으로부터 수득된 배경 값을 각 샘플로부터 공제하였다. 희석된 IgG로부터 수득한 배경 값을 각 샘플로부터 공제하였다. 자발적 및 총 용해 대조군을 기초로 하여 데이터를 흡광도 값으로부터 특이적-용해 비율(%)로 전환시켰다. 특이적-용해 비율은 다음 방정식으로부터 계산하였다: 특이적 용해 비율(%) = (실험적 A490 - 배경 A490)/(최대 A490 - 배경 A490) X 100 [여기서, 배경 A490은 조 IgG 상등액에 존재하는 오염성 LDH로 인한 IgG 배경과, IgG의 부재 하에 효과기 및 표적 세포로부터 수득한 A490의 합이다]. Fc 변이체 활성 비율을, 야생형 대조군 평균치를 기준으 로 하여 표준화시켰다. 두 번 되풀이한 검정 판에 대해 표준화시킨 활성 비율(%)을 평균내고, 개별적 검정 판 간의 표준 편차를 각 샘플로부터 계산하였다.

vii. 결과

상대적 ADCC 특이 활성이 표 2에 나타나 있다. 이 표에 보고된 CDC 값은 실시예 4에 기재된 바와 같이 생성시켰고, FcRn 결합 검정 값은 실시예 5에 기재된 바와 같이 생성시켰다.

도 7A는 IgG 변이체를 적정시킨 후 수득한 대표적인 ADCC 데이터를 도시한 것이다. 이 실험에서는, 단일 및 이중 아미노산 Fc-영역 IgG 변이체를 사용한 다음, PBMCs를 15:1의 비율로 부가함으로써 SKW6.4 세포를 옵소닌화시켰다. 검정 판을 5% C0₂의 존재 하에 3시간 동안 37℃에서 항온 배양한 다음, 원심분리시켰다. 상등액 일부를 수집하고, 이를 미세역가 판에 옮긴 다음, 등 용적의 LDH 기질을 부가함으로써 상등액 중의 LDH 활성을 탐지하였다. 색 전개 후, 흡광도를 490 nm에서 판독하였다. 조 IgG 상등액 중의 오염성 LDH로 인한 배경을 측정하고, 이들 배경 값을 날 (raw) A490로부터 공제하여 도 7A에 도시된 데이터를 수득하였다. 이들 데이터는 야생형 항-CD20 항체와 비교해서, A330K, A330R 및 I332E 단일 아미노산 변이체의 ADCC 활성이 증강되었다는 것을 보여준다. A330K 또는 A330R을 I332E 변이체와 병용하면 ADCC 활성이 추가로 개선되었다. 비-특이적 IgG는 이들 검정 조건 하에서 활성을 전혀 나타내지 않았다. 당화를 변경시킨 유사한 검정 결과가 도 7B에 도시되었다. 특히, 7B (샘플 표지된 GnTIII)는 I332 변이체의 활성이 (예를 들어, 이등분 GlcNAc 함량을 증가시킴으로써) 당화를 변경시킨 경우에 추가로 증강될 수 있다는 것을 보여준다.

도 8은 정제된 IgG를 사용하여 수득한 대표적인 ADCC 데이터를 도시한 것이다. 플롯은 비-특이적 IgG, 야생형 항-CD20 및 Fc-영역 변이체 I332D 및 I332E에 대한 세포독성 비율 대 IgG 농도를 도시한 것이다. 세포독성 비율은 다음 방정식에 기초하여 계산하였다: % 세포독성 = (실험적 A490 - 배경 A490)/(최대 A490 - 배경 A490) X 100 [여기서, 배경 A490은 IgG의 부재 하에 효과기 세포 및 표적 세포로부터 수득한 것이다]. 데이터는 I332D 및 I332E 변이체의 ADCC 활성이 야생형과 비교해서 증강되었다는 것을 보여준다. 본 실험에 사용된 표적 세포는 SKW6.4이고 효과기 대 표적 비 15:1을 표준 3시간 ADCC 검정에 사용하였다.

도 9는 동일한 유형의 ADCC 활성을 도시한 것인데, 단 저 친화성 가변 영역을 이용하였다 (AME 33 대신 AME 6F1을 이용하였다). 상기 도면은 이러한 특별한 항-CD20 특이성을 수반한 ADCC 활성과 Wil-2 및 SKW6.4 세포주가 가변 영역 친화성과는 독립적 (비-의존적)이란 사실을 입증해준다.

도 10은 Fc 감마 RI 수용체 결합을 도시한 것이다. 추정상의 막관통 도메인 대신 C-말단 6-his 태그가 부가된 인간 Fc 감마 RI 수용체의 세포외 부분 (CD64)을 HEK-293A 세포에서 발현시키고, Ni-칼럼을 사용하여 정제하였다. 수용체를 ELISA 판 상에서 4℃ 하에 밤새 피복시킨 다음, 판을 슈퍼블록 (superblock)을 이용하여 연속해서 차단시켰다. 차단 및 세척한 후, IgG 희석물을 제조하고 수용체-피복된 판에 가한 다음, 37℃ 하에 2시간 동안 항온 배양하였다. 결합되지 않은 IgG를 세척함으로써 제거하고, 1:1000의 항-인간 카파 알칼리성 포스파타제 접합된 이차 항체를 이용하여 결합된 항체를 탐지하였다. 세척 후, VMAX 미세판 판독기 (공급처: Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 사용하여 흡광도를 560 nm에서 비색 결정하면서 포스파타제 기질 (페놀프탈레인 모노포스페이트) (PPMP) (공급처: JBL Scientific)을 부가함으로써, 결합된 IgG를 탐지하였다. 데이터를 log IgG 농도 대 흡광도로서 플롯팅하였다.

실시예 2

전혈 검정에서 B 세포 고갈을 알아보기 위한 변이체 스크리닝

본 실시예에는 전혈 검정에서 B 세포 고갈을 알아보기 위한 변이체 스크리닝이 기재되어 있다.

i. FcγRIIA 유전자형별 검사

QiaAmp 키트 (Qiagen, Cat No. 51104)를 사용하여 말초혈 샘플로부터 게놈 DNA를 분리하였다. 프라이머 (5' GGAAAATCCCAGAAATTCTCGC 3' - 서열 61) 및 (5' CAACAGCCTGACTACCTATTACGCGGG 3' - 서열 62)를 사용하여 FcγRIIA를 PCR에 의해 증폭시켰다. 민엘루트 (MinElute) PCR 정제용 키트 (Qiagen, Cat No. 28006)를 사용하여 PCR 생성물을 정제하고, 이를 60℃에서 12시간 동안 제한 효소 BstUI로 분해시켰다. 분해시킨 샘플을 3% 아가로스 겔 상에서 분석하였다. 모든 PCR 생성물을 H 또는 R 유전자형과는 독립적인 내부 BstUI 부위에서 절단하였다. R 대립 유전자를 보유하고 있는 생성물을 부가의 BstUI 부위에서 절단하였다. 이로써 H/H 유전자형이 생성되었는데, 이는 337 bp의 1개 단편에 의해 확인되었고, H/R 유전자형은 337 bp와 316 bp의 2개 단편에 의해 확인되었으며, R/R 유전자형은 316 bp의 1개 단편에 의해 확인되었다.

ii. FcγRIIIA 유전자형별 검사

QiaAmp 키트 (Qiagen, Cat No. 51104)를 사용하여 말초혈 샘플로부터 게놈 DNA를 분리하였다. 프라이머 (5' ATATTTACAGAATGGCA 3' - 서열 63) 및 (5' GGTGATGTTCACAGTCTCTGAAGACACATTFTTACTGTCAA 3' - 서열 64)를 사용하여 FcγRIIIA를 PCR에 의해 게놈 DNA로부터 증폭시켰다. 민엘루트 PCR 정제용 키트 (Qiagen, Cat No. 28006)를 사용하여 PCR 생성물을 정제하고, 이를 37℃에서 16시간 동안 제한 효소 HincII로 분해시켰다. 분해시킨 샘플을 3% 누시브 (NuSieve) 아가로스 겔 상에서 분석하였다. HincII는 V 대립 유전자를 절단시키지만, F 대립 유전자는 절단시키지 않았다. 따라서, F/F는 148 bp의 1개 단편을 제공하고, F/V는 148, 109, 및 39 bp의 3개 단편을 제공하며, V/V는 109 및 39 bp의 2개 단편을 제공하였다.

iii. B 세포 고갈 검정 (전혈을 이용함)

헤파린 처리시킨 말초혈을 건강한 자원자로부터 채집하였다. 혈액을 FACS 완충액 (인산염 완충 식염수 + 2% 태아 소 혈청)에서 희석시킨 변이체, 리툭산 또는 비-특이적 IgG (음성 대조군)과 혼합하였다. 튜브를 37℃에서 4시간 동안 항온 배양한 다음, 실온에서 30분 동안 플루오레세인-항-CD45 (백혈구를 확인하기 위함) (BD, cat#555482) 및 피코에리트린-항-CD19 (B 세포를 확인하기 위함) (BD, cat#555413)으로 염색하였다. BD 팜라이스 (PharmLyse) (BD, cat#555899)를 부가함으로써 적혈구를 용해시키고, 샘플을 세척한 다음 FACS 완충액에 재현탁시켜 벡톤 딕킨슨 (Becton Dickinson) FAC 분류 유동 세포계수기 상에서 분석하였다. 분석 직전에, 프로피듐 요오다이드 (PI)를 0.1 ㎍/ml 최종 농도로 샘플에 가하여 살아있는 세포와 사멸된 세포를 구별하였다. 대조군은 FACS 완충액 단독과 항온 배양시킨 세포, 염색되지 않고 단일 색상으로 염색된 샘플을 포함하였다. 각 샘플을 대상으로 하여, 세 번 되풀이하도록 설정하고, 림프구 전방/측면 스캐터 (FSCSSC) 게이트 내에 속하는 10,000 PI-음성 사건들을 수집하였다. WinMDI 소프트웨어를 이용하여 데이터를 분석하였다. 분석을 위해, CD45로의 양성 염색, PI 음성도 및 FSC/SSC 특징들을 기초로 하여 살아 있는 림프구를 확인하였다. 각 샘플에서, 이들 특징을 수반한 CD19+ 세포 비율을 확인하였다. 데이터는 평균 % CD19+ 세포 +/- 1 표준 편차로서 표현하였다. 또 다른 한편, 공여자들 간의 비교를 촉진하기 위해, 데이터를 잔존하는 초기 CD19+ 세포의 %, 즉 (처리 후 잔존하는 CD19+ 림프구의 %)/(FACS 완충액 처리된 샘플 중에서 CD19+ 림프구의 %) x 100%로서 표현하였다.

도 12는 대표적인 B 세포 고갈 데이터를 도시한 것인데, 이는 I332E 변이체가 FcγRIIIa 수용체의 VV (고 친화성) 유전자형을 함유하는 전혈 샘플에서 리툭산 보다 더 큰 정도로 보다 효과적으로 B 세포를 고갈시켰다는 사실을 입증해준다.

도 13은 대표적인 B 세포 고갈 데이터를 도시한 것인데, 이는 I332E 변이체가 FcγRIIIa 수용체의 FF (전 친화성) 유전자형을 함유하는 전혈 샘플에서 리툭산 보다 더 큰 정도로 보다 효과적으로 B 세포를 고갈시켰다는 사실을 입증해준다. FcγRIIIa 수용체에 대한 VF (이형접합성) 유전자형을 표시하거나 또는 FcγRIIa 수용체의 HH, HR 또는 RR 유전자형을 표시하는 전혈을 이용하여 본 검정을 수행하는 경우에 유사한 결과가 수득되었다 (표 3).

도 14는 대표적 B 세포 고갈 데이터를 도시한 것인데, 이는 변이체 A378D가 예상치 못하게도, 시험관내 ADCC 및 CDC 검정에서 등가 또는 보다 큰 활성을 지닌 변이체 보다 더 큰 정도로 더 효과적으로 B 세포를 고갈시켰다는 것을 입증해준다.

실시예 3

변이체의 친화도 결정

본 실시예에는 FcγRIIIa (FF 유전자형)과 야생형 (또는 모) Fc 및 변이체 I332E 간의 상호 작용의 친화도 (Kd)를 어떻게 결정하였는가가 기재되어 있다.

i. FcγRIIIa/IgG Kd 분석

인간 FcγRIIIa (158F) 가용성 세포외 도메인을 293 세포에서 발현시키고, 그의 공학적으로 처리시킨 6-히스티딘 태그에 Ni-NTA 수지를 결합시킴으로써 정제하였다.

아즈락톤 비드의 1개 튜브 (Sapidyne)를 중탄산나트륨 완충액 (pH 9.3) 중에서 l mg의 FcγRIII (158F)와 커플링시켰다. 슬러리를 4℃ 하에 밤새 텀블링시키고, PBS로 2회 세척한 다음, 실온에서 1시간 동안 차단용 완충액 (1M 트리스 pH 7.4 + 1% BSA)로 차단시켰다. 그 다음, 비드를 PBS로 3회 세척하고, 0.01% 아지드를 수반한 50 mL의 PBS에 재현탁시켰다. 4 μM에서 1.95 nM로 적정시킨 FcγRIII와 7.5 nM IgG를 함유하는 모든 12개 평형물을 유동 완충액 (PBS pH 7.4, 0.1% BSA 0.01% 아지드)에서 제조하고, 실온에서 16시간 동안 평형시켰다. 모든 실험을 0.5 ml/min의 유속을 이용하여 실온에서 유동 완충액에서 수행하였다. 기기의 플로 셀 (flow cell)에 FcγRIII 비드를 패킹한 후, 제1 평형물로부터 자유 IgG를 포획하였다. 이어서, 비드를 세척하고, 고우트 항-인간 Fc (Fab')2-FITC 접합체 (공급처: Jackson Immunochemicals)를 사용하여 결합된 IgG를 탐지하였다. 그 다음, 이러한 공정을 나머지 11개 평형물에 대해서도 반복해서 수행하고, 키넥사 프로 (Kinexa Pro) 소프트웨어를 이용한 분석에 따라서 Kd를 결정하였다. 이러한 접근법을 이용한 결과, FcγRIIIa (FF 유전자형)과 야생형 (또는 모) Fc 간의 상호 작용의 친화도 (Kd)는 387 nM인 것으로 결정된 반면, 변이체 I332E의 친화도는 52 nM인 것으로 결정되었다. 당화-처리시킨 항체 (GnTIII)는 83 nM의 Kd를 나타낸 반면, 조합 변이체 (L256P, I332E)는 21 nM의 Kd를 나타내었다.

실시예 4

변이체의 CDC 활성의 성상 확인

본 실시예에는 각종 Fc 영역 변이체의 CDC 활성을 어떻게 결정하였는가가 기재되어 있다.

i. 검정

본 검정은 라모스 (Ramos) (RA #1) 세포 (ATCC 카탈로그 번호 CRL-1596) 상에서 인간 보체 (공급처: Quidel Corp., cat#A113)를 사용하여 수행하였다. 라모스 세포를, 10% PBS를 함유하는 깁코 (Gibco) RPMI1640 배지에서 37℃ 및 5% C0₂ 하에 배양하였다. 검정하기 전날, 세포를 T175 플라스크에 1 x 10⁶개 세포로 시딩하였다. 그 다음날, 1% FBS를 함유하고 페놀 레드는 수반하지 않는 RPMI1640에 세포를 3.57 x 10⁵개 세포/ml가 되도록 재현탁시켰다. 웰당 70 ㎕ 세포를 코스타르 3917 편평한 바닥 판에 분배하였다. 적정 곡선을 위해, 변이체 IgG를 RPMI1640 배지 중의 일련의 3배 희석물에서 제조하였다. 단일점 라이브러리 스크리닝 검정을 위해, 배양 상등액 중에 일시적으로 발현된 IgG 변이체를 모의 배지 중의 1 ㎍/ml으로 표준화시켰다. RPMI1640 + 1% FBS에서 1:5로 희석시킨 30 마이크로리터의 변이체 IgG (즉, 200 ng/ml 최종 농도)와 50 ㎕의 인간 보체 (공급처: Quidel Corp., cat#A113)를, 조심스럽게 피펫팅함으로써 잘 혼합시킨 표적 세포에 가하였다. 판을 5% C0₂의 존재 하에 37℃에서 1.5시간 동안 항온 배양하였다. 15 ㎕/웰의 알라마르 블루 (공급처: Serotec, cat#BUF012B)를 부가한 후, 항온 배양을 밤새 지속하였다. 그 다음날 아침, 560 nm에서의 여기와 590 nm에서의 방출을 나타내는 퍼킨엘머 (PerkinElmer)의 인비젼 (EnVision) 2100 다중-표지 판독기에 의해 형광 신호를 측정하였다.

ii. 데이터 분석

모든 단일점 검정을 두 번 되풀이하여 수행하였다. 각 검정 판은 IgG의 부재 하에서 인간 보체에 의한 자발적 표적 세포 용해에 대한 대조군과, 1% 트리톤 X-100의 존재 하에서 표적 세포 최대 용해에 대한 대조군을 함유하였다. 3개의 야생형 대조군이 각 검정 판 상에 포함되어 있고, CDC 검정 신호를 평균내었다. 자발적 용해 대조군으로부터 수득된 배경 값을 각 샘플로부터 공제하였다. 자발적 및 최대 용해 대조군을 기초로 하여 데이터를 형광 신호로부터 특이적-용해 비율(%)로 전환시켰다. 특이적-용해 비율은 다음 방정식으로부터 계산하였다: 특이적 용해 비율(%) = (실험적 형광 신호 - 자발적 신호)/(최대 용해 신호 - 자발적 신호) X 100. Fc 변이체 활성 비율을, 3개의 야생형 대조군 평균치를 기준으로 하여 계산하였다. 야생형을 기준으로 하여 두 번 되풀이한 검정 판에 대해 표준화시킨 활성 비율(%)을 평균내고, 개별적 검정 판 간의 표준 편차를 계산하였다.

도 1lA, B, 및 C는 IgG 변이체를 적정시킨 후 수득된 대표적인 CDC 데이터를 도시한 것이다. 이 실험에서는, 단일 및 이중 아미노산 Fc-영역 IgG 변이체 및 인간 보체 둘 다를 사용하여 라모스 세포를 용해시켰다. 검정 판을 5% C0₂의 존재 하에 37℃에서 1.5시간 동안 항온 배양한 다음, 15 ㎕의 알라마르 블루를 부가하고 밤새 항온 배양하였다. 형광 신호를 측정하고, IgG 농도에 대해 플롯팅하였다. 이들 데이터는 야생형 항-CD20 항체와 비교해서, 단일 아미노산 변이체 I332D, I332E의 경우에는 CDC 활성이 약간 증강되었고 (도 1lA), T256P 및 S440Y의 경우에는 상당히 증강되었으며 (도 11B), T256P와 I332E의 조합물의 경우에도 상당히 증강되었다는 것을 보여준다 (도 11C). 변이체 A378D의 경우에는, CDC 활성이 저하되었다 (도 11C 및 표 2).

실시예 5

FcRn에 대한 결합성의 성상 확인

본 실시예에는 변이체 IgG에 대한 Fc 신생아 수용체 (FcRn) 결합성을 알아보기 위한 검정이 기재되어 있다. U-바닥의 96-웰 ELISA 판을 4℃에서 50 mM 탄산염 완충액 (pH 9.3) 중의 50 ㎕/웰의 2 ㎍/ml 뉴트라비딘 (Neutravidin) (공급처: Pierce Biotechnology, Cat#31000)으로 밤새 피복시켰다 (Costar). 결합되지 않은 뉴트라비딘을 제거하고, 판을 PBST (0.1% Tween 20을 함유하는 PBS)로 3회 세척하였다. PBS 중의 2.5 ㎍/ml으로 50 ㎕/웰 바이오틴-표지된 가용성 FcRn을 적용하고, 실온에서 1시간 동안 항온 배양하였다. 이어서, 75 ㎕의 카세인 차단용 완충액 (공급처: Pierce Biotechnology, Cat#37528)을 1시간 동안 상기 판에 가하였다. 이어서, ELISA 판을 PBST로 세척하고, 50 ㎕/웰의 변이체 IgG와 함께 항온 배양하였다. 적정 곡선을 위해, 변이체 IgG를 FcRn-결합성 완충액 [100 mM NaP0₄, 상이한 pH (6.0 내지 7.4) 하의 0.05% Tween-20] 중에서 일련의 3배 희석시킴으로써 제조하였다. 단일점 스크리닝을 위해, 배양 상등액 중에 일시적으로 발현된 IgG 변이체를 50 ng/ml의 최종 농도 (pH 7.4 결합의 경우에는 200 ng/ml)으로 표준화시키고, FcRn 결합성 완충액을 이용하여 pH를 조정하여 6.0이 되도록 하였다. 그 다음 단계에서는, 상응하는 pH의 FcRn-결합성 완충액을 사용하여 판을 세척하고 시약을 희석시켰다. 결합 반응은 실온에서 1시간 동안 수행하였다. 3회 세척한 후, 결합된 IgG를 고우트 (Fab')2 항-인간-Fab-HRP 접합체에 의해 1시간 동안 탐지하였다. HRP 활성을 피어스 (Pierce)의 HRP 기질 (공급처: Turbo TMB-ELISA, Cat#34022)에서 5 내지 30분 동안 전개하였다. 50 ㎕의 2 M H₂SO₄를 부가함으로써 반응을 중단시키고, VMAX 미세판 판독기 (공급처: Molecular Devices)를 이용하여 450 nm에서의 흡광도를 판독하였다.

실시예 6

항-CD20-I332E Fc 변이체 인간 요법

시험관내 연구 및 뮤린 종양 모델 [참고: Clynes RA, et al. Nat Med. 6: 443 (2000)]은 ADCC가 항-CD20 항체, 예를 들어 RITUXAN의 항-종양 효과에 있어 일정 역할을 한다는 사실을 명백하게 입증해주었다. 인간 환자를 문헌 [참고: Cartron et al., Blood 99: 754 (2002); 본원에 참고로 도입된다]에 기재된 바와 유사한 방식으로 항-CD20-I332E Fc 변이체 항체 (도 15 및 16), 또는 RITUXAN으로 처치할 수 있다. 예를 들어, 적어도 1개의 측정 가능한 질환 부위를 갖고 있고 GELF 기준에 따라서 종양 존재량이 적은, 앤-아르보 (Ann-Arbor) 분류법에 따라서 제II 기 내지 제IV 기 질병 상태를 나타내는 환자에게, 총 4회의 대략 375 mg/㎡ 용량의 항-CD20-I332E Fc 변이체, 또는 RITUXAN을 정맥내 주입 (1일, 8일, 15일 및 22일)함으로써 투여하여 이러한 환자를 처치할 수 있었다. 일차 효능 종점이 목표로 하는 반응 속도인데, 즉 최근 국제 전문 위원회가 제안한 기준에 따라서 완전한 차도 (CR), 확인되지 않은 CR (Cru), 또는 부분 반응 (PR)을 달성하는 환자의 비율이다. 2개월 단위 (M2)로 임상 반응을 평가할 수 있다. 환자를 1년 단위 (M12)로 진행 과정을 평가할 수 있다.

RITUXAN 또는 항-CD20-I332E로 치료받은 환자에 대한 M2 및 M12에서 목표로 하는 반응 속도를 비교하여, I332E 변이체에 의해 제공된 개선된 ADCC 활성을 정량화할 수 있다. 기타 항-CD20 변이체 (예: I332D, P247L A330K, A339T, A378D, 또는 표 1에 나타낸 바와 같은 조합 변이체)를 사용하여 상기와 동일한 실시예를 반복할 수 있었다.

부가적으로, 변이체의 효능 증강은 상이한 투여 경로, 주사 빈도 감소, 및/또는 보다 적은 용량의 투여를 가능케할 수 있다.

상기 명세서에 언급된 모든 공개문헌 및 특허는 본원에 참고로 도입된다. 본 발명에 기재된 방법 및 시스템의 각종 변형 및 변동이 본 발명의 요지 및 범위를 벗어나지 않고서도 당업자에게는 명백할 것이다. 본 발명이 구체적인 바람직한 양태와 관련하여 기재되긴 하였지만, 청구된 바와 같은 본 발명이 이러한 구체적 양태로만 제한되지 않는다는 것을 인지해야 한다. 실제로, 화학 및 분자 생물학, 또는 관련 분야의 전문가에게는 명백한, 본 발명을 실시하기 위한 본원에 기재된 방법의 각종 변형이 다음 청구의 범위 내에 속한다.

SEQUENCE LISTING <110> Applied Molecular Evolution <120> Fc Region Variants <130> X-16757 <150> 60/535,764 <151> 2004-01-12 <160> 56 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 218 <212> PRT <213> Human <400> 1 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 35 40 45 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 85 90 95 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 100 105 110 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 115 120 125 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 130 135 140 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 145 150 155 160 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 165 170 175 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 180 185 190 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 195 200 205 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 2 <211> 217 <212> PRT <213> Human <400> 2 Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 3 <211> 218 <212> PRT <213> Human <400> 3 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp 35 40 45 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 85 90 95 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly 100 105 110 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 115 120 125 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 130 135 140 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn 145 150 155 160 Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 165 170 175 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 180 185 190 Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr 195 200 205 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 4 <211> 218 <212> PRT <213> Human <400> 4 Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 35 40 45 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 85 90 95 Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 100 105 110 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu 115 120 125 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 130 135 140 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glx Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 145 150 155 160 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 165 170 175 Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn 180 185 190 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 195 200 205 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 210 215 <210> 5 <211> 215 <212> PRT <213> Murine <400> 5 Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys 1 5 10 15 Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val 20 25 30 Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp 35 40 45 Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe 50 55 60 Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp 65 70 75 80 Cys Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe 85 90 95 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys 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acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggacgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990 <210> 33 <211> 93 <212> DNA <213> HUMAN <400> 33 gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 60 ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgc 93 <210> 34 <211> 87 <212> DNA <213> HUMAN <400> 34 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 60 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaag 87 <210> 35 <211> 90 <212> DNA <213> HUMAN <400> 35 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 60 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 90 <210> 36 <211> 69 <212> DNA <213> HUMAN <400> 36 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 60 ccgggtaaa 69 <210> 37 <211> 66 <212> DNA <213> HUMAN <400> 37 tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 60 ccggag 66 <210> 38 <211> 93 <212> DNA <213> HUMAN <400> 38 gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaaca caaggacacc 60 ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgc 93 <210> 39 <211> 93 <212> DNA <213> HUMAN <400> 39 gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaaat caaggacacc 60 ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgc 93 <210> 40 <211> 93 <212> DNA <213> HUMAN <400> 40 gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaact gaaggacacc 60 ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgc 93 <210> 41 <211> 93 <212> DNA <213> HUMAN <400> 41 gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 60 ttcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgc 93 <210> 42 <211> 93 <212> DNA <213> HUMAN <400> 42 gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 60 ctcatgatct cccggatgcc tgaggtcaca tgc 93 <210> 43 <211> 93 <212> DNA <213> HUMAN <400> 43 gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 60 ctcatgatct cccggccacc tgaggtcaca tgc 93 <210> 44 <211> 87 <212> DNA <213> HUMAN <400> 44 gtggtggtgg acgtgagcga cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 60 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaag 87 <210> 45 <211> 87 <212> DNA <213> HUMAN <400> 45 gtggtggtgg acgtgagcga ggaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 60 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaag 87 <210> 46 <211> 87 <212> DNA <213> HUMAN <400> 46 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggccggc 60 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaag 87 <210> 47 <211> 87 <212> DNA <213> HUMAN <400> 47 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtgaaaggc 60 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaag 87 <210> 48 <211> 90 <212> DNA <213> HUMAN <400> 48 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccaaaa cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 60 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 90 <210> 49 <211> 90 <212> DNA <213> HUMAN <400> 49 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccacgc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 60 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 90 <210> 50 <211> 90 <212> DNA <213> HUMAN <400> 50 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccgacgaga aaaccatctc caaagccaaa 60 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 90 <210> 51 <211> 90 <212> DNA <213> HUMAN <400> 51 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccgaggaga aaaccatctc caaagccaaa 60 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 90 <210> 52 <211> 90 <212> DNA <213> HUMAN <400> 52 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccaaagaga aaaccatctc caaagccaaa 60 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 90 <210> 53 <211> 90 <212> DNA <213> HUMAN <400> 53 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc ccccgcgaga aaaccatctc caaagccaaa 60 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 90 <210> 54 <211> 90 <212> DNA <213> HUMAN <400> 54 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa 60 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 90 <210> 55 <211> 66 <212> DNA <213> HUMAN <400> 55 tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgacgtgg agtgggagag caatgggcag 60 ccggag 66 <210> 56 <211> 69 <212> DNA <213> HUMAN <400> 56 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagtacct ctccctgtct 60 ccgggtaaa 69

Claims

모 인간 Fc 영역의 변이체 또는 그의 일부를 포함하는 항체로서, 이러한 변이체가 모 Fc 영역과 비교해서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 아미노산 치환이 247, 251, 256, 268, 280, 330, 332, 339, 378 및 440으로 이루어진 군 중에서 선택된 인간 Fc 서열의 위치에 상응하는 위치에서 이루어지는 항체.
제1항에 있어서, 치환이 247L, 247H, 247I, 251F, 256M, 256P, 258E, 268D, 280A, 280K, 330K, 330R, 332E, 332D, 332K, 332R, 339T, 378D 및 440Y로 이루어진 군 중에서 선택되는 항체.
제1항에 있어서, 변이체 Fc 영역에서의 하나 이상의 아미노산 치환이 인간 Fc 서열의 위치 332에 상응하는 위치에서 이루어지는 항체.
제3항에 있어서, 치환이 332E, 332D, 332K 및 332R로 이루어진 군 중에서 선택되는 항체.
제1항에 있어서, 변이체 Fc 영역에서의 하나 이상의 아미노산 치환이 378D인 항체.
제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 모 Fc 영역의 변이체를 포함하는 항체가 모 Fc 영역을 포함하는 항체 보다 더 효과적으로, 효과기 세포의 존재 하에 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 매개하는 항체.
제6항에 있어서, 동일한 검정으로 측정한 경우에, 모 Fc 영역을 포함하는 항체가 100의 상대적 ADCC 특이 활성을 표시하게 되면, 변이체 Fc 영역을 포함하는 항체가 100 초과의 상대적 ADCC 특이 활성 값을 표시하는 항체.
제6항에 있어서, 동일한 검정으로 측정한 경우에, 모 Fc 영역을 포함하는 항체가 100의 상대적 ADCC 특이 활성을 표시하게 되면, 변이체 Fc 영역을 포함하는 항체가 100 미만의 상대적 ADCC 특이 활성 값을 표시하는 항체.
제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 모 Fc 영역의 변이체를 포함하는 항체가 모 Fc 영역을 포함하는 항체 보다 더 효과적으로 보체-의존성 세포독성 (CDC)을 매개하는 항체.
제9항에 있어서, 동일한 검정으로 측정한 경우에, 모 Fc 영역을 포함하는 항체가 100의 상대적 CDC 특이 활성을 표시하게 되면, 모 Fc 영역의 변이체를 포함하는 항체가 100 초과의 상대적 CDC 특이 활성 값을 표시하는 항체.
제9항에 있어서, 동일한 검정으로 측정한 경우에, 모 Fc 영역을 포함하는 항체가 100의 상대적 CDC 특이 활성을 표시하게 되면, 모 Fc 영역의 변이체를 포함하는 항체가 100 미만의 상대적 CDC 특이 활성 값을 표시하는 항체.
제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 모 Fc 영역이 IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE로 이루어진 군 중에서 선택된 부류인 항체.
제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 모 Fc 영역이 IgGl, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 군 중에서 선택된 아부류인 항체.
제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체.
제14항에 있어서, 모노클로날 항체가 2개의 동일한 중쇄 폴리펩티드와 2개의 동일한 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 모노클로날 항체.
제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, 인간 CD20과 특이적으로 결합하는 항체.
경쇄 폴리펩티드를 포함하고, 이러한 경쇄 폴리펩티드가 서열 57에 나타낸 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 모노클로날 항체.
제17항에 있어서, 중쇄 폴리펩티드를 추가로 포함하고, 이러한 중쇄 폴리펩티드가 서열 58에 나타낸 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 모노클로날 항체.
제1항 내지 제18항 중의 어느 한 항의 항체를 포함하는 제약 조성물.