TWI523662B - Ｐｃｓｋ９拮抗劑 - Google Patents

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TWI523662B
TWI523662B TW099143361A TW99143361A TWI523662B TW I523662 B TWI523662 B TW I523662B TW 099143361 A TW099143361 A TW 099143361A TW 99143361 A TW99143361 A TW 99143361A TW I523662 B TWI523662 B TW I523662B
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Description

PCSK9拮抗劑
本發明係關於針對PCSK9之抗體拮抗劑。
相關專利申請案之交叉參考
本發明主張2009年12月11日申請之美國臨時專利申請案第61/285,942號之優先權權益，該申請案出於所有目的以引用的方式併入本文中。
低密度脂蛋白受體(LDL-R)經由清除血流中之低密度脂蛋白(LDL)來防止動脈粥樣硬化及高膽固醇血症。LDL-R之轉譯後含量受前趨蛋白轉化酶枯草溶菌素/kexin 9a型(「PCSK9」)調控。近來已報導在小鼠中敲除PCSK9。此等小鼠顯示血漿膽固醇含量降低約50%，並且顯示在降低血漿膽固醇時對史他汀類抑制素(statin)之敏感性增加(Rashid S等人,(2005) Proc Natl Acad Sci 102:5374-5379)。人類基因資料亦證明PCSK9在LDL穩衡中之作用。近來鑑別出兩種可能為PCSK9中之「功能損失型」突變的突變。具有此等突變之個體的LDL-C血漿含量降低約40%，此轉化為冠心病減少約50-90%。總而言之，此等研究表明，PCSK9抑制劑將會有益於降低LDL-C血漿濃度及由PCSK9介導之其他疾病病狀，並且可能例如與適用於降低膽固醇之第二藥劑共同投與以便增加功效。
本發明提供結合至前趨蛋白轉化酶枯草溶菌素/kexin 9型(PCSK9)(例如SEQ ID NO:47)並拮抗其功能的抗體、及使用該等抗體來(例如)治療由PCSK9所介導之疾病病狀的方法。
在一態樣中，本發明提供結合至前趨蛋白轉化酶枯草溶菌素/kexin 9型(PCSK9)的抗體及抗原結合分子。在一些實施例中，抗體：
a)　不阻斷PCSK9結合至低密度脂蛋白受體(LDLR)；及
b)　抑制PCSK9介導之LDLR降解。
在一些實施例中，抗體或抗原結合分子結合至人類PCSK9之殘基位置680-692內的至少一個胺基酸。例如，在一些實施例中，抗體或抗原結合分子結合至胺基酸序列RSRHLAQASQELQ(SEQ ID NO:49)內之PCSK9之抗原決定基。
在一些實施例中，抗體或抗原結合分子結合至人類PCSK9之平衡解離常數(KD)為約500 pM或500 pM以下。例如，在一些實施例中，抗體或抗原結合分子結合至人類PCSK9之平衡解離常數(KD)為約400 pM、300 pM、250 pM、200 pM、190 pM、180 pM、170 pM、160 pM、150 pM、140 pM或140 pM以下。
在一些實施例中，抗體或抗原結合分子之活體內半衰期為至少約7天。在一些實施例中，抗體或抗原結合分子之活體內半衰期為至少約3、4、5、6、7、8、9、10天。在一些實施例中，抗體或抗原結合分子具有至少約2週(例如2、3、4週或更久)之活體內降低膽固醇之作用。較佳在人類個體中測定活體內半衰期。
在一些實施例中，抗體包含：
(a)　重鏈可變區，其包含人類重鏈V區段、重鏈互補決定區3(CDR3)及重鏈構架區4(FR4)；及
(b)　輕鏈可變區，其包含人類輕鏈V區段、輕鏈CDR3及輕鏈FR4，其中
i)　該重鏈CDR3包含胺基酸序列SYYYY(A/N)MD(A/F/S/V/Y)(SEQ ID NO:14)；且
ii)　該輕鏈CDR3可變區包含胺基酸序列LQWSSDPPT(SEQ ID NO:26)。
在一些實施例中，抗體包含：
(a)　重鏈可變區，其包含人類重鏈V區段、重鏈互補決定區3(CDR3)及重鏈構架區4(FR4)；及
(b)　輕鏈可變區，其包含人類輕鏈V區段、輕鏈CDR3及輕鏈FR4，其中
i)　該重鏈CDR3包含胺基酸序列SYYYYNMDY(SEQ ID NO:12)；且
ii)　該輕鏈CDR3可變區包含胺基酸序列LQWSSDPPT(SEQ ID NO:26)。
在一些實施例中，抗體包含：
(a)　重鏈可變區，其包含人類重鏈V區段、重鏈互補決定區3(CDR3)及重鏈構架區4(FR4)；及
(b)　輕鏈可變區，其包含人類輕鏈V區段、輕鏈CDR3及輕鏈FR4，其中
i)　該重鏈CDR3包含胺基酸序列SYYYYAMDY(SEQ ID NO:13)；且
ii)　該輕鏈CDR3可變區包含胺基酸序列LQWSSDPPT(SEQ ID NO:26)。
在一些實施例中，重鏈CDR3包含選自由SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:13組成之群的胺基酸序列，且輕鏈CDR3包含胺基酸序列SEQ ID NO:26。
在一些實施例中，重鏈V區段與SEQ ID NO:28具有至少85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性，且其中輕鏈V區段與SEQ ID NO:31具有至少85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。
在一些實施例中，重鏈V區段與SEQ ID NO:27具有至少85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性，且其中輕鏈V區段與選自由SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:30組成之群的胺基酸具有至少85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。
在一些實施例中，重鏈FR4為人類生殖系FR4。在一些實施例中，重鏈FR4為SEQ ID NO:35。
在一些實施例中，輕鏈FR4為人類生殖系FR4。在一些實施例中，輕鏈FR4為SEQ ID NO:39。
在一些實施例中，重鏈V區段及輕鏈V區段各包含互補決定區1(CDR1)及互補決定區2(CDR2)；其中：
i)　重鏈V區段之CDR1包含胺基酸序列SEQ ID NO:8；
ii)　重鏈V區段之CDR2包含胺基酸序列SEQ ID NO:11；
iii)輕鏈V區段之CDR1包含胺基酸序列SEQ ID NO:22；且
iv)　輕鏈V區段之CDR2包含胺基酸序列SEQ ID NO:25。
在一些實施例中，重鏈V區段及輕鏈V區段各包含互補決定區1(CDR1)及互補決定區2(CDR2)；其中：
i)　重鏈V區段之CDR1包含胺基酸序列SEQ ID NO:7；
ii)　重鏈V區段之CDR2包含胺基酸序列SEQ ID NO:10；
iii)輕鏈V區段之CDR1包含胺基酸序列SEQ ID NO:21；且
iv)　輕鏈V區段之CDR2包含胺基酸序列SEQ ID NO:24。
在一些實施例中，
i)　重鏈V區段之CDR1包含SEQ ID NO:7；
ii)　重鏈V區段之CDR2包含SEQ ID NO:10；
iii)　重鏈CDR3包含選自由SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:13組成之群的胺基酸序列；
iv)　輕鏈V區段之CDR1包含SEQ ID NO:21；
v)　輕鏈V區段之CDR2包含SEQ ID NO:24；且
vi)　輕鏈CDR3包含SEQ ID NO:26。
在一些實施例中，重鏈可變區與SEQ ID NO:40之可變區具有至少85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性，且輕鏈可變區與SEQ ID NO:41之可變區具有至少90%胺基酸序列一致性。
在一些實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO:40之重鏈及包含SEQ ID NO:41之輕鏈。
在一些實施例中，重鏈可變區與選自由SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:4組成之群的可變區具有至少85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性，且輕鏈可變區與選自由SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:18組成之群的可變區具有至少85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性。
在一些實施例中，重鏈可變區包含選自由SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:4組成之群的胺基酸序列，且輕鏈可變區包含選自由SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:18組成之群的胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體為IgG。在一些實施例中，抗體為IgG1。在一些實施例中，抗體具有與選自由SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:5組成之群的胺基酸共有至少85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的重鏈。在一些實施例中，抗體具有與選自由SEQ ID NO:17及SEQ ID NO:19組成之群的胺基酸共有至少85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的輕鏈。
在一些實施例中，抗體為FAb'片段。在一些實施例中，抗體為單鏈抗體(scFv)。在一些實施例中，抗體包含人類恆定區。在一些實施例中，抗體包含人類IgG1恆定區。在一些實施例中，人類IgG1恆定區經突變以降低對細胞或補體C1組分上之效應子配位體(諸如Fc受體(FcR)，例如FcγR1)的結合親和力。參看例如美國專利第5,624,821號。在一些實施例中，IgG1恆定區之胺基酸殘基L234及L235被取代為Ala234及Ala235。重鏈恆定區中之殘基編號為EU指數編號(參看Kabat等人，(1983)「Sequences of Proteins of Immunological Interest」，美國健康與人類服務部(U.S. Dept. Health and Human Services))。
在一些實施例中，抗體被連接至載體蛋白質，例如白蛋白。
在一些實施例中，抗體經PEG化。
在一個相關態樣中，本發明提供結合至PCSK9之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區及該輕鏈可變區各包含以下三個互補決定區(CDR)：CDR1、CDR2及CDR3；其中：
i)　重鏈可變區之CDR1包含胺基酸序列SEQ ID NO:8；
ii)　重鏈可變區之CDR2包含胺基酸序列SEQ ID NO:11；
iii)　重鏈可變區之CDR3包含胺基酸序列SEQ ID NO:14；
iv)　輕鏈可變區之CDR1包含胺基酸序列SEQ ID NO:22；
v)　輕鏈可變區之CDR2包含胺基酸序列SEQ ID NO:25；
vi)　輕鏈可變區之CDR3包含胺基酸序列SEQ ID NO:26。
在一些實施例中，
i)　重鏈可變區之CDR1包含選自由SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:7組成之群的胺基酸序列；
ii)　重鏈可變區之CDR2包含選自由SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:10組成之群的胺基酸序列；
iii)　重鏈可變區之CDR3包含選自由SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:13組成之群的胺基酸序列；
iv)　輕鏈可變區之CDR1包含選自由SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:21組成之群的胺基酸序列；
v)　輕鏈可變區之CDR2包含選自由SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24組成之群的胺基酸序列；
vi)　輕鏈可變區之CDR3包含胺基酸序列SEQ ID NO:26。
在一個相關態樣中，本發明提供結合至PCSK9之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區及該輕鏈可變區各包含以下三個互補決定區(CDR)：CDR1、CDR2及CDR3；其中：
i)　重鏈可變區之CDR1包含胺基酸序列SEQ ID NO:6；
ii)　重鏈可變區之CDR2包含胺基酸序列SEQ ID NO:9；
iii)　重鏈可變區之CDR3包含胺基酸序列SEQ ID NO:13；
iv)　輕鏈可變區之CDR1包含胺基酸序列SEQ ID NO:20；
v)　輕鏈可變區之CDR2包含胺基酸序列SEQ ID NO:23；
vi)　輕鏈可變區之CDR3包含胺基酸序列SEQ ID NO:26。
在一個相關態樣中，本發明提供結合至PCSK9之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區及該輕鏈可變區各包含以下三個互補決定區(CDR)：CDR1、CDR2及CDR3；其中：
i)　重鏈可變區之CDR1包含胺基酸序列SEQ ID NO:7；
ii)　重鏈可變區之CDR2包含胺基酸序列SEQ ID NO:10；
iii)　重鏈可變區之CDR3包含胺基酸序列SEQ ID NO:12；
iv)　輕鏈可變區之CDR1包含胺基酸序列SEQ ID NO:21；
v)　輕鏈可變區之CDR2包含胺基酸序列SEQ ID NO:24；
vi)　輕鏈可變區之CDR3包含胺基酸序列SEQ ID NO:26。
在一個相關態樣中，本發明提供結合至PCSK9之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區及該輕鏈可變區各包含以下三個互補決定區(CDR)：CDR1、CDR2及CDR3；其中：
i)　重鏈可變區之CDR1包含胺基酸序列SEQ ID NO:7；
ii)　重鏈可變區之CDR2包含胺基酸序列SEQ ID NO:10；
iii)　重鏈可變區之CDR3包含胺基酸序列SEQ ID NO:13；
iv)　輕鏈可變區之CDR1包含胺基酸序列SEQ ID NO:21；
v)　輕鏈可變區之CDR2包含胺基酸序列SEQ ID NO:24；
vi)　輕鏈可變區之CDR3包含胺基酸序列SEQ ID NO:26。
在另一態樣中，本發明提供包含如本文所述之抗體或抗原結合分子及生理學上相容之賦形劑的組合物。
在一些實施例中，該組合物進一步包含可降低個體之低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量的第二藥劑。
在一些實施例中，該第二藥劑為史他汀類抑制素(statin)。例如，該史他汀類抑制素可選自由阿托伐他汀(atorvastatin)、西立伐他汀(cerivastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、美伐他汀(mevastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、普伐他汀(pravastatin)、羅素他汀(rosuvastatin)及辛伐他汀(simvastatin)組成之群。
在一些實施例中，該第二藥劑係選自由纖維酸酯、菸鹼酸及其類似物、膽固醇吸收抑制劑、膽汁酸螯合劑、甲狀腺激素模擬物、微粒體三酸甘油酯轉移蛋白(MTP)抑制劑、二醯基甘油醯基轉移酶(DGAT)抑制劑、靶向PCSK9之抑制性核酸及靶向apoB100之抑制性核酸組成之群。
在另一態樣中，本發明提供降低有需要之個體之LDL-C、非HDL-C及/或總膽固醇的方法，該方法包含投與該個體治療有效量之如本文所述之抗體或抗原結合分子。
在一些實施例中，該個體對史他汀類抑制素療法具低反應性或抗性。在一些實施例中，該個體不耐受史他汀類抑制素療法。在一些實施例中，該個體之基線LDL-C含量為至少約100 mg/dL，例如至少約110、120、130、140、150、160、170、180、190 mg/dL或更高。在一些實施例中，該個體患有家族性高膽固醇血症。在一些實施例中，該個體患有三酸甘油酯血症。在一些實施例中，該個體具有功能獲得型PCSK9基因突變。在一些實施例中，該個體患有藥物誘導之血脂異常。
在一些實施例中，總膽固醇隨LDL-C而降低。
在一些實施例中，該方法進一步包含投與該個體治療有效量的可有效降低LDL-C之第二藥劑。
在一些實施例中，該第二藥劑為史他汀類抑制素。例如，該史他汀類抑制素可選自由阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、羅素他汀及辛伐他汀組成之群。
在一些實施例中，該第二藥劑係選自由纖維酸酯、菸鹼酸及其類似物、膽固醇吸收抑制劑、膽汁酸螯合劑、甲狀腺激素模擬物、微粒體三酸甘油酯轉移蛋白(MTP)抑制劑、二醯基甘油醯基轉移酶(DGAT)抑制劑、靶向PCSK9之抑制性核酸及靶向apoB100之抑制性核酸組成之群。
在一些實施例中，該抗體或抗原結合分子及該第二藥劑係以混合物形式共同投與。
在一些實施例中，該抗體或抗原結合分子及該第二藥劑係獨立地共同投與。
在一些實施例中，該抗體係經靜脈內投與。在一些實施例中，該抗體係經皮下投與。
定義
「抗體」係指免疫球蛋白家族之多肽，或包含能夠非共價、可逆且以特異性方式結合相應抗原之免疫球蛋白片段的多肽。例示性抗體結構單元包含四聚物。各四聚物由兩對相同之多肽鏈構成，各對具有一條「輕」鏈(約25 kD)及一條「重」鏈(約50-70 kD)，由二硫鍵連接。已識別之免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε及μ恆定區基因，以及無數免疫球蛋白可變區基因。輕鏈被分類為κ或λ。重鏈被分類為γ、μ、α、δ或ε，該分類又分別界定免疫球蛋白類別，即IgG、IgM、IgA、IgD及IgE。各鏈之N末端界定主要負責抗原識別的約100至110或更多個胺基酸之可變區。術語可變輕鏈(VL)及可變重鏈(VH)分別係指輕鏈及重鏈之此等區域。如本申請案中所使用，「抗體」涵蓋抗體及其具有特定結合特異性(例如針對PCSK9)之片段的所有變化形式。因而，全長抗體、嵌合抗體、人類化抗體、單鏈抗體(ScFv)、Fab、Fab'及具有相同結合特異性之此等片段之多聚體型式(例如F(ab')2)均在此概念之範疇內。
「互補決定域」或「互補決定區」(「CDR」)可互換地指VL及VH之高變區。CDR為抗體鏈之靶蛋白結合位點，該位點對該靶蛋白具有特異性。在各人類VL或VH中存在三個CDR(CDR1-3，自N-末端依序編號)，構成可變域的約15-20%。CDR在結構上與靶蛋白之抗原決定基互補，且因而直接負責結合特異性。VL或VH之其餘片段，即所謂構架區，在胺基酸序列中展現較少變化(Kuby,Immunology,第4版，第4章。W.H. Freeman & Co.,New York,2000)。
CDR及構架區之位置係使用此項技術中之各種熟知定義來確定，例如Kabat、Chothia、國際ImMunoGeneTics資料庫(IMGT)(在全球資訊網上，imgt.cines.fr/)及AbM(參看例如Johnson等人，Nucleic Acids Res.,29:205-206(2001)；Chothia及Lesk,J. Mol. Biol.,196:901-917(1987)；Chothia等人，Nature,342:877-883(1989)；Chothia等人，J. Mol. Biol.,227:799-817(1992)；Al-Lazikani等人，J.Mol.Biol.,273:927-748(1997))。抗原結合位點之定義亦描述於以下文獻中：Ruiz等人，Nucleic Acids Res.,28:219-221(2000)；及Lefranc,M.P.,Nucleic Acids Res.,29:207-209(2001)；MacCallum等人，J. Mol. Biol.,262:732-745(1996)；及Martin等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,86:9268-9272(1989)；Martin等人，Methods Enzymol.,203:121-153(1991)；及Rees等人，Sternberg M.J.E.(編)，Protein Structure Prediction,Oxford University Press,Oxford,141-172(1996)。
術語「結合特異性決定子」或「BSD」可互換地指為決定抗體之結合特異性所必需的互補決定區內之最小鄰近或非鄰近胺基酸序列。最小結合特異性決定子可處於一或多個CDR序列內。在一些實施例中，最小結合特異性決定子存在於抗體重鏈或輕鏈之一部分或全長CDR3序列內(亦即僅由抗體重鏈或輕鏈之部分或全長CDR3序列決定)。
如本文中所使用之「抗體輕鏈」或「抗體重鏈」分別係指包含VL或VH之多肽。內源性VL係由基因區段V(可變性)及J(接合性)編碼，且內源性VH係由V、D(多樣性)及J編碼。VL或VH中之每一者均包括CDR以及構架區。在本申請案中，抗體輕鏈及/或抗體重鏈有時可統稱為「抗體鏈」。此等術語涵蓋含有不破壞VL或VH之基本結構之突變的抗體鏈，如熟習此項技術者將容易地識別。
抗體係以完整免疫球蛋白形式或以由各種肽酶消化所產生之許多經充分表徵之片段的形式存在。因而，例如，胃蛋白酶在抗體絞鏈區中之二硫鍵下消化抗體以產生Fab'之二聚物F(ab)'2，Fab'自身為藉由二硫鍵接合至VH-CH1之輕鏈。可在溫和條件下還原F(ab)'2以使絞鏈區中之二硫鍵斷裂，從而使F(ab)'2二聚物轉化為Fab'單體。Fab'單體本質上為具有部分絞鏈區之Fab。Paul,Fundamental Immunology第3版(1993)。雖然根據完整抗體之消化來界定不同抗體片段，但熟習此項技術者應瞭解，該等片段可以化學方式或藉由使用重組DNA法而重新合成。因而，如本文中所使用之術語「抗體」亦包括藉由修飾完整抗體所產生之抗體片段或使用重組DNA法重新合成之抗體片段(例如單鏈Fv)或使用噬菌體呈現集合庫鑑別之抗體片段(參看例如McCafferty等人，Nature 348:552-554(1990))。
為了製備單株或多株抗體，可使用此項技術中已知之任何技術(參看例如Kohler及Milstein,Nature 256:495-497(1975)；Kozbor等人,Immunology Today 4:72(1983)；Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,第77-96頁。Alan R. Liss,Inc. 1985)。用於產生單鏈抗體之技術(美國專利第4,946,778號)可經調適而用於產生針對本發明多肽之抗體。又,轉殖基因小鼠或諸如其他哺乳動物之其他生物體可用於表現人類化抗體。或者,可使用噬菌體呈現技術鑑別特異性結合至所選抗原的抗體及雜聚Fab片段(參看例如McCafferty等人,同上文；Marks等人,Biotechnology,10:779-783,(1992))。
用於使非人類抗體人類化或靈長類化之方法在此項技術中為熟知的。一般而言，人類化抗體具有一或多個自非人類來源引入其中之胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘基通常被稱為輸入殘基，其通常係取自輸入可變域。人類化基本上可根據Winter及合作者之方法(參看例如Jones等人，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science 239:1534-1536(1988)；及Presta,Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992))，藉由用齧齒動物CDR或CDR序列取代人類抗體之相應序列來進行。因此，該等人類化抗體為嵌合抗體(美國專利第4,816,567號)，其中實質上不及完整之人類可變域已經來自非人類物種之相應序列取代。實際上，人類化抗體通常為一些互補決定區(「CDR」)殘基及可能存在之一些構架(「FR」)殘基經來自齧齒動物抗體之類似位點之殘基取代的人類抗體。
「嵌合抗體」為抗體分子，其中(a)恆定區或其部分經改變、置換或交換以便抗原結合位點(可變區)連接至不同或經改變之類別、效應功能及/或物種之恆定區，或連接至賦予嵌合抗體新特性的完全不同之分子(例如酶、毒素、激素、生長因子及藥物)；或(b)可變區或其部分經具有不同或經改變之抗原特異性的可變區改變、置換或交換。
本發明之抗體或抗原結合分子進一步包括一或多個免疫球蛋白鏈，該等免疫球蛋白鏈化學結合至或表現為與其他蛋白質之融合蛋白質。其亦包括雙特異性抗體。「雙特異性」或「雙功能」抗體為具有兩個不同重鏈/輕鏈對及兩個不同結合位點的人工雜交抗體。本發明之其他抗原結合片段或抗體部分包括二價scFv(微型雙功能抗體)、雙特異性scFv抗體(其中該抗體分子識別兩個不同的抗原決定基)、單結合域(dAb)及微型抗體。
本文所述之各種抗體或抗原結合片段可藉由酶或化學修飾完整抗體來產生，或使用重組DNA法重新合成(例如單鏈Fv)或使用噬菌體呈現集合庫鑑別(參看例如McCafferty等人，Nature 348:552-554,1990)。例如，可使用此項技術中所述之方法產生微型抗體，例如Vaughan及Sollazzo,Comb Chem High Throughput Screen. 4:417-30 2001。可藉由多種方法產生雙特異性抗體，包括融合融合瘤或連接Fab'片段。參看例如Songsivilai及Lachmann,Clin. Exp. Immunol. 79:315-321(1990)；Kostelny等人，J. Immunol. 148,1547-1553(1992)。可使用噬菌體呈現集合庫或核糖體呈現集合庫、基因改組集合庫來鑑別單鏈抗體。該等集合庫可由合成、半合成或天然及免疫功能正常之來源構成。
「嵌合抗體」為抗體分子，其中(a)恆定區或其部分經改變、置換或交換以便抗原結合位點(可變區)連接至不同或經改變之類別、效應功能及/或物種之恆定區，或連接至賦予嵌合抗體新特性的完全不同之分子(例如酶、毒素、激素、生長因子、藥物等，或(b)可變區或其部分經具有不同或經改變之抗原特異性的可變區改變、置換或交換。例如，如以下實例中所示，小鼠抗PCSK9抗體可藉由用來自人類免疫球蛋白之恆定區置換其恆定區來加以修飾。歸因於用人類恆定區置換，因此嵌合抗體可保留其識別人類PCSK9之特異性，同時其在人類中之抗原性與初始小鼠抗體相比降低。
術語「抗體結合分子」或「非抗體配位體」係指使用非免疫球蛋白蛋白質骨架之抗體模擬物，包括阿德奈汀(adnectin)、高親和性多聚體(avimer)、單鏈多肽結合分子及抗體樣結合肽模擬物。
術語「可變區」或「V區」可互換地指包含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4之重鏈或輕鏈。參看圖1。內源性可變區係由免疫球蛋白重鏈V-D-J基因或輕鏈V-J基因編碼。V區可能為天然存在、重組或合成的。
如本文所使用之術語「可變區段」或「V區段」可互換地指包括FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3之可變區子序列。參看圖1。內源性V區段係由免疫球蛋白V基因編碼。V區段可能為天然存在、重組或合成的。
如本文所使用之術語「J區段」係指包含CDR3及FR4之C末端部分的所編碼之可變區之子序列。內源性J區段係由免疫球蛋白J基因編碼。參看圖1。J區段可能為天然存在、重組或合成的。
「人類化」抗體為保留非人類抗體之反應性同時在人類中具有較低免疫原性的抗體。舉例而言，此抗體可藉由保留非人類CDR區並用其人類對應物置換抗體之其餘部分來獲得。參看例如Morrison等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81:6851-6855(1984)；Morrison及Oi,Adv. Immunol.,44:65-92(1988)；Verhoeyen等人，Science,239:1534-1536(1988)；Padlan,Molec. Immun.,28:489-498(1991)；Padlan,Molec. Immun.,31(3):169-217(1994)。
術語「相應人類生殖系序列」係指編碼相較於由人類生殖系免疫球蛋白可變區序列所編碼之所有其他已知可變區胺基酸序列與參考可變區胺基酸序列或子序列共有最高確定之胺基酸序列一致性的人類可變區胺基酸序列或子序列的核酸序列。相應人類生殖系序列亦可指與所有其他所評估之可變區胺基酸序列相比，與參考可變區胺基酸序列或子序列具有最高胺基酸序列一致性的人類可變區胺基酸序列或子序列。相應人類生殖系序列可能為僅構架區、僅互補決定區、構架及互補決定區、可變區段(如上文所定義)，或包含可變區之序列或子序列的其他組合。序列一致性可使用本文所述之方法確定，例如使用BLAST、ALIGN或此項技術已知之另一比對算法來比對兩個序列而確定。相應人類生殖系核酸或胺基酸序列可與參考可變區核酸或胺基酸序列具有至少約90%、92%、94%、96%、98%、99%序列一致性。可例如經由可公開獲得之國際ImMunoGeneTics資料庫(IMGT)(在全球資訊網上，imgt.cines.fr/)及V-base(在全球資訊網上，vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk)來確定相應人類生殖系序列。
片語「特異性(或選擇性)結合」在用於描述抗原(例如蛋白質)與抗體或來源於抗體之結合劑間之相互作用的內容中時係指在蛋白質及其他生物製劑之異質群體中，例如在生物樣本(例如血液、血清、血漿或組織樣本)中，由抗原之存在所決定的結合反應。因而，在指定免疫檢定條件下，具有特定結合特異性之抗體或結合劑結合至特定抗原，程度至少為背景之兩倍，且實質上不以顯著量結合至樣本中所存在之其他抗原。在該等條件下特異性結合至抗體或結合劑可能需要針對該抗體或藥劑對特定蛋白質之特異性加以選擇。在需要或適當時，此選擇可藉由自其他物種(例如小鼠)或其他PCSK亞型減去與(例如)PCSK9分子交叉反應的抗體來達成。可使用各種免疫檢定格式來選擇可與特定蛋白質起特異性免疫反應的抗體。例如，固相ELISA免疫檢定通常用於選擇可與蛋白質起特異性免疫反應的抗體(關於可用於測定特異免疫反應性之免疫檢定格式及條件的說明，參看例如Harlow及Lane,Using Antibodies,A Laboratory Manual(1998))。通常，特異性或選擇性結合反應將產生比背景信號高至少兩倍的信號，且更通常為比背景高至少10至100倍。
術語「平衡解離常數(KD，M)」係指由解離速率常數(kd，時間-1)除以締合速率常數(ka，時間-1M-1)所得的值。可使用此項技術中之任何已知方法量測平衡解離常數。本發明抗體之解離常數一般將為小於約10-7 M或10-8 M，例如小於約10-9 M 或10-10M，在一些實施例中小於約10-11 M、10-12 M或10-13 M。
如本文所使用之術語「抗原結合區」係指本發明之PCSK9結合分子中負責該分子與PCSK9之間的特異性結合的結構域。抗原結合區包括至少一個抗體重鏈可變區及至少一個抗體輕鏈可變區。在本發明之各PCSK9結合分子中存在有至少一個該等抗原結合區，且各抗原結合區可與其他抗原結合區相同或不同。在一些實施例中，本發明之PCSK9結合分子的至少一個抗原結合區充當PCSK9拮抗劑。
如本文所使用之術語「拮抗劑」係指能夠特異性結合靶分子並抑制其活性的藥劑。例如，PCSK9拮抗劑特異性結合至PCSK9，並完全或部分地抑制PCSK9介導之LDLR降解。抑制PCSK9介導之LDLR降解可能干擾或可能不干擾PCSK9與LDLR之結合。在一些情況下，PCSK9拮抗劑可根據其結合至PCSK9並抑制PCSK9與LDLR結合的能力來鑑別。當在暴露於本發明拮抗劑時PCSK9介導之LDLR降解與在對照物存在下或在不存在拮抗劑時PCSK9介導之降解相比減少至少約10%，例如減少至少約25%、50%、75%，或完全受抑制時，發生抑制。對照物可能不暴露於抗體或抗原結合分子、暴露於特異性結合至另一抗原之抗體或抗原結合分子，或已知不起拮抗劑作用之抗PCSK9抗體或抗原結合分子。「抗體拮抗劑」係指拮抗劑為抑制性抗體的情形。
術語「PCSK9」或「前趨蛋白轉化酶枯草溶菌素/kexin 9a型」可互換地指屬於分泌性枯草桿菌酶家族之蛋白酶K亞家族的天然存在之人類前趨蛋白轉化酶。合成出可溶酶原形式之PCSK9，其在內質網中經受自催化分子內加工且認為其充當前趨蛋白轉化酶。PCSK9在膽固醇穩衡中起作用且可能在皮層神經元分化中起作用。此PCSK9基因之突變與自體顯性家族性高膽固醇血症之一種形式相關。參看例如Burnett及Hooper,Clin Biochem Rev(2008) 29(1):11-26。PCSK9之核酸及胺基酸序列為已知的，且已分別以GenBank寄存編號NM_174936.2及NP_777596.2公開。如本文所使用，PCSK9多肽功能性結合至LDLR並促進LDLR降解。PCSK9胺基酸序列在結構上與GenBank寄存編號NP_777596.2之胺基酸序列具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。PCSK9核酸序列在結構上與GenBank寄存編號NM_174936.2之核酸序列具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。
片語「PCSK9功能獲得型突變」係指PCSK9基因中所出現之自然突變，該等突變導致及/或引起家族性高膽固醇血症表現型、加速性動脈粥樣硬化及早發性冠心病，例如由LDLR降解增強及LDLR含量降低所致。PCSK9功能獲得型基因突變之對偶基因出現率較少。參看Burnett及Hooper,Clin Biochem Rev.(2008)29(1):11-26。例示性PCSK9功能獲得型突變包括D129N、D374H、N425S及R496W。參看Fasano等人，Atherosclerosis(2009)203(1):166-71。PCSK9功能獲得型突變綜述於例如以下文獻中：Burnett及Hooper,同上文；Fasano等人，同上文；Abifadel等人，J Med Genet(2008)45(12):780-6；Abifadel等人，Hum Mutat(2009)30(4):520-9；及Li等人，Recent Pat DNA Gene Seq(2009)Nov.1(PMID 19601924)。
本發明多肽之「活性」係指多肽在其天然細胞或組織中的結構、調控或生化功能。多肽活性之實例包括直接活性及間接活性。PCSK9之例示性直接活性為與多肽直接相互作用之結果，包括結合至LDLR及PCSK9介導之LDLR降解。在PCSK9情況下，觀察到例示性間接活性為細胞、組織、器官或個體中對多肽指導之活性的表現型或反應之變化，例如肝LDLR增加減少、血漿HDL-C減少、血漿膽固醇減低、對史他汀類抑制素之敏感性增強。
當應用於核酸或蛋白質時，術語「分離」表示核酸或蛋白質基本上不含其在天然狀態下所締合之其他細胞組分。其較佳處於均質狀態。其可呈無水或水溶液形式。通常使用分析化學技術測定純度及均質性，諸如聚丙烯醯胺凝膠電泳或高效液相層析法。作為製劑中所存在之主要物質的蛋白質實質上經純化。詳言之，分離之基因係自側接該基因並編碼蛋白質而非相關基因的開放閱讀框架分離。術語「經純化」表示核酸或蛋白質在電泳凝膠中基本上產生一條帶。詳言之，其意謂核酸或蛋白質為至少85%純，更佳為至少95%純，且最佳為至少99%純。
術語「核酸」或「聚核苷酸」係指呈單股或雙股形式的脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非有特定限制，否則該術語涵蓋含有結合性質與參考核酸相似且以類似於天然存在之核苷酸之方式代謝的天然核苷酸之已知類似物的核酸。除非另外指示，否則特定核酸序列亦隱含地涵蓋其經保守修飾之變異體(例如簡併密碼子取代)、對偶基因、直系同源物、SNP及互補序列以及明確指定之序列。特定言之，簡併密碼子取代可藉由產生一或多個所選(或所有)密碼子之第三位經混合鹼基及/或脫氧肌苷殘基取代的序列來達成(Batzer等人，Nucleic Acid Res. 19:5081(1991)；Ohtsuka等人，J. Biol. Chem. 260:2605-2608(1985)；及Rossolini等人，Mol. Cell. Probes 8:91-98(1994))。
術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換地用於指胺基酸殘基之聚合物。該等術語適用於一或多個胺基酸殘基為相應天然存在之胺基酸之人工化學模擬物的胺基酸聚合物以及天然存在之胺基酸聚合物及非天然存在之胺基酸聚合物。
術語「胺基酸」係指天然存在及合成之胺基酸以及以類似於天然存在之胺基酸之方式起作用的胺基酸類似物及胺基酸模擬物。天然存在之胺基酸為由遺傳密碼子編碼之胺基酸以及後來經修飾之胺基酸，例如羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸及O-磷酸絲胺酸。胺基酸類似物係指與天然存在之胺基酸具有相同基本化學結構(亦即與氫、羧基、胺基及R基團結合之α碳)的化合物，例如高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶。該等類似物具有經修飾之R基團(例如正白胺酸)或經修飾之肽骨架，但保留與天然存在之胺基酸相同的基本化學結構。胺基酸模擬物係指具有不同於胺基酸之一般化學結構的結構但以類似於天然存在之胺基酸之方式起作用的化合物。
「經保守修飾之變異體」適用於胺基酸及核酸序列兩者。關於特定核酸序列，經保守修飾之變異體係指編碼相同或基本上相同之胺基酸序列的核酸，或在核酸不編碼胺基酸序列之情況下，係指基本上相同之序列。由於遺傳密碼子之簡併，因此大量功能上相同之核酸編碼任何指定蛋白質。舉例而言，密碼子GCA、GCC、GCG及GCU均編碼胺基酸丙胺酸。因此，在丙胺酸由密碼子指定的每個位置處，密碼子可變成任何所述之相應密碼子而不改變所編碼之多肽。該等核酸變異為「沉默變異」，其為一種經保守修飾之變異。本文中編碼多肽之每個核酸序列亦說明每種可能之核酸沉默變異。熟習此項技術者應認識到核酸中之各密碼子(除通常為甲硫胺酸之唯一密碼子之AUG及通常為色胺酸之唯一密碼子之TGG以外)可經修飾而產生功能上相同之分子。因此，編碼多肽之核酸之各沉默變異隱含於各所述序列中。
關於胺基酸序列，熟習此項技術者應認識到，對核酸、肽、多肽或蛋白質序列之個別取代、缺失或添加改變、添加或缺失所編碼序列中之單一胺基酸或較小百分比之胺基酸，其產生「經保守修飾之變異體」，其中該改變使得胺基酸經化學上相似之胺基酸取代。提供功能上相似之胺基酸的保守性取代表在此項技術中為熟知的。該等經保守修飾之變異體亦可加上且不排除本發明之多形性變異體、種間同系物及對偶基因。
以下8個群各含有作為彼此之保守性取代的胺基酸：1)丙胺酸(A)、甘胺酸(G)；2)天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)；3)天冬醯胺(N)、麩醯胺酸(Q)；4)精胺酸(R)、離胺酸(K)；5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；6)苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)；7)絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；及8)半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)(參看例如Creighton,Proteins(1984))。
藉由在比較窗上比較兩個最佳比對序列來確定「序列一致性百分比」，其中在兩個序列之最佳比對中，與不包含添加或缺失之參考序列(例如本發明之多肽)相比，比較窗中之聚核苷酸序列部分可包含添加或缺失(意即缺口)。如下計算百分比：確定兩個序列中出現相同核酸鹼基或胺基酸殘基之位置數來產生匹配位置數；將匹配位置數除以比較窗中之總位置數；並將結果乘以100以產生序列一致性百分比。
在兩個或兩個以上核酸或多肽序列之情況下，術語「一致」或「一致性」百分比係指兩個或兩個以上序列或子序列為相同序列。如使用以下序列比較算法之一或藉由手動比對及目視檢查所量測，當在比較窗或指定區域上比較並比對最大一致性時，若兩個序列具有所指定之百分比的相同胺基酸殘基或核苷酸(亦即在指定區域上，或當未指定時在參考序列之整個序列上具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)，則兩個序列「實質上一致」。本發明提供實質上分別與本文中所例示之多肽或聚核苷酸(例如SEQ ID NO:1-5、15-19及40-41中之任一者中所例示之可變區；SEQ ID NO:27-31中之任一者中所例示之可變區段；SEQ ID NO:6-14、20-26中之任一者中所例示之CDR；SEQ ID NO:32-39中之任一者中所例示之FR；及SEQ ID NO:42-45中之任一者中所例示之核酸序列)一致的多肽或聚核苷酸。視情況在至少約15、25或50個核苷酸長之區域上，或更佳在100至500或1000個或更多個核苷酸長之區域上，或在全長參考序列上存在一致性。關於胺基酸序列，可在至少5、10、15或20個胺基酸長，視情況至少約25、30、35、40、50、75或100個胺基酸長，視情況至少約150、200或250個胺基酸長之區域上，或在全長參考序列上存在一致性或實質一致性。關於較短胺基酸序列，例如具有20個或更少胺基酸之胺基酸序列，當一或兩個胺基酸殘基根據本文中所定義之保守性取代而經保守取代時，存在實質一致性。
在序列比較中，一個序列通常充當與測試序列相比較的參考序列。當使用序列比較算法時，將測試序列及參考序列輸入電腦，指定子序列座標(若必要時)且指定序列算法程式參數。可使用預設程式參數，或者可指定替代性參數。序列比較算法接著基於程式參數計算測試序列相對於參考序列之序列一致性百分比。
如本文中所用之「比較窗」包括參考具有選自由20至600、通常約50至約200、更通常約100至約150組成之群的鄰近位置數目中之任一者的區段，其中在兩個序列經最佳比對後，序列可與具有相同鄰近位置數目之參考序列相比較。用於比較之序列比對法在此項技術中為熟知的。可例如藉由Smith及Waterman(1970) Adv. Appl. Math. 2:482c之局部同源算法、Needleman及Wunsch(1970) J. Mol. Biol. 48：443之同源比對算法、Pearson及Lipman(1988) Proc.Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444之相似度搜尋法、藉由此等算法之電腦化實施(Wisconsin Genetics Software Package中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.,Madison,WI)或藉由手工比對及目視檢查(參看例如Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(1995增刊))進行用於比較之最佳序列比對。
適用於確定序列一致性及序列相似度百分比之算法的兩個實例為BLAST及BLAST 2.0算法，其分別描述於Altschul等人(1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402及Altschul等人(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410中。執行BLAST分析之軟體可由國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)公開獲得。此算法涉及首先藉由鑑別查詢序列中具有長度W之短字來鑑別高得分序列對(HSP)，當與資料庫序列中具有相同長度之字比對時，其匹配或滿足一些正值臨限得分T。T被稱為相鄰字得分臨限值(Altschul等人，同上文)。此等初始相鄰字命中(word hit)充當起始搜尋之種子以發現含有其之較長HSP。該等字命中沿各序列雙向延伸直至累積比對分數可增加。對於核苷酸序列，使用參數M(一對匹配殘基之獎勵分數；始終>0)及N(錯配殘基之懲罰分數；始終<0)計算累積分數。對於胺基酸序列，使用得分矩陣計算累積分數。字命中在各方向上之延伸可在下列情況下中止：累積比對分數自其最大獲得值下降量X；歸因於一或多個負得分殘基比對之累積，累積分數趨於零或零以下；或達到任一序列之末端。BLAST算法參數W、T及X決定比對之靈敏度及速度。BLASTN程式(對於核苷酸序列)使用字長(W)11、期望值(E)10、M=5、N=-4及兩股之比較作為預設值。對於胺基酸序列，BLASTP程式使用字長3及期望值(E)10、及BLOSUM62得分矩陣(參看Henikoff及Henikoff(1989),Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915)比對(B)50、期望值(E)10、M=5、N=-4及兩股之比較作為預設值。
BLAST算法亦執行兩個序列之間相似度的統計分析(參看例如Karlin及Altschul(1993),Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787)。由BLAST算法所提供之一個相似度量度為最小和概率(P(N))，其提供兩個核苷酸或胺基酸序列之間會偶然發生匹配的概率指標。舉例而言，若在測試核酸與參考核酸之比較中最小和概率小於約0.2，更佳小於約0.01，且最佳小於約0.001，則認為該核酸與參考序列相似。
兩個核酸序列或多肽實質上相同之一個指標為由第一核酸所編碼之多肽可與針對由第二核酸所編碼之多肽而產生之抗體起免疫交叉反應，此如下文所述。因而，例如若某一多肽與第二多肽的不同之處僅在於保守取代，則兩個肽通常實質上相同。兩個核酸序列實質上相同的另一指標為兩個分子或其互補序列在嚴格條件下與彼此雜交，此如下文所述。兩個核酸序列實質上相同的又一指標為可使用相同引子來擴增序列。
當在描述抗原結合區如何連接於本發明之PCSK9結合分子內的內容中使用時，術語「連接」涵蓋物理接合該等區域之所有可能方式。眾多抗原結合區常常由化學鍵接合，諸如共價鍵(例如肽鍵或二硫鍵)或非共價鍵，可能為直接鍵(亦即在兩個抗原結合區之間無連接子)或間接鍵(亦即在兩個或兩個以上抗原結合區之間藉助於至少一個連接子分子)。
術語「個體(subject/individual)」及「患者」可互換地指哺乳動物，例如人類或非人類靈長類哺乳動物。哺乳動物亦可為實驗室哺乳動物，例如小鼠、大鼠、兔、倉鼠。在一些實施例中，哺乳動物可能為農業哺乳動物(例如馬、綿羊、牛、豬、駱駝)或家養哺乳動物(例如犬、貓)。
術語「治療上可接受之量」或「治療有效劑量」可互換地指足以實現所要結果(亦即減少血漿非HDL-C、高膽固醇血症、動脈粥樣硬化、冠心病)之量。在一些實施例中，治療上可接受之量不誘致或導致不理想之副作用。可藉由首先投與低劑量，接著逐漸增加該劑量直至達成所要效應來確定治療上可接受之量。本發明之PCSK9拮抗型抗體之「預防有效劑量」及「治療有效劑量」分別可防止與PCSK9存在相關之疾病症狀發作或使與PCSK9存在相關之疾病症狀的嚴重程度降低。該等術語分別亦可提高或增加無疾病症狀之出現頻率及持續時間。「預防有效劑量」或「治療有效劑量」分別亦可預防或改善因由PCSK9活性所導致之病症及疾病所致的損傷或失能。
術語「共同投與」係指在個體血液中同時存在兩種活性劑。共同投與之活性劑可同時或依序遞送。
如本文所使用之片語「基本上由...組成」係指在方法或組合物中包括特定類屬或種類之活性藥劑，以及出於該等方法或組合物之指定目的不具活性的任何賦形劑。在一些實施例中，片語「基本上由...組成」明確排除包括除本發明之拮抗劑抗PCSK9抗體以外的一或多種其他活性劑。在一些實施例中，片語「基本上由...組成」明確排除包括除本發明之拮抗劑抗PCSK9抗體及共同投與之第二藥劑以外的一或多種其他活性劑。
術語「史他汀類抑制素」係指作為3-羥基-3-甲基戊二醯基輔酶A(HMG-CoA)還原酶之競爭性抑制物的一類藥劑。
1.引言
本發明之抗體及抗原結合分子特異性結合至前趨蛋白轉化酶枯草溶菌素/kexin 9a型(「PCSK9」)。本發明之抗PCSK9抗體及抗原結合分子結合至PCSK9之C-末端，且意外地具有干擾PCSK9介導之低密度脂蛋白受體(LDL-R)降解而不干擾PCSK9與LDL-R之結合的性質。詳言之，抗PCSK9抗體及抗原結合分子結合至PCSK9之殘基680-692內的抗原決定基，例如位於PCSK9 C末端之胺基酸序列RSRHLAQASQELQ(SEQ ID NO:49)內的抗原決定基。由於本發明之抗體及抗原結合分子在結合於細胞上時結合至PCSK9而不是僅結合於循環PCSK9，因此其在患者體內之活體內半衰期相對較長，例如至少約7天或更久，且在一些實施例中在投藥後的至少兩週內提供降脂質效應。本發明之抗PCSK9抗體及抗原結合分子為PCSK9拮抗劑，因為其防止、減少及/或抑制PCSK9介導之LDL-R降解，從而促進低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)攝取增加。抗PCSK9抗體及抗原結合分子可用於治療患有例如血脂異常、高膽固醇血症、三酸甘油酯血症及其他PCSK9介導之疾病病狀的個體。
2.改良之一般抗PCSK9抗體
抗PCSK9抗體片段可藉由此項技術中已知之任何方式產生，包括(但不限於)重組表現、化學合成及抗體四聚物之酶消化，而全長單株抗體可藉由例如融合瘤或重組產生來獲得。重組表現可來自於此項技術已知之任何適當宿主細胞，例如哺乳動物宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆蟲宿主細胞等。當存在時，抗PCSK9抗體之恆定區在適當時可為任何類型或亞型，且可選自欲用本發明方法治療之個體物種，例如人類、非人類靈長類或其他哺乳動物，例如農業哺乳動物(例如馬、綿羊、牛、豬、駱駝)、家養哺乳動物(例如犬、貓)或齧齒動物(例如大鼠、小鼠、倉鼠、兔)。在一些實施例中，抗PCSK9抗體經人類化或為HumaneeredTM。在一些實施例中，恆定區同型為IgG，例如IgG1。在一些實施例中，人類IgG1恆定區經突變以降低對細胞或補體C1組分上之效應子配位體(諸如Fc受體(FcR)，例如FcγR1)的結合親和力。參看例如美國專利第5,624,821號。含有該等突變之抗體介導降低或沒有抗體依賴性細胞毒性(ADCC)或補體依賴性細胞毒性(CDC)。在一些實施例中，IgGl恆定區之胺基酸殘基L234及L235被取代為Ala234及Ala235。重鏈恆定區中之殘基編號為EU指數編號(參看Kabat等人，(1983)「Sequences of Proteins of Immunological Interest」，美國健康與人類服務部(U.S. Dept. Health and Human Services))。亦參看例如Woodle等人，Transplantation(1999)68(5):608-616；Xu等人，Cell Immunol(2000)200(1):16-26；及Hezareh等人，J Virol 75(24):12161-8。
本發明之抗PCSK9抗體或抗原結合分子亦包括具有駱駝骨架的單域抗原結合單元。駱駝家族中之動物包括駱駝、美洲駝及羊駝。駱駝產生缺乏輕鏈之功能性抗體。重鏈可變(VH)域自發摺疊並獨立地充當抗原結合單元。相較於經典抗原結合分子(Fab)或單鏈可變片段(scFv)中之六個CDR，其結合表面僅涉及三個CDR。駱駝抗體能夠獲得相當於習知抗體的結合親和力。本文中所例示之具有抗PCSK9抗體結合特異性的基於駱駝骨架之抗PCSK9分子可使用此項技術熟知之方法產生，例如Dumoulin等人，Nature Struct. Biol. 11:500-515,2002；Ghahroudi等人，FEBS Letters 414:521-526,1997；及Bond等人，J Mol Biol.332:643-55,2003。
本發明之改良之抗PCSK9抗體為具有與人類生殖系V區序列具有實質胺基酸序列一致性的V區序列同時保留參考抗體之特異性及親和力的經工程改造之人類抗體。參看美國專利公開案第2005/0255552號及美國專利公開案第2006/0134098號，二者均以引用的方式併入本文中。改良過程自參考抗體之可變區鑑別確定抗原結合特異性所需之最小序列資訊，並將該資訊轉移至人類部分V區基因序列集合庫，以產生聚焦於抗原決定基之人類抗體V區集合庫。可使用基於微生物之分泌系統，使集合庫成員表現為抗體Fab片段，並篩選集合庫中與抗原結合之Fab，例如使用群落移接結合檢定。參看例如美國專利公開案第2007/0020685號。可進一步判別陽性純系，以鑑別具有最高親和力的純系。所得經工程改造之人類Fab保留親本參考抗PCSK9抗體之結合特異性，通常與親本抗體相比對抗原具有等同或較高之親和力，且具有與人類生殖系抗體V區相比具有高度序列一致性的V區。
為產生聚焦於抗原決定基之集合庫所需的最小結合特異性決定子(BSD)通常以重鏈CDR3(「CDRH3」)內之序列及輕鏈CDR3(「CDRL3」)內之序列為代表。BSD可包含CDR3之部分或全部長度。BSD可包含鄰接或非鄰接胺基酸殘基。在一些情況下，聚焦於抗原決定基之集合庫係由連接至含有BSD之參考抗體之獨特CDR3-FR4區的人類V區段序列及人類生殖系J區段序列構築(參看美國專利公開案第2005/0255552號)。或者，人類V區段集合庫可藉由依序卡匣置換來產生，其中最初僅部分參考抗體V區段被人類序列集合庫置換。在剩餘參考抗體胺基酸序列之情況下支持結合的所鑑別之人類「卡匣」接著在第二次集合庫篩選中重組而產生完全人類V區段(參看美國專利公開案第2006/0134098號)。
在各情況下，含有來自參考抗體之特異性決定子的配對之重鏈及輕鏈CDR3區段、CDR3-FR4區段或J區段係用於限制結合特異性，使得獲自該集合庫之抗原結合劑保留參考抗體之抗原決定基特異性。可在集合庫構築期間在各鏈之CDR3區中引入其他突變性變化，以便鑑別具有最佳結合動力學之抗體。所得經工程改造之人類抗體具有來源於人類生殖系集合庫之V區段序列，保留來自CDR3區內之短BSD序列，且具有人類生殖系構架4(FR4)區。
因此，在一些實施例中，抗PCSK9抗體含有來源於起始或參考單株抗體之重鏈及輕鏈CDR3內之最小結合序列決定子(BSD)。重鏈及輕鏈可變區之其餘序列(CDR及FR)，例如V區段及J區段，來自於相應人類生殖系及親和力成熟胺基酸序列。V區段可選自人類V區段集合庫。可藉由親和力成熟實現進一步序列改進。
在另一實施例中，抗PCSK9抗體之重鏈及輕鏈含有來自相應人類生殖系序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3)(例如選自人類V區段集合庫)之人類V區段，及來自起始單株抗體之CDR3-FR4序列區段。CDR3-FR4序列區段可藉由用相應人類生殖系序列置換序列區段及/或藉由親和力成熟進一步改進。例如，可用相應人類生殖系序列置換圍繞BSD之FR4及/或CDR3序列，同時保留來自起始單株抗體之CDR3的BSD。
在一些實施例中，重鏈V區段之相應人類生殖系序列為Vh1-02。在一些實施例中，重鏈J區段之相應人類生殖系序列為JH4。在一些實施例中，重鏈J區段包含人類生殖系JH4部分序列WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:50)。來自人類生殖系JH4之全長J區段為YFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:51)。根據免疫球蛋白可變區基因之標準命名法提及可變區基因。當前免疫球蛋白基因資訊可經由全球資訊網獲得，例如ImMunoGeneTics(IMGT)、V-base及PubMed資料庫。亦參看Lefranc,Exp Clin Immunogenet. 2001;18(2):100-16；Lefranc,Exp Clin Immunogenet. 2001;18(3):161-74；Exp Clin Immunogenet. 2001;18(4):242-54；及Giudicelli等人，Nucleic Acids Res. 2005 Jan 1;33(Database issue):D256-61。
在一些實施例中，輕鏈V區段之相應人類生殖系序列為VK3 L6。在一些實施例中，輕鏈J區段之相應人類生殖系序列為Jk2。在一些實施例中，輕鏈J區段包含人類生殖系Jk2部分序列FGQGTKLEIK(SEQ ID NO:52)。來自人類生殖系Jk2之全長J區段為YTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:53)。
在一些實施例中，重鏈V區段與胺基酸序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFS(D/T)MYMSWVRQAPGQGLEWMGRIDPAN(A/E/G)HTNY(A/D)(P/Q)KFQ(A/G)RVTMTRDTSISTAYMELSRLTSDDTAVYYCAR(SEQ ID NO:28)具有至少85%、89%、90%、93%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，重鏈V區段與胺基酸序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSTMYMSWVRQAPGQGLEWMGRIDPANEHTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLTSDDTAVYYCAR(SEQ ID NO:27)具有至少85%、89%、90%、93%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。
在一些實施例中，輕鏈V區段與胺基酸序列(E/Q)IV(L/M)TQSPATLSVSPGERATLSC(R/S)AS(Q/S)SVSYMHWYQQKPGQAPRLLIY(G/L)(T/V)F(N/R)(L/R)A(S/T)GIPDRFSGSGSGTDFTLTIGRLEPEDFAVYYC(SEQ ID NO:31)具有至少85%、89%、90%、93%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，重鏈V區段與胺基酸序列QIVLTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSYMHWYQQKPGQAPRLLIYGVFRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTIGRLEPEDFAVYYC(SEQ ID NO:29)具有至少85%、89%、90%、93%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，重鏈V區段與胺基酸序列EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSYMHWYQQKPGQAPRLLIYGVFRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTIGRLEPEDFAVYYC(SEQ ID NO:30)具有至少85%、89%、90%、93%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。
在一些實施例中：
i)重鏈CDR3包含胺基酸序列SYYYY(A/N)MD(A/F/S/V/Y)(SEQ ID NO:14)；且
ii)輕鏈CDR3可變區包含胺基酸序列LQWSSDPPT(SEQ ID NO:26)。
在一些實施例中：
i)　重鏈CDR3包含選自由SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:13組成之群的胺基酸序列；且
ii)　輕鏈CDR3包含胺基酸序列SEQ ID NO:26。
在一些實施例中，本發明抗體包含包含以下之重鏈可變區：包含胺基酸序列(D/T)MYMS(SEQ ID NO:8)之CDR1；包含胺基酸序列RIDPAN(A/E/G)HTNY(A/D)(P/Q)KFQ(A/G)(SEQ ID NO:11)之CDR2；及包含胺基酸序列SYYYY(A/N)MD(A/F/S/V/Y)(SEQ ID NO:14)之CDR3。
在一些實施例中，本發明抗體包含包含以下之輕鏈可變區：包含胺基酸序列(R/S)AS(Q/S)SVSYMH(SEQ ID NO:22)之CDR1；包含胺基酸序列(G/L)(T/V)F(N/R)(L/R)A(S/T)(SEQ ID NO:25)之CDR2；及包含胺基酸序列LQWSSDPPT(SEQ ID NO:26)之CDR3。
在一些實施例中，重鏈可變區包含以下：包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列的FR1；包含SEQ ID NO:33之胺基酸序列的FR2；包含SEQ ID NO:34之胺基酸序列的FR3；及包含SEQ ID NO:35之胺基酸序列的FR4。所鑑別之胺基酸序列可能具有一或多個經取代之胺基酸(例如來自親和力成熟)或一或兩個經保守取代之胺基酸。
在一些實施例中，輕鏈可變區包含以下:包含SEQ ID NO:36之胺基酸序列的FR1；包含SEQ ID NO:37之胺基酸序列的FR2；包含SEQ ID NO:38之胺基酸序列的FR3；及包含SEQ ID NO:39之胺基酸序列的FR4。所鑑別之胺基酸序列可能具有一或多個經取代之胺基酸(例如來自親和力成熟)或一或兩個經保守取代之胺基酸。
本發明之抗PCSK9抗體的可變區在其全長上一般將與相應人類生殖系可變區胺基酸序列具有至少約85%之總體可變區(例如FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)胺基酸序列一致性，例如至少約89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。例如，抗PCSK9抗體之重鏈可與人類生殖系可變區Vh1-02具有至少約85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性。抗PCSK9抗體之輕鏈可與人類生殖系可變區VK3 L6具有至少約85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性。在一些實施例中，僅構架區內之胺基酸經添加、缺失或取代。在一些實施例中，序列一致性比較排除CD3。
在一些實施例中，本發明之抗PCSK9抗體包含與SEQ ID NO:40之重鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的重鏈可變區，且包含與SEQ ID NO:41之輕鏈可變區(亦即共同序列)具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的輕鏈可變區。
在一些實施例中，本發明之抗PCSK9抗體包含與SEQ ID NO:1之重鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的重鏈可變區，且包含與SEQ ID NO:15之輕鏈可變區(亦即小鼠LFU720)具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的輕鏈可變區。
在一些實施例中，本發明之抗PCSK9抗體包含與SEQ ID NO:2之重鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的重鏈可變區，且包含與SEQ ID NO:16之輕鏈可變區(亦即LGT-209)具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的輕鏈可變區。
在一些實施例中，本發明之抗PCSK9抗體包含與SEQ ID NO:2之重鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的重鏈可變區，且包含與SEQ ID NO:18之輕鏈可變區(亦即LGT-210)具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的輕鏈可變區。
在一些實施例中，本發明之抗PCSK9抗體包含與SEQ ID NO:4之重鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的重鏈可變區，且包含與SEQ ID NO:16之輕鏈可變區(亦即LGT-211)具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的輕鏈可變區。
在一些實施例中，本發明之抗PCSK9抗體包含與SEQ ID NO:3之重鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的重鏈多肽，且包含與SEQ ID NO:17之輕鏈可變區(亦即LGT-209)具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的輕鏈多肽。
在一些實施例中，本發明之抗PCSK9抗體包含與SEQ ID NO:3之重鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的重鏈多肽，且包含與SEQ ID NO:19之輕鏈可變區(亦即LGT-210)具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的輕鏈多肽。
在一些實施例中，本發明之抗PCSK9抗體包含與SEQ ID NO:5之重鏈可變區具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的重鏈多肽，且包含與SEQ ID NO:17之輕鏈可變區(亦即LGT-211)具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的輕鏈多肽。
對於所鑑別的長度小於20個胺基酸之胺基酸序列，可容許一或兩個保守性胺基酸殘基取代同時仍保留所要特異性結合及/或拮抗活性。
本發明之抗PCSK9抗體結合PCSK9之平衡解離常數(KD)一般將為小於約10-8 M或10-9 M，例如小於約10-10 M或10-11 M，在一些實施例中小於約10-12 M或10-13 M。
抗PCSK9抗體可根據本發明之方法視情況進行多聚及使用。抗PCSK9抗體可能為全長四聚抗體(亦即具有兩個輕鏈及兩個重鏈)、單鏈抗體(例如scFv)，或包含形成一或多個抗原結合位點並賦予PCSK9結合特異性之抗體片段的分子，例如包含重鏈及輕鏈可變區(舉例而言，Fab'或其他相似片段)。
本發明進一步提供編碼本文所述之抗體的聚核苷酸，例如編碼重鏈或輕鏈可變區或包含如本文所述之互補決定區之區段的聚核苷酸。在一些實施例中，編碼重鏈之聚核苷酸與選自由SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43及SEQ ID NO:54組成之群的聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。在一些實施例中，編碼輕鏈之聚核苷酸與選自由SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45及SEQ ID NO:55組成之群的聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。
在一些實施例中，編碼重鏈之聚核苷酸與SEQ ID NO:42之聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。在一些實施例中，編碼輕鏈之聚核苷酸與SEQ ID NO:45之聚核苷酸(亦即LGT-209)具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。
在一些實施例中，編碼重鏈之聚核苷酸與選自由SEQ ID NO:42組成之群的聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。在一些實施例中，編碼輕鏈之聚核苷酸與選自由SEQ ID NO:44組成之群的聚核苷酸(亦即LGT-210)具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。
在一些實施例中，編碼重鏈之聚核苷酸與選自由SEQ ID NO:43組成之群的聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。在一些實施例中，編碼輕鏈之聚核苷酸與選自由SEQ ID NO:45組成之群的聚核苷酸(亦即LGT-211)具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。
在一些實施例中，編碼重鏈之聚核苷酸與SEQ ID NO:54之聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。在一些實施例中，編碼輕鏈之聚核苷酸與SEQ ID NO:55之聚核苷酸(亦即小鼠LFU720)具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。
3.用於鑑別抗PCSK9抗體之檢定
可藉由產生抗PCSK9抗體，接著測試各抗體減少或抑制PCSK9介導之事件(例如結合至LDLR、促進LDLR降解)的能力來鑑別拮抗劑抗體。該等檢定可在活體外或活體內進行。較佳抗體結合至PCSK9，不防止PCSK9結合至LDLR，且減少或抑制PCSK9介導之LDLR降解。
抗體或抗原結合分子與PCSK9之結合可使用此項技術已知之任何方法加以測定，包括(但不限於)ELISA、Biacore及西方墨點法。
亦可使用此項技術已知之任何方法量測PCSK9介導之LDLR降解。在一實施例中，使用輸注小鼠模型測定抗PCSK9抗體或抗原結合分子抑制LDLR降解之能力。經靜脈內向小鼠中輸注抗PCSK9抗體或抗原結合分子(例如3μg/h)，並測定在肝膜製備物中之LDLR含量，與來自已接收經靜脈內輸注之對照抗體(例如結合至無關抗原之抗體)的小鼠之肝膜製備物中的LDLR含量相比較。與已接收對照抗體之小鼠相比，已接收拮抗型抗PCSK9抗體之小鼠將具有更高可偵測LDLR含量，例如高至少10%、20%、50%、80%、100%。
亦可測試抗PCSK9拮抗劑抗體在降低LCL-C、非HDL-C及/或總膽固醇之血漿含量方面的治療功效。抗PCSK9抗體或抗原結合分子經靜脈內輸注至哺乳動物(例如小鼠、大鼠、非人類靈長類動物、人類)中，並測定LCL-C、非HDL-C及/或總膽固醇之含量，與在治療前得自同一哺乳動物之LCL-C、非HDL-C及/或總膽固醇之含量或來自已接收經靜脈內輸注之對照抗體(例如結合至無關抗原的抗體)之哺乳動物的LCL-C、非HDL-C及/或總膽固醇之含量相比較。與處理前之哺乳動物或已接收對照抗體之哺乳動物相比，已接收拮抗型抗PCSK9抗體之哺乳動物將具有更低可偵測LCL-C、非HDL-C及/或總膽固醇血漿含量，例如低至少10%、20%、50%、80%、100%。
4.包含抗PCSK9抗體之組合物
本發明提供包含本發明抗PCSK9抗體或抗原結合分子與醫藥學上可接受之載劑一起調配的醫藥組合物。該組合物可另外含有適合治療或預防指定病症的其他治療劑。醫藥載劑增強組合物或使組合物穩定或有助於製備組合物。醫藥學上可接受之載劑包括生理上相容之溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑及其類似物。
可藉由此項技術已知之各種方法投與本發明之醫藥組合物。投藥途徑及/或模式視所要結果而變化。經靜脈內、經肌肉內、經腹膜內或經皮下投藥或投與靶部位附近較佳。醫藥學上可接受之載劑應適合經靜脈內、經肌肉內、經皮下、非經腸、經鼻內、吸入、經脊椎或經表皮投藥(例如藉由注射或輸注)。視投藥途徑而定，可將活性化合物(亦即抗體、雙特異性及多特異性分子)包覆於物質中以保護該化合物免受酸作用及可能使化合物鈍化之其他天然條件影響。
抗體可單獨或與其他適合組分組合製成氣霧劑調配物(亦即其可能「霧化」)以經由吸入投與。氣霧劑調配物可置入可接受之加壓推進劑中，諸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮氣及其類似物。
在一些實施例中，組合物無菌且為流體。例如，可藉由使用諸如卵磷脂之包衣、藉由在分散液情況下維持所需粒徑及藉由使用界面活性劑來維持適當流動性。在許多情況下，組合物中較佳包括等滲劑，例如糖、諸如甘露糖醇或山梨糖醇之多元醇及氯化鈉。可藉由在組合物中包括延遲吸收之藥劑(例如單硬脂酸鋁或明膠)而達成可注射組合物之長期吸收。
可根據熟知及此項技術中慣常實施之方法製備本發明醫藥組合物。醫藥學上可接受之載劑部分地由所投與之特定組合物以及用於投與該組合物之特定方法來確定。因此，存在多種適合之本發明醫藥組合物之調配物。可在例如以下文獻中獲得調配抗體及確定適當給藥及時程的適用方法：Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版，University of the Sciences in Philadelphia,編，Lippincott Williams & Wilkins(2005)；及Martindale: The Complete Drug Reference,SWeetman,2005,London: Pharmaceutical Press.；及Martindale,Martindale: The Extra Pharmacopoeia,第31版，1996,Amer Pharmaceutical Assn；及Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R. Robinson,編，Marcel Dekker,Inc.,New York,1978，各文獻係以引用的方式併入本文中。較佳在GMP條件下製造醫藥組合物。治療有效劑量或有效劑量之抗PCSK9抗體通常用於本發明之醫藥組合物中。藉由熟習此項技術者已知之習知方法將抗PCSK9抗體調配成醫藥學上可接受之劑型。調節給藥方案以提供所要反應(例如治療反應)。在確定治療有效量或預防有效量時，可投與低劑量，接著逐漸增加，直至在不需要之副反應最小或不存在的情況下達成所要反應。例如，可投與單一大丸劑；可隨時間投與若干分次劑量；或可按治療情況之緊急程度所指示按比例減小或增加劑量。出於投藥簡便性及劑量均一性考慮，將非經腸組合物調配成單位劑型尤其有利。如本文中所用之單位劑型係指適合作為單位劑量用於欲治療之個體的物理個別單位；各單位含有與所需醫藥載劑締合之經計算以產生所要治療效應之預定量活性化合物。
可改變本發明醫藥組合物中之活性成分的實際劑量濃度以便獲得在對患者無毒性之情況下針對特定患者、組合物及投藥方式有效達成所要治療反應的活性成分之量。所選劑量濃度視多種藥物動力學因素而定，包括本發明所採用之特定組合物或其酯、鹽或醯胺之活性、投藥途徑、投藥時間、所採用之特定化合物之排泄速率、治療持續時間、與所採用之特定組合物組合使用之其他藥物、化合物及/或材料、所治療患者之年齡、性別、體重、病狀、一般健康狀況及先前病史及其類似因素。
在一些實施例中，醫藥組合物包含抗PCSK9抗體或抗原結合分子與第二醫藥劑之混合物。例如，組合物可包含本發明之抗PCSK9抗體或抗原結合分子及已知有益於降低膽固醇(包括LDL-C、非HDL-C及總膽固醇)及/或升高HDL-C的藥劑。
與本發明之抗PCSK9拮抗劑抗體或抗原結合分子一起包括在混合物中的例示性第二藥劑包括(但不限於)HMG-CoA還原酶抑制劑(亦即史他汀類抑制素)、纖維酸酯(例如安妥明(clofibrate)、吉非羅齊(gemfibrozil)、非諾貝特(fenofibrate)、環丙貝特(ciprofibrate)、苯紮貝特(bezafibrate))、菸鹼酸及其類似物、膽固醇吸收抑制劑、膽汁酸螯合劑(例如消膽胺、考來替潑(colestipol)、考來維侖(colesvelam))、回腸膽汁酸轉運(IBAT)抑制劑、甲狀腺激素模擬物(例如化合物KB2115)、微粒體三酸甘油酯轉移蛋白(MTP)抑制劑、雙過氧化質體增殖物激活受體(PPAR)α及γ激動劑、醯基CoA：二醯基甘油醯基轉移酶(DGAT)抑制劑、醯基CoA：膽固醇醯基轉移酶(ACAT)抑制劑、Niemann Pick C1類似物1(NPC1-L1)抑制劑(例如依澤麥布(ezetimibe))、ATP結合卡匣(ABC)蛋白G5或G8之激動劑、膽固醇酯轉移蛋白(CETP)抑制劑、靶向PCSK9之抑制性核酸及靶向apoB100之抑制性核酸。降脂劑為此項技術中已知的，且描述於例如以下文獻中：Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics，第11版，Brunton,Lazo及Parker，編，McGraW-Hill(2006)；2009 Physicians' Desk Reference(PDR)，例如第63版(2008),Thomson PDR。
適用於本發明組合物中之其他降脂劑描述及/或綜述於例如以下文獻中：Chang等人，Curr Opin Drug Disco Devel(2002) 5(4):562-70；Sudhop等人，Drugs(2002) 62(16):2333-47；Bays及Stein,Expert Opin Pharmacother(2003) 4(11):1901-38；Kastelein,Int J Clin Pract Suppl(2003) Mar(134):45-50；Tomoda及Omura,Pharmacol Ther(2007) 115(3):375-89；Tenenbaum等人，Adv Cardiol(2008) 45:127-53:Tomkin,Diabetes Care(2008) 31(2):S241-S248；Lee等人，J Microbiol Biotechnol(2008) 18(11):1785-8；Oh等人，Arch Pharm Res(2009) 32(1):43-7；Birch等人，J Med Chem(2009) 52(6):1558-68；及Baxter及Webb,Nature Reviews Drug Discovery(2009) 8:308-320。
在一些實施例中，本發明之抗PCSK9抗體或抗原結合分子係以與史他汀類抑制素之混合物的形式提供。例示性史他汀類抑制素包括(但不限於)阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、羅素他汀及辛伐他汀。
在一些實施例中，本發明之抗PCSK9抗體或抗原結合分子係以與會誘導高膽固醇血症或三酸甘油酯血症之醫藥劑之混合物的形式提供。例如，第二醫藥劑可能為蛋白酶抑制劑，例如沙奎那韋(Saquinavir)、利托那韋(Ritonavir)、茚地那韋(Indinavir)、奈非那韋(Nelfinavir)、安普那韋(Amprenavir)、咯匹那韋(Lopinavir)、阿紮那韋(Atazanavir)、夫沙那韋(Fosamprenavir)、替拉那韋(Tipranavir)、地瑞那韋(Darunavir)、阿巴卡韋-拉米夫定-齊多夫定(abacavir-lamivudine-zidovudine)(Trizivir)。在一些實施例中，該第二醫藥劑為他克莫司(Tacrolimus)。
5.　使用抗PCSK9抗體之方法
a.　欲用抗PCSK9抗體治療之病狀
本發明之抗PCSK9拮抗劑抗體及抗原結合分子可用於治療由PCSK9活性或過度活性所介導之任何疾病病狀。
例如，因許多原因或病因而患有血脂異常或高膽固醇血症或處於患上血脂異常或高膽固醇血症之風險下的個體可能受益於投與本發明之抗PCSK9拮抗劑抗體及抗原結合分子。例如，個體可能患有家族性或遺傳散播性同種接合子或異種接合子高膽固醇血症，其中存在功能性LDL-R。與家族性或遺傳性高膽固醇血症相關及/或導致家族性或遺傳性高膽固醇血症的遺傳突變概括於例如以下文獻中：Burnett及Hooper,Clin Biochem Rev(2008) 29(1):11-26。個體亦會患有其他疾病病狀或參與會促成或增加患上血脂異常或高膽固醇血症之風險的行為。例如，個體可能肥胖，或患有糖尿病或代謝性症候群。個體可能為吸菸者、具有久坐生活方式，或食用高膽固醇飲食。
靶向PCSK9適用於降低、逆轉、抑制或預防血脂異常、高膽固醇血症及餐後三酸甘油酯血症。參看例如Le May等人，Arterioscler Thromb Vasc Biol(2009) 29(5):684-90；Seidah,Expert Opin Ther Targets(2009) 13(1):19-28；及Poirier等人，J Biol Chem(2009) PMID 19635789。因此，投與本發明之抗PCSK9拮抗劑抗體及抗原結合分子可用於降低、逆轉、抑制及預防有需要之個體之血脂異常、高膽固醇血症及餐後三酸甘油酯血症。
本發明之抗PCSK9拮抗劑抗體及抗原結合分子可用於減少或降低有需要之個體的低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。該個體可能具有持續性升高之LDL-C含量。在一些實施例中，該個體之LDL-C血漿含量一貫高於80 mg/dL，例如高於約90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190 mg/dL，或更高。本發明之抗PCSK9拮抗劑抗體及抗原結合分子亦可用於減少或降低有需要之個體的非高密度脂蛋白膽固醇(非HDL-C)或總膽固醇。
個體可能已服用另一種醫藥劑來降低膽固醇，且對此藥劑具有抗性或不耐受此藥劑。例如，對個體可能已採用一種史他汀類抑制素治療方案，該方案可能已被證明在此個體中在將LDL-C、非HDL-C或總膽固醇降低至可接受程度的方面無效。個體亦可能不耐受史他汀類抑制素之投與。本發明之抗PCSK9拮抗劑抗體及抗原結合分子與適用於降低LDL-C或非HDL-C及/或升高HDL-C之第二藥劑組合投與將例如藉由允許降低第二藥劑之投與劑量來改良第二藥劑之有效性及耐受性。
在一些實施例中，個體在PCSK9基因中具有功能獲得型突變，該突變導致例如LDLR降解異常增加。
在一些實施例中，個體接收會誘導血脂異常或高膽固醇血症之醫藥劑，亦即個體患有藥物誘導之血脂異常或高膽固醇血症。例如，個體可接收蛋白酶抑制劑之治療方案，例如用於治療HIV感染。已知會導致血漿三酸甘油酯含量升高之另一醫藥劑為他克莫司，一種投與移植患者之免疫抑制藥物。環孢菌素已顯示顯著增加LDL。參看例如Ballantyne等人(1996)78(5):532-5。第二代抗精神病藥(例如阿立哌唑(aripiprazole)、氯氮平(clozapine)、奧氮平(olanzapine)、奎硫平(quetiapine)、利螺環酮(risperidone)及齊拉西酮(ziprasidone))亦已與血脂異常相關。參看例如Henderson,J Clin Psychiatry(2008)69(2):e04及Brooks等人，Curr Psychiatry Rep(2009)11(1):33-40。
b.　抗PCSK9抗體之投與
醫師或獸醫可以低於達成所要治療效果所需之劑量的劑量開始投與以醫藥組合物形式採用之本發明抗體，且逐步增加劑量直至達成所要效果。一般而言，本發明組合物之有效劑量視許多不同因素而變化，包括欲治療之特定疾病或病狀、投藥方式、靶部位、患者之生理狀態、患者是人類還是動物、所投與之其他藥物，及治療是預防性的還是治療性的。需要滴定治療劑量以優化安全及功效。關於抗體之投與，劑量範圍在約0.0001至100毫克/公斤宿主體重範圍內，且更通常為0.01至5毫克/公斤宿主體重。例如，劑量可能為1毫克/公斤體重或10毫克/公斤體重或在1-10毫克/公斤體重範圍內。視需要或要求而定，可每日、每週、每兩週、每月，或者更頻繁或較不頻繁地給藥。例示性治療方案需要每週投藥一次、每兩週投藥一次或一月投藥一次或每三至六個月投藥一次。
在一些實施例中，投與編碼本發明之抗PCSK9抗體或抗原結合分子的聚核苷酸。在藥劑為核酸之實施例中，典型劑量可介於約0.1毫克/公斤體重至高達且包括約100毫克/公斤體重範圍內，例如約1毫克/公斤體重至約50毫克/公斤體重。在一些實施例中，約1、2、3、4、5、10、15、20、30、40或50毫克/公斤體重。
抗體可以單次或分次劑量形式投與。抗體通常以多次投與。單次劑量之間的間隔可能為每週、每兩週、每月或每年，視需要或要求而定。間隔亦可視量測患者中抗PCSK9抗體之血液含量所指示而為不定期的。在某些方法中，調節劑量以達成1-1000 μg/ml之血漿抗體濃度，且在某些方法中為25-300 μg/ml。或者，抗體可以持續釋放調配物形式投與，在該狀況下，需要較不頻繁之投藥。劑量及頻率視抗體在患者體內之半衰期而變化。一般而言，人類化抗體顯示比嵌合抗體及非人類抗體更長之半衰期。投藥劑量及頻率可視治療是預防性的還是治療性的而變化。在預防性應用中，經較長時段以相對不頻繁之間隔投與相對較低之劑量。一些患者在其餘生中繼續接受治療。在治療性應用中，有時需要以相對較短間隔投與相對較高劑量，直至疾病進展降低或終止，且較佳直至患者顯示疾病症狀部分或完全改善。其後，可向患者投與預防性療法。在一些實施例中，當患者之血漿LDL-C含量上升超過預定臨限值(例如至少約80 mg/dL，例如至少約90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190 mg/dL或更高)時，投與抗PCSK9抗體或抗原結合劑。
c.　與第二藥劑一起共同投與
PCSK9抗體拮抗劑可與已知有益於降低膽固醇(包括LDL-C、非HDL-C及總膽固醇)及/或升高HDL-C之藥劑組合使用。
活性劑可以與抗PCSK9拮抗劑抗體之混合物的形式一起投藥，或各藥劑可獨立投與。抗體藥劑及其他活性劑可能但不必同時投與。
用於與本發明之抗PCSK9拮抗劑抗體或抗原結合分子共同投與之例示性第二藥劑包括(但不限於)HMG-CoA還原酶抑制劑(亦即史他汀類抑制素)、纖維酸酯(例如安妥明、吉非羅齊、非諾貝特、環丙貝特、苯紮貝特)、菸鹼酸及其類似物、膽固醇吸收抑制劑、膽汁酸螯合劑(例如消膽胺、考來替潑、考來維侖)、回腸膽汁酸轉運(IBAT)抑制劑、甲狀腺激素模擬物(例如化合物KB2115)、微粒體三酸甘油酯轉移蛋白(MTP)抑制劑、雙過氧化質體增殖物激活受體(PPAR)α及γ激動劑、醯基CoA：二醯基甘油醯基轉移酶(DGAT)抑制劑、醯基CoA：膽固醇醯基轉移酶(ACAT)抑制劑、Niemann Pick C1類似物1(NPC1-L1)抑制劑(例如依澤麥布)、ATP結合卡匣(ABC)蛋白G5或G8之激動劑、膽固醇酯轉移蛋白(CETP)抑制劑、靶向PCSK9之抑制性核酸及靶向apoB100之抑制性核酸。
所使用之其他降脂劑描述及/或綜述於例如以下文獻中：Chang等人，Curr Opin Drug Disco Devel(2002) 5(4):562-70；Sudhop等人，Drugs(2002) 62(16):2333-47；Bays及Stein,Expert Opin Pharmacother(2003) 4(11):1901-38；Kastelein,Int J Clin Pract Suppl(2003) Mar(134):45-50；Tomoda及Omura,Pharmacol Ther(2007) 115(3):375-89；Tenenbaum等人，Adv Cardiol(2008) 45:127-53；Tomkin,Diabetes Care(2008) 31(2):S241-S248；Lee等人，J Microbiol Biotechnol(2008) 18(11):1785-8；Oh等人，Arch Pharm Res(2009) 32(1): 43-7；Birch等人，J Med Chem(2009) 52(6):1558-68；及Baxter及Webb,Nature Reviews Drug Discovery(2009)8:308-320。
在一些實施例中，本發明之抗PCSK9抗體或抗原結合分子與史他汀類抑制素共同投與。例示性史他汀類抑制素包括(但不限於)阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、羅素他汀及辛伐他汀。
在一些實施例中，本發明之抗PCSK9抗體或抗原結合分子與會誘導高膽固醇血症或三酸甘油酯血症之醫藥劑共同投與。例如，第二醫藥劑可能為蛋白酶抑制劑，例如沙奎那韋、利托那韋、茚地那韋、奈非那韋、安普那韋、咯匹那韋、阿紮那韋、夫沙那韋、替拉那韋、地瑞那韋、阿巴卡韋-拉米夫定-齊多夫定(Trizivir)。在一些實施例中，第二醫藥劑為他克莫司。
在一些實施例中，本發明之抗PCSK9抗體或抗原結合分子與特異性靶向PCSK9或apoB100之抑制性核酸(例如siRNA、miRNA、反義序列、核糖核酸酶)共同投與。
6.套組
本發明醫藥組合物可以套組形式提供。在某些實施例中，本發明套組包含本發明之抗PCSK9拮抗劑抗體或抗原結合分子，如本文所述。抗PCSK9抗體或抗原結合分子可以均勻或變化劑量提供。
在一些實施例中，套組包含一或多種第二醫藥劑，如本文所述。第二醫藥劑可與抗PCSK9抗體或抗原結合分子提供於同一調配物中或提供於獨立調配物中。第一及第二藥劑之劑量可獨立地為均勻的或變化的。
在一些實施例中，套組包含PCSK9抗體拮抗劑及一或多種已知有益於降低膽固醇(包括LDL-C、非HDL-C及總膽固醇)及/或升高HDL-C之藥劑。
與本發明之抗PCSK9拮抗劑抗體或抗原結合分子一起包括在套組中的例示性第二藥劑包括(但不限於)HMG-CoA還原酶抑制劑(亦即史他汀類抑制素)、纖維酸酯(例如安妥明、吉非羅齊、非諾貝特、環丙貝特、苯紮貝特)、菸鹼酸及其類似物、膽固醇吸收抑制劑、膽汁酸螯合劑(例如消膽胺、考來替潑、考來維侖)、回腸膽汁酸轉運(IBAT)抑制劑、甲狀腺激素模擬物(例如化合物KB2115)、微粒體三酸甘油酯轉移蛋白(MTP)抑制劑、雙過氧化質體增殖物激活受體(PPAR)α及γ激動劑、醯基CoA：二醯基甘油醯基轉移酶(DGAT)抑制劑、醯基CoA：膽固醇醯基轉移酶(ACAT)抑制劑、Niemann Pick C1類似物1(NPC1-L1)抑制劑(例如依澤麥布)、ATP結合卡匣(ABC)蛋白G5或G8之激動劑、膽固醇酯轉移蛋白(CETP)抑制劑、靶向PCSK9之抑制性核酸及靶向apoB100之抑制性核酸。
適用於套組中之其他降脂劑描述及/或綜述於例如以下文獻中：Chang等人，Curr Opin Drug Disco Devel(2002)5(4):562-70；Sudhop等人，Drugs(2002)62(16):2333-47；Bays及Stein,Expert Opin Pharmacother(2003)4(11):1901-38；Kastelein,Int J Clin Pract Suppl(2003) Mar(134):45-50；Tomoda及Omura,Pharmacol Ther(2007) 115(3):375-89；Tenenbaum等人，Adv Cardiol(2008) 45:127-53；Tomkin,Diabetes Care(2008)31(2):S241-S248；Lee等人，J Microbiol Biotechnol(2008)18(11):1785-8；Oh等人，Arch Pharm Res(2009) 32(1): 43-7；Birch等人，J Med Chem(2009)52(6):1558-68；及Baxter及Webb,Nature Reviews Drug Discovery(2009) 8:308-320。
在一些實施例中，本發明之抗PCSK9抗體或抗原結合分子與史他汀類抑制素一起於套組中提供。例示性史他汀類抑制素包括(但不限於)阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、羅素他汀及辛伐他汀。
在一些實施例中，本發明之抗PCSK9抗體或抗原結合分子與會誘導高膽固醇血症或三酸甘油酯血症之醫藥劑一起於套組中提供。例如，第二醫藥劑可能為蛋白酶抑制劑，例如沙奎那韋、利托那韋、茚地那韋、奈非那韋、安普那韋、咯匹那韋、阿紮那韋、夫沙那韋、替拉那韋、地瑞那韋、阿巴卡韋-拉米夫定-齊多夫定(Trizivir)。在一些實施例中，該第二醫藥劑為他克莫司。
實例
提供以下實例旨在說明而不是限制所主張之本發明。
實例1：Pcsk9拮抗劑NVPLFU720之產生及鑑別 概要
研究之進行旨在產生針對Pcsk9之功能性抗體拮抗劑。已鑑別出分泌能夠結合至蛋白質之經His標記之型式的抗體的多種融合瘤。評估來自融合瘤之抗體的功能性拮抗活性，如根據其抑制HepG2細胞上之LDL受體的受Pcsk9介導之降解從而使得此等細胞攝取LDL膽固醇之能力增強的能力所量測。鑑別有效的功能性鼠類抗人類Pcsk9 IgG1-κ單株抗體並將其命名為NVP-LFU720(LFU720)。
方法 抗原及其他蛋白質
藉由轉染HEK293 FreestyleTM細胞(Invitrogen，Carlsbad，Ca)來產生分泌人類Pcsk9蛋白質之穩定表現細胞株。簡而言之，使用Lipofectamine 2000TM轉染試劑及以蜂毒素信號序列、成熟Pcsk9 cDNA(aa 31-692)及處於序列C-末端處之his6(SEQ ID NO:57)標籤為特徵之重組質體(由E.Hampton選殖，GNF，NPL 010051)轉染在BioCoat燒瓶(Becton Dickinson)中於FreestyleTM培養基(Invitrogen)加上10%胎牛血清中以黏附模式培養之細胞。轉染後48小時，藉由向培養基中添加100 μg/mL勻黴素(Zeocin)來開始選擇陽性轉染物。4週後，形成產生Pcsk9之細胞的四個穩定細胞池。使產量最高之細胞池4在FreestyleTM培養基中適應無血清懸浮條件，隨後按比例放大以便使用WaveTM生物反應器以10-20 L生產體積之規模進行大規模生產。
隨時間進行若干輪，產生重組蛋白質，其產量介於12至30 mg/L之間。收集細胞上清液並藉由交叉流動過濾加以濃縮。所得濃縮物以0.5 mL/min施加於25 mL NiNTA His-Bind Superflow管柱(用50 mM Tris/300 mM NaCl/1 mM CaCl2/2 mM β-巰基乙醇平衡，pH 7.4)。在用50 mM Tris/300 mM NaCl/20 mM咪唑(pH 7.4)進行基線洗滌後，用50 mM Tris/300 mM NaCl/250 mM咪唑(pH 7.4)溶離所結合之物質。相對於PBS(pH 7.3)透析所得溶離物，無菌過濾並等分。藉由分析型尺寸排阻層析法分析樣本以測定寡聚程度。所獲得之純化蛋白質之HPLC層析圖顯示兩個峰，主峰佔85%。全長蛋白質之HPLC-ESI MS分析顯示58176.0 Da之質量，該質量與所有半胱胺酸殘基均經氧化之蜂毒素-hsPcsk9 aa31-692-His的預定質量一致。樣本之一部分另外經N-糖基化。具有約13 kD質量之污染蛋白質最可能類似於蛋白質之游離原結構域。再使用在Freestyle培養基中無血清懸浮培養之HEK293 Freestyle細胞，以大規模短暫表現法產生來自小鼠及獼猴之Pcsk9的相應同系物。使用聚伸乙基亞胺作為質體DNA之載體，以1:3(μg/mL:μg/mL DNA:PEI)之比率將重組質體，即以天然前導序列及處於C-末端處之his6(SEQ ID NO:57)標籤為特徵的小鼠Pcsk9 cDNA以及以CD33前導序列及C末端his6(SEQ ID NO:57)標籤為特徵的獼猴Pcsk9，轉染至Freestyle細胞中。在WaveTM生物反應器中以10公升規模執行若干輪生產；類似於上文關於人類Pcsk9蛋白質所述之方案進行蛋白質純化及表徵。小鼠Pcsk9蛋白質之產量在0.7至2.7毫克/公升培養物範圍內，以3.1毫克/公升獲得獼猴Pcsk9。
融合瘤產生 小鼠之免疫及融合瘤之產生
用完全弗氏佐劑(Freunds Complete Adjuvant)按1:1稀釋經純化之Pcsk9，接著使Bcl-2轉殖基因小鼠(C57BL/6-Tgn(bcl-2) 22 wehi品系)免疫。使用需要在多個部位處重複免疫(RIMMS)之程序使小鼠免疫。簡而言之，在鄰近於周邊淋巴結(PLN)之8個特定部位處對小鼠注射1-3 μg抗原。此程序在12天內重複6次。在第12天，收集測試血液，並藉由ELISA分析血清抗體效價。在第15天，自高效價小鼠獲取彙集之PLN。為了收集淋巴細胞，用普通DMEM洗滌PLN兩次，接著藉由通過0.22微米篩網(Falcon #352350)來分離。再洗滌所得淋巴細胞兩次，接著融合。以2.5個淋巴細胞：1個NSO細胞之比例將NSO/Bcl-2骨髓瘤細胞與淋巴細胞混合。離心細胞混合物，隨後向細胞集結塊中逐滴添加1 mL PEG 1500，歷時1分鐘。30秒後，緩慢添加1 mL DMEM，且1分鐘後，添加19 mL DMEM，歷時5分鐘。集結融合之細胞，以2×105個細胞/毫升之密度再懸浮於HAT培養基(DMEM+20% FBS、Pen/Strep/Glu、1×NEAA、1×HAT、0.5×HFCS)中，並置於37℃下歷時1小時。接著以60微升/孔將細胞塗於384孔板中。
篩選分泌針對Pcsk9之功能性抗體的融合瘤
在融合後10天，篩檢融合瘤板中Pcsk9特異性抗體之存在。在ELISA篩選中，用50 μL Pcsk9(在PBS中稀釋至15奈克/孔)塗佈Maxisorp 384孔板(Nunc #464718)並在4℃下培育隔夜。吸出殘餘蛋白質，並用含1% BSA之PBS阻斷各孔。在室溫下培育30分鐘後，用PBS+0.05% Tween(PBST)洗滌各孔4次。將15 μL融合瘤上清液轉移至ELISA板。將在獲取PLN時得到之15 μL小鼠血清按1:1000稀釋於PBS中，並作為陽性對照物來添加。將50 μL二次抗體(山羊抗小鼠IgG-HRP(Jackson Immuno Research #115-035-071)，按1:5000稀釋於PBS中)添加至ELISA板上之所有孔中。在室溫下培育1小時後，用PBST洗滌板8次。添加25 μL TMB(KPL#50-76-05)，且在室溫下培育30分鐘後，在605 nm下讀取板之吸光度。將來自陽性孔之細胞擴增至24孔板中之HT培養基(DMEM+20% FBS、Pen/Strep/Glu、1×NEAA、1×HT、0.5×HFCS)中。
抗體純化
使用蛋白質G(Upstate #16-266(Billerica，MA))純化含有LFU720之上清液。在裝載上清液之前，用10倍管柱體積之PBS平衡樹脂。繼結合樣本之後，用10倍管柱體積之PBS洗滌管柱，接著用5倍管柱體積之0.1 M甘胺酸(pH 2.0)溶離抗體。立即用1/10體積的Tris HCl(pH9.0)中和管柱溶離份。量測各溶離份之OD280，且彙集陽性溶離份並相對於PBS(pH 7.2)透析隔夜。
結合動力學及Biacore檢定
藉由表面電漿子共振量測，使用光學生物感測器Biacore S51來測定動力學結合參數。此技術允許對配位體與受體之結合(ka)及解離(kd)之微觀速率常數進行無標記測定。因此，其尤其適用於表徵抗體-抗原相互作用。
藉由用預先固定於Series S CM-5 Biacore感測器晶片(已獲認證)(Biacore #BR-1005-30)上之兔抗小鼠Fcγ抗體(Biacore #BR-1005-14)捕捉小鼠抗體來進行Pcsk9與LFU720(2 μg/mL)之結合研究。用「胺偶合套組」(Biacore #BR-1000-50)進行Fcγ捕捉抗體之共價結合。用含10 mM乙酸鈉之50 μg/mL抗Fcγ抗體溶液(pH 5)(Biacore #BR-1003-51)，在10 μL/min之流速下，使捕捉抗體(兔抗小鼠)附著於EDC活化聚葡萄糖表面。使濃度範圍為0.5 μM至7.8 nM之Pcsk9(2倍連續稀釋物)流經處於PBS加上100 mMNaCl、0.005% P20(Biacore #BR-1000-54)中之捕捉之LFU720晶片。使用Biacore S51評估軟體分析所得感測圖。將所有濃度之數據整體擬合成1:1朗繆爾模型(Langmuir model)。
TR-FRET檢定
在384孔白色淺板(Perkin Elmer，6008280)中進行TR-FRET檢定。在室溫下，在15 μL檢定緩衝液(20 mM HEPES(pH 7.2)、150 mM NaCl、1 mM CaCl2、0.1% v/v Tween 20及0.1% w/v BSA)中，將hPcsk9-AF(10.7 nM)與未標記hPcsk9蛋白質、EGF-A肽或NVP-LFU720-AX-1抗體之連續稀釋物一起培育30分鐘。此後向hPcsk9與NVP-LFU720-AX-1之預培育複合物中添加於檢定緩衝液中之5 μLhLDL-R-Eu(4 nM)，並在室溫下培育90分鐘。此等經標記蛋白質之最終濃度為8 nM hPcsk9-AF及1 nM hLDL-R-Eu。用EnVision 2100多標記讀數器(Perkin Elmer)在330 nm激發及665 nm發射下量測TR-FRET信號。使用下式將數據轉化為經校正之值：[(665 nm值×10,000)/(615 nm值)]。藉由下式計算抑制百分比：100-[(經處理樣本之經校正之值/未經處理樣本之經校正之平均值)×100]。使用Prism 5版根據下式繪製抑制百分比劑量反應曲線：Y=最小值+(最大值-最小值)/(1+10^((LogIC50-X)*希爾斜率))(GraphPad Prism Software)。
LDL-R轉換檢定
以胰蛋白酶處理HepG2細胞，並以6×104個細胞/孔接種於平底96孔板(Corning，3595，預先塗佈有1% v/v膠原蛋白)中之100 μL培養基中，接著在37℃下於5% CO2中培育24小時。一般而言，用100 μL含hPcsk9蛋白質、EGF-A肽及/或NVP-LFU720-AX-1抗體之無血清培養基處理細胞。處理後，丟棄培養基，並用100 μL PBS洗滌細胞。為了收集細胞，添加100 μL Versine(Biowhittaker，17-771E)並在37℃下於5% CO2中培育1小時，接著添加100 μL FACS緩衝液。將細胞轉移至V形底96孔板(Corning，3894)中，並在1200 rpm下離心5分鐘以集結細胞。為了阻斷細胞上之非特異性結合位點，向各孔中添加處於FACS緩衝液中之50 μL 100 μg/mL正常兔IgG(MP biomedicals，55944)及小鼠IgG(Sigma，I5381)，並在冰中培育30分鐘。將細胞在1200 rpm下離心5分鐘，並藉由輕彈板來移除緩衝液。為了標記細胞，向各孔中添加處於FACS緩衝液中之10 μL兔抗hLDL-R-Alexa 647 IgG(5 μg/mL)及10 μL小鼠抗轉鐵蛋白-R-藻紅素(PE)IgG(2 μg/mL)(CD71，Becton Dickinson Biosciences，624048)標記抗體，並在冰中培育60分鐘。將細胞在1200 rpm下離心5分鐘，並藉由輕彈板來移除緩衝液。藉由用200微升/孔FACS緩衝液洗滌細胞兩次來移除未結合之抗體。將細胞固定於1%多聚甲醛之PBS溶液中，並對活細胞進行閘控(5000)，並使用BD LSR II流式細胞儀及FACSDIVA軟體(Becton Dickinson)進行分析。在488 nm激發及575 nm發射下量測PE螢光之中值。在488 nm激發及633 nm發射下量測Alexa 647螢光之中值。定製之兔抗hLDL-R多株IgG 583係由Covance(Denver，PA，USA)為了以FACS偵測HepG2細胞上之表面hLDL-R而定製。與正常兔IgG相比，兔抗hLDL-R IgG 583展現約7倍之窗用於偵測HepG2細胞表面上之hLDL-R。為了測定抗hLDL-R IgG 583對HepG2細胞表面上之LDL-R的特異性，使用hLDL-R蛋白質作為結合此IgG之競爭物來進行一項實驗。隨著hLDL-R蛋白質之濃度增加，觀察到抗hLDL-R IgG 583對HepG2細胞之平均中螢光有劑量依賴性下降。此證實抗hLDL-R IgG 583特異性識別HepG2細胞表面上之LDL-R，如藉由FACS所量測。未來之研究將直接使用經標記之抗hLDL-R-583-Alexa 647IgG用於對HepG2細胞表面上之LDL-R進行FACS定量。
LDL-C攝取
以胰蛋白酶處理HepG2細胞，並以6×104個細胞/孔接種於平底96孔板(Corning，3595，預先塗佈有1% v/v膠原蛋白)中之100 μL培養基中，接著在37℃下於5% CO2中培育24小時。除非另外陳述，否則用100 μL含hPcsk9蛋白質、EGF-A肽及/或NVP-LFU720-AX-1抗體之無血清培養基處理細胞。在處理後，各孔接收20 μL處於無血清培養基中之30 μg/mL經3,3'-二(十八烷基)吲哚碳菁標記之低密度脂蛋白(DiI-LDL)(Intracell，RP-077-175)，並在37℃下於5% CO2中培育2小時。藉由輕彈板來移除培養基，並用100 μL磷酸鹽緩衝鹽水(無鈣或鎂之PBS，Invitrogen，14190-144)洗滌細胞。藉由輕彈板來移除PBS，並向各孔中添加100 μL 0.25%胰蛋白酶-EDTA，並在37℃下於5% CO2中培育5分鐘。向各孔中添加100 μL FACS緩衝液(含5% FBS、2 mM EDTA及0.2%疊氮化鈉之PBS)，並藉由在1200 rpm下離心5分鐘來集結細胞。藉由輕彈板來丟棄培養基，並藉由向每孔中添加處於PBS中之50 μL 1%多聚甲醛(Electron Microscopy Sciences，15710)來固定細胞。對活細胞進行閘控，並使用BD LSR II流式細胞儀及FACSDIVA軟體(Becton Dickinson)進行分析。在激發488 nm及發射575 nm下量測DiI-LDL螢光之中值，且分析5000個細胞。使用Microsoft Excel 2002(Microsoft Corporation)產生條形圖。如下計算活化百分比：活化%=[1-(X÷A)]×100，其中X=自樣本孔讀取之中螢光，且A=自僅經hPcsk9處理之孔讀取之中螢光。
相對於處理繪製活化百分比曲線，以便自使用等式Y=最小值+(最大值-最小值)/(1+10^((LogEC50-X)×希爾斜率))及GraphPad Prism 5(GraphPad Software)產生之劑量反應曲線確定EC50。
結果 抗人類Pcsk9單株抗體之產生
自經Pcsk9蛋白質免疫之動物的主要淋巴結收集B細胞。使用標準PEG介導之融合來產生融合瘤。藉由ELISA檢定所得融合，且鑑別人類Pcsk9之陽性結合物並進行擴增以產生上清液。鑑別出多個ELISA陽性純系，隨後藉由功能檢定加以篩分。經鑑別為主導候選物之純系為LFU720。除了主導候選物LFU720以外，亦鑑別出不能阻斷Pcsk9與LDLr之相互作用(如藉由FRET所量測)但當結合至Pcsk9時仍能夠阻斷Pcsk9介導LDLr降解之能力(如藉由LDLc攝取所量測)的多個其他純系，包括純系21D6、5A4-C1及13F1。純系21D6亦顯示在活體內阻斷LDLr之Pcsk9降解的能力。
篩選特異性結合至Pcsk9之LFU720
藉由在ELISA中評估與一系列其他蛋白質之結合來檢驗LFU720特異性。將LFU720與三種其他經HIS標記之蛋白質的結合與LFU720與Pcsk9-HIS之結合相比較。此結果顯示，結合至Pcsk9具特異性，且抗體不結合至HIS標籤。
評估LFU720與獼猴Pcsk9之結合
測定LFU720與Pcsk9之獼猴同系物的結合。在此檢定中，來自表現經HIS標記之獼猴Pcsk9之細胞的上清液與Ni捕捉板一起利用，以免需要純化該物質。稀釋人類Pcsk9且亦經由其HIS標籤加以捕捉。LFU720能夠結合至人類及獼猴Pcsk9。在ELISA中5P20亦不結合至人類LDL-R或小鼠Pcsk9。
LFU720之結合動力學
藉由使用光學生物感測器技術(Biacore)分析識別人類Pcsk9蛋白質之小鼠抗體LFU720的結合親和力。發現LFU720以高親和力結合至重組人類Pcsk9，該親和力達到亞奈莫耳級別(KD=200 pM)。
篩 選阻斷Pcsk9/LDL-R相互作用之LFU720
使用TR-FRET檢定來測定抗hPcsk9抗體NVP-LFU720是否可破壞hPcsk9-AF與hLDL-R-Eu標記蛋白質之間的相互作用。評估未標記之hPcsk9蛋白質或EGF-A肽以證明該檢定可偵測由hLDL-R-Eu與hPcsk9-AF標記蛋白質之相互作用所產生之TR-FRET信號的破環。增加未標記之hPcsk9之濃度來與hPcsk9-AF競爭結合至hLDL-R-Eu，此導致TR-FRET信號減弱。EGF-A肽破壞hLDL-R-Eu與hPcsk9-AF之間的相互作用，IC50為2.5 μM。反之，NVP-LFU720不充分破壞hPcsk9-Eu與hLDL-R-AF之間的TR-FRET信號，IC50大於1000 nM，且在低抗體濃度下展現U形反應。
篩選抑制Pcsk9介導之LDL-R降解的LFU720
Pcsk9結合至LDL-R已顯示導致LDL-R降解，且使用HepG2細胞及重組人類Pcsk9確認此結果。測定LFU720結合Pcsk9及阻斷此效應之能力。NVP-LFU720抑制經外源性hPcsk9處理之HepG2細胞，並導致細胞表面LDL-R增加。
篩選抑制Pcsk9及恢復LDL攝取之LFU720
抑制LDL-R之Pcsk9降解將恢復HepG2細胞內化LDL-C之能力。NVP-LFU720防止經外源性hPcsk9處理之HepG2細胞上的Pcsk9介導之LDL-R降解，且導致DiI-LDL攝取增加，EC50為99 nM。
實例2：產生PCSK9拮抗劑抗體NVP-LGT209、NVP-LGT210及NVP-LGT211 引言
此實例描述藉由對鼠類單株PCSK9拮抗劑抗體NVP-LFU720進行工程改造而與人類生殖系抗體具有較高序列同源性來產生人類抗體NVP-LGT209、NVP-LGT210及NVP LGT211。NVP-LGT209、NVP-LGT210及NVP LGT211保留親本鼠類抗體NVP-LFU720之抗原決定基特異性、親和力及獼猴PCSK9交叉反應活性。NVP-LGT209、NVP-LGT210及NVP LGT211與人類生殖系序列之同源性比原始鼠類抗體高得多，且因此將被人類免疫系統更好地耐受。
小鼠單株抗體LFU720經人類化工程改造(HumaneeredTM)以使其蛋白質序列較接近於人類生殖系序列並降低其免疫原性。HumaneeringTM技術可獲自KaloBios of South San Francisco(在全球資訊網上，kalobios.com)。抗體HumaneeringTM產生經工程改造之人類抗體，其V區序列與人類生殖系序列具有高度同源性，同時仍保留親本或參考抗體之特異性及親和力(美國專利公開案2005/0255552及2006/0134098)。該方法首先鑑別參考Fab之重鏈及輕鏈可變區中的最小抗原結合特異性決定子(BSD)(通常為重鏈CDR3及輕鏈CDR3內之序列)。由於此等重鏈及輕鏈BSD維持於在HumaneeringTM處理期間所構築之所有集合庫中，因此各集合庫聚焦於抗原決定基，且最終完全HumaneeredTM之抗體保留原始小鼠抗體之抗原決定基特異性。
接著，產生全鏈集合庫(其中整個輕鏈或重鏈可變區經置換為人類序列集合庫)及/或卡匣集合庫(其中小鼠Fab之一部分重鏈或輕鏈可變區經置換為人類序列集合庫)。使用細菌分泌系統使集合庫成員表現為抗體Fab片段，並篩選集合庫中的結合抗原之Fab，例如使用群落移接結合檢定(CLBA)。可進一步表徵陽性純系以鑑別具有最高親和力的純系。在剩餘鼠類序列之情況下支持結合的所鑑別之人類卡匣接著在最終的集合庫篩選中組合而產生完全人類V區。
所得HumaneeredTM Fab具有來源於人類集合庫之V區段序列，保留在CDR3區內所鑑別之短BSD序列，且具有人類生殖系構架4區。藉由將重鏈及輕鏈之可變區選殖於IgG表現載體中來將此等Fab轉化為完全IgG。此處理所產生之完全HumaneeredTM之抗體保留親本鼠類抗體之結合特異性，通常與親本抗體相比對抗原具有等同或較高之親和力，且在蛋白質層面上具有與人類生殖系抗體基因相比具有高度序列一致性的V區。
方法 選殖鼠類V區
藉由RT-PCR，由自融合瘤細胞株分離之RNA，使用標準方法擴增來自鼠類單株NVP-LFU720之V區DNA。成功用於融合瘤cDNA之重鏈可變區之PCR擴增的引子為VH14(5'-CTTCCTGATGGCAGTGGTT-3'；SEQ ID NO:58)(ChardesT等人，1999,FEBS Letters;452(3):386-94)及HC恆定區(5'-GCGTCTAGAAYCTCCACACACAGGRRCCAGTGGATAGAC-3'；SEQ ID NO:59)。成功用於融合瘤cDNA之輕(κ)鏈可變區之PCR擴增的引子為Vκ4/5(5'-TCAGCTTCYTGCTAATCAGTG-3'；SEQ ID NO:60)(Chardes T等人，1999，同上文)及LC恆定區(5'-GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGG-3'；SEQ ID NO:61)。對經擴增之重鏈及輕鏈可變區進行定序。接著使用PCR擴增V基因並且併入限制酶位點以選殖於KaloBios載體中：Vh在NcoI(5')及NheI(3')處選殖於KB1292-His(編碼C末端可撓性連接子及CH1上之胺基酸序列AAGASHHHHHH(SEQ ID NO:62)之6-His(SEQ ID NO:57)標籤的KB1292之經修改型式)；Vk在NcoI(5')及BsiWI(3')處選殖於KB1296中。接著，藉由用BssHII及ClaI進行限制消化並連接而將此等獨立之重鏈及輕鏈載體組合於單一雙順反子KaloBios Fab表現載體中。Fab片段自此載體表現於大腸桿菌中。測試此Fab之PCSK9抗原結合並將其稱為參考Fab SR032。
Fab純化
使用KaloBios表現載體藉由自大腸桿菌分泌來表現Fab片段。細胞在2xYT培養基中生長至OD600為約0.6。藉由添加IPTG達到100 μM並在33℃下振盪4小時來誘導表現。藉由滲透性溶解並藉由親和層析法使用Ni-NTA管柱(His Trap HP管柱；GE Healthcare目錄號#17-5247-01)根據標準方法加以純化而自胞外質部分獲得組裝之Fab。在含有500mM咪唑之緩衝液中溶離Fab，並相對於不含鈣及鎂之PBS(pH 7.4)澈底透析。
集合庫構築
關於集合庫構築中之第一步驟，藉由Kalo Bios人類V區段集合庫序列之PCR擴增來產生聚焦於抗原決定基之完全人類V區集合庫。在製造此等全鏈集合庫時，使用重疊PCR使來自經優化之參考Fab SR038的含有BSD及人類生殖系J區段序列之獨特CDR3-FR4區連接於人類V區段集合庫。不直接篩選此等完全V區集合庫；相反，其係用作構築Vh及Vk中間集合庫之模板。基於CDR區中最接近原始鼠類Vh及Vk之人類生殖系序列來選擇用於構築全鏈集合庫之Kalo Bios人類V區段集合庫。原始鼠類NVP-LFU720Vh在其CDR中最接近人類生殖系序列Vh1-02，因此使用含有Vh1亞群成員之兩個Kalo Bios集合庫(KB1410及KB1411)的混合物來製造完全Vh集合庫。同樣，由於NVP-LFU720 Vk在其CDR中最接近Vk3 L6人類生殖系序列，因此使用含有Vk3亞群成員之兩個Kalo Bios人類V區段集合庫(KB1423及KB1424)的混合物來製造完全Vk集合庫。接著，將此等全長Vh及Vk集合庫用作模板以構築卡匣集合庫，其中僅一部分親本鼠類V區段被置換為人類序列集合庫。藉由橋式PCR構築兩類卡匣：在FR1、CDR1及FR2之第一部分中含有人類序列之前端卡匣係由上述Vh1集合庫(KB1410及KB1411)之混合物或Vk3集合庫(KB1423及KB1424)之混合物作為模板而擴增得來。使用上述完全人類Vh或Vk區集合庫作為模板來擴增在FR3、CDR2及FR2之最後部分中含有人類序列的中間卡匣。Vh卡匣在FR2中在胺基酸位置45-49(Kabat編號)處具有重疊之共同序列；Vk卡匣在FR2中在胺基酸位置35-39(Kabat編號)處具有重疊之共同序列。以此方式，藉由PCR構築人類V-重鏈1及V-κ 3同型之前端及中間人類卡匣集合庫。將各Vh卡匣集合庫在NcoI(5')及KpnI(3')處選殖於載體KB1292-His中；各Vk卡匣集合庫在NcoI(5')及HindIII(3')處選殖於載體KB1296-B(具有添加於FR4中之沉默HindIII位點的KaloBios載體KB1296之經修改型式)。接著，藉由用BssHII及ClaI消化，隨後進行連接來使所得Vh或Vk質體集合庫與來自經優化之參考Fab SR038的互補鏈組合(例如使Vh前端集合庫與經優化之參考Vk載體組合)，以產生表現完全Fab之雙順反子載體集合庫。
一般ELISA
將重組人類或獼猴PCSK9-His6抗原用於所有ELISA檢定。通常，藉由在4℃下隔夜培育使稀釋於PBS(pH 7.4)中之PCSK9-His6抗原以300奈克/孔結合至96孔微量滴定板。在37℃下用3% BSA於PBS中之溶液阻斷板1小時，接著用PBST沖洗一次。接著向各孔中添加含Fab之誘導細胞培養基或經稀釋純化之Fab(50 μL)。在37℃下培育1小時後，用PBST沖洗板3次。向各孔中添加以1:5000稀釋於PBS(50 μL)中之抗人類-κ鏈HRP結合物(Sigma #A7164)，並在室溫下培育該板45分鐘。用PBST洗滌板3次，接著向各孔中添加100 μL SureBlue TMB受質(KPL #52-00-03)並在室溫下培育板約10分鐘。在分光光度計中在650 nm處對板讀數。
為了對經純化之人類及小鼠IgG進行特異性ELISA，用一組經純化之人類或小鼠抗原以88奈克/孔塗佈384孔板，並在4℃下培育隔夜。如上所述阻斷並洗滌該板，接著向各孔中添加22 μL於PBS中稀釋至2 μg/mL的經純化之小鼠或人類抗PCSK9抗體。在37℃下培育板1小時，接著用PBST洗滌。將結合至HRP之抗小鼠Fc抗體(Jackson ImmunoResearch Labs #115-035-071)或抗人類K抗體(Sigma #A7164)按1:5000稀釋於PBS(25 μL)中，並添加至各孔中。在室溫下培育該板1小時，接著如上所述來洗滌並顯色。
群落移接結合檢定(CLBA)
基本上如(美國專利公開案2005/0255552及2006/0134098)中所述，使用塗佈有6 μg/mL PCSK9-His6之硝化纖維素過濾器來篩選Fab片段之HumaneeredTM集合庫。使用按1:5000稀釋於PBST中之鹼性磷酸酶結合抗人類K輕鏈抗體(Sigma #A3813)偵測結合至經抗原塗佈之過濾器的Fab，並用鹼性磷酸酶之DuoLux化學發光受質(Vector Laboratories #SK-6605)產生墨點。
經生物素標記之重組PCSK9之產生及親和力量測
藉由在pRS5a/PCSK9質體中於編碼PCSK9之基因與His6(SEQ ID NO:57)標籤之間插入EcoRI限制位點來產生具有C末端Avi(用於定點生物素化)及His6(SEQ ID NO:57)標籤之PCSK9(PCSK9-Avi-His6)，其表現具有C末端His6(SEQ ID NO:57)標籤之PCSK9 Uniprot寄存編號Q8NBP7之胺基酸31-692。編碼Avi標籤(胺基酸序列：GGGLNDIFEAQKIEWHE；SEQ ID NO:63)且側接EcoRI懸垂物之寡聚核苷酸經T4聚核苷酸激酶(Invitrogen)磷酸化，黏接，隨後使用新插入之EcoRI位點連接於pRS5a/PCSK9中。藉由序列分析驗證含有Avi標籤之純系。在293 Freestyle表現系統(Invitrogen)中表現PCSK9-Avi-His6，並使用Ni-NTA樹脂(QIAGEN)純化所分泌之重組蛋白質。在純化後，相對於10 mM Tris(pH 8.0)、50 mM NaCl透析PCSK9-Avi-His6蛋白質。根據製造商方案用生物素-蛋白質連接酶(Avidity)在活體外對該蛋白質進行生物素標記。完成後，即相對於PBS(pH 7.2)透析反應物，且藉由西方墨點法用結合HRP之抗生蛋白鏈菌素探測來驗證生物素標記。
使用溶液平衡滴定(「SET」)檢定分析IgG及Fab片段之結合動力學。簡而言之，將hPCSK9之連續稀釋物添加至60　pM IgG或Fab中並培育隔夜。用1 μg/ml hPCSK9塗佈96孔標準結合微量滴定板(Meso Scale Discovery)並培育隔夜，用PBS/0.05%(w/v)Tween 20洗滌，用PBS/5%(w/v)BSA阻斷並再次洗滌。將抗體-抗原製劑添加至經PCSK9塗佈之標準結合板並在室溫下培育30分鐘。再在三個洗滌步驟後，添加經Sulfo標籤標記之山羊抗人類偵測抗體(R32AJ-5，MesoScale Discovery)並在室溫下培育1小時。在洗滌板三次後，添加讀數緩衝液(Meso Scale Discovery)且藉由Sector Imager 6000(Meso Scale Discovery)量測電致化學發光(ECL)信號。用Excel內嵌XLfit 4.3.2(ID Business Solutions)使用Piehler等人，(1997) J Immunol Methods 201:189-206中所述之適用於抗體之擬合模型來處理ECL資料。在溶液中於人類PCSK9與抗體LGT209、LGT210及LGT211之間觀察到高親和力結合，針對各者所計算之KD值為150-190 pM。
抗體產生及純化
藉由使用293fectin轉染試劑(Invitrogen #51-0031)根據製造商方案將如下載體共同轉染至293 Freestyle細胞中來產生完全HumaneeredTM之NVP-LGT209、NVP-LGT210及NVP-LGT211抗體(沉默IgGlκ)：
LGT-209-pJG04(Vh)+pJG10(Vk)
LGT-210-pJG04(Vh)+pJG01(Vk)
LGT-211-pSR74(Vh)+pJG10(Vk)。
使用5 mL HiTrap蛋白質A HP管柱(GE Healthcare #17-0403-03)自293 Freestyle細胞上清液純化抗體。使用IgG溶離緩衝液(Pierce #21004)溶離抗體，並藉由透析將緩衝液交換成PBS。在AKTAFPLC液相層析系統(GE Healthcare)上進行蛋白質A親和層析。
抗原決定基競爭檢定
使用ForteBio Octet QK系統及塗佈有經生物素標記之PCSK9-Avi-His6之抗生蛋白鏈菌素高結合生物感測器來檢定原始小鼠抗體NVP-LFU720與其HumaneeredTM衍生物NVP-LGT209對結合PCSK9上之抗原決定基之競爭。接著使三種不同抗體結合至獨立的經PCSK9塗佈之感測器直至飽和：小鼠LFU720、完全人類LGT209或對照小鼠抗體7D16(已知具有獨立於LFU720之抗原決定基)。接著，將所有感測器浸入含有LFU720小鼠抗體之孔中以測定第一抗體是否可阻斷LFU720結合。
結果 鼠類及參考V區胺基酸序列
對來自表現NVP-LFU720之融合瘤細胞的RT-PCR產物進行定序，且主要(95%或95%以上)在蛋白質層面上使用ThermoElectron LTQ-Orbitrap質譜儀驗證此序列。接著將LFU720之重鏈及輕鏈可變區選殖至KaloBios載體中以便產生參考Fab SR032。NVP-LFU720 Vk中之第一胺基酸必須自麩醯胺酸(Q)變成麩胺酸(E)以便可選殖至KaloBios載體中用於產生參考Fab SR032；因此，SR032 Vk在第一Vk位置具有麩胺酸。Fab SR032具有與人類恆定區融合之來自NVP-LFU720之完整鼠類V區，且係自大腸桿菌純化而來。在PCSK9-His6抗原結合之稀釋ELISA測試中，所選殖之SR032參考Fab產生取決於Fab濃度的結合曲線。除參考Fab(SR032)以外，亦構築經優化之參考Fab SR038。使SR032中之若干構架胺基酸殘基變成SR038中之人類生殖系。
參考Fab及經優化之參考Fab的親和力分析
合併於經優化之參考Fab SR038之FR1及FR3中的人類生殖系殘基為由用於擴增人類V區段譜系之PCR引子所指定的殘基，且因而存在於HumaneeredTM V區集合庫之所有成員中。構築經優化之參考Fab以評定人類生殖系之任何變化是否會改變Fab結合性質。藉由稀釋ELISA使用經純化之Fab，測定SR032及SR038對重組PCSK9抗原之親和力相同，此表明容許SR038中之胺基酸變化。
集合庫構築及完全Humaneered TM Fab之選擇
產生侷限於重鏈及輕鏈前端及中間卡匣集合庫亞群之Vh1或Vk3並藉由CLBA加以篩選。對於Vh，藉由群落移接結合檢定鑑別支持結合至PCSK9抗原之前端卡匣，而Vh中間卡匣並非如此。對於Vk，藉由群落移接鑑別前端及中間卡匣，且此外，鑑別一些完全Vk純系(歸因於Vk前端集合庫經全鏈Vk純系污染)。在ELISA檢定中針對含Fab之細胞上清液再確定來自各集合庫之許多結合物，且來自各集合庫之若干Fab係自胞外質部分純化而來並使用Forte分析根據親和力來分級排序。
由於未鑑別出支持PCSK9結合之V重鏈中間卡匣，因此構築兩個突變誘發集合庫，其在重鏈CDR2或FR3內之所有位置編碼親本鼠類殘基或最接近之人類生殖系殘基。因而，構建經工程改造之人類中間卡匣集合庫，加以篩選，並鑑別抗原結合純系。接著，組合在個別純系之情況下支持結合之Vh中部中的人類生殖系變化以產生一個最終中間卡匣，並藉由Forte分析確定在經優化之參考Fab之情況下含有此卡匣之Fab以及經優化之參考Fab的結合親和力。
由所產生之集合庫，藉由CLBA成功地鑑別出重鏈及輕鏈之支持結合至PCSK9抗原的前端及中間人類卡匣。藉由ELISA確定所有此等結合物，接著純化Fab並使用ForteBio Octet系統進行分級排序。藉由橋式PCR將重鏈及輕鏈之高等級卡匣組合成一個最終集合庫，並藉由CLBA自此集合庫選擇出支持結合至PCSK9之完全HumaneeredTM Fab。與此同時，將所有高等級卡匣或鏈(最佳Vh前端、經工程改造之Vh中部及最佳全長輕鏈)組合在一起以產生單一Fab SR066，預計其將支持高親和力結合。
親本小鼠mAb NVP-LFU720及HumaneeredTM Ab NVP-LGT209、NVP-LGT210及NVP-LGT211之重鏈及輕鏈可變區之序列分別示於圖1至圖4中。
使用ForteBio Octet分析測試完全Humaneered TM Fab對PCSK9抗原之親和力
表現並純化HumaneeredTM SR066 Fab及自最終組合集合庫中取出之三個Fab(#1-2、#3-2及#4-2)。接著使用ForteBio Octet系統將此四個人類Fab之結合動力學與經優化之參考Fab SR038之動力學相比較(數值資料匯總於表1中)。
難以對此等Fab進行蛋白質濃度測定；因而，解離速率(kd)數據比締合速率(ka)及KD數據更為可靠(僅解離速率與濃度無關)。所測試之所有四種HumaneeredTM Fab的解離速率看似比經優化之參考Fab的解離速率「差」(亦即快)3至4倍。此親和力下降現象可能歸因於此等純系之重鏈前端，因為選自原始重鏈前端卡匣集合庫之所有Fab結合物的解離速率看似比經優化之參考Fab差(未展示數據)。由於重鏈前端含有CDR1，因此，在Vh前端卡匣中對此CDR所作之變化為最終HumaneeredTM Fab之親和力降低的潛在原因。在完全HumaneeredTM Fab中，SR066具有最佳解離速率(表1)，且SR066與參考(小鼠)序列之間在重鏈CDR1中存在三個差異。為了檢驗對CDRH1所作之變化引起親和力下降(見於所有HumaneeredTM Fab)之觀點，一次性同時使SR066之CDRH1中的兩個殘基變回至與原始鼠類殘基相匹配，且表現並純化此等經改變之Fab以供Forte動力學分析。
在CDRH1中具有兩個同時變化的一個Fab(SR079)(表2)顯著改良SR066之結合動力學(數值資料匯總於表3中)。實際上，SR079 Fab之解離速率看似與經優化之參考(小鼠)Fab SR038相等。
殘基以普通字體表示。
HumaneeredTM Fab SR066、#1-2、#3-2及#4-2在CDRH2中含有「Asn-Gly」(「NG」)胺基酸序列，該序列來自於原始小鼠抗體。已知此序列可能經歷脫醯胺化，該性質對於製造而言不理想。因此，在努力改良HumaneeredTM SR066 Fab之親和力的同時，針對SR066，構築兩個誘變集合庫，其中「N」或「G」被除原始胺基酸以外之每個可能胺基酸取代(例如在「N移除集合庫」中，「N」被除「N」以外之每個胺基酸取代)。接著藉由ELISA篩檢來自此集合庫之含Fab之細胞上清液，以鑑別不再具有「NG」序列但仍保留SR066結合程度(其小於經優化之參考Fab SR038的結合程度)的純系。「N移除集合庫」不產生結合程度與SR066相同的任何Fab，但「G移除集合庫」產生具有足夠結合程度且在「G」位置具有許多不同取代之Fab。在此等Fab中，選擇「NG」變成「NE」、「NA」及「NM」之Fab來進行純化及Forte動力學分析，且發現具有與親本Fab SR066相似之動力學。
工程改造7472人類IgG以改良親和力 Vk工程改造
為了產生完全人類IgG，擴增SR079(具有改良之親和力的SR066之經修改型式)之Vh序列直至CDRH2，並藉由橋式PCR，自CDRH2至大部分FR4黏合至「G移除集合庫」純系(在CDRH2中含有「NE」)之序列。將此Vh序列選殖至pRS5a-hIgGl LALA+KpnI(已在不影響Vh之胺基酸序列的情況下於FR4中添加KpnI位點，而改造之沉默IgGl選殖載體)中NruI(5')及KpnI(3')處，以產生pSR074。擴增來自SR066之Vk(自FR1直至經過FR4之部份區段)並選殖至pRS5a-hK中AgeI及BsiWI處，產生pSR072。藉由定序法驗證此等載體，並共同轉染至293 Freestyle細胞中。此IgG(稱為「7472」)係自含有抗體之細胞培養基純化而來。令人驚訝的是，藉由Biacore分析得知，抗體7472之締合速率顯著比親本小鼠抗體LFU720慢(數據未示出)。藉由各人類鏈與互補親本小鼠鏈之互換，確定此締合速率缺陷歸因於與人類輕鏈相關之問題。改變pSR072人類輕鏈，可以恢復親和力(表4)：使輕鏈之前4個殘基變回至小鼠序列，且使CDRl之第二半部中之殘基變回至小鼠殘基。將此輕鏈選殖至上述pRS5a-hK中，以產生pJG10及pJG01，並藉由共同轉染pSR074(Hc載體)及pJG10(Lc載體)或pJG01(Lc載體)來產生完全IgG。總而言之，此等變化部分地恢復HumaneeredTM抗體之親和力，如藉由Biacore所測定。
表4展示人類抗體7472、親本小鼠抗體LFU720之輕鏈及由pJG10編碼之輕鏈之部分的比對。此部分與由pJG01編碼之輕鏈一致。使用輕鏈載體來表現最終HumaneeredTM抗體NVP-LGT209、NVP-LGT210及NVP-LGT-211。
CDRH3之親和力成熟
與輕鏈變化同時，構築Fab集合庫以使pSR074重鏈之CDR3親和力成熟。在此集合庫中，CDR3殘基單一地經除原始殘基以外的所有其他胺基酸取代。藉由CLBA篩選此集合庫，藉由ELISA驗證結合物，並純化所得Fab，且藉由生物層干涉測量術進行測試，以測定其結合動力學相對於親本人類Fab是否有改良。
鑑別出一個顯著改良親和力之CDRH3取代：A變成N(表5)。隨後在pSR074重鏈IgG表現質體之情況下進行此變化；此新構築體被稱為pJG04。藉由共同轉染pJG04(Hc)及pJG10且隨後純化來產生最終HumaneeredTM抗體NVP-LGT209(LGT209)。藉由共同轉染pJG04(Hc)及pJG01且隨後純化來產生最終HumaneeredTM抗體NVP-LGT210(LGT210)。此變化未引入抗體NVP-LGT211(LGT211)中。
表5展示人類抗體7472、親本小鼠抗體LFU720及由pJG04(用於表現最終HumaneeredTM抗體NVP-LGT209及NVP-LGT210之重鏈載體)編碼之重鏈之重鏈CDR3的比對。A-N取代加有下劃線。
使用溶液平衡滴定(SET)系統分析NVP-LGT209、NVP-LGT210及NVP-LGT211之結合動力學
使用SET檢定，測定NVP-LGT209、NVP-LGT210及NVP-LGT211抗體對人類PCSK9之結合親和力在150-190 pM之間，如表6中所指示。此表明該等抗體與PCSK9之間在溶液中有高親和力相互作用。
藉由ELISA分析NVP-LGT209之抗原特異性
為了測試最終HumaneeredTM IgG LGT209、LGT210及LGT211中是否保留親本小鼠抗體LFU720之抗原特異性，在ELISA檢定中測試抗體與一組人類及小鼠抗原(以及人類PCSK9)之結合。此檢定之結果(圖5A至圖5C)顯示，LGT209、LGT210及LGT211保留對PCSK9之高特異性，與鼠類抗體LFU720相似。
ELISA中抗體與人類及獼猴Pcsk9蛋白質之結合
評估LGT209、LGT210及LGT211與人類及獼猴(cyno)Pcsk9之特異性結合。此ELISA檢定顯示，如同親本小鼠抗體LFU720，HumaneeredTM抗體LGT209、LGT210及LGT211能夠以類似方式結合人類及獼猴Pcsk9(圖6A至圖6C)。
基於生物層干涉測量術之抗原決定基競爭檢定
為了測試最終HumaneeredTM抗體LGT209、LGT210及LGT211中是否保留親本鼠類抗體NVP-LFU720之抗原決定基特異性，開發了一項使用ForteBio Octet系統之競爭檢定。HumaneeredTM抗體LGT209、LGT210及LGT211阻斷親本小鼠抗體NVP-LFU720之結合，此表明HumaneeredTM抗體保留原始鼠類抗體之抗原決定基特異性。當變換裝載抗體之順序時獲得類似結果，亦即首先結合NVP-LFU720，接著為HumaneeredTM抗體。
Humaneered TM 抗體LGT209、LGT210及LGT211之胺基酸序列及與人類生殖系序列之一致性百分比
最終HumaneeredTM IgG LGT209、LGT210及LGT211之可變區胺基酸序列分別示於圖2至圖4中；CDR加有下劃線且以粗體表示。核苷酸序列包括序列表中。
藉由相對於單一人類生殖系序列(分別為Vh1 1-02及Vk3 A27；表7)比對Vh及Vk胺基酸序列來確定抗體LGT209、LGT210及LGT211與人類生殖系序列之一致性百分比。自對各鏈之計算中略去CDRH3及CDRL3中之殘基。
關於經人類化工程改造之抗體之功能特徵化的額外資訊論述於圖8至圖14之圖註中。
實例3：PCSK9拮抗劑抗體NVP-LGT209、NVP-LGT210及NVP-LGT211之突變分析
評估PCSK9拮抗劑抗體NVP-LGT209、NVP-LGT210及NVP LGT211之變異體結合於PCSK9之能力。結果匯總如下：
關於重鏈CDR1：TMYMS(SEQ ID NO:66)，僅含有原始小鼠殘基(以粗體表示)之純系保留小鼠Ab之結合動力學(如藉由生物層干涉測量術分析所測定)。因此，重鏈CDR1內之此等殘基在結合中起作用。
關於重鏈CDR2：RIDPAN E HTNYAQKFQG(SEQ ID NO:74)，在自編碼原始(小鼠)殘基或最接近之人類生殖系序列中各位置處之相應殘基的集合庫中獲取之抗體結合物中以粗體表示之殘基未有改變(藉由ELISA篩選)。因此，加粗之殘基在結合中起作用。在由加有下劃線之Glu殘基所指示之位置處容許保存性取代，例如，此位置可能為A、E或D，如藉由ELISA所測定及藉由生物層干涉測量術所確定。
關於重鏈CDR3：SYYYY( A/N)MD Y(SEQ ID NO:75)，在自在各位置處編碼所有胺基酸可能性(除原始aa以外)之親和力成熟集合庫中獲取的純系中以粗體表示之殘基未有改變。因此，加粗之殘基在結合中起作用。在由加有下劃線之Ala或Asn殘基所指示之位置處容許保存性取代，例如，此位置可能為A、N或Q，如藉由Biacore所測定。在由加有下劃線之Tyr殘基所指示之位置處容許保存性取代，例如，此位置可能為A、F、S、V或Y，如藉由Biacore所測定。
關於輕鏈FR1：(E/Q)IV(M/L)TQSPATLSVSPGERATLSC(SEQ ID NO:76)，在加有下劃線之位置1及4處容許保存性取代，如藉由Biacore所測定。例如，位置1處之胺基酸可能為A、D、E、N或Q。位置4處之胺基酸可能為V、I、L或M。位置1-4為QIVL(SEQ ID NO:69)(如在小鼠親本LFU720、LGT209及LGT211 Vk中)與位置1-4為EIVM(SEQ ID NO:67)(如在LGT210 Vk中)相比具有改良之結合，如藉由Biacore所測定。
關於輕鏈CDR1：RASQSVSYMH(SEQ ID NO:71)，加粗殘基之間隔對結合有影響，因為在Lc CDR1之此部分中具有2個額外胺基酸之人類純系的親和力受損。因此，加粗之殘基在結合中起作用。
關於輕鏈CDR3：LQWSSDPPT(SEQ ID NO:26)，在此等位置處不容許對人類生殖系作出變化，如藉由ELISA所測定。因此，加粗之殘基在結合中起作用。
應瞭解，本文中所述之實例及實施例僅用於說明之目的，且熟習此項技術者可根據其提出各種修改或變更，且該等修改或變更應包括在本申請案之精神及範圍以及隨附申請專利範圍之範疇內。本文中所引用之所有公開案、專利、專利申請案及序列寄存條目係出於所有目的以全文引用的方式併入本文中。
<110>　美商艾姆公司
<120>　PCSK9拮抗劑
<130>　021288-006410PC
<140>　099143361
<141>　2010-12-10
<150>　61/285,942
<151>　2009-12-11
<160>　76
<170>　FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>　1
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<212>　PRT
<213>　小家鼠
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<223>　小鼠抗-PCSK9單株抗體LFU720重鏈可變區(FR1-FR4)
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<213>　人工序列
<220>
<223>　合成抗-PCSK9單株抗體pJG04(純系LGT-209及LGT-210) Vh重鏈可變區(FR1-FR4)
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<213>　人工序列
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<223>　合成抗-PCSK9單株抗體pJG04(純系LGT-209及LGT-210)Vh重鏈，包括IgG1恆定鏈
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<221>　VARIANT
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<213>　人工序列
<220>
<223>　合成小鼠抗-PCSK9單株抗體LFU720重鏈互補決定區1(CDR1)
<400>　6
<210>　7
<211>　5
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　抗-PCSK9單株抗體純系LGT-209、LGT-210及LGT-211重鏈互補決定區1(CDR1)
<400>　7
<210>　8
<211>　5
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　抗-PCSK9單株抗體共同序列重鏈互補決定區1(CDR1)
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(1)...(1)
<223>　Xaa=Asp或Thr
<400>　8
<210>　9
<211>　17
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成小鼠抗-PCSK9單株抗體LFU270重鏈互補決定區2(CDR2)
<400>　9
<210>　10
<211>　17
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成抗-PCSK9單株抗體純系LGT-209、LGT-210及LGT-211重鏈互補決定區2(CDR2)
<400>　10
<210>　11
<211>　17
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成抗-PCSK9單株抗體共同序列重鏈互補決定區2(CDR2)
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(7)...(7)
<223>　Xaa=Ala、Glu或Gly
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(12)...(12)
<223>　Xaa=Ala或Asp
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(13)...(13)
<223>　Xaa=Pro或Gln
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(17)...(17)
<223>　Xaa=Ala或Gly
<400>　11
<210>　12
<211>　9
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成抗-PCSK9單株抗體pJG04(純系LGT-209及LGT-210)Vh重鏈互補決定區3(CDR3)
<400>　12
<210>　13
<211>　9
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成小鼠抗-PCSK9單株抗體LFU270及抗-PCSK9單株抗體pSR74(純系LGT-211)Vh重鏈互補決定區3(CDR3)
<400>　13
<210>　14
<211>　9
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成抗-PCSK9單株抗體共同序列重鏈互補決定區3(CDR3)
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(6)...(6)
<223>　Xaa=Ala或Asn
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(9)...(9)
<223>　Xaa=Ala、Phe、Ser、Val或Tyr
<400>　14
<210>　15
<211>　106
<212>　PRT
<213>　小家鼠
<220>
<223>　小鼠抗-PCSK9單株抗體LFU720輕鏈可變區(FR1-FR4)
<400>　15
<210>　16
<211>　106
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成抗-PCSK9單株抗體pJG10(純系LGT-209及LGT-211)Vk輕鏈可變區(FR1-FR4)
<400>　16
<210>　17
<211>　213
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成抗-PCSK9單株抗體pJG10(純系LGT-209及LGT-211)Vk輕鏈，包括κ恆定鏈
<400>　17
<210>　18
<211>　106
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成抗-PCSK9單株抗體pJG01(純系LGT-210)Vk輕鏈可變區(FR1-FR4)
<400>　18
<210>　19
<211>　213
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成抗-PCSK9單株抗體pJG01(純系LGT-210)Vk輕鏈，包括κ恆定鏈
<400>　19
<210>　20
<211>　10
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成小鼠抗-PCSK9單株抗體LFU720輕鏈互補決定區1(CDR1)
<400>　20
<210>　21
<211>　10
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成抗-PCSK9單株抗體純系LGT-209、LGT-210及LGT-211輕鏈互補決定區1(CDR1)
<400>　21
<210>　22
<211>　10
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成抗-PCSK9單株抗體共同序列輕鏈互補決定區1(CDR1)
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(1)...(1)
<223>　Xaa=Arg或Ser
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(4)...(4)
<223>　Xaa=Gln或Ser
<400>　22
<210>　23
<211>　7
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成小鼠抗-PCSK9單株抗體LFU720輕鏈互補決定區2(CDR2)
<400>　23
<210>　24
<211>　7
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成抗-PCSK9單株抗體純系LGT-209、LGT-210及LGT-211輕鏈互補決定區1(CDR1)
<400>　24
<210>　25
<211>　7
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成抗-PCSK9單株抗體共同序列輕鏈互補決定區2(CDR2)
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(1)...(1)
<223>　Xaa=Gly或Leu
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(2)...(2)
<223>　Xaa=Thr或Val
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(4)...(4)
<223>　Xaa=Asn或Arg
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(5)...(5)
<223>　Xaa=Leu或Arg
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(7)...(7)
<223>　Xaa=Ser或Thr
<400>　25
<210>　26
<211>　9
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成小鼠抗-PCSK9單株抗體LFU720及抗-PCSK9單株抗體純系LGT-209、LGT-210及LGT-211輕鏈互補決定區3(CDR3)
<400>　26
<210>　27
<211>　98
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成抗-PCSK9單株抗體純系LGT-209、LGT-210及LGT-211重鏈可變區段(FR1-FR3)
<400>　27
<210>　28
<211>　98
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成抗-PCSK9單株抗體共同序列重鏈可變區段(FR1-FR3)
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(31)...(31)
<223>　Xaa=Asp或Thr
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(56)...(56)
<223>　Xaa=Ala、Glu或Gly
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(61)...(61)
<223>　Xaa=Ala或Asp
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(62)...(62)
<223>　Xaa=Pro或Gln
<220>
<221>　VARIANT
(222>　(66)...(66)
<223>　Xaa=Ala或Gly
<400>　28
<210>　29
<211>　87
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成抗-PCSK9單株抗體pJG10(純系LGT-209及LGT-211)Vk輕鏈可變區段(FR1-FR3)
<400>　29
<210>　30
<211>　87
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成抗-PCSK9單株抗體pJG10(純系LGT-209及LGT-211)Vk輕鏈可變區段(FR1-FR3)
<400>　30
<210>　31
<211>　87
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成抗-PCSK9單株抗體pJG01(純系LGT-209、LGT-210及LGT-211)共同Vk輕鏈可變區段(FR1-FR3)
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(4)...(4)
<223>　Xaa=Leu或Met
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(24)...(24)
<223>　Xaa=Arg或ser
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(27)...(27)
<223>　Xaa=Gln或Ser
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(49)...(49)
<223>　Xaa=Gly或Leu
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(50)...(50)
<223>　Xaa=Thr或Val
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(52)...(52)
<223>　Xaa=Asn或Arg
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(53)...(53)
<223>　Xaa=Leu或Arg
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(55)...(55)
<223>　Xaa=Ser或Thr
<400>　31
<210>　32
<211>　30
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>　
<223>　合成抗-PCSK9單株抗體純系LGT-209、LGT-210及LGT-211共同序列重鏈構架區1(FR1)
<400>　32
<210>　33
<211>　14
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成抗-PCSK9單株抗體純系LGT-209、LGT-210及LGT-211重鏈構架區2(FR2)
<400>　33
<210>　34
<211>　32
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>　
<223>　合成抗-PCSK9單株抗體純系LGT-209、LGT-210及LGT-211重鏈構架區3(FR3)
<400>　34
<210>　35
<211>　11
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成抗-PCSK9單株抗體純系LGT-209、LGT-210及LGT-211重鏈構架區4(FR4)
<400>　35
<210>　36
<211>　22
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成抗-PCSK9單株抗體純系LGT-209、LGT-210及LGT-211共同輕鏈構架區1(FR1)
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(4)...(4)
<223>　Xaa=Leu或Met
<400>　36
<210>　37
<211>　15
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成抗-PCSK9單株抗體純系LGT-209、LGT-210及LGT-211輕鏈構架區2(FR2)
<400>　37
<210>　38
<211>　32
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成抗-PCSK9單株抗體純系LGT-209、LGT-210及LGT-211輕鏈構架區3(FR3)
<400>　38
<210>　39
<211>　10
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成抗-PCSK9單株抗體純系LGT-209、LGT-210及LGT-211輕鏈構架區4(FR4)
<400>　39
<210>　40
<211>　118
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成抗-PCSK9單株抗體共同序列重鏈可變區(FR1-FR4)
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(31)...(31)
<223>　Xaa=Asp或Thr
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(56)...(56)
<223>　Xaa=Ala、Glu或Gly
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(61)...(61)
<223>　Xaa=Ala或Asp
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(62)...(62)
<223>　Xaa=Pro或Gln
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(66)...(66)
<223>　Xaa=Ala或Gly
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(104)...(104)
<223>　Xaa=Ala或Asn
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(107)...(107)
<223>　Xaa=Ala、Phe、Ser、Val或Tyr
<400>　40
<210>　41
<211>　106
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成抗-PCSK9單株抗體共同序列輕鏈可變區(FR1-FR4)
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(4)...(4)
<223>　Xaa=Leu或Met
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(24)...(24)
<223>　Xaa=Arg或Ser
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(27)...(27)
<223>　Xaa=Gln或Ser
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(49)...(49)
<223>　Xaa=Gly或Leu
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(50)...(50)
<223>　Xaa=Thr或Val
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(52)...(52)
<223>　Xaa=Asn或Arg
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(53)...(53)
<223>　Xaa=Leu或Arg
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(55)...(55)
<223>　Xaa=Ser或Thr
<400>　41
<210>　42
<211>　354
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成抗-PCSK9單株抗體pJG04(純系LGT-209及LGT-210)重鏈
<400>　42
<210>　43
<211>　354
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成抗-PCSK9單株抗體pSR74(純系LGT-211)重鏈
<400>　43
<210>　44
<211>　318
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成抗-PCSK9單株抗體pJG01(純系LGT-210)輕鏈
<400>　44
<210>　45
<211>　318
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成抗-PCSK9單株抗體pJG10(純系LGT-209及LGT-211)輕鏈
<400>　45
<210>　46
<211>　13
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成抗-PCSK9單株抗體抗原決定基
<400>　46
<210>　47
<211>　692
<212>　PRT
<213>　智人
<220>
<223>　人類前趨蛋白轉化酶枯草溶菌素/kexin 9型(PCSK9)、前趨蛋白轉化酶9(PC9)、神經細胞凋亡調節轉化酶1(NARC1，NARC-1)、FH3、HCHOLA3、LDLCQ1前趨蛋白原
<220>
<221>　SIGNAL
<222>　(1)...(30)
<223>　信號肽
<220>
<221>　PROPEP
<222>　(31)...(692)
<223>　前趨蛋白
<220>
<221>　CHAIN
<222>　(153)...(692)
<223>　成熟蛋白質
<400>　47
<210>　48
<211>　3636
<212>　DNA
<213>　智人
<220>
<221>　CDS
<222>　(292)...(2370)
<223>　人類前趨蛋白轉化酶枯草溶菌素/kexin 9型(PCSK9)、前趨蛋白轉化酶9(PC9)、神經細肥凋亡調節轉化酶1(NARC1，NARC-1)、FH3、HCHOLA3、LDLCQ1前趨蛋白原
<220>
<221>　sig_peptide
<222>　(292)...(381)
<223>　信號肽
<220>
<221>　misc_structure
<222>　(382)...(2367)
<223>　前趨蛋白原
<220>
<221>　mat_peptide
<222>　(538)...(2367)
<223>　成熟蛋白質
<400>　48
<210>　49
<211>　13
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成抗-PCSK9 C末端抗原決定基，殘基680-692
<400>　49
<210>　50
<211>　11
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　抗-PCSK9重鏈J-區段中之合成人類生殖系JH4部分序列
<400>　50
<210>　51
<211>　15
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　來自人類生殖系JH4之合成全長J-區段
<400>　51
<210>　52
<211>　10
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　抗-PCSK9輕鏈J-區段中之合成人類生殖系Jk2部分序列
<400>　52
<210>　53
<211>　12
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　來自人類生殖系Jk2之合成全長J-區段
<400>　53
<210>　54
<211>　354
<212>　DNA
<213>　小家鼠
<220>
<223>　小鼠抗-PCSK9單株抗體LFU270重鏈可變區
<400>　54
<210>　55
<211>　318
<212>　DNA
<213>　小家鼠
<220>
<223>　小鼠抗-PCSK9單株抗體LFU270輕鏈可變區
<400>　55
<210>　56
<211>　5
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成PCSK9 C末端突變體A685X
<400>　56
<210>　57
<211>　6
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成C末端his6標籤、6-His標籤、HIS標籤
<400>　57
<210>　58
<211>　19
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　重鏈可變區之合成RT-PCR擴增引子V-H14
<400>　58
<210>　59
<211>　39
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　重鏈可變區之合成RT-PCR擴增引子HC恆定區
<400>　59
<210>　60
<211>　21
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　輕鏈可變區之合成RT-PCR擴增引子Vκ4/5
<400>　60
<210>　61
<211>　29
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　輕鏈可變區之合成RT-PCR擴增引子LC恆定區
<400>　61
<210>　62
<211>　11
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成C末端可撓性連接子及6-His標籤
<400>　62
<210>　63
<211>　17
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　用於定點生物素化之合成Avi標籤
<400>　63
<210>　64
<211>　5
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　SR066之合成CDRH1(經人類化工程改造)
<400>　64
<210>　65
<211>　5
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　SR038之合成CDRH1(小鼠)
<400>　65
<210>　66
<211>　5
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　SR079之合成CDRH1(經人類化工程改造)
<400>　66
<210>　67
<211>　4
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成7472輕鏈(LC)N末端
<400>　67
<210>　68
<211>　12
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成7472輕鏈(LC)CDR1
<400>　68
<210>　69
<211>　4
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成LFU720及pJG10輕鏈(LC)N末端
<400>　69
<210>　70
<211>　10
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成LFU720輕鏈(LC)互補決定區1(CDR1)
<400>　70
<210>　71
<211>　10
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成pJG10輕鏈(LC)互補決定區1(CDR1)
<400>　71
<210>　72
<211>　12
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成7472及LFU720重鏈CDR3(CDRH3)
<400>　72
<210>　73
<211>　12
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成pJG04重鏈CDR3(CDRH3)
<400>　73
<210>　74
<211>　17
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成抗-PCSK9重鏈CDR2
<400>　74
<210>　75
<211>　9
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成抗-PCSK9重鏈CDR3
<221>　VARIANT
<222>　(6)...(6)
<223>　Xaa=Ala或Asn
<400>　75
<210>　76
<211>　23
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成抗-PCSK9輕鏈FR1
<220>
<221>　VARIANT
<222>　(4)...(4)
<223>　Xaa=Met或Leu
<400>　76
圖1說明親本小鼠單株抗體NVP-LFU720之重鏈(SEQ ID NO:1)及輕鏈(SEQ ID NO:15)胺基酸序列。CDR1、CDR2及CDR3之序列加下劃線並以粗體表示；
圖2說明親本小鼠單株抗體NVP-LGT209之重鏈(SEQ ID NO:2)及輕鏈(SEQ ID NO:16)胺基酸序列。CDR1、CDR2及CDR3之序列加下劃線並以粗體表示；
圖3說明親本小鼠單株抗體NVP-LGT210之重鏈(SEQ ID NO:2)及輕鏈(SEQ ID NO:18)胺基酸序列。CDR1、CDR2及CDR3之序列加下劃線並以粗體表示；
圖4說明親本小鼠單株抗體NVP-LGT211之重鏈(SEQ ID NO:4)及輕鏈(SEQ ID NO:16)胺基酸序列。CDR1、CDR2及CDR3之序列加下劃線並以粗體表示；
圖5A至圖5C說明測試NVP-LGT209(A)、NVP-LGT210(B)及NVP-LGT-211(C)相較於NVP-LFU720-NX-4與若干不同人類及小鼠抗原之結合的ELISA檢定；
圖6A至圖6C說明NVP-LGT209(A)、NVP-LGT210(B)及NVP-LGT-211(C)在ELISA中與人類及獼猴Pcsk9之結合。二次抗體為已按1:5000稀釋之山羊抗小鼠。僅二次抗體為僅有二次抗體之對照組；
圖7說明親本小鼠單株抗體NVP-LFU720結合至PCSK9之C-末端殘基680-692(RSRHLAQASQELQ；SEQ ID NO:49)。HumaneeredTM抗體LGT209、LGT210及LGT211競爭相同抗原決定基。C末端突變體A685X=SEQ ID NO:56；
圖8說明親本小鼠抗體NVP-LFU720(5P20)不充分地破壞PCSK9與LDL-R之相互作用，如在時差式螢光共振能量轉移(TR-FRET)生物化學檢定中所測定。相比之下，13C10破壞PCSK9-LDL-R FRET相互作用，IC50為50 nM。在室溫下，在檢定緩衝液(20 mM HEPES(pH 7.2)、150 mM NaCl、1 mM CaCl2、0.1% v/v Tween 20及0.1% w/v BSA)中將標記有螢光團之人類PCSK9(hPCSK9-AF)與NVP-LFU720-AX-1或13C10一起培育30分鐘。此後添加經銪標記之LDL-R(hLDL-R-Eu)，並再在室溫下培育90分鐘，以使最終濃度為8 nM hPcsk9-AF及1 nM hLDL-R-Eu。用板式讀數器(EnVision 2100，Perkin Elmer)量測TR-FRET信號(330 nm激發及665 nm發射)，並計算在5P20或13C10存在下之抑制%。藉由在Prism(GraphPad)中繪製抑制百分比值曲線來計算IC50值。各數據點為平均值±SD(n=每點4次重複)。數據表示至少兩次獨立的實驗；
圖9說明HumaneeredTM抗體LGT209、LGT210及LGT211在引起LDL-R含量及HepG2細胞對LDL之攝取增加的方面與小鼠抗體LFU720等同。在LDL-R量測中，將細胞與PCSK9結合抗體一起培育並用抗LDL-R抗體標記。在LDL攝取中，將細胞與PCSK9結合抗體PCSK9及DiI-LDL一起培育。藉由流動式細胞測量術量測LDL-R抗體及DiI-LDL螢光。圖上顯示各檢定重複量測之平均值+SEM。結果為3次獨立實驗的結果；
在LDL攝取檢定中，在室溫下，在含有10%缺乏脂蛋白之胎牛血清(Intracel)及200 nM人類PCSK9之DMEM中培育PCSK9結合抗體30分鐘(Hampton等人，PNAS(2007)104:14604-14609)，且向96孔板中之細胞中添加抗體/PCSK9/培養基溶液並培育隔夜。第二天，添加經1,1'-二(十八烷基)-3,3,3',3'-四甲基-吲哚碳菁過氯酸鹽標記之LDL(DiI-LDL，Biomedical Technologies)，再歷時2小時。接著吸出培養基，用PBS洗滌細胞三次，並用0.25%胰蛋白酶-EDTA使細胞解離。接著將細胞轉移至FACS緩衝液(含5%胎牛血清、2 mM EDTA及0.2%疊氮化鈉之PBS)中，在1000×g下離心10分鐘，吸出並在1%多聚甲醛中固定。用細胞DiI螢光(在488 nm下激發及在575 nm下發射)使用流動式細胞測量術(Becton Dickinson LSR II)量測LDL攝取。在表面LDL-R檢定中，將細胞與含抗體之無血清培養基一起培育，用PBS洗滌，並在Versine(Biowhittaker，17-771E)及FACS緩衝液中加以收集。將細胞轉移至新板中，在1200 rpm下離心5分鐘，並用正常兔IgG(MP biomedicals)阻斷。用FACS緩衝液中的兔抗hLDL-R-Alexa 647 IgG(5 μg/ml)標記抗體標記細胞，離心，洗滌，並在1%多聚甲醛中固定。藉由流動式細胞測量術(488 nm激發及633 nm發射)量測表面LDL-R。使用Prism(GraphPad)計算EC50；
圖10提供旨在測定本發明抗體降低膽固醇之作用的人類PCSK9輸注小鼠模型之研究設計圖解。LGT209、LGT210及LGT211為以高親和力結合至hPCSK9但與鼠類PCSK9無可偵測之結合的HumaneeredTM抗PCSK9抗體。為了測試LGT209、LGT210或LGT211是否可抑制hPCSK9介導之非HDL膽固醇升高並防止PCSK9介導之肝LDLR降解，將抗體各自注射至小鼠體內3小時，接著植入含hPCSK9之滲透性微型泵(用於連續輸注)。在注入hPCSK9後24小時，收集血漿及肝組織；
圖11顯示在輸注小鼠模型中用抗體LGT209、LGT210及LGT211處理引起人類PCSK9(「hPCSK9」)之積累。簡而言之，藉由ELISA使用mAb 7D16捕捉來量測總hPCSK9。mAb 7D16結合PCSK9上不同於LGT209、LGT210及LGT211之抗原決定基，且可用於量測總(游離及結合之)PCSK9。所觀察之總hPCSK9增加大概歸因於hPCSkK9/Ab複合物的增加。藉由ELISA使用hPCSK9捕捉來量測游離抗體。此檢定量測「游離」抗體，且可能量測1:1 Ab:PCSK9複合物。對C57BL/6小鼠用單獨媒劑、單獨PCSK9、PCSK9+20 mg/kg LGT210、PCSK9+20 mg/kg NVP-LGT211、或小鼠非特異性IgG混合物(陰性對照)處理。繪出個別數據點，用橫條劃出平均值；p<0.05可視為顯著的；
藉由Meso Scale Discovery(MSD)檢定定量血漿IgG含量。使用hPCSK9捕捉來量測游離抗體。此檢定量測「游離」抗體，且可能量測1:1 Ab:PCSK9複合物。在IgG MSD檢定中，使用MSD標準96板(L11XA-3)。簡而言之，在4℃下用25至28 μl捕捉抗原PCSK9-His(於PBS中，1微克/毫升)塗佈板(25-28奈克/孔)隔夜。移除塗佈溶液，並用150微升/孔5%MSD阻斷劑A(R93AA-2)，在室溫下振盪1小時來阻斷板。在用PBS+0.05% Tween-20(300 μl×3次)洗滌板後，添加25 μl IgG校正物稀釋物(以MSD阻斷劑A作10次連續稀釋，自10,000至0.0003 ng/ml)、未知血漿樣本稀釋物(10,000×，用MSD阻斷劑A稀釋)或品質控制樣本，並在室溫下振盪培育1小時。在洗滌後，以25微升/孔添加1 μg/ml偵測抗體(MSD山羊抗小鼠SULFO-TAG標記偵測抗體，R32AC-5，經1% BSA/PBS/0.05% Tween 20稀釋)，並在室溫下振盪培育1小時。在洗滌並以150微升/孔添加1×讀數緩衝液T後，立即在MSD SECTOR Imager 6000上對板讀數。使用MSD資料分析軟體得出標準曲線圖及算出未知樣本；
藉由Meso Scale Discovery(MSD)檢定定量血漿IgG及hPCSK9含量。MSD hPCSK9檢定類似於IgG檢定，但具有以下例外。用25-28 μl捕捉抗體(7D16.C3：2.95 mg/ml)以1 μg/ml塗佈板。mAb 7D16結合PCSK9上不同於LGT209、LGT210及LGT211之抗原決定基，且可用於量測總(游離及結合之)PCSK9。在阻斷板後，將25 μl hPCSK9校正物稀釋物(10個點，自10,000至0.0003 ng/ml)及血漿樣本稀釋物(10,000×，用MSD阻斷劑A稀釋)在室溫下振盪培育1小時，接著與一次偵測抗體(兔抗PCSK9多株抗體，Ab4，自製兔ID #RB11835)一起培育。增加二次偵測抗體(MSD山羊抗兔SULFO-TAG標記偵測抗體，R32AB-5)之培育步驟，接著用MSD SECTOR Imager 6000讀數。所觀察之總hPCSK9增加大概歸因於hPCSkK9/Ab複合物的增加。使用GraphPad Prism 4.02(GraphPad software，San Diego，CA)進行統計分析。使用單因子ANOVA來分析組間差異，且當發現總體差異時，使用Newman-Keuls事後檢驗來測定處理組間的特定差異；
圖12說明在輸注小鼠模型中抗體LGT209、LGT210及LGT211使得肝LDL-R不受hPCSK9介導之降解影響。對C57BL/6小鼠用單獨媒劑、單獨PCSK9、PCSK9+20 mg/kg LGT210、PCSK9+20 mg/kg NVP-LGT211、或小鼠非特異性IgG混合物(陰性對照)處理。展示來自個別動物之肝樣本的數據；
使用20泳道4-12% Bis-Tris Invitrogen Midi凝膠(Invitrogen WG1402BX10)用MOPS電泳緩衝液(Invitrogen NP0001)對質膜樣本進行聚丙烯醯胺凝膠電泳。在70℃下加熱所製備之樣本10分鐘，置於冰上，接著使用Matrix多通道移液器將10 μl各樣本裝載於凝膠上。沿樣本裝載SeeBlue Plus2標記(Invitrogen LC5925)以便進行尺寸測定及凝膠定向。在200 V之恆定電壓下對凝膠進行電泳，直至染料前沿達到凝膠底部。在電泳後，使用iBlot單元(Invitrogen IB1001EU)將凝膠轉移至硝化纖維素膜(Invitrogen IB3010-01)。轉移在20 V下進行7分鐘。在轉移後，用Pierce Superblock T20(Pierce 37536)阻斷該等膜至少30分鐘。將膜置於「雜交袋(seal-a-meal)」中，接著添加兔抗LDLR抗體於Superblock中之1:500稀釋物，接著在4℃下振盪培育隔夜。各膜在TBS/0.05% Tween中振盪沖洗5次，歷時5分鐘，接著向該等膜中添加山羊抗兔HRP二次抗體於Superblock中之1:30,000稀釋物，歷時1小時。各膜再在TBS/0.05% Tween中振盪沖洗5次，歷時5分鐘。使用Pierce SuperSignal West Pico化學發光受質(Pierce 37079)根據製造商說明書偵測HRP結合物。簡而言之，混合相等份數之過氧化物溶液及魯米諾/增強劑溶液，並添加至該等膜上(0.2 ml/cm2)，歷時5分鐘。藉由吸乾來移除過量溶液，並使該等膜暴露於Kodak BioMax MR X射線底片(Kodak 870 1302)以供曝光；
圖13A至圖13C說明在hPCSK9輸注小鼠模型中抗體LGT209、LGT210及LGT211引起血漿非HDL膽固醇降低。預先注射LGT209抗體對hPCSK9介導之非HDL膽固醇升高的防止達46%。預先注射LGT210或LGT211等同或以更高程度防止hPCSK9介導之非HDL膽固醇升高。13C10為以高親和力結合至hPCSK9之經驗證鼠類抗PCSK9抗體，且在此檢定中用作陽性對照物。對C57BL/6小鼠用單獨媒劑、單獨PCSK9、PCSK9+20 mg/kg LGT209、PCSK9+20 mg/kg LGT210、PCSK9+20 mg/kg NVP-LGT211、PCSK9+20 mg/kg 13C10、或小鼠非特異性IgG混合物(陰性對照)處理。圖上展示個別值，用橫條劃出平均值。為了定量血漿總膽固醇含量，使用Olympus臨床分析儀(Olympus America Inc.：Olympus AU400)。將血漿樣本按1:3稀釋於ddH2O中，並根據製造商說明書定量40 μl經稀釋之血漿樣本的總膽固醇含量。為了定量血漿HDL及非HDL，使用獲自Helena Laboratories之Spife 3000獲得脂蛋白膽固醇部分。所有程序，包括樣本製備、凝膠製備、樣本施加、凝膠電泳、染色、洗滌及乾燥，均按照操作手冊中所提供之說明進行。接著，在Quick Scan 2000中使用Slit 5掃描凝膠，並使用Helena密度計計算脂蛋白膽固醇部分之相對百分比。最後，藉由各部分之百分比與總膽固醇含量相乘來計算HDL及非HDL之絕對值；及
圖14說明抗體LGT209、LGT210及LGT211(人類IgG1沉默)之大鼠藥物動力學(PK)圖形與「典型」IgG1(PK)圖形之比較。與典型IgG1半衰期(約6天)相比，抗體LGT209、LGT210及LGT211之半衰期顯著更長(7-13天)(例如，如在人類個體中所測定)。不存在靶介導之傾向(TMD)的跡象，此表明該等抗體不與齧齒動物PCSK9起交叉反應。對於各測試抗體，以10 mg/kg對3隻雄性Lewis大鼠進行注射。在時間=0、1、6、24小時、2、4、8及16天時，獲取250 μl血液樣本，且稀釋已變澄清之血漿並在捕捉ELISA(山羊抗人類IgG)中進行評估以量測所回收之總人類抗體。亦生成各測試抗體之標準曲線。將所回收之IgG之量相對於典型人類IgG在大鼠中之預期回收量進行繪圖。
(無元件符號說明)

Claims (18)

  1. 一種結合至前趨蛋白轉化酶枯草溶菌素/Kexin 9型(PCSK9)之抗體，其中該抗體包含重鏈V區段及輕鏈V區段，其各包含互補決定區1(CDR1)、互補決定區2(CDR2)及互補決定區3(CDR3)，其中：i)該重鏈V區段之該CDR1包含SEQ ID NO：7；ii)該重鏈V區段之該CDR2包含SEQ ID NO：10；iii)該重鏈CDR3包含選自由SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：13組成之群的胺基酸序列；iv)該輕鏈V區段之該CDR1包含SEQ ID NO：21；v)該輕鏈V區段之該CDR2包含SEQ ID NO：24；及vi)該輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：26。
  2. 如請求項1之抗體，其中該重鏈可變區與SEQ ID NO：40之可變區具有至少90%胺基酸序列一致性，且該輕鏈可變區與SEQ ID NO：41之可變區具有至少90%胺基酸序列一致性，或其中該重鏈可變區與SEQ ID NO：40之可變區具有至少95%胺基酸序列一致性，且該輕鏈可變區與SEQ ID NO：41之可變區具有至少95%胺基酸序列一致性，或其中該抗體包含包含SEQ ID NO：40之重鏈及包含SEQ ID NO：41之輕鏈，或其中該重鏈可變區與選自由SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：4組成之群的可變區具有至少90%胺基酸序列一致性，且該輕鏈可變區與選自由SEQ ID NO：16及SEQ ID NO：18組成之群的可變區具有至少90%胺基酸序列一致性，或其中該重鏈可變區與選自由SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：4組成之群的可變區具有至少95%胺基酸序列一致性，且該輕鏈可變區與選自由SEQ ID NO：16及SEQ ID NO：18組成之群的可變區具有至少95%胺基酸序列一致性，或其中該重鏈可變區包含選自由SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：4組成之群的胺基酸序列，且該輕鏈可變區包含選自由SEQ ID NO：16及SEQ ID NO：18組成之群的胺基酸序列。
  3. 如請求項1之抗體，其中該抗體為FAb'片段，或其中該抗體為IgG，或其中該抗體為單鏈抗體(scFv)，或其中該抗體包含人類恆定區，或其中該抗體被連接至載體蛋白質，或其中該抗體經PEG化。
  4. 一種特異性結合PCSK9之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區及該輕鏈可變區各包含以下三個互補決定區(CDR)：CDR1、CDR2及CDR3，其中：i)該重鏈可變區之該CDR1包含胺基酸序列SEQ ID NO：8； ii)該重鏈可變區之該CDR2包含胺基酸序列SEQ ID NO：11；iii)該重鏈可變區之該CDR3包含胺基酸序列SEQ ID NO：14；iv)該輕鏈可變區之該CDR1包含胺基酸序列SEQ ID NO：22；v)該輕鏈可變區之該CDR2包含胺基酸序列SEQ ID NO：25；vi)該輕鏈可變區之該CDR3包含胺基酸序列SEQ ID NO：26。
  5. 一種特異性結合PCSK9之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區及該輕鏈可變區各包含以下三個互補決定區(CDR)：CDR1、CDR2及CDR3，其中：i)該重鏈可變區之該CDR1包含選自由SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：7組成之群的胺基酸序列；ii)該重鏈可變區之該CDR2包含選自由SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10組成之群的胺基酸序列；iii)該重鏈可變區之該CDR3包含選自由SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：13組成之群的胺基酸序列；iv)該輕鏈可變區之該CDR1包含選自由SEQ ID NO：20及SEQ ID NO：21組成之群的胺基酸序列；v)該輕鏈可變區之該CDR2包含選自由SEQ ID NO：23及SEQ ID NO：24組成之群的胺基酸序列；vi)該輕鏈可變區之該CDR3包含胺基酸序列SEQ ID NO：26。
  6. 一種組合物，其包含如請求項1之抗體及生理學上相容之賦形劑。
  7. 如請求項6之組合物，其中該組合物進一步包含可降低個體之低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量的第二藥劑。
  8. 如請求項7之組合物，其中該第二藥劑為史他汀類抑制素。
  9. 如請求項8之組合物，其中該史他汀類抑制素係選自由阿托伐他汀(atorvastatin)、西立伐他汀(cerivastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、美伐他汀(mevastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、普伐他汀(pravastatin)、羅素他汀(rosuvastatin)及辛伐他汀(simvastatin)組成之群。
  10. 如請求項7之組合物，其中該第二藥劑係選自由纖維酸酯、菸鹼酸及其類似物、膽固醇吸收抑制劑、膽汁酸螯合劑、甲狀腺激素模擬物、微粒體三酸甘油酯轉移蛋白(MTP)抑制劑、二醯基甘油醯基轉移酶(DGAT)抑制劑、靶向PCSK9之抑制性核酸及靶向apoB100之抑制性核酸組成之群。
  11. 一種如請求項1之抗體之用途，其係用於製造為有需要之個體降低LDL-C的藥物。
  12. 如請求項11之用途，其中該個體對史他汀類抑制素療法具低反應性或抗性，或其中該個體不耐受史他汀類抑制素療法， 或其中該個體之基線LDL-C含量為至少約100mg/dL，或其中該個體患有家族性高膽固醇血症，或其中總膽固醇隨LDL-C而降低，或其中該個體患有三酸甘油酯血症，或其中該個體具有功能獲得型PCSK9基因突變，或其中該個體患有藥物誘導之血脂異常。
  13. 如請求項11之用途，其中該抗體係與可有效降低LDL-C之治療有效量之第二藥劑一起投與至該個體。
  14. 如請求項13之用途其中該第二藥劑為史他汀類抑制素。
  15. 如請求項14之用途，其中該史他汀類抑制素係選自由阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、羅素他汀及辛伐他汀組成之群。
  16. 如請求項13之用途，其中該第二藥劑係選自由纖維酸酯、菸鹼酸及其類似物、膽固醇吸收抑制劑、膽汁酸螯合劑、甲狀腺激素模擬物、微粒體三酸甘油酯轉移蛋白(MTP)抑制劑、二醯基甘油醯基轉移酶(DGAT)抑制劑、靶向PCSK9之抑制性核酸及靶向apoB100之抑制性核酸組成之群。
  17. 如請求項13之用途，其中該抗體及該第二藥劑係供混合物形式共同投與，或其中該抗體及該第二藥劑係供獨立地共同投與。
  18. 如請求項11之用途，其中該抗體係供靜脈內投與，或其中該抗體係供皮下投與。
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