ES2366974T3 - Compuestos y procedimientos para modular la expresión de sglt2. - Google Patents

Abstract

Un compuesto antisentido corto de 10 a 14 monómeros de longitud, que comprende una región hueco de 2'desoxirribonucleótido flanqueada en cada lado por un ala, en el que cada ala consiste de forma independiente en 1 a 3 monómeros modificados de alta afinidad que son nucleótidos modificados con azúcar que comprenden un puente entre la posición 4' y 2' del azúcar, y en el que el compuesto antisentido corto está dirigido a un ácido nucleico que codifica SGLT

Description

Antecedentes

Utilizar las secuencias génicas causantes de enfermedad como diana fue sugerido por primera vez hace casi 40 años (Belikova y col., Tet.Lett., 1967, 37, 3557-3562) y, una década más tarde, se demostró la actividad antisentido en cultivos celulares (Zamecnik y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 1978, 75, 280-284). Una ventaja de la tecnología antisentido en el tratamiento de una enfermedad o afección producida por un gen causante de enfermedad es que es un enfoque genético directo que tiene la capacidad para modular la expresión de genes causantes de enfermedades específicas.

En general, el principio detrás de la tecnología antisentido es que un compuesto antisentido hibrida con un ácido nucleico diana y efectúa la modulación de la actividad de la expresión génica o su función, tal como la transcripción, la traducción o el corte y empalme. La modulación de la expresión génica se puede conseguir mediante, por ejemplo, degradación de la diana o inhibición basada en la ocupación. Un ejemplo de modulación de la función diana del ARN mediante degradación es la RNasa, degradación basada en H del ARN diana por hibridación con un compuesto antisentido similar a ADN. Otro ejemplo de modulación de la expresión génica mediante degradación diana es por el ARN de interferencia (ARNi). El ARNi es una forma de silenciamiento génico mediado por antisentido, que implica la introducción de ARNds, que conduce a la reducción específica de secuencia de los niveles de ARNm endógeno objetivo, La especificidad de secuencia convierte a los compuestos antisentido en herramientas extremadamente atractivas par la validación de dianas y la funcionalización génica, así como herramientas de investigación para identificar y caracterizar nucleasas y como agentes terapéuticos para modular de forma selectiva la expresión de genes implicados en la patogenia de una cualquiera de diversas enfermedades.

La tecnología antisentido es un medio eficaz para reducir la expresión de uno o más productos génicos específicos y, por tanto, se puede demostrar que son únicos en su utilidad en una serie de aplicaciones terapéuticas, diagnósticas y de investigación. De forma rutinaria se usan nucleósidos químicamente modificaros para su incorporación en compuestos antisentido con el objetivo de potenciar una o más propiedades, tales como la resistencia a las nucleasas, la farmacocinética o la afinidad por un ARN diana.

A pesar de la expansión de la información desde el descubrimiento de la tecnología antisentido, sigue existiendo la necesidad no satisfecha de compuestos antisentido con mayor eficacia, menor toxicidad y menores costes. Hasta la presente revelación no se han empleado modificaciones de alta afinidad en el diseño de compuestos antisentido cortos para reducir el ARN diana in vivo. Esto es por los problemas con el grado de especificidad diana que habría empleado una secuencia de nucleótidos o más corta para reducir la diana en un sistema vivo. En estudios previos se ha descrito que se consigue mayor especificidad y, por tanto, mayor potencial de potencia, con los compuestos antisentido de longitud entre 16 y 20 bases nucleotídicas.

El documento WO 2005/038013 (ISIS PHARMACEUTICALS, INC.) describe compuestos antisentido y procedimientos para modular la expresión de genes diana expresados en el riñón.

El documento WO 2005/02552 (ISIS PHARMACEUTICALS, INC.) describe composiciones y procedimientos para modular la expresión de SGLT2.

La presente revelación describe que la incorporación de nucleótidos de alta afinidad químicamente modificados en compuestos antisentido permite compuestos antisentido de una longitud de 8-16 bases nucleotídicas útiles para la reducción de los ARN diana en animales con mayor potencia y mejor índice terapéutico. Por tanto, en el presente documento se proporcionan compuestos antisentido que comprenden modificaciones en nucleótidos de alta afinidad útiles para reducir un ARN diana in vivo. Dichos compuestos antisentido cortos son eficaces a dosis menores que los compuestos antisentido descritos anteriormente, lo que permite una reducción de la toxicidad y los costes de tratamiento.

Sumario de la invención

La invención proporciona un compuesto antisentido corto de 10 a 14 monómeros de longitud, que comprende una región hueco en 2'-desoxirribonucleótido flanqueada por cada lado por un ala, en la que cada ala consta de forma independiente de 1 a 3 monómeros modificados de alta afinidad que son nucleótidos modificados con azúcar que comprenden un puente entre la posición 4' y 2' del azúcar, y en el que el compuesto antisentido está dirigido a un ácido nucleico que codifica SGLT2.

La invención también proporciona un compuesto antisentido corto de 10 a 14 monómeros de longitud, que comprende una región hueco en 2'-desoxirribonucleótido flanqueada por cada lado por un ala, en la que cada ala consta de forma independiente de 1 a 3 monómeros modificados de alta afinidad que son nucleótidos modificados con azúcar que comprenden el grupo OCH2CH2OCH3 sustituido en 2’ y en el que el compuesto antisentido está dirigido a un ácido nucleico que codifica SGLT2.

La invención también proporciona un procedimiento ex vivo de modular la expresión de SGLT2 poniendo en contacto un ácido nucleico de SGLT2 con un compuesto antisentido corto tal como se ha descrito anteriormente.

La invención también proporciona el compuesto antisentido corto tal como se ha descrito anteriormente para uso en el tratamiento de un trastorno metabólico en un animal.

Otros aspectos de la invención se exponen en las reivindicaciones adjuntas.

Sumario de la divulgación

En el presente documento se divulgan compuestos antisentido cortos y procedimientos de uso de dichos compuestos para reducir la expresión del ARN diana en células o tejidos. En ciertas realizaciones, en el presente documento se divulga un procedimiento de reducir la expresión de una diana en un animal, que comprende administrar al animal un compuesto antisentido corto dirigido al ácido nucleico de dicha diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos son compuestos oligonucleotídicos. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido cortos tienen una longitud de aproximadamente 8 a 16, preferentemente de 9 a 15, más preferentemente de 9 a 14, más preferentemente de 10 a 14, y comprenden una región hueco flanqueada por cada lado por un ala, en la que cada ala consta de forma independiente de 1 a 3 nucleótidos. Entre los motivos preferidos se incluyen motivos ala-hueco desoxi-ala seleccionados de 3-10-3, 2-10-3, 2-10-2, 1-10-1, 2-8-2, 1-8-1, 3-6-3 o 1-6

1. En una realización preferida, el oligonucleótido antisentido corto comprende al menos una modificación de alta afinidad. En una realización adicional, la modificación de alta afinidad incluye nucleótidos de alta afinidad químicamente modificados. En una realización preferida, cada ala consta de forma independiente de 1 a 3 nucleótidos modificados de alta afinidad. En una realidad, los nucleótidos modificados de alta afinidad son nucleótidos modificados con azúcar.

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos exhiben mayor captación en el intestino en comparación con los compuestos antisentido de mayor longitud. Por tanto, en el presente documento también se divulgan procedimientos de reducir una diana en un animal, que comprende administrar por vía oral los compuestos antisentido cortos de la presente divulgación.

También se divulgan procedimientos de tratamiento de un trastorno metabólico en un animal, que comprende administrar a un animal que necesite dicha terapia un compuesto antisentido corto dirigido a un ácido nucleico implicado en la regulación del metabolismo o aclaramiento de la glucosa, el metabolismo de los lípidos, el metabolismo del colesterol o la señalización de la insulina.

También se divulgan procedimientos de incremento de la sensibilidad a la insulina, disminución de la glucosa en sangre o disminución de HbA1c en un animal, que comprende administrar a dicho animal un compuesto antisentido corto dirigido a un ácido nucleico que codifica una diana implicada en la regulación del metabolismo o aclaramiento de la glucosa, el metabolismo de los lípidos, el metabolismo del colesterol o la señalización de la insulina.

Se divulgan procedimientos adicionales de disminución del colesterol total en suero, LDL sérica, VLDL sérica, HDL sérica, triglicéridos séricos, apolipoproteína(s) sérica(s) o ácidos grasos libres en un animal, que comprende administrar a dicho animal un compuesto antisentido corto dirigido a un ácido nucleico que codifica una diana implicada en la regulación del metabolismo o aclaramiento de la glucosa, el metabolismo de los lípidos, el metabolismo del colesterol o la señalización de la insulina, en el que dicho compuesto antisentido corto tiene una longitud de 8 a 16 nucleótidos y comprende una región hueco flanqueada por cada lado por un anal, en la que cada ala consta de forma independiente de 1 a 3 nucleótidos modificados de alta afinidad.

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos comprenden además un grupo conjugado. Entre los grupos conjugados se incluyen, C16 y colesterol.

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos comprenden al menos una base nucleotídica modificada, enlace internucleosídico o resto de azúcar. En ciertas realizaciones, dicho enlace internucleosídico modificado es un enlace internucleosídico fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico es un enlace internucleosídico fosforotioato.

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos comprenden al menos una modificación de alta afinidad. En ciertas de dichas realizaciones, la modificación de alta afinidad es un nucleótido de alta afinidad químicamente modificado. En ciertas realizaciones, los nucleótidos de alta afinidad químicamente modificados son nucleótidos modificados con azúcar. En ciertas realizaciones, al menos uno de los nucleótidos modificados con azúcar comprende un puente entre la posición 4’ y la posición 2’ del azúcar. Cada uno de los nucleótidos modificados con azúcar está, de forma independiente, en la conformación del azúcar ß-D o α-L En ciertas realizaciones, cada uno de dichos nucleótidos modificados confiere una Tm de al menos 1 a 4 grados por nucleótido. En ciertas realizaciones, cada uno de dichos nucleótidos modificados con azúcar comprende un grupo sustituyente en 2’ que es distinto a H o a OH. Dichos nucleótidos modificados con azúcar incluyen aquéllos que tienen un resto de azúcar bicíclico con puente en las posiciones 4' a 2’. En ciertas realizaciones, cada uno de los grupos sustituyentes en 2’ es, de forma independiente, alcoxi, alcoxi sustituido o halógeno. En ciertas realizaciones, cada uno de los grupos sustituyentes en 2’ es OCH2CH2OCH3 (2’-MOE).

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen uno o más nucleótidos modificados con azúcar, que comprenden un puente entre la posición 4’ y 2’ del azúcar, en los que cada uno de dichos puentes comprende de forma independiente de 2 a 4 grupos de unión seleccionados de forma independiente de -[C(R1)(R2)]n-, C(R1)=C(R2)-, -C(R1)=N-, -C(=NR1)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, n-Si(R1)2, -S(=O)x-y -N(R1)-;

en las que

xes 0, 1, o 2;;

n es 1, 2, 3 o 4;

cada R1 y R2 es, de forma independiente, H, un grupo protector, hidroxilo, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5C20, arilo C5-C20 sustituido, radical heterociclo, radical heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical alicíclico C5-C7, radical alicíclico C5-C7 sustituido, halógeno, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3 , COOJ1, acilo (C(=O)H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(=O)2-J1 o sulfoxilo (S(=O)-J1); y

y cada J1 y J2 es, de forma independiente, H, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, aminoalquilo C1-C12, aminoalquilo C1-C12 sustituido o un grupo protector.

En un aspecto, cada uno de dichos puentes es, de forma independiente, -[C(R1)(R2)]n-, -[C(R1)(R2)]n-O-, -C(R1R2)N(R1)-O-o nn-C(R1R2)-O-N(R1)-. En otro aspecto, cada uno de dichos puentes es, de forma independiente, 4’(CH2)3-2’, 4’-(CH2)2-2’, 4’-CH2O-2’, 4’-(CH2)2-O-2’, 4’-CH2-O-N(R1)-2’ y 4’-CH2-N(R1)-O-2’-, en el que cada R1 es, de forma independiente, H, un grupo protector o alquilo C1-C12.

En cierta realización, en el presente documento se divulgan compuestos antisentido cortos útiles en la reducción de dianas y/o ARN dianas asociados con estados de enfermedad en animales. En ciertas realizaciones se divulgan procedimientos de uso de compuestos antisentido cortos para reducir la expresión de un ARN diana en un animal. En ciertas realizaciones en el presente documento se divulga el uso de un compuesto antisentido corto en la divulgación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno metabólico en un animal. En ciertas realizaciones en el presente documento se divulga el uso de un compuesto antisentido corto en la preparación de un medicamento para incrementar la sensibilidad a la insulina, disminuir la glucosa en sangre o disminuir el HbA1c en un animal. También se divulga el uso de un compuesto antisentido corto en la preparación de un medicamento para disminuir el colesterol sérico total, los niveles de LDL en suero, los niveles de VLDL en suero, los niveles de HDL en suero, triglicéridos en suero, una poliproteína(a) en suero o ácidos grasos libres en un animal.

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos del presente documento exhiben una potencia igual o mayor con respecto al defectivo de ARN diana en comparación con el oligonucleótido antisentido parental más largo, de al menos 20 nucleótidos de longitud. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos exhiben un inicio de la acción más rápido (reducción del ARN diana) en comparación con el oligonucleótido antisentido parental. En ciertas realizaciones, el incremento de la potencia se produce en el riñón. En ciertas realizaciones, el ARN diana se expresa predominantemente en los riñones. En ciertas realizaciones, el incremento de la potencia se produce en el hígado. En ciertas realizaciones, el ARN diana se expresa predominantemente en el hígado.

Descripción detallada

Debe entenderse que tanto la descripción general anterior como la descripción detallada siguiente son ejemplos y explicaciones únicamente y no son restrictivas de la invención reivindicada. En el presente documento, el uso del singular incluye el plural a menos que específicamente se indique lo contrario. Como se usa en el presente documento, “o” significa “y/o”, a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término “que incluye”, así como otras formas, tales como "incluye" e "incluido" no es limitante. Asimismo, términos tales como “elemento” o “componente” abarcan tanto elementos como componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden más de una subunidad, menos que específicamente se indique lo contrario.

Los encabezados de sección usados en el presente documento son únicamente con motivos organizativos y no deben interpretarse como limitantes de la materia objeto descrita.

A. Definiciones

A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura usada en relación con la química analítica, la química orgánica sintética y la química medicinal y farmacéutica descritas en el presente documento y los procedimientos y técnicas de las mismas descritos en el presente documento son los bien conocidos y usados habitualmente en la técnica. Se pueden usar técnicas estándar para síntesis química, análisis químico, preparación farmacéutica, formulación y liberación, y tratamiento de sujetos. Algunas de estas técnicas y procedimientos se pueden encontrar en, por ejemplo, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research" Edited by Sangvi y Cook, American Chemical Society, Washington D.C., 1994; y "Remington’s Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, Pa., 18th edition, 1990

A menos que se especifique lo contrario, los siguientes términos tienen los significados siguientes:

Como se usa en el presente documento, el término “nucleósido” quiere decir una glicosilamina que comprende una base nucleotídica y un azúcar. Nucleósidos incluyen, entre otros, nucleósidos naturales, nucleósidos abásicos, nucleósidos modificados y nucleósidos que tienen bases miméticas y/o grupos de azúcar.

Como se usa en el presente documento, el término “nucleótido” se refiere a una glicosilamina que comprende una base nucleotídica y un azúcar que tiene un grupo fosfato unido covalentemente al azúcar. Los nucleótidos pueden estar modificados con cualquiera de diversos sustituyentes.

Como se usa en el presente documento, el término “base nucleotídica” se refiere a una parte de base de un nucleósido o nucleótido. Una base nucleotídica puede comprender cualquier átomo o grupo de átomos capaces de unir el hidrógeno con una base de otro ácido nucleico.

Como se usa en el presente documento, la expresión “resto de base heterocíclica” se refiere a una base nucleotídica que comprende un heterociclo.

Como se usa en el presente documento, el término “desoxirribonucleótido” quiere decir un nucleótido que tiene un hidrógeno en la posición 2’ de la porción azúcar del nucleótido. Los desoxirribonucleótidos pueden estar modificados con cualquiera de diversos sustituyentes.

Como se usa en el presente documento, el término “ribonucleótido” quiere decir un nucleótido que tiene un hidroxi en la posición 2’ de la porción azúcar del nucleótido. Los ribonucleótidos pueden estar modificados con cualquiera de diversos sustituyentes.

Como se usa en el presente documento, la expresión “compuesto oligomérico” se refiere a una estructura polimérica que comprende dos o más subestructuras y que es capaz de hibridar con una región de una molécula de ácido nucleico. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos son oligonucleósidos. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos son oligonucleótidos. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos son compuestos antisentido. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos son oligonucleótidos antisentido. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos son compuestos antisentido cortos. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos son oligonucleótidos antisentido cortos. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos son oligonucleótidos quiméricos.

Como se usa en el presente documento, el término “monómero” se refiere a una única unidad de un oligómero. Monómeros incluyen, entre otros, nucleósidos y nucleótidos, naturales o modificados.

Como se usa en el presente documento, “oligonucleósido” se refiere a un oligonucleótido en el que los enlaces internucleosídicos no contienen un átomo de fósforo.

Como se usa en el presente documento, el término “oligonucleótido” se refiere a una compuesto oligomérico que comprende una pluralidad de nucleótidos unidos. En cierta realización se modifica uno o más nucleótidos de un oligonucleótido. En ciertas realizaciones, un oligonucleótido comprende ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN).

En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos están compuestos por bases nucleotídicas naturales y/o no naturales, azúcares y enlaces internucleotídicos covalentes y pueden además incluir conjugados de ácidos no nucleicos.

Como se usa en el presente documento, “enlace internucleotídico” se refiere a un enlace covalente entre nucleótidos adyacentes.

Como se usa en el presente documento, “enlace monomérico” se refiere a un enlace covalente entre dos monómeros. Enlaces monoméricos incluyen, entre otros, enlaces internucleotídicos y enlaces internucleosídicos.

Como se usa en el presente documento, “enlace internucleotídico natural” se refiere a un enlace fosfodiéster 3’ a 5’.

Como se usa en el presente documento, el término “compuesto antisentido” se refiere a un compuesto oligomérico que es, al menos parcialmente, complementario a una molécula de ácido nucleico diana con la que hibrida. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido modula (incrementa o disminuye) la expresión de un ácido nucleico diana. Los compuestos antisentido incluyen, entre otros, compuestos que son oligonucleótidos, oligonucleósidos, análogos de oligonucleótidos, miméticos de oligonucleótidos y combinaciones quiméricas de estos. En consecuencia, aunque todos los compuestos antisentido son compuestos oligoméricos, no todos los compuestos oligoméricos son compuestos antisentido.

Como se usa en el presente documento, la expresión “oligonucleótido antisentido” se refiere a un compuesto antisentido que es un oligonucleótido.

Como se usa en el presente documento, la expresión “oligonucleótido antisentido parental” se refiere a un oligonucleótido de 20 nucleótidos de longitud que tiene una región hueco desoxi que tiene diez 2'desoxirribonucleótidos, flanqueadas por una primera y una segunda región ala, teniendo cada una de ellas cinco 2’O-(2-metoxietil)ribonucleótidos (un gápmero 5-10-5 MOE) y que comprende la secuencia del correspondiente compuesto antisentido corto de que es padre,

Como se usa en el presente documento, “compuesto antisentido corto” se refiere a un compuesto antisentido de aproximadamente 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 monómeros de longitud. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene al menos una modificación de alta afinidad.

Como se usa en el presente documento, el término “oligonucleótido antisentido corto” se refiere a un oligonucleótido antisentido de aproximadamente 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 nucleótidos de longitud. En ciertas realizaciones, un oligonucleótido antisentido corto tiene al menos una modificación de alta afinidad.

Como se usa en el presente documento, la expresión “gápmero corto” se refiere a un oligonucleótido antisentido corto que tiene una primera y una segunda región ala, teniendo cada una de ellas de forma independiente de 1 a 3 nucleótidos de longitud y una región hueco de 2 a 14 bases nucleotídicas de longitud.

Como se usa en el presente documento, el término “motivo” se refiere a un patrón de nucleótidos no modificados y modificados en un compuesto antisentido corto.

Como se usa en el presente documento, el término “oligómero antisentido quimérico” se refiere a un compuesto oligomérico antisentido que tiene al menos un azúcar, una base nucleotídica o un enlace internucleosídico que está modificado diferencialmente en comparación con al menos otro azúcar, base nucleotídica o enlace internucleosídico dentro del mismo compuesto oligomérico antisentido. El resto de los azúcares, bases nucleotídicas y enlaces internucleosídicos pueden estar modificados de forma independiente o no modificados, ser iguales o diferentes.

Como se usa en el presente documento, la expresión “oligonucleótido antisentido quimérico” se refiere a un oligonucleótido antisentido que tiene al menos un azúcar, una base nucleotídica o un enlace internucleosídico que está modificado diferencialmente en comparación con al menos otro azúcar, base nucleotídica o enlace internucleosídico dentro del mismo oligonucleótido antisentido. El resto de los azúcares, bases nucleotídicas y enlaces internucleosídicos pueden estar modificados de forma independiente o no modificados, ser iguales o diferentes.

Como se usa en el presente documento, la expresión “oligonucleótido antisentido de estructura mixta” se refiere a un oligonucleótido antisentido en el que al menos un enlace internucleosídico del oligonucleótido antisentido es diferente de al menos otro enlace internucleotídico del oligonucleótido antisentido.

Como se usa en el presente documento, el término “diana” se refiere a una proteína cuya modulación se desea.

Como se usa en el presente documento, “gen diana” se refiere a un gen que codifica una diana.

Como se usa en el presente documento, las expresiones “ácido nucleico diana” y “molécula de ácido nucleico que codifica una diana” se refieren a cualquier molécula de ácido nucleico cuya expresión o actividad puede ser modulada por un compuesto antisentido. Ácidos nucleicos diana incluyen, entre otros, ARN (incluidos, entre otros, pre-ARNm y ARNm o porciones de los mismos) transcritos a partir de ADN que codifica una diana, y, también, ADNc derivado de dicho ARN, y ARNmi. Por ejemplo, el ácido nucleico diana puede ser un gen celular (o ARNm tránscrito a partir del gen), cuya expresión se asocia con un trastorno o estado de enfermedad concreto, o una molécula de ácido nucleico de un agente infeccioso.

Como se usa en el presente documento, el término “dirigido” o “dirigido a” se refiere a la asociación de un compuesto antisentido con una molécula de ácido nucleico diana concreta o una región concreta de nucleótidos dentro de una molécula de ácido nucleico diana.

Como se usa en el presente documento, la expresión “sitio diana en 5’" se refiere al nucleótido de un ácido nucleico

diana que es complementario al nucleótido más en 5' de un compuesto antisentido concreto.

Como se usa en el presente documento, la expresión “sitio diana en 3’" se refiere al nucleótido de un ácido nucleico diana que es complementario al nucleótido más en 3' de un compuesto antisentido concreto.

Como se usa en el presente documento, la expresión “región diana” se refiere a una porción de un ácido nucleico diana con la que uno o más compuestos antisentido son complementarios.

Como se usa en el presente documento, la expresión “segmento diana” se refiere una parte más pequeña o subporciones de una región dentro de un ácido nucleico diana.

Como se usa en el presente documento, la expresión “complementariedad con la base nucleotídica” se refiere a una base nucleotídica que puede aparearse con otra base nucleotídica. Por ejemplo, en el ADN, la adenina (A) es complementaria de la timina (T).

Por ejemplo, en el ARN, la adenina (A) es complementaria del uracilo (U). En ciertas realizaciones, base nucleotídica complementaria se refiere a una base nucleotídica de un compuesto antisentido que puede aparearse con bases con una base nucleotídica de su ácido nucleico diana. Por ejemplo, si una base nucleotídica en una posición determinada de un compuesto antisentido puede unirse por puentes de hidrógeno a una base nucleotídica en cierta posición de un ácido nucleico diana, la posición del enlace de hidrógeno entre el nucleótido y el ácido nucleico diana se considera complementaria en dicho par de bases nucleotídicas.

Como se usa en el presente documento, la expresión “base nucleotídica no complementaria” se refiere a un par de bases nucleotídicas que no forman enlaces de hidrógeno entre sí o, de otro modo, soportar hibridación.

Como se usa en el presente documento, el término “complementariedad” se refiere a la capacidad de un compuesto oligomérico para hibridar con otro compuesto oligomérico o ácido nucleico a través de complementariedad de base nucleotídica. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido y su diana son complementarios entre sí cuando un número suficiente de posiciones correspondientes en cada molécula están ocupadas por bases nucleotídicas que se pueden unir entre sí para permitir una asociación estable entre el compuesto antisentido y la diana. Un experto en la técnica reconoce que la inclusión de faltas de coincidencia es posible sin eliminar la capacidad de los compuestos oligoméricos para permanecer en asociación. Por tanto, en el presente documento se describen compuestos antisentido que pueden comprender hasta aproximadamente 20% de nucleótidos que están desapareados (es decir, no son bases nucleotídicas complementarias a los correspondientes nucleótidos de la diana). Preferentemente, los compuestos antisentido no contienen más de aproximadamente 15%, más preferentemente no más de aproximadamente 10%, más preferentemente no más de aproximadamente 5% o ningún desapareamiento. Los nucleótidos restantes son bases nucleotídicas complementarias o, por otro lado, no alteran la hibridación (p. ej., bases universales). Un experto en la técnica reconocería que los compuestos proporcionados en el presente documento son al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% complementarios a un ácido nucleico diana.

Como se usa en el presente documento, el término “desapareamiento” se refiere a una base nucleotídica no complementaria en un compuesto oligomérico complementario.

Como se usa en el presente documento, “hibridación” quiere decir el apareamiento de compuestos oligoméricos complementarios (p. ej., compuesto antisentido y su ácido nucleico diana). Aunque no está limitado a un mecanismo concreto, el mecanismo más habitual de apareamiento implica enlaces de hidrógeno que pueden ser enlaces de hidrógeno de Watson-Crick, de Hoogsteen o de Hoogsteen inverso, entre nucleósidos o bases nucleotídicas complementarias. Por ejemplo, la base natural adenina es una base nucleotídica complementaria a las bases nucleotídicas naturales timidina y uracilo, que se aparean a través de la formación de enlaces de hidrógeno. La base natural guanina es una base nucleotídica complementaria de las bases naturales citosina y 5metil-citosina. La hibridación se puede producir en varias circunstancias.

Como se usa en el presente documento, la expresión “hibrida específicamente” se refiere a la capacidad de un compuesto oligomérico para hibridar con un sitio en el ácido nucleico con mayor afinidad que con la que hibrida con otro sitio en el ácido nucleico. En ciertas realizaciones, un oligonucleótido antisentido hibrida específicamente con más de un sitio diana.

Como se usa en el presente documento, "diseñar" o "diseñado" se refieren al procedimiento de diseñar un compuesto oligomérico que hibrida específicamente con una molécula de ácido nucleico seleccionado.

Como se usa en el presente documento, el término “modulación” se refiere a una perturbación de la función o actividad cuando se compara con el nivel de la función o actividad antes de la modulación. Por ejemplo, modulación incluye el cambio, un incremento (estimulación o inducción) o una disminución (inhibición o reducción) de la expresión génica. Como ejemplo adicional, la modulación de la expresión puede incluir perturbar la selección de un

sitio de corte y empalme del procesamiento de pre-ARNm.

Como se usa en el presente documento, el término “expresión” se refiere a todas las funciones y etapas por las cuales la información codificada en un gen se convierte en estructuras presentes y funcionando en una célula. Dichas estructuras incluyen, entre otras, los productos de la transcripción y la traducción.

Como se usa en el presente documento, “variante” se refiere a un tránscrito de ARN alternativo que se puede producir a partir de la misma región genómica del ADN. Variantes incluyen, entre otras, “variantes pre-ARNm” que son transcritos producidos a partir del mismo ADN genómico que difieren de otros transcritos producidos a partir del mismo ADN genómico en su posición de iniciación o de terminación y contienen secuencias intrónicas y exónicas-Variantes también incluyen, entre otras, aquéllas con aquéllas con uniones de corte y empalme alternativas o codones de iniciación y terminación alternativos.

Como se usa en el presente documento, “monómero modificado de alta afinidad” se refiere a un monómero que tiene al menos una base nucleotídica modificada, un enlace internucleosídico o un resto de azúcar, cuando se compara con monómeros naturales, de modo que la modificación aumenta la afinidad de un compuesto antisentido que comprende en monómero de alta afinidad por su ácido nucleico diana. Las modificaciones de alta afinidad incluyen, entre otras, monómeros (p. ej., nucleósidos y nucleótidos), que comprenden azúcares modificados en 2’.

Como se usa en el presente documento, la expresión “modificado en 2’” o “sustituido en 2’” quiere decir un azúcar que comprende un sustituyente en la posición 2’ distinto a H u OH. Los monómeros modificados en 2’ incluyen, entre otros, BNA y monómeros (p. ej., nucleósidos y nucleótidos) con sustituyentes en 2’, tal como alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-alquilo C1-C10, -OCF3 , O-(CH2)2-O-CH3, 2’-O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), o O-CH2C(=O)-N(Rm)(Rn), en las que cada Rm y Rn es, de forma independiente, H o alquilo C1-C10 sustituido o insustituido. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos comprenden un monómero modificado en 2’ que no tiene la fórmula 2’-O(CH2)nH, en la que n es de uno a seis. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos comprenden un monómero modificado en 2’ que no tiene la fórmula 2’-OCH3. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos comprenden un monómero modificado en 2’ que no tiene la fórmula o, en la alternativa, 2’-O (CH2)2OCH3.

Como se usa en el presente documento, la expresión “ácido nucleico bicíclico” o “BNA” o “nucleósido bicíclico” o “nucleótido bicíclico” se refiere a un nucleósido o nucleótido en el que la porción furanosa del nucleósido incluye un puente que conecta dos átomos de carbono sobre el anillo de furanosa, formando de este modo un sistema de anillo bicíclico.

Como se usa en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, la expresión “metilenoxi BNA” solo se refiere a ß-D-metilenoxi BNA.

Como se usa en el presente documento, el término “MOE” se refiere al sustituyente 2’-metoxietilo.

Como se usa en el presente documento, el término “gápmero” se refiere a un compuesto oligomérico quimérico que comprende una región central (un “hueco”) y una región en cualquiera de los lados de la región central (las “alas”), en la que el hueco comprende al menos una modificación que es diferente de la de cada ala. Dichas modificaciones incluyen modificaciones en la base nucleotídica, el enlace monomérico y el azúcar, así como la ausencia de modificación (sin modificar). Por tanto, en ciertas realizaciones, los enlaces nucleotídicos en cada una de las alas son diferentes de los enlaces nucleotídicos en el hueco. En ciertas realizaciones, cada ala comprende nucleótidos con modificaciones de alta afinidad y el hueco comprende nucleótidos que no comprenden dicha modificación. En ciertas realizaciones, los nucleótidos en el hueco y los nucleótidos en las alas comprenden todos ellos modificaciones de alta afinidad, pero las modificaciones de alta afinidad en el hueco son diferentes de las modificaciones de alta afinidad en las alas. En ciertas realizaciones, las modificaciones en las alas son las mismas entre sí, En ciertas realizaciones, las modificaciones en las alas son diferentes entre sí, En ciertas realizaciones, los nucleótidos en el hueco no están modificados y los nucleótidos en las alas están modificados. En ciertas realizaciones, la(s) modificación(es) en cada ala son las mismas, En ciertas realizaciones, la(s) modificación(es) en un ala son diferentes de la(s) modificación(es) en las otras alas. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos son gápmeros que tienen 2'-desoxinucleótidos en el hueco y nucleótidos con modificaciones de alta afinidad en el ala.

Como se usa en el presente documento, el término “profármaco” se refiere a un agente terapéutico que se preparar en forma inactiva que se convierte en una forma activa (es decir, el fármaco) dentro del cuerpo o las células del mismo por acción de enzimas endógenas u otros productos químicos y/o condiciones.

Como se usa en el presente documento, el término "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a sales de compuestos activos que conservan la actividad biológica deseada del compuesto activo y que no producen efectos toxicológicos indeseados.

Como se usa en el presente documento, la expresión “estructura caperuza” o “resto caperuza terminal” se refiere a modificaciones químicas que se han incorporado en cualquier extremo de un compuesto antisentido.

Como se usa en el presente documento, el término “prevención” se refiere a retrasar o impedir el inicio o desarrollo de una afección o enfermedad durante un periodo de tiempo que va desde horas a días, preferentemente de semanas a meses.

Como se usa en el presente documento, el término “mejora” se refiere a una disminución de al menos un indicador de la gravedad de una afección o enfermedad. La gravedad de los indicadores se puede determinar mediante medidas subjetivas u objetivas que son conocidas para los expertos en la técnica.

Como se usa en el presente documento, el término “tratamiento” se refiere a administrar una composición de la invención para efectuar una alteración o mejora de la afección o enfermedad. La prevención, mejora y/o tratamiento puede requerir la administración de múltiples dosis a intervalos regulares o antes del inicio de la afección o enfermedad para alterar el curso de la enfermedad o afección. Además, se puede usar un único agente en un único individuo para cada prevención, mejora y tratamiento de una afección o enfermedad de forma secuencial o concurrente.

Como se usa en el presente documento, la expresión “agente farmacéutico” se refiere a una sustancia que proporciona un beneficio terapéuticos cuando se administra a un sujeto.

Como se usa en el presente documento, la expresión “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio terapéutico a un animal.

Como se usa en el presente documento, “administrar" significa proporcionar un agente farmacéutico a un animal e incluye, entre otros, la administración por un profesional médico y la autoadministración.

Como se usa en el presente documento, el término “co-administración” se refiere a la administración de dos o más agentes farmacéuticos a un animal. Los dos o más agentes farmacéuticos pueden estar en una única composición farmacéutica o pueden estar en composiciones farmacéuticas distintas. Cada uno de los dos o más agentes farmacéuticos puede administrarse por la misma vía de administración o por vías diferentes. La co-administración abarca la administración en paralelo o secuencial.

Como se usa en el presente documento, la expresión ”composición farmacéutica” se refiere a una mezcla de sustancias adecuadas para administrar a un individuo. Por ejemplo, una composición farmacéutica puede comprender un oligonucleótido antisentido y una solución acuosa estéril.

Como se usa en el presente documento, el término “individuo” se refiere a un ser humano o a un animal no humano seleccionado para el tratamiento o terapia.

Como se usa en el presente documento, el término “animal” se refiere a un animal humano o no humano, incluidos, entre otros, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y primates no humanos, incluidos, entre otros, monos y chimpancés.

Como se usa en el presente documento, el término “sujeto” se refiere a un animal, incluido, entre otros, el ser humano, al que se administra una composición farmacéutica.

Como se usa en el presente documento, el término “duración” se refiere al periodo de tiempo durante el cual continua una actividad o acontecimiento. En ciertas realizaciones, la duración del tratamiento es el periodo de tiempo durante el cual se administran las dosis de una composición farmacéutica.

Como se usa en el presente documento, la expresión “administración parenteral” se refiere a la administración mediante inyección o infusión. La administración parenteral incluye, entre otras, administración subcutánea, administración intravenosa o administración intramuscular.

Como se usa en el presente documento, la expresión “administración subcutánea” se refiere a la administración justo debajo de la piel. “Administración intravenosa” significa administración en una vena.

Como se usa en el presente documento, el término “dosis” se refiere a una cantidad especificada de un agente farmacéutico proporcionada en una única administración. En ciertas realizaciones, una dosis se puede administrar en dos o más bolos, comprimidos o inyecciones. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, en las que se desea la administración subcutánea, la dosis deseada requiere un volumen que no se acomoda fácilmente mediante una única inyección. En dichas realizaciones, se pueden usar dos o más inyecciones para alcanzar la dosis deseada. En ciertas realizaciones, una dosis se puede administrar en dos o más inyecciones para minimizar la reacción en el punto de inyección en un individuo.

Como se usa en el presente documento, la expresión “unidad de dosificación” se refiere a una forma en la que se proporciona un agente farmacéutico. En ciertas realizaciones, una unidad de dosificación es un vial que comprende oligonucleótido antisentido liofilizado. En ciertas realizaciones, una unidad de dosificación es un vial que comprende oligonucleótido antisentido reconstituido.

Como se usa en el presente documento, la expresión “agente farmacéutico” se refiere a una sustancia que proporciona un beneficio terapéutico cuando se administra a un individuo. Por ejemplo, en ciertas realizaciones un oligonucleótido antisentido es un agente farmacéutico.

Como se usa en el presente documento, la expresión “ingrediente farmacéutico activo” se refiere a la sustancia en una composición farmacéutica que proporciona un efecto deseado.

Como se usa en el presente documento, la expresión “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio terapéutico a un individuo. En ciertas realizaciones, una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto antisentido es la cantidad que necesita administrarse para tener como resultado un beneficio observable.

Como se usa en el presente documento, el término “hipertrigliceridemia” se refiere a una afección caracterizada por niveles elevados de colesterol en suero.

Como se usa en el presente documento, el término “hiperlipidemia” se refiere a una afección caracterizada por niveles elevados de lípidos en suero.

Como se usa en el presente documento, el término “hipertrigliceridemia” se refiere a una afección caracterizada por niveles elevados de triglicéridos en suero.

Como se usa en el presente documento, el término “hipercolesterolemia no familiar” se refiere a una afección caracterizada por niveles elevados de colesterol que no es el resultado de una única mutación génica hereditaria.

Como se usa el presente documento, la expresión “hipercolesterolemia poligénica” se refiere a una afección caracterizada por niveles elevados de colesterol que es el resultado de la influencia de diversos factores genéticos. En ciertas realizaciones, la hipercolesterolemia poligénica se puede exacerbar por la ingesta de lípidos en la dieta.

Como se usa el presente documento, la expresión “hipercolesterolemia familiar (HF)" se refiere a un trastorno metabólico dominante autosómico caracterizado por una mutación en el gen del receptor de LDL (LDL-R), niveles marcadamente elevados de LDL-C e inicio prematuro de aterosclerosis. Un diagnóstico de hipercolesterolemia familiar se realiza cuando un individuo cumple uno o más de los criterios siguientes: pruebas genéticas que confirman 2 genes mutados del receptor de LDL; pruebas genéticas que confirman un genes mutado del receptor de LDL; historial documentado de LDL-colesterol en suero sin tratar superior a 500 mg/dl; xantoma tendinoso y/o cutáneo antes de los 10 años de edad: o ambos padres presentan niveles elevados de LDL-colesterol en suero documentados antes de la terapia hipolipemiante consistente con hipercolesterolemia familiar heterocigótica.

Como se usa en el presente documento, la expresión “hipercolesterolemia familiar homocigótica” o “HFHo” se refiere a una afección caracterizada por una mutación en los genes de LDL-T tanto maternos como paternos.

Como se usa en el presente documento, la expresión “hipercolesterolemia familiar heterocigótica” o “HFHe” se refiere a una afección caracterizada por una mutación en los genes de LDL-T o maternos o paternos.

Como se usa en el presente documento, la expresión “dislipidemia mixta” se refiere a una afección caracterizada por niveles elevados de colesterol en suero y niveles elevados de triglicéridos en suero.

Como se usa en el presente documento, la expresión “dislipidemia diabética” o “diabetes de tipo II con dislipidemia" se refiere a una afección caracterizada por diabetes de tipo II, niveles reducidos de HDL-C, niveles elevados de triglicéridos en suero y niveles elevados de partículas de LDL pequeñas densas.

Como se usa en el presente documento, la expresión “equivalentes de riesgo de “CPC” se refiere a indicadores de enfermedad aterosclerótica clínica que confieren un riesgo elevado de cardiopatía coronaria. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, los equivalentes de riesgo de CPC incluyen, sin limitaciones, cardiopatía coronaria clínica, enfermedad de las arterias carótidas sintomática, enfermedad arterial periférica y/o aneurisma aórtico abdominal.

Como se usa en el presente documento, la expresión “enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA”) se refiere a una afección caracterizada por la inflamación grasa del hígado que no se debe a un abuso del consumo de alcohol (por ejemplo, consumo de alcohol de más d 20 g/días). En ciertas realizaciones, la EHGNA está relacionada con la resistencia a la insulina y el síndrome metabólico.

Como se usa en el presente documento, la expresión “esteatohepatitis no alcohólica (EHNA)” se refiere a una afección caracterizada por la inflamación y la acumulación de grasa y tejido fibroso en el hígado que no se debe a un abuso del consumo de alcohol. EHNA es una forma extrema de la EHGNA.

Como se usa en el presente documento, la expresión “factores principales de riesgo” se refiere a factores que contribuyen a un alto riesgo de una enfermedad o afección concreta. En ciertas realizaciones, los factores principales de riesgo de cardiopatía coronaria incluyen, entre otros, tabaquismo, hipertensión, niveles bajos de HDLC, antecedentes familiares de cardiopatía coronaria y la edad.

Como se usa en el presente documento, el término “factores de riesgo de CPC” se refiere a equivalentes de riesgo de CPC y factores de riesgo principales.

Como se usa en el presente documento, la expresión “cardiopatía coronaria (CPC)” se refiere a un estrechamiento de los vasos sanguíneos pequeños que suministran sangre y oxígeno al corazón, que a menudo da como resultado aterosclerosis.

Como se usa en el presente documento, la expresión “riesgo reducido de cardiopatía coronaria” se refiere a una reducción de la probabilidad de que un individuo desarrolle cardiopatía coronaria. En ciertas realizaciones, una reducción del riesgo de cardiopatía coronaria se mide por una mejora en uno o más factores de riesgo de CPC, por ejemplo una disminución de los niveles de LDL-C.

Como se usa en el presente documento, el término “aterosclerosis” se refiere a un endurecimiento de las arterias que afecta a las arterias de tamaño grande y medio y que se caracteriza por la presencia de depósitos de grasa. Los depósitos de grasa se denominan “ateromas” o “placas”, que consisten principalmente en colesterol y otras grasas, calcio y tejido cicatricial, y daños en el revestimiento de las arterias.

Como se usa en el presente documento, la expresión “historial de cardiopatía coronaria” se refiere a la aparición de cardiopatía coronaria clínicamente evidente en el historial médico de un individuo o un miembro de la familia del individuo.

Como se usa en el presente documento, la expresión “cardiopatía coronaria de inicio precoz” se refiere a un diagnóstico de cardiopatía coronaria antes de los 50 años de edad.

Como se usa en el presente documento, la expresión “individuo intolerante a estatinas” se refiere a un individuo que, como resultado de la terapia con estatinas, experimenta uno o más incrementos de la creatinina quinasa, anomalías en las pruebas de función hepática, dolores musculares o efectos secundarios en el sistema nervioso central.

Como se usa en el presente documento, el término “eficacia” se refiere a la capacidad para producir un efecto deseado. Por ejemplo, la eficacia de una terapia hipolipemiante puede ser la reducción en la concentración de uno

o más de LDL-C, VLDL-C, IDL-C, no-HDL-C, ApoB, lipoproteína(a), o triglicéridos.

Como se usa en el presente documento, la expresión “perfil de seguridad aceptable” se refiere a un patrón de efectos secundarios que está dentro de los límites clínicamente aceptables.

Como se usa en el presente documento, la expresión “efectos secundarios” se refiere a respuestas fisiológicas atribuibles a un tratamiento aparte de los efectos deseados. En ciertas realizaciones, los efectos secundarios incluyen, sin limitaciones, reacciones en el sitio de la inyección, anomalías en las pruebas de función hepática, anomalías en la función renal, toxicidad hepática, toxicidad renal, anomalías en el sistema nervioso central y miopatías. Por ejemplo, incrementos en los niveles de aminotransferasas en suero pueden indicar toxicidad hepática o anomalías en la función hepática. Por ejemplo, incrementos en los niveles de bilirrubina pueden indicar toxicidad hepática o anomalías en la función hepática.

Como se usa en el presente documento, la expresión “reacción en el sitio de la inyección” se refiere a inflamación o enrojecimiento anormal de la piel en el punto de inyección en un individuo.

Como se usa en el presente documento, la expresión “cumplimiento del individuo” se refiere a la adhesión a una terapia recomendada o prescrita por un individuo.

Como se usa en el presente documento, la expresión “terapia hipolipemiante” se refiere a un régimen terapéutico proporcionado a un individuo para reducir uno o más lípidos en un individuo. En ciertas realizaciones, se proporciona una terapia hipolipemiante para reducir uno o más de ApoB, colesterol total, LDL-C, VLDL-C, IDL-C, no-HDL-C, triglicéridos, partículas de LDL pequeñas densas y Lp (a) en un individuo.

Como se usa en el presente documento, la expresión “agente hipolipemiante” se refiere a un agente farmacéutico proporcionado a un individuo para alcanzar una disminución de los niveles de lípidos en el individuo. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, se proporciona a un individuo un agente hipolipemiante para reducir uno o más de ApoB, LDL-C, colesterol total y triglicéridos.

Como se usa en el presente documento, la expresión “LDL-C diana” se refiere a un nivel de LDL-C que se desea tras la terapia hipolipemiante.

Como se usa en el presente documento, el término “cumplimiento” se refiere a la adhesión a una terapia recomendada por parte de un individuo.

Como se usa en el presente documento, la expresión “terapia recomendada” se refiere a un régimen terapéutico recomendado por un profesional médico para el tratamiento, mejora o prevención de una enfermedad.

Como se usa en el presente documento, la expresión “actividad baja del receptor de LDL” se refiere a la actividad del receptor de LDL que no es lo suficientemente alta como para mantener niveles clínicamente aceptables de LDLC en la corriente sanguínea.

Como se usa en el presente documento, la expresión “desenlace cardiovascular” se refiere a la aparición de acontecimientos cardiovasculares adversos principales.

Como se usa en el presente documento, la expresión “desenlace cardiovascular mejorado” se refiere a una reducción de la aparición de acontecimientos cardiovasculares adversos principales o del riesgo de los mismos. Ejemplos de acontecimientos cardiovasculares adversos principales incluyen, sin limitaciones, muerte, reinfarto, ictus, shock cardiogénico, edema pulmonar, parada cardíaca y disrritmia auricular.

Como se usa en el presente documento, la expresión “marcadores sustitutos del desenlace cardiovascular” se refiere a los indicadores indirectos de acontecimientos cardiovasculares adversos o del riesgo de los mismos. Por ejemplo, marcadores sustitutos del desenlace cardiovascular incluyen el espesor de la media íntima de la carótida (CIMT). Otro ejemplo de un marcador sustituto del desenlace cardiovascular incluye el tamaño del ateroma. El tamaño del ateroma puede determinarse mediante ultrasonidos intravasculares (USIV).

Como se usa en el presente documento, la expresión “incremento de los niveles de HDL-C” se refiere a un incremento de los niveles de HDL-C en suero en un individuo a lo largo del tiempo.

Como se usa en el presente documento, el término “hipolipemiante” se refiere a una reducción de uno o más lípidos en suero en un individuo a lo largo del tiempo.

Como se usa en el presente documento, la expresión “trastorno metabólico” se refiere a una afección caracterizada por una alteración o interrupción de la función metabólica. “Metabólica/o” y “metabolismo” son términos bien conocidos en la técnica y generalmente incluyen toda la gama de procesos bioquímicos que se producen dentro de un organismo vivo. Trastornos metabólicos incluyen, entre otros, hiperglucemia, prediabetes, diabetes (de tipo I y de tipo II), obesidad, resistencia a la insulina y síndrome metabólico.

Como se usa en el presente documento, la expresión “síndrome metabólico” se refiere a una combinación de factores de riesgo cardiovascular lipídicos y no lipídicos de origen metabólico Se ha vinculado estrechamente con el trastorno metabólico generalizado conocido como resistencia a la insulina. El Panel de Tratamiento de adultos III (ATP III) del Programa Nacional educativo sobre colesterol de EE.UU. (NCEP) estableció criterios para el diagnóstico del síndrome metabólico cuando están presentes tres o más de cinco determinantes de riesgo. Los cinco determinantes de riesgo son obesidad abdominal, definida como una circunferencia de la cintura superior a 102 cm para varones o superior a 88 cm para mujeres, niveles de triglicéridos superiores o iguales a 150 mg/dl, niveles de HDL-colesterol inferiores a 40 mg/dl para varones e inferiores a 50 mg/dl para mujeres, presión arterial superior o igual a 130/85 mmHg y niveles de glucosa en ayunas superiores o iguales a 110 mg/dl. Estos determinantes se pueden medir fácilmente en la práctica clínica (JAMA, 2001, 285: 2486-2497).

El término “alquilo” tal como se usa en el presente documento, se refiere a un radical de hidrocarburo saturado lineal o ramificado que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono. Ejemplos de grupos alquilo incluyen, entre otros, metilo, etilo, propilo, butilo, isopropilo, n-hexilo, octilo, decilo, dodecilo y similares. Normalmente, los grupos alquilo incluyen de 1 a aproximadamente 24 átomos de carbono, más habitualmente de 1 a aproximadamente 12 átomos de carbono (alquilo C1-C12) siendo más preferidos con de 1 a aproximadamente 6 átomos de carbono. La expresión “alquilo menor” como se usa en el presente documento incluye de 1 a aproximadamente 6 átomos de carbono. Los grupos alquilo, como se usan en el presente documento. pueden incluir, opcionalmente, uno o más sustituyentes adicionales.

El término “alquenilo”, como se usa en el presente documento, se refiere a un radical hidrocarburo de cadena lineal

o ramificada que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono y que tiene al menos un doble enlace carbono-carbono. Ejemplos de grupos alquenilo incluyen, entre otros, etenilo, propenilo, butenilo, 1-metil-2-buten-1-ilo, dienos tales como 1,3-butadieno y similares. Normalmente, los grupos alquenilo incluyen de 2 a aproximadamente 24 átomos de carbono, más habitualmente de 2 a aproximadamente 12 átomos de carbono, siendo más preferidos de 2 a aproximadamente 6 átomos de carbono. Los grupos alquenilo, como se usan en el presente documento, pueden incluir, opcionalmente, uno o más sustituyentes adicionales.

El término “alquinilo”, como se usa en el presente documento, se refiere a un radical hidrocarburo de cadena lineal

o ramificada que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono y que tiene al menos un triple enlace carbono-carbono. Ejemplos de grupos alquinilo incluyen, entre otros, etinilo, 1-propinilo, 1-butinilo y similares. Normalmente, los grupos alquinilo incluyen de 2 a aproximadamente 24 átomos de carbono, más habitualmente de 2 a aproximadamente 12 átomos de carbono, siendo más preferidos de 2 a aproximadamente 6 átomos de carbono. Los grupos alquinilo, como se usan en el presente documento, pueden incluir, opcionalmente, uno o más sustituyentes adicionales.

El término “aminoalquilo”, como se usa en el presente documento, se refiere a un radical alquilo amino sustituido. Con este término se quiere incluir grupos alquilo C1-C12 que tienen un sustituyente amino en cualquier posición y en el que el grupo alquilo une el grupo aminoalquilo a la molécula parental. Las porciones alquilo y/o amino del grupo aminoalquilo puede estar sustituido además con grupos sustituyentes.

El término “alifático”, como se usa en el presente documento, se refiere a un radical hidrocarburo de cadena lineal o ramificada que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono, en el que la saturación entre dos cualesquiera átomos de carbono es un enlace sencillo, doble o triple. Preferentemente, un grupo alifático contiene de 1 a aproximadamente 24 átomos de carbono, más habitualmente de 1 a aproximadamente 12 átomos de carbono, siendo más preferidos de 1 a aproximadamente 6 átomos de carbono. La cadena lineal o ramificada de un grupo alifático puede interrumpirse con uno o más heteroátomos que incluyen nitrógeno, oxígeno, azufre o fósforo. Dichos grupos alifáticos interrumpidos por heteroátomos incluyen, sin limitaciones, polialcoxis, tales como polialquilenglicoles, poliaminas y poliiminas. Los grupos alifáticos como se usan en el presente documento pueden incluir, opcionalmente, grupos sustituyentes adicionales.

El término “alicíclico” o “aliciclilo” se refiere a un sistema de anillo cíclico en el que el anillo es alifático. El sistema de anillo puede comprender uno o más anillos de los que al menos un anillo es alifático. Alicíclicos preferidos incluyen anillos que tienen de aproximadamente 5 a aproximadamente 9 átomos en el anillo. Los grupos alicíclicos, como se usan en el presente documento, pueden incluir, opcionalmente, grupos sustituyentes adicionales.

El término “alcoxi”, como se usa en el presente documento, se refiere a un radical formado entre un grupo alquilo y un átomo de oxígeno, en el que el átomo de oxígeno se usa para unir el grupo alcoxi a una molécula parental. Ejemplos de grupos alcoxi incluyen, entre otros, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, n-butoxi, sec-butoxi, terc—butoxi, n-pentoxi, neopentoxi, n-hexoxi y similares. Los grupos alcoxi como se usan en el presente documento pueden incluir, opcionalmente, grupos sustituyentes adicionales.

Los términos “halo” y “halógeno”, como se usan en el presente documento, se refieren a un átomo seleccionado de flúor, cloro, bromo y yodo.

Los términos “arilo” y “aromático”, como se usan en el presente documento, se refieren a un sistema de anillo carbocíclico mono o policíclico que tiene de uno o más anillos aromáticos. Ejemplos de grupos arilo incluyen, entre otros, fenilo, naftilo, tetrahidronaftilo, indanilo, indenilo y similares. Sistemas de anillo de arilo preferidos tienen de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 átomos en uno o más anillos. Los grupos arilo, como se usan en el presente documento, pueden incluir, opcionalmente, grupos sustituyentes adicionales.

Los términos “aralquilo” y "arilalquilo”, como se usan en el presente documento, se refiere a un radical formado entre un grupo alquilo y un grupo arilo, en el que el grupo alquilo se usa para unir el grupo aralquilo a una molécula parental. Ejemplos incluyen, entre otros, bencilo, fenetilo y similares. Grupos aralquilo, como se usan en el presente documento, pueden incluir, opcionalmente, grupos sustituyentes adicionales unidos a los grupos alquilo, arilo o ambos, que forman el grupo radical.

La expresión “radical heterocíclico”, se usa en el presente documento, Se refiere a un radical de sistema del anillo mono o policíclico que incluye al menos un heteroátomo y está insaturado, parcialmente saturado o completamente saturad, de modo que incluye grupos heteroarilo. Con heterocíclico también se quiere incluir sistemas de anillo condensados, en los que uno o más de los anillos condensados contienen al menos un heteroátomo y los otros anillos pueden contener uno o más heteroátomos o contener, opcionalmente, ningún heteroátomo. Normalmente, un grupo heterocíclico incluye al menos un átomo seleccionado de azufre, nitrógeno u oxígeno. Ejemplos de grupos heterocíclicos incluyen [1,3]dioxolano, pirrolidinilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, oxazolidinilo, isoxazolidinilo, morfolinilo, tiazolidinilo, isotiazolidinilo, quinoxalinilo, piridazinonilo, tetrahidrofurilo y similares. Grupos heterocíclicos, como se usan en el presente documento, pueden incluir, opcionalmente, grupos sustituyentes adicionales.

Los términos “heteroarilo” y “heteroaromático”, como se usa en el presente documento, se refiere a un radical que comprende un anillo, sistema del anillo o sistema de anillo condensado mono o policíclico, en el que al menos uno de los anillos es aromático e incluye uno o más heteroátomos. Con heteroarilo también se quiere incluir sistemas de anillo condensado que incluyen sistemas en los que uno o más de los anillos condensados no contienen heteroátomos. Normalmente, grupos heteroarilo incluyen un átomo de anillo seleccionado de azufre, nitrógeno u oxígeno. Ejemplos de grupos heteroarilo incluyen, entre otros, piridinilo, pirazinilo, pirimidinilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tiazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo, tiofenilo, furanilo, quinolinilo, isoquinolinilo, bencimidazolilo, benzoxazolilo, quinoxalinilo y similares. Los radicales heteroarilo pueden estar unidos a una molécula parental directamente o a través de un resto ligador, tal como un grupo alifático o heteroátomo. Grupos heteroarilo, como se usan en el presente documento, pueden incluir, opcionalmente, grupos sustituyentes adicionales.

El término “heteroarilalquilo” tal como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo heteroarilo como se ha definido anteriormente que tiene un radical alquilo que puede unir el grupo heteroarilalquilo a una molécula parental. Ejemplos incluyen, entre otros, piridinilmetilo, pirimidiniletilo, naftiridinilpropilo y similares. Grupos heteroarilalquilo, como se usan en el presente documento, pueden incluir, opcionalmente, grupos sustituyentes adicionales en uno o ambas porciones de heteroarilo o alquilo.

La expresión “estructura mono o policíclica”, como se usa en la presente invención, incluye todos los sistemas de anillo que son sencillos o policíclicos que tienen anillos que están condensados o unidos, y se pretende que incluya sistemas de anillo sencillo y mixto seleccionados de forma individual de alifáticos, alicíclicos, arilo, heteroarilo, aralquilo, arilalquilo, heterocíclicos, heteroarilo, heteroaromáticos, heteroarilalquilo. Dichas estructuras mono y policíclicas pueden contener anillos que son uniformes o que tienen varios grados de saturación, incluidos completamente saturados, parcialmente saturados o completamente insaturados. Cada anillo puede comprender átomos de anillo seleccionados de C, N, O y S, para dar anillos heterocíclicos, así como anillos que sólo comprenden átomos de anillo de C que pueden estar presentes en un motivo mixto, tal como, por ejemplo bencimidazol, en el que un anillo tiene sólo átomos de anillo de C y el anillo condensado tiene dos átomos de nitrógeno. Las estructuras mono y policíclicas pueden además estar sustituidas con grupos sustituyentes, tal como, por ejemplo, ftalimida, que tiene dos grupos =O unidos a uno de los anillos. En otro aspecto, las estructuras mono y policíclicas pueden estar unidas a una molécula parental directamente a través de un átomo de anillo, a través de un grupo sustituyente o de un resto ligador bifuncional.

El término “acilo”, como se usa en el presente documento, se refiere a un radical formado mediante eliminación de un grupo hidroxilo de un ácido orgánico y d tiene la fórmula general -C(O)-X, en la que X normalmente es alifático, alicíclico o aromático. Ejemplos incluyen carbonilos alifáticos, carbonilos aromáticos, sulfonilos alifáticos, sulfinilos aromáticos, sulfinilos alifáticos, fosfatos aromáticos, fosfatos alifáticos y similares. Los grupos acilo, como se usan en el presente documento, pueden incluir, opcionalmente, grupos sustituyentes adicionales.

El término “hidrocarbilo” incluye grupos que comprenden C, O y H. Se incluyen grupos lineales, ramificados y cíclicos que tienen cualquier grado de saturación. Dichos grupos hidrocarbilo pueden incluir uno o más heteroátomos seleccionados de N, O y S, y pueden además estar mono o polisustituidos con uno o más grupos sustituyentes.

Los términos “sustituyente” y “grupo sustituyente”, como se usan en el presente documento, incluyen grupos que normalmente se añaden a otros grupos o compuestos parentales para potenciar las propiedades deseadas o dar efectos deseados. Los grupos sustituyentes pueden estar protegidos o sin proteger y se pueden añadir a un sitio disponible o a muchos sitios disponibles en un compuesto parental. Los grupos sustituyentes pueden también estar sustituidos con otros grupos sustituyentes y pueden estar unidos directamente o a través de un grupo ligador, tal como un grupo alquilo o hidrocarbilo, a un compuesto parental. Dichos subgrupos incluyen, sin limitaciones, halógeno, hidroxilo, alquilo, alquenilo, alquinilo, acil(-C(O)Raa), carboxil(-C(O)O-Raa), grupos alifáticos, grupos alicíclicos, alcoxi, oxo (-O-Raa) sustituido, arilo, aralquilo, heterocíclico, heteroarilo, heteroarilalquilo, amino(-NRbbRcc), imino(=NRbb),amido (-C(O)NRbbRcc o -N(Rbb)C(O)Raa), azido (-N3 ), nitro (-NO2), ciano(-CN), carbamido(-OC(O)NRbbRcc o -N (Rbb)C(O)OR), ureido (-N(Rbb)C(O)NRbbRcc), tioureido (-N(Rbb)C(S)NRbbRcc), guanidinil (-N(Rbb)C(=NRbb)Rbb-Rcc), amidinil (-C(=NRbb)NRbbRcc o (-C(=NRbb)NRbbR), tiol (-SRbb), sulfinil (S(O)Rbb), sulfonil (-S(O)2Rbb), sulfonamidil (-S(O)2NRbbRccor -N(Rbb)S(O)2Rbb) y grupos conjugados. En los que cada Raa, Rbb y Rcc es, de forma independiente, H, un grupo funcional químico opcionalmente unido o un grupo sustituyente adicional con una lista preferida, incluidos, sin limitaciones, alquilo, alquenilo, alquinilo, alifático, alcoxi, acilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, alicíclico, heterocíclico y heteroarilalquilo.

B. Ciertos compuestos oligoméricos

En ciertas realizaciones es deseable modificar químicamente compuestos oligoméricos, comparados con los oligómeros naturales, tales como ADN o ARN. Ciertas de estas modificaciones alteran la actividad del compuesto oligomérico. Ciertas de estas modificaciones pueden alterar la actividad mediante, por ejemplo: incremento de la afinidad de un compuesto antisentido por su ácido nucleico diana, incremento de su resistencia a una o más nucleasas y/o alteración de la farmacocinética o distribución tisular del compuesto oligomérico. En ciertos casos, el uso de sustancias químicas que incrementan la afinidad de un compuesto oligomérico por su diana puede permitir el uso de compuestos oligoméricos más cortos.

1. Ciertos monómeros

En cierta realización, los compuestos oligoméricos comprenden uno o más monómeros modificados. En ciertas de estas realizaciones, los compuestos oligoméricos comprenden uno o más monómeros de alta afinidad. En ciertas realizaciones, dicho monómero de alta afinidad se selecciona de monómeros (p. ej., nucleósidos y nucleótidos), que comprenden azúcares modificados en 2, incluidos, entre otros: BNA y monómeros (p. ej., nucleósidos y nucleótidos) con sustituyentes en 2’, tal como alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-alquilo C1-C10, -OCF3 , O-(CH2)2-O-CH3, 2’-O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), o O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), en las que cada Rm y Rn es, de forma independiente, H o alquilo C1-C10 sustituido o insustituido.

En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos que incluyen, entre otros, compuestos antisentido cortos de la presente divulgación, comprenden uno o más monómeros de afinidad, siempre que el compuesto oligomérico no comprende un nucleótido que comprende 2’-O(CH2)nH, en la que n es de uno a seis.

En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos que incluyen, entre otros, compuestos antisentido cortos de la presente divulgación, comprenden uno o más monómeros de afinidad, siempre que el compuesto oligomérico no comprende un nucleótido que comprende 2’-OCH3 o un 2’-O(CH2)2OH3.

En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos que incluyen, entre otros, compuestos antisentido cortos de la presente divulgación, comprenden uno o más monómeros de afinidad, siempre que el compuesto oligomérico no comprenda un nucleótido que comprende un α-L-Metilenoxi (4’-CH2-O-2’) BNA.

En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos que incluyen, entre otros, compuestos antisentido cortos de la presente divulgación, comprenden uno o más monómeros de afinidad, siempre que el compuesto oligomérico no comprenda un nucleótido que comprende un ß-D-Metilenoxi (4’-CH2-O-2’) BNA.

En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos que incluyen, entre otros, compuestos antisentido cortos de la presente divulgación, comprenden uno o más monómeros de afinidad, siempre que el compuesto oligomérico no comprenda un α-L-Metilenoxi (4’-CH2-O-2’) BNA o un ß-D-Metilenoxi (4’-CH2-O-2’) BNA.

a. Ciertas bases nucleotídicas

La porción de base natural de un nucleósido es, normalmente, una base heterocíclica. Las dos clases más habituales de dichas bases heterocíclicas son las purinas y las pirimidinas. Para los nucleósidos que incluyen un azúcar de pento-furanosilo, un grupo fosfato se puede unir al resto hidroxilo en 2’, 3’ o 5’ del azúcar. Al formar oligonucleótidos, los grupos fosfato unen covalentemente a los nucleósidos adyacentes entre sí para formar un compuesto polimérico lineal. Dentro de los oligonucleótidos, normalmente se hace referencia a los grupos fosfato como formadores del esqueleto internucleotídico del oligonucleótido. El enlace natural o estructura de ARN y de ADN es un enlace fosfodiéster 3' a 5'.

Además de las bases nucleotídicas “no modificadas” o “naturales”, tal como las bases nucleotídicas de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases nucleotídicas de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U), muchas bases nucleotídicas modificadas o miméticos de bases nucleotídicas conocidas para los expertos en la técnica son susceptibles con los compuestos descritos en el presente documento. En ciertas realizaciones, una base nucleotídica modificada es una base nucleotídica que es bastante similar en estructura a la base nucleotídica parental, tal como, por ejemplo, 7-deaza purina, una 5-metilcitosina o una pinza G.

En ciertas realizaciones, los miméticos de las bases nucleotídicas incluyen estructuras más complicadas, tales como, por ejemplo, un mimético de una base nucleotídica de fenoxacina tricíclica. Los procedimientos para la preparación de las bases nucleotídicas modificadas indicadas anteriormente son bien conocidos para los expertos en la técnica.

b. Ciertos azúcares

Los compuestos oligoméricos descritos en el presente documento pueden comprender uno o más monómeros, incluido un nucleósido o nucleótido, que tiene un resto de azúcar no modificado. Por ejemplo, el anillo de azúcar de furanosilo de un nucleósido se puede modificar de diversos modos, incluidos, entre otros, la adición de un grupo sustituyente, en puente don dos átomos de anillo no germinales, para formar un ácido bicíclico-nucleico (BNA) no germinal.

En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos comprenden uno o más monómeros que es un BNA. En ciertas realizaciones, los BNA incluyen, entre otros, (A) α-L-metilenoxi (4’-CH2-O-2’) BNA, (B) ß-D-metilenoxi(4’-CH2

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O-2’) BNA, (C) Etilenoxi (4’-(CH2)2-O-2’)BNA, (D) aminooxi(4’-CH2-O-N(R)-2’) BNA y (E) oxiamino (4’-CH2-N(R)-O-2’) BNA, como se representa en la Figura 1.

imagen1

Figura 1 Ciertas estructuras de BNA

En ciertas realizaciones, los BNA incluyen, entre otros, compuestos que tienen al menos un puente entre la posición 4’ y la posición 2’ del azúcar, en los que cada uno de los puentes comprende de forma independiente de 1 o de 2 a 4 grupos de unión seleccionados de forma independiente de -[C(R1)(R2)]-, -C(R1)=C(R2)-, -C(R1)=N-, -C(=NR1)-, C(=O)-, -C(=S)-, -O-, n-Si(R1)2, -S(=O)x-y -N(R1)-;

en la que:

xes 0, 1, o 2;;

n es 1, 2, 3 o 4;

cada R1 y R2 es, de forma independiente, H, un grupo protector, hidroxilo, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5C20, arilo C5-C20 sustituido, radical heterociclo, radical heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical alicíclico C5-C7, radical alicíclico C5-C7 sustituido, halógeno, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3 , COOJ1, acilo (C(=O)H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(=O)2-J1 o sulfoxilo (S(=O)-J1); y cada J1 y J2 es, de forma independiente, H, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C1-C12, alquenilo C1-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C3-C20 sustituido, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, aminoalquilo C1-C12, aminoalquilo C1-C12 sustituido o un grupo protector.

En una realización, cada uno de los puentes o los compuestos de BNA es, de forma independiente, -[C(R1)(R2)]n-, [C(R1)(R2)]-O-, -C(R1R2)-N(R1)-O-o -C(R1R2)-ON(R1)-. En otra realización, cada uno de dichos puentes es, de forma independiente, 4’-(CH2)2-2’, 4’-(CH2)3-2’, 4’-CH2O-2’, 4’-(CH2)2-O-2’, 4’-CH2-O-N(R1)-2’ y 4’-CH2-N(R1)-O-2’-, en el que cada R1 es, de forma independiente, H, un grupo protector o alquilo C1-C12.

Ciertos BNA se han preparado y divulgado en la literatura de patentes, así como en la literatura científica (Singh y col., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin y col., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt y col., Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar y col., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; documento WO 94/14226; documento WO 2005/021570; Singh y col., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Ejemplos de patentes de EE.UU. presentadas y solicitudes publicadas que divulgan BNA incluyen, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 7.053.207; 6.268.490; 6.770.748; 6.794.499; 7.034.133; y 6.525.191; y las publicaciones preconcesión de EE.UU. nº 2004-0171570; 2004-0219565; 2004-0014959; 2003-0207841; 2004-0143114; y 20030082807.

En el presente documento también se proporciona BNA en los que el grupo 2’-hidroxilo del anillo de azúcar ribosilo está unido al átomo de carbono en 4’ del anillo de azúcar, formando de este modo un enlace metilenoxi (4’-CH2-O2’) para formar el resto azúcar bicílico (Revisado en in Elayadi y col., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch y col., Chem. Biol., 2001, 8-7; y Orum y col., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; véase también las patentes de EE.UU.: 6.268.490 y 6.670.461). El enlace puede ser un grupo metilen(CH2-) que forma un puente entre el átomo de oxígeno en 2’ y el átomo de carbono en 4’, para los que el término metilenoxi(4’-CH2-O-2’) BNA se usa para el resto bicíclico; en el caso de que haya un grupo etileno en esta posición se usa el término etilenoxi(4’CH2CH2-O-2’) BNA (Singh y col., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456: Morita y col., Bioorganic Medicinal Chemistry, 2003, 11, 2211-2226). El metilenoxi(4’-CH2-O-2’) BNA y otros análogos del azúcar bicíclico muestran estabilidades térmicas del dúplex muy altas con complementariedad de ADN y ARN (Tm = +3 a +10° C), estabilidad frente a la degradación 3’-exonucleolítica y buenas propiedades de solubilidad. Se han descrito potentes oligonucleótidos antisentido no tóxicos que comprenden BNA (Wahlestedt y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 56335638).

Un isómero de metilenoxi(4’-CH2-O-2’) BNA que también se ha tratado es alfa-L-metilenoxi(4’-CH2-O-2’) BNA, que se ha demostrado que tiene una estabilidad superior contra una 3'-exonucleasa. Los alfa-L-metilenoxi(4’-CH2-O-2’) BNA se incorporaron en gápmeros y quimeras antisentido, que mostraron una potente actividad antisentido (Frieden

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y col., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).

Se han descrito la síntesis y preparación de los monómeros de metilenoxi(4’-CH2-O-2’) BNA adenina, citosina, guanina, 5-metilcitosina, timina y uracilo, junto con su oligomerización y las propiedades de reconocimiento de ácidos nucleicos (Koshkin y col., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). También se han descrito BNA y su preparación en los documentos WO 98/39352 y WO 99/14226.

También se han preparado análogos de metilenoxi(4’-CH2-O-2’) BNA, fosforotioato-metilenoxi(4’-CH2-O-2’) BNA y 2’-tio-BNA (Kumar y col., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). También se ha descrito la preparación de análogos nucleosídicos bloqueados que comprenden dúplex de oligodesoxirribonucleótidos como sustratos para las ácido nucleico polimerasas (Wengel y col., WO 99/14226). Además, en la técnica se ha descrito la síntesis de 2'amino-BNA, un nuevo análogo oligonucleotídico de alta afinidad restringido por conformación (Singh y col., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). Además, se han preparado 2’-amino y 2’-metilamino-BNA y anteriormente se ha comunidad la estabilidad térmica de otros dúplex con hebras de ARN y ADN complementarias.

Se conocen bien restos de azúcar modificado y se pueden usar para alterar, normalmente incrementar, la afinidad del compuesto antisentido por su diana y/o incrementar la resistencia a nucleasas. Una lista representativa de azúcares modificados preferidos incluye, entre otros, azúcares modificados bicíclicos (BNA), incluidos metilenoxi(4’CH2-O-2’) BNA y etilenoxi (4’-(CH2)2-O-2’-puente) BNA; azúcares sustituidos, especialmente azúcares sustituidos en 2’ que tienen un grupo sustituyente 2’-F, 2’-OCH3 o 2’-O (CH2)2-OCH3; y azúcares modificados en 4’-tio. Los azúcares también pueden reemplazarse con grupos miméticos de azúcar, entre otros. Los expertos en la técnica conocen bien procedimientos para las preparaciones de azúcares modificados. Algunas patentes y publicaciones representativas que instruyen sobre la preparación de dichos azúcares modificados incluyen, entre otros, las patentes de EE.UU. nº: 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; 5.792.747; 5.700.920; 6.531.584; y 6.600.032; y WO 2005/121371.

En ciertas realizaciones, BNA incluyen nucleósidos bicíclicos que tienen la fórmula:

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en la que:

Bx es un resto base heterocíclica;

T1 es H o un grupo protector de hidroxilo;

T2 es H, un grupo protector de hidroxilo o un grupo de fósforo reactivo;

Z es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 sustituido, acilo, acilo sustituido o amida sustituida.

En una realización, cada uno de los grupos sustituidos está, de forma independiente, mono o polisustituido con grupos sustituyentes opcionalmente protegidos seleccionados de forma independiente de halógeno, oxo, hidroxilo, OJ1,NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1,OC (=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 y CN, en los que cada J1,J2 y J3 es, de forma independiente, H o alquilo C1-C6 y X es O, S o NJ1.

En ciertas de estas realizaciones, cada uno de los grupos sustituidos está, de forma independiente, mono o polisustituido con grupos sustituyentes seleccionados de forma independiente de halógeno, oxo, hidroxilo, OJ1,NJ1J2, SJ1, N3, OC (=X)NJ1 y NJ3C(=X)NJ1J2, en los que cada J1,J2 y J3 es, de forma independiente, H, alquilo C1-C6 o alquilo C1-C6 sustituido y X es O o NJ1.

En ciertas realizaciones, el grupo Z es alquilo C1-C6 sustituido con uno o más Xx, en la que cada Xx es, de forma independiente, OJ1,NJ1J2 ,SJ1,N3 , OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2 ,NJ3 C(=X)NJ1J2 o CN; en los que cada J1,J2 y J3 es, de forma independiente, H o alquilo C1-C6 y X es O, S o NJ1. En otra realización, grupo Z es alquilo C1-C6 sustituido con uno o más Xx, en la que cada Xx es, de forma independiente halo (p. ej., flúor), hidroxilo, alcoxi (p. ej., CH3O-), alcoxi o azido sustituido.

En ciertas realizaciones, el grupo Z es -CH2Xx, en la que Xx es OJ1,NJ1J2 ,SJ1,N3 , OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2 , NJ3 C(=X)NJ1J2 o CN; en los que cada J1,J2 y J3 es, de forma independiente, H o alquilo C1-C6 y X es O, S o NJ1. En otra

realización, el grupo Z es CH2Xx, en la que Xx es halo (p. ej., flúor), hidroxilo, alcoxi (p. ej., CH3O-) o azido.

En ciertas de estas realizaciones, el grupo Z está en la configuración (R).

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En ciertas de estas realizaciones, el grupo Z está en la configuración (S).

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En ciertas realizaciones, cada T1 y T2 es un grupo protector de hidroxilo. Una lista preferida de grupos protectores de hidroxilo incluye bencilo, benzoílo, 2,6-diclorobencilo, t-butildimetilsililo, t-butildifenilsililo, mesilato, tosilato, dimetoxitritilo (DMT), 9-fenilxantina-9-ilo (Pixilo) y 9-(p-metoxifenilo)xantina-9-ilo (MOX). En ciertas realizaciones, T1 es un grupo protector de hidroxilo seleccionado de acetilo, bencilo, t-butildimetilsililo, t-butildifenilsililo y

10 dimetoxitritilo, en los que un grupo protector de hidroxilo más preferido es T1 es 4,4’-dimetoxitritilo.

En ciertas realizaciones, T2 es un grupo de fósforo reactivo en el que los grupos de fósforo reactivos preferidos incluyen diisipropilcianoetoxi fosforoamidita y H-fosfonato. En ciertas realizaciones, T1 es 4,4’-dimetoxitritilo y T2 es diisipropilcianoetoxi fosforoamidita.

En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos tienen al menos un monómero de la fórmula:

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o de la fórmula:

o de la fórmula:

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20 en las que

Bx es un resto base heterocíclica;

T3 es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado ligado o un grupo de union internucleosídica unido a un nucleósido, un nucleótido, un oligonucleósido, un oligonucleótido, una subunidad monomérica o un compuesto oligomérico;

T4 es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado ligado o un grupo de union internucleosídica unido a un nucleósido, un nucleótido, un oligonucleósido, un oligonucleótido, una subunidad monomérica o un compuesto oligomérico; en el que al menos uno de T3 y T4 es grupo de union internucleosídica unido a un nucleósido, un nucleótido, un oligonucleósido, un oligonucleótido, una subunidad monomérica o un compuesto oligomérico; y

Z es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 sustituido, acilo, acilo sustituido o amida sustituida.

En una realización, cada uno de los grupos sustituidos está, de forma independiente, mono o polisustituido con grupos sustituyentes opcionalmente protegidos seleccionados de forma independiente de halógeno, oxo, hidroxilo, OJ1,NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1,OC (=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 y CN, en los que cada J1,J2 y J3 es, de forma independiente, H o alquilo C1-C6 y X es O, S o NJ1.

En una realización, cada uno de los grupos sustituidos está, de forma independiente, mono o polisustituido con grupos sustituyentes seleccionados de forma independiente de halógeno, oxo, hidroxilo, OJ1,NJ1J2, SJ1, N3, OC (=X)J1 y NJ3C(=X)NJ1J2, en los que cada J1,J2 y J3 es, de forma independiente, H o alquilo C1-C6 y X es O o NJ1.

En ciertas de estas realizaciones, al menos un Z es alquilo C1-C6 o alquilo C1-C6 sustituido. En ciertas realizaciones, cada Z es, de forma independiente, alquilo C1-C6 o alquilo C1-C6 sustituido. En ciertas realizaciones, al menos un Z es alquilo C1-C6. En ciertas realizaciones, cada Z es, de forma independiente, alquilo C1-C6. En ciertas realizaciones, al menos un Z es metilo. En ciertas realizaciones, cada Z es metilo. En ciertas realizaciones, al menos un Z es etilo. En ciertas realizaciones, cada Z es etilo. En ciertas realizaciones, al menos un Z es alquilo C1C6 sustituido. En ciertas realizaciones, cada Z es, de forma independiente, alquilo C1-C6 sustituido. En ciertas realizaciones, al menos un Z es metilo sustituido. En ciertas realizaciones, cada Z es metilo sustituido. En ciertas realizaciones, al menos un Z es etilo sustituido. En ciertas realizaciones, cada Z es etilo sustituido.

En ciertas realizaciones, al menos un grupo sustituyente es alcoxi C1-C6 (p. ej., al menos un Z es alquilo C1-C6 sustituido con uno o más alcoxi C1-C6). En otra realización, cada grupo sustituyente es, de forma independiente, alcoxi C1-C6 (p. ej., cada Z es, de forma independiente, alquilo C1-C6 sustituido con uno o más alcoxi C1-C6).

En ciertas realizaciones, al menos un grupo sustituyente alcoxi C1-C6 es CH3O-(p. ej., al menos un Z es CH3OCH2). En otra realización, cada grupo sustituyente alcoxi C1-C6 es CH3O-(p. ej., cada Z es CH3OCH2-).

En ciertas realizaciones, al menos un grupo sustituyente es halógeno (p. ej., al menos un Z es alquilo C1-C6 sustituido con uno o más halógenos). En ciertas realizaciones, cada grupo sustituyente es, de forma independiente, halógeno (p. ej., cada Z es, de forma independiente, alquilo C1-C6 sustituido con uno o más halógenos). En ciertas realizaciones, al menos un grupo sustituyente halógeno es flúor (p. ej., al menos un Z es CH2FCH2-, CHF2 CH2-o CF3CH2-). En ciertas realizaciones, cada grupo sustituyente halógeno es flúor (p. ej., cada Z es, de forma independiente, CH2FCH2-, CHF2 CH2-o CF3CH2-).

En ciertas realizaciones, al menos un grupo sustituyente es hidroxilo (p. ej., al menos un Z es alquilo C1-C6 sustituido con uno o más hidroxilos). En ciertas realizaciones, cada grupo sustituyente es, de forma independiente, hidroxilo (p. ej., cada Z es, de forma independiente, alquilo C1-C6 sustituido con uno o más hidroxilos). En ciertas realizaciones, al menos un Z es HOCH2-. En otra realización, cada Z es HOCH2-.

En ciertas realizaciones, al menos un Z es CH3-, CH3CH2-, CH2OCH3-, CH2F-o HOCH2-. En ciertas realizaciones, cada Z es, de forma independiente, CH3-, CH3CH2-, CH2OCH3-, CH2F-o HOCH2-.

En ciertas realizaciones, al menos un grupo Z es alquilo C1-C6 sustituido con uno o más Xx, en la que cada Xx es, de forma independiente, OJ1,NJ1J2 ,SJ1,N3 , OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2 ,NJ3 C(=X)NJ1J2 o CN; en los que cada J1,J2 y J3 es, de forma independiente, H o alquilo C1-C6 y X es O, S o NJ1. En otra realización, al menos un grupo Z es alquilo C1-C6 sustituido con uno o más Xx, en la que cada Xx es, de forma independiente halo (p. ej., flúor), hidroxilo, alcoxi

(p. ej., CH3O-), alcoxi o azido.

En ciertas realizaciones, cada grupo Z es, de forma independiente, alquilo C1-C6 sustituido con uno o más Xx, en la que cada Xx es, de forma independiente, OJ1,NJ1J2 ,SJ1,N3 , OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2 ,NJ3 C(=X)NJ1J2 o CN; en los que cada J1,J2 y J3 es, de forma independiente, H o alquilo C1-C6 y X es O, S o NJ1. En otra realización, cada grupo Z es, de forma independiente, alquilo C1-C6 sustituido con uno o más Xx, en los que cada Xx es, de forma independiente halo (p. ej., flúor), hidroxilo, alcoxi (p. ej., CH3O-) o azido.

En ciertas realizaciones, al menos un grupo Z es -CH2Xx, en la que Xx es OJ1,NJ1J2 ,SJ1,N3 , OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2 , NJ3 C(=X)NJ1J2 o CN; en los que cada J1,J2 y J3 es, de forma independiente, H o alquilo C1-C6 y X es O, S o NJ1. En ciertas realizaciones, al menos un grupo Z es CH2Xx, en la que Xx es halo (p. ej., flúor), hidroxilo, alcoxi (p. ej., CH3O-) o azido.

En ciertas realizaciones, cada grupo Z es, de forma independiente, -CH2Xx, en la que Xx es, de forma independiente, OJ1, NJ1J2, SJ1,N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3 C(=X)NJ1J2 o CN; en los que cada J1,J2 y J3 es, de forma independiente, H o alquilo C1-C6 y X es O, S o NJ1. En otra realización, cada grupo Z es, de forma independiente, CH2Xx, en la que Xx es, de forma independiente, halo (p. ej., flúor), hidroxilo, alcoxi (p. ej., CH3O-) o azido.

En ciertas realizaciones, al menos un Z es CH3-. En otra realización, cada Z es CH3-..

En ciertas realizaciones, el grupo Z de al menos un monómero está en la configuración (R) representada por la fórmula:

o la fórmula:

o la fórmula:

imagen1

15 En ciertas realizaciones, el grupo Z de cada monómero de la fórmula está en la configuración (R).

En ciertas realizaciones, el grupo Z de al menos un monómero está en la configuración (S) representada por la fórmula:

o la fórmula:

o la fórmula:

imagen1

5

10

15

20

25

30

35

40

En ciertas realizaciones, el grupo Z de cada monómero de la fórmula está en la configuración (S).

En ciertas realizaciones, cada T3 es H o un grupo protector de hidroxilo. En ciertas realizaciones, cada T4 es H o un grupo protector de hidroxilo. En una realización adicional, T3 es un grupo de unión internucleosídica unido a un nucleósido, nucleótido o una subunidad monomérica. En ciertas realizaciones, T4 es un grupo de unión internucleosídica unido a un nucleósido, nucleótido o una subunidad monomérica. En ciertas realizaciones, T3 es un grupo de unión internucleosídica unido a un oligonucleósido o a un oligonucleótido. En ciertas realizaciones, T4 es un grupo de unión internucleosídica unido a un oligonucleósido o a un oligonucleótido. En ciertas realizaciones, T3 es un grupo de unión internucleosídica unido a un compuesto oligomérico. En ciertas realizaciones, T4 es un grupo de unión internucleosídica unido a un compuesto oligomérico. En ciertas realizaciones, al menos uno de T3 y T4 comprende un grupo de unión internucleosídica seleccionado de fosfodiéster o fosforotioato.

En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos tienen al menos una región de al menos dos monómeros contiguos de la fórmula:

o de la fórmula:

o de la fórmula: a

imagen1

En ciertas realizaciones, el compuesto oligomérico comprende al menos dos regiones de al menos dos monómeros contiguos de la fórmula anterior. En ciertas realizaciones, el compuesto oligomérico comprende un el compuesto oligomérico con hueco. En ciertas realizaciones, el compuesto oligomérico comprende al menos una región de aproximadamente 8 a aproximadamente 14 nucleósidos ß-D-2’-desoxirribofuranosilo contiguos. En ciertas realizaciones, el compuesto oligomérico comprende al menos una región de aproximadamente 9 a aproximadamente 12 nucleósidos ß-D-2’-desoxirribofuranosilo contiguos.

En ciertas realizaciones, los monómeros incluyen miméticos de azúcar. En ciertas de estas realizaciones, se usa un mimético en lugar del azúcar o de la combinación azúcar-unión internucleosídica, y la base nucleotídica se mantiene por hibridación a una diana seleccionada. Ejemplos representativos de miméticos de azúcar incluyen, entre otros, ciclohexenilo o morfolino. Ejemplos representativos de un mimético para una combinación de azúcar-unión internucleosídica incluyen, entre otros, ácidos nucleicos peptídicos (PNA) o grupos morfolino unidos por enlaces aquirales sin carga. En algunos casos se usa un mimético en lugar de la base nucleotídica. Miméticos de bases nucleotídicas representativos son bien conocidos en la técnica e incluyen, entre otros, análogos de fenoxacina tricíclica y bases universales (Berger y col., Nuc Acid Res. 2000, 28:2911-14. Los procedimientos para la síntesis de azúcar, nucleósidos y miméticos de bases nucleotídicas son bien conocidos para los expertos en la técnica.

3. Enlaces monoméricos

En el presente documento se describen grupos ligadores que unen monómeros (incluidos, entre otros, nucleósidos y nucleótidos modificados y no modificados), formando de este modo un compuesto oligomérico. Las dos clases principales de grupos de unión se definen por la presencia o ausencia de un átomo de fósforo. Enlaces representativos que contienen fósforo incluyen, entre otros, fosforodiésteres (P=O), fosforotriésteres, metilfosfonatos, fosforoamidato y fosforotioatos (P=S). Grupos de unión sin fósforo representativos incluyen, entre otros, metilenmetilimino (-CH2-N(CH3)O-CH2-), tiodiéster (-O-C(O)-S-), tionocarbamato (-O-C(O)(NH)-S-); siloxano (O-Si(H) 2-O-); y N,N’-dimetilhidrazina (-CH2-N(CH3)-N(CH3)-). Los compuestos oligoméricos que tienen grupos de unión sin fósforo se denominan oligonucleósidos. Se pueden usar enlaces modificados, en comparación con los enlaces fosfodiéster naturales, para alterar, normalmente aumentar, la resistencia a la nucleasa del compuesto oligomérico. En ciertas realizaciones, se pueden preparar enlaces que tienen un átomo quiral, como mezclas racémicas en forma de enantiómeros separados. Enlaces quirales representativos incluyen, entre otros, alquilfosfonatos y fosforotioatos. Los procedimientos para la preparación de enlaces que contienen fósforo y que no contienen fósforo son bien conocidos para los expertos en la técnica.

Los compuestos oligoméricos descritos en el presente documento contienen uno o más centros asimétricos y pueden, por tanto, dar lugar a enantiómeros, diastereómeros y otras formas estereoisoméricas que pueden definirse en términos de estereoquímica como (R) o (S), (α)o(β), tal como para anómeros de azúcar, o como (D) o (L), tal como para aminoácidos. Incluidos en los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento están todos estos posibles isómeros, así como sus formas racémicas y óptimamente puras.

4. Compuestos oligoméricos

En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan compuestos oligoméricos que tienen grupos de fósforo reactivos útiles para formar enlaces, incluidos, por ejemplo, enlaces internucleosídicos fosfodiéster y fosforotioato. Procedimientos de preparación y/o purificación de precursores o compuestos oligoméricos no son una limitación de las composiciones o procedimientos proporcionados en el presente documento. Los procedimientos para la síntesis y purificación de compuestos oligoméricos, incluidos ADN, ARN, oligonucleótidos, oligonucleósidos y compuestos antisentido son bien conocidos para los expertos en la técnica.

En general, los compuestos oligoméricos comprenden una pluralidad de subunidades monoméricas unidas mediante grupos de unión. Ejemplos no limitantes de compuestos oligoméricos incluyen cebadores, sondas, compuestos antisentido, oligonucleótidos antisentido, oligonucleótidos de secuencias de guía externas (SGE), empalmadotes alternativos y ARNsi. Como tales, estos compuestos se pueden introducir en forma de monocatenaria, bicatenaria, circular, ramificada o en horquilla y pueden contener elementos estructurales tales como protuberancias o bucles. Compuestos oligoméricos bicatenarios pueden ser dos hebras hibridadas para formar compuestos bicatenarios o una sola hebra con suficiente autocomplementariedad para permitir la hibridación y la formación de un compuesto completamente o parcialmente bicatenario.

En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona compuestos oligoméricos quiméricos. En ciertas de estas realizaciones, los compuestos oligoméricos quiméricos son oligonucleótidos quiméricos. En ciertas de estas realizaciones, los oligonucleótidos quiméricos comprenden nucleótidos modificados de forma diferente. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos quiméricos son oligonucleótidos antisentido de estructura mixta.

En general, un compuesto oligomérico quimérico tendrá nucleósidos modificados que pueden estar en posiciones aisladas o agrupados en regiones que definirán un motivo concreto. Cualquier combinación de modificaciones y/o grupos miméticos puede comprender un compuesto oligomérico quimérico, tal como se describe en el presente documento.

En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos quiméricos normalmente comprenden al menos una región modificada de modo que confieren un incremento de la resistencia a la degradación por nucleasas, incremento de la captación celular y/o incremento de la afinidad de unión por el ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, una región adicional del compuesto oligomérico puede servir como sustrato para las enzimas capaces de escindir ARN:ADN o híbridos ARN:ARN. A modo de ejemplo, la RNasa H es una endonucleasa celular que escinde la hebra de ARN de un dúplex ARN:ADN. Por tanto, la activación de la RNasa H da lugar a la escisión del ARN diana, de modo que se potencia considerablemente la eficiencia de la inhibición de la expresión génica. En consecuencia, a menudo se pueden obtener resultados comparables con compuestos oligoméricos más cortos cuando se usan quimeras, en comparación con, por ejemplo, fosforotioato desoxioligonucleótidos que hibridan con la misma región diana. La escisión del ARN diana se puede detectar de forma rutinaria mediante electroforesis en gel y, en caso necesario, técnicas asociadas de hibridación de ácidos nucleicos conocidas en la técnica.

En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos quiméricos son gápmeros. En ciertas realizaciones, los compuestos quiméricos son compuestos antisentido cortos. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos son gápmeros. En ciertas de estas realizaciones, un oligómero antisentido de estructura mixta tiene un tipo de enlace internucleotídico en una o ambas alas y un tipo diferente de enlaces internucleotídicos en el hueco. En n ciertas de estas realizaciones, el oligómero antisentido de estructura mixta tiene enlaces fosfodiéster en las alas y enlaces fosforotioato en el hueco. En ciertas realizaciones en las que el enlace internucleotídico en un ala es diferente del enlace internucleotídico en el hueco, el enlace internucleotídico que une dicha ala y el hueco es el mismo que el enlace internucleotídico del ala. En ciertas realizaciones en las que el enlace internucleotídico en un ala es diferente del enlace internucleotídico en el hueco, el enlace internucleotídico que une dicha ala y el hueco es el mismo que el enlace internucleotídico del hueco.

C. Ciertos compuestos antisentido cortos

En el presente documento se divulgan compuestos antisentido de 8 a 16, preferentemente de 9 a 15, más preferentemente de 9 a 14, más preferentemente de 10 a 14 nucleótidos de longitud. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen una longitud de 9 a 14 nucleótidos. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen una longitud de 10 a 14 nucleótidos. En ciertas realizaciones, dichos compuestos antisentido cortos son oligonucleotídicos antisentido cortos.

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos comprenden una o más modificaciones químicas. En ciertas de estas realizaciones, los compuestos antisentido cortos comprenden al menos un nucleótido modificado. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos comprenden al menos dos o más nucleótidos modificados. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos comprenden al menos un enlace internucleotídico modificado. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos quiméricos son oligonucleótidos de estructura mixta. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos son oligonucleótidos quiméricos. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos se modifican de forma uniforme. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos comprenden modificaciones seleccionadas de forma independiente en cada base nucleotídica y en cada enlace.

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos son gápmeros cortos. En ciertas de estas realizaciones, los gápmeros cortos comprenden al menos una modificación de alta afinidad en una o más alas del compuesto. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos comprenden de 1 a 3 modificaciones de alta afinidad en cada ala. En ciertas realizaciones, las modificaciones de alta afinidad de los compuestos antisentido cortos permiten una afinidad por la diana similar, o incluso mayor, a la afinidad por la diana de compuestos antisentido más largos. En ciertas realizaciones, los nucleótidos modificados de alta afinidad son nucleótidos modificados con azúcar. Dichos nucleótidos modificados con azúcar incluyen aquéllos que comprenden un puente entre las posiciones 4' y 2’ del azúcar. Las modificaciones de alta afinidad de ejemplo incluyen, entre otras, BNA y otras modificaciones en 2’, tal como 2’-MOE. En una realización alternativa de la invención, la modificación de alta afinidad no es un nucleótido modificado con azúcar 2’-O-(CH2)nH (n=1-6).

En una realización alternativa adicional, el nucleótido modificado de alta afinidad no es un nucleótido 2’-OCH3 o un 2’-OCH2CH2OCH3 . En ciertas realizaciones, los nucleótidos modificados de alta afinidad confieren un Tm de al menos 1, al menos 1,5, al menos 2, al menos 2,5, al menos 3,0, al menos 3,5 o al menos 4,0 grados por nucleótido. En la técnica se sabe que algunas modificaciones nucleotídicas de alta afinidad aumentan la toxicidad. Como se muestra en el presente documento, los compuestos antisentido cortos que tienen un número limitado (en general de 2 a 6) de modificaciones de alta afinidad exhiben poco o ninguna toxicidad, pero conservan o aumentan la afinidad por el ARN diana, al tiempo que también reducen significativamente la expresión del ARN diana. Los compuestos antisentido cortos de la invención pueden comprender, opcionalmente, un grupo conjugado, tal como, por ejemplo, colesterol o C16.

1. Ciertas alas

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos comprenden un ala en 5’ y/o un ala en 3’. En dichas realizaciones, las características del ala en 3’ y las características del ala en 5’ se seleccionan de forma independiente. Por tanto, en dichas realizaciones, el número de monómeros en el ala 5’ y el número de monómeros (longitud) en el ala 5’ pueden ser iguales o pueden ser diferentes; las modificaciones, si las hubiera, en el ala 5’ pueden ser las mismas que las modificaciones, si las hubiera, en el ala 3', o dichas modificaciones, si las hubiera, pueden ser diferentes; y los enlaces monoméricos en el ala 5’ y los enlaces monoméricos en el ala 3’ pueden ser iguales o pueden ser diferentes.

En ciertas realizaciones, un ala comprende uno, dos o tres monómeros (es decir, tiene una longitud de 1, 2 o 3). En ciertas realizaciones, los monómeros de un ala están modificados. En ciertas de dichas realizaciones, los monómeros del ala están modificados para incrementar la afinidad del compuesto antisentido por su ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, los monómeros de un ala son nucleósidos o nucleótidos. En ciertas de dichas realizaciones, los nucleósidos o nucleótidos del ala comprenden una modificación en 2’. En ciertas realizaciones, los monómeros (nucleósidos o nucleótidos) del ala son BNA. En ciertas de dichas realizaciones, los monómeros del ala se seleccionan de α-L-metilenoxi (4’-CH2-O-2’) BNA, ß-D-metilenoxi(4’-CH2-O-2’) BNA, etilenoxi (4’-(CH2)2-O2’)BNA, aminooxi(4’-CH2-O-N(R)-2’) BNA y oxiamino (4’-CH2-N(R)-O-2’) BNA. En ciertas realizaciones, los monómeros de un ala comprenden un sustituyente en la posición 2’ seleccionado de alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-alquilo C1-C10, -OCF3 , O-(CH2)2-O-CH3, 2’-O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), y O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), en las que cada Rm y Rn es, de forma independiente, H o alquilo C1-C10 sustituido o insustituido. En ciertas realizaciones, los monómeros de un ala son nucleótidos 2’MOE.

En ciertas realizaciones, los enlaces monoméricos en un ala son enlaces internucleotídicos naturales. En ciertas realizaciones, los enlaces monoméricos en un ala son enlaces internucleotídicos no naturales o enlaces internucleotídicos. En ciertas de dichas realizaciones, los enlaces monoméricos en el ala son más resistentes a una

o más nucleasas que los enlaces internucleotídicos naturales. En ciertas de dichas realizaciones, los enlaces monoméricos en el ala son enlaces fosforotioato (P=S). En ciertas realizaciones en las que un ala tiene más de un enlace monomérico, los enlaces monoméricos son iguales entre sí. En ciertas realizaciones en las que un ala tiene más de un enlace monomérico, los enlaces monoméricos son diferentes entre sí.

Un experto en la técnica reconocerá que las características y modificaciones tratadas anteriormente pueden usarse en cualquier combinación para preparar un ala. La siguiente tabla proporciona ejemplos no limitantes que muestran cómo se podría preparar un ala seleccionando un cierto número de monómero, modificaciones monoméricas (si las hubiera) y enlaces monoméricos dentro del ala.

Longitud

Tipo de monómero/modificaciones Enlaces monoméricos dentro del ala

1

2’ MOE Ninguno

1

BNA Ninguno

1

Metilenoxi BNA Ninguno

1

ENA Ninguno

2

2’ MOE P=S

2

BNA P=S

2

Metilenoxi BNA P=S

2

ENA P=S

2

2’ MOE P=O

2

BNA P=O

2

Metilenoxi BNA P=O

2

ENA P=O

3

2’ MOE P=S

3

BNA P=S

3

Metilenoxi BNA P=S

3

ENA P=S

3

2’ MOE P=O

3

BNA P=O

3

Metilenoxi BNA P=O

3

ENA P=O

10 En ciertas realizaciones en las que un ala comprende dos, tres o cuatro monómeros, dichos dos, tres o cuatro monómeros comprenden todos ellos las mismas modificaciones, si las hubiera. En ciertas realizaciones en las que un ala comprende dos, tres o cuatro monómeros, uno o más de dichos dos, tres o cuatro bases nucleotídicas comprende una o más modificaciones que son diferentes de una o más de las modificaciones de uno o más del resto de los monómeros.

15 2. Ciertos huecos

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos comprenden un hueco entre el ala en 5’ y el ala en 3’. En ciertas realizaciones, el hueco comprende cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece o catorce monómeros. En ciertas realizaciones, los monómeros del hueco son desoxirribonucleótidos no modificados. En ciertas realizaciones, los monómeros del hueco son ribonucleótidos no modificados. En ciertas realizaciones, las

20 modificaciones del hueco (si las hubiera) tienen como resultado un compuesto antisentido que, cuando se une a su ácido nucleico diana, soporta la escisión por una RNasa, incluida, entre otras, la RNasa H.

En ciertas realizaciones, los enlaces monoméricos en el hueco son enlaces internucleotídicos naturales. En ciertas realizaciones, los enlaces monoméricos en el hueco son enlaces internucleotídicos no naturales. En ciertas de dichas realizaciones, los enlaces monoméricos en el hueco son más resistentes a una o más nucleasas que los enlaces internucleotídicos naturales. En ciertas de dichas realizaciones, los enlaces monoméricos en el hueco son

5 enlaces fosforotioato (P=S). En ciertas realizaciones, los enlaces monoméricos en el hueco son iguales entre sí. En ciertas realizaciones, los enlaces monoméricos en el hueco no son todos iguales.

Un experto en la técnica reconocerá que las características y modificaciones tratadas anteriormente pueden usarse en cualquier combinación para preparar un hueco. La siguiente tabla proporciona ejemplos no limitantes que muestran cómo se podría preparar un hueco seleccionando un cierto número de monómeros, modificaciones

10 monoméricas (si las hubiera) y enlaces monoméricos dentro del hueco.

Longitud

Tipo de monómero/modificaciones Enlaces monoméricos dentro del hueco

5

ADN P=S

6

ADN P=S

7

ADN P=S

8

ADN P=S

9

ADN P=S

10

ADN P=S

11

ADN P=S

12

ADN P=S

13

ADN P=S

14

ADN P=S

6

ADN P=O

7

ADN P=O

8

ADN P=O

9

ADN P=O

10

ADN P=O

11

ADN P=O

12

ADN P=O

8

ARN P=S

9

ARN P=S

10

ARN P=S

11

ARN P=S

12

ARN P=S

3. Ciertos compuestos oligoméricos antisentido con huecos

Un experto en la técnica reconocerá que se pueden seleccionar las alas y los huecos tratados anteriormente y después combinar en diversas combinaciones para generar compuestos oligoméricos con huecos, incluidos, entre otros, compuestos oligoméricos antisentido con huecos y oligonucleótidos antisentido con huecos. Las 15 características (longitud, modificaciones, enlaces) del ala en 5’ y del ala en 3’ pueden seleccionarse de forma independiente entre sí. Las características del hueco incluyen al menos una diferencia en la modificación en comparación con las características del ala en 5’ y al menos una diferencia en comparación con las características del ala en 3’ (es decir, debe haber al menos una diferencia en la modificación entre regiones adyacentes para

distinguir dichas regiones adyacentes entre sí). Las características del hueco pueden, por otro lado, seleccionarse de forma independiente.

En ciertas realizaciones, los enlaces monoméricos en un ala son enlaces monoméricos dentro del hueco son iguales. En ciertas realizaciones, los enlaces monoméricos en un ala son enlaces monoméricos dentro del hueco 5 son diferentes. En ciertas de dichas realizaciones, el enlace monomérico que une el ala y el hueco es igual que los enlaces monoméricos dentro del ala. En ciertas realizaciones, el enlace monomérico que une el ala y el hueco es igual que los enlaces monoméricos dentro del hueco. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen enlaces uniformes a lo largo del compuesto. En ciertas de dichas realizaciones, todos los enlaces son enlaces fosforotioato (P=S). Un experto en la técnica reconocerá que las alas en 3’, las alas en 5’, los huecos y los

10 enlaces tratados anteriormente pueden usarse en cualquier combinación para preparar un gápmero. La siguiente tabla proporciona ejemplos no limitantes que muestran cómo se podría preparar un gápmero seleccionando un cierto número de ala en 5’, un hueco, un ala en 3’ y ciertos enlaces que unen el hueco y cada ala.

Ala en 5’

Puente en 5’ Hueco Puente en 3’ Ala en 3’

Longitud

Monómero Enlace Enlace Longitud Monómero Enlace Enlace Longitud Monómero Enlace

2

MOE P=S P=S 6 ADN P=S P=S 2 MOE P=S

2

BNA P=S P=O 8 ADN P=O P=S 3 BNA P=S

1

MOE Ningun o P=S 10 ADN P=S P=S 1 MOE P=S

2

MOE P=S P=S 8 ARN P=S P=S 2 MOE P=S

3

Metilenoxi BNA P=S P=S 8 ARN P=S P=S 3 MOE P=S

3

ADN P=O P=O 10 ARN P=S P=O 3 2’OH P=O

2

2-F P=S P=S 5 ARN P=S P=S 2 2’-F P=S

1

MOE P=O P=S 5 ADN P=O P=S 4 MOE P=S

15 En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos descritos en el presente documento pueden comprender de aproximadamente 8 a aproximadamente 16, preferentemente de 9 a 15, más preferentemente de 9 a 14, más preferentemente de 10 a 14 monómeros (es decir, de aproximadamente 8 a aproximadamente 16 monómeros unidos). Un experto en la técnica apreciará que esto comprende compuestos antisentido de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 bases nucleotídicas. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos son compuestos antisentido.

20 En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen una longitud de 8 bases nucleotídicas. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen una longitud de 9 bases nucleotídicas. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen una longitud de 10 bases nucleotídicas. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen una longitud de 11 bases nucleotídicas. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen una longitud de 12 bases nucleotídicas.

25 En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen una longitud de 13 bases nucleotídicas. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen una longitud de 14 bases nucleotídicas. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen una longitud de 15 bases nucleotídicas. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen una longitud de 16 bases nucleotídicas. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen una longitud de 8 monómeros. En ciertas

30 realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen una longitud de 9 monómeros. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen una longitud de 10 monómeros. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen una longitud de 11 monómeros. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen una longitud de monómeros. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen una longitud de 13 monómeros. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen una longitud de 14 monómeros. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen una longitud de 15 monómeros. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen una longitud de 16 monómeros. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos comprenden de 9 a 15 monómeros. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos comprenden de 10 a 15 monómeros. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos comprenden de 12 a 14 monómeros. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos comprenden de 12 a 14 nucleótidos o nucleósidos.

Un experto en la técnica e informado por los compuestos antisentido cortos ilustrados en el presente documento podrá, sin experimentación indebida, identificar otros compuestos antisentido cortos.

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos comprenden un hueco flanqueado por más de un ala por ambos lados. Por tanto, en ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto comprende dos o más alas en 5’ y dos o más alas en 3’. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos comprenden un ala en 5’ y dos o más alas en 3’. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos comprenden un ala en 3’ y dos o más alas en 5’. Ciertas de dichas realizaciones comprende, por ejemplo, las regiones siguientes: una primera ala en 5’-un puente-una segunda ala en 5’-un puente – un hueco – un puente – una segunda ala en 3’ – un puente – una primera ala en 3’. En dichas realizaciones, cada región tiene al menos una diferencia en la modificación cuando se compara con su región adyacente. Por tanto, en dichas realizaciones, la segunda ala en 5’ y la segunda ala en 3’, cada una de forma independiente, comprenden una o más diferencias en la modificación cuando se compara con el hueco y cuando se compara con la primera ala en 5’ y con la primera ala en 3’-En dichas realizaciones, las modificaciones de la primera ala en 3’ y con la primera ala en 5’ pueden ser cada una o ambas iguales o diferentes de las modificaciones del hueco, si las hubiera.

4. Ciertos grupos conjugados

En un aspecto, los compuestos oligoméricos están modificados mediante unión covalente de uno o más grupos conjugados. En general, los grupos conjugados modifican una o más propiedades del compuesto oligomérico unido incluidas, entre otras, farmacodinámica, farmacocinética, unión, absorción, distribución celular, captación celular, carga y aclaramiento. Los grupos conjugados se usan rutinariamente en las técnicas químicas y están unidos directamente o mediante un resto de unión o grupo de unión opcional a un compuesto parental, tal como un compuesto oligomérico. Una lista preferida de grupos conjugados incluye, sin limitaciones, intercalantes, moléculas indicadoras, poliaminas, poliamidas, polietilenglicoles, tioéteres, poliésteres, colesteroles, tiocolesteroles, restos ácido cólico, folato, lípidos, fosfolípidos, biotina, fenazina, fenantridina, antraquinona, adamantano, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y pigmentos.

Grupos conjugados preferidos en la presente invención incluyen restos lipídicos, tales como resto colesterol ((Letsinger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553); ácido cólico (Manoharan y col., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4, 1053); un tioéter, por ejemplo hexil-S-tritiltiol (Manoharan y col., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306; Manoharan y col., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765); un tiocolesterol (Oberhauser y col., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533); una cadena alifática, por ejemplo residuos de dodecandiol o undeciloilo (Saison-Hehmoaras y col., EMBO J., 1991, 10, 111; Kabanov y col., FEBS Lett., 1990, 259, 327; Svinarchuk y col., Biochimie, 1993, 75, 49); un fosfolípido, por ejemplo, dihexadecil-rac-glicerol o trietilamonio-1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato (Manoharan y col., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651; Shea y col., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777); una poliamina

o una cadena de polietilenglicol (Manoharan y col., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969); ácido adamantano acético (Manoharan y col., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651); un resto palmitilo (Mishra y col., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229); o u resto octadecilamina o hexilamino-carboniloxicolesterol (Crooke y col., J. Pharmacol:Exp. Ther., 1996,277,923).

Grupos de unión o restos de unión bifuncionales, tales como los conocidos en la técnica, son adecuados para los compuestos proporcionados en el presente documento. Los grupos de unión son útiles para la unión de grupos químicos funcionales, grupos conjugados, grupos indicadores y otros grupos para sitios selectivos en un compuesto parental, tal como, por ejemplo, un compuesto oligomérico. En general, un resto de unión bifuncional comprende un resto hidrocarbilo que tiene dos grupos funcionales. Uno de los grupos funcionales se selecciona de modo que se una a una molécula parental o compuesto de interés y el otro se selecciona de modo que se una esencialmente a cualquier grupo seleccionado, tal como un grupo químico funcional o un grupos conjugado. En algunas realizaciones, el ligador comprende una estructura de cadena o un oligómero de unidades repetidas, tales como unidades de etilenglicol o aminoácido. Ejemplos de grupos funcionales que se usan de forma rutinaria en un resto de unión bifuncional incluyen, entre otros, electrófilos para reaccionar con grupos nucleófilos y nucleófilos para reaccionar con grupos electrófilos. En algunas realizaciones, restos de unión bifuncionales incluyen amino, hidroxilo, ácido carboxílico, tiol, insaturaciones (p. ej., dobles o triples enlaces) y similares. Algunos ejemplos no limitantes de restos de unión bifuncionales incluyen ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico (ADO), 4-(N-maleimidometil) cyclohexan-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC) y ácido 6-aminohexanoico (AHEX o AHA). Otros grupos de unión incluyen, entre otros, alquilo C1-C10 sustituido, alquenilo C2-C10 sustituido o insustituido o alquinilo C2-C10 sustituido

o insustituido, en los que una lista no limitante de grupos sustituyentes preferidos incluyen hidroxilo, amino, alcoxi, carboxi, bencilo, fenilo, nitro, tiol, tioalcoxi, halógeno, alquilo, arilo, alquenilo y alquinilo.

5. Síntesis, purificación y análisis

La oligomerización de nucleósidos y nucleótidos modificados y no modificados se puede realizar de forma rutinaria de acuerdo con los procedimientos de la bibliografía (Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Ed. Agrawal (1993), Humana Press) y/o ARN (Scaringe, Methods (2001), 23, 206-217. Gait y col., Applications of Chemically synthesized RNA in RNA: Protein Interactions, Ed. Smith (1998), 1-36. Gallo y col., Tetrahedron (2001), 57,5707, 5707-5713).

Los compuestos oligoméricos proporcionados en el presente documento pueden fabricarse de forma conveniente y rutinaria a través de la técnica bien conocida de la síntesis en fase sólida. El equipo para dicha síntesis se comercializa en diferentes proveedores incluidos, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, CA). También se puede emplear adicionalmente o como alternativa cualquier otro medio para dicha síntesis. Es bien conocido el uso de técnicas similares para preparar oligonucleótidos tales como fosforotioatos y derivados alquilados. La invención no está limitada por el procedimiento de la síntesis de compuestos antisentido.

Los expertos en la técnica conocen procedimientos de purificación y análisis de compuestos oligoméricos. Los procedimientos de análisis incluyen electroforesis capilar (EC) y espectroscopia de masas por electronebulización. Dichos procedimientos de síntesis y análisis pueden realizarse en placas de múltiples pocillos. El procedimiento de la invención no está limitado por el procedimiento de la purificación de oligómeros.

D. Antisentido

Los mecanismos antisentido son todos aquéllos que implican la hibridación de un compuesto con un ácido nucleico diana, en los que el resultado o efecto de la hibridación es la degradación de la diana o la ocupación de la diana con la detención de la maquinaria celular que implica, por ejemplo, transcripción o corte y empalme.

U tipo de mecanismo antisentido que implica la degradación diana incluye una RNasa H. La RNasa H es una endonucleasa celular que escinde la hebra de ARN de un dúplex ARN:ADN. En la técnica se sabe que los compuestos antisentido monocatenarios que son "similares a ADN" provocan actividad de RNasa H en células de mamífero. Por tanto, la activación de la RNasa H da lugar a la escisión del ARN diana, de modo que se potencia considerablemente la eficiencia de la inhibición de la expresión génica mediada por oligonucleótidos similares a ADN.

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido modificados químicamente tienen una afinidad mayor por los ARN diana que los ADN no modificados. En ciertas de dichas realizaciones, dicha afinidad mayor proporciona a su vez mayor potencia, lo que permite la administración de dosis menores de dichos compuestos, menor potencial de toxicidad y mejora del índice terapéutico y menor costes globales de la terapia.

La presente revelación demuestra que la incorporación de nucleótidos y nucleósidos de alta afinidad químicamente modificados en compuestos antisentido permite el diseño de compuestos antisentido cortos de una longitud de 8-16 bases nucleotídicas útiles para la reducción de los ARN diana y/o las proteínas diana en células, tejidos y animales, incluidos, entre otros, seres humanos con mayor potencia y mejor índice terapéutico. Por tanto, en ciertas realizaciones, en el presente documento se divulgan compuestos antisentido que comprenden modificaciones en nucleótidos de alta afinidad útiles para reducir un ARN diana in vivo. Ciertos de dichos compuestos antisentido cortos son eficaces a dosis menores que los compuestos antisentido descritos anteriormente, lo que permite una reducción de la toxicidad y los costes de tratamiento. Además, ciertos compuestos antisentido cortos tienen mayor potencial para dosificación oral.

Para abordar la necesidad de compuestos antisentido más potentes, en el presente documento se divulgan compuestos antisentido cortos (de 8 a 16, preferentemente de 9 a 15, más preferentemente de 9 a 14, más preferentemente de 10 a 14 nucleótidos de longitud) con mayor actividad in vivo respecto a los compuestos más largos. Ciertos compuestos antisentido cortos son compuestos gápmeros que comprenden nucleótidos químicamente modificados de alta afinidad en los extremos 3' y 5' (alas) del compuesto. En ciertas realizaciones, la adición de nucleótidos modificados de alta afinidad permite que los compuestos antisentido sean activos, o específicos, contra, de, su ARN diana objetivo in vivo a pesar de tener una longitud más corta. En el presente documento se contemplan compuestos antisentido en los que cada una de las alas comprende de forma independiente de 1 a 3 nucleótidos modificados de alta afinidad. En ciertas realizaciones, las modificaciones de alta afinidad son modificaciones de azúcar. Los nucleótidos modificados de alta afinidad incluyen, entre otros, BNA u otros nucleótidos modificados en 2’, tales como nucleótidos 2’-MOE. También se contemplan compuestos antisentido cortos que tienen al menos un enlace internucleotídico modificado, tal como un enlace internucleotídico fosforotioato. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos de la presente invención pueden tener todos los enlaces internucleotídicos de fosforotioato. Los compuestos antisentido cortos comprenden, opcionalmente, un grupo conjugado. Como se muestra en el presente documento, los compuestos tienen mayor afinidad por ADN diana que por ADN y son significativamente más potentes in vivo, como se demuestra mediante la reducción del ARNm diana así como la mejora de una diversidad de indicaciones de enfermedad.

Como se usa en el presente documento, un ARN que está implicado en la regulación del metabolismo o aclaramiento de la glucosa, el metabolismo de los lípidos, el metabolismo del colesterol o el metabolismo de la insulina es cualquier ARN implicado en las vías bioquímicas que regulan estos procesos. Dichos ARN son bien conocidos en la técnica.

1. Modulación de la expresión diana

En ciertas realizaciones, se identifica una diana y se diseñan oligonucleótidos antisentido para modular dicha diana

o su expresión. En ciertas realizaciones, el diseño de un compuesto oligomérico para una molécula de ácido nucleico diana puede ser un procedimiento de múltiples etapas. Normalmente el procedimiento comienza con la identificación de una proteína diana cuya actividad se tiene que modular y, después, la identificación del ácido nucleico cuya expresión produce la proteína diana. En ciertas realizaciones, el diseño de un compuesto antisentido da lugar a un compuesto antisentido que puede hibridar con la molécula de ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido o un oligonucleósido antisentido. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana son complementarios entre sí. En ciertas de dichas realizaciones, un compuesto antisentido es perfectamente complementario de un ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido incluye un apareamiento erróneo. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido incluye dos apareamientos erróneos. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido incluye tres o más apareamientos erróneos.

La modulación de la expresión de un ácido nucleico diana se puede conseguir mediante la alteración de cualquier número de funciones del ácido nucleico. En ciertas realizaciones, las funciones del ARN que se van a modular incluyen, entre otras, funciones de translocación, que incluyen, entre otras, translocación del ARN a un sitio de traducción de proteínas, translocación del ARN a sitios dentro de la célula que están lejos del sitio de la síntesis de ARN, y traducción de proteínas a partir del ARN, Las funciones de procesamiento de ARN que se pueden modular incluye, entre otras, corte y empalme del ARN para dar una o más especies de ARN, tapar los extremos del ARN, maduración en 3’ del ARN y actividad catalítica o formación de complejos que implican al ARN que se pueden unirse o ser facilitados por el ARN, La modulación de la expresión puede tener como resultado el incremento de los niveles de una o más especies de ácido nucleico o la disminución de los niveles de una o más especies de ácido nucleico, bien temporalmente o a un nivel neto en equilibrio. Por tanto, en una realización, modulación de la expresión puede significar aumentar o disminuir los niveles de ARN o de proteínas dianas. En otra realización, modulación de la expresión puede significar aumentar o disminuir uno o más productos de corte y empalme del ARN o un cambio en la proporción de dos o más productos de corte y empalme.

En ciertas realizaciones, la expresión de un gen diana se modula usando un compuesto oligomérico que comprende de aproximadamente 8 a aproximadamente 16, preferentemente de 9 a 15, más preferentemente de 9 a 14, más preferentemente de 10 a 14 monómeros (es decir, de aproximadamente 8 a aproximadamente 16 monómeros unidos). Un experto en la técnica apreciará que esto comprende procedimientos de modulación de la expresión de un gen diana usando uno o más compuestos antisentido de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 bases nucleotídicas.

En ciertas realizaciones, los procedimientos de modulación de un gen diana comprende usar un compuesto antisentido corto que tiene 8 bases nucleotídicas de longitud. En ciertas realizaciones, los procedimientos de modulación de un gen diana comprende usar un compuesto antisentido corto que tiene 9 bases nucleotídicas de longitud. En ciertas realizaciones, los procedimientos de modulación de un gen diana comprende usar un compuesto antisentido corto que tiene 8 bases nucleotídicas de longitud. En ciertas realizaciones, los procedimientos de modulación de un gen diana comprende usar un compuesto antisentido corto que tiene 10 bases nucleotídicas de longitud. En ciertas realizaciones, los procedimientos de modulación de un gen diana comprende usar un compuesto antisentido corto que tiene 10 bases nucleotídicas de longitud. En ciertas realizaciones, los procedimientos de modulación de un gen diana comprende usar un compuesto antisentido corto que tiene 11 bases nucleotídicas de longitud. En ciertas realizaciones, los procedimientos de modulación de un gen diana comprende usar un compuesto antisentido corto que tiene 12 bases nucleotídicas de longitud. En ciertas realizaciones, los procedimientos de modulación de un gen diana comprende usar un compuesto antisentido corto que tiene 13 bases nucleotídicas de longitud. En ciertas realizaciones, los procedimientos de modulación de un gen diana comprende usar un compuesto antisentido corto que tiene 14 bases nucleotídicas de longitud. En ciertas realizaciones, los procedimientos de modulación de un gen diana comprende usar un compuesto antisentido corto que tiene 15 bases nucleotídicas de longitud. En ciertas realizaciones, los procedimientos de modulación de un gen diana comprende usar un compuesto antisentido corto que tiene 16 bases nucleotídicas de longitud.

En ciertas realizaciones, los procedimientos de modulación de la expresión un gen diana comprenden el uso de un compuesto antisentido corto que comprende de 9 a1 5 monómeros. En ciertas realizaciones, los procedimientos de modulación de la expresión un gen diana comprenden el uso de un compuesto antisentido corto que comprende de 10 a1 5 monómeros. En ciertas realizaciones, los procedimientos de modulación de la expresión un gen diana comprenden el uso de un compuesto antisentido corto que comprende de 12 a14 monómeros.

En ciertas realizaciones, los procedimientos de modulación de la expresión un gen diana comprenden el uso de un compuesto antisentido corto que comprende 12 o14 nucleótidos o nucleósidos.

2. Hibridación

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido hibridan específicamente cuando hay un grado suficiente de complementariedad para evitar la unión inespecífica del compuesto antisentido con secuencias de un ácido nucleico no diana en condiciones en las que se desea unión específica, es decir en condiciones fisiológicas en el caso de los ensayos in vivo o tratamiento terapéutico, y en las condiciones en las que se realizan los ensayos en el caso de los ensayos in vitro.

Como se usa en el presente documento, “condiciones rigurosas de hibridación” o “condiciones rigurosas” se refiere a condiciones en las cuales un compuesto antisentido hibrida con su secuencia diana pero con un número mínimo de otras secuencias. Las condiciones rigurosas son dependientes de la secuencia y serán diferentes en circunstancias diferentes y “condiciones rigurosas” en las que los compuestos antisentido hibridan con una secuencia diana vienen determinadas por la naturaleza y la composición de los compuestos antisentido y de los ensayos en los que se están investigando.

3.

Complementariedad

En la técnica se entiende que la incorporación de modificaciones de afinidad en el nucleótido puede hacer que se produzca un mayor número de apareamientos erróneos en comparación con un compuesto no modificado. De forma similar, ciertas secuencias oligonucleotídicas pueden ser más tolerantes a los apareamientos erróneos que otras secuencias oligonucleotídicas. Un experto en la técnica es capaz de determinar un número adecuado de apareamientos erróneos entre oligonucleótidos o entre un oligonucleótido y un ácido nucleico diana, tal como mediante la determinación de la temperatura de fusión (Tm). Tm o Tm se pueden calcular mediante técnicas familiares para un experto en la técnica. Por ejemplo, las técnicas descritas en Freier y col. (Nucleic Acids Research, 1997, 25, 22: 4429-4443) permiten a un experto en la técnica evaluar en las modificaciones nucleotídicas su capacidad para incrementar la temperatura de fusión de un dúplex ARN:ADN.

4.

Identidad

Los compuestos antisentido, o una porción de los mismos, pueden tener un porcentaje definido de identidad con una SEC ID Nº o un compuesto que tenga un número Isis específico. Como se usa en el presente documento, una secuencia es idéntica a la secuencia divulgada en el presente documento si tiene la misma capacidad de apareamiento de bases nucleotídicas. Por ejemplo, un ARN que contiene uracilo en lugar de timidina en las secuencias divulgadas de los compuestos descritos en el presente documento se consideraría idéntico, ya que ambos se aparearían con adenina. Esta identidad puede estar a lo largo de toda la longitud del compuesto oligomérico o en una porción del compuesto antisentido (p. ej., las bases nucleotídicas 1-20 de un compuesto de 27 unidades pueden compararse con un compuesto de 20 unidades para determinar el porcentaje de identidad del compuesto oligomérico con la SEC ID Nº. Los expertos en la técnica entienden que un compuesto antisentido no tiene que tener una secuencia idéntica a la de los descritos en el presente documento para funcionar de un modo similar al compuesto antisentido descrito en el presente documento. En el presente documento también se proporcionan versiones más cortas de los compuestos antisentido enseñados en el presente documento o versiones no idénticas de los compuestos antisentido enseñados en el presente documento. Las versiones no idénticas son aquéllas en las que cada base no tiene la misma actividad de apareamiento que los compuestos antisentido enseñados en el presente documento. Las bases no tienen la misma actividad de apareamiento por ser más cortas o por tener al menos un sitio abásico. Como alternativa, una versión no idéntica puede incluir al menos una base sustituida con una base diferente con distinta actividad de apareamiento (p. ej., G puede estar sustituida por C, A o T). El porcentaje de identidad se calcula de acuerdo con el número de bases que tienen idéntico apareamiento de bases correspondiente a la SEC ID Nº o al compuesto antisentido con el que se está comparando. Las bases no idénticas pueden estar adyacentes, dispersas por el oligonucleótido o ambas cosas.

Por ejemplo, un compuesto de 16 unidades que tiene la misma secuencia que las bases nucleotídicas 2-17 es un 80% idéntico al compuesto de 20 unidades. Como alternativa, un compuesto de 20 unidades que contiene cuatro bases nucleotídicas no idénticas al compuesto de 20 unidades es también un 80% idéntico al compuesto de 20 unidades. Un compuesto de 14 unidades que tiene la misma secuencia que las bases nucleotídicas 1-14 de un compuesto de 18 unidades es un 78% idéntico al compuesto de 18 unidades. Dichos cálculos entran dentro de la capacidad de los expertos en la técnica.

El porcentaje de identidad se basa en el porcentaje de bases nucleotídicas en la secuencia original presentes en una porción de la secuencia modificada. Por tanto, un compuesto antisentido de 30 bases nucleotídicas que comprende la secuencia completa de la complementaria de un segmento diana activo de 20 bases nucleotídicas tendría una porción de identidad del 100% con el complementario del segmento diana activo de 20 bases nucleotídicas, al tiempo que además comprende una porción adicional de 10 bases nucleotídicas. En el contexto de la presente descripción, el complementario de un segmento diana activo puede constituir una única porción. En realizaciones preferidas, los oligonucleótidos proporcionados en el presente documento son al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% idénticos a al menos una porción del complementario de los segmentos diana activos presentados en el presente documento.

E. Ácidos nucleicos, regiones y segmentos diana

El ácido nucleico diana es una molécula de ácido nucleico que codifica SGLT2. Moléculas de ácido nucleico que codifican SGLT2 incluyen, sin limitaciones, la SEC ID Nº 3 que codifica SGLT2 humano (NM_003 041.1).

El procedimiento de apuntar a una diana incluye la determinación de al menos una región, segmento o sito diana dentro del ácido nucleico diana para que se produzca la interacción antisentido de modo que tenga lugar el efecto deseado.

En ciertas realizaciones, el nucleótido más en 5’ de una región diana es el sitio diana en 5' de un compuesto antisentido corto y el nucleótido más en 3’ de una región diana es el sitio diana en 3’ del mismo compuesto antisentido corto. En ciertas realizaciones, el nucleótido más en 5’ de una región diana es el sitio diana en 5' de un compuesto antisentido corto y el nucleótido más en 3’ de una región diana es el sitio diana en 3’ de un compuesto antisentido corto diferente. En ciertas realizaciones, una región diana comprende una secuencia nucleotídica dentro de 10, 15 o 20 nucleótidos de un sitio diana en 5’ o un sitio diana en 3’.

En ciertas realizaciones, una región diana es una región estructuralmente definida del ácido nucleico. Por ejemplo, en ciertas de dichas realizaciones, una región diana puede abarcar una 3’ UTR, una 5’ UTR, un exón, un intrón, una región codificadora, una región de inicio de la traducción, una región de terminación de la traducción u otra región de ácido nucleico definida.

Las localizaciones sobre el ácido nucleico diana definido por tener uno o más compuestos antisentido cortos activos diana se denominan ”segmentos diana activos”. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico diana que tiene uno o más compuestos antisentido cortos activos diana es ARN diana. Cuando un segmento diana activo se define por múltiples compuestos antisentido cortos, los compuestos están separados preferentemente por no más de aproximadamente 10 nucleótidos sobre la secuencia diana, más preferentemente no más de aproximadamente 5 nucleótidos sobre la secuencia diana, incluso más preferentemente los compuestos antisentido cortos son contiguos, más preferentemente los compuestos antisentido cortos se solapan. Puede haber una considerable variación de la actividad (p. ej., definida por el porcentaje de inhibición) de los compuestos antisentido cortos dentro de un segmento diana activo. Los compuestos antisentido cortos activos son aquéllos que modulan la expresión de su ácido nucleico diana, incluidos, entre otros, un ARN diana. Los compuestos antisentido cortos activos inhiben la expresión de su ARN diana al menos un 10%, preferentemente un 20%. En una realización preferida, al menos aproximadamente el 50%, preferentemente aproximadamente el 70% de los compuestos antisentido cortos dirigidos al segmento diana activo modulan la expresión de su ARN diana al menos un 40%. En una realización más preferida, el nivel de inhibición requerido para definir un compuesto antisentido corto activo se define en base a los resultados del cribado usado para definir los segmentos diana activos.

Un segmento diana adecuado es una porción de al menos aproximadamente 8 bases nucleotídicas de una región diana a la que está dirigido un compuesto antisentido corto activo. Los segmentos diana pueden incluir secuencias de ADN o ARN que comprenden al menos las 8 bases nucleotídicas consecutivas desde el extremo 5’ de uno de los segmentos diana ilustrativos (siendo las bases nucleotídicas restantes una tira consecutiva del mismo ADN o ARN comenzando inmediatamente antes del extremo 5' del segmento diana y continuando hasta que el ADN o ARN comprende de aproximadamente 8 a aproximadamente 16 bases nucleotídicas). Los segmentos diana también están representados por secuencias de ADN o ARN que comprenden al menos las 8 bases nucleotídicas consecutivas desde el extremo 3’ de uno de los segmentos diana ilustrativos (siendo las bases nucleotídicas restantes una tira consecutiva del mismo ADN o ARN comenzando inmediatamente después del extremo 3' del segmento diana y continuando hasta que el ADN o ARN comprende de aproximadamente 8 a aproximadamente 16 bases nucleotídicas). Se entiende que los segmentos diana antisentido pueden representados por secuencias de ADN o ARN que comprenden al menos 8 bases nucleotídicas consecutivas de una porción interna de la secuencia de un segmento diana ilustrativo y pueden extenderse en una o ambas direcciones hasta que el compuesto antisentido corto comprende de aproximadamente 8 a aproximadamente 16 bases nucleotídicas. Un experto en la técnica armado con los segmentos diana ilustrados en el presente documento podrá, sin experimentación indebida, identificar otros segmentos diana.

Una vez que se han identificado una o más regiones, segmentos o sitios diana, se escogen los compuestos antisentido cortos que son suficientemente complementarios a la diana, es decir hibridan suficientemente bien y con suficiente especificidad, para dar el efecto deseado.

Los compuestos antisentido cortos también pueden estar dirigidos a regiones de la secuencia de bases nucleotídicas diana que comprende cualquier base nucleotídica consecutiva de 8 a 16 bases nucleotídicas de longitud a lo largo de la molécula de ácido nucleico diana.

Los segmentos diana de 8 a 16 bases nucleotídicas de longitud que comprenden una tira de al menos ocho (8) bases nucleotídicas consecutivas seleccionadas del interior de los segmentos diana ilustrativos también se consideran adecuados como diana. Por tanto, los compuestos antisentido cortos también pueden abarcar 8-16 bases nucleotídicas con los segmentos identificados en el presente documento comenzando en un sitio diana en 5’ concreto. Cualquier segmento de , 9, 10, 11, o, más preferentemente, de 12, 13, 14, 15 o 16 bases nucleotídicas contiguas en un perímetro de 50, preferentemente 25, más preferentemente 16 bases nucleotídicas alrededor de estas regiones también se consideran adecuados como diana.

En otra realización, los “segmentos diana adecuados” identificados en el presente documento se pueden emplear en una criba para compuestos antisentido cortos adicionales que modulan la expresión de un ácido nucleico diana. “Moduladores” son los compuestos que disminuyen o incrementan la expresión de un ácido nucleico diana y que comprenden al menos una porción de 8 bases nucleotídicas que es complementaria a un segmento diana. El procedimiento de criba comprende las etapas de poner en contacto un segmento diana de un ácido nucleico con uno o más moduladores candidatos y seleccionar uno o más moduladores candidatos que disminuya o incremente la expresión de un ácido nucleico diana. Una vez que se ha demostrado que el modulador o moduladores candidatos diana son capaces de modular (p. ej., disminuir o aumentar) la expresión de un ácido nucleico diana, el modulador puede emplearse en estudios de investigación adicionales de la función o par usar como agente de investigación, diagnóstico o terapéutico de acuerdo con la presente divulgación.

Para todos los compuestos antisentido cortos tratados en el presente documento, secuencia, monómero, modificación monomérica y enlace monomérico pueden, cada uno, seleccionarse de forma independiente. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos están descritos con un motivo. En dichas realizaciones, cualquier motivo puede usarse con cualquier secuencia, la secuencia y/o el motivo se divulguen específicamente en el presente documento o no. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos comprenden modificaciones que no son adecuados para describir con un motivo (por ejemplo, los compuestos antisentido cortos que comprenden varias modificaciones y/o enlaces diferentes en varias posiciones a lo largo del compuesto). Dichas combinaciones se pueden incorporar para cualquier secuencia, se divulgue o no en el presente documento. El listado de secuencias que acompaña a esta presentación proporciona ciertas secuencias de ácido nucleico independientes de la modificación química. Aunque dicho listado identifica cada secuencia como “ARN” o “ADN”, según se requiera, en realidad dichas secuencias pueden modificarse con cualquier combinación de modificaciones químicas y/o motivos.

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos comprenden al menos un monómero modificado de alta afinidad. En ciertas realizaciones, se proporcionan compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico que codifica.

F. Ciertas dianas

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos pueden diseñarse de modo que modulen cualquier diana. En ciertas realizaciones, la diana es clínicamente relevante. En dichas realizaciones, la modulación de la diana tiene como resultado un beneficio clínico. Ciertas dianas se expresan, preferentemente, en el riñón. Ciertas dianas se expresan, preferentemente, en el hígado. Ciertas dianas se asocian con un trastorno metabólico. Ciertas dianas se asocian con un trastorno cardiovascular. En ciertas realizaciones, la diana es SGLT2.

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos exhiben in vivo una reducción del ARN diana específico del riñón y del hígado. Dicha propiedad convierte a dichos compuestos antisentido cortos en particularmente útiles para la inhibición de muchos ARN diana implicados en enfermedades metabólicas y cardiovasculares. Por tanto, en el presente documento se divulgan procedimientos de tratar trastornos metabólicos y cardiovasculares poniendo en contacto dichos tejidos renales o hepáticos con compuestos antisentido cortos dirigidos a ARN asociados con dichos trastornos. Por tanto, en el presente documento también se divulgan procedimientos de mejorar cualquiera de diversas indicaciones de enfermedad metabólica o cardiovascular con los compuestos antisentido cortos de la presente divulgación.

2. SGLT-2

El transportador 2 de glucosa dependiente de sodio (SGLT-2) se expresa en las células epiteliales de los túbulos proximales del riñón y funciona reabsorbiendo la glucosa y evitando la pérdida de glucosa en la orina. Para el genoma humano, el SGLT-2 es un miembro de una familia de 11 miembros de cotransportadores de sustrato de sodio. Muchas de estos miembros de la familia comparten homología de secuencia, por ejemplo SGLT-1 comparte aproximadamente un 59% de identidad de secuencia con SGLT-2 y aproximadamente un 70% de identidad de secuencia con SGLT-3. El SGLT-1 es un transportador de glucosa que se encuentra en el corazón y el SNC. El SGLT-3 es un canal de sodio sensible a glucosa en el intestino delgado. Los patrones de seguridad separados para estos SGLT es un punto de distinción entre los miembros homólogos de la familia. (Handlon, A.L., Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15(11):1532-1540; Kanai y col., J. Clin. Invest., 1994, 93, 397-404; Wells y col., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., 1992, 263, F459-465).

En estudios de SGLT2 humano inyectado en oocitos de xenopus se demostró que esta proteína participa en el transporte dependiente de sodio de D-glucosa y alfa-metil-D-glucopiranósido (alfa-MeGlc; un análogo de la glucosa) con un valor de Km de 1.6 mM para alfa-MeGlc y una proporción de acoplamiento entre sodio y glucosa de 1:1 (Kanai y col., J. Clin. Invest., 1994, 93, 397-404; You y col., J. Biol. Chem., 1995, 270, 29365-29371). Esta actividad de transporte fue suprimida por floricina, un glicósido vegetal que se une al sitio de la glucosa de los SGLT, pero no es transportado y, por tanto, inhibe la acción de SGLT (You y col., J. Biol. Chem., 1995, 270, 29365-29371).

La diabetes es un trastorno que se caracteriza por hiperglucemia debido a una deficiente acción de la insulina. La hiperglucemia crónica es un factor de riesgo importante de complicaciones asociadas con la diabetes, incluidas cardiopatía, retinopatía, nefropatía y neuropatía. Dado que los riñones desempeñan un papel fundamental en la regulación de los niveles de glucosa en plasma, los transportadores de glucosa renal se están convirtiendo en atractivas dianas farmacológicas (Wright, Am. J. Physiol. Renal Physiol., 2001, 280, F10-18). La nefropatía diabética es la causa más frecuente de la nefropatía terminal que se desarrolla en muchos pacientes con diabetes. La glucotoxicidad, que es el resultado de la hiperglucemia a largo plazo, induce la resistencia a la insulina dependiente de tejido en pacientes diabéticos (Nawano y col., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., 2000, 278, E535543).

Definiciones

“Transportador 2 de glucosa dependiente de sodio” es el producto génico o proteína cuya expresión se va a modular mediante la administración de un compuesto antisentido corto. En general, el transportador 2 de glucosa dependiente de sodio se denomina SGLT2, pero también puede denominarse SLC5A2; transportador 2 de sodioglucosa; cotransportador de sodio-glucosa, renal de baja afinidad; cotransportador de sodio-glucosa, renal; familia 5 transportadora de solutos (cotransportador de sodio/glucosa), miembro 2; SL52.

“Ácido nucleico de SGLT2 ” significa cualquier ácido nucleico que codifica el SGLT2. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un ácido nucleico de SGLT2 incluye, sin limitaciones, una secuencia de ADN que codifica SGLT2, una secuencia de ARN transcrita a partir de ADN que codifica SGLT2, y una secuencia de ARNm que codifica el SGLT2. “ARNm de SGLT2” significa un ARNm que codifica una proteína SGLT2.

Indicaciones terapéuticas

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos se usan para modular la expresión de SGLT-2 y proteínas relacionadas. En ciertas realizaciones, dicha modulación se consigue proporcionando compuestos antisentido cortos que hibridan con una o más moléculas de ácido nucleico diana que codifican SGLT-2, incluidos, entre otros, SGLT2, SL52, SLCSA2, cotransportador de sodio-glucosa, cotransportador de sodio-glucosa renal de baja afinidad, cotransportador 2 de sodio-glucosa y miembro co transportador 2 de sodio/glucosa de la familia 5 de transportadores de solutos. También se divulgan procedimientos de tratamiento de enfermedades y trastornos metabólicos y/o cardiovasculares tal como se describe en el presente documento. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos que inhiben la expresión de SGLT2 se usan en procedimientos de reducción de los niveles de glucosa en sangre en un animal y procedimientos de retraso o prevención del inicio de la diabetes de tipo

2. Dichos procedimientos comprenden administrar una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más de los compuestos de la divulgación al animal que pueda necesitar el tratamiento. El uno o más de los compuestos puede ser un compuesto antisentido corto dirigido a un ácido nucleico que codifica el SGLT2. En el presente documento se divulgan procedimientos de potenciar la inhibición de la expresión de SGLT2 en células renales o tejidos renales, que comprende poner en contacto las células o tejidos con uno o más de los compuestos de la divulgación, tal como compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico que codifica el SGLT2.

Aunque se han descrito ciertos compuestos, composiciones y procedimientos con especificidad de acuerdo con ciertas realizaciones, los ejemplos siguientes sólo sirven para ilustrar los compuestos de lo divulgado y no se pretende que limiten la misma.

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos son compuestos oligoméricos quiméricos que tienen esqueletos mixtos de fosforotioato y fosfodiéster. Ciertos compuestos antisentido cortos de esqueleto mixto tienen un hueco central que comprende al menos 5 nucleósidos 2’-desoxi contiguos flanqueados por dos alas, cada una de los cuales comprende al menos un 2’-O-metoxietil nucleósido. En ciertas realizaciones, los enlaces internucleosídicos de los compuestos de esqueleto mixto son enlaces fosforotioato en el hueco y enlaces fosfodiéster en las dos alas. En ciertas realizaciones, los compuestos de esqueleto mixto tienen enlaces fosforotioato en las alas, a excepción de un enlace fosfodiéster en uno o ambos extremos 5’ y 3’ del oligonucleótido. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a SGLT2 tienen un motivo (ala-hueco desoxiala) seleccionado de 3-10-3, 2-10-3, 2-10-2, 1-10-1,1-10-2, 2-8-2, 1-9-2, 1-8-1, 3-6-3 o 1-6-1. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a SGLT2 tienen un motivo (ala-hueco desoxi-ala) seleccionado de 1-10-1, 1-10-2, 2-8-2, 1-9-2, 1-8-1, 3-6-3 o 1-6-1.

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de SGLT2 y que tienen un esqueletos mixto se liberan eficientemente en el riñón. En ciertas realizaciones, la administración de los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de SGLT2 y que tienen un esqueleto mixto tiene como resultado la modulación de la expresión del gen diana en el riñón. En ciertas de dichas realizaciones, hay poca o ninguna toxicidad renal. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de SGLT2 y que tienen un esqueleto mixto son más potentes en la reducción del ARNm de SGLT-2 y tienen un inicio más rápido en comparación con un compuesto antisentido corto que no tenga un esqueleto mixto pero que, por lo demás, sea idéntico. En ciertas de dichas realizaciones, dicho incremento de la potencia y/o menor toxicidad es en ratón y/o rata. En ciertas de dichas realizaciones, dicho incremento de la potencia y/o menor toxicidad es en un ser humano.

A modo de ejemplo, y sólo con fines ilustrativos, el ISIS 145733, que comprende enlaces fosforotioato uniformes, e ISIS 257016, que comprende enlace fosfodiéster en las alas y enlaces fosforotioato en el hueco son, por lo demás, idénticos. Ambos comprenden la secuencia GAAGTAGCCACCAACTGTGC (SEC ID Nº 1572). Ambos oligonucleótidos comprenden además un hueco que consiste en diez 2’-desoxinucleótidos, flanqueado por cada lado por nucleótidos 2’-metoxietil (2’-MOE) de cinco nucleótidos. Todos los residuos de citidina son 5-metilcitidinas. El compuesto de esqueleto mixto ISIS 257016 era aproximadamente 50 veces más potente en la reducción del ARNm de SGLT-2 en comparación con el compuesto parental no mixto, ISIS 145733 (véase el EJEMPLO 3)

Los estudios farmacocinéticos de cierto compuesto de esqueleto mixto ISIS 257016 indican que, en ciertas realizaciones, el compuesto actúa como profármaco que es metabolizado a un farmacóforo de 12 bases nucleotídicas. Los estudios con ISIS 370717, un compuesto antisentido corto de 12 bases nucleotídicas correspondiente al ISIS 257016, muestran que el compuesto tiene un perfil farmacológico similar al ISIS 257016, pero con un inicio de acción más rápido. El ISIS 370717 es un oligonucleótido antisentido de 12 bases nucleotídicas dirigido a SGLT-2, que comprende la secuencia TAGCCACCAACT (SEC ID Nº 1554), que además comprende un hueco que consta de diez 2'-desoxinucleótidos, flanqueados en ambos extremos por alas de un nucleótido. Las alas están compuestas por nucleótidos 2’-metoxietilo (2’-MOE). Todos los residuos de citidina son 5-metilcitidinas. Los enlaces internucleosídicos son fosforotioato (P=S) a lo largo del oligonucleótido. La similitud de la actividad farmacológica de ISIS 257016 e ISIS 370717 avala los estudios farmacocinéticos que indican que ISIS 257016 era un profármaco que tiene un farmacóforo de 12 nucleótidos (véase el EJEMPLO 4). Además, estudios con versiones estabilizadas (con caperuzas en los extremos) de ISIS 257016 muestran una espectacular pérdida de actividad.

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos que comprenden monómeros 2’ MOE en las alas se liberan de forma eficiente en el riñón y el tratamiento con dichos compuestos tiene como resultado una modulación eficiente de la expresión de un gen diana en el riñón sin toxicidad hepática o renal. En el presente documento, también se muestra que, en ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos son más potentes en la reducción del ARNm de SGLT-2 y tienen un inicio más rápido en comparación con los oligonucleótidos parentales dirigidos a ARNm de SGLT-2 en ratón y rata. En el presente documento se muestra shortmeros 2’MOE en el hueco para mejorar la potencia y la biodisponibilidad por encima de los compuestos parentales.

A modo de ejemplo, y sólo con fines ilustrativos, los estudios con ISIS 370717 revelan una acumulación significativamente mayor del compuesto antisentido corto en el tejido renal (aproximadamente 500 microgramos por gramo de tejido) en comparación con el padre más largo. Además, el ARNm de SGLT-2 se redujo en más del 80% sobre los controles (véase el EJEMPLO 5). El gápmero 1-10-1 ISIS 370717 se usó como molde para elaborar oligos relacionados con la secuencia con diversos motivos. Los estudios en los que se evalúan las variaciones en el ala, el hueco y la longitud total alrededor del oligonucleótido de 12 unidades ISIS 370717 se pueden ver en el EJEMPLO

6. Ciertos motivos evaluados incluyó 1-10-1, 2-8-2, 1-8-1, 3-6-3, y 1-6-1 (véase la Tabla 4 en el EJEMPLO 6). Los compuestos se analizaron según su efecto sobre los niveles de RNM de SGLT2. Todos los motivos inhibían la expresión de SGLT2 in vivo de un modo dependiente de la dosis. Se descubrió que los gápmeros 1-10-1, 2-8-2 y 18-1 eran particularmente potentes. El ARNm de SGLT-2 se redujo en más del 80% sobre los controles usando estos motivos.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de SGLT2 y que tienen un motivo seleccionado de: gápmero 1-10-1 y 1-10-2 MOE. (Véase la Tabla 6 en el EJEMPLO 7). Ciertos de dichos compuestos se analizaron según su efecto sobre los niveles de ARNm de SGLT2 en rata. Los resultados de la Tabla 7 ilustran que los gápmeros 1-10-1 y 1-10-2 MOE inhiben la expresión de SGLT2 in vivo de un modo dependiente de la dosis y se pudo alcanzar una reducción de más del 80% de ARNm de SGLT-2.

Ciertos gápmeros 1-10-1 and 2-8-2 MOE adicionales se evaluaron en modelos in vivo de ratón y de rata (véase, por ejemplo, el EJEMPLO 8 y 9). Con muchos de los gápmeros 1-10-1 y 2-8-2 MOE se consiguió una reducción mayor del 80% del ARNm de SGLT-2 a concentraciones de oligos relativamente bajas y en ausencia de efectos tóxicos.

En otro ejemplo no limitante, también se analizó el efecto de ISIS 388625 sobre los niveles de ARNm de SGLT2 en perros. Los estudios en perros ilustran que se puede conseguir una inhibición superior al 80% de la expresión de SGLT2 a una dosis de 1 mg/kg/semana. Se puede conseguir una inhibición todavía mayor a dosis ligeramente mayores. También se mostró que la administración de ISIS 388625 mejoraba la tolerancia a la glucosa. Los niveles máximos de glucosa en plasma disminuyeron en más del 50% de media y el posterior descenso de la glucosa se redujo en comparación con los controles salinos en una prueba convencional de tolerancia a la glucosa (véase el EJEMPLO 11). Asimismo, en un modelo de diabetes en ratas, se demostró que los compuestos antisentido cortos disminuían significativamente los niveles plasmáticos de glucosa y de HbA1C en el tiempo, en comparación con animales tratados con PBS y con control (véase el Ejemplo 10).

En los animales de todos los estudios se evaluó también la toxicidad. Por ejemplo, se evaluaron el peso corporal total, el peso del hígado, bazo y riñón. Cambios significativos en el peso del hígado, del bazo o corporal pueden indicar que un compuesto concreto produce efectos tóxicos. Se encontró que todos los cambios estaban dentro del margen de error. No se observaron cambios significativos en el peso corporal durante el tratamiento o al final del estudio. Tampoco se observaron cambios significativos en el peso del hígado ni del bazo.

Ciertos compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de SGLT2

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos están dirigidos a un ácido nucleico de SGLT2 que tiene la secuencia de número de registro en GENBANK® NM_003041.1, incorporada en el presente documento como SEC ID Nº 2. En ciertas de dichas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a la SEC ID Nº 3 es al menos un 90% complementario a la SEC ID Nº 3. En ciertas de dichas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a la SEC ID Nº 3 es al menos un 95% complementario a la SEC ID Nº 3. En ciertas de dichas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a la SEC ID Nº 3 ES 100% complementario a la SEC ID Nº 1. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a la SEC ID Nº 3 comprende una secuencia nucleotídica seleccionada de las secuencias nucleotídicas indicadas en las Tablas 1 y 2.

La secuencia nucleotídica indicada en cada SEC ID Nº en las Tablas 1 y 2 es independiente de cualquier modificación de un resto azúcar, un enlace monomérico o una base nucleotídica. Como tales, los compuestos antisentido cortos definidos por una SEC ID Nº pueden comprender, de forma independiente, una o más modificaciones en un resto azúcar, un enlace internucleosídico o una base nucleotídica. Los compuestos antisentido descritos por el Número Isis (Nº Isis) indican una combinación de secuencia de bases nucleotídicas y una o más modificaciones en un resto azúcar, un enlace internucleosídico o una base nucleotídica.

Las Tablas 1 y 2 ilustran ejemplos de compuestos antisentido cortos dirigidos a la SEC ID Nº 3. La Tabla 1 ilustra compuestos antisentido cortos que son 100% complementarios a la SEC ID Nº 3. La Tabla 2 ilustra compuestos antisentido cortos que tienen uno o dos apareamientos erróneos con respecto a la SEC ID Nº 3. La columna denominada "motivo gápmero" indica el motivo ala-hueco-ala de cada compuesto antisentido corto. El segmento hueco comprende 2'-desoxinucleótidos y cada nucleótido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado en 2'. El azúcar modificado en 2' concreto también está indicado en la columna “motivo gápmero”. Por ejemplo, ‘2-10-2 MOE’ significa un motivo gápmero 2-10-2, en el que un segmento de hueco de diez 2’desoxinucleótidos está flanqueado por segmentos ala de dos nucleótidos, en los que los nucleótidos de los segmentos ala son nucleótidos 2’-MOE. Los enlaces internucleosídicos son fosforotioato. Los compuestos antisentido cortos comprenden 5-metil-citidina en lugar de citosina no modificada, a menos que “citosina no modificada” esté en la lista en la columna del motivo gápmero, en cuyo caso las citosinas indicadas son citosinas no modificadas. Por ejemplo, “5-mC sólo en hueco” indica que el segmento de hueco tiene 5-metilcitosinas, mientras que los segmentos ala tienen citosinas no modificadas.

Tabla 1. Compuestos antisentido cortos dirigidos a la SEC ID Nº 3

Nº ISIS

Sitio diana en 5’ Sitio diana en 3’ Secuencia (5’-3’) Motivo gápmero SEC ID Nº

379684

84 95 TGTCAGCAGGAT 1-10-1 MOE 214

405193

113 124 CAGCAGGAAATA 2-8-2 MOE 215

405194

114 125 CCAGCAGGAAAT 2-8-2 MOE 216

405195

115 126 ACCAGCAGGAAA 2-8-2 MOE 217

405196

116 127 GACCAGCAGGAA 2-8-2 MOE 218

405197

117 128 TGACCAGCAGGA 2-8-2 MOE 219

379685

117 128 TGACCAGCAGGA 1-10-1 MOE 219

405198

118 129 ATGACCAGCAGG 2-8-2 MOE 221

405199

119 130 AATGACCAGCAG 2-8-2 MOE 222

405200

120 131 CAATGACCAGCA 2-8-2 MOE 223

405201

121 132 CCAATGACCAGC 2-8-2 MOE 224

379686

135 146 ACCACAAGCCAA 1-10-1 MOE 225

379711

172 183 TAGCCGCCCACA 1-10-1 MOE 226

388628

172 183 TAGCCGCCCACA 2-8-2 MOE 226

405202

207 218 CCGGCCACCACA 2-8-2 MOE 228

405203

208 219 ACCGGCCACCAC 2-8-2 MOE 229

405204

236 247 GATGTTGCTGGC 2-8-2 MOE 230

379687

236 247 GATGTTGCTGGC 1-10-1 MOE 230

405205

237 248 CGATGTTGCTGG 2-8-2 MOE 232

405206

238 249 CCGATGTTGCTG 2-8-2 MOE 233

405207

239 250 GCCGATGTTGCT 2-8-2 MOE 234

405208

240 251 TGCCGATGTTGC 2-8-2 MOE 235

405209

241 252 CTGCCGATGTTG 2-8-2 MOE 236

405210

260 271 CAGGCCCACAAA 2-8-2 MOE 237

405211

261 272 CCAGGCCCACAA 2-8-2 MOE 238

405212

262 273 GCCAGGCCCACA 2-8-2 MOE 239

379688

288 299 CCAAGCCACTTG 1-10-1 MOE 240

379689

318 329 AGAGCGCATTCC 1-10-1 MOE 241

379690

435 446 ACAGGTAGAGGC 1-10-1 MOE 242

405248

474 485 AGATCTTGGTGA 2-8-2 MOE 243

379691

474 485 AGATCTTGGTGA 1-10-1 MOE 243

382676

527 539 TGTTCCAGCCCAG 1-10-2 MOE 245

(continuación) (continuación)

Nº ISIS

Sitio diana en 5’ Sitio diana en 3’ Secuencia (5’-3’) Motivo gápmero SEC ID Nº

388625

528 539 TGTTCCAGCCCA 2-8-2 MOE 246

389780

528 539 TGTTCCAGCCCA 1-9-2 MOE 246

379692

528 539 TGTTCCAGCCCA 1-10-1 MOE 246

392170

528 539 TGTTCCAGCCCA 1-10-1 Metilenoxi BNA 246

392173

528 539 TGTTCCAGCCCA 2-8-2 Metilenoxi BNA 246

405213

529 540 ATGTTCCAGCCC 2-8-2 MOE 251

405214

564 575 TGGTGATGCCCA 2-8-2 MOE 252

405215

565 576 ATGGTGATGCCC 2-8-2 MOE 253

405216

566 577 CATGGTGATGCC 2-8-2 MOE 254

379693

566 577 CATGGTGATGCC 1-10-1 MOE 254

405217

567 578 TCATGGTGATGC 2-8-2 MOE 256

405218

568 579 ATCATGGTGATG 2-8-2 MOE 257

405219

587 598 CCCTCCTGTCAC 2-8-2 MOE 258

405220

588 599 GCCCTCCTGTCA 2-8-2 MOE 259

405221

589 600 AGCCCTCCTGTC 2-8-2 MOE 260

405222

590 601 CAGCCCTCCTGT 2-8-2 MOE 261

405223

591 602 CCAGCCCTCCTG 2-8-2 MOE 262

405224

592 603 GCCAGCCCTCCT 2-8-2 MOE 263

379694

629 640 GACGAAGGTCTG 1-10-1 MOE 264

405225

707 718 GTATTTGTCGAA 2-8-2 MOE 265

379695

737 748 GGACACCGTCAG 1-10-1 MOE 266

379696

974 985 CAGCTTCAGGTA 1-10-1 MOE 267

405226

998 1009 CATGACCATGAG 2-8-2 MOE 268

405227

999 1010 GCATGACCATGA 2-8-2 MOE 269

405228

1000 1011 GGCATGACCATG 2-8-2 MOE 270

405229

1001 1012 TGGCATGACCAT 2-8-2 MOE 271

405230

1002 1013 CTGGCATGACCA 2-8-2 MOE 272

379697

1002 1013 CTGGCATGACCA 1-10-1 MOE 272

405231

1003 1014 CCTGGCATGACC 2-8-2 MOE 274

379698

1091 1102 GCAGCCCACCTC 1-10-1 MOE 275

405232

1092 1103 AGCAGCCCACCT 2-8-2 MOE 276

405233

1093 1104 GAGCAGCCCACC 2-8-2 MOE 277

405234

1130 1141 CATGAGCTTCAC 2-8-2 MOE 278

Nº ISIS

Sitio diana en 5’ Sitio diana en 3’ Secuencia (5’-3’) Motivo gápmero SEC ID Nº

405235

1131 1142 GCATGAGCTTCA 2-8-2 MOE 279

382677

1131 1143 GGCATGAGCTTCA 1-10-2 MOE 280

388626

1132 1143 GGCATGAGCTTC 2-8-2 MOE 281

379699

1132 1143 GGCATGAGCTTC 1-10-1 MOE 281

405236

1133 1144 GGGCATGAGCTT 2-8-2 MOE 283

405237

1157 1168 CAGCATGAGTCC 2-8-2 MOE 284

405238

1158 1169 CCAGCATGAGTC 2-8-2 MOE 285

379700

1158 1169 CCAGCATGAGTC 1-10-1 MOE 285

405239

1159 1170 GCCAGCATGAGT 2-8-2 MOE 287

379701

1230 1241 CCATGGTGAAGA 1-10-1 MOE 288

405240

1542 1553 CACAGCTGCCCG 2-8-2 MOE 289

405241

1543 1554 ACACAGCTGCCC 2-8-2 MOE 290

405242

1544 1555 CACACAGCTGCC 2-8-2 MOE 291

382678

1544 1556 GCACACAGCTGCC 1-10-2 MOE 292

388627

1545 1556 GCACACAGCTGC 2-8-2 MOE 293

379702

1545 1556 GCACACAGCTGC 1-10-1 MOE 293

379703

1701 1712 GCCGGAGACTGA 1-10-1 MOE 295

405243

1976 1987 ATTGAGGTTGAC 2-8-2 MOE 296

405244

1977 1988 CATTGAGGTTGA 2-8-2 MOE 297

405245

1978 1989 GCATTGAGGTTG 2-8-2 MOE 298

405246

1979 1990 GGCATTGAGGTT 2-8-2 MOE 299

405247

1980 1991 GGGCATTGAGGT 2-8-2 MOE 300

Tabla 2: Compuestos antisentido cortos dirigidos a la SEC ID Nº 3 y que tienen 1 o 2 apareamientos erróneos

Nº ISIS

Sitio diana en 5’ Sitio diana en 3’ Secuencia (5’-3’) Motivo gápmero SEC ID Nº

405200

96 107 CAATGACCAGCA 2-8-2 MOE 223

405215

382 393 ATGGTGATGCCC 2-8-2 MOE 253

405216

383 394 CATGGTGATGCC 2-8-2 MOE 254

379693

383 394 CATGGTGATGCC 1-10-1 MOE 254

379701

471 482 CCATGGTGAAGA 1-10-1 MOE 288

405218

472 483 ATCATGGTGATG 2-8-2 MOE 257

405246

536 547 GGCATTGAGGTT 2-8-2 MOE 299

imagen2

En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 85-184 de la SEC ID Nº 3. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 85-184 de la SEC ID Nº 3. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 85-184 comprende una secuencia de nucleótidos

5 seleccionada de las SEC ID Nº 214, 215, 216, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 224, 225 o 227. En ciertas de dichas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 85-184 de la SEC ID Nº 3 se selecciona de los Nº Isis 379684, 405193, 405194, 405195, 405196, 405197, 379685, 405198, 405199, 405200 o 405201, 379686, 379711 o 388628.

En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 113-132 de la SEC ID Nº 3. En ciertas realizaciones,

10 un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 113-132 de la SEC ID Nº 3. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 113-132 comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de las SEC ID Nº 215, 216, 217, 218, 219, 221, 222, 223 o 224. En ciertas de dichas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 113-132 de la SEC ID Nº 3 se selecciona de los Nº Isis

405193, 405194, 405195, 405196, 405197, 379685, 405198, 405199, 405200 o 405201.

En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 207-329 de la SEC ID Nº 3. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 207-329 de la SEC ID Nº 3. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 207-329 comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de las SEC ID Nº 228, 229, 230, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240 o 241. En ciertas de dichas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 207-329 de la SEC ID Nº 3 se selecciona de los Nº Isis 405202, 405203, 405204, 379687, 405205, 405206, 405207, 405208, 405209, 405210, 405211, 405212, 379688 o 379689.

En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 207-273 de la SEC ID Nº 3. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 207-273 de la SEC ID Nº 3. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 207-273 comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de las SEC ID Nº 228, 229, 230, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238 o 239. En ciertas de dichas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 207-273 de la SEC ID Nº 3 se selecciona de los Nº Isis 405202, 405203, 405204, 379687, 405205, 405206, 405207, 405208, 405209, 405210, 405211 o 405212.

En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 207-219 de la SEC ID Nº 3. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 207-219 de la SEC ID Nº 3. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 207-219 comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de las SEC ID Nº 228 o 229. En ciertas de dichas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 207-219 de la SEC ID Nº 3 se selecciona de los Nº Isis 405202 o 405203.

En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 236-252 de la SEC ID Nº 3. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 236-252 de la SEC ID Nº 3. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 236-252 comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de las SEC ID Nº 230, 232, 233, 234, 235 o 236. En ciertas de dichas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 236-252 de la SEC ID Nº 3 se selecciona de los Nº Isis 405204, 379687, 405205, 405206, 405207, 405208 o 405209.

En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 260-273 de la SEC ID Nº 3. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 260-273 de la SEC ID Nº 3. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 260-273 comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de las SEC ID Nº 237, 238 o 239. En ciertas de dichas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 260-273 de la SEC ID Nº 3 se selecciona de los Nº Isis 405210, 405211 o 405212.

En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 435-640 de la SEC ID Nº 3. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 435-640 de la SEC ID Nº 3. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 435-640 comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de las SEC ID Nº 242, 243, 245, 246, 251, 252, 253, 254, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263 o

264. En ciertas de dichas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 435-640 de la SEC ID Nº 3 se selecciona de los Nº Isis 379690, 405248, 379691, 389780, 379692, 382676, 388625, 392170, 392173, 405213, 405214, 405215, 405216, 379693, 405217, 405218, 405219, 405220, 405221, 405222, 405223, 405224 o 379694.

En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 527-540 de la SEC ID Nº 3. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 527-540 de la SEC ID Nº 3. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 527-540 comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de las SEC ID Nº 245, 246 o 251. En ciertas de dichas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 527-540 de la SEC ID Nº 3 se selecciona de los Nº Isis 389780, 379692, 382676, 388626, 392170, 392173 o 405213.

En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 564-603 de la SEC ID Nº 3. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 564-603 de la SEC ID Nº 3. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 564-603 comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de las SEC ID Nº 252, 253, 254, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262 o 263. En ciertas de dichas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 564-603 de la SEC ID Nº 3 se selecciona de los Nº Isis 405214, 405215, 405216, 379693, 405217, 405218, 405219, 405220, 405221, 405222, 405223 o 405224.

En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 564-579 de la SEC ID Nº 3. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 564-579 de la SEC ID Nº 3. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 564-579 comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de las SEC ID Nº 252, 253, 254, 256 o 257. En ciertas de dichas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 564-579 de la SEC ID Nº 3 se selecciona de los Nº Isis 405214, 405215, 405216, 379693, 405217 o 405218.

En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 587-603 de la SEC ID Nº 3. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 587-603 de la SEC ID Nº 3. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 587-603 comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de las SEC ID Nº 258, 259, 260, 261, 262 o 263. En ciertas de dichas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 587-603 de la SEC ID Nº 3 se selecciona de los Nº Isis 405219, 405220, 405221, 405222, 405223 o 405224.

En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 974-1014 de la SEC ID Nº 3. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 974-1014 de la SEC ID Nº 3. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 974-1014 comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de las SEC ID Nº 267, 268, 269, 270, 271, 272 o 274. En ciertas de dichas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 974-1014 de la SEC ID Nº 3 se selecciona de los Nº Isis 379696, 405226, 405227, 405228, 405229, 405230, 379697 o 405231.

En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 998-1014 de la SEC ID Nº 3. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 998-1014 de la SEC ID Nº 3. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 998-1014 comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de las SEC ID Nº 268, 269, 270, 271, 272 o 274. En ciertas de dichas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 998-1014 de la SEC ID Nº 3 se selecciona de los Nº Isis 405226, 405227, 405228, 405229, 405230, 379697 o 405231.

En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 1091-1170 de la SEC ID Nº 3. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 1091-1170 de la SEC ID Nº 3. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 1091-1170 comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de las SEC ID Nº 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 283, 284, 285, 286 o 287. En ciertas de dichas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 1091-1170 de la SEC ID Nº 3 se selecciona de los Nº Isis 379698, 405232, 405233, 405234, 405235, 388626, 379699, 382677, 405236, 405237, 405238, 379700, o 405239.

En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 1091-1104 de la SEC ID Nº 3. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 1091-1104 de la SEC ID Nº 3. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 1091-1104 comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de las SEC ID Nº 275, 276 o 277. En ciertas de dichas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 1091-1104 de la SEC ID Nº 3 se selecciona de los Nº Isis 379698, 405232 o 405233.

En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 1130-1144 de la SEC ID Nº 3. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 1130-1144 de la SEC ID Nº 3. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 1130-1144 comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de las SEC ID Nº 278, 279, 280, 281 o 283. En ciertas de dichas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 1130-1144 de la SEC ID Nº 3 se selecciona de los Nº Isis 405234, 405235, 388626, 379699, 382677 o 405236.

En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 1157-1170 de la SEC ID Nº 3. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 1157-1170 de la SEC ID Nº 3. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 1157-1170 comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de las SEC ID Nº 284, 285 o 287. En ciertas de dichas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 1157-1170 de la SEC ID Nº 3 se selecciona de los Nº Isis 405237, 405238, 379700 o 405239.

En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 1542-1556 de la SEC ID Nº 3. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 1542-1556 de la SEC ID Nº 3. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 1542-1556 comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de las SEC ID Nº 289, 290, 291, 292 o 293. En ciertas de dichas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 1542-1556 de la SEC ID Nº 3 se selecciona de los Nº Isis 405240, 405241, 405242, 388629, 379702 o 382678.

En ciertas realizaciones, una región diana es los nucleótidos 1976-1991 de la SEC ID Nº 3. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 1976-1991 de la SEC ID Nº 3. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 1976-1991 comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de las SEC ID Nº 296, 297, 298, 299 o 300. En ciertas de dichas realizaciones, un compuesto antisentido corto dirigido a los nucleótidos 1976-1991 de la SEC ID Nº 3 se selecciona de los Nº Isis 405243, 405244, 405245, 405246 o 405247.

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de SGLT2 tienen una longitud de 8 a 16, preferentemente de 9 a 15, más preferentemente de 9 a 14, más preferentemente de 10 a 14 nucleótidos de longitud. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de SGLT2 tienen una longitud de 9 a 14 nucleótidos. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de SGLT2 tienen una longitud de 10 a 14 nucleótidos. En ciertas realizaciones, dichos compuestos antisentido cortos son oligonucleotídicos antisentido cortos.

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de SGLT2 son gápmeros cortos. En ciertas de dichas realizaciones, los gápmeros cortos dirigidos a un ácido nucleico de SGLT2 comprenden al menos una modificación de alta afinidad en una o más alas del compuesto. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de comprenden de 1 a 3 modificaciones de alta afinidad en cada ala. En ciertas de dichas realizaciones, los nucleósidos o nucleótidos del ala comprenden una modificación en 2’. En ciertas realizaciones, los monómeros del ala son BNA. En ciertas de dichas realizaciones, los monómeros del ala se seleccionan de α-L-metilenoxi (4’-CH2-O-2’) BNA, ß-D-metilenoxi(4’-CH2-O-2’) BNA, etilenoxi (4’-(CH2)2-O-2’)BNA, aminooxi(4’-CH2-O-N(R)-2’) BNA y oxiamino (4’-CH2-N(R)-O-2’) BNA. En ciertas realizaciones, los monómeros de un ala comprenden un sustituyente en la posición 2’ seleccionado de alilo, amino, azido, tio, Oalilo, O-alquilo C1-C10, -OCF3 , O-(CH2)2-O-CH3, 2’-O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), y O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), en las que cada Rm y Rn es, de forma independiente, H o alquilo C1-C10 sustituido o insustituido.

En ciertas realizaciones, los monómeros de un ala son nucleótidos 2’MOE.

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de SGLT2 comprenden un hueco entre el ala en 5’ y el ala en 3’. En ciertas realizaciones, el hueco comprende cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece o catorce monómeros. En ciertas realizaciones, los monómeros del hueco son desoxirribonucleótidos no modificados. En ciertas realizaciones, los monómeros del hueco son ribonucleótidos no modificados. En ciertas realizaciones, las modificaciones del hueco (si las hubiera) tienen como resultado un compuesto antisentido que, cuando se une a su ácido nucleico diana, soporta la escisión por una RNasa, incluida, entre otras, la RNasa H.

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de SGLT2 tienen enlaces monoméricos. En ciertas de dichas realizaciones, dichos enlaces son todos enlaces fosforotioato. En ciertas realizaciones, los enlaces son todos enlaces fosfodiéster. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de tienen esqueletos mixtos.

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de SGLT2 tienen una longitud de 8 monómeros. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de SGLT2 tienen una longitud de 9 monómeros. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de SGLT2 tienen una longitud de 10 monómeros. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de SGLT2 tienen una longitud de 11 monómeros. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de SGLT2 tienen una longitud de monómeros. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de SGLT2 tienen una longitud de 13 monómeros. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de SGLT2 tienen una longitud de 14 monómeros. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de SGLT2 tienen una longitud de 15 monómeros. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de SGLT2 tienen una longitud de 16 monómeros. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de SGLT2 comprenden de 9 a 15 monómeros. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de SGLT2 comprenden de 10 a 15 monómeros. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de SGLT2 comprenden de 12 a 14 monómeros. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de SGLT2 comprenden de 12 a 14 nucleótidos o nucleósidos.

En ciertas realizaciones, en el presente documento se divulgan procedimientos de modulación de la expresión de SGLT2. En ciertas realizaciones, dichos procedimientos comprenden el uso de uno o más compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de SGLT2, en el que el compuesto antisentido corto dirigido a un ácido nucleico de SGLT2 tiene una longitud de aproximadamente 8 a aproximadamente 16, preferentemente de 9 a 15, más preferentemente de 9 a 14, más preferentemente de 10 a 14 monómeros (es decir, de aproximadamente 8 a aproximadamente 16 monómeros unidos). Un experto en la técnica apreciará que esto comprende procedimientos de modulación de la expresión de ApoB usando uno o más compuestos antisentido cortos dirigidos a un ácido nucleico de SGLT2 de de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 monómeros.

En ciertas realizaciones, los procedimientos de modulación de SGLT2 comprenden el uso de un compuesto antisentido corto dirigido a un ácido nucleico de SGLT2 que tiene una longitud de 8 monómeros. En ciertas realizaciones, los procedimientos de modulación de SGLT2 comprenden el uso de un compuesto antisentido corto dirigido a un ácido nucleico de SGLT2 que tiene una longitud de 9 monómeros. En ciertas realizaciones, los procedimientos de modulación de SGLT2 comprenden el uso de un compuesto antisentido corto dirigido a un ácido nucleico de SGLT2 que tiene una longitud de 10 monómeros. En ciertas realizaciones, los procedimientos de modulación de SGLT2 comprenden el uso de un compuesto antisentido corto dirigido a un ácido nucleico de SGLT2 que tiene una longitud de 11 monómeros. En ciertas realizaciones, los procedimientos de modulación de SGLT2 comprenden el uso de un compuesto antisentido corto dirigido a un ácido nucleico de SGLT2 que tiene una longitud de 12 monómeros. En ciertas realizaciones, los procedimientos de modulación de SGLT2 comprenden el uso de un compuesto antisentido corto dirigido a un ácido nucleico de SGLT2 que tiene una longitud de 13 monómeros. En ciertas realizaciones, los procedimientos de modulación de SGLT2 comprenden el uso de un compuesto antisentido corto dirigido a un ácido nucleico de SGLT2 que tiene una longitud de 14 monómeros. En ciertas realizaciones, los procedimientos de modulación de SGLT2 comprenden el uso de un compuesto antisentido corto dirigido a un ácido nucleico de SGLT2 que tiene una longitud de 15 monómeros. En ciertas realizaciones, los procedimientos de modulación de SGLT2 comprenden el uso de un compuesto antisentido corto dirigido a un ácido nucleico de SGLT2 que tiene una longitud de 16 monómeros.

En ciertas realizaciones, los procedimientos de modulación de la expresión de SGLT2 comprenden el uso de un compuesto antisentido corto dirigido a un ácido nucleico de SGLT2 que comprende de 9 a 15 monómeros. En ciertas realizaciones, los procedimientos de modulación de la expresión de SGLT2 comprenden el uso de un compuesto antisentido corto dirigido a un ácido nucleico de SGLT2 que comprende de 10 a 15 monómeros. En ciertas realizaciones, los procedimientos de modulación de la expresión de SGLT2 comprenden el uso de un compuesto antisentido corto dirigido a un ácido nucleico de SGLT2 que comprende de 12 a 14 monómeros. En ciertas realizaciones, los procedimientos de modulación de la expresión de SGLT2 comprenden el uso de un compuesto antisentido corto dirigido a un ácido nucleico de SGLT2 que comprende de 12 o 14 nucleótidos o nucleósidos.

Sales, profármacos y bioequivalentes

Los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento comprenden cualquier sal, éster o sales de dichos ésteres farmacéuticamente aceptables, o cualquier otro equivalente funcional que, tras la administración a un animal, incluido un ser humano, puede proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biológicamente activo o un residuo del mismo. De acuerdo con esto, por ejemplo, la divulgación también se extiende a profármacos y sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos antisentido, sales farmacéuticamente aceptables de dichos profármacos, y otros bioequivalentes.

El término “profármaco” indica un agente terapéutico que se prepara en una forma inactiva o menos activa que se convierte en una forma activa (es decir, el fármaco) dentro del cuerpo o las células del mismo por acción de enzimas endógenas u otros productos químicos y/o condiciones. En particular, las versiones profármaco de los oligonucleótidos se preparan como derivados SATE ((S-actil-2-tioetil)fosfato de acuerdo con los procedimientos divulgados en el documento WO 93/24510 o el documento WO 94/26764. Los profármacos también pueden incluir compuestos antisentido en los que uno o ambos extremos comprenden bases nucleotídicas que se escinden (p. ej., incorporando enlaces fosfodiéster en el esqueleto en los extremos) para producir el compuesto activo. En ciertas realizaciones, uno o más restos que no son fármacos se escinden de un profármaco, dando la forma activa. En ciertas de dichas realizaciones, dichos restos que no son fármacos no son un nucleótido o un oligonucleótido.

La expresión “sales farmacéuticamente aceptables” se refiere a sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de los compuestos descritos en el presente documento. es decir, sales que conservan la actividad biológica deseada del compuesto parental y que no producen efectos toxicológicos indeseados en el mismo. Las sales de sodio de los oligonucleótidos antisentido son útiles y bien aceptadas para administración terapéutica a seres humanos.

En ciertas realizaciones, se proporcionan sales, incluidas, entre otras, las sales de ácidos nucleicos bicatenarios (incluidos, entre otros, compuestos de ARD bicatenario).

G. Ciertas composiciones farmacéuticas

En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden uno o más compuestos antisentido cortos y uno o más excipientes. En ciertas de dichas realizaciones, se seleccionan excipientes de agua, soluciones salinas, alcohol, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilasa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa y polivinilpirrolidona.

En ciertas realizaciones, se prepara una composición farmacéutica de la presente invención usando técnicas conocidas, incluidas, entre otras procedimientos mezclado, disolución, granulación, formación de pastillas,

trituración, emulsión, encapsulación, atrapamiento o de formación de comprimidos.

En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica de la presente invención es un líquido (p. ej., una suspensión, elixir y/o solución). En ciertas de dichas realizaciones, se prepara una composición farmacéutica líquida usando ingredientes conocidos en la técnica, incluidos, entre otros, agua, glicoles, aceites, alcoholes, agentes aromatizantes, conservantes y agentes colorantes.

En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica de la presente invención es un sólido (p. ej., un polco, comprimido y/o cápsula). En ciertas de dichas realizaciones, se prepara una composición farmacéutica sólida que comprende uno o más oligonucleótidos usando ingredientes conocidos en la técnica, incluidos, entre otros, almidones, azúcares, diluyentes, agentes de granulación, lubricantes, aglutinantes y agentes disgregantes.

En ciertas realizaciones, se formula una composición farmacéutica de la presente invención como una preparación depot. Ciertas preparaciones depot normalmente son de acción más prolongada que las preparaciones que no son depot. En ciertas realizaciones, dichas preparaciones se administran mediante implantación (por ejemplo subcutánea o intramuscular) o mediante inyección intramuscular. En ciertas realizaciones, las preparaciones depot se preparan usando materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o en forma de derivados escasamente solubles, por ejemplo en forma de una sal escasamente soluble.

En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica de la presente invención comprende un sistema de liberación. Ejemplos de sistemas de liberación incluyen, entre otros, liposomas y emulsiones. Ciertos sistemas de liberación son útiles para preparar ciertas composiciones farmacéuticas, incluidas las que comprenden compuestos hidrófobos. En ciertas realizaciones, se usan ciertos disolventes orgánicos, tales como dimetilsulfóxido.

En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica de la presente invención comprende una o más moléculas de liberación específicas de tejido diseñadas para liberar el uno o más agentes farmacéuticos de la presente invención en tejidos o tipos de células específicos. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas incluyen liposomas recubiertos con un anticuerpo específico de tejido.

En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica de la presente invención comprende un sistema de codisolvente. Ciertos de dichos sistemas de co-disolvente comprende, por ejemplo, alcohol bencílico, un tensioactivo apolar, un polímero orgánico miscible en agua y una fase acuosa. En ciertas realizaciones, dichos sistemas de codisolvente se usan para compuestos hidrófobos. Un ejemplo no limitante de dicho sistema de co-disolvente es el sistema de co-disolvente de VPD, que es una solución de etanol absoluto que comprende 3% p/v de alcohol bencílico, 8% p/v del tensioactivo apolar, polisorbato 80.TN y 65% p/v de polietilenglicol 300. Las proporciones de dichos sistemas de co-disolvente se pueden variar considerablemente sin alterar de forma significativa sus características de solubilidad y de toxicidad. Además, la identidad de los componentes del co-disolvente se puede variar: por ejemplo, se pueden usar otros tensioactivos en lugar de Polisorbato 80.TM; el tamaño de la fracción de polietilenglicol puede variarse; otros polímeros biocompatibles pueden sustituir al polietilenglicol, por ejemplo polivinilpirrolidona; y otros azúcares o polisacáridos pueden sustituir a la dextrosa.

En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica de la presente invención comprende un sistema de liberación sostenida. Un ejemplo no limitante de dicho sistema de liberación sostenida es una matriz semipermeable de polímeros hidrófobos sólidos. En ciertas realizaciones, los sistemas de liberación sostenida pueden, en función de su naturaleza química, liberar agentes farmacéuticos durante un periodo de horas, días, semanas o meses.

En ciertas realizaciones, se prepara una composición farmacéutica de la presente invención para administración oral. En ciertas de dichas realizaciones, se formula una composición farmacéutica combinando uno o más oligonucleótidos con uno o más transportadores farmacéuticamente aceptables. Ciertos de dichos transportadores permiten formular las composiciones farmacéuticas en forma de comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones espesas, suspensiones y similares, para ingestión por un sujeto. En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas para uso oral se obtienen mezclando oligonucleótidos y uno o más excipientes sólidos. Excipientes adecuados incluyen, entre otros, cargas, tales como azúcares, incluidas lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa, tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y/o polivinilpirrolidona (PVP). En ciertas realizaciones, dicha mezcla opcionalmente se tritura y opcionalmente se añaden adyuvantes. En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se forman para obtener comprimidos o núcleos de pastillas. En ciertas realizaciones se añaden agentes disgregantes (p. ej., polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal de los mismos, tal como alginato de sodio).

En ciertas realizaciones, los núcleos de pastillas se proporcionan con recubrimientos. En ciertas de dichas realizaciones se pueden usar soluciones de azúcar concentradas, que opcionalmente pueden comprender goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, soluciones de laca y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. A los recubrimientos de pastillas o comprimidos se pueden añadir colorantes o pigmentos.

En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas para administración oral son cápsulas duras hechas de gelatina. Ciertas de dichas cápsulas duras comprenden uno o más agentes farmacéuticos de la presente invención mezclados con una o más cargas, tales como lactosa, aglutinantes, tales como almidones y/o lubricantes, tales como talco o estearato de magnesio, y, opcionalmente estabilizantes. En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas para administración oral son cápsulas blandas selladas hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. En ciertas cápsulas blandas, uno o más agentes farmacéuticos de la presente invención se disuelven o suspenden en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicol líquido. Además, se pueden añadir estabilizantes.

En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se preparan para administración bucal. Ciertas de dichas composiciones farmacéuticas son comprimidos o píldoras formuladas de un modo convencional.

En ciertas realizaciones, se prepara una composición farmacéutica para administración mediante inyección (p. ej., intravenosa, subcutánea, intramuscular, etc.). En ciertas de dichas realizaciones, una composición farmacéutica comprende un transportador y se formula en solución acuosa, tal como agua o tampones fisiológicamente compatibles, tales como solución de Hank, solución de Ringer o solución salina tamponada fisiológicamente. En ciertas realizaciones se incluyen otros ingredientes (p. ej., ingredientes que ayudan a la solubilidad o sirven como conservantes). En ciertas realizaciones se preparan suspensiones inyectables usando transportadores líquidos adecuados, agentes de suspensión y similares. Ciertas composiciones farmacéuticas para inyección se presentan en forma de monodosis, por ejemplo en ampollas, o en envases con múltiples dosis. Ciertas composiciones farmacéuticas para inyección son suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Ciertos disolventes para uso en composiciones farmacéuticas para inyección incluyen, entre otros, disolventes lipófilos y aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo o triglicéridos, y liposomas. Las suspensiones inyectables acuosas pueden comprender sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa sódica, sorbitol, o dextrano. Opcionalmente, dichas suspensiones también pueden comprender estabilizantes o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de los agentes farmacéuticos para permitir la preparación de soluciones muy concentradas.

En ciertas realizaciones, se prepara una composición farmacéutica para administración transmucosa. En ciertas de dichas realizaciones se usan penetrantes adecuados para atravesar la barrera. Tales penetrantes se conocen generalmente en la técnica.

En ciertas realizaciones, se prepara una composición farmacéutica para administración por inhalación. Ciertas de dichas composiciones farmacéuticas se preparan en forma de un nebulizador de aerosol en un envase presurizado

o nebulizador. Ciertas de dichas composiciones farmacéuticas comprenden un propelente, por ejemplo diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En ciertas realizaciones usando un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula que libera una cantidad medida. En ciertas realizaciones se pueden formular cápsulas y cartuchos para usar en un inhalador o insuflador. Ciertas de dichas formulaciones comprenden una mezcla en polvo de un agente farmacéutico de la invención y una base en polvo adecuada, tal como lactosa o almidón.

En ciertas realizaciones, se prepara una composición farmacéutica para administración rectal, tal como supositorios

o enema de retención. Ciertas de dichas composiciones farmacéuticas comprenden ingredientes conocidos, tales como manteca de cacao y/u otros glicéridos.

En ciertas realizaciones, se prepara una composición farmacéutica para administración tópica. Ciertas de dichas composiciones farmacéuticas comprenden bases blandas de hidratación, tales como ungüentos o cremas. Ejemplos de bases adecuadas para ungüentos incluyen, entre otros, vaselina, vaselina más siliconas volátiles, lanolina y agua en emulsiones de aceite, tal como Eucerin.TM., disponible en Beiersdorf (Cincinnati, Ohio). Ejemplos de bases de crema adecuados incluyen, entre otros, Nivea.TM. Crema, disponible en Beiersdorf (Cincinnati, Ohio), crema fría (USP), Purpose Cream.TM, disponible en Johnson & Johnson (New Brunswick, N.J.), pomada hidrófila (USP) y Lubriderm.TM., disponible en Pfizer (Morris Plains, NJ.).

En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica de la presente invención comprende un oligonucleótido en una cantidad terapéuticamente eficaz. En ciertas realizaciones, la cantidad terapéuticamente eficaz es suficiente para prevenir, aliviar o mejorar los síntomas de una enfermedad o para prolongar la supervivencia del sujeto que se esté tratando. La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz entra bien en de la capacidad de los expertos en la técnica.

En ciertas realizaciones, se formulan uno o más compuestos antisentido cortos de la presente invención como un profármaco. En ciertas realizaciones, tras la administración in vivo, un profármaco se convierte químicamente en la forma biológica, farmacéutica o terapéuticamente más activa del compuesto antisentido corto. En ciertas realizaciones, los profármacos son útiles porque son más fáciles de administrar que la correspondiente forma activa. Por ejemplo, en ciertos casos, un profármaco puede estar más biodisponible (p. ej., mediante administración oral) que su correspondiente forma activa. En ciertos casos, un profármaco puede temer mejor solubilidad en comparación con la correspondiente forma activa. En ciertas realizaciones, los profármacos son menos hidrosolubles que la correspondiente forma activa. En ciertos casos, dichos profármacos poseen superior transmisión a través de las membranas celulares, en los que la solubilidad en agua es perjudicial para la movilidad. En ciertas realizaciones, un profármaco es un éster. En ciertas de dichas realizaciones, el éster se hidroliza metabólicamente en ácido carboxílico tras la administración. En ciertos casos, el compuesto que contiene ácido carboxílico es la correspondiente forma activa. En ciertas realizaciones, un profármaco comprende un péptido corto (poliaminoácido) unido a un grupo ácido. En ciertas de dichas realizaciones, el péptido se escinde tras la administración para formar la correspondiente forma activa.

En ciertas realizaciones, se produce un profármaco modificando un compuesto farmacéuticamente activo de modo que el compuesto activo se regenerará tras la administración in vivo. El profármaco se puede diseñar para alterar la estabilidad metabólica o las características de transporte de un fármaco, para enmascarar los efectos secundarios o la toxicidad, para mejorar el sabor de un fármaco o para alterar otras características o propiedades de un fármaco. En virtud de los conocimientos sobre los procesos farmacodinámicos y el metabolismo de los fármacos in vivo, los expertos en la técnica, una vez que se conoce el compuesto farmacéuticamente activo, pueden diseñar profármacos del compuesto (véase, por ejemplo, Nogrady (1985) Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, New York, páginas 388-392).

En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica que comprende uno o más agentes farmacéuticos de la presente invención es útil para tratar afecciones o trastornos en un mamífero, y, particularmente, en un sujeto humano. Las vías de administración adecuadas incluyen, entre otras, las vías oral, rectal, transmucosa, intestinal, enteral, tópica, supositorios, mediante inhalación, intratecal, intraventricular, intraperitoneal, intranasal, intraocular y parenteral (p. ej., intravenosa, intramuscular, intramedular y subcutánea). En ciertas realizaciones se administran agentes farmacéuticos intratecales para alcanzar exposiciones locales en lugar de sistémicas. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas se pueden inyectar directamente en el área del efecto deseado (p. ej., en el área renal o cardíaca).

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos, en comparación con sus oligonucleótidos parentales, sin particularmente adecuados para administración oral. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos están mejor adaptados para administración oral que sus oligonucleótidos parentales, porque tienen mayor potencia en comparación con dichos oligonucleótidos parentales. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos están mejor adaptados para administración oral que sus oligonucleótidos parentales, porque tienen mejores propiedades de estabilidad, disponibilidad o solubilidad en comparación con los oligonucleótidos parentales.

En un aspecto adicional, un agente farmacéutico es un oligonucleótido liofilizado estéril que se reconstituye con un diluyente adecuado, por ejemplo agua estéril para inyectables. El producto reconstituido se administra como una inyección subcutánea o como una infusión intravenosa tras la dilución en solución salina. El producto farmacológico liofilizado consta del oligonucleótido que se ha preparado en agua para inyectables, ajustado a un pH 7,0-9,0 con ácido o base durante la preparación y, después, se liofiliza. El oligonucleótido liofilizado puede ser 25-800 mg del oligonucleótido. Se entiende que esto abarca 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775 y 800 mg de oligonucleótido liofilizado. El producto farmacológico liofilizado puede envasarse en un vial de cristal transparente de tipo 1 de 2 ml (tratado con sulfato amónico), tapado con un cierre de caucho de bromobutilo y sellado con un sello de aluminio FLIP-OFF® .

Las composiciones de la presente invención pueden comprender, adicionalmente, otros componentes adyuvantes encontrados convencionalmente en composiciones farmacéuticas a sus niveles de uso establecidos en la técnica. Por tanto, por ejemplo, las composiciones pueden comprender materiales adicionales, compatibles farmacéuticamente activos, tales como, por ejemplo, antipruríticos, astringentes, anestésicos locales o agentes antiinflamatorios, o pueden comprender materiales adicionales útiles en la formulación física de varias formas de dosificación de las composiciones de la presente invención, tales como colorantes, agentes aromatizantes, conservantes, antioxidantes, opacificantes, agentes espesantes y estabilizantes. No obstante, dichos materiales, cuando se añaden, no deberían interferir indebidamente con las actividades biológicas de los componentes de las composiciones de la presente invención. Las formulaciones se pueden esterilizar y, si se desea, mezclar con agentes adyuvantes, por ejemplo lubricantes, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, sales de influencia sobre la presión osmótica, tampones, colorantes, aromatizantes y/o sustancias aromáticas y similares, que no interaccionan de forma perjudicial con el(los) oligonucleótidos de la formulación.

Los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento se pueden mezclar, encapsular, conjugar o,

de otro modo, asociar con otras moléculas, estructuras moleculares o mezclas de compuestos.

En el presente documento también se describen composiciones farmacéuticas y formulaciones que incluyen los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar de diversos modos dependiendo de si se desea tratamiento local o sistémico y del área que se va a tratar. En una realización preferida, la administración es tópica en la superficie del tracto respiratorio, particularmente pulmonar, por ejemplo mediante nebulización, inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, por boca y/o nariz.

Las formulaciones farmacéuticas descritas en la presente invención, que se pueden presentar de forma conveniente en forma de monodosis, se pueden preparar de acuerdo con técnicas convencionales bien conocidas en la industria farmacéutica. Dichas técnicas incluyen la etapa de poner en contacto los ingredientes activos con el(los) transportador(es) farmacéutico(s) o excipiente(s). En general, las formulaciones se preparan poniendo en contacto de forma uniforme y estrecha los ingredientes activos con transportadores líquidos o transportadores sólidos finamente divididos o con ambos y, después, en caso necesario, dando forma al producto en la formulación deseada (p. ej., en un tamaño de partícula específico para liberación). En una realización preferida, las formulaciones farmacéuticas se preparan para administración pulmonar en un disolvente adecuado, por ejemplo agua o solución salina normal, posiblemente en una formulación estéril, con transportadores u otros agentes para permitir la formación de gotas del diámetro deseado para liberación usando inhaladores, dispositivos de liberación nasal, nebulizadores y otros dispositivos para liberación pulmonar. Como alternativa, las formulaciones farmacéuticas se pueden formular como polvos secos para usar en inhaladores de polvo seco.

Un “transportador farmacéutico” o “excipiente” puede ser un disolvente farmacéuticamente aceptable, agente de suspensión o cualquier otro vehículo farmacológicamente inerte para liberar uno o más ácidos nucleicos a un individuo y se conocen en la técnica. El excipiente puede ser líquido o sólido y se selecciona, con el modo de administración previsto en mente, de modo que proporcione el volumen y la consistencia etc. deseados cuando se combina con un ácido nucleico y los otros componentes de una composición farmacéutica dada.

H. Ciertos usos terapéuticos

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido se usan para modular la expresión de un gen diana en un animal, tal como un ser humano. En ciertas realizaciones, dichos compuestos se pueden usar para tratar trastornos metabólicos o modular una o más indicaciones de enfermedad. Por ejemplo, los procedimientos comprenden la etapa de administrar a dicho animal que necesite terapia por una enfermedad o afección asociada con un gen diana una cantidad eficaz de un compuestos antisentido que module la expresión del gen. Los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento que modulan de forma eficaz a expresión de un ARN diana o productos proteicos de la expresión se consideran compuestos antisentido activos. Los compuestos antisentido activos también pueden incluir compuestos que modulan de forma eficaz una o más de una serie de indicaciones de enfermedad, incluidas indicaciones de enfermedad metabólica y cardiovascular, ejemplos de los cuales se describen más adelante.

La modulación de la expresión de un gen diana se puede medir en un fluido corporal, que puede o no contener células, tejido u órgano del animal. Procedimientos de obtener muestras para análisis, tales como fluidos corporales

(p. ej., esputo, suero, orina), tejidos (p. ej., biopsia) u órganos y procedimientos de preparación de las muestras para permitir el análisis son bien conocidos para los expertos en la técnica. Procedimientos para el análisis de ARN y los niveles de proteínas se tratan anteriormente y son bien conocidos para los expertos en la técnica. Los efectos del tratamiento se pueden evaluar midiendo biomarcadores, o indicaciones de enfermedad, asociados con la expresión del gen diana en los fluidos, tejidos u órganos mencionados anteriormente, recogidos de un animal en contacto con uno o más compuestos descritos en el presente documento, mediante procedimientos clínicos rutinarios conocidos en la técnica. Estos biomarcadores incluyen, entre otros: transaminasas hepáticas, bilirrubina albúmina, nitrógeno ureico en sangre, creatinina y otros marcadores de función renal y hepática; interleucinas, factores de necrosis tumoral, moléculas de adhesión intracelular, proteína C reactiva, quimiocinas, citocinas y otros marcadores de inflamación.

Los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento se pueden usar en composiciones farmacéuticas añadiendo una cantidad eficaz de un compuesto a un diluyente o transportador adecuado farmacéuticamente aceptable. Transportadores y diluyentes aceptables son bien conocidos para los expertos en la técnica. La selección de un diluyente o transportador se basa en una serie de factores, incluidos, entre otros, la solubilidad del compuesto y la vía de administración. Dichas consideraciones son bien conocidas poros expertos en la técnica. En un aspecto, los compuestos antisentido descritos en el presente documento inhiben la expresión de un gen diana. Los compuestos también se pueden usar en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades y trastornos relacionados con un gen diana.

También se contemplan procedimientos mediante los que fluidos corporales, órganos o tejidos se ponen en contacto con una cantidad eficaz de uno o más de los compuestos antisentido o las composiciones proporcionadas en el presente documento. Los fluidos corporales, órganos o tejidos se pueden poner en contacto con uno o más de los compuestos, dando como resultado la modulación de la expresión de un gen diana en las células de los fluidos corporales, órganos o tejidos. Una cantidad eficaz se puede determinar monitorizando el efecto modulador del compuesto antisentido o compuestos o composiciones sobre los ácidos nucleicos diana o sus productos mediante procedimientos de rutina para el experto en la técnica.

Coadministración

En ciertas realizaciones, dos o más compuestos antisentido se administran de forma conjunta. En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas incluyen uno o más compuestos antisentido, particularmente oligonucleótidos, dirigidos a un primer ácido nucleico y uno o más compuestos antisentido dirigidos a un segundo ácido nucleico diana. Uno o más de dichos compuestos antisentido pueden ser un compuesto antisentido corto. En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas incluyen dos o más compuestos antisentido dirigidos a diferentes regiones del mismo ácido nucleico diana. Uno o más de dichos compuestos antisentido pueden ser un compuesto antisentido corto. Dos o más compuestos combinados se pueden usar juntos o de forma secuencial.

En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas se administran conjuntamente con uno o más agentes farmacéuticos distintos. En ciertas realizaciones, dichos uno más agentes farmacéuticos distintos están diseñados para tratar la misma enfermedad o afección distinta a la de las una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención. En ciertas realizaciones, dichos uno más agentes farmacéuticos distintos están diseñados para tratar otra enfermedad o afección distinta a la de las una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención. En ciertas realizaciones, dichos uno más agentes farmacéuticos distintos están diseñados para tratar un efecto indeseado de las una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención. En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención se administran conjuntamente con otro agente farmacéutico para tratar un efecto indeseado de dicho otro agente farmacéutico. En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención y uno o más agentes farmacéuticos distintos se administran al mismo tiempo. En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención y uno o más agentes farmacéuticos distintos se administran en momentos diferentes. En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención y uno o más agentes farmacéuticos distintos preparan juntos en una única formulación. En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención y uno o más agentes farmacéuticos distintos se preparan por separado.

En ciertas realizaciones, los agentes farmacéuticos que se pueden administrar de forma conjunta con una composición farmacéutica de la presente invención incluyen agentes hipolipemiantes. En ciertas de dichas realizaciones, los agentes farmacéuticos que se pueden administrar de forma conjunta con una composición farmacéutica de la presente invención incluyen, entre otros, atorvastatina, simvastatina, rosuvastatina y ezetimiba. En ciertas de dichas realizaciones, el agente hipolipemiante se administra antes de la administración de una composición farmacéutica de la presente invención. En ciertas de dichas realizaciones, el agente hipolipemiante se administra después de la administración de una composición farmacéutica de la presente invención. En ciertas de dichas realizaciones, el agente hipolipemiante se administra al mismo tiempo que la composición farmacéutica de la presente invención. En ciertas de dichas realizaciones, la dosis de un agente hipolipemiante coadministrado es la misma que la dosis que se administraría si el agente hipolipemiante se administrara solo. En ciertas de dichas realizaciones, la dosis de un agente hipolipemiante coadministrado es menor que la dosis que se administraría si el agente hipolipemiante se administrara solo. En ciertas de dichas realizaciones, la dosis de un agente hipolipemiante coadministrado es mayor que la dosis que se administraría si el agente hipolipemiante se administrara solo.

En ciertas realizaciones, un agente hipolipemiante coadministrado es un inhibidor de la HMG-CoA reductasa. En ciertas de dichas realizaciones, el inhibidor de la HMG-CoA reductasa es una estatina. En ciertas de dichas realizaciones, la estatina se selecciona de atorvastatina, simvastatina, pravastatina, fluvastatina y rosuvastatina. En ciertas realizaciones, un agente hipolipemiante coadministrado es un inhibidor de la absorción de colesterol. En ciertas de dichas realizaciones, el inhibidor de la absorción de colesterol es ezetimiba. En ciertas realizaciones, un agente hipolipemiante coadministrado es un inhibidor de la HMG-CoA reductasa formulado conjuntamente con un inhibidor de la absorción de colesterol. En ciertas de dichas realizaciones, el agente hipolipemiante formulado conjuntamente es ezetimiba/simvastatina. En ciertas realizaciones, un agente hipolipemiante coadministrado es un inhibidor de la proteína de transferencia de triglicéridos microsomal.

En ciertas realizaciones, un agente farmacéutico coadministrado es un secuestrante de ácidos biliares. En ciertas de dichas realizaciones, el secuestrante de ácidos biliares se selecciona de colestiramina, colestipol y colesevelam.

En ciertas realizaciones, un agente farmacéutico coadministrado es un ácido nicotínico. En ciertas de dichas realizaciones, el ácido nicotínico se selecciona de ácido nicotínico de liberación inmediata, ácido nicotínico de liberación extendida y ácido nicotínico de liberación sostenida.

En ciertas realizaciones, un agente farmacéutico coadministrado es un ácido fíbrico. En ciertas de dichas realizaciones, el ácido fíbrico se selecciona de gemfibrozilo, fenofibrato, clofibrato, bezafibrato y ciprofibrato.

Otros ejemplos de agentes farmacéuticos que se pueden administrar de forma conjunta con una composición farmacéutica de la presente divulgación incluyen, entre otros, corticosteroides, incluidos, entre otros, prednisona; inmunoglobulinas, incluidas, entre otras inmunoglobulina intravenosa (IgIV); analgésicos (p. ej., acetaminófeno); agentes antiinflamatorios, incluidos, entre otros, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (p. ej., ibuprofeno, inhibidores de la COX-1 e inhibidores de la COX-2); salicilatos; antibióticos; antivirales; agentes antifúngicos; agentes antidiabéticos (p. ej., biguanidas, inhibidores de la glucosidasa, insulinas, sulfonilureas y tiazolidendionas); modificadores adrenérgicos; diuréticos; hormonas (p. ej., esteroides anabólicos, andrógenos, estrógenos, calcitonina, progestina, somatostatina y hormonas tiroideas); inmunomoduladores; relajantes musculares; antihistamínicos, agentes antiosteoporosis (p. ej., bisfosfonatos, calcitonina y estrógenos); prostaglandinas, agentes antineoplásicos; agentes psicoterapéuticos; sedantes; productos de roble venenoso del atlántico y de zumaque venenoso; anticuerpos; y vacunas.

En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar de forma conjunta con una terapia hipolipemiante. En ciertas de dichas realizaciones, una terapia hipolipemiante es un cambio terapéutico del estilo de vida. En ciertas de dichas realizaciones, una terapia hipolipemiante es aféresis de LDL.

I. Kit, reactivos de investigación y diagnósticos

Los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento se pueden utilizar para diagnóstico y como reactivos y kit de investigación. Además, los compuestos antisentido que pueden inhibir la expresión génica o modular la expresión génica con especificidad, a menudo son usados por los expertos en la técnica para aclarar la función de genes concretos o distinguir entre funciones de varios miembros de una vía biológica.

Para usar en kit y diagnóstico, los compuestos antisentido descritos en el presente documento, bien solos o en combinación con otros compuestos o terapéuticas, se pueden usar como herramientas en análisis diferencial y/o de combinación para aclarar los patrones de expresión de una porción o todo el complemento de genes expresados dentro de las células o tejidos. Los procedimientos de análisis de la expresión génica son bien conocidos para los expertos en la técnica.

J. Ciertas ventajas de los compuestos antisentido cortos

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen ventajas cuando se comparan con sus oligonucleótidos parentales. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, compuestos antisentido cortos tienen mayor afinidad por un ácido nucleico diana que su oligonucleótido parental. En ciertas realizaciones, compuestos antisentido cortos tienen mayor potencia in vitro que su oligonucleótido parental. En ciertas de dichas realizaciones, la mayor potencia in vitro no está completamente explicada por su mayor afinidad. En ciertas de dichas realizaciones, dicha mayor potencia in vitro se puede atribuir a un incremento de la capacidad de los compuestos antisentido cortos para penetrar en las células y/o a la mayor capacidad par acceder a los ácidos nucleicos diana en una célula. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido cortos tienen mayor potencia in vivo que sus oligonucleótidos parentales. En ciertas realizaciones, dicha mayor potencia in vivo no se puede atribuir al incremento de la potencia in vitro o al incremento de la afinidad. En ciertas realizaciones, , los compuestos antisentido cortos tienen incluso mayor potencia in vivo en comparación con sus oligonucleótidos parentales de lo que se predeciría en base a sus potencias in vitro o en las afinidades. En ciertas realizaciones, dicho incremento de la potencia in vivo puede atribuirse al incremento de la biodisponibilidad, menor penetración en la célula, mejor acceso al ácido nucleico diana une vez que está en la célula o a otros factores.

En ciertas realizaciones, cabría esperar que los compuestos antisentido cortos fueran menos específicos de su ácido nucleico diana en comparación con sus oligonucleótidos parentales. En ciertas de dichas realizaciones, cabría esperar un incremento de los efectos secundarios, incluido el potencial de efectos tóxicos, de los compuestos antisentido cortos. En ciertas realizaciones, dichos efectos secundarios adicionales no se observan. En ciertas realizaciones, los ácidos nucleicos no diana a los que se puede unir un compuesto antisentido corto no están disponibles para el compuesto antisentido corto. En dichas realizaciones, los efectos secundarios, incluida la toxicidad, son menos problemáticos de lo que cabría esperar.

En ciertas realizaciones, porque son más pequeños, es menos probable que los compuesto antisentido corto se unan a proteínas. En ciertas de dichas realizaciones, dicha menor unión de proteínas tiene como resultado menor toxicidad, ya que la unión a proteínas puede tener consecuencias no deseadas. En ciertas de dichas realizaciones, dicha menor unión de proteínas tiene como resultado mayor potencia, ya que deja más compuesto antisentido disponible para el efecto terapéutico. En ciertas realizaciones, la menor unión de proteínas tiene como resultado una menor toxicidad por interacción farmacológica.

Ejemplo 1: Cultivo celular y tratamiento con compuestos antisentido cortos

El efecto de los compuestos antisentido cortos sobre la expresión del ácido nucleido diana se puede analizar en una cualquiera de una serie de líneas celulares cultivadas o primarias. Las líneas celulares se pueden obtener de fuentes disponibles para el público, tal como la Colección Americana de Cultivos Tipo ((Manassas, VA). Las células se cultivan de acuerdo con procedimientos bien conocidos para los expertos en la técnica.

Cuando las células alcanzaron la confluencia adecuada, fueron tratadas con oligonucleótido usando LIPOFECTIN®, tal como se ha descrito. Cuando las células alcanzaron una confluencia del 65-75 % fueron tratadas con oligonucleótido. El oligonucleótido se mezcló con LIPOFECTIN® Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) en medio Opti-MEM® con reducción de suero (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) para alcanzar la concentración deseada del oligonucleótido y una concentración de LIPOFECTIN® de 2,5 o 3 µg/ml por oligonucleótido 100 nM. Esta mezcla de transfección se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 0,5 horas. Para las células cultivadas en placas de 96 pocillos, las células se lavaron una vez con 100 µl de OPTIMEM®-1 y después se trataron con 130 µl de la mezcla de transfección. Las células cultivadas en placas de 24 pocillos u otras placas de cultivo tisular estándar se trataron de forma similar, usando volúmenes adecuados de medio y de oligonucleótido. Las células fueron tratadas y los datos se obtuvieron por duplicado o por triplicado. Tras aproximadamente 4-7 horas de tratamiento a 37 ºC, el medio que contenía la mezcla de transfección se reemplazó con medio de cultivo fresco. Las células se recogieron 16-24 horas después del tratamiento con oligonucleótido.

Se usan oligonucleótidos control para determinar la concentración óptima del compuesto oligomérico para una línea celular concreta. Además, cuando los compuestos oligoméricos se analizan en experimentos de detección selectiva de compuestos oligoméricos o ensayos fenotípicos, los oligonucleótidos control se analizan en paralelo.

La concentración del oligonucleótido usado varía de una línea celular a otra línea celular. Para determinar la concentración óptima del oligonucleótido para una línea celular concreta, se trata a las células con un oligonucleótido control positivo con una serie de concentraciones. La concentración del oligonucleótido control positivo que tiene como resultado un 80% de inhibición del ARNm diana se usa después como concentración de detección selectiva para nuevos oligonucleótidos en experimentos posteriores para dicha línea celular. Si no se alcanza un 80% de inhibición, la concentración menor del oligonucleótido control positivo que tiene como resultado un 60% de inhibición del ARNm diana se usa después como concentración de detección selectiva del oligonucleótido en experimentos posteriores para dicha línea celular. Si no se alcanza 60% de inhibición, se estima que dicha línea celular concreta es inadecuada para los experimentos de transfección de oligonucleótidos. Las concentraciones de los oligonucleótidos antisentido usadas en el presente documento son de 50 nM A 300 nM cuando el oligonucleótido antisentido se transfecciona usando un reactivo de liposoma y 1 nM a 40 nM cuando el oligonucleótido antisentido se transfecciona mediante electroporación.

Ejemplo 2: Análisis con PCR cuantitativa en tiempo real de los niveles de ARNm diana

La cuantificación de los niveles de ARNm diana se realizó mediante PCR cuantitativa en tiempo real usando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM® 7600, 7700, o 7900 (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Antes del análisis de PCR cuantitativa, los equipos cebador-sonda específicos del gen diana que se está midiendo se evaluaron según su capacidad de "multiplexar” con una reacción de amplificación por GAPDH. Tras el aislamiento, el ARN se somete a reacción secuencia de transcriptasa inversa (TI) y PCR en tiempo real, ambas realizadas en el mismo pocillo. Los reactivos para TI y PCR se obtuvieron en Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA). La PCR con TI en tiempo real se llevó a cabo en el mismo añadiendo 20 µl de cóctel de PCR (2,5 X tampón de PCR menos MgCl2, MgCl2 6,6 mM, 375 µM cada uno de dATP, dCTP, dCTP y dGTP, 375 nM de cada uno de cebador directo y cebador inverso, 125 nM de sonda, 4 Unidades de inhibidor de RNasa, 1,25 unidades de PLATINUM® Taq, 5 Unidades de transcriptasa inversa MuLV y 2,5 x pigmento de Rox) a placas de 96 pocillos que contienen 30 µl de solución de ARN total (20-200 ng). La reacción de TI se llevó a cabo mediante incubación durante 30 minutos a 48 ºC. Tras una incubación de 10 minutos a 95 ºC para activar la PLATINUM® Taq, se llevaron a cabo 40 ciclos de un protocolo de PCR de dos etapas: 95 ºC durante 15 segundos (desnaturalización), seguido de 60 ºC durante 1,5 minutos (hibridación/extensión)

Las cantidades del gen diana obtenidos mediante PCR en tiempo real con TI se normalizaron usando el nivel de expresión de GAPDH, un gen cuya expresión es constante, o cuantificando el ARN total usando RiboGreen® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). La expresión de GAPDH se cuantificó mediante PCR en tiempo real con TI realizada simultáneamente con la diana, multiplexando o por separado. El ARN total se cuantificó usando reactivo de cuantificación RiboGreen® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR)

En una placa de 96 pocillos que contenía 30 µl de ARN celular purificado se pipetearon 170 µl de reactivo de trabajo RiboGreen® (reactivo RiboGreen® diluido a 1:350 en Tris-Hcl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5). La placa se leyó en un

5

10

15

20

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30

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40

lector CytoFluor® 4000 (PE Applied Biosystems) con excitación de 485 nm y emisión a 530 nm.

Las sondas para PCR de GAPDH tiene JOE unido covalentemente en el extremo 5’ y TAMRA o MGB unidos covalentemente al extremo 3’, donde JOE es el colorante indicador fluorescente y TAMRA o MGB es el colorante inactivador. En algunos tipos de celular se usan cebadores y sondas diseñados para una secuencia de GAPDH de una especie diferente, para medir los gastos de expresión de GAPDH. Por ejemplo, un equipo de sonda y cebador para GAPDH se usa para medir la expresión de GAPDH en células y líneas celulares derivadas de mono.

Las sondas y cebadores para uso en PCR en tiempo real se diseñaron para hibridar con los ácidos nucleicos diana a través de procedimientos de rutina. Por ejemplo, el software PrimerExpress® (Applied Biosystems, Foster City, CA) se usa de forma rutinaria para diseñar sondas y cebadores para uso en PCR en tiempo real.

Ejemplo 3: Administración de un compuesto antisentido parental y parental de esqueleto mixto dirigido al ARNm de SGLT-2

En ratones db/db (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) se administró ISIS 257016 por vía intraperitoneal a una dosis de 1, 7.5, 14 o 17 mg/kg dos veces a la semana. Los grupos control incluyeron un grupo que recibió solución salina según el mismo calendario de dosificación y un grupo que recibió ISIS 145733. Tanto ISIS 257016 como ISIS 145733 comprenden la secuencia GAAG-TAGCCACCAACTGTGC (SEC ID Nº 1572), que además comprende una región “hueco” central constituida por diez 2’-desoxinucleótidos, que está flanqueada por ambos lados (direcciones 5’ y 3’) por "alas" de cinco nucleótidos. Las alas están compuestas por nucleótidos 2’-metoxietilo (2’-MOE). Todos los residuos de citidina son 5-metilcitidinas. Los enlaces internucleosídicos (esqueleto) son fosforotioato (P=S) a lo largo del oligonucleótido para ISIS 145733; no obstante, ISIS 257016 tiene un esqueleto mixto. Los enlaces internucleosídicos para ISIS 257016 son fosfodiéster (P=O) en las alas y fosforotioato en el hueco. Cuarenta y ocho horas después de la administración de la última dosis, se sacrificó a los ratones y el tejido renal se analizó para determinar los niveles de ARNm de SGLT-2. Los resultados se muestran a continuación en la Tabla 3.

Tabla 3: Inhibición antisentido de la expresión de ARNm de SGLT2 in vivo por gápmeros 5-10-5 MOE

% Cambio en la expresión de SGLT2 respecto a la solución salina

Dosis de oligonucleótido nmol/kg

ISIS 145733 ISIS 257016

17

-37,5 -76

14

-31,25 -74

7,5

-12,5 -62,5

1

+ 3 -44

Tanto ISIS 257016 como ISIS 145733 redujeron marcadamente los niveles de SGLT-2 en comparación con la solución salina control. (Los niveles de ARNm se determinaron usando PCR en tiempo real con TI, tal como se ha descrito anteriormente). No obstante, se ha demostrado que ISIS 257016 era aproximadamente 20-50 veces más potente en la reducción de ARNm de SGLT-2 en comparación con ISIS 145733. Se observó una reducción asociada de los niveles de glucosa en plasma en los grupos de tratamiento (661 ± 14 para el grupo de solución salina en comparación con 470 ± 23 para el grupo que recibe ISIS 257016). La acumulación de ISIS 257016 e ISIS 145733 en el riñón fue similar para todo el intervalo de dosis, no obstante se detectó poco del antisentido 257016 de longitud completa en el riñón, lo que avala la teoría de que un producto de degradación es responsable del incremento de actividad. Asimismo, el inicio de la acción tras una única dosis de 25 mg/kg se correlacionó con un punto de tiempo en el que quedaba poco compuesto antisentido 257016 intacto.

Se realizaron estudios similares con ratones ob/ob de poca masa y en ratas ZDF ((Charles Rivers Laboratories) usando ISIS 257016, ISIS 145733 o solución salina según un calendario de dosificación similar tal como se ha descrito anteriormente. La secuencia del sitio de unión para ISIS 145733 e ISIS 257016 está conservada entre ratones y ratas (véase la Tabla 4). La reducción de ARNm de SGLT-2 en el riñón fue similar a la observada anteriormente. En un estudio con ratas, a una dosis de 10 mg/kg administrada dos veces a la semana durante dos semanas, se demostró que ISIS 145733 reducía los niveles de ARNm de SGLT-2 en aproximadamente un 40%, mientras que la reducción conseguida con ISIS 257016 era superior al 80%. ISIS 257016 reduce la expresión de SGT2 máximamente a una dosis baja de 12,5 mg/kg. Estudios adicionales con intervalos de dosis menores muestran una reducción significativa de los niveles de ARNm de SGLT2 con el compuesto antisentido de esqueleto

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10

15

20

25

30

35

40

mixto a dosis inferiores a 1 mg/kg/semana.

Ejemplo 4: Administración de un compuesto antisentido parental y corto dirigido al ARNm de SGLT-2

Los estudios farmacocinéticos indicaron que ISIS 257016 actuaba como profármaco que se metabolizaba a un farmacóforo de 12 bases nucleotídicas. En un estudio posterior, se administró a ratas ZDF dosis intraperitoneales dos veces a la semana de 1,5 mg/kg de ISIS 257016 o ISIS 370717 o solución salina según un calendario de dosificación similar. ISIS 370717 es un compuesto antisentido de 12 bases nucleotídicas dirigido al ácido nucleico de SGLT-2, que comprende la secuencia TAGCCACCAACT (SEC ID Nº 154) y que además comprende una región “hueco” central constituida por diez 2’-desoxinucleótidos, que está flanqueada por ambos lados (direcciones 5’ y 3’) por "alas" de un nucleótido. Las alas están compuestas por nucleótidos 2’-metoxietilo (2’-MOE). Todos los residuos de citidina son 5-metilcitidinas. Los enlaces internucleosídicos (esqueleto) son fosforotioato (P=S) a lo largo del oligonucleótido.

Tras cinco semanas de administración de dosis se sacrificó a los animales y el tejido renal se analizó para determinar los niveles de ARNm de SGLT-2. La actividad farmacológica de ISIS 257016 e ISIS 370717 fue similar, no obstante el compuesto antisentido de 12 nucleótidos mostró un inicio de acción más rápido. ISIS 370717 mostró casi un 80% de inhibición de la expresión de SGLT2 en riñones el día dos después de una única dosis de 2,8 umoles/kg, mientras que ISIS 257016 mostró únicamente una inhibición del 25% el día 2 después de la misma administración de una sola dosis. Los datos apoyan que ISIS 257016 es un profármaco que tiene un farmacóforo de 12 nucleótidos.

Ejemplo 5: Potencia y biodisponibilidad de un compuesto antisentido corto

La potencia mejorada mostrada por ISIS 370717 y la mejor biodisponibilidad oral para estos compuestos antisentido cortos convierte a estos compuestos en útiles para administración oral. Ratas normales recibieron ISIS 370717, ISIS 145733 o solución salina a 100 mg/kg dos veces a la semana mediante administración intrayeyunal. Aproximadamente 48 después de la última dosis, se sacrificó a los animales y el tejido renal se analizó para determinar la concentración del compuesto antisentido y los niveles de ARNm de SGLT-2. Se produjo una acumulación significativamente mayor de ISIS 370717 en el tejido renal (aproximadamente 500 microgramos por gramo de tejido) en comparación con los controles. Además, el ARNm de SGLT-2 se redujo en más del 80% sobre los controles.

Ejemplo 6: Variaciones en el ala, el hueco y la longitud total alrededor de un compuesto antisentido corto de 12 nucleótidos

El gápmero ISIS 370717 1-10-1 MOE se usó como molde para elaborar oligos relacionados con la secuencia con diversos motivos. Estas variaciones se proporcionan en la Tabla 4. Los compuestos antisentido se diseñaron para dirigirlos a diferentes regiones del ácido nucleico de SGLT2 de ratón o de rata, usando las secuencias publicadas (número de registro en GenBank U29881.1, que se incorpora en el presente documento como SEC ID Nº 1575 y el número de registro en GenBank AJ292928.1, que se incorpora en el presente documento como SEC ID Nº 1576, respectivamente).

Tabla 4: Compuestos antisentido cortos dirigidos a ácidos nucleicos de SGLT2

Nº ISIS

Sitio diana en 5’ de ratón SEC ID Nº 1575 Sitio diana en 5’ de rata SEC ID Nº 1576 Motivo gápmero Secuencia (5’-3’) SEC ID Nº

257016

2680 148 5-10-5 MOE GAAGTAGCCACCAACTGTGC 1553

370717

2684 152 1-10-1 MOE TAGCCACCAACT 1554

386169

2684 152 2-8-2 MOE TAGCCACCAACT 1555

386176

2685 153 1-8-1 MOE AGCCACCAAC 1556

386196

2684 152 3-6-3 MOE TAGCCACCAACT 1557

Los compuestos antisentido se analizaron según su efecto sobre los niveles de ARNM de SGLT2. Los datos son intervalos tomados de tres experimentos en los que se administró a los ratones las dosis dos veces a la semana durante tres semanas con 2,5, 0,5 o 0,1 umol/kg de los gápmeros MOE anteriores administrados por inyección intraperitoneal. Se sacrificó a los ratones 48 horas tras la última administración y se evaluaron los niveles de SGLT2 en riñones. Los niveles de ARNm de SGLT2 se determinaron mediante PCR en tiempo real con TI tal como se ha descrito en otros ejemplos en el presente documento. Los resultados de la PCR se normalizaron según un control interno ISIS. Los resultados se muestran a continuación en la Tabla 5.

Tabla 5: Inhibición antisentido de SGLT2 in vivo por gápmeros 1-10-1 y 1-10-2 MOE

% Cambio en la expresión de SGLT2 respecto a la solución salina

Dosis de oligonucleótido umol/kg

ISIS 370717 ISIS 386169 ISIS 386176 ISIS 386196 ISIS 386197

2,5

-82 -85 -80 -50 -20

0,5

-70 -80 -68 -30 -15

0,1

-55 -70 -65 -35 -20

Estos resultados ilustran que los diversos motivos analizados inhiben la expresión de SGLT2 in vivo de un modo dependiente de la dosis. Se descubrió que los gápmeros 1-10-1, 2-8-2 y 1-8-1 eran particularmente potentes.

Ejemplo 7: Inhibición antisentido de SGLT2 de rata por los gápmeros 1-10-1 y 1-10-2 MOE

10 Los compuestos antisentido de los gápmeros 1-10-1 y 1-10-2 MOE, proporcionados en la Tabla 6, se diseñaron para dirigirse a diferentes regiones del ARN de SGLT2 de ratón o de rata. Todos los compuestos antisentido cortos de la Tabla 6 eran oligonucleótidos quiméricos (“gápmeros” de 12 0 13 nucleótidos de longitud, compuestos por un segmento “hueco” central constituido por diez 2’-desoxinucleótidos, que está flanqueado en el extremo 5' por un "ala" de un nucleósido y por el extremo 3' por un "ala" de dos o un nucleótido. Las alas están compuestas por

15 nucleótidos 2’-metoxietilo (2’-MOE). Los enlaces internucleosídicos (esqueleto) son fosforotioato (P=S) a lo largo del oligonucleótido. Todos los residuos de citidina son 5-metilcitidinas.

Tabla 6: Compuestos antisentido dirigidos a ácidos nucleicos de SGLT2

Nº ISIS

Sitio diana en 5’ en la SEC ID Nº XXX (ratón) Sitio diana en 5’ en la SEC ID Nº XXX (rata) Motivo gápmero Secuencia (5’-3’) SEC ID Nº

370717

2684 152 1-10-1 MOE TAGCCACCAACT 1554

382675

2683 151 1-10-1 MOE TAGCCACCAACTG 1559

379692

508 1-10-1 MOE TGTTCCAGCCCA 246

382676

507 1-10-2 MOE TGTTCCAGCCCAG 246

379699

1112 1-10-2 MOE GGCATGAGCTTC 281

382677

1111 1-10-2 MOE GGCATGAGCTTCA 281

382677

958 1-10-2 MOE GGCATGAGCTTCA 281

Los compuestos antisentido cortos se analizaron según su efecto sobre los niveles de ARNM de SGLT2 en ratas.

20 Los datos son intervalos tomados de tres experimentos con ratas macho Male Sprague-Dawley (170-200 g) en los que se administraron las dosis dos veces a la semana durante tres semanas con 450, 150 o 50 umol/kg del gápmero 1-10-1 o 1-10-2 MOE administrado por inyección intraperitoneal. Se sacrificó a las ratas 48 horas después de la última administración y se evaluaron los niveles de ARNm de SGLT2 en riñones. Los niveles diana se determinaron mediante PCR en tiempo real con TI tal como se ha descrito en otros ejemplos en el presente

25 documento. Los resultados de la PCR se normalizaron según un control interno ISIS. Los resultados se muestran a continuación en la Tabla 7.

Tabla 7: Inhibición antisentido del ARNm de SGLT2 in vivo por los gápmeros 1-10-1 y 1-10-2 MOE

% Cambio en la expresión de SGLT2 respecto a la solución salina

Dosis de oligonucleótido

ISIS ISIS ISIS ISIS ISIS ISIS

nmol/kg

370717 1-10-1 382675 1-10-2 379692 1-10-1 382676 1-10-2 379699 1-10-1 382677 1-10-2

450

-70 -80 -90 -85 -83 -75

150

-70 -65 -85 -80 -75 -60

50

-55 -50 -80 -65 -60 -40

Estos resultados ilustran que ambos gápmeros, 1-10-1 y 1-10-2, reducen el ARNm de SGLT2 in vivo de un modo dependiente de la dosis.

5 En las ratas se evaluó después el peso corporal total, el peso del hígado, del bazo y del riñón. Cambios significativos en el peso del hígado, del bazo o corporal pueden indicar que un compuesto concreto produce efectos tóxicos. Todos los cambios estaban dentro del margen de error del experimento. No se observaron cambios significativos en el peso corporal durante el tratamiento o al final del estudio. Tampoco se observaron cambios significativos en el peso del hígado ni del bazo.

10 Los efectos tóxicos de los compuestos antisentido cortos administrados in vivo se pueden evaluar midiendo los niveles de enzimas y proteínas asociados con enfermedad o lesión hepática o renal. A menudo, las elevaciones de los niveles de las transaminasas séricas, aspartato aminotransferasa (AST) y alanina aminotransferasa (ALT) son indicadores de enfermedad o lesión hepática. La bilirrubina total en suero es un indicador de la función hepática y biliar, y la albúmina y el nitrógeno ureico en sangre (BUN) son indicadores de la función renal. En ocasiones, los

15 niveles de glucosa y triglicéridos se ven alterados debido a la toxicidad de un tratamiento. La glucosa en suero también depende en parte de la actividad de SGLT2. Los niveles de ALT, AST, bilirrubina total, albúmina, BUN, glucosa y triglicéridos se midieron en ratas tratadas con los compuestos antisentido cortos. Los niveles de indicadores clínicos de rutina de lesión y enfermedad hepática y renal estaban dentro de los intervalos normales y no cambiaron significativamente respecto a los animales tratados con solución salina, lo que demuestra que los

20 compuestos antisentido cortos no afectan de forma significativa a la función renal o hepática. Los niveles de triglicéridos y glucosa no se elevaron significativamente con respecto a los animales tratados con solución salina.

Ejemplo 8: Inhibición antisentido de SGLT2 de ratón y de rata por los gápmeros 1-10-1 MOE

Los compuestos antisentido con el gápmero 1-10-1 MOE diseñados para dirigirse hacia diferentes regiones del ARNm de SGLT2 de ratón se muestran en la Tabla 8.

25 Tabla 8: Composición de los compuestos antisentido dirigidos al ARNm de SLGT-2

Nº ISIS

Sitio diana en 5’ en la SEC ID Nº XXX (ratón) Sitio diana en 5’ en la SEC ID Nº XXX (rata) Motivo Secuencia (5’-3’) SEC ID Nº

370717

2684 152 1-10-1 MOE TAGCCACCAACT 1554

379692

508 1-10-1 MOE TGTTCCAGCCCA 246

379699

1112 1-10-1 MOE GGCATGAGCTTC 281

379702

1525 1-10-1 MOE GCACACAGCTGC 293

381408

3034** 1-10-1 MOE TACCGAACACCT 1560

**indica 3 apareamientos erróneos con una secuencia diana

Los compuestos antisentido cortos se analizaron según su efecto sobre los niveles de ARNm de SGLT2 de ratón. Los datos son intervalos tomados de tres experimentos en los que se administró a ratones Balb/c macho de

54

semanas de edad las dosis dos veces a la semana durante dos semanas con 450, 150 o 50 nmol/kg de uno de los gápmeros 1-10-1 MOE anteriores administrados por inyección intraperitoneal. Se sacrificó a los ratones 48 horas después de la última administración y se evaluaron los niveles de ARNm de SGLT2 en los riñones. Los niveles diana se determinaron mediante PCR en tiempo real con TI tal como se ha descrito en otros ejemplos en el presente documento. Los resultados de la PCR se normalizaron según un control interno ISIS. Los resultados se muestran a continuación en la Tabla 9.

Tabla 9: Inhibición antisentido del ARNm de SGLT2 in vivo por gápmeros 1-10-1 MOE

% Cambio en la expresión de SGLT2 respecto a la solución salina

Dosis de oligonucleótido nmol/kg

ISIS 370717 ISIS 379692 ISIS 379699 ISIS 379702 ISIS 381408

450

-65 -80 -80 -75 -

150

-55 -70 -62,5 -72,5 -

50

-47,5 -52,5 -42,5 -52,5 -

Estos resultados ilustran que todos los gápmeros 1-10-1 MOE excepto ISIS 381408 inhiben la expresión de SGLT2

10 in vivo de un modo dependiente de la dosis. La actividad de ISIS 381408 se ha demostrado en estudios con ratas (véase la Tabla 9).

Evaluación de los gápmeros 1-10-1 en ratas

El efecto de los gápmeros 1-10-1 anteriores (véase la Tabla 8 anterior) sobre los niveles de ARNm de SGLT2 de rata. Los datos se toman de cuatro experimentos en los que se administró a ratas macho Male Sprague-Dawley

15 (170-200 g) dosis dos veces a la semana durante tres semanas con 250 nmol/kg administrados por inyección intraperitoneal. Se sacrificó a las ratas 48 horas después de la última administración y se evaluaron los niveles de ARNm de SGLT2 en riñones. Los niveles diana se determinaron mediante PCR en tiempo real con TI tal como se ha descrito en otros ejemplos en el presente documento. Los resultados de la PCR se normalizaron según un control interno ISIS. Los resultados se muestran a continuación en la Tabla 10.

20 Tabla 10: Inhibición antisentido del ARNm de SGLT2 in vivo por gápmeros 1-10-1 MOE

% Cambio en la expresión de SGLT2 respecto a la solución salina

Dosis de oligonucleótido nmol/kg

ISIS 370717 ISIS 379692 ISIS 379699 ISIS 379702 ISIS 381408

250

-70 -85 -75 -25 -5

Estos resultados ilustran que todos los gápmeros 1-10-1 MOE inhiben la expresión de SGLT2 in vivo en los estudios con ratas.

Ejemplo 9: Inhibición antisentido de la expresión de SGLT2 de ratón y de rata por los gápmeros 1-10-1 y 2-8-2 25 MOE adicionales

Los compuestos antisentido cortos de los gápmeros 1-10-1 y 2-8-2 MOE se diseñaron para dirigirse a diferentes regiones del ARN de SGLT2 de ratón pero tienen complementariedad entre especies. Los compuestos antisentido cortos se muestran en la Tabla 11. Todos los compuestos antisentido cortos de la Tabla 11 son gápmeros de 12 nucleótidos de longitud, compuestos por un segmento “hueco” central constituido por 2’-desoxinucleótidos, que está

30 por ambos lados (direcciones 5’ y 3’) por segmentos de ala que tienen modificaciones en 2’. Las alas están compuestas por nucleótidos 2’-metoxietilo (2’-MOE). Los enlaces internucleosídicos (esqueleto) son fosforotioato (P=S) a lo largo del oligonucleótido. Todos los residuos de citidina son 5-metilcitidinas.

Tabla 11. Compuestos antisentido cortos dirigidos a ácido nucleico de SGLT2

Nº ISIS

Sitio diana en 5’ (rata) SEC ID diana (rata) Motivo gápmero Secuencia (5’-3’) SEC ID Nº

379692

508 1-10-1 MOE TGTTCCAGCCCA 246

388625

508 1-10-1 MOE TGTRCCAGCCCA 246

379699

1112 1-10-1 MOE GGCATGAGCTTC 281

388626

1112 2-8-2 MOE GGCATGAGCTTC 281

379702

1525 2-8-2 MOE GCACACAGCTGC 293

388627

1525 2-8-2 MOE GCACACAGCTGC 293

Los compuestos antisentido cortos se analizaron según su efecto sobre los niveles de ARNm de SGLT2 de ratón in vivo. Los datos se tomaron de tres experimentos en los que a ratones macho Balb/c de 6 semanas de edad se

5 administraron las dosis dos veces a la semana durante tres semanas con 0,5, 0,1 o 0,02 umol/kg del gápmero 1-101 o 2-8-2 MOE administrado por inyección intraperitoneal. Se sacrificó a los ratones 48 horas tras la última administración y se evaluaron los niveles de SGLT2 en riñones. Los niveles diana se determinaron mediante PCR en tiempo real con TI tal como se ha descrito en otros ejemplos en el presente documento. Los resultados de la PCR se normalizaron según un control interno ISIS. Los resultados se muestran a continuación en la Tabla 12.

10 Tabla 12: Inhibición antisentido del ARNm de SGLT2 in vivo por los gápmeros 1-10-1 y 2-8-2 MOE

% Cambio en la expresión de SGLT2 respecto a la solución salina

Dosis de oligonucleótido umol/kg

ISIS 379692 1-10-1 ISIS 388625 2-8-2 ISIS 379699 1-10-1 ISIS 388626 2-8-2 ISIS 379702 1-10-1 ISIS 388627 2-8-2

0,5

-85 -90 -75 -80 -70 -65

0,1

-75 -88 -60 -60 -65 -50

0,02

-55 -65 -30 -45 -40 -38

Estos resultados ilustran que ambos gápmeros, 1-10-1 y 2-8-2, inhiben la expresión de SGLT2 in vivo de un modo dependiente de la dosis.

En los ratones se evaluó después el peso corporal total, el peso del hígado, del bazo y del riñón. Todos los cambios

15 estaban dentro del margen de error del experimento. No se observaron cambios significativos en el peso corporal durante el tratamiento o al final del estudio. Tampoco se observaron cambios significativos en el peso del hígado ni del bazo.

Los niveles de ALT, AST, BUN, transaminasas, creatinina en plasma, glucosa y triglicéridos se midieron en ratones tratados con los compuestos antisentido cortos. Los niveles de indicadores clínicos de rutina de lesión y

20 enfermedad hepática y renal estaban dentro de los intervalos normales y no cambiaron significativamente respecto a los animales tratados con solución salina, lo que demuestra que los compuestos antisentido cortos no afectan de forma significativa a la función renal o hepática. Los niveles de triglicéridos y glucosa no se elevaron significativamente con respecto a los animales tratados con solución salina.

Evaluación del gápmero ISIS 3796921 1-10-1 MOE, el gápmero ISIS 392170-10 Metilenoxi BNA, el gápmero ISIS 25 388625 2-8-2 MOE y el gápmero ISIS 392173 2-8-2 Metilenoxi BNA en ratones

El efecto del gápmero ISIS 379692 1-10-1 MOE y el gápmero ISIS 388625 2-8-2 MOE se comparan con el efecto del gápmero ISIS 392170 1-10-1 Metilenoxi BNA y del gápmero ISIS 392173 2-8-2 etilenoxi BNA (véase la Tabla 13) sobre los niveles de ARNm de SGLT2 de ratón in vivo. Los datos se toman de tres experimentos en los que a ratones macho Balb/c de 6 semanas de edad se administraron las dosis dos veces a la semana durante tres 30 semanas con 5, 25 y 125 mmol/kg del gápmero ISIS 379692 1-10-1 MOE o del gápmero ISIS 388625 2-8-2 MOE administrado por inyección intraperitoneal. Se sacrificó a los ratones 48 horas después de la última administración y

5

10

15

20

25

30

35

se evaluaron los niveles de ARNm de SGLT2 en los riñones. Los niveles diana se determinaron mediante PCR en tiempo real con TI tal como se ha descrito en otros ejemplos en el presente documento. Los resultados de la PCR se normalizaron según un control interno ISIS. Los datos se expresan en forma de cambio porcentual ("+" indica un incremento, "-" indica una disminución) respecto a los animales tratados con solución salina y se ilustran en la Tabla

13.

Tabla 13. Inhibición antisentido del ARNm de SGLT2 in vivo por los gápmeros 1-10-1 y 2-8-2 MOE

Dosis de oligonucleótido nmol/kg

ISIS 379692 1-10-1 MOE ISIS 392170 1-10-1 Metilenoxi BNA ISIS 388625 2-8-2 MOE ISIS 392173 2-8-2 Metilenoxi BNA

125

-58 -69 -70 -75

25

-46 -54 -47 -57

5

-7 -23 -18 -44

Estos resultados ilustran que ambos gápmeros, 1-10-1 y 2-8-2, inhiben la expresión de SGLT2 in vivo a los tres intervalos de dosificación más altos de un modo dependiente de la dosis. Los resultados también ilustran que los constructos de metilenoxi BNA son más potentes que los constructos MOE. No se observaron cambios significativos en el peso corporal durante el tratamiento o al final del estudio. Tampoco se observaron cambios significativos en el peso del hígado ni del bazo. Los parámetros de toxicidad, incluidos los niveles de ALT, AST, BUN y creatinina, estaban dentro de los intervalos normales y no cambiaron significativamente respecto a los animales tratados con solución salina, lo que demuestra que los compuestos no afectan de forma significativa a la función renal o hepática.

Evaluación del gápmero ISIS 379692-10-1 MOE y el gápmero ISIS 388625-8-2 MOE en ratas

El efecto del gápmero ISIS 379692 1-10-1 MOE y del gápmero ISIS 388625 MOE 2-8-2 (véase la Tabla 14) sobre los niveles de ARNm de SGLT2 de rata in vivo. Los datos se toman de cuatro experimentos en los que a ratas macho Sprague-Dawley (170-200 g) se administraron las dosis dos veces a la semana durante tres semanas con 200, 50, 12,5 o 3,125 nmol/kg del gápmero ISIS 379692 1-10-1 MOE o del gápmero ISIS 388625 2-8-2 MOE administrado por inyección intraperitoneal. Se sacrificó a las ratas 48 horas tras la última administración y se evaluaron los niveles de SGLT2 en riñones. Los niveles diana se determinaron mediante PCR en tiempo real con TI tal como se ha descrito en otros ejemplos en el presente documento. Los resultados de la PCR se normalizaron según un control interno ISIS. Los resultados se muestran a continuación en la Tabla 14.

Tabla 14: Inhibición antisentido del ARNm de SGLT2 in vivo por los gápmeros 1-10-1 y 2-8-2 MOE

% Cambio en la expresión de SGLT2 respecto a la solución salina

Dosis de oligonucleótido umol/kg

ISIS 379692 1-10-1 ISIS 388625 2-8-2

200

-80 -80

50

-65 -65

12,5

-15 -15

3,125

30 25

Estos resultados ilustran que ambos gápmeros, 1-10-1 y 2-8-2, inhiben la expresión de SGLT2 in vivo a los tres intervalos de dosificación más altos de un modo dependiente de la dosis.

En las ratas se evaluó después el peso corporal total, el peso del hígado, del bazo y del riñón. Todos los cambios estaban dentro del margen de error del experimento. No se observaron cambios significativos en el peso corporal durante el tratamiento o al final del estudio. Tampoco se observaron cambios significativos en el peso del hígado ni del bazo.

Los niveles de ALT, AST, BUN, colesterol, creatinina en plasma y triglicéridos se midieron en ratas tratadas con los compuestos antisentido cortos. Los niveles de indicadores clínicos de rutina de lesión y enfermedad hepática y renal estaban dentro de los intervalos normales y no cambiaron significativamente respecto a los animales tratados con solución salina, lo que demuestra que los compuestos antisentido cortos no afectan de forma significativa a la función renal o hepática.

Ejemplo 10: Inhibición antisentido de la expresión de SGLT2 en ratas ZDF

Se analizó el efecto de ISIS 388625, 388626 y el oligo control ISIS 388628 sobre los niveles de glucosa en plasma

5 en ratas ZDF y de HbA1c. La rata diabética gras Zucker (ZDF) deficiente en leptina es un modelo útil para la investigación de la diabetes de tipo 2. La diabetes se desarrolla espontáneamente en estas ratas macho a las 8-10 semanas de edad y se asocia con hiperfagia, poliuria, polidipsia y alteración de la ganancia de peso, síntomas que aparecen en paralelo a los síntomas clínicos de la diabetes (Phillips MS, y col., 1996, Nat Genet 13, 18-19). En ratas ZDF de seis semanas de edad se inyectó por vía intraperitoneal el compuesto antisentido corto a una dosis de

10 40 OnM/kg una vez a la semana durante doce semanas. Los datos se ilustran en las tablas 15 y 16.

Tabla 15: Glucosa en plasma

Nº ISIS

SEC ID Nº Secuencia (5’-3’) Motivo Niveles de glucosa en plasma registrados en fechas específicas (mg/dl)

Día 10

Día 40 Día 55 Día 66

PBS

n/a n/a 450,7 478,5 392,8 526,2

388625

246 TGTTCCAGCCCA 2-8-2 MOE 435,5 278,7 213,8 325,5

388626

281 GGCATGAGCTTC 2-8-2 MOE 434,7 300,5 219,8 379,8

388628

226 TAGCCGCCCACA 2-8-2 MOE 436 502 411,2 668,8

Tabla 16: Estado HbA1c

Nº ISIS

SEC ID Nº Secuencia (5’-3’) Motivo Porcentaje de HbA1c en fechas específicas (%) p <0,001

Día 40

Día 55 Día 68

PBS

n/a n/a 8 8,9 10

388625

246 TGTTCCAGCCCA 2-8-2 MOE 6,5 5,8 4,3

388626

281 GGCATGAGCTTC 2-8-2 MOE 6,6 5,9 4

388628

226 TAGCCGCCCACA 2-8-2 MOE 8 9,1 7,8

15 ISIS 388625 and 388626 redujeron de forma significativa los niveles de glucosa en plasma y HbAIC en comparación con los animales tratados con PBS y control.

Ejemplo 11: Inhibición antisentido de la expresión de SGLT2 en riñón de perro (ISIS 388625)

ISIS 388625 es un gápmero 2-8-2 MOE con la secuencia TGTTCCAGCCCA (SEC ID Nº 246) (p. ej., véase la Tabla

15). El efecto de ISIS 388625 sobre los niveles de ARNm de SGLT2 de perro. Los datos se toman de dos grupos de 20 dosificación en los que un total de nueve perros sabueso macho recibieron dosis con uno o diez mg/kg/semana de

ISIS 388625 o solución salina administrados mediante inyección subcutánea dos veces a la semana. El día 46 del

estudio se sacrificó a todos los perros y se evaluaron los niveles de SGLT2 en riñones. Los niveles diana se

determinaron mediante PCR cuantitativa en tiempo real con TI tal como se ha descrito en otros ejemplos en el

presente documento. Los resultados de la PCR se normalizaron según un control interno ISIS. Los resultados se 25 muestran a continuación en la Tabla 17.

Tabla 17: Inhibición antisentido del ARNm de SGLT2 in vivo por ISIS 388625

% Cambio en la expresión de SGLT2 respecto a la solución salina

Dosis de oligonucleótido mg/kg/semana

ISIS 388625

1

-85

10

-95

Estos resultados ilustran que se puede conseguir una reducción superior al 80% del ARNm de SGLT2 a una dosis de 1 mg/kg/semana de ISIS 388625. Se puede alcanzar una reducción incluso mayor a dosis ligeramente mayores.

5 También se mostró que la administración de ISIS 388625 mejoraba la tolerancia a la glucosa. Los niveles máximos de glucosa en plasma disminuyeron en más del 50% de media y el posterior descenso de la glucosa se redujo en comparación con los controles salinos en una prueba convencional de tolerancia a la glucosa. También aumento la excreción de glucosa en orina.

Ejemplo 12: Análisis in vivo de los compuestos antisentido cortos dirigidos al ácido nucleico SGLT2

10 Se diseñaron veinte gápmeros 1-10-1 MOE complementarios a SGLT2 humano/de mono/de ratón/de rata, se sintetizaron y se analizaron in vivo para determinar la supresión de los niveles de ARNm de SGLT2 en riñón. Los sitios diana para ratón y rata se indican en la Tabla 18. Los sitios diana para seres humano se indican en las Tablas 1 y 2. Los datos son las medias de dos experimentos en los que ratones Baln7c macho de 6 semanas de edad recibieron inyecciones intraperitoneales de 350 nmol/kg de oligonucleótido, dos veces a la semana, durante un

15 periodo de dos semanas (un total de cuatro inyecciones). Se sacrificó a los ratones 48 horas después de la última administración y se evaluaron los niveles de ARNm de SGLT2 en los riñones. Los niveles de ARNm de SGLT2 se determinaron mediante análisis PCR cuantitativa en tiempo real de acuerdo con procedimientos estándar, usando dos grupos de cebador-sonda para PCR diferentes, el grupo cebador-sonda (PPS) 534 y PPS 553. Los niveles de ARNm de SGLT2 se normalizaron a niveles de ARNm de ciclofilina, que también se midieron mediante PCR

20 cuantitativa en tiempo real. Los resultados se muestran a continuación en la Tabla 18.

Tabla 18: Inhibición antisentido de SGLT2 in vivo

Nº ISIS

Sitio diana en 5’ en la SEC ID Nº XXX (ratón) Sitio diana en 5’ en la SEC ID Nº XXX (rata) Secuencia (5’-3’) Motivo PPS 534 % S. salina PPS 553 % S. salina SEC ID Nº

PBS

N/A -- --

370717

2684 152 TAGCCACCAACT 1-10-1 MOE -84,4 -84,3 1554

379684

2070 64 TGTCAGCAGGAT 1-10-1 MOE -45,0 -43,2 214

379685

2103 97 TGACCAGCAGGA 1-10-1 MOE -10,3 -20,5 219

379686

2121* 115 ACCACAAGCCAA 1-10-1 MOE -71,9 -75,1 225

379687

2824 216 GATGTTGCTGGC 1-10-1 MOE -47,1 -52,1 230

379688

2876 268 CCAAGCCACTTG 1-10-1 MOE -62,6 -70,4 240

379689

298 AGAGCGCATTCC 1-10-1 MOE -17,5 -30,4 241

379690

415 ACAGGTAGAGGC 1-10-1 MOE -18,9 -22,5 242

379691

454 AGATCTTGGTGA 1-10-1 MOE -35,4 -48,6 243

379692

508 TGTTCCAGCCCA 1-10-1 -88,1 -88,5 246

(continuación)

Nº ISIS

Sitio diana en 5’ en la SEC ID Nº XXX (ratón) Sitio diana en 5’ en la SEC ID Nº XXX (rata) Secuencia (5’-3’) Motivo PPS 534 % S. salina PPS 553 % S. salina SEC ID Nº

379693

546 CATGGTGATGCC 1-10-1 -51,6 -59,9 254

379694

609 GACGAAGGTCTG 1-10-1 -42,1 -54,4 264

379695

717 GGACACCGTCAG 1-10-1 -52,5 -64,1 266

379696

954 CAGCTTCAGGTA 1-10-1 -24,6 -36,2 267

379697

982 CTGGCATGACCA 1-10-1 -32,0 -46,3 272

379698

1071 GCAGCCCACCTC 1-10-1 -11,8 -27,0 275

379699

1112 GGCATGAGCTTC 1-10-1 -83,5 -85,8 281

379700

1138 CCAGCATGAGTC 1-10-1 -2,8 -16,4 285

379701

1210 CCATGGTGAAGA 1-10-1 -0,3 -11,9 288

379702

1525 GCACACAGCTGC 1-10-1 -87,8 -89,5 293

379703

1681 GCCGGAGACTGA 1-10-1 -44,2 -45,9 295

*indica 1 o 2 apareamientos erróneos con una secuencia diana

LISTADO DE SECUENCIAS <110>Isis Pharmaceuticals, Inc. Sanjay Bhanot

5 Richard S. Geary Robert McKay Brett P. Monia Punit P. Seth Andrew M. Siwkowski

10 Eric E. Swayze Edward Wancewitz

<120> COMPUESTOS Y PROCEDIMIENTOS PARA MODULAR LA EXPRESIÓN DE SGLT2

<130> CORE0061WO9

<150> PCT/US2007/061183 15 <151> 2007-01-27

<150> 60/746,631

<151> 2006-05-05

<150> 60/747,059

<151> 2006-05-11

<150> 60/805,660

<151> 2006-06-23

<150> 60/864,554

<151> 2006-11-06 5 <160> 1576

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1 <211>14121

<212> ADN 10 <213> H. sapiens

<400> 1

imagen1

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<210> 2

<211> 13928

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 2

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imagen3

<210> 3

<211> 2273

<212> ADN

<400> 3

imagen3

<210> 4

<211> 3636

<212> ADN

<400> 4

imagen3

<210> 5

<211> 874

<212> ADN

<400> 5

imagen1

<210> 6

<211> 1631

<212> ADN

imagen4

<210> 7

<211> 1898 15 <212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 7

imagen3

<210> 8

<211> 106000

<212> ADN

<400> 8

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<210> 9

<211> 2034

<212> ADN

<400> 9

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<210> 10

<211> 2439

<212> ADN

<400> 10

imagen3

5 <210> 11

<211> 3318

<212> ADN

<213>

H. sapiens

10 <400> 11

imagen3

<210> 12

<211> 78001

<212> ADN

<400> 12

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<210> 13

<211> 2160

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 13

imagen3

<210> 14

<211> 5572

<212> ADN

<400> 14

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imagen3

<210> 15

<211> 103886

<212> ADN

<400> 15

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<210> 16

<211> 16 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético 10 <400> 16 ccggaggtgc tt gaat

<210> 17

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 17 cggaggtgct tgaa

<210> 18

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 18 gaagccatac acctct

<210> 19

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 19 aagccataca cctc

<210> 20

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 20 gttgaagcca tacacc

<210> 21

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 21 ttgaagccat acac

<210> 22

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

16

14

16

14

16

14

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 22 cctcagggtt gaagcc

<210> 23

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 23 ctcagggttg aagc

<210> 24

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 24 tttgccctca gggttg

<210> 25

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 25 ttgccctcag ggtt

<210> 26

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 26 agttcttggt tttctt

<210> 27

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 27 gttcttggtt ttct

16

14

16

14

16

14

<210> 28

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 28 cctcttgatg ttcagg

<210> 29

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 29 ctcttgatgt tcag

<210> 30

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 30 atgcccctct tgatgt

<210> 31

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 31 tgcccctctt gatg

<210> 32

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 32 tgccacattg ccct

<210> 33

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

16

14

16

14

14

<400> 33 ttgccacatt gccc

<210> 34

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 34 gttgccacat tgcc

<210> 35

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 35 tgttgccaca ttgc

<210> 36

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 36 ctgttgccac attg

<210> 37

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 37 tctgttgcca catt

<210> 38

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 38 ttctgttgcc acat

<210> 39

<211> 14

<212> ADN

14

14

14

14

14

14

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 39 tttctgttgc caca

<210> 40

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 40 atttctgttg ccac

<210> 41

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 41 gtaggagaaa ggcagg

<210> 42

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 42 taggagaaag gcag

<210> 43

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 43 ggcttgtaaa gtgatg

<210> 44

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 44 gcttgtaaag tgat

14

14

16

14

16

14

<210> 45

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 45 ccactggagg atgtga

<210> 46

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 46 cactggagga tgtg

<210> 47

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 47 tttcagcatg ctttct

<210> 48

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 48 ttcagcatgc tttc

<210> 49

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 49 catatttgtc acaaac

<210> 50

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

16

14

16

14

16

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 50 atatttgtca caaa

<210> 51

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 51 atgcccatat ttgtca

<210> 52

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 52 tgcccatatt tgtc

<210> 53

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 53 ttttggtggt agagac

<210> 54

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 54 tttggtggta gaga

<210> 55

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 55 tctgcttcgc acct

<210> 56

<211> 14

14

16

14

16

14

14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 56 gtctgcttcg cacc

<210> 57

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 57 agtctgcttc gcac

<210> 58

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 58 cagtctgctt cgca

<210> 59

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 59 tcagtctgct tcgc

<210> 60

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 60 ctcagtctgc ttcg

<210> 61

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 61

14

14

14

14

14

cctcagtctg cttc

<210> 62

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 62 gcctcagtct gctt

<210> 63

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 63 agcctcagtc tgct

<210> 64

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 64 aactctgagg attgtt

<210> 65

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 65 actctgagga ttgt

<210> 66

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 66 tcattaactc tgagga

<210> 67

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

14

14

14

16

14

16

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 67 cattaactct gagg

<210> 68

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 68 attcatcatt aactct

<210> 69

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 69 ttcatcatta actc

<210> 70

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 70 ttgttctgaa tgtcca

<210> 71

<211> 4

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 71 actg

<210> 72

<211> 4

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 72 actg

<210> 73

14

16

14

16

4

4

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 73 tgttctgaat gtcc

<210> 74

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 74 cagatgagtc catttg

<210> 75

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 75 agatgagtcc attt

<210> 76

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 76 atccacaggg aaattg

<210> 77

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 77 tccacaggga aatt

<210> 78

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

14

16

14

16

14

<400> 78 cagttgtaca agttgc

<210> 79

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 79 agttgtacaa gttg

<210> 80

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 80 cacagagtca gccttc

<210> 81

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 81 acagagtcag cctt

<210> 82

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 82 ggtcaaccac agagtc c

<210> 83

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 83 gtcaaccaca gagt

<210> 84

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

16

14

16

14

16

14

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 84 cagccacatg cagc

<210> 85

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 85 ccagccacat gcag

<210> 86

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 86 accagccaca tgca

<210> 87

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 87 taccagccac atgc

<210> 88

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 88 ttaccagcca catg

<210> 89

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 89 gttaccagcc acat

14

14

14

14

14

14

<210> 90

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 90 ggttaccagc caca

<210> 91

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 91 aggttaccag ccac

<210> 92

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 92 taggttacca gcca

<210> 93

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 93 aggttctgct ttcaac

<210> 94

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 94 ggttctgctt tcaa

<210> 95

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

14

14

14

16

14

<400> 95 tactgatcaa attgta

<210> 96

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 96 actgatcaaa ttgt

<210> 97

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 97 tttttcttgt atctgg

<210> 98

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 98 ttttcttgta tctg

<210> 99

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 99 atccattaaa acctgg

<210> 100

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 100 tccattaaaa cctg

<210> 101

<211> 16

<212> ADN

16

14

16

14

16

14

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 101 atattgctct gcaaag

<210> 102

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 102 tattgctctg caaa

<210> 103

<211> 4

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 103 actg

<210> 104

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 104 atattgctct gcaa

<210> 105

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 105 aatattgctc tgca

<210> 106

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 106 gaatattgct ctgc

16

14

4

14

14

14

<210> 107

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 107 agaatattgc tctg

<210> 108

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 108 tagaatattg ctct

<210> 109

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 109 atagaatatt gctc

<210> 110

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 110 gatagaatat tgct

<210> 111

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 111 ggatagaata ttgc

<210> 112

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

14

14

14

14

14

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 112 atggaatcct caaatc

<210> 113

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 113 tggaatcctc aaat

<210> 114

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 114 gaattctggt atgtga

<210> 115

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 115 aattctggta tgtg

<210> 116

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 116 agctggaatt ctggta

<210> 117

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 117 gctggaattc tggt

<210> 118

<211> 16

16

14

16

14

16

14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 118 tgaaaatcaa aattga

<210> 119

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 119 gaaaatcaaa attg

<210> 120

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 120 aaacagtgca tagtta

<210> 121

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 121 aacagtgcat agtt

<210> 122

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 122 ttcaggaatt gttaaa

<210> 123

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 123

16

14

16

14

16

tcaggaattg ttaa

<210> 124

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 124 ttttgtttca ttatag

<210> 125

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 125 tttgtttcat tata

<210> 126

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 126 gatgacactt gattta

<210> 127

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 127 atgacacttg attt

<210> 128

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 128 gtgtgatgac acttga

<210> 129

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

14

16

14

16

14

16

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 129 tgtgatgaca cttg

<210> 130

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 130 tattcagtgt gatgac

<210> 131

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 131 attcagtgtg atga

<210> 132

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 132 attggtattc agtgtg

<210> 133

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 133 ttggtattca gtgt

<210> 134

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 134 cctctagctg taag

<210> 135

14

16

14

16

14

14

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 135 ccctctagct gtaa

<210> 136

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 136 gccctctagc tgta

<210> 137

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 137 ggccctctag ctgt

<210> 138

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 138 aggccctcta gctg

<210> 139

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 139 gaggccctct agct

<210> 140

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

14

14

14

14

14

<400> 140 agaggccctc tagc

<210> 141

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 141 aagaggccct ctag

<210> 142

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 142 aaagaggccc tcta

<210> 143

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 143 gaatggacag gtcaat

<210> 144

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 144 aatggacagg tcaa

<210> 145

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 145 gttttgaatg gacagg

<210> 146

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

14

14

14

16

14

16

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 146 ttttgaatgg acag

<210> 147

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 147 tggtagtttt gaatgg

<210> 148

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 148 ggtagttttg aatg

<210> 149

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 149 tcactgtatg gttt

<210> 150

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 150 ctcactgtat ggtt

<210> 151

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 151 gctcactgta tggt

14

16

14

14

14

14

<210> 152

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 152 ggctcactgt atgg

<210> 153

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 153 tggctcactg tatg

<210> 154

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 154 ctggctcact gtat

<210> 155

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 155 gctggctcac tgta

<210> 156

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 156 ggctggctca ctgt

<210> 157

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

14

14

14

14

14

<400> 157 aggctggctc actg

<210> 158

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 158 caggtccagt tcat

<210> 159

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 159 gcaggtccag ttca

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<400> 160 tgcaggtcca gttc

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<400> 161 gtgcaggtcc agtt

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 162 ggtgcaggtc cagt

<210> 163

<211> 14

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14

14

14

14

14

14

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<210> 164

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<400> 164 ttggtgcagg tcca

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<400> 166 ctttggtgca ggtc

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<400> 167 taactcagat cctg

<210> 168

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<400> 168 ataactcaga tcct

14

14

14

14

14

14

<210> 169

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 170 aaataactca gatc

<210> 171

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 171 aaaataactc agat

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<400> 172 caaaataact caga

<210> 173

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<400> 173 gcaaaataac tcag

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

14

14

14

14

14

<223> Oligonucleótido Sintético

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<213> Secuencia Artificial

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<213> Secuencia Artificial

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14

14

14

16

14

16

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<220>

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<213> Secuencia Artificial

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14

14

16

14

16

ccagtattaa tttt

<210> 186

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<220>

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14

16

14

14

16

14

<220>

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<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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4

4

4

4

4

4

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 197 actg

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<211> 4

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<211> 4

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<211> 14

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<210> 201

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<210> 202

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético 4

4

4

14

16

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<210> 203

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 203 gcccagttcc atgacc

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<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 204 cccagttcca tgac

<210> 205

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 205 ttgaggaagc cagatt

<210> 206

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 206 tgaggaagcc agat

<210> 207

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 207 tggatgcagt aatctc

<210> 208

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

14

16

14

16

14

16

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 208 ggatgcagta atct

<210> 209

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 209 tataaagtcc agcatt

<210> 210

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 210 ataaagtcca gcat

<210> 211

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 211 aagttcctgc ttgaag

<210> 212

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 212 agttcctgct tgaa

<210> 213

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 213 aatggtgaag tact

14

16

14

16

14

14

<210> 214

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 214 tgtcagcagg at

<210> 215

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 215 cagcaggaaa ta

<210> 216

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 216 ccagcaggaa at

<210> 217

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 217 accagcagga aa

<210> 218

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 218 gaccagcagg aa

<210> 219

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

12

12

12

12

12

<400> 219 tgaccagcag ga

<210> 220

<211> 4

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 220 actg

<210> 221

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 221 atgaccagca gg

<210> 222

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 222 aatgaccagc ag

<210> 223

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 223 caatgaccag ca

<210> 224

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 224 ccaatgacca gc

<210> 225

<211> 12

<212> ADN

12

4

12

12

12

12

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 225 accacaagcc aa

<210> 226

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 226 tagccgccca ca

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<211> 4

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 227 actg

<210> 228

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 228 ccggccacca ca

<210> 229

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 229 accggccacc ac

<210> 230

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 230 gatgttgctg gc

12

12

4

12

12

12

<210> 231

<211> 4

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 231 actg

<210> 232

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 232 cgatgttgct gg

<210> 233

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 233 ccgatgttgc tg

<210> 234

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 234 gccgatgttg ct

<210> 235

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 235 tgccgatgtt gc

<210> 236

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 4

12

12

12

12

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 236 ctgccgatgt tg

<210> 237

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 237 caggcccaca aa

<210> 238

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 238 ccaggcccac aa

<210> 239

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 239 gccaggccca ca

<210> 240

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 240 ccaagccact tg

<210> 241

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 241 agagcgcatt cc

<210> 242

<211> 12

12

12

12

12

12

12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 242 acaggtagag gc

<210> 243

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 243 agatcttggt ga

<210> 244

<211> 4

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 244 actg

<210> 245

<211> 13

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 245 tgttccagcc cag

<210> 246

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 246 tgttccagcc ca

<210> 247

<211> 4

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 247

12

12

4

13

12

actg

<210> 248

<211> 4

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 248 actg

<210> 249

<211> 4

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 249 actg

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<211> 4

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 250 actg

<210> 251

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 251 atgttccagc cc

<210> 252

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 252 tggtgatgcc ca

<210> 253

<211> 12

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<213> Secuencia Artificial

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14

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14

14

14

14

14

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14

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14

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14

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14

14

14

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14

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<400> 455 agaactcaca tctg

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

14

14

14

4

4

14

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<210> 458

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 458 ataatggcat cccg

<210> 459

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<220>

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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14

14

14

4

14

14

<210> 462

<211> 14

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<210> 464

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<400> 464 actg

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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14

4

4

4

14

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 468 actg

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<211> 4

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<210> 471

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<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<211> 4

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14

4

4

4

4 14

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<210> 474

<211> 14

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<220>

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<220>

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<400> 475 actg

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<400> 476 actg

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<220>

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4

14

4

4

4

4

<210> 479

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<220>

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<220>

4

4

4

4

4

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16

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14

14

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14

14

14

14

14

caggagatgt tggc

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<220>

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14

14

14

14

14

14

<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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14

14

14

14

14

14

<211> 14

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<211> 14

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 508 cggtgttgca cttt

<210> 509

<211> 14

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 510 agcggtgttg cact

<210> 511

<211> 14

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

14

14

14

14

14

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<210> 513

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<211> 14

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<210> 517

<211> 14

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<220>

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<211> 14

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14

14

14

14

14

14

<220>

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<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<210> 521

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<220>

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<220>

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<220>

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4

14

14

14

14

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<400> 524 tggaagctgc tgta

<210> 525

<211> 14

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<211> 14

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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14

14

14

14

14

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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14

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14

14

14

14

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<223> Oligonucleótido Sintético

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14

14

14

14

14

<223> Oligonucleótido Sintético

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<220>

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14

14

14

14

14

14

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<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 552 ttgcatgaac accg

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<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 554 tattgcatga acac

<210> 555

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 555 atattgcatg aaca

<210> 556

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 556 catattgcat gaac

<210> 557

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 557

14

14

14

14

14

aggttgtgca ggta

<210> 558

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 558 caggttgtgc aggt

<210> 559

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 559 gcaggttgtg cagg

<210> 560

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 560 agcaggttgt gcag

<210> 561

<211> 14

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<210> 562

<211> 14

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

14

14

14

14

14

14

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 564 gcccagcagg ttgt

<210> 565

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 565 ggcccagcag gttg

<210> 566

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 566 aggcccagca ggtt

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<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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14

14

14

14

16

14

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<211> 14

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

16

14

16

14

14

<400> 574 ggagcgcagg gtgc

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<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 575 tgcacctcct tgtt

<210> 576

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<210> 577

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<400> 578 atctggcaga ggtt

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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14

14

14

16

14 16

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 580 ggccagcagg agta

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 583 gtggtgacat tggtca

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<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<400> 584 ggtgacattg gtca

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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14

16

14

16

14

4

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<211> 4

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<211> 14

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<210> 588

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 588 atgttggcag tggt

<210> 589

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 589 aggaaatgtt ggcagt

<210> 590

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 590 gaaatgttgg cagt

<210> 591

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético 4

14

14

16

14

<400> 591 caggaaatgt tggc

<210> 592

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<400> 592 gggcaggaaa tgtt

<210> 593

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<400> 595 ctttgtggca ccaa

<210> 596

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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14

14

14

14

14

14

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 598 gctgcacttt gtgg

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<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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14

14

14

14

14

14

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 606 cacacctctt gaac

<210> 607

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

16

14

14

14

14

<223> Oligonucleótido Sintético

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<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 609 tctggacctc gatc

<210> 610

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 610 ctgctataca tcttgg

<210> 611

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<400> 611 gctatacatc ttgg

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<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 612 cacggtgtac atcacc

<210> 613

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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16

14

16

14

16

14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 614 ggacagactg tagccc

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<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<211> 16

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<220>

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<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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16

14

16

14

16

acactgaggt catc

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 620 cgccccgtca ctga

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<212> ADN

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<220>

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<220>

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14

14

16

14

16

14

<220>

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<220>

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<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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16

14

16

14

16

14

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<210> 634

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 634 atccaccaga atcc

<210> 635

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

16

14

16

14

14

<400> 636 ggacaaagat gaaaaa

<210> 637

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<210> 638

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<210> 641

<211> 14

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<210> 642

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16

14

16

14

16

14

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<210> 643

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<210> 644

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 644 cagtcacaaa ggca

<210> 645

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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14

14

14

14

14

14

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<220>

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<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<211> 4

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

14

4

4

4

4 <400> 653 actg

<210> 654

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 655 actg

<210> 656

<211> 4

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 656 actg

<210> 657

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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4

14

4

4

14

14

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<220>

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<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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14

14

16

14

14

14

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<213> Secuencia Artificial

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14

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14

14

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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16

14

16

14

16

atgagggtct tcat

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 686 aggaccccgg agta

<210> 687

<211> 14

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<213> Secuencia Artificial

14

14

12

16

16

14

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<220>

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<220>

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14

12

12

16

14

12

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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14

12

16

16

14

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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12

16

14

16

14

<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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16

14

16

14

16

14

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<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<210> 711

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<220>

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<213> Secuencia Artificial

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<212> ADN

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<220>

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<220>

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<212> ADN

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<220>

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16

14

16

16

14

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16

14

12

16

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16

14

16

14

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<220>

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<220>

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14

14

12

16

14

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<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 735 gacagggcag at

<210> 736

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 736 tgacagggca ga

<210> 737

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16

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12

12

12

12

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<210> 739

<211> 14

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 739 ccaggcatgg agct

<210> 740

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 740 ccaggcatgg ag

<210> 741

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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16

14

12

12

16

ttccgcaggg tgac

<210> 744

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 744 gcggttccgc agggtg

<210> 745

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<220>

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14

16

14

16

14

16

<220>

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 752 ttctggaccc atcggc

<210> 753

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 753 ggacccatcg gc

<210> 754

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 754 tctggaccca tcgg

<210> 755

14

16

14

16

12

14

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 755 caccagcccc caggtg

<210> 756

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 756 accagccccc aggt

<210> 757

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<210> 758

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 758 agggcaccag cccc

<210> 759

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 759 tggagtaggg caccag

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<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

16

14

16

14

16

<400> 760 ggagtagggc acca

<210> 761

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 761 cttggagtag gg

<210> 762

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<400> 762 tgatgggctt ggagta

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<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 763 gatgggcttg gagt

<210> 764

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 764 tgtggtacag gtcgat

<210> 765

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 765 gtggtacagg tcga

<210> 766

<211> 12

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<213> Secuencia Artificial

14

12

16

14

16

14

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 766 ggtacaggtc ga

<210> 767

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<400> 768 gtgtggtaca ggtc

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<400> 770 atggtgtggt acag

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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12

16

14

16

14

16

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<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<220>

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<220>

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<220>

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<400> 776 agcttcacca gg

<210> 777

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<213> Secuencia Artificial

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14

16

14

12

12

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<220>

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<220>

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<220>

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14

16

16

16

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<210> 788

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<220>

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14

14

14

16

14

16

<210> 789

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<220>

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<220>

16

14

16

14

16

<223> Oligonucleótido Sintético

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<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<220>

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14

16

14

16

14

16

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14

16

14

16

14

tacagaaggc acccag

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<220>

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14

16

14

14

16

<220>

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<211> 16

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<220>

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14

16

14

16

14

14

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<220>

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<220>

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<220>

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<210> 820

<211> 14

<212> ADN

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<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<210> 821

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<220>

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16

14

16

14

16

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<220>

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<211> 14

<212> ADN

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<220>

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<210> 825

<211> 16

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<220>

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<220>

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<210> 827

<211> 16

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<220>

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<210> 828

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4 16

14

16

14 16

<220>

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<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<210> 831

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<220>

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<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<210> 833

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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14

12

12

14

12

12

<210> 834

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<210> 835

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<220>

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<210> 836

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<210> 837

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<210> 838

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<210> 839

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

12

12

12

12

12

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 840 caatttaatc cg

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<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<210> 842

<211> 12

<212> ADN

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<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 842 cactgatcct gc

<210> 843

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 843 cagccttgtc ga

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<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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12

12

12

12

12

12

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<210> 846

<211> 12

<212> ADN

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<220>

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<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 847 ccagttccca gc

<210> 848

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 848 cccagccttg tc

<210> 849

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 849 cccagttccc ag

<210> 850

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 850 ccgcccagtt cc

12

12

12

12

12

12

<210> 851

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 851 cctgcactga cg

<210> 852

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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12

12

12

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14

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<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<210> 952

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

14

14

14

12

12

12

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 952 gttccctttg cagg

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<210> 954

<211> 14

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<210> 955

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<210> 956

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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14

14

14

12

12

14

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<213> Secuencia Artificial

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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14

14

14

12

14

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 968 gttcttagga ag

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12

12

12

14

12

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<400> 972 ttgttcttag gaag

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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12

14

12

14

12

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<213> Secuencia Artificial

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12

14

12

12

14

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14

12

14

12

12

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<220>

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12

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12

attcttaaca caga

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<220>

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<220>

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<220>

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12

12

12

14

12

<220>

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<220>

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<220>

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<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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12

12

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12

12

12

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<210> 1004

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<400> 1006 gctccttcca ct

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<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<210> 1008

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

14

12

12

12

14

<400> 1008 tcggactttg aa

<210> 1009

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1009 tcggactttg aaaa

<210> 1010

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<210> 1011

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<210> 1012

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<211> 12

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<210> 1014

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

12

14

14

14

12

12

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<211> 14

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<211> 12

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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12

14

12

14

12

14

<210> 1020

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1020 ccttccactg atcctg

<210> 1021

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1021 ctccttccac tg

<210> 1022

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1022 tgcagccatg tact

<210> 1023

<211> 12

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<210> 1024

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<210> 1025

<211> 14

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

16

12

14

12

14

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<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1026 tccactgatc ct

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<400> 1028 tccttccact gatcct

<210> 1029

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1029 ttccactgat cc

<210> 1030

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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14

12

14

16

12

16

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1031 tccttccact gatc

<210> 1032

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1032 gctccttcca ctgatc

<210> 1033

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1033 gctccttcca ctga

<210> 1034

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1034 aagctccttc cactga

<210> 1035

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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14

16

14

16

14

12

<210> 1037

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1037 gggaaagctc cttcca

<210> 1038

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1038 ttgcaatgtc tggc

<210> 1039

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1039 gatttatctg gctg

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1040 aagggccctg gg

<210> 1041

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<213> Secuencia Artificial

<220>

16

14

14

12

12

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1042 agggcttcca gt

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1043 aggaagggct tc

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<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1044 ccttccactg at

<210> 1045

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<210> 1047

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<211> 14

12

12

12

14

14

12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<210> 1049

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1049 aacaatgtgt tgta

<210> 1050

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1050 ccctctacac ca

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<211> 14

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1053

14

14

12

14

14

cagtgtgcac acag

<210> 1054

<211> 14

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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14

12

14

14

12

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<213> Secuencia Artificial

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12

14

12

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12

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<213> Secuencia Artificial

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<213> Secuencia Artificial

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<213> Secuencia Artificial

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<213> Secuencia Artificial

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14

12

14

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12

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12

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4

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<213> Secuencia Artificial

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<213> Secuencia Artificial

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12

12

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<220>

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16

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14

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<220>

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<220>

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14

14

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14

14

14

14

14

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14

14

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12

12

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12

12

12

12

14

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12

12

12

12

12

<220>

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12

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14

16

16

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<213> Secuencia Artificial

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12

12

12

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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14

14

14

14

14

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<220>

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<400> 1140 gtattcaagt aa

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12

12

12

12

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<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1146 ttcttaaagg tg

<210> 1147

<211> 12

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<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

12

14

12

12

12

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<213> Secuencia Artificial

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<213> Secuencia Artificial

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12

12

12

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12

12

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12

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12

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12

12

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<213> Secuencia Artificial

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<213> Secuencia Artificial

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14

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12

ctttgtcaag at

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12

12

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15

15

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15

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16

16

12

12

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12

12

12

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12

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12

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<220>

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<220>

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12

12

12

12

12

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12

12

12

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12

12

12

12

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12

12

12

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<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1232 gcatcatcaa tc

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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12

12

14

12

12

12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1234 gcaaaactca tt

<210> 1235

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1236 gtgcaactct gc

<210> 1237

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1237 aatattcatg ta

<210> 1238

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1238 ggattgcaag tt

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<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1239

12

14

12

12

12

ataaagcatc tg

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1241 gaagccctaa tc

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1242 taaattgtat gc

<210> 1243

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1244 caagatcttc ac

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14

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12

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12

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14

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12

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14

14

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14

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14

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14

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12

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14

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12

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15

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<210> 1439

<211> 15

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1439 tgaactgcta gcctc

<210> 1440

<211> 15

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1440 ttgaactgct agcct

<210> 1441

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1441 tgaactgcta gcct

<210> 1442

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

15

15

15

15

14

<400> 1442 agttgaactg ctag

<210> 1443

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1443 gttgaactgc ta

<210> 1444

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1444 gaagttgaac tg

<210> 1445

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1445 acagaagttg aact

<210> 1446

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1446 tcattgtcac taac

<210> 1447

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1447 cattgtcact aa

<210> 1448

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

14

12

12

14

14

12

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1448 tcaggttcat tg

<210> 1449

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1449 atgatcaggt tcat

<210> 1450

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1450 tataatgatc aggt

<210> 1451

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1451 ataatgatca gg

<210> 1452

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<210> 1453

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1453 tcagtggtgt caga

12

14

14

12

14

14

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<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1454 ctctggatca gagt

<210> 1455

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1455 aaggttcatt ctct

<210> 1456

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<400> 1456 ttcatcaaaa ggtt

<210> 1457

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

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<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1458 cttcatcaaa ag

<210> 1459

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

14

14

14

14

12

<400> 1459 atgctgatct tcat

<210> 1460

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1460 ttttgtaatt tgtg

<210> 1461

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1461 tcagactttt gtaa

<210> 1462

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1462 tgtcctattg ccat

<210> 1463

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1463 tctgacacaa tgtc

<210> 1464

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1464 ctgacacaat gt

<210> 1465

<211> 14

<212> ADN

14

14

14

14

14

12

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1465 tgttcctata actg

<210> 1466

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1466 gttcctataa ct

<210> 1467

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1467 aagattggtc agga

<210> 1468

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1468 agattggtca gg

<210> 1469

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1469 gtgtcaaaac cctg

<210> 1470

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1470 agctacacaa cc

14

12

14

12

14

12

<210> 1471

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1471 cacagctaca caac

<210> 1472

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1472 acagctacac aa

<210> 1473

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1473 tatatacatg acac

<210> 1474

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1474 atatacatga ca

<210> 1475

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1475 aattttaaat gtcc

<210> 1476

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

14

12

14

12

14

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1476 attttaaatg tc

<210> 1477

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1477 tcctaattga at

<210> 1478

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1478 aaagtgccat ct

<210> 1479

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1479 tttataaaac tgga

<210> 1480

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1480 ttataaaact gg

<210> 1481

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1481 tgcaaactta tctg

<210> 1482

<211> 12

12

12

12

14

12

14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1482 gcaaacttat ct

<210> 1483

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1483 agccaactgc aa

<210> 1484

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1484 cttagccaac tgca

<210> 1485

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1485 ttagccaact gc

<210> 1486

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1486 taaatcattg tcaa

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<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1487

12

12

14

12

14

gcactggcct tgat

<210> 1488

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1488 cactggcctt ga

<210> 1489

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1489 ttagcactgg cc

<210> 1490

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1490 tgtgtaaggt ca

<210> 1491

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1491 gttaatgaca tt

<210> 1492

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1492 gacaatttct ac

<210> 1493

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

14

12

12

12

12

12

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1493 aacactgcac at

<210> 1494

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1494 taggtcaagt ctaa

<210> 1495

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1495 tataggtcaa gtct

<210> 1496

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1496 tttggataaa tata

<210> 1497

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1497 tgggacttca cacc

<210> 1498

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1498 accacagcta gt

<210> 1499

12

14

14

14

14

12

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1499 gggacttcac ac

<210> 1500

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1500 ccaaaaacct tact

<210> 1501

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1501 gtggcaacca ca

<210> 1502

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1502 aaggcttaaa gt

<210> 1503

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1503 aggacttggg at

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<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

12

14

12

12

12

<400> 1504 gggaatcaga gc

<210> 1505

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1505 atttgatgct gc

<210> 1506

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1506 ttccaatgac ta

<210> 1507

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1507 atcaacagct gc

<210> 1508

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1508 gattgcaagt tccg

<210> 1509

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1509 tgcttggaag ga

<210> 1510

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

12

12

12

12

14

12

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1510 ctgctgcaca tcca

<210> 1511

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1511 cacattaaca gt

<210> 1512

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1512 agttgaaatt tc

<210> 1513

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1513 accctcattc ag

<210> 1514

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1514 agaatgagac tt

<210> 1515

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1515 gtaaatccta ag

14

12

12

12

12

12

<210> 1516

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1516 taaatatagg tc

<210> 1517

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1517 aatgccttat ta

<210> 1518

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1518 caccttaaaa tttg

<210> 1519

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1519 gtgtacagat tt

<210> 1520

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1520 ctttcagtca ta

<210> 1521

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

12

12

14

12

12

<400> 1521 gggcatatca aa

<210> 1522

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1522 tgaggcatta tc

<210> 1523

<211> 4

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1523 actg

<210> 1524

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 1524 cgtgggctcc agcattcta

<210> 1525

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 1525 agtcatttct gcctttgcgt c

<210> 1526

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda

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<210> 1527

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<212> ADN

12

12

4

19

21

22

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 1527 gaaaatagac ttcctgaata actatgcatt

<210> 1528

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 1528 actcgcttgc cagcttgc

<210> 1529

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda

<400> 1529 tttctgagtc cccgtgccca aca

<210> 1530

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 1530 tgagccttgc caccttctct

<210> 1531

<211> 15

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 1531 gcgcacccca gccaa

<210> 1532

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda

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30

18

23

20

15 29

<210> 1533

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 1533 atttcctgcc cctggtacct

<210> 1534

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 1534 cgggcccaca cctcttg

<210> 1535

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda

<400> 1535 ccacaaagtg cagcaccgcc tagtgt

<210> 1536

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 1536 gccacaggct cccagacat

<210> 1537

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 1537 tccatcctct tgatatctcc ttttg

<210> 1538

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 20

17

26

19

25 <223> Sonda

<400> 1538 acagccatca tcaaagagat cgttagcaga a

<210> 1539

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 1539 atgacaatca tgttgcagca attc

<210> 1540

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 1540 cgatgcaata aatatgcaca aatca

<210> 1541

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda

<400> 1541 ctgtaaagct ggaaagggac ggactggt

<210> 1542

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1542 gtgtgcacac agct

<210> 1543

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1543 cagcctgggc ac

<210> 1544

<211> 14

31

24

25

28

14

12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1544 tgctcgaact cctt

<210> 1545

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1545 gaagtcactg gctt

<210> 1546

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1546 gggaagtcac tggc

<210> 1547

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1547 gttaggcaaa gggc

<210> 1548

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1548 gggctgagtg accc

<210> 1549

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1549

14

14

14

14

14

atgctagtgc acta

<210> 1550

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1550 agctcgctac ctct

<210> 1551

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1551 gaggtatccc atct

<210> 1552

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1552 ggcaacttca acct

<210> 1553

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1553 gaagtagcca ccaactgtgc

<210> 1554

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1554 tagccaccaa ct

<210> 1555

<211> 4

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

14

14

14

14

20

12

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1555 actg

<210> 1556

<211> 4

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1556 actg

<210> 1557

<211> 10

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1557 agccaccaac

<210> 1558

<211> 8

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1558 gccaccaa

<210> 1559

<211> 13

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1559 tagccaccaa ctg

<210> 1560

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1560 taccgaacac ct

<210> 1561

4

4

10

8

13

12

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1561 gtccctgaag atgtcaatgc

<210> 1562

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1562 tgcactttgt ggtaccaagg

<210> 1563

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1563 gcttctccat cata

<210> 1564

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1564 tgtcttgctg cttt

<210> 1565

<211> 4

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1565 actg

<210> 1566

<211> 4

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

20

20

14

14

4 <400> 1566 actg

<210> 1567

<211> 4

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1567 actg

<210> 1568

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1568 atggcttctc catcatatcc

<210> 1569

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1569 cttgggcatg ctcgtcagtc

<210> 1570

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1570 ccttccctga aggttcctcc

<210> 1571

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1571 ctgctagcct ctggatttga

<210> 1572

<211> 4

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

4

4

20

20

20

20

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1572 actg 4

<210> 1573

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1573 gaatatctat aatg 14

<210> 1574

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido Sintético

<400> 1574 gtaagcaagg ct 12

<210> 1575

<211> 2254

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus

<400> 1575

imagen1

<210> 1576

<211> 3300

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 1576

imagen1

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un compuesto antisentido corto de 10 a 14 monómeros de longitud, que comprende una región hueco de 2'desoxirribonucleótido flanqueada en cada lado por un ala, en el que cada ala consiste de forma independiente en 1 a 3 monómeros modificados de alta afinidad que son nucleótidos modificados con azúcar que comprenden un puente entre la posición 4' y 2' del azúcar, y en el que el compuesto antisentido corto está dirigido a un ácido nucleico que codifica SGLT2.

2. 2.

   Un compuesto antisentido corto de 10 a 14 monómeros de longitud, que comprende una región hueco de 2'desoxirribonucleótido flanqueada en cada lado por un ala, en el que cada ala consiste de forma independiente en 1 a 3 monómeros modificados de alta afinidad que son nucleótidos modificados con azúcar que comprenden el grupo 2’sustituyente OCH2CH2OCH3, y en el que el compuesto antisentido corto está dirigido a un ácido nucleico que codifica SGLT2.

3. 3.

   El compuesto antisentido corto de la reivindicación 1, en el que la conformación de cada uno de dichos nucleótidos modificados con azúcar es, de forma independiente, β-D o α-L.

4. 4.

   El compuesto antisentido corto de la reivindicación 1, en el que cada uno de dichos puentes comprende independientemente 1 o de 2 a 4 grupos unidos seleccionados de forma independiente de -[C(R1)(R2)]n-,-C(R1)=C(R2)-, -C(R1)=N-, -C(=NR1)-, -C(-O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(R1)2-, -S(-O)x-y -N(R1)-;

   en los que

   xes 0, 1 o 2;

   n es 1, 2, 3 o 4;

   cada uno de R1 y R2 es, de forma independiente, H, un grupo protector, hidroxilo, alquilo C1-C12, alquilo C1C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5C20, arilo C5-C20 sustituido, radical heterociclo, radical heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical alicíclico C5-C7, radical alicíclico C5-C7 sustituido, halógeno, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(=O)2-J1) o sulfoxilo (S(=O)-J1); y

   cada uno de J1 y J2 es, de forma independiente, H, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, aminoalquilo C1-C12, aminoalquilo C1-C12 sustituido o un grupo protector.

5. 5.

   El compuesto antisentido corto de la reivindicación 4, en el que cada uno de dichos puentes es, de forma independiente, 4’-CH2-2’, 4’-(CH2)2-2’, 4’-CH2-O-2’, 4’-(CH2)2-O-2’, 4’CH2-O-N(R1)-2’ y 4’-CH2-N(R1)-O-2’-en los que cada R1 es, de forma independiente, H, un grupo protector o alquilo C1-C12.

6. 6.

   El compuesto antisentido corto de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que al menos un enlace monomérico es un enlace monomérico modificado tal como un enlace fosforotioato.

7. 7.

   El compuesto antisentido corto de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que cada enlace monomérico es un enlace internucleosídico fosforotioato.

8. 8.

   El compuesto antisentido corto de cualquiera de las reivindicaciones precedentes que tiene 10-13 monómeros de longitud, 10-12 monómeros de longitud, 10-11 monómeros de longitud, 10 monómeros de longitud, 11 monómeros de longitud, 12 monómeros de longitud, 13 monómeros de longitud o 14 monómeros de longitud.

9. 9.

   El compuesto antisentido corto de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEC ID Nos: 214-219, 221-226, 228-230, 232-243, 245-246, 251-254, 256-272, 274-281, 283-285, 287-293 y 295-300.

10. 10.

    El compuesto antisentido corto de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que tiene 12 monómeros de longitud.

11. 11.

    El compuesto antisentido corto de la reivindicación 10, que tiene un motivo seleccionado de 1-10-1 y 2-8-2 en el que el primer número representa el número de monómeros en el ala 5’, el segundo número representa el número de monómeros en el hueco y el tercer número representa el número de monómeros en el ala 3’.

12. 12.

    El compuesto antisentido corto de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el compuesto está formado por un segmento de hueco central que consiste en 2’-desoxinucleótidos, que está flanqueado a ambos lados por segmentos de ala compuestos por nucleótidos 2’-metoxietilo (2’-MOE), en el que los enlaces internucleosídicos son

    fosforotioato (P=S) en todo el oligonucleótido, y todos los residuos citidina son 5-metilcitidinas.

13. 13.

    El compuesto antisentido corto de la reivindicación 12, que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEC ID Nos: 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 283, 284, 285 y 287.

14. 14.

    El compuesto antisentido corto de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho compuesto

    5 comprende la secuencia de oligonucleótidos de SEC ID Nº:281, tiene 12 monómeros de longitud, tiene un motivo 2-8-2 en el que el primer número representa el número de monómeros en el ala 5’, el segundo número representa el número de monómeros en el hueco, y el tercer número representa el número de monómeros en el ala 3’, y en el que el compuesto está formado por un segmento central que consiste en 2’-desoxinucleótidos, que está flanqueado a ambos lados por segmentos de ala compuestos por nucleótidos 2’-metoxietilo (2’-MOE), en el que los enlaces

    10 internucleosídicos son fosforotioato (P=S) en todo el oligonucleótido, y todos los residuos citidina son 5-metilcitidinas.

15. 15.

    El compuesto antisentido corto de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que es una sal farmacéuticamente aceptable.

16. 16.

    Un procedimiento ex vivo para modular la expresión de SGLT2 poniendo en contacto un ácido nucleico de SGLT2 con un compuesto antisentido corto de cualquiera de las reivindicaciones 1-15.

    15 17. El compuesto antisentido corto de cualquiera de las reivindicaciones 1-15, para su uso en el tratamiento de un trastorno metabólico en un animal.