JP2024518545A - Ｔｒｅｍ２のアゴニスト - Google Patents

Ｔｒｅｍ２のアゴニスト Download PDF

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デーヴィッド ヴェルン ハンセン，
イシドロ ホッツェル，
イー－チュン シャオ，
チョンホア リン，
ダーヤ サシャシャイ，
ベニー チー，
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Abstract

本出願は、とりわけ、ヒトＴＲＥＭ２（骨髄細胞２上に発現されるトリガー受容体）に特異的に結合する特定の抗体を開示する。いくつかの実施形態では、抗体はＴＲＥＭ２アゴニストとして作用する。いくつかの実施形態では、本明細書の抗体は、残基Ｈ１５７とＳ１５８との間のＴＲＥＭ２切断の産物である可溶性ＴＲＥＭ２に結合することなく、無傷のヒトＴＲＥＭ２のストーク領域に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＴＲＥＭ２アゴニストとして作用し、１０ｎＭから１００～５００ｐＭ、１０～５０ｐＭ、又は１～１０ｐＭの範囲の低い解離定数でＴＲＥＭ２のストーク領域に特異的に結合し、Ｈ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがるＴＲＥＭ２エピトープに特異的に結合し、可溶性ＴＲＥＭ２には結合しない。いくつかの実施形態では、本明細書の抗体はまた、ヒトミクログリア細胞モデルにおける及びマウスモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの可溶性ＴＲＥＭ２のシェディングを阻害し、血漿、ＣＳＦ及び／又は脳における可溶性ＴＲＥＭ２のレベルを低下させ、ヒトミクログリア細胞の生存を増強し、ヒトミクログリアモデルにおけるＡβプラーク形成及び圧縮を増加させ（例えば、ヒトミクログリアにおけるＡβプラーク強度の増加及び／又はＸ０４プラーク強度の増加によって測定される場合）、したがって、いくつかの神経保護活性を提供し得る。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年５月１４日に出願された米国仮出願第６３／１８８，８００号の優先権を主張し、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる、１１５ＫＢのサイズを有する、２０２２年５月９日に作成された「０１１６４－００１４－００ＰＣＴ＿ＳＴ２５」と題するコンピュータ可読形式の配列表を含む。
分野
本出願は、とりわけ、ＴＲＥＭ２に特異的に結合する特定の抗体を開示する。いくつかの実施形態では、抗体はＴＲＥＭ２アゴニストとして作用する。
背景
ＴＲＥＭ２（骨髄細胞上に発現されるトリガー受容体２）は、ミクログリアにおいて脳内で発現される活性化免疫細胞受容体である（Ｈｉｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６（１２）：１８９６－１９０５（２０１３）；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ ８９：３７－５３（２０１６）；Ｄｅｃｚｋｏｗｓｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １８１：１２０７－１２１７（２０２０）；Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２１７（２）：４５９－４７２（２０１８）；Ｙｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２３：５１２－５３３（２０１７））。特定のＴＲＥＭ２変異は、アルツハイマー病（ＡＤ）の危険因子として同定されている（Ｇｕｅｒｒｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６８：１１７－２７（２０１３）；Ｊｏｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６８：１０７－１１６（２０１３））。ＴＲＥＭ２がβ－アミロイド（Ａβ）プラーク及びタウタンパク質のリン酸化凝集物等のＡＤ病変の発生にどのように影響するかを理解するために、マウスモデルでも研究が行われている。新たなコンセンサスは、ＴＲＥＭ２機能が損なわれている場合、Ａβプラークは、より圧縮されていない形態を有し、周囲の神経突起に対してより損傷を与えるということである（Ｍｅｉｌａｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４０：１８７２－１９（２０２０）；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２１３：６６７－６７５（２０１６）；Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ ９０：７２４－７３９（２０１６））。
Ａβ凝集体は、組換えＴＲＥＭ２細胞外ドメインに直接結合することが見出されているが、他の研究は、特定のリン脂質がＴＲＥＭ２の関連リガンドであることを示唆している。ＴＲＥＭ２は、ＡＰＯＥ又はＡＰＯＪが脂質化されている場合にも結合し、ＡＰＯＥ／ＡＰＯＪを含有する親油性物品の取り込みを促進する。（Ｙｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ ９１：３２８－３４０（２０１６）．）さらに、ＡβオリゴマーがＡＰＯＥ／ＡＰＯＪリポ粒子に結合すると、Ａβのミクログリア取り込み及び分解が加速され、このプロセスはＴＲＥＭ２によって部分的に媒介される。ライゲーション後、ＴＲＥＭ２は、食作用、エンドサイトーシス、走化性、ＣＳＦ－１媒介性生存、凝集体分解及び代謝変化を含むミクログリア過程の宿主に影響を及ぼすＤＡＰ１２／Ｆｙｎ／Ｓｙｋシグナル伝達カスケードを誘発する。したがって、ＴＲＥＭ２は、アミロイド及び脂質に応答したミクログリア活性の中心であると思われる。
概要
本開示は、ＴＲＥＭ２に特異的に結合し、ＴＲＥＭ２アゴニストとして作用し、アルツハイマー病（ＡＤ）及び多発性硬化症（ＭＳ）等の神経変性疾患の治療に有用な特に固有の特徴セットを有し得る抗体に関する。
ＴＲＥＭ２タンパク質は、ストークドメインと呼ばれる細胞外領域で切断され、「可溶性ＴＲＥＭ２」又は「ｓＴＲＥＭ２」と呼ばれる可溶性ペプチドをもたらす細胞膜貫通タンパク質である。ｉｎ ｖｉｖｏでのＴＲＥＭ２切断は、残基Ｈ１５７と残基Ｓ１５８との間で起こり、ｓＴＲＥＭ２を生じると考えられる。本開示は、切断産物ｓＴＲＥＭ２に結合することなく、非可溶性のインタクトなＴＲＥＭ２中のストークドメインに特異的に結合するという固有の特性を有する抗体を記載する。例えば、本明細書における特定の抗体は、ＴＲＥＭ２アゴニストとして作用するだけでなく、１０ｎＭから１００～５００ｐＭ、１０～５０ｐＭ、又は１～１０ｐＭの低い解離定数でＴＲＥＭ２のストークドメインに特異的に結合し、Ｈ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがるＴＲＥＭ２エピトープに特異的に結合する。これらの抗体はＴＲＥＭ２ストークドメインに特異的に結合するが、可溶性ＴＲＥＭ２には結合しない。
切断されていないＴＲＥＭ２に対するこれらの抗体の特異性は、ｉｎ ｖｉｖｏ投与後の末梢及び脳における可溶性ＴＲＥＭ２に対する抗体の望ましくない結合の回避及び／又は切断部位の遮断並びに細胞表面から放出されるｓＴＲＥＭ２の量の減少を含む、ｉｎ ｖｉｖｏでのいくつかの潜在的な利点を有し得る。可溶性ＴＲＥＭ２結合の欠如は、例えば、より多くの投薬された抗ＴＲＥＭ２抗体が細胞の表面上の未切断ＴＲＥＭ２の所望の標的に到達することを可能にすることによって、ｉｎ ｖｉｖｏで有益であり得る。限定ではなく例として、この固有の結合プロファイルは、ｉｎ ｖｉｖｏでの可溶性ＴＲＥＭ２への抗体の望ましくない結合を防ぎ、抗体が末梢でｓＴＲＥＭ２よりもむしろ中枢神経系内の細胞の表面でＴＲＥＭ２をより特異的に標的化することを確実にし得る。
したがって、本開示は、以下の特定の抗体を包含する：（ａ）ＴＲＥＭ２ストークドメインに、より具体的にはＨ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがるＴＲＥＭ２エピトープに特異的に結合し、（ｂ）可溶性ＴＲＥＭ２に結合せず、したがって、ｉｎ ｖｉｖｏで可溶性ＴＲＥＭ２結合のリスクを示さない可能性がある。いくつかの実施形態では、本開示の抗体はまた、（ｃ）例えば培養細胞においてＮＦＡＴ制御遺伝子発現及び／又はＳｙｋキナーゼリン酸化を誘導することによってＴＲＥＭ２アゴニストとして作用し、（ｄ）ＴＲＥＭ２に対して非常に高い親和性、例えば１００～５００ｐＭ、１０～５０ｐＭ又は１～１０ｐＭの解離定数でＴＲＥＭ２に特異的に結合する親和性を示す。いくつかの実施形態では、本明細書における抗体はまた、ヒトミクログリア細胞モデルにおける及びマウスモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの可溶性ＴＲＥＭ２のシェディングを阻害し、血漿、ＣＳＦ及び／又は脳における可溶性ＴＲＥＭ２のレベルを低下させ、ヒトミクログリア細胞の生存を増強し、ヒトミクログリアモデルにおけるＡβプラーク形成及び圧縮を増加させ（例えば、ヒトミクログリアにおけるＡβプラーク強度の増加及び／又はＸ０４プラーク強度の増加によって測定される場合）、したがって、いくつかの神経保護活性を提供し得る。
本開示は、とりわけ、骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体であって、抗体が、配列番号１、９、１１、１９、又は６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号２、１０、１２、２０、５５、６３、６５又は７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、以下のアミノ酸配列：Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｙ（式中、Ｘ１及びＸ２は、共に、Ｉ－Ｌ又はＬのいずれかであり、Ｘ３は、Ｄ又はＥのいずれかである）を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体を包含する。
本開示はまた、例えば、骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体であって、抗体が、配列番号１、９、１１、１９、又は６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号２、１０、１２、２０、５５、６３、６５又は７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、以下のアミノ酸配列：Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｙ（式中、Ｘ１及びＸ２は、共に、Ｉ－Ｌ又はＬのいずれかであり、Ｘ３は、Ｄ又はＥのいずれかである）を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号４、２７、３７、４７、５７又は６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号６、２９、３９、４９、５９又は６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体を包含する。本開示は更に、例えば、骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体であって、抗体が、配列番号１、９、１１、又は１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号２、１０、１２、又は２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、以下のアミノ酸配列：Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｙ（式中、Ｘ１及びＸ２は、共に、Ｉ－Ｌ又はＬのいずれかであり、Ｘ３は、Ｄ又はＥのいずれかである）を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体を包含する。
本明細書におけるいくつかの実施形態では、抗体は、以下の特性の１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、又は全てを有する：
（ａ）ＴＲＥＭ２のストークドメインに特異的に結合する、
（ｂ）可溶性ＴＲＥＭ２（ｓＴＲＥＭ２）に結合しない、
（ｃ）アミノ酸１４６～１６１（配列番号９６）又は１５１～１６５（配列番号９７）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドに、アミノ酸１３９～１５８（配列番号９２）及び／又は１５９～１７５（配列番号９４）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドよりも高い親和性で特異的に結合する、
（ｄ）Ｈ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがるＴＲＥＭ２エピトープに特異的に結合する、
（ｅ）野生型ＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチドと比較して（例えば、二重層干渉法によって測定される場合）、Ｄ１５２Ａ、Ｈ１５７Ａ及びＩ１５９Ａ置換を含むＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチドに対する結合親和性の低下を示す、
（ｆ）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、３７℃で１ｎＭ未満、０．７ｎＭ未満、０．６ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．４ｎＭ未満、０．３ｎＭ未満のＫＤでヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に特異的に結合する、並びに
（ｇ）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、３７℃で１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、７ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、又は２ｐＭ未満のＫＤでヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に特異的に結合する。
さらに、いくつかの実施形態では、抗体は、ラットＩＧＨＶ６－８生殖細胞系列セグメントに由来するＶＨ配列を有し、且つ／又は抗体が、ラットＩＧＫＶ２Ｓ１１生殖細胞系列セグメントに由来するＶＬ配列を有する。いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号４、２７又は６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号６、２９又は６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号１若しくは９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号２若しくは１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含み、軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含むか、又は重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号１１若しくは１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号１２若しくは２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含み、軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号７、１７、３０、４０、５０、６０、７０、７６、７７、７８、８１、８２、８３、１３３、１３５、１３７、１３９、１４６、１４８、１５０、又は１５２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％同一であるＶＨを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号７、１７、１３３、１３５、１３７、１３９、１４６、１４８、１５０、又は１５２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％同一であるＶＨを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号８、１８、３１、４１、５１、６１、７１、７９、８０、８４、８５、１３２、１３４、１３６、１３８、１４５、１４７、１４９又は１５１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％又は少なくとも９９％同一であるＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号８、１８、１３２、１３４、１３６、１３８、１４５、１４７、１４９又は１５１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％又は少なくとも９９％同一であるＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号７、１７、１３３、１３５、１３７、１３９、１４６、１４８、１５０、又は１５２のアミノ酸配列を含むＶＨを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号８、１８、１３２、１３４、１３６、１３８、１４５、１４７、１４９、又は１５１のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
本開示はまた、とりわけ、骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体であって、抗体が、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｄ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｅ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｆ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｇ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｈ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、又は
（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、を含む、骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体を包含する。
いくつかの実施形態では、抗体は、
上記部分（ａ）のＣＤＲを含み、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＨを更に含むか、
上記部分（ｂ）のＣＤＲを含み、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＨを更に含むか、
上記部分（ｃ）のＣＤＲを含み、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＨを更に含むか、
上記部分（ｄ）のＣＤＲを含み、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＨを更に含むか、
上記部分（ｅ）のＣＤＲを含み、配列番号３０のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＨを更に含むか、
上記部分（ｆ）のＣＤＲを含み、配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＨを更に含むか、
上記部分（ｇ）のＣＤＲを含み、配列番号５０のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＨを更に含むか、
上記部分（ｈ）のＣＤＲを含み、配列番号６０のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＨを更に含むか、又は
上記部分（ｉ）のＣＤＲを含み、配列番号７０のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＨを更に含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、
上記部分（ａ）のＣＤＲを含み、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＬを更に含むか、
上記部分（ｂ）のＣＤＲを含み、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＬを更に含むか、
上記部分（ｃ）のＣＤＲを含み、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＬを更に含むか、
上記部分（ｄ）のＣＤＲを含み、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＬを更に含むか、
上記部分（ｅ）のＣＤＲを含み、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＬを更に含むか、
上記部分（ｆ）のＣＤＲを含み、配列番号４１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＬを更に含むか、
上記部分（ｇ）のＣＤＲを含み、配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＬを更に含むか、
上記部分（ｈ）のＣＤＲを含み、配列番号６１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＬを更に含むか、又は
上記部分（ｉ）のＣＤＲを含み、配列番号７１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＬを更に含む。
いくつかの例では、抗体は、
上記部分（ａ）のＣＤＲを含み、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨを更に含むか、
上記部分（ｂ）のＣＤＲを含み、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨを更に含むか、
上記部分（ｃ）のＣＤＲを含み、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨを更に含むか、
上記部分（ｄ）のＣＤＲを含み、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨを更に含むか、
上記部分（ｅ）のＣＤＲを含み、配列番３０のアミノ酸配列を含むＶＨを更に含むか、
上記部分（ｆ）のＣＤＲを含み、配列番４０のアミノ酸配列を含むＶＨを更に含むか、
上記部分（ｇ）のＣＤＲを含み、配列番５０のアミノ酸配列を含むＶＨを更に含むか、
上記部分（ｈ）のＣＤＲを含み、配列番６０のアミノ酸配列を含むＶＨを更に含むか、又は
上記部分（ｉ）のＣＤＲを含み、配列番７０のアミノ酸配列を含むＶＨを更に含む。
いくつかの例では、抗体は、
上記部分（ａ）のＣＤＲを含み、配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬを更に含むか、
上記部分（ｂ）のＣＤＲを含み、配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬを更に含むか、
上記部分（ｃ）のＣＤＲを含み、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬを更に含むか、
上記部分（ｄ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬを更に含むか、
上記部分（ｅ）のＣＤＲを含み、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＬを更に含むか、
上記部分（ｆ）のＣＤＲを含み、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬを更に含むか、
上記部分（ｇ）のＣＤＲを含み、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＬを更に含むか、
上記部分（ｈ）のＣＤＲを含み、配列番号６１のアミノ酸配列を含むＶＬを更に含むか、又は
上記部分（ｉ）のＣＤＲを含み、配列番号７１のアミノ酸配列を含むＶＬを更に含む。
いくつかの例では、抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。いくつかの例では、抗体は、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。いくつかの例では、抗体は、ヒトＩＧＫＶ２－２８＊０１生殖系列と比較して、フレームワーク領域に１～５個のアミノ酸置換を含むＶＬを含み、任意に、アミノ酸置換がＱ１００Ｐ及び／又はＶ１０４Ｌを含む。いくつかの例では、抗体は、
上記部分（ａ）のＣＤＲを含み、配列番号１４５のアミノ酸配列を含むＶＬを更に含むか、
上記部分（ｂ）のＣＤＲを含み、配列番号１４５のアミノ酸配列を含むＶＬを更に含むか、
上記部分（ａ）のＣＤＲを含み、配列番号１４７のアミノ酸配列を含むＶＬを更に含むか、
上記部分（ｂ）のＣＤＲを含み、配列番号１４７のアミノ酸配列を含むＶＬを更に含むか、
上記部分（ａ）のＣＤＲを含み、配列番号１４９のアミノ酸配列を含むＶＬを更に含むか、
上記部分（ｂ）のＣＤＲを含み、配列番号１４９のアミノ酸配列を含むＶＬを更に含むか、
上記部分（ａ）のＣＤＲを含み、配列番号１５１のアミノ酸配列を含むＶＬを更に含むか、
上記部分（ｂ）のＣＤＲを含み、配列番号１５１のアミノ酸配列を含むＶＬを更に含むか、
上記部分（ｃ）のＣＤＲを含み、配列番号１３２のアミノ酸配列を含むＶＬを更に含むか、
上記部分（ｄ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号１３２のアミノ酸配列を含むＶＬを更に含むか、
上記部分（ｃ）のＣＤＲを含み、配列番号１３４のアミノ酸配列を含むＶＬを更に含むか、
上記部分（ｄ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号１３４のアミノ酸配列を含むＶＬを更に含むか、
上記部分（ｃ）のＣＤＲを含み、配列番号１３６のアミノ酸配列を含むＶＬを更に含むか、
上記部分（ｄ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号１３６のアミノ酸配列を含むＶＬを更に含むか、
上記部分（ｃ）のＣＤＲを含み、配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＶＬを更に含むか、又は
上記部分（ｄ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＶＬを更に含む。
いくつかの実施形態では、本明細書において抗体は、以下の特性の１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、又は全てを有する：
（ａ）ＴＲＥＭ２のストークドメインに特異的に結合する、
（ｂ）可溶性ＴＲＥＭ２（ｓＴＲＥＭ２）に結合しない、
（ｃ）アミノ酸１４６～１６１（配列番号９６）又は１５１～１６５（配列番号９７）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドに、アミノ酸１３９～１５８（配列番号９２）及び／又は１５９～１７５（配列番号９４）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドよりも高い親和性で特異的に結合する、
（ｄ）Ｈ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがるＴＲＥＭ２エピトープに特異的に結合する、
（ｅ）野生型ＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチドと比較して（例えば、二重層干渉法によって測定される場合）、Ｄ１５２Ａ、Ｈ１５７Ａ及びＩ１５９Ａ置換を含むＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチドに対する結合親和性の低下を示す、
（ｆ）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、３７℃で１ｎＭ未満、０．７ｎＭ未満、０．６ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．４ｎＭ未満、若しくは０．３ｎＭ未満、又は１００～５００ｐＭ若しくは１００～２００ｐＭのＫＤでヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に特異的に結合する、並びに
（ｇ）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、３７℃で１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、７ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満若しくは２ｐＭ未満、又は１０～５０ｐＭ若しくは１０～２５ｐＭのＫＤでヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に特異的に結合する。
本出願はまた、例えば、骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体であって、抗体が、
（ａ）配列番号１４６のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１４５のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｂ）配列番号１４８のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１４７のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｃ）配列番号１５０のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１４９のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｄ）配列番号１５２のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１５１のアミノ酸配列を含むＶ、を含む、骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体を包含する。いくつかの実施形態では、抗体は、以下の特性の１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、又は全てを有する：
（ａ）ＴＲＥＭ２のストークドメインに特異的に結合する、
（ｂ）可溶性ＴＲＥＭ２（ｓＴＲＥＭ２）に結合しない、
（ｃ）アミノ酸１４６～１６１（配列番号９６）又は１５１～１６５（配列番号９７）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドに、アミノ酸１３９～１５８（配列番号９２）及び／又は１５９～１７５（配列番号９４）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドよりも高い親和性で特異的に結合する、
（ｄ）Ｈ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがるＴＲＥＭ２エピトープに特異的に結合する、
（ｅ）野生型ＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチドと比較して（例えば、二重層干渉法によって測定される場合）、Ｄ１５２Ａ、Ｈ１５７Ａ及びＩ１５９Ａ置換を含むＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチドに対する結合親和性の低下を示す、並びに
（ｆ）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、３７℃で１ｎＭ未満、０．７ｎＭ未満、０．６ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．４ｎＭ未満、若しくは０．３ｎＭ未満、又は１００～５００ｐＭ若しくは１００～２００ｐＭのＫＤでヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に特異的に結合する。
本出願は更に、例えば、骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体であって、抗体が、
（ａ）配列番号１３３のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１３２のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｂ）配列番号１３５のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１３４のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｃ）配列番号１３７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１３６のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｄ）配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む、骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体を包含する。いくつかの実施形態では、抗体は、以下の特性の１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、又は全てを有する：
（ａ）ＴＲＥＭ２のストークドメインに特異的に結合する、
（ｂ）可溶性ＴＲＥＭ２（ｓＴＲＥＭ２）に結合しない、
（ｃ）アミノ酸１４６～１６１（配列番号９６）又は１５１～１６５（配列番号９７）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドに、アミノ酸１３９～１５８（配列番号９２）及び／又は１５９～１７５（配列番号９４）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドよりも高い親和性で特異的に結合する、
（ｄ）Ｈ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがるＴＲＥＭ２エピトープに特異的に結合する、
（ｅ）野生型ＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチドと比較して（例えば、二重層干渉法によって測定される場合）、Ｄ１５２Ａ、Ｈ１５７Ａ及びＩ１５９Ａ置換を含むＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチドに対する結合親和性の低下を示す、並びに
（ｆ）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、３７℃で１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、７ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満若しくは２ｐＭ未満、又は１０～５０ｐＭ若しくは１０～２５ｐＭのＫＤでヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に特異的に結合する。
いくつかの例では、本明細書における抗体は、以下の特徴の１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、又は全てを有する：
（ａ）ヒトＴＲＥＭ２を発現するＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター細胞においてルシフェラーゼレポーター活性を誘導する、
（ｂ）血漿中のｉｎ ｖｉｖｏでのｓＴＲＥＭ２のレベルを低下させる、
（ｃ）ヒトＴＲＥＭ２を発現するＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター細胞におけるｓＴＲＥＭ２のシェディングを阻害する、
（ｄ）ヒトＭＤＭ細胞においてチロシンリン酸化を誘導する、
（ｅ）ヒトＭＤＭ細胞においてＳＹＫリン酸化を誘導する、
（ｆ）ＩＬ－３４及びＣＳＦ－１の非存在下においてヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアの生存を増強する、
（ｇ）ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアにおけるｓＴＲＥＭ２のシェディングを阻害する、
（ｈ）ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアにおいてＳＹＫリン酸化を誘導する、及び
（ｉ）ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアにおけるＡβオリゴマーの存在下での総Ａβプラーク強度及び／又は平均Ｘ０４プラーク強度を増加させる（例えば、本明細書における実施例１７のアッセイに記載される）。いくつかの実施形態では、本明細書において抗体はまた、オフターゲット結合アッセイ（例えば、本明細書における実施例１０に記載される）において低いオフターゲット結合スコア（例えば、１未満のスコア）を有する。
いくつかの実施形態では、抗体は、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又は（Ｆａｂ’）２等の抗体断片である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、又はＩｇＧ４抗体等のＩｇＧ抗体である。いくつかのこのような例では、抗体は、野生型ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含む。いくつかのこのような例では、抗体は、（ａ）Ｎ２９７Ｇ置換、（ｂ）Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ置換（ＬＡＬＡＰＧ置換）、又は（ｃ）Ｎ２９７Ｇ、Ｍ４２８Ｌ、及びＮ４３４Ｓ置換を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。本明細書におけるいくつかの実施形態では、抗体は、低下したエフェクター機能を有するか、若しくはエフェクターレスであるか、又はＦｃγＲに結合しない。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｎ２９７Ｇ置換を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。本明細書におけるいくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１４４のアミノ酸配列を含む重鎖及び／又は配列番号１７６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１４４のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるが、配列番号１４４のＣ末端リジンを欠くか、又は配列番号１４４のＣ末端グリシン及びリジンを欠く重鎖、及び／又は配列番号１７６のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１４４のアミノ酸配列からなる重鎖及び／又は配列番号１７６のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む。本明細書におけるいくつかの実施形態では、抗体は、Ｓ２２８Ｐ置換を含むか、又はＳ２２８Ｐ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ置換を含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含む。本明細書におけるいくつかの実施形態では、抗体は完全長抗体である。本明細書におけるいくつかの実施形態では、抗体は、重鎖定常領域においてＣ末端リジンを欠くＩｇＧ抗体である。
本明細書において本開示はまた、例えば、骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体であって、抗体が、配列番号１７のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる重鎖、及び／又は配列番号１８のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる軽鎖を含む、骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体を包含する。本明細書において本開示は更に、骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体であって、抗体が、配列番号１４４のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる重鎖、及び／又は配列番号１７６のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる軽鎖を含む、骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体を包含する。本明細書において本開示はまた、骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体であって、抗体が、配列番号１４４のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなるが、配列番号１４４のＣ末端リジンを欠くか、若しくは配列番号１４４のＣ末端グリシン及びリジンを欠く重鎖、及び／又は配列番号１７６のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる軽鎖を含む、骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体を包含する。本開示はまた、骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体であって、抗体が、配列番号１４４のアミノ酸配列からなる重鎖、及び／又は配列番号１７６のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体を包含する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＴＲＥＭ２ストークドメインに特異的に結合し、可溶性ＴＲＥＭ２（ｓＴＲＥＭ２）には結合せず、抗体が、Ｈ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがるＴＲＥＭ２エピトープに特異的に結合し、且つ／又はアミノ酸１３９～１５８（配列番号９２）及び／又は１５９～１７５（配列番号９４）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドよりも高い親和性で、アミノ酸１４６～１６１（配列番号９６）又は１５１～１６５（配列番号９７）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＴＲＥＭ２ストークドメインに特異的に結合し、可溶性ＴＲＥＭ２（ｓＴＲＥＭ２）に結合せず、抗体が、ＴＲＥＭ２アゴニストである。本明細書におけるいくつかの実施形態では、抗体は、以下の特性の１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、又は全てを有する：
（ａ）ＴＲＥＭ２のストークドメインに特異的に結合する、
（ｂ）可溶性ＴＲＥＭ２（ｓＴＲＥＭ２）に結合しない、
（ｃ）アミノ酸１４６～１６１（配列番号９６）又は１５１～１６５（配列番号９７）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドに、アミノ酸１３９～１５８（配列番号９２）及び／又は１５９～１７５（配列番号９４）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドよりも高い親和性で特異的に結合する、
（ｄ）Ｈ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがるＴＲＥＭ２エピトープに特異的に結合する、
（ｅ）野生型ＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチドと比較して（例えば、二重層干渉法によって測定される場合）、Ｄ１５２Ａ、Ｈ１５７Ａ及びＩ１５９Ａ置換を含むＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチドに対する結合親和性の低下を示す、
（ｆ）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、３７℃で１ｎＭ未満、０．７ｎＭ未満、０．６ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．４ｎＭ未満、０．３ｎＭ未満のＫＤでヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に特異的に結合する、並びに
（ｇ）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、３７℃で１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、７ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、又は２ｐＭ未満のＫＤでヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、野生型ＴＲＥＭ２ストークドメインと比較して、Ｄ１５２Ａ、Ｈ１５７Ａ及びＩ１５９Ａ置換を含むＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチドに対する結合親和性の低下を示し（例えば、二重層干渉法によって測定される場合）、且つ／又はヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、３７℃で１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、７ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、若しくは２ｐＭ未満、又は１０～５０ｐＭ若しくは１０～２５ｐＭのＫＤで特異的に結合する。また、いくつかの実施形態では、抗体は、以下の特徴の１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、又は全てを有する：
（ａ）ヒトＴＲＥＭ２を発現するＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター細胞においてルシフェラーゼレポーター活性を誘導する、
（ｂ）血漿中のｉｎ ｖｉｖｏでのｓＴＲＥＭ２のレベルを低下させる、
（ｃ）ヒトＴＲＥＭ２を発現するＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター細胞におけるｓＴＲＥＭ２のシェディングを阻害する、
（ｄ）ヒトＭＤＭ細胞においてチロシンリン酸化を誘導する、
（ｅ）ヒトＭＤＭ細胞においてＳＹＫリン酸化を誘導する、
（ｆ）ＩＬ－３４及びＣＳＦ－１の非存在下においてヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアの生存を増強する、
（ｇ）ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアにおけるｓＴＲＥＭ２のシェディングを阻害する、
（ｈ）ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアにおいてＳＹＫリン酸化を誘導する、及び
（ｉ）ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアにおけるＡβオリゴマーの存在下での総Ａβプラーク強度及び／又は平均Ｘ０４プラーク強度を増加させる（例えば、本明細書における実施例１７のアッセイに記載される）。いくつかの実施形態では、抗体はまた、オフターゲット結合アッセイ（例えば、本明細書における実施例１０に記載される）において低いオフターゲット結合スコア（例えば、１未満のスコア）を有する。
本明細書において本開示はまた、骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体であって、抗体が、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨが、配列番号１１又は１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号１２又は２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含み、更に、抗体が、ＴＲＥＭ２ストークドメインに特異的に結合し、可溶性ＴＲＥＭ２（ｓＴＲＥＭ２）には結合せず、抗体が、ＴＲＥＭ２アゴニストであり、抗体が、Ｈ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがるＴＲＥＭ２エピトープに特異的に結合し、且つ／又はアミノ酸１３９～１５８（配列番号９２）及び／又は１５９～１７５（配列番号９４）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドよりも高い親和性で、アミノ酸１４６～１６１（配列番号９６）又は１５１～１６５（配列番号９７）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドに特異的に結合する、骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体を包含する。いくつかの実施形態では、抗体は、野生型ＴＲＥＭ２ストークドメインと比較して、Ｄ１５２Ａ、Ｈ１５７Ａ及びＩ１５９Ａ置換を含むＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチドに対する結合親和性の低下を示し（例えば、二重層干渉法によって測定される場合）、且つ／又はヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、３７℃で１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、７ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、若しくは２ｐＭ未満、又は１０～５０ｐＭ若しくは１０～２５ｐＭのＫＤで特異的に結合する。また、いくつかの実施形態では、抗体は、以下の特徴の１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、又は全てを有する：
（ａ）ヒトＴＲＥＭ２を発現するＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター細胞においてルシフェラーゼレポーター活性を誘導する、
（ｂ）血漿中のｉｎ ｖｉｖｏでのｓＴＲＥＭ２のレベルを低下させる、
（ｃ）ヒトＴＲＥＭ２を発現するＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター細胞におけるｓＴＲＥＭ２のシェディングを阻害する、
（ｄ）ヒトＭＤＭ細胞においてチロシンリン酸化を誘導する、
（ｅ）ヒトＭＤＭ細胞においてＳＹＫリン酸化を誘導する、
（ｆ）ＩＬ－３４及びＣＳＦ－１の非存在下においてヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアの生存を増強する、
（ｇ）ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアにおけるｓＴＲＥＭ２のシェディングを阻害する、
（ｈ）ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアにおいてＳＹＫリン酸化を誘導する、及び
（ｉ）ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアにおけるＡβオリゴマーの存在下での総Ａβプラーク強度及び／又は平均Ｘ０４プラーク強度を増加させる（例えば、本明細書における実施例１７のアッセイに記載される）。いくつかの実施形態では、抗体はまた、オフターゲット結合アッセイ（例えば、本明細書における実施例１０に記載される）において低いオフターゲット結合スコア（例えば、１未満のスコア）を有する。さらに、いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号１７、１３３、１３５、１３７若しくは１３９のアミノ酸配列を含む、又は抗体が、配列番号１４４のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる重鎖を含む。いくつかの例では、抗体は、（ａ）Ｎ２９７Ｇ置換、（ｂ）Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ置換（ＬＡＬＡＰＧ置換）、又は（ｃ）Ｎ２９７Ｇ、Ｍ４２８Ｌ、及びＮ４３４Ｓ置換を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。いくつかの例では、抗体は、低下したエフェクター機能を有するか、若しくはエフェクターレスであるか、又はＦｃγＲに結合しない。
本明細書におけるいくつかの実施形態では、二重特異性抗体若しくは多重特異性抗体であるか、又は少なくとも１つの他の分子に共有結合的若しくは非共有結合的にコンジュゲートされている。いくつかの例では、抗体は、少なくとも１つの他の分子に共有結合的又は非共有結合的にコンジュゲートされ、少なくとも１つの他の分子が、検出標識及び／又は薬物を含む。
本開示はまた、本明細書に記載の抗体及び薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物を含む。本開示はまた、本明細書に開示される抗体をコードする単離された核酸又は２つ以上の核酸のセットを包含する。本開示はまた、本明細書における抗体の重鎖及び軽鎖をコードする１つ以上の核酸を含む単離されたベクターを含む。本開示は、核酸又はベクターを含む単離された宿主細胞を更に包含する。本開示はまた、ＴＲＥＭ２に特異的に結合する抗体を産生する方法であって、抗体の発現に適した条件下で宿主細胞を培養することを含む方法を包含する。いくつかの例では、本方法は、宿主細胞から抗体を回収することを含む。本開示はまた、本方法によって産生される抗体を包含する。
本開示は、本明細書における抗体又は本明細書における医薬組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象におけるＴＲＥＭ２機能喪失に関連する症状を治療する方法を更に含む。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書における抗体又は本明細書における医薬組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象のｓＴＲＥＭ２のレベルを低下させる方法を含む。いくつかの例では、症状は神経炎症性若しくは神経変性疾患であるか、又は対象は神経炎症性若しくは神経変性疾患に罹患している。いくつかの例では、神経炎症性疾患又は神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、前頭側頭型認知症、認知症、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ナス・ハコーラ病、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、リソソーム蓄積症、スフィンゴミエリンリピドーシス（ニーマン・ピックＣ）、ムコ多糖症ＩＩ／ＩＩＩＢ、異染性白質ジストロフィー、多巣性運動ニューロパチー、神経ベーチェット病、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、視神経炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、脳卒中、横断性脊髄炎、外傷性脳損傷、又は脊髄損傷である。いくつかの例では、疾患は、アルツハイマー病である。いくつかの例では、疾患は、ＭＳである。
本開示はまた、ＴＲＥＭ２機能喪失に関連する症状の治療を必要とする対象におけるＴＲＥＭ２機能喪失に関連する症状の治療において使用するための本明細書における抗体又は医薬組成物を包含する。いくつかの実施形態では、本明細書における開示は、ｓＴＲＥＭ２のレベルを低下させることを必要とする対象においてｓＴＲＥＭ２のレベルを低下させるのに使用するための本明細書における抗体又は医薬組成物を包含する。いくつかの例では、症状は、神経炎症性疾患若しくは神経変性疾患であるか、又は対象が、神経炎症性疾患若しくは神経変性疾患に罹患している。いくつかの例では、神経炎症性疾患又は神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、前頭側頭型認知症、認知症、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ナス・ハコーラ病、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、リソソーム蓄積症、スフィンゴミエリンリピドーシス（ニーマン・ピックＣ）、ムコ多糖症ＩＩ／ＩＩＩＢ、異染性白質ジストロフィー、多巣性運動ニューロパチー、神経ベーチェット病、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、視神経炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、脳卒中、横断性脊髄炎、外傷性脳損傷、又は脊髄損傷である。いくつかの例では、疾患は、アルツハイマー病である。いくつかの例では、疾患は、ＭＳである。
本開示は更に、ＴＲＥＭ２機能喪失に関連する症状の治療を必要とする対象におけるＴＲＥＭ２機能喪失に関連する症状を治療するための医薬の調製における本明細書における抗体又は本明細書における医薬組成物の使用を含む。本明細書における開示はまた、ｓＴＲＥ２のレベルを低下させることを必要とする対象においてｓＴＲＥ２のレベルを低下させるための医薬の調製における抗体又は医薬組成物の使用を含む。いくつかの例では、症状は、神経炎症性疾患若しくは神経変性疾患であるか、又は対象が、神経炎症性疾患若しくは神経変性疾患に罹患している。いくつかの例では、神経炎症性疾患又は神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、前頭側頭型認知症、認知症、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ナス・ハコーラ病、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、リソソーム蓄積症、スフィンゴミエリンリピドーシス（ニーマン・ピックＣ）、ムコ多糖症ＩＩ／ＩＩＩＢ、異染性白質ジストロフィー、多巣性運動ニューロパチー、神経ベーチェット病、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、視神経炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、脳卒中、横断性脊髄炎、外傷性脳損傷、又は脊髄損傷である。いくつかの例では、疾患は、アルツハイマー病である。いくつかの例では、疾患は、ＭＳである。
追加の目的及び利点は、以下の説明に部分的に記載され、説明から部分的に理解されるか、又は実践によって習得され得る。目的及び利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘される要素及び組み合わせによって実現及び達成される。前述の一般的な説明及び以下の詳細な説明は、いずれも例示的かつ説明的なものにすぎず、特許請求の範囲を限定するものではないことを理解されたい。例えば、本明細書に示され特許請求される様々な実施形態に加えて、開示された主題はまた、本明細書に開示され特許請求される特徴の他の組み合わせを有する他の実施形態を対象とする。したがって、本明細書に提示される、特に態様又は実施形態として提示される特定の特徴は、本開示の主題が本明細書に開示される特徴の任意の好適な組み合わせを含むように、本開示の主題の範囲内において他の様式で互いに組み合わせられ得る。本明細書に開示された主題の特定の実施形態の説明は、例示及び説明の目的で提示されている。網羅的であること、又は開示された主題を開示される実施形態に限定することは意図されていない。
図面の簡単な説明
図１は、異なる免疫戦略を有するハイブリドーマによって得られた抗ＴＲＥＭ２クローンの概要を示す。
図２Ａ～図２Ｂは、３つの異なる抗体による様々なＴＲＥＭ２ストークのペプチド配列及び各ペプチドへの結合強度を提供する。図２Ａは、ＴＲＥＭ２ストークドメイン内のペプチド断片の配列を示す。残基１５７と残基１５８との間のＴＲＥＭ２切断部位に隣接するＴＲＥＭ２残基を太字で示す。図２Ｂは、図２Ａのペプチドに対する３つの抗体の結合データ（ｎＭ）を示す。結合は、Ａ６２０吸光度値と共に灰色の濃淡で示されている（濃い陰影はより強い結合を示す）。
図３Ａ～図３Ｂは、抗ＴＲＥＭ２抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列及び重鎖可変領域アミノ酸配列を示す。３．１０Ｃ２可変領域配列と比較したアミノ酸の相違を黒色で示す。Ｃｈｏｔｈｉａ又はＫａｂａｔによるＣＤＲ領域は、配列の上に示されており、Ｋａｂａｔ ＣＤＲの定義にも下線が引かれている。図３Ａは、５つのクローンについての軽鎖可変領域配列を示す。図３Ｂは、６つのクローンについての重鎖可変領域配列を示す。
図４は、異なる軽鎖と組み合わせたラットレパートリーのディープシーケンシングデータセットからのＩＧＨＶ６－８クローンを用いた抗体のＥＬＩＳＡスクリーニングを示す。表中のストーク、１４９－１５８、１５９－１７５及びインヒビンは、それぞれ、ＴＲＥＭ２のストークドメイン、ストークの断片１４９～１５８及び１５９～１７５、並びに３０ｍｅｒのインヒビン対照ペプチドを指す。ＥＬＩＳＡシグナルを灰色の濃淡で示す。ＩＭＧＴ定義（長さ５）におけるクローンのＣＤＲ Ｈ３配列を左の列に示す。クローン３．１０Ｃ２は、それ自体の同族軽鎖のみと対合された。ＫＶ２Ｓ１１は、生殖系列配列構成のＩＧＫ２Ｓ１１生殖細胞系列セグメント及び３．１０Ｃ２抗体群と同様のＶＪ接合配列を有する軽鎖を指す。
図５は、抗ＴＲＥＭ２抗体の結合に影響を与えるアラニン／グリシン変異の概要を示す。灰色のボックスは、異なる抗体のオフレート結合又は総結合のいずれかに影響を及ぼす突然変異を示す。ＴＲＥＭ２中のアミノ酸残基及び位置を表の最上段に示す。タンパク質の切断部位に隣接するＴＲＥＭ２の２つの残基は、同じ行で灰色で強調されている。抗体ＡＬ２ｐ－３１は、マウス抗体９Ｆ５のヒト化高親和性変異体である。抗体Ｐａｒａ．０９は、抗体３．２Ｈ７軽鎖を有する。
図６Ａ～図６Ｂは、ヒト化３．１０Ｃ２ ＣＤＲグラフト変異体配列を示す。可変領域配列は、ヒト化に使用されるヒトフレームワーク配列にアラインメントされる。フレームワーク配列（上の配列）との差異を黒色で強調する。Ｋａｂａｔの定義におけるＣＤＲ領域には下線が引かれている。各図中の「３．１０Ｃ２」は、ラット３．１０Ｃ２可変領域配列を指す。図６Ａは、３つの変異体の軽鎖可変領域配列を示す。図６Ｂは、４つの変異体の重鎖可変領域配列を示す。
図７Ａ～図７Ｂは、３．１０Ｃ２ ＣＤＲグラフトクローンの発現収率を示す。図７Ａは、異なる重鎖及び軽鎖ヒト化変異体を有するヒト化ＩｇＧ変異体の力価（ｍｇ／Ｌ）によって測定される場合の発現収率を示す。クローンＬ９及びＬ１０は、それぞれクローンＬ１及びＬ５と同一である（図６Ａを参照）が、フレームワーク４にＱ１００Ｐ変異を有する。図７Ｂは、ヒト化３．１０Ｃ２－Ｌ１変異体又はラット３．１０Ｃ２軽鎖と組み合わせたヒト化３．１０Ｃ２－Ｈ１重鎖変異体を有するＦａｂ断片（ｍｇ）の発現収率を示す。
図８Ａ～図８Ｂは、ヒト化３．２７Ｈ７軽鎖及びＰａｒａ．０９重鎖ＣＤＲグラフト変異体配列を示す。可変領域配列は、ヒト化に使用されるヒトフレームワーク配列にアラインメントされる。フレームワーク配列（上の配列）との差異を黒色で強調する。Ｋａｂａｔの定義におけるＣＤＲ領域には下線が引かれている。「３．２７Ｈ７」及び「Ｐａｒａ．０９」はラット可変領域配列である。図８Ａは、３つの変異体の軽鎖可変領域配列を示す。図８Ｂは、４つの変異体の重鎖可変領域配列を示す。
図９Ａ～図９Ｂは、抗体ｈ３．１０Ｃ２．ｖ１の可変領域及びＣＤＲの配列を示す。Ｋａｂａｔ ＣＤＲ領域には下線が引かれている。図９Ａは、軽鎖可変領域配列を示す。図９Ｂは、重鎖可変領域配列を示す。
図１０は、抗体３．１０Ｃ２のスキャニング突然変異誘発を示す。図１０は、３７℃における抗体３．１０Ｃ２重鎖ＣＤＲ単一点突然変異体の解離速度の分布を示す。同じ実験セットで決定された抗体３．１０Ｃ２の解離速度を点線で示す。野生型３．１０Ｃ２と比較してより低い解離速度を有する２つの３．１０Ｃ２点突然変異体が示されており、それぞれの改善率が括弧内に示されている。４４０個の突然変異体のデータを示す。
図１１は、ラット及びＣＨＯ細胞で産生されたＰａｒａ．０９のヒト化変異体のプロテインＡクロマトグラフィー後の発現収率（ｍｇ／Ｌ）を示す。各抗体のアイソタイプを示す。
図１２Ａ～図１２Ｂは、抗体ｈＰａｒａ．０９．ｖ２の可変領域のアミノ酸配列を示す。Ｋａｂａｔ ＣＤＲ領域には下線が引かれている。図１２Ａは、軽鎖可変領域配列を示す。図１２Ｂは、重鎖可変領域配列を示す。
図１３Ａ及び図１３Ｂは、ｈＰａｒａ．０９．ｖ２及びｈＰａｒａ．０９．ｖ２突然変異体の軽鎖（図１３Ａ）及び重鎖（図１３Ｂ）の配列、並びにＣＤＲ領域を示す。ｈＰａｒａ．０９．ｖ２と比較した、Ｑ１００Ｐ、Ｉ５８Ｖ及びＶ１０４Ｌ突然変異、並びに軽鎖における他の突然変異が強調表示される。Ｋａｂａｔ ＣＤＲ領域には下線が引かれている。
図１４Ａ～図１４Ｂは、軽鎖（図１４Ａ）及び重鎖（図１４Ｂ）抗体ｈ３．１０Ｃ２．ｖ１及びｈ３．１０Ｃ２．ｖ１突然変異体の可変領域の配列及びＣＤＲ領域を示す。軽鎖におけるＱ１００Ｐ、Ｉ５８Ｖ及びＬ１０４Ｖ突然変異が強調される。Ｋａｂａｔ ＣＤＲ領域には下線が引かれている。
図１５は、４つの抗ＴＲＥＭ２抗体（親及びヒト化）の正規化されたバキュロウイルス（ＢＶ）ＥＬＩＳＡ反応性を示す：ラット可変領域及びヒトＩｇＧ１定常領域を有するキメラクローン、並びにＦｃ受容体結合を排除するためのＮ２９７Ｇ変異を有するヒトＩｇＧ１定常領域を有するヒト化変異体ｈ３．１０Ｃ２．ｖ１及びｈＰａｒａ．０９．ｖ２。
図１６は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで可溶性ＴＲＥＭ２（ｓＴＲＥＭ２）に結合する及び、それに結合しない抗体を示す。図１６は、試験された抗体についてのｓＴＲＥＭ２結合についての正規化された値を示す：対照抗体１．１６Ｂ８（ＣＴＬ）、ラットＰａｒａ．０９－ＬＣ ３．２７Ｈ７ ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧ（Ｐａｒａ０９）、ラット３．１０Ｃ２ ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧ（３．１０Ｃ２）、ラット３．１８Ｅ５ ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧ（３．１８Ｅ５）、ラット３．５０Ｇ１ ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧ（３．５０Ｇ１）、ラット３．２７Ｈ７ ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧ（３．２７Ｈ７）、ラット３．３６Ｆ５ ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧ（３．３６Ｆ５）、Ａ．９Ｆ５（本明細書では９Ｆ５とも呼ばれる）、ＡＬ２ｐ－１２、ＡＬ２ｐ－３１、ＡＬ２ｐ－５８、ＢＭ．３Ｄ３、ＢＭ．４２Ｅ８、ＢＭ．ＲＳ９、ＢＭ．１４Ｄ３、及びＢＭ．１４Ｄ８。
図１７は、ｍＩｇＧ２ａフォーマットにおける組換え抗体のＪｕｒｋａｔレポーター活性を示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞の核因子）の制御下でルシフェラーゼを発現し、ヒトＴＲＥＭ２を発現するように操作した。図１７は、細胞において中程度から強いルシフェラーゼ発現を誘導した８つの抗体：３．１０Ｃ２、３．１８Ｅ５、３．２７Ｈ７、３．５０Ｇ１、３．１７Ｇ１２、３．２７Ｈ５、３．４１Ｂ１０、及び３．４７Ｂ１を示す。
図１８Ａ～図１８Ｂは、ヒトＴＲＥＭ２を発現するＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター細胞におけるルシフェラーゼの漸増濃度のラット抗ヒト及びヒト化抗ＴＲＥＭ２抗体発現の効果を示す。ｍＩｇＧ２ ＬＡＬＡＰＧフォーマット（図１８Ａ）及びヒト化ｈＰａｒａ．０９．ｖ２及びｈ３．１０Ｃ２．ｖ１抗体（図１８Ｂ）における様々な濃度のラット抗ヒト抗体の存在下でのルシフェラーゼシグナルを２４時間後に示す。
図１９Ａ～図１９Ｃは、ｈＴＲＥＭ２突然変異体Ｒ４７Ｈ（図１９Ａ）、Ｒ６２Ｈ（図１９Ｂ）又はＨ１５７Ｙ（図１９Ｃ）を発現するＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター細胞株におけるラット抗ヒト３．１０Ｃ２、３．１８Ｅ５、３．２７Ｈ７及び３．５０Ｇ１ ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧ抗体によるルシフェラーゼ発現の誘導を示す。
図２０Ａ～図２０Ｂ及び図２０Ｄは、ＥＬＩＳＡによって測定した場合、２４時間後にｈＴＲＥＭ２を発現するＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター細胞株におけるｓＴＲＥＭ２シェディングに対するラット抗ヒト抗体及びヒト化抗体の効果を示す。図２０Ａは、漸増濃度のｓＴＲＥＭ２レベルに対するラット１．２０Ａ２ ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧ、ラットＰａｒａ．０９ ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧ及びラット３．１０Ｃ２ ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧ抗体の効果を示す。図２０Ｂは、ヒト化ｈ３．１０Ｃ２．ｖ１及びヒトＩｇＧ１ Ｎ２９７ＧフォーマットのｈＰａｒａ．０９．ｖ２の効果を示す。図２０は、ヒト化抗体ｈＰａｒａ．０９ ｖ２、ｈＰａｒａ．０９．ｖ２ Ｑ１００Ｐ／Ｖ１０４Ｌ、及びｈＰａｒａ．０９．ｖ２ Ｑ１００Ｐの効果を示す。図２０Ｃは、ｈＰａｒａ．０９ ｖ２，ｈＰａｒａ．０９．ｖ２ Ｑ１００Ｐ／Ｖ１０４Ｌ及びｈＰａｒａ．０９．ｖ２ Ｑ１００Ｐ抗体によって誘導されたルシフェラーゼ発現を示す。
図２１は、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来ミクログリアにおけるＴＲＥＭ２シェディングに対するマウスＩｇＧ２ ＬＡＬＡＰＧを含む抗体３．１０Ｃ２、３．１８Ｅ５、３．２７Ｈ７、３．５０Ｇ１、及び９Ｆ５の効果を示す。
図２２Ａ～図２２Ｃは、ヒト化抗ＴＲＥＭ２抗体とのインキュベーション後の初代ヒト単球由来マクロファージ（ｈＭＤＭ）細胞におけるｐａｎホスホ－チロシン（ｐＹ）レベル（図２２Ａ）及びホスホ－ＳＹＫ（ｐＳＹＫ）レベル（図２２Ｂ～図２２Ｃ）を、規定される１０～２０分の期間（図２２Ａ～図２２Ｂ）又は用量範囲（図２２Ｃ）について示す。図２２Ｂでは、ＴＲＥＭ２発現を減少させるように改変されたｈＭＤＭ細胞（ｇＴＲＥＭ２）とリン酸化も比較した。図２２Ｃは、漸増用量のヒト化抗体ｈＰａｒａ．０９．ｖ２ Ｎ２９７Ｇ若しくはｈＰａｒａ．０９．ｖ２ Ｑ１００Ｐ／Ｖ１０４Ｌ Ｎ２９７Ｇ、又は対照抗体によるＳＹＫリン酸化の効果を示す。ｐＳＹＫレベルを測定し、総ＳＹＫ量に対して正規化した。３つの独立した生物学的標本からｎ＝６。
図２３Ａ～図２３Ｅは、ラット抗ヒト及びヒト化抗ＴＲＥＭ２抗体がヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）ミクログリアの生存を促進することを示す。図２３Ａは、対照抗体（ｇＤ ｈＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｇ）治療によって誘導される応答の倍数として測定される、漸増用量のｈＰａｒａ．０９ ｖ２，ｈ３．１０Ｃ２．ｖ１による治療によって誘導される野生型（ＷＴ、細線）又はＴＲＥＭ２ ＫＯ（ＫＯ、点線）のｉＰＳＣミクログリアの生存を示す。エラーバー＋／－ＳＥＭ。図２３Ｂは、漸増用量（０、１、１０、１００ｎｇ）での抗体による治療に応答したｉＰＳＣ－ＭＧ細胞の生存を示す。抗体は、ＴＲＥＭ２結合（図の上部に示される残基のスパン）に従ってグループ分けされる。エラーバー＋／－ＳＥＭ。図２３Ｃは、１時間、４時間及び２４時間の時点でのｉＰＳＣ－ＭＧにおけるヒト化抗体（ｈＰａｒａ０９．ｖ２ Ｎ２９７Ｇ、ｈＰａｒａ０９．ｖ２．Ｑ１００Ｐ／Ｖ１０４Ｌ Ｎ２９７Ｇ）によるｐＳＹＫ誘導を示す。エラーバー＋／－ＳＥＭ。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊＜０．０００１。図２３Ｄは、ＳＹＫ阻害剤（ＳＹＫｉ）の存在下及び非存在下におけるミクログリア生存に対する漸増濃度のヒト化Ｐａｒａ．０９．ｖ２抗体又は抗ｇＤ対照抗体の効果を示す。エラーバー＋／－ＳＥＭ。図２３Ｅは、対照抗ｇＤ抗体と比較した、列挙された抗ＴＲＥＭ２抗体のミクログリア生存及びＥＣ５０（グラフの下の表に示すｎＭ）を示す。エラーバー＋／－ＳＥＭ。
図２４Ａ～図２４Ｃは、ヒト化抗ＴＲＥＭ２抗体がｉＰＳＣ－ＭＧアミロイドベータプラーク形成及び圧縮を増加させることを示す。図２４Ａは、ｈＰａｒａ．０９．Ｑ１００Ｐ ｈＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｇ又は対照ｇＤ．ｈＩｇＧ１．Ｎ２９７Ｇで治療したｉＰＳＣミクログリア周囲のＡβプラーク様構造及びＡβ凝集体形成の免疫蛍光画像を示す。左から右へ、パネルは以下を示す：Ａβアミロイド斑についての染色（メトキシＸ０４染色）、ミクログリア染色（ＩＢＡ１染色）、及びＩＢＡ１陽性ミクログリア、Ａβ及びアミロイド斑についての染色のコロケーションを示す３つ全ての染色からの統合画像。図２４Ｂは、いずれもヒトＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｇフォーマットにおける漸増濃度のいくつかのヒト化抗ＴＲＥＭ２抗体又は対照抗ｇＤ抗体の存在下での総Ａβプラーク強度を示す。ＥＣ５０値を各抗体についてｎＭでグラフの下の表に示す。エラーバー＋／－ＳＥＭ。図２４Ｃは、いずれもヒトＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｇフォーマットにおける、いくつかのヒト化抗ＴＲＥＭ２抗体又は対照抗ｇＤ抗体の漸増抗体濃度での平均Ｘ０４ ｉＰＳＣ－ＭＧプラーク強度を示す。ＥＣ５０値を、曲線の下の表に各抗体についてｎＭで示す。
図２５Ａ～図２５Ｃは、抗ＴＲＥＭ２抗体又は対照抗体で治療したマウスにおけるｓＴＲＥＭ２レベルを示す。図２５Ａ～図２５Ｂは、マウスＩｇＧ２ ＬＡＬＡＰＧフォーマットの３．１０Ｃ２及びＰａｒａ．０９で治療したマウスの血漿（図２５Ａ）及び脳ホモジネート（図２５Ｂ）試料中の対照抗体（ｇｐ１２０）に対するｓＴＲＥＭ２のパーセントを示す。図２５Ｃは、アイソタイプ対照と比較した、漸増用量のマウスＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧフォーマットのＰａｒａ．０９及びＡＬ２ｐ５８抗体で治療したマウスの血漿中のｓＴＲＥＭ２レベル（ｐｇ／ｍｌ）を示す。
図２６Ａ～図２６Ｆは、ｈ３．１０Ｃ２．ｖ１．ｈＩｇＧ１．Ｎ２９７Ｇ、ｈＰａｒａ．０９．ｖ２．ｈＩｇＧ１．Ｎ２９７Ｇ、又は抗ｇＤ．ｈＩｇＧ１．Ｎ２９７Ｇ対照抗体を投薬したカニクイザルのＣＳＦ、血漿及び脳溶解物試料における経時的なｓＴＲＥＭ２レベルを示す。図２６Ａ～図２６Ｃは、ＣＳＦ（図２６Ａ）、血漿（図２６Ｂ）及び脳（図２６Ｃ）において２日間にわたって測定されたｓＴＲＥＭ２レベルを示す。図２６Ｄ～図２６Ｆは、ＣＳＦ（図２６Ｄ）、血漿（図２６Ｅ）及び脳（図２６Ｆ）において２８日間にわたって測定されたｓＴＲＥＭ２レベルを示す。
図２７は、増殖マーカーＫｉ６７について染色された、３．１０Ｃ２、Ｐａｒａ．０９、又は対照抗体で治療したマウスの脳切片を示す。細胞増殖は、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）陽性細胞の数当たりのＫｉ６７＋細胞の平均数として表される。
例示的な実施形態の説明
定義
本明細書で使用される場合、約という用語は、明示的に示されているかどうかにかかわらず、例えば、整数、分数、及びパーセンテージを含む数値を指す。約という用語は、一般に、当業者が列挙された値（例えば、同じ機能又は結果を有する）と等価であると考えるであろう数値の範囲（例えば、列挙された範囲の＋／－５～１０％）を指す。少なくとも及び約等の用語が数値又は範囲のリストの前にある場合、それらの用語は、リストに提供された値又は範囲の全てを修飾する。いくつかの例では、約という用語は、最も近い有効数字に丸められた数値を含み得る。
別段定義されない限り、本発明に関連して使用される科学用語及び専門用語は、当業者が通常理解する意味を有するものとする。さらに、文脈が特に必要としない限り、単数形の用語は、複数形を含み、複数形の用語は、単数形を含むものとする。
本願において、「又は」の使用は、別段述べられない限り、「及び／又は」を意味する。複数の従属請求項の文脈において、「又は」の使用は、選択的にのみ、１つより多い先行する独立請求項又は従属請求項を指す。また、「エレメント」又は「構成要素」等の用語は、別段具体的に述べられていない限り、１つの単位及びエレメントを含むエレメント及び構成成分と、１つよりも多いサブユニットを含む構成成分との両方を包含する。
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養及び形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）、酵素反応及び精製法に関連して使用される例示的な手法は、例えば、とりわけ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））に説明されている。
以下の用語は、本開示に従って利用される場合、他に別段の指示がない限り、以下の意味を有するものと理解すべきである。
本明細書で使用される場合、「ＴＲＥＭ２」又は「骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体」は、特に明記しない限り（すなわち、マウスＴＲＥＭ２又はカニクイザルＴＲＥＭ２等）、ヒトＴＲＥＭ２タンパク質（「ｈＴＲＥＭ２」）を指す。アミノ酸１～１８のシグナル配列を含む例示的なｈＴＲＥＭ２アミノ酸配列を配列番号２１に示し、シグナル配列を含まない例示的な配列を配列番号２２に示す。シグナル配列を含むＴＲＥＭ２は、タンパク質の「前駆体」又は「プレタンパク質」形態と呼ばれることもあり、シグナル配列を含まないＴＲＥＭ２は、タンパク質の「成熟」形態と呼ばれることもある。タンパク質の膜結合型には、Ｖ型免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン（アミノ酸１９～１２８）、続いてＴＲＥＭ２「ストーク」ドメイン（アミノ酸１２９～１７４において；配列番号９０）が含まれ、これらは集合的にタンパク質の「細胞外ドメイン」を形成し、続いて膜貫通ドメイン（残基１７５～１９７）、及びサイトゾルドメイン（残基１９８～２３０）が含まれる。タンパク質の可溶性形態、本明細書では「可溶性ＴＲＥＭ２」又は「ｓＴＲＥＭ２」は、ストークドメインでの切断又は選択的スプライシングのいずれかによって体内で生成され得る。例えば、プロテアーゼは、Ｈ１５７とＳ１５８との間でタンパク質を切断し、Ｈ１５７までのタンパク質のＮ末端部分、例えば残基１９～１５７を含む可溶性ＴＲＥＭ２を切断し得る。例示的なｓＴＲＥＭ２アミノ酸配列を配列番号２３に示す。切断されてｓＴＲＥＭ２を形成し得るタンパク質の部分は、「外部ドメイン」としても公知であり、残基１９～１５７を含む。一般に、本明細書で使用される場合、「ＴＲＥＭ２」という用語は、文脈がタンパク質の両方の形態が参照されていることを明示的に明確にしない限り、タンパク質の膜結合形態を指す。さらに、ｈＴＲＥＭ２は、いくつかのアイソフォーム又は対立遺伝子を含み、その天然の配列又はスプライシングは、配列番号２１及び２２に示され、本明細書における実施例のセクションに記載されているものとは異なり得る。ＴＲＥＭ２という用語は、特定のアイソフォーム又は配列が言及されない限り、ＴＲＥＭ２のこれらの天然の形態の全てを含む。
「親和性」とは、分子（例えば、抗体）とその結合パートナー（例えば、抗原）との単一の結合部位の間の非共有結合性相互作用の合計の強度のことを指す。別途示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は一般に、解離定数（ＫＤ）によって表し得る。親和性は、本明細書に記載するものを含め、当技術分野で一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な実例となる例示的な方法を以下に記載する。
本明細書において「抗体」という用語は、少なくとも重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と、少なくとも軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３とを含む分子のことを指し、その分子は、抗原に結合することができる。この用語は、最も広い意味で使用され、それらが所望のＴＲＥＭ２特異的結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ等）、完全長抗体、一本鎖抗体、抗体コンジュゲート及び抗体断片を含むがこれらに限定されない、様々な抗体構造を包含する。
「単離された」抗体は、その天然の環境の構成要素から分離されたものである。いくつかの態様では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）法によって測定される場合、９５％又は９９％より高い純度になるまで精製される。抗体純度の評価のための方法の総説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ８４８：７９－８７（２００７）を参照されたい。
「抗原」とは、抗体の標的、すなわち、抗体が特異的に結合する分子のことを指す。「エピトープ」という用語は、抗体が結合する相手である、タンパク質性又は非タンパク質性のいずれかの、抗原上の部位を示す。タンパク質上のエピトープは、連続した一続きのアミノ酸から両方とも形成され得る（線状エピトープ）か、又は例えば、抗原の折り畳みに起因して（すなわち、タンパク質性抗原の三次折り畳みによって）空間的に近接する、非連続のアミノ酸を含み得る（立体構造エピトープ）。線状エピトープは、通常、タンパク質性抗原を変性剤に曝露した後も依然として抗体によって結合されるのに対し、立体構造エピトープは、通常、変性剤での治療により破壊される。いくつかの例では、本明細書におけるＴＲＥＭ２「エピトープ」は、分子内の天然のプロテイナーゼ切断部位又は切断点等の部位に「またがる（ｓｐａｎ）」場合があり、これは、切断部位の両側で１つ以上の抗体残基と抗原との間に密接な接触があること、又は抗体が部位にまたがるＴＲＥＭ２ペプチドに結合することを意味する。このような場合、ＴＲＥＭ２エピトープは、切断部位又は切断点の両側の残基を含む。
本開示において、「特異的に結合する」又は「特異的結合」及び同様の用語は、結合親和性が十分に強く、結合対のメンバー間の相互作用がランダムな分子会合（すなわち、「非特異的結合」）に起因し得ないことを意味する。特異的結合は、典型的には、１μＭ以下の解離定数（ＫＤ）を必要とする。特異的結合は、多くの場合、例えば、１０ｎＭ以下のＴＲＥＭ２に対するＫＤを含み得る。
「抗ＴＲＥＭ２抗体」又は「ＴＲＥＭ２抗体」又は「ＴＲＥＭ２に特異的に結合する抗体」又は「ＴＲＥＭ２に結合する抗体」及び同様の語句は、本明細書で定義されるＴＲＥＭ２に特異的に結合する抗体を指す。
本明細書における特定の抗体は「可溶性ＴＲＥＭ２に結合しない」。本明細書で使用される場合、これは、抗体が、ＥＬＩＳＡアッセイでアッセイした場合、ｓＴＲＥＭ２に対して１０％を超える結合を示さないことがあり、いくつかの例ではｓＴＲＥＭ２に対して５％を超える結合を示さないことを意味し、結合％は、ｓＴＲＥＭ２に対する結合が１００％に設定されている陽性対照抗体１．１６Ｂ８の結合に対して正規化されている。対照抗体１．１６Ｂ８の軽鎖配列を配列番号１７０に示し、その重鎖配列を配列番号１７１に示す。いくつかの実施形態では、ＥＬＩＳＡアッセイが、下記の実施例１１及び図１６に示されるように行われる場合がある。いくつかの実施形態では、抗体３．１７Ａ９をアッセイにおける検出剤として使用する。検出抗体３．１７Ａ９の軽鎖配列を配列番号１６８に示し、その重鎖配列を配列番号１６９に示す。本明細書における特定の抗体は、「ＦｃγＲに結合しない」か、又は「ＦｃγＲに結合しない」重鎖定常領域若しくはＦｃ領域を有し、これは、結合が適切なｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいてトレースレベルを超えて検出されないことを意味する。
「重鎖」という用語は、リーダー配列の有無にかかわらず、少なくとも重鎖可変領域を含むポリペプチドのことを指す。いくつかの実施形態では、重鎖は、重鎖定常領域の少なくとも一部を含む。「完全長重鎖」という用語は、リーダー配列の有無にかかわらず、重鎖可変領域及び重鎖定常領域を含むポリペプチドのことを指す。
「軽鎖」という用語は、リーダー配列の有無にかかわらず、少なくとも軽鎖可変領域を含むポリペプチドのことを指す。いくつかの実施形態では、軽鎖は、軽鎖定常領域の少なくとも一部を含む。「完全長軽鎖」という用語は、リーダー配列の有無にかかわらず、軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域を含むポリペプチドのことを指す。
本明細書で使用される場合、「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、抗体可変領域の各領域のことを指し、それらの領域は、配列が超可変性である、抗原結合特異性を決定する領域、例えば、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）である。一般に、抗体は、６つのＣＤＲ；ＶＨに３つ（ＣＤＲ－Ｈ１又は重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）、ＶＬに３つ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３）を含む。別段示されない限り、ＣＤＲは本明細書における配列表に従って決定され、重鎖及び軽鎖の領域及びドメインのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１）に記載されているＫａｂａｔナンバリングシステムに従ってナンバリングされる。いくつかの例では、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａ重鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２の両方を配列表に提供する。配列番号１～６及び９～１０、並びに１１～１６及び１９～２０の場合、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲは、ＣＤＲ－Ｈ１及びＣＤＲ－Ｈ２において異なるが、残りの４つのＣＤＲにおいて同じである。当業者は、ＣＤＲの表記が、ＭｃＣａｌｌｕｍ又は他の任意の科学的に認められた命名システムに従っても決定され得ることを理解するだろう。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）；ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６））を参照されたい。アミノ酸残基２７ｃ－３６（Ｌ１）、４６－５５（Ｌ２）、８９－９６（Ｌ３）、３０－３５ｂ（Ｈ１）、４７－５８（Ｈ２）及び９３－１０１（Ｈ３）に生じる抗原接触は、ＭａｃＣａｌｌｕｍ ＣＤＲを構成する。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の一部ではない可変領域残基の残基のことを指す。可変領域のＦＲは、一般に、４つのＦＲ：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４からなる。したがって、ＣＤＲ及びＦＲ配列は、一般的に、ＶＨ（又はＶＬ）において次の配列で出現する：ＦＲ１－ＣＤＲ－Ｈ１（ＣＤＲ－Ｌ１）－ＦＲ２－ＣＤＲ－Ｈ２（ＣＤＲ－Ｌ２）－ＦＲ３－ＣＤＲ－Ｈ３（ＣＤＲ－Ｌ３）－ＦＲ４。
「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般的に、類似の構造を有し、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐａｇｅ ９１（２００７）を参照されたい。可変ドメインは、ＦＲ１及び／又はＦＲ４の全部又は一部を伴って又は伴わずに、重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３；並びにＦＲ１及び／又はＦＲ４の全部又は一部を伴って又は伴わずに軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３を含み得る。すなわち、可変ドメインは、抗原結合活性を保持する限り、ＦＲ１及び／又はＦＲ４の一部を欠いていてもよい。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するために十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体を、その抗原に結合する抗体のＶＨ又はＶＬドメインを使用して単離することにより、それぞれ相補的なＶＬ又はＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングしてもよい。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０－８８７（１９９３）；Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）を参照。
抗体の軽鎖及び重鎖の「定常領域」とは、ＦＲ及びＣＤＲ並びに可変領域の外側の追加の配列部分のことを指す。特定の抗体断片は、定常領域の全部又は一部を欠いていてもよい。Ｎ末端からＣ末端に向かって、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＨ）を有し、それに続いて３つの定常重鎖ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端に向かって、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＬ）を有し、それに続いて定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。
本明細書における「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部分を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、ネイティブ配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を含む。一態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端までに及ぶ。しかしながら、宿主細胞によって産生される抗体は、重鎖のＣ末端から１つ以上の、特に１つ又は２つのアミノ酸の翻訳後開裂を受けてもよい。したがって、全長重鎖をコードする特定の核酸分子の発現によって、宿主細胞によって産生する抗体は、全長重鎖を含んでいてもよく、又は全長重鎖の開裂した変異体を含んでいてもよい。これは、重鎖の最終的な２つのＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）及びリジン（Ｋ４４７、ＥＵインデックスによるナンバリング）である場合であってもよい。ゆえに、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）又はＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）及びリジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在してもよいし、存在しなくてもよい。したがって、例えば、「完全長ＩｇＧ１」は、Ｇｌｙ４４６及びＬｙｓ４４７を有するか、又はＬｙｓ４４７を有しないか、又はＧｌｙ４４６とＬｙｓ４４７との両方を有しない、ＩｇＧ１を含む。Ｆｃ領域を含む重鎖のアミノ酸配列は、別段示されない限り、本明細書ではＣ末端のグリシン－リジンジペプチドなしで示される。一態様では、本発明による抗体に含まれる、本明細書で指定されるＦｃ領域を含む重鎖はＧｌｙ４４６及びＬｙｓ４４７（ＥＵインデックスによるナンバリング）を含み得る。一態様では、本発明による抗体に含まれる、本明細書で指定されるＦｃ領域を含む重鎖は、Ｇｌｙ４４６（ＥＵインデックスによるナンバリング）を含み得る。本明細書で別段特定されない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されているような、ＥＵナンバリングシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。
「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域に起因し得る生物学的活性のことを指し、それは抗体のアイソタイプによって異なる。抗体エフェクター機能の例としては：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション；並びにＢ細胞活性化が挙げられる。例えば、「インタクトなエフェクター機能」を有する抗体は、その特定のアイソタイプの天然のインタクトなエフェクター機能を有する重鎖定常領域若しくはＦｃ領域、例えば野生型重鎖定常領域若しくはＦｃ領域、又はエフェクター機能に影響を及ぼすことが示されていない改変を有するものを含む。対照的に、抗体重鎖定常領域又はＦｃ領域は、抗体の使用に応じて、エフェクター機能を低減又は増強するために、アミノ酸置換、挿入若しくは欠失、又はグリコシル化修飾等の様々な方法で修飾され得る。本明細書では、いくつかの抗体は「インタクトなエフェクター機能」を有し得るが、他の抗体は「エフェクターレス」であり得、これは、それらが検出可能なＣＤＣ又はＡＤＣＣ活性を示さないこと、又はそれらが検出可能なＣＤＣ又はＡＤＣＣ活性を有さないことが以前に示された重鎖定常領域又はＦｃ領域を含むことを意味する。他の場合では、抗体は、対応する野生型Ｆｃ又は重鎖定常領域（例えば、本明細書における抗体との関連において、低下したエフェクター機能を有することが以前に示されているもの、又は低下したエフェクター機能を有するもの）と比較して「低下したエフェクター機能」を有する変異型Ｆｃ領域又は重鎖定常領域を有し得る。低下したエフェクター機能を有するこのような抗体は、例えば、対応する野生型Ｆｃ領域と比較して、より低い程度のＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性及び／又はＦｃγＲ結合活性を示し得て、及び／又はＦｃＲｎ等の特定のＦｃ受容体への結合等のいくつかのエフェクター機能を保持し得るが、例えば、検出可能なＣＤＣ又はＡＤＣＣ又はＦｃγＲ結合活性が低いか又は全くない。
抗体の「クラス」は、その重鎖によって保有される定常ドメイン又は定常領域の型を指す。抗体の５つの主要なクラスがあり、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭであり、これらのうちのいくつかは、下位クラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に更に分けてもよい。特定の態様では、抗体はＩｇＧ１アイソタイプである。特定の態様では、抗体は、Ｆｃ領域エフェクター機能を低下させるためのＰ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ変異を有するＩｇＧ１アイソタイプのものである。他の態様では、抗体はＩｇＧ２アイソタイプのものである。特定の態様では、抗体は、ＩｇＧ４抗体の安定性を改善するためのヒンジ領域にＳ２２８Ｐ変異を有するＩｇＧ４アイソタイプのものである。いくつかの態様では、抗体は非ヒトＩｇＧ定常領域を有していてもよく、例えばマウスＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧ抗体等のマウスＩｇＧ２ａ抗体であってもよい。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２種類の１つに割り当てられてもよい。
「抗体断片」とは、インタクトな抗体が結合する抗原（すなわち、ＴＲＥＭ２）に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ、及びｓｃＦａｂ）；シングルドメイン抗体（ｄＡｂ）、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。特定の抗体断片の総説については、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１２６－１１３６（２００５）を参照されたい。
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「ホール抗体」という用語は、天然の抗体の構造と実質的に類似の構造を有する抗体、又はＩｇＧ抗体の場合、本明細書で定義されるようなＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体のことを指すために交換可能に本明細書で使用される。
「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の供給源又は種に由来し、重鎖及び／又は軽鎖の残りの部分が異なる供給源又は種に由来する抗体を指す。
「ヒト化」抗体とは、非ヒトＣＤＲ由来のアミノ酸残基と、ヒトＦＲ由来のアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。特定の態様では、ヒト化抗体は、非ヒト抗体の可変ドメインに対応する全て又はほぼ全てのＣＤＲ、及びヒト抗体の可変ドメインに対応する全て又はほぼ全てのＦＲにおける、ほぼ全ての少なくとも１つ、通常２つの可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、任意に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち該集団を構成する個々の抗体が、可能性の或る変異体抗体（これらは例えば天然に存在する変異を含むか又はモノクローナル抗体調製物の製造中に生じ、このような変異体は通常少量存在する）を除き、同一であり及び／又は同じエピトープに結合する。様々な決定基（エピトープ）に対する様々な抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集合から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするように解釈すべきではない。例えば、本発明によるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない種々の手法によって作製され得、このような方法、及びモノクローナル抗体を作製するための他の例示的な方法は、本明細書に記載される。
「多重特異性」抗体は、２つ以上の標的抗原に特異的に結合する抗体であり、「二重特異性」抗体は、２つの抗原に特異的に結合する抗体である。「抗体コンジュゲート」は、治療薬又は標識を含むがこれらに限定されない１つ以上の異種分子にコンジュゲートされた抗体である。
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」とは、配列をアラインメントし、最大の配列同一性パーセントを達成するために必要ならばギャップを導入した後の、アラインメントのためにいかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮しない場合の、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、当分野の技術の範囲内にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ，Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア又はＦＡＳＴＡプログラムパッケージのような公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大整列度を達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含め、配列をアラインメントさせるのに適切なパラメータを決定することができる。あるいは、パーセント同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成することができる。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって作成されており、ソースコードは、米国著作権局（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２０５５９）のユーザドキュメンテーションにファイルされており、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下に登録されており、国際公開第２００１／００７６１１号に記載されている。
別段示されない限り、本明細書における目的のために、パーセントアミノ酸配列同一性の値は、ＦＡＳＴＡパッケージバージョン３６．３．８ｃのｇｇｓｅａｒｃｈプログラム又はその後のＢＬＯＳＵＭ５０比較行列を用いて生成される。ＦＡＳＴＡプログラムパッケージは、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｄ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９８８），’’Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ’’，ＰＮＡＳ ８５：２４４４－２４４８；Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９６）’’Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ’’Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：２２７－２５８；ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ．Ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４６：２４－３６によって認定され、ｗｗｗ．ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｄｏｗｎ．ｓｈｔｍｌ ｏｒ ｗｗｗ．Ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｓｓ／ｆａｓｔａから公的に利用可能である。あるいは、ｇｇｓｅａｒｃｈ（ｇｌｏｂａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｐｒｏｔｅｉｎ）プログラム及びデフォルトオプション（ＢＬＯＳＵＭ５０；ｏｐｅｎ：－１０；ｅｘｔ：－２；Ｋｔｕｐ＝２）を用いて、ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉでアクセス可能な公開サーバを使用して配列を比較し、ローカルではなくグローバルなアライメントを確実に実行することができる。パーセントアミノ酸同一性は、出力アラインメントヘッダ中に与えられる。
「核酸分子」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び／又は物質を含む。各ヌクレオチドは、塩基で構成され、具体的には、プリン塩基又はピリミジン塩基（すなわち、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ））、糖（すなわち、デオキシリボース又はリボース）、及びリン酸基で構成される。多くの場合、核酸分子は、塩基の配列によって記載され、それにより、塩基は、核酸分子の１次構造（線状構造）を表す。塩基の配列は、典型的には、５’から３’へと表される。本明細書において、核酸分子という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、例えば、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）及びゲノムＤＮＡ、リボ核酸（ＲＮＡ）、特に、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ又はＲＮＡの合成形態、及びこれらの分子の２つ以上を含む混合ポリマーを包含する。核酸分子は、線状でも環状でもよい。さらに、核酸分子という用語は、センス鎖とアンチセンス鎖との両方、並びに一本鎖形態及び二本鎖形態を含む。さらに、本明細書に記載される核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド又は天然に存在しないヌクレオチドを含み得る。誘導体化された糖又はホスフェート骨格結合又は化学修飾された残基を含む、天然に存在しないヌクレオチドの例として、修飾されたヌクレオチド塩基が挙げられる。核酸分子は、例えば、宿主又は患者において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで本発明の抗体の直接的な発現のためのベクターとして適したＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子も包含する。このようなＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ベクターは、修飾されていなくてもよく、又は修飾されていてもよい。例えば、ｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏで抗体を産生するために対象にｍＲＮＡを注入することができるように、ＲＮＡベクターの安定性及び／又はコードされた分子の発現を高めるように化学修飾されてもよい。（例えば、Ｓｔａｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１７，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ １２ Ｊｕｎｅ ２０１７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４３５６又はＥＰ ２ １０１ ８２３ Ｂ１を参照）。
「単離された」核酸とは、自然環境の構成要素から切り離されている核酸分子のことである。単離された核酸には、通常核酸分子を含む細胞内に含まれる核酸分子が含まれるが、核酸分子は、染色体外又は天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
「抗ＴＲＥＭ２抗体をコードする単離された核酸」とは、項ＴＲＥＭ２抗体の重鎖及び軽鎖（又はそれらの断片）をコードする１つ以上の核酸分子を指し、単一のベクター又は別個のベクター内のこのような核酸分子（複数可）を含み、このような核酸分子（複数可）は、宿主細胞内の１つ以上の場所に存在する。
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、連結している別の核酸を増殖可能な核酸分子を指す。この用語は、自己複製する核酸構造としてのベクター、及びベクターが導入された宿主細胞のゲノム内へと組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、それらが機能的に連結されている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターを本明細書では、「発現ベクター」と呼ぶ。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」という用語は互換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞、及びこのような細胞の子孫を含む細胞を指す。
「シグナル配列」又は「リーダー配列」という用語は、哺乳動物細胞からのポリペプチドの分泌を促進するポリペプチドのＮ末端に位置するアミノ酸残基の配列を指す。リーダー配列は、哺乳動物細胞からのポリペプチドの搬出時に切断され、成熟タンパク質を形成し得る。リーダー配列は、天然又は合成であり得、それらは、それらが結合しているタンパク質と異種又は相同であり得る。非限定的な例示的なリーダー配列には、異種タンパク質由来のリーダー配列も含まれる。いくつかの実施形態では、抗体はリーダー配列を欠く。いくつかの実施形態では、抗体は、ネイティブ抗体リーダー配列及び異種リーダー配列から選択され得る少なくとも１つのリーダー配列を含む。
本明細書で使用される場合、「シェディング」という用語は、タンパク質のストークドメインのタンパク質分解的切断によって膜結合ＴＲＥＭ ２から可溶性ＴＲＥＭ２を作製するプロセスを指す。Ｉｎ ｖｉｖｏでは、「シェディング」は、例えば、メタロプロテイナーゼ又は他の酵素による細胞膜上のＴＲＥＭ２の切断により、細胞表面で起こり得る。いくつかの例では、タンパク質のＨ１５７とＳ１５８との間で切断が起こり、外部ドメイン残基１９～１５７からｓＴＲＥＭ２が形成される。
本明細書で使用される場合、「アゴニスト」という用語は、それが結合する分子の少なくとも１つの活性若しくは機能の増加を引き起こす、又はそうでなければ分子を活性化する若しくは活性化するのを助ける抗体等の物質を指す。本明細書で使用される場合、「アンタゴニスト」という用語は、それが結合する分子の少なくとも１つの活性若しくは機能の減少を引き起こす、又はそうでなければ分子の少なくとも１つの活性若しくは機能を遮断若しくは阻害する抗体等の物質を指す。
本明細書における「アゴニスト抗ＴＲＥＭ２抗体」又は同様の語句は、例えば、ヒトＴＲＥＭ２を発現するＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞においてルシフェラーゼレポーター活性を誘導する、及び／又はヒトＴＲＥＭ２を発現するＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞、ヒト単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）細胞及び／又はヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来ミクログリア細胞においてＳＹＫリン酸化（ｐ－ＳＹＫ）を誘導する抗体を指す。アゴニスト抗ＴＲＥＭ２抗体はまた、本明細書に記載されるように、例えば、他の活性の中でもとりわけ、ＩＬ－３４及びＣＳＦ－１の非存在下でのヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアの生存を増強すること、並びにヒトマクロファージ及びミクログリアにおけるＴＲＥＭ２シグナル伝達を活性化すること等のさらなる活性を有する場合がある。
「対象」及び「患者」という用語は、ヒトを指すために本明細書では互換的に使用される。いくつかの実施形態では、げっ歯類、サル、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、哺乳動物実験動物、哺乳動物農場動物、哺乳動物スポーツ動物、及び哺乳動物ペットを含むがこれらに限定されない他の哺乳動物を治療する方法も提供される。
本明細書で使用される場合、「治療」は、ヒト又は他の哺乳動物における疾患の治療薬の任意の投与又は適用を包含し、例えば、退縮を引き起こすことによって、又は失われた、欠損した、若しくは欠陥のある機能を回復若しくは修復することによって、又は非効率的なプロセスを刺激することによって、疾患を阻害するか又は疾患の進行を遅延させること、疾患又はその進行を阻害するか又は遅延させること、疾患の少なくとも１つの症候の発症を停止するか又は遅延させること、疾患の発症までの時間を遅延させること、少なくとも１つの疾患症候の発症を予防すること、少なくとも１つの疾患症候の発症までの時間を遅延させること、疾患を部分的若しくは完全に軽減すること、又は疾患を治癒することを含む。「阻害」又は「阻害する」という用語は、任意の症候若しくは表現型の特徴の減少若しくは停止、又はその症候若しくは特徴の発生率、程度若しくは可能性の減少若しくは停止を指す。
「薬学的に許容され得る担体」は、対象への投与のための「医薬組成物」を一緒に含む治療薬と共に使用するための当技術分野で慣用的な非毒性の固体、半固体、又は液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料、製剤補助剤、又は担体を指す。薬学的に許容され得る担体は、使用される投与量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、製剤の他の成分と適合性である。薬学的に許容され得る担体は、使用される製剤に適している。例えば、治療薬が経口投与される場合、担体はゲルカプセルであり得る。治療薬が皮下投与される場合、担体は理想的には皮膚に対して刺激性でなく、注射部位反応を引き起こさない。
本明細書における「有効量」という用語は、上述の治療、阻害、又は減少等の所望の結果をもたらすのに十分な量を指す。
固有の抗ＴＲＥＭ２抗体の開発
本明細書における開示は、抗ＴＲＥＭ２抗体を包含する。本明細書におけるいくつかの実施形態では、抗体は固有の特性セットを有する。例えば、本明細書における特定の抗体は、（ａ）残基１５７と１５８との間の切断部位にまたがるエピトープでＴＲＥＭ２ストークドメインに特異的に結合し、ＴＲＥＭ２の残基１５１～１６５からなるポリペプチドにも特異的に結合し、（ｂ）可溶性ＴＲＥＭ２に結合せず、したがってｉｎ ｖｉｖｏで可溶性ＴＲＥＭ２結合の有意なリスクを示さない可能性があり、（ｃ）ＴＲＥＭ２アゴニストとして作用し、（ｄ）例えば１００～５００ｐＭ、１０～５０ｐＭ、又は１～１０ｐＭの解離定数でＴＲＥＭ２に特異的に結合する。
下記の実施例の節において記載されるように、本明細書における特定の例示的抗体が、ラット抗ヒトＴＲＥＭ２抗体の最初のスクリーニングの後で部分的に得られた。ＴＲＥＭ２のアミノ酸１５１～１６５の領域の結合エピトープに特異的に結合するラット抗ヒトＴＲＥＭ２抗体の特定のセットは、スクリーニングに見出される他の抗体とは異なり、また、他の以前に記載された抗ＴＲＥＭ２抗体とは異なり、比較的高い親和性と、可溶性ＴＲＥＭ２に対する結合の欠如との両方を有することが見出された。この抗体セットには、ラット抗ヒト抗体３．１０Ｃ２、３．５０Ｇ１、３．１８Ｅ５、３．２７Ｈ７（「３．１０Ｃ２群抗体」とも呼ばれる）及び３．３６Ｆ５が含まれる。（図３Ａ～図３Ｂ、並びに図２Ａ～図２Ｂ及び図１６も参照）。
さらなるＴＲＥＭ２免疫化ラット免疫レパートリーのディープシーケンシング実験を重鎖可変領域で行い、ＴＲＥＭ２に対して更に高い親和性を有する抗体を得た。この実験により、３．１０Ｃ２群の抗体とはクローン的に無関係であり、３．１０Ｃ２群の以前に同定された抗体と比較して重鎖ＣＤＲ３が異なるＰａｒａ．０９重鎖可変領域が同定された。（図４及び図８Ｂを参照）。Ｐａｒａ．０９重鎖可変領域を、以前に同定された３．１０Ｃ２群抗体由来の軽鎖可変領域と組み合わせた。得られたＦａｂ断片のヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に対する親和性は、１～５ｐＭ程度であった（すなわち、１－５Ｅ×１０－１２Ｍ）。（表１及び実施例５を参照）。
次いで、ラット抗ヒト抗体をヒト化した。抗体ｈ３．１０Ｃ２．ｖ１及びｈＰａｒａ．０９．ｖ２は、本明細書におけるヒト化抗体の例である。（図９Ａ～図９Ｂ及び図１２Ａ～図１２Ｂを参照）。次いで、例えば、発現収率等の特性を改善するために、ヒト化抗体の軽鎖フレームワーク領域のさらなる修飾を行った。例えば、軽鎖フレームワーク領域（例えば、Ｉ５８Ｖ、Ｑ１００Ｐ及び／又はＶ１０４Ｌ、（本明細書で使用される場合、命名法の慣例は「アミノ酸位置－新規アミノ酸」であり、すなわち、Ｉ５８Ｖは位置５８のアミノ酸Ｉがアミノ酸Ｖに変更されていることを示す））の位置５８、１００及び／又は１０４における特定の修飾は、ＴＲＥＭ２ストークドメインに対する高親和性等の出発ラット抗ヒト抗体の特徴を保持するだけでなく、比較的高い収率で発現するヒト化抗体をもたらした。このような例示的抗体を図１３Ａ～図１３Ｂ及び図１４Ａ～図１４Ｂに示す。以下の実施例１１及び１３～１７に更に記載されるように、例えば、本明細書における抗体はＴＲＥＭ２アゴニストであり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでいくつかの他の有益な生物学的特性も示す。
例示的な抗ＴＲＥＭ２抗体配列
いくつかの実施形態では、本開示は、ＴＲＥＭ２に特異的に結合する単離された抗体であって、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨが、配列番号１、９、１１、１９又は６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号２、１０、１２、２０、５５、６３、６５又は７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２とを含む抗体を包含する。いくつかの実施形態では、ＶＬは、配列番号４、２７、３７、４７、５７、又は６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号６、配列番号２９、配列番号３９、配列番号４９、配列番号５９又は配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、以下のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む：Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｙ（式中、Ｘ１及びＸ２は、共に、Ｉ－Ｌ又はＬのいずれかであり、Ｘ３は、Ｄ又はＥのいずれかである）。いくつかの実施形態では、抗体は、ラットＩＧＨＶ６－８生殖細胞系列セグメントに由来するＶＨを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ラットＩＧＫＶ２Ｓ１１生殖細胞系列セグメントに由来するＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ラットＩＧＨＶ６－８に由来するＶＨ及びラットＩＧＫＶ２Ｓ１１に由来するＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＴＲＥＭ２に特異的に結合する単離された抗体であって、配列番号１、９、１１、１９又は６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号２、１０、１２、２０、５５、６３、６５又は７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、以下のアミノ酸配列：Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｙ（式中、Ｘ１及びＸ２は、共に、Ｉ－Ｌ又はＬのいずれかであり、Ｘ３は、Ｄ又はＥのいずれかである）を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号４、２７、３７、４７、５７又は６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号６、２９、３９、４９、５９又は６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、ＴＲＥＭ２に特異的に結合する単離された抗体を包含する。例えば、このような抗体を図３Ａ～図３Ｂに示す。例としては、３．１０Ｃ２、３．５０Ｇ１、３．１８Ｅ５、３．３６Ｆ５及び３．２７Ｈ７の重鎖Ｋａｂａｔ ＣＤＲ並びにＰａｒａ．０９を含む抗体が挙げられる。いくつかの例では、抗体は、配列番号１、９、１１又は１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号２、１０、１２又は２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、以下のアミノ酸配列：Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｙ（式中、Ｘ１及びＸ２は、共に、Ｉ－Ｌ又はＬのいずれかであり、Ｘ３は、Ｄ又はＥのいずれかである）を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
いくつかの例では、軽鎖可変領域（ＶＬ）は、３．１０Ｃ２又は３．２７Ｈ７のいずれかの軽鎖ＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、抗体軽鎖可変領域は、配列番号４、２７又は６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号６、２９又は６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含み得る。いくつかの例では、抗体は、３．２７Ｈ７の軽鎖ＣＤＲ、すなわち、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む。
いくつかの例では、重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号１若しくは９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号２若しくは１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含み、軽鎖可変領域（ＶＬ）が、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む。他の場合には、重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号１１若しくは１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号１２若しくは２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含み、軽鎖可変領域（ＶＬ）が、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書における抗体は、図３Ｂに示される配列のものと少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％同一である重鎖可変領域アミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書における抗体は、図６Ｂに示される配列のものと少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％同一である重鎖可変領域アミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書における抗体は、図８Ｂに示される配列のものと少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％同一である重鎖可変領域アミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書における抗体は、図９Ｂに示される配列のものと少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％同一である重鎖可変領域アミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書における抗体は、図１２Ｂに示される配列のものと少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％同一である重鎖可変領域アミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書における抗体は、図１３Ｂに示される配列のものと少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％同一である重鎖可変領域アミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書における抗体は、図１４Ｂに示される配列のものと少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％同一である重鎖可変領域アミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、抗体フレームワーク領域は、キメラ又はヒト化であり得る。
いくつかの例では、抗体は、配列番号７又は１７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％又は少なくとも９９％同一であるＶＨを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号７、１７、３０、４０、５０、６０、７０、７６、７７、７８、８１、８２、８３、１３３、１３５、１３７、１３９、１４６、１４８、１５０、又は１５２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％同一であるＶＨを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号７、１７、１３３、１３５、１３７、１３９、１４６、１４８、１５０、又は１５２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％同一であるＶＨを含む。他の場合において、抗体は、配列番号７、１７、３０、４０、５０、６０、７０、７６、７７、７８、８１、８２、８３、１３３、１３５、１３７、１３９、１４６、１４８、１５０又は１５２のアミノ酸配列を含むＶＨを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号７、１７、１３３、１３５、１３７、１３９、１４６、１４８、１５０、又は１５２のアミノ酸配列を含むＶＨを含む。
いくつかの実施形態では、抗体軽鎖可変領域は、図３Ａに示される配列のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体軽鎖可変領域は、図６Ａに示される配列のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体軽鎖可変領域は、図８Ａに示される配列のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体軽鎖可変領域は、図９Ａに示される配列のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体軽鎖可変領域は、図１２Ａに示される配列のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体軽鎖可変領域は、図１３Ａに示される配列のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体軽鎖可変領域は、図１４Ａに示される配列のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域フレームワークはヒト化又はキメラである。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号８又は１８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％又は少なくとも９９％同一であるＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号８、１８、３１、４１、５１、６１、７１、７９、８０、８４、８５、１３２、１３４、１３６、１３８、１４５、１４７、１４９又は１５１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％又は少なくとも９９％同一であるＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号８、１８、１３２、１３４、１３６、１３８、１４５、１４７、１４９又は１５１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％又は少なくとも９９％同一であるＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号８又は１８のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号８、１８、３１、４１、５１、６１、７１、７９、８０、８４、８５、１３２、１３４、１３６、１３８、１４５、１４７、１４９又は１５１のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号８、１８、１３２、１３４、１３６、１３８、１４５、１４７、１４９、又は１５１のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、抗体３．１０Ｃ２、３．５０Ｇ１、３．１８Ｅ５、３．３６Ｆ５、３．２７Ｈ７又はＰａｒａ．０９の重鎖ＣＤＲ及び抗体３．２７Ｈ７の軽鎖ＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、抗体３．１０Ｃ２又はＰａｒａ．０９の重鎖ＣＤＲ、及び抗体３．２７Ｈ７の軽鎖ＣＤＲを含む。（図３Ａ～図３Ｂを参照）。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化又はキメラである。
いくつかの実施形態では、抗体は、以下のＣＤＲのセットのうちの１つを含む：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｄ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｅ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｆ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｇ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｈ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、又は
（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）。ＣＤＲ（ａ）～（ｉ）は、後続の４つの段落でも参照される。
いくつかの実施形態では、抗体は、
（ａ）上記段落の（ａ）又は（ｂ）のＣＤＲを含み、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＨを更に含むか、
（ｃ）上記段落の（ｃ）又は（ｄ）のＣＤＲを含み、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＨを更に含むか、
（ｅ）上記段落の（ｅ）のＣＤＲを含み、配列番号３０のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＨを更に含むか、
（ｆ）上記段落の（ｆ）のＣＤＲを含み、配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＨを更に含むか、
（ｇ）上記段落の（ｇ）のＣＤＲを含み、配列番号５０のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＨを更に含むか、
（ｈ）上記段落の（ｈ）のＣＤＲを含み、配列番号６０のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＨを更に含むか、又は
（ｉ）上記段落の（ｉ）のＣＤＲを含み、配列番号７０のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＨを更に含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、
（ａ）上記部分（ａ）又は（ｂ）のＣＤＲを含み、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＬを更に含むか、
（ｃ）上記部分（ｃ）又は（ｄ）のＣＤＲを含み、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＬを更に含むか、
（ｅ）上記（ｅ）のＣＤＲを含み、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＬを更に含むか、
（ｆ）上記（ｆ）のＣＤＲを含み、配列番号４１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＬを更に含むか、
（ｇ）上記（ｇ）のＣＤＲを含み、配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＬを更に含むか、
（ｈ）上記（ｈ）のＣＤＲを含み、配列番号６１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＬを更に含むか、又は
（ｉ）上記（ｉ）のＣＤＲを含み、配列番号７１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＬを更に含む。
いくつかの例では、抗体は、
（ａ）（ａ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨを更に含むか、
（ａ）（ｂ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨを更に含むか、
（ｃ）（ｃ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨを更に含むか、
（ｄ）（ｄ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨを更に含むか、
（ｅ）（ｅ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＶＨを更に含むか、
（ｆ）（ｆ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＨを更に含むか、
（ｇ）（ｇ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号５０のアミノ酸配列を含むＶＨを更に含むか、
（ｈ）（ｈ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号６０のアミノ酸配列を含むＶＨを更に含むか、又は
（ｉ）（ｉ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号７０のアミノ酸配列を含むＶＨを更に含む。
いくつかの例では、抗体は、
（ａ）（ａ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬを更に含むか、
（ａ）（ｂ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬを更に含むか、
（ｃ）（ｃ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬを更に含むか、
（ｄ）（ｄ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬを更に含むか、
（ｅ）（ｅ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＬを更に含むか、
（ｆ）（ｆ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬを更に含むか、
（ｇ）（ｇ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＬを更に含むか、
（ｈ）（ｈ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号６１のアミノ酸配列を含むＶＬを更に含むか、又は
（ｉ）（ｉ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号７１のアミノ酸配列を含むＶＬを更に含む。
上記のように、いくつかの実施形態では、ＶＨ及び／又はＶＬはヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗体は、例えば、３．１０Ｃ２Ｌ１を３．１０Ｃ２Ｈ１、Ｈ３若しくはＨ５と組み合わせるか、又は３．１０Ｃ２Ｌ５を３．１０Ｃ２Ｈ１、Ｈ３若しくはＨ５と組み合わせる等、図６Ａ～図６Ｂに示すような軽鎖及び重鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、例えば、３．２７Ｈ７Ｌ１をＰａｒａ．０９Ｈ１、Ｈ５若しくはＨ７と組み合わせるか、又は３．２７Ｈ７Ｌ６をＰａｒａ．０９Ｈ１、Ｈ５若しくはＨ７と組み合わせる等、図８Ａ～図８Ｂに示すような軽鎖及び重鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１又は１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号２又は１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、以下のアミノ酸配列：Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｙ（式中、Ｘ１及びＸ２は一緒になってＩ－Ｌ又はＬのいずれかであり、Ｘ３はＤ又はＥのいずれかである）を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含むＶＨを含み、ヒトＩＧＨＶ－７３＊０１（配列番号７４）のＶＨフレームワーク領域と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％又は少なくとも９９％同一のＶＨフレームワーク領域を更に含む。（図６Ｂ及び図８Ｂを参照）。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号４、１４又は２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号５、１５又は２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号６、１６又は２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含むＶＬを含み、ヒトＩＧＫＶ－２８＊０１（配列番号７５）のＶＬフレームワーク領域と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％又は少なくとも９９％同一のＶＬフレームワーク領域を更に含む。（図６Ａ及び図８Ａを参照）。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号７６、７７、又は７８のアミノ酸配列を含むＶＨを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号７９又は８０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号７６、７７、又は７８のアミノ酸配列を含むＶＨを含み、配列番号７９又は８０のアミノ酸配列を含むＶＬを更に含む。（図６Ａ～図６Ｂを参照）。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号８１、８２、又は８３のアミノ酸配列を含むＶＨを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号８４又は８５のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号８１、８２、又は８３のアミノ酸配列を含むＶＨを含み、配列番号８４又は８５のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。（図８Ａ～図８Ｂを参照）。
上記のいくつかの実施形態では、抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。（図９Ａ～図９Ｂを参照；すなわち、ｈ３．１０Ｃ２．ｖ１）。上記のいくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。（図１０Ａ～図１０Ｂを参照；すなわち、ｈＰａｒａ．０９．ｖ２．）上記の実施形態のいずれにおいても、抗体はヒト化又はキメラ（すなわち、ヒト化又はキメラフレームワーク領域を有すること）であり得る。
いくつかの実施形態では、抗体のフレームワーク領域は、例えば、発現収率等の特性を改善するために、ヒト化後に更に修飾される。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１８による軽鎖を含むが、フレームワーク領域内の１～５残基が置換されている。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１８による軽鎖を含むが、フレームワーク領域においてＩ５８、Ｑ１００及びＶ１０４のうちの１つ以上、例えばＩ５８Ｖ、Ｑ１００Ｐ及び／又はＶ１０４Ｌにおける置換を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１８による軽鎖を含むが、Ｑ１００Ｐ置換、Ｉ５８Ｖ置換とＱ１００Ｐ置換の両方、又はＱ１００Ｐ置換とＶ１０４Ｌ置換の両方を有する。（例えば、図１３Ａ及び図１４Ａを参照）。いくつかのこのような実施形態では、抗体は、以下のＶＨ及びＶＬのセットのうちの１つを含む：（ａ）配列番号１３３及び１３２（抗体ｈＰａｒａ．０９．ｖ２ Ｑ１００Ｐ）；（ｂ）配列番号１３５及び１３４（抗体ｈＰａｒａ．０９．ｖ２Ｉ５８Ｖ／Ｑ１００Ｐ）；（ｃ）配列番号１３７及び１３６（抗体ｈＰａｒａ．０９．ｖ２ Ｑ１００Ｐ／Ｖ１０４Ｌ）；（ｄ）配列番号１４６及び１４５（抗体ｈ３．１０Ｃ２．ｖ１ Ｑ１００Ｐ）；（ｅ）配列番号１４８及び１４７（抗体ｈ３．１０Ｃ２．ｖ１Ｉ５８Ｖ／Ｑ１００Ｐ）；又は（ｆ）配列番号１５０及び１４９（抗体ｈ３．１０Ｃ２．ｖ１ Ｑ１００Ｐ／Ｖ１０４Ｌ）。他の実施形態では、抗体は、配列番号１３９及び１３８のＶＨ及びＶＬを含む（ｈ３．１０Ｃ２．Ｈ１－３．１０Ｃ２．Ｌ１０）。更に他の実施形態では、抗体は、配列番号１５２及び１５１のＶＨ及びＶＬを含む（ｈＰａｒａ．０９．Ｈ５－３．１０Ｃ２．Ｌ１０）。
いくつかの実施形態では、抗体は、ヒトＩＧＫＶ２－２８＊０１生殖系列（ＩＧＫＶ２－２８＊０１のＫａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａフレームワーク及びＣＤＲ領域を示す図８Ａを参照）と比較して、フレームワーク領域に１～１０個のアミノ酸置換を含むＶＬを含む。いくつかの例では、抗体は、ヒトＩＧＫＶ２－２８＊０１と比較してフレームワーク領域に１～５個のアミノ酸置換を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、これらのアミノ酸置換は、Ｑ１００Ｐ若しくはＶ１０４Ｌ又はＱ１００ＰとＶ１０４Ｌとの両方を含む。いくつかのこのような例では、ＶＬは位置５８にＶａｌを含み、他の場合では、ＶＬは位置５８にＩｌｅを含む（例えば、ＩＧＫＶ２－２８＊０１と比較したＱ１００Ｐ及び５８Ｖ又はＱ１００Ｐ及びＶ５８Ｉ）。
本明細書における実施形態のいずれかでは、抗体は、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又は（Ｆａｂ’）２等の抗体断片であり得る。他の実施形態では、抗体は全抗体（すなわち、重鎖定常領域及び軽鎖定常領域を含む）であり得る。他の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、又はＩｇＭ抗体であり得る。いくつかの実施形態では、抗体は、野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域又は野生型ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域、ヒトＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ Ｆｃ領域、ヒトＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ／Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ Ｆｃ領域、ヒトＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｇ Ｆｃ領域、ヒトＩｇＧ１ ＬＡＬＡＰＧ（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ）Ｆｃ領域、又はヒトＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｇ／Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ Ｆｃ領域を有し得る。マウスＩｇＧ抗体の場合、抗体はｍＩｇＧ１又はｍＩｇＧ２又はｍＩｇＧ２ ＬＡＬＡＰＧ抗体であり得る。抗体は、いくつかの例では、完全長重鎖及び／又は完全長軽鎖を含み得る。いくつかの例では、抗体は、重鎖定常領域のＣ末端Ｌｙｓ又はＣ末端Ｌｙｓ及びＧｌｙ残基を欠いていてもよい。他の場合では、抗体は、それらのＣ末端残基の一方又は両方を含有する。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１４４のアミノ酸配列を含むか、又はこれからなる重鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１７６のアミノ酸配列を含むか、又はこれからなる軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１４４のアミノ酸配列を含むか、又はこれからなる重鎖と、配列番号１７６のアミノ酸配列を含むか、又はこれからなる軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１４４のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるが、配列番号１４４のＣ末端リジンを欠くか、又は配列番号１４４のＣ末端グリシン及びリジンを欠く重鎖と、配列番号１７６のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１４４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１７６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１４４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１７６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１４４のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖であって、任意に、Ｃ末端リジン又はグリシン－リジンを含まない重鎖と、配列番号１７６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１４４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１７６のアミノ酸配列を含むか又はこれからなる軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１４４のアミノ酸配列と比較して１、２、３、４、又は５個のアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１７６のアミノ酸配列と比較して１、２、３、４、又は５個のアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１４４のアミノ酸配列と比較して１、２、３、４、又は５個のアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１７６のアミノ酸配列と比較して１、２、３、４、又は５個のアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を有するアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１４４のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖であって、任意に、Ｃ末端リジン又はグリシン－リジンを含まない重鎖と、配列番号１７６のアミノ酸配列と比較して１、２、３、４、又は５個のアミノ酸置換、挿入、又は欠失を有するアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１４４のアミノ酸配列と比較して１、２、３、４、又は５個のアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１７６のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖とを含む。配列番号１４４及び／又は配列番号１７６の配列変異を可能にする上記の場合のいずれにおいても、いくつかの実施形態では、このような配列変異は、抗体が配列番号１１、１２及び１３又は代替では１９、２０及び１３の重鎖ＣＤＲ及び／又は配列番号１４、１５及び１６の軽鎖ＣＤＲも含むように、抗体フレームワーク及び／又は定常領域に限定される。他の実施形態では、配列番号１４４及び／又は配列番号１７６におけるこのような配列変異は、抗体が配列番号１７及び／又は１８も含むように、抗体定常領域に限定される。
いくつかの例では、抗体は二重特異性又は多重特異性であり得る。いくつかの例では、抗体は、標識又は薬物等の別の分子に直接又はリンカーを介してコンジュゲートされ得る。
いくつかの例では、抗体はインタクトなエフェクター機能を有する。いくつかの例では、抗体は、エフェクター機能が低下したＦｃ領域を有する。他の場合では、抗体は、エフェクターのないＦｃ領域を有する。例えば、抗体治療薬のＦｃ領域は、補体成分Ｃ１ｑ及びＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）に結合して、食作用、サイトカイン放出、及び活性酸素種の産生等の細胞エフェクター応答を誘発することができる。（例えば、Ｘ．Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ＆Ｃｅｌｌ ９：６３－７３（２０１８）；Ｓ．Ｂ．Ｍｋａｄｄｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙを参照、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１９．００８１１（２０１９）で入手可能。）これらの経路の過剰活性化は、ＣＮＳにおいて、特に病態の状況において有害であり得る。（Ｄ．Ｊ．ＤｉＳａｂａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３９（Ｓ２）：１３６－１５３（２０１６）．）臨床的には、インタクトなエフェクター機能を有し、アミロイドベータ凝集体に結合するアミロイドベータに対する抗体治療薬は、潜在的に有害な副作用であるＡＲＩＡ（アミロイド関連イメージング異常）の発生率を大幅に増加させるが、ＡＲＩＡは、アミロイドベータの単量体型にのみ結合する抗体又はエフェクター機能が低下した抗体からは観察されていない。（Ｍ．Ｆｉｌｉｐｐｉ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ Ｎｅｕｒｏｌ．７９（３）：２９１－３０４（２０２２）．）いくつかの実施形態では、例えば本明細書における実施例及び図に記載されるように、エフェクター機能が低下した本明細書における抗体（上記のように、ＬＡＬＡＰＧ変異又はＮ２９７Ｇ変異のいずれかを有するヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含む）は、ＴＲＥＭ２刺激を介してＣＮＳにおいてミクログリア応答を誘発するのに十分であった。
例示的な抗体変異体、断片及び定常領域
さらなる態様では、本明細書におけるＴＲＥＭ２に特異的に結合する抗体は、以下のセクションに記載されるように、単独で又は組み合わせて特徴のいずれかを組み込んでもよい。
抗体断片
特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片は、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片と、下記の他の断片とを含む。特定の抗体断片の総説としては、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の概説としては、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照；国際公開第９３／１６１８５号；米国特許第５，５７１，８９４号及び同５，８７，４５８号も参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、増加したｉｎ ｖｉｖｏ半減期を有するＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。
ダイアボディは、二価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第４０４，０９７号、国際公開第１９９３／０１１６１号、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）；ａｎｄ Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照されたい。また、トリアボディ及びテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）に記載されている。
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部若しくは一部又は軽鎖可変ドメインの全部若しくは一部を含む抗体断片である。特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６号を参照）。
抗体断片は、本明細書に記載されているように、インタクト抗体のタンパク質分解消化、及び組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生産を含むがこれらに限定されない様々な技術によって作製することができる。
キメラ抗体及びヒト化抗体
特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、及びＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４））に記載されている。一つの例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサル等の非ヒト霊長類に由来する可変領域）とヒト定常領域を含む。更なる例では、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のそれらから変更されている「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
特定の実施形態では、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減するために、親の非ヒト抗体の特異性と親和性を保持したままヒト化されている。通常、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えばＣＤＲ（又はその一部）が非ヒト抗体に由来する１つ以上の可変ドメインを含み、ＦＲ（又はその一部）はヒト抗体配列に由来する。ヒト化抗体は、任意に、ヒト定常領域の少なくとも一部も含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体中のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性又は親和性を復元又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。
ヒト化抗体及びこれを製造する方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ、「Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．」、第１３巻：第１６１９～１６３３頁（２００８年）に記載され、更に、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、「Ｎａｔｕｒｅ」、第３３２巻：第３２３～３２９頁（１９８８年）；Ｑｕｅｅｎら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」、第８６巻：第１００２９～１００３３頁（１９８９年）；米国特許第５，８２１，３３７号、第７，５２７，７９１号、第６，９８２，３２１号及び第７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ」、第３６巻：第２５～３４頁（２００５年）（特異性決定領域（ＳＤＲ）のグラフト接合を記載する）；Ｐａｄｌａｎ、「Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、第２８巻：第４８９～４９８頁（１９９１年）（「リサーフェシング」を記載する）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ」、第３６巻：第４３～６０頁（２００５年）（「ＦＲシャッフリング」を記載する）；並びに、Ｏｓｂｏｕｒｎら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ」、第３６巻：第６１～６８頁（２００５年）、及びＫｌｉｍｋａら、「Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ」、第８３巻：第２５２～２６０頁（２０００年）（ＦＲシャッフリングに対する「ガイド付き選択」手法を記載する）に更に記載される。
ヒト化に使用可能なフレームワーク領域としては、限定されないが、「ベストフィット」法を用いて選択されるフレームワーク領域（例えば、Ｓ ｉｍｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）を参照）；軽鎖又は重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列から誘導されるフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅ ｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏ ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；及びＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）を参照）；ヒト成熟（体細胞性変異を受けた）フレームワーク領域又はヒト生殖系列フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）を参照）；並びに、ＦＲライブラリーのスクリーニングから誘導されるフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８－１０６８４（１９９７）及びＲｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１－２２６１８（１９９６）を参照）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４重鎖定常領域を含み得る。
二重特異性又は多重特異性抗体
特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施形態では、結合特異性の一方はＴＲＥＭ２であり、他方は任意の他の抗原に対するものである。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、ＴＲＥＭ２の２つの異なるエピトープに結合し得る。二重特異性抗体はまた、細胞傷害剤等の薬物を局在化させるために、又はＴＲＥＭ２を発現する細胞に検出標識を局在化させるために使用され得る。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）は、本明細書に記載のＣＤＲ又は可変領域を含む第１の可変ドメインを含む。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片として調製され得る。
多重特異性抗体を作製するための技術には、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組換え共発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７（１９８３））、国際公開第９３／０８８２９号、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６５５（１９９１）を参照）、及び「ノブ・イントゥ・ホール」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照）が含まれるが、これらに限定されるものではない。多重特異性抗体はまた、抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果の操作（国際公開第２００９／０８９００４Ａ１号）；２つ以上の抗体又は断片の架橋（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、及びＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照）；二重特異性抗体を作製するためのロイシンジッパーの使用（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍ’’ｎｏｌ．，１’’８（５）：１５４７－１５５３（１９９２）を参照）；二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術の使用（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照）；及び単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照）；及び、例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載される三重特異性抗体の調製によっても作製され得る。
「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能性抗原結合部位を持つ操作抗体もまた本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６号を参照）。
さらなる抗体変異体
特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列中に適正な修飾を導入することによって、又はペプチド合成によって調製されてもよい。このような改変としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失及び／又は抗体のアミノ酸配列内の残基への挿入及び／又は抗体のアミノ酸配列内の残基の置換が挙げられる。最終構築物に到達するために欠失、挿入、及び置換を任意に組み合わせることができるが、但し、その最終構築物が所望の特性、例えば、抗原結合を保有することを条件とする。生成されたヒト化変異体の具体例は、例えば、本明細書における図６Ａ～図６Ｂ、図８Ａ～図８Ｂ、図９Ａ～図９Ｂ及び図１２Ａ～図１２Ｂに記載されている。
置換変異体、挿入変異体、及び欠失変異体
特定の実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換による変異導入のための目的の部位には、ＨＶＲ及びＦＲが含まれる。保存的置換は、表Ａに「好ましい置換」の見出しの下で示される。より実質的な変化は、表Ａに「例示的な置換」の見出しの下に示され、アミノ酸側鎖クラスを参照して以下に更に記載される。アミノ酸置換を目的の抗体に導入し、産物を所望の活性、例えば抗原結合の保持／改善、免疫原性の低下、又はＡＤＣＣ若しくはＣＤＣ活性の増加若しくは低下についてスクリーニングしてもよい。

表Ａ
Figure 2024518545000002
アミノ酸は、共通する側鎖の特性に従って以下のように分類され得る：（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。
ある種の置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することを含む。一般に、更なる研究のために選択される、得られた変異体（複数可）は、親抗体と比較して、特定の生物学的特性における修飾（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性の低減）を有し、及び／又は実質的に保持された親抗体の特定の生物学的特性を有することになる。例示的な置換変異体は、例えば、本明細書に記載されるもの等のファージディスプレイに基づく親和性成熟技法を使用して好都合に生成され得る、親和性成熟抗体である。簡潔には、１つ以上のＨＶＲ残基が変異を受け、変異体抗体がファージにディスプレイされ、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
改変（例えば、置換）は、ＨＶＲ中で、例えば、抗体親和性を改善するために行われてもよい。このような改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で変異を受けるコドンによってコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９－１９６（２００８）を参照）、及び／又は抗原と接触する残基内で行われ得て、結果として得られる変異体ＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリーを構築し、それから再選択することによる親和性成熟が、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，（２００１））に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施形態では、多様な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチド指向性変異誘発）のいずれかによって、成熟のために選択される可変遺伝子に多様性が導入される。その後、二次ライブラリーが作製される。その後、このライブラリーがスクリーニングされて、所望の親和性を有する任意の抗体変異体を特定する。多様性を導入するための別の方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４～６個の残基）をランダム化する、ＨＶＲ指向性アプローチを含む。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発又はモデリングを使用して、具体的に特定されてもよい。特にＣＤＲ－Ｈ３及びＣＤＲ－Ｌ３が標的とされることが多い。
特定の実施形態では、置換、挿入、又は欠失は、このような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、１つ以上のＨＶＲ内で生じ得る。例えば、結合親和性を実質的に低減させない保存的改変（例えば、本明細書に提供されるような保存的置換）が、ＨＶＲ中で行われてもよい。このような変化は、例えば、ＨＶＲ内の抗原接触残基の外側であり得る。上に提供される変異体ＶＨ及びＶＬ配列の特定の実施形態では、各ＨＶＲは、改変されていないか、又は１つ、２つ、若しくは３つ以下のアミノ酸置換を含有するかのいずれかである。
変異誘発を標的とし得る抗体の残基又は領域の同定のための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１－１０８５によって記載されるように、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、抗体と抗原との相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、残基又は標的残基群（例えば、帯電した残基、例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕ）が同定され、中性又は負に帯電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）によって置き換えられる。更なる置換が、最初の置換 に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入されてもよい。これに代えて、又はこれに加えて、抗体と抗原との間の接点を同定するための抗原－抗体複合体の結晶構造。このような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的にしても排除してもよい。変異体は、所望の特性を有するか否かを決定するためにスクリーニングされてもよい。
アミノ酸配列挿入には、１個の残基から１００個以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端融合、並びに１個又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入物の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体の血清半減期を延ばす（例えばＡＤＥＰＴ用の）酵素に対する抗体又はポリペプチドのＮ末端又はＣ末端への融合体を含む。
グリコシル化変異体
Ｆｃ領域のグリコシル化の変化、並びに特定のＦｃ領域変異は、エフェクター機能を増強又は低減することによって、抗体のエフェクター機能に影響を及ぼし得るか、又はいくつかの例では抗体をエフェクターレスにし得る。
特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化されている程度を増加又は減少させるように変化する。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が作り出されるか、又は除去されるようにアミノ酸配列を改変させることにより好都合に達成され得る。
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合した炭水化物が改変され得る。哺乳動物細胞によって産生された天然抗体は、典型的には、Ｎ結合によってＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に通常付着した分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６－３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖は、種々の炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮａｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分オリゴ糖構造の「ステム」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースを含んでもよい。いくつかの実施形態では、本発明の抗体中のオリゴ糖の改変は、特定の改良された特性を有する抗体変異体を作成するために行われてもよい。
一態様では、抗体は、例えば、その残基をグリシン又は別のアミノ酸（Ｎ２９７Ｇ）に変異させることによって、Ａｓｎ２９７におけるグリコシル化を低減又は排除するように改変され得る。他の場合には、Ｆｃ領域中の他の残基を、ＡＤＣＣ活性及び／又はＣＤＣ活性を低下させるために、又はＦｃ－ガンマ受容体結合を低下させる若しくは改変するために改変され得る。
別の実施形態では、Ｆｃ領域に（直接的又は間接的に）付着したフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体変異体が提供される。例えば、このような抗体内のフコースの量は、１％～８０％、１％～６５％、５％～６５％又は２０％～４０％であり得る。フコースの量は、例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法によって測定される場合、Ａｓｎ２９７（例えば、複合体構造、ハイブリッド構造、及び高マンノース構造）に付着した全ての糖鎖構造の合計に対するＡｓｎ２９７における糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域の約２９７位に位置するアスパラギン残基を指す（Ｆｃ領域残基のＥｕナンバリング）；但し、Ａｓｎ２９７はまた、抗体のマイナーな配列変化のために、位置２９７の上流又は下流、すなわち位置２９４と３００（ＥＵナンバリング）の間の約±３個のアミノ酸に位置していてもよい。このようなフコシル化変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）；同第２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照されたい。「脱フコシル化」又は「フコース欠乏」抗体変異体に関する刊行物の例としては：米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；国際公開第２０００／６１７３９号；同第２００１／２９２４６号；米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号；同第２００２／０１６４３２８号；同第２００４／００９３６２１号；同第２００４／０１３２１４０号；同第２００４／０１１０７０４号；同第２００４／０１１０２８２号；同第２００４／０１０９８６５号；国際公開第２００３／０８５１１９号；同第２００３／０８４５７０号；同第２００５／０３５５８６号；同第２００５／０３５７７８号；同第２００５／０５３７４２号；同第２００２／０３１１４０号；Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９－１２４９（２００４）；Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が挙げられる。デフコシル化抗体を産生することができる細胞株の例としては、タンパク質フコシル化を欠損するＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３－５４５（１９８６）；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号，Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ；及び国際公開第２００４／０５６３１２号Ａ１、Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、例えばアルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）；Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０－６８８（２００６）；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、抗体は、例えば、フコシル化を減少させるために、又はグリコシル化を排除するために、Ａｓｎ２９７（ＥＵナンバリング）に突然変異を含むヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４重鎖定常領域を有し得る。いくつかの実施形態では、抗体は、Ａｓｎ２９７Ａｌａ又はＡｓｎ２９７Ｇｌｙ変異を有し得る。
例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている二分オリゴ糖を有する抗体変異体が更に提供される。このような抗体変異体は、低減されたフコシル化及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。このような抗体変異体の例は、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８（Ｊｅａｎ－Ｍａｉｒｅｔ ｅｔ ａｌ．）；米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．）に記載されている。Ｆｃ領域に付着したオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を持つ抗体変異体も提供される。このような抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。このような抗体変異体は、例えば、国際公開第１９９７／３００８７（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．）；、国際公開第１９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）、及び国際公開第１９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載される。
Ｆｃ領域変異体
特定の実施形態では、１つ以上のアミノ酸修飾が本明細書に提供される抗体のＦｃ領域に導入され、それにより、Ｆｃ領域変異体が作製され得る。Ｆｃ領域変異体は、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含み得る。
特定の実施形態では、本発明は、全てではないが一部のエフェクター機能を有し（すなわち、エフェクター機能が低下した抗体を産生すること、又はエフェクターレス抗体を産生すること）、それによりｉｎ ｖｉｖｏでの抗体の半減期が重要であるが、特定のエフェクター機能（例えば、補体及びＡＤＣＣ等）が不要又は有害である用途にとって望ましい候補となり得る、抗体変異体を企図する。ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の低下／消失を確認するために、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏの細胞毒性アッセイを実施することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実行して、抗体がＦｃγＲ結合を欠いている（そのため、ＡＤＣＣ活性を欠いている可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持することを確認することができる。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞が、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方で、単球は、Ｆｃ（ＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲの発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ及びＫｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７－４９２（１９９１）の４６４頁の表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：７０５９－７０６３（１９８６）を参照）、及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１４９９－１５０２（１９８５）；５，８２１，３３７（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１－１３６１（１９８７）を参照）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ方法を用いてもよい（例えば、フローサイトメトリー（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）のためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ、及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、又は加えて、目的とする分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されるような動物モデルにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏで評価され得る。また、抗体がＣ１ｑに結合することができないがゆえにＣＤＣ活性を欠いていることを確認するために、Ｃ１ｑ結合アッセイを行ってもよい。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０１：１０４５－１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ １０３：２７３８－２７４３（２００４）を参照）。ＦｃＲｎ結合及びｉｎ ｖｉｖｏクリアランス／半減期の決定はまた、当技術分野で知られている方法を用いて行うことができる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９－１７６９（２００６）を参照）。
エフェクター機能が低下した抗体としては、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９のうちの１つ以上の置換（米国特許第６，７３７，０５６号；残基のＥＵナンバリング）を有するものが挙げられる。このようなＦｃ突然変異体には、残基２６５及び２９７がアラニンに置換されたいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体（米国特許第７，３３２，５８１号；ＥＵナンバリング）を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７のうちの二つ以上に置換を有するＦｃ突然変異体が含まれる。いくつかの実施形態では、抗体は、ＥＵナンバリング規則に従ってアミノ酸位置２６５に操作されたアラニンを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ＥＵナンバリング規則に従ってアミノ酸位置２９７に操作されたアラニンを含む。
ＦｃＲに対する結合が改善又は減少した特定の抗体変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びＳｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１－６６０４（２００１）を参照）。
特定の実施形態では、抗体変異体は、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８、３３３、及び／又は３３４位（残基のＥＵナンバリング）での置換を有するＦｃ領域を含む。
いくつかの実施形態では、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びＩｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８－４１８４（２０００）に記載されているように、Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）の変化（すなわち向上又は減少のいずれか）をもたらすＦｃ領域内で改変を行う。
母体ＩｇＧの胎児への移入の原因である、増加した半減期及び新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への改善された結合を有する抗体（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）ａｎｄ Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））は、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）に記載される。それらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する１つ以上の置換をＦｃ領域内に有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体としては、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４（ＥＵナンバリング）のうちの１つ以上での置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を有する変異体を含む（米国特許第７，３７１，８２６号）。Ｆｃ領域変異体のその他の例に関係するＤｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８－４０（１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号；同第５，６２４，８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号もまた参照されたい。
いくつかの実施形態では、抗体は、野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域又は野生型ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域、ヒトＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ Ｆｃ領域、ヒトＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ／Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ Ｆｃ領域、ヒトＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｇ Ｆｃ領域、ヒトＩｇＧ１ ＬＡＬＡＰＧ（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ）Ｆｃ領域、又はヒトＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｇ／Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ Ｆｃ領域を有し得る。（全ての位置がＥＵナンバリングである。）
システイン改変抗体変異体
特定の実施形態では、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されているシステイン操作された抗体、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂ」を作製することが望ましい場合がある。特定の実施形態では、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位に存在する。これらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書に更に記載されるように、抗体を薬物部位又はリンカー薬物部位等のような他の部位に抱合させてイムノコンジュゲートを作製するために使用され得る。特定の実施形態では、以下の残基のうちのいずれか１つ以上がシステインで置換されていてもよい。軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔナンバリング）、重鎖のＡ１１８（ＥＵナンバリング）、及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵナンバリング）。システイン改変抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されているように作製してよい。
抗体誘導体及びコンジュゲート
特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、当該技術分野で知られ、容易に入手可能な追加の非タンパク質部分を含むように更に改変され得る。抗体の誘導体化に適した部位としては、水溶性ポリマーが挙げられるが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ：ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレン（ｐｒｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）グリコールホモポリマー、プロリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、並びにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造時に有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量であってもよく、分岐していても、分岐していなくてもよい。抗体に付着するポリマーの数は変化し得て、１つを超えるポリマーが付着する場合、ポリマーは、同じ分子であってもよく、又は異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化のために使用されるポリマーの数及び／又は種類は、限定されないが、改良対象の抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が規定の条件下で治療に使用されるかどうか等を含む考慮事項に基づいて決定され得る。
別の実施形態では、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る抗体及び非保護性部位のコンジュゲートが提供される。一実施形態では、非保護性部分はカーボンナノチューブである（Ｋａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０２：１１６００－１１６０５（２００５））。放射線は、任意の波長のものであってよく、通常の細胞には害を与えないが抗体－非タンパク質部分に近位の細胞が死滅する温度まで非タンパク質部分を加熱する波長を含むがこれに限定されない。
いくつかの実施形態では、抗ＴＲＥＭ２抗体は、検出標識及び／又は薬物にコンジュゲートされる。本明細書で使用される場合、検出標識は、抗体の検出を容易にする及び／又は抗体が結合する分子の検出を容易にする部分である。限定されない例示的な検出標識には、放射性同位体、蛍光基、酵素基、化学発光基、ビオチン、エピトープタグ、金属結合タグ等が含まれるが、これらに限定されない。
特定の抗ＴＲＥＭ２抗体の例示的な特性
本明細書における実施例に記載されるように、ラット抗ヒト抗ＴＲＥＭ２抗体のセットを、本明細書におけるスクリーニング、続いて、例えば、（ａ）残基１５７と１５８との間の切断部位にまたがるエピトープでＴＲＥＭ２ストークドメインに特異的に結合し、また、残基１５１～１６５からなるポリペプチドに特異的に結合し、より具体的にはｈＴＲＥＭ２の残基１５１～１６１内に結合すること、（ｂ）可溶性ＴＲＥＭ２に結合しないこと、（ｃ）ＴＲＥＭ２アゴニストとして作用すること、及び（ｄ）ＴＲＥＭ２に高親和性で特異的に結合することを含む固有の特性セットを有するディープシーケンシング分析から同定した。これらのラット抗ヒト抗体、３．１０Ｃ２、３．２７Ｈ７、３．５０Ｇ１、３．１８Ｅ５（「３．１０Ｃ２群」）、３．３６Ｆ５、及びＰａｒａ．０９、並びにそれらのヒト化変異体は、これら及び追加の特性を有し得るが、これらは以下により詳細に記載される。
結合親和性
いくつかの実施形態では、本明細書における抗体は、高い親和性でヒトＴＲＥＭ２とカニクイザルＴＲＥＭ２の両方に特異的に結合する。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書における抗ＴＲＥＭ２抗体は、例えば３７℃で、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、２５ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、７ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、又は２ｐＭ未満のＫＤでヒトＴＲＥＭ２に結合し得る。いくつかの実施形態では、本明細書における抗ＴＲＥＭ２抗体は、例えば３７℃でＳＰＲにより、１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、７ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、又は２ｐＭ未満のＫＤで、カニクイザルＴＲＥＭ２に結合し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書における抗ＴＲＥＭ２抗体は、５００ｐＭ未満（すなわち、０．５ｎＭ未満）のＫＤでｈＴＲＥＭ２に結合する。いくつかの実施形態では、本明細書における抗ＴＲＥＭ２抗体は、２００ｐＭ未満（すなわち、０．２ｎＭ未満）のＫＤでｈＴＲＥＭ２に結合する。いくつかの実施形態では、本明細書における抗ＴＲＥＭ２抗体は、１００ｐＭ未満（すなわち、０．１ｎＭ未満）のＫＤでｈＴＲＥＭ２に結合する。いくつかの実施形態では、本明細書における抗ＴＲＥＭ２抗体は、５０ｐＭ未満（すなわち、５Ｅ－１１Ｍ未満又は０．０５ｎＭ未満）のＫＤでｈＴＲＥＭ２に結合する。いくつかの実施形態では、本明細書における抗ＴＲＥＭ２抗体は、１０～１００ｐＭ、１０～５０ｐＭ、１０～２５ｐＭ、又は１～１０ｐＭのＫＤでｈＴＲＥＭ２に結合する。いくつかの実施形態では、本明細書における抗ＴＲＥＭ２抗体は、５００ｐＭ未満（すなわち、５Ｅ－１０Ｍ未満又は０．５ｎＭ未満）のＫＤでカニクイザルＴＲＥＭ２に結合する。いくつかの実施形態では、本明細書における抗ＴＲＥＭ２抗体は、２００ｐＭ未満（すなわち、２Ｅ－１０Ｍ未満又は０．２ｎＭ未満）のＫＤでカニクイザルＴＲＥＭ２に結合する。いくつかの実施形態では、本明細書における抗ＴＲＥＭ２抗体は、１００ｐＭ未満（すなわち、１Ｅ－１０Ｍ未満又は０．１ｎＭ未満）のＫＤでカニクイザルＴＲＥＭ２に結合する。いくつかの実施形態では、本明細書における抗ＴＲＥＭ２抗体は、５０ｐＭ未満（すなわち、５Ｅ－１１Ｍ未満又は０．０５ｎＭ未満）のＫＤでカニクイザルＴＲＥＭ２に結合する。いくつかの実施形態では、本明細書における抗ＴＲＥＭ２抗体は、１０～１００ｐＭ、１０～５０ｐＭ、又は１０～２５ｐＭのＫＤでカニクイザルＴＲＥＭ２に結合する。いくつかの実施形態では、本明細書における抗ＴＲＥＭ２抗体は、１００～５００ｐＭ、１０～１００ｐＭ、１０～５０ｐＭ、１０～２５ｐＭ、又は１～１０ｐＭのＫＤでヒト及びカニクイザルの両方のＴＲＥＭ２に結合する。
例えば、元のラット抗ヒト３．１０Ｃ２抗体のＦａｂ及びＩｇＧバージョンの両方が、約２００ｐＭのＫＤでｈＴＲＥＭ２に結合した。例えば、ｈ３．１０Ｃ２．ｖ１は、ヒト及びカニクイザルの両方のＴＲＥＭ２に結合し、ＫＤは１００から５００ｐＭの間であった。例えば、３．１０Ｃ２抗体基に基づく異なる軽鎖を有するＰａｒａ．０９重鎖を有するラット抗ヒト抗体は、１～５ｐＭのＫＤでヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に結合した。ヒト化ｈＰａｒａ．０９．ｖ２は、１０～２５ｐＭのＫＤでヒト及びカニクイザルのＴＲＥＭ２に結合した。３．１０Ｃ２のさらなるヒト化バージョンは１００～２００ｐＭのＫＤでヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に結合し、Ｐａｒａ．０９のさらなるヒト化バージョンは１０～５０ｐＭのＫＤでヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に結合した。
本明細書におけるＫＤは、例えばＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）ＳＰＲアッセイを使用してＳＰＲによって測定され得る。例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－３０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－Ｔ２００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を使用するアッセイは、固定化された抗体チップを用いて行うことができる。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は、会合及び解離センサーグラムを同時に適合させることによって、単純な１対１ラングミュア結合モデル（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して計算することができる。平衡解離定数（ＫＤ）を、比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出する。例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５－８８１（１９９９）を参照されたい。
以下の実施例において、親和性は、２つのフォーマットのうちの１つでＳＰＲによって測定した。１つのフォーマットでは、ＴＲＥＭ２－ＦｃをプロテインＡチップに固定化し、可溶性抗ＴＲＥＭ２ Ｆａｂ断片をリガンドとして使用した。第２のフォーマットでは、抗ＴＲＥＭ２ ＩｇＧを抗ＣＨ１ Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）チップに固定化し、リガンドとして可溶性モノマーＴＲＥＭ２を使用した。例えば、表１、表４及び表６に示すＫＤ測定は、３７℃でＳＰＲによって決定した。
エピトープ及び可溶性ＴＲＥＭ２結合の欠如、並びにＴＲＥＭ２シェディングの阻害
実施例の節において示されるように、本開示は、ストーク結合剤として文献において以前に記載された他の抗ＴＲＥＭ２抗体とは対照的に、ｈＴＲＥＭ２の残基１２９～１７４（配列番号９０を参照）にまたがるＴＲＥＭ２のストークドメイン内で特異的に結合するが、可溶性ＴＲＥＭ２（ｓＴＲＥＭ２；ｈＴＲＥＭ２の残基１９～１５７）には結合しない抗体を提供する。ｓＴＲＥＭ２は、残基Ｈ１５７と残基Ｓ１５８との間のＴＲＥＭ２の切断によって形成され、一般にＴＲＥＭ２の残基１９～１５７を含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２のストークドメインへの結合は、ストークドメイン及び第１の膜貫通ドメイン残基を含む、ＴＲＥＭ２の残基１２９～１７４（配列番号９０）又は残基１２９～１７５（配列番号１７７；図２Ａ）を含むポリペプチドへの結合アッセイを行うことによって示され得る。本明細書で提供される結果は、本開示の３．１０Ｃ２、Ｐａｒａ．０９、３．５０Ｇ１、３．１８Ｅ５、３．３６Ｆ５又は３．２７Ｈ７抗体、並びにＰａｒａ．０９．ｖ２、３．１０Ｃ２．ｖ１等の本明細書に記載のそれらの抗体のヒト化バージョンが、Ｈ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがるエピトープに結合し、Ｈ１５７－Ｓ１５８切断部位でのＴＲＥＭ２の切断時に破壊され、ｓＴＲＥＭ２には存在しない可能性が高いことを示す。（例えば、図２Ａ～図２Ｂ及び図５）。対照的に、文献に記載されているいくつかの抗ＴＲＥＭ２抗体は、可溶性ＴＲＥＭ２への結合を示し、いくつかの例では、切断部位の周囲の残基と接触し得るにもかかわらず、インタクトなＴＲＥＭ２の切断によって破壊されない異なるエピトープを認識する可能性が高い（例えば、図５を参照）。したがって、本開示は、他の抗ＴＲＥＭ２抗体には見られない特性、すなわち、ｓＴＲＥＭ２に結合する以前の抗体と同様のタンパク質領域と相互作用するように見えるにもかかわらず、インタクトなＴＲＥＭ２に結合するがｓＴＲＥＭ２には結合しない能力を有する抗体を提供する。
前述のように、本明細書における特定の抗体は可溶性ＴＲＥＭ２に結合しない。本明細書で使用される場合、これは、抗体が、ＥＬＩＳＡアッセイでアッセイした場合、ｓＴＲＥＭ２に対して１０％を超える結合を示さないことがあり、いくつかの例ではｓＴＲＥＭ２に対して５％を超える結合を示さないことを意味し、結合％は、ｓＴＲＥＭ２に対する結合が１００％に設定されている陽性対照抗体１．１６Ｂ８の結合に対して正規化されている。対照抗体１．１６Ｂ８の軽鎖配列を配列番号１７０に示し、その重鎖配列を配列番号１７１に示す。いくつかの実施形態では、抗体３．１７Ａ９がＥＬＩＳＡアッセイにおける検出剤として使用される。検出抗体３．１７Ａ９の軽鎖配列を配列番号１６８に示し、重鎖配列を配列番号１６９に示す。いくつかの実施形態では、ｈＴＲＥＭ２の残基１９～１５７を含むポリペプチドを使用して、結合をアッセイを行ってもよい（例えば、配列番号２１の残基１９～１５７）。いくつかの実施形態では、抗体は、結合が対照抗体１．１６Ｂ８の結合に対して正規化され、検出抗体３．１７Ａ９が検出試薬として使用され、ｓＴＲＥＭ２が配列番号２１の残基１９～１５７を含むポリペプチドであるＥＬＩＳＡアッセイでは可溶性ＴＲＥＭ２に結合しない。いくつかの実施形態では、ＥＬＩＳＡアッセイが、下記の実施例１１及び図１６に示されるように行われる場合がある。
例えば、本明細書における実施例１１に示すように、ヒトＴＲＥＭ２ ＥＬＩＳＡアッセイは、捕捉試薬として試験する抗体をプレートウェル上にコーティングし、検出試薬としてビオチン化ＩｇＶ反応性モノクローナル抗体３．１７Ａ９を使用することによって、ｓＴＲＥＭ２に対する抗体の結合を測定した。対照抗体１．１６Ｂ８を陽性対照抗体として使用して、ｓＴＲＥＭ２結合の標準を確立した。例えば、このアッセイでは、Ｐａｒａ．０９－ＬＣ ３．２７Ｈ７ ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧ（Ｐａｒａ０９）、ラット３．１０Ｃ２ ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧ（３．１０Ｃ２）、ラット３．１８Ｅ５ ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧ（３．１８Ｅ５）、ラット３．５０Ｇ１ ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧ（３．５０Ｇ１）、ラット３．２７Ｈ７ ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧ（３．２７Ｈ７）、ラット３．３６Ｆ５ ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧ（３．３６Ｆ５）は全て、ｓＴＲＥＭ２に対する結合を示さなかった（図１６を参照、１．１１６Ｂ８対照とは対照的に、これらの抗体についてほぼ０の正規化されたｓＴＲＥＭ２結合を示す）。ｈＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｇ定常領域を有するヒト化抗体Ｐａｒａ．０９．ｖ２抗体もｓＴＲＥＭ２結合について試験し、ｍＩｇＧ２ ＬＡＬＡＰＧを有するラットＰａｒａ．０９と同様に、ｓＴＲＥＭ２に対する結合を示さなかった。したがって、いくつかの実施形態では、図１６に示す抗体等の本明細書における抗体及びＰａｒａ．０９．ｖ２、３．１０Ｃ２．ｖ１等のこのような抗体のヒト化変異体は、可溶性ＴＲＥＭ２に結合しない。いくつかの実施形態では、それらの抗体はＴＲＥＭ２ストークドメインに結合するが、可溶性ＴＲＥＭ２には結合しない。
ｓＴＲＥＭ２への結合の欠如は、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗体とｓＴＲＥＭ２との間の望ましくない結合の可能性を有意に低減又は排除し得るので、ｉｎ ｖｉｖｏで有利であり得る。例えば、機構によって制限されることなく、ｓＴＲＥＭ２は、さもなければ、抗ＴＲＥＭ２抗体に対する「デコイ」として作用することができ、その結果、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗体分子は、細胞表面でＴＲＥＭ２に結合するために利用可能ではない。
実施例及び本明細書における添付の図に示されるように、本明細書における抗体はまた、ＴＲＥＭ２のストークドメイン内の残基に、Ｈ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがる領域において、具体的にはＴＲＥＭ２の１４９～１６８、１４６～１６９、１４６～１６１及び１５１～１６５の範囲の残基において結合する場合がある。この固有の切断部位にまたがるエピトープは、本明細書における抗体がＴＲＥＭ２ストークに結合し、可溶性ＴＲＥＭ２にも結合しない理由を説明し得る。（例えば、図５を参照）。いくつかの実施形態では、本明細書における抗体は、アミノ酸１４６～１６１（配列番９６）及び／又は１５１～１６５（配列番号９７）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドに、アミノ酸１３９～１５８（配列番号９２）及び／又は１５９～１７５（配列番号９４）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドよりも高い親和性で、特異的に結合する。いくつかの例では、本明細書における抗体は、アミノ酸１４９～１６８（配列番９３）、１４６～１６９（配列番号９５）、１４６～１６１（配列番号９６）及び／又は１５１～１６５（配列番号９７）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドに、アミノ酸１３９～１５８（配列番号９２）及び／又は１５９～１７５（配列番号９４）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドよりも高い親和性で、特異的に結合する。いくつかの実施形態では、本明細書における抗体は、アミノ酸１４６～１６１（配列番９６）及び／又は１５１～１６５（配列番号９７）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドに、アミノ酸１３９～１５８（配列番号９２）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチド及び１５９～１７５（配列番号９４）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドよりも高い親和性で、特異的に結合する。いくつかの例では、本明細書における抗体は、アミノ酸１４９～１６８（配列番９３）、１４６～１６９（配列番号９５）、１４６～１６１（配列番号９６）及び／又は１５１～１６５（配列番号９７）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドに、アミノ酸１３９～１５８（配列番号９２）ＴＲＥＭ２ポリペプチド、及び１５９～１７５（配列番号９４）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドよりも高い親和性で、特異的に結合する。
本明細書に提供される実施例に示されるように、データは、本開示の抗体がＴＲＥＭ２の残基１５１～１６１内のエピトープに特異的に結合することを示唆する。（図２Ａ及び図２Ｂを参照）。いくつかの実施形態では、本明細書における抗体は、Ｈ１５７－Ｓ１５８におけるＴＲＥＭ２切断部位にまたがるＡｓｐ－１５２、Ｈｉｓ－１５４、Ｖａｌ－１５５、Ｇｌｕ－１５６、Ｈｉｓ－１５７、Ｓｅｒ－１５８、Ｉｌｅ－１５９及びＳｅｒ－１６０のうちの１つ以上を含むエピトープに結合する。（図５を参照）。いくつかの実施形態では、本明細書における抗体は、残基１５２、１５４、１５７、１５８及び１５９を含むエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、本明細書における抗体は、Ａｓｐ－１５２、Ｈｉｓ－１５７及びＩｌｅ－１５９を含むエピトープに特異的に結合する。特定の実施形態では、本明細書における抗体は、残基Ａｓｐ－１５２、Ｈｉｓ－１５４、Ｖａｌ－１５５、Ｇｌｕ－１５６、Ｈｉｓ－１５７及びＩｌｅ－１５９の１つ以上を含むエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、本明細書における抗体は、Ｇｌｕ－１５６及びＳｅｒ－１６０を含むエピトープに結合する。アラニンスキャニング分析は、抗体３．２７Ｈ７の軽鎖可変領域と対になった０９重鎖可変領域を含む抗体Ｐａｒａ．０９のＴＲＥＭ２結合は、例えばＡｓｐ－１５２、Ｈｉｓ－１５７及びＩｌｅ－１５９におけるアラニン変異によって影響を受けることを示す。（図５）。Ｐａｒａ．０９及び３．１０Ｃ２は、３．１０Ｃ２の結合がＨ１５４及びＳ１５８におけるアラニン変異によって更に影響を受けることを除いて、アラニンスキャニングアッセイにおいて同様のパターンを有する。（図５）。
いくつかの実施形態では、Ｐａｒａ．０９ｖ２及び３．１０Ｃ２．ｖ１等のこのような抗体のヒト化変異体を含むＰａｒａ．０９又は３．１０Ｃ２等の本明細書における抗体はまた、によって測定される場合、ＴＲＥＭ２に特異的に結合しない対照抗体（例えば、アイソタイプ対照）と比較して、マウス血漿、ＣＳＦ又は脳組織等におけるｉｎ ｖｉｖｏでｓＴＲＥＭ２のレベルを低下させる。例えば、いくつかの実施形態では、ＥＬＩＳＡアッセイは、アイソタイプ対照抗体と比較して、抗ＴＲＥＭ２抗体の存在下でインキュベートした血漿、ＣＳＦ又は脳組織試料からの可溶性ＴＲＥＭ２のレベルの変化を決定することによって実施され得る。抗ＴＲＥＭ２抗体の存在下でのｓＴＲＥＭ２の低下したレベルは、ｓＴＲＥＭ２シェディングの阻害を示す。
以下の実施例１８Ａ～Ｂに示すように、ｓＴＲＥＭ２への結合の欠如は、ｉｎ ｖｉｖｏでのｓＴＲＥＭ２のこの枯渇とも相関している（マウス血漿、ＣＳＦ及び脳組織中）。比較抗体とは対照的に、例示的抗体Ｐａｒａ．０９による治療は、ベースライン対照レベルを下回る実質的に低いレベルの血漿ｓＴＲＥＭ２をもたらしたが、比較抗ＴＲＥＭ２抗体による治療は、血漿中のｓＴＲＥＭ２のレベルを数倍増加させた。（実施例１８Ｂ及び図２５Ｃ）。例えば、マウスのｍＩｇＧ２ ＬＡＬＡＰＧバックグラウンド中のＰａｒａ．０９抗体は、投与後少なくとも７日間血漿中の可溶性ＴＲＥＭ２レベルの７０～８５％の減少を引き起こしたが、比較抗体は同じ期間にわたってｓＴＲＥＭ２レベルを２倍超増加させた。（図２５Ｃ）。したがって、いくつかの実施形態では、Ｐａｒａ．０９及び３．１０Ｃ２等の本明細書における抗体並びにＰａｒａ．０９．ｖ２及び３．１０Ｃ２．ｖ１等のそれらのヒト化変異体は、マウスへの投与後少なくとも７日間、マウス血漿中の可溶性ＴＲＥＭ２レベルの減少を引き起こす。したがって、インタクトＴＲＥＭ２に対する増大した特異性及びｉｎ ｖｉｖｏでのｓＴＲＥＭ２に対する結合の欠如を有する本開示の抗体は、上昇したｓＴＲＥＭ２レベルが望ましくない状況において特に有用であり得る。
したがって、Ｐａｒａ．０９及び３．１０Ｃ２等の本明細書における抗体及びそれらのヒト化変異体は、以下の特性のいずれか１つ以上を有し得る：（ａ）ＴＲＥＭ２のストークドメインへの特異的結合；（ｂ）可溶性ＴＲＥＭ２（ｓＴＲＥＭ２）に結合しない；（ｃ）アミノ酸１３９～１５８（配列番号９２）及び／又は１５９～１７５（配列番号９４）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドよりも高い親和性での、アミノ酸１４６～１６１（配列番号９６）又は１５１～１６５（配列番号９７）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドへの特異的結合；（ｄ）Ｈ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがるＴＲＥＭ２エピトープへの特異的結合；（ｅ）野生型ＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチド（例えば、二重層干渉法によって測定される場合）と比較して、Ｄ１５２Ａ、Ｈ１５７Ａ及びＩ１５９Ａ置換を含むＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチドに対する結合親和性の低下；（ｆ）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による、３７℃での１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、７ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、若しくは２ｐＭ未満、又は１０～５０ｐＭ若しくは１０～２５ｐＭのＫＤでのヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２への特異的結合。いくつかの例では、及び抗体は、上記の特性のうちの２つ以上、上記の特性のうちの３つ以上、上記の特性のうちの４つ以上、上記の特性のうちの５つ以上、又は上記の特性の全てを有し得る。例えば、いくつかの例では、本明細書における抗体は、可溶性ＴＲＥＭ２には結合せず、また、Ｈ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがるＴＲＥＭ２エピトープに対する特異的結合を示し、及び／又はアミノ酸１３９－１５８（配列番号９２）及び／又はアミノ酸１５９～１７５（配列番号９４）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドよりも高い親和性で、アミノ酸１４６～１６１（配列番号９６）又はアミノ酸１５１～１６５（配列番号９７）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドに対する特異的結合を示す。いくつかのこのような例では、抗体はまた、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、３７℃で１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、７ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満若しくは２ｐＭ未満、又は１０～５０ｐＭ若しくは１０～２５ｐＭのＫＤでヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に特異的に結合する。例えば、いくつかの例では、本明細書における抗体は可溶性ＴＲＥＭ２に結合せず、ＴＲＥＭ２のストークドメインに特異的に結合する。いくつかの例では、本明細書における抗体は可溶性ＴＲＥＭ２に結合せず、野生型ＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチド（例えば、二重層干渉法によって測定される場合）と比較して、Ｄ１５２Ａ、Ｈ１５７Ａ及びＩ１５９Ａ置換を含むＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチドに対して結合親和性の低下を有する。いくつかのこのような例では、抗体はまた、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、３７℃で１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、７ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満若しくは２ｐＭ未満、又は１０～５０ｐＭ若しくは１０～２５ｐＭのＫＤでヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に特異的に結合する。さらに、いくつかの例では、抗体はインタクトなエフェクター機能も有する。いくつかの例では、抗体は、低下したエフェクター機能を有するＦｃ領域も有する。他の場合では、抗体は、エフェクターレスのＦｃ領域も有する。例えば、いくつかの例では、抗体は、Ｎ２９７Ｇ置換を有するｈＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。
特定の例示的実施形態では、抗体は重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨは配列番号１１又は１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号１２又は２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含み、更に、抗体は可溶性ＴＲＥＭ２（ｓＴＲＥＭ２）に結合せず、抗体は、以下のセクションで更に説明するＴＲＥＭ２アゴニストである。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号１７、１３３、１３５、１３７若しくは１３９のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号１７、１３３、１３５、１３７若しくは１３９のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。又は抗体が、Ｃ末端リジン若しくはＣ末端グリシン－リジンを含む又は含まない配列番号１４４のアミノ酸配列を含む若しくはそれからなる重鎖を含むか、又は配列番号１４４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、抗体はまた、Ｈ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがるＴＲＥＭ２エピトープに特異的に結合し、及び／又はアミノ酸１４６～１６１（配列番号９６）若しくは１５１～１６５（配列番号９７）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドに、アミノ酸１３９～１５８（配列番号９２）及び／又は１５９～１７５（配列番号９４）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドよりも高い親和性で特異的に結合する。いくつかの例では、抗体は可溶性ＴＲＥＭ２に結合せず、野生型ＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチド（例えば、二重層干渉法によって測定される場合）と比較して、Ｄ１５２Ａ、Ｈ１５７Ａ及びＩ１５９Ａ置換を含むＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチドに対して結合親和性の低下を有する。いくつかの例では、抗体はまた、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、３７℃で１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、７ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満若しくは２ｐＭ未満、又は１０～５０ｐＭ若しくは１０～２５ｐＭのＫＤでヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に特異的に結合する。さらに、いくつかの例では、抗体はインタクトなエフェクター機能も有する。いくつかの例では、抗体は、低下したエフェクター機能を有するＦｃ領域も有する。他の場合では、抗体は、エフェクターレスのＦｃ領域も有する。例えば、いくつかの例では、抗体は、Ｎ２９７Ｇ置換を有するｈＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。これらの場合のいずれにおいても、いくつかの実施形態では、抗体は、３．１０Ｃ２、３．５０Ｇ１、３．１８Ｅ５、３．３６Ｆ５又は３．２７Ｈ７の軽鎖ＣＤＲ１～３を有し得る。
本明細書に記載される抗体はまた、この節に記載される上記の特性の任意の組み合わせと共に、次の節に記載されるさらなる生物学的活性の１つ以上を有し得る。
さらなる生物学的活性
いくつかの実施形態では、Ｐａｒａ．０９及び３．１０Ｃ２並びにそれらのヒト化変異体等の本明細書における抗体は、以下のさらなる特徴の１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、又は６つ以上、７つ以上、８つ以上、又は全てを有し得る：（ａ）ヒトＴＲＥＭ２を発現するＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター細胞においてルシフェラーゼレポーター活性を誘導すること；（ｂ）血漿中のｉｎ ｖｉｖｏでのｓＴＲＥＭ２のレベルの低下；（ｃ）ヒトＴＲＥＭ２を発現するＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター細胞におけるｓＴＲＥＭ２のシェディングの阻害；（ｄ）ヒトＭＤＭ細胞におけるチロシンリン酸化の誘導；（ｅ）ヒトＭＤＭ細胞におけるＳＹＫリン酸化の誘導；（ｆ）ＩＬ－３４及びＣＳＦ－１の非存在下でのヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアの生存の増強；（ｇ）ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアにおけるｓＴＲＥＭ２のシェディングの阻害；（ｈ）ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアにおけるＳＹＫリン酸化の誘導；（ｉ）ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアにおけるＡβオリゴマーの存在下での総Ａβプラーク強度及び／又は平均Ｘ０４プラーク強度の増加（例えば、本明細の実施例１７のアッセイに記載される）。
したがって、いくつかの実施形態では、Ｐａｒａ．０９及び３．１０Ｃ２並びにそれらのヒト化変異体等の本明細書における抗体はまた、ヒトＴＲＥＭ２を発現するように操作されたＪｕｒｋａｔ細胞を含む培養細胞、あるいはヒト単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）又はヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来ミクログリアにおいてｓＴＲＥＭ２レベル（すなわち、ｓＴＲＥＭ２シェディングを阻害する）を低下させる。いくつかの例では、細胞培養アッセイにおけるｓＴＲＥＭ２レベルをＥＬＩＳＡアッセイによって測定してもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書における抗体は、ＴＲＥＭ２アゴニストである。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書における抗体は、ヒトＴＲＥＭ２を発現するＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞においてレポーター遺伝子発現を誘導する。例えば、ＴＲＥＭ２活性は、ＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞の核因子）の制御下で遺伝子発現の増強をもたらす細胞シグナル伝達事象をもたらし得る。ＮＦＡＴ活性は、例えば、ＮＦＡＴ転写因子による遺伝子発現の活性化に応答してホタルルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子を発現するように操作されたＪｕｒｋａｔ細胞を使用して評価することができる。ＮＦＡＴ制御遺伝子発現に対する抗ＴＲＥＭ２抗体の効果を試験するために、ヒトＴＲＥＭ２を発現するＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞を構築することができる。いくつかの実施形態では、本明細書における抗体は、ヒトＴＲＥＭ２を発現するＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞におけるレポーター遺伝子発現を増強する。（図１８Ａ～図１８Ｂを参照）。いくつかの実施形態では、本明細書における抗体はまた、ｈＴＲＥＭ２ Ｒ４７Ｈ、ｈＴＲＥＭ２ Ｒ６２Ｈ及び／又はＨ１５７Ｙ等のヒトＴＲＥＭ２突然変異体を発現するＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞におけるレポーター遺伝子発現を増強する。（図１９Ａ～図１９Ｃを参照）。
ＴＲＥＭ２活性、したがって抗ＴＲＥＭ２抗体によるアゴニズムはまた、一般にチロシン残基のリン酸化レベルによって、又はＴＲＥＭ２関連細胞シグナル伝達の活性化時にリン酸化されるキナーゼであるＳｙｋキナーゼのリン酸化レベルによって評価され得る。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書における抗体は、ヒトＴＲＥＭ２、ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリア又はヒトＭＤＭ細胞を発現するＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞のうちの１つ以上におけるｐａｎホスホ－チロシン（ｐＹ）レベル及びリン酸化Ｓｙｋキナーゼ（ｐ－ＳＹＫ）レベルの一方又は両方における増大によって測定されるように、ＴＲＥＭ２活性を増大させる。いくつかの実施形態では、本明細書における抗体は、ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリア及びヒトＭＤＭ細胞においてＳＹＫリン酸化を増加させる。
いくつかの実施形態では、本明細書における抗体はまた、細胞の生存及び成長を促進するために通常必要とされるＩＬ－３４及びＣＳＦ－１の非存在下でそれらの細胞を培養した場合、ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアの生存を増強する。例えば、ヒト化抗体ｈＰａｒａ．０９．ｖ２、ｈ３．１０Ｃ２．ｖ１、ｈＰａｒａ．０９Ｑ１００ＰＶ１０４Ｌ、及びｈＰａｒａ．０９Ｑ１００ＰはそれぞれｉＰＳＣ由来ミクログリアの生存を増強し、ＥＣ５０は６５ｐＭ～６１０ｐＭの範囲であった（それぞれ６５ｐＭ、３５０ｐＭ、１９０ｐＭ及び６１０ｐＭ）。（実施例１７及び図２３Ｅを参照）。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書における抗体は、ＩＬ－３４及びＣＳＦ－１の非存在下におけるｉＰＳＣ由来ミクログリアの生存を、６０ｐＭ～７００ｐＭ、例えば、６０ｐＭ～４００ｐＭ、又は６０ｐＭ～２００ｐＭの範囲のＥＣ５０で高め得る。さらに、いくつかの実施形態では、抗体は、ＩＬ－３４及びＣＳＦ－１の非存在下でのミクログリア生存を、アイソタイプ対照抗体のものよりも少なくとも３倍、又は３～８倍、例えば３～６倍、３～５倍、５～８倍、又は３～４倍増強し得る。（図２３Ｄ～図２３Ｅを参照）。
いくつかの実施形態では、本明細書における抗体は、ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアにおいてＡβオリゴマーの存在下でＡβプラーク強度を増加させ、及び／又はＸ０４プラーク強度を増加させる。（実施例１７及び図２４Ａ～図２４Ｃを参照）。プラーク形成及び圧縮は、例えば、ｉＰＳＣ由来ミクログリアを、Ａβを認識するもの（すなわち、「Ａβ強度」又は「Ａβプラーク強度」を測定すること）又はＡβプラークを認識するもの（Ｘ０４マーカー、「Ｘ０４強度」又は「Ｘ０４プラーク強度」の測定）等の特定のマーカー色素で染色する場合、強度の増加として測定され得る。いくつかの例では、「総」Ａβプラーク強度を決定してもよい。いくつかの例では、「平均」Ｘ０４プラーク強度を測定してもよい。プラーク形成及び圧縮、総Ａβプラーク強度及び平均Ｘ０４プラーク強度を測定するためのアッセイの例を実施例１７及び図２４Ａ～図２４Ｃに示す。
いくつかの実施形態では、本明細書における抗体は、アイソタイプ対照抗体と比較した総Ａβプラーク強度及び平均Ｘ０４強度の一方又は両方の増加によって示されるように、ｉＰＳＣ由来ミクログリアにおけるＡβプラーク形成及び圧縮を増加させる。例えば、いくつかの実施形態では、抗体の存在は、アイソタイプ対照抗体と比較して、総Ａβプラーク強度を４～６倍増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書における抗体は、１００ｎＭと８００ｎＭとの間の総Ａβプラーク強度の増加に対するＥＣ５０を有する。例えば、図２４Ｂに示されるように、抗体ｈＰａｒａ．０９．ｖ２、ｈ３．１０Ｃ２．ｖ１、ｈＰａｒａ．０９Ｑ１００ＰＶ１０４Ｌ、及びＰａｒａ．０９ Ｑ１００Ｐは、ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアモデルプラークアッセイにおいて総Ａβプラーク強度を増加させ、ＥＣ５０は、それぞれ３３０ｎＭ、１３０ｎＭ、７７０ｎＭ及び１２０ｎＭであった。さらに、いくつかの実施形態では、抗体の存在は、アイソタイプ対照抗体と比較して、アッセイにおける平均Ｘ０４プラーク強度を２～３倍増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書における抗体は、１０ｎＭ～５００ｎＭの平均Ｘ０４プラーク強度の増加に対するＥＣ５０を有する。例えば、図２４Ｃに示されるように、抗体ｈＰａｒａ．０９．ｖ２、ｈ３．１０Ｃ２．ｖ１、ｈＰａｒａ．０９Ｑ１００ＰＶ１０４Ｌ、及びｈＰａｒａ．０９Ｑ１００Ｐは、ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアモデルプラークアッセイにおいて平均Ｘ０４プラーク強度を増加させ、ＥＣ５０は、それぞれ３２０ｎＭ、１１ｎＭ、４０ｎＭ及び５００ｎＭであった。
ヒトＴＲＥＭ２を発現するＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞からのデータ、並びにＭＤＭ及びｉＰＳＣ由来ミクログリアモデルからのデータは、本明細書における抗体が、例えば、神経保護活性を有し得ることを示している。例えば、本明細書における抗体は、ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアの生存を増強し、ｐ－ＳＹＫリン酸化及び／又はＮＦＡＴ制御遺伝子発現を増加させ、ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアにおいてＡβオリゴマーの存在下でＡβプラーク形成及び圧縮を促進するという生物学的活性の組み合わせを有し得る。いくつかの実施形態では、本明細書における抗体はまた、ＢＶ ＥＬＩＳＡアッセイにおいてほとんど又は全く有意なオフターゲット結合を示さない。（Ｈｏｔｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｄｅｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．４１６１／ｍａｂｓ．２２１８９（２０１２））。例示的なＢＶ ＥＬＩＳＡアッセイは、以下の実施例１０に記載される通りである。このようなアッセイでは、例えば、抗体は、高い（スコア＞５）、中程度（スコア１～５）及び低い（検出不能、スコア＜１）オフターゲット結合を有し得る。いくつかの実施形態では、本明細書における抗体を、高い中程度のオフターゲット結合スコア及び低いオフターゲット結合スコアを有すると以前に決定された抗体と並行して試験した場合、本明細書における抗体は低いオフターゲット結合スコア、すなわち１未満を有することが分かった。（図１５を参照）。特に、ヒトＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｇ定常領域バックグラウンドで調製された３．１０Ｃ２．ｖ１及びＰａｒａ．０９．ｖ２は、それぞれ１００～５００ｐＭ及び１０～５０ｐＭ範囲のＴＲＥＭ２に対する親和性も有するにもかかわらず、このアッセイでは低いオフターゲット結合を示した（すなわち、１未満のスコアである。）。このアッセイにおける低いスコアは、例えば、抗体がｉｎ ｖｉｖｏで誤った標的に結合する可能性が低いことを示し得、これはヒト及びカニクイザルにおける好ましい薬物動態特性と相関し、ｉｎ ｖｉｖｏでの標的外結合に起因する毒性及び副作用を低減するのに有益であり得る。
特定の例示的なヒト化抗体の配列及び特性
抗体ｈ３．１０Ｃ２．ｖ１．
いくつかの態様では、本開示は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗体に関し、重鎖可変領域は、３．１０Ｃ２抗体の重鎖ＣＤＲを含むアミノ酸配列を含み、配列番号１、２及び３（Ｋａｂａｔ）を含むか、又は配列番号９、１０及び３（Ｃｈｏｔｈｉａ）を含む。（図９Ｂを参照）。いくつかの実施形態では、抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、配列番号４、５及び６を含む３．２７Ｈ７ Ｆａｂの軽鎖ＣＤＲに基づく、３．１０Ｃ２．ｖ１抗体の軽鎖ＣＤＲを含むアミノ酸配列を含む。（図９Ａを参照）。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１～６を含む、３．１０Ｃ２．ｖ１の重鎖及び軽鎖ＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号９、１０、３、４、５及び６を含む、３．１０Ｃ２．ｖ１の重鎖及び軽鎖ＣＤＲを含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１、２及び３、あるいは９、１０及び３の重鎖ＣＤＲ、及び／又は配列番号４、５及び６の軽鎖ＣＤＲを含み、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を更に含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１、２及び３、あるいは配列番号９、１０及び３の重鎖ＣＤＲ、及び／又は配列番号４、５及び６の軽鎖ＣＤＲを含み、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を更に含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１、２及び３、あるいは９、１０及び３の重鎖ＣＤＲ、及び／又は配列番号４、５及び６の軽鎖ＣＤＲを含み、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを更に含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１、２及び３、あるいは９、１０及び３の重鎖ＣＤＲ、及び／又は配列番号４、５及び６の軽鎖ＣＤＲを含み、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を更に含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１、２及び３、あるいは９、１０及び３の重鎖ＣＤＲ、及び／又は配列番号４、５及び６の軽鎖ＣＤＲを含み、配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を更に含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１、２及び３の重鎖ＣＤＲ、あるいは配列番号９、１０及び３の軽鎖ＣＤＲ、及び／又は配列番号４、５及び６の軽鎖ＣＤＲを含み、配列番号７の重鎖フレームワーク領域に、配列番号７のアミノ酸配列を含むが最大５個、例えば１、２、３、４又は５個のアミノ酸置換、挿入又は欠失を有する重鎖可変領域を更に含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１、２及び３の重鎖ＣＤＲ、あるいは配列番号９、１０及び３の軽鎖ＣＤＲ、及び／又は配列番号４、５及び６の軽鎖ＣＤＲを含み、配列番号８の軽鎖フレームワーク領域に、配列番号８のアミノ酸配列を含むが最大５個、例えば１、２、３、４又は５個のアミノ酸置換、挿入又は欠失を有する軽鎖可変領域を更に含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８のアミノ酸配列を含むが、配列番号７及び／又は配列番号８のフレームワーク領域において５個までのアミノ酸の置換、挿入又は欠失、例えば１、２、３、４又は５個のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を有する軽鎖可変領域とを含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は重鎖定常領域及び／又は軽鎖定常領域を更に含む。
本明細書における実施形態のいずれかでは、抗体は、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又は（Ｆａｂ’）２等の抗体断片であり得る。他の実施形態では、抗体は全抗体（すなわち、重鎖定常領域及び軽鎖定常領域を含む）であり得る。他の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、又はＩｇＭ抗体であり得る。いくつかの実施形態では、抗体は、野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域又は野生型ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域、ヒトＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ Ｆｃ領域、ヒトＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ／Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ Ｆｃ領域、ヒトＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｇ Ｆｃ領域、ヒトＩｇＧ１ ＬＡＬＡＰＧ（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ）Ｆｃ領域、又はヒトＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｇ／Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ Ｆｃ領域を有し得る。マウスＩｇＧ抗体の場合、抗体はｍＩｇＧ１又はｍＩｇＧ２又はｍＩｇＧ２ ＬＡＬＡＰＧ抗体であり得る。抗体は、いくつかの例では、完全長重鎖及び／又は完全長軽鎖を含み得る。いくつかの例では、抗体は、重鎖定常領域のＣ末端Ｌｙｓ又はＣ末端Ｌｙｓ及びＧｌｙ残基を欠いていてもよい。他の場合では、抗体は、それらのＣ末端残基の一方又は両方を含有する。いくつかの例では、抗体は二重特異性又は多重特異性であり得る。いくつかの例では、抗体は、標識又は薬物等の別の分子に直接又はリンカーを介してコンジュゲートされ得る。いくつかの例では、抗体はインタクトなエフェクター機能を有する。いくつかの例では、抗体は、エフェクター機能が低下したＦｃ領域を有する。他の場合では、抗体は、エフェクターのないＦｃ領域を有する。例えば、いくつかの例では、抗体は、Ｎ２９７Ｇ置換を有するｈＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、以下により詳細に記載される特定の特性を有し得る。例えば、いくつかの態様では、抗体は、以下の特徴の１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、又は全てを有する：（ａ）ＴＲＥＭ２のストークドメインに特異的に結合し、ｈＴＲＥＭ２の残基１５１～１６５からなるポリペプチド（配列番号９７）に特異的に結合する；（ｂ）可溶性ＴＲＥＭ２（ｓＴＲＥＭ２）に結合しない；及び（ｃ）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、３７℃で１ｎＭ未満、０．７ｎＭ未満、０．６ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．４ｎＭ未満若しくは０．３ｎＭ未満、又は１００～５００ｐＭ若しくは１００～２００ｐＭのＫＤでヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に特異的に結合する。さらなる態様では、抗体はまた、（ｄ）ＴＲＥＭ２のＨ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがるエピトープに特異的に結合し得る；（ｅ）アミノ酸１４６～１６１（配列番号９６）又は１５１～１６５（配列番号９７）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドに、アミノ酸１３９～１５８（配列番号９２）及び／又は１５９～１７５（配列番号９４）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドよりも高い親和性で特異的に結合し得る；並びに（ｆ）野生型ＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチド（例えば、二重層干渉法によって測定される場合）と比較して、Ｄ１５２Ａ、Ｈ１５７Ａ、及びＩ１５９Ａ置換を個々に含むＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチドに対する結合親和性の低下を示し得る。したがって、いくつかの例では、抗体（ａ）は可溶性ＴＲＥＭ ２に結合せず、（ｂ）はＴＲＥＭ ２のストークドメインに特異的に結合する。いくつかの例では、抗体は、（ａ）可溶性ＴＲＥＭ２に結合せず、（ｂ）ＴＲＥＭ２のＨ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがるＴＲＥＭ２エピトープに特異的に結合し、及び／又は（ｃ）アミノ酸１４６～１６１（配列番号９６）又は１５１～１６５（配列番号９７）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドに、アミノ酸１３９～１５８（配列番号９２）及び／又は１５９～１７５（配列番号９４）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドよりも高い親和性で特異的に結合する。いくつかの例では、（ａ）抗体は可溶性ＴＲＥＭ２に結合せず、（ｂ）野生型ＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチド（例えば、二重層干渉法によって測定される場合）と比較して、Ｄ１５２Ａ、Ｈ１５７Ａ及びＩ１５９Ａ置換を個々に含むＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチドに対する結合親和性の低下を示す。さらなる場合には、抗体（ｃ）は、３７℃での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による３７℃での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、１ｎＭ未満、０．７ｎＭ未満、０．６ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．４ｎＭ未満、若しくは０．３ｎＭ未満、又は３７℃で１００～５００ｐＭ若しくは１００～２００ｐＭのＫＤでヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に特異的に結合する。
いくつかの態様では、抗体は、ＴＲＥＭ２のＨ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがるエピトープに特異的に結合し、可溶性ＴＲＥＭ２には結合しないＴＲＥＭ２アゴニストである。いくつかの態様では、抗体は、ＴＲＥＭ２のＨ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがるエピトープに特異的に結合し、可溶性ＴＲＥＭ２に結合せず、３７℃での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による３７℃での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、ヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に、１ｎＭ未満、０．７ｎＭ未満、０．６ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．４ｎＭ未満、又は０．３ｎＭ未満、又は１００～５００ｐＭ又は１００～２００ｐＭのＫＤで特異的に結合する、ＴＲＥＭ２アゴニストである。いくつかの態様では、抗体は、ＴＲＥＭ２のＨ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがるエピトープに特異的に結合し、可溶性ＴＲＥＭ２には結合しないＴＲＥＭ２アゴニストである。これらの場合のいずれにおいても、抗体は、以下に列挙されるさらなる特性（ａ）～（ｉ）のうちの１つ以上を更に有し得る。
いくつかの例では、抗体は、ＢＶ ＥＬＩＳＡアッセイ等のオフターゲット結合アッセイでも低いオフターゲット結合スコア（例えば、１未満のスコア）を有する（一例は、本明細書における実施例１０に記載されるように行われるアッセイである）。いくつかの例では、このような抗体は、ＴＲＥＭ ２アゴニストとして作用する場合があり、また、下記に列挙される特性（ａ）～（ｉ）の１つ以上を有し得る。
具体的には、いくつかの態様では、抗体はまた、以下の特徴の１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、又は全てを有し得る：（ａ）ヒトＴＲＥＭ２を発現するＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞においてルシフェラーゼレポーター活性を誘導する；（ｂ）血漿中のｉｎ ｖｉｖｏでのｓＴＲＥＭ２のレベルを低下させる；（ｃ）ｓＴＲＥＭ２の排出を阻害し、及び／又はＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター細胞におけるヒトＴＲＥＭ２の内在化を誘導する；（ｄ）ヒトＴＲＥＭ２を発現するヒトＭＤＭ細胞においてチロシンリン酸化を誘導する；（ｅ）ヒトＴＲＥＭ２を発現するヒトＭＤＭ細胞においてＳＹＫリン酸化（ｐ－ＳＹＫ）を誘導する；（ｆ）ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアの生存を増強する；（ｇ）ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアにおけるｓＴＲＥＭ２のシェディングを阻害する；（ｈ）ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアにおいてＴＲＥＭ２シグナル伝達を活性化する；及び（ｉ）ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアにおいてＡβオリゴマーの存在下で総Ａβプラーク強度及び／又は平均Ｘ０４プラーク強度を増加させる。
ｈ３．１０Ｃ２．ｖ１変異体抗体
いくつかの実施形態では、本明細書における抗体は、上に記載され、図９Ａ～図９Ｂに示されるように、ｈ３．１０Ｃ２．ｖ１の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ、並びにｈ３．１０Ｃ２．ｖ１抗体の重鎖フレームワーク領域を含み得るが、例えば、図１４Ａに示されるように、抗体軽鎖に追加の修飾を有する。例えば、いくつかの実施形態では、以下の実施例に記載されるように、発現収率等を改善するために、フレームワーク領域に特定の軽鎖修飾を行ってもよい。
いくつかの実施形態では、抗体は、以下のＶＨ及びＶＬのセットのうちの１つを含む：（ａ）配列番号１４６及び１４５（抗体ｈ３．１０Ｃ２．ｖ１ Ｑ１００Ｐ）；（ｂ）配列番号１４８及び１４７（抗体ｈ３．１０Ｃ２．ｖ１Ｉ５８Ｖ／Ｑ１００Ｐ）；又は（ｃ）配列番号１５０及び１４９（抗体ｈ３．１０Ｃ２．ｖ１ Ｑ１００Ｐ／Ｖ１０４Ｌ）。いくつかの実施形態では、抗体は重鎖定常領域及び／又は軽鎖定常領域を更に含む。
本明細書における実施形態のいずれかでは、抗体は、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又は（Ｆａｂ’）２等の抗体断片であり得る。他の実施形態では、抗体は全抗体（すなわち、重鎖定常領域及び軽鎖定常領域を含む）であり得る。他の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、又はＩｇＭ抗体であり得る。いくつかの実施形態では、抗体は、野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域又は野生型ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域、ヒトＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ Ｆｃ領域、ヒトＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ／Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ Ｆｃ領域、ヒトＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｇ Ｆｃ領域、ヒトＩｇＧ１ ＬＡＬＡＰＧ（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ）Ｆｃ領域、又はヒトＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｇ／Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ Ｆｃ領域を有し得る。マウスＩｇＧ抗体の場合、抗体はｍＩｇＧ１又はｍＩｇＧ２又はｍＩｇＧ２ ＬＡＬＡＰＧ抗体であり得る。抗体は、いくつかの例では、完全長重鎖及び／又は完全長軽鎖を含み得る。いくつかの例では、抗体は、重鎖定常領域のＣ末端Ｌｙｓ又はＣ末端Ｌｙｓ及びＧｌｙ残基を欠いていてもよい。他の場合では、抗体は、それらのＣ末端残基の一方又は両方を含有する。いくつかの例では、抗体は二重特異性又は多重特異性であり得る。いくつかの例では、抗体は、標識又は薬物等の別の分子に直接又はリンカーを介してコンジュゲートされ得る。いくつかの例では、抗体はインタクトなエフェクター機能を有する。いくつかの例では、抗体は、エフェクター機能が低下したＦｃ領域を有する。他の場合では、抗体は、エフェクターのないＦｃ領域を有する。例えば、いくつかの例では、抗体は、Ｎ２９７Ｇ置換を有するｈＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、以下により詳細に記載される特定の特性を有し得る。例えば、いくつかの態様では、抗体は、以下の特徴の１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、又は全てを有する：（ａ）ＴＲＥＭ２のストークドメインに特異的に結合する；（ｂ）可溶性ＴＲＥＭ２（ｓＴＲＥＭ２）に結合しない；及び（ｃ）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、３７℃で１ｎＭ未満、０．７ｎＭ未満、０．６ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．４ｎＭ未満若しくは０．３ｎＭ未満、又は１００～５００ｐＭ若しくは１００～２００ｐＭのＫＤでヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に特異的に結合する。さらなる態様では、抗体はまた、（ｄ）ＴＲＥＭ２のＨ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがるエピトープに特異的に結合し得る；（ｅ）アミノ酸１４６～１６１（配列番号９６）又は１５１～１６５（配列番号９７）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドに、アミノ酸１３９～１５８（配列番号９２）及び／又は１５９～１７５（配列番号９４）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドよりも高い親和性で特異的に結合し得る；並びに（ｆ）野生型ＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチド（例えば、二重層干渉法によって測定される場合）と比較して、Ｄ１５２Ａ、Ｈ１５７Ａ、及びＩ１５９Ａ置換を個々に含むＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチドに対する結合親和性の低下を示し得る。したがって、いくつかの例では、抗体（ａ）は可溶性ＴＲＥＭ ２に結合せず、（ｂ）はＴＲＥＭ ２のストークドメインに特異的に結合する。いくつかの例では、抗体は、（ａ）可溶性ＴＲＥＭ２に結合せず、（ｂ）ＴＲＥＭ２のＨ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがるＴＲＥＭ２エピトープに特異的に結合し、及び／又は（ｃ）アミノ酸１４６～１６１（配列番号９６）又は１５１～１６５（配列番号９７）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドに、アミノ酸１３９～１５８（配列番号９２）及び／又は１５９～１７５（配列番号９４）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドよりも高い親和性で特異的に結合する。いくつかの例では、（ａ）抗体は可溶性ＴＲＥＭ２に結合せず、（ｂ）野生型ＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチド（例えば、二重層干渉法によって測定される場合）と比較して、Ｄ１５２Ａ、Ｈ１５７Ａ及びＩ１５９Ａ置換を個々に含むＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチドに対する結合親和性の低下を示す。これらの例のいくつかでは、抗体はまた、（ｃ）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、３７℃で１ｎＭ未満、０．７ｎＭ未満、０．６ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．４ｎＭ未満、若しくは０．３ｎＭ未満、又は１００～５００ｐＭ若しくは１００～２００ｐＭのＫＤでヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に特異的に結合する。
いくつかの態様では、抗体は、ＴＲＥＭ２のＨ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがるエピトープに特異的に結合し、可溶性ＴＲＥＭ２には結合しないＴＲＥＭ２アゴニストである。いくつかの態様では、抗体は、ＴＲＥＭ２のＨ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがるエピトープに特異的に結合し、可溶性ＴＲＥＭ２に結合せず、３７℃で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、ヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に、１ｎＭ未満、０．７ｎＭ未満、０．６ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．４ｎＭ未満、又は０．３ｎＭ未満、又は１００～５００ｐＭ又は１００～２００ｐＭのＫＤで特異的に結合する、ＴＲＥＭ２アゴニストである。いくつかの態様では、抗体は、ＴＲＥＭ２のＨ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがるエピトープに特異的に結合し、可溶性ＴＲＥＭ２には結合しないＴＲＥＭ２アゴニストである。
いくつかの例では、抗体はまた、オフターゲット結合アッセイ（本明細書における実施例１０に記載されるように実施される）において低いオフターゲット結合スコア（例えば、１未満のスコア）を有する。いくつかの例では、このような抗体は、ＴＲＥＭ ２アゴニストとして作用する場合があり、また、下記に列挙される特性（ａ）～（ｉ）の１つ以上を有し得る。
具体的には、いくつかの態様では、抗体はまた、以下の更なる特徴の１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、又は全てを有し得る：（ａ）ヒトＴＲＥＭ２を発現するＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞においてルシフェラーゼレポーター活性を誘導する；（ｂ）血漿中のｉｎ ｖｉｖｏでのｓＴＲＥＭ２のレベルを低下させる；（ｃ）Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター細胞におけるｓＴＲＥＭ２のシェディングを阻害する；（ｄ）ヒトＭＤＭ細胞においてチロシンリン酸化を誘導する；（ｅ）ヒトＭＤＭ細胞においてＳＹＫリン酸化を誘導する；（ｆ）ＩＬ３４及びＣＳＦ１の非存在下でのヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアの生存を増強する；（ｇ）ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアにおけるｓＴＲＥＭ２のシェディングを阻害する；（ｈ）ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアにおいてＳＹＫリン酸化を誘導する；並びに（ｉ）ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアにおけるＡβオリゴマーの存在下での総Ａβプラーク強度及び／又は平均Ｘ０４プラーク強度を増加させる。
いくつかの実施形態では、抗体は、以下のＶＨ及びＶＬのセットのうちの１つを含む：（ａ）配列番号１４６及び１４５（抗体ｈ３．１０Ｃ２．ｖ１ Ｑ１００Ｐ）；（ｂ）配列番号１４８及び１４７（抗体ｈ３．１０Ｃ２．ｖ１Ｉ５８Ｖ／Ｑ１００Ｐ）；並びに（ｃ）配列番号１５０及び１４９（抗体ｈ３．１０Ｃ２．ｖ１ Ｑ１００Ｐ／Ｖ１０４Ｌ）。
抗体ｈＰａｒａ．０９．ｖ２
いくつかの実施形態では、抗体は、抗体Ｐａｒａ．０９．ｖ２の重鎖及び軽鎖ＣＤＲを含み、重鎖ＣＤＲはＰａｒａ．０９重鎖に基づき、軽鎖ＣＤＲは３．２７Ｈ７ Ｆａｂに基づく。いくつかの実施形態では、本明細書における抗体は、配列番号１１、１２及び１３（Ｋａｂａｔ）又は代替では１９、２０及び１３（Ｃｈｏｔｈｉａ）の重鎖ＣＤＲ、及び／又は配列番号１４、１５及び１６の軽鎖ＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１１、１２及び１３（Ｋａｂａｔ）、あるいは１９、２０及び１３（Ｃｈｏｔｈｉａ）の重鎖ＣＤＲ、及び／又は配列番号１４、１５及び１６の軽鎖ＣＤＲを含み、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を更に含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１１、１２及び１３、あるいは１９、２０及び１３の重鎖ＣＤＲ、及び／又は配列番号１４、１５及び１６の軽鎖ＣＤＲを含み、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を更に含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１１、１２及び１３、あるいは１９、２０及び１３の重鎖ＣＤＲ、及び／又は配列番号１４、１５及び１６の軽鎖ＣＤＲを含み、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを更に含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１１、１２、及び１３、あるいは１９、２０、及び１３の重鎖ＣＤＲ、及び／又は配列番号１４、１５、及び１６の軽鎖ＣＤＲを含み、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を更に含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１１、１２、及び１３、あるいは１９、２０、及び１３の重鎖ＣＤＲ、及び／又は配列番号１４、１５、及び１６の軽鎖ＣＤＲを含み、配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を更に含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１１、１２、及び１３、あるいは１９、２０、及び１３の重鎖ＣＤＲ、及び／又は配列番号１４、１５、及び１６の軽鎖ＣＤＲを含み、配列番号１７のアミノ酸配列を含むが、配列番号１７の重鎖フレームワーク領域に最大５個、例えば１、２、３、４、又は５個のアミノ酸置換、挿入、又は欠失を有する重鎖可変領域を更に含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１１、１２及び１３の重鎖ＣＤＲ、あるいは配列番号１９、２０及び１３の軽鎖ＣＤＲ、及び／又は配列番号１４、１５及び１６の軽鎖ＣＤＲを含み、配列番号１８の軽鎖フレームワーク領域に、配列番号１８のアミノ酸配列を含むが最大５個、例えば１個、２個、３個、４個又は５個のアミノ酸置換、挿入又は欠失を有する軽鎖可変領域を更に含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むが、配列番号１７及び／又は配列番号１８のフレームワーク領域において５個までのアミノ酸の置換、挿入又は欠失、例えば１、２、３、４又は５個のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を有する軽鎖可変領域とを含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は重鎖定常領域及び／又は軽鎖定常領域を更に含む。
本明細書における実施形態のいずれかでは、抗体は、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又は（Ｆａｂ’）２等の抗体断片であり得る。他の実施形態では、抗体は全抗体（すなわち、重鎖定常領域及び軽鎖定常領域を含む）であり得る。他の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、又はＩｇＭ抗体であり得る。いくつかの実施形態では、抗体は、野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域又は野生型ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域、ヒトＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ Ｆｃ領域、ヒトＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ／Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ Ｆｃ領域、ヒトＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｇ Ｆｃ領域、ヒトＩｇＧ１ ＬＡＬＡＰＧ（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ）Ｆｃ領域、又はヒトＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｇ／Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ Ｆｃ領域を有し得る。マウスＩｇＧ抗体の場合、抗体はｍＩｇＧ１又はｍＩｇＧ２又はｍＩｇＧ２ ＬＡＬＡＰＧ抗体であり得る。抗体は、いくつかの例では、完全長重鎖及び／又は完全長軽鎖を含み得る。いくつかの例では、抗体は、重鎖定常領域のＣ末端Ｌｙｓ又はＣ末端Ｌｙｓ及びＧｌｙ残基を欠いていてもよい。他の場合では、抗体は、それらのＣ末端残基の一方又は両方を含有する。いくつかの例では、抗体は二重特異性又は多重特異性であり得る。いくつかの例では、抗体は、標識又は薬物等の別の分子に直接又はリンカーを介してコンジュゲートされ得る。いくつかの例では、抗体はインタクトなエフェクター機能を有する。いくつかの例では、抗体は、エフェクター機能が低下したＦｃ領域を有する。他の場合では、抗体は、エフェクターレスであるＦｃ領域を有する。例えば、いくつかの例では、抗体は、Ｎ２９７Ｇ置換を有するｈＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１４４のアミノ酸配列を含むか、又はこれからなる重鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１７６のアミノ酸配列を含むか、又はこれからなる軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１４４のアミノ酸配列を含むか、又はこれからなる重鎖と、配列番号１７６のアミノ酸配列を含むか、又はこれからなる軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１４４のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるが、配列番号１４４のＣ末端リジンを欠くか、又は配列番号１４４のＣ末端グリシン及びリジンを欠く重鎖と、配列番号１７６のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１４４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１７６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１４４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１７６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１４４のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖であって、任意に、Ｃ末端リジン又はグリシン－リジンを含まない重鎖と、配列番号１７６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１４４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１７６のアミノ酸配列を含むか又はこれからなる軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１４４のアミノ酸配列と比較して１、２、３、４、又は５個のアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１７６のアミノ酸配列と比較して１、２、３、４、又は５個のアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１４４のアミノ酸配列と比較して１、２、３、４、又は５個のアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１７６のアミノ酸配列と比較して１、２、３、４、又は５個のアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を有するアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１４４のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖であって、任意に、Ｃ末端リジン又はグリシン－リジンを含まない重鎖と、配列番号１７６のアミノ酸配列と比較して１、２、３、４、又は５個のアミノ酸置換、挿入、又は欠失を有するアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１４４のアミノ酸配列と比較して１、２、３、４、又は５個のアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１７６のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖とを含む。配列番号１４４及び／又は配列番号１７６の配列変異を可能にする上記の場合のいずれにおいても、いくつかの実施形態では、このような配列変異は、抗体が配列番号１１、１２及び１３又は代替では１９、２０及び１３の重鎖ＣＤＲ及び／又は配列番号１４、１５及び１６の軽鎖ＣＤＲも含むように、抗体フレームワーク及び／又は定常領域に限定される。他の実施形態では、配列番号１４４及び／又は配列番号１７６におけるこのような配列変異は、抗体が配列番号１７及び／又は１８も含むように、抗体定常領域に限定される。
いくつかの実施形態では、抗体は、以下により詳細に記載される特定の特性を有し得る。
例えば、いくつかの態様では、抗体は、以下の特徴の１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、又は全てを有する：（ａ）ＴＲＥＭ２のストークドメインに特異的に結合する；（ｂ）可溶性ＴＲＥＭ２（ｓＴＲＥＭ２）に結合しない；（ｃ）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって３７℃で１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、７ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、又は２ｐＭ未満、例えば１０～５０ｐＭ又は１０～２５ｐＭのＫＤでヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に特異的に結合する。さらなる態様では、抗体はまた、（ｄ）ＴＲＥＭ２のＨ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがるエピトープに特異的に結合し得る；（ｅ）アミノ酸１４６～１６１（配列番号９６）又は１５１～１６５（配列番号９７）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドに、アミノ酸１３９～１５８（配列番号９２）及び／又は１５９～１７５（配列番号９４）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドよりも高い親和性で特異的に結合し得る；並びに（ｆ）野生型ＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチド（例えば、二重層干渉法によって測定される場合）と比較して、Ｄ１５２Ａ、Ｈ１５７Ａ、及びＩ１５９Ａ置換を個々に含むＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチドに対する結合親和性の低下を示し得る。したがって、例として、いくつかの態様では、抗体は、ＴＲＥＭ２のＨ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがるエピトープに特異的に結合し、可溶性ＴＲＥＭ２には結合しない。いくつかのこのような例では、抗体はまた、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、７ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、又は２ｐＭ未満、例えば１０～５０ｐＭ又は１０～２５ｐＭのＫＤでヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に特異的に結合する。いくつかの態様では、抗体は、ＴＲＥＭ２のＨ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがるエピトープに特異的に結合し、及び／又はアミノ酸１４６～１６１（配列番号９６）若しくは１５１～１６５（配列番号９７）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドに、アミノ酸１３９～１５８（配列番号９２）及び／又は１５９～１７５（配列番号９４）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドよりも高い親和性で特異的に結合し、可溶性ＴＲＥＭ２にも結合しない。いくつかのこのような例では、抗体はまた、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、７ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、または２ｐＭ未満、例えば１０～５０ｐＭまたは１０～２５ｐＭのＫＤでヒトおよびカニクイザルＴＲＥＭ２に特異的に結合する。いくつかの態様では、抗体はＴＲＥＭ２のストークドメインに特異的に結合し、可溶性ＴＲＥＭ２には結合しない。いくつかのこのような例では、抗体はまた、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、７ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、又は２ｐＭ未満、例えば１０～５０ｐＭ又は１０～２５ｐＭのＫＤでヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に特異的に結合する。いくつかの態様では、抗体は可溶性ＴＲＥＭ２に結合しない。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって３７℃で１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、７ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、又は２ｐＭ未満、例えば１０～５０ｐＭ又は１０～２５ｐＭのＫＤでヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に特異的に結合する。いくつかの例では、抗体は可溶性ＴＲＥＭ２に結合せず、野生型ＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチド（例えば、二重層干渉法によって測定される場合）と比較して、Ｄ１５２Ａ、Ｈ１５７Ａ及びＩ１５９Ａ置換を個々に含むＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチドに対する結合親和性の低下を示す。いくつかのこのような例では、抗体はまた、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、７ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、又は２ｐＭ未満、例えば１０～５０ｐＭ又は１０～２５ｐＭのＫＤでヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に特異的に結合する。いくつかの例では、抗体はインタクトなエフェクター機能を有する。いくつかの例では、抗体は、エフェクター機能が低下したＦｃ領域を有する。他の場合では、抗体は、エフェクターレスであるＦｃ領域を有する。例えば、いくつかの例では、抗体は、Ｎ２９７Ｇ置換を有するｈＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。
いくつかの例では、抗体はまた、オフターゲット結合アッセイ（本明細書における実施例１０に記載されるように実施される）において低いオフターゲット結合スコア（例えば、１未満のスコア）を有する。いくつかの例では、抗体は、３．１０Ｃ２の重鎖及び軽鎖ＣＤＲを含む抗体よりもヒトＴＲＥＭ２に対して低いＫＤを有し得る。
いくつかの態様では、抗体は、ＴＲＥＭ２のＨ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがるエピトープに特異的に結合し、可溶性ＴＲＥＭ２には結合しないＴＲＥＭ２アゴニストである。いくつかの態様では、抗体は、ＴＲＥＭ２のＨ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがるエピトープに特異的に結合し、可溶性ＴＲＥＭ２には結合しないＴＲＥＭ２アゴニストである。いくつかの態様では、抗体は、ＴＲＥＭ２のＨ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがるエピトープに特異的に結合する；可溶性ＴＲＥＭ２には結合しない；また、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって３７℃で１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、７ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、又は２ｐＭ未満、例えば１０～５０ｐＭ又は１０～２５ｐＭのＫＤでヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に特異的に結合するＴＲＥＭ２アゴニストである。いくつかの例では、抗体はインタクトなエフェクター機能を有する。いくつかの例では、抗体は、エフェクター機能が低下したＦｃ領域を有する。他の場合では、抗体は、エフェクターレスであるＦｃ領域を有する。例えば、いくつかの例では、抗体は、Ｎ２９７Ｇ置換を有するｈＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。
これらの場合のいずれにおいても、抗体は、以下に列挙されるさらなる特性（ａ）～（ｉ）のうちの１つ以上を更に有し得る。
具体的には、いくつかの態様では、抗体はまた、以下の特徴の１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、又は全てを有し得る：（ａ）ヒトＴＲＥＭ２を発現するＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞においてルシフェラーゼレポーター活性を誘導する；（ｂ）血漿中のｉｎ ｖｉｖｏでのｓＴＲＥＭ２のレベルを低下させる；（ｃ）ヒトＴＲＥＭ２を発現するＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター細胞におけるｓＴＲＥＭ２のシェディングを阻害する；（ｄ）ヒトＭＤＭ細胞においてチロシンリン酸化を誘導する；（ｅ）ヒトＭＤＭ細胞においてＳＹＫリン酸化を誘導する；（ｆ）ＩＬ３４及びＣＳＦ１の非存在下でのヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアの生存を増強する；（ｇ）ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアにおけるｓＴＲＥＭ２のシェディングを阻害する；（ｈ）ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアにおいてＳＹＫリン酸化を誘導する；並びに（ｉ）ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアにおけるＡβオリゴマーの存在下での総Ａβプラーク強度及び／又は平均Ｘ０４プラーク強度を増加させる。いくつかの実施形態では、抗体は、３．１０Ｃ２の重鎖及び軽鎖ＣＤＲを含む抗体よりも高いルシフェラーゼレポーター活性（例えば、本明細書における実施例に記載されるようなＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーターアッセイにおけるより低いＥＣ５０）を有し得る。いくつかの実施形態では、抗体は、３．１０Ｃ２の重鎖及び軽鎖ＣＤＲを含む抗体と比較して、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞において（例えば、実施例に記載のアッセイにおいて）ｓＴＲＥＭ２シェディングのより大きな阻害を示し得る。
ｈＰａｒａ．０９．ｖ２変異体抗体
いくつかの実施形態では、本明細書における抗体は、上に記載され、図１２Ａ～図１２Ｂに示されるような、ｈＰａｒａ．０９．ｖ２の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ並びにｈＰａｒａ．０９．ｖ２抗体の重鎖フレームワーク領域を含み得るが、例えば、図１３ Ａに示されるように、抗体軽鎖にさらなる修飾を有する。例えば、いくつかの実施形態では、以下の実施例に記載されるように、発現収率を改善するために、フレームワーク領域に特定の軽鎖修飾を行ってもよい。
いくつかのこのような実施形態では、抗体は、以下のＶＨ及びＶＬのセットのうちの１つを含む：（ａ）配列番号１３３及び１３２（抗体ｈＰａｒａ０９．ｖ２ Ｑ１００Ｐ）；（ｂ）配列番号１３５及び１３４（抗体ｈＰａｒａ０９．ｖ２Ｉ５８Ｖ／Ｑ１００Ｐ）；（ｃ）配列番号１３７及び１３６（抗体ｈＰａｒａ０９．ｖ２ Ｑ１００Ｐ／Ｖ１０４Ｌ）。いくつかの実施形態では、抗体は重鎖定常領域及び／又は軽鎖定常領域を更に含む。いくつかの実施形態では、抗体軽鎖は、配列番号１７６のアミノ酸配列を含むか又はこれからなる。
本明細書における実施形態のいずれかでは、抗体は、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又は（Ｆａｂ’）２等の抗体断片であり得る。他の実施形態では、抗体は全抗体（すなわち、重鎖定常領域及び軽鎖定常領域を含む）であり得る。他の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、又はＩｇＭ抗体であり得る。いくつかの実施形態では、抗体は、野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域又は野生型ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域、ヒトＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ Ｆｃ領域、ヒトＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ／Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ Ｆｃ領域、ヒトＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｇ Ｆｃ領域、ヒトＩｇＧ１ ＬＡＬＡＰＧ（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ）Ｆｃ領域、又はヒトＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｇ／Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ Ｆｃ領域を有し得る。マウスＩｇＧ抗体の場合、抗体はｍＩｇＧ１又はｍＩｇＧ２又はｍＩｇＧ２ ＬＡＬＡＰＧ抗体であり得る。抗体は、いくつかの例では、完全長重鎖及び／又は完全長軽鎖を含み得る。いくつかの例では、抗体は、重鎖定常領域のＣ末端Ｌｙｓ又はＣ末端Ｌｙｓ及びＧｌｙ残基を欠いていてもよい。他の場合では、抗体は、それらのＣ末端残基の一方又は両方を含有する。いくつかの例では、抗体は二重特異性又は多重特異性であり得る。いくつかの例では、抗体は、標識又は薬物等の別の分子に直接又はリンカーを介してコンジュゲートされ得る。いくつかの例では、抗体はインタクトなエフェクター機能を有する。いくつかの例では、抗体は、エフェクター機能が低下したＦｃ領域を有する。他の場合では、抗体は、エフェクターレスであるＦｃ領域を有する。例えば、いくつかの例では、抗体は、Ｎ２９７Ｇ置換を有するｈＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、以下により詳細に記載される特定の特性を有し得る。例えば、いくつかの態様では、抗体は、以下の特徴の１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、又は全てを有する：（ａ）ＴＲＥＭ２のストークドメインに特異的に結合する；（ｂ）可溶性ＴＲＥＭ２（ｓＴＲＥＭ２）に結合しない；（ｃ）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって３７℃で１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、７ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、又は２ｐＭ未満、又は１０～５０ｐＭ若しくは１０～２５ｐＭのＫＤでヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に特異的に結合する。さらなる態様では、抗体はまた、（ｄ）ＴＲＥＭ２のＨ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがるエピトープに特異的に結合し得る；（ｅ）アミノ酸１４６～１６１（配列番号９６）又は１５１～１６５（配列番号９７）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドに、アミノ酸１３９～１５８（配列番号９２）及び／又は１５９～１７５（配列番号９４）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドよりも高い親和性で特異的に結合し得る；並びに（ｆ）野生型ＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチド（例えば、二重層干渉法によって測定される場合）と比較して、Ｄ１５２Ａ、Ｈ１５７Ａ、及びＩ１５９Ａ置換を個々に含むＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチドに対する結合親和性の低下を示し得る。したがって、例として、いくつかの態様では、抗体は、ＴＲＥＭ２のＨ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがるエピトープに特異的に結合し、可溶性ＴＲＥＭ２には結合しない。いくつかのこのような例では、抗体はまた、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、７ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、又は２ｐＭ未満、例えば１０～５０ｐＭ又は１０～２５ｐＭのＫＤでヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に特異的に結合する。いくつかの態様では、抗体は、ＴＲＥＭ２のＨ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがるエピトープに特異的に結合し、及び／又はアミノ酸１４６～１６１（配列番号９６）若しくは１５１～１６５（配列番号９７）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドに、アミノ酸１３９～１５８（配列番号９２）及び／又は１５９～１７５（配列番号９４）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドよりも高い親和性で特異的に結合し、可溶性ＴＲＥＭ２にも結合しない。いくつかのこのような例では、抗体はまた、３７℃で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、７ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、又は２ｐＭ未満、例えば１０～５０ｐＭ又は１０～２５ｐＭのＫＤでヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に特異的に結合する。いくつかの態様では、抗体はＴＲＥＭ２のストークドメインに特異的に結合し、可溶性ＴＲＥＭ２には結合しない。いくつかのこのような例では、抗体はまた、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、７ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、又は２ｐＭ未満、例えば１０～５０ｐＭ又は１０～２５ｐＭのＫＤでヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に特異的に結合する。いくつかの態様では、抗体は可溶性ＴＲＥＭ２に結合しない。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって３７℃で１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、７ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、又は２ｐＭ未満、例えば１０～５０ｐＭ又は１０～２５ｐＭのＫＤでヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に特異的に結合する。いくつかの例では、抗体は可溶性ＴＲＥＭ２に結合せず、野生型ＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチド（例えば、二重層干渉法によって測定される場合）と比較して、Ｄ１５２Ａ、Ｈ１５７Ａ及びＩ１５９Ａ置換を個々に含むＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチドに対する結合親和性の低下を示す。いくつかのこのような例では、抗体はまた、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、７ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、又は２ｐＭ未満、例えば１０～５０ｐＭ又は１０～２５ｐＭのＫＤでヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に特異的に結合する。いくつかの例では、抗体はインタクトなエフェクター機能を有する。いくつかの例では、抗体は、エフェクター機能が低下したＦｃ領域を有する。他の場合では、抗体は、エフェクターレスであるＦｃ領域を有する。例えば、いくつかの例では、抗体は、Ｎ２９７Ｇ置換を有するｈＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。
いくつかの例では、抗体はまた、オフターゲット結合アッセイ（本明細書における実施例１０に記載されるように実施される）において低いオフターゲット結合スコア（例えば、１未満のスコア）を有する。いくつかの例では、抗体は、３．１０Ｃ２の重鎖及び軽鎖ＣＤＲを含む抗体よりもヒトＴＲＥＭ２に対して低いＫＤを有し得る。いくつかの態様では、抗体は、ＴＲＥＭ２のＨ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがるエピトープに特異的に結合し、可溶性ＴＲＥＭ２には結合しないＴＲＥＭ２アゴニストである。いくつかの態様では、抗体は、ＴＲＥＭ２のＨ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがるエピトープに特異的に結合し、可溶性ＴＲＥＭ２には結合しないＴＲＥＭ２アゴニストである。いくつかの態様では、抗体は、ＴＲＥＭ２のＨ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがるエピトープに特異的に結合する；可溶性ＴＲＥＭ２には結合しない；また、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって３７℃で１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、７ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、又は２ｐＭ未満、例えば１０～５０ｐＭ又は１０～２５ｐＭのＫＤでヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に特異的に結合するＴＲＥＭ２アゴニストである。いくつかの例では、抗体はインタクトなエフェクター機能を有する。いくつかの例では、抗体は、エフェクター機能が低下したＦｃ領域を有する。他の場合では、抗体は、エフェクターレスであるＦｃ領域を有する。例えば、いくつかの例では、抗体は、Ｎ２９７Ｇ置換を有するｈＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。
これらの場合のいずれにおいても、抗体は、以下に列挙されるさらなる特性（ａ）～（ｉ）のうちの１つ以上を更に有し得る。
いくつかの態様では、抗体はまた、以下の特徴の１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、又は全てを有し得る：（ａ）ヒトＴＲＥＭ２を発現するＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞においてルシフェラーゼレポーター活性を誘導する；（ｂ）血漿中のｉｎ ｖｉｖｏでのｓＴＲＥＭ２のレベルを低下させる；（ｃ）ヒトＴＲＥＭ２を発現するＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター細胞におけるｓＴＲＥＭ２ヒトＴＲＥＭ２のシェディングを阻害する；（ｄ）ヒトＭＤＭ細胞においてチロシンリン酸化を誘導する；（ｅ）ヒトＭＤＭ細胞においてＳＹＫリン酸化を誘導する；（ｆ）ＩＬ３４及びＣＳＦ１の非存在下でのヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアの生存を増強する；（ｇ）ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアにおけるｓＴＲＥＭ２のシェディングを阻害する；（ｈ）ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアにおいてＳＹＫリン酸化を誘導する；並びに（ｉ）ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアにおけるＡβオリゴマーの存在下での総Ａβプラーク強度及び／又は平均Ｘ０４プラーク強度を増加させる。いくつかの実施形態では、抗体は、３．１０Ｃ２の重鎖及び軽鎖ＣＤＲを含む抗体よりも高いルシフェラーゼレポーター活性（例えば、本明細書における実施例に記載されるようなＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーターアッセイにおけるより低いＥＣ５０）を有し得る。いくつかの実施形態では、抗体は、３．１０Ｃ２の重鎖及び軽鎖ＣＤＲを含む抗体と比較して、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞において（例えば、実施例に記載のアッセイにおいて）ｓＴＲＥＭ２シェディングのより大きな阻害を示し得る。
いくつかの実施形態では、抗体は、以下のＶＨ及びＶＬのセットのうちの１つを含む：（ａ）配列番号１３３及び１３２（抗体ｈＰａｒａ０９．ｖ２ Ｑ１００Ｐ）；（ｂ）配列番号１３５及び１３４（抗体ｈＰａｒａ０９．ｖ２Ｉ５８Ｖ／Ｑ１００Ｐ）；（ｃ）配列番号１３７及び１３６（抗体ｈＰａｒａ０９．ｖ２ Ｑ１００Ｐ／Ｖ１０４Ｌ）。
抗体をコードする核酸
抗ＴＲＥＭ２抗体の１つ以上の鎖をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子も提供される。いくつかの実施形態では、核酸分子は、抗ＴＲＥＭ２抗体の重鎖又は軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、抗ＴＲＥＭ２抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドと軽鎖をコードするポリヌクレオチドの両方を含む。いくつかの実施形態では、第１の核酸分子は、重鎖をコードする第１のポリヌクレオチドを含み、第２の核酸分子は、軽鎖をコードする第２のポリヌクレオチドを含む。
いくつかのかかる実施形態では、重鎖及び軽鎖は、１つの核酸分子から、又は２つの別個の核酸分子から、２つの別個のポリペプチドとして発現される。いくつかの実施形態では、例えば抗体がｓｃＦｖである場合、単一ポリヌクレオチドは、共に連結された重鎖と軽鎖の両方を含む単一ポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、抗ＴＲＥＭ ２抗体の重鎖又は軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、翻訳されると、重鎖又は軽鎖のＮ末端に位置するリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含む。上述のように、リーダー配列は、天然の重鎖又は軽鎖リーダー配列であってもよく、又は別の異種リーダー配列であってもよい。
核酸分子は、当技術分野で従来の組換えＤＮＡ技術を使用して構築され得る。いくつかの実施形態では、核酸分子は、選択された宿主細胞における発現に適した発現ベクターである。
ベクター及び宿主細胞並びに作製方法
抗ＴＲＥＭ２重鎖及び／又は抗ＴＲＥＭ２軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。抗ＴＲＥＭ２重鎖及び／又は抗ＴＲＥＭ２軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含むベクターも提供される。このようなベクターとしては、限定されないが、ＤＮＡベクター、ファージベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター等が挙げられる。いくつかの実施形態では、ベクターは、重鎖をコードする第１のポリヌクレオチド配列及び軽鎖をコードする第２のポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、重鎖及び軽鎖は、２つの別個のポリペプチドとしてベクターから発現される。いくつかの実施形態では、重鎖及び軽鎖は、例えば抗体がｓｃＦｖである場合等、単一のポリペプチドの一部として発現される。
いくつかの実施形態では、第１のベクターは重鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、第２のベクターは軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１のベクター及び第２のベクターは、同様の量（同様のモル量又は同様の質量量等）で宿主細胞にトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、第１のベクター及び第２のベクターの５：１～１：５のモル比又は質量比が宿主細胞にトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、重鎖をコードするベクターと軽鎖をコードするベクターとについて１：１～１：５の質量比が使用される。いくつかの実施形態では、重鎖をコードするベクターと軽鎖をコードするベクターの質量比１：２が使用される。
いくつかの実施形態では、ＣＨＯ若しくはＣＨＯ由来細胞又はＮＳＯ細胞におけるポリペプチドの発現に最適化されたベクターが選択される。例示的なこのようなベクターは、例えば、Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｄｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：８８０－８８９（２００４）に記載される。
いくつかの実施形態では、ヒトを含む動物における抗ＴＲＥＭ２重鎖及び／又は抗ＴＲＥＭ２軽鎖のｉｎ ｖｉｖｏ発現のためにベクターが選択される。いくつかのかかる実施形態では、ポリペプチドの発現は、組織特異的に機能するプロモーターの制御下にある。例えば、肝臓特異的プロモーターは、例えば、ＰＣＴ公開番号の国際公開第２００６／０７６２８８号に記載されている。
抗ＴＲＥＭ２抗体の組換え産生のために、例えば、上述のもの等の抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び／又は発現のために、１つ以上のベクター中に挿入される。このような核酸は、容易に単離され得て、従来の手順を用いて（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定され得る。
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現のための適切な宿主細胞には、本明細書に記載の原核細胞又は真核細胞が含まれる。例えば、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされていない場合、抗体は細菌内で生産されてもよい。細菌での抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、同第５，７８９，１９９号、及び同第５，８４０，５２３号を参照されたい。（また、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における抗体断片の発現について記載している、Ｃｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３），ｐｐ．２４５－２５４も参照）発現後、本発明の抗体は、細菌細胞ペーストから可溶性画分として単離され、更に精製され得る。
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現宿主としては、原核生物に加えて、糸状菌や酵母等の真核微生物が適しており、その中にはグリコシル化経路が「ヒト化」されており、結果として部分的又は完全にヒトのグリコシル化パターンを有する抗体を産生する真菌株や酵母株も含まれる。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９－１４１４（２００４），ａｎｄ Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０－２１５（２００６）を参照されたい。
また、グリコシル化抗体を発現させるのに適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定されており、これを昆虫細胞と組み合わせて使用され得て、特にスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションに使用され得る。
植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、第６，０４０，４９８号、第６，４２０，５４８号、第７，１２５，９７８号、及び第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物で抗体を生成するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技法について記載）を参照されたい。
脊椎動物細胞も、宿主として使用される。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚性腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載される２９３又は２９３細胞）；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０）に記載されるＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカ緑猿腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）；ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；水牛ラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；例えば、Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２）に記載されるＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４２１６（１９８０））を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、並びにＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０等の骨髄腫細胞株が挙げられる。抗体産生に好適な特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐｐ．２５５－２６８（２００３）
抗ＴＲＥＭ２抗体は、任意の適切な方法によって精製され得る。このような方法には、アフィニティーマトリックス又は疎水性相互作用クロマトグラフィーの使用が含まれるが、これらに限定されない。適切なアフィニティーリガンドとしては、ＴＲＥＭ ２ ＥＣＤ及び抗体定常領域に結合するリガンドが挙げられる。例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、又は抗体アフィニティカラムを使用して定常領域を結合し、抗ＴＲＥＭ２抗体を精製し得る。疎水性相互作用クロマトグラフィー、例えばブチル又はフェニルカラムもまた、いくつかのポリペプチドの精製に適し得る。ポリペプチドを精製する多くの方法が当技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、抗ＴＲＥＭ２抗体は無細胞系で産生される。非限定的な例示的な無細胞系は、例えば、Ｓｉｔａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４９８：２２９－４４（２００９）；Ｓｐｉｒｉｎ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：５３８－４５（２００４）；Ｅｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．２１：６９５－７１３（２００３）に記載されている。
薬学的使用の方法
本開示はまた、例えば、薬学的治療において、本明細書における抗ＴＲＥＭ２抗体を使用する方法を包含する。例えば、本開示は、対象における機能のＴＲＥＭ２喪失に関連する症状を治療する方法を包含する。本開示はまた、対象におけるｓＴＲＥＭ２のレベルを低下させる方法を包含する。
いくつかの例では、症状は神経炎症性又は神経変性疾患である。例としては、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、前頭側頭型認知症、認知症、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ナス・ハコーラ病、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、リソソーム蓄積症、スフィンゴミエリンリピドーシス（ニーマン・ピックＣ）、ムコ多糖症ＩＩ／ＩＩＩＢ、異染性白質ジストロフィー、多巣性運動ニューロパチー、神経ベーチェット病、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、視神経炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、脳卒中、横断性脊髄炎、外傷性脳損傷、又は脊髄損傷が挙げられる。いくつかの例では、症状は、アルツハイマー病である。いくつかの例では、症状は、ＭＳである。
例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）の病理学的特徴には、アミロイド斑を形成するベータ－アミロイドペプチドの細胞外沈着物、及び神経原線維変化と呼ばれる凝集した過剰リン酸化タウの細胞内沈着物が含まれる。これらの病状に続いて、活性化星状膠細胞及びミクログリアを含む脳炎症、並びに神経変性が増加する。家族性形態のＡＤは、プレセニリン１／２及びアミロイド前駆体タンパク質遺伝子の突然変異によって引き起こされ得る。これらのヒト変異並びにタウタンパク質における変異を発現するトランスジェニックマウスは、Ａベータ病態、過剰リン酸化タウ及び神経変性において同様の年齢依存的増加を示す。ＴＲＥＭ２機能の喪失を引き起こす変異は、プラークの不規則なミクログリア圧縮、プラークを取り囲む神経炎ジストロフィーの上昇、ａベータ誘発タウ病態の上昇及び神経変性をもたらす。理論に拘束されることを望むものではないが、ＴＲＥＭ ２活性の増強は、毒性の低いアミロイド斑への貪食又は圧縮によって、ミクログリア活性を増強し、毒性アミロイド－ベータペプチドの除去を促進し、したがってＡＤを治療し得る。
多発性硬化症（ＭＳ）は、ＣＮＳにおける自己免疫関連脱髄を特徴とする疾患である。患者では、疾患は、他の神経学的影響の中でも、運動失調、四肢脱力、及び視神経炎等の症候のエピソードを呈する。現在の治療は免疫抑制剤を含み、有効性は限られている可能性があるが、疾患を効果的に予防又は逆転させる治療法はない。ＭＳを治療し、いくつかの例では、回復させるためのアプローチとして、再髄鞘化療法が提案されている。前駆細胞（ＯＰＣ）から成熟したミエリン化オリゴデンドロサイトへのオリゴデンドロサイト分化を促進する化合物及び治療法は、再ミエリン化治療、並びにグリア細胞を改変する治療への可能な経路と考えられている。具体的には、ミクログリアは、ミエリン残屑を除去し、新たなミエリンの形成を促進する役割を有すると考えられている。ＴＲＥＭ２の機能喪失は、低髄性白質ジストロフィーをもたらし、ＴＲＥＭ２ノックアウトマウスは、ＭＳの動物モデルにおいて再髄鞘化及び回復に著しい障害を有する。理論に拘束されることを望むものではないが、ＴＲＥＭ２経路の活性化は再ミエリン化を加速し、したがってＭＳを治療し得る。
様々な実施形態では、抗ＴＲＥＭ２抗体は、経口、静脈内、皮下、非経口、鼻腔内、筋肉内、皮内、局所、経皮、及び髄腔内を含むがこれらに限定されない様々な経路によって、又はその他の方法で埋め込み若しくは吸入によってｉｎ ｖｉｖｏで投与され得る。主題の組成物は、固体、半固体、液体、又は気体の形態の調製物に製剤化されてもよく、限定されないが、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏、液剤、坐剤、浣腸剤、注射剤、吸入剤及びエアロゾル剤を含む。抗ＴＲＥＭ２抗体をコードする核酸分子は、直接又はウイルスベクター等のベクターで投与され得る。適切な製剤及び投与経路は、意図する用途に従って選択され得る。
様々な実施形態では、抗ＴＲＥＭ２抗体を含む組成物は、多種多様な薬学的に許容され得る担体（例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ｗｉｔｈ Ｆａｃｔｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ：Ｄｒｕｇｆａｃｔｓ Ｐｌｕｓ，２０ｔｈ ｅｄ．（２００３）；Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，７ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００４）；Ｋｉｂｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ（２０００））を含む製剤で提供される。ビヒクル、アジュバント、及び希釈剤を含む様々な薬学的に許容され得る担体が利用可能である。さらに、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、等張性調整剤、安定剤、湿潤剤等の様々な薬学的に許容され得る補助物質も入手可能である。非限定的な例示的な担体としては、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
様々な実施形態では、抗ＴＲＥＭ２抗体を含む組成物は、必要に応じて、従来の添加剤、例えば、可溶化剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤及び保存剤と共に、植物油又は他の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステル、又はプロピレングリコール等の水性又は非水性溶媒に溶解、懸濁、又は乳化することによって、注射又は注入のために製剤化され得る。様々な実施形態では、組成物は、例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の加圧された許容され得る噴射剤を使用して、吸入用に製剤化されてもよい。組成物はまた、様々な実施形態では、例えば生分解性又は非生分解性ポリマーと共に、持続放出マイクロカプセルに製剤化され得る。非限定的な例示的な生分解性製剤は、ポリ乳酸－グリコール酸ポリマーを含む。非限定的な例示的な非生分解性製剤は、ポリグリセリン脂肪酸エステルを含む。このような製剤を製造する特定の方法は、例えば、欧州特許出願公開第１ １２５ ５８４号Ａ１に記載されている。
各々が１つ以上の用量の抗ＴＲＥＭ２抗体を含有する１つ以上の容器を含む医薬パック及びキットも提供される。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の薬剤を含む又は含まない抗ＴＲＥＭ２抗体を含む組成物の所定量を含む単位投与量が提供される。いくつかの実施形態では、このような単位投与量は、注射用の単回使用プレフィルドシリンジで供給される。様々な実施形態では、単位投与量に含まれる組成物は、生理食塩水、スクロース等；リン酸塩等の緩衝剤を含んでもよく、及び／又は安定かつ有効なｐＨ範囲内で製剤化される。あるいは、いくつかの実施形態では、組成物は、適切な液体、例えば滅菌水の添加時に再構成され得る凍結乾燥粉末として提供され得る。いくつかの実施形態では、組成物は、タンパク質凝集を阻害する１つ以上の物質、例えば限定されないが、スクロース及びアルギニンを含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、ヘパリン及び／又はプロテオグリカンを含む。
実施例１：ラット抗ＴＲＥＭ２抗体の調製
Ａ．材料及び方法
抗ヒトＴＲＥＭ２抗体を作製するために、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、カリフォルニア州ホリスター）又はＴＲＥＭ２ノックアウトマウス（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、サウスサンフランシスコ）を、様々な抗原フォーマット：完全フロイントアジュバント又はＲｉｂｉアジュバントで乳化したヒトＴＲＥＭ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）タンパク質；ヒト全長ＴＲＥＭ２を発現する細胞外小胞（ＥＶ）；又は遺伝子銃若しくは流体力学的尾静脈（ＨＴＶ）注射を介して送達される完全長ヒトＴＲＥＭ２をコードするｐＤＮＡ（図１）で免疫した。
免疫化された動物からのリンパ節及び脾臓を採取し、Ｂ細胞を以下のように単離した。ラットについては、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのビオチン化抗体（ＣＤ４、ＣＤ８ａ、ＣＤ１１ｂ／ｃ、ＣＤ１６１、ＨＩＳ４８、ＩｇＭ）のカクテルを使用してクラススイッチＢ細胞を濃縮し、続いてストレプトアビジンビーズを使用して磁気分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カリフォルニア州サンディエゴ）した。マウスについては、ｐａｎ Ｂ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用してＢ細胞を濃縮し、続いてＩｇＭ陽性Ｂ細胞を磁気的に枯渇させた（ビオチン化抗ＩｇＭ ＩＩ／４１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。ＩｇＭ枯渇Ｂ細胞を、電気融合（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、マサチューセッツ州ホリストン）によってＳｐ２ａｂ骨髄腫細胞（Ａｂｅｏｍｅ、ジョージア州アセンズ）と融合した。Ｃｌｏｎａｃｅｌｌ－ＨＹ培地Ｃ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カナダ）中で一晩回収した後、ＨＡＴ（ヒポキサンチン－アミノプテリン－チミジン）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で細胞を選択した。次いで、融合したハイブリドーマを採取し、ラットハイブリドーマ用の抗ラットＩｇＧ－Ａｌｅｘａ ４８８（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、又はマウスハイブリドーマ用の抗マウスＩｇＧ ＦＩＴＣ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｓ）、及び蛍光コンジュゲート化ヒトＴＲＥＭ ２－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４３（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）で染色した。単一ＩｇＧ＋／ヒトＴＲＥＭ２＋ハイブリドーマ細胞を、ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＩ選別機（ＢＤ、ニュージャージー州フランクリンレイクス）を用いて９６ウェルプレートに選別し、７日間培養した。上清をヒトＴＲＥＭ２抗原に対するＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、ＥＬＩＳＡ陽性クローンをスケールアップした。ハイブリドーマ上清からの精製ＩｇＧ（Ｇａｍｍａ Ｂｉｎｄ Ｐｌｕｓ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ペンシルバニア州ピッツバーグ）を、ＤＯＸ誘導性ヒトＴＲＥＭ２発現２９３細胞及び機能活性を使用して細胞表面結合についてＦＡＣＳによってスクリーニングした。
Ｂ．結果
合計１，６５０個のハイブリドーマクローンが、ＥＬＩＳＡ形式で固定化ヒトＴＲＥＭ２に特異的に結合した（図１）。これらのうち、９４７は、ヒトＴＲＥＭ２を発現する２９３個の細胞にＦＡＣＳで結合した（図１）。次いで、ＦＡＣＳ陽性ハイブリドーマクローンの免疫グロブリン遺伝子の可変領域を配列決定した。
合計２２９個の固有のクローンが同定され、その大部分は、ヒトＴＲＥＭ２ ＥＣＤで免疫したＳＤラットに由来するものであった（図１）。固有のＦＡＣＳ陽性抗ＴＲＥＭ２クローンの可変領域配列を、遺伝子合成によるマウスＩｇＧ２ａ、ＬＡＬＡＰＧを有するエフェクターレスマウスＩｇＧ２ａ（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ、Ｅｕナンバリングシステム）、キメラヒトＩｇＧ１、キメラエフェクターレスヒトＩｇＧ１ ＬＡＬＡＰＧ（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ）及びキメラエフェクターレスヒトＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｇ（ＧｅｎｅＷｉｚ）としてクローニングするために使用した。組換えＩｇＧをＣＨＯ細胞で一過性に発現させ、プロテインＡ及びサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。選択されたクローンをＣＨＯ細胞中のキメラヒトＦａｂ断片としてもクローニングし、抗ＣＨ１アフィニティークロマトグラフィー、引き続いてサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。
実施例２：抗ＴＲＥＭ２クローンのエピトープ特異性
Ａ．材料及び方法
抗体を、ヒトＴＲＥＭ２ストーク（ＴＲＥＭ２残基１２９～１７４）由来のペプチドへの結合についてスクリーニングした。ＴＲＥＭ２残基１２９～１７５の範囲の重複配列を有するペプチドを使用して、ストーク全体のカバレッジを提供した（図２Ａ）。抗体エピトープを、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用してヒトＴＲＥＭ２のストークドメインにマッピングした。重複するビオチン化ペプチドを、ストレプトアビジンでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに捕捉した。ペプチドに対する抗体の結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲート化された抗マウスＩｇＧを用いて検出した。
Ｂ．結果
ヒトＴＲＥＭ２のストーク（ｓｔａｌｋ）ペプチド断片に結合するいくつかの抗体群が見出され、３つのラット抗ヒト抗体が一般にＴＲＥＭ２の残基１５１～１６１に結合する：図２Ｂ中の抗体３．１０Ｃ２、３．１８Ｅ５、及び３．５０Ｇ１（ｎＭでの結合親和性）。特に、これら３つの抗体は、ｈＴＲＥＭ２ストークの残基１４６～１６９、１４６～１６１、１４９～１６８又は１５１～１６５のペプチドに結合し、残基１２９～１７５からなるペプチドよりも、良好ではないにしても少なくとも同様に結合する。これらの４つのペプチドはそれぞれ、ｈＴＲＥＭ２ストークの残基１５１から残基１６１までの領域を包含し、ｈＴＲＥＭ２ストーク上のＨｉｓ１５７－Ｓｅｒ１５８切断位置を含み、これも図２Ａに示されている。他の試験した全てのペプチドに対するこれらの抗体の親和性は、１２９～１７５ペプチドに対する親和性と比較して有意に低下した。
実施例３：ラット抗ＴＲＥＭ２抗体の親和性
Ａ．材料及び方法
４６個のラット抗ヒト抗体を、ｈＴＲＥＭ２及びカニクイザルＴＲＥＭ２のストークに対する結合親和性について試験した。ｈＴＲＥＭ２ストーク及びカニクイザルＴＲＥＭ２ストークに対する抗体結合親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００装置を使用して表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した。ＴＲＥＭ２ストーク抗原（ヒト又はカニクイザル）を抗ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）チップ上に固定化し、抗ＴＲＥＭ２抗体クローンを３７℃で固定化ＴＲＥＭ２に結合させた。結合親和性ＫＤ（ｎＭ）を測定し、記録した。
Ｂ．結果
ｈＴＲＥＭ２ストークに対する４６個の試験抗体の結合親和性を測定したところ、測定されたＫＤ値は１．１３μＭ～０．０１ｎＭの範囲であった。カニクイザルＴＲＥＭ２ストークに対する結合測定のためにいくつかの抗体を選択した。試験した抗体の最初の群から、５つの抗体（３．１０Ｃ２、３．５０Ｇ１、３．１８Ｅ５、３．３６Ｆ５、及び３．２７Ｈ７）は、ヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２ストーク領域の両方について特に低いＫＤ値を有した。ｈＴＲＥＭ２ストークに対する抗体３．１０Ｃ２、３．５０Ｇ１、３．１８Ｅ５、３．３６Ｆ５及び３．２７Ｈ７の結合親和性は、それぞれ０．２４ｎＭ、０．６１ｎＭ、０．２６ｎＭ、１０ｎＭ及び０．２２ｎＭであった。カニクイザルＴＲＥＭ２ストークに対する抗体３．１０Ｃ２、３．５０Ｇ１、３．１８Ｅ５、３．３６Ｆ５及び３．２７Ｈ７の結合親和性は、それぞれ０．２５ｎＭ、０．５７ｎＭ、０．３０ｎＭ、１２ｎＭ及び０．２６ｎＭであった。これらのクローンは、同じＢ細胞クローン系統における独立したクローンであり、ＣＤＲ及び３．１０Ｃ２、３．５０Ｇ１、３．１８Ｅ５、３．３６Ｆ５及び３．２７Ｈ７の可変領域のそれらの配列を図３Ａ～図３Ｂに示す。それらの最初の５つの抗体のうち、４つは１ｎＭ未満のＫＤ値、具体的には３．１０Ｃ２、３．５０Ｇ１、３．１８Ｅ５及び３．２７Ｈ７を有していた。これらの４つの抗体は、以下では抗体の「３．１０Ｃ２群」と総称される。
実施例４：ラット抗体クローンのディープシーケンシング及びクローンＰａｒａ．０９の同定
抗体の３．１０Ｃ２、３．５０Ｇ１、３．１８Ｅ５、及び３．２７Ｈ７群（まとめて「３．１０Ｃ２群」）及び３．３６Ｆ５抗体クローンと同様の結合及び活性特性を有するが、ＴＲＥＭ２に対して更に高い親和性を有する免疫化ラット抗体レパートリーのディープシーケンシングデータセットからクローンを同定することを目的として、さらなる研究を行った。
Ａ．理論的根拠及び序論
げっ歯類抗体レパートリーにおいて、同じＶＨ及びＶＬ生殖細胞系列セグメントを共有する抗原に特異的な抗体は、ＣＤＲ Ｈ３の多様性にもかかわらず、エピトープ特異性を高い頻度で共有する傾向があることが以前に示されている（Ｈｓｉａｏ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ １２：１，１７２２５４１，ｄｏｉ：１０．１０８０／１９４２０８６２．２０２０．１７２２５４１（２０２０））。したがって、ＩＧＨＶ６－８及びＩＧＫＶ２Ｓ１１生殖細胞系列セグメントを有するが異なるＣＤＲ Ｈ３配列を有する免疫化ラット由来の追加の抗体は、これらがＴＲＥＭ２特異的である場合、抗体の３．１０Ｃ２群と同じエピトープを認識する可能性があった。感染ドナー由来の抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０抗体について、同様の様式で抗原に結合するクローン独立抗体のためのマイニングが記載されている（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１０：Ｅ４０８８－Ｅ４０９７，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１３０６２６２１１０（２０１３）．）。しかしながら、３．１０Ｃ２群の抗体の場合、ＨＩＶ－１抗体に使用されるのと同様の系統発生的技術は利用できなかった。これには少なくとも３つの理由があった：（１）抗体の３．１０Ｃ２群の突然変異荷重は比較的低かった；（２）抗原結合のための抗体の３．１０Ｃ２群の重要な特徴は知られていなかった；（３）３．１０Ｃ２群と同じクラスのクローン独立抗体は知られていなかった。ディープシーケンシングによる交差系統交差ドナー抗体のマイニングは、レパートリーからの特定のクローンタイプのマイニングのための実質的な配列情報を提供する非常に類似した長いＣＤＲ Ｈ３配列の状況でのみ記載されている（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１０：Ｅ４０８８－Ｅ４０９７，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１３０６２６２１１０（２０１３））。対照的に、この場合、３．１０Ｃ２群のクローン非依存性抗体のレパートリーを検索するために利用可能な情報は比較的限られており、検索のための特異的配列情報をほとんど提供しない非常に短いＣＤＲ Ｈ３配列を含む。したがって、３．１０Ｃ２群では、ＶＨ及びＶＬの生殖細胞系列セグメント対合情報のみがマイニングに利用可能であったが、この情報は、ＴＲＥＭ２以外の抗原に特異的なものを含むレパートリーにおける異なる特異性の多くのクローンが同じ生殖細胞系列セグメント対合を共有するため、マイニングに対する特異性を欠いていた。
さらに、クローン３．３６Ｆ５は、ラットＩＧＨＶ６－８生殖細胞系列セグメント及びＫａｂａｔ ＣＤＲ Ｈ３配列ＬＤＹ（又はＩＭＧＴシステムではＴＧＬＤＹ）を有するクローン３．１０Ｃ２群と非常に類似したＶＨを有するが、生殖細胞系列セグメントＩＧＫＶ２Ｕ１８（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｍｕｎ．Ｂｉｏｌ．２：３０４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４２００３－０１９－０５５１－ｙ（２０１９）に記載される生殖細胞系列セグメント）を有する異なる軽鎖を有する。（図３Ｂを参照）。したがって、同様のＩＧＫＶセグメントを有する軽鎖はまた、ディープシーケンシングデータセットをマイニングするために３．１０Ｃ２クローン群を置換し得る。最後に、これらのクローンは同じＢ細胞から系統を引き継がないため、３．１０Ｃ２群のクローンと同じ特異性を共有するクローン非依存性ＶＨ配列は、重鎖ＩＧＨＶ６－８生殖細胞系列セグメント及び軽鎖ＩＧＫＶ２Ｓ１１、ＩＧＫＶ２Ｕ１８又は同様の生殖細胞系列セグメントを発現する任意のＴＲＥＭ２免疫ラットに由来し得る。
ディープシーケンシングデータセットにおけるクローン系統外のクローンのためのマイニング戦略が最近記載されている（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ｄｏｉ：１０．１０８０／１９４２０８６２．２０２０．１８６９４０９（２０２１））。しかしながら、その方法は、本明細書に記載されるものとは異なり、ＣＤＲ Ｈ３を含むアミノ酸同一性に依存し、同じＣＤＲ Ｈ３長さを有する配列に限定される（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０２１）。ここで使用される検索戦略は、ＣＤＲ Ｈ３が主要な特異性決定因子であり、クローン選択のための同一性計算にＣＤＲ Ｈ３配列を含む、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，の検索戦略に暗黙的であるという現在保持されている見解に反して、異なるＣＤＲ Ｈ３長さを可能にしたとしても、ＣＤＲ Ｈ３配列を完全に無視する。さらに、本明細書に記載する方法は、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，が、クローン間の残基の任意のセットにわたって所与のレベルのアミノ酸同一性を明示的に必要とせず、ＶＨ生殖細胞系列セグメントのみを使用し、実際には、広く異なるＣＤＲ Ｈ３配列を有するクローンを同定しようとするものである。したがって、ＣＤＲ Ｈ３配列特性を無視したＶＨ生殖細胞系列セグメントによるマイニングは、原則として、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．の方法と同じエピトープ特異性を有する独立したクローンのより広い検索を可能にする一方で、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．によって実施されるような情報に富む配列特性の必要性を回避する。
Ｂ．材料及び方法
３匹の免疫化ラットのＶＨレパートリーを、ｃＤＮＡ合成及びＰＣＲ増幅のためのラット特異的プライマーを使用したペアエンドイルミナ配列決定によって配列決定した。簡潔には、３．１０Ｃ２群クローンがリンパ節組織を使用してハイブリドーマによって誘導された同じプールされた３匹のラットのセットからの骨髄及び脾臓組織を使用して総ＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ＰＣＲ工程で使用して、フレームワーク１領域の第１残基をコードする配列に特異的なラットＶＨ生殖細胞系列セグメントプライマー及びラットＩｇＧ及びＩｇＡアイソタイプに特異的な定常領域プライマーを用いて全レパートリーＶＨセグメントを増幅した。アンプリコンをＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ（商標）装置におけるペアエンドシーケンシングに供した。配列リードを全長ＶＨ配列にアセンブルし、前述のように（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｍｕｎ．Ｂｉｏｌ．２：３０４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４２００３－０１９－０５５１－ｙ（２０１９））Ａｂｓｏｌｖｅ（商標）を使用して生殖細胞系列セグメント及びＣＤＲ境界について解析した。
ＩＧＨＶ６－８生殖細胞系列セグメント及び多様なＣＤＲ Ｈ３配列を有する独立したクローン型からの２９個のクローンを選択し、ＩｇＧ断片の発現のために３．１０Ｃ２クローン群の異なる軽鎖と対合させた。選択された変異体の全長の重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡクローンをＥｘｐｉ２９３細胞に１ｍｌスケールでトランスフェクトし、ＩｇＧを前述のようにプロテインＡクロマトグラフィーによって精製した（Ｂｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１１２：１８３２－４，ｄｏｉ：１０．１００２／ｂｉｔ．２５６０１（２０１５）；Ｌｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｂｓ １０：６２４－３５，ｄｏｉ：１０．１０８０／１９４２０８６２．２０１８．１４４５４５０（２０１８））。
ＥＬＩＳＡ形式でＴＲＥＭ２ストークのペプチドへの結合についてクローンを試験した。各クローンの重鎖ＣＤＲ３を図４（左列）に示す。
Ｃ．結果
２９個の選択されたクローンのうち、Ｐａｒａ．０９と呼ばれる１つのクローンは、３．１０Ｃ２対照と同様に、３．１０Ｃ２群の軽鎖と対にした場合に、ヒトＴＲＥＭ２ストークのペプチド（ＴＲＥＭ２残基１２９～１７５）及びＥＬＩＳＡにおける残基１４９から１５８のＴＲＥＭ２ペプチド断片にロバストに結合した（図４）。クローンＰａｒａ．０９のＣＤＲ Ｈ３配列は、３．１０Ｃ２群のＣＤＲ Ｈ３よりも１残基長く、異なるＩＧＨＪ生殖細胞系列セグメント（ＩＧＨＪ２の代わりにＩＧＨＪ３）を有し、Ｐａｒａ．０９が３．１０Ｃ２群のクローン変異体ではなく、むしろラットレパートリーにおいて独立して生成されたクローン系統であることを示している。また、Ｐａｒａ．０９は、挿入を無視した場合（３．１０Ｃ２及びＰａｒａ．０９についてのＴＧ－ＬＤＹ対ＴＤＩＬＥＹそれぞれ、挿入には下線が引かれ、相違は太字及び斜体で強調表示される）、３．１０Ｃ２群と比較してＣＤＲ Ｈ３に２アミノ酸の差がある（図３Ｂ）。すなわち、Ｐａｒａ．０９のＣＤＲ Ｈ３の残基の半分（ＩＭＧＴシステムでは６個中３個、Ｋａｂａｔシステムでは４個中２個）のみが、クローン３．１０Ｃ２の同様の位置で同じである。３．１０Ｃ２クラスのクローンと比較してＰａｒａ．０９の独立したクローン起源を強調すると、Ｐａｒａ．０９は重鎖フレームワーク４領域にラットＩＧＨＪ３生殖細胞系列セグメントを有するが、クローンの３．１０Ｃ２群はラットＩＧＨＪ２生殖細胞系列セグメントを有する。
さらに、ＣＤＲ Ｈ３配列のみではＴＲＥＭ２結合因子を予測しない。これは、クローンＰａｒａ．１０によって例示され、これはＴＲＥＭ２ストーク又はペプチド断片１４９～１５８に結合せず、エピトープは、３．１０Ｃ２群又は生殖系列軽鎖のいずれかに対合された場合、３．１０Ｃ２群の抗体によって結合される（図３Ａ～図３Ｂ）。このクローンは、３．１０Ｃ２群のＣＤＲ Ｈ３よりも１残基長いＣＤＲ Ｈ３を有するが（及びＰａｒａ．０９ＣＤＲ Ｈ３と同じ長さ）、他の位置ではこれらとは異なっていない（それぞれ３．１０Ｃ２及びＰａｒａ．１０についてのＴＧＬ－ＤＹ対ＴＧＬＧＤＹ、挿入には下線が引かれる）。すなわち、Ｐａｒａ．０９ ＣＤＲ Ｈ３領域には、このクローンを明白な抗ＴＲＥＭ２候補とする明白な配列特性はない。最後に、ディープシーケンシングデータセットにおける３．１０Ｃ２群及びＰａｒａ．０９系統配列の頻度は、ハイブリドーマによってＰａｒａ．０９のありそうにない発見の理由を説明するが、ディープシーケンシングデータセットにおいて１４７個の固有の３．１０Ｃ２群ＶＨ配列について８，２８３個のリードカウントがあったのに対して、４個の固有のＰａｒａ．０９の関連ＶＨクローンについて４７個の配列リードしかなかった。３．１０Ｃ２群のカウント頻度では、１７４個のハイブリドーマのうち４個のみがこの群にあったことを考えると、ハイブリドーマ又は同様の技術によって低頻度Ｐａｒａ．０９クローンを同定する可能性は非常に低いと推定される。
実施例５：Ｐａｒａ．０９ Ｆａｂ断片の結合親和性
Ａ．材料及び方法
軽鎖抗体３．１０Ｃ２、３．１８Ｅ５、３．２７Ｈ７及び３．５０Ｇ１（「３．１０Ｃ２群」）と対になったクローンＰａｒａ．０９の重鎖を含む抗体断片を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００装置においてＳＰＲによってヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に対する親和性について試験した。簡潔には、クローン変異体をＦａｂ断片として発現させ、抗ＣＨ１アフィニティークロマトグラフィー、引き続いてサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。ＴＲＥＭ２－Ｆｃ抗原を抗ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）チップ上に固定化し、可溶性Ｐａｒａ．０９変異体及び３．１０Ｃ２クローンＦａｂ断片を固定化ＴＲＥＭ２に３７℃で結合させた。
Ｂ．結果
全てのＰａｒａ．０９クローン変異体は、使用される軽鎖に関係なく、また３．１０Ｃ２と比較してＰａｒａ．０９のＣＤＲ Ｈ１及びＨ２の高い類似性にもかかわらず、抗体３．１０Ｃ２の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むＦａｂよりも有意に高い親和性を示した（表１）。これは、ＣＤＲ Ｈ３がより高い結合親和性にとって重要であることを示している。より高い親和性は、結合速度論におけるより高い会合速度（ｋａ）及びより低い解離速度（ｋｄ）の両方によって反映された。結果を以下の表１に示す。
Figure 2024518545000003
実施例６：抗体と相互作用するＴＲＥＭ２ストーク中の残基のマッピング
Ａ．材料及び方法
一方、抗体がどのように生成されたかに基づいて、Ｐａｒａ．０９のエピトープは３．１０Ｃ２群の抗体と同じ領域に存在すると予想され、結合に対する個々の残基の重要性を評価するために、より詳細な研究を行った。クローンＰａｒａ．０９、抗体３．１０Ｃ２、及び３．５０Ｇ１等の３．１０Ｃ２群の他の抗体のエピトープマッピングを、残基１４９から１６１の単一アラニン点突然又は位置１５３のアラニンからグリシンへの突然変異を有する合成ＴＲＥＭ２ペプチドへの結合を試験することによって実施した（図５）。合成ペプチドへの結合を、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ装置でのバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、合成ペプチドのストレプトアビジン被覆センサーチップへの固定化及びペプチドの遊離可溶性Ｆａｂ断片への結合によって試験して、結合に対する効果を不明瞭にするアビディティー効果を回避した。これは、抗体結合に対する単一突然変異の効果が、それらの高い親和性、特にＰａｒａ．０９のために明らかではないため必要であり、これにより、突然変異体に対する親和性が低下していても、変異型ペプチドへのロバストな結合が可能になる。したがって、Ｆａｂ断片の結合の減少又はより速い解離を、抗体結合に対する突然変異の影響の読み出しとして使用した。
Ｂ．結果
重複ペプチドマッピングは、残基Ｇｌｕ－１５１から、含まれる残基Ｉｌｅ－１５９～Ａｒｇ－１６１間の区間（図２Ａ～図２Ｂ）に及ぶ、３．１０Ｃ２、３．１８Ｅ５及び３．５０Ｇ１のエピトープのおおよそのスパンを提供した。この実施例に記載されるような突然変異スキャニングによる３．１０Ｃ２、３．５０Ｇ１及びＰａｒａ．０９のさらなるマッピングは、結合に重要な側鎖を有する残基が、重複するペプチドへの結合と一致して、含まれるＡｓｐ－１５２～Ｉｌｅ－１５９の範囲内に位置することを示した。図５に示されるように、両方とも３．１０Ｃ２群にある抗体３．１０Ｃ２及び３．５０Ｇ１は、同様の結合プロフィルを有し、合成ペプチドは、ＴＲＥＭ２切断部位にまたがる１５２、１５４、１５７、１５８及び１５９の位置にアラニン変異を含み、それぞれが、ペプチドに対するＦａｂ断片の結合に影響を及ぼした。具体的には、結合のための重要なＴＲＥＭ２残基側鎖には、３．１０Ｃ２、３．５０Ｇ１及びＰａｒａ．０９抗体のそれぞれについて少なくともＡｓｐ－１５２、Ｈｉｓ－１５７及びＩｌｅ－１５９が含まれる。ｈｕＰａｒａの結晶構造の検討。ＴＲＥＭ２の残基１４８～１６５（分解能＝２Å）を有するペプチドとの複合体における０９．ｖ２ Ｑ１００Ｐ及びｈｕ３．１０Ｃ２．ｖ１ Ｑ１００Ｐは更に、ＴＲＥＭ２と２つの抗体との主な接触が残基Ａｓｐ－１５２、Ｈｉｓ－１５４、Ｖａｌ－１５５、Ｇｌｕ－１５６、Ｈｉｓ－１５７及びＩｌｅ－１５９によって媒介されることを示した（スキャニング突然変異誘発によって特定される残基には下線が引かれている）。抗体３．５０Ｇ１はまた、Ｅ１５６Ａ及びＳ１６０Ａ変異によって影響を受けたが、３．１０Ｃ２は影響を受けなかった。本開示による別の抗体クローン３．４７Ｂ１は、ＴＲＥＭ２への結合に影響を及ぼすより制限された一連の変異を有し、Ｈ１５７Ａ及びＩ１５９Ａのみが結合に対して検出可能な効果を有していた（図５）。抗体３．２７Ｈ７（したがって、本明細書ではＰａｒａ．０９－Ｌ２７Ｈ７とも呼ばれる）の軽鎖可変領域と対になったＰａｒａ．０９重鎖可変領域を含む抗体Ｐａｒａ．０９は、突然変異Ｈ１５４Ａ及びＳ１５８Ａについて結合に対する影響が観察されなかったことを除いて、３．１０Ｃ２と同様のパターンを有した（図５）。結晶構造を更に調べると、３．１０Ｃ２及びＰａｒａ．０９は、複合構造において非常に類似していることを示し、接触の角度及び数並びに疎水性ポケットの深さの差異は、観察された差異を説明し得る両抗体の異なるＣＤＲ Ｈ３長さによってもたらされる可能性が高い。
いくつかの以前に記載された抗ＴＲＥＭ２抗体も、突然変異スキャニングを使用してＴＲＥＭ２のストークドメインへの結合について評価した。抗体１４Ｄ３及び１４Ｄ８（例えば、国際公開第２０１８０１５５７３号に記載される）については、Ａ１５３Ｇ変異は結合に影響を及ぼしたが、Ｄ１５２Ａ及びＳ１５８Ａ変異は影響を及ぼさず（図５）、１４Ｄ３／１４Ｄ８抗体と比較して３．１０Ｃ２群とＰａｒａ．０９との間のエピトープ特異性の違いを示した。以前に記載された９Ｆ５及びＡＬ２ｐ－３１抗体（国際公開第２０１７０６２６７２号及び／又は国際公開第２０１９２８２９２号に記載）（後者は９Ｆ５のヒト化及び親和性成熟バージョンである）は、切断部位の直前で残基１５０から残基１５６又は１５７まで伸長する、３．１０Ｃ２、３．５０Ｇ１及びＰａｒａ．０９－Ｌ２７Ｈ７抗体と比較して、突然変異に対する感受性の異なるパターンを有していた。（図５）。３．１０Ｃ２、３．５０Ｇ１及びＰａｒａ．０９－Ｌ２７Ｈ７とは対照的に、残基１５８から１６１へのアラニン変異は、９Ｆ５及びＡＬ２ｐ－３１Ｆａｂの結合に影響を及ぼさなかった。したがって、これらの以前に記載された抗体は、切断部位の両側の残基とは相互作用せず、むしろ切断時にｓＴＲＥＭ２中に見出される残基とのみ相互作用するという点で明確に見える。
実施例７：ヒト化抗体３．１０Ｃ２
Ａ．材料及び方法
抗体３．１０Ｃ２を、ＣＤＲグラフティングによってＶＫ２及びＶＨ３フレームワークにおいてヒト化した。簡潔には、ラット抗体のＣＤＲ領域を、これらの抗体の最も近いヒト生殖系列である軽鎖ＩＧＫＶ２－２８＊０１及び重鎖ＩＧＫＶ３－７３＊０１フレームワークに移植した（図６Ａ～図６Ｂ）。ＣＤＲ領域には、軽鎖についてはＫａｂａｔ位置２４～３４（ＣＤＲ Ｌ１）、５０～５６（ＣＤＲ Ｌ２）及び８９～９７（ＣＤＲ Ｌ３）が含まれ、重鎖についてはカバット位置２６～３５（ＣＤＲ Ｈ１）、５０～６５（ＣＤＲ Ｈ２）及び９３～１０２（ＣＤＲ Ｈ３）が含まれた。ＣＤＲグラフトヒト化（例えば、米国特許第８，４２６，１４７号を参照）で通常行われるように、ラット抗体とヒト生殖系列との間で異なる「ベルニエ（Ｖｅｒｎｉｅｒ）」位置及びドメイン界面として知られるラットフレームワーク残基をＣＤＲグラフトに添加して、抗原への結合をレスキューした。これらには、この場合、軽鎖残基２、４及び６８並びに重鎖フレームワーク残基２４、４８、４９、７６及び７８（図６Ａ～図６Ｂ）が含まれた。ヒト及びマウスフレームワーク残基の異なるセットを有する変異体をＥｘｐｉ２９３細胞においてヒトＩｇＧ１として発現させ、プロテインＡクロマトグラフィーによって精製した。
重鎖変異体を３．１０Ｃ２－Ｌ１軽鎖と組み合わせることによって、ヒト化重鎖変異体を親和性について試験した。これらの変異体をＦａｂ断片として発現させ、プロテインＡクロマトグラフィーによって精製し、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００装置を用いてプロテインＡチップ上にコーティングしたＴＲＥＭ２－Ｆｃに対する親和性について試験した。
Ｂ．結果
全てのラットフレームワークベルニエ残基を有する３．１０Ｃ２－Ｌ１軽鎖変異体を有するヒト化変異体の精製収率は一貫して低かった（図７Ａ）。ラットフレームワーク残基Ｔｈｒ－２及びヒト残基Ｍｅｔ－４及びＧｌｙ－６８を有する別の軽鎖変異体３．１０Ｃ２－Ｌ５も、Ｅｘｐｉ２９３細胞において一貫して低い収率を有していた（図７Ａ）。
２つのヒト化変異体、３．１０Ｃ２－Ｈ３／３．１０Ｃ２－Ｌ１及び３．１０Ｃ２－Ｈ５／３．１０Ｃ２－Ｌ１ Ｆａｂ断片は、ラット３．１０Ｃ２ Ｆａｂ断片に匹敵する解離速度を有したが、有意に低下した会合速度を有した（表２）。他の変異体は、有意に低い解離速度を有していた（表２）。
Figure 2024518545000004
ヒト化変異体の低い発現は、溶液中で試験したＦａｂ変異体の予想外の低い会合率と相まって、発現及び製品品質の欠陥を示唆した。軽鎖Ｌ９及びＬ１０（それぞれＰｒｏ－１００を有する軽鎖１及び５に対応する）において、Ｐｒｏ－１００（ラット残基）を、典型的にはヒト化に含まれないフレームワーク４位である軽鎖のＧｌｎ－１００（ヒト残基）で置換すると、いくつかのヒト化重鎖変異体（図７Ａ）の状況でＩｇＧの発現が回復したが、重鎖（ＨＨ）二量体に対応する溶出ピークが保持された。
軽鎖Ｐｒｏ－１００突然変異体の結果から、発現不良は軽鎖の欠損によるものであることが示唆された。本発明者らは、ヒト化３．１０Ｃ２－Ｌ１又はラット３．１０Ｃ２軽鎖のいずれかと組み合わせた３．１０Ｃ２－Ｈ１重鎖（３．１０Ｃ２ラット残基としてフレームワーク位置２４、４８、４９、７６及び７８を有するヒト化変異体）から構成されるハイブリッドＦａｂ断片を発現させることによってこれを確認した。３．１０Ｃ２－Ｈ１／３．１０Ｃ２－Ｌ１ヒト化変異体はあまり発現しなかったが、３．１０Ｃ２－Ｈ１重鎖及びラット３．１０Ｃ２軽鎖を有するハイブリッドＦａｂ断片はロバストに発現し（図７Ｂ）、ヒト化３．１０Ｃ２の軽鎖が発現に欠陥を有することが確認された。本発明者らは、３．１０Ｃ２抗体群の他の軽鎖がヒト化及び発現により適しているかどうかを調べた。
本発明者らは、ヒト化３．１０Ｃ２重鎖と対になった抗ＴＲＥＭ２抗体３．２７Ｈ７のヒト化軽鎖変異体、３．１０Ｃ２のクローン変異体が、ヒト化変異体のより良好な発現及び製品品質をもたらすかどうかを試験した。３．２７Ｈ７軽鎖を、グラフト内の軽鎖フレームワーク残基２、４、５８及び６８を含む３．１０Ｃ２軽鎖と同じフレームワーク内でヒト化した（図８Ａ～図８Ｂ）。ヒト化３．１０Ｃ２重鎖変異体をヒト化３．２７Ｈ７軽鎖変異体と組み合わせて、Ｎ２９７Ｇ変異を有するヒトＩｇＧ１を産生した。
４つのヒト化３．１０Ｃ２／３．２７Ｈ７ハイブリッド変異体を発現させ、精製した。３．１０Ｃ２－Ｈ１／３．２７Ｈ７－Ｌ１クローンは、プロテインＡクロマトグラフィーによる精製後、一過性トランスフェクトＣＨＯ細胞において２４６ｍｇ／Ｌで良好に発現し、材料の９９．５％で単分散ピークを示した。
変異体３．１０Ｃ２－Ｈ３／３．２７Ｈ７－Ｌ１ ＩｇＧ及び３．１０Ｃ２－Ｈ３／３．２７Ｈ７－Ｌ６ ＩｇＧも、ＣＨＯ細胞において３６４及び４０８ｍｇ／Ｌで良好に発現した。しかしながら、いくらかの重鎖－重鎖（ＨＨ）二量体は、精製された試料において質量分析によって検出可能であった。
変異体３．１０Ｃ２－Ｈ１／３．２７Ｈ７－Ｌ６ ＩｇＧは、３５６ｍｇ／ＬでＣＨＯ細胞において十分に発現し、サイズ排除クロマトグラフィーによって単分散ピークを示し、非還元条件下で質量分析によって検出可能なＨＨ二量体を示さなかった。この変異体をｈ３．１０Ｃ２．ｖ１と命名し直し、その配列を図９Ａ～図９Ｂに示す。
ヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に対するｈ３．１０Ｃ２．ｖ１（図９Ａ～図９Ｂ）の親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００装置においてＳＰＲによって２つのフォーマットで、両方とも３７℃で測定した。１つのフォーマットでは、ＴＲＥＭ２－ＦｃをプロテインＡチップに固定化し、可溶性抗ＴＲＥＭ２ Ｆａｂ断片をリガンドとして使用した。第２のフォーマットでは、抗ＴＲＥＭ２ ＩｇＧを抗ＣＨ１ Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）チップに固定化し、リガンドとして可溶性モノマーＴＲＥＭ２を使用した。ｈＴＲＥＭ２に対するヒト化抗体ｈ３．１０Ｃ２．ｖ１の親和性は３９０から４２０ｐＭの範囲であったが、カニクイザルＴＲＥＭ２に対する親和性は同様の４３０ｐＭであった（表３）。したがって、ヒト化抗ＴＲＥＭ２ ｈ３．１０Ｃ２．ｖ１は、ヒト及びカニクイザルの両方のＴＲＥＭ２に対して良好に発現し、高い親和性を保持することが見出された。
実施例８：飽和突然変異誘発による抗体３．１０Ｃ２重鎖の親和性成熟
Ａ．材料及び方法
３．１０Ｃ２抗体重鎖に基づく突然変異体のライブラリーを、抗体親和性を更に改善する目的で、重複組換えＰＣＲによって構築した。重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡ断片を各突然変異体に１つずつ混合し、１ｍｌスケールでＥｘｐｉ２９３細胞をトランスフェクトするために使用し、前述のようにプロテインＡクロマトグラフィーによって精製した（Ｂｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．（２０１５）；Ｌｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｂｓ（２０１８））。
得られたライブラリーは、重鎖可変領域に１分子当たり１つの突然変異をそれぞれ有する個々のＩｇＧクローンからなる。変異型ＩｇＧ及び可溶性単量体ＴＲＥＭ２をリガンドとして捕捉するために抗ヒトＦａｂチップを使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）８Ｋ機器においてＳＰＲによってオフレート（解離速度）についてクローンをスクリーニングした。
Ｂ．結果
突然変異Ｔ９３Ｅ及びＴ９３Ｈを含む、生成された数百の突然変異体クローンのうち２つのみが、親３．１０Ｃ２クローンと比較してオフレートの有意であるが比較的小さい（１．４～２倍）減少を有した（図１０）。興味深いことに、抗体３．１０Ｃ２の同じ位置と比較して、Ｐａｒａ．０９のそれぞれのＣＤＲ Ｈ３残基である、突然変異Ｇ９４Ｄ及びＤ１０１Ｅは、ＴＲＥＭ２に対する３．１０Ｃ２の親和性を減少させるか（Ｇ９４Ｄ）、又は結合を消失させ（Ｄ１０１Ｅ）（図１０）、Ｐａｒａ．０９のＣＤＲ Ｈ３が、３．１０Ｃ２のＣＤＲ Ｈ３と構造的に等価ではないことを示した。さらに、スキャニング突然変異誘発（図１０）は、クローン３．１０Ｃ２親和性がほぼ最大であり、重鎖ＣＤＲの突然変異誘発によって容易に改善することができないことを示した。したがって、３．１０Ｃ２群と同じエピトープに対してクローンＰａｒａ．０９を用いて達成された実質的に高い親和性は、同じ構造のＣＤＲ Ｈ３配列の変異を探索するが、ＣＤＲ Ｈ３の構造的に異なる解決策を探索しない従来の親和性最適化方法では容易にアクセスできなかった挿入を含むＣＤＲ Ｈ３の実質的な変化を必要とした。
実施例９：ヒト化抗体Ｐａｒａ．０９
Ａ．材料及び方法
Ｐａｒａ．０９重鎖可変領域及び３．２７Ｈ７軽鎖可変領域（Ｐａｒａ．０９－２７Ｈ７とも呼ばれる）を含む抗体Ｐａｒａ．０９を、抗体３．１０Ｃ２と同じフレームワークを使用してＣＤＲグラフト化によってＶＫ２及びＶＨ３フレームワークでヒト化した。簡潔には、ラットＰａｒａ．０９ ＶＨ配列のＣＤＲ領域を、この抗体の最も近いヒト生殖系列である重鎖ＩＧＫＶ３－７３＊０１フレームワークにグラフト化した（図９Ｂ）。Ｐａｒａ．０９ヒト化用の軽鎖は、上記の抗体３．２７Ｈ７の同じヒト化軽鎖変異体を使用した（図９Ａ）。３．１０Ｃ２抗体ヒト化の実施例７に記載されているように、ラット抗体とヒト生殖系列との間で異なる「ベルニエ」位置及びドメイン界面として知られているラットフレームワーク残基をＣＤＲグラフトに添加して、抗原への結合をレスキューした。全てのフレームワークのベルニエ位置を有するＰａｒａ．０９－Ｈ１／３．２７Ｈ７－Ｌ１と呼ばれる変異体は、ＣＨＯ細胞においてＮ２９７Ｇ変異を有するヒトＩｇＧ１として発現された。
Ｂ．結果
ヒト化Ｐａｒａ．０９－Ｈ１／３．２７Ｈ７－Ｌ１の精製収率は、マウスＩｇＧ２ａ又はヒトＩｇＧ１定常領域のいずれかを有するキメラ抗体と比較して低かった（図１１）。しかしながら、ＣＨＯ細胞における、ｈ３．１０Ｃ２．ｖ１と同じ軽鎖である３．２７Ｈ７－Ｌ６と対になったヒト化Ｐａｒａ．０９－Ｈ１重鎖の発現は、高レベルのＩｇＧ（培養物の３１４ｍｇ／Ｌ）を生じ、ＨＨ二量体は生じず、ＩｇＧアセンブリの他の副生成物は比較的少なかった。より少ないラットフレームワーク残基を有する重鎖変異体のさらなる分析により、最も少ないラット残基を有する変異体としてＰａｒａ．０９－Ｈ５が同定され、これを軽鎖３．２７Ｈ７－Ｌ６と組み合わせると、検出可能なＨＨ二量体なしでＣＨＯ細胞（５４４ｍｇ／Ｌの培養物）において高レベルのＩｇＧ発現が得られた。この変異体はｈＰａｒａ．０９．ｖ２と呼ばれ、その配列を図１２Ａ～図１２Ｂに示す。ｈ３．１０Ｃ２．ｖ１ ＩｇＧ及びＦａｂ断片について上記のように決定された、ＴＲＥＭ２についての、ｈＰａｒａ．０９．ｖ２（図１２Ａ～図１２Ｂ）と命名し直されたこの変異体の一価親和性は、ｈＴＲＥＭ２については１１～２１ｐＭ、カニクイザルＴＲＥＭ２については１８から２２ｐＭの範囲であった（表３）。

表３：ヒトＴＲＥＭ２及びカニクイザルＴＲＥＭ２についてのｈＰａｒａ．０９．ｖ２及びｈ３．１０Ｃ２．ｖ１の結合親和性
Figure 2024518545000005
要約すると、一連のラット抗ＴＲＥＭ２抗体のＴＲＥＭ２結合エピトープを決定し、結合親和性を測定した。実施例１～６を参照されたい。候補抗体を、ＴＲＥＭ２親和性及び発現収率を改善するために操作し、ヒト化した。実施例７～９を参照されたい。同定された抗体を含めた：（１）ラットＰａｒａ．０９（これは、３．２７Ｈ７軽鎖及びＰａｒａ．０９重鎖、すなわちＰａｒａ．０９－Ｌ２７Ｈ７を含み、配列を図３Ａ～図３Ｂに示す）、（２）ヒト化Ｐａｒａ．０９．ｖ２（すなわち、ｈＰａｒ．０９．ｖ２；配列を図１２Ａ～図１２Ｂに示す）、（３）ラット３．１０Ｃ２（配列を図６Ａ～図６Ｂに示す）、（４）ヒト化３．１０Ｃ２．ｖ１（すなわち、ｈ．３１０．Ｃ２．ｖ１；配列を図９Ａ～図９Ｂに示す）。
実施例１０：オフターゲット結合の決定
Ａ．材料及び方法
ラット及びヒト化抗体が「オフターゲット」（すなわち、意図されたＴＲＥＭ２以外の標的）に結合する可能性を、抗原としてバキュロウイルス粒子を使用したＥＬＩＳＡアッセイで試験した（（ＢＶ ＥＬＩＳＡ；Ｈｏｔｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｄｅｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．４１６１／ｍａｂｓ．２２１８９（２０１２））。正規化は、抗体試料のＥＬＩＳＡ吸光度読み取り値を、前述のように試験抗体を含まないブランクウェルの吸光度読み取り値で割ることによって行った。（Ｉｄ）。このアッセイにおいて高い（スコア＞５）、中程度（スコア約５）及び低い（検出不能、１未満のスコア）標的外結合を有することが以前に示された対照抗体を並行して試験した。４つの抗体、ラット可変領域及びヒトＩｇＧ１定常領域を有するキメラクローン並びにＮ２９７Ｇ変異を有するヒトＩｇＧ１定常領域を有するヒト化変異体ｈ３．１０Ｃ２．ｖ１ 及びｈＰａｒａ．０９．ｖ２を試験した。
Ｂ．結果
ヒトＩｇＧ１定常領域を有するキメララット抗体は、アッセイにおいて非常に低い反応性を有し、スコアは１未満であった（図１５）。同様に、両方ともヒトＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｇであるヒト化抗ＴＲＥＭ２抗体ｈ３．１０Ｃ２．ｖ１及びｈＰａｒａ．０９．ｖ２の正規化ＢＶ ＥＬＩＳＡスコアは１未満であり（図１５）、オフターゲット結合の検出可能な傾向は示されなかった。したがって、ヒト化ｈ３．１０Ｃ２．ｖ１及びｈＰａｒａ．０９．ｖ２抗体は、中ピコモル濃度から低ピコモル濃度の範囲でＴＲＥＭ２に対する高い結合親和性を有するが、好都合な低い又は検出不能なオフターゲット結合能を保持する。
実施例１１：可溶性ＴＲＥＭ２に対する結合の決定
Ａ．材料及び方法
ヒトＴＲＥＭ２ ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、以下のように、可溶性ＴＲＥＭ２（ｓＴＲＥＭ２）に対する４０を超える抗体の結合を測定した：試験抗ｈＴＲＥＭ２抗体を捕捉試薬としてプレートウェル上にコーティングし、ビオチン化ＩｇＶ反応性モノクローナル抗体３．１７Ａ９を検出試薬として使用した。抗体１．１６Ｂ８を対照抗体として使用して、ｓＴＲＥＭ２結合の標準を確立した。試験抗体又は対照抗体でコーティングしたプレートを、ｈＴＲＥＭ２を発現するトランスジェニックマウス由来の骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）培養物からの希釈培養上清と共にインキュベートした。ｓＴＲＥＭ２は、ｈＴＲＥＭ２を発現するＢＭＤＭ培養物によって構成的に産生され、培養上清中に排出される。測定は、検出については４５０ｎｍ、バックグラウンドについては５７０ｎｍで記録した。市販の試薬は試験した抗体の一部のｓＴＲＥＭ２検出に適合しなかったため、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓキットで提供される試薬よりも３．１７Ａ９／１．１６Ｂ８抗体対を選択した。対照抗体１．１６Ｂ８の軽鎖配列を配列番号１７０に示し、その重鎖配列を配列番号１７１に示す。検出抗体３．１７Ａ９の軽鎖配列を配列番号１６８に示し、重鎖配列を配列番号１６９に示す。
Ｂ．結果
図１６は、抗体に対するｓＴＲＥＭ２結合の値を示す。結合を、１に設定した対照（ＣＴＬ）抗体１．１６Ｂ８に対して正規化した。正規化されたｓＴＲＥＭ２結合を以下について示す：ラットＰａｒａ．０９－ＬＣ ３．２７Ｈ７ ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧ（Ｐａｒａ０９）、ラット３．１０Ｃ２ ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧ（３．１０Ｃ２）、ラット３．１８Ｅ５ ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧ（３．１８Ｅ５）、ラット３．５０Ｇ１ ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧ（３．５０Ｇ１）、ラット３．２７Ｈ７ ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧ（３．２７Ｈ７）、ラット３．３６Ｆ５ ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧ（３．３６Ｆ５）、Ａ．９Ｆ５、ＡＬ２ｐ－１２、ＡＬ２ｐ－３１、ＡＬ２ｐ－５８、ＢＭ．３Ｄ３、ＢＭ．４２Ｅ８、ＢＭ．ＲＳ９、ＢＭ．１４Ｄ３、及びＢＭ．１４Ｄ８。試験した抗体ラットＰａｒａ．０９－ＬＣ ３．２７Ｈ７ ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧ（Ｐａｒａ０９）、ラット３．１０Ｃ２ ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧ（３．１０Ｃ２）、ラット３．１８Ｅ５ ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧ（３．１８Ｅ５）、ラット３．５０Ｇ１ ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧ（３．５０Ｇ１）、ラット３．２７Ｈ７ ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧ（３．２７Ｈ７）、ラット３．３６Ｆ５ ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧ（３．３６Ｆ５）は、ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧ重鎖定常領域を含む。試験した抗体のうち、３．１０Ｃ２、Ｐａｒａ．０９並びにクローン関連抗体３．１８Ｅ５、３．５０Ｇ１、３．２７Ｈ７、及び３．３６Ｆ５のみが、ｓＴＲＥＭ２に対する結合を何ら示さなかった（図１６を参照、１．１１６Ｂ８対照とは対照的に、これらの抗体についてほぼ０の正規化されたｓＴＲＥＭ２結合を示す）。ｈＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｇ定常領域を有するヒト化抗体Ｐａｒａ．０９．ｖ２抗体もｓＴＲＥＭ２結合について試験し、ｍＩｇＧ２ ＬＡＬＡＰＧを有するラットＰａｒａ．０９と同様に、ｓＴＲＥＭ２に対する結合を示さなかった。
さらに、例えば国際公開第２０１８０１５５７３号、国際公開第２０１９５５８４１号、国際公開第２０１７０６２６７２号及び／又は国際公開第２０１９２８２９２号に記載されている、Ａ．９Ｆ５（９Ｆ５とも呼ばれる）、ＡＬ２ｐ－１２、ＡＬ２ｐ－３１、ＡＬ２ｐ－５８、ＢＭ．３Ｄ３、ＢＭ．４２Ｅ８、ＢＭ．ＲＳ９、ＢＭ．１４Ｄ３、及びＢＭ．１４Ｄ８を含む、ストークｈＴＲＥＭ２への結合として文献に以前に記載された９つの抗体をこの実験で試験した。３．１０Ｃ２、Ｐａｒａ．０９、３．１８Ｅ５、３．５０Ｇ１、３．２７Ｈ７、及び３．３６Ｆ５抗体とは異なり、ここで試験した９つの以前に記載された抗体は、アッセイにおいてｓＴＲＥＭ２に結合した（図１６を参照、それらの抗体について０．５～１．５の正規化されたｓＴＲＥＭ２結合を示す）。試験された抗体はＴＲＥＭ２ストークドメインにエピトープを有し、結果は、前述の抗体と比較して、３．１０Ｃ２、Ｐａｒａ．０９、３．１８Ｅ５、３．５０Ｇ１、３．２７Ｈ７、及び３．３６Ｆ５の固有のエピトープを反映し得ることから、この結果は、試験された抗体の結合プロファイルと併せて考慮すると驚くべきことである。（例えば、図５を参照）。
先の実施例に記載されたペプチドマッピング及び突然変異スキャニングの結果は、３．１０Ｃ２／Ｐａｒａ．０９／３．５０Ｇ１と抗体９Ｆ５及びその誘導体との間で観察された可溶性ＴＲＥＭ２への結合の違いの基礎を提供し得る。Ｐａｒａ．０９、３．１０Ｃ２及び３．５０Ｇ１のエピトープは、Ｈｉｓ－１５７とＳｅｒ－１５８との間のＡＤＡＭ１０切断部位にまたがっており、突然変異スキャニング及び構造分析によって決定される切断部位の両側に重要な接触部位を有する。（図５を参照）。対照的に、上記の実施例６で述べたように、Ａ．９Ｆ５（図５の９Ｆ９）及びその誘導体ＡＬ２ｐ－３１のエピトープは、ＴＲＥＭ２切断部位のＮ末端側に完全に位置する。（図５を参照）。ＴＲＥＭ２接触点におけるこの差異は、ｓＴＲＥＭ２に対する結合における観察された差異を説明し得、その結果、可溶性ＴＲＥＭ２に対するこれらの以前に記載された抗体が結合する。
しかしながら、驚くべきことに、抗体１４Ｄ３及び１４Ｄ８は、抗体３．１０Ｃ２、３．５０Ｇ１及びＰａｒａ．０９に類似して見えるアラニン変異型ペプチドへの結合パターンを有するが（図５）、一価で生理学的に関連する様式でｓＴＲＥＭ２へのロバストな結合を依然として示す（図１６）。非常に高い親和性を有する３．１０Ｃ２及びＰａｒａ．０９は、可溶性ＴＲＥＭ２中の部分エピトープに対する結合を保持すると予想され得るが、より低い親和性（３～５ｎＭ）の１４Ｄ３及び１４Ｄ８抗体は、これらの部分エピトープに対する結合をより容易に失う可能性があるため、これは非常に驚くべきことであった。これは、先の実施例に記載された結合プロファイルが、抗ＴＲＥＭ２抗体が完全長の膜結合型ＴＲＥＭ２形態と可溶性ＴＲＥＭ２形態とを区別するために必要な抗ＴＲＥＭ２抗体とＴＲＥＭ２との間の全ての相互作用を説明し得ないことを示し、本開示の抗体の独自性を更に確立する。
したがって、これらの結果が示すように、３．１０Ｃ２、Ｐａｒａ．０９、３．１８Ｅ５及び３．５０Ｇ１抗体の結合プロファイルを有する抗体は固有である。これらの抗体は、ＴＲＥＭ２ストークドメインに効果的に結合するが、可溶性ＴＲＥＭ２には結合しない。これらの抗体の特異性は、ｉｎ ｖｉｖｏ投薬後の末梢及び脳における可溶性ＴＲＥＭ２が投与された抗体を含まないままであることを可能にすることを含む、いくつかの潜在的な利点を有し得る。インタクトなＴＲＥＭ２の切断部位にまたがるエピトープに対するこれらの抗体の高親和性及び切断された可溶性ＴＲＥＭ２への結合の欠如は、投薬された抗ＴＲＥＭ２抗体のより多くが細胞の表面上のＴＲＥＭ２の所望の標的に到達することを可能にすることから、細胞表面から放出されるｓＴＲＥＭ２の量を減少させることまで、いくつかの方法のいずれかにおいてｉｎ ｖｉｖｏで有益であり得る。
実施例１２：抗ＴＲＥＭ２抗体はＴＲＥＭ２依存性及びＮＦＡＴ駆動型ルシフェラーゼ活性を誘導する
Ａ．材料及び方法
Ｊｕｒｋａｔに基づくルシフェラーゼレポーター細胞株を使用して、完全長抗ｈＴＲＥＭ２抗体がヒトＴＲＥＭ２関連シグナル伝達を誘導する能力を試験した。ＴＲＥＭ２活性化及び細胞膜でのＤＡＰ１２（１２キロダルトンのＤＮＡＸ活性化タンパク質）とのその相互作用は、細胞質におけるＳｙｋキナーゼ（そのリン酸化形態がｐＳＹＫ又はホスホ－ＳＹＫと呼ばれる脾臓チロシンキナーゼ）のリン酸化及び他の細胞シグナル伝達事象を誘導し、最終的に活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）制御遺伝子発現の活性化をもたらし得る。したがって、Ｓｙｋキナーゼのリン酸化及びＮＦＡＴ制御遺伝子発現の両方を使用して、ＴＲＥＭ２活性に対する抗体の効果及び抗体がＴＲＥＭ２をアゴナイズする（ａｇｏｎｉｚｅ）かどうかを決定し得る。このアッセイでは、抗体の添加がＮＦＡＴの活性化によるレポーター遺伝子の発現を誘導するかどうかを試験するため、ＮＦＡＴ応答エレメントの制御下でルシフェラーゼレポーターを発現するように、またヒトＴＲＥＭ２及びＤＡＰ１２を共発現するようにＪｕｒｋａｔ細胞を操作した。
ＮＦＡＴ応答エレメントの制御下でホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定に発現するように、親Ｊｕｒｋａｔルシフェラーゼレポーター細胞株（ヒトＴリンパ球；Ｓｉｇｎｏｓｉｓ）を操作した。次いで、親Ｊｕｒｋａｔルシフェラーゼレポーター細胞株を、ＴＲＥＭ２（野生型又は突然変異体）及びＤＡＰ１２を共発現するようにＭＳＣＶベースのレトロウイルスベクターを使用して形質導入して、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴルシフェラーゼＴＲＥＭ２レポーター細胞株を作製した。
Ｊｕｒｋａｔレポーターアッセイを使用して、アイソタイプ対照抗体と比較した抗ヒトＴＲＥＭ２抗体のアゴニスト効果を試験した。各抗体及びアイソタイプ対照を可溶性形態で１０ｕｇ／ｍＬでＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター細胞に添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。ルシフェラーゼ活性は、Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（商標）基質（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｅ２６１０）基質を添加することによって測定した。室温で３分間インキュベートした後、ＴｅｃａｎプレートリーダーでＭ１０００プログラムを使用して発光測定値を記録した。
抗ヒトＴＲＥＭ２抗体の時間依存性レポーター活性を決定するために、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター細胞を、それぞれ１０μｇ／ｍＬの抗ＴＲＥＭ２抗体の存在下で３、６又は２４時間培養した後、ルシフェラーゼ活性を測定するためのＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（商標）基質を添加した。
Ｂ．結果
実施例１のスクリーニングで同定された５６個のラット抗ヒトＴＲＥＭ２抗体（組換えｍＩｇＧ２ａの形態）をＪｕｒｋａｔレポーターアッセイでスクリーニングした。これら５６のうち、４つの「３．１０Ｃ２群」抗体：３．１０Ｃ２、３．１８Ｅ５、３．２７Ｈ７及び３．５０Ｇ１を含む８つの抗体のみが、アイソタイプ対照と比較して、Ｌｕｃ ＲＬＵにおいてルシフェラーゼレポーター活性を誘導し（ルシフェラーゼ相対光単位）、このことは、これらの抗ＴＲＥＭ２抗体が、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター細胞において天然のリガンド活性を模倣し得ることを示唆している（図１７）。それらの８つの抗体のうち、４つの「３．１０Ｃ２群」抗体：３．１０Ｃ２、３．１８Ｅ５、３．２７Ｈ７及び３．５０Ｇ１は、同等に強いアゴニズムを示したが、４つの他の試験された抗体は、中程度のアゴニスト活性しか示さなかった（図１７）。残りの４８個の試験抗体は、アイソタイプ対照よりも低いＬｕｃ ＲＬＵ値を有していた。これらのデータは、ＴＲＥＭ２ストークの１５１～１６５位の特定のエピトープに特異的に結合する３．１０Ｃ２群の抗体が、そのストークの領域の外側に結合する抗体と比較して、比較的強いアゴニスト活性を有することを示している。
同じ５６個の抗体も、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞を使用して経時アッセイで試験した。試験した抗体のうち、「３．１０Ｃ２群」抗体３．１０Ｃ２、３．１８Ｅ５、３．２７Ｈ７、及び３．５０Ｇ１も、アイソタイプと比較して強い時間依存性アゴニスト活性（Ｌｕｃ ＲＬＵ倍率変化）を示した。
実施例１３：ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧ又はｈＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｇフォーマットにおける抗ＴＲＥＭ２抗体は、Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞においてルシフェラーゼ活性を誘導する
Ａ．材料及び方法
ラット抗ヒト抗体Ｐａｒａ．０９及び３．１０Ｃ２を、（Ｆｃのエフェクター機能を低下させるために）マウスＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧ Ｆｃ領域を含むように操作し、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター細胞におけるアゴニスト活性について更に試験した。ヒト化抗体Ｐａｒａ．０９．ｖ２及び３．１０Ｃ２を、エフェクター機能を低下させるためにヒトＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｇフォーマットで同様に操作し、試験した。Ｊｕｒｋａｔに基づくルシフェラーゼレポーターアッセイを、実施例１２において上記で記載されるように行った。抗ヒトＴＲＥＭ２抗体の用量依存的活性を試験するために、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター細胞を、連続希釈した抗ヒトＴＲＥＭ２抗体の存在下で２４時間培養した。
一般的なｈＴＲＥＭ２変異に対する抗ｈＴＲＥＭ２抗体活性も評価した：３つのｈＴＲＥＭ２突然変異体を発現するＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター細胞株：Ｒ４７Ｈ、Ｒ６２Ｈ及びＨ１５７Ｙを構築した。これらの突然変異体の存在は、アルツハイマー病のリスクの増加と相関し得る。
ルシフェラーゼ駆動発光の測定のためにＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｅ２６１０）基質を添加する前に、ＴＲＥＭ２シェディング分析のために上清試料を収集した。
Ｂ．結果
ラット抗体及びヒト化抗体の両方が、ルシフェラーゼレポーター活性の誘導によって示されるように、２４時間でアゴニスト活性を示した。図１８Ａ（ラット抗体）及び図１８Ｂ（ヒト化抗体）を参照されたい。これらのデータは、ラット及びヒト化Ｐａｒａ．０９及び３．１０Ｃ２抗体の両方がアゴニスト活性を有し、このような活性が抗体エフェクター機能に関連しないことを更に実証している。
４つの「３．１０Ｃ２群」抗体（ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧフォーマット）３．１０Ｃ２、３．１８Ｅ５、３．２７Ｈ７及び３．５０Ｇ１もまた、３つのｈＴＲＥＭ２突然変異体、それぞれＲ４７Ｈ（図１９Ａ）、Ｒ６２Ｈ（図１９Ｂ）及びＨ１５７Ｙ（図１９Ｃ）を発現するように操作されたＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞においてルシフェラーゼ活性を誘導した。これらの結果は、抗ｈＴＲＥＭ２抗体が、野生型ｈＴＲＥＭ２及びこれらのｈＴＲＥＭ２変異の両方に対してアゴニスト活性を有し、したがって、これらの変異型ＴＲＥＭ２タンパク質を有する患者において有用であり得ることを実証している。
実施例１４：Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞におけるｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧ又はｈＩｇＧ１ Ｎ２９７ＧフォーマットブロックＴＲＥＭ２シェディングにおける抗ＴＲＥＭ２抗体
Ａ．材料及び方法
可溶性ＴＲＥＭ２を放出するＴＲＥＭ２シェディングは、疾患発症の数十年前にアルツハイマー病患者で起こり得る。アミロイド斑への可溶性ＴＲＥＭ２の結合は、ミクログリアによるニューロン保護プラーク圧縮を妨害し得る。したがって、本明細書におけるラット及びヒト化Ｐａｒａ．０９抗体及び３．１０Ｃ２抗体の両方を実施例１２及び１３に記載されるＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター細胞において試験して、それらがＴＲＥＭ２シェディングも阻害し得るかどうかを判定した。Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター細胞における可溶性抗ヒトＴＲＥＭ２抗体のＴＲＥＭ２シェディング阻害活性を判定するために、２４時間後にレポーターアッセイプレートから上清を採取し、実施例１１において上記で記載されるようにＥＬＩＳＡアッセイを使用してｓＴＲＥＭ２を測定した。
次に、ヒト化Ｐａｒａ．０９変異体、ｈＰａｒａ．０９ ｖ２、ｈＰａｒａ．０９ ｖ２．Ｑ１００Ｐ／Ｖ１０４Ｌ及びｈＰａｒａ．０９．ｖ２ Ｑ１００ＰのＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター及びＴＲＥＭ２シェディング阻害アッセイにおける活性を、ヒト化３．１０Ｃ２．ｖ１抗体の活性と比較した。Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター細胞を、連続希釈したヒト化抗体の存在下で２４時間培養し、上記のように試験した。
Ｂ．結果
ＥＬＩＳＡアッセイでは、ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧ形態のＰａｒａ．０９が、同じフォーマットの他の試験抗体と比較して最も強いＴＲＥＭ２シェディング阻害活性を示した。ｈＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｇフォーマットのヒト化抗体ｈＰａｒａ．０９．ｖ２は、ｈＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｇフォーマットのヒト化抗体ｈ３．１０Ｃ２ ｖ１よりも強いＴＲＥＭ ２シェディング阻害を示した（図２０Ｂを参照）。ラット抗体によるｓＴＲＥＭ２シェディングの阻害は、アッセイにおいてほとんどシェディング阻害を示さない別の抗体（１．２０Ａ２ ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧ）とは対照的に示される。（図２０Ａを参照）。
変異体ｈＰａｒａ．０９ ｖ２．Ｑ１００Ｐ／Ｖ１０４Ｌ及びｈＰａｒａ．０９．ｖ２ Ｑ１００Ｐは、それぞれＱ１００Ｐ／Ｖ１０４Ｌ及びＱ１００Ｐ変異を除いて、ｈＰａｒａ．０９ｖ２と同一である（図１３Ａ～図１３Ｂ）。図２０Ｃ～図２０Ｄに示されるように、ｈＩｇＧ１ Ｎ２９７ＧフォーマットのｈＰａｒａ．０９ ｖ２、ｈＰａｒａ．０９ ｖ２．Ｑ１００Ｐ／Ｖ１０４Ｌ及びｈＰａｒａ．０９．ｖ２ Ｑ１００Ｐは、同等の活性を示した。加えて、実施例１３に示される結果と一致して、それらの３つのＰａｒａ．０９ヒト化抗体の活性は、ヒト化３．１０Ｃ２．ｖ１抗体よりも高かった。
Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター細胞（ＥＣ５０）及びＴＲＥＭ２シェディング阻害（ＩＣ５０）におけるＴＲＥＭ２抗体の測定された効力を以下の表４に要約する。
表４：ＴＲＥＭ２抗体の効力（ＥＣ５０）及びＴＲＥＭ２シェディング阻害（ＩＣ５０）
Figure 2024518545000006
 （ＮＡ＝利用不可）
実施例１５：可溶性抗ＴＲＥＭ２抗体はヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアにおけるＴＲＥＭ２シェディングを阻止する
Ａ．材料及び方法
ＴＲＥＭ２はミクログリア細胞においてｉｎ ｖｉｖｏで発現されるため、ＴＲＥＭ２シェディングの阻害を次にヒトｉＰＳＣ由来ミクログリア細胞において試験した。ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリア（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）における抗ヒトＴＲＥＭ２抗体によるＴＲＥＭ２シェディング阻害を明らかにするために、ｉＰＳＣ－ミクログリアを、１０ｕｇ／ｍＬの可溶性抗ＴＲＥＭ２ ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧ抗体の存在下、維持培地（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）とともに培養した。ＡＤＡＭ１０プロテアーゼ阻害剤ＧＩ２５４０２３Ｘ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を、ｓＴＲＥＭ２の切断及びシェディングを遮断するための陽性対照として使用した。培養上清試料を、Ｒ＆Ｄアッセイキットを使用したＥＬＩＳＡアッセイのために３日目に採取した。
Ｂ．結果
ラット抗ヒトＴＲＥＭ２抗体３．１０Ｃ２、３．１８Ｅ５、３．２７Ｈ７及び３．５０Ｇ１は、α－セクレターゼＡＤＡＭ１０の強力かつ選択的なメタロプロテイナーゼ阻害剤であるＧＩ２５４０２３Ｘに匹敵するレベルでｓＴＲＥＭ２を減少させたが、以前に記載された抗体９Ｆ５は、ＴＲＥＭ２シェディングをより低い程度まで阻害した（図２１）。これらのデータは、ＴＲＥＭ２シェディングが３．１０Ｃ２、３．１８Ｅ５、３．２７Ｈ７及び３．５０Ｇ１アゴニスト抗ＴＲＥＭ２抗体によって遮断され、細胞膜結合ＴＲＥＭ２もこれらの同じ抗体によって安定化され得ることを示唆する。これらのデータはまた、ｉｎ ｖｉｖｏでＴＲＥＭ２を発現する細胞型におけるＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ細胞からのデータを確認する。
実施例１６：初代ヒト単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）におけるＴＲＥＭ２刺激後のホスホ－チロシン及びｐＳＹＫ活性化
上記のように、細胞膜でのＴＲＥＭ２のＤＡＰ１２への結合は、部分的にはＳｙｋキナーゼ（ＳＹＫ）のリン酸化を介してＴＲＥＭ２関連細胞シグナル伝達の活性化をもたらし、ｐＳＹＫを形成する。したがって、抗体のアゴニスト活性を更に評価するために、ＳＹＫリン酸化並びにｐａｎチロシンリン酸化に対する抗ＴＲＥＭ２抗体の効果をヒトマクロファージモデルシステムで決定した。リン酸化の変化がＴＲＥＭ２活性によるものであることを確実にするために、ＴＲＥＭ２欠失の状況で試験を行った。抗体エフェクター活性を低下させるために、ヒトＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｇフォーマットで抗体を試験した。
Ａ．材料及び方法
１．ヒト単球由来マクロファージの単離及び培養
Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、同意した健常ドナーのバフィーコートからヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。次に、キットの説明書に従って古典的単球単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、ＣＤ１４＋Ｃ１６－単球をＰＢＭＣから単離した。フロースルーを収集し、３００×ｇで１０分間スピンダウンし、次いで、増殖培地に再懸濁した。細胞を１０％ＤＭＳＯの最終濃度に希釈し、凍結し、将来の使用のために液体窒素中で保存した。各実験について、複数のドナーからのアリコートを解凍し、単球由来マクロファージ（ｈＭＤＭ）を、１０％熱不活性化血清及び５０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＭ－ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含有する高グルコースＤＭＥＭ中で５～７日間培養して分化させ、１日おきに部分培地を交換した。
ＴＲＥＭ２を標的とするガイドＲＮＡ二重鎖を形成するために、配列ＴＴＧＴＡＧＡＴＴＣＣＧＣＡＧＣＧＴＡＡ又は配列ＡＡＴＧＧＴＧＡＧＡＧＴＧＣＣＡＣＣＣＡ又はＴＡＣＣＡＧＴＧＣＣＡＧＡＧＣＣＴＣＣＡ（それぞれ配列番号１７３、１７４及び１７５）に基づくＡｌｔ－Ｒ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｃｒＲＮＡ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、Ｄｕｐｌｅｘ緩衝液（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で１００ｕＭに溶解し、Ｄｕｐｌｅｘ緩衝液中で１００ｕＭに溶解したＡｌｔ－Ｒ ｔｒａｃｒＲＮＡと、１対１のモル比で混合した。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ混合物を、９５℃で５分間のインキュベーション、続いて室温で１５分間のインキュベーション及び－２０℃での貯蔵によってハイブリダイズさせた。ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖を５μｇのＡｌｔ－ＲＳ．ｐと混合することによって、リボ核タンパク質複合体を形成した。ＨｉＦｉ Ｃａｓ ９ヌクレアーゼＶ３（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を３対１のモル比で添加し、室温で少なくとも１５分間インキュベートする。２つの別々のガイドＲＮＡ配列に対する２つのリボ核タンパク質複合体を１対１の比で組み合わせ、両方のガイドＲＮＡをｈＭＤＭにトランスフェクトした。
ＴＲＥＭ ２欠損細胞プールを生成するために、ｈＭＤＭを解凍の１６～２４時間後に収集し、５００×ｇで５分間遠心分離し、Ｐ３一次ヌクレオフェクション溶液（Ｌｏｎｚａ）に再懸濁して、２０μＬの反応あたり２～４×１０６細胞の濃度にした。各２０μＬの反応物を、３つのＴＲＥＭ２標的化ガイドＲＮＡと複合体化した合計１０μｇのＣａｓ９と混合し、直ちに供給されたヌクレオフェクターカセットストリップ（Ｌｏｎｚａ）に移した。ストリップをＬｏｎｚａ ４Ｄ－ヌクレオフェクター（４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅ Ｕｎｉｔ：Ｌｏｎｚａ，ＡＡＦ－１００２Ｂ；４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｘ Ｕｎｉｔ：ＡＡＦ－１００２Ｘ）にロードし、ＣＭ－１３７パルスプログラムを使用して電気穿孔した。細胞を回収し、増殖培地に１０６細胞／ｍＬに希釈し、５～７日間プレートした。効率的なノックアウト（９０％超）が、ＴＩＤＥ分析及びＦＡＣＳによって確認された。
２．ｐａｎチロシン及びＳＹＫリン酸化の測定
全ての実験について、ｈＭＤＭを低グルコース培地に切り替え、抗ＴＲＥＭ２抗体の添加前に２４時間Ｍ－ＣＳＦ及び血清を除去した。ｈＭＤＭを抗体と３７℃で１０分間又は２０分間インキュベートした。抗体刺激後、培養培地を除去し、細胞を、ｃＯｍｐｌｅｔｅミニプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）及びｐｈｏｓＳＴＯＰ（Ｒｏｃｈｅ）ホスファターゼ阻害剤を含有するＲＩＰＡ緩衝液に溶解した。タンパク質溶解物を収集した後、試料を使用して、ｐａｎホスホ－チロシン（ｐＹ）及びホスホ－ＳＹＫ活性の両方を測定した。ｐＹ発現のため、試料をウエスタンブロットで泳動し、膜をＰ－Ｙ－１０００（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及び抗ベータアクチン（１：１０００、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に４℃で一晩インキュベートした。翌日、二次蛍光抗体を暗所、室温で１時間添加し、Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線イメージングプラットフォーム（１：１０，０００、ＬＩ－ＣＯＲ）を使用して撮像した。バンド強度をＩｍａｇｅＳｔｕｄｉｏ Ｌｉｔｅ（ＬＩ－ＣＯＲ）で計算し、アイソタイプ対照に正規化する前に、全ての試料をローディング対照に対して正規化した。
総ＳＹＫ及びホスホ－ＳＹＫを、キットの説明書ごとにそれぞれのＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）ＳｕｒｅＦｉｒｅ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（商標）アッセイ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して測定した。簡潔には、タンパク質溶解物をアクセプタービーズと共に１時間インキュベートし、続いてストレプトアビジン被覆ドナービーズと共に暗所で１時間インキュベートした。その後、適合性Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）Ｎｅｏ２プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）を使用してプレートを撮像した。ホスホ－ＳＹＫ定量のため、試料を最初に総ＳＹＫに対して正規化し、次いでアイソタイプ対照抗体に対して正規化した。
Ｂ．結果
図２２Ａにおいて、ｐａｎホスホ－チロシン活性をウエスタンブロットで評価した。アイソタイプ対照と比較して、ｈＰａｒａ．０９．ｖ２ Ｎ２９７Ｇ治療は、刺激後２０分でｐＹの有意な増加を示した。図２２Ｂでは、ｐｈｏｓｐｈｏ－ＳＹＫレベルを、ａｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）アッセイキットを用いて測定し、全ての試料を総ＳＹＫレベルに対して正規化した。ｐＳＹＫの有意な増加が、２０分でｈＰａｒａ０９．ｖ２抗体及びｈ３．１０Ｃ２．ｖ１抗体の両方から観察された。抗体治療の２０分後に、ＴＲＥＭ２欠損細胞（ガイドＲＮＡ標的化ＴＲＥＭ２又はｇＴＲＥＭ２を含むＣａｓ９リボ核タンパク質複合体でトランスフェクトした細胞）ではｐＳＹＫの増加は観察されなかった。平均±ＳＥＭ、５つの別個の生物学的標本からｎ＝６、又はｇＴＲＥＭ２について２つの別個の生物学的標本からｎ＝２ ＊＊ｐ＜０．０１ ＊＊＊ ｐ＜０．００１（アイソタイプ対照条件と比較したＤｕｎｎｅｔｔの検定による一元配置分散分析）。図２２Ｃに示されるように、ヒト化抗体ｈＰａｒａ．０９．ｖ２ Ｎ２９７Ｇ及びｈＰａｒａ．０９．ｖ２ Ｑ１００Ｐ／Ｖ１０４Ｌ Ｎ２９７Ｇによる刺激は、初代ｈＭＤＭにおけるホスホ－ＳＹＫレベルを増加させた。
実施例１７：抗ＴＲＥＭ２抗体Ｐａｒａ．０９は、ヒトｉＰＳＣミクログリア生存を促進する
ＴＲＥＭ２がミクログリア細胞において脳内で発現されることから、ミクログリア生存、ｓＴＲＥＭ２シェディング、ＳＹＫリン酸化、並びにＡβプラークの形成及び圧縮に対する抗体の効果を決定するために、ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリア細胞モデル系においてさらなる実験を行った。
Ａ．材料及び方法
１．ｉＰＳＣミクログリア生存アッセイ（ＥＣ５０実験）
ｉ．抗体コーティング
３８４ウェルプレート（Ｃｅｌｌ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｕｌｔｒａ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）のコーティングのために、１ｍｇ／ｍＬのｈ３．１０Ｃ２．ｖ１のＮ２９７Ｇ及びＬＡＬＡＰＧ変異体、並びにｈＰａｒａ．０９．ｖ２．Ｎ２９７Ｇのストック溶液を冷ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）中で調製した。ストック溶液を混合し、９６ウェル試薬マスターブロック（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）での連続希釈に使用した。自動マルチチャネルピペット（Ｖｏｙａｇｅｒ １２５μＬ、Ｉｎｔｅｇｒａ）を備えたピペッティングロボット（Ａｓｓｉｓｔ Ｐｌｕｓ、Ｉｎｔｅｇｒａ）を使用して、２５μＬ／ウェルを繰り返し分注することにより（ｎ＝４～６）、コーティング溶液を３８４ウェルプレートに移した。蒸発及びエッジ効果を最小限に抑えるために、外側ウェルをＤＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で満たした。短時間の遠心分離後、プレートを３７℃、５％ＣＯ２及び９５％湿度で一晩インキュベートした。
ｉｉ．ｉＰＳＣミクログリア培地調製
使用した基本培地は、Ｂ２７サプリメン（Ｇｉｂｃｏ）、Ｎ２サプリメント（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭクレアチン（Ｓｉｇｍａ）、２００ｎＭ Ｌ－アスコルビン酸２－リン酸セスキマグネシウム（Ｓｉｇｍａ）、２０ｎｇ／ｍＬ組換えＢＤＮＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、２０ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＧＤＮＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、１μｇ／ｍＬラミニンマウスタンパク質（Ｇｉｂｃｏ）、０．５ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ（商標）（Ｇｉｂｃｏ）、５０Ｕ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、０．１ｍｇ／ｍＬ Ｎｏｒｍｏｃｉｎ（商標）（ｉｎ ｖｉｖｏＧｅｎ）、５ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＴＧＦ－β１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ＨＥＫ２９３由来）、１．５ｎｇ／ｍＬ羊毛コレステロール（Ａｖａｎｔｉ）、０．１ｎｇ／ｍＬオレイン酸（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、０．００１ｎｇ／ｍＬ １１（Ｚ）－エイコセン酸（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、４６０μＭ １－チオグリセロール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０μｇ／ｍＬ インスリン、５．５μｇ／ｍＬ トランスフェリン、６．７ｎｇ／ｍＬの亜セレン酸ナトリウム（ＩＴＳ－Ｇ、Ｇｉｂｃｏ）、５．４μｇ／ｍＬ ヒトインスリン溶液（Ｓｉｇｍａ）を含む基本培地（ＢｒａｉｎＰｈｙｓ Ｂａｓａｌ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）であった。ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＴＧＦ－β１、ＩＬ－３４及びＭ－ＣＳＦを０．１％ＢＳＡ中で再構成した。羊毛コレステロール、オレイン酸及び１１（Ｚ）－エイコセン酸を毎月エタノール中で新たに調製した。完全なミクログリア培養培地を得るために、還元ミクログリア培地に１００ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＩＬ－３４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）及び２５ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＭ－ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充した。最小ミクログリア培養培地の調製のために、２５ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＩＬ－３４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）及び０．３１３ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＭ－ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を基本培地に補充した。
ｉｉｉ．ｉＰＳＣミクログリア細胞の融解、播種及び培養
ヒト野生型又はＴＲＥＭ２ ＫＯ ｉＰＳＣ由来ミクログリア（ｉＣｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｇｌｉａ、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．）を完全ミクログリア培地で解凍した。計数後、細胞を遠心分離し、最小ミクログリア培養培地に再懸濁した。細胞生存アッセイのために、予めコーティングされた３８４ウェルプレート（Ｃｅｌｌ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｕｌｔｒａ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）のコーティング溶液を吸引し、細胞を５０μＬのそれぞれの培地に８，０００細胞／ウェルで播種した。プレートを短時間遠心分離し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２及び９５％湿度で３日間培養した。
ｉｖ．上清の収集及び細胞の固定
３日間の培養後、細胞の上清を、自動マルチチャネルピペット（Ｖｏｙａｇｅｒ １２５μＬ、Ｉｎｔｅｇｒａ）を備えたピペッティングロボット（Ａｓｓｉｓｔ Ｐｌｕｓ、Ｉｎｔｅｇｒａ）によって収集した。吸引速度を２μＬ／秒に設定し、細胞層の妨害を避けるために、ピペット操作高さをプレート底部から１～１．２ｍｍ上方に維持した。３０μＬ／ウェルを３８４ディープウェルマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）に移した。上清収集直後に、細胞を、ＤＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中４％ＰＦＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、４％スクロース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で室温にて１時間固定した。固定後、細胞をＤＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で２回洗浄した。
２．免疫染色
免疫染色の前に、細胞を、ＤＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中２％正常ロバ血清（ＪａｃｋｓｏｕｎＩｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１％ＢＳＡ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するブロッキング緩衝液と共に室温で１時間インキュベートした。一次ウサギ抗Ｉｂａ１ポリクローナル抗体（１：５００、Ｗａｋｏ）をブロッキング溶液で希釈し、室温で１時間インキュベートし、細胞をブロッキング緩衝液で３回洗浄した。二次Ｃｙ３ロバ抗ウサギ（１：６００、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８ファロイジン（１：１０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（１：１００００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をブロッキング緩衝液中で調製し、室温で更に１時間インキュベートした。二次染色後、細胞をＤＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の反復添加及び吸引によって６回洗浄し、イメージングまで暗所で保存した。
３．イメージング
染色されたミクログリアを含有するマイクロプレートを、２０倍の水浸対物レンズを備えた自動高含有量イメージャ（Ｏｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘ（登録商標）ハイコンテンツスクリーニングシステム、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で撮像した。スピニングディスク共焦点モード（画像サイズ１０８０×１０８０画素、画素サイズ０．５９８μｍ）で全てのウェルのタイルスキャン（３×３タイル）を取得し、２．８８ｍｍ２の有効視野（各ウェルの約２７％）を得た。各位置を３つの蛍光チャネルで撮像した。核染料Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２の励起を４０５ｎｍで実施し、主放出シグナルを４５６ｎｍで検出した。４８８ｎｍでのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８ファロイジンの励起によって５２２ｎｍでアクチンを検出した。Ｉｂａ１は、主に５９９ｎｍで発光する、５６１ｎｍでのＣｙ３の励起によって可視化された。
４．ｉＰＳＣミクログリアＡβプラーク形成アッセイ
Ａβプラークの形成及び圧縮におけるプレート結合抗ＴＲＥＭ２抗体の効果を試験するために、ＡＤ脳に見られるＡβオリゴマーのレベルの増加を模倣する合成Ａβオリゴマーを使用するｉｎ ｖｉｔｒｏヒトｉＰＳＣ－ＭＧプラーク形成アッセイを行った。ｉＰＳＣミクログリアを、この実施例のセクション１に記載されるように、対照抗体（ｇＤ ｈＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｇ）、又は、ＩＬ－３４及びＣＳＦ－１を用いずに、Ａβオリゴマーの存在下における漸増濃度の抗ＴＲＥＭ２抗体の存在下で培養した。再構成Ａβモノマー（１－４２）（Ａｎａｓｐｅｃ）をＢｒａｉｎＰｈｙｓ（商標）基本培地中１００μＭまで４℃で２４時間インキュベートすることによって、Ａβオリゴマーを生成させた。Ａβオリゴマーを、プレーティング直後に２．５μＭの最終濃度で細胞に適用した。細胞を２日間インキュベートし、次いで固定し、Ａβ、メトキシ－Ｘ０４（アミロイド斑色素）及びＩＢＡ１について染色した。染色されたミクログリアを含有するマイクロプレートを、２０倍の空気対物レンズを備えた自動ハイコンテンツイメージャ（セル６０００内、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）で撮像した。全てのウェルのタイルスキャン（３×３タイル）を取得した。各位置を４つの蛍光チャネルで撮像した。Ａβプラーク結合色素メトキシ－Ｘ０４の励起を４０５ｎｍで行い、主な発光シグナルを４５６ｎｍで検出した。４８８ｎｍでのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８ファロイジンの励起によって５２２ｎｍでアクチンを検出した。Ｉｂａ１は、主に５９９ｎｍで発光する、５６１ｎｍでのＣｙ３の励起によって可視化された。Ａβを、６４７ｎＭの励起波長を使用して抗６Ｅ１０抗体によって可視化した。
５．ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）アッセイ
異なるフォーマットの４８又は９６ウェル細胞培養マイクロプレートを、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）中２００μｇ／ｍＬ抗体でコーティングした。９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）を５０μＬ／ウェルでコーティングし、４８ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）を１５０μＬ／ウェルでコーティングし、３７℃、５％ＣＯ２、湿度９５％で一晩インキュベートした。ｉＰＳＣミクログリアを、この実施例のセクション１に記載されるようにプレーティングし、培養した。
６．溶解液調製
培養３日後、Ｔｙｒ５２５／５２６上のリン酸化及び内因性ＳＹＫの総レベルの測定のための試料を、溶解緩衝液（溶解緩衝液ウルトラ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）による細胞溶解によって得た。使用済みの培地を除去し、新たに調製した１×溶解緩衝液をマイクロプレート（４８ウェルでは１００μＬ、９６ウェルでは６０μＬ）に添加した。プレートをプレートシェーカー（３５０ｒｐｍ）上で室温にて１０分間撹拌した。同じ培養条件（Ｎ＝３～４、ｎ＝２～３）の非溶解複製ウェルへの溶解物の連続的なキャリーオーバーによって、濃縮試料を生成した。プレートを再び室温で１０分間撹拌し、濃縮溶解物を９６ウェルディープウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）に移し、－８０℃で凍結した。
７．Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ
Ｌｕｍｉｎｅｘ多重分析物プロファイリング技術（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ２０－Ｐｌｅｘ Ｈｕｍａｎ ＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘ（商標）Ｐａｎｅｌ）を使用して、収集したミクログリア培養上清からの多重タンパク質定量を行った。アッセイキットを、製造者のプロトコルに従って使用した。十分な試料体積を得るために、同じ条件の複数のウェルの上清をプールし、プールした試料を２連で分析した。アッセイプレートをＬｕｍｉｎｅｘ（商標）ＭＡＧＰＩＸ（商標）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で読み取った。
８．ＳＹＫリン酸化アッセイ
抗ＴＲＥＭ２抗体がＳＹＫリン酸化を誘導したかどうかを決定するために、野生型ｉＰＳＣ－ＭＧを、ＩＬ－３４及びＣＳＦ－１を含まず、プレート結合抗体：対照（ｇＤ ｈＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｇ）、抗ＴＲＥＭ２ ｈＰａｒａ．０９．Ｖ２ ｈＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｇ又は変異体ｈＰａｒａ．Ｑ１００Ｐ．Ｖ１０４Ｌ ｈＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｇ抗体の存在下で、培養培地中、４８ウェルプレート中で培養した。指定の時点（１時間、４時間、２４時間）について細胞を播種し、次いで、溶解し、ｐＳＹＫ及び総ＳＹＫについてＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）アッセイで分析した。比を、抗ｇＤ対照抗体を使用して測定された比に対して各時点で更に正規化した。各条件について、ｎ＝４ウェルが存在した。治療した細胞からのタンパク質溶解物中のホスホ－ＳＹＫ対総ＳＹＫの比をＥＬＩＳＡによって測定した。
Ｂ．結果
１．抗ＴＲＥＭ２抗体はヒトｉＰＳＣ－ＭＧ生存を促進する
本発明者らは、対照抗ｇＤ抗体と比較して、ミクログリアの生存に通常必要とされるＩＬ－３４及びＣＳＦ－１を含まないｉＰＳＣ－ＭＧを培養することによって、抗ＴＲＥＭ２抗体３．１０Ｃ２ｖ１及びｈＰａｒａ０９．ｖ２（ＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｇバックグラウンド中）がヒトｉＰＳＣ由来ミクログリア（ｉＰＳＣ－ＭＧ）の生存を促進するかどうかを試験した。（図２３Ａ）。対照抗体では、ほとんどのミクログリアがＩＬ－３４及びＣＳＦ－１なしで３日間の培養後に死亡した。対照的に、３．１０Ｃ２ｖ１及びｈＰａｒａ０９．ｖ２は、用量依存的様式でｉＰＳＣ－ＭＧ生存を促進した。生存効果がＴＲＥＭ２シグナル伝達を介して媒介されることを検証するために、ＴＲＥＭ２ノックアウト（ＫＯ）ｉＰＳＣミクログリアにおいて抗体も試験した。抗体３．１０Ｃ２ｖ１及びｈＰａｒａ０９．ｖ２は、ＴＲＥＭ２－ＫＯ ｉＰＳＣミクログリアの生存を促進しなかった。したがって、抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体３．１０Ｃ２ｖ１及びｈＰａｒａ０９．ｖ２は、ＴＲＥＭ２依存的様式でｉＰＳＣ－ＭＧ生存を促進した。
ヒトｉＰＳＣ－ＭＧ生存アッセイを使用して、６つのエピトープビン（図２３Ｂ）のそれぞれからの最も高い親和性を有する２～４個の抗体クローンを使用して、ｈＴＲＥＭ２の異なる領域への結合を示した実施例１のスクリーニングから抗ＴＲＥＭ２抗体をスクリーニングした。３．１０Ｃ２群に対応するエピトープビン内の抗体は、１ｎｇ及び１０ｎｇでさえ最も高い生存活性を示した。したがって、３．１０Ｃ２群の抗体は、ｉＰＳＣ－ＭＧミクログリア生存の促進において最も高いアゴニスト活性を示した。
２．抗ＴＲＥＭ２抗体はｉＰＳＣ－ＭＧにおいてｐＳＹＫ依存性生存を誘導する
ＴＲＥＭ２は、その細胞質免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を介してＳＹＫを動員するＤＡＰ１２との会合を介してシグナル伝達する。したがって、ＳＹＫは、ＴＲＥＭ２シグナル伝達の下流エフェクターである。図２３Ｃに示すように、対照抗ｇＤ抗体と比較して、ｈＰａｒａ．０９．Ｖ２ ｈＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｇ抗体及び変異体ｈＰａｒａ．Ｑ１００Ｐ．Ｖ１０４Ｌ ｈＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｇ抗体は両方とも、１時間のインキュベーションでホスホ－ＳＹＫの２倍の上昇、及び４時間で１０倍を超える誘導を示した（エラーバー＋／－ＳＥＭ。２元配置分散分析を使用して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊＜０．０００１）。ホスホ－ＳＹＫレベルは２４時間で対照レベルに戻った。ヒトＭＤＭ細胞について上に示される結果と一致して、両方の抗体は、ｉＰＳＣ由来ミクログリアにおいてＳＹＫキナーゼを介してＴＲＥＭ２シグナル伝達の増加を誘発した。
ＴＲＥＭ２活性化媒介生存がＳＹＫキナーゼ活性を必要とするかどうかを試験するために、ヒトｉＰＳＣ－ＭＧを、２５０ｎＭのＳＹＫ阻害剤ＰＲＴ－０６０３１８（ＰＲＴ３１８）の存在下で抗ＴＲＥＭ２抗体ｈＰａｒａ．０９．Ｖ２ ｈＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｇと共にインキュベートした（図２３Ｄ）。ＳＹＫ阻害剤の存在下では、ｈＰａｒａ．０９．Ｖ２ ｈＩｇＧ１ Ｎ２９７ＧはｉＰＳＣ－ＭＧ生存を促進せず、ＴＲＥＭ２媒介生存機能がＳＹＫ活性を必要とすることを示した。
ｉＰＳＣ－ＭＧアッセイを更に使用して、抗ＴＲＥＭ２抗体クローンのＥＣ５０を決定した。図２３Ｅに示されるように、試験された抗ＴＲＥＭ２抗体は、サブナノモル濃度の範囲でｉＰＳＣ－ＭＧ生存を促進した。
これらのデータは、抗体がマクロファージ及びミクログリアモデルにおいてＳＹＫのリン酸化を介してＴＲＥＭ２シグナル伝達を強力に活性化することを更に確認した。
３．アルツハイマー病に対する抗ＴＲＥＭ２抗体及びＴＲＥＭ２の神経保護機能
いくつかの以前の研究は、ＴＲＥＭ２活性が密集したプラークへのＡβのミクログリアパッキング（ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ ｐａｃｋｉｎｇ）を調節し、これがアルツハイマー病（ＡＤ）における重要な神経保護活性を付与し得ることを示している。（Ｕｌｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓｃｈｅｍｎｅｕｒｏ．５ｂ００３１３（２０１６）；Ｙｅｈ ＦＬ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｍｅｄ．２０１７．０３．００８（２０１７）；Ｂｏｈｌｅｎ ＣＪ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ－ｇｅｎｅｔ－１１２６１８－０４３５１５（２０１９）；Ｗａｎｇ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ｄｏｉ：１０．１０８４／ｊｅｍ．２０１５１９４８（２０１６）；Ｍｅｉｌａｎｄｔ ＷＪ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ｄｏｉ：１０．１５２３／ＪＮＥＵＲＯＳＣＩ．１８７１－１９．２０１９（２０２０）．）
図２４Ａは、対照抗ｇＤ抗体又はｈＰａｒａ０９．Ｑ１００Ｐのいずれかで治療した細胞の、ＡβΑベータ）、アミロイド斑（Ｘ０４）及びＩＢＡ１に対するマーカーによる染色を個々に、及び組み合わせて（統合して）示す。ＡβオリゴマーをヒトｉＰＳＣ由来ミクログリア培養物に２日間添加すると、ロバストなＡβプラーク様構造の形成及びＡβ凝集体の形成がもたらされた（図２４Ａ左側のＡβパネル）。アミロイド特異的結合色素Ｍｅｔｈｏｘｙ－Ｘ０４は、アミロイド斑に見られるＡβペプチドの特異的確認に結合する（Ｋｌｕｎｋ ＷＥ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｔｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ ｄｏｉ：１０．１０９３／ｊｎｅｎ／６１．９．７９７（２００２））。Ｘ０４染色を使用して、観察された凝集物がミクログリアによって形成されたアミロイド斑であることを確認した。（図２４Ａ、中央のＸ０４パネル）。ＩＢＡ１マーカーはミクログリアを標識する。図２４Ａにおいて、右側のＩＢＡ１パネルは、ｈＰａｒａ０９．Ｑ１００Ｐ ｈＩｇＧ１ Ｎ２７９Ｇ抗体の存在下でのより強いＩＢＡ１染色を示す。
Ａβ及びＸ０４染色強度の増加はそれぞれ、アミロイド斑の形成及び圧縮を反映する。対照抗体と比較して、ｈＰａｒａ０９．Ｑ１００Ｐ ｈＩｇＧ１ Ｎ２７９Ｇは、ヒトｉＰＳＣミクログリアにおけるＡβ凝集体の形成を増強した（図２４Ａ）。対照抗体で治療した細胞のβ凝集体はより拡散していたが、抗ＴＲＥＭ２ ｈＰａｒａ０９．Ｑ１００Ｐ ｈＩｇＧ１ Ｎ２７９Ｇ 抗体の存在下で形成されたＡβ凝集体はより明るく、はるかに圧縮され、丸くなっていた（図２４Ａ、Ａβパネル）。Ａβ染色の増加は、抗ＴＲＥＭ２ ｈＰａｒａ０９．Ｑ１００Ｐ ｈＩｇＧ１ Ｎ２７９Ｇ抗体に応答して、Ａβ凝集体の同じ領域に圧縮されたＡβペプチドがより多いことを示した。Ａβ染色と一致して、抗ＴＲＥＭ２の存在下ではＡβ凝集体においてより強力なＸ０４染色も存在し、より多くの色素が特定のアミロイド斑様構造に結合したことを示した（図２４Ａ、Ｘ０４パネル）。対照と比較して、抗ＴＲＥＭ２の存在下でアミロイド斑の周囲により多くのミクログリアが検出された（図２４Ａ、統合パネル）。
このアッセイでは、ｈＰａｒａ０９．Ｑ１００Ｐ ｈＩｇＧ１ Ｎ２７９Ｇに加えて、いくつかのヒト化抗ＴＲＥＭ２抗体を試験した。総アミロイド斑形成を定量するために、総Ｘ０４強度を測定し、抗体なし対照に対して正規化した。条件ごとにＮ＝４ウェル。エラーバー＋／－ＳＥＭ。抗ＴＲＥＭ２抗体の存在下では、アミロイド斑様構造の最大５倍の増加があった。（図２４Ｂ）。アミロイド斑圧縮を測定するために、各Ａβ凝集領域内のプラーク色素Ｘ０４染色の平均強度を測定した。図２４Ｃは、増加する抗体濃度での平均Ｘ０４ ｉＰＳＣ－ＭＧプラーク強度を示す。ＥＣ５０値を、曲線の下の表に各抗体についてｎＭで示す。図２４Ｃに示されるように、抗ＴＲＥＭ２抗体は、平均Ｘ０４強度を３倍まで増加させた。
したがって、本開示の抗ＴＲＥＭ２抗体による治療は、ＴＲＥＭ２シグナル活性化を示すホスホ－ＳＹＫ比の最大１０倍の増加を示し、必要とされるミクログリア成長因子ＩＬ－３４及びＣＳＦ－１の非存在下でのミクログリア生存率の５～８倍の増加をもたらした。ＡＤ病理学的脳環境をモデル化するＡβオリゴマーの存在下では、抗ＴＲＥＭ２抗体はまた、総Ａβプラーク強度及び平均Ｘ０４プラーク強度の増加によって測定されるように、Ａβプラーク形成及び圧縮を３～５倍増加させた。このミクログリア生存率の増加は、より多くのミクログリアがＡβオリゴマーに作用し、それらをアミロイド斑にパッケージングすることを可能にし得る。したがって、抗体は、ヒトミクログリアにおいてＴＲＥＭ２シグナル伝達を活性化し、ミクログリアの生存を機能的に増加させ、アミロイド斑へのＡβ圧縮を促進することによって、ｉｎ ｖｉｖｏで神経保護を提供し得る。
実施例１８Ａ：マウスにおける３．１０Ｃ２及びＰａｒａ．０９の全身投与はｉｎ ｖｉｖｏで可溶性ＴＲＥＭ２レベルを減少させる
Ａ．材料及び方法
ＰＳ２ＡＰＰマウスＴＲＥＭ２ノックアウト（ＫＯ）バックグラウンドでヒトＴＲＥＭ２を発現するトランスジェニックマウスに、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与により、３．１０Ｃ２、Ｐａｒａ．０９（ラットＰａｒａ．０９－ＬＣ ３．２７Ｈ７）、又は対照ｇｐ１２０ ＩｇＧ抗体を投薬した。各抗体は、ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧ骨格を含んでいた。投与した用量は０日目に２０ｍｇ／ｋｇ及び８０ｍｇ／ｋｇであり、血漿及び脳試料を３日目に収集した。
マウスは７～８月齢であった。マウスをアバチン（Ａｖｅｒｔｉｎ）で麻酔し、心臓穿刺によって血液を収集した。マウスの脳を冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で灌流し、取り出し、正中線を分割した。片側半球を４％ＰＦＡに４８時間滴下固定し、次いでＰＢＳに移し、次いで、凍結保存のために３０％スクロースに移した。冠状切片（３５μｍ）を摺動ミクロトームで作製した。他方の半脳から、海馬及び皮質を単離し、急速に凍結した。皮質組織を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅカタログ番号４６９３１５９００１）及びＰｈｏｓＳＴＯＰ（商標）（Ｒｏｃｈｅカタログ番号４９０６８３７００１）を含有する１０体積のＴＢＳ（５０ｍｍトリスｐＨ７．５、１５０ｍｍ ＮａＣｌ）中でホモジナイズし、１００ｍｇの組織ごとに１ｍｌの溶解緩衝液を使用した。その後、１つの３－ｍｍステンレス鋼ビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）を各管に添加し、試料をＱｉａｇｅｎ ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ（商標）ＩＩを用いて３０Ｈｚで３分間ホモジナイズした。次いで、均質化された試料を、４℃で２０分間、２０，０００×ｇでの遠心分離によって清澄化した。上清を新しいチューブに移し、－８０℃で保存した。
Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号ＤＹ１８２８－０５）によるヒトＴＲＥＭ２ ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、血漿及び脳溶解物中のｓＴＲＥＭ２を試験した。アッセイキットで提供されたヒトｓＴＲＥＭ２捕捉抗体（ＡＦ１８２８）をＰＢＳで希釈し、９６ウェルプレートに固定した。ブロッキング及び洗浄後、プレート希釈試料及び標準を添加し、室温で２時間インキュベートした。洗浄後、ヒトｓＴＲＥＭ２検出抗体を希釈し、更に２時間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、ストレプトアビジン－ＨＲＰと共に２０分間インキュベートし、続いて室温で２０分間基質溶液をインキュベートした。反応を停止させた後、検出用に４５０ｎｍ、バックグラウンド用に５７０ｎｍの２つのフィルターを用いてプレートを読み取った。濃度は、濃度に対して光学濃度をプロットすることによって得られた標準曲線上で決定した。
Ｂ．結果
３．１０Ｃ２．ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧ及びＰａｒａ．０９．ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧ抗体の投与は、対照抗体（ｇｐ１２０）の投与後に測定された可溶性ＴＲＥＭ２のレベルと比較して、血漿（図２５Ａ）及び脳ホモジネート（図２５Ｂ）試料の両方で可溶性ＴＲＥＭ２レベルの用量依存的減少を引き起こした。ｓＴＲＥＭ２の減少は、抗体がシェディングを阻止するか、あるいは活性化時に受容体の内在化を誘導し得ることを示し得る。ｓＴＲＥＭ２の減少は、治療抗体が末梢及び脳においてｉｎ ｖｉｖｏで標的と係合することができることを示唆している。
実施例１８Ｂ：Ｐａｒａ ０９投与は、比較抗ＴＲＥＭ２抗体で見られる効果とは対照的に、ｉｎ ｖｉｖｏ血漿可溶性ＴＲＥＭ２レベルの減少をもたらす
Ａ．材料及び方法
ＰＳ２ＡＰＰマウスＴＲＥＭ２ノックアウト（ＫＯ）バックグラウンドにおいてヒトＴＲＥＭ２を発現するトランスジェニックマウス（５～６月齢）に、腹腔内投与により、Ｐａｒａ．０９（ラットＰａｒａ．０９－ＬＣ ３．２７Ｈ７）、比較抗体ＡＬ２ｐ５８、又は対照ｇｐ１２０ ＩｇＧ抗体を投薬した。各抗体は、ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧ骨格を含んでいた。投与した用量は以下の通りであった：Ｐａｒａ０９－１００ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ；Ａｌ２ｐ５８－２０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ；ｇｐ１２０アイソタイプ対照－２００ｍｇ／ｋｇ。３日目又は７日目に末梢血漿（Ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｌａｓｍａ）を収集した。
動物の取り扱い、組織の収集及び処理、並びにＲ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓによるヒトＴＲＥＭ２ ＥＬＩＳＡアッセイを、実施例１８Ａに記載のように行った。マウスをアバチン（Ａｖｅｒｔｉｎ）で麻酔し、心臓穿刺によって血液を収集した。Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号ＤＹ１８２８－０５）によるヒトＴＲＥＭ２ ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、血漿溶解物中のｓＴＲＥＭ２を試験した。アッセイキットで提供されたヒトｓＴＲＥＭ２捕捉抗体をＰＢＳで希釈し、９６ウェルプレートに固定した。ブロッキング及び洗浄後、プレート希釈試料及び標準を添加し、室温で２時間インキュベートした。洗浄後、ヒトｓＴＲＥＭ２検出抗体を希釈し、更に２時間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、ストレプトアビジン－ＨＲＰと共に２０分間インキュベートし、続いて室温で２０分間基質溶液をインキュベートした。反応を停止させた後、検出用に４５０ｎｍ、バックグラウンド用に５７０ｎｍの２つのフィルターを用いてプレートを読み取った。濃度は、濃度に対して光学濃度をプロットすることによって得られた標準曲線上で決定した。
Ｂ．結果
Ｐａｒａ．０９ ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧ抗体の投与は、血漿試料中の可溶性ＴＲＥＭ２レベルの７０％～８５％の実質的かつ用量依存的な減少を引き起こした（図２５Ｃ）。対照的に、ＴＲＥＭ２のストークドメインＡＬ２ｐ５８（国際公開第２０１９０２８２９２号を参照）に結合すると記載されており、先の実施例ではｓＴＲＥＭ２に結合することが示されている比較抗ＴＲＥＭ２抗体は、対照抗体で見られるｓＴＲＥＭ２レベルと比較して２倍を超える血漿ｓＴＲＥＭ２レベルの顕著な増加を示した。図２５Ｃに示すように、ＡＬ２ｐ５８で治療した動物における血漿ｓＴＲＥＭ２レベルのこの増加は、治療後少なくとも７日間持続した。したがって、Ｐａｒａ０９の投与は血漿中のｓＴＲＥＭ２レベルを減少させたが、比較抗体の投与は、ｉｎ ｖｉｖｏで血漿ｓＴＲＥＭ２レベルの長期かつ実質的な増加を引き起こすという反対の効果を有し、これはｓＴＲＥＭ２への結合の望ましくない副作用であり得る。
実施例１８Ｃ：カニクイザルにおけるｈ３．１０Ｃ２．ｖ１及びｈＰａｒａ．０９．ｖ２抗体の単回用量静脈内注射は、ｉｎ ｖｉｖｏで可溶性ＴＲＥＭ２レベルを減少させる
Ａ．材料及び方法
およそ２～３歳の天然の雌性カニクイザルに、ｈ３．１０Ｃ２．ｖ１．ｈｕＩｇＧ１．Ｎ２９７Ｇ、ｈＰａｒａ．０９．ｖ２．ｈＩｇＧ．Ｎ２９７Ｇ、又は対照抗体（抗ｇＤ．ｈＩｇＧ１．Ｎ２９７Ｇ）を、１日目に５０又は２００ｍｇ／ｋｇで静脈内で投薬した。ＣＳＦ試料収集のため、カニクイザルの腰椎に髄腔内カテーテルを外科的に埋め込んだ。末梢静脈を介して意識のある動物から血液試料を収集した。動物を安楽死させ、肉眼的剖検を行って脳試料を収集した。３０～５０ｍｇの脳穿刺を小脳、大脳皮質、及び海馬から収集した。ＣＳＦ及び血漿試料を、投与後２日の期間を有するコホートについては－７、０、１及び２日目に、投与後２８日の期間を有するコホートについては－７、０、１、２、４、７、１０、１４、２１及び２８日目に収集した。治療前の－７日目及び０日目に収集した試料を平均して、ベースライン可溶性ＴＲＥＭ２（ｓＴＲＥＭ２）濃度を決定した。研究３日目及び２９日目に安楽死させた動物から脳試料を収集した。
市販のヒトＴＲＥＭ２ ＥＬＩＳＡキット（Ｏｒｉｇｅｎｅ ＥＡ１０２４８４）を使用して、カニクイザルＣＳＦ、血漿及び脳溶解物中の可溶性ＴＲＥＭ２レベルを決定した。９６ウェルプレートを抗ＴＲＥＭ２捕捉抗体でプレコートした。１００μＬの標準、対照又は試料を各ウェルに添加し、３７℃で９０分間インキュベートした。ウェルの内容物を吸引によって除去し、１００μＬの希釈ビオチン化検出抗体を各ウェルに添加した。３７℃で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。１００μＬ／ウェルのアビジン－ペルオキシダーゼ二次検出試薬をプレートに添加し、プレートを３７℃で３０分間更にインキュベートした。プレートを５回洗浄した後、９０μＬ／ウェルの発色試薬を添加し、プレートを１５～２５分間インキュベートした。１００μＬ／ウェルの停止溶液を添加して発色を停止させた。吸光度を、６５０ｎｍの参照波長に対して４５０ｎｍで測定した。試料の濃度を、標準曲線の４パラメータ適合から外挿した。報告可能なアッセイ範囲は０．０３１３～２．０ｎｇ／ｍＬであり、定量下限はＣＳＦでは１５６ｐｇ／ｍＬ、血漿では３１３ｐｇ／ｍＬ、脳溶解物では９４ｐｇ／ｍＬである。
Ｂ．結果
ｓＴＲＥＭ２の減少の一般的な傾向は、対照群と比較して、ｈ３．１０Ｃ２．ｖ１．ｈｕＩｇＧ１．Ｎ２９７Ｇ及びｈＰａｒａ．０９．ｖ２．ｈＩｇＧ．Ｎ２９７Ｇ群のほとんどの試料で観察された（図２６Ａ～図２６Ｃ）。血漿（対照群に対して治療群では５０％以上）、次いでＣＳＦ、次いで脳において最大の減少が観察された。ｈ３．１０Ｃ２．ｖ１．ｈｕＩｇＧ１．Ｎ２９７Ｇ又はｈＰａｒａ．０９．ｖ２．ｈＩｇＧ．Ｎ２９７Ｇによる治療は、ＣＳＦ及び脳において用量依存性応答を示すようであった。ｈＰａｒａ．０９．ｖ２．ｈＩｇＧ．Ｎ２９７Ｇは、ｈ３．１０Ｃ２．ｖ１．ｈｕＩｇＧ１．Ｎ２９７Ｇと比較して、脳及びＣＳＦ ｓＴＲＥＭ２の最大の減少を示した。２８日間実行した５０ｍｇ／ｋｇ群では、ｓＴＲＥＭ２の減少が特に１０日目に脳、ＣＳＦ、及び血漿で観察された（図２６Ｄ～図２６Ｆ）。
ｓＴＲＥＭ２の減少は、治療用抗体が脳及びＣＳＦにおいてｉｎ ｖｉｖｏでインタクトＴＲＥＭ２標的と係合し得て、また末梢におけるｓＴＲＥＭ２の長期減少をもたらし得ることを示唆する。
実施例１９：ＴＲＥＭ２活性化抗体はＩｎ Ｖｉｖｏで細胞増殖を増加させる
Ａ．材料及び方法
遊離浮遊冠状切片（３５μｍ、動物あたり２個）をＰＢＳで５分間２回洗浄し、続いてＰＢＳ－Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（０．１％）で１０分間２回洗浄した。次いで、切片をＤａｋｏ Ｔａｒｇｅｔ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ロッシュカタログ番号Ｓ２３６７８４－２）中、１０５℃で１０分間インキュベートし、ＰＢＳ中で洗浄し、次いで、ＰＢＳ中の５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００中で室温にて２～３時間ブロッキングした。一次抗体（マウスモノクローナルＫｉ６７；ＢＤ ＰｈａｒｍｉｇｅｎカタログＮｏ．５５６００３）を１：１００に希釈し、４℃で一晩インキュベートし、ロバ抗マウスＡｌｅｘａ５５５二次抗体を室温で２時間インキュベートした。切片をＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ（商標）ｐｌｕｓ（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ）ガラススライド上にマウントし、Ｐｒｏｌｏｎｇ（商標）Ｇｏｌｄ＋ＤＡＰＩ退色防止マウント媒体でカバースリップした。免疫蛍光スライドの画像取得は、ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ（登録商標）Ｓ６０又はＸＲ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｃｏｒｐ、カリフォルニア州サンノゼ）デジタルホールスライドスキャナを用いて２００倍の倍率で行った。各チャネルの理想的な露光は、最も明るい強度の試料に基づいて決定し、スライドのセット全体をバッチとして実行するように設定した。
３．１０Ｃ２、Ｐａｒａ０９又は対照ｇｐ１２０ ＩｇＧ抗体（各抗体はｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡＰＧ骨格を含む）で治療したマウスの脳切片を増殖マーカーＫｉ６７について染色し、Ｋｉ６７＋／ＤＡＰＩ＋細胞の数を計算した。Ｋｉ６７及びＤＡＰＩについて陽性の細胞を計数し、動物あたり２つの切片から平均した。
Ｂ．結果
図２７に示すように、Ｐａｒａ．０９（８０ｍｇ／ｋｇ）は、アイソタイプ対照治療マウスと比較して、単回注射の３日後にＫｉ６７＋細胞の数を有意に増加させた。Ｋｉ６７＋細胞の一元配置ＡＮＯＶＡにより、有意な治療効果（Ｆ（４，１５）＝３．４７７ Ｐ＝０．０３３６）が見出され、テューキーの事後多重比較により、Ｐａｒａ．０９（８０ｍｇ／ｋｇ）と対照アイソタイプ（ｇｐ１２０、８０ｍｇ／ｋｇ）との間に有意差があった（ｐ＜０．０５）。このデータは、Ｐａｒａ．０９がＴＲＥＭ２経路活性化を誘導し、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞増殖を増加させることを確認する。
実施例２０：ヒトアルツハイマー病のマウスモデルにおけるアミロイド及びタウの病態に対する抗ＴＲＥＭ２抗体の効果
アルツハイマー病（ＡＤ）の病理学的特徴には、アミロイド斑を形成するベータ－アミロイドペプチドの細胞外沈着物、及び神経原線維変化と呼ばれる凝集した過剰リン酸化タウの細胞内沈着物が含まれる。これらの病状に続いて、活性化星状膠細胞及びミクログリアを含む脳炎症、並びに神経変性が増加する。家族性形態のＡＤを引き起こすプレセニリン２及びアミロイド前駆体タンパク質にヒト変異を発現するトランスジェニックマウス（ＰＳ２ＡＰＰマウス）は、ＡＤ患者で見られるＡベータ病態において同様の年齢依存的増加を示す。タウ変異型Ｐ３０１Ｌマウスと交雑したＰＳ２ＡＰＰマウス（ＴａｕＰＳ２ＡＰＰマウス）は、過剰リン酸化タウ及び神経変性を含むＡＤ病理のさらなる特徴を示す。抗ＴＲＥＭ２抗体を使用してヒトＴｒｅｍ２を活性化するとミクログリア活性が増強され、毒性の低いアミロイド斑への貪食又は圧縮によって毒性アミロイド－ベータペプチドの除去が促進されるかどうかを試験するために、ヒトＴＲＥＭ２（ｈＴＲＥＭ２ ＢＡＣ）発現マウスを、マウスＴｒｅｍ２ノックアウトバックグラウンドにおいて、ＴａｕＰＳ２ ＡＰＰマウスに交配する。この試験では、１４～１６匹のＴａｕＰＳ２ ＡＰＰ－ｈＴｒｅｍ２マウスの群に、３４週齢から開始して１６週間、低用量又は高用量の抗ＴＲＥＭ２抗体又は対照ＩｇＧ抗体の毎週又は毎月（４週間ごと）の全身注射を行う。体積測定ＭＲＩによる脳萎縮の変化を、治療の開始時及び終了時にマウスを撮像することによってモニターする。
投与の完了時に、血漿及び脳試料を収集してＥＬＩＳＡによって抗体曝露を測定し、一方の半脳を免疫組織化学的染色のためにパラホルムアルデヒドで固定し、皮質及び海馬組織を収集して生化学的分析を行う。プラーク形成についての組織学的染色を、メトキシ－Ｘ０４等のアミロイド染色を使用して行う。プラークの周りのミクログリアのクラスター化及び形態の変化を、Ｉｂａ１及びメトキシ－Ｘ０４等のミクログリアマーカーで染色することによって評価する。治療がプラーク関連神経変性（神経炎性ジストロフィー）の発症を変化させるかどうかを決定するために、切片を、プラークについてメトキシ－Ｘ０４及びプラークを取り囲む神経炎性ジストロフィーに蓄積するリソソームタンパク質マーカー、例えばＬＡＭＰ１で共染色する。
海馬におけるｐＴａｕ及び神経変性の組織学的測定に対する抗ＴＲＥＭ２抗体治療の効果を、リン酸化タウ及び凝集タウの様々な形態について染色することによって測定する（例えば、ＡＴ８、ＰＨＦ１、ＭＣ１及びｐ２１２／２１４抗体）。神経変性は、変性している軸索及び突起を検出するアミノ第二銅銀染色で切片を染色することによって評価される。変性軸索の可溶性マーカーである神経線維軽鎖（ＮｆＬ）もまた、血漿及びＣＳＦからＥＬＩＳＡによって測定される。
実施例２１：多発性硬化症モデルにおける抗ＴＲＥＭ２抗体の効果
多発性硬化症（ＭＳ）は、ＣＮＳにおける自己免疫関連脱髄を特徴とする疾患である。患者では、疾患は、他の神経学的影響の中でも、運動失調、四肢脱力、及び視神経炎等の症候のエピソードを呈する。抗ＴＲＥＭ２抗体によるＴＲＥＭ２経路の活性化が再髄鞘化を促進するかどうかを、ＭＳのキュプリゾン誘発脱髄モデルにおいて試験する。キュプリゾンは、げっ歯類固形飼料（０．２～０．２５％）に導入されると、オリゴデンドロサイトを確実に標的とし、脳の白質路に沿って脱髄病変を引き起こし、ヒトＭＳ患者で観察される脱髄を模倣する毒性銅キレート剤である。マウスを典型的には４週間治療し、その時点で脳梁の病変はＭＲＩによって検出可能である。キュプリゾン固形飼料から除去した後、正常な野生型マウスは、キュプリゾン治療の３日後に（ｄＭＢＰの染色によって測定される）分解ミエリンの蓄積、（ソロクロムシアニン染色によって測定される）インタクトなミエリンの減少、並びに病変部位への星状膠細胞（ＧＦＡＰ）及びミクログリア（Ｉｂａ１）浸潤を示す。野生型マウスにおける増加した前駆細胞及び成熟乏突起膠細胞（Ｏｌｉｇ２）は、典型的には３日目までに上昇し、再髄鞘化を支持し、これは典型的にはキュプリゾン治療後１４日までに完了する。電子顕微鏡法はまた、白質路における再髄鞘化のレベルを定量化するために使用され得る。
再髄鞘化事象に対する抗ＴＲＥＭ２抗体治療の影響を、病変を誘導するためにキュプリゾン固形飼料に４週間曝露したｈＴＲＥＭ２－ＢＡＣトランスジェニックマウスを使用して試験し、次いで、キュプリゾン固形飼料を除去しながら抗ＴＲＥＭ２抗体又はｇｐ１２０等のアイソタイプ対照抗体のいずれかで治療する。典型的には、各群は５～１０匹のマウスを含む。群には、対照固形飼料又はキュプリゾン固形飼料を４週間与えたマウスが含まれ、キュプリゾン固形飼料を４週間与えた後、対照固形飼料を３、７、又は１４日間与えたマウスの群が含まれる。マウスは、４週間のキュプリゾン固形飼料の後に高用量の抗ＴＲＥＭ２又は対照抗体を単回投与され、脳及び血漿試料は、抗体注射の３、７、又は１４日後のいずれかに収集される。脳梁病変の染色された切片（例えば、対象あたり６～１８切片）を、高解像度画像化及び自動解析ソフトウェア（ＭＡＴＬＡＢ）を使用して定量化する。抗体注射後１４日間の試料を、再髄鞘化について電子顕微鏡法によって測定する。
前述の発明は明確な理解のために例示及び実例によって幾分詳細に説明されているが、これらの説明及び実例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書に引用される全ての特許及び科学文献の開示内容は、その全体が出典明示により本明細書に援用される。
配列表
以下の表は、本明細書における本文及び図に記載又は引用される特定の配列を提供する。配列番号９０、９２～９３、及び９５～１０１では、タンパク質中の切断部位の位置であるＴＲＥＭ２残基Ｈ１５７及びＳ１５８に下線が引かれている。
Figure 2024518545000007
Figure 2024518545000008
Figure 2024518545000009
Figure 2024518545000010
Figure 2024518545000011
Figure 2024518545000012
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Figure 2024518545000014
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Figure 2024518545000016
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Claims (82)

  1. 骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体であって、前記抗体が、配列番号１、９、１１、１９又は６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号２、１０、１２、２０、５５、６３、６５又は７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、以下のアミノ酸配列：Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｙ（式中、Ｘ１及びＸ２は、共に、Ｉ－Ｌ又はＬのいずれかであり、Ｘ３は、Ｄ又はＥのいずれかである）を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体。
  2. 骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体であって、前記抗体が、配列番号１、９、１１、１９又は６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号２、１０、１２、２０、５５、６３、６５又は７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、以下のアミノ酸配列：Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｙ（式中、Ｘ１及びＸ２は、共に、Ｉ－Ｌ又はＬのいずれかであり、Ｘ３は、Ｄ又はＥのいずれかである）を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号４、２７、３７、４７、５７又は６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号６、２９、３９、４９、５９又は６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体。
  3. 骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体であって、前記抗体が、配列番号１、９、１１、又は１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号２、１０、１２、又は２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、以下のアミノ酸配列：Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｙ（式中、Ｘ１及びＸ２は、共に、Ｉ－Ｌ又はＬのいずれかであり、Ｘ３は、Ｄ又はＥのいずれかである）を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体。
  4. 前記抗体が、以下の特性：
    （ａ）ＴＲＥＭ２のストークドメインに特異的に結合する、
    （ｂ）可溶性ＴＲＥＭ２（ｓＴＲＥＭ２）に結合しない、
    （ｃ）アミノ酸１４６～１６１（配列番号９６）又は１５１～１６５（配列番号９７）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドに、アミノ酸１３９～１５８（配列番号９２）及び／又は１５９～１７５（配列番号９４）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドよりも高い親和性で特異的に結合する、
    （ｄ）Ｈ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがるＴＲＥＭ２エピトープに特異的に結合する、
    （ｅ）野生型ＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチドと比較して（例えば、二重層干渉法によって測定される場合）、Ｄ１５２Ａ、Ｈ１５７Ａ及びＩ１５９Ａ置換を含むＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチドに対する結合親和性の低下を示す、
    （ｆ）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、３７℃で１ｎＭ未満、０．７ｎＭ未満、０．６ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．４ｎＭ未満、０．３ｎＭ未満のＫＤでヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に特異的に結合する、並びに
    （ｇ）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、３７℃で１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、７ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、又は２ｐＭ未満のＫＤでヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に特異的に結合する、
    のうちの１つ以上を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の単離された抗体。
  5. 前記抗体が、ラットＩＧＨＶ６－８生殖細胞系列セグメントに由来するＶＨ配列を有し、且つ／又は前記抗体が、ラットＩＧＫＶ２Ｓ１１生殖細胞系列セグメントに由来するＶＬ配列を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の単離された抗体。
  6. 前記軽鎖可変領域（ＶＬ）が、配列番号４、２７又は６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号６、２９又は６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の抗体。
  7. 前記軽鎖可変領域（ＶＬ）が、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の抗体。
  8. （ａ）前記重鎖可変領域（ＶＨ）が、配列番号１若しくは９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号２若しくは１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含み、前記軽鎖可変領域（ＶＬ）が、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含むか、又は
    （ｂ）前記重鎖可変領域（ＶＨ）が、配列番号１１若しくは１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号１２若しくは２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含み、前記軽鎖可変領域（ＶＬ）が、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む、
    請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体。
  9. 前記抗体が、配列番号７、１７、３０、４０、５０、６０、７０、７６、７７、７８、８１、８２、８３、１３３、１３５、１３７、１３９、１４６、１４８、１５０、又は１５２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％同一であるＶＨを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体。
  10. 前記抗体が、配列番号７、１７、１３３、１３５、１３７、１３９、１４６、１４８、１５０、又は１５２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％同一であるＶＨを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体。
  11. 前記抗体が、配列番号８、１８、３１、４１、５１、６１、７１、７９、８０、８４、８５、１３２、１３４、１３６、１３８、１４５、１４７、１４９、又は１５１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％同一であるＶＬを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体。
  12. 前記抗体が、配列番号８、１８、１３２、１３４、１３６、１３８、１４５、１４７、１４９、又は１５１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％同一であるＶＬを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体。
  13. 前記抗体が、配列番号７、１７、１３３、１３５、１３７、１３９、１４６、１４８、１５０、又は１５２のアミノ酸配列を含むＶＨを含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体。
  14. 前記抗体が、配列番号８、１８、１３２、１３４、１３６、１３８、１４５、１４７、１４９、又は１５１のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の抗体。
  15. 骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体であって、前記抗体が、
    （ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
    （ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
    （ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
    （ｄ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
    （ｅ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
    （ｆ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
    （ｇ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
    （ｈ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、又は
    （ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
    を含む、骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体。
  16. 前記抗体が、
    （ａ）請求項１５（ａ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＨをさらに含むか、
    （ｂ）請求項１５（ｂ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＨをさらに含むか、
    （ｃ）請求項１５（ｃ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＨをさらに含むか、
    （ｄ）請求項１５（ｄ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＨをさらに含むか、
    （ｅ）請求項１５（ｅ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号３０のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＨをさらに含むか、
    （ｆ）請求項１５（ｆ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＨをさらに含むか、
    （ｇ）請求項１５（ｇ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号５０のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＨをさらに含むか、
    （ｈ）請求項１５（ｈ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号６０のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＨをさらに含むか、又は
    （ｉ）請求項１５（ｉ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号７０のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＨをさらに含む、
    請求項１５に記載の抗体。
  17. 前記抗体が、
    （ａ）請求項１５（ａ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＬをさらに含むか、
    （ｂ）請求項１５（ｂ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＬをさらに含むか、
    （ｃ）請求項１５（ｃ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＬをさらに含むか、
    （ｄ）請求項１５（ｄ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＬをさらに含むか、
    （ｅ）請求項１５（ｅ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＬをさらに含むか、
    （ｆ）請求項１５（ｆ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号４１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＬをさらに含むか、
    （ｇ）請求項１５（ｇ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＬをさらに含むか、
    （ｈ）請求項１５（ｈ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号６１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＬをさらに含むか、又は
    （ｉ）請求項１５（ｉ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号７１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一であるＶＬをさらに含む、
    請求項１５又は１６に記載の抗体。
  18. 前記抗体が、
    （ａ）請求項１５（ａ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨをさらに含むか、
    （ｂ）請求項１５（ｂ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨをさらに含むか、
    （ｃ）請求項１５（ｃ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨをさらに含むか、
    （ｄ）請求項１５（ｄ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨをさらに含むか、
    （ｅ）請求項１５（ｅ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＶＨをさらに含むか、
    （ｆ）請求項１５（ｆ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＨをさらに含むか、
    （ｇ）請求項１５（ｇ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号５０のアミノ酸配列を含むＶＨをさらに含むか、
    （ｈ）請求項１５（ｈ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号６０のアミノ酸配列を含むＶＨをさらに含むか、又は
    （ｉ）請求項１５（ｉ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号７０のアミノ酸配列を含むＶＨをさらに含む、
    請求項１５、１６又は１７に記載の抗体。
  19. 前記抗体が、
    （ａ）請求項１５（ａ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬをさらに含むか、
    （ｂ）請求項１５（ｂ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬをさらに含むか、
    （ｃ）請求項１５（ｃ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬをさらに含むか、
    （ｄ）請求項１５（ｄ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬをさらに含むか、
    （ｅ）請求項１５（ｅ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＬをさらに含むか、
    （ｆ）請求項１５（ｆ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬをさらに含むか、
    （ｇ）請求項１５（ｇ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＬをさらに含むか、
    （ｈ）請求項１５（ｈ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号６１のアミノ酸配列を含むＶＬをさらに含むか、又は
    （ｉ）請求項１５（ｉ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号７１のアミノ酸配列を含むＶＬをさらに含む、
    請求項１５～１８のいずれか１項に記載の抗体。
  20. 配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項１５～１８のいずれか１項に記載の抗体。
  21. 配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項１５～１８のいずれか１項に記載の抗体。
  22. 前記抗体が、ヒトＩＧＫＶ２－２８＊０１生殖細胞系列と比較して、フレームワーク領域に１～５個のアミノ酸置換を含むＶＬを含み、任意に、前記アミノ酸置換がＱ１００Ｐ及び／又はＶ１０４Ｌを含む、請求項１５～１８のいずれか１項に記載の抗体。
  23. 前記抗体が、
    （ａ）請求項１５（ａ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号１４５のアミノ酸配列を含むＶＬをさらに含むか、
    （ｂ）請求項１５（ｂ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号１４５のアミノ酸配列を含むＶＬをさらに含むか、
    （ｃ）請求項１５（ａ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号１４７のアミノ酸配列を含むＶＬをさらに含むか、
    （ｄ）請求項１５（ｂ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号１４７のアミノ酸配列を含むＶＬをさらに含むか、
    （ｅ）請求項１５（ａ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号１４９のアミノ酸配列を含むＶＬをさらに含むか、
    （ｆ）請求項１５（ｂ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号１４９のアミノ酸配列を含むＶＬをさらに含むか、
    （ｇ）請求項１５（ａ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号１５１のアミノ酸配列を含むＶＬをさらに含むか、
    （ｈ）請求項１５（ｂ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号１５１のアミノ酸配列を含むＶＬをさらに含むか、
    （ｉ）請求項１５（ｃ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号１３２のアミノ酸配列を含むＶＬをさらに含むか、
    （ｊ）請求項１５（ｄ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号１３２のアミノ酸配列を含むＶＬをさらに含むか、
    （ｋ）請求項１５（ｃ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号１３４のアミノ酸配列を含むＶＬをさらに含むか、
    （ｌ）請求項１５（ｄ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号１３４のアミノ酸配列を含むＶＬをさらに含むか、
    （ｍ）請求項１５（ｃ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号１３６のアミノ酸配列を含むＶＬをさらに含むか、
    （ｎ）請求項１５（ｄ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号１３６のアミノ酸配列を含むＶＬをさらに含むか、
    （ｏ）請求項１５（ｃ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＶＬをさらに含むか、又は
    （ｐ）請求項１５（ｄ）に記載のＣＤＲを含み、配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＶＬをさらに含む、
    請求項１５～１８に記載の抗体。
  24. 前記抗体が、以下の特性：
    （ａ）ＴＲＥＭ２のストークドメインに特異的に結合する、
    （ｂ）可溶性ＴＲＥＭ２（ｓＴＲＥＭ２）に結合しない、
    （ｃ）アミノ酸１４６～１６１（配列番号９６）又は１５１～１６５（配列番号９７）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドに、アミノ酸１３９～１５８（配列番号９２）及び／又は１５９～１７５（配列番号９４）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドよりも高い親和性で特異的に結合する、
    （ｄ）Ｈ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがるＴＲＥＭ２エピトープに特異的に結合する、
    （ｅ）野生型ＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチドと比較して（例えば、二重層干渉法によって測定される場合）、Ｄ１５２Ａ、Ｈ１５７Ａ及びＩ１５９Ａ置換を含むＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチドに対する結合親和性の低下を示す、
    （ｆ）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、３７℃で１ｎＭ未満、０．７ｎＭ未満、０．６ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．４ｎＭ未満、若しくは０．３ｎＭ未満、又は１００～５００ｐＭ若しくは１００～２００ｐＭのＫＤでヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に特異的に結合する、並びに
    （ｇ）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、３７℃で１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、７ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満若しくは２ｐＭ未満、又は１０～５０ｐＭ若しくは１０～２５ｐＭのＫＤでヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に特異的に結合する、
    のうちの１つ以上を有する、請求項１５～２３のいずれか１項に記載の単離された抗体。
  25. 骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体であって、前記抗体が、
    （ａ）配列番号１４６のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１４５のアミノ酸配列を含むＶＬ、
    （ｂ）配列番号１４８のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１４７のアミノ酸配列を含むＶＬ、
    （ｃ）配列番号１５０のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１４９のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｄ）配列番号１５２のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１５１のアミノ酸配列を含むＶＬ、
    を含む、骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体。
  26. 前記抗体が、以下の特性：
    （ａ）ＴＲＥＭ２のストークドメインに特異的に結合する、
    （ｂ）可溶性ＴＲＥＭ２（ｓＴＲＥＭ２）に結合しない、
    （ｃ）アミノ酸１４６～１６１（配列番号９６）又は１５１～１６５（配列番号９７）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドに、アミノ酸１３９～１５８（配列番号９２）及び／又は１５９～１７５（配列番号９４）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドよりも高い親和性で特異的に結合する、
    （ｄ）Ｈ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがるＴＲＥＭ２エピトープに特異的に結合する、
    （ｅ）野生型ＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチドと比較して（例えば、二重層干渉法によって測定される場合）、Ｄ１５２Ａ、Ｈ１５７Ａ及びＩ１５９Ａ置換を含むＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチドに対する結合親和性の低下を示す、並びに
    （ｆ）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、３７℃で１ｎＭ未満、０．７ｎＭ未満、０．６ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．４ｎＭ未満、若しくは０．３ｎＭ未満、又は１００～５００ｐＭ若しくは１００～２００ｐＭのＫＤでヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に特異的に結合する、
    のうちの１つ以上を有する、請求項２５に記載の単離された抗体。
  27. 骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体であって、前記抗体が、
    （ａ）配列番号１３３のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１３２のアミノ酸配列を含むＶＬ、
    （ｂ）配列番号１３５のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１３４のアミノ酸配列を含むＶＬ、
    （ｃ）配列番号１３７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１３６のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｄ）配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＶＬ、
    を含む、骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体。
  28. 前記抗体が、以下の特性：
    （ａ）ＴＲＥＭ２のストークドメインに特異的に結合する、
    （ｂ）可溶性ＴＲＥＭ２（ｓＴＲＥＭ２）に結合しない、
    （ｃ）アミノ酸１４６～１６１（配列番号９６）又は１５１～１６５（配列番号９７）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドに、アミノ酸１３９～１５８（配列番号９２）及び／又は１５９～１７５（配列番号９４）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドよりも高い親和性で特異的に結合する、
    （ｄ）Ｈ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがるＴＲＥＭ２エピトープに特異的に結合する、
    （ｅ）野生型ＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチドと比較して（例えば、二重層干渉法によって測定される場合）、Ｄ１５２Ａ、Ｈ１５７Ａ及びＩ１５９Ａ置換を含むＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチドに対する結合親和性の低下を示す、並びに
    （ｆ）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、３７℃で１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、７ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満若しくは２ｐＭ未満、又は１０～５０ｐＭ若しくは１０～２５ｐＭのＫＤでヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に特異的に結合する、
    のうちの１つ以上を有する、請求項２７に記載の単離された抗体。
  29. 前記抗体が、以下の特徴：
    （ａ）ヒトＴＲＥＭ２を発現するＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター細胞においてルシフェラーゼレポーター活性を誘導する、
    （ｂ）血漿中のｉｎ ｖｉｖｏでのｓＴＲＥＭ２のレベルを低下させる、
    （ｃ）ヒトＴＲＥＭ２を発現するＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター細胞におけるｓＴＲＥＭ２のシェディングを阻害する、
    （ｄ）ヒトＭＤＭ細胞においてチロシンリン酸化を誘導する、
    （ｅ）ヒトＭＤＭ細胞においてＳＹＫリン酸化を誘導する、
    （ｆ）ＩＬ－３４及びＣＳＦ－１の非存在下においてヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアの生存を増強する、
    （ｇ）ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアにおけるｓＴＲＥＭ２のシェディングを阻害する、
    （ｈ）ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアにおいてＳＹＫリン酸化を誘導する、並びに
    （ｉ）ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアにおけるＡβオリゴマーの存在下での総Ａβプラーク強度及び／又は平均Ｘ０４プラーク強度（例えば、本明細書の実施例１７のアッセイに記載される）を増加させる、
    のうちの１つ以上を有する、請求項１～２８のいずれか１項に記載の抗体。
  30. 前記抗体が、オフターゲット結合アッセイ（例えば、本明細書の実施例１０に記載される）において低いオフターゲット結合スコア（例えば、１未満のスコア）を有する、請求項１～２９のいずれか１項に記載の抗体。
  31. Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又は（Ｆａｂ’）２等の抗体断片である、請求項１～３０のいずれか１項に記載の抗体。
  32. ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４抗体等のＩｇＧ抗体である、請求項１～３０のいずれか１項に記載の抗体。
  33. 前記抗体が、野生型ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含む、請求項３２に記載の抗体。
  34. 前記抗体が、（ａ）Ｎ２９７Ｇ置換、（ｂ）Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ置換（ＬＡＬＡＰＧ置換）、又は（ｃ）Ｎ２９７Ｇ、Ｍ４２８Ｌ、及びＮ４３４Ｓ置換を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む、請求項３３に記載の抗体。
  35. 前記抗体が、低下したエフェクター機能を有するか、若しくはエフェクターレスであるか、又はＦｃγＲに結合しない、請求項３３又は３４に記載の抗体。
  36. 前記抗体が、Ｎ２９７Ｇ置換を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む、請求項１～３５のいずれか１項に記載の抗体。
  37. 前記抗体が、配列番号１４４のアミノ酸配列を含む重鎖及び／又は配列番号１７６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１～３６のいずれか１項に記載の抗体。
  38. 前記抗体が、配列番号１４４のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなるが、配列番号１４４のＣ末端リジンを欠くか、若しくは配列番号１４４のＣ末端グリシン及びリジンを欠く重鎖、及び／又は配列番号１７６のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる軽鎖を含む、請求項１～３６のいずれか１項に記載の抗体。
  39. 前記抗体が、配列番号１４４のアミノ酸配列からなる重鎖及び／又は配列番号１７６のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項１～３６のいずれか１項に記載の抗体。
  40. 前記抗体が、Ｓ２２８Ｐ置換を含むか、又はＳ２２８Ｐ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ置換を含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含む、請求項３３に記載の抗体。
  41. 完全長抗体である、請求項１～３０又は３２～３６又は４０のいずれか１項に記載の抗体。
  42. 重鎖定常領域においてＣ末端リジンを欠くＩｇＧ抗体である、請求項１～３０又は３２～３６又は４０のいずれか１項に記載の抗体。
  43. 骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体であって、前記抗体が、配列番号１７のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる重鎖、及び／又は配列番号１８のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる軽鎖を含む、骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体。
  44. 骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体であって、前記抗体が、配列番号１４４のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる重鎖、及び／又は配列番号１７６のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる軽鎖を含む、骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体。
  45. 骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体であって、前記抗体が、配列番号１４４のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなるが、配列番号１４４のＣ末端リジンを欠くか、若しくは配列番号１４４のＣ末端グリシン及びリジンを欠く重鎖、及び／又は配列番号１７６のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる軽鎖を含む、骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体。
  46. 骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体であって、前記抗体が、配列番号１４４のアミノ酸配列からなる重鎖、及び／又は配列番号１７６のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体。
  47. 前記抗体が、ＴＲＥＭ２ストークドメインに特異的に結合し、可溶性ＴＲＥＭ２（ｓＴＲＥＭ２）には結合せず、前記抗体が、Ｈ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがるＴＲＥＭ２エピトープに特異的に結合し、且つ／又はアミノ酸１３９～１５８（配列番号９２）及び／若しくは１５９～１７５（配列番号９４）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドよりも高い親和性で、アミノ酸１４６～１６１（配列番号９６）若しくは１５１～１６５（配列番号９７）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドに特異的に結合する、請求項４３～４６のいずれか１項に記載の単離された抗体。
  48. 前記抗体が、ＴＲＥＭ２ストークドメインに特異的に結合し、可溶性ＴＲＥＭ２（ｓＴＲＥＭ２）に結合せず、前記抗体が、ＴＲＥＭ２アゴニストである、請求項４３～４６のいずれか１項に記載の単離された抗体。
  49. 骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体であって、前記抗体が、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記ＶＨが、配列番号１１又は１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号１２又は２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含み、さらに、前記抗体が、ＴＲＥＭ２ストークドメインに特異的に結合し、可溶性ＴＲＥＭ２（ｓＴＲＥＭ２）には結合せず、前記抗体が、ＴＲＥＭ２アゴニストであり、前記抗体が、Ｈ１５７－Ｓ１５８切断部位にまたがるＴＲＥＭ２エピトープに特異的に結合し、且つ／又はアミノ酸１３９～１５８（配列番号９２）若しくは／又は１５９～１７５（配列番号９４）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドよりも高い親和性で、アミノ酸１４６～１６１（配列番号９６）若しくは１５１～１６５（配列番号９７）からなるＴＲＥＭ２ポリペプチドに特異的に結合する、骨髄細胞－２上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合する単離された抗体。
  50. 前記抗体が、野生型ＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチドと比較して、Ｄ１５２Ａ、Ｈ１５７Ａ及びＩ１５９Ａ置換を含むＴＲＥＭ２ストークドメインポリペプチドに対する結合親和性の低下を示し（例えば、二重層干渉法によって測定される場合）、且つ／又はヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ２に、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、３７℃で１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、７ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、若しくは２ｐＭ未満、又は１０～５０ｐＭ若しくは１０～２５ｐＭのＫＤで特異的に結合する、請求項４３～４９のいずれか１項に記載の単離された抗体。
  51. 前記抗体が、以下の特徴：
    （ａ）ヒトＴＲＥＭ２を発現するＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター細胞においてルシフェラーゼレポーター活性を誘導する、
    （ｂ）血漿中のｉｎ ｖｉｖｏでのｓＴＲＥＭ２のレベルを低下させる、
    （ｃ）ヒトＴＲＥＭ２を発現するＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター細胞におけるｓＴＲＥＭ２のシェディングを阻害する、
    （ｄ）ヒトＭＤＭ細胞においてチロシンリン酸化を誘導する、
    （ｅ）ヒトＭＤＭ細胞においてＳＹＫリン酸化を誘導する、
    （ｆ）ＩＬ－３４及びＣＳＦ－１の非存在下においてヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアの生存を増強する、
    （ｇ）ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアにおけるｓＴＲＥＭ２のシェディングを阻害する、
    （ｈ）ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアにおいてＳＹＫリン酸化を誘導する、及び
    （ｉ）ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアにおけるＡβオリゴマーの存在下での総Ａβプラーク強度及び／又は平均Ｘ０４プラーク強度（例えば、本明細書の実施例１７のアッセイに記載される）を増加させる、
    のうちの１つ以上を有する、請求項４３～５０のいずれか１項に記載の単離された抗体。
  52. 前記抗体が、オフターゲット結合アッセイ（例えば、本明細書の実施例１０に記載される）において低いオフターゲット結合スコア（例えば、１未満のスコア）を有する、請求項４３～５１のいずれか１項に記載の抗体。
  53. 前記ＶＨが、配列番号１７、１３３、１３５、１３７若しくは１３９のアミノ酸配列を含むか、又は前記抗体が、配列番号１４４のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる重鎖を含む、請求項４７～５２のいずれか１項に記載の抗体。
  54. 前記抗体が、（ａ）Ｎ２９７Ｇ置換、（ｂ）Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ置換（ＬＡＬＡＰＧ置換）、又は（ｃ）Ｎ２９７Ｇ、Ｍ４２８Ｌ、及びＮ４３４Ｓ置換を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む、請求項４７～５３のいずれか１項に記載の抗体。
  55. 前記抗体が、低下したエフェクター機能を有するか、若しくはエフェクターレスであるか、又はＦｃγＲに結合しない、請求項４７～５４のいずれか１項に記載の抗体。
  56. 二重特異性抗体若しくは多重特異性抗体であるか、又は少なくとも１つの他の分子に共有結合的若しくは非共有結合的にコンジュゲートされている、請求項１～５５のいずれか１項に記載の抗体。
  57. 前記抗体が、少なくとも１つの他の分子に共有結合的又は非共有結合的にコンジュゲートされ、前記少なくとも１つの他の分子が、検出標識及び／又は薬物を含む、請求項５６に記載の抗体。
  58. 請求項１～５７のいずれか１項に記載の抗体と、薬学的に許容され得る担体と、を含む、医薬組成物。
  59. 請求項１～５７のいずれかに記載の抗体をコードする、単離された核酸又は２つ以上の核酸のセット。
  60. 請求項１～５７のいずれか１項に記載される抗体の前記重鎖及び前記軽鎖をコードする１つ以上の核酸を含む、単離されたベクター。
  61. 請求項５９に記載の核酸又は請求項６０に記載のベクターを含む、単離された宿主細胞。
  62. ＴＲＥＭ２に特異的に結合する抗体を産生する方法であって、請求項６０に記載の宿主細胞を、前記抗体の発現に適した条件下で培養することを含む、ＴＲＥＭ２に特異的に結合する抗体を産生する方法。
  63. 前記宿主細胞から前記抗体を回収することをさらに含む、請求項６２に記載の方法。
  64. 請求項６２又は６３に記載の方法によって産生される、抗体。
  65. ＴＲＥＭ２機能喪失に関連する症状を治療することを必要とする対象における、ＴＲＥＭ２機能喪失に関連する症状を治療する方法であって、請求項１～５７のいずれか１項に記載の抗体又は請求項５８に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、ＴＲＥＭ２機能喪失に関連する症状を治療する方法。
  66. ｓＴＲＥＭ２のレベルを低下させることを必要とする対象において、ｓＴＲＥＭ２のレベルを低下させる方法であって、請求項１～５７のいずれか１項に記載の抗体又は請求項５８に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、ｓＴＲＥＭ２のレベルを低下させる方法。
  67. 前記症状が、神経炎症性疾患若しくは神経変性疾患であるか、又は前記対象が、神経炎症性疾患若しくは神経変性疾患に罹患している、請求項６５又は６６に記載の方法。
  68. 前記神経炎症性疾患又は神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、前頭側頭型認知症、認知症、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ナス・ハコーラ病、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、リソソーム蓄積症、スフィンゴミエリンリピドーシス（ニーマン・ピックＣ）、ムコ多糖症ＩＩ／ＩＩＩＢ、異染性白質ジストロフィー、多巣性運動ニューロパチー、神経ベーチェット病、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、視神経炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、脳卒中、横断性脊髄炎、外傷性脳損傷、又は脊髄損傷である、請求項６７に記載の方法。
  69. 前記疾患がアルツハイマー病である、請求項６８に記載の方法。
  70. 前記疾患がＭＳである、請求項６８に記載の方法。
  71. ＴＲＥＭ２機能喪失に関連する症状の治療を必要とする対象における、ＴＲＥＭ２機能喪失に関連する症状の治療において使用するための、請求項１～５７のいずれか１項に記載の抗体又は請求項５８に記載の医薬組成物。
  72. ｓＴＲＥＭ２のレベルを低下させることを必要とする対象において、ｓＴＲＥＭ２のレベルを低下させるのに使用するための、請求項１～５７のいずれか１項に記載の抗体又は請求項５８に記載の医薬組成物。
  73. 前記症状が、神経炎症性疾患若しくは神経変性疾患であるか、又は前記対象が、神経炎症性疾患若しくは神経変性疾患に罹患している、請求項７１又は７２に記載の使用のための抗体。
  74. 前記神経炎症性疾患又は神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、前頭側頭型認知症、認知症、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ナス・ハコーラ病、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、リソソーム蓄積症、スフィンゴミエリンリピドーシス（ニーマン・ピックＣ）、ムコ多糖症ＩＩ／ＩＩＩＢ、異染性白質ジストロフィー、多巣性運動ニューロパチー、神経ベーチェット病、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、視神経炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、脳卒中、横断性脊髄炎、外傷性脳損傷、又は脊髄損傷である、請求項７３に記載の使用のための抗体。
  75. 前記疾患がアルツハイマー病である、請求項７４に記載の使用のための抗体。
  76. 前記疾患がＭＳである、請求項７４に記載の使用のための抗体。
  77. ＴＲＥＭ２機能喪失に関連する症状の治療を必要とする対象における、ＴＲＥＭ２機能喪失に関連する症状を治療するための医薬の調製における、請求項１～５７のいずれか１項に記載の抗体又は請求項５８に記載の医薬組成物の使用。
  78. ｓＴＲＥＭ２のレベルを低下させることを必要とする対象において、ｓＴＲＥＭ２のレベルを低下させるための医薬の調製における、請求項１～５７のいずれか１項に記載の抗体又は請求項５８に記載の医薬組成物の使用。
  79. 前記症状が、神経炎症性疾患若しくは神経変性疾患であるか、又は前記対象が、神経炎症性疾患若しくは神経変性疾患に罹患している、請求項７７又は７８に記載の使用。
  80. 前記神経炎症性疾患又は神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、前頭側頭型認知症、認知症、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ナス・ハコーラ病、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、リソソーム蓄積症、スフィンゴミエリンリピドーシス（ニーマン・ピックＣ）、ムコ多糖症ＩＩ／ＩＩＩＢ、異染性白質ジストロフィー、多巣性運動ニューロパチー、神経ベーチェット病、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、視神経炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、脳卒中、横断性脊髄炎、外傷性脳損傷、又は脊髄損傷である、請求項７９に記載の使用。
  81. 前記疾患がアルツハイマー病である、請求項８０に記載の使用。
  82. 前記疾患がＭＳである、請求項８０に記載の使用。
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