EP2496602A1 - Anticorps chimerique anti ricine - Google Patents
Anticorps chimerique anti ricineInfo
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Abstract
La présente invention a pour objet un anticorps monoclonal chimérique dirigé contre la ricine, dans lequel la chaîne légère et la chaîne lourde sont telles que: la région constante de la chaîne légère et la région constante de la chaîne lourde sont essentiellement constituées respectivement de la région constante de la chaîne légère et la région constante de la chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine, la région variable de la chaîne légère et la région variable de la chaîne lourde comprennent respectivement la région variable de la chaîne légère et la région variable de la chaîne lourde d'une immunoglobuline de macaque, ledit anticorps monoclonal n'induisant substantiellement pas de réponse immune anti anticorps chimériques.
Description
ANTICORPS CHIMERIQUE ANTI RICINE
La présente invention concerne un anticorps chimérique dirigé contre la Ricine. La ricine est une toxalbumine produite par un arbrisseau de la famille des euphorbiacées, le Ricin {Ricinus communis). La ricine est une glycoprotéine très toxique de poids moléculaire 66 000 Da, formée de deux chaînes polypeptidiques A et B, reliées entre elles par un pont disulfure. La chaîne B permet à la toxine de se fixer à la paroi cellulaire et la chaîne A, responsable des propriétés toxiques, est capable d'inhiber la synthèse des protéines en inhibant TARN ribosomal 28S, entraînant la mort cellulaire. Elle est présente à une concentration variant de 1 à 10 % dans la graine de Ricin. Elle peut être extraite de l'huile de ricin incomplètement purifiée.
La ricine est une toxine excessivement toxique. Cependant sa toxicité varie selon son mode de pénétration dans l'organisme.
Lorsque la ricine est absorbée par voie digestive, elle est en grande partie détruite par les enzymes digestives protéolytiques mais son absorption perlinguale peut augmenter la quantité absorbée.
Par contre, lorsque la ricine est inhalée (voie pulmonaire) ou administrée par voie parentérale sa toxicité est multipliée par 1000.
Les symptômes sont peu spécifiques et divergent selon la voie d'absorption de la ricine. Ils se manifestent généralement en l'espace de 2 à 24 heures et rarement au-delà de deux jours.
L'absorption par ingestion provoque des vomissements, des malaises, des douleurs abdominales, des diarrhées sanglantes (selles semblables à de l'eau de riz), un besoin douloureux de déféquer ou d'uriner (anurie), la déshydratation, la somnolence, une faiblesse musculaire, des crampes, une paralysie vasomotrice, et la tachycardie. L'absorption par inhalation provoque un affaiblissement, de la fièvre, des vertiges, de la dyspnée, de la toux, des œdèmes pulmonaires, des douleurs dans les membres.
Après une apparente amélioration, l'infection peut avoir une issue mortelle.
Chez l'homme, la dose estimée létale de ricine est de 1 à 10 μg/kg.
Au vu de ces symptômes variés et la dangerosité à très faible dose de la ricine, il existe un réel besoin de se protéger contre la contamination par la ricine, et notamment lors d'une éventuelle utilisation dans le cadre d'attaques bio-terroristes.
Un test de diagnostic rapide de l'intoxication par la ricine par voie pulmonaire a récemment été développé (Guglielmo-Viret et al. 2007). Après une exposition à la ricine, les antidotes suivants peuvent être utilisés : analogues de sucre empêchant la liaison de la ricine à sa cible ou inhibiteurs de la sous-unité catalytique tels que Fazidothymidine.
Une autre stratégie pour le traitement d'une intoxication à la ricine pourrait être la vaccination. Par exemple, des anticorps ont été développés dans le but d'interférer avec la liaison de la toxine de la maladie du charbon aux récepteurs de surface cellulaire ou dans le but d'inhiber l'assemblage de la toxine. Cependant, à l'heure actuelle, aucune thérapie spécifique de la ricine n'est proposée.
Wang et al. (Wang et al, 2007, Biotechnol Lett 29 : 1811-1816) ont récemment développé un anticorps chimérique homme/souris dirigé contre la ricine. Cependant, cet anticorps chimérique de première génération, bien que spécifique de la ricine, est capable d'induire une réaction immune anti anticorps chimériques (HACA « human anti chimeric antibody ») et d'induire une faible tolérance chez le patient.
La demande internationale WO 2009/053637 décrit des fragments des régions constantes simple chaîne (scFv) d'anticorps issus de macaque capables de neutraliser efficacement la ricine, ainsi que des fragments scFv humanisés ou super humanisés.
Cependant, de tels fragments sont de petite taille, ont une demie vie très courte et sont rapidement éliminés par les reins et ne sont pas capables de fournir une protection à long terme. De plus, du fait de l'absence de région constante, ces fragments ont une faible efficacité de stimulation du système immunitaire (recrutement des effecteurs de l'immunité).
Aussi, il existe un réel besoin de fournir des anticorps spécifiques de la ricine qui soient stables après administration et qui possèdent un taux de neutralisation de la toxine très important.
Il est également important de fournir des anticorps qui, lorsqu'ils sont administrés, ne favorisent pas une réponse immunitaire de type HACA de l'hôte.
Aussi, l'invention a pour objet de fournir des anticorps neutralisants de la ricine.
L'invention a également pour objet de fournir des moyens de production de ces anticorps spécifiques de la ricine.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation de ces anticorps en tant que médicaments ou agents de décontamination lors d'une contamination par la ricine.
L'invention concerne un anticorps monoclonal chimérique dirigé contre la ricine, dans lequel la chaîne légère et la chaîne lourde sont telles que :
• la région constante de la chaîne légère est essentiellement constituée de la région constante de la chaîne légère d'une immunoglobuline humaine,
• la région constante de la chaîne lourde est essentiellement constituée de la région constante de la chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine,
• la région variable de la chaîne légère comprend la région variable de la chaîne légère d'une immunoglobuline de macaque, et
• la région variable de la chaîne lourde comprend la région variable de la chaîne lourde d'une immunoglobuline de macaque,
ledit anticorps monoclonal n'induisant substantiellement pas de réponse immune anti anticorps chimériques.
L'invention repose sur la constatation faite par les Inventeurs que des anticorps chimériques macaques/humains de l'invention montrent une amélioration de la neutralisation de la ricine, par rapport aux anticorps ou fragments d'anticorps de l'art antérieur, et que lesdits anticorps sont similaires aux anticorps humains donc ne devraient pas provoquer pas de réponse immune de type anticorps anti anticorps chimériques.
Dans l'invention, le terme « anticorps » se réfère à une immunoglobuline, protéine multimérique constituée de 4 chaînes participant à la réponse immunitaire acquise.
Les immunoglobulines sont bien connues de l'homme de métier et sont constituées d'un assemblage de deux dimères constitués chacun d'une chaîne lourde et d'une chaîne légère. Le complexe multimérique assemblé par la liaison d'une chaîne légère et d'une chaîne lourde par un pont disulfure entre deux cystéines, les deux chaînes lourdes étant elle-même également reliées entre elles par deux ponts disulfure.
Chacune des chaînes lourdes et des chaînes légères est constituée d'une région constante et d'une région variable. L'assemblage des chaînes qui composent un anticorps permet de définir une structure tridimensionnelle caractéristique en Y, où
la base du Y correspond à la région constante Fc qui est reconnue par le complément et les récepteurs Fc, et
l'extrémité des bras du Y correspondent à l'assemblage respectif des régions variables de la chaîne légère et variable de la chaîne lourde.
Plus précisément, chaque chaîne légère est constituée d'une région variable (VL) et d'une région constante (CL). Chaque chaîne lourde est constituée d'une région variable (VH) et d'une région constante constituée de trois domaines constants Cm, Cm et C - Les domaines Cm et C composent le domaine Fc.
La structure d'un anticorps est représentée schématiquement dans la figure 1.
La région variable de la chaîne légère est constituée de trois domaines déterminant la reconnaissance de l'antigène (CDR) entourées de quatre domaines charpentes. Le repliement tridimensionnel de la région variable est tel que les 3 CDR sont exposés du même coté de la protéine et permettent la formation d'une structure spécifique reconnaissant un antigène déterminé.
La structure en collier de perle d'une région variable d'une chaîne légère ou lourde d'un anticorps est représentée dans la figure 2. Les anticorps décrits dans l'invention sont isolés et purifiés, et sont différents des anticorps naturels du fait qu'ils sont chimériques. Ces anticorps sont matures, c'est-à-dire qu'ils possèdent une structure tridimensionnelle ad hoc leur permettant de reconnaître l'antigène, et possèdent toutes les modifications post-traductionnelles essentielles à leur reconnaissance antigénique.
II s'agit d'anticorps monoclonaux, c'est-à-dire qu'ils ne reconnaissent qu'un seul déterminant antigénique dans la ricine, contrairement aux anticorps polyclonaux qui correspondent à un mélange d'anticorps monoclonaux, et donc peuvent reconnaître plusieurs déterminants antigéniques dans une même protéine. Par « anticorps monoclonal chimérique », on entend dans l'invention un anticorps isolé, dans lequel la séquence de chaque chaîne légère et/ou de chaque chaîne lourde qui le constitue comprend ou consiste en une séquence hybride issue d'au moins deux animaux distincts. Notamment les anticorps chimériques de l'invention sont des hybrides homme/macaque, ce qui signifie qu'une région de la séquence des chaînes légères et des chaînes lourdes est issue de la séquence d'une immunoglobuline de macaque, et que le reste de la séquence desdites chaînes lourdes et des dites chaînes légères est issue de la séquence d'une, ou éventuellement plusieurs, immunoglobuline humaine.
« La région constante de la chaîne légère est essentiellement constituée de la région constante de la chaîne légère d'une immunoglobuline humaine » signifie que la région constante de la chaîne légère peut être constituée de la séquence de la région constante d'une chaîne légère d'une immunoglobuline humaine, mais peut également être constituée d'une séquence correspondant à la fusion de plusieurs séquences de plusieurs régions constantes de plusieurs immunoglobulines humaines. En d'autres termes, la région constante de la chaîne légère peut être constituée d'une séquence correspondant à une mosaïque de séquences de régions constantes de chaînes légères, sous réserve que ladite séquence mosaïque reconstitue une séquence d'une région constante d'une chaîne légère.
« La région constante de la chaîne lourde est essentiellement constituée de la région constante de la chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine » signifie que la région constante de la chaîne lourde peut être constituée de la séquence de la région constante d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine, mais peut également être constituée d'une séquence correspondant à la fusion de plusieurs séquences de plusieurs régions constantes de plusieurs immunoglobulines humaines. En d'autres termes, la région constante de la chaîne lourde peut être constituée d'une séquence correspondant à une mosaïque de séquences de régions constantes de chaînes lourdes, sous réserve que ladite séquence mosaïque reconstitue une séquence d'une région constante d'une chaîne lourde.
« La région variable de la chaîne légère comprend la région variable de la chaîne légère d'une immunoglobuline de macaque » signifie que la séquence de la région variable de la chaîne légère correspond à la séquence de la région variable d'une chaîne légère d'une immunoglobuline de macaque. Cette région variable de la chaîne légère peut être fusionnée dans sa région N-terminale, à la région C-terminale d'une séquence permettant l'excrétion de l'anticorps. Cette séquence permettant l'excrétion de l'anticorps est appelée peptide signal ou séquence leader.
« La région variable de la chaîne lourde comprend la région variable de la chaîne lourde d'une immunoglobuline de macaque » signifie que la séquence de la région variable de la chaîne lourde correspond à la séquence de la région variable d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline de macaque. Cette région variable de la chaîne lourde peut être fusionnée dans sa région N-terminale, à la région C-terminale d'une séquence permettant l'excrétion de l'anticorps.
Ainsi la définition de l'anticorps monoclonal de l'invention couvre à la fois :
le précurseur de l'anticorps chimérique homme/macaque tel que défini ci-dessus, et l'anticorps chimérique homme/macaque défini ci-dessus.
Dans la cellule productrice de l'anticorps monoclonal de l'invention, ledit anticorps monoclonal anti ricine est produit sous forme d'un précurseur. Ce précurseur possède donc dans la région N-terminale de la chaîne légère et de la chaîne lourde une séquence leader, ou peptide signal. Ce précurseur subit alors diverses étapes de maturation, et en particulier les séquences leader sont clivées pour permettre la sécrétion de l'anticorps dans le milieu extracellulaire. L'anticorps sécrété est donc un anticorps mature.
Les anticorps monoclonaux de l'invention « n'induisent substantiellement pas de réponse immune anti anticorps chimériques ». Cela signifie que lorsque les anticorps monoclonaux de l'invention sont administrés à un individu, notamment humain, le système immunitaire dudit individu n'est substantiellement pas ou peu stimulé, et donc ledit individu ne produit pas d'anticorps dirigés contre les anticorps de l'invention. Un mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un anticorps monoclonal tel que défini précédemment capable de neutraliser la ricine in vitro et in vivo, et notamment présentant un taux de neutralisation de la ricine supérieur au taux de neutralisation d'un fragment scFv dirigé contre la ricine.
Les Inventeurs ont montré que l'anticorps selon l'invention est capable d'inhiber la ricine, de manière plus efficace, à une plus faible dose, qu'un fragment simple chaîne d'une immunoglobuline (scFv), et notamment un fragment scFv chimérique homme macaque tel que défini dans l'invention
Un mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un anticorps monoclonal tel que défini précédemment, capable de neutraliser la ricine, et notamment présentant un taux de neutralisation de la ricine d'au moins 40%, 50 %, 60%, 70%> et préférentiellement d'au moins 80%.
Les anticorps monoclonaux de l'invention sont « capables de neutraliser la ricine ». Cela signifie que les anticorps monoclonaux selon l'invention sont capables d'empêcher l'action de la ricine, ou en d'autres termes d'inhiber l'effet toxique de la ricine sur la sous unité 28S des ribosomes. Cette inhibition est due à une séquestration de la ricine, ou à un masquage du ou des domaines de la ricine responsable de son effet toxique.
Par conséquent, les anticorps monoclonaux de l'invention neutralisent l'effet toxique de la ricine.
L'activité de neutralisation des anticorps peut être mesurée à l'aide de protocole de routine couramment utilisé par l'homme de métier. Parmi ces tests, on peut citer le test de neutralisation basé sur la survie cellulaire.
Dans ce test, on mesure la capacité qu'ont les anticorps de l'invention à protéger de la mort les cellules J774A.1 mises en contact avec de la Ricine.
Brièvement, les cellules J774A.1 (ATCC-LGC, Molsheim,France) sont ensemencées à une densité de 14,000 cellules/puits (200 μΐ/puits), dans une plaque de culture et cultivées à 37°C en présence de 5% de C02 pendant 24 heures dans du DMEM complémenté avec 10% de sérum de veau fœtal. Les anticorps de l'invention sont incubés avec 480 ng/ml de ricine ou avec du sérum contrôle (anticorps non relevant) pendant 1 heure. Le mélange est ensuite ajouté aux cellules. 24 heures après, la viabilité cellulaire est mesurée par des techniques connues de l'homme de métier (exclusion au bleu Trypan, Cytox (Promega), mesure de l'apoptose...). Chaque test est corrigé par rapport aux contrôles « 100% de viabilité » cellulaire (pas de ricine et pas d'anticorps) et « 0% viabilité » (ricine sans anticorps).
Un autre test peut être utilisé pour mesure l'activité neutralisante des anticorps monoclonaux de l'invention, il s'agit de mesurer l'inhibition de la traduction protéique. Pour cela on mesure la traduction d'une protéine marqueur, par exemple la traduction de la luciférase, dans un système de traduction in vitro acellulaire [Haie ML Pharmacol Toxicol 2001, 88(5):255-260]. Brièvement, le test de mesure de la traduction de l'AR message de la luciférase est le suivant :
Les anticorps monoclonaux sont déposés dans des plaques 96 puits dans du tampon phosphate salin (PB S) et de la ricine est ajoutée à une concentration finale de 4mM. Du lysat de réticulocyte de lapin complémenté de RNAsin ®, des acides aminés et de l'ARN messager de la luciférase est alors ajouté dans chaque puits. La réaction est réalisée pendant lh30.
5 μΐ^ de la reaction sont alors prélevés et ajouté à 45 μΐ^ de tampon réactionnel permettant de détecter l'activité luciférase (Luciférase assay reagent, Promega, Inc.). La lumière émise (luminescence) est mesurée en compte par seconde (CPS) à l'aide d'un lecteur multiplaque Victor (PerkinElmer Wallac, Boston MA). Les données sont exprimées en pourcentage par rapport au contrôle (% contrôle= (CPS traité/ CPS contrôle) xl00)).
Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un anticorps monoclonal défini précédemment, dans lequel :
• la région constante de la chaîne légère comprend ou consiste en la région constante de la chaîne légère d'une immunoglobuline humaine de type IgGl, et
• la région constante de la chaîne lourde comprend ou consiste en la région constante de la chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine de type IgGl
ladite chaîne légère d'une immunoglobuline humaine de type IgGl et ladite chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine de type IgGl étant notamment la région constante d'une chaîne légère et la région constante d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine obtenue par immunisation avec l'antigène Rhésus D.
Ainsi, l'anticorps monoclonal de l'invention est non seulement capable de neutraliser la ricine par l'intermédiaire de ses régions variables, mais également de faciliter la dégradation de la ricine en favorisant sa dégradation par les macrophages.
Plus particulièrement les régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes de l'anticorps monoclonal de l'invention sont issues des IgGl d'un individu immunisé avec un antigène Rhésus D. Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, l'anticorps monoclonal décrit ci-dessus et ci-après possède une chaîne légère, et notamment une région constante de ladite chaîne légère de type kappa (κ).
Dans autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un anticorps monoclonal dirigé contre la ricine précédemment décrit, dans lequel :
• la chaîne légère dudit anticorps monoclonal comprend au moins les régions de complémentarité déterminante (CDRLm) de la région variable d'une chaîne légère d'une immunoglobuline de macaque, et
· la chaîne lourde dudit anticorps monoclonal comprend au moins les régions de complémentarité déterminante (CDRnm) de la région variable d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline de macaque.
L'anticorps monoclonal de l'invention comprend donc, dans la région variable de la chaîne légère, au moins les 3 CDR d'une immunoglobuline de macaque, le reste de la région variable de la chaîne légère pouvant être issue de macaque ou de toute autre espèce de mammifère et notamment d'humain.
L'anticorps monoclonal de l'invention comprend donc, dans la région variable de la chaîne lourde, au moins les 3 CDR d'une immunoglobuline de macaque, le reste de la région variable de la chaîne lourde pouvant être issue de macaque ou de toute autre espèce de mammifère et notamment d'humain.
Lorsque l'anticorps monoclonal ne possède dans la région variable de la chaîne légère que les CDR de la chaîne légère d'une immunoglobuline de macaque, et ne possède dans la région variable de la chaîne lourde que les CDR de la chaîne lourde d'une immunoglobuline de
macaque, et que tout le reste des deux régions variables est issu d'une immunoglobuline humaine, l'anticorps est alors appelé anticorps chimérique humanisé.
Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un anticorps monoclonal défini ci-dessus, dans lequel :
• la région variable de la chaîne légère dudit anticorps monoclonal comprend ou est constitué de la séquence SEQ ID NO 2 suivantes :
Nter-ELQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRSYLAWYQQKPGKAPKLLIYDAAHL QSGVPSRFSGSGSGTEFSLTISSLQPEDFAVYYCQQRNSYPLTFGGGTKVEIK-Cter (SEQ ID NO 2), et
• la région variable de la chaîne lourde dudit anticorps monoclonal comprend ou est constitué de la séquence SEQ ID NO 4 suivantes :
Nter-QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMDWVRQAPGKGLEWVSRISP GGDVTWYADSVKGRFTISRDNAQNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARDDIVVSRIFDD WGQGVLVTVSS-Cter (SEQ ID NO 4).
Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un anticorps monoclonal défini ci-dessus, dans lequel :
• la région variable de la chaîne légère dudit anticorps monoclonal est constitué de la séquence SEQ ID NO 2 suivante :
Nter-ELQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRSYLAWYQQKPGKAPKLLIYDAAHL QSGVPSRFSGSGSGTEFSLTISSLQPEDFAVYYCQQRNSYPLTFGGGTKVEIK-Cter (SEQ ID NO 2), et
• la région variable de la chaîne lourde dudit anticorps monoclonal est constitué de la séquence SEQ ID NO 4 suivante :
Nter-QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMDWVRQAPGKGLEWVSRISP GGDVTWYADSVKGRFTISRDNAQNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARDDIVVSRIFDD WGQGVLVTVSS-Cter (SEQ ID NO 4). RI A S
Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un anticorps monoclonal tel que défini précédemment comprenant :
• une chaîne légère comprenant ou consistant en la séquence SEQ ID NO 6 suivante :
Nter-ELQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRSYLAWYQQKPGKAPKLLIYDAAHL QSGVPSRFSGSGSGTEFSLTISSLQPEDFAVYYCQQRNSYPLTFGGGTKVEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKD STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC-Cter, et
• une chaîne lourde comprenant ou consistant en la séquence SEQ ID NO 8 suivante : Nter-QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMDWVRQAPGKGLEWVSRISP GGDVTWYADSVKGRFTISRDNAQNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARDDIVVSRIFDD WGQGVLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK VEPKSCD KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK-Cter
REV7
L'invention concerne également un anticorps monoclonal dirigé contre la ricine tel que défini ci-dessus, dans lequel :
• la chaîne légère dudit anticorps monoclonal comprend la région leader de la région variable d'une chaîne légère d'une immunoglobuline humaine (LVn ,
• la chaîne lourde dudit anticorps monoclonal comprend la région leader de la région variable d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine (LVia).
Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un anticorps monoclonal dirigé contre la ricine tel que défini précédemment, dans lequel :
• la région variable de la chaîne légère comprend, dans sa région N-terminale, une séquence signal, notamment la région leader de la région variable de la chaîne légère d'une seconde immunoglobuline, en particulier humaine, et
• la région variable de la chaîne lourde comprend, dans sa région N-terminale, une séquence signal, notamment la région leader de la région variable de la chaîne lourde d'une troisième immunoglobuline, en particulier humaine,
la seconde et la troisième immunoglobuline étant identiques ou différentes.
Comme mentionné précédemment la région leader, ou peptide signal, qui se trouve dans la région N-terminale de la région variable de la chaîne légère et de la chaîne lourde correspond à une séquence protéique de sécrétion. Au cours de la synthèse protéique de la chaîne légère et de la chaîne lourde, ladite séquence leader signifie que la protéine en cours de synthèse doit rester dans la lumière du réticulum endoplasmique rugueux (RER). Cette séquence est ensuite éliminée de la chaîne légère mature et de la chaîne lourde mature, de telle sorte que l'anticorps monoclonal mature capable d'interagir avec la ricine ne possède plus cette séquence. De plus, l'invention concerne un précurseur d'un anticorps monoclonal susmentionné, dans lequel :
• la région leader LVLII comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO 17 suivante Nter-MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC-Cter, et
• La région leader LVia comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO 18 suivante
Nter-MKHLWFFLLLVAAPRWVLS- Cter..
Dans un autre mode de réalisation préféré, l'invention concerne un précurseur de l'anticorps monoclonal précédemment décrit, dans lequel :
· la région variable de la chaîne légère dudit anticorps monoclonal comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO 10 suivante :
Nter-MDMRVPAOLLGLLLLWLPGARCELOMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASOSIRSY LAWYQQKPGKAPKLLIYDAAHLQSGVPSRFSGSGSGTEFSLTISSLQPEDFAVYYCQQ RNSYPLTFGGGTKVEIK-Cter, et
· la région variable de la chaîne lourde dudit anticorps monoclonal comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO 12 suivante :
Nter-rnkhlwfflllvaaprwylsOVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMDWVROA PGKGLEWVSRISPGGDVTWYADSVKGRFTISRDNAQNTLYLQMNSLRAEDTAVYFC ARDDIVVSRIFDDWGQGVLVTVSS-Cter.
Dans les séquences susmentionnées (les séquences SEQ ID NO 10 et SEQ ID NO 12), les acides aminés soulignés dont le symbole en codification « une lettre » est en minuscule correspondent aux acides aminés de la séquence leader. Les acides aminés dont le symbole en codification « une lettre » est en majuscule correspondent à la région variable.
L'invention concerne, dans un mode de réalisation avantageux, un anticorps monoclonal défini précédemment comprenant :
• une chaîne légère consistant en la séquence SEQ ID NO 14 suivante :
Nter-MDMRVPAOLLGLLLLWLPGARCELOMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASOSIRSY LAWYQQKPGKAPKLLIYDAAHLQSGVPSRFSGSGSGTEFSLTISSLQPEDFAVYYCQQ RNSYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPV TKSFNRGEC-Cter, et
• une chaîne lourde consistant en la séquence SEQ ID NO 16 suivante :
Nter-MKHLWFFLLLVAAPRWVLSOVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFTDYY MDWVRQAPGKGLEWVSRISPGGDVTWYADSVKGRFTISRDNAQNTLYLQMNSLRA EDTAVYFCARDDIVVSRIFDDWGQGVLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN VNHKP SNTKVDK VEPKS CDKTHTCPPCP APELLGGP S VFLFPPKPKDTLMI SRTPE V TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK-Cter
L'invention concerne également la chaîne légère de l'anticorps monoclonal défini ci dessus, et notamment comprenant la séquence SEQ ID NO 6, et plus précisément consistant en la séquence SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 14.
L'invention concerne également la chaîne lourde définie ci-dessus, et notamment comprenant la séquence SEQ ID NO 8, et plus précisément consistant en la séquence SEQ ID NO 8 ou SEQ ID NO 16.
L'invention concerne également un fragment de l'anticorps monoclonal tel que défini ci- dessus, ledit fragment étant un fragment Fab ou F(ab)'2.
Les fragments de type scFv sont exclus de l'invention.
Ainsi, les fragments Fab et F(ab)'2 sont donc constitués :
pour le Fab : d'une chaîne légère comprenant une région constante d'une chaîne légère d'une immunoglobuline humaine et d'une région variable d'une immunoglobuline de macaque, et d'une chaîne lourde comprenant une région constante d'une chaîne lourde
d'une immunoglobuline humaine et d'une région variable d'une immunoglobuline de macaque,
- pour le F(ab)'2, de l'association par un pont disulfure de deux Fab décrits ci-dessus. L'invention a également pour objet un acide nucléique comprenant une séquence codant la chaîne légère de l'anticorps monoclonal défini précédemment, notamment comprenant la séquence SEQ ID NO 1 ou 5
Ainsi, dans l'invention les séquences d'acides nucléiques sont telles que la séquence SEQ ID NO 1 code pour la protéine SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3 code pour la protéine SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 code pour la protéine SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7 code pour la protéine SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9 code pour la protéine SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11 code pour la protéine SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13 code pour la protéine SEQ ID NO 14 et SEQ ID NO 15 code pour la protéine SEQ ID NO 16.
L'invention a également pour objet un acide nucléique comprenant ou constitué d'une séquence codant la chaîne légère de l'anticorps monoclonal défini précédemment, notamment comprenant la séquence SEQ ID NO 9 ou 13.
Un autre mode de réalisation avantageux concerne un acide nucléique comprenant ou constitué d'une séquence codant la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal tel que défini précédemment, notamment comprenant la séquence SEQ ID 7.
Un autre mode de réalisation avantageux concerne un acide nucléique comprenant ou constitué d'une séquence codant la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal tel que défini précédemment, notamment comprenant la séquence SEQ ID 15.
Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un acide nucléique tel que défini précédemment, comprenant :
• un acide nucléique, codant la chaîne légère de l'anticorps monoclonal défini ci- dessus, comprenant ou constitué d'une séquence choisie parmi les acides nucléiques SEQ ID NO 1, 5, 9 et 13, et/ou
• un acide nucléique, codant la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal défini ci- dessus, comprenant ou constitué d'une séquence choisie parmi les acides nucléiques SEQ ID NO 3, 7, 11 et 15.
Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un acide nucléique comprenant ou constitué d'une séquence codant la chaîne légère de l'anticorps monoclonal défini précédemment, notamment comprenant ou constitué de l'une quelconque des séquences SEQ ID NO 1, 5, 9 ou 13.
Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un acide nucléique comprenant une séquence codant la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal défini précédemment, notamment comprenant ou constitué de l'une quelconque des séquences SEQ ID N0 3, 7, 11 ou 15.
Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un acide nucléique tel que défini précédemment, comprenant :
• un acide nucléique comprenant ou constitué d'une séquence choisie parmi les acides nucléiques SEQ ID NO 1, 5, 9 et 13, et
« un acide nucléique comprenant ou constitué d'une séquence choisie parmi les acides nucléiques SEQ ID NO 3, 7, 11 et 15.
Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un acide nucléique tel que défini précédemment, comprenant :
· un acide nucléique comprenant ou constitué de la séquence SEQ ID NO 5 ou 13, et
• un acide nucléique comprenant ou constitué de la séquence SEQ ID NO 7 ou 15. Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un acide nucléique tel que défini précédemment, comprenant :
• un acide nucléique comprenant ou constitué de la séquence SEQ ID NO 13, et · un acide nucléique comprenant ou constitué de la séquence SEQ ID NO 15.
Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un acide nucléique comprenant une séquence codant la chaîne légère de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus et comprenant une séquence codant la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal défini ci- dessus.
En d'autres termes, la séquence susmentionnée comprend, dans la même molécule, ou plus particulièrement sur le même brin, une séquence codant la chaîne légère de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus suivie d'une séquence codant la chaîne lourde de l'anticorps
monoclonal défini ci-dessus. Cela signifie également que la séquence susmentionnée comprend, dans la même molécule, une séquence codant la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus suivie d'une séquence codant la chaîne légère de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus.
L'invention concerne aussi un vecteur d'expression comprenant au moins un acide nucléique défini précédemment, ledit acide nucléique étant sous contrôle des éléments permettant son expression.
Par « vecteur d'expression », il est défini dans l'invention une molécule d'ADN qui possède des éléments permettant sa réplication (duplication) dans au moins un organisme vivant. Ces éléments permettant la réplication sont notamment des origines de réplication de levure ou de bactéries, ou encore des éléments de contrôle de la réplication d'un virus.
Les vecteurs selon l'invention sont notamment des plasmides, des phages, des chromosomes artificiels de levure (YAC), des chromosomes artificiels de bactéries (BAC), les génomes modifiés de virus réplicatifs ou de virus intégratifs ...
Ces vecteurs sont dits « d'expression » car ils disposent de séquences nucléotidiques qui permettent l'expression, c'est-à-dire la transcription en ARN, des séquences nucléotidiques qu'elles contrôlent.
Dans l'invention, ladite séquence d'acide nucléique contenue dans ledit vecteur est placée « sous contrôle des éléments permettant son expression ». Cela signifie que ledit vecteur d'expression possède au moins une séquence d'initiation de la transcription tel qu'un promoteur d'un virus comme le promoteur précoce du virus simien SV40, ou du Cytomégalovirus (CMV) ou encore les séquences promotrices du virus du sarcome de Rous (RSV), et notamment une séquence ou promoteur comprenant une boite TATAA. De plus, ledit vecteur possède également au moins une séquence de terminaison de la transcription, et en particulier une séquence de polyadénylation issues d'un gène de mammifère, notamment humain.
A ces séquences indispensables pour l'expression de la séquence nucléotidique contenue dans ledit vecteur peuvent s'ajouter d'autres séquences permettant de réguler ou de moduler l'expression de la dite séquence. Une liste non exhaustive comprend : des introns de gènes de mammifères, et notamment humains, des séquences de régulation de transcription de type amplificateur (« enhancers ») ou encore des séquences transcrites mais non traduites de gènes de mammifères, et notamment humains.
Un mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un vecteur d'expression tel que défini ci-dessus, comprenant au moins un acide nucléique choisi parmi les acides nucléiques comprenant les séquences suivantes SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 et 15.
Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un ensemble comprenant deux vecteurs d'expression,
le premier vecteur d'expression comprenant un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi les acides nucléiques SEQ ID NO 1, 5, 9 et 13, et
le second vecteur d'expression comprenant un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi les acides nucléiques SEQ ID NO 3, 7, 11 et 15.
Un autre mode réalisation avantageux de l'invention concerne un ensemble comprenant deux vecteurs d'expression susmentionnés, dans lequel
le premier vecteur d'expression comprenant un acide nucléique comprenant la séquence SEQ ID NO 13, et
le second vecteur d'expression comprenant un acide nucléique comprenant la séquence SEQ ID NO 15. Un autre mode réalisation avantageux de l'invention concerne un vecteur d'expression susmentionné, comprenant
• un premier acide nucléique choisi parmi les acides nucléiques de séquences suivantes : SEQ ID NO 1, 5, 9 et 13, ledit premier acide nucléique étant sous contrôle des éléments permettant son expression, et
· un second acide nucléique choisi parmi les acides nucléiques de séquences suivantes : SEQ ID NO 3, 7, 11 et 15, ledit second acide nucléique étant sous contrôle des éléments permettant son expression.
Un autre mode réalisation avantageux de l'invention concerne un vecteur d'expression susmentionné, comprenant
• un premier acide nucléique comprenant ou constitué de la séquence SEQ ID NO 13, ledit premier acide nucléique étant sous contrôle des éléments permettant son expression, et
• un second acide nucléique comprenant ou constitué de la séquence SEQ ID NO 15, ledit second acide nucléique étant sous contrôle des éléments permettant son expression.
Ce vecteur d'expression comporte donc deux séquences d'acides nucléiques susmentionnées, et plus particulièrement comporte une séquence d'acide nucléique codant la chaîne légère de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus, et une séquence d'acide nucléique codant la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus.
Préférentiellement, ledit vecteur d'expression contient un premier élément permettant l'expression de la séquence d'acide nucléique codant la chaîne légère de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus et un second élément permettant l'expression de la séquence d'acide nucléique codant la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus, ledit premier et ledit second élément permettant l'expression desdites séquences d'acides nucléiques étant identiques ou différents, et préférentiellement identiques. Ces éléments de contrôle sont notamment les séquences terminales longues répétées (LTR) du virus RSV.
Un autre mode de réalisation de l'invention concerne un vecteur d'expression défini ci dessus, comprenant au moins un gène de résistance à un antibiotique.
Par « au moins un gène de résistance » on entend dans l'invention que ledit vecteur d'expression peut contenir 1 ou 2, ou 3 ou 4 ou 5 ou 6 gènes de résistance à un antibiotique. Par « gène de résistance à un antibiotique », on définit dans l'invention un gène dont le produit d'expression exerce un effet cytostatique (inhibition de la croissance) ou cytolytique (mort cellulaire) de cellules. Les antibiotiques concernés par l'invention ont notamment un effet sur les cellules procaryotes, mais peuvent également avoir un effet sur les cellules eucaryotes, qu'il s'agisse de levures, de plantes, d'insectes, d'amphibiens ou de mammifères. Plus particulièrement, le vecteur d'expression susmentionné possède un gène de résistance à un antibiotique spécifique des cellules procaryotes et au moins un gène, préférentiellement 2 gènes, de résistance à un antibiotique spécifique des cellules eucaryotes.
On peut citer comme antibiotiques spécifiques des cellules procaryotes : l'Ampiciline, la Tétracycline et ses dérives, l'Hygromycine, la Canamycine... On peut citer comme antibiotiques spécifiques des cellules eucaryotes : le G418, la Généticine (sels de G418), la Puromycine, le Méthotrexate, la Blasticidine...
Plus particulièrement, un mode de réalisation de l'invention concerne un vecteur d'expression tel que défini précédemment, comprenant ou consistant en la séquence SEQ ID NO 21.
Les Unités transcriptionnelles (UT) d'intérêt codant pour la chaîne lourde et la chaîne légère sont clonés sous la forme d'ADNc et sous la dépendance du promoteur RSV. Ce promoteur correspond au LTR (Long Terminal Repeat) du virus du sarcome de Rous qui contient un élément enhancer dans sa région 5'.
Est cloné immédiatement en 3' du promoteur un intron artificiel optimisé pour l'épissage alternatif et composé d'une séquence donneuse en 5' isolé de la beta-globine humaine et en a 3' d'une séquence acceptrice dérivée du gène de variable de la chaîne lourde d'immunoglobuline. Les UT d'intérêt se terminent par des séquences de polyadénylation dérivées du gène de l'hormone de croissance (GH) d'origine humaine (hGH) pour la chaîne lourde et bovine (bGH) pour la chaîne légère. Cette différence d'origine dans le choix des polyA est réalisée dans un but de limiter les recombinaisons entre les gènes d'intérêt. Cette association promoteur LTRRSV, intron chimérique, ADNc et séquence polyA a été sélectionné car elle confère une haute activité transcriptionnelle et traductionnelle dans la lignée cellulaire YB2/0.
Le vecteur d'expression contient en plus des UT d'intérêt plusieurs UT de résistances à des molécules chimiques: gene Bla: Ce gène (nommé Amp dans les cartes de restriction des vecteurs) exprime l'enzyme beta-lactamase chez la bactérie (promoteur procaryote) et confère une résistance à l'ampicilline.
gene Neo: Ce gène code pour l'enzyme npt II (neomycin-phosphotransferase II) sous le contrôle du promoteur SV40 et confère une résistance à divers antibiotiques comme la néomycine, kanamycine ou G418 aux cellules de mammifère transfectées et exprimant ce gène.
gene Dhfr: Ce gène code pour l'enzyme DHFR (DiHydroFolate Reductase) sous le contrôle du promoteur SV40 et confère une résistance au methotrexate (MTX). Ce procédé peut être utilisé pour réaliser de l'amplification génique en augmentant la concentration de MTX résultant ainsi du augmentation de la production d'anticorps par les cellules transfectées.
L'invention a également pour objet une cellule, ou plusieurs cellules, ou une lignée cellulaire comprenant au moins un vecteur d'expression tel que défini précédemment.
Les cellules « comprenant au moins un vecteur » correspondent à des cellules dans lesquelles au moins un vecteur d'expression susmentionné a été introduit.
L'homme de métier connaît parfaitement les techniques de biologie moléculaire permettant d'introduite à l'intérieur d'une cellule une séquence d'ADN ou un vecteur d'expression, et notamment en se référant par exemple à [Sambrook, J et al. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Vol. 1, 2, 3 (1989)]. Il sera communément utilisé par la suite le terme de « transfection » pour designer l'action d'introduire un vecteur dans une cellule.
On peut citer par exemple, les techniques de transfection au phosphate de calcium, par utilisation de particules lipidiques ou « lipofectants », ou encore par des techniques permettant de générer des trous dans la membrane cellulaire au moyen d'un choc électrique (électroporation). Cette liste n'a pas de caractère exhaustif.
Les cellules ou lignes cellulaires utilisées dans l'invention sont des cellules issues de procaryotes ou d'eucaryotes tels que les bactéries, les levures ou autres champignons, les cellules d'insectes, les cellules d'amphibiens, les cellules de mammifères et notamment de rongeurs, les cellules humaines...
On distinguera plutôt la cellule de la lignée cellulaire par le fait que la lignée cellulaire est une population cellulaire en culture établie, c'est-à-dire qu'elle a acquis des caractéristiques permettant leur prolifération in vitro, et notamment une caractéristique d'immortalisation.
Un mode de réalisation avantageux de l'invention concerne une cellule ou une lignée cellulaire précédemment citée, présentant une activité de fucosylation substantiellement réduite par rapport à une cellule normale, ladite cellule ou lignée cellulaire étant notamment une cellule de mammifère, et en particulier la lignée YB2/0.
La lignée cellulaire avantageuse de l'invention est la lignée YB2/0 disponible à l'ATCC sous le numéro n° CRL 1662.
Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une cellule ou une lignée cellulaire comprenant un vecteur d'expression défini ci-dessus, permettant l'expression
· d'un anticorps monoclonal précédemment défini,
• ou d'une chaîne légère d'un anticorps monoclonal telle que définie précédemment,
• ou d'une chaîne lourde d'un anticorps monoclonal telle que définie précédemment.
Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une cellule ou une lignée cellulaire obtenue par le clonage d'une cellule susmentionnée.
Les technique de clonage cellulaire sont largement connues de l'homme de métier, et repose sur le principe d'isolement des cellules d'une population cellulaire afin que chaque cellule individuelle donne naissance à des cellules filles (ou clone) isolées des cellules filles issues de la division des autres cellules de la population.
Le principe général du clonage cellulaire est la dilution limite des cellules.
Egalement, un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne une cellule ou une lignée cellulaire issue du clonage susmentionné, lesdites cellules ou lignée cellulaire étant caractérisées par le fait qu'elles
• présentent une apoptose inférieure à 25%, et
• sécrètent au moins 20μg/ml d'anticorps monoclonal précédemment défini.
La mesure de Γ apoptose, ou mort cellulaire programmée, se fait par des techniques utilisées en routine par l'homme de métier qui consiste à évaluer l'une au moins des étapes caractéristique de l'apoptose : modification de la membrane plasmique, modification des protéines de la famille des Caspases, modification des facteurs de transactions et fragmentation de l'ADN.
Parmi les cellules ou lignées obtenues par clonage, il n'est avantageusement conservé selon l'invention que les cellules qui produisent une quantité importante d'anticorps monoclonal, et notamment celles qui produisent au moins 20μg/ml d'anticorps monoclonal. La mesure de la quantité d'anticorps est aisément réalisable par l'homme de métier, en utilisant des techniques simples de dosage des protéines. Un autre mode de réalisation de l'invention concerne une cellule ou une lignée cellulaire obtenue par le clonage de la cellule susmentionnée, et notamment caractérisée en ce qu'elle
• présente une apoptose inférieure à 25%,
• est stable au cours des divisions cellulaires, et
• sécrète au moins 14μg/ml d'anticorps monoclonal défini précédemment.
La notion de stabilité cellulaire implique que les cellules issue du clonage des cellules clonées issues des cellules contenant au moins un vecteur permettant l'expression d'un anticorps monoclonal selon l'invention sont capables au cours des différentes divisions de conserver leurs propriétés de résistances aux antibiotique et de produire les anticorps monoclonaux.
Un autre aspect de l'invention concerne une composition pharmaceutique, et notamment vaccinale, comprenant au moins
• un anticorps monoclonal défini ci-dessus, ou
« un acide nucléique défini ci-dessus, ou
• un vecteur d'expression défini ci-dessus, ou
• un fragment dudit anticorps monoclonal défini ci-dessus,
en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Avantageusement, l'invention concerne une composition pharmaceutique, et notamment vaccinale, comprenant au moins un anticorps monoclonal défini ci-dessus, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Le dosage de la substance active dépend particulièrement du mode d'administration, et est aisément déterminé par l'homme de métier.
« Un véhicule pharmaceutiquement acceptable » réfère à un matériel non toxique qui est compatible avec un système biologique tel qu'une cellule, une culture cellulaire, un tissu ou un organisme.
Une quantité thérapeutiquement efficace peut varier entre 0.01 mg/kg et 50 mg/kg, préférablement entre 0.1 mg/kg et 20 mg/kg, et plus préférablement entre 0.1 mg/kg et 2 mg/kg, en une ou plusieurs administrations quotidiennes, pendant un ou plusieurs jours.
La composition pharmaceutique de l'invention peut être administrée notamment par voie intraveineuse, notamment par injection ou par perfusion graduelle, par voie sous-cutanée, par voie systémique, par voie locale au moyen d'infiltrations, per os, ou par voie respiratoire ou pulmonaire au moyen d'aérosol.
Les préparations pour une administration parentérale peuvent inclure des solutions aqueuses ou non-aqueuses stériles, des suspensions ou des émulsions. Des exemples de solvants non- aqueux sont le propylène glycol, le polyéthylène glycol, des huiles végétales, telle que l'huile d'olive, ou des esters organiques injectables tels que l'éthyl oléate. Des véhicules aqueux comprennent l'eau, des solutions alcool/eau, des émulsions ou des suspensions.
La forme galénique avantageuse de la composition pharmaceutique de l'invention est un aérosol comprenant
• un anticorps monoclonal défini ci-dessus, ou
• un acide nucléique défini ci-dessus, ou
• un vecteur d'expression défini ci-dessus, ou
• un fragment dudit anticorps monoclonal défini ci-dessus,
en association avec un excipient, en présence ou non d'un agent de propulsion.
Dans un mode de réalisation de l'invention, l'aérosol se présente sous forme d'un liquide contenant l'anticorps anti-ricine et un excipient. Les excipients sont le plus souvent des alcools, mais tout autre excipient connu de l'homme du métier pourra être utilisé dans le cadre de l'invention. L'aérosol sous forme liquide peut être associé à un gaz propulseur comme les chlorofluorocarbones (CFC) ou hydrofluorocarbones (HFA).
L'aérosol sous forme liquide peut aussi être constitué de microparticules lipidiques et d'un excipient. Dans ce cas, les excipients peuvent être choisis parmi le dipalmitoylphosphatidylcholine de synthèse (DPPC), le lactose ou l'hydroxyethylamidon (HES). Les microparticules sont ensuite administrées à l'aide d'un insufflateur.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, l'aérosol se présente sous forme de poudre. La poudre se compose de particules de taille comprise entre 1 et 10 μιη et de préférence inférieure à 9μιη, ou de préférence inférieure à 5 μιη. A titre d'exemple non limitatif, les méthodes suivantes peuvent être utilisées pour obtenir une poudre sèche : la pulvérisation accompagnée d'une dessiccation par congélation ou la cristallisation par ultrasons, la précipitation dirigée.
L'administration de l'aérosol sera réalisée selon qu'il se présente sous forme liquide ou solide à l'aide d'un nébuliseur qui peut être pneumatique, ultrasonique ou à tamis ou à l'aide d'un aérosol doseur (de liquide préssurisé, mécanique, électrohydrodynamique, thermiques) pour les formulations liquides ou à l'aide d'inhalateur pour les formulations solides. (ReychlerG., Dessanges JF et Vecellio L, Rev. Mal. Respir, 2007 ; 24 : 1013-1023).
L'invention concerne également l'utilisation d'au moins :
• un anticorps monoclonal défini ci-dessus, ou
• un fragment dudit anticorps monoclonal défini ci-dessus, ou
· un acide nucléique défini ci-dessus, ou
• un vecteur d'expression défini ci-dessus, ou
• une cellule définie ci-dessus,
pour la préparation d'un médicament pour le traitement ou la prévention d'une pathologie associée à la contamination par la ricine.
Par traitement, on entend le moyen de soigner une pathologie déclarée, dont les symptômes sont visibles. Par prévention, on entend le moyen d'empêcher ladite pathologie de se déclarer. Les pathologies associées à la ricine correspondent aux symptômes liés à la contamination à la ricine, et notamment les diarrhées, les modifications des les électrolytes, la déshydratation, les œdèmes, les troubles respiratoires, hépatiques et rénaux...
L'invention a également pour objet une méthode de dosage in vitro de la ricine dans un échantillon biologique issu d'un individu susceptible d'être contaminé par la ricine, ladite méthode comprenant :
• la mise en contact dudit échantillon avec au moins un anticorps monoclonal défini précédemment, et
« la détermination de la présence ou l'absence de ricine dans ledit échantillon par la détection de la formation d'un éventuel complexe immun entre la ricine et ledit anticorps monoclonal.
Les anticorps monoclonaux de l'invention peuvent donc être utilisés pour détecter la présence de ricine dans un échantillon biologique.
Notamment, lesdits anticorps peuvent être utilisés pour la mise en œuvre de techniques de détection connues de l'homme de métier comme des ELISA, des RIE, de l'imunoprécipitation ou de l'immunomarquage (Western blot).
L'invention concerne aussi un procédé de décontamination in vitro d'un échantillon susceptible d'être contaminé par la ricine, notamment d'un échantillon biologique, comprenant :
• la mise en contact dudit échantillon avec au moins un anticorps monoclonal défini précédemment, et
· l'élimination, dudit échantillon, des complexes immuns formés entre la ricine et ledit anticorps monoclonal.
Un moyen de mettre en œuvre ledit procédé de décontamination consiste, par exemple, en l'utilisation des anticorps monoclonaux de l'invention sur lesquels sont greffés des billes magnétiques sur la région constante dudit anticorps.
Une fois lesdits anticorps couplés à des billes magnétiques mises en contact avec l'échantillon à décontaminer, la ricine est éliminée de l'échantillon en captant les anticorps selon l'invention au moyen d'un aimant.
Un autre moyen de mettre en œuvre ledit procédé de décontamination consiste, par exemple, en l'utilisation des anticorps monoclonaux immobilisé sur une colonne comportant de la protéine A ou G de Staphylococcus aureus. L'échantillon a décontaminé est alors passé au travers de la colonne afin de retenir, sur les anticorps selon l'invention immobilisé, la ricine susceptible d'être contenue dans ledit échantillon.
Un mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un procédé de préparation d'un anticorps monoclonal anti ricine susmentionné comprenant :
a. la transformation d'une cellule, notamment de mammifère, en particulier la lignée YB2/0 avec au moins un vecteur défini précédemment,
b. la sélection des cellules transformées,
c. l'évaluation de la production dudit anticorps des clones sélectionnés à l'étape précédente, par la détermination de la présence ou l'absence de la formation d'un éventuel complexe immun entre la ricine et ledit anticorps monoclonal.
Un mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un procédé défini ci dessus, dans lequel la sélection des cellules transformées est réalisée par détermination de leur résistance à au moins un antibiotique.
Un mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un procédé défini ci dessus, où les cellules produisant une quantité dudit anticorps monoclonal supérieure à 22 μg/mL sont sélectionnées.
Un mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un procédé défini ci dessus, où les cellules sélectionnées à l'étape c sont clonées.
Un mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un procédé défini ci dessus, où les cellules clonées sont sélectionnées une nouvelle fois pour :
• leur résistance à au moins un antibiotique, et
• leur capacité à produire au moins 11 μ§/ι Ι. dudit anticorps monoclonal.
L'invention sera mieux illustrée par les exemples et les figures suivantes. Les exemples ci- après visent à éclaircir l'objet de l'invention et illustrer des modes de réalisation avantageux, mais en aucun cas vise à restreindre la portée de l'invention.
Légende des figures
La figure 1 correspond à une représentation schématique d'un anticorps. Les parties noires correspondent aux parties constantes des chaînes lourdes, les parties en gris foncé correspondent à la partie constante de la chaîne légère, les parties en gris clair correspondent à la partie variable de la chaîne lourde, et les parties blanches correspondent à la partie variable de la chaîne légère. -S-S- représente les ponts disulfures établis entre deux cystéines. Les régions CDR et charpentes sont indiquées par des flèches. Les fragments Fab et Fc sont également représentés.
La figure 2 correspond à une représentation schématique en collier de perles de la séquence d'acides aminés d'une partie variable d'une chaîne légère ou d'une chaîne lourde d'immunoglobuline. Les boules noires correspondent aux acides aminés formant les régions charpentes, et les boules grises correspondent aux acides aminés représentant les CDR.
La figure 3 correspond à une représentation schématique de la fusion entre le peptide leader de la partie variable de la chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine avec la partie variable de la chaîne lourde de Γ immunoglobuline de macaque. Les oligonucléotides ayant servi pour les PCR sont figurés sur le schéma. Les sites de restriction uniques sont également indiqués.
La figure 4 correspond à une représentation schématique de la fusion entre le peptide leader de la partie variable de la chaîne légère d'une immunoglobuline humaine avec la partie variable de la chaîne légère de l'immunoglobuline de macaque. Les oligonucléotides ayant servi pour les PCR sont figurés sur le schéma. Les sites de restriction uniques sont également indiqués.
La figure 5 correspond à la représentation schématique du vecteur de clonage intermédiaire H622-26 contenant la chaîne lourde « double hybride » où le leader humain est fusionné à la région variable de la chaîne lourde de macaque (VH 43RCA), elle-même fusionnée à la région constante de l'immunoglobuline humaine (CH T125).
Les différents éléments de régulation (promoteurs, introns chimériques, sites de polyadénylation...) ainsi que les gènes de résistance aux antibiotiques et les origines de réplication sont également représentés.
La figure 6 correspond à la représentation schématique du vecteur de clonage final HK622-26 (SEQ ID NO 21) contenant la chaîne lourde « double hybride » où le leader humain est fusionné à la région variable de la chaîne lourde de macaque (VH 43RCA), elle-même fusionnée à la région constante de l'immunoglobuline humaine (CH T125), et la chaîne légère « double hybride » où le leader humain est fusionné à la région variable de la chaîne légère de macaque (VK 43RCA), elle-même fusionnée à la région constante de l'immunoglobuline humaine (CK T125)
Les différents éléments de régulation (promoteurs, introns chimériques, sites de polyadénylation...) ainsi que les gènes de résistance aux antibiotiques et les origines de réplication sont également représentés.
La figure 7 correspond à un gel d'agarose 2% sur lequel ont été séparés les produits de PCR permettant la détection des mycoplasmes.
Les pistes 3 et 22 correspondent à la migration du marqueur de poids moléculaire, les pistes 1 et 20 correspondent à la migration des produits de PCR réalisées à partir d'un témoin négatif, et les pistes 2 et 21 correspondent à la migration des produits de PCR réalisées à partir d'un témoin positif.
Les pistes 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 23, et 25 correspondent à la migration des produits de PCR réalisés respectivement à partir des culots des cloïdes GG3, IF2, EE9, EG11, JB3, ED9, EC2, GF2, 1A1 et KC9.
Les pistes 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 24, et 26 correspondent à la migration des produits de PCR réalisés respectivement à partir des surnageants des cloïdes GG3, IF2, EE9, EG11, JB3, ED9, EC2, GF2, 1 Al et KC9.
La figure 8 représente sous forme de graphique la stabilité de production d'anticorps des trois cloïdes EE9, GG3 et IF2. Les barres grises représentent les mesures réalisées lors du premier dosage, et les barres noires représentent les mesures réalisées lors du second dosage.
L'axe des abscisses représente le temps en jours, et l'axe des ordonnées représente la quantité d'anticorps produits en ng/mL.
La figure 9 correspond à un gel d'agarose 2% sur lequel ont été séparés les produits de PCR permettant la détection des mycoplasmes.
Les pistes 4, 17, 30 et 33 correspondent à la migration du marqueur de poids moléculaire, les pistes 3 et 31 correspondent à la migration des produits de PCR réalisées à partir d'un témoin négatif, et les pistes 2 et 32 correspondent à la migration des produits de PCR réalisées à partir d'un témoin positif.
Les pistes 5, 7, 9, 11, 13, 15, 18, 20, 22, 24, 26 et 28 correspondent à la migration des produits de PCR réalisés respectivement à partir des culots des clones GG9-4B2, GG9-2F8, GG9-5D8, GG9-2G10, IF2-2F2, IF2-2E3, GG3-2G4, GG3-EC2, GG3-1G9, GG3-2G2, GG3-5G11, GG3-1D8 et EE9-5G7.
Les pistes 6, 8, 10, 12, 14, 16, 19, 21, 23, 25, 27 et 29 correspondent à la migration des produits de PCR réalisés respectivement à partir des culots des clones EE9-4B2, EE9-2F8, EE9-5D8, EE9-2G10, IF2-2F2, IF2-2E3, GG3-2G4, GG3-EC2, GG3-1G9, GG3-2G2, GG3- 5G11, GG3-1D8 et EE9-5G7.
La figure 10 représente sous forme de graphique la stabilité de production d'anticorps des clones EE9-2G10, EE9-5D8, EE9-5G7, GG3-1G9, GG3-2G4, IF2-1C7, IF2-2D8 et IF2-2E9 sur 8 jours. Les barres grises représentent les mesures réalisées lors du premier dosage, et les barres noires représentent les mesures réalisées lors du second dosage.
L'axe des abscisses représente le temps en jours, et l'axe des ordonnées représente la quantité d'anticorps produits en ng/mL.
La figure 11 représente la courbe de survie cumulée de Camplan-Meyer de souris ayant reçu 50μg de ricine par instillation pulmonaire ainsi q'une IgG humaine contrôle (coube avec des triangles), soit l'anticorps selon l'invention (43RCA) 6h (courbe avec un carré) , 22h (courbe avec des losanges) ou 24 heures (courbe interrompue avec des cercles) après l'instillation de ricine.
La figure 12 représente la courbe de survie cumulée de Camplan-Meyer de souris ayant reçu 50μg de ricine par instillation pulmonaire ainsi que 20 μg d'une IgG humaine contrôle (coube avec des triangles), soit l'anticorps selon l'invention (43RCA) à une concentration de 20, 10, 5 et 1 μg,
La figure 13 représente la courbe de survie cumulée de Camplan-Meyer de souris ayant reçu 50μg de ricine par instillation pulmonaire ainsi que 150 μg de l'anticorps selon l'invention
(43RCA) 44 heures (courbe avec des carrés) ou 54 heures (courbe avec des losanges) après l'instillation de ricine. En contrôle (courbe avec des triangles) est indiqué la survie des souries traitées avec la ricine et une immunoglobuline non relevante. EXEMPLES
Exemple 1 : Construction et séquençage d'un vecteur d'expression H 622-26 pour l'expression d'anticorps selon l'invention.
Le vecteur d'expression, HK622-26 (SEQ ID NO 21), a été construit pour l'expression de l'anticorps mono clonal (IgG) chimérique macaque-homme anti ricine.
Le vecteur HK622-26 a été construit à partir du vecteur CHK622-05 par « double » chimérisation, c'est-à-dire ajout par PCR d'assemblage de régions leaders humaines et par ajout des régions constantes CK et CH humaines par clonage aux séquences variables VH et VK de macaque.
Les régions variables des chaînes lourde et légère VH et VK sont extraites d'un vecteur codant pour un ScFv anti ricine, ScFv43RCA/H2-Vl 16 et sont introduites dans le vecteur « générique » CHK622-08 après avoir ajouté des séquences leaders pour assurer une bonne synthèse de l'anticorps chimérique. Les régions constantes CK et CH sont d'origine humaine et dérivées du clone T125-A2 dirigé contre l'antigène Rhésus D
A- Synthèse par PCR d'assemblage de la région VH43RCA
La région VH43RCA correspond à la chimérisation de :
- la séquence leader VH de la séquence humaine M29812 (sous groupe VH4, VH4-59), contenue dans le vecteur HK558-12, ladite séquence leader VH étant constituée de la séquence suivante :
5'-ATGAAACATCTGTGGTTCTTCCTTCTCCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTG TCC-3' (SEQ ID NO 19), et
- la séquence de la région VH macaque anti ricine contenue dans le plasmide pHaI14 contenant le fragment ScFv43RCA/H2-Vl 16, ladite séquence de la région VH macaque étant constituée de la séquence SEQ ID NO 3.
La chimérisation est réalisée de la manière suivante :
- la séquence leader VH (SEQ ID NO 19) est amplifiée par PCR en utilisant le couple d'amorces suivantes :
• VHI-Ricine amorce sens:
5 '-CTCA GTGCTA GCGCCGCCA CATGAAAC ATCTGTGGT- J ' (SEQ ID NO 22) • VH2-Ricine amorce antisens:
5 '-CCAGCTGCACCTGGGACAGGACCCAT-3 ' (SEQ ID NO 23)
à partir d'une matrice d'ADN plasmidique HK558-12.
La réaction de PCR est réalisée selon le protocole suivant :
dénaturation : 5 min à 95 °C
dénaturation : 0.5 min à 95°C l
hybridation : 0.5 min à 50°C } répétitions 10 fois
élongation : 0.5 min à 72 °C J
- élongation : 10 min à 72 °C
Ce couple d'amorces permet d'obtenir un amplicon (amplicon 1) de 91 bases contenant le site Nhe I (GCTAGC)), la séquence Kozak (gras) et la séquence leader humaine SEQ ID NO
17).
- la séquence de la région VH macaque (SEQ ID NO 3) est amplifiée par PCR en utilisant le couple d'amorces suivantes :
• VH3-Ricine amorce sens:
5 '-A TGGGTCCTGTCCCA GGTGCA GCTGG-3 '(SEQ ID NO 24)
• VH4-Ricine amorce antisens:
5 '-A CCGA TGGGCCCTTGGTGGA GGCTGA GGA G A CGGTGA CCA-3 ' (SEQ ID NO
25)
à partir d'une matrice d'ADN plasmidique pHaI14.
La réaction de PCR est réalisée selon le protocole suivant :
dénaturation : 5 min à 95 °C
dénaturation : 0.5 min à 95°C l
hybridation : 0.5 min à 50°C \ répétitions 10 fois
élongation : 0.5 min à 72 °C J
élongation : 10 min à 72 °C
Ce couple d'amorces permet d'obtenir un amplicon (amplicon 2) de 396 bases contenant la séquence VH macaque et le site Apa I (GGGCCCC).
Les amplicons 1 et 2 obtenus précédemment sont alors réunis pour donner l'amplicon 3 final par PCR d'assemblage en utilisant les amorces VH1 et VH4 susmentionnées.
La réaction de PCR d'assemblage est réalisée selon le protocole suivant :
dénaturation : 5 min à 95 °C
- dénaturation : 0.5 min à 95°C l
hybridation : 0.5 min à 50°C } répétitions 15 fois
élongation : 1 min à 72 °C J
élongation : 10 min à 72 °C La figure 3 montre la région VH43RCA avec les différents couples d'amorces ayant servi à la préparation du fragment VH chimérique final (amplicon 3) de 461 pb.
B- Synthèse par PCR d'assemblage de la région VK43RCA La région VK43RCA correspond à la chimérisation de :
la séquence leader VK de la séquence humaine Z0006 (sous groupe VK1, VK1-13) contenue dans le vecteur HK558-12, ladite séquence leader VK étant constituée de la séquence suivante :
5'-ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCA GGTGCCAGATGT-3 ' (SEQ ID NO 17), et
la séquence de la région VK macaque anti ricine contenue dans le plasmide pHaL14 contenant le fragment ScFv43RCA/H2-Vl 16, ladite séquence de la région VH macaque étant constituée de la séquence SEQ ID NO 1. La chimérisation est réalisée de la manière suivante :
- la séquence leader VK (SEQ ID NO 17) est amplifiée par PCR en utilisant le couple d'amorces suivantes :
• VKl-Ricine amorce sens:
5 '-CTCAGTACTA GTGCCGCCA CCATGGACATGAGGGTCCCCG- J ' (SEQ ID NO
26)
• VK2-Ricine amorce antisens:
5 '- TGTCA TCTGGA GCTCA CA TCTGGCA CCTGG -3 ' (SEQ ID NO 27)
à partir d'une matrice d'ADN plasmidique HK558-12.
La réaction de PCR est réalisée selon le protocole suivant :
dénaturation : 5 min à 95°C
dénaturation : 0.5 min à 95°C l
hybridation : 0.5 min à 50°C \ répétitions 10 fois
élongation : 0.5 min à 72 °C J
élongation : 10 min à 72 °C
Ce couple d'amorces permet d'obtenir un amplicon (amplicon ) de 102 bases contenant le site Spe I (ACTAGT), la séquence kozak (gras) et la séquence leader humaine SEQ ID NO 19).
- la séquence de la région VK macaque (SEQ ID NO 1) est amplifiée par PCR en utilisant le couple d'amorces suivantes :
• VK3-Ricine amorce sens:
5 '-CCA GGTGCCA G A TGTGA GCTCCA G A TGA CA-3 '(SEQ ID NO 28)
• VK4-Ricine amorce antisens:
5 - TGAAGACACTTGGTGCAGCCACAGTTCGTTTGATCTCCACCTTGGTCC -3
(SEQ ID NO 29)
à partir d'une matrice d'ADN plasmidique pHaI14.
La réaction de PCR est réalisée selon le protocole suivant :
dénaturation : 5 min à 95°C
dénaturation : 0.5 min à 95°C ]
hybridation : 0.5 min à 50°C i" répétitions 15 fois
élongation : 1 min à 72 °C J
élongation : 10 min à 72 °C
Ce couple d'amorces permet d'obtenir un amplicon (amplicon 2') de 364 bases contenant la séquence VK macaque et le site Dra III (CACTTGGTG).
Les amplicons et 2' obtenus précédemment sont alors réunis pour donner Γ amplicon 3' final par PCR d'assemblage en utilisant les amorces VK1 et VK4 susmentionnées.
La réaction de PCR d'assemblage est réalisée selon le protocole suivant :
dénaturation : 5 min à 95 °C
dénaturation : 0.5 min à 95°C l
hybridation : 0.5 min à 50°C } répétitions 15 fois
- élongation : 1 min à 72 °C J
-élongation : 10 min à 72 °C
La figure 4 montre la région VK43RCA avec les différents couples d'amorces ayant servi à la préparation du fragment VH chimérique final (amplicon 3') de 436 pb.
C- Construction du vecteur H622-26
Les amplicon 3 et 3' sont introduits dans le vecteur « générique » CHK622-08 contenant les séquences des chaînes constantes CH lourdes et CK légères de l'IgGl du clone T125-A2 dirigé contre l'antigène Rhésus D.
Le clonage des amplicon 3 et 3 ' est réalisé séquentiellement de la manière suivante :
1- L'amplicon 3 et le vecteur CHK622-08 sont soumis à une double digestion par les enzymes de restriction Nhe I- Apa I.
Les fragments de digestion sont ensuite purifiés, et un mélange vecteur / amplicon 3 est soumis à une ligation cohésive.
Les produits de la ligation sont ensuite utilisés pour transformer des bactéries, et les transformants sont sélectionnés sur milieu LB complémenté d'ampicilline.
Les clones résistants sont ensuite testés par PCR en utilisant les amorces 5PRSVBIS et GSP2ANP : un fragment de 783 bp est attendu pour les clones positifs.
= 6 clones positifs en PCR ont été sélectionnés pour un criblage par digestion enzymatique : par digestion de contrôle Nhe I + Apa I (vérification de l'insert et des jonctions): Le profil attendu est constitué de 2 bandes 447+9917 bp, et
- par digestion Hind III (vérification du vecteur entier) : Le profil attendu est constitué de 4 bandes 3759+2894+2559+1152 bp
Tous les clones sont positifs, et le clone le clone H622-26, dont la carte de restriction est représentée dans la figure 5, est choisi pour la seconde étape.
2- L'amplicon 3' et le vecteur H622-26 sont soumis à une double digestion par les enzymes de restriction Spe I- Dra III.
Les fragments de digestion sont ensuite purifiés, et un mélange vecteur / amplicon 3' est soumis à une ligation cohésive.
Les produits de la ligation sont ensuite utilisés pour transformer des bactéries, et les transformants sont sélectionnés sur milieu LB complémenté d'ampiciline.
Les clones résistants sont ensuite testés par PCR en utilisant les amorces 5' 1PLC et CK4: un fragment de 539 bp est attendu pour les clones positifs.
= 6 clones positifs en PCR ont été sélectionnés pour un criblage par digestion enzymatique : par digestion de contrôle Spe I + Dra III (vérification de l'insert et des jonctions): Le profil attendu est constitué de 2 bandes 420+10344bp, et
- par digestion Hind III (vérification du vecteur entier) : Le profil attendu est constitué de 4 bandes 3759+2894+2559+155 lbp.
Tous les clones sont positifs. Après séquençage, seuls 4 clones possèdent une séquence correcte. Le clone 2 a été choisi, et correspond au vecteur H622-26. La carte de restriction du vecteur H622-26est représentée dans la figure 6.
Le vecteur est alors prêt pour la transformation des cellules.
Exemple 2 : Obtention de clones producteurs d'anti ricine dans la lignée YB2/0 par transfection double directe
Cette étude a pour but l'obtention de clones producteurs d'anti ricine dans la lignée YB2/0 par double transfection directe.
Les cellules YB2/0 ont été entretenues (par repiquage à lxl05cell/ml 2 fois par semaine) en vue de la transfection à 105 cellules/ml en milieu EMS, 5% SVF.
Les vecteurs utilisés pour la transfection sont les suivants : HK622-26 / EcoRV, H416-24 (T+) et K416-23 (T+). HK622-26 / EcoRV signifie que le vecteur obtenu dans l'exemple 1 a été linéarisé par digestion avec l'enzyme Eco RV afin de favoriser son intégration dans les cellules transformées.
Transfection
Les cellules sont transfectées selon le protocole suivant :
4 cuvettes comprenant 500 de cellules sont préparées de la manière suivante :
- Cuvette 1 et 2 : 42,8μ§ de vecteur HK622-26/EcoRV
- Cuvette Témoin positif : 25,2μ de vecteur H416-24 linéarisé
23,2 μg de vecteur K416-23 linéarisé
- Cuvette Témoin négatif : pas de vecteur
Les cellules sont alors électroporées à un voltage de 230 V et une capacitance de 960μΡ pendant 17,9 ms.
Une fois l'électroporation terminée, les cellules sont prélevées délicatement des cuvettes et placées dans du milieu sélectif, RPMI, 5% SVF dialysé, 1 g/1 généticine pour les P24 (25000cell/ml) et P96 àlOOcell/puits (la généticine n'étant appliquée qu'à J+3, une fois que l'expression du gène de résistance a eu lieu) et en RPMI, 5% SVF dialysé, 0,5g/l généticine, 50nM méthotrexate (MTX) et ensemencées dans des plaques de culture de la manière suivante :
- Cuvette 1 et 2 (par cuvette) : 1 Plaque 24 puits à 25000 cellules/puits
5 Plaques 96 puits à 2500 cellules/puits
1 Plaque 96 puits à 100 cellules/puits
- Cuvette Témoin T+ : 1 Plaque 96 puits à 2500 cellules/puits
1 Plaque 96 puits à 100 cellules/puits
- Cuvette Témoin T- : 1 Plaque 96 puits à 2500 cellules/puits
1 Plaque 96 puits à 100 cellules/puits
Les cellules sont cultivées en présence d'antibiotique pendant 4 semaines.
Pour les plaques 96 puits, le milieu est changé deux fois par semaine.
Le reste des cellules transformées est réparti en plaques 6 puits pour chacune des cuvettes 1 et 2.
Sélection des transformants
- Evaluation de la production d'anticorps
Dans une première étape, le taux de production moyen d'anticorps est évalué sur 3 pools issus de chacune des transfections des cuvettes 1 et 2, après 13 jours de culture en milieu sélectif. Au total 6 pools ont été testés, et la concentration moyenne en anticorps monoclonal a été mesurée en μg/ml. La densité cellulaire et la viabilité cellulaire ont également été déterminées.
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 1 suivant :
Densité cellulaire Concentration
Cuvette Pool Viabilité (%)
(106 cellules/ml) anticorps ^g/ml)
1 0,62 82 5,6
1 2 0,52 74 5,1
3 0,44 88 4,2
1 0,62 84 3,6
2 2 0,72 86 5,8
3 0,52 72 6
Tableau 1 : viabilité et dosage de la production d'anticorps des différents pools.
On constate que les deux transfections permettent la production de l'anticorps monoclonal anti ricine.
- Première sélection clonale
Après 22 jours de culture en milieu sélectif, l'apparition des clones résistants au G418 et au méthotrexate a été évaluée.
Le bilan des clones apparu est décrit dans le tableau 2 suivant :
Tableau 2 : nombre de clones ayant émergé.
P96 = plaque 96 puits
Au total 76 pseudo-clones (puits) double résistants (G418 et méthotrexate) ont émergé à l'issue de la double sélection, soit une efficacité de transfection de 7,9% (76 puits positifs sur 960 puits ensemencés).
Les cellules ayant proliféré dans les puits sont considérées comme n'étant pas des clones purs, puisque 2500 cellules par puits ont été ensemencées.
Pour chaque pseudo clones, ou cloïdes, un dosage de la quantité d'immunoglobuline sécrétée a été réalisé.
Les résultats des dosages d'immunoglobulines des 24 meilleurs clones sont présentés dans le tableau 3 suivant :
Tableau 3 : dosage de la production d'anticorps des différents cloïdes testés.
Parmi les 24 cloïdes testés, 10 ont une production d'anticorps monoclonal supérieure à 8,9 μg/mL. Tous ces cloïdes (EC2, ED9, EE9, EGl l, GF2, CG3, IA1, IF2, JB3 et KC9) ont été congelés dans du milieu sans antibiotique en présence de 10% DMSO, et conservés à -195°C dans l'azote liquide.
Pour chacun de ces 10 cloïdes, un test de viabilité cellulaire a été réalisé avant congélation (Tableau 4), et un dépistage de la présence éventuelle de mycoplasmes a été réalisé (Figure 7). Tous les clones présentent un taux de survie satisfaisant (>85%) et aucun clone n'est contaminé par les mycoplasmes.
Cloide Viabilité (%)
GF2 89
EE9 97
IF2 89
EG11 89
KC9 85
EC2 95
ED9 95
GG3 100
IA1 100
JB3 100
Tableau 4 : viabilité des cloïdes
Les 3 cloïdes (EE9, CG3 et IF2), dont la production d'anticorps est la plus élevée (supérieure à 22μg/mL), sont sélectionnés pour un nouveau clonage cellulaire.
La stabilité de production d'anticorps monoclonal a également été testée pour chacun des cloïdes sélectionnés.
Les trois cloïdes EE9, GG3 et IF2 ont été entretenus pendant 6 semaines par dilution en cascade en plaque 24 puits en milieu DMEM + 5%SVF dialysé avec repiquage tous les 7 jours. La production d'anticorps monoclonal est évaluée par deux dosages ELIS A indépendants, et les résultats sont indiqués dans le tableau 5 suivant :
La stabilité des cloïdes au cours du temps est également représentée sous forme de graphiqi dans la figure 8.
Parmi les 3 cloïdes choisis, le cloïde GG3 voit sa production d'anticorps diminuer très signifïcativement au cours des passages.
Sur la base de cette indiction, les cloïdes sélectionnés ont été reclonés afin de disposer de clones « purs ».
- Seconde sélection clonale
Un second clonage des cloïdes EE9, CG3 et IF2 a été réalisé en milieu DMEM 5% SVF dialysé. 5 plaques 96 puits, à 40 cellules par puits, ont été ensemencées en milieu DMEM 5% SVF dialysé. Il n'y a eu aucun clone pour ce clonage.
Un deuxième clonage a été réalisé en milieu DMEM et EMS 5%SVF dialysé.
Les cellules ont été décongelées en milieu RPMI 5%SVF dialysé puis passées en milieu EMS
5%SVF et DMEM 5%SVF. Les cellules ont été repiquées à 4,5.105 cellules/mL la veille du clonage.
5 plaques 96puits, à 40 cellules par puits, ont été ensemencées par cloïde et par milieu soit un total de 30 plaques, ou 2880 puits. Le bilan d'apparition des clones est présenté dans le tableau 6.
Tableau 6 : nombre de clones ayant émergé après clonage des 3 cloïdes, en fonction du milieu de culture.
Deux criblages par ELISA ont permis de sélectionner les 10 meilleurs clones issus des 80 clones de cloïdes ayant émergés. Les résultats des ELISA de 11 clones issus du cloïde EE9, 11 clones issus du cloïde GG3 et 10 clones issus du cloïde IF2, sont présentés dans le tableau 7 suivant :
Tableau 7 : dosage de la production d'anticorps des différents clones testés.
Pour chaque cloïde, 5 clones ont été conservés. Les 5 clones issus du cloïde EE9 (EE9- 5G7,EE9-5D8, EE9-2F8, EE9-4B1 et EE8-2G10) sécrètent en moyenne plus de 4^g/mL d'anticorps monoclonal, les 5 clones issus du cloïde GG3 (GG3-2G4, GG3-1G9, GG3-2G2, GG3-1D8 et GG3-5G11) sécrètent en moyenne plus de 6^g/mL d'anticorps monoclonal et les 5 clones issus du cloïde IF2 (IF2-2E9, IF2-2D8, IF2-1C7, IF2-1D5 et IF2-2F7) sécrètent plus de 8μg/mL d'anticorps monoclonal.
Pour chacun de ces 15 clones, un test de viabilité cellulaire a été réalisé avant congélation (Tableau 7), et un dépistage de la présence éventuelle de mycoplasmes a été réalisé (Figure 9).
Tous les clones présentent un taux de survie satisfaisant (>70%) et aucun clone n'est contaminé par les mycoplasmes.
Tableau 7 : viabilité des clones sélectionnés
Au final 8 clones ont été sélectionnés sur les critères suivants :
leur production d'anticorps monoclonal > 14μ§/ι Ε
- leur viabilité > 70%
Les clones sélectionnés sont donc les clones suivants : EE9-5G7, EE9-5D8, EE9-2G10, GG3- 2G4, GG3-1G9, IF2-2E9, IF2-2D8 et IF2-1C7.
- Stabilité des clones
Le but de ces expériences est de vérifier que les différents clones sécrètent substantiellement la même quantité d'anticorps monoclonal au cours des différents passages.
Les huit clones sélectionnés ont été entretenus pendant 8 semaines par dilution en cascade en plaque 24 puits avec repiquage tous les 7 jours. Les clones issus du cloïde EE9 ont été maintenus en milieu EMS +5%SVF dialysé et les clones issus des cloïdes GG3 et IF2 en milieu DMEM + 5%SVF dialysé.
La production d'anticorps monoclonal est évaluée par ELIS A, et les résultats sont indiqués dans le tableau 8 suivant :
Tableau 8 : production d'anticorps au cours du temps.
La stabilité des clones au cours du temps est également représentée sous forme de graphique dans la figure 10.
Au final, 3 clones ont été sélectionnés pour leur stabilité de production d'anticorps monoclonal : le clone EE9-5G7, le clone IF2-2D8 et le clone IF2-2E9.
Exemple 3 : Production en rollers d'anticorps selon l'invention
Le clone EE9-5G7 a été sélectionné pour la production de 500 mg d'anticorps selon les dosages de pseudo production maximale en statique qui établissaient son niveau de production à 19 mg/L et également sur les résultats de l'étude de stabilité menée sur le cloïde parental EE9 dont le niveau de production est stable sur six semaines.
A partir de ces données, le clone EE9-5G7 a été amplifié de manière à réaliser deux productions successives de 30 rollers en mode batch. La production a été arrêtée lorsque la viabilité cellulaire est descendue en dessous de 50%. Le dosage du surnageant en fin de production n'était que de 12 mg/L soit 648 mg d'anticorps produit. Ce surnageant a été dosé, centrifugé, filtré avant d'être concentré 15 fois. Le concentré a été purifié par chromatographie d'affinité et a permis d'obtenir 468mg d'anticorps purifié.
La production d'anticorps monoclonal anti ricine par les clones IF2-2D8 et IF2-2E9 a été réalisée par production en roller en milieu RPMI et EMS.
Les cellules ont été décongelées et ensemencées à 2.105 cellules/ml dans du milieu DMEM, 5%>SVF dépiété en Ig, 0,5 g/1 généticine. La viabilité à la décongélation était de 91%> pour le clone IF2-2D8 et 93% pour le clone IF2-2E9.
Le suivi de culture et de production des rollers est présenté dans le tableau 9 pour le clone IF2-2D8 et le tableau 10 pour le clone IF2-2E9.
Densité
Concentration Viabilité Type de Volume de
Date repiquage Nombre de Flask Milieu
(xl06/ml) (%) contenant milieu (ml)
(xlOE6/ml)
J0 changement milieu T75 30 2 DMEM
J3 - 10ml + 10ml milieu T75 30 2 DMEM
J7 0,64 86 0,1 T75 30 1 DMEM
J 10 1 , 1 95 0, 1 T75 30 1 DMEM
T75 30 1 DMEM
J14 1,38 96 0,1 T75 30 1 RPMI
T75 30 1 EMS
0,9 100 0,2 T175 100 1 RPMI
J17
0,88 98 0,2 T175 100 1 EMS
1,48 97 0,3 Roller 500 1 EMS
J20
1,12 100 0,3 Roller 400 1 RPMI
Lancement
0,8 95 0,44 Roller 900 EMS
Production
J22
Lancement
0,74 95 0,32 Roller 900 RPMI
Production
2,12 93 Roller 900 EMS
J24
0,92 96 Roller 900 RPMI
Viabilité <50% Arrêt du Roller EMS
J27
Viabilité <50% Arrêt du Roller RPMI
Tableau 9 : Suivi de culture et de production des rollers du clone IF2-2D8
Tableau 10 : Suivi de culture et de production des rollers du clone IF2-2E9
Les surnageants de ces rollers ont été dosés par ELIS A (tableau 11) afin de mesurer la quantité d'anticorps produit.
Tableau 11 : Dosage des surnageants des rollers.
Les surnageants ont été filtrés sur filtre 0,22 μιη, et les anticorps ont été purifiés par chromatographie d'affinité sur colonne HiTrap rprotein A FF.
Bilan de purification des anticorps anti-ricin IF2-2D8 et IF2-2E9
Les concentrés ont permis d'obtenir entre 16 et 32.8 mg d'anticorps purifié pour chacun des clones.
Les clones IF2-2D8 et IF2-2E9 se sont avérés stables au cours des différents passages (contrairement à leur cloïde parental) produisent deux fois plus d'anticorps monoclonal que le clone EE9-5G7.
La caractérisation physico-chimique des anticorps a montré que c'est le clone IF2-2E9 qui produisait l'anticorps le plus semblable à l'anticorps produit par le clone EE9-5G7. De ce fait, c'est le clone IF2-2E9 qui a été choisi pour les prochaînes production d'anticorps anti-ricine
Production et purification d'un lot de 500 mg d'anticorps anti-ricine
Le surnageant de culture du clone IF2-2E9 a été concentré, filtré puis les anticorps ont été purifiés par une première étape de chromatographie d'affinité sur Sépharose-protéine A suivie de deux étapes d'échange d'ions. La quantité d'anticorps purifié est de 642 mg.
Exemple 4 : Test de la neutralisation in vitro de la ricine par l'anticorps monoclonal chimérique homme/macaque - test de survie.
Dans ce test, on mesure la capacité qu'ont les anticorps de l'invention à protéger de la mort les cellules J774A.1 mises en contact avec de la Ricine.
Brièvement, les cellules J774A.1 (ATCC-LGC, Molsheim,France) sont ensemencées à une densité de 14,000 cellules/puits (200 μΐ/puits), dans une plaque de culture et cultivées à 37°C en présence de 5% de C02 pendant 24 heures dans du DMEM complémenté avec 10% de sérum de veau fœtal. Les anticorps de l'invention sont incubés avec 480 ng/ml de ricine ou avec du sérum contrôle (anticorps non relevant) pendant 1 heure. Le mélange est ensuite ajouté aux cellules. 24 heures après, la viabilité cellulaire est mesurée par des techniques
connues de l'homme de métier (exclusion au bleu Trypan, Cytox (Promega), mesure de l'apoptose...). Chaque test est corrigé par rapport aux contrôles « 100% de viabilité » cellulaire (pas de ricine et pas d'anticorps) et « 0% viabilité » (ricine sans anticorps). Exemple 5 : Test de la neutralisation in vitro de la ricine par l'anticorps monoclonal chimérique homme/macaque - test d'inhibition de la traduction.
Un autre test peut être utilisé pour mesure l'activité neutralisante des anticorps monoclonaux de l'invention, il s'agit de mesurer l'inhibition de la traduction protéique. Pour cela on mesure la traduction d'une protéine marqueur, par exemple la traduction de la luciférase, dans un système de traduction in vitro acellulaire [Haie ML Pharmacol Toxicol 2001, 88(5):255-260]. Brièvement, le test de mesure de la traduction de l'ARN message de la luciférase est le suivant :
Les anticorps monoclonaux sont déposés dans des plaques 96 puits dans du tampon phosphate salin (PBS) et de la ricine est ajoutée à une concentration finale de 4mM. Du lysat de réticulocyte de lapin complémenté de RNAsin ®, des acides aminés et de l'ARN messager de la luciférase est alors ajouté dans chaque puits. La réaction est réalisée pendant lh30.
5 μΐ^ de la reaction sont alors prélevés et ajouté à 45 μΐ^ de tampon réactionnel permettant de détecter l'activité luciférase (Luciférase assay reagent, Promega, Inc.). La lumière émise (luminescence) est mesurée en compte par seconde (CPS) à l'aide d'un lecteur multiplaque
Victor (PerkinElmer Wallac, Boston MA). Les données sont exprimées en pourcentage par rapport au contrôle (% contrôle= (CPS traité/ CPS contrôle) xl00)).
Dans les deux tests (Exemple 4 et Exemple 5), la comparaison entre la dose protectrice 50% du scFv (1 μg/ml) et celle de l'IgG (0,5 μg/ml) montre un net bénéfice de l'expression sous forme d'IgG.
Exemple 6 : Test de la neutralisation in vivo de la ricine par l'anticorps monoclonal chimérique homme/macaque -.
Afin de tester l'effet neutralisant de l'anticorps anti ricine in vivo, des rats Fisher (Charles River Laboratories L'Arbresle, France) ont reçu une dose de 16μg/kg en masse de ricine et 50μg d'anticorps anti ricine, après adaptation du protocole décrit par Ezzell et al. (Ezzell, et al. 1984. Infect. Immun. 45:761-767)
Les tests ont été réalisés en mesurant la viabilité des animaux en fonction des doses de ricine et d'anticorps anti ricine injectés.
En contrôle, la viabilité des rats traités à la ricine seule (test positif) et des rats traités avec de l'anticorps anti ricine seul (test négatif) a également été évaluée.
Exemple 7 : Test d'affinité de l'anticorps monoclonal chimérique homme/macaque pour la ricine.
La mesure de l'affinité de l'anticorps anti ricine pour son antigène, c'est-à-dire la ricine, a été mesuré par résonance plasmonique de surface au moyen d'un appareil BIAcore X (Biacore, Uppsala, Suède).
La ricine a été immobilisée sur une puce CM5 (Biacore), au moyen d'un couplage aminé selon les instructions du fabricant.
Pour chaque mesure, un minimum de six dilutions, dans un tampon HBS-EP (Biacore) d'anticorps anti ricine a été testé pendant 900s (dilutions de 10 à 0,1 μg/mL). Après chaque dilution d'anticorps, la puce a été régénérée avec de la glycine 1,5 (Biacore) à un débit de ΙΟμΙ/min pendant 30s.
Les constantes d'affinité ont été calculées en utilisant la méthode décrite par Karlsson et al. (Karlsson et al. 1991 , J. Immunol. Methods 145:229-240) et vérifiées par des tests internes comme cela est décrit par Schuck, et al. (Schuck, P., and A. P. Minton. 1996. Anal. Biochem. 240:262-272).
Exemple 8 : Administration par instillation de l'anticorps monoclonal chimérique homme/macaque à des souris et détermination de la survie
Des souris BALb/c (20-22g) ont été exposées à de la ricine par instillation pulmonaire à raison de 16μg/kg de poids corporel et la survie a été contrôlée pendant 10 jours après l'administration de la ricine.
L'anticorps de type IgG 43RCA anti-chaine A de la ricine ou une IgG humaine contrôle ont été administrés par instillation pulmonaire à raison de 50 μg. L'effet protecteur de l'anticorps de type IgG 43RCA anti-chaine A de la ricine a été mesuré par le pourcentage de survie des
souris et par le ratio du poids mouillé sur poids sec des poumons compte tenu que la ricine induit un œdème pulmonaire.
Les souris exposées à la ricine ayant reçue une IgG humaine contrôle sont toutes mortes au jour 3 (0% de survie) (n=4). On observe 100% de survie chez les souris ayant reçu dans une même injection la ricine et l'anticorps 43RCA (n=2, non représenté sur la figure 11)
Les souris ayant reçu l'anticorps 43RCA 6 heures après l'administration de la ricine, montrent 100 % de survie également (n=7)
Parmi les souris ayant reçu l'anticorps 43RCA 22 heures après l'administration de la ricine (n=7), 2 meurent au jour 4, 1 meurt au jour 8 et les 4 autres souris survivent. Le pourcentage de survie est égal à 57.1% lorsque l'anticorps est administré 22 heures après l'administration de la ricine par voie pulmonaire. Parmi les souris ayant reçu l'anticorps 43RCA 24 heures après l'administration de la ricine (n=l l), 2 meurent au jour 4, 2 meurent au jour 6 Au jour 10, 7 des 11 souris survivent. Le taux de survie est égal à 63.6%.
Le ratio poids mouillé sur poids sec des poumons est mesuré 3 jours après l'administration de ricine aux souris en présence ou non d'anticorps 43RCA. Comme indiqué dans le tableau ci- dessous, le ratio diminue si les souris reçoivent de la ricine pré-mélangée avec l'anticorps 43RCA, démontrant que cet anticorps 43RCA neutralise la toxicité de la toxine et limite l'œdème des poumons.
Exemple 9 : Administration par instillation de l'anticorps monoclonal chimérique homme/macaque à des souris et détermination de doses minimales
Des souris BALb/c ont été exposées à de la ricine par instillation pulmonaire à raison de 16μg/kg de poids corporel et ont reçu une administration de 43RCA 6 heures après à raison de 1, 5, 10, 20 μg.
La figure 12 montrent que quelque soit la dose administrée, on observe 100% de survie des souris. L'anticorps 43RCA présente une efficacité thérapeutique dès 1 μg lorsqu'il est administré 6 heures après l'intoxication par la ricine.
Des souris BALb/c ont été exposées à de la ricine par instillation pulmonaire à raison de 16μ§/1¾ de poids corporel et la survie a été contrôlée pendant 10 jours après l'administration de la ricine. L'anticorps de type IgG 43RCA anti-chaine A de la ricine ou une IgG humaine contrôle ont été administrées par instillations pulmonaire à raison de 150 mg.
Comme indiqué sur la figure 13, les souris ayant reçu la ricine et une IgG contrôle meurent toutes au jour 4. Les souris ayant reçu l'anticorps 43RCA 44 heures après l'administration pulmonaire de ricine montrent une survie égale à 83% (n= 12). Les souris ayant reçu l'anticorps 43RCA 54 heures après l'administration pulmonaire de ricine montrent une survie égale à 75% (n=8). L'anticorps 43RCA présente donc une efficacité thérapeutique même lorsqu'il est administré plus de deux jours après l'intoxication par la ricine.
Exemple 10 : Administration par aérosol de l'anticorps monoclonal chimérique homme/macaque.
Des souris ont été exposées à des aérosols contenant de la ricine et de l'anticorps anti ricine obtenus par un nébulisateur Collison (diamètre aérodynamique médian en masse [MMAD] =1,2 urn).
Les concentrations en ricine et en anticorps, lors de chaque exposition, ont été identiques (ricin = 1 mg/ml, anticorps = 14 mg/ml); la concentration en aérosol étant déterminée par la durée d'exposition.
Les aérosols sont mesurés continuellement durant l'exposition au moyen d'un impacteur en verre (AGI). La concentration en protéine recueillie dans l'impacteur a été mesurée par le kit de dosage de protéines micro BCA (Pierce Co., Rockford, IL, U.S.A.)
Les conditions de diffusion des aérosols et leur recueillement sont restés constantes tout au long de l'étude. La concentration en aérosol ^g/L) ont été calculées et la dose de ricine inhale ^g/souris) a été estimé par la formule de Guyton.
Claims
1. Anticorps monoclonal chimérique dirigé contre la ricine, dans lequel la chaîne légère et la chaîne lourde sont telles que :
• la région constante de la chaîne légère est essentiellement constituée de la région constante de la chaîne légère d'une immunoglobuline humaine,
• la région constante de la chaîne lourde est essentiellement constituée de la région constante de la chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine,
• la région variable de la chaîne légère comprend la région variable de la chaîne légère d'une immunoglobuline de macaque, et
• la région variable de la chaîne lourde comprend la région variable de la chaîne lourde d'une immunoglobuline de macaque,
ledit anticorps monoclonal n'induisant substantiellement pas de réponse immune anti anticorps chimériques.
2. Anticorps monoclonal selon la revendication 1, capable de neutraliser la ricine, et notamment présentant un taux de neutralisation de la ricine supérieur au taux de neutralisation d'un fragment scFv dirigé contre la ricine.
3. Anticorps monoclonal selon la revendication 1 ou 2, dans lequel :
• la région constante de la chaîne légère comprend ou consiste en la région constante de la chaîne légère d'une immunoglobuline humaine de type IgGl, et
• la région constante de la chaîne lourde comprend ou consiste en la région constante de la chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine de type IgGl
ladite chaîne légère d'une immunoglobuline humaine de type IgGl et ladite chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine de type IgGl étant notamment la région constante d'une chaîne légère et la région constante d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine obtenue par immunisation avec l'antigène Rhésus D, et en particulier du clone T125-A2 humain.
4. Anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel :
• la région variable de la chaîne légère dudit anticorps monoclonal comprend ou est constituée de la séquence SEQ ID NO 2, et • la région variable de la chaîne lourde dudit anticorps monoclonal comprend ou est constituée de la séquence SEQ ID NO 4.
5. Anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel :
• la région variable de la chaîne légère dudit anticorps monoclonal comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO 6,
• la région variable de la chaîne lourde dudit anticorps monoclonal comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO 8.
6. Fragment de l'anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, ledit fragment étant un fragment Fab ou F(ab)'2.
7. Acide nucléique comprenant une séquence codant la chaîne légère de l'anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, notamment comprenant l'une quelconque des séquences SEQ ID NO 1, 5, 9 ou 13.
8. Acide nucléique comprenant une séquence codant la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal selon la revendication 1 à 5, notamment comprenant l'une quelconque des séquences SEQ ID NO 3, 7, 11 ou 15.
9. Acide nucléique comprenant une séquence codant la chaîne légère d'un anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 et comprenant une séquence codant la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.
10. Vecteur d'expression comprenant au moins un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, ledit acide nucléique étant sous contrôle des éléments permettant son expression.
11. Vecteur d'expression selon la revendication 10, comprenant
• un premier acide nucléique choisi parmi les acides nucléiques de séquences suivantes : SEQ ID NO 1, 5, 9 et 13, ledit premier acide nucléique étant sous contrôle des éléments permettant son expression, et • un second acide nucléique choisi parmi les acides nucléiques de séquences suivantes : SEQ ID NO 3, 7, 11 et 15, ledit second acide nucléique étant sous contrôle des éléments permettant son expression,
12. Vecteur d'expression selon la revendication 10 ou 11, comprenant ou consistant en la séquence SEQ ID N0 21.
13. Composition pharmaceutique, et notamment vaccinale, comprenant au moins
• un anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, ou
• un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, ou
• un vecteur selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, ou
• un fragment dudit anticorps monoclonal selon la revendication 6,
en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
14. Composition pharmaceutique, et notamment vaccinale, comprenant au moins un anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
15. Utilisation d'au moins :
• un anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, ou
• un fragment dudit anticorps monoclonal selon la revendication 6, ou
• un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, ou
• un vecteur selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, ou
• une cellule selon l'une quelconque des revendications 13 à 15,
pour la préparation d'un médicament pour le traitement ou la prévention d'une pathologie associée à la contamination par la ricine.
16. Méthode de dosage in vitro de la ricine dans un échantillon biologique issu d'un individu susceptible d'être contaminé par la ricine, ladite méthode comprenant :
• la mise en contact dudit échantillon avec au moins un anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, et • la détermination de la présence ou l'absence de ricine dans ledit échantillon par la détection de la formation d'un éventuel complexe immun entre la ricine et ledit anticorps monoclonal.
17. Procédé de décontamination in vitro d'un échantillon susceptible contaminé par la ricine, notamment d'un échantillon biologique, comprenant :
• la mise en contact dudit échantillon avec au moins un anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, et
• l'élimination, dudit échantillon, des complexes immuns formés entre la ricine et ledit anticorps monoclonal.
18. Procédé de préparation d'un anticorps monoclonal anti ricine selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 comprenant :
a. la transformation d'une cellule, notamment de mammifère, en particulier la lignée YB2/0 avec au moins un vecteur selon l'une quelconque des revendications 10 à 12,
b. la sélection des cellules transformées,
c. l'évaluation de la production dudit anticorps des clones sélectionnés à l'étape précédente, par la détermination de la présence ou de l'absence de la formation d'un éventuel complexe immun entre la ricine et ledit anticorps monoclonal.
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