WO2011055088A1 - Anticorps chimerique anti ricine - Google Patents

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WO2011055088A1
WO2011055088A1 PCT/FR2010/052375 FR2010052375W WO2011055088A1 WO 2011055088 A1 WO2011055088 A1 WO 2011055088A1 FR 2010052375 W FR2010052375 W FR 2010052375W WO 2011055088 A1 WO2011055088 A1 WO 2011055088A1
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monoclonal antibody
ricin
light chain
heavy chain
nucleic acid
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PCT/FR2010/052375
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Philippe Thullier
Alexandre Fontayne
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Etat Francais Represente Par Le Delegue General Pour L'armement
Lfb Biotechnologies
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Definitions

  • the present invention relates to a chimeric antibody against ricin.
  • Ricin is a toxalbumin produced by a shrub of the Euphorbiaceae family, Ricinus communis.
  • Ricin is a very toxic glycoprotein with a molecular weight of 66,000 Da, consisting of two polypeptide chains A and B, linked together by a disulfide bridge.
  • the B chain allows the toxin to attach to the cell wall and the A chain, responsible for the toxic properties, is able to inhibit protein synthesis by inhibiting 28S ribosomal RNA, resulting in cell death. It is present at a concentration varying from 1 to 10% in the castor seed. It can be extracted from incompletely purified castor oil.
  • Ricin is an excessively toxic toxin. However, its toxicity varies according to its mode of penetration into the body.
  • the symptoms are not very specific and vary depending on the route of absorption of ricin. They usually occur within 2 to 24 hours and rarely beyond 2 days.
  • Absorption by ingestion causes vomiting, discomfort, abdominal pain, bloody diarrhea (watery stools similar to rice water), painful need to defecate or urinate (anuria), dehydration, drowsiness, muscle weakness, cramps, vasomotor paralysis, and tachycardia.
  • Inhalation absorption causes weakness, fever, dizziness, dyspnoea, coughing, pulmonary edema, pain in the limbs.
  • the infection can have a deadly outcome.
  • the estimated lethal dose of ricin is 1 to 10 ⁇ g / kg.
  • Another strategy for the treatment of ricin poisoning could be vaccination.
  • antibodies have been developed for the purpose of interfering with the binding of anthrax toxin to cell-surface receptors or for the purpose of inhibiting the assembly of the toxin.
  • no specific ricin therapy is proposed.
  • fragments are small in size, have a very short half-life and are rapidly eliminated by the kidneys and are not able to provide long-term protection. In addition, because of the absence of constant region, these fragments have a low efficiency of stimulation of the immune system (recruitment of effectors of immunity).
  • the object of the invention is to provide neutralizing antibodies to ricin.
  • the invention also aims to provide means for producing these ricin-specific antibodies.
  • the invention relates to a chimeric monoclonal antibody against ricin, wherein the light chain and the heavy chain are such that:
  • the constant region of the light chain essentially consists of the constant region of the light chain of a human immunoglobulin,
  • the constant region of the heavy chain essentially consists of the constant region of the heavy chain of a human immunoglobulin
  • variable region of the light chain comprises the variable region of the light chain of a macaque immunoglobulin
  • variable region of the heavy chain comprises the variable region of the heavy chain of a macaque immunoglobulin
  • said monoclonal antibody does not substantially induce any chimeric anti-chimeric immune response.
  • the invention is based on the finding made by the inventors that macaque / human chimeric antibodies of the invention show an improvement in the neutralization of ricin, compared to the antibodies or antibody fragments of the prior art, and that said Antibodies are similar to human antibodies so should not cause any chimeric anti-antibody immune response.
  • antibody refers to an immunoglobulin, a multimeric protein consisting of 4 chains participating in the acquired immune response.
  • Immunoglobulins are well known to those skilled in the art and consist of an assembly of two dimers each consisting of a heavy chain and a light chain.
  • the multimeric complex assembled by the binding of a light chain and a heavy chain by a disulfide bridge between two cysteines, the two heavy chains being itself also interconnected by two disulfide bridges.
  • Each of the heavy chains and light chains consists of a constant region and a variable region.
  • the assembly of the chains that make up an antibody makes it possible to define a characteristic three-dimensional structure in Y, where
  • the base of Y corresponds to the constant region Fc which is recognized by complement and Fc receptors, and
  • each light chain consists of a variable region (V L ) and a constant region (C L ).
  • Each heavy chain consists of a variable region (V H) and a constant region consisting of three constant domains Cm, Cm and C - The domains Cm and C compose the domain Fc.
  • FIG. 1 The structure of an antibody is shown schematically in FIG. 1
  • variable region of the light chain consists of three domains determining antigen recognition (CDR) surrounded by four framework domains.
  • CDR antigen recognition
  • the three-dimensional folding of the variable region is such that the 3 CDRs are exposed on the same side of the protein and allow the formation of a specific structure recognizing a specific antigen.
  • the pearl collar structure of a variable region of a light or heavy chain of an antibody is shown in FIG. 2.
  • the antibodies described in the invention are isolated and purified, and are different from natural antibodies because they are chimerical. These antibodies are mature, that is to say they have an ad hoc three-dimensional structure allowing them to recognize the antigen, and have all the post-translational modifications essential for their antigenic recognition.
  • chimeric monoclonal antibody in the invention an isolated antibody, in which the sequence of each light chain and / or each heavy chain constituting it comprises or consists of a hybrid sequence derived from at least two distinct animals. .
  • the chimeric antibodies of the invention are human / macaque hybrids, which signifies that a region of the sequence of the light and heavy chains is derived from the sequence of a macaque immunoglobulin, and that the rest of the sequence of said heavy chains and said light chains is derived from the sequence of one, or possibly several, human immunoglobulin.
  • the constant region of the light chain essentially consists of the constant region of the light chain of a human immunoglobulin" means that the constant region of the light chain may consist of the sequence of the constant region of a light chain of human immunoglobulin, but may also consist of a sequence corresponding to the fusion of several sequences of several constant regions of several human immunoglobulins.
  • the constant region of the light chain may consist of a sequence corresponding to a mosaic of sequences of light chain constant regions, provided that said mosaic sequence reconstitutes a sequence of a constant region of a light region. light chain.
  • the constant region of the heavy chain consists essentially of the constant region of the heavy chain of a human immunoglobulin
  • the constant region of the heavy chain can be constituted by the sequence of the constant region of a heavy chain.
  • human immunoglobulin but may also consist of a sequence corresponding to the fusion of several sequences of several constant regions of several human immunoglobulins.
  • the constant region of the heavy chain may consist of a sequence corresponding to a mosaic of heavy chain constant region sequences, provided that said mosaic sequence reconstitutes a sequence of a constant region of a heavy chain.
  • variable region of the light chain comprises the variable region of the light chain of a macaque immunoglobulin
  • sequence of the variable region of the light chain corresponds to the sequence of the variable region of a light chain of a macaque immunoglobulin.
  • This variable region of the light chain can be fused in its N-terminal region to the C-terminal region of a sequence allowing the excretion of the antibody. This sequence allowing the excretion of the antibody is called signal peptide or leader sequence.
  • variable region of the heavy chain comprises the variable region of the heavy chain of a macaque immunoglobulin
  • sequence of the variable region of the heavy chain corresponds to the sequence of the variable region of a heavy chain of a macaque immunoglobulin.
  • This variable region of the heavy chain can be fused in its N-terminal region to the C-terminal region of a sequence allowing the excretion of the antibody.
  • said anti-ricin monoclonal antibody is produced as a precursor.
  • This precursor therefore has in the N-terminal region of the light chain and the heavy chain a leader sequence, or signal peptide.
  • This precursor then undergoes various stages of maturation, and in particular the leader sequences are cleaved to allow the secretion of the antibody in the extracellular medium.
  • the secreted antibody is therefore a mature antibody.
  • the monoclonal antibodies of the invention "do not substantially induce chimeric anti-chimeric immune responses". This means that when the monoclonal antibodies of the invention are administered to an individual, in particular a human, the immune system of said individual is substantially not or only slightly stimulated, and therefore said individual does not produce antibodies directed against the antibodies of the subject. 'invention.
  • An advantageous embodiment of the invention relates to a monoclonal antibody as defined above capable of neutralizing ricin in vitro and in vivo, and in particular having a ricin neutralization rate greater than the neutralization rate of a scFv fragment directed against ricin.
  • the antibody according to the invention is capable of inhibiting ricin, more effectively, at a lower dose, than a single chain fragment of an immunoglobulin (scFv), and in particular an scFv fragment.
  • scFv immunoglobulin
  • An advantageous embodiment of the invention relates to a monoclonal antibody as defined above, capable of neutralizing ricin, and especially having a ricin neutralization level of at least 40%, 50%, 60%, 70%> and preferably at least 80%.
  • the monoclonal antibodies of the invention are "capable of neutralizing ricin". This means that the monoclonal antibodies according to the invention are capable of preventing the action of ricin, or in other words of inhibiting the toxic effect of ricin on the 28S subunit of ribosomes. This inhibition is due to sequestration of ricin, or a masking of the ricin or domains responsible for its toxic effect.
  • the monoclonal antibodies of the invention neutralize the toxic effect of ricin.
  • Antibody neutralization activity can be measured using a routine protocol commonly used by those skilled in the art. Among these tests, there may be mentioned the neutralization test based on cell survival.
  • the J774A.1 cells (ATCC-LGC, Molsheim, France) are inoculated at a density of 14,000 cells / well (200 ⁇ l / well), in a culture plate and cultured at 37 ° C. in the presence of 5% of CO 2 for 24 hours in DMEM supplemented with 10% fetal calf serum.
  • the antibodies of the invention are incubated with 480 ng / ml ricin or with control serum (non-relevant antibody) for 1 hour. The mixture is then added to the cells. 24 hours later, cell viability is measured by techniques known to those skilled in the art (exclusion Trypan blue, Cytox (Promega), apoptosis measurement ). Each test is corrected against cellular "100% viability" controls (no ricin and no antibodies) and "0% viability" (ricin without antibodies).
  • Another test may be used to measure the neutralizing activity of the monoclonal antibodies of the invention, it is a question of measuring the inhibition of protein translation.
  • a marker protein for example the translation of luciferase
  • an acellular in vitro translation system [Haie ML Pharmacol Toxicol 2001, 88 (5): 255-260] is measured.
  • the measurement of the translation of the AR message of luciferase is as follows:
  • the monoclonal antibodies are deposited in 96-well plates in phosphate buffered saline (PB S) and ricin is added to a final concentration of 4 mM.
  • PB S phosphate buffered saline
  • Rabbit reticulocyte lysate supplemented with RNAsin®, amino acids and messenger RNA from luciferase is then added to each well. The reaction is carried out for 1h30.
  • Another advantageous embodiment of the invention relates to a monoclonal antibody defined above, in which:
  • the constant region of the light chain comprises or consists of the constant region of the light chain of an IgG1-type human immunoglobulin
  • the constant region of the heavy chain comprises or consists of the constant region of the heavy chain of an IgG1-type human immunoglobulin
  • said light chain of an IgG1-type human immunoglobulin and said IgG1-type human immunoglobulin heavy chain being in particular the constant region of a light chain and the constant region of a heavy chain of a human immunoglobulin obtained by immunization with Rhesus D antigen.
  • the monoclonal antibody of the invention is not only capable of neutralizing ricin via its variable regions, but also of facilitating the degradation of ricin by promoting its degradation by macrophages.
  • the constant regions of the light and heavy chains of the monoclonal antibody of the invention are derived from the IgG1 of an individual immunized with a Rhesus D antigen.
  • the monoclonal antibody described above and hereinafter has a light chain, and in particular a constant region of said kappa light chain ( ⁇ ).
  • the invention relates to a monoclonal antibody directed against ricin described above, in which:
  • the light chain of said monoclonal antibody comprises at least the regions of critical complementarity (CDR Lm ) of the variable region of a light chain of a macaque immunoglobulin, and
  • the heavy chain of said monoclonal antibody comprises at least the regions of critical complementarity (CDRn m ) of the variable region of a heavy chain of a macaque immunoglobulin.
  • the monoclonal antibody of the invention therefore comprises, in the light chain variable region, at least the 3 CDRs of a macaque immunoglobulin, the remainder of the variable region of the light chain possibly derived from macaque or any another species of mammal and in particular of human.
  • the monoclonal antibody of the invention therefore comprises, in the variable region of the heavy chain, at least the 3 CDRs of a macaque immunoglobulin, the rest of the variable region of the heavy chain may be derived from macaque or any another species of mammal and in particular of human.
  • the antibody When the monoclonal antibody possesses in the variable light chain region only the CDRs of the light chain of a macaque immunoglobulin, and has in the variable region of the heavy chain only the CDRs of the heavy chain of a immunoglobulin macaque, and that all the rest of the two variable regions is derived from a human immunoglobulin, the antibody is then called humanized chimeric antibody.
  • Another advantageous embodiment of the invention relates to a monoclonal antibody defined above, in which:
  • variable region of the light chain of said monoclonal antibody comprises or consists of the following sequence SEQ ID NO 2:
  • variable region of the heavy chain of said monoclonal antibody comprises or consists of the following sequence SEQ ID No. 4:
  • Another advantageous embodiment of the invention relates to a monoclonal antibody defined above, in which:
  • variable region of the light chain of said monoclonal antibody consists of the following sequence SEQ ID NO 2:
  • variable region of the heavy chain of said monoclonal antibody consists of the following sequence SEQ ID NO 4:
  • a light chain comprising or consisting of the following sequence SEQ ID NO 6: Nter-ELQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRSYLAWYQQKPGKAPKLLIYDAAHL QSGVPSRFSGSGSGTEFSLTISSLQPEDFAVYYCQQRNSYPLTFGGGTKVEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKD STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC-Cter and
  • the invention also relates to a monoclonal antibody directed against ricin as defined above, in which:
  • the light chain of said monoclonal antibody comprises the leader region of the variable region of a light chain of a human immunoglobulin (LVn,
  • the heavy chain of said monoclonal antibody comprises the leader region of the variable region of a heavy chain of a human immunoglobulin (LVia).
  • Another advantageous embodiment of the invention relates to a monoclonal antibody directed against ricin as defined above, in which:
  • variable region of the light chain comprises, in its N-terminal region, a signal sequence, in particular the leader region of the variable region of the light chain of a second immunoglobulin, in particular a human, and
  • variable region of the heavy chain comprises, in its N-terminal region, a signal sequence, in particular the leader region of the variable region of the heavy chain of a third immunoglobulin, in particular a human,
  • the leader region, or signal peptide which is in the N-terminal region of the variable region of the light chain and the heavy chain corresponds to a secretory protein sequence.
  • said leader sequence means that the protein being synthesized must remain in the light of the rough endoplasmic reticulum (RER). This sequence is then removed from the mature light chain and the mature heavy chain, so that the mature monoclonal antibody capable of interacting with ricin no longer has this sequence.
  • the invention relates to a precursor of a monoclonal antibody mentioned above, wherein:
  • the LV L I I leader region comprises or consists of the following SEQ ID NO 17 sequence Nter-MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC-Cter, and
  • the LVia leader region comprises or consists of the following sequence SEQ ID NO 18
  • the invention relates to a precursor of the previously described monoclonal antibody, wherein:
  • variable region of the light chain of said monoclonal antibody comprises or consists of the following sequence SEQ ID NO 10:
  • variable region of the heavy chain of said monoclonal antibody comprises or consists of the following sequence SEQ ID NO 12:
  • the underlined amino acids whose symbol in "one letter" coding is in lower case correspond to the amino acids of the leader sequence.
  • the amino acids whose symbol in the "one letter” coding is in upper case correspond to the variable region.
  • the invention relates, in an advantageous embodiment, to a monoclonal antibody defined above comprising:
  • a heavy chain consisting of the following sequence SEQ ID NO 16:
  • the invention also relates to the light chain of the monoclonal antibody defined above, and in particular comprising the sequence SEQ ID NO 6, and more specifically consisting of the sequence SEQ ID NO 6 or SEQ ID NO 14.
  • the invention also relates to the heavy chain defined above, and in particular comprising the sequence SEQ ID NO 8, and more specifically consisting of the sequence SEQ ID NO 8 or SEQ ID NO 16.
  • the invention also relates to a fragment of the monoclonal antibody as defined above, said fragment being a Fab or F (ab) '2 fragment.
  • Fragments of scFv type are excluded from the invention.
  • Fab and F (ab) '2 fragments therefore consist of:
  • a light chain comprising a constant region of a light chain of a human immunoglobulin and a variable region of a macaque immunoglobulin
  • a heavy chain comprising a constant region of a chain heavy of a human immunoglobulin and a variable region of a macaque immunoglobulin
  • the subject of the invention is also a nucleic acid comprising a sequence encoding the light chain of the monoclonal antibody defined above, in particular comprising the sequence SEQ ID No. 1 or 5
  • the nucleic acid sequences are such that the sequence SEQ ID NO 1 codes for the protein SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3 codes for the protein SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 code for the Protein SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7 code for the protein SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9 code for the protein SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11 code for the protein SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13 code for the protein SEQ ID NO 14 and SEQ ID NO 15 codes for the protein SEQ ID NO 16.
  • the subject of the invention is also a nucleic acid comprising or consisting of a sequence encoding the light chain of the monoclonal antibody defined above, in particular comprising the sequence SEQ ID No. 9 or 13.
  • nucleic acid comprising or consisting of a sequence encoding the heavy chain of the monoclonal antibody as defined above, in particular comprising the sequence SEQ ID 7.
  • nucleic acid comprising or consisting of a sequence encoding the heavy chain of the monoclonal antibody as defined above, in particular comprising the sequence SEQ ID 15.
  • nucleic acid as defined above, comprising:
  • Another advantageous embodiment of the invention relates to a nucleic acid comprising or consisting of a sequence encoding the light chain of the monoclonal antibody defined above, in particular comprising or consisting of any of the sequences SEQ ID NO 1, 5 , 9 or 13.
  • nucleic acid comprising a sequence encoding the heavy chain of the monoclonal antibody defined above, in particular comprising or consisting of any of SEQ ID NO: 3, 7, 11 or 15 sequences. .
  • nucleic acid as defined above, comprising:
  • a nucleic acid comprising or consisting of a sequence chosen from nucleic acids SEQ ID Nos. 1, 5, 9 and 13, and
  • a nucleic acid comprising or consisting of a sequence selected from nucleic acids SEQ ID NO 3, 7, 11 and 15.
  • nucleic acid as defined above, comprising:
  • a nucleic acid comprising or consisting of the sequence SEQ ID No. 5 or 13, and
  • a nucleic acid comprising or consisting of the sequence SEQ ID No. 7 or 15.
  • Another advantageous embodiment of the invention relates to a nucleic acid as defined above, comprising:
  • a nucleic acid comprising or consisting of the sequence SEQ ID NO 13 and a nucleic acid comprising or consisting of the sequence SEQ ID NO 15.
  • the invention relates to a nucleic acid comprising a sequence encoding the light chain of the monoclonal antibody defined above and comprising a sequence encoding the heavy chain of the monoclonal antibody defined above.
  • the above-mentioned sequence comprises, in the same molecule, or more particularly on the same strand, a sequence encoding the light chain of the monoclonal antibody defined above followed by a sequence encoding the heavy chain of the 'antibody monoclonal defined above. It also means that the aforementioned sequence comprises, in the same molecule, a sequence encoding the heavy chain of the monoclonal antibody defined above followed by a sequence encoding the light chain of the monoclonal antibody defined above.
  • the invention also relates to an expression vector comprising at least one nucleic acid defined above, said nucleic acid being under control elements allowing its expression.
  • expression vector it is defined in the invention a DNA molecule that has elements allowing its replication (duplication) in at least one living organism. These elements allowing replication include origins of replication of yeast or bacteria, or elements for controlling the replication of a virus.
  • the vectors according to the invention are in particular plasmids, phages, artificial chromosomes of yeast (YAC), artificial chromosomes of bacteria (BAC), modified genomes of replicative viruses or integrative viruses, etc.
  • vectors are called "expression” because they have nucleotide sequences that allow the expression, that is to say the transcription in RNA, of the nucleotide sequences that they control.
  • said nucleic acid sequence contained in said vector is placed "under control of the elements allowing its expression".
  • said expression vector has at least one transcription initiation sequence such as a promoter of a virus such as the SV40 simian virus early promoter, or Cytomegalovirus (CMV) or the promoter sequences of the virus. Rous sarcoma (RSV), and in particular a sequence or promoter comprising a TATAA box.
  • said vector also has at least one transcription termination sequence, and in particular a polyadenylation sequence derived from a mammalian gene, in particular a human gene.
  • nucleotide sequence contained in said vector may be added other sequences for regulating or modulating the expression of said sequence.
  • a non-exhaustive list includes: introns of mammalian genes, and in particular human genes, enhancer-type transcriptional regulation sequences ("enhancers") or else transcribed but untranslated sequences of mammalian and, in particular, human genes.
  • An advantageous embodiment of the invention relates to an expression vector as defined above, comprising at least one nucleic acid chosen from nucleic acids comprising the following sequences: SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 and 15.
  • Another advantageous embodiment of the invention relates to a set comprising two expression vectors
  • the first expression vector comprising a nucleic acid comprising a sequence selected from nucleic acids SEQ ID Nos. 1, 5, 9 and 13, and
  • the second expression vector comprising a nucleic acid comprising a sequence chosen from nucleic acids SEQ ID NO 3, 7, 11 and 15.
  • Another advantageous embodiment of the invention relates to a set comprising two aforementioned expression vectors, in which
  • the first expression vector comprising a nucleic acid comprising the sequence SEQ ID NO 13, and
  • the second expression vector comprising a nucleic acid comprising the sequence SEQ ID No. 15.
  • Another advantageous embodiment of the invention relates to an expression vector mentioned above, comprising
  • a first nucleic acid selected from the nucleic acids of the following sequences: SEQ ID No. 1, 5, 9 and 13, said first nucleic acid being under control of the elements allowing its expression, and
  • a second nucleic acid chosen from the nucleic acids of the following sequences: SEQ ID NOs 3, 7, 11 and 15, said second nucleic acid being under control of the elements allowing its expression.
  • Another advantageous embodiment of the invention relates to an expression vector mentioned above, comprising
  • a first nucleic acid comprising or consisting of the sequence SEQ ID No. 13, said first nucleic acid being under control of the elements allowing its expression
  • a second nucleic acid comprising or consisting of the sequence SEQ ID NO 15, said second nucleic acid being under control of the elements allowing its expression.
  • This expression vector thus comprises two nucleic acid sequences mentioned above, and more particularly comprises a nucleic acid sequence encoding the light chain of the monoclonal antibody defined above, and a nucleic acid sequence encoding the heavy chain. of the monoclonal antibody defined above.
  • said expression vector contains a first element allowing the expression of the nucleic acid sequence encoding the light chain of the monoclonal antibody defined above and a second element allowing the expression of the nucleic acid sequence. coding the heavy chain of the monoclonal antibody defined above, said first and said second element allowing the expression of said nucleic acid sequences being identical or different, and preferably identical.
  • control elements include the repeated long terminal sequences (LTR) of the RSV virus.
  • Another embodiment of the invention relates to an expression vector defined above, comprising at least one antibiotic resistance gene.
  • the expression vector may contain 1 or 2, or 3 or 4 or 5 or 6 antibiotic resistance genes.
  • antibiotic resistance gene is defined in the invention a gene whose expression product exerts a cytostatic effect (growth inhibition) or cytolytic (cell death) cells.
  • the antibiotics concerned by the invention in particular have an effect on prokaryotic cells, but may also have an effect on eukaryotic cells, whether they be yeasts, plants, insects, amphibians or mammals.
  • the aforementioned expression vector has an antibiotic resistance gene specific for prokaryotic cells and at least one gene, preferably 2 genes, for resistance to an antibiotic specific for eukaryotic cells.
  • an embodiment of the invention relates to an expression vector as defined above, comprising or consisting of the sequence SEQ ID NO 21.
  • the transcriptional units (UT) of interest coding for the heavy chain and the light chain are cloned in the form of cDNA and under the control of the RSV promoter.
  • This promoter corresponds to the Rous sarcoma virus long terminal repeat (LTR) which contains an enhancer element in its 5 'region.
  • LTR Rous sarcoma virus long terminal repeat
  • An artificial intron optimized for alternative splicing and composed of a 5 'donor sequence isolated from human beta-globin and 3' of an acceptor sequence derived from the variable gene of the promoter is cloned immediately 3 'from the promoter. the immunoglobulin heavy chain.
  • the UTs of interest end with polyadenylation sequences derived from the human growth hormone (GH) gene (hGH) for the heavy and bovine (bGH) chain for the light chain.
  • GH human growth hormone
  • bGH bovine
  • This difference of origin in the choice of polyA is carried out in order to limit recombinations between the genes of interest.
  • This LTRRSV promoter, chimeric intron, cDNA and polyA sequence association was selected because it confers high transcriptional and translational activity in the YB2 / 0 cell line.
  • the expression vector contains, in addition to UTs of interest, several UTs of resistance to chemical molecules: gene Bla: This gene (named Amp in the vector restriction maps) expresses the beta-lactamase enzyme in the bacterium (promoter prokaryotic) and confers resistance to ampicillin.
  • Neo gene This gene encodes the enzyme npt II (neomycin phosphotransferase II) under the control of the SV40 promoter and confers resistance to various antibiotics such as neomycin, kanamycin or G418 to mammalian cells transfected and expressing this gene.
  • npt II neomycin phosphotransferase II
  • Dhfr gene This gene encodes the enzyme DHFR (DiHydroFolate Reductase) under the control of the SV40 promoter and confers resistance to methotrexate (MTX). This method can be used to perform gene amplification by increasing the MTX concentration thereby resulting in increased antibody production by the transfected cells.
  • DHFR DiHydroFolate Reductase
  • MTX methotrexate
  • the subject of the invention is also a cell, or several cells, or a cell line comprising at least one expression vector as defined above.
  • the cells "comprising at least one vector” correspond to cells in which at least one aforementioned expression vector has been introduced.
  • Examples include calcium phosphate transfection techniques, using lipid particles or "lipofectants", or techniques for generating holes in the cell membrane by means of an electric shock (electroporation). This list is not exhaustive.
  • the cells or cell lines used in the invention are cells derived from prokaryotes or eukaryotes such as bacteria, yeasts or other fungi, insect cells, amphibian cells, mammalian cells and especially rodents, human cells ...
  • the cell is distinguished from the cell line by the fact that the cell line is a cell population in established culture, that is to say that it has acquired characteristics allowing their proliferation in vitro, and in particular a characteristic of immortalization.
  • An advantageous embodiment of the invention relates to a cell or a previously mentioned cell line, having a fucosylation activity substantially reduced compared to a normal cell, said cell or cell line being in particular a mammalian cell, and in particular the line YB2 / 0.
  • the advantageous cell line of the invention is the YB2 / 0 line available from the ATCC under the number CRL 1662.
  • the invention relates to a cell or a cell line comprising an expression vector defined above, allowing the expression
  • the invention relates to a cell or a cell line obtained by cloning a cell mentioned above.
  • the cell cloning technique is widely known to those skilled in the art, and is based on the principle of isolating the cells of a cell population so that each individual cell gives rise to daughter cells (or clone) isolated from the daughter cells. of the division of the other cells of the population.
  • the general principle of cell cloning is the limiting dilution of cells.
  • Another advantageous embodiment of the invention relates to a cell or a cell line resulting from the above-mentioned cloning, said cells or cell line being characterized by the fact that they
  • apoptosis or programmed cell death
  • techniques routinely used by a person skilled in the art which consists in evaluating at least one of the stages characteristic of apoptosis: modification of the plasma membrane, modification of the Caspase family proteins, modification of the transaction factors and DNA fragmentation.
  • the cells that produce a significant amount of monoclonal antibody including those that produce at least 20 ⁇ g / ml of monoclonal antibody. Measurement of the amount of antibody is readily achievable by those skilled in the art, using simple protein assay techniques.
  • Another embodiment of the invention relates to a cell or a cell line obtained by cloning the aforementioned cell, and in particular characterized in that it
  • the concept of cell stability implies that the cells resulting from the cloning of the cloned cells from the cells containing at least one vector allowing the expression of a monoclonal antibody according to the invention are capable, during the different divisions, of preserving their resistance properties. antibiotic and produce the monoclonal antibodies.
  • Another aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition, and especially a vaccine composition, comprising at least
  • the invention relates to a pharmaceutical composition, and especially a vaccine composition, comprising at least one monoclonal antibody defined above, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the dosage of the active substance is particularly dependent on the mode of administration, and is readily determined by those skilled in the art.
  • a pharmaceutically acceptable carrier refers to a non-toxic material that is compatible with a biological system such as a cell, a cell culture, a tissue or an organism.
  • a therapeutically effective amount may range from 0.01 mg / kg to 50 mg / kg, preferably from 0.1 mg / kg to 20 mg / kg, and more preferably from 0.1 mg / kg to 2 mg / kg, in one or more daily administrations. for one or more days.
  • composition of the invention may be administered especially intravenously, in particular by injection or by gradual infusion, subcutaneously, systemically, by the local route by means of infiltrations, per os, or by respiratory route or pulmonary by aerosol.
  • Preparations for parenteral administration may include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions or emulsions.
  • non-aqueous solvents are propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils, such as olive oil, or injectable organic esters such as ethyl oleate.
  • Aqueous vehicles include water, alcohol / water solutions, emulsions or suspensions.
  • the aerosol is in the form of a liquid containing the anti-ricin antibody and an excipient.
  • the excipients are most often alcohols, but any other excipient known to those skilled in the art may be used in the context of the invention.
  • the aerosol in liquid form can be combined with a propellant such as chlorofluorocarbons (CFC) or hydrofluorocarbons (HFA).
  • the aerosol in liquid form may also consist of lipid microparticles and an excipient.
  • the excipients may be chosen from synthetic dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), lactose or hydroxyethylstarch (HES).
  • DPPC dipalmitoylphosphatidylcholine
  • HES hydroxyethylstarch
  • the aerosol is in the form of a powder.
  • the powder is composed of particles of size between 1 and 10 ⁇ and preferably less than 9 ⁇ , or preferably less than 5 ⁇ .
  • spray accompanied by freeze drying or ultrasonic crystallization, directed precipitation can be used to obtain a dry powder: spray accompanied by freeze drying or ultrasonic crystallization, directed precipitation.
  • the administration of the aerosol will be carried out according to whether it is in liquid or solid form using a nebulizer that can be pneumatic, ultrasonic or sieved or using a metered dose inhaler (liquid pressurized, mechanical, electrohydrodynamic, thermal) for liquid or inhaler formulations for solid formulations.
  • a metered dose inhaler liquid pressurized, mechanical, electrohydrodynamic, thermal
  • the invention also relates to the use of at least:
  • treatment we mean the means of treating a declared pathology, whose symptoms are visible.
  • prevention means the means of preventing said pathology from being declared.
  • the pathologies associated with ricin correspond to the symptoms related to the ricin contamination, and in particular the diarrhea, the modifications of the electrolytes, the dehydration, the edemas, the respiratory, hepatic and renal disorders ...
  • the subject of the invention is also a method for the in vitro assay of ricin in a biological sample derived from an individual likely to be contaminated with ricin, said method comprising:
  • the monoclonal antibodies of the invention can therefore be used to detect the presence of ricin in a biological sample.
  • said antibodies can be used for the implementation of detection techniques known to those skilled in the art such as ELISA, RIE, imunoprecipitation or immunolabeling (Western blot).
  • the invention also relates to a method for in vitro decontamination of a sample likely to be contaminated with ricin, in particular a biological sample, comprising:
  • One way of carrying out said decontamination process consists, for example, in the use of the monoclonal antibodies of the invention on which magnetic beads are grafted onto the constant region of said antibody.
  • Another means of carrying out said decontamination process consists, for example, in the use of immobilized monoclonal antibodies on a column comprising Staphylococcus aureus protein A or G.
  • the decontaminated sample is then passed through the column in order to retain, on the antibodies according to the immobilized invention, the ricin that may be contained in said sample.
  • transforming a cell in particular a mammalian cell, in particular the YB2 / 0 line with at least one vector defined previously,
  • An advantageous embodiment of the invention relates to a process defined above, in which the selection of the transformed cells is carried out by determining their resistance to at least one antibiotic.
  • An advantageous embodiment of the invention relates to a method defined above, wherein the cells producing an amount of said monoclonal antibody greater than 22 ⁇ g / ml are selected.
  • An advantageous embodiment of the invention relates to a method defined above, wherein the cells selected in step c are cloned.
  • An advantageous embodiment of the invention relates to a method defined above, where the cloned cells are again selected for: • their resistance to at least one antibiotic, and
  • Figure 1 corresponds to a schematic representation of an antibody.
  • the black parts correspond to the constant parts of the heavy chains, the parts in dark gray correspond to the constant part of the light chain, the parts in light gray correspond to the variable part of the heavy chain, and the white parts correspond to the variable part of the light chain.
  • -S-S- represents the disulfide bridges established between two cysteines.
  • the CDR and framework regions are indicated by arrows.
  • the Fab and Fc fragments are also represented.
  • Figure 2 is a schematic representation in a bead collar of the amino acid sequence of a variable part of an immunoglobulin light chain or heavy chain.
  • the black balls correspond to the amino acids forming the framework regions, and the gray balls correspond to the amino acids representing the CDRs.
  • Figure 3 corresponds to a schematic representation of the fusion between the leader peptide of the variable part of the heavy chain of a human immunoglobulin with the variable part of the macaque immunoglobulin heavy chain. Oligonucleotides used for PCR are shown in the diagram. Unique restriction sites are also indicated.
  • Figure 4 is a schematic representation of the fusion between the leader peptide of the variable part of the light chain of a human immunoglobulin with the variable part of the macaque immunoglobulin light chain. Oligonucleotides used for PCR are shown in the diagram. Unique restriction sites are also indicated.
  • Figure 5 corresponds to the schematic representation of the H622-26 intermediate cloning vector containing the "double hybrid" heavy chain where the human leader is fused to the variable region of the macaque heavy chain (VH 43RCA), itself fused to the constant region of human immunoglobulin (CH T125).
  • FIG. 6 corresponds to the schematic representation of the final cloning vector HK622-26 (SEQ ID No. 21) containing the "double hybrid" heavy chain where the human leader is fused to the variable region of the macaque heavy chain (VH 43RCA) , itself fused to the constant region of human immunoglobulin (CH T125), and the "double hybrid” light chain where the human leader is fused to the variable region of the macaque light chain (VK 43RCA), itself even fused to the constant region of human immunoglobulin (CK T125)
  • Figure 7 corresponds to a 2% agarose gel on which were separated the PCR products allowing the detection of mycoplasmas.
  • Lanes 3 and 22 correspond to the migration of the molecular weight marker
  • lanes 1 and 20 correspond to the migration of the PCR products made from a negative control
  • lanes 2 and 21 correspond to the migration of the products of PCR made from a positive control.
  • Lanes 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 23, and 25 correspond to the migration of the PCR products made respectively from the pellets of cloids GG3, IF2, EE9, EG11, JB3, ED9, EC2, GF2, 1A1 and KC9.
  • Lanes 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 24, and 26 correspond to the migration of the PCR products produced respectively from the supernatants of cloids GG3, IF2, EE9, EG11, JB3, ED9, EC2, GF2, Al and KC9.
  • Figure 8 graphically depicts the antibody production stability of the three EE9, GG3 and IF2 cloids.
  • the gray bars represent the measurements made during the first assay, and the black bars represent the measurements made during the second assay.
  • the x-axis represents the time in days, and the y-axis represents the amount of antibody produced in ng / mL.
  • Figure 9 corresponds to a 2% agarose gel on which were separated the PCR products allowing the detection of mycoplasmas.
  • Lanes 4, 17, 30 and 33 correspond to the migration of the molecular weight marker
  • lanes 3 and 31 correspond to the migration of the PCR products made from a negative control
  • lanes 2 and 32 correspond to the migration of PCR products made from a positive control.
  • Lanes 5, 7, 9, 11, 13, 15, 18, 20, 22, 24, 26 and 28 correspond to the migration of the PCR products produced respectively from the pellets of the clones GG9-4B2, GG9-2F8, GG9 -5D8, GG9-2G10, IF2-2F2, IF2-2E3, GG3-2G4, GG3-EC2, GG3-1G9, GG3-2G2, GG3-5G11, GG3-1D8 and EE9-5G7.
  • Lanes 6, 8, 10, 12, 14, 16, 19, 21, 23, 25, 27 and 29 correspond to the migration of the PCR products produced respectively from the pellets of the clones EE9-4B2, EE9-2F8, EE9 -5D8, EE9-2G10, IF2-2F2, IF2-2E3, GG3-2G4, GG3-EC2, GG3-1G9, GG3-2G2, GG3-5G11, GG3-1D8 and EE9-5G7.
  • Figure 10 graphically depicts the antibody production stability of the EE9-2G10, EE9-5D8, EE9-5G7, GG3-1G9, GG3-2G4, IF2-1C7, IF2-2D8 and IF2-2E9 clones on 8 days.
  • the gray bars represent the measurements made during the first assay, and the black bars represent the measurements made during the second assay.
  • the x-axis represents the time in days, and the y-axis represents the amount of antibody produced in ng / mL.
  • FIG. 11 represents the cumulative survival curve of Camplan-Meyer from mice which have received 50 ⁇ g of ricin by pulmonary instillation as well as a control human IgG (triangles with a curve), ie the antibody according to the invention (43RCA) 6h ( curve with a square), 22h (curve with diamonds) or 24 hours (curve interrupted with circles) after instillation of ricin.
  • FIG. 12 represents the cumulative survival curve of Camplan-Meyer from mice which received 50 ⁇ g of ricin by pulmonary instillation as well as 20 ⁇ g of a control human IgG (curve with triangles), ie the antibody according to the invention (43RCA ) at a concentration of 20, 10, 5 and 1 ⁇ g,
  • FIG. 13 represents the cumulative survival curve of Camplan-Meyer of mice which received 50 ⁇ g of ricin by pulmonary instillation as well as 150 ⁇ g of the antibody according to the invention (43RCA) 44 hours (curve with squares) or 54 hours (curve with diamonds) after instillation of ricin. In control (curve with triangles) is indicated the survival of smiles treated with ricin and a non-relevant immunoglobulin.
  • the expression vector, HK622-26 (SEQ ID NO. 21), was constructed for the expression of chimeric macaque-man anti-ricin monoclonal antibody (IgG).
  • the vector HK622-26 was constructed from the CHK622-05 vector by "double" chimerization, that is, by PCR assembly of human leader regions and addition of human CK and CH constant regions by cloning. variable sequences VH and VK macaque.
  • VH and VK heavy and light chain variable regions are extracted from a vector coding for an anti-ricin ScFv, ScFv43RCA / H2-Vl 16 and are introduced into the "generic" vector CHK622-08 after adding leader sequences to ensure a good synthesis of the chimeric antibody.
  • the CK and CH constant regions are of human origin and derived from the T125-A2 clone directed against the Rhesus D antigen
  • the region VH43RCA corresponds to the chimerization of:
  • VH leader sequence of the human sequence M29812 (subgroup VH4, VH4-59), contained in the vector HK558-12, said VH leader sequence consisting of the following sequence:
  • VH leader sequence (SEQ ID NO 19) is amplified by PCR using the following pair of primers:
  • the PCR reaction is carried out according to the following protocol:
  • amplicon 1 containing the Nhe I site (GCTAGC)), the Kozak sequence (fat) and the human leader sequence SEQ ID NO
  • sequence of the macaque VH region (SEQ ID NO 3) is amplified by PCR using the following pair of primers:
  • the PCR reaction is carried out according to the following protocol:
  • This pair of primers makes it possible to obtain an amplicon (amplicon 2) of 396 bases containing the macaque VH sequence and the Apa I site (GGGCCCC).
  • the amplicons 1 and 2 obtained above are then combined to give the final amplicon 3 by assembly PCR using the primers VH1 and VH4 mentioned above.
  • the assembly PCR reaction is carried out according to the following protocol:
  • FIG. 3 shows the VH43RCA region with the different primer pairs used for the preparation of the final chimeric VH fragment (amplicon 3) of 461 bp.
  • VK43RCA region corresponds to the chimerization of:
  • leader sequence VK of the human sequence Z0006 (subgroup VK1, VK1-13) contained in the vector HK558-12, said leader sequence VK consisting of the following sequence:
  • VK leader sequence (SEQ ID NO 17) is amplified by PCR using the following pair of primers: • VKl-Ricine primer senses:
  • the PCR reaction is carried out according to the following protocol:
  • This pair of primers makes it possible to obtain a 102 bases amplicon (amplicon) containing the Spe I site (ACTAGT), the kozak (fatty) sequence and the human leader sequence SEQ ID NO 19).
  • sequence of the macaque VK region (SEQ ID NO 1) is amplified by PCR using the following pair of primers:
  • the PCR reaction is carried out according to the following protocol:
  • the amplicons and 2 'obtained previously are then combined to give the final amplicon 3' by assembly PCR using the VK1 and VK4 primers mentioned above.
  • the assembly PCR reaction is carried out according to the following protocol:
  • Figure 4 shows the region VK43RCA with the different primer pairs used in the preparation of the final chimeric VH fragment (amplicon 3 ') of 436 bp.
  • the amplicon 3 and the CHK622-08 vector are subjected to double digestion with the Nhe I-Apa I restriction enzymes.
  • the digestion fragments are then purified, and a vector / amplicon 3 mixture is subjected to a cohesive ligation.
  • the products of the ligation are then used to transform bacteria, and the transformants are selected on LB medium supplemented with ampicillin.
  • the resistant clones are then tested by PCR using primers 5PRSVBIS and GSP2ANP: a 783 bp fragment is expected for the positive clones.
  • the digestion fragments are then purified, and a vector / 3 'amplicon mixture is subjected to a cohesive ligation.
  • the products of the ligation are then used to transform bacteria, and the transformants are selected on LB medium supplemented with ampicillin.
  • the resistant clones are then tested by PCR using the primers 5 '1PLC and CK4: a fragment of 539 bp is expected for the positive clones.
  • the expected profile consists of 4 bands 3759 + 2894 + 2559 + 155 lbp.
  • the vector is then ready for cell transformation.
  • This study aims to obtain clones producing anti-ricin in the YB2 / 0 line by direct double transfection.
  • YB2 / 0 cells were maintained (by subculture at 1x10 5 cells / ml twice weekly) for transfection at 10 5 cells / ml in EMS medium, 5% FCS.
  • HK622-26 / EcoRV H416-24 (T +) and K416-23 (T +).
  • HK622-26 / EcoRV means that the vector obtained in Example 1 was linearized by digestion with the Eco RV enzyme to promote its integration into the transformed cells.
  • the cells are transfected according to the following protocol:
  • 4 cuvettes comprising 500 cells are prepared in the following manner:
  • the cells are then electroporated at a voltage of 230 V and a capacitance of 960 ⁇ for 17.9 ms.
  • the cells are gently removed from the cuvettes and placed in selective medium, RPMI, 5% FCS dialyzed, 1 g / 1 geneticin for P24 (25000 cells / ml) and P96 at 100 cells / well (Geneticin II). being applied at D + 3, once expression of the resistance gene has occurred) and in RPMI, 5% FCS dialysed, 0.5 g / L geneticin, 50 nM methotrexate (MTX) and seeded in plates of culture as follows:
  • Control Cuvette 1 Plate 96 wells at 2500 cells / well
  • Control Cuvette T- 1 Plate 96 wells at 2500 cells / well
  • the cells are cultured in the presence of antibiotic for 4 weeks.
  • the medium is changed twice a week.
  • the rest of the transformed cells are divided into 6-well plates for each of the bowls 1 and 2.
  • the average production rate of antibodies is evaluated on 3 pools from each of the transfections of cuvettes 1 and 2 after 13 days of culture in a selective medium. A total of 6 pools were tested, and the average monoclonal antibody concentration was measured in ⁇ g / ml. Cell density and cell viability were also determined.
  • Table 1 viability and dosage of the antibody production of the different pools.
  • Table 3 Assay of the production of antibodies of the various cloids tested.
  • 10 have a monoclonal antibody production greater than 8.9 ⁇ g / mL. All these cloids (EC2, ED9, EE9, EG1, GF2, CG3, IA1, IF2, JB3 and KC9) were frozen in antibiotic-free medium in the presence of 10% DMSO, and stored at -195 ° C. liquid nitrogen.
  • the 3 cloids (EE9, CG3 and IF2), whose antibody production is the highest (greater than 22 ⁇ g / mL), are selected for a new cell cloning.
  • Monoclonal antibody production stability was also tested for each of the selected cloids.
  • the GG3 clone saw its antibody production decrease very significantly during the passages.
  • a second cloning of the cloids EE9, CG3 and IF2 was performed in DMEM 5% SVF dialysed medium. Five 96-well plates at 40 cells per well were seeded in DMEM 5% SVF dialysed medium. There was no clone for this cloning.
  • a second cloning was performed in DMEM and EMS 5% SVF dialysed medium.
  • the cells were thawed in RPMI 5% FCS dialyzed medium and then passed in EMS medium.
  • Table 6 number of clones that emerged after cloning of the 3 cloids, depending on the culture medium.
  • Table 7 assay for the production of antibodies of the various clones tested.
  • Clones from clone EE9 (EE9-5G7, EE9-5D8, EE9-2F8, EE9-4B1 and EE8-2G10) secrete an average of more than 4 ⁇ g / ml of monoclonal antibody
  • clones from clone GG3 (GG3-2G4, GG3-1G9, GG3-2G2, GG3-1D8 and GG3-5G11) secrete, on average, more than 6 ⁇ g / ml of monoclonal antibody and the 5 clones from clone IF2 (IF2-2E9, IF2- 2D8, IF2-1C7, IF2-1D5 and IF2-2F7) secrete more than 8 ⁇ g / mL of monoclonal antibody.
  • the clones selected are therefore the following clones: EE9-5G7, EE9-5D8, EE9-2G10, GG3-2G4, GG3-1G9, IF2-2E9, IF2-2D8 and IF2-1C7.
  • the eight selected clones were maintained for 8 weeks by cascade dilution in a 24-well plate with subculture every 7 days.
  • the clones derived from the EE9 clone were maintained in EMS + 5% FCS dialysed medium and clones derived from GG3 clones and IF2 in DMEM + 5% FCS dialysed medium.
  • Clone EE9-5G7 was selected for the production of 500 mg of antibody in the static maximum pseudo-production assays that established its 19 mg / L production level and also on the results of the stability study conducted on the parental clique EE9 whose production level is stable over six weeks.
  • the EE9-5G7 clone was amplified so as to produce two successive productions of 30 rollers in batch mode. Production was halted when cell viability fell below 50%. The determination of the supernatant at the end of production was only 12 mg / L, ie 648 mg of antibody produced. This supernatant was assayed, centrifuged, filtered before being concentrated 15 times. The concentrate was purified by affinity chromatography and 468 mg of purified antibody was obtained.
  • the production of anti-ricin monoclonal antibody by clones IF2-2D8 and IF2-2E9 was performed by roller production in RPMI and EMS medium.
  • the cells were thawed and seeded at 2.10 5 cells / ml in DMEM medium, 5%> SVF degraded to Ig, 0.5 g / l geneticin.
  • the viability at thawing was 91%> for the IF2-2D8 clone and 93% for the IF2-2E9 clone.
  • the supernatants were filtered through a 0.22 ⁇ filter, and the antibodies were purified by HiTrap rprotein A FF column affinity chromatography.
  • IF2-2D8 and IF2-2E9 anti-ricin antibody purification test
  • the concentrates yielded between 16 and 32.8 mg of purified antibody for each of the clones.
  • the IF2-2D8 and IF2-2E9 clones were stable during the various passages (unlike their parental cloids) produce twice as much monoclonal antibody as the EE9-5G7 clone.
  • the physicochemical characterization of the antibodies showed that the IF2-2E9 clone produced the most similar antibody to the antibody produced by the EE9-5G7 clone. As a result, the IF2-2E9 clone was chosen for the next production of anti-ricin antibodies
  • the culture supernatant of clone IF2-2E9 was concentrated, filtered and the antibodies were purified by a first Sepharose Protein A affinity chromatography step followed by two ion exchange steps.
  • the amount of purified antibody is 642 mg.
  • the J774A.1 cells (ATCC-LGC, Molsheim, France) are inoculated at a density of 14,000 cells / well (200 ⁇ l / well), in a culture plate and cultured at 37 ° C. in the presence of 5% of CO 2 for 24 hours in DMEM supplemented with 10% fetal calf serum.
  • the antibodies of the invention are incubated with 480 ng / ml ricin or with control serum (non-relevant antibody) for 1 hour. The mixture is then added to the cells. 24 hours later, cell viability is measured by techniques Known to those skilled in the art (Trypan blue exclusion, Cytox (Promega), measurement of apoptosis, etc.).
  • Another test may be used to measure the neutralizing activity of the monoclonal antibodies of the invention, it is a question of measuring the inhibition of protein translation.
  • a marker protein for example the translation of luciferase
  • the test for measuring the translation of the luciferase message RNA is as follows:
  • the monoclonal antibodies are deposited in 96-well plates in phosphate buffered saline (PBS) and ricin is added to a final concentration of 4 mM.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Rabbit reticulocyte lysate supplemented with RNAsin®, amino acids and messenger RNA from luciferase is then added to each well. The reaction is carried out for 1h30.
  • reaction buffer for detecting luciferase activity (Luciferase Assay Reagent, Promega, Inc.).
  • the emitted light (luminescence) is measured in counts per second (CPS) using a multiplaque reader
  • Example 6 Test of the in vivo neutralization of ricin by the human / macaque chimeric monoclonal antibody
  • Fisher rats (Charles River Laboratories L'Arbresle, France) received a dose of 16 ⁇ g / kg of ricin and 50 ⁇ g of anti-ricin antibody after adaptation of the protocol described by Ezzell et al. (Ezzell et al., 1984. Infect Immun 45: 761-767) The tests were carried out by measuring the viability of the animals according to the doses of ricin and injected anti-ricin antibodies.
  • Example 7 Affinity test of the human / macaque chimeric monoclonal antibody for ricin.
  • Ricin was immobilized on a CM5 chip (Biacore) by means of an amine coupling according to the manufacturer's instructions.
  • Example 8 Administration by instillation of the human / macaque chimeric monoclonal antibody to mice and determination of survival
  • BALb / c mice (20-22g) were exposed to ricin by pulmonary instillation at 16 ⁇ g / kg body weight and survival was monitored for 10 days after ricin administration.
  • the IgG 43RCA anti-ricin A chain antibody or a control human IgG were administered by pulmonary instillation at a rate of 50 ⁇ g.
  • the protective effect of the IgG 43RCA anti-chain A ricin antibody was measured by the percentage of survival of mice and the ratio of wet weight to dry weight of the lungs given that ricin induces pulmonary edema.
  • the survival percentage is 57.1% when the antibody is administered 22 hours after administration of ricin by pulmonary route.
  • the survival rate is 63.6%.
  • the wet weight to dry weight ratio of the lungs is measured 3 days after the administration of ricin to the mice in the presence or absence of 43RCA antibodies. As shown in the table below, the ratio decreases if the mice receive ricin premixed with the 43RCA antibody, demonstrating that this 43RCA antibody neutralizes the toxicity of the toxin and limits the edema of the lungs.
  • Example 9 Administration by instillation of the human / macaque chimeric monoclonal antibody to mice and determination of minimum doses
  • BALb / c mice were exposed to ricin by pulmonary instillation at a rate of 16 .mu.g / kg of body weight and were administered 43RCA 6 hours later at a rate of 1, 5, 10, 20 micrograms.
  • Figure 12 show that regardless of the dose administered, 100% survival of the mice is observed.
  • the 43RCA antibody has a therapeutic efficacy of 1 ⁇ g when administered 6 hours after ricin intoxication.
  • BALb / c mice were exposed to ricin by pulmonary instillation at 16 ⁇ / 13 ⁇ 4 body weight and survival was monitored for 10 days after ricin administration.
  • the ricin anti-rat A chain IgG 43RCA antibody or a control human IgG were administered by pulmonary instillations at 150 mg.
  • mice that received ricin and one control IgG all died on day 4.
  • the 43RCA antibody therefore has therapeutic efficacy even when administered more than two days after ricin intoxication.
  • Example 10 Aerosol Administration of the Monoclonal Antibody Man-Macaque Monoclonal.
  • ricin 1 mg / ml
  • antibody 14 mg / ml
  • aerosol concentration being determined by the duration of exposure.
  • Aerosols are measured continuously during exposure using a glass impactor (AGI).
  • AGI glass impactor
  • the protein concentration collected in the impactor was measured by the micro BCA protein assay kit (Pierce Co., Rockford, IL, U.S.A.)

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Abstract

La présente invention a pour objet un anticorps monoclonal chimérique dirigé contre la ricine, dans lequel la chaîne légère et la chaîne lourde sont telles que: la région constante de la chaîne légère et la région constante de la chaîne lourde sont essentiellement constituées respectivement de la région constante de la chaîne légère et la région constante de la chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine, la région variable de la chaîne légère et la région variable de la chaîne lourde comprennent respectivement la région variable de la chaîne légère et la région variable de la chaîne lourde d'une immunoglobuline de macaque, ledit anticorps monoclonal n'induisant substantiellement pas de réponse immune anti anticorps chimériques.

Description

ANTICORPS CHIMERIQUE ANTI RICINE
La présente invention concerne un anticorps chimérique dirigé contre la Ricine. La ricine est une toxalbumine produite par un arbrisseau de la famille des euphorbiacées, le Ricin {Ricinus communis). La ricine est une glycoprotéine très toxique de poids moléculaire 66 000 Da, formée de deux chaînes polypeptidiques A et B, reliées entre elles par un pont disulfure. La chaîne B permet à la toxine de se fixer à la paroi cellulaire et la chaîne A, responsable des propriétés toxiques, est capable d'inhiber la synthèse des protéines en inhibant TARN ribosomal 28S, entraînant la mort cellulaire. Elle est présente à une concentration variant de 1 à 10 % dans la graine de Ricin. Elle peut être extraite de l'huile de ricin incomplètement purifiée.
La ricine est une toxine excessivement toxique. Cependant sa toxicité varie selon son mode de pénétration dans l'organisme.
Lorsque la ricine est absorbée par voie digestive, elle est en grande partie détruite par les enzymes digestives protéolytiques mais son absorption perlinguale peut augmenter la quantité absorbée.
Par contre, lorsque la ricine est inhalée (voie pulmonaire) ou administrée par voie parentérale sa toxicité est multipliée par 1000.
Les symptômes sont peu spécifiques et divergent selon la voie d'absorption de la ricine. Ils se manifestent généralement en l'espace de 2 à 24 heures et rarement au-delà de deux jours.
L'absorption par ingestion provoque des vomissements, des malaises, des douleurs abdominales, des diarrhées sanglantes (selles semblables à de l'eau de riz), un besoin douloureux de déféquer ou d'uriner (anurie), la déshydratation, la somnolence, une faiblesse musculaire, des crampes, une paralysie vasomotrice, et la tachycardie. L'absorption par inhalation provoque un affaiblissement, de la fièvre, des vertiges, de la dyspnée, de la toux, des œdèmes pulmonaires, des douleurs dans les membres.
Après une apparente amélioration, l'infection peut avoir une issue mortelle.
Chez l'homme, la dose estimée létale de ricine est de 1 à 10 μg/kg.
Au vu de ces symptômes variés et la dangerosité à très faible dose de la ricine, il existe un réel besoin de se protéger contre la contamination par la ricine, et notamment lors d'une éventuelle utilisation dans le cadre d'attaques bio-terroristes. Un test de diagnostic rapide de l'intoxication par la ricine par voie pulmonaire a récemment été développé (Guglielmo-Viret et al. 2007). Après une exposition à la ricine, les antidotes suivants peuvent être utilisés : analogues de sucre empêchant la liaison de la ricine à sa cible ou inhibiteurs de la sous-unité catalytique tels que Fazidothymidine.
Une autre stratégie pour le traitement d'une intoxication à la ricine pourrait être la vaccination. Par exemple, des anticorps ont été développés dans le but d'interférer avec la liaison de la toxine de la maladie du charbon aux récepteurs de surface cellulaire ou dans le but d'inhiber l'assemblage de la toxine. Cependant, à l'heure actuelle, aucune thérapie spécifique de la ricine n'est proposée.
Wang et al. (Wang et al, 2007, Biotechnol Lett 29 : 1811-1816) ont récemment développé un anticorps chimérique homme/souris dirigé contre la ricine. Cependant, cet anticorps chimérique de première génération, bien que spécifique de la ricine, est capable d'induire une réaction immune anti anticorps chimériques (HACA « human anti chimeric antibody ») et d'induire une faible tolérance chez le patient.
La demande internationale WO 2009/053637 décrit des fragments des régions constantes simple chaîne (scFv) d'anticorps issus de macaque capables de neutraliser efficacement la ricine, ainsi que des fragments scFv humanisés ou super humanisés.
Cependant, de tels fragments sont de petite taille, ont une demie vie très courte et sont rapidement éliminés par les reins et ne sont pas capables de fournir une protection à long terme. De plus, du fait de l'absence de région constante, ces fragments ont une faible efficacité de stimulation du système immunitaire (recrutement des effecteurs de l'immunité).
Aussi, il existe un réel besoin de fournir des anticorps spécifiques de la ricine qui soient stables après administration et qui possèdent un taux de neutralisation de la toxine très important.
Il est également important de fournir des anticorps qui, lorsqu'ils sont administrés, ne favorisent pas une réponse immunitaire de type HACA de l'hôte.
Aussi, l'invention a pour objet de fournir des anticorps neutralisants de la ricine.
L'invention a également pour objet de fournir des moyens de production de ces anticorps spécifiques de la ricine.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation de ces anticorps en tant que médicaments ou agents de décontamination lors d'une contamination par la ricine. L'invention concerne un anticorps monoclonal chimérique dirigé contre la ricine, dans lequel la chaîne légère et la chaîne lourde sont telles que :
• la région constante de la chaîne légère est essentiellement constituée de la région constante de la chaîne légère d'une immunoglobuline humaine,
• la région constante de la chaîne lourde est essentiellement constituée de la région constante de la chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine,
• la région variable de la chaîne légère comprend la région variable de la chaîne légère d'une immunoglobuline de macaque, et
• la région variable de la chaîne lourde comprend la région variable de la chaîne lourde d'une immunoglobuline de macaque,
ledit anticorps monoclonal n'induisant substantiellement pas de réponse immune anti anticorps chimériques.
L'invention repose sur la constatation faite par les Inventeurs que des anticorps chimériques macaques/humains de l'invention montrent une amélioration de la neutralisation de la ricine, par rapport aux anticorps ou fragments d'anticorps de l'art antérieur, et que lesdits anticorps sont similaires aux anticorps humains donc ne devraient pas provoquer pas de réponse immune de type anticorps anti anticorps chimériques.
Dans l'invention, le terme « anticorps » se réfère à une immunoglobuline, protéine multimérique constituée de 4 chaînes participant à la réponse immunitaire acquise.
Les immunoglobulines sont bien connues de l'homme de métier et sont constituées d'un assemblage de deux dimères constitués chacun d'une chaîne lourde et d'une chaîne légère. Le complexe multimérique assemblé par la liaison d'une chaîne légère et d'une chaîne lourde par un pont disulfure entre deux cystéines, les deux chaînes lourdes étant elle-même également reliées entre elles par deux ponts disulfure.
Chacune des chaînes lourdes et des chaînes légères est constituée d'une région constante et d'une région variable. L'assemblage des chaînes qui composent un anticorps permet de définir une structure tridimensionnelle caractéristique en Y, où
la base du Y correspond à la région constante Fc qui est reconnue par le complément et les récepteurs Fc, et
l'extrémité des bras du Y correspondent à l'assemblage respectif des régions variables de la chaîne légère et variable de la chaîne lourde. Plus précisément, chaque chaîne légère est constituée d'une région variable (VL) et d'une région constante (CL). Chaque chaîne lourde est constituée d'une région variable (VH) et d'une région constante constituée de trois domaines constants Cm, Cm et C - Les domaines Cm et C composent le domaine Fc.
La structure d'un anticorps est représentée schématiquement dans la figure 1.
La région variable de la chaîne légère est constituée de trois domaines déterminant la reconnaissance de l'antigène (CDR) entourées de quatre domaines charpentes. Le repliement tridimensionnel de la région variable est tel que les 3 CDR sont exposés du même coté de la protéine et permettent la formation d'une structure spécifique reconnaissant un antigène déterminé.
La structure en collier de perle d'une région variable d'une chaîne légère ou lourde d'un anticorps est représentée dans la figure 2. Les anticorps décrits dans l'invention sont isolés et purifiés, et sont différents des anticorps naturels du fait qu'ils sont chimériques. Ces anticorps sont matures, c'est-à-dire qu'ils possèdent une structure tridimensionnelle ad hoc leur permettant de reconnaître l'antigène, et possèdent toutes les modifications post-traductionnelles essentielles à leur reconnaissance antigénique.
II s'agit d'anticorps monoclonaux, c'est-à-dire qu'ils ne reconnaissent qu'un seul déterminant antigénique dans la ricine, contrairement aux anticorps polyclonaux qui correspondent à un mélange d'anticorps monoclonaux, et donc peuvent reconnaître plusieurs déterminants antigéniques dans une même protéine. Par « anticorps monoclonal chimérique », on entend dans l'invention un anticorps isolé, dans lequel la séquence de chaque chaîne légère et/ou de chaque chaîne lourde qui le constitue comprend ou consiste en une séquence hybride issue d'au moins deux animaux distincts. Notamment les anticorps chimériques de l'invention sont des hybrides homme/macaque, ce qui signifie qu'une région de la séquence des chaînes légères et des chaînes lourdes est issue de la séquence d'une immunoglobuline de macaque, et que le reste de la séquence desdites chaînes lourdes et des dites chaînes légères est issue de la séquence d'une, ou éventuellement plusieurs, immunoglobuline humaine. « La région constante de la chaîne légère est essentiellement constituée de la région constante de la chaîne légère d'une immunoglobuline humaine » signifie que la région constante de la chaîne légère peut être constituée de la séquence de la région constante d'une chaîne légère d'une immunoglobuline humaine, mais peut également être constituée d'une séquence correspondant à la fusion de plusieurs séquences de plusieurs régions constantes de plusieurs immunoglobulines humaines. En d'autres termes, la région constante de la chaîne légère peut être constituée d'une séquence correspondant à une mosaïque de séquences de régions constantes de chaînes légères, sous réserve que ladite séquence mosaïque reconstitue une séquence d'une région constante d'une chaîne légère.
« La région constante de la chaîne lourde est essentiellement constituée de la région constante de la chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine » signifie que la région constante de la chaîne lourde peut être constituée de la séquence de la région constante d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine, mais peut également être constituée d'une séquence correspondant à la fusion de plusieurs séquences de plusieurs régions constantes de plusieurs immunoglobulines humaines. En d'autres termes, la région constante de la chaîne lourde peut être constituée d'une séquence correspondant à une mosaïque de séquences de régions constantes de chaînes lourdes, sous réserve que ladite séquence mosaïque reconstitue une séquence d'une région constante d'une chaîne lourde.
« La région variable de la chaîne légère comprend la région variable de la chaîne légère d'une immunoglobuline de macaque » signifie que la séquence de la région variable de la chaîne légère correspond à la séquence de la région variable d'une chaîne légère d'une immunoglobuline de macaque. Cette région variable de la chaîne légère peut être fusionnée dans sa région N-terminale, à la région C-terminale d'une séquence permettant l'excrétion de l'anticorps. Cette séquence permettant l'excrétion de l'anticorps est appelée peptide signal ou séquence leader.
« La région variable de la chaîne lourde comprend la région variable de la chaîne lourde d'une immunoglobuline de macaque » signifie que la séquence de la région variable de la chaîne lourde correspond à la séquence de la région variable d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline de macaque. Cette région variable de la chaîne lourde peut être fusionnée dans sa région N-terminale, à la région C-terminale d'une séquence permettant l'excrétion de l'anticorps.
Ainsi la définition de l'anticorps monoclonal de l'invention couvre à la fois :
le précurseur de l'anticorps chimérique homme/macaque tel que défini ci-dessus, et l'anticorps chimérique homme/macaque défini ci-dessus. Dans la cellule productrice de l'anticorps monoclonal de l'invention, ledit anticorps monoclonal anti ricine est produit sous forme d'un précurseur. Ce précurseur possède donc dans la région N-terminale de la chaîne légère et de la chaîne lourde une séquence leader, ou peptide signal. Ce précurseur subit alors diverses étapes de maturation, et en particulier les séquences leader sont clivées pour permettre la sécrétion de l'anticorps dans le milieu extracellulaire. L'anticorps sécrété est donc un anticorps mature.
Les anticorps monoclonaux de l'invention « n'induisent substantiellement pas de réponse immune anti anticorps chimériques ». Cela signifie que lorsque les anticorps monoclonaux de l'invention sont administrés à un individu, notamment humain, le système immunitaire dudit individu n'est substantiellement pas ou peu stimulé, et donc ledit individu ne produit pas d'anticorps dirigés contre les anticorps de l'invention. Un mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un anticorps monoclonal tel que défini précédemment capable de neutraliser la ricine in vitro et in vivo, et notamment présentant un taux de neutralisation de la ricine supérieur au taux de neutralisation d'un fragment scFv dirigé contre la ricine.
Les Inventeurs ont montré que l'anticorps selon l'invention est capable d'inhiber la ricine, de manière plus efficace, à une plus faible dose, qu'un fragment simple chaîne d'une immunoglobuline (scFv), et notamment un fragment scFv chimérique homme macaque tel que défini dans l'invention
Un mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un anticorps monoclonal tel que défini précédemment, capable de neutraliser la ricine, et notamment présentant un taux de neutralisation de la ricine d'au moins 40%, 50 %, 60%, 70%> et préférentiellement d'au moins 80%.
Les anticorps monoclonaux de l'invention sont « capables de neutraliser la ricine ». Cela signifie que les anticorps monoclonaux selon l'invention sont capables d'empêcher l'action de la ricine, ou en d'autres termes d'inhiber l'effet toxique de la ricine sur la sous unité 28S des ribosomes. Cette inhibition est due à une séquestration de la ricine, ou à un masquage du ou des domaines de la ricine responsable de son effet toxique.
Par conséquent, les anticorps monoclonaux de l'invention neutralisent l'effet toxique de la ricine. L'activité de neutralisation des anticorps peut être mesurée à l'aide de protocole de routine couramment utilisé par l'homme de métier. Parmi ces tests, on peut citer le test de neutralisation basé sur la survie cellulaire.
Dans ce test, on mesure la capacité qu'ont les anticorps de l'invention à protéger de la mort les cellules J774A.1 mises en contact avec de la Ricine.
Brièvement, les cellules J774A.1 (ATCC-LGC, Molsheim,France) sont ensemencées à une densité de 14,000 cellules/puits (200 μΐ/puits), dans une plaque de culture et cultivées à 37°C en présence de 5% de C02 pendant 24 heures dans du DMEM complémenté avec 10% de sérum de veau fœtal. Les anticorps de l'invention sont incubés avec 480 ng/ml de ricine ou avec du sérum contrôle (anticorps non relevant) pendant 1 heure. Le mélange est ensuite ajouté aux cellules. 24 heures après, la viabilité cellulaire est mesurée par des techniques connues de l'homme de métier (exclusion au bleu Trypan, Cytox (Promega), mesure de l'apoptose...). Chaque test est corrigé par rapport aux contrôles « 100% de viabilité » cellulaire (pas de ricine et pas d'anticorps) et « 0% viabilité » (ricine sans anticorps).
Un autre test peut être utilisé pour mesure l'activité neutralisante des anticorps monoclonaux de l'invention, il s'agit de mesurer l'inhibition de la traduction protéique. Pour cela on mesure la traduction d'une protéine marqueur, par exemple la traduction de la luciférase, dans un système de traduction in vitro acellulaire [Haie ML Pharmacol Toxicol 2001, 88(5):255-260]. Brièvement, le test de mesure de la traduction de l'AR message de la luciférase est le suivant :
Les anticorps monoclonaux sont déposés dans des plaques 96 puits dans du tampon phosphate salin (PB S) et de la ricine est ajoutée à une concentration finale de 4mM. Du lysat de réticulocyte de lapin complémenté de RNAsin ®, des acides aminés et de l'ARN messager de la luciférase est alors ajouté dans chaque puits. La réaction est réalisée pendant lh30.
5 μΐ^ de la reaction sont alors prélevés et ajouté à 45 μΐ^ de tampon réactionnel permettant de détecter l'activité luciférase (Luciférase assay reagent, Promega, Inc.). La lumière émise (luminescence) est mesurée en compte par seconde (CPS) à l'aide d'un lecteur multiplaque Victor (PerkinElmer Wallac, Boston MA). Les données sont exprimées en pourcentage par rapport au contrôle (% contrôle= (CPS traité/ CPS contrôle) xl00)).
Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un anticorps monoclonal défini précédemment, dans lequel :
• la région constante de la chaîne légère comprend ou consiste en la région constante de la chaîne légère d'une immunoglobuline humaine de type IgGl, et • la région constante de la chaîne lourde comprend ou consiste en la région constante de la chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine de type IgGl
ladite chaîne légère d'une immunoglobuline humaine de type IgGl et ladite chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine de type IgGl étant notamment la région constante d'une chaîne légère et la région constante d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine obtenue par immunisation avec l'antigène Rhésus D.
Ainsi, l'anticorps monoclonal de l'invention est non seulement capable de neutraliser la ricine par l'intermédiaire de ses régions variables, mais également de faciliter la dégradation de la ricine en favorisant sa dégradation par les macrophages.
Plus particulièrement les régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes de l'anticorps monoclonal de l'invention sont issues des IgGl d'un individu immunisé avec un antigène Rhésus D. Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, l'anticorps monoclonal décrit ci-dessus et ci-après possède une chaîne légère, et notamment une région constante de ladite chaîne légère de type kappa (κ).
Dans autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un anticorps monoclonal dirigé contre la ricine précédemment décrit, dans lequel :
• la chaîne légère dudit anticorps monoclonal comprend au moins les régions de complémentarité déterminante (CDRLm) de la région variable d'une chaîne légère d'une immunoglobuline de macaque, et
· la chaîne lourde dudit anticorps monoclonal comprend au moins les régions de complémentarité déterminante (CDRnm) de la région variable d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline de macaque.
L'anticorps monoclonal de l'invention comprend donc, dans la région variable de la chaîne légère, au moins les 3 CDR d'une immunoglobuline de macaque, le reste de la région variable de la chaîne légère pouvant être issue de macaque ou de toute autre espèce de mammifère et notamment d'humain.
L'anticorps monoclonal de l'invention comprend donc, dans la région variable de la chaîne lourde, au moins les 3 CDR d'une immunoglobuline de macaque, le reste de la région variable de la chaîne lourde pouvant être issue de macaque ou de toute autre espèce de mammifère et notamment d'humain.
Lorsque l'anticorps monoclonal ne possède dans la région variable de la chaîne légère que les CDR de la chaîne légère d'une immunoglobuline de macaque, et ne possède dans la région variable de la chaîne lourde que les CDR de la chaîne lourde d'une immunoglobuline de macaque, et que tout le reste des deux régions variables est issu d'une immunoglobuline humaine, l'anticorps est alors appelé anticorps chimérique humanisé.
Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un anticorps monoclonal défini ci-dessus, dans lequel :
• la région variable de la chaîne légère dudit anticorps monoclonal comprend ou est constitué de la séquence SEQ ID NO 2 suivantes :
Nter-ELQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRSYLAWYQQKPGKAPKLLIYDAAHL QSGVPSRFSGSGSGTEFSLTISSLQPEDFAVYYCQQRNSYPLTFGGGTKVEIK-Cter (SEQ ID NO 2), et
• la région variable de la chaîne lourde dudit anticorps monoclonal comprend ou est constitué de la séquence SEQ ID NO 4 suivantes :
Nter-QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMDWVRQAPGKGLEWVSRISP GGDVTWYADSVKGRFTISRDNAQNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARDDIVVSRIFDD WGQGVLVTVSS-Cter (SEQ ID NO 4).
Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un anticorps monoclonal défini ci-dessus, dans lequel :
• la région variable de la chaîne légère dudit anticorps monoclonal est constitué de la séquence SEQ ID NO 2 suivante :
Nter-ELQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRSYLAWYQQKPGKAPKLLIYDAAHL QSGVPSRFSGSGSGTEFSLTISSLQPEDFAVYYCQQRNSYPLTFGGGTKVEIK-Cter (SEQ ID NO 2), et
• la région variable de la chaîne lourde dudit anticorps monoclonal est constitué de la séquence SEQ ID NO 4 suivante :
Nter-QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMDWVRQAPGKGLEWVSRISP GGDVTWYADSVKGRFTISRDNAQNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARDDIVVSRIFDD WGQGVLVTVSS-Cter (SEQ ID NO 4). RI A S
Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un anticorps monoclonal tel que défini précédemment comprenant :
• une chaîne légère comprenant ou consistant en la séquence SEQ ID NO 6 suivante : Nter-ELQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRSYLAWYQQKPGKAPKLLIYDAAHL QSGVPSRFSGSGSGTEFSLTISSLQPEDFAVYYCQQRNSYPLTFGGGTKVEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKD STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC-Cter, et
• une chaîne lourde comprenant ou consistant en la séquence SEQ ID NO 8 suivante : Nter-QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMDWVRQAPGKGLEWVSRISP GGDVTWYADSVKGRFTISRDNAQNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARDDIVVSRIFDD WGQGVLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK VEPKSCD KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK-Cter
REV7
L'invention concerne également un anticorps monoclonal dirigé contre la ricine tel que défini ci-dessus, dans lequel :
• la chaîne légère dudit anticorps monoclonal comprend la région leader de la région variable d'une chaîne légère d'une immunoglobuline humaine (LVn ,
• la chaîne lourde dudit anticorps monoclonal comprend la région leader de la région variable d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine (LVia).
Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un anticorps monoclonal dirigé contre la ricine tel que défini précédemment, dans lequel :
• la région variable de la chaîne légère comprend, dans sa région N-terminale, une séquence signal, notamment la région leader de la région variable de la chaîne légère d'une seconde immunoglobuline, en particulier humaine, et
• la région variable de la chaîne lourde comprend, dans sa région N-terminale, une séquence signal, notamment la région leader de la région variable de la chaîne lourde d'une troisième immunoglobuline, en particulier humaine,
la seconde et la troisième immunoglobuline étant identiques ou différentes. Comme mentionné précédemment la région leader, ou peptide signal, qui se trouve dans la région N-terminale de la région variable de la chaîne légère et de la chaîne lourde correspond à une séquence protéique de sécrétion. Au cours de la synthèse protéique de la chaîne légère et de la chaîne lourde, ladite séquence leader signifie que la protéine en cours de synthèse doit rester dans la lumière du réticulum endoplasmique rugueux (RER). Cette séquence est ensuite éliminée de la chaîne légère mature et de la chaîne lourde mature, de telle sorte que l'anticorps monoclonal mature capable d'interagir avec la ricine ne possède plus cette séquence. De plus, l'invention concerne un précurseur d'un anticorps monoclonal susmentionné, dans lequel :
• la région leader LVLII comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO 17 suivante Nter-MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC-Cter, et
• La région leader LVia comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO 18 suivante
Nter-MKHLWFFLLLVAAPRWVLS- Cter..
Dans un autre mode de réalisation préféré, l'invention concerne un précurseur de l'anticorps monoclonal précédemment décrit, dans lequel :
· la région variable de la chaîne légère dudit anticorps monoclonal comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO 10 suivante :
Nter-MDMRVPAOLLGLLLLWLPGARCELOMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASOSIRSY LAWYQQKPGKAPKLLIYDAAHLQSGVPSRFSGSGSGTEFSLTISSLQPEDFAVYYCQQ RNSYPLTFGGGTKVEIK-Cter, et
· la région variable de la chaîne lourde dudit anticorps monoclonal comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO 12 suivante :
Nter-rnkhlwfflllvaaprwylsOVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMDWVROA PGKGLEWVSRISPGGDVTWYADSVKGRFTISRDNAQNTLYLQMNSLRAEDTAVYFC ARDDIVVSRIFDDWGQGVLVTVSS-Cter.
Dans les séquences susmentionnées (les séquences SEQ ID NO 10 et SEQ ID NO 12), les acides aminés soulignés dont le symbole en codification « une lettre » est en minuscule correspondent aux acides aminés de la séquence leader. Les acides aminés dont le symbole en codification « une lettre » est en majuscule correspondent à la région variable. L'invention concerne, dans un mode de réalisation avantageux, un anticorps monoclonal défini précédemment comprenant :
• une chaîne légère consistant en la séquence SEQ ID NO 14 suivante :
Nter-MDMRVPAOLLGLLLLWLPGARCELOMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASOSIRSY LAWYQQKPGKAPKLLIYDAAHLQSGVPSRFSGSGSGTEFSLTISSLQPEDFAVYYCQQ RNSYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPV TKSFNRGEC-Cter, et
• une chaîne lourde consistant en la séquence SEQ ID NO 16 suivante :
Nter-MKHLWFFLLLVAAPRWVLSOVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFTDYY MDWVRQAPGKGLEWVSRISPGGDVTWYADSVKGRFTISRDNAQNTLYLQMNSLRA EDTAVYFCARDDIVVSRIFDDWGQGVLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN VNHKP SNTKVDK VEPKS CDKTHTCPPCP APELLGGP S VFLFPPKPKDTLMI SRTPE V TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK-Cter
L'invention concerne également la chaîne légère de l'anticorps monoclonal défini ci dessus, et notamment comprenant la séquence SEQ ID NO 6, et plus précisément consistant en la séquence SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 14.
L'invention concerne également la chaîne lourde définie ci-dessus, et notamment comprenant la séquence SEQ ID NO 8, et plus précisément consistant en la séquence SEQ ID NO 8 ou SEQ ID NO 16.
L'invention concerne également un fragment de l'anticorps monoclonal tel que défini ci- dessus, ledit fragment étant un fragment Fab ou F(ab)'2.
Les fragments de type scFv sont exclus de l'invention.
Ainsi, les fragments Fab et F(ab)'2 sont donc constitués :
pour le Fab : d'une chaîne légère comprenant une région constante d'une chaîne légère d'une immunoglobuline humaine et d'une région variable d'une immunoglobuline de macaque, et d'une chaîne lourde comprenant une région constante d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine et d'une région variable d'une immunoglobuline de macaque,
- pour le F(ab)'2, de l'association par un pont disulfure de deux Fab décrits ci-dessus. L'invention a également pour objet un acide nucléique comprenant une séquence codant la chaîne légère de l'anticorps monoclonal défini précédemment, notamment comprenant la séquence SEQ ID NO 1 ou 5
Ainsi, dans l'invention les séquences d'acides nucléiques sont telles que la séquence SEQ ID NO 1 code pour la protéine SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3 code pour la protéine SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 code pour la protéine SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7 code pour la protéine SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9 code pour la protéine SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11 code pour la protéine SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13 code pour la protéine SEQ ID NO 14 et SEQ ID NO 15 code pour la protéine SEQ ID NO 16.
L'invention a également pour objet un acide nucléique comprenant ou constitué d'une séquence codant la chaîne légère de l'anticorps monoclonal défini précédemment, notamment comprenant la séquence SEQ ID NO 9 ou 13.
Un autre mode de réalisation avantageux concerne un acide nucléique comprenant ou constitué d'une séquence codant la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal tel que défini précédemment, notamment comprenant la séquence SEQ ID 7.
Un autre mode de réalisation avantageux concerne un acide nucléique comprenant ou constitué d'une séquence codant la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal tel que défini précédemment, notamment comprenant la séquence SEQ ID 15.
Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un acide nucléique tel que défini précédemment, comprenant :
• un acide nucléique, codant la chaîne légère de l'anticorps monoclonal défini ci- dessus, comprenant ou constitué d'une séquence choisie parmi les acides nucléiques SEQ ID NO 1, 5, 9 et 13, et/ou
• un acide nucléique, codant la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal défini ci- dessus, comprenant ou constitué d'une séquence choisie parmi les acides nucléiques SEQ ID NO 3, 7, 11 et 15. Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un acide nucléique comprenant ou constitué d'une séquence codant la chaîne légère de l'anticorps monoclonal défini précédemment, notamment comprenant ou constitué de l'une quelconque des séquences SEQ ID NO 1, 5, 9 ou 13.
Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un acide nucléique comprenant une séquence codant la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal défini précédemment, notamment comprenant ou constitué de l'une quelconque des séquences SEQ ID N0 3, 7, 11 ou 15.
Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un acide nucléique tel que défini précédemment, comprenant :
• un acide nucléique comprenant ou constitué d'une séquence choisie parmi les acides nucléiques SEQ ID NO 1, 5, 9 et 13, et
« un acide nucléique comprenant ou constitué d'une séquence choisie parmi les acides nucléiques SEQ ID NO 3, 7, 11 et 15.
Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un acide nucléique tel que défini précédemment, comprenant :
· un acide nucléique comprenant ou constitué de la séquence SEQ ID NO 5 ou 13, et
• un acide nucléique comprenant ou constitué de la séquence SEQ ID NO 7 ou 15. Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un acide nucléique tel que défini précédemment, comprenant :
• un acide nucléique comprenant ou constitué de la séquence SEQ ID NO 13, et · un acide nucléique comprenant ou constitué de la séquence SEQ ID NO 15.
Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un acide nucléique comprenant une séquence codant la chaîne légère de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus et comprenant une séquence codant la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal défini ci- dessus.
En d'autres termes, la séquence susmentionnée comprend, dans la même molécule, ou plus particulièrement sur le même brin, une séquence codant la chaîne légère de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus suivie d'une séquence codant la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus. Cela signifie également que la séquence susmentionnée comprend, dans la même molécule, une séquence codant la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus suivie d'une séquence codant la chaîne légère de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus.
L'invention concerne aussi un vecteur d'expression comprenant au moins un acide nucléique défini précédemment, ledit acide nucléique étant sous contrôle des éléments permettant son expression.
Par « vecteur d'expression », il est défini dans l'invention une molécule d'ADN qui possède des éléments permettant sa réplication (duplication) dans au moins un organisme vivant. Ces éléments permettant la réplication sont notamment des origines de réplication de levure ou de bactéries, ou encore des éléments de contrôle de la réplication d'un virus.
Les vecteurs selon l'invention sont notamment des plasmides, des phages, des chromosomes artificiels de levure (YAC), des chromosomes artificiels de bactéries (BAC), les génomes modifiés de virus réplicatifs ou de virus intégratifs ...
Ces vecteurs sont dits « d'expression » car ils disposent de séquences nucléotidiques qui permettent l'expression, c'est-à-dire la transcription en ARN, des séquences nucléotidiques qu'elles contrôlent.
Dans l'invention, ladite séquence d'acide nucléique contenue dans ledit vecteur est placée « sous contrôle des éléments permettant son expression ». Cela signifie que ledit vecteur d'expression possède au moins une séquence d'initiation de la transcription tel qu'un promoteur d'un virus comme le promoteur précoce du virus simien SV40, ou du Cytomégalovirus (CMV) ou encore les séquences promotrices du virus du sarcome de Rous (RSV), et notamment une séquence ou promoteur comprenant une boite TATAA. De plus, ledit vecteur possède également au moins une séquence de terminaison de la transcription, et en particulier une séquence de polyadénylation issues d'un gène de mammifère, notamment humain.
A ces séquences indispensables pour l'expression de la séquence nucléotidique contenue dans ledit vecteur peuvent s'ajouter d'autres séquences permettant de réguler ou de moduler l'expression de la dite séquence. Une liste non exhaustive comprend : des introns de gènes de mammifères, et notamment humains, des séquences de régulation de transcription de type amplificateur (« enhancers ») ou encore des séquences transcrites mais non traduites de gènes de mammifères, et notamment humains. Un mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un vecteur d'expression tel que défini ci-dessus, comprenant au moins un acide nucléique choisi parmi les acides nucléiques comprenant les séquences suivantes SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 et 15.
Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un ensemble comprenant deux vecteurs d'expression,
le premier vecteur d'expression comprenant un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi les acides nucléiques SEQ ID NO 1, 5, 9 et 13, et
le second vecteur d'expression comprenant un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi les acides nucléiques SEQ ID NO 3, 7, 11 et 15.
Un autre mode réalisation avantageux de l'invention concerne un ensemble comprenant deux vecteurs d'expression susmentionnés, dans lequel
le premier vecteur d'expression comprenant un acide nucléique comprenant la séquence SEQ ID NO 13, et
le second vecteur d'expression comprenant un acide nucléique comprenant la séquence SEQ ID NO 15. Un autre mode réalisation avantageux de l'invention concerne un vecteur d'expression susmentionné, comprenant
• un premier acide nucléique choisi parmi les acides nucléiques de séquences suivantes : SEQ ID NO 1, 5, 9 et 13, ledit premier acide nucléique étant sous contrôle des éléments permettant son expression, et
· un second acide nucléique choisi parmi les acides nucléiques de séquences suivantes : SEQ ID NO 3, 7, 11 et 15, ledit second acide nucléique étant sous contrôle des éléments permettant son expression.
Un autre mode réalisation avantageux de l'invention concerne un vecteur d'expression susmentionné, comprenant
• un premier acide nucléique comprenant ou constitué de la séquence SEQ ID NO 13, ledit premier acide nucléique étant sous contrôle des éléments permettant son expression, et • un second acide nucléique comprenant ou constitué de la séquence SEQ ID NO 15, ledit second acide nucléique étant sous contrôle des éléments permettant son expression.
Ce vecteur d'expression comporte donc deux séquences d'acides nucléiques susmentionnées, et plus particulièrement comporte une séquence d'acide nucléique codant la chaîne légère de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus, et une séquence d'acide nucléique codant la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus.
Préférentiellement, ledit vecteur d'expression contient un premier élément permettant l'expression de la séquence d'acide nucléique codant la chaîne légère de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus et un second élément permettant l'expression de la séquence d'acide nucléique codant la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal défini ci-dessus, ledit premier et ledit second élément permettant l'expression desdites séquences d'acides nucléiques étant identiques ou différents, et préférentiellement identiques. Ces éléments de contrôle sont notamment les séquences terminales longues répétées (LTR) du virus RSV.
Un autre mode de réalisation de l'invention concerne un vecteur d'expression défini ci dessus, comprenant au moins un gène de résistance à un antibiotique.
Par « au moins un gène de résistance » on entend dans l'invention que ledit vecteur d'expression peut contenir 1 ou 2, ou 3 ou 4 ou 5 ou 6 gènes de résistance à un antibiotique. Par « gène de résistance à un antibiotique », on définit dans l'invention un gène dont le produit d'expression exerce un effet cytostatique (inhibition de la croissance) ou cytolytique (mort cellulaire) de cellules. Les antibiotiques concernés par l'invention ont notamment un effet sur les cellules procaryotes, mais peuvent également avoir un effet sur les cellules eucaryotes, qu'il s'agisse de levures, de plantes, d'insectes, d'amphibiens ou de mammifères. Plus particulièrement, le vecteur d'expression susmentionné possède un gène de résistance à un antibiotique spécifique des cellules procaryotes et au moins un gène, préférentiellement 2 gènes, de résistance à un antibiotique spécifique des cellules eucaryotes.
On peut citer comme antibiotiques spécifiques des cellules procaryotes : l'Ampiciline, la Tétracycline et ses dérives, l'Hygromycine, la Canamycine... On peut citer comme antibiotiques spécifiques des cellules eucaryotes : le G418, la Généticine (sels de G418), la Puromycine, le Méthotrexate, la Blasticidine... Plus particulièrement, un mode de réalisation de l'invention concerne un vecteur d'expression tel que défini précédemment, comprenant ou consistant en la séquence SEQ ID NO 21.
Les Unités transcriptionnelles (UT) d'intérêt codant pour la chaîne lourde et la chaîne légère sont clonés sous la forme d'ADNc et sous la dépendance du promoteur RSV. Ce promoteur correspond au LTR (Long Terminal Repeat) du virus du sarcome de Rous qui contient un élément enhancer dans sa région 5'.
Est cloné immédiatement en 3' du promoteur un intron artificiel optimisé pour l'épissage alternatif et composé d'une séquence donneuse en 5' isolé de la beta-globine humaine et en a 3' d'une séquence acceptrice dérivée du gène de variable de la chaîne lourde d'immunoglobuline. Les UT d'intérêt se terminent par des séquences de polyadénylation dérivées du gène de l'hormone de croissance (GH) d'origine humaine (hGH) pour la chaîne lourde et bovine (bGH) pour la chaîne légère. Cette différence d'origine dans le choix des polyA est réalisée dans un but de limiter les recombinaisons entre les gènes d'intérêt. Cette association promoteur LTRRSV, intron chimérique, ADNc et séquence polyA a été sélectionné car elle confère une haute activité transcriptionnelle et traductionnelle dans la lignée cellulaire YB2/0.
Le vecteur d'expression contient en plus des UT d'intérêt plusieurs UT de résistances à des molécules chimiques: gene Bla: Ce gène (nommé Amp dans les cartes de restriction des vecteurs) exprime l'enzyme beta-lactamase chez la bactérie (promoteur procaryote) et confère une résistance à l'ampicilline.
gene Neo: Ce gène code pour l'enzyme npt II (neomycin-phosphotransferase II) sous le contrôle du promoteur SV40 et confère une résistance à divers antibiotiques comme la néomycine, kanamycine ou G418 aux cellules de mammifère transfectées et exprimant ce gène.
gene Dhfr: Ce gène code pour l'enzyme DHFR (DiHydroFolate Reductase) sous le contrôle du promoteur SV40 et confère une résistance au methotrexate (MTX). Ce procédé peut être utilisé pour réaliser de l'amplification génique en augmentant la concentration de MTX résultant ainsi du augmentation de la production d'anticorps par les cellules transfectées.
L'invention a également pour objet une cellule, ou plusieurs cellules, ou une lignée cellulaire comprenant au moins un vecteur d'expression tel que défini précédemment. Les cellules « comprenant au moins un vecteur » correspondent à des cellules dans lesquelles au moins un vecteur d'expression susmentionné a été introduit.
L'homme de métier connaît parfaitement les techniques de biologie moléculaire permettant d'introduite à l'intérieur d'une cellule une séquence d'ADN ou un vecteur d'expression, et notamment en se référant par exemple à [Sambrook, J et al. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Vol. 1, 2, 3 (1989)]. Il sera communément utilisé par la suite le terme de « transfection » pour designer l'action d'introduire un vecteur dans une cellule.
On peut citer par exemple, les techniques de transfection au phosphate de calcium, par utilisation de particules lipidiques ou « lipofectants », ou encore par des techniques permettant de générer des trous dans la membrane cellulaire au moyen d'un choc électrique (électroporation). Cette liste n'a pas de caractère exhaustif.
Les cellules ou lignes cellulaires utilisées dans l'invention sont des cellules issues de procaryotes ou d'eucaryotes tels que les bactéries, les levures ou autres champignons, les cellules d'insectes, les cellules d'amphibiens, les cellules de mammifères et notamment de rongeurs, les cellules humaines...
On distinguera plutôt la cellule de la lignée cellulaire par le fait que la lignée cellulaire est une population cellulaire en culture établie, c'est-à-dire qu'elle a acquis des caractéristiques permettant leur prolifération in vitro, et notamment une caractéristique d'immortalisation.
Un mode de réalisation avantageux de l'invention concerne une cellule ou une lignée cellulaire précédemment citée, présentant une activité de fucosylation substantiellement réduite par rapport à une cellule normale, ladite cellule ou lignée cellulaire étant notamment une cellule de mammifère, et en particulier la lignée YB2/0.
La lignée cellulaire avantageuse de l'invention est la lignée YB2/0 disponible à l'ATCC sous le numéro n° CRL 1662.
Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une cellule ou une lignée cellulaire comprenant un vecteur d'expression défini ci-dessus, permettant l'expression
· d'un anticorps monoclonal précédemment défini,
• ou d'une chaîne légère d'un anticorps monoclonal telle que définie précédemment,
• ou d'une chaîne lourde d'un anticorps monoclonal telle que définie précédemment. Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une cellule ou une lignée cellulaire obtenue par le clonage d'une cellule susmentionnée.
Les technique de clonage cellulaire sont largement connues de l'homme de métier, et repose sur le principe d'isolement des cellules d'une population cellulaire afin que chaque cellule individuelle donne naissance à des cellules filles (ou clone) isolées des cellules filles issues de la division des autres cellules de la population.
Le principe général du clonage cellulaire est la dilution limite des cellules.
Egalement, un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne une cellule ou une lignée cellulaire issue du clonage susmentionné, lesdites cellules ou lignée cellulaire étant caractérisées par le fait qu'elles
• présentent une apoptose inférieure à 25%, et
• sécrètent au moins 20μg/ml d'anticorps monoclonal précédemment défini.
La mesure de Γ apoptose, ou mort cellulaire programmée, se fait par des techniques utilisées en routine par l'homme de métier qui consiste à évaluer l'une au moins des étapes caractéristique de l'apoptose : modification de la membrane plasmique, modification des protéines de la famille des Caspases, modification des facteurs de transactions et fragmentation de l'ADN.
Parmi les cellules ou lignées obtenues par clonage, il n'est avantageusement conservé selon l'invention que les cellules qui produisent une quantité importante d'anticorps monoclonal, et notamment celles qui produisent au moins 20μg/ml d'anticorps monoclonal. La mesure de la quantité d'anticorps est aisément réalisable par l'homme de métier, en utilisant des techniques simples de dosage des protéines. Un autre mode de réalisation de l'invention concerne une cellule ou une lignée cellulaire obtenue par le clonage de la cellule susmentionnée, et notamment caractérisée en ce qu'elle
• présente une apoptose inférieure à 25%,
• est stable au cours des divisions cellulaires, et
• sécrète au moins 14μg/ml d'anticorps monoclonal défini précédemment.
La notion de stabilité cellulaire implique que les cellules issue du clonage des cellules clonées issues des cellules contenant au moins un vecteur permettant l'expression d'un anticorps monoclonal selon l'invention sont capables au cours des différentes divisions de conserver leurs propriétés de résistances aux antibiotique et de produire les anticorps monoclonaux. Un autre aspect de l'invention concerne une composition pharmaceutique, et notamment vaccinale, comprenant au moins
• un anticorps monoclonal défini ci-dessus, ou
« un acide nucléique défini ci-dessus, ou
• un vecteur d'expression défini ci-dessus, ou
• un fragment dudit anticorps monoclonal défini ci-dessus,
en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Avantageusement, l'invention concerne une composition pharmaceutique, et notamment vaccinale, comprenant au moins un anticorps monoclonal défini ci-dessus, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Le dosage de la substance active dépend particulièrement du mode d'administration, et est aisément déterminé par l'homme de métier.
« Un véhicule pharmaceutiquement acceptable » réfère à un matériel non toxique qui est compatible avec un système biologique tel qu'une cellule, une culture cellulaire, un tissu ou un organisme.
Une quantité thérapeutiquement efficace peut varier entre 0.01 mg/kg et 50 mg/kg, préférablement entre 0.1 mg/kg et 20 mg/kg, et plus préférablement entre 0.1 mg/kg et 2 mg/kg, en une ou plusieurs administrations quotidiennes, pendant un ou plusieurs jours.
La composition pharmaceutique de l'invention peut être administrée notamment par voie intraveineuse, notamment par injection ou par perfusion graduelle, par voie sous-cutanée, par voie systémique, par voie locale au moyen d'infiltrations, per os, ou par voie respiratoire ou pulmonaire au moyen d'aérosol.
Les préparations pour une administration parentérale peuvent inclure des solutions aqueuses ou non-aqueuses stériles, des suspensions ou des émulsions. Des exemples de solvants non- aqueux sont le propylène glycol, le polyéthylène glycol, des huiles végétales, telle que l'huile d'olive, ou des esters organiques injectables tels que l'éthyl oléate. Des véhicules aqueux comprennent l'eau, des solutions alcool/eau, des émulsions ou des suspensions.
La forme galénique avantageuse de la composition pharmaceutique de l'invention est un aérosol comprenant
• un anticorps monoclonal défini ci-dessus, ou • un acide nucléique défini ci-dessus, ou
• un vecteur d'expression défini ci-dessus, ou
• un fragment dudit anticorps monoclonal défini ci-dessus,
en association avec un excipient, en présence ou non d'un agent de propulsion.
Dans un mode de réalisation de l'invention, l'aérosol se présente sous forme d'un liquide contenant l'anticorps anti-ricine et un excipient. Les excipients sont le plus souvent des alcools, mais tout autre excipient connu de l'homme du métier pourra être utilisé dans le cadre de l'invention. L'aérosol sous forme liquide peut être associé à un gaz propulseur comme les chlorofluorocarbones (CFC) ou hydrofluorocarbones (HFA).
L'aérosol sous forme liquide peut aussi être constitué de microparticules lipidiques et d'un excipient. Dans ce cas, les excipients peuvent être choisis parmi le dipalmitoylphosphatidylcholine de synthèse (DPPC), le lactose ou l'hydroxyethylamidon (HES). Les microparticules sont ensuite administrées à l'aide d'un insufflateur.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, l'aérosol se présente sous forme de poudre. La poudre se compose de particules de taille comprise entre 1 et 10 μιη et de préférence inférieure à 9μιη, ou de préférence inférieure à 5 μιη. A titre d'exemple non limitatif, les méthodes suivantes peuvent être utilisées pour obtenir une poudre sèche : la pulvérisation accompagnée d'une dessiccation par congélation ou la cristallisation par ultrasons, la précipitation dirigée.
L'administration de l'aérosol sera réalisée selon qu'il se présente sous forme liquide ou solide à l'aide d'un nébuliseur qui peut être pneumatique, ultrasonique ou à tamis ou à l'aide d'un aérosol doseur (de liquide préssurisé, mécanique, électrohydrodynamique, thermiques) pour les formulations liquides ou à l'aide d'inhalateur pour les formulations solides. (ReychlerG., Dessanges JF et Vecellio L, Rev. Mal. Respir, 2007 ; 24 : 1013-1023).
L'invention concerne également l'utilisation d'au moins :
• un anticorps monoclonal défini ci-dessus, ou
• un fragment dudit anticorps monoclonal défini ci-dessus, ou
· un acide nucléique défini ci-dessus, ou
• un vecteur d'expression défini ci-dessus, ou
• une cellule définie ci-dessus, pour la préparation d'un médicament pour le traitement ou la prévention d'une pathologie associée à la contamination par la ricine.
Par traitement, on entend le moyen de soigner une pathologie déclarée, dont les symptômes sont visibles. Par prévention, on entend le moyen d'empêcher ladite pathologie de se déclarer. Les pathologies associées à la ricine correspondent aux symptômes liés à la contamination à la ricine, et notamment les diarrhées, les modifications des les électrolytes, la déshydratation, les œdèmes, les troubles respiratoires, hépatiques et rénaux...
L'invention a également pour objet une méthode de dosage in vitro de la ricine dans un échantillon biologique issu d'un individu susceptible d'être contaminé par la ricine, ladite méthode comprenant :
• la mise en contact dudit échantillon avec au moins un anticorps monoclonal défini précédemment, et
« la détermination de la présence ou l'absence de ricine dans ledit échantillon par la détection de la formation d'un éventuel complexe immun entre la ricine et ledit anticorps monoclonal.
Les anticorps monoclonaux de l'invention peuvent donc être utilisés pour détecter la présence de ricine dans un échantillon biologique.
Notamment, lesdits anticorps peuvent être utilisés pour la mise en œuvre de techniques de détection connues de l'homme de métier comme des ELISA, des RIE, de l'imunoprécipitation ou de l'immunomarquage (Western blot).
L'invention concerne aussi un procédé de décontamination in vitro d'un échantillon susceptible d'être contaminé par la ricine, notamment d'un échantillon biologique, comprenant :
• la mise en contact dudit échantillon avec au moins un anticorps monoclonal défini précédemment, et
· l'élimination, dudit échantillon, des complexes immuns formés entre la ricine et ledit anticorps monoclonal. Un moyen de mettre en œuvre ledit procédé de décontamination consiste, par exemple, en l'utilisation des anticorps monoclonaux de l'invention sur lesquels sont greffés des billes magnétiques sur la région constante dudit anticorps.
Une fois lesdits anticorps couplés à des billes magnétiques mises en contact avec l'échantillon à décontaminer, la ricine est éliminée de l'échantillon en captant les anticorps selon l'invention au moyen d'un aimant.
Un autre moyen de mettre en œuvre ledit procédé de décontamination consiste, par exemple, en l'utilisation des anticorps monoclonaux immobilisé sur une colonne comportant de la protéine A ou G de Staphylococcus aureus. L'échantillon a décontaminé est alors passé au travers de la colonne afin de retenir, sur les anticorps selon l'invention immobilisé, la ricine susceptible d'être contenue dans ledit échantillon.
Un mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un procédé de préparation d'un anticorps monoclonal anti ricine susmentionné comprenant :
a. la transformation d'une cellule, notamment de mammifère, en particulier la lignée YB2/0 avec au moins un vecteur défini précédemment,
b. la sélection des cellules transformées,
c. l'évaluation de la production dudit anticorps des clones sélectionnés à l'étape précédente, par la détermination de la présence ou l'absence de la formation d'un éventuel complexe immun entre la ricine et ledit anticorps monoclonal.
Un mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un procédé défini ci dessus, dans lequel la sélection des cellules transformées est réalisée par détermination de leur résistance à au moins un antibiotique.
Un mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un procédé défini ci dessus, où les cellules produisant une quantité dudit anticorps monoclonal supérieure à 22 μg/mL sont sélectionnées.
Un mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un procédé défini ci dessus, où les cellules sélectionnées à l'étape c sont clonées.
Un mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un procédé défini ci dessus, où les cellules clonées sont sélectionnées une nouvelle fois pour : • leur résistance à au moins un antibiotique, et
• leur capacité à produire au moins 11 μ§/ι Ι. dudit anticorps monoclonal.
L'invention sera mieux illustrée par les exemples et les figures suivantes. Les exemples ci- après visent à éclaircir l'objet de l'invention et illustrer des modes de réalisation avantageux, mais en aucun cas vise à restreindre la portée de l'invention.
Légende des figures
La figure 1 correspond à une représentation schématique d'un anticorps. Les parties noires correspondent aux parties constantes des chaînes lourdes, les parties en gris foncé correspondent à la partie constante de la chaîne légère, les parties en gris clair correspondent à la partie variable de la chaîne lourde, et les parties blanches correspondent à la partie variable de la chaîne légère. -S-S- représente les ponts disulfures établis entre deux cystéines. Les régions CDR et charpentes sont indiquées par des flèches. Les fragments Fab et Fc sont également représentés.
La figure 2 correspond à une représentation schématique en collier de perles de la séquence d'acides aminés d'une partie variable d'une chaîne légère ou d'une chaîne lourde d'immunoglobuline. Les boules noires correspondent aux acides aminés formant les régions charpentes, et les boules grises correspondent aux acides aminés représentant les CDR.
La figure 3 correspond à une représentation schématique de la fusion entre le peptide leader de la partie variable de la chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine avec la partie variable de la chaîne lourde de Γ immunoglobuline de macaque. Les oligonucléotides ayant servi pour les PCR sont figurés sur le schéma. Les sites de restriction uniques sont également indiqués.
La figure 4 correspond à une représentation schématique de la fusion entre le peptide leader de la partie variable de la chaîne légère d'une immunoglobuline humaine avec la partie variable de la chaîne légère de l'immunoglobuline de macaque. Les oligonucléotides ayant servi pour les PCR sont figurés sur le schéma. Les sites de restriction uniques sont également indiqués.
La figure 5 correspond à la représentation schématique du vecteur de clonage intermédiaire H622-26 contenant la chaîne lourde « double hybride » où le leader humain est fusionné à la région variable de la chaîne lourde de macaque (VH 43RCA), elle-même fusionnée à la région constante de l'immunoglobuline humaine (CH T125).
Les différents éléments de régulation (promoteurs, introns chimériques, sites de polyadénylation...) ainsi que les gènes de résistance aux antibiotiques et les origines de réplication sont également représentés. La figure 6 correspond à la représentation schématique du vecteur de clonage final HK622-26 (SEQ ID NO 21) contenant la chaîne lourde « double hybride » où le leader humain est fusionné à la région variable de la chaîne lourde de macaque (VH 43RCA), elle-même fusionnée à la région constante de l'immunoglobuline humaine (CH T125), et la chaîne légère « double hybride » où le leader humain est fusionné à la région variable de la chaîne légère de macaque (VK 43RCA), elle-même fusionnée à la région constante de l'immunoglobuline humaine (CK T125)
Les différents éléments de régulation (promoteurs, introns chimériques, sites de polyadénylation...) ainsi que les gènes de résistance aux antibiotiques et les origines de réplication sont également représentés.
La figure 7 correspond à un gel d'agarose 2% sur lequel ont été séparés les produits de PCR permettant la détection des mycoplasmes.
Les pistes 3 et 22 correspondent à la migration du marqueur de poids moléculaire, les pistes 1 et 20 correspondent à la migration des produits de PCR réalisées à partir d'un témoin négatif, et les pistes 2 et 21 correspondent à la migration des produits de PCR réalisées à partir d'un témoin positif.
Les pistes 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 23, et 25 correspondent à la migration des produits de PCR réalisés respectivement à partir des culots des cloïdes GG3, IF2, EE9, EG11, JB3, ED9, EC2, GF2, 1A1 et KC9.
Les pistes 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 24, et 26 correspondent à la migration des produits de PCR réalisés respectivement à partir des surnageants des cloïdes GG3, IF2, EE9, EG11, JB3, ED9, EC2, GF2, 1 Al et KC9.
La figure 8 représente sous forme de graphique la stabilité de production d'anticorps des trois cloïdes EE9, GG3 et IF2. Les barres grises représentent les mesures réalisées lors du premier dosage, et les barres noires représentent les mesures réalisées lors du second dosage.
L'axe des abscisses représente le temps en jours, et l'axe des ordonnées représente la quantité d'anticorps produits en ng/mL.
La figure 9 correspond à un gel d'agarose 2% sur lequel ont été séparés les produits de PCR permettant la détection des mycoplasmes. Les pistes 4, 17, 30 et 33 correspondent à la migration du marqueur de poids moléculaire, les pistes 3 et 31 correspondent à la migration des produits de PCR réalisées à partir d'un témoin négatif, et les pistes 2 et 32 correspondent à la migration des produits de PCR réalisées à partir d'un témoin positif.
Les pistes 5, 7, 9, 11, 13, 15, 18, 20, 22, 24, 26 et 28 correspondent à la migration des produits de PCR réalisés respectivement à partir des culots des clones GG9-4B2, GG9-2F8, GG9-5D8, GG9-2G10, IF2-2F2, IF2-2E3, GG3-2G4, GG3-EC2, GG3-1G9, GG3-2G2, GG3-5G11, GG3-1D8 et EE9-5G7.
Les pistes 6, 8, 10, 12, 14, 16, 19, 21, 23, 25, 27 et 29 correspondent à la migration des produits de PCR réalisés respectivement à partir des culots des clones EE9-4B2, EE9-2F8, EE9-5D8, EE9-2G10, IF2-2F2, IF2-2E3, GG3-2G4, GG3-EC2, GG3-1G9, GG3-2G2, GG3- 5G11, GG3-1D8 et EE9-5G7.
La figure 10 représente sous forme de graphique la stabilité de production d'anticorps des clones EE9-2G10, EE9-5D8, EE9-5G7, GG3-1G9, GG3-2G4, IF2-1C7, IF2-2D8 et IF2-2E9 sur 8 jours. Les barres grises représentent les mesures réalisées lors du premier dosage, et les barres noires représentent les mesures réalisées lors du second dosage.
L'axe des abscisses représente le temps en jours, et l'axe des ordonnées représente la quantité d'anticorps produits en ng/mL.
La figure 11 représente la courbe de survie cumulée de Camplan-Meyer de souris ayant reçu 50μg de ricine par instillation pulmonaire ainsi q'une IgG humaine contrôle (coube avec des triangles), soit l'anticorps selon l'invention (43RCA) 6h (courbe avec un carré) , 22h (courbe avec des losanges) ou 24 heures (courbe interrompue avec des cercles) après l'instillation de ricine.
La figure 12 représente la courbe de survie cumulée de Camplan-Meyer de souris ayant reçu 50μg de ricine par instillation pulmonaire ainsi que 20 μg d'une IgG humaine contrôle (coube avec des triangles), soit l'anticorps selon l'invention (43RCA) à une concentration de 20, 10, 5 et 1 μg,
La figure 13 représente la courbe de survie cumulée de Camplan-Meyer de souris ayant reçu 50μg de ricine par instillation pulmonaire ainsi que 150 μg de l'anticorps selon l'invention (43RCA) 44 heures (courbe avec des carrés) ou 54 heures (courbe avec des losanges) après l'instillation de ricine. En contrôle (courbe avec des triangles) est indiqué la survie des souries traitées avec la ricine et une immunoglobuline non relevante. EXEMPLES
Exemple 1 : Construction et séquençage d'un vecteur d'expression H 622-26 pour l'expression d'anticorps selon l'invention.
Le vecteur d'expression, HK622-26 (SEQ ID NO 21), a été construit pour l'expression de l'anticorps mono clonal (IgG) chimérique macaque-homme anti ricine.
Le vecteur HK622-26 a été construit à partir du vecteur CHK622-05 par « double » chimérisation, c'est-à-dire ajout par PCR d'assemblage de régions leaders humaines et par ajout des régions constantes CK et CH humaines par clonage aux séquences variables VH et VK de macaque.
Les régions variables des chaînes lourde et légère VH et VK sont extraites d'un vecteur codant pour un ScFv anti ricine, ScFv43RCA/H2-Vl 16 et sont introduites dans le vecteur « générique » CHK622-08 après avoir ajouté des séquences leaders pour assurer une bonne synthèse de l'anticorps chimérique. Les régions constantes CK et CH sont d'origine humaine et dérivées du clone T125-A2 dirigé contre l'antigène Rhésus D
A- Synthèse par PCR d'assemblage de la région VH43RCA
La région VH43RCA correspond à la chimérisation de :
- la séquence leader VH de la séquence humaine M29812 (sous groupe VH4, VH4-59), contenue dans le vecteur HK558-12, ladite séquence leader VH étant constituée de la séquence suivante :
5'-ATGAAACATCTGTGGTTCTTCCTTCTCCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTG TCC-3' (SEQ ID NO 19), et
- la séquence de la région VH macaque anti ricine contenue dans le plasmide pHaI14 contenant le fragment ScFv43RCA/H2-Vl 16, ladite séquence de la région VH macaque étant constituée de la séquence SEQ ID NO 3. La chimérisation est réalisée de la manière suivante :
- la séquence leader VH (SEQ ID NO 19) est amplifiée par PCR en utilisant le couple d'amorces suivantes :
• VHI-Ricine amorce sens:
5 '-CTCA GTGCTA GCGCCGCCA CATGAAAC ATCTGTGGT- J ' (SEQ ID NO 22) • VH2-Ricine amorce antisens:
5 '-CCAGCTGCACCTGGGACAGGACCCAT-3 ' (SEQ ID NO 23)
à partir d'une matrice d'ADN plasmidique HK558-12.
La réaction de PCR est réalisée selon le protocole suivant :
dénaturation : 5 min à 95 °C
dénaturation : 0.5 min à 95°C l
hybridation : 0.5 min à 50°C } répétitions 10 fois
élongation : 0.5 min à 72 °C J
- élongation : 10 min à 72 °C
Ce couple d'amorces permet d'obtenir un amplicon (amplicon 1) de 91 bases contenant le site Nhe I (GCTAGC)), la séquence Kozak (gras) et la séquence leader humaine SEQ ID NO
17).
- la séquence de la région VH macaque (SEQ ID NO 3) est amplifiée par PCR en utilisant le couple d'amorces suivantes :
• VH3-Ricine amorce sens:
5 '-A TGGGTCCTGTCCCA GGTGCA GCTGG-3 '(SEQ ID NO 24)
• VH4-Ricine amorce antisens:
5 '-A CCGA TGGGCCCTTGGTGGA GGCTGA GGA G A CGGTGA CCA-3 ' (SEQ ID NO
25)
à partir d'une matrice d'ADN plasmidique pHaI14.
La réaction de PCR est réalisée selon le protocole suivant :
dénaturation : 5 min à 95 °C
dénaturation : 0.5 min à 95°C l
hybridation : 0.5 min à 50°C \ répétitions 10 fois
élongation : 0.5 min à 72 °C J élongation : 10 min à 72 °C
Ce couple d'amorces permet d'obtenir un amplicon (amplicon 2) de 396 bases contenant la séquence VH macaque et le site Apa I (GGGCCCC).
Les amplicons 1 et 2 obtenus précédemment sont alors réunis pour donner l'amplicon 3 final par PCR d'assemblage en utilisant les amorces VH1 et VH4 susmentionnées.
La réaction de PCR d'assemblage est réalisée selon le protocole suivant :
dénaturation : 5 min à 95 °C
- dénaturation : 0.5 min à 95°C l
hybridation : 0.5 min à 50°C } répétitions 15 fois
élongation : 1 min à 72 °C J
élongation : 10 min à 72 °C La figure 3 montre la région VH43RCA avec les différents couples d'amorces ayant servi à la préparation du fragment VH chimérique final (amplicon 3) de 461 pb.
B- Synthèse par PCR d'assemblage de la région VK43RCA La région VK43RCA correspond à la chimérisation de :
la séquence leader VK de la séquence humaine Z0006 (sous groupe VK1, VK1-13) contenue dans le vecteur HK558-12, ladite séquence leader VK étant constituée de la séquence suivante :
5'-ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCA GGTGCCAGATGT-3 ' (SEQ ID NO 17), et
la séquence de la région VK macaque anti ricine contenue dans le plasmide pHaL14 contenant le fragment ScFv43RCA/H2-Vl 16, ladite séquence de la région VH macaque étant constituée de la séquence SEQ ID NO 1. La chimérisation est réalisée de la manière suivante :
- la séquence leader VK (SEQ ID NO 17) est amplifiée par PCR en utilisant le couple d'amorces suivantes : • VKl-Ricine amorce sens:
5 '-CTCAGTACTA GTGCCGCCA CCATGGACATGAGGGTCCCCG- J ' (SEQ ID NO
26)
• VK2-Ricine amorce antisens:
5 '- TGTCA TCTGGA GCTCA CA TCTGGCA CCTGG -3 ' (SEQ ID NO 27)
à partir d'une matrice d'ADN plasmidique HK558-12.
La réaction de PCR est réalisée selon le protocole suivant :
dénaturation : 5 min à 95°C
dénaturation : 0.5 min à 95°C l
hybridation : 0.5 min à 50°C \ répétitions 10 fois
élongation : 0.5 min à 72 °C J
élongation : 10 min à 72 °C
Ce couple d'amorces permet d'obtenir un amplicon (amplicon ) de 102 bases contenant le site Spe I (ACTAGT), la séquence kozak (gras) et la séquence leader humaine SEQ ID NO 19).
- la séquence de la région VK macaque (SEQ ID NO 1) est amplifiée par PCR en utilisant le couple d'amorces suivantes :
• VK3-Ricine amorce sens:
5 '-CCA GGTGCCA G A TGTGA GCTCCA G A TGA CA-3 '(SEQ ID NO 28)
• VK4-Ricine amorce antisens:
5 - TGAAGACACTTGGTGCAGCCACAGTTCGTTTGATCTCCACCTTGGTCC -3
(SEQ ID NO 29)
à partir d'une matrice d'ADN plasmidique pHaI14.
La réaction de PCR est réalisée selon le protocole suivant :
dénaturation : 5 min à 95°C
dénaturation : 0.5 min à 95°C ]
hybridation : 0.5 min à 50°C i" répétitions 15 fois
élongation : 1 min à 72 °C J
élongation : 10 min à 72 °C Ce couple d'amorces permet d'obtenir un amplicon (amplicon 2') de 364 bases contenant la séquence VK macaque et le site Dra III (CACTTGGTG).
Les amplicons et 2' obtenus précédemment sont alors réunis pour donner Γ amplicon 3' final par PCR d'assemblage en utilisant les amorces VK1 et VK4 susmentionnées.
La réaction de PCR d'assemblage est réalisée selon le protocole suivant :
dénaturation : 5 min à 95 °C
dénaturation : 0.5 min à 95°C l
hybridation : 0.5 min à 50°C } répétitions 15 fois
- élongation : 1 min à 72 °C J
-élongation : 10 min à 72 °C
La figure 4 montre la région VK43RCA avec les différents couples d'amorces ayant servi à la préparation du fragment VH chimérique final (amplicon 3') de 436 pb.
C- Construction du vecteur H622-26
Les amplicon 3 et 3' sont introduits dans le vecteur « générique » CHK622-08 contenant les séquences des chaînes constantes CH lourdes et CK légères de l'IgGl du clone T125-A2 dirigé contre l'antigène Rhésus D.
Le clonage des amplicon 3 et 3 ' est réalisé séquentiellement de la manière suivante :
1- L'amplicon 3 et le vecteur CHK622-08 sont soumis à une double digestion par les enzymes de restriction Nhe I- Apa I.
Les fragments de digestion sont ensuite purifiés, et un mélange vecteur / amplicon 3 est soumis à une ligation cohésive.
Les produits de la ligation sont ensuite utilisés pour transformer des bactéries, et les transformants sont sélectionnés sur milieu LB complémenté d'ampicilline.
Les clones résistants sont ensuite testés par PCR en utilisant les amorces 5PRSVBIS et GSP2ANP : un fragment de 783 bp est attendu pour les clones positifs.
= 6 clones positifs en PCR ont été sélectionnés pour un criblage par digestion enzymatique : par digestion de contrôle Nhe I + Apa I (vérification de l'insert et des jonctions): Le profil attendu est constitué de 2 bandes 447+9917 bp, et
- par digestion Hind III (vérification du vecteur entier) : Le profil attendu est constitué de 4 bandes 3759+2894+2559+1152 bp Tous les clones sont positifs, et le clone le clone H622-26, dont la carte de restriction est représentée dans la figure 5, est choisi pour la seconde étape.
2- L'amplicon 3' et le vecteur H622-26 sont soumis à une double digestion par les enzymes de restriction Spe I- Dra III.
Les fragments de digestion sont ensuite purifiés, et un mélange vecteur / amplicon 3' est soumis à une ligation cohésive.
Les produits de la ligation sont ensuite utilisés pour transformer des bactéries, et les transformants sont sélectionnés sur milieu LB complémenté d'ampiciline.
Les clones résistants sont ensuite testés par PCR en utilisant les amorces 5' 1PLC et CK4: un fragment de 539 bp est attendu pour les clones positifs.
= 6 clones positifs en PCR ont été sélectionnés pour un criblage par digestion enzymatique : par digestion de contrôle Spe I + Dra III (vérification de l'insert et des jonctions): Le profil attendu est constitué de 2 bandes 420+10344bp, et
- par digestion Hind III (vérification du vecteur entier) : Le profil attendu est constitué de 4 bandes 3759+2894+2559+155 lbp.
Tous les clones sont positifs. Après séquençage, seuls 4 clones possèdent une séquence correcte. Le clone 2 a été choisi, et correspond au vecteur H622-26. La carte de restriction du vecteur H622-26est représentée dans la figure 6.
Le vecteur est alors prêt pour la transformation des cellules.
Exemple 2 : Obtention de clones producteurs d'anti ricine dans la lignée YB2/0 par transfection double directe
Cette étude a pour but l'obtention de clones producteurs d'anti ricine dans la lignée YB2/0 par double transfection directe.
Les cellules YB2/0 ont été entretenues (par repiquage à lxl05cell/ml 2 fois par semaine) en vue de la transfection à 105 cellules/ml en milieu EMS, 5% SVF.
Les vecteurs utilisés pour la transfection sont les suivants : HK622-26 / EcoRV, H416-24 (T+) et K416-23 (T+). HK622-26 / EcoRV signifie que le vecteur obtenu dans l'exemple 1 a été linéarisé par digestion avec l'enzyme Eco RV afin de favoriser son intégration dans les cellules transformées.
Transfection Les cellules sont transfectées selon le protocole suivant :
4 cuvettes comprenant 500 de cellules sont préparées de la manière suivante :
- Cuvette 1 et 2 : 42,8μ§ de vecteur HK622-26/EcoRV
- Cuvette Témoin positif : 25,2μ de vecteur H416-24 linéarisé
23,2 μg de vecteur K416-23 linéarisé
- Cuvette Témoin négatif : pas de vecteur
Les cellules sont alors électroporées à un voltage de 230 V et une capacitance de 960μΡ pendant 17,9 ms.
Une fois l'électroporation terminée, les cellules sont prélevées délicatement des cuvettes et placées dans du milieu sélectif, RPMI, 5% SVF dialysé, 1 g/1 généticine pour les P24 (25000cell/ml) et P96 àlOOcell/puits (la généticine n'étant appliquée qu'à J+3, une fois que l'expression du gène de résistance a eu lieu) et en RPMI, 5% SVF dialysé, 0,5g/l généticine, 50nM méthotrexate (MTX) et ensemencées dans des plaques de culture de la manière suivante :
- Cuvette 1 et 2 (par cuvette) : 1 Plaque 24 puits à 25000 cellules/puits
5 Plaques 96 puits à 2500 cellules/puits
1 Plaque 96 puits à 100 cellules/puits
- Cuvette Témoin T+ : 1 Plaque 96 puits à 2500 cellules/puits
1 Plaque 96 puits à 100 cellules/puits
- Cuvette Témoin T- : 1 Plaque 96 puits à 2500 cellules/puits
1 Plaque 96 puits à 100 cellules/puits
Les cellules sont cultivées en présence d'antibiotique pendant 4 semaines.
Pour les plaques 96 puits, le milieu est changé deux fois par semaine.
Le reste des cellules transformées est réparti en plaques 6 puits pour chacune des cuvettes 1 et 2.
Sélection des transformants
- Evaluation de la production d'anticorps
Dans une première étape, le taux de production moyen d'anticorps est évalué sur 3 pools issus de chacune des transfections des cuvettes 1 et 2, après 13 jours de culture en milieu sélectif. Au total 6 pools ont été testés, et la concentration moyenne en anticorps monoclonal a été mesurée en μg/ml. La densité cellulaire et la viabilité cellulaire ont également été déterminées.
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 1 suivant : Densité cellulaire Concentration
Cuvette Pool Viabilité (%)
(106 cellules/ml) anticorps ^g/ml)
1 0,62 82 5,6
1 2 0,52 74 5,1
3 0,44 88 4,2
1 0,62 84 3,6
2 2 0,72 86 5,8
3 0,52 72 6
Tableau 1 : viabilité et dosage de la production d'anticorps des différents pools.
On constate que les deux transfections permettent la production de l'anticorps monoclonal anti ricine.
- Première sélection clonale
Après 22 jours de culture en milieu sélectif, l'apparition des clones résistants au G418 et au méthotrexate a été évaluée.
Le bilan des clones apparu est décrit dans le tableau 2 suivant :
Figure imgf000037_0001
Tableau 2 : nombre de clones ayant émergé.
P96 = plaque 96 puits
Au total 76 pseudo-clones (puits) double résistants (G418 et méthotrexate) ont émergé à l'issue de la double sélection, soit une efficacité de transfection de 7,9% (76 puits positifs sur 960 puits ensemencés). Les cellules ayant proliféré dans les puits sont considérées comme n'étant pas des clones purs, puisque 2500 cellules par puits ont été ensemencées.
Pour chaque pseudo clones, ou cloïdes, un dosage de la quantité d'immunoglobuline sécrétée a été réalisé.
Les résultats des dosages d'immunoglobulines des 24 meilleurs clones sont présentés dans le tableau 3 suivant :
Figure imgf000039_0001
Tableau 3 : dosage de la production d'anticorps des différents cloïdes testés.
Parmi les 24 cloïdes testés, 10 ont une production d'anticorps monoclonal supérieure à 8,9 μg/mL. Tous ces cloïdes (EC2, ED9, EE9, EGl l, GF2, CG3, IA1, IF2, JB3 et KC9) ont été congelés dans du milieu sans antibiotique en présence de 10% DMSO, et conservés à -195°C dans l'azote liquide.
Pour chacun de ces 10 cloïdes, un test de viabilité cellulaire a été réalisé avant congélation (Tableau 4), et un dépistage de la présence éventuelle de mycoplasmes a été réalisé (Figure 7). Tous les clones présentent un taux de survie satisfaisant (>85%) et aucun clone n'est contaminé par les mycoplasmes.
Cloide Viabilité (%)
GF2 89
EE9 97 IF2 89
EG11 89
KC9 85
EC2 95
ED9 95
GG3 100
IA1 100
JB3 100
Tableau 4 : viabilité des cloïdes
Les 3 cloïdes (EE9, CG3 et IF2), dont la production d'anticorps est la plus élevée (supérieure à 22μg/mL), sont sélectionnés pour un nouveau clonage cellulaire.
La stabilité de production d'anticorps monoclonal a également été testée pour chacun des cloïdes sélectionnés.
Les trois cloïdes EE9, GG3 et IF2 ont été entretenus pendant 6 semaines par dilution en cascade en plaque 24 puits en milieu DMEM + 5%SVF dialysé avec repiquage tous les 7 jours. La production d'anticorps monoclonal est évaluée par deux dosages ELIS A indépendants, et les résultats sont indiqués dans le tableau 5 suivant :
Figure imgf000040_0001
La stabilité des cloïdes au cours du temps est également représentée sous forme de graphiqi dans la figure 8.
Parmi les 3 cloïdes choisis, le cloïde GG3 voit sa production d'anticorps diminuer très signifïcativement au cours des passages.
Sur la base de cette indiction, les cloïdes sélectionnés ont été reclonés afin de disposer de clones « purs ». - Seconde sélection clonale
Un second clonage des cloïdes EE9, CG3 et IF2 a été réalisé en milieu DMEM 5% SVF dialysé. 5 plaques 96 puits, à 40 cellules par puits, ont été ensemencées en milieu DMEM 5% SVF dialysé. Il n'y a eu aucun clone pour ce clonage.
Un deuxième clonage a été réalisé en milieu DMEM et EMS 5%SVF dialysé.
Les cellules ont été décongelées en milieu RPMI 5%SVF dialysé puis passées en milieu EMS
5%SVF et DMEM 5%SVF. Les cellules ont été repiquées à 4,5.105 cellules/mL la veille du clonage.
5 plaques 96puits, à 40 cellules par puits, ont été ensemencées par cloïde et par milieu soit un total de 30 plaques, ou 2880 puits. Le bilan d'apparition des clones est présenté dans le tableau 6.
Figure imgf000041_0001
Tableau 6 : nombre de clones ayant émergé après clonage des 3 cloïdes, en fonction du milieu de culture.
Deux criblages par ELISA ont permis de sélectionner les 10 meilleurs clones issus des 80 clones de cloïdes ayant émergés. Les résultats des ELISA de 11 clones issus du cloïde EE9, 11 clones issus du cloïde GG3 et 10 clones issus du cloïde IF2, sont présentés dans le tableau 7 suivant :
Figure imgf000042_0001
Tableau 7 : dosage de la production d'anticorps des différents clones testés.
Pour chaque cloïde, 5 clones ont été conservés. Les 5 clones issus du cloïde EE9 (EE9- 5G7,EE9-5D8, EE9-2F8, EE9-4B1 et EE8-2G10) sécrètent en moyenne plus de 4^g/mL d'anticorps monoclonal, les 5 clones issus du cloïde GG3 (GG3-2G4, GG3-1G9, GG3-2G2, GG3-1D8 et GG3-5G11) sécrètent en moyenne plus de 6^g/mL d'anticorps monoclonal et les 5 clones issus du cloïde IF2 (IF2-2E9, IF2-2D8, IF2-1C7, IF2-1D5 et IF2-2F7) sécrètent plus de 8μg/mL d'anticorps monoclonal.
Pour chacun de ces 15 clones, un test de viabilité cellulaire a été réalisé avant congélation (Tableau 7), et un dépistage de la présence éventuelle de mycoplasmes a été réalisé (Figure 9). Tous les clones présentent un taux de survie satisfaisant (>70%) et aucun clone n'est contaminé par les mycoplasmes.
Figure imgf000043_0001
Tableau 7 : viabilité des clones sélectionnés
Au final 8 clones ont été sélectionnés sur les critères suivants :
leur production d'anticorps monoclonal > 14μ§/ι Ε
- leur viabilité > 70%
Les clones sélectionnés sont donc les clones suivants : EE9-5G7, EE9-5D8, EE9-2G10, GG3- 2G4, GG3-1G9, IF2-2E9, IF2-2D8 et IF2-1C7.
- Stabilité des clones
Le but de ces expériences est de vérifier que les différents clones sécrètent substantiellement la même quantité d'anticorps monoclonal au cours des différents passages.
Les huit clones sélectionnés ont été entretenus pendant 8 semaines par dilution en cascade en plaque 24 puits avec repiquage tous les 7 jours. Les clones issus du cloïde EE9 ont été maintenus en milieu EMS +5%SVF dialysé et les clones issus des cloïdes GG3 et IF2 en milieu DMEM + 5%SVF dialysé.
La production d'anticorps monoclonal est évaluée par ELIS A, et les résultats sont indiqués dans le tableau 8 suivant :
Figure imgf000044_0001
Tableau 8 : production d'anticorps au cours du temps.
La stabilité des clones au cours du temps est également représentée sous forme de graphique dans la figure 10.
Au final, 3 clones ont été sélectionnés pour leur stabilité de production d'anticorps monoclonal : le clone EE9-5G7, le clone IF2-2D8 et le clone IF2-2E9. Exemple 3 : Production en rollers d'anticorps selon l'invention
Le clone EE9-5G7 a été sélectionné pour la production de 500 mg d'anticorps selon les dosages de pseudo production maximale en statique qui établissaient son niveau de production à 19 mg/L et également sur les résultats de l'étude de stabilité menée sur le cloïde parental EE9 dont le niveau de production est stable sur six semaines.
A partir de ces données, le clone EE9-5G7 a été amplifié de manière à réaliser deux productions successives de 30 rollers en mode batch. La production a été arrêtée lorsque la viabilité cellulaire est descendue en dessous de 50%. Le dosage du surnageant en fin de production n'était que de 12 mg/L soit 648 mg d'anticorps produit. Ce surnageant a été dosé, centrifugé, filtré avant d'être concentré 15 fois. Le concentré a été purifié par chromatographie d'affinité et a permis d'obtenir 468mg d'anticorps purifié.
La production d'anticorps monoclonal anti ricine par les clones IF2-2D8 et IF2-2E9 a été réalisée par production en roller en milieu RPMI et EMS.
Les cellules ont été décongelées et ensemencées à 2.105 cellules/ml dans du milieu DMEM, 5%>SVF dépiété en Ig, 0,5 g/1 généticine. La viabilité à la décongélation était de 91%> pour le clone IF2-2D8 et 93% pour le clone IF2-2E9.
Le suivi de culture et de production des rollers est présenté dans le tableau 9 pour le clone IF2-2D8 et le tableau 10 pour le clone IF2-2E9.
Densité
Concentration Viabilité Type de Volume de
Date repiquage Nombre de Flask Milieu
(xl06/ml) (%) contenant milieu (ml)
(xlOE6/ml)
J0 changement milieu T75 30 2 DMEM
J3 - 10ml + 10ml milieu T75 30 2 DMEM
J7 0,64 86 0,1 T75 30 1 DMEM
J 10 1 , 1 95 0, 1 T75 30 1 DMEM
T75 30 1 DMEM
J14 1,38 96 0,1 T75 30 1 RPMI
T75 30 1 EMS
0,9 100 0,2 T175 100 1 RPMI
J17
0,88 98 0,2 T175 100 1 EMS
1,48 97 0,3 Roller 500 1 EMS
J20
1,12 100 0,3 Roller 400 1 RPMI
Lancement
0,8 95 0,44 Roller 900 EMS
Production
J22
Lancement
0,74 95 0,32 Roller 900 RPMI
Production 2,12 93 Roller 900 EMS
J24
0,92 96 Roller 900 RPMI
Viabilité <50% Arrêt du Roller EMS
J27
Viabilité <50% Arrêt du Roller RPMI
Tableau 9 : Suivi de culture et de production des rollers du clone IF2-2D8
Figure imgf000046_0001
Tableau 10 : Suivi de culture et de production des rollers du clone IF2-2E9
Les surnageants de ces rollers ont été dosés par ELIS A (tableau 11) afin de mesurer la quantité d'anticorps produit.
Figure imgf000046_0002
Tableau 11 : Dosage des surnageants des rollers.
Les surnageants ont été filtrés sur filtre 0,22 μιη, et les anticorps ont été purifiés par chromatographie d'affinité sur colonne HiTrap rprotein A FF. Bilan de purification des anticorps anti-ricin IF2-2D8 et IF2-2E9
Figure imgf000047_0001
Les concentrés ont permis d'obtenir entre 16 et 32.8 mg d'anticorps purifié pour chacun des clones.
Les clones IF2-2D8 et IF2-2E9 se sont avérés stables au cours des différents passages (contrairement à leur cloïde parental) produisent deux fois plus d'anticorps monoclonal que le clone EE9-5G7.
La caractérisation physico-chimique des anticorps a montré que c'est le clone IF2-2E9 qui produisait l'anticorps le plus semblable à l'anticorps produit par le clone EE9-5G7. De ce fait, c'est le clone IF2-2E9 qui a été choisi pour les prochaînes production d'anticorps anti-ricine
Production et purification d'un lot de 500 mg d'anticorps anti-ricine
Le surnageant de culture du clone IF2-2E9 a été concentré, filtré puis les anticorps ont été purifiés par une première étape de chromatographie d'affinité sur Sépharose-protéine A suivie de deux étapes d'échange d'ions. La quantité d'anticorps purifié est de 642 mg.
Exemple 4 : Test de la neutralisation in vitro de la ricine par l'anticorps monoclonal chimérique homme/macaque - test de survie.
Dans ce test, on mesure la capacité qu'ont les anticorps de l'invention à protéger de la mort les cellules J774A.1 mises en contact avec de la Ricine.
Brièvement, les cellules J774A.1 (ATCC-LGC, Molsheim,France) sont ensemencées à une densité de 14,000 cellules/puits (200 μΐ/puits), dans une plaque de culture et cultivées à 37°C en présence de 5% de C02 pendant 24 heures dans du DMEM complémenté avec 10% de sérum de veau fœtal. Les anticorps de l'invention sont incubés avec 480 ng/ml de ricine ou avec du sérum contrôle (anticorps non relevant) pendant 1 heure. Le mélange est ensuite ajouté aux cellules. 24 heures après, la viabilité cellulaire est mesurée par des techniques connues de l'homme de métier (exclusion au bleu Trypan, Cytox (Promega), mesure de l'apoptose...). Chaque test est corrigé par rapport aux contrôles « 100% de viabilité » cellulaire (pas de ricine et pas d'anticorps) et « 0% viabilité » (ricine sans anticorps). Exemple 5 : Test de la neutralisation in vitro de la ricine par l'anticorps monoclonal chimérique homme/macaque - test d'inhibition de la traduction.
Un autre test peut être utilisé pour mesure l'activité neutralisante des anticorps monoclonaux de l'invention, il s'agit de mesurer l'inhibition de la traduction protéique. Pour cela on mesure la traduction d'une protéine marqueur, par exemple la traduction de la luciférase, dans un système de traduction in vitro acellulaire [Haie ML Pharmacol Toxicol 2001, 88(5):255-260]. Brièvement, le test de mesure de la traduction de l'ARN message de la luciférase est le suivant :
Les anticorps monoclonaux sont déposés dans des plaques 96 puits dans du tampon phosphate salin (PBS) et de la ricine est ajoutée à une concentration finale de 4mM. Du lysat de réticulocyte de lapin complémenté de RNAsin ®, des acides aminés et de l'ARN messager de la luciférase est alors ajouté dans chaque puits. La réaction est réalisée pendant lh30.
5 μΐ^ de la reaction sont alors prélevés et ajouté à 45 μΐ^ de tampon réactionnel permettant de détecter l'activité luciférase (Luciférase assay reagent, Promega, Inc.). La lumière émise (luminescence) est mesurée en compte par seconde (CPS) à l'aide d'un lecteur multiplaque
Victor (PerkinElmer Wallac, Boston MA). Les données sont exprimées en pourcentage par rapport au contrôle (% contrôle= (CPS traité/ CPS contrôle) xl00)).
Dans les deux tests (Exemple 4 et Exemple 5), la comparaison entre la dose protectrice 50% du scFv (1 μg/ml) et celle de l'IgG (0,5 μg/ml) montre un net bénéfice de l'expression sous forme d'IgG.
Exemple 6 : Test de la neutralisation in vivo de la ricine par l'anticorps monoclonal chimérique homme/macaque -.
Afin de tester l'effet neutralisant de l'anticorps anti ricine in vivo, des rats Fisher (Charles River Laboratories L'Arbresle, France) ont reçu une dose de 16μg/kg en masse de ricine et 50μg d'anticorps anti ricine, après adaptation du protocole décrit par Ezzell et al. (Ezzell, et al. 1984. Infect. Immun. 45:761-767) Les tests ont été réalisés en mesurant la viabilité des animaux en fonction des doses de ricine et d'anticorps anti ricine injectés.
En contrôle, la viabilité des rats traités à la ricine seule (test positif) et des rats traités avec de l'anticorps anti ricine seul (test négatif) a également été évaluée.
Exemple 7 : Test d'affinité de l'anticorps monoclonal chimérique homme/macaque pour la ricine.
La mesure de l'affinité de l'anticorps anti ricine pour son antigène, c'est-à-dire la ricine, a été mesuré par résonance plasmonique de surface au moyen d'un appareil BIAcore X (Biacore, Uppsala, Suède).
La ricine a été immobilisée sur une puce CM5 (Biacore), au moyen d'un couplage aminé selon les instructions du fabricant.
Pour chaque mesure, un minimum de six dilutions, dans un tampon HBS-EP (Biacore) d'anticorps anti ricine a été testé pendant 900s (dilutions de 10 à 0,1 μg/mL). Après chaque dilution d'anticorps, la puce a été régénérée avec de la glycine 1,5 (Biacore) à un débit de ΙΟμΙ/min pendant 30s.
Les constantes d'affinité ont été calculées en utilisant la méthode décrite par Karlsson et al. (Karlsson et al. 1991 , J. Immunol. Methods 145:229-240) et vérifiées par des tests internes comme cela est décrit par Schuck, et al. (Schuck, P., and A. P. Minton. 1996. Anal. Biochem. 240:262-272).
Exemple 8 : Administration par instillation de l'anticorps monoclonal chimérique homme/macaque à des souris et détermination de la survie
Des souris BALb/c (20-22g) ont été exposées à de la ricine par instillation pulmonaire à raison de 16μg/kg de poids corporel et la survie a été contrôlée pendant 10 jours après l'administration de la ricine.
L'anticorps de type IgG 43RCA anti-chaine A de la ricine ou une IgG humaine contrôle ont été administrés par instillation pulmonaire à raison de 50 μg. L'effet protecteur de l'anticorps de type IgG 43RCA anti-chaine A de la ricine a été mesuré par le pourcentage de survie des souris et par le ratio du poids mouillé sur poids sec des poumons compte tenu que la ricine induit un œdème pulmonaire.
Les souris exposées à la ricine ayant reçue une IgG humaine contrôle sont toutes mortes au jour 3 (0% de survie) (n=4). On observe 100% de survie chez les souris ayant reçu dans une même injection la ricine et l'anticorps 43RCA (n=2, non représenté sur la figure 11)
Les souris ayant reçu l'anticorps 43RCA 6 heures après l'administration de la ricine, montrent 100 % de survie également (n=7)
Parmi les souris ayant reçu l'anticorps 43RCA 22 heures après l'administration de la ricine (n=7), 2 meurent au jour 4, 1 meurt au jour 8 et les 4 autres souris survivent. Le pourcentage de survie est égal à 57.1% lorsque l'anticorps est administré 22 heures après l'administration de la ricine par voie pulmonaire. Parmi les souris ayant reçu l'anticorps 43RCA 24 heures après l'administration de la ricine (n=l l), 2 meurent au jour 4, 2 meurent au jour 6 Au jour 10, 7 des 11 souris survivent. Le taux de survie est égal à 63.6%.
Le ratio poids mouillé sur poids sec des poumons est mesuré 3 jours après l'administration de ricine aux souris en présence ou non d'anticorps 43RCA. Comme indiqué dans le tableau ci- dessous, le ratio diminue si les souris reçoivent de la ricine pré-mélangée avec l'anticorps 43RCA, démontrant que cet anticorps 43RCA neutralise la toxicité de la toxine et limite l'œdème des poumons.
Figure imgf000050_0001
Exemple 9 : Administration par instillation de l'anticorps monoclonal chimérique homme/macaque à des souris et détermination de doses minimales
Des souris BALb/c ont été exposées à de la ricine par instillation pulmonaire à raison de 16μg/kg de poids corporel et ont reçu une administration de 43RCA 6 heures après à raison de 1, 5, 10, 20 μg.
La figure 12 montrent que quelque soit la dose administrée, on observe 100% de survie des souris. L'anticorps 43RCA présente une efficacité thérapeutique dès 1 μg lorsqu'il est administré 6 heures après l'intoxication par la ricine. Des souris BALb/c ont été exposées à de la ricine par instillation pulmonaire à raison de 16μ§/1¾ de poids corporel et la survie a été contrôlée pendant 10 jours après l'administration de la ricine. L'anticorps de type IgG 43RCA anti-chaine A de la ricine ou une IgG humaine contrôle ont été administrées par instillations pulmonaire à raison de 150 mg.
Comme indiqué sur la figure 13, les souris ayant reçu la ricine et une IgG contrôle meurent toutes au jour 4. Les souris ayant reçu l'anticorps 43RCA 44 heures après l'administration pulmonaire de ricine montrent une survie égale à 83% (n= 12). Les souris ayant reçu l'anticorps 43RCA 54 heures après l'administration pulmonaire de ricine montrent une survie égale à 75% (n=8). L'anticorps 43RCA présente donc une efficacité thérapeutique même lorsqu'il est administré plus de deux jours après l'intoxication par la ricine.
Exemple 10 : Administration par aérosol de l'anticorps monoclonal chimérique homme/macaque.
Des souris ont été exposées à des aérosols contenant de la ricine et de l'anticorps anti ricine obtenus par un nébulisateur Collison (diamètre aérodynamique médian en masse [MMAD] =1,2 urn).
Les concentrations en ricine et en anticorps, lors de chaque exposition, ont été identiques (ricin = 1 mg/ml, anticorps = 14 mg/ml); la concentration en aérosol étant déterminée par la durée d'exposition.
Les aérosols sont mesurés continuellement durant l'exposition au moyen d'un impacteur en verre (AGI). La concentration en protéine recueillie dans l'impacteur a été mesurée par le kit de dosage de protéines micro BCA (Pierce Co., Rockford, IL, U.S.A.)
Les conditions de diffusion des aérosols et leur recueillement sont restés constantes tout au long de l'étude. La concentration en aérosol ^g/L) ont été calculées et la dose de ricine inhale ^g/souris) a été estimé par la formule de Guyton.

Claims

REVENDICATIONS
1. Anticorps monoclonal chimérique dirigé contre la ricine, dans lequel la chaîne légère et la chaîne lourde sont telles que :
• la région constante de la chaîne légère est essentiellement constituée de la région constante de la chaîne légère d'une immunoglobuline humaine,
• la région constante de la chaîne lourde est essentiellement constituée de la région constante de la chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine,
• la région variable de la chaîne légère comprend la région variable de la chaîne légère d'une immunoglobuline de macaque, et
• la région variable de la chaîne lourde comprend la région variable de la chaîne lourde d'une immunoglobuline de macaque,
ledit anticorps monoclonal n'induisant substantiellement pas de réponse immune anti anticorps chimériques.
2. Anticorps monoclonal selon la revendication 1, capable de neutraliser la ricine, et notamment présentant un taux de neutralisation de la ricine supérieur au taux de neutralisation d'un fragment scFv dirigé contre la ricine.
3. Anticorps monoclonal selon la revendication 1 ou 2, dans lequel :
• la région constante de la chaîne légère comprend ou consiste en la région constante de la chaîne légère d'une immunoglobuline humaine de type IgGl, et
• la région constante de la chaîne lourde comprend ou consiste en la région constante de la chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine de type IgGl
ladite chaîne légère d'une immunoglobuline humaine de type IgGl et ladite chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine de type IgGl étant notamment la région constante d'une chaîne légère et la région constante d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine obtenue par immunisation avec l'antigène Rhésus D, et en particulier du clone T125-A2 humain.
4. Anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel :
• la région variable de la chaîne légère dudit anticorps monoclonal comprend ou est constituée de la séquence SEQ ID NO 2, et • la région variable de la chaîne lourde dudit anticorps monoclonal comprend ou est constituée de la séquence SEQ ID NO 4.
5. Anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel :
• la région variable de la chaîne légère dudit anticorps monoclonal comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO 6,
• la région variable de la chaîne lourde dudit anticorps monoclonal comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO 8.
6. Fragment de l'anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, ledit fragment étant un fragment Fab ou F(ab)'2.
7. Acide nucléique comprenant une séquence codant la chaîne légère de l'anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, notamment comprenant l'une quelconque des séquences SEQ ID NO 1, 5, 9 ou 13.
8. Acide nucléique comprenant une séquence codant la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal selon la revendication 1 à 5, notamment comprenant l'une quelconque des séquences SEQ ID NO 3, 7, 11 ou 15.
9. Acide nucléique comprenant une séquence codant la chaîne légère d'un anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 et comprenant une séquence codant la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.
10. Vecteur d'expression comprenant au moins un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, ledit acide nucléique étant sous contrôle des éléments permettant son expression.
11. Vecteur d'expression selon la revendication 10, comprenant
• un premier acide nucléique choisi parmi les acides nucléiques de séquences suivantes : SEQ ID NO 1, 5, 9 et 13, ledit premier acide nucléique étant sous contrôle des éléments permettant son expression, et • un second acide nucléique choisi parmi les acides nucléiques de séquences suivantes : SEQ ID NO 3, 7, 11 et 15, ledit second acide nucléique étant sous contrôle des éléments permettant son expression,
12. Vecteur d'expression selon la revendication 10 ou 11, comprenant ou consistant en la séquence SEQ ID N0 21.
13. Composition pharmaceutique, et notamment vaccinale, comprenant au moins
• un anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, ou
• un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, ou
• un vecteur selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, ou
• un fragment dudit anticorps monoclonal selon la revendication 6,
en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
14. Composition pharmaceutique, et notamment vaccinale, comprenant au moins un anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
15. Utilisation d'au moins :
• un anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, ou
• un fragment dudit anticorps monoclonal selon la revendication 6, ou
• un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, ou
• un vecteur selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, ou
• une cellule selon l'une quelconque des revendications 13 à 15,
pour la préparation d'un médicament pour le traitement ou la prévention d'une pathologie associée à la contamination par la ricine.
16. Méthode de dosage in vitro de la ricine dans un échantillon biologique issu d'un individu susceptible d'être contaminé par la ricine, ladite méthode comprenant :
• la mise en contact dudit échantillon avec au moins un anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, et • la détermination de la présence ou l'absence de ricine dans ledit échantillon par la détection de la formation d'un éventuel complexe immun entre la ricine et ledit anticorps monoclonal.
17. Procédé de décontamination in vitro d'un échantillon susceptible contaminé par la ricine, notamment d'un échantillon biologique, comprenant :
• la mise en contact dudit échantillon avec au moins un anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, et
• l'élimination, dudit échantillon, des complexes immuns formés entre la ricine et ledit anticorps monoclonal.
18. Procédé de préparation d'un anticorps monoclonal anti ricine selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 comprenant :
a. la transformation d'une cellule, notamment de mammifère, en particulier la lignée YB2/0 avec au moins un vecteur selon l'une quelconque des revendications 10 à 12,
b. la sélection des cellules transformées,
c. l'évaluation de la production dudit anticorps des clones sélectionnés à l'étape précédente, par la détermination de la présence ou de l'absence de la formation d'un éventuel complexe immun entre la ricine et ledit anticorps monoclonal.
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