CN101146554B - 中和肉毒杆菌神经毒素的治疗性单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了抗体，其特异性地结合和中和肉毒杆菌神经毒素A型(BoNT/A)和被那些抗体结合的表位。所述抗体和其衍生物和/或特异性地结合本文提供的中和表位的其它抗体，可以用于中和肉毒杆菌神经毒素，且因此也可以用于治疗肉毒中毒。

Description

中和肉毒杆菌神经毒素的治疗性单克隆抗体
与相关申请的交叉参考
本申请要求享有2005年1月27日提交的USSN 60/648,256的优先权和利益，其内容在这里为所有目的整体引作参考。
关于在联邦资助的研究和开发下作出的发明的权利的声明
本发明在国立卫生研究院(National Institute of Health)授予的基金号AI53389和AI56493以及国防部(Department of Defense)基金DAMD17-03-C-0076和DAMD 17-98-C-8030的政府支持下完成。政府具有本发明的某些权利。
发明领域
本发明涉及中和肉毒杆菌神经毒素(例如，BoNT/A)的抗体和它们在治疗肉毒中毒中的用途。
发明背景
肉毒中毒是由梭菌属(Clostridium)的成员分泌的肉毒杆菌神经毒素造成的，且其特征在于弛缓性麻痹，其如果没有立即致命，则需要长期在重病监护病房中住院治疗和机械换气。天然产生的肉毒中毒发生在胃肠道被梭菌细菌定居的婴儿或成年人中(婴儿或肠肉毒中毒)，在摄食被污染的食物产品后(食物肉毒中毒)，或在厌氧伤口感染中(伤口肉毒中毒)(Center for Disease Control(1998)Botulism in theUnited States，1899-1998.Handbook for epidemiologists，clinicians，andlaboratory workers.Atlanta，Georgia U.S.Department of Health andHuman Services，Public Health Service：下载地址是“www.bt.cdc.gov/agent/botulism/index.asp”)。肉毒中毒神经毒素(BoNT)也被疾病控制中心(Centers for Disease Control)(CDC)归入生物恐怖主义的6种最高危险的威胁因子(“A类因子”)之一，这是由于它们的巨大效力和致死率、容易生产和运输、和需要长期重症监护(Arnon等(2001)JAMA 285：1059-1070)。伊拉克和前苏联都生产了用作武器的BoNT(United Nations Security Council(1995)Tenth report ofthe executive committee of the special commission established by thesecretary-general pursuant to paragraph 9(b)(I)of security councilresolution 687(1991)，and paragraph 3 of resolution 699(1991)on theactivities of the Special Commision；Bozheyeva等(1999)Former sovietbiological weapons facilities in Kazakhstan：past，present，and future.Center for Nonproliferation Studies，Monterey Institute of InternationalStudies)，且日本宗教奥姆真理教(Aum Shinrikyo)尝试使用BoNT进行生物恐怖主义(Arnon等(2001)同上)。作为这些威胁的结果，需要用于预防和治疗中毒的特异性药物试剂。
没有存在特异性的小分子药物可以用于预防或治疗肉毒中毒，但是从CDC可以得到用于研究的五价类毒素疫苗(Siegel(1988)J.Clin.Microbiol.26：2351-2356)，且重组疫苗正在开发中(Smith(1998)Toxicon 36：1539-1548)。无论如何，由于疾病或暴露的稀少，和接种疫苗将阻止BoNT的随后的医学应用的事实，大规模平民或军人接种疫苗是不可能的。由于疾病的快速发作，暴露后的接种疫苗是无用的。毒素中和抗体(Ab)可以用于暴露之前或之后的预防，或用于治疗(Franz等(1993)Pp.473-476 In B.R.DasGupta(编)，Botulinum andTetanus Neurotoxins：Neurotransmission and Biomedical Aspects.Plenum Press，New York)。存在小量的马抗毒素和人肉毒杆菌免疫球蛋白，且其目前分别用于治疗成年人(Black和Gunn.(1980)Am.J.Med.，69：567-570；Hibbs等(1996)Clin.Infect.Dis.，23：337-340)和婴儿肉毒中毒(Arnon(1993).Clinical trial of human botulism immuneglobulin.，p.477-482.In B.R.DasGupta(编)，Botulinum and TetanusNeurotoxins：Neurotransmission and Biomedical Aspects.Plenum Press，New York)。
重组单克隆抗体(mAb)可以无限地提供抗毒素，其没有感染性疾病危险，且不需要人供体进行血浆去除术。鉴于BoNT的极端致死率，mAb必须是高效力的，以在合理的成本提供足够数目的剂量。这样的mAb的开发，已经成为国家变态反应和传染病研究所(National Instituteof Allergy and Infectious Diseases)的最高优先的研究目标。尽管迄今为止尚未描述一种非常有效的mAb，但我们最近报道了，组合2-3种mAb，可以产生非常有效的BoNT中和(Nowakowski等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99：11346-50)。
存在至少7种BoNT血清型(A-G)的事实，使肉毒中毒的mAb疗法的开发变得复杂(Hatheway(1995)Curr.Top.Microbio.Immunol，195：55-75.)，所述血清型即使有的话，也表现出微弱的抗体交叉反应性。尽管仅仅4种BoNT血清型常规造成人疾病(A、B、E和F)，但已经出现了由BoNT C造成的婴儿肉毒中毒的一个报道病例(Oguma等(1990)Lancet 336：1449-1450)，与BoNT D有关的一次食物传播的肉毒中毒爆发(Demarchi，等(1958)Bull.Acad.Nat.Med.，142：580-582)，以及其中分离出BoNT G的几个可疑死亡病例(Sonnabend等(1981)J.Infect.Dis.，143：22-27)。还已经表明，气溶胶化的BoNT/C、D和G通过吸入途径，在灵长类动物中产生肉毒中毒(Middlebrook和Franz(1997)Botulinum Toxins，chapter 33.In F.R.Sidell，E.T.Takafuji，D.R.Franz(编)，Medical Aspects of Chemical and Biological Warfare.TMM publications，Washington，D.C.)，且最可能也影响人类。因而，7种BoNT血清型中的任一种都可能用作生物威胁因子。
还已经报道了血清型中的BoNT基因和蛋白序列的变异性，且有证据表明，这样的变异性可以影响单克隆抗体与BoNT/A的结合(Kozaki等(1998)Infect.Immun.，66：4811-4816；Kozaki等(1995)Microbiol.Immunol.，39：767-774)。现在尚不清楚不同血清型内的这种毒素变异性的程度，也不清楚它对单克隆抗体组的结合和中和能力的影响。
发明概述
本发明涉及结合和中和肉毒杆菌神经毒素的抗体。我们已经发现，通过使用高亲和力地结合特定神经毒素血清型的2种或更多种亚型的中和抗体，可以特别有效地中和肉毒中毒神经毒素(BoNT)血清型。尽管这可以通过使用针对每种亚型的2种或更多种不同抗体来实现，但在某些实施方案中，通过使用一种或多种抗体，其中每种抗体可与至少2种BoNT亚型交叉反应，可以达到甚至更有效的中和。在某些实施方案中，本发明提供了组合物，其包含可以高亲和力地结合2种或更多种BoNT亚型(例如，BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3等)的中和抗体。
因而，在一个实施方案中，本发明提供了中和哺乳动物(例如，人)的肉毒杆菌神经毒素的方法。该方法通常包含，给所述哺乳动物施用BoNT血清型的至少2种不同中和抗体，其中2种抗体中的至少一种以大于约10nM的亲和力结合所述BoNT血清型(例如，BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F等)的至少2种不同亚型。在某些实施方案中，至少一种抗体结合选自下述的至少2种不同亚型：BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3和BoNT/A4，分别以大于约10nM的亲和力。在某些实施方案中，至少一种抗体结合BoNT/A1和BoNT/A2，分别以大于约10nM的亲和力。在某些实施方案中，两种抗体同时结合至少一种、优选至少2种亚型。在某些实施方案中，所述抗体各自包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个选自下述的CDR：RAZ1 VL CDR1、RAZ1 VL CDR2、RAZ1 VL CDR3、RAZ1 VH CDR1、RAZ1 VH CDR2、RAZ1 VH CDR3、1D11 VL CDR1、1D11 VL CDR2、1D11 VL CDR3、1D11 VH CDR1、1D11 VH CDR2、1D11 VH CDR3、2G11 VL CDR1、2G11 VL CDR2、2G11 VL CDR3、2G11 VH CDR1、2G11 VH CDR2、2G11 VH CDR3、5G4 VL CDR1、5G4 VL CDR2、5G4 VL CDR3、5G4 VH CDR1、5G4VH CDR2、5G4 VH CDR3、3D12 VL CDR1、3D12 VL CDR2、3D12 VLCDR3、3D12 VH CDR1、3D12 VH CDR2、3D12 VH CDR3、CR1 VLCDR1、CR1 VL CDR2、CR1 VL CDR3、CR1 VH CDR1、CR1 VH CDR2、CR1 VH CDR3、CR2 VL CDR1、CR2 VL CDR2、CR2 VL CDR3、CR2VH CDR1、CR2 VH CDR2、CR2 VH CDR3、ING1 VL CDR1、ING1 VLCDR2、ING1 VL CDR3、ING1 VH CDR1、ING1 VH CDR2、ING1 VHCDR3、ING2 VL CDR1、ING2 VL CDR2、ING2 VL CDR3、ING2 VHCDR1、ING2 VH CDR2和ING2 VH CDR3(参见，例如，图18和26，表2和/或表13等)。在各种实施方案中，所述抗体各自包含均选自VH结构域的VH CDR1、CDR2和CDR3，所述VH结构域选自：RAZ1VH结构域、CR1 VH结构域、ING1 VH结构域、ING2 VH结构域、1D11 VH结构域、2G11 VH结构域、3D12 VH结构域和5G4 VH结构域。在各种实施方案中，所述抗体各自包含均选自VL结构域的VLCDR1、CDR2和CDR3，所述VL结构域选自：RAZ1 VL结构域、CR1VL结构域、CR2 VL结构域、ING1 VL结构域、ING2 VL结构域、1D11VL结构域、2G11 VL结构域、3D12 VL结构域和5G4 VL结构域。在某些实施方案中，所述抗体各自包含均选自VH结构域的VH CDR1、CDR2和CDR3，所述VH结构域选自：RAZ1 VH结构域、CR1 VH结构域、CR2 VH结构域、ING1 VH结构域、ING2 VH结构域、1D11VH结构域、2G11 VH结构域、3D12 VH结构域和5G4 VH结构域；和均选自VL结构域的VL CDR1、CDR2和CDR3，所述VL结构域选自：RAZ1 VL结构域、CR1 VL结构域、CR2 VL结构域、ING1 VL结构域、ING2 VL结构域、1D11 VL结构域、2G11 VL结构域、3D12VL结构域和5G4 VL结构域。在某些实施方案中，至少一种所述抗体包含选自下述抗体的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3：RAZ1、CR1、ING1和ING2。在各种实施方案中，至少一种抗体是单链Fv(scFv)、IgG、IgA、IgM、Fab、(Fab′)2或(scFv′)2。在某些实施方案中，至少一种所述抗体选自：RAZ1、CR1、CR2、ING1、ING2、2G11、3D12和5G4。
在各种实施方案中，本发明提供了分离的抗体，其特异性地结合被选自下述的抗体特异性地结合的表位：C25、1C6、3D12、B4、1F3、HuC25、AR1、AR2、AR3、AR4、WR1(V)、WR1(T)、3-1、3-8、3-10、ING1、CR1、CR2、RAZ1和/或ING2。在某些实施方案中，所述抗体结合和中和一种、或优选2种或更多种肉毒杆菌神经毒素亚型(例如，BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3等)。所述抗体实际上可以是任意哺乳动物类型(例如小鼠、人、山羊、兔)或嵌合的(例如人源化的)，但是最优选地是人或人源化的。
在一个实施方案中，所述抗体包含至少1个(更优选至少2个、且最优选至少3个)在表2、和/或表6、和/或表9和/或表13和/或图26中列出的可变重链(VH)互补性决定区(CDR)或其保守置换。在另一个实施方案中，所述抗体包含至少1个(更优选至少2个、且最优选至少3个)在表2、和/或表6、和/或表9和/或表13、和/或图26中列出的可变轻链(VL)互补性决定区(CDR)或其保守置换。在另一个实施方案中，所述抗体包含至少1个(更优选至少2个、且最优选至少3个)在表2、和/或表6、和/或表9和/或表13、和/或图26中列出的可变重链(VH)互补性决定区(CDR)或其保守置换，和至少1个(更优选至少2个、且最优选至少3个)在表2、和/或表6、和/或表9和/或表13、和/或图26中列出的可变轻链(VL)互补性决定区(CDR或其保守置换，和/或1、2或3个在表2、和/或表6、和/或表9和/或表13、和/或图26中列出的VL或VH构架区。某些优选抗体包括，但不限于C25、1C6、3D12、B4、1F3、HuC25、AR1、AR2、AR3、AR4、WR1(V)、WR1(T)、3-1、3-8、3-10、ING1、CR1、RAZ1、ING2、1D11、2G11、3D 12和/或5G4。某些优选抗体包括IgG、单链Fv(scFv)，而其它优选抗体包括，但不限于IgG、IgA、IgM、Fab、(Fab′)2、(scFv′)2等。在某些实施方案中，所述抗体可以是多价的。所述抗体可以包括包含2个scFv片段的融合蛋白。
本发明也提供了组合物，其包含在药理学赋形剂中的一种或多种本文所述的肉毒杆菌神经毒素-中和抗体。
本发明也提供了BoNT-中和表位。某些优选表位包括被C25、1C6、3D12、B4、1F3、HuC25、AR1、AR2、AR3、AR4、WR1(V)、WR1(T)、3-1、3-8、3-10、ING1、CR1、CR2、RAZ1、ING2、1D11、2G11、3D12和/或5G4特异性地结合的BoNT/A HC表位。某些优选多肽不是全长BoNT，且更特别优选的多肽不是全长BoNT Hc片段。因而，最优选的表位是BoNT/A HC子序列或片段，其中优选子序列的长度为至少4，优选至少6，更优选至少8且最优选至少10、12、14或甚至15个氨基酸。在这方面，注意到HuC25和它的衍生物(AR1、2、3、4和CR1)结合N-末端的HC结构域，而3D12/RAZ1结合C-末端的HC结构域。这些表位都不是线性的。
定义
“BoNT多肽”指肉毒杆菌神经毒素多肽(例如，BoNT/A多肽、BoNT/B多肽、BoNT/C多肽等)。BoNT多肽可以指全长多肽或其片段。因而，例如，术语“BoNT/A多肽”指全长BoNT/A(由A型血清型肉毒梭菌(Clostridium botulinum)生成的神经毒素)或其片段(例如Hc片段)。HC片段是BoNT/A的约50Da C-末端片段(残基873-1296)(Lacy和Stevens(1999)J.Mol.Biol.，291：1091-1104)。
“BoNT”血清型指标准的已知的BoNT血清型之一(例如BoNT/A、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F等)。BoNT血清型彼此的差异为在氨基酸水平少至约35％(例如，BoNT/E和BoNT/F之间)，到在氨基酸水平最高至约66％(例如，BoNT/A对BoNT/C或D)。因而，BoNT血清型彼此的差异在氨基酸水平是约35-66％。
术语“BoNT亚型”(例如，BoNT/A1A亚型)指特定血清型(例如，A、C、D、F等)的肉毒杆菌神经毒素基因序列，它们彼此充分不同，以产生有差别的抗体结合。在某些实施方案中，所述亚型彼此的差异在氨基酸水平是至少2.5％，优选至少5％，或10％，更优选至少15％或20％。在某些实施方案中，所述亚型彼此的差异在氨基酸水平是不过35％，优选不过31.6％，更优选不过30％，或25％，更优选低于约20％或16％。在某些实施方案中，BoNT亚型彼此的差异在氨基酸水平是至少2.6％，更优选至少3％，且最优选至少3.6％。BoNT亚型彼此的差异在氨基酸水平通常是低于约31.6％，更优选低于约16％。
“中和”指肉毒杆菌神经毒素(例如，BoNT/A)毒性的可测量的降低。
当关于抗体使用时，术语“高亲和力”指该抗体以至少约10-8M、优选至少约10-9M、更优选至少约10-10M、且最优选至少约10-11M的亲和力(KD)，特异性地结合其靶。在某些实施方案中，“高亲和力”抗体具有约1nM-约5pM的KD。
在本文中使用下面的缩写：AMP，氨苄青霉素；BIG，肉毒杆菌免疫球蛋白；BoNT，肉毒杆菌神经毒素；BoNT/A，BoNT A型；CDR，互补性决定区；ELISA，酶联免疫吸附测定；GLU，葡萄糖；HBS，HEPES-缓冲盐水(10mM HEPES，150mM NaCl[pH 7.4])；Hc，BoNT重链的c-末端结构域(结合结构域)；HN，BoNT重链的N-末端结构域(易位结构域)；IgG，免疫球蛋白G；IMAC，固定化金属亲和层析；IPTG，异丙基-β-D-吡喃型硫代半乳糖苷；KAN，卡那霉素；Kd，平衡常数；koff，解离速率常数；kon，结合速率常数；MPBS，溶于PBS中的脱脂奶粉；NTA，次氮基三乙酸；PBS，磷酸缓冲盐水(25mM NaH2PO4，125mM NaCl[pH 7.0]；RU，共振单位；scFv，单链Fv抗体片段；TPBS，溶于PBS中的0.05％(vol/vol)吐温20；TMPBS，溶于MPBS中的0.05％(vol/vol)吐温20；TU，转导单位；VH，免疫球蛋白重链可变区；VK，免疫球蛋白κ轻链可变区；VL免疫球蛋白轻链可变区；wt，野生型。
术语“多肽”、“肽”或“蛋白”在本文中可互换地用于指，通过邻近残基的α-氨基和羧基之间的肽键彼此连接到一起的氨基酸残基的线性系列。氨基酸残基优选地是天然“L”异构体形式。但是，“D”异构体形式的残基可以置换任意L-氨基酸残基，只要该多肽保留所需的功能性质。另外，除了20种“标准”氨基酸以外，所述氨基酸还包括修饰的和罕见的氨基酸，它们包括，但不限于在37CFR(1.822(b)(4)中列出的那些。此外，应当指出，在氨基酸残基序列的开始或结束处的破折号，表示与一个或多个氨基酸残基的另一个序列的肽键，或与羧基或羟基末端基团的共价键。
本文使用的“抗体”指由基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的一种或多种多肽组成的蛋白。公知的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及众多的免疫球蛋白可变区基因。轻链分为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，它们又分别限定了免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
已知一般的免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由2个相同的多肽链对组成，每对具有一条“轻链”(约25kD)和一条“重链”(约50-70kD)。每条链的N-末端限定了约100-110或更多个氨基酸的可变区，后者主要负责抗原识别。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指这些轻链和重链。
抗体作为完整免疫球蛋白或用各种肽酶消化产生的许多充分表征的片段存在。因而，例如，胃蛋白酶在铰链区的二硫键以下消化抗体，以产生F(ab)′2，即Fab的二聚体，所述Fab本身是通过二硫键连接到VH-CH1上的轻链。在温和条件下可以还原F(ab)′2，以破坏铰链区中的二硫键，从而将(Fab′)2二聚体转化成Fab′单体。Fab′单体基本上是具有铰链区的部分的Fab(关于其它抗体片段的更详细的描述，参见，Fundamental Immunology，W.E.Paul，编，Raven Press，N.Y.(1993))。尽管就消化完整抗体而言定义了各种抗体片段，但技术人员会明白，可以化学地或通过使用重组DNA方法，从头合成这样的Fab′片段。因而，本文使用的术语抗体也包括通过修饰完整抗体产生的或使用重组DNA方法从头合成的抗体片段。优选的抗体包括Fab’2、IgG、IgM、IgA和单链抗体，更优选单链Fv(scFv)抗体，其中可变重链和可变轻链连接到一起(直接地或通过肽接头)，以形成连续多肽。
“抗原结合部位”或“结合部分”指免疫球蛋白分子的参与抗原结合的部分。抗原结合部位由重链(“H”)和轻链(“L”)的N-末端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。在重链和轻链的V区内的3个高度趋异的序列段称作“高变区”，它们插入在称作“构架区”或“FR”的更保守的侧接序列段之间。因而，术语“FR”指在免疫球蛋白的高变区之间和附近天然发现的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的3个高变区和重链的3个高变区在三维空间上彼此相对地布置，以形成抗原结合“表面”。该表面介导靶抗原的识别和结合。每条重链和轻链的3个高变区称作“互补性决定区”或“CDR”，且表征在例如Kabat等Sequences of proteins of immunological interest，4th ed.U.S.Dept.Health and Human Services，Public Health Services，Bethesda，MD(1987)。
S25抗体指由克隆S25表达的抗体，或以其它方式合成，但是与所述克隆25表达的抗体具有相同的CDR，和优选但非必需的相同的构架区的抗体。类似地，抗体C25、1C6、3D12、B4、1F3、HuC25、AR1、AR2、AR3、AR4、WR1(V)、WR1(T)、3-1、3-8、3-10、ING1、CR1、RAZ1或ING2指由对应克隆表达的抗体，和/或以其它方式合成，但是与所参考的抗体具有相同的CDR，和优选但非必需的相同的构架区的抗体。
本文使用的术语“免疫结合”和“免疫结合性质”指发生在免疫球蛋白分子和该免疫球蛋白特异性的抗原之间的类型的非共价相互作用。可以根据相互作用的解离常数(Kd)，表达免疫结合相互作用的强度或亲和力，其中更小的Kd代表更大的亲和力。使用本领域众所周知的方法，可以定量选择的多肽的免疫结合性质。一种这样的方法需要测量抗原结合部位/抗原复合物形成和解离的速率，其中这些速率取决于复合物配偶体的浓度、相互作用的亲和力和相等地影响两个方向的速率的几何参数。因而，通过计算浓度以及结合和解离的实际速率，可以确定“结合速率常数”(Kon)和“解离速率常数”(Koff)。Koff/Kon的比，能够取消与亲和力无关的所有参数，并因而等于解离常数Kd。一般地参见，Davies等Ann.Rev.Biochem.，59：439-473(1990)。
“BoNT-中和抗体”指结合一种或多种肉毒杆菌神经毒素(例如，BoNT/A1、BoNT/A2等)，并通过这样的结合减少该BoNT神经毒素的毒性的抗体。因而，例如本文使用的术语“BoNT/A-中和抗体”指这样的抗体，其特异性地结合BoNT/A多肽(例如BoNT/A1多肽)，在某些实施方案中，结合BoNT/A多肽的HC结构域，并通过这样的结合减少该BoNT/A多肽的毒性。减少的毒性可以测量为本文所述的发展麻痹的时间的增加和/或致死剂量(例如LD50)。源自BoNT-中和抗体的抗体包括，但不限于，在本文中特别提供其序列的抗体。
源自BoNT-中和抗体的抗体优选地具有约1.6x10-8或更好的结合亲和力，且可以通过筛选在噬菌体或酵母上展示的单链Fv片段文库来衍生，所述单链Fv片段文库从用肉毒杆菌类毒素、毒素或BoNT片段免疫的哺乳动物(包括小鼠和人)得到的重链(VH)和轻链(VL)可变区基因构建。抗体也可以通过筛选噬菌体或酵母展示文库来衍生，其中已知的BoNT-中和可变重链(VH)与大量可变轻链(VL)组合地表达，或者相反地，已知的BoNT-中和可变轻链与大量可变重链(VH)组合地表达。BoNT-中和抗体也包括通过向本文所述的可变重链或可变轻链的互补性决定区(CDR1、CDR2或CDR3)导入突变产生的那些抗体。最后，BoNT-中和抗体包括由应用于本文所述的BoNT-中和抗体和它们的衍生物上的这些修饰方法的任意组合产生的那些抗体。
中和表位指被中和抗体特异性地结合的表位。
单链Fv(“scFv”或“scFv”)多肽是共价连接的VH::VL异源二聚体，其可以由核酸表达，所述核酸包括直接连接的或通过肽编码接头连接的VH-和VL-编码序列。Huston，等(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA，85：5879-5883。许多结构将来自抗体V区的天然聚集的、但是化学上分离的轻和重多肽链转化成scFv分子，所述scFv分子将折叠成基本上类似于抗原结合部位的三维结构。参见，例如美国专利号5,091,513和5,132,405和4,956,778。
在一类实施方案中，重组设计方法可以用于开发用于将来自抗体可变区的2个天然结合的、但是化学上分离的重和轻多肽链转化成将折叠成基本上类似于天然抗体结构的三维结构的scFv分子的合适化学结构(接头)。
设计标准包括，确定跨一条链的C-末端和另一条链的N-末端之间的距离的适当长度，其中接头通常由小亲水氨基酸残基形成，其不倾向于卷曲或形成二级结构。这样的方法已经记载在本领域中。参见，例如，Huston等的美国专利号5,091,513和5,132,405；和Ladner等的美国专利号4,946,778。
在这方面，接头设计的第一个一般步骤包含，鉴别要连接的似乎合理的位点。每个VH和VL多肽结构域上的适宜连接位点包括将导致来自多肽结构域的残基的最少损失，且使包含与分子稳定性的需要相一致的最小数目残基的接头成为必需的那些。一对位点限定了要连接的“缺口”。连接一个结构域的C-末端和下一个结构域的N-末端的接头通常包含亲水氨基酸，其在生理溶液中呈现无组织的构型，且优选地不含有具有可能妨碍VH和VL链正确折叠的大侧基的残基。因而，在本发明中合适的接头通常包含甘氨酸和丝氨酸残基的交替集合的多肽链，且可以包括为增加溶解度而插入的谷氨酸和赖氨酸残基。本发明中一种具体的接头具有氨基酸序列[(Gly)4Ser]3(SEQ ID NO：1)。另一种特别优选的接头具有包含2或3个[(Ser)4Gly](SEQ ID NO：2)重复的氨基酸序列，例如[(Ser)4Gly]3(SEQ ID NO：3)等。使用本领域已知的各种寡核苷酸合成技术，可以容易地提供编码这样的接头部分的核苷酸序列。参见，例如，Sambrook，同上。
当提及抗体时，短语“特异性地结合蛋白”或“与……特异性地免疫反应”指结合反应，它在有异源蛋白群体和其它生物制品存在下，是蛋白存在的决定因素。因而，在指定的免疫测定条件下，指定的抗体结合特定蛋白，且不以显著量结合在样品中存在的其它蛋白。在这样的条件下与蛋白的特异性结合，可能需要针对其对特定蛋白的特异性而选择的抗体。例如，可以针对BoNT/A蛋白产生BoNT/A-中和抗体，其特异性地结合BoNT/A蛋白，且不结合在组织样品中存在的其它蛋白。许多种免疫测定形式可以用于选择可与特定蛋白特异性地免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定常规地用于选择与蛋白特异性地免疫反应的单克隆抗体。关于免疫测定形式的描述和可以用于确定特异性的免疫反应性的条件，参见Harlow和Lane(1988)Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Publications，NewYork。
术语“保守置换”用于指蛋白或肽，以反映基本上没有改变该分子的活性(特异性或结合亲和力)的氨基酸置换。通常，保守的氨基酸置换包含，用一种氨基酸置换具有类似化学性质(例如电荷或疏水性)的另一种氨基酸。下面的6组各自含有彼此是一般的保守置换的氨基酸：1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
附图简述
图1解释了使用噬菌体文库体外生产抗体的策略。从脾细胞制备mRNA，制备第一链cDNA，并通过PCR扩增抗体VH和VL基因。使用PCR，将VH和VL基因随机地剪接到一起，以生成scFv基因谱。将所述scFv基因谱与编码噬菌粒小外壳蛋白(pIII)的基因(gIII)符合读框地克隆进噬菌粒载体中。在产生的噬菌体抗体文库中的每个噬菌体都在它的表面上表达scFv-pIII融合蛋白，且在内部含有编码scFv的基因。通过固定化的抗原的亲和层析，可以将结合特定抗原的噬菌体抗体与非结合的噬菌体抗体分离。单轮选择以20-10,000的系数增加结合抗原的噬菌体抗体的数目，这取决于抗体的亲和力。洗脱的噬菌体抗体用于感染大肠杆菌(E.coli)，后者然后生产更多的噬菌体抗体，以用于下一轮选择。重复的选择轮次，使得分离最初以低于1/10亿的频率存在的结合抗原的噬菌体抗体成为可能。
图2中的图A和图B显示的传感器图(sensorgram)解释了用于对结合BoNT/A HC的scFv进行表位作图的技术。通过在BIAcore中使用表面等离振子共振，利用成对研究的scFv，进行表位作图。将每种scFv注射进BIAcore，并使其结合偶联在传感器芯片表面上的BoNT/A HC，直到达到饱和。将每种单独的scFv结合的量(以RU为单位)与当混合两种scFv并一起注射时结合的量相比较。点a显示了基线，随后开始注射。点b1和b2显示了初始结合阶段。点c1和c2显示了解离的开始。点a和c之间的差异(以RU为单位)等于结合BoNT/A HC的scFv的量。图A显示了识别不同表位的两种scFv(C25和C9)。一起注射的两种scFv结合的量(C9/C25，点c2)，是单独注射的两种scFv的和(c1)。图B显示了识别相同表位的两种scFv(C39和C25)。一起注射的两种scFv结合的量(C25/C39；点c)，与单独注射的两种scFv的(c)相同。点b1和c1之间、b2和c2之间、和b1和c之间的巨大差异(以RU为单位)是由于scFv和电泳缓冲液之间折射率的差异。
图3显示了在小鼠半膈模型中scFv中和BoNT/A的评价。在加入20pM BoNT/A(对照)，20pM BoNT/A+20nM scFv S25、C25、1C6或1F3(分别代表表位1-4)、或各自终浓度为20nM的S25和C25的组合之前(-30至0分钟)和之后，测量电刺激小鼠半膈后发展的颤搐张力。将结果表达为稳态颤搐张力(在0分钟)相对于时间的分数。scFv
1C6和1F3没有改变达到50％颤搐减少的时间，而scFv C25和S25明显延长所述时间。与单独的C25或S25相比，S25和C25的组合明显延长达到神经性麻痹的时间。
图4显示了mAb、mAb对和寡克隆(oligoclonal)Ab的体外毒素中和。在分离的小鼠半膈中测量达到50％颤搐减少的时间，并针对只有毒素的对照，单一mAb(C25、S25或3D12)，mAb对(C25 S25、C25+3D12或3D12+S25)，和寡克隆Ab(C25+3D12+S25)进行报道。与只有毒素相比，单一mAb明显延长达到神经性麻痹的时间。与单一mAb相比，mAb对明显延长达到神经性麻痹的时间。
图5A和5B显示了mAb(图5A)和mAb对(图5B)的体内毒素中和。将共50微克Ab与20或100只小鼠LD50的毒素相混合，并腹膜内注射(i.p.)。确定达到死亡的时间和存活小鼠的数目。单一mAb都没有表现出抗20LD50的显著保护。当给予任意mAb对时，所有小鼠都在100LD50攻击后存活。
图6显示了mAb、mAb对和寡克隆Ab的体内毒素中和。以递增的毒素攻击剂量，测定mAb、mAb对和寡克隆Ab的体内毒素中和。单一mAb都没有表现出显著保护。相反地，所有mAb对都中和了至少100LD50，就最有效的对(C25+3D12)而言，约50％的小鼠在1,500LD50的毒素攻击后存活。寡克隆Ab甚至更有效，约50％的小鼠在20,000LD50的毒素攻击后存活。
图7显示了抗体的溶液平衡解离常数(Kd)。通过测量随着递增的BoNT HC毒素而变化的存在的游离Ab的量，在流式荧光计中测量单一mAb C25和3D12的溶液Kd。以等摩尔量组合C25和3D12mAb，使C25Kd降低超过100倍。加入第三种Ab(S25)，使Kd另外降低4倍，达到18pM。
图8A和8B显示了可溶scFv抗体的ELISA表征。通过固定化涂布到聚苯乙烯平板上的每种指示的BoNT血清型BoNT/A HC和BoNT/A HN，进行测定。图8A：用过氧化物酶-缀合的mAb抗-E抗体(1∶2500)，检测可与涂布的抗原反应的、细菌表达的源自免疫文库的scFv抗体。图8B：用9E10抗体(1∶500)、随后用过氧化物酶-缀合的抗-小鼠-Fc抗体，检测可与涂布的抗原反应的、细菌表达的源自未免疫文库的scFv抗体。将测定的结果显示为在405nm的吸光度，其尚未对蛋白浓度标准化。
图9A和9B显示了对结合BoNT/A HC的scFv进行表位作图的传感器图。点‘a’：注射起始，点‘b’：注射终止，和点‘c’：结合的scFv的量。点b和c之间的差异(以RU为单位)是由于scFv和电泳缓冲液之间折射率的差异。图9A：scFv 3A6和3D12识别相同的表位，如当混合2种scFv时结合的RU没有增加所表明的。图9B：scFv 2A9和2A1识别不同的表位，如当混合2种scFv时结合的RU几乎加性的增加所表明的。
图10A和10B显示了靶向BoNT/A HC结构域的scFv抗体的单独作用和组合作用。图10A：在加入20pM BoNT/A(对照)，20pMBoNT/A+20nM I聚簇成员(3D12)、II聚簇成员(3F10)、C25或S25之前(-30至0分钟)和之后，测量电刺激小鼠半膈后发展的颤搐张力。scFv3F10没有改变达到50％颤搐减少的时间，而scFv C25、S25或3D12明显延长达到50％颤搐减少的时间。图10B：C25与S25或3D12(聚簇I)的组合，明显延长达到50％颤搐减少的时间。
图11显示了公开的肉毒杆菌神经毒素基因的系统树。使用Vector NTI软件，从公开的梭菌神经毒素基因的DNA序列，构建该系统树。
图12A和12B显示了BoNT/A基因序列的分析。图12A：BoNT/A基因的系统树揭示了2个聚簇，A1和A2。图12B：BoNT/A1和BoNT/A2之间的氨基酸侧链差异模型。BoNT/A重链结合结构域是白色的，在图的顶部，推定的神经节苷脂结合残基是蓝色的，且神经节苷脂是红色的。重链易位结构域是橙色的，且轻链是白色的，在图的底部。BoNT A1和A2毒素之间的侧链差异显示为绿色。
图13显示了BoNT/B基因序列的分析。BoNT/B基因的系统树揭示了4个聚簇：BoNT/B1、BoNT/B2、非蛋白水解的BoNT/B和二价BoNT/B。聚簇之间的百分比差异是3.6-7.7％。关于BoNT/A，在重链中观察到最大差异。
图14显示了通过捕获ELISA测得的BoNT/A HC单克隆抗体(C25、B4、S25和3D12)与BoNT/A1和BoNT/A2毒素的结合。给孔涂布指示的mAb，随后涂布可变浓度的纯的或复合的BoNT/A1或BoNT/A2。使用多克隆马BoNT/A抗血清，检测毒素结合。A1毒素用实心正方形表示；A2毒素用空心圆表示。纯毒素是实线；毒素复合物是虚线。
图15显示了通过捕获ELISA测得的BoNT/A易位结构域和轻链单克隆抗体与BoNT/A1和BoNT/A2毒素的结合。方法与图14所述相同。
图16解释了mAb对的保护用BoNT/A1毒素攻击的小鼠的能力。将一定范围的小鼠LD50的BoNT/A1毒素复合物与50ug等摩尔比的指示的mAb相混合，并腹膜内地注射混合物。表示小鼠存活数目对攻击剂量的关系。
图17A和17B解释了mAb三联体保护用BoNT/A1或BoNT/A2毒素攻击的小鼠的能力。将一定范围的小鼠LD50的BoNT/A1毒素复合物(图17A)或BoNT/A2毒素复合物(图17B)与50ug等摩尔比的指示的mAb相混合，并腹膜内地注射混合物。表示小鼠存活数且对攻击剂量的关系。
图18.突变的和选择的抗体的序列(HU-C25(VH SEQ ID NO：4，VL SEQ ID NO：17)、AR1(VH SEQ ID NO：5，VL SEQ ID NO：18)、AR2(VH SEQ ID NO：6，VL SEQ ID NO：19)、AR3(VH SEQ ID NO：7，VL SEQ ID NO：20)、AR4(VH SEQ ID NO：8，VL SEQ ID NO：21)、CR1(VH SEQ ID NO：9，VL SEQ ID NO：22))。破折号表示保守的残基。字母表示突变的残基。也参见SEQ ID NO：431-434(CR1)。
图19A和19B.突变的和选择的抗体的序列。图19A：3D12(VHSEQ ID NO：11，VL SEQ ID NO：10)和RAZ1(VH SEQ ID NO：11，VL SEQ ID NO：354))。图19B：ING1(VH SEQ ID NO：12，VL SEQ IDNO：358)、1D11(VH SEQ ID NO：12，VL SEQ ID NO：13)、2G11(VHSEQ ID NO：12，VL SEQ ID NO：14)、5G4(VH SEQ ID NO：12，VLSEQ ID NO：15)、ING2(VH SEQ ID NO：16，VL SEQ ID NO：362)。破折号表示保守的残基。字母表示突变的残基。也参见SEQ ID NO：351-354(RAZ1)、SEQ ID NO：355-358(ING1)、SEQ ID NO：359-362(ING2)。
图20A和20B显示了用于HuC25(图20A)和3D12(图20B)scFv的亲和力成熟的方案，其中使用酵母展示。
图21A至21D显示了野生型和亲和力成熟的酵母展示的scFv的亲和力。图21A：Hu C25和AR1；图21B：AR1和AR2；图21C：AR2和AR4；图21D：3D12和RAZ1。
图22解释了使用野生型和亲和力成熟的抗体，通过流式细胞术检测BoNT/A。
图23A和23B显示了野生型和亲和力成熟的抗体中和BoNT/A的效力。图23A：100只小鼠LD50攻击。图23B：200只小鼠LD50攻击。
图24A 24B显示了野生型和亲和力成熟的抗体对中和BoNT/A的效力。图24A：500只小鼠LD50攻击。图24B：5000只小鼠LD50攻击。
图25解释了抗体组合对BoNT/A2的中和。
图26显示了Hu-C25谱系抗体(HU-C25(VH SEQ ID NO：4，VLSEQ ID NO：17)、AR1(VH SEQ ID NO：5，VL SEQ ID NO：18)、AR2(VH SEQ ID NO：6，VL SEQ ID NO：19)、AR3(VH SEQ ID NO：7，VL SEQ ID NO：20)、AR4(VH SEQ ID NO：8，VL SEQ ID NO：21)、CR1(VH SEQ ID NO：9，VL SEQ ID NO：22)和CR2(VH SEQ ID NO：23，VL SEQ ID NO：22))的比对。也参见SEQ ID NO：367-372(CR2)。
详述
本发明提供了新的抗体，其特异性地结合和中和肉毒杆菌神经毒素A型，且在某些实施方案中，特异性地结合和中和其它肉毒杆菌神经毒素血清型(例如，B、C、D、E、F等)。肉毒杆菌神经毒素由厌氧细菌肉毒梭菌产生。肉毒杆菌神经毒素中毒(肉毒中毒)在许多背景下产生，包括但不限于，食物中毒(食物传播的肉毒中毒)、感染的伤口(伤口肉毒中毒)和因摄食孢子和毒素在婴儿肠内产生引起的“婴儿肉毒中毒”。肉毒中毒是一种麻痹性疾病，其通常从脑神经受累开始，并最终发展成牵连肢体。在急性情况下，肉毒中毒可以是致命的。
肉毒中毒神经毒素(BoNT)也被疾病控制中心(CDC)归入生物恐怖主义的6种最高危险的威胁因子(“A类因子”)之一，这是由于它们的巨大效力和致死率、容易生产和运输、和需要长期重症监护(Arnon等(2001)JAMA 285：1059-1070)。伊拉克和前苏联都生产了用作武器的BoNT(UN Security Council(1995)同上；Bozheyeva(1999)同上)，且日本宗教奥姆真理教尝试使用BoNT进行生物恐怖主义(Arnon等(2001)同上)。作为这些威胁的结果，需要用于预防和治疗中毒的特异性药物试剂。
最近已经发现，存在各种BoNT血清型的多种亚型。此外，我们还已经发现，许多结合例如BoNT/A1亚型的抗体不结合BoNT/A2亚型等。
我们已经发现，通过使用高亲和力地结合特定BoNT血清型的2种或更多种亚型的中和抗体，可以特别有效地中和肉毒中毒神经毒素(BoNT)亚型。尽管这可以通过使用针对每种亚型的2种或更多种不同抗体来实现，但这是低效率的、无效的且不实际的。给定BoNT的高毒性，希望BoNT治疗剂是非常有效的。因为已经必须使用多种抗体来以所需效力中和给定BoNT血清型(参见下面和图5、6、16和17)，所以如果必须使用每种亚型的不同抗体，那么从生产观点看，所需抗体的数目将是难以接受的。增加混合物中抗体的数目，也降低效力。因而，例如，如果在4种抗体的混合物中，2种中和A1，且2种中和A2毒素，则仅仅50％抗体将中和给定毒素。相反地，二者都中和A1和A2毒素的2种抗体的混合物，对任一种毒素都将具有100％活性，且更容易生产。例如对于两种BoNT/A亚型(A1、A2)，可以用2-3种抗体实现有效的中和。如果BoNT/A1和BoNT/A2中和需要不同抗体，则需要4-6种抗体。对于额外的亚型，复杂性进一步增加。因而，在某些实施方案中，本发明提供了高亲和力地结合2种或更多种BoNT亚型(例如，BoNT/A1、BoNT/A2等)的中和抗体。
高亲和力地结合BoNT/A1和BoNT/A2的抗体的实例包括、但不限于，本文所述的CR1、RAZ1、ING1和ING2。
还令人惊奇地发现，当人们开始组合中和抗体时，抗体组合的效力急剧增加。该增加使得生成用于治疗用途所需效力的肉毒杆菌抗体成为可能。还令人惊奇地，当人们开始组合2和3种单克隆抗体时，识别的特定BoNT表位变得不太重要。因而，例如，如实施例5所表明的，结合BoNT的易位结构域和/或催化结构域的抗体具有中和活性，当相互组合时，或当与识别BoNT受体结合结构域(HC)的mAb组合时，都可以有效地中和BoNT活性。因而，在某些实施方案中，本发明预期组合物，其包含至少2种、更优选至少3种结合BoNT上的非重叠表位的高亲和力抗体。
因而，在某些实施方案中，本发明预期组合物，其包含2种或更多种、优选3种或更多种选自下述的不同抗体：3D12、RAZ1、CR1、ING1、ING2和/或包含一个或多个来自这些抗体的CDR的抗体，和/或一种或多种包含自这些抗体的突变体的抗体，例如ING1的1D11、2G11或5G4突变体(参见，例如，图19B)。
如上所指出的，在某些实施方案中，本发明提供的抗体结合和中和一种或多种肉毒杆菌神经毒素A型(BoNT/A)亚型。在本上下文中，中和指BoNT/A毒性的可测量的降低。通过许多本领域技术人员众所周知的方法，可以体外测量这样的毒性的降低。一种这样的测定包含，测量在半膈制剂中达到给定百分比(例如50％)颤搐张力减少的时间。可以体内测量毒性，例如作为在有一种或多种推定的中和抗体存在下，试验动物(例如小鼠)肉毒杆菌神经毒素A型的LD50。在施用之前，可以将中和抗体与肉毒杆菌神经毒素相组合，或可以在施用神经毒素之前、同时或之后，给动物施用所述抗体。
由于本发明的抗体起中和肉毒杆菌神经毒素A型的作用，所以它们可以用于治疗与肉毒杆菌神经毒素中毒有关的病理学。所述治疗基本上包含，给中毒的生物(例如人或非人哺乳动物)施用足以中和(例如减轻或消除)BoNT中毒症状的量的一种或多种中和抗体。
在急性情况下，例如，肺活量低于预期的30-40％、和/或麻痹快速发展、和/或存在具有绝对或相对高碳酸血的低氧血时，这样的治疗是最需要的和有效的。这些抗体也可以用于治疗具有比指示的症状更轻微的症状的早期病例(以阻止发展)或甚至预防性地应用(军事中对参与损害路线的士兵预期的应用)。使用中和抗体的治疗，可以作为其它治疗的附件而提供(例如抗生素治疗)。
本发明提供的抗体也可以用于快速检测/诊断肉毒中毒(A型毒素)，并从而补充和/或替代以前的实验室诊断。
在另一个实施方案中，本发明提供了被肉毒杆菌神经毒素A型中和抗体特异性地结合的表位。这些表位可以用于分离和/或鉴别和/或筛选本文所述的其它抗体BoNT/A中和抗体。
I.肉毒杆菌神经毒素(BoNT)-中和抗体的效力
不受特定理论的约束，认为用于治疗肉毒中毒(马和人)的现有抗毒素具有约5000只小鼠LD50/mg(人)和55,000只小鼠LD50mg(马)的效力。
基于我们的计算，我们认为商业上需要的抗毒素将具有大于约10,000-100,000LD50/mg的效力。本文所述抗体的组合(例如，2或3种抗体)满足该效力。因而，在某些实施方案中，本发明提供了抗体和/或抗体组合，其中和至少约10,000只小鼠LD50/mg抗体，优选至少约15,000只小鼠LD50/mg抗体，更优选至少约20,000只小鼠LD50/mg抗体，且最优选至少约25,000只小鼠LD50/mg抗体。
II.肉毒杆菌神经毒素(BoNT)-中和抗体
在某些优选实施方案中，选择结合1种、但是更优选地结合至少2种或更多种BoNT亚型的BoNT中和抗体。对于每种BoNT血清型，已知许多亚型。因而，例如，BoNT/A亚型包括，但不限于，BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3等(参见，例如，图11)。还注意到，例如，BoNT/A1亚型包括，但不限于，62A、NCTC 2916、ATCC 3502和Hall hyper(HallAllergan)，且是相同的(在氨基酸水平99.9-100％同一性)，且已经归入亚型A1(图12A)。BoNT/A2序列(Kyoto-F和FRI-A2H)(Willems，等(1993)Res.Microbiol.144：547-556)在氨基酸水平是100％同一的。另一种BoNT/A亚型(我们称作A3)由称作Loch Maree的品系生成，该品系在苏格兰的爆发中杀死了许多人。我们的数据表明，与A1和A2毒素交叉反应的本文所述的3种抗体(参见表1)，也与A3毒素交叉反应(它们是CR1、ING1和RAZ1)。我们已经鉴别出的另一种BoNT/A毒素称作A4。它由生产B和A毒素的二价梭菌品系生产。
类似地，如图11所示，也已知血清型B、C、E和F的许多亚型。使用本文所述的方法，发现可以生产(例如，选择/工程改造)与一种血清型内的2种或更多种亚型交叉反应的高亲和力抗体。此外，不受特定理论的约束，这些交叉反应的抗体似乎基本上更有效地中和肉毒杆菌神经毒素，尤其当与一种或多种不同中和抗体组合使用时。
在表2和图18和19中，解释了许多原型上“交叉反应的”抗体的可变重链(VH)和可变轻链(VL)结构域的序列。如上所指出的，抗体CR1、RAZ1、ING1和ING2是与BoNT/A1和BoNT/A2亚型交叉反应的，而抗体CR1、ING1和RAZ1另外是与BoNT/A3亚型交叉反应的。
通过人源化的C25(HuC25)(即AR2的衍生物)的突变和选择，生产抗体CR1，例如，如实施例4所述。在A1和A2亚型上突变和选择抗体。类似地，抗体3D12的突变(参见，例如，实施例2)产生RAZ1。酵母上选择免疫scFv文库，产生ING1和ING2。
表1.工程改造的抗体的结合数据
Figure GSB00000347175700201
表2和图18和19提供了交叉反应的抗体RAZ1、CR1、ING1和ING2的VH和VL区的氨基酸序列信息。提供了关于特异性地结合BoNT/A1亚型的抗体AR2和AR3的类似信息。另外，在本文中提供了S25、C25、C39、1C6、3D12、B4、1F3、HuC25、AR1、AR2、WR1(V)、WR1(T)、3-1、3-8和/或3-10的序列信息(参见，例如，表6、和/或表11和/或表13)。
表2.亲和力成熟的、交叉反应的、和/或修饰的抗体的氨基酸序列
Figure GSB00000347175700211
Figure GSB00000347175700221
*完整重链的序列是重链构架1+CDR1+构架2+CDR2+构架3+CDR3+构架4。
完整轻链的序列是轻链构架1+CDR1+构架2+CDR2+构架3+CDR3+构架4。
使用本文提供的教导和序列信息，可以直接或通过接头(例如(Gly4Ser3，SEQ ID NO：181)连接可变轻链和可变重链，以形成单链Fv抗体。可以使用各种CDR和/或构架区，来形成全人抗体、嵌合抗体、抗体片段、多价抗体等。
III.BoNT中和抗体的制备
A)BoNT-中和抗体的重组表达
使用本文提供的信息，使用本领域技术人员众所周知的标准技术，制备本发明的肉毒杆菌神经毒素-中和抗体。
例如，本文提供的多肽序列(参见，例如，表2、和/或表6、和/或表9和/或表13)可以用于确定编码BoNT/A-中和抗体的适当核酸序列，然后将该核酸序列用于表达一种或多种BoNT-中和抗体。根据本领域技术人员众所周知的标准方法，可以最优化所述核酸序列，以反映各种表达系统的特定密码子“偏好”。
使用本文提供的序列信息，根据本领域技术人员已知的许多标准方法，可以合成核酸。寡核苷酸合成，优选地在可商业得到的固相寡核苷酸合成机器上进行(Needham-VanDevanter等(1984)Nucleic AcidsRes.12：6159-6168)，或使用Beaucage等(Beaucage等(1981)Tetrahedron Letts.22(20)：1859-1862)所述的固相亚磷酰胺三酯方法手工合成。
一旦合成了编码BoNT/A-中和抗体的核酸，就可以根据标准方法扩增和/或克隆它。本领域已知达到这些目的的分子克隆技术。技术人员已知许多种适用于构建重组核酸的克隆和体外扩增方法。这些足以指导技术人员进行许多克隆应用的技术和说明书的实例，参见Berger和Kimmel，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods inEnzymology volume 152 Academic Press，Inc.，San Diego，C(Berger)；Sambrook等(1989)Molecular Cloning-A Laboratory Manual(第2版)Vol.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Press，NY，(Sambrook)；和Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等，编，Current Protocols，a joint venture between Greene PublishingAssociates，Inc.和John Wiley & Sons，Inc.，(1994增刊)(Ausubel)。生产重组免疫球蛋白的方法也是本领域已知的。参见，Cabilly，美国专利号4,816,567；和Queen等(1989)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 86：10029-10033。
足以指导技术人员进行体外扩增方法的技术的实例，包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、Qβ-复制酶扩增和其它RNA聚合酶介导的技术，参见Berger、Sambrook和Ausubel，以及Mullis等，(1987)美国专利号4,683,202；PCR Protocols A Guide to Methods andApplications(Innis等编)Academic Press Inc.San Diego，CA(1990)(Innis)；Arnheim & Levinson(October 1，1990)C&EN 36-47；TheJournal Of NIH Research(1991)3，81-94；(Kwoh等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，1173；Guatelli等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87，1874；Lomell等(1989)J.Clin.Chem 35，1826；Landegren等，(1988)Science 241，1077-1080；Van Brunt(1990)Biotechnology 8，291-294；Wu和Wallace，(1989)Gene 4，560；和Barringer等(1990)Gene 89，117。改进的克隆体外扩增的核酸的方法，记载在Wallace等，美国专利号5,426,039。
一旦分离并克隆了BoNT/A-中和抗体的核酸，人们就可以在本领域技术人员已知的许多重组地工程改造的细胞中表达该基因。这些细胞的实例包括细菌、酵母、丝状真菌、昆虫(尤其是使用杆状病毒载体时)和哺乳动物细胞。预见到，本领域技术人员知道可用于表达BoNT/A-中和抗体的许多表达系统的知识。
总之，编码BoNT/A-中和抗体的天然的或合成的核酸的表达，通常通过将编码所述抗体的核酸可操作地连接到启动子(它是组成型或诱导型的)上，并将该构建体整合入表达载体来实现。载体可以适合于在原核生物、真核生物或二者中复制并整合。一般的克隆载体含有转录和翻译终止子、起始序列和启动子，它们用于调节编码BoNT/A-中和抗体的核酸的表达。载体任选地包含基因表达盒，其含有至少1个独立终止子序列、允许该表达盒在真核生物和原核生物两者中复制的序列(即穿梭载体)和原核生物和真核生物系统两者的选择标记。参见Sambrook。
为了得到克隆的核酸的高水平表达，通常构建表达质粒，后者通常含有指导转录的强启动子、翻译起始的核糖体结合位点、和转录/翻译终止子。在大肠杆菌中适于该目的的调节区的实例是，Yanofsky(1984)J.Bacteriol.，158：1018-1024所述的大肠杆菌色氨酸生物合成途径的启动子和操纵基因区，和Herskowitz和Hagen(1980)Ann.Rev.Genet.，14：399-445所述的噬菌体λ的左侧启动子(PL)。在转化进大肠杆菌中的DNA载体中包含选择标记，也是有用的。这样的标记的实例包括赋予对氨苄青霉素、四环素或氯霉素的抗性的基因。关于选择标记的细节，例如，在大肠杆菌中的应用，参见Sambrook。
使用大肠杆菌、芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)(Palva，等(1983)Gene 22：229-235；Mosbach等，Nature，302：543-545和沙门氏菌属(Salmonella)，可以得到用于表达BoNT/A-中和抗体的表达系统。大肠杆菌系统是优选的。
原核细胞生产的BoNT/A-中和抗体可能需要暴露于离液剂，以进行正确折叠。在从例如大肠杆菌纯化的过程中，任选地将表达的蛋白变性，然后复性。这通过例如使细菌生产的抗体溶于离液剂(例如盐酸胍)中来实现。然后通过缓慢的透析或通过凝胶过滤，使抗体复性。参见，美国专利号4,511,503。
在哺乳动物细胞中转染和表达基因的方法，是本领域已知的。用核酸转导细胞可以包含，例如，将含有BoNT/A-中和核酸的病毒载体与该载体的宿主范围内的细胞一起温育。参见，例如，Goeddel(1990)Methods in Enzymology，vol.185，Academic Press，Inc.，San Diego，CA或Krieger(1990)Gene Transfer and Expression--A Laboratory Manual，Stockton Press，New York，N.Y.和其中引用的文献。
在本发明中使用的细胞的培养，包括来自组织或血液样品的细胞系和培养的细胞，是本领域众所周知的(参见，例如，Freshney(1994)Culture of Animal Cells，a Manual of Basic Technique，third edition，Wiley-Liss，N.Y.和其中引用的文献)。
关于使用和操作抗体的技术，参见Coligan(1991)CurrentProtocols in Immunology Wiley/Greene，NY；Harlow和Lane(1989)Antibodies：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press，NY；Stites等(编)Basic and Clinical Immunology(4th ed.)Lange MedicalPublications，Los Altos，CA，和其中引用的文献；Goding(1986)Monoclonal Antibodies：Principles and Practice(第2版)Academic Press，New York，NY；和Kohler和Milstein(1975)Nature 256：495-497。对肉毒杆菌神经毒素A型特异性的BoNT/A-中和抗体具有1x10-8M或更好的KD，优选实施方案具有1nM或更好的KD，且最优选实施方案具有0.1nM或更好的KD。
在一个优选实施方案中，将BoNT/A-中和抗体基因(例如BoNT/A-中和scFv基因)亚克隆进表达载体pUC119mycHis(Tomlinson等(1996)J.Mol.Biol.，256：813-817)或pSYN3中，从而导致在scFv的C-末端添加六组氨酸标记以促进纯化。在实施例1中，提供了用于克隆和纯化BoNT/A-中和抗体的详细方案。
B)完整多克隆或单克隆抗体的制备
本发明的BoNT中和抗体包括单个的、等位基因的、品系或物种变体和其片段，其都是它们的天然存在的(全长)形式和重组形式。在某些实施方案中，选择结合被本文所述抗体(例如，S25、C25、C39、1C6、3D12、B4、1F3、HuC25、AR1、AR2、WR1(V)、WR1(T)、3-1、3-8、3-10、CR1、RAZ1、1D11、2G11、5G4、ING1和/或ING2)结合的一种或多种表位的优选抗体。某些优选抗体可与2种或更多种BoNT亚型(例如BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3等)交叉反应。所述抗体可以以它们的天然构型或非天然构型产生。也可以产生抗独特型的抗体。许多制备特异性地结合特定表位的抗体的方法，是技术人员已知的。下面的讨论作为可用技术的一般综述；但是，技术人员将认识到，对下述方法的许多变化是已知的。
1)多克隆抗体生产
生产多克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的。简而言之，将免疫原(例如，BoNT/A1或A2、BoNT/A1或A2 Hc或BoNT/A1或A2子序列，包括但不限于，包含被本文公开的克隆S25、C25、C39、1C6、3D12、B4、1F3、HuC25、AR1、AR2、WR1(V)、WR1(T)、3-1、3-8、3-10和/或CR1、RAZ1、1D11、2G11、5G4、ING1和/或ING2表达的抗体特异性地结合的表位的子序列)，优选纯化的多肽，与适当载体(例如，GST、匙孔血蓝蛋白等)偶联的多肽，或掺入免疫接种载体例如重组痘苗病毒中的多肽(参见，美国专利号4,722,848)，与佐剂相混合，并用该混合物免疫动物。通过采集试验流血和测定对目标多肽的反应性的效价，监控动物对免疫原制剂的免疫应答。当得到对免疫原的适当高效价的抗体时，从该动物收集血液，并制备抗血清。在需要时，进行抗血清的进一步分级分离，以富集与BoNT/A多肽反应的抗体(参见，例如，Coligan(1991)Current Protocols in ImmunologyWiley/Greene，NY；和Harlow和Lane(1989)Antibodies：A LaboratoryManual Cold Spring Harbor Press，NY)。
使用本文所述的选择技术，可以从多克隆血清中选择特异性地结合本文所述中和表位的抗体。
2)单克隆抗体生产
在有些情况下，需要从各种哺乳动物宿主例如小鼠、啮齿类动物、灵长类动物、人等制备单克隆抗体。关于制备这样的单克隆抗体的技术的描述，参见，例如，Stites等(编)Basic and Clinical Immunology(第4版)Lange Medical Publications，Los Altos，CA，和其中引用的文献；Harlow和Lane，同上；Goding(1986)Monoclonal Antibodies ：Principlesand Practice(第2版)Academic Press，New York，NY；和Kohler和Milstein(1975)Nature 256：495-497。
总之，如下所述生产单克隆抗体：给动物注射免疫原(例如，BoNT/A、BoNT/A Hc或BoNT/A子序列，包括但不限于，包含被本文公开的克隆S25、C25、C39、1C6、3D12、B4、1F3、HuC25、AR1、AR2、WR1(V)、WR1(T)、3-1、3-8、3-10和/或CR1、RAZ1、1D11、2G11、5G4、ING1和/或ING2表达的抗体特异性地结合的表位的子序列)。然后处死动物，从它的脾收集细胞，所述细胞与骨髓瘤细胞融合。结果是能体外繁殖的杂交细胞或“杂交瘤”。然后，筛选杂交瘤群体，以分离单个克隆，其中的每个分泌对免疫原的单一抗体种类。以此方式，得到的单个抗体种类是对在免疫原性物质上识别出的特异性位点作出应答所产生的来自免疫动物的无限增殖化的和克隆的单一B细胞的产物。
无限增殖化的替代方法包括用EB病毒、癌基因或逆转录病毒进行转化，或本领域已知的其它方法。筛选由单个无限增殖化细胞产生的集落，用于生产对BoNT抗原具有需要的特异性和亲和力的抗体，并通过各种技术，包括注射进脊椎动物(优选哺乳动物)宿主的腹膜腔，增强由这种细胞产生的单克隆抗体的得率。本发明的抗体可以经过或不经过修饰地使用，且包括嵌合抗体例如人源化的鼠抗体。
IV.BoNT中和抗体的修饰
A)噬菌体展示可以用于增加抗体亲和力。
为了生成更高亲和力的抗体，可以基于结合scFv的序列(例如，表2、和/或表6、和/或表9和/或表13)，生成突变型scFv基因谱，且在噬菌体表面上表达。抗体片段在感染细菌的病毒(噬菌体)表面上的展示，使得生产具有宽范围的亲和力和动力学特性的人或其它哺乳动物抗体(例如scFv)成为可能。为了在噬菌体表面上展示抗体片段(噬菌体展示)，将抗体片段基因插入编码噬菌体表面蛋白(例如，pIII)的基因中，并在噬菌体表面表达抗体片段-pIII融合蛋白(McCafferty等(1990)Nature，348：552-554；Hoogenboom等(1991)Nucleic Acids Res.，19：4133-4137)。
由于在噬菌体表面上的抗体片段是有功能的，所以通过抗原亲和层析，可以将携带结合抗原的抗体片段的那些噬菌体与未结合的或更低亲和力的噬菌体分离(McCafferty等(1990)Nature，348：552-554)。允许噬菌体的混合物结合亲和基质，通过洗涤去除未结合的或更低亲和力的噬菌体，并通过用酸或碱处理，洗脱结合的噬菌体。根据抗体片段的亲和力，通过单轮亲和选择，得到20倍-1,000,000倍的富集因子。
通过如下所述用洗脱的噬菌体或的洗脱的噬菌体的修饰变体感染细菌，可以培养更多的噬菌体，并用于另一轮选择。以此方式，一轮的1000倍富集变成2轮选择的1,000,000倍(McCafferty等(1990)Nature，348：552-554)。因而，甚至当每轮中的富集较低时，多轮亲和选择也导致罕见噬菌体的分离，且其中含有的遗传材料编码结合抗体的序列(Marks等(1991)J.Mol.Biol.，222：581-597)。噬菌体展示提供的基因型和表型之间的物理联系，使得测试抗体片段文库中的每个成员与抗原的结合成为可能，甚至对于大至100,000,000个克隆的文库。例如，对抗原进行多轮选择后，回收以仅1/30,000,000克隆的频率发生的结合scFv(同前)。
1)链改组
生成突变型scFv基因谱的一个方法包含，用VH或VL基因谱替代来自结合scFv的VH或VL基因(链改组)(Clackson等(1991)Nature，352：624-628)。这样的基因谱含有许多源自与结合scFv相同种系基因的V基因，但是具有点突变(Marks等(1992)Bio/Technology，10：779-783)。使用轻链或重链改组和噬菌体展示，可以显著增加例如BoNT/A1/BoNT/A2-中和抗体片段的结合亲和力(参见，例如，Marks等(1992)Bio/Technology，10：779-785，其中结合半抗原苯基
Figure GSB00000347175700291
唑酮(phox)的人scFv抗体片段的亲和力从300nM增加至15nM(20倍))。
因而，为了改变BoNT-中和抗体的亲和力，生成突变型scFv基因谱，其含有已知BoNT-中和抗体(例如，CR1、RAZ1、ING1、ING2)的VH基因和VL基因谱(轻链改组)。或者，生成scFv基因库，其含有已知BoNT-中和抗体(例如，CR1、RAZ1、ING1、ING2)的VL基因和VH基因谱(重链改组)。将scFv基因谱克隆进噬菌体展示载体(例如，pHEN-1，Hoogenboom等(1991)Nucleic Acids Res.，19：4133-4137)，且在转化后，得到转化体文库。如实施例所述，制备噬菌体，浓缩，并进行选择。
在每轮选择中，抗原浓度都降低，从而在最后的选择轮次之前，达到低于所需的Kd的浓度。这导致基于亲和力选择噬菌体(Hawkins等(1992)J.Mol.Biol.226：889-896)。
2)通过定点诱变，增加BoNT-中和抗体的亲和力
接触氨基酸侧链的大多数抗原位于互补性决定区(CDR)，3个在VH(CDR1、CDR2和CDR3)，且3个在VL(CDR1、CDR2和CDR3)(Chothia等(1987)J.Mol.Biol.，196：901-917；Chothia等(1986)Science，233：755-8；Nhan等(1991)J.Mol.Biol.，217：133-151)。这些残基提供负责抗体对抗原的亲和力的大部分结合能量。在其它分子中，已经表明使接触配体的氨基酸突变，是增加一种蛋白分子对它的结合配偶体的亲和力的有效方式(Lowman等(1993)J.Mol.Biol.，234：564-578；Wells(1990)Biochemistry，29：8509-8516)。因而，CDR的突变(随机化)和针对BoNT/A、BoNT/A HC或本文鉴别出的它们的表位的筛选，可以用于生成具有提高的结合亲和力的BoNT/A-中和抗体。
在某些实施方案中，使用例如S25作为模板(Kd＝7.3x10-8M)，在分开的文库中随机化每个CDR。为了简化亲和力测量，使用S25或其它更低亲和力的BoNT/A-中和抗体作为模板，而不是更高亲和力的scFv。组合来自每个CDR文库的最高亲和力突变体的CDR序列，以得到加性的亲和力增加。类似的方法已经用于将人生长激素(hGH)对生长激素受体的亲和力增加了超过1500倍，从3.4x10-10至9.0x10-13M(Lowman等(1993)J.Mol.Biol.，234：564-578)。
为了增加BoNT-中和抗体的亲和力，通过合成“掺杂的”寡核苷酸，其中野生型核苷酸以例如49％的频率存在，将位于一种或多种CDR中的氨基酸残基(例如，位于VL CDR3中的9个氨基酸残基)部分地随机化。将该寡核苷酸用于用PCR扩增BoNT-中和scFv基因的剩余部分。
例如，在一个实施方案中，为了生成其中VH CDR3被随机化的文库，合成寡核苷酸，其退火到BoNT-中和抗体VH构架3，并编码VHCDR3和构架4的部分。在要随机化的4个位置，可以使用序列NNS，其中N是4种核苷酸的任一个，且S是“C”或“T”。将该寡核苷酸用于用PCR扩增BoNT/A-中和抗体VH基因，从而生成突变型BoNT-中和抗体VH基因谱。使用PCR来剪接VH基因谱与BoNT-中和抗体轻链基因，并将得到的scFv基因谱克隆进噬菌体展示载体(例如，pHEN-1或pCANTAB5E)。连接的载体DNA用于转化电感受态(electrocompetent)大肠杆菌，以生成噬菌体抗体文库。
为了选择更高亲和力的突变型scFv，如实施例所述，在递减量的一种或多种BoNT亚型上，进行噬菌体抗体文库的每轮选择。通常，通过96孔平板上的ELISA，可以筛选来自第3轮和第4轮选择的96个克隆对所需抗原(例如，BoNT/A1和/或BoNT/A2)的结合。例如在10ml培养物中表达来自例如20-40个ELISA阳性克隆的scFv，收获周质，并通过BIAcore测定scFv koff。对具有最慢koff的克隆测序，并将每个独特的scFv亚克隆进适宜的载体(例如，pUC119 mycHis)。如本文所述，在培养物中表达scFv，并纯化。通过BIAcore测定纯化的scFv的亲和力。
3)BoNT-中和(scFv′)2同源二聚体的生成
为了生成BoNT-中和(scFv′)2抗体，通过接头(例如，碳接头、肽等)或通过例如2个半胱氨酸之间的二硫键，连接2个BoNT-中和scFv。因而，例如，为了生成二硫键连接的BoNT/A-中和scFv，可以通过定点诱变将半胱氨酸残基导入在BoNT/A-中和scFv的羧基-末端处的myc标记和六组氨酸标记之间。通过DNA测序，证实正确序列的导入。在优选实施方案中，构建体是在pUC119中，以便pelB前导序列指导表达的scFv到周质中，且存在导入BoNT/A-中和突变型scFv的克隆位点(Ncol和Notl)。表达的scFv具有在C-末端的myc标记，随后是2个甘氨酸、1个半胱氨酸，然后是促进通过IMAC纯化的6个组氨酸。2个半胱氨酸残基之间形成二硫键后，2个scFv彼此被26个氨基酸(2个11氨基酸myc标记和4个甘氨酸)分开。从该构建体表达、通过IMAC纯化的scFv可以主要包含单体scFv。为了生产(scFv′)2二聚体，通过与1MM β-巯基乙醇一起温育，还原半胱氨酸，且通过加入DTNB，封闭一半scFv。将封闭的和未封闭的scFv一起温育，以形成(scFv′)2，且得到的材料可以任选地通过凝胶过滤进行分析。如本文所述，可以任选地通过BIAcore测定BoNT-中和scFv′单体和(scFv′)2二聚体的亲和力。
在特别优选的实施方案中，通过接头、更优选地通过肽接头连接scFv片段，生成(scFv′)2二聚体。这可以通过本领域技术人员众所周知的许多种方式来实现。例如，一个优选方法记载在Holliger等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(也参见WO 94/13804)。
通常，通过PCR克隆导入接头。例如，编码5氨基酸接头(G4S，SEQ ID NO：136)的合成寡核苷酸可以用于PCR扩增BoNT/A-中和抗体VH和VL基因，然后将它们剪接到一起，以生成BoNT/A-中和双抗体基因。然后，根据本领域技术人员众所周知的标准方法，将该基因克隆进适宜的载体，表达，并纯化。
4)BoNT-中和(scFv)2、Fab和(Fab′)2分子的制备
BoNT-中和抗体例如BoNT/A1-A2-中和scFv或具有更高亲和力的变体，是适用于生成大小和效价变体的模板。例如，可以从本文所述的亲本scFv(例如CR1、RAZ1、ING1、ING2等)生成BoNT/A1-A2-中和(scFv′)2。使用适宜的限制酶，可以切割scFv基因，并将其克隆进本文所述的另一种载体。
在一个实施方案中，表达的scFv具有在C-末端的myc标记，随后是2个甘氨酸、1个半胱氨酸，然后是促进纯化的6个组氨酸。2个半胱氨酸残基之间形成二硫键后，2个scFv彼此被26个氨基酸(例如，2个11氨基酸myc标记和4个甘氨酸)分开。从该构建体表达scFv，并纯化。
为了生产(scFv′)2二聚体，通过与1mM β-巯基乙醇一起温育，还原半胱氨酸，通过加入DTNB，封闭一半scFv。将封闭的和未封闭的scFv一起温育，以形成(scFv′)2，将其纯化。在分离了更高亲和力scFv时，将它们的基因类似地用于构建(scFv′)2。
使用与Better等(1988)Science，240：1041-1043所述类似的表达载体，在大肠杆菌中表达BoNT/A-中和Fab。为了生成BoNT/A-中和Fab，使用PCR从scFv扩增VH和VL基因。将VH基因克隆进表达载体(例如，基于PUC119的细菌表达载体)，该载体提供了位于VH基因下游且与其符合读框的IgG CH1结构域。所述载体也含有lac启动子、指导表达的VH-CH1结构域进入周质的pelb前导序列、指导表达的轻链进入周质的基因3前导序列、和轻链基因的克隆位点。例如通过PCR指纹分析，鉴别含有正确VH基因的克隆。使用PCR，将VL基因剪接到CL基因中，并克隆进含有VH CH1基因的载体中。
B)中和抗体的选择
在优选实施方案中，BoNT-中和抗体(通过噬菌体展示、酵母展示、免疫接种方法、杂交瘤技术等生产)的选择包含，筛选得到的抗体与适宜抗原的特异性结合。在本发明的情况下，合适的抗原包括，但不限于BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3 HC、BoNT重链的C-末端结构域(结合结构域)、BoNT/A3全毒素或重组BoNT结构域例如HC(结合结构域)、HN(易位结构域)或LC(轻链)。在特别优选的实施方案中，选择中和抗体与由一种或多种本文所述抗体识别的表位的特异性结合。
选择可以经由本领域技术人员众所周知许多方法中的任一种。在优选实施方案中，选择是通过针对所需靶例如BoNT/A或BoNT/A HC的免疫层析(例如，使用免疫管(immunotube)、Maxisorp、Nunc)。在另一个实施方案中，选择是针对在表面等离振子共振系统(例如，BIAcore、Pharmacia)中的BoNT HC，其或者是单独的，或者是与结合被一种或多种本文所述抗体特异性地结合的表位的抗体相组合。选择也可以使用酵母展示文库的流式细胞术来实现。在一个优选实施方案中，顺序选择酵母展示文库，首先在BoNT/A1上，然后在BoNT/A2上，以得到高亲和力地结合BoNT/A的两种亚型的抗体。对于其它亚型，也可以重复该操作。
关于噬菌体展示，通过在抗体片段基因和基因III之间包含琥珀密码子，可以简化结合的分析。这使得可能简单地通过改变宿主细菌品系，容易地在展示的和可溶的抗体片段之间转换。当噬菌体在大肠杆菌的supE抑制性品系中生长时，抗体基因和基因III之间的琥珀终止密码子被读作谷氨酰胺，并在噬菌体表面上展示抗体片段。当洗脱的噬菌体用于感染非抑制性品系时，琥珀密码子被读作终止密码子，且细菌将可溶抗体分泌进周质和培养基中(Hoogenboom等(1991)Nucleic Acids Res.，19：4133-4137)。可以检测可溶scFv与抗原的结合，例如通过使用识别scFv上的C-末端myc肽标记的鼠IgG单克隆抗体(例如，9ElO)的ELISA(Evan等(1985)Mol.Cell Biol.，5：3610-3616；Munro等(1986)Cell，46：291-300)，例如随后与缀合到检测标记(例如，辣根过氧化物酶)上的多克隆抗-小鼠Fc一起温育。
如上文所指出的，通过将scFv基因克隆进表达载体(例如，表达载体pUC119mycHIS)，其导致在scFv的C-末端添加myc肽标记和随后的六组氨酸标记，可以促进BoNT-中和抗体的纯化。所述载体也优选地编码果胶酸裂合酶前导序列，其指导scFv表达进细菌周质，在那里切割前导序列。这使得从细菌周质直接收获天然的正确折叠的scFv成为可能。然后表达BoNT-中和抗体，并使用固定化的金属亲和层析，从细菌上清液进行纯化。
C)测量BoNT-中和抗体对一种或多种BoNT亚型的亲和力
如上面所解释的，对增加的抗体亲抗原性的选择包含，测量BoNT-中和抗体(或修饰的BoNT-中和抗体)对一种或多种目标靶(例如BoNT/A亚型或其结构域，例如Hc或其它表位)的亲和力。在本文提供的实施例中，详细描述了进行这样的测量的方法。简而言之，例如，在BIAcore(一种基于表面等离振子共振的生物传感器)中，测定BoNT/A-中和抗体的Kd和与BoNT/A结合的动力学。关于该技术，将抗原偶联到能检测质量变化的衍生传感器芯片上。当抗体经过传感器芯片时，抗体结合抗原，从而导致可定量的质量的增加。随着抗体浓度而变化的结合速率的测量，可以用于计算结合速率常数(kon)。结合阶段后，使缓冲液经过芯片，并测定抗体的解离速率(koff)。通常，测量的Kon的范围是1.0x102-5.0x106，而koff的范围是1.0x10-1-1.0x10-6。然后，计算平衡常数Kd为koff/kon，并因而通常测量范围是10-5-10-12。以该方式测量的亲和力与通过荧光猝灭滴定在溶液中测量的亲和力很好地关联。
噬菌体展示和选择通常导致更高亲和力的突变型scFv的选择(Marks等(1992)Bio/Technology，10：779-783；Hawkins等(1992)J.Mol.Biol.226：889-896；Riechmann等(1993)Biochemistry，32：8848-8855；Clackson等(1991)Nature，352：624-628)，但是可能不导致亲和力差异低于6倍的突变体的分离(Riechmann等(1993)Biochemistry，32：8848-8855)。因而，需要快速方法来估计选择后分离的突变型scFv的相对亲和力。因为增加的亲和力主要源自koff的降低，所以测量koff应鉴别出更高亲和力的scFv。在BIAcore中，可以测量细菌周质中未纯化的scFv的koff，因为表达水平高得足以产生足够的结合信号，且koff独立于浓度。周质的和纯化的scFv的koff值，通常非常一致。
V.人或人源化的(嵌合的)抗体生产
如上文所指出的，本发明的BoNT-中和抗体可以施用给生物(例如，人患者)，以用于治疗目的(例如，治疗肉毒中毒)。施用给生物的抗体可能是免疫原性的，所述生物为除了所述抗体在其中产生的以外的。因而，例如，重复施用给人的鼠抗体经常诱导抗所述抗体的免疫应答(例如，人抗-小鼠抗体(HAMA)应答)。尽管对于使用本发明的非人抗体，这通常不是问题，因为它们通常不会重复使用，但通过将所述抗体的部分或全部改变成特有的人序列，从而分别产生嵌合抗体或人抗体，可以降低所述抗体的免疫原性质。
A)嵌合抗体
嵌合抗体是包含人和非人部分的免疫球蛋白分子。更具体地，嵌合抗体的抗原结合区(或可变区)源自非人来源(例如，鼠)，且嵌合抗体的恒定区(它赋予免疫球蛋白生物效应子功能)源自人来源。嵌合抗体应当具有非人抗体分子的抗原结合特异性和人抗体分子赋予的效应子功能。大量生成嵌合抗体的方法是本领域技术人员众所周知的(参见，例如，美国专利号：5,502,167、5,500,362、5,491,088、5,482,856、5,472,693、5,354,847、5,292,867、5,231,026、5,204,244、5,202,238、5,169,939、5,081,235、5,075,431和4,975,369)。
通常，用于生产嵌合抗体的方法由下述步骤组成(一些步骤的次序可以互换)：(a)鉴别和克隆编码所述抗体分子的抗原结合部分的正确基因区段；该基因区段(对于重链，称作VDJ，即可变、多变和连接区，或对于轻链，称作VJ，即可变、连接区)(或简称为V或可变区)可以是cDNA或基因组形式；(b)克隆编码恒定区或其所需部分的基因区段；(c)将可变区与恒定区相连接，从而使得完整嵌合抗体以可转录的和可翻译的形式编码；(d)将该构建体连接进载体，所述载体含有选择标记和基因控制区例如启动子、增强子和聚腺苷酸添加信号；(e)在宿主细胞(例如，细菌)中扩增该构建体；(f)将该DNA导入真核细胞(转染)，最经常是哺乳动物淋巴细胞；和在适合表达嵌合抗体的条件下，培养宿主细胞。
通过这些方法，已经操作了几种不同抗原结合特异性的抗体，以制备嵌合蛋白(例如，抗-TNP：Boulianne等(1984)Nature，312：643；和抗-肿瘤抗原：Sahagan等(1986)J.Immunol.，137：1066)。同样地，通过将新序列连接到编码抗原结合区的那些序列上，已经实现了几种不同效应子功能。其中的一些包括酶(Neuberger等(1984)Nature 312：604)，来自另一物种的免疫球蛋白恒定区和另一免疫球蛋白链的恒定区(Sharon等(1984)Nature 309：364；Tan等，(1985)J.Immunol.135：3565-3567)。
在一个优选实施方案中，重组DNA载体用于转染生产BoNT/A-中和抗体的细胞系。新的重组DNA载体含有用于替代在细胞系中编码免疫球蛋白恒定区的基因的全部或部分的“替代基因”(例如，替代基因可以编码人免疫球蛋白恒定区，特定免疫球蛋白类别，或酶，毒素，生物学活性肽，生长因子，抑制剂，或促进与药物、毒素或其它分子的缀合的接头肽的全部或部分，等)，和允许与抗体生产细胞内的免疫球蛋白序列进行靶定的同源重组的“靶序列”。
在另一个实施方案中，重组DNA载体用于转染生产具有所需效应子功能的抗体(例如，人免疫球蛋白恒定区)的细胞系，在该情况下，在重组载体中包含的替代基因可以编码BoNT/A-中和抗体的全部或部分区域，且在重组载体中包含的靶序列允许抗体生产细胞内的同源重组和靶定的基因修饰。在任一个实施方案中，当仅仅替代可变区或恒定区的部分时，得到的嵌合抗体可以确定相同抗原和/或使相同效应子功能被修改或提高，从而嵌合抗体可以表现出更大的抗原特异性、更高亲和力的结合恒定区、增强的效应子功能或转染的抗体生产细胞系的增强的分泌和生产等。
不论实现的实施方案，整合的DNA的选择方法(通过选择标记)、嵌合抗体生产的筛选和细胞克隆，可以用于得到生产嵌合抗体的细胞克隆。
因而，可以将编码单克隆抗体修饰的DNA片段直接靶向B-细胞或杂交瘤细胞系内表达的免疫球蛋白基因的位点。任意特定修饰的DNA构建体，可以用于改变任意单克隆细胞系或杂交瘤的蛋白产物。这样的方法避免了高成本且费时的从表达有用抗原特异性的每个B-细胞克隆克隆重链和轻链可变区基因的任务。除了避免克隆可变区基因的方法以外，当基因是在它的天然染色体位置而不是随机位置时，嵌合抗体的表达水平应更高。制备嵌合的(人源化的)抗体的详细方法，可参见美国专利5,482,856。
B)人和人源化抗体
在另一个实施方案中，本发明提供了人源化的或全人的抗-BoNT-中和抗体(例如HuC25、RAZ1、CR1、ING1、ING2等)。人抗体完全由特性人多肽序列组成。使用许多方法(综述参见，例如，Larrick等，美国专利号5,001,065)，可以生产本发明的人BoNT-中和抗体。
在某些优选实施方案中，通过修饰和筛选全人单链(例如scFv)文库，获得本发明的全人scFv抗体。因而，在某些实施方案中，使用本文所述的噬菌体和/或酵母展示方法，生产全人抗体。生产全人基因文库的方法，是本领域技术人员众所周知的(参见，例如，Vaughn等(1996)Nature Biotechnology，14(3)：309-314，Marks等(1991)J.Mol.Biol.，222：581-597，和PCT/US96/10287)。
在另一个实施方案中，在三体瘤(trioma)细胞中生产本发明的人BoNT-中和抗体。然后，将编码抗体的基因克隆进其它细胞、尤其是非人哺乳动物细胞，并表达。
通过三体瘤技术生产人抗体的一般方法，已经记载在Ostberg等(1983)Hybridoma 2：361-367，Ostberg，美国专利号4,634,664和Engelman等，美国专利号4,634,666。通过该方法得到的抗体生产性细胞系称作三体瘤，因为它们源自3种细胞：2种人细胞和1种小鼠细胞。已经发现三体瘤比从人细胞制备的普通杂交瘤更稳定地生产抗体。
三体瘤细胞的制备，需要初始融合小鼠骨髓瘤细胞系和未免疫的人外周B淋巴细胞。该融合产生含有人和小鼠染色体的异种杂交细胞(参见，Engelman，同上)。选择已经丧失分泌抗体的能力的异种细胞。优选地，选择抗8-氮鸟嘌呤的异种细胞。这样的细胞不能在次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)或重氮丝氨酸-次黄嘌呤(AH)培养基上繁殖。
通过异种细胞和针对BoNT多肽(例如，BoNT/A、BoNT/A Hc、BoNT/A子序列，包括但不限于包含被本文所述抗体特异性地结合的表位的子序列等)免疫的B-淋巴细胞之间的进一步融合，赋予分泌抗体的能力。从人供体的脾、血或淋巴结，得到B-淋巴细胞。如果需要抗特定抗原或表位的抗体，则优选地使用该抗原或其表位(而不是整个多肽)作为免疫原。或者，从未免疫的个体得到B-淋巴细胞，并用BoNT多肽或其表位体外地刺激。在另一个变体中，从受感染的或以另外方式免疫的个体得到B-淋巴细胞，然后通过体外地暴露于BoNT多肽约7-14天，进行超免疫化。
通过众所周知的方法，将通过上述方法之一制备的免疫的B-淋巴细胞与异种杂交细胞相融合。例如，在约37℃，用40-50％的MW1000-4000的聚乙二醇处理所述细胞约5-10分钟。从融合混合物分离细胞，并在对所需杂交体选择性的培养基中繁殖。当异种杂交细胞对8-氮鸟嘌呤有抗性时，通过在HAT或AH培养基上连续传代细胞，可以方便地选择无限增殖化的三体瘤细胞。其它选择方法当然也是可能的，这取决于在融合中使用的细胞的性质。通过测定三体瘤培养基结合BoNT多肽或其表位的能力，鉴别出分泌具有要求的结合特异性的抗体的克隆。通过有限稀释技术，亚克隆生产具有所需的特异性的人抗体的三体瘤，并在培养基中体外培养，或注射进选择的宿主动物，并体内生长。
然后，测试得到的三体瘤细胞系结合BoNT多肽或其表位的能力。通过常规的抗体分级分离方法，例如硫酸铵沉淀、DEAE纤维素层析和亲和层析，可以从得到的培养基或体液分离抗体。
尽管三体瘤是遗传上稳定的，但它们不以非常高的水平生产抗体。通过将来自三体瘤的抗体基因克隆进一种或多种表达载体，和将所述载体转化进细胞系，例如通常用于表达重组的或人源化的免疫球蛋白的细胞系，可以提高表达水平。与增加抗体得率一样，该策略提供额外的优点，即从不具有人组分的细胞系获得免疫球蛋白，且因此不需要进行人细胞系所需的特别广泛的病毒筛选。
根据本领域已知的方法，包括但不限于聚合酶链反应(PCR)，克隆编码由三体瘤细胞系分泌的免疫球蛋白的重链和轻链的基因(参见，例如，Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；Berger & Kimmel，Methods inEnzymology，Vol.152：Guide to Molecular Cloning Techniques，Academic Press，Inc.，San Diego，Calif.，1987；Co等(1992)J.Immunol.，148：1149)。例如，从通过逆转录三体瘤RNA生产的三体瘤基因组DNA或cDNA，克隆编码重链和轻链的基因。克隆通过常规技术来实现，包括使用PCR引物，该引物与和待克隆的基因或该基因的区段侧接或重叠的序列杂交。
通常，重组构建体包含编码由三体瘤细胞系表达的免疫球蛋白的完整人免疫球蛋白重链和/或完整人免疫球蛋白轻链的DNA区段。或者，生产仅编码第一抗体基因的部分的DNA区段，所述部分具有结合和/或效应子活性。其它重组构建体含有与其它免疫球蛋白基因区段、尤其是其它人恒定区序列区段(重链和/或轻链)融合的三体瘤细胞系免疫球蛋白基因区段。可以从各种参照来源选择人恒定区序列，包括但不限于在Kabat等(1987)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，U.S.Department of Health and Human Services中列出的那些。
除了编码BoNT/A-中和免疫球蛋白或其片段的DNA区段外，使用本领域技术人员已知的各种重组DNA技术，例如定点诱变(参见Gillman & Smith(1979)Gene，8：81-97；Roberts等(1987)Nature328：731-734)，可以容易地设计和生产其它基本上同源的修饰的免疫球蛋白。这样的修饰的区段通常将保留抗原结合能力和/或效应子功能。此外，迄今为止修饰的区段通常不从原始三体瘤基因组序列改变以阻止在严格条件下与这些序列的杂交。因为，象许多基因一样，免疫球蛋白基因含有分开的功能区，每个功能区具有一种或多种不同的生物活性，所述基因可以与来自其它基因的功能区相融合，以产生具有新性质或新性质组合的融合蛋白(例如，免疫毒素)。
根据本文所述的标准方法，可以克隆和表达基因组序列。
抗体生产的其它方法包括体外免疫接种人血。在该方法中，生产能生产人抗体的人血淋巴细胞。从患者收集人外周血，并处理，以回收单核细胞。然后去除抑制性T-细胞，并将剩余细胞悬浮于组织培养基中，向其中加入抗原和自体血清，以及优选的非特异性淋巴细胞激活剂。然后将细胞温育一段时间，从而使它们生产所需的特异性抗体。然后将细胞与人骨髓瘤细胞融合，以使细胞系无限增殖化，从而允许连续生产抗体(参见美国专利4,716,111)。
在另一种方法中，制备生产人BoNT-中和抗体的小鼠-人杂交瘤(参见，例如，美国专利5,506,132)。其它方法包括转化成表达人免疫球蛋白基因的鼠的免疫接种，和噬菌体展示筛选(Vaughan等同上)。
VI.测定中和表位的交叉反应性
在优选实施方案中，本发明的抗体特异性地结合一种或多种被本文所述的抗体(例如S25、C25、C39、1C6、1F3、CR1、3D12、RAZ1、ING1、ING2等)识别的表位。换而言之，特别优选的抗体与这些抗体中的一种或多种交叉反应。测定交叉反应性的方法，是本领域技术人员众所周知的(参见，例如，Dowbenko等(1988)J.Virol.62：4703-4711)。
这可以通过提供一种或多种附着在固体支持物上的分离的靶BoNT多肽(例如BoNT/A1和/或BoNT/A2，或所述毒素的重组结构域，例如Hc)，和测定测试抗体与例如S25、C25、C39、1C6、1F3、CR1、3D12、RAZ1、ING1和/或ING2等竞争结合靶BoNT肽的能力来确定。因而，竞争结合格式的免疫测定优选地用于交叉反应性测定。例如，在一个实施方案中，将BoNT/A1和/或A2HC多肽固定化到固体支持物上。加入测定中的待测抗体(例如通过从噬菌体-展示文库选择来产生)与S25、C25、C39、1C6、1F3、CR1、3D12、RAZ1、ING1、ING2等抗体竞争与固定化的BoNT多肽的结合。对比测试抗体与S25、C25、C39、1C6、1F3、CR1、3D12、RAZ1、ING1和/或ING2等抗体竞争与固定化的蛋白结合的能力。然后使用标准计算，计算上述蛋白的％交叉反应性。
如果测试抗体与S25、C25、C39、1C6、1F3、CR1、3D12、RAZ1、ING1和/或ING2等抗体中的一种或多种竞争，并与相同靶具有相当于或大于约1x10-8M的结合亲和力，则预期该测试抗体是BoNT-中和抗体。
在特别优选的实施方案中，通过在BIAcore中使用表面等离振子共振，进行交叉反应性。在BlAcore流动室中，如实施例所述，将BoNT多肽(例如，BoNT/A1和/或BoNT/A2 Hc)偶联到传感器芯片(例如CM5)上。以5μl/分钟的流速，将100nM-1μM抗体滴定注射到流动室表面上约5分钟，以确定导致表面几乎饱和的抗体浓度。然后，使用产生几乎饱和和至少100RU结合的抗体的浓度的抗体对，评价表位作图或交叉反应性。对于对中的每个成员，测定结合的抗体的量，然后将2种抗体混合到一起，以产生等于用于测量单一抗体的浓度的终浓度。当一起注射时，识别不同表位的抗体表现出结合的RU的基本上加性的增加，而识别相同表位的抗体仅仅表现出RU的最小增加(参见实施例)。在特别优选的实施方案中，如果在一起“注射”时，抗体表现出基本上加性的增加(优选地以至少约1.4的因子增加，更优选地以至少约1.6的因子增加，且最优选地以至少约1.8或2的因子增加)，则称所述抗体是交叉反应性的。
通过许多其它标准技术(参见，例如，Geysen等(1987)J.Immunol.Meth.102，259-274)，可以确定在所需表位的交叉反应性。该技术包含，合成大量重叠BoNT肽。然后针对一种或多种原型抗体(例如，CR1、RAZ1、ING1、ING2等)筛选合成的肽，且通过结合特异性和亲和力，可以鉴别出被这些抗体特异性地结合的特征表位。这样鉴别出的表位可以方便地用于本文所述的竞争测定，以鉴别交叉反应性的抗体。
使用“多大头针”肽合成技术(参见，例如，Geysen等(1987)Science，235：1184-1190)，可以方便地制备用于表位作图的肽。使用一种或多种BoNT亚型的已知序列(参见，例如，Atassi等(1996)J.Prot.Chem.，7：691-700和其中引用的文献)，可以以顺序方式，在一个或多个96-孔微量培养板阵列的塑料大头针上，单个地合成重叠BoNT多肽序列。
使用该多大头针肽系统进行表位作图的方法，记载在美国专利5,739,306。简而言之，首先用含有溶于PBS中的2％牛血清清蛋白和0.1％吐温20的预涂布缓冲液在室温处理大头针1小时。然后，将大头针插入96-孔微量培养板的个别孔中，所述孔含有溶于预涂布缓冲液中的抗体，例如为2μg/ml。温育优选地是在室温约1小时。在PBST中洗涤大头针(例如，每10分钟冲洗3次)，然后在96-孔微量培养板的孔中在室温温育1小时，所述孔含有100μl 1∶4,000稀释的HRP-缀合的山羊抗-小鼠IgG(Fc)(Jackson ImmunoResearch Laboratories)。如前所述洗涤大头针后，将大头针置于孔中在室温30分钟进行颜色反应，所述孔含有过氧化物酶底物2，2′-连氮基-双[3-乙基苯并噻唑啉-b-磺酸](ABTS)二铵溶液和H2O2(Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.，Gaithersburg，Md.)。通过平板读数器(例如，BioTek ELISA平板读数器)，针对492nm背景吸收波长在405nm读平板。表现出显色的孔指示着这些孔中的BoNT/A HC肽与S25、C25、C39、1C6或1F3抗体的反应性。
VII.测定抗-BoNT抗体的中和活性
优选的本发明抗体单独地或组合地，起中和(减少或消除)肉毒杆菌神经毒素A型的毒性的作用。可以体内或体外地评价中和。体内中和测量简单地包含，测量由于存在一种或多种待测中和活性的抗体，BoNT神经毒素施用引起的致死率(例如，LD50或其它标准度量)的变化。神经毒素可以直接施用给测试生物(例如小鼠)，或生物可以携带肉毒中毒感染(例如，被肉毒梭菌感染)。可以在注射BoNT神经毒素或感染实验动物之前、过程中或之后，施用抗体。进展速率或死亡率的降低，指示着抗体具有中和活性。
中和活性的一种合适的体外测定使用半膈制剂(Deshpande等(1995)Toxicon，33：551-557)。简而言之，将左和右膈神经半膈制剂悬浮于生理溶液中，并维持在恒温(例如36℃)。超大地刺激膈神经(例如在0.05Hz，以0.2ms持续时间的方波)。使用连接到图表记录器上的力位移转换器(例如，GrassModel FT03)，测量等长颤搐张力。
将纯化的抗体与纯化的BoNT (例如BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/B等)在室温温育30分钟，然后加入组织浴中，从而产生约2.0x10-8M的最终抗体浓度和约2.0x10-11M的最终BoNT浓度。对于每种研究的抗体，测定达到50％颤搐张力减少的时间(例如，且对于单独的BoNT，测量3次；且对于抗体+BoNT，测量3次)。通过标准的统计学分析(例如双尾(two-tailed)t检验)，在标准的显著性水平(例如，认为＜0.05的P值是显著的)，测定达到特定(任意)百分比(例如50％)颤搐减少的时间之间的差异。
VIII.诊断测定
如上面所解释的，本发明抗-BoNT抗体可以用于BoNT毒素(例如BoNT/A1毒素)的体内或体外检测，并因而可以用于肉毒中毒的诊断(例如确认诊断)。从生物获取的生物学样品中BoNT的检测和/或定量，是该生物感染肉毒梭菌的指示。
可以定量源自患者的生物学样品，例如源自患者的细胞或组织样品中的BoNT抗原。本文使用的生物学样品是含有可以与肉毒梭菌感染相关联和指示该感染的BoNT浓度的生物学组织或流体样品。优选生物学样品包括血液、尿、唾液和组织活组织检查。
尽管样品通常采自人患者，但所述测定可以用于检测来自一般哺乳动物的细胞中的BoNT抗原，所述哺乳动物例如狗、猫、羊、牛和猪，且最特别是灵长类动物，例如人、黑猩猩、大猩猩、猕猴和狒狒，和啮齿类动物例如小鼠、大鼠和豚鼠。
根据本领域技术人员众所周知的标准方法，最一般地通过活组织检查或静脉穿刺术，从患者分离组织或流体样品。通过在适宜的缓冲溶液中稀释，或根据需要进行浓缩，任选地在必要时预处理样品。可以使用在生理pH的众多标准含水缓冲溶液中的任一种，其中使用许多缓冲剂之一，例如磷酸盐、Tris等。
A)免疫结合测定
使用一种或多种本发明的抗-BoNA抗体作为特异性地结合BoNT多肽的捕获剂，可以在免疫测定中检测BoNT多肽(例如，BoNT/A1、BoNT/A2等)。
本文使用的免疫测定是使用抗体(例如BoNT/A-中和抗体)来特异性地结合分析物(例如，BoNT/A)的测定。所述免疫测定的特征在于，一种或多种抗-BoNT抗体与靶(例如一种或多种BoNT/A亚型)的结合，这与其它用以分离、靶向和定量所述BoNT分析物的物理或化学性质成对比。
使用许多非常公认的免疫结合测定中的任一种(参见，例如，美国专利4,366,241；4,376,110；4,517,288；和4,837,168等)，可以检测和定量BoNT标记。关于一般免疫测定的综述，也参见Methods in CellBiology Volume 37：Antibodies in Cell Biology，Asai，编AcademicPress，Inc.New York(1993)；Basic and Clinical Immunology第7版，Stites & Terr，编(1991))。
本发明的免疫测定可以以许多构造形式的任一种来进行(参见，例如，Maggio(编)(1980)Enzyme Immunoassay CRC Press，Boca Raton，Florida；Tijan(1985)“Practice and Theory of Enzyme Immunoassays，”Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，ElsevierScience Publishers B.V.，Amsterdam；Harlow和Lane，同上；Chan(编)(1987)Immunoassay：A Practical Guide Academic Press，Orlando，FL；Price和Newman(编)(1991)Principles and Practice of ImmunoassaysStockton Press，NY；和Ngo(编)(1988)Non isotopic ImmunoassaysPlenum Press，NY综述的那些)。
免疫测定经常使用标记试剂来特异性地结合和标记由捕获剂和分析物形成的结合复合物(例如，BoNT/A-中和抗体/BoNT/A复合物)。标记试剂本身可以是构成抗体/分析物复合物的部分之一。因而，例如，标记试剂可以是标记的BoNT/A多肽或标记的抗-BoNT/A抗体。或者，标记试剂任选地是第三部分，例如另一种抗体，其特异性地结合BoNT抗体、BoNT肽、抗体/多肽复合物、或共价地连接到BoNT多肽或抗-BoNT抗体的修饰的捕获基团(例如，生物素)。
在一个实施方案中，标记试剂是特异性地结合抗-BoNT抗体的抗体。这样的试剂是本领域技术人员众所周知的，且最一般地包含标记的抗体，其特异性地结合抗-BoNT抗体所来源的特定动物物种的抗体(例如，抗-物种抗体)。因而，例如，当捕获剂是人来源的BoNT/A-中和抗体时，标记试剂可以是小鼠抗-人IgG，即对人抗体恒定区特异性的抗体。
能特异性地结合免疫球蛋白恒定区的其它蛋白，例如链球菌A蛋白或G蛋白，也可以用作标记试剂。这些蛋白是链球菌细菌细胞壁的正常组分。它们表现出强烈的与来自许多物种的免疫球蛋白恒定区的非免疫原性反应性(通常参见Kronval，等，(1973)J.Immunol.，111：1401-1406，和Akerstrom，等，(1985)J.Immunol.，135：2589-2542，等)。
在整个测定中，在每次组合试剂后，可能需要温育和/或洗涤步骤。温育步骤可以为约5秒至几小时，优选为约5分钟至约24小时。但是，温育时间将依赖于测定形式、分析物、溶液体积、浓度等。通常，在环境温度进行测定，尽管它们可以在一定温度范围内进行，例如5℃至45℃。
1)非竞争性测定形式
在某些实施方案中，用于检测BoNT神经毒素(例如BoNT血清型和/或亚型)的免疫测定是竞争性的或非竞争性的。非竞争性免疫测定是直接测量捕获的分析物(在该情况下，BoNT多肽)的量的测定。例如，在一个优选的“夹心”测定中，将捕获剂(例如，抗-BoNT抗体)直接或间接地结合到固体基质上，将它固定化在那里。这些固定化的抗-BoNT抗体捕获存在于试验样品(例如，血液样品)中的BoNT多肽。这样固定化的BoNT多肽然后被标记试剂结合，所述标记试剂例如携带标记的BoNT/A-中和抗体。或者，第二抗体可以缺少标记，但是它又可以被标记的第三抗体结合，所述第三抗体对第二抗体所来源的物种的抗体是特异性的。洗掉游离的标记的抗体，并检测剩余的结合的标记的抗体(例如，使用γ检测器，其中标记是放射性的)。
2)竞争性测定形式
在竞争性测定中，通过测量由存在于样品中的分析物从捕获剂(例如，BoNT/A-中和抗体)置换(或竞争出)的添加的(外源性的)分析物的量，间接测量存在于样品中的分析物(例如，BoNT/A)的量。例如，在一个竞争性测定中，将已知量的BoNT/A加入含有未确定量的BoNT/A的试验样品中，并使样品接触特异性地结合BoNT/A的捕获剂，例如，BoNT/A-中和抗体。加入的结合BoNT/A-中和抗体的BoNT/A的量，与存在于试验样品中的BoNT/A的浓度成反比。
可以将BoNT/A-中和抗体固定化在固体基质上。通过测量存在于BoNT/A-BoNT/A-中和抗体复合物中的BoNT/A的量，或通过测量剩余的未复合的BoNT/A的量，测定结合到BoNT/A-中和抗体上的BoNT/A的量。
B)非特异性结合的减少
技术人员将明白，经常需要减少免疫测定中和分析物纯化过程中的非特异性结合。当测定包含例如BoNT/A多肽、BoNT/A-中和抗体、或固定化在固体基质上的其它捕获剂时，需要使与基质的非特异性结合的量最小化。减少这样的非特异性结合的方式，是本领域技术人员众所周知的。通常，这包含，给基质包被蛋白组合物。具体地，广泛地使用诸如牛血清清蛋白(BSA)、脱脂奶粉和明胶的蛋白组合物。
C)基质
如上所述，依赖于测定，任选地将各种组分(包括BoNT多肽、抗-BoNT抗体等)结合到固体表面上。许多用于固定化生物分子到多种固体表面上的方法是本领域已知的。例如，固体表面可以是膜(例如，硝酸纤维素)、微量滴定盘(例如，PVC、聚丙烯或聚苯乙烯)、试管(玻璃或塑料)、测量尺(例如，玻璃、PVC、聚丙烯、聚苯乙烯、胶乳等)、微量离心管、或玻璃、二氧化硅、塑料、金属或聚合物珠。可以共价地结合或通过非特异性结合非共价地附着所需组分。
许多种有机的和无机的、天然的和合成的聚合物，可以用作固体表面的材料。示例性的聚合物包括聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚对苯二甲酸乙二酯、人造丝、尼龙、聚(丁酸乙烯酯)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、硅氧烷、聚甲醛、纤维素、乙酸纤维素、硝酸纤维素等。可以使用的其它材料包括纸、玻璃、陶瓷、金属、准金属、半导体材料、水泥等。另外，可以使用形成凝胶的物质，例如蛋白(例如，明胶)、脂多糖、硅酸盐、琼脂糖和聚丙烯酰胺。形成几个水相的聚合物例如葡聚糖、聚(亚烷基)二醇，或表面活性剂例如磷脂、长链(12-24碳原子)烷基铵盐等，也是合适的。当固体表面是多孔的时，依赖于系统的性质，可以使用各种孔径。
在制备表面中，可以使用许多不同的材料，例如作为叠层，以得到各种性质。例如，蛋白包衣例如明胶，可以用于避免非特异性结合、简化共价缀合、增强信号检测等。
如果需要化合物和表面之间的共价结合，则表面通常是多功能的，或能被多功能化。可以存在于表面上并用于连接的官能团可以包括羧酸、醛、氨基、氰基、烯基、羟基、巯基等。将许多种化合物连接到各种表面上的方式，是众所周知的，并在文献中详细地阐明。参见，例如，Immobillized Enzymes，Ichiro Chibata，Halsted Press，New York，1978，和Cuatrecasas，(1970)J.Biol.Chem.2453059。
除了共价结合外，可以使用各种非共价结合测定组分的方法。非共价结合通常是化合物向表面的非特异性吸收。通常，用第二种化合物封闭表面，以阻止标记的测定组分的非特异性结合。或者，将表面进行设计，从而使得它非特异性地结合一种组分，但是不显著结合另一种组分。例如，携带凝集素例如伴刀豆球蛋白A的表面，将结合含有碳水化合物的化合物，但是不结合缺少糖基化的标记的蛋白。在美国专利号4,447,576和4,254,082中，综述了用于非共价附着测定组分的各种固体表面。
D)其它测定形式
通过本领域技术人员众所周知的许多其它方式中的任一种，也可以检测和定量BoNT多肽或抗-BoNT抗体(例如BoNT/A中和抗体)。这些包括分析型生化方法例如分光光度法、射线照相术、电泳、毛细管电泳、高效液相层析(HPLC)、薄层层析(TLC)、超扩散(hyperdiffusion)层析等，和各种免疫学方法例如流体或凝胶沉淀素反应、免疫扩散(单或双)、免疫电泳、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光测定等。
蛋白印迹分析和相关方法也可以用于检测和定量BoNT多肽在样品中的存在。该技术通常包含，在分子量的基础上，通过凝胶电泳分离样品产物，将分离的产物转移至合适的固体支持物(例如硝酸纤维素滤器、尼龙滤器或衍生的尼龙滤器)，和将样品与特异性地结合BoNT多肽的抗体一起温育。所述抗体特异性地结合固体支持物上的目标生物试剂。这些抗体被直接标记，或随后使用标记的抗体(例如，标记的羊抗-人抗体，其中标记基因的抗体是人抗体)进行检测，所述标记的抗体特异性地与结合BoNT多肽的抗体结合。
其它测定形式包括脂质体免疫测定(LIA)，它们使用设计用于结合特定分子(例如，抗体)和释放被囊化的试剂或标记的脂质体。然后根据标准技术(参见，Monroe等，(1986)Amer.Clin.Prod.Rev.5：34-41)，检测释放的化学试剂。
E)抗-BoNT(例如，BoNT/A-中和)抗体的标记
通过本领域技术人员已知的许多方法之一，可以标记抗-BoNT抗体。因而，例如，标记试剂可以是，例如，单克隆抗体、多克隆抗体、蛋白或复合物，例如本文所述的那些，或聚合物例如亲和基质、碳水化合物或脂质。通过任意已知方法进行检测，包括免疫印迹、蛋白印迹分析、凝胶迁移率变动分析、放射性或生物发光标记的示踪、核磁共振、电子顺磁共振、停流光谱学、柱层析、毛细管电泳或基于大小和/或电荷变化的示踪分子的其它方法。在测定中使用的具体标记或可检测的基团，不是本发明的关键方面。可检测的基团可以是具有可检测的物理或化学性质的任意材料。这样的可检测的标记已经在免疫测定领域很好地开发，且通常，在这样的方法中有用的任意标记都可以用于本发明。因而，标记是通过光谱的、光化学的、生化的、免疫化学的、电的、光学的或化学的方式可检测的任意组合物。在本发明中有用的标记包括磁珠(例如DynabeadsTM)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、罗丹明等)、放射性标记(例如，3H、125I、35S、14C或32P)、酶(例如，LacZ、CAT、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和通常用作可检测酶的其它酶，无论作为标记基因产物还是在ELISA中)和比色标记例如胶态金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、胶乳等)珠。
根据本领域众所周知的方法，可以将标记直接或间接偶联到所需测定组分上。如上文所指出的，可以使用许多种标记，标记的选择取决于要求的灵敏度、缀合化合物的容易、稳定性要求、可利用的仪器和处理规定。
非放射性标记经常通过间接方式进行附着。通常，将配体分子(例如，生物素)共价结合到分子上。配体然后结合抗-配体(例如，链霉抗生物素蛋白)分子，后者是固有地可检测的或共价地结合到信号系统上，例如可检测的酶、荧光化合物或化学发光化合物。可以使用许多配体和抗-配体。当配体具有天然抗-配体时，例如，生物素、甲状腺素和氢化可的松，它可以与标记的、天然产生的抗-配体结合使用。或者，任意半抗原或抗原化合物可以与抗体结合使用。
所述分子也可以直接缀合到信号产生性化合物上，例如，通过与酶或荧光团缀合。作为标记的目标酶主要是水解酶，特别是磷酸酶、酯酶和糖苷酶，或氧化还原酶，特别是过氧化物酶。荧光化合物包括荧光素和它的衍生物，罗丹明和它的衍生物，丹磺酰，伞形酮，等。化学发光化合物包括萤光素和2，3-二氢酞嗪二酮，例如，鲁米诺。关于可以使用的各种标记或信号产生系统的综述，参见，美国专利号4,391,904，其在本文引作参考。
检测标记的方式是本领域技术人员众所周知的。因而，例如，当标记是放射性标记时，检测方式包括闪烁计数器或在放射自显影中的照相胶片。当标记是荧光标记时，它可以如下检测：用适宜波长的光来激发荧光染料，并检测得到的荧光，例如，通过显微镜术、目检、通过照相胶片、通过使用电子检测器例如电荷耦合设备(CCD)或光电倍增器等。类似地，通过提供酶的适宜底物，和检测得到的反应产物，可以检测酶促标记。最后，通过观察与标记有关的颜色，可以简单地检测简单的比色标记。因而，在各种测量尺测定中，缀合的金经常呈现粉红色，而各种缀合的珠呈现珠的颜色。
有些测定形式不需要使用标记的组分。例如，凝集测定可以用于检测BoNT肽的存在。在该情况下，用包含靶抗体的样品，凝集抗原-包被的颗粒。在该形式中，不需要标记任何组分，且通过简单的目检，检测靶抗体的存在。
IX.药物组合物
本发明的BoNT-中和抗体可以用于减轻肉毒中毒的进展，所述肉毒中毒由例如内源性疾病过程或化学/生物战试剂产生。通常，将包含一种、或优选2种或更多种不同抗体的组合物施用给需要它的哺乳动物(例如，人)。
我们已经发现，通过使用高亲和力地结合特定BoNT血清型的2种或更多种亚型的中和抗体，可以特别有效地中和肉毒中毒神经毒素(BoNT)亚型。尽管这可以通过使用针对每种亚型的2种或更多种不同抗体来实现，但这是低效率的、无效的且不实际的。给定BoNT的高毒性，希望BoNT治疗剂是非常有效的。因为通常必须使用多种抗体来以所需效力中和给定BoNT血清型(参见下面和图5、6、16和17)，所以如果必须使用每种亚型的不同抗体，则从生产观点看，所需抗体的数目将是难以接受的。增加混合物中抗体的数目，也降低效力。因而，如果在4种抗体的混合物中，2种中和A1，且2种中和A2毒素，则仅仅50％抗体将中和给定毒素。相反地，二者都中和A1和A2毒素的2种抗体的混合物，对任一种毒素都将具有100％活性，且将更容易生产。例如对于两种BoNT/A亚型(A1、A2)，可以用2-3种抗体实现有效的中和。如果BoNT/A1和BoNT/A2中和需要不同抗体，则需要4-6种抗体。对于额外的亚型，复杂性进一步增加。因而，在某些实施方案中，本发明提供了组合物，其包含高亲和力地结合2种或更多种BoNT亚型(例如，BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3等)的中和抗体。
还令人惊奇地发现，当人们开始组合中和抗体时，抗体组合的效力急剧增加。该增加使得生成用于治疗用途所需效力的肉毒杆菌抗体成为可能。还令人惊奇地，当人们开始组合2和3种单克隆抗体时，识别的特定BoNT表位变得不太重要。因而，例如，如实施例5所表明的，结合BoNT的易位结构域和/或催化结构域的抗体具有中和活性，当相互组合时，或当与识别BoNT受体结合结构域(HC)的mAb组合时，都可以有效地中和BoNT活性。因而，在某些实施方案中，本发明预期组合物，其包含至少2种、更优选至少3种结合BoNT上的非重叠表位的高亲和力抗体。
在某些实施方案中，本发明预期组合物，其包含2种或更多种、优选3种或更多种选自下述的不同抗体：3D12、RAZ1、CR1、ING1、ING2和/或包含一个或多个来自这些抗体的CDR的抗体，和/或一种或多种包含自这些抗体的突变体的抗体，例如ING1的1D11、2G11和5G4突变体。
本发明的BoNT-中和抗体可以用于肠胃外、体表、经口或局部施用，例如通过气溶胶或经皮地，以用于预防和/或治疗性处理。依赖于施用方式，可以在许多单位剂量形式中施用药物组合物。例如，适用于经口施用的单位剂量形式包括粉末、片剂、丸剂、胶囊和糖锭。当经口施用时，优选地保护本发明的包含抗体的药物组合物免受消化。这通常通过使抗体与组合物相混合，以使它们对酸和酶促水解有抗性，或通过将抗体包装在适当抗性的载体例如脂质体中来实现。保护蛋白免受消化的方法，是本领域众所周知的。
本发明的药物组合物特别适用于肠胃外施用，例如静脉内施用或施用进体腔或器官内腔中。用于施用的组合物通常将包含一种或多种BoNT-中和抗体溶于药学可接受的载体、优选含水载体中的溶液。可以使用许多种含水载体，例如，缓冲盐水等。这些溶液是无菌的，且通常不含有不需要的物质。通过常规的、众所周知的灭菌技术，可以将这些组合物灭菌。根据需要，所述组合物可以含有药学可接受的辅料，以接近生理条件，例如pH调节剂和缓冲剂，毒性调节剂等，例如，乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中BoNT/A-中和抗体的浓度可以广泛变化，且将主要根据选择的特定施用方式和患者的需要，基于流体体积、粘度、体重等进行选择。
因而，用于静脉内施用的一般药物组合物可以是每位患者每天约0.1-10mg。可以使用每位患者每天约1mg至最高达约200mg的剂量。制备可肠胃外施用的组合物的方法，是本领域技术人员已知的或显而易见的，且更详细地记载在诸如Remington’s Pharmaceutical Science，第15版，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania(1980)的出版物中。
含有本发明的BoNT-中和抗体或其混合物的组合物，通常用于治疗性处理。优选的药物组合物以足以中和(减轻或消除)BoNT毒素(即减少或消除BoNT中毒(肉毒中毒)的症状)的剂量施用。足以实现该目的的量，定义为“治疗有效剂量”。对于该用途有效的量，将取决于疾病的严重性和患者健康的总体状况。
依赖于患者需要和耐受的剂量和频率，可以施用组合物一次或多次。在任何情况下，组合物应当提供足够量的本发明的抗体，以有效地治疗患者。
X.诊断或治疗用试剂盒
在另一个实施方案中，本发明提供了试剂盒，其用于治疗肉毒中毒，或用于检测/确认肉毒梭菌感染。所述试剂盒通常包含一种或多种本发明的抗-BoNT抗体(例如，用于药物用途的BoNT-中和抗体)。对于诊断目的，可以任选地标记抗体。另外，所述试剂盒通常包括指导材料，其公开了使用BoNT-中和抗体治疗肉毒中毒症状的方法。所述试剂盒也可以包括其它组分，以促进试剂盒的设计的特定用途。因而，例如，当试剂盒含有一种或多种用于检测或诊断BoNT亚型的抗-BoNT抗体时，可以标记所述抗体，且所述试剂盒可以另外含有检测所述标记的工具(例如酶促标记的酶底物，用于检测荧光标记的滤器装置，适宜的第二标记例如羊抗-人抗体等)。所述试剂盒可以另外包括缓冲剂和常规地用于实践特定方法的其它试剂。这样的试剂盒和适宜的内容物是本领域技术人员众所周知的。
在某些实施方案中，提供用于治疗肉毒中毒的试剂盒包含一种或多种BoNT中和抗体。所述抗体可以分开地提供，或混合在一起提供。通常，所述抗体提供在无菌的药理学可接受的赋形剂中。在某些实施方案中，所述抗体可以预装载在递送装置(例如，一次性注射器)中提供。
所述试剂盒可以任选地包括指导材料，其教导抗体的用途、推荐的剂量、禁忌症等。
实施例
提供下面的实施例，其仅作为解释，而不是作为限制。技术人员将容易地认识到可以改变或修改许多非关键参数以产生基本上类似的结果。
实施例1
肉毒杆菌神经毒素中和抗体的制备
材料和方法
A)寡核苷酸设计
如以前关于人V-基因引物所述(Marks，等(1991)J.Mol.Biol.222：581-597；Marks，等，Eur.J.Immunol.21：985-991)，设计家族-特异性的鼠VH和VK引物，以扩增全长重排的V基因。简而言之，从Kabat(Kabat，等(1991)Sequences of proteins of immunological interest，U.S.Department of Health and Human Services，U.S.GovernmentPrinting Office，Bethesda，MD)和GenBank数据库收集鼠VH和VK DNA序列，比对，并根据家族分类，且设计家族特异性的引物，以退火到包含构架1的前23个核苷酸。类似地，设计JH和JK基因-区段特异性的引物，以退火到包含4个JH和5个JK基因区段中的每一个的最后24个核苷酸(Kabat，等同上)。
B)载体构建
为了构建载体pSYN3，使用PCR，利用引物LMB3(Marks，等(1991)Eur.J.Immunol.21：985-991)和E-tagback(5′-ACC ACC GAATTC TTA TTA ATG GTG ATG ATG GTG GAT GAC CAG CCG GTTCCA GCG G-3′(SEQ ID NO：137)，从pCANTAB 5E(Pharmacia Biotech，Milwaukee，WI.)扩增1.5kb填充片段。用SfiI和Notf消化该DNA片段，凝胶纯化，并连接进用SfiI和NotI消化的pCANTAB5E。连接的DNA用于转化大肠杆菌TG1(Gibson(1991)Studies on the Epstein-Barrvirus genome.University of Cambridge，Cambridge，U.K.)，并通过DNA测序，鉴别含有正确插入片段的克隆。得到的载体允许将噬菌体-展示的scFv亚克隆为SfiI-NotI或Mcol-NotI片段，以作为含有C-末端E表位标记、随后是六组氨酸标记的天然scFv分泌进大肠杆菌周质中。
C)免疫接种
为了构建文库1，在第0、2和4周，用纯BoNT/A Hc(OphidianPharmaceuticals，Madison，WI.)免疫BALB/c小鼠(16-22g)。给每只动物皮下给予1μg吸附到明矾(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL.)上的材料，体积为0.5ml。第二次免疫接种后，用100,000 50％致死剂量的纯BoNT/A攻击小鼠2周，并在1周后将其处死。
为了构建文库2，在第0、2和4周，用纯BoNT/A Hc免疫CD-1小鼠(16-22g)，并在第三次免疫接种后2周将其处死。对于2个文库，在处死后立即取出脾，并通过Cathala等(1993)DNA 2：329的方法，提取总RNA。
D)文库构建
如以前在Marks，等(1991)J.Mol.Biol.222：581-597中所述的，从约10μg总RNA合成第一链cDNA，例外是，用10pmol每种寡核苷酸MIgG1 For、MIgG3 For和MCK For(表3)，特异性地引发免疫球蛋白mRNA。为了构建文库1，使用可商业得到的VH和VK反向引物和JH和JK正向引物(重组噬菌体抗体系统；Pharmacia Biotech)，从第一链cDNA扩增重排的VH和VK基因。对于文库2，与JH或JK基因-区段-特异性的正向引物的等摩尔混合物联合使用家族特异性的VH和VK反向引物的等摩尔混合物，以尝试增加文库多样性(参见上面的“寡核苷酸设计”)。在50-μl反应混合物中，分开地扩增重排的VH和VK基因，所述反应混合物含有在生产商提供的缓冲液中的5μl第一链CDNA反应混合物、适宜反向引物的20pmol等摩尔混合物、适宜正向引物的20pmol等摩尔混合物、250μm(每种)脱氧核苷三磷酸、1.5mm MgCI2、10μg牛血清清蛋白/ml和1μl(5U)水生栖热菌(Thermas aquaticus)(Taq)DNA聚合酶(Promega)。给所述反应混合物覆盖石蜡油(Sigma)，并循环30次(95℃1分钟，60℃1分钟，和72℃1分钟)。凝胶纯化反应产物，使用DEAE膜从凝胶分离，用高盐缓冲液从膜洗脱，乙醇沉淀，并重新悬浮于20μL水中(Sambrook，等(1989)Molecular cloning；a laboratory manual，第2版Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.).
表3.小鼠免疫球蛋白基因的PCR使用的寡核苷酸引物
Figure GSB00000347175700541
Figure GSB00000347175700551
通过重叠延伸，使用剪接，从纯化的VH和VK基因谱和接头DNA装配ScFv基因谱。接头DNA编码肽序列(Gly4Ser3，(SEQ ID NO：2)Huston，等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)，且与重排的VH基因的3′末端和重排的V.基因的5′末端互补。将VH和VK DNA(各1.5μg)与500ng接头DNA(重组噬菌体抗体系统；PharmaciaBiotech)在25μl PCR混合物中相组合，所述PCR混合物含有在生产商提供的缓冲液中的250μm(每种)脱氧核苷三磷酸、1.5mM MgCl、10μg牛血清清蛋白/ml和1μl(5U)Taq DNA聚合酶(Promega)，并将混合物循环10次(94℃1分钟，62℃1分钟，和72℃1分钟)，以连接片段。加入侧接寡核苷酸引物(对于文库I，是提供在重组噬菌体抗体系统试剂盒中的RS；且对于文库2，是VHSfi和JKNot引物的等摩尔混合物[表3])，并将反应混合物循环33次(94℃1分钟，55℃1分钟，和72℃1分钟)，以添加限制位点。
如上所述凝胶纯化ScFv基因谱，用Sfif和Notl消化，并通过电洗脱纯化，并将1μg每种谱连接进用Sfil和Notl消化的1μgpCANTAB5E载体(Pharmacia Biotech)(文库1)或1μg pHEN-1(Hoogenboom，等(1991)Nucleic Acids Res.19：4133-4137)(文库2)。通过苯酚-氯仿提取，纯化连接混合物，乙醇沉淀，重新悬浮于20μl水中，并将2.5μl样品电穿孔入(Dower，等(1988)Nucleic Acids Res.16：6127-6145)50μl大肠杆菌TGI(Gibson(1984)，Studies on theEpstein-Barr virus genome.University of Cambridge，Cambridge，U.K.)。使细胞在1ml SOC(Sambrook，等同上)中生长30分钟，然后铺平板在含有100μg的AMP/ml和1％(wt/vol)GLU(TYE-AMP-GLU)的TYE(Miller(1972)Experiments in molecular genetics.，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)培养基上。将菌落从平板刮到5ml 2x TY培养液(Miller(1972)同上)中，后者含有100μg AMP/ml、1％GLU(2x TY-AMP-GLU)和15％(vol/vol)甘油，用于在-70℃保藏。如Marks等(1991)Eur.J.Immunol.，21：985-991所述，通过PCR筛选(Gussow，等(1989)，Nucleic Acids Res.17：4000)，测定文库的克隆效率和多样性。
E)噬菌体的制备
为了从文库拯救噬菌粒颗粒，将10ml 2x TY-AMP-GLU用来自文库原种的适宜体积的细菌(约50-100μl)接种，以产生0.3-0.5的A600，且在摇动下，在37℃培养细菌30分钟。加入约1012PFU的VCS-M13(Stratagene)颗粒，并将混合物在4℃温育过夜。用2％MPBS在37℃封闭管1小时，选择，洗涤，并使用浓度为5.0x1012TU/ml的噬菌体，如文献35所述准确地进行洗脱。1/3洗脱的噬菌体用于感染10ml对数期大肠杆菌TGI，将其如上所述铺平板到TYE-AMP-GLU平板上。
重复拯救-选择-铺平板循环3次，此后通过ELISA分析克隆的结合。还在可溶BoNT/A Hc上选择文库。对于文库1，将1.0mg BoNT/AHc(700μg/ml)生物素化(重组噬菌体选择模块；Pharmacia)，并按照生产商的推荐进行纯化。对于每轮选择将1ml噬菌体(约1013TU)与1ml PBS相混合，所述PBS含有4％脱脂奶粉、0.05％吐温20和10μg生物素化的BoNT/A Hc/ml。在室温1小时后，如Schier等(1996)J.Mol.Biol.，255：28-43所述，将抗原-结合的噬菌体捕获到封闭的链霉抗生物素蛋白-包被的M280磁珠(Dynabead；Dynal)上。将Dynabead洗涤共10次(3次在TPBS中，2次在TMPBS中，2次在PBS中，1次在MPBS中，和另外2次在PBS中)。通过与100μl 100mM三乙胺一起温育5分钟，从Dynabead洗脱结合的噬菌体，并用1M Tris-HCl、pH 7.5中和，且将1/3洗脱物用于感染对数期大肠杆菌TG1。
对于文库2，通过降低用于选择的可溶BoNT/A Hc的浓度(第1轮10μg/ml，第2轮1μg/ml，和第3轮10ng/ml)，进行亲和力-驱动的选择(Hawkins，等(1992)J.Mol.Biol.226：889-896；Schier，等(1996)同上))。通过C-末端六组氨酸标记，将可溶BoNT/A Hc捕获到200μlNi2+-NTA(Qiagen)上。捕获后，洗涤Ni2+-NTA树脂共10次(5次在TPBS中，且5次在PBS中)，如上所述洗脱结合的噬菌体，且将洗脱物用于感染对数期大肠杆菌TGI。
F)结合剂的初步表征
使用含有表达的scFv的细菌上清液，通过ELISA，初步分析与BoNT/A、BoNT/A Hc和BoNT/A HN的结合(Chen，等(1997)Infect.Immun.65：1626-1630)。如marks等(1991)J.Mol.Biol.，222：581-597所述，在96-孔微量滴定板中进行scFv的表达(De Bellis，等，(1990)Nucleic Acids Res.18：1311)。对于ELISA，用溶于PBS中的BoNT/A、BoNT/A Hc或BoNT/A HN(10μg/ml)，在4℃包被微量滴定板(Falcon3912)过夜，然后用2％MPBS在室温封闭1小时。将含有表达的scFv的细菌上清液加入孔中，并在室温温育1.5小时。洗涤平板6次(3次使用TPBS，且3次使用PBS)，并如Marks等(1991)J.Mol.Biol.，222：581-597和Schier等(1996)Gene 169：147-155所述，使用抗-myc标记抗体(9E10；Santa Cruz Biotechnology)或抗-E抗体(Pharmacia Biotech)和过氧化物酶-缀合的抗-小鼠Fc抗体(Sigma)，通过它们的C-末端肽标记，检测scFv的结合(对于文库1，在pCANTAB5E中的E表位标记；且对于文库2，在pHEN-1中的myc表位标记[Munro，等(1986)Cell 46：291-300])。通过BstN1指纹分析和DNA测序，测定独特的结合scFv的数目。
G)scFv的亚克隆、表达和纯化
为了促进纯化，将scFv基因亚克隆进表达载体pUC119mycHis(Schier等(1995)J.Mol.Biol.，263：551-567)或pSYN3，从而导致六组氨酸标记添加在scFv的C-末端。培养200毫升含有适宜噬菌粒之一的大肠杆菌TG1培养物，用IPTG诱导scFv的表达(De Bellis，等(1990)，Nucleic Acids Res.18：1311)，并使培养物在25℃生长过夜。从周质收获scFv(Breitling，等(1991)Gene 104：147-153)，针针IMAC加载缓冲液(50mM磷酸钠[pH 7.5]，500mM NaCl，20mM咪唑)中在4℃透析过夜，且然后通过0.2-μm-孔径滤器过滤。如上面的Schier等(1995)所述，通过IMAC纯化scFv(Hochuli，等(1988)Bio/Technology6：1321-1325)。
为了从二聚的和聚集的scFv制备单体scFv，在离心浓缩器(Centricon 10；Amicon)中将样品浓缩至＜1ml的体积，并使用HBS，在Superdex 75柱(Pharmacia)上分级分离。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定等分试样，评价最终制剂的纯度。通过考马斯蓝染色，检测蛋白条带。分光光度地测定浓度，其中假定1.0的A280对应着0.7mg/ml的scFv浓度。
H)亲和力和结合动力学的测量
使用在BIAcore(Pharmacia Biosensor AB)中的表面等离振子共振，测定纯化的scFv的Kds。在BIAcore流动室中，使用N-羟基琥珀酰亚胺-N-乙基-N′-(二甲氨基丙基)碳二亚胺化学(Johnson，等(1991)Anal.Biochem.198：268-277)，将约600RU的BoNT/A Hc(15μg/ml，溶于10mM乙酸钠[pH 4.5]中)偶联到CM5传感器芯片上。该量偶联的BoNT/A Hc导致最多100-175RU的结合的scFv。为了在scFv结合后再生表面，注射5μl的4M MgCl2，从而导致回到基线。在这些再生条件下，重复使用表面20-30次。在浓度范围为50-1,000nM的5μl/分钟连续流下，测量结合。从ln(dR/dt)/t对浓度的图，测定kon，其中R是反应，且t是时间(Karlsson，等(1991)J.Immunol.Methods 145：229-240)。通过使用30μl/分钟的流速，从在最高浓度的分析的scFv处的传感器图的解离部分，测定koff(Karlsson，等(1991)J.Immunol.Methods 145：229-240)。将Kd计算为koff/kon。
I)表位作图
使用在BIAcore中的表面等离振子共振，进行表位作图。在BlAcore流动室中，如上所述将约1,200RU的BoNT/A Hc偶联到CM5传感器芯片上。以5μl/分钟的流速，将100nM-1μM scFv的滴定在流动室表面注射5分钟，以测定导致表面接近饱和的scFv浓度。用scFv对，以产生接近饱和和至少100RU结合的scFv的浓度，进行表位作图。对于对中的每个成员，测定结合的scFv的量，然后将2种scFv混合到一起，产生的终浓度等于用于测量单一scFv的浓度。当一起注射时，识别不同表位的scFv表现出结合的RU的加性增加(图2图A)，而识别相同表位的scFv仅仅表现出RU的最小增加(图2图B)。
J)体外中和研究
如Deshpande等(1995)Toxicon 33：551-557所述，使用小鼠半膈制剂，进行体外中和研究。简而言之，从雄性CD/1小鼠(25-33g)切下左和右膈神经半膈制剂，并悬浮于生理溶液(135mM NaCl，5mMKCl，15mM NaHCO3，1mM Na2HPO4，1mM MgCl2，2mM CaCl2，和11mM GLU)中。使95％O2-5％CO2作泡状通过温育浴，并维持在恒温36℃。在0.05Hz，以0.2ms持续时间的方波，超大地刺激膈神经。使用连接到图表记录器上的力位移转换器(Model FT03；Grass)，测量等长颤搐张力。将纯化的scFv与纯化的BoNT/A在室温温育30分钟，然后加入组织浴，从而产生2.0x10-8M的终scFv浓度和2.0x10-11M的终BoNT/A浓度。对于研究的每种scFv，对于单独的BoNT/A，测定达到50％颤搐张力减少的时间3次，且对于scFv+BoNT/A，测定达到50％颤搐张力减少的时间3次。以分别2.0x10-8M的终浓度，研究S25和C25的组合。通过双尾t检验，测定达到50％颤搐减少的时间之间的差异，认为＜0.05的P值是显著的。
表4.结合来自噬菌体抗体文库的克隆的频率
a表达为阳性克隆数/克隆总数。对于BoNT/A和BoNT/A Hc上的选择，分别在固定化的BoNT/A和BoNT/A Hc上进行ELISA。ND，从进行的选择没有测定数据。
b源自用BoNT/A Hc免疫2次和用BoNT/A免疫1次的小鼠。
c使用吸收到免疫管上的抗原，进行免疫管选择。
d在溶液中进行生物素化的选择，捕获到链霉抗生物素蛋白磁珠上。
e源自用BoNT/A Hc免疫3次的小鼠。
f在溶液中进行Ni2+-NTA选择，捕获到Ni2+-NTA琼脂糖上。
结果
A)噬菌体抗体文库构建和表征.
从免疫的小鼠的VH和VK基因，构建了2个噬菌体抗体文库(图1)。对于文库1，用BoNT/A HC免疫小鼠2次，且在第二次免疫接种后2周，用100,000 50％致死剂量的BoNT/A进行攻击。小鼠在BoNT/A进行攻击后存活，且1周后处死。处死后立即取出脾，并制备总RNA。为了文库构建，特异性地引发IgG重链和κ轻链mRNA，并合成第一链cDNA。通过PCR扩增VH和VK基因谱，并在重组噬菌体抗体系统中提供VH、JH VK和JK引物。
使用编码15-氨基酸肽接头(G4S)3(SEQ ID NO：1)的合成DNA，将VH和VK基因谱随机地剪接到一起，以制备scFv基因谱。将每个scFv基因谱分别地克隆进噬菌体展示载体pCANTAB5E(Pharmacia)。转化后，得到2.1x106成员的文库。如通过PCR筛选测定的，90％的克隆具有scFv基因的适当大小的插入片段，且如通过PCR指纹分析测定的，克隆的scFv基因是多样的。10个来自文库1的未选择的克隆的DNA测序揭示，所有VH基因都源自鼠VH2家族，且所有VK基因都源自鼠VK4和VK6家族(Kabat，等(1991)同上)。基于该观察的V-基因偏好，设计了家族特异性的VH和VK引物以及JH和JK基因-区段-特异性的引物(表3)。然后，将这些引物用于构建第二个噬菌体抗体文库。
对于文库2，用BoNT/A Hc免疫小鼠3次，并在第三次免疫接种后2周处死。在脾收获之前，没有用BoNT/A攻击小鼠，因为这导致非-Hc-结合抗体的生成(参见下面的“噬菌体抗体的选择和初步表征”)。收获脾，并如上所述构建噬菌体抗体文库，例外是，使用VH-、JH-、VK-和JK-特异性的引物。转化后，得到1.0x106成员的文库。如通过PCR筛选测定的，95％的克隆具有scFv基因的适当大小的插入片段，且如通过PCR指纹分析测定的，克隆的scFv基因是多样的(未显示数据)。10个来自文库2的未选择的克隆的DNA测序揭示了比在文库1中观察到的更大的多样性；VH基因源自VH1、VK2和VK3家族，且VK基因源自VK2、VK3、VK4和VK6家族(Kabat，等(1991)同上)。
B)噬菌体抗体的选择和初步表征
为了分离结合BoNT/A的噬菌体抗体，从文库拯救噬菌体，并在纯化的BoNT/A或BoNT/A Hc上选择。除了Hc以外，在全毒素上进行选择，因为不清楚重组毒素Hc模仿全毒素中的Hc的构象的程度。在吸附到聚苯乙烯的抗原上，进行BoNT/A和BoNT/A Hc结合剂的选择。另外，在溶液中，在生物素化的Hc上选择结合Hc的噬菌体，捕获到链霉抗生物素蛋白磁珠(对于文库1)上，或在六组氨酸标记的Hc上进行选择，捕获到Ni2+-NTA琼脂糖(对于文库2)上。基于我们以前的观察，即在吸附到聚苯乙烯上的蛋白上的选择，产生不识别天然蛋白的噬菌体抗体(Schier等(1995)Immunotechnology，1：73-81)，使用在溶液中的选择。在溶液中的选择不是在全毒素上进行的，因为我们不能成功地生物素化该毒素而不破坏免疫反应性。
2-3轮选择后，至少67％分析的scFv结合用于选择的抗原(表2)。通过DNA指纹分析和随后的DNA测序，测定独特scFv的数目，并通过ELISA测定每种scFv对纯BoNT/A和重组BoNT/A Hc和HN的特异性，且推测结合BoNT/A、但是不结合Hc或HN的scFv结合轻链(催化结构域)。从用Hc免疫、并用BoNT/A攻击的小鼠，分离出共33个独特的scFv(表5，文库1)。当在全毒素上选择文库1时，鉴别出25个独特的scFv。但是，这些scFv中仅有2个结合Hc，大多数(Hathaway，等(1984)J.Infect.Dis.150：407-412)结合轻链，且2个结合HN。2个Hc结合性scFv不象识别类似表位的其它scFv一样好地表达，且因此在亲和力或中和能力方面没有表征它们(参见下文)。
在Hc上选择文库1，产生了另外8个独特的scFv(表3和4)。但是，共计仅50％在Hc上选择的scFv也结合全毒素。该结果表明，Hc表面的相当大部分不能被全毒素接近。或者，scFv可以结合在全毒素中不存在的Hc构象。从仅用Hc免疫的小鼠(文库2)，在全毒素上选择的所有scFv也结合Hc。但是与文库1一样，仅50％的在Hc上选择的scFv结合全毒素。总之，从文库2分离出18个独特的Hc结合性scFv，从而产生共28个独特的Hc结合性scFv(表5和6)。在固定化到聚苯乙烯上的Hc和在溶液中的Hc上，分离出相同或相关序列的scFv。因而，在Hc的情况下，选择方法不重要。
表5.从噬菌体抗体文库选择的BoNT结合性scFv的特异性
Figure GSB00000347175700621
C)表位作图
使用在BIAcore中的表面等离振子共振，对所有28个独特的Hc结合性scFv进行表位作图。用scFv对，以导致芯片表面接近饱和和至少100RU结合的scFv的浓度，进行表位作图。对于对中的每个成员，测定结合的scFv的量，然后将2种scFv混合到一起，产生的终浓度等于用于测量单一scFv的浓度。当一起注射时，识别不同表位的scFv表现出结合的RU的加性增加(图2图A)，而识别相同表位的scFv仅仅表现出RU的最小增加(图2图B)。通过该技术，28个scFv的作图，产生在Hc上识别的4个不重叠表位(表6)。从文库1得到仅识别表位1和2的scFv，而从文库2得到识别所有4个表位的scFv。
识别相同表位的许多scFv(C1和S25；C9和C15；1E8和1G7；1B6和1C9；C25和C39；2G5、3C3、3F4和3H4；1A1和1F1；1B3和1C6；1G5和1H6；1F3和2E8)具有源自相同V-D-J重排的VH结构域，如由高水平的VHCDR3和VH-基因区段同源性所证实的(表6)。这些scFv的不同之处仅在于，通过体细胞高变或PCR错误导入的置换。对于表位1和2，识别相同表位的大多数或所有scFv都源自相同或非常类似的VH-基因区段，但是在VHCDR3长度和序列方面明显不同(对于表位1，9个scFv中的5个；对于表位2，8个scFv中的8个)(表6)。这些包括源自不同小鼠的scFv。鉴于基本谱中VHCDR2序列的巨大程度的多样性(Tomlinson等(1996)J.Mol.biol.，256：813-817)，特定的VH-基因区段关于它们形成能识别特定病原性抗原形状的结合位点的能力可能已经发生了进化。相反地，更大的结构变化似乎发生在重排的YK基因中。例如，对于表位21，观察到3种不同种系基因和CDR1主链构象(Chothia，等(1987)J.Mol.Biol.196：901-917)，其中所有VH基因都源自相同种系基因。以前已经报道了这样的链配对中的“混乱”(Clackson，等(1991)Nature 352：624-628)。
D)亲和力、结合动力学和体外毒素中和
为一种代表性的结合每种表位的scFv，测定亲和力、结合动力学和体外毒素中和。对于每种表位，选择用于进一步研究的scFv具有高表达水平和慢koff的最佳组合，如在表位作图研究过程中所测得的。研究的4种scFv的Kd是7.3x10-8至1.1x10-9M(表7)，这些值与从杂交瘤生产的单克隆IgG的报道的值相当(Foote，等(1991)Nature352：530-532)。对于抗-肉毒杆菌毒素抗体，C25具有报道的最高亲和力(Kd＝1.1x10-9M)。scFv之间的kon差异超过84倍，且koff差异超过33倍(表7)。通过使用小鼠半膈制剂，和测量单独的BoNT/A和在有2.0x10-8M scFv存在下，达到50％颤搐张力减少的时间，测定体外毒素中和。将值记录为达到50％颤搐减少的时间。结合表位1(S25)和表位2(C25)的scFv明显延长了达到神经性麻痹的时间：分别是1.5倍(152％)和2.7倍(270％)(表7和图3)。相反地，结合表位3和4的scFv对达到神经性麻痹的时间没有显著作用。S25和C25的混合物对达到神经性麻痹的时间具有显著的加性作用，达到50％颤搐减少的时间增加了3.9倍(390％)。
Figure GSB00000347175700651
Figure GSB00000347175700661
Figure GSB00000347175700671
Figure GSB00000347175700681
表7.从噬菌体抗体文库选择的scFv的亲和力、结合动力学和体外毒素中和结果
Figure GSB00000347175700691
a通过表面等离振子共振测量kon和koff，且将Kd计算为koff/kon。
b与单独BoNT/A的时间相比，在小鼠半膈测定中使用20nM scFv+20pM BoNT/A达到50％颤搐减少的时间(分钟)。对于C25+S25组合，每次使用20nM scFv。每个值是至少3次观察的平均值±SEM。
cp＜0.01，与BoNT/A相比。
dp＜0.05，与C25相比。
讨论
BoNT由通过一个二硫键相连的重链和轻链组成。毒素的羧基-末端一半结合特异性的膜受体，从而导致内化，而氨基-末端一半介导毒素从内体进入胞质的易位。轻链是锌内肽酶，其切割基本的突触小体蛋白，从而导致突触传递的失败和麻痹。有效的免疫治疗必须阻止毒素与受体的结合，因为其它2种毒素功能在细胞内产生。鉴别Hc上的介导结合的表位，是设计更好的疫苗和开发用于被动免疫治疗的高效价的中和单克隆抗体(或多种抗体)基本的第一步。
为此，我们尝试通过用重组BoNT/A Hc免疫接种，指导对中和表位的免疫应答。这应导致抗体的产生，所述抗体阻止毒素与它的细胞受体的结合。该方法的一个限制是，重组Hc模仿全毒素中的Hc的构象的程度。50％的在Hc上选择出的抗体识别全毒素的事实，暗示着该分子的大部分的显著结构同源性。尽管50％的在Hc上选择出的抗体不结合全毒素，但这可能由针对其它毒素结构域包装Hc表面的相当大部分引起。但是，我们的结果没有排除下述可能性，即有些这样的抗体会结合不存在于全毒素中的Hc构象，或重组Hc缺少存在于全毒素中的构象表位。这会导致不能生成抗某些构象表位的抗体。尽管如此，用Hc进行免疫和选择，导致结合全毒素的大量单克隆抗体的分离。相反地，用全毒素或类毒素免疫接种后分离的单克隆抗体结合其它毒素结构域(HN或轻链)或存在于粗毒素制剂中的非毒素蛋白和类毒素(参见上面来自文库1的结果，和Emanuel等(1996)j.Immunol.Meth.，193：189-197)。
为了生产和表征最大数目的可能的单克隆抗体，我们使用了噬菌体展示。该方法使得生成和筛选数百万用于结合的不同抗体成为可能。产生的抗体片段是已经克隆的，且可以容易地测序，以鉴别独特抗体的数目。在大肠杆菌中的表达水平通常足以产生毫克量的scFv，后者可以在亚克隆进在C末端附着了六组氨酸标记的载体后，通过IMAC容易地纯化。最后，可以亚克隆VH和VL基因，以构建完整的IcG分子，进行嫁接，以构建人源化的抗体，或进行突变以制备超高-亲和力抗体。通过该方法，制备和表征了28个独特的单克隆抗-BoNT/A Hc抗体。
抗体序列是多样的，由3个不同VH-基因家族、至少13个独特的V-D-J重排、和3个VK-基因家族组成。该大量BoNT/A Hc抗体的产生，是选择用于免疫接种和选择的抗原(BoNT/A Hc)的结果。例如，从用五价类毒素免疫的小鼠的V基因构建的Fab噬菌体抗体文库，仅仅产生2个结合纯毒素(在该情况下，BoNT/B)的Fab。大多数Fab结合存在于类毒素中的非毒素蛋白(Emanuel，等，J.Immunol.Methods193：189-197(1996))。
尽管抗体的序列多样性，但表位作图揭示了仅4个不重叠的表位。表位1和2是免疫显性的，可被21/28(75％)的抗体识别。令人感兴趣地，大约相同数目(3-5)的免疫显性的BoNT/A Hc肽(非构象的)表位，在用五价类毒素免疫接种后被小鼠和人多克隆抗体识别，且在用甲醛-灭活的BoNT/A免疫接种后被马多克隆抗体识别(Atassi(1996)J.Protein Chem.，15：691-699)。
结合表位1和2的scFv导致小鼠神经肌接点处毒素-诱导的神经性麻痹的部分拮抗作用。当一起施用时，两种scFv具有加性作用，达到神经性麻痹的时间显著增加。这些结果与BoNT/A Hc上存在2个独特受体结合位点相一致。尽管尚未正式地鉴别出BoNT/A受体，但结果与配体结合研究的结果相一致，这也指示毒素上高和低亲和力的2类受体结合位点，且已经导致毒素结合的“双受体”模型(Montecucco(1986)Trends Biochem.Sci.11：314-317)。但是，这2个位点是否是在Hc上，存在争论。在2个研究中，BoNT/A Hc部分地抑制了结合和神经肌肉麻痹(Black，等(1986)J.Cell Biol.，103：521-534；Black，等(1980)Am.J.Med.，69：567-570)，而Daniels-Holgate等(1996)J.Neurosci.Res.44：263-271表明，BoNT/A Hc抑制运动神经末端的结合，但是对小鼠神经肌接点处毒素-诱导的神经性麻痹没有拮抗作用。我们的结果与Hc上存在2个“生产性”受体结合位点相一致，它们导致毒素内化和毒性。scFv效力的差异，可能反映Hc对受体结合位点的亲和力差异，或可能反映大于10倍的scFv对Hc的亲和力差异。最后，我们尚没有正式地表明，任一种scFv实际上阻断毒素与细胞表面的结合。可以想象，观察到的对达到神经性麻痹的时间的作用，源自结合后事件的干扰。
ScFv对小鼠半膈测定中毒素-诱导的神经性麻痹的拮抗作用，低于对2.0x10-9M多克隆马抗毒素(PerImmune Inc.)观察到的拮抗作用(达到神经性麻痹的时间延长7.5倍)。该差异可能是由于封闭其它结合位点的必要性、抗体亲和力或抗体亲抗原性的差异、或导致不能结合的聚集毒素的交联作用。抗体结合的亲和力也可能是重要因子，因为毒素以高亲和力结合它的受体(Williams等(1983)Eur.J.Biochem.，131：437-445)，且可以通过内化，在细胞内浓缩。注意到，最有效的scFv具有最高的对Hc的亲和力。本文描述的识别相同中和表位、但是具有不同Kd的其它scFv的可用性，应有助于定义亲和力的重要性。但是，这些scFv的差异在于许多氨基酸，且也可以差异在于细微特异性，从而使得难以解释结果。或者，与噬菌体展示相组合的诱变可以导致差别仅在于序列中的少数氨基酸、但是亲和力变化是几个数量级的scFv的生产(Schier等(1996)J.Mol.Biol.，263：551-567)。相同的方法可以用于使抗体亲和力增加到皮摩尔范围(同前)。
中和的“黄金标准”是保护小鼠免于与抗体共注射的毒素的致死作用。尽管尚未正式确立体外和体内保护之间的关系，但马抗毒素可能中和2类测定中的毒素(参见上文和Hatheway等(1984)J.Infect.Dis.，150：407-412)。认为该关系适用于本文报告的scFv，且这可以实验地验证。
这样的研究对于小(25-kDa)scFv抗体片段是不适当的。小尺寸的scFv导致快速再分布(在α阶段的半衰期是2.4-12分钟)和清除(在β阶段的半衰期是1.5-4小时)和迅速变得不可检测的抗体水平(Huston，等，(1996)J.Nucl.Med.40：320；Schier等(1995)Immunotechnology，1：73-81)，同时毒素水平可能保持较高(Hildebrand，等(1961)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.107-284-289)。通过从scFv的VH和VL基因构建完整IgG分子，可以促进体内研究的表现。人恒定区的使用，将产生免疫原性比鼠单克隆更低、且比目前使用的马抗毒素低得多的嵌合抗体。通过CDR嫁接，可以进一步降低免疫原性，以产生人源化的抗体。
实施例2
重组寡克隆抗体对肉毒杆菌神经毒素的有效中和
产芽孢细菌肉毒梭菌分泌肉毒杆菌神经毒素(BoNT)，即已知的最有毒的物质(Gill(1982)Microbiol.Rev.46：86-94)。该蛋白毒素由重链和轻链组成，含有3个功能结构域(Simpson(1980)J.Pharmacol.Exp.Ther.212：16-21；Montecucco和Schiavo(1995)Q.Rev.Biophys.28：423-472；Lacy等(1998)Nat.Struct.Biol.5：898-902)。重链的C末端部分(HC)包含结合结构域，它结合突触前神经元上的唾液酸神经节苷脂受体和推定的蛋白受体，从而导致毒素胞吞作用(Dolly等(1984)Nature(London)307：457-460；Montecucco(1986)TrendsBiochem.Sci.11：315-317)。重链的N-末端部分(HN)包含易位结构域，它允许毒素逃离内体。轻链是切割SNARE复合物的不同成员的锌内肽酶，依赖于血清型，导致神经肌肉传递的阻断(Schiavo等(1992)Nature(London)359：832-835；Schiavo等(1993)J.Biol.Chem.268：23784-23787)。
存在7种BoNT血清型(A-G；Lacy和Stevens(1999)J.Mol.Biol.291：1091-1104)，其中4种(A、B、E和F)造成人疾病肉毒中毒(Arnon等(2001)J.Am.Med.Assoc.285：1059-1070)。肉毒中毒的特征在于弛缓性麻痹，其如果没有立即致命，则需要长期在重病监护病房中住院治疗和机械换气。毒素的有效麻痹能力，已经导致它在低剂量作为治疗许多活动过度的肌肉状况的药物的应用，所述状况包括颈张力障碍、大脑性瘫痪、创伤后脑损伤和中风后痉挛状态(Mahant等(2000)J.Clin.Neurosci.7：389-394)。BoNT也被疾病控制中心(CDC)归入生物恐怖主义的6种最高危险的威胁因子(“A类因子”)之一，这是由于它们的巨大效力和致死率、容易生产和运输、和需要长期重症监护(Arnon等(2001)J.Am.Med.Assoc.285：1059-1070)。伊拉克和前苏联都生产了用作武器的BoNT(United Nations Security Council(1995)Tenth Report of the Executive Committee of the Special CommissionEstablished by the Secretary-General Pursuant to Paragraph 9(b)(I) ofSecurity Council Resolution 687(1991)，and Paragraph 3 of Resolution 699(1991)on the Activities of the Special Commission(United Nations SecurityCouncil，New York)；Bozheyeva等(1999)Former Soviet BiologicalWeapons Facilities in Kazakhstan：Past，Present，and Future(Center forNonproliferation Studies，Monterey Institute of International Studies，Monterey，CA)，且日本宗教奥姆真理教尝试使用BoNT进行生物恐怖主义(Arnon等(2001)J.Am.Med.Assoc.285：1059-1070)。作为这些威胁的结果，需要用于预防和治疗中毒的特异性药物试剂。
没有存在特异性的小分子药物可以用于预防或治疗肉毒中毒，但是从CDC可以得到用于研究的五价类毒素(Siegel(1988)J.Clin.Microbiol.26：2351-2356)，且重组疫苗正在开发中(Byrne和Smith(2000)Biochimie 82：955-966)。无论如何，由于疾病或暴露的稀少，和接种疫苗将阻止BoNT的随后的医学应用的事实，大规模平民或军人接种疫苗是不可能的。由于疾病的快速发作，暴露后的接种疫苗是无用的。毒素中和抗体(Ab)可以用于暴露之前或之后的预防，或用于治疗(Franz等(1993)Pp.473-476 In Botulinum and TetanusNeurotoxins：Neurotransmission and  Biomedical Aspects.，DasGuptaB.R.，(编)，Plenum，New York)。存在小量的马抗毒素和人肉毒杆菌免疫球蛋白，且其目前分别用于治疗成年人(Black和Gunn(1980)Am.J.Med.69：567-570；Hibbs等(1996)Clin.Infect.Dis.23：337-340)和婴儿肉毒中毒(Arnon(1993)Pp.477-482in Botulinum and TetanusNeurotoxins：Neurotransmission and Biomedical Aspects，ed.DasGupta，B.R.Plenum，New York)。重组单克隆抗体(mAb)可以无限地提供抗毒素，其没有感染性疾病危险，且不需要人供体进行血浆去除术。这样的mAb必须是高效力的，以在合理的成本提供足够数量的剂量。在有些情况下，多克隆Ab的效力可以概括在单一mAb中(Lang等(1993)J.Immunol.151：466-472)。在BoNT的情况下，还要生产有效的中和mAb：单一mAb中和小鼠中的最多10-100倍50％致死剂量(LD50)的毒素(Pless等(2001)Infect.Immun.69：570-574；Hallis等(1993)Pp.433-436 In：Botulinum and Tetanus Neurotoxins：Neurotransmission andBiomedical Aspects，编DasGupta，B.R.，Plenum，New York)。在该实例中，我们表明通过组合2或3种mAb，可以非常有效地体外和体内地中和BoNT血清型A(BoNT/A)，从而提供预防和治疗肉毒中毒和由其它病原体和生物威胁因子造成的疾病的药物。
方法
IgG构建
使用PCR，利用引物对GTC TCC TGA GCT AGC TGA GGA GACGGT GAC CGT GGT(SEQ ID NO：183)和GTA CCA ACG CGT GTCTTG TCC CAG GTC CAG CTG CAG GAG TCT(C25，SEQ ID NO：184)、GTA CCA ACG CGT GTC TTG TCC CAG GTG AAG CTG CAGCAG TCA(S25，SEQ ID NO：185)、或GTA CCA ACG CGT GTC TTGTCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT(3D12，SEQ ID NO：186)，从各噬菌粒DNA扩增C25、S25和3D12单链可变片段(scFv)的VH基因。用Mlu1和NheI消化DNA，连接进N5KG1 Val-Lark(Mitch Reff赠，IDEC Pharmaceuticals，San Diego)，并通过DNA测序，鉴别含有正确VH的克隆。利用引物对TCA GTC GTT GCA TGT ACT CCA GGTGCA CGA TGT GAC ATC GAG CTC ACT CAG TCT(SEQ ID NO：187)和CTG GAA ATC AAA CGT ACG TTT TAT TTC CAG CTT GGT(C25，SEQ ID NO：188)、TCA GTC GTT GCA TGT ACT CCA GGTGCA CGA TGT GAC ATC GAG CTC ACT CAG TCT(SEQ ID NO：189)和CTG GAA ATC AAA CGT ACG TTT GAT TTC CAG CTT GGT(S25，SEQ ID NO：190)，或TCA GTC GTT GCA TGT ACT CCA GGTGCA CGA TGT GAC ATC GTG ATG ACC CAG TCT(SEQ ID NO：191)和CTG GAA ATC AAA CGT ACG TTT TAT CTC CAG CTT GGT(3D12，SEQ ID NO：192)，从各噬菌粒DNA扩增C25、S25和3D12scFv的V_基因，克隆进pCR-TOPO(Invitrogen)，并通过DNA测序，鉴别含有正确V_的克隆。使用DraIII和BsiWI，从pCR-TOPO切除V_基因，并连接进DraIII-和BsiWI-消化的含有适宜VH基因的N5KG1Val-Lark DNA。并通过DNA测序，鉴别含有正确VH和Vκ基因的克隆，并通过电穿孔，将载体DNA用于转染CHO DG44细胞。通过在G418中选择，确立稳定细胞系，并在1L旋转摇瓶中扩张。收集含有IgG的上清液，通过超滤浓缩，并在G蛋白(Pharmacia)上纯化。
IgG亲和力和结合动力学的测量
使用表面等离振子共振，在BIAcore(Pharmacia Biosensor)中测量IgG结合动力学，并用于计算Kd。使用N-羟基琥珀酰亚胺-N-乙基-N′-(二甲氨基丙基)-碳二亚胺化学，将约200-400反应单位的纯化的IgG(10-20μg/ml，溶于10mM乙酸盐中，pH 3.5-4.5)偶联到CM5传感器芯片上。使用50-800nM的浓度范围，在15μl/分钟的连续流下，测量纯化的BoNT/AHC的结合速率常数。从(ln(dR/dt))/t与浓度的图，确定结合速率常数(kon)。从使用30μl/分钟的流速来预防重新结合分析的最高scFv浓度处的传感器图解离部分，确定解离速率常数(koff)。将Kd计算为koff/kon。
体外毒素中和的测量
从雄性CD-1小鼠(25-33g)切除膈神经半膈制剂，并悬浮于135mM NaCl，5mM KCl，1mM Na2HPO4，15mM NaHCO3，1mM MgCl2，2mM CaCl2和11mM葡萄糖。使95％O2/5％CO2作泡状通过温育浴，并维持在36℃。在0.05Hz，以0.2ms持续时间的方波刺激膈神经。使用力位移转换器(Model FT03，Grass Instruments，Quincy，MA)，测量等长颤搐张力。将纯化的IgG与BoNT A在室温温育30分钟，然后加入组织浴，从而产生终IgG浓度6.0x10-8M(只有S25和3D12)或2.0x10-8M(只有C25)和终BoNT A浓度2.0x10-11M。对于IgG对，每种IgG的终浓度降低50％，且对于所有3种IgG混合物的研究，每种IgG的终浓度降低67％。
体内毒素中和的测量
在总体积为0.5ml的明胶磷酸盐缓冲液中，将50微克适宜的IgG加入指示数目小鼠LD50的BoNT/A神经毒素(Hall品系)，且在室温温育30分钟。对于Ab对，加入25μg每种Ab，且对于3种Ab的组合，加入16.7μg每种Ab。然后，将混合物腹膜内地注射进雌性CD-1小鼠(16-22g)。将小鼠分成10只的组进行研究，且至少每天观察。注射后5天，测定最终的死亡计数。
mAb溶液亲和力的测量
使用KinExA流式荧光计进行平衡结合研究，以定量抗体与抗原的反应混合物中具有未占据的结合位点的抗体。在Hepes-缓冲盐水pH7.4中，进行使用包含1、2或3种不同抗体的反应混合物的研究，总抗体浓度分别是342、17.2和17.2pM。在所有情况下，可溶毒素的浓度从低于表观Kd值的0.1变至大于其10倍(12浓度，最小)。将包含1、2或3种不同抗体的反应混合物在25℃分别温育0.5、3和17小时，以确保达到平衡。
结果
为了生成能中和BoNT/A的mAb，我们预先从用重组BoNT/A结合结构域(HC)免疫的小鼠和从用五价肉毒杆菌类毒素免疫的人生成了scFv噬菌体抗体文库(Amersdorfer等(1997)Infect.Immun.65：3743-3752；Amersdorfer等(2002)Vaccine 20：1640-1648)。从这些文库筛选超过100种独特mAb后，鉴别出3组scFv，它们结合BoNT/AHC上的不重叠表位，且体外中和毒素(延长在鼠半膈模型中达到神经性麻痹的时间；Amersdorfer等(1997)Infect.Immun.65：3743-3752；Amersdorfer等(2002)Vaccine 20：1640-1648)。当组合2种结合不重叠表位的scFv时，体外毒素中和显著增加。因为25-kDa scFv从血清的迅速清除，不能测定体内毒素中和(Colcher等(1990)J.Natl.Cancer Inst.82：1191-1197)。
为了评价体内BoNT神经毒素中和，从体外中和毒素的3种BoNT/A scFv的VH和V-基因，构建IgG。将VH和Vκ基因顺序克隆进哺乳动物表达载体，从而导致人Cκ基因与Vκ的融合，和人γ1基因与VH的融合。确立稳定的表达细胞系，并从上清液纯化IgG，从而对于鼠scFv C25和S25，产生含有鼠V-结构域和人C-结构域的嵌合IgG，且对于人scFv 3D12，产生全人IgG。测量IgG平衡结合常数(Kd)，并发现至少与它们所来源的scFv的结合常数相当(表8)。2种IgG(S25和3D12)的抗原结合亲和力显著高于对应的scFv(更低的Kd)，主要是因为结合速率常数(kon)的增加。我们推测这反映了分子稳定性的增加，并从而反映功能性抗体浓度的增加。
表8.BoNT/A IgG和IgG所来源的scFv的结合(kon)和解离(koff)速率常数和平衡解离常数(Kd)
在小鼠半膈测定中，测定IgG的体外毒素中和(Desphande等(1995)Toxicon 33：551-557)。与单独的毒素相比，3种IgG中的每种都显著增加了达到神经性麻痹的时间，其中C25是最有效的(图4)。当研究IgG对时，观察到毒素中和的显著协同作用。对于这些研究，必需降低研究的C25 IgG的浓度3倍，至20nM，这是因为它的高效力和半膈制剂具有8-小时的寿命的事实。与任一种单独的IgG的时间相比，每对IgG显著增加达到神经性麻痹的时间(图4)。所有3种IgG的混合物进一步增加达到神经性麻痹的时间，尽管该差异与抗体对相比并没有达到统计学显著性，因为仅研究了小量膈。
使用小鼠测定研究了体内毒素中和，其中预混合毒素和Ab，并腹膜内地注射，并测定达到死亡的时间和存活小鼠的数目(Sheridan等(2001)Toxicon 39：651-657)。50微克每种单一mAb都延长了达到死亡的时间，但是不能保护用20LD50攻击的小鼠(图5A)。相反地，任意mAb对完全保护用100LD50的毒素攻击的小鼠(图5B)。在500LD50，大多数接受2种mAb对(S25+3D12或C25+S25)的小鼠死亡，而80％接受C25+3D12对的小鼠存活(图3)。接受所有3种mAb(寡克隆Ab)的混合物的所有小鼠在500LD50的毒素的攻击后存活(图6)。在这些研究中，施用的Ab的总量保持恒定在每只小鼠50μg。为了测定效力，以递增剂量的毒素，研究了mAb对和寡克隆Ab (图6)。最有效的mAb对(C25+3D12)保护90％的用1,000LD50攻击的小鼠，且没有小鼠在2,500LD50的攻击后存活。相反地，寡克隆Ab完全保护用5,000LD50毒素攻击的所有小鼠，5/10的小鼠在20,000LD50毒素的攻击后存活。使用改进的标准小鼠中和生物测定(Hatheway和Dang(1994)Pp.93-107 In：Therapy with Botulinum Toxin，编Jankovic，J.，Dekker，New York)，滴定寡克隆Ab的效力，并测得为45国际单位(IU)/mg的Ab，比用于治疗婴儿肉毒中毒的人肉毒杆菌免疫球蛋白有效90倍(Arnon(1993)Pp.477-482 in Botulinum and TetanusNeurotoxins：Neurotransmission and Biomedical Aspects，编DasGupta，B.R.Plenum，New York)。作为定义，1IU中和10,000LD50的BoNT/A毒素(Bowmer(1963)Bull.W.H.O.29：701-709)。
2个可能的机理是当组合mAb时观察到效力增加的原因：Ab混合物对毒素的功能性结合亲和力的增加，和/或结合细胞受体的毒素表面的封闭的增加。为了确定组合抗体对功能性结合亲和力的作用，通过使用流式荧光计来定量溶液反应混合物中剩余的游离抗体，测定每种单一mAb、mAb对和所有3种mAb的混合物的表观Kd。对于单一mAb，在均匀溶液中测得的抗原结合亲和力(抗原和抗体都在溶液中；图7)低于通过表面等离振子共振在BIAcore中测得的亲和力(表8)(更高的Kd)，在后者中，抗体被固定化，且仅抗原在溶液中。当抗体C25(它表现出最大体外效力)与抗体3D12以等摩尔量混合时，得到的Ab组合以65pM的表观Kd结合毒素，所述亲和力为用单独的个别抗体观察到的亲和力的200和10倍(更低的Kd)。向混合物中加入等摩尔量的第三种mAb(S25)，使表观亲和力进一步增加至18pM。C25与S25的等摩尔混合物，仅仅产生亲和力的微弱的2倍增加，这可以解释为什么该对比C25和3D12的组合的体内效力更低。用多种mAb观察到的功能性亲和力的增加，可能是由于在第一种mAb的结合后发生的毒素构象变化，其导致第二种和第三种mAb的更高亲和力的结合，或来自mAb结合，其使毒素从单价变成多价抗原(Moyle等(1983)J.Immunol.131：1900-1905)。这导致“抗体亲抗原性作用”和亲和力的增加。抗体亲抗原性作用已经被较好地认识，并关于结合多价抗原的IgG进行表征(Crothers和Metzger(1972)Immunochemistry 9：341-357)，例如细胞表面，但是未被充分认为发生在溶液中。
测得的Kd的增加，与观察到的mAb对和寡克隆Ab的体内效力的增加相一致。重排平衡结合方程：
    游离的毒素/结合的毒素＝Kd/[血清抗体].
假定2-ml小鼠血量，当小鼠接受50μg Ab时，血清抗体浓度是160nM。因为毒素的施用量是LD50的许多倍，所以结合的毒素约等于施用的毒素。因而，上述方程简化为：
    游离的毒素/施用的毒素＝Kd/160nM。
为了确定导致50％小鼠死亡的施用的毒素量，人们使用1LD50替代游离的毒素的量，并求出施用的毒素，产生方程：
    施用的毒素(按LD50计)＝1LD50x160nM/Kd.
使用C25的溶液Kd，50％小鼠存活的预测毒素剂量是16LD50(施用的毒素＝1LD50x160nM/10nM)。当将该计算应用于C25和3D12Ab对和寡克隆Ab时，组合抗体的效力增加的量级与功能性亲和力的增加平行(表9)。
表9.观察到的和预测的重组抗体的毒素中和
Figure GSB00000347175700791
寡克隆Ab的有效毒素中和的第二个可能机理是，需要封闭结合细胞受体的毒素结合结构域表面上的多个表位。已经假设，毒素通过毒素结合结构域上的至少2个位点，结合细胞受体(Dolly等(1984)Nature(London)307：457-460；Montecucco(1986)Trends Biochem.Sci.11：315-317)。这些包括神经节苷脂结合位点和推定的蛋白受体结合位点。实际上，已经在同源破伤风毒素的共结晶结构中，观察到2个空间上分离的神经节苷脂结合位点(Fotinou等(2001)J.Biol.Chem.276：32274-32281)，且结合不重叠的破伤风毒素表位的mAb可以阻断毒素与GT1b神经节苷脂的结合(Fitzsimmons等(2000)Vaccine19：114-121)。我们以前的表位作图研究与封闭大部分BoNT结合结构域(HC)的多个mAb相一致(Mullaney等(2001)Infect.Immun.69：6511-6514)。2种mAb(S25和3D12)结合BoNT HC的C-末端亚结构域。C25mAb结合由来自BoNT HC的N-和C-末端亚结构域的序列组成的构象表位。与表位作图相一致的一种模型将3种mAb表位置于相同HC表面上，并与推定的细胞神经节苷脂受体GT1b的已知停靠位点重叠(Mullaney等(2001)Infect.Immun.69：6511-6514)。
讨论
总之，我们已经表明，6种A类生物战试剂之一BoNT/A，可以用仅由3种mAb组成的寡克隆Ab有效地中和。寡克隆Ab的效力是超免疫的人球蛋白的90倍，并接近超免疫的单-血清型马A型抗毒素的效力(Sheridan等(2001)Toxicon 39：651-657)。因而，可以将多克隆血清的效力去卷积(deconvolute)或还原成仅仅结合3种不重叠的表位的mAb。该协同作用导致3种mAb的效力与任一种单一mAb的效力相比增加了超过20,000倍。其它人以前已经表明单克隆抗体之间在中和破伤风毒素或HIV感染中的协同作用。在破伤风毒素的情况下，组合3-4种单克隆抗体，使体内毒素中和的效力增加最高达200倍(Volk等(1984)Infect.Immun.45：604-609)。在HIV的情况下，组合3或4种mAb，使病毒中和效力与单一mAb相比增加10倍(Zwick等(2001)J.Virol.75：12198-12208)。因而，我们的观察可能证实在许多系统中是常见的。但是，我们表明，在毒素中和的情况下，增加的效力可能源自混合抗体的功能性亲和力的大幅增加。不清楚该机理是否对于病毒中和是真实的。
人们可以假设，对毒素的多克隆体液免疫应答，在功能上由仅仅结合少数不重叠的表位的Ab支配。效力的增加似乎主要源自寡克隆Ab的Kd与单一mAb相比的大幅降低，且也源自与细胞受体相互作用的毒素表面的更大封闭，这样的机理通常适用于许多在溶液中的抗原，从而表明寡克隆Ab可以提供比mAb更有效的抗原中和的一般途径。尽管通过工程改造使C25mAb的Kd变得接近pM，可能实现类似的效力，但寡克隆Ab提供达到有效的抗毒素的更简单的、更快速的途径。
寡克隆Ab也提供安全的且无限供给的药物，用于预防和治疗BoNT/A中毒。因为Ab由嵌合的或人IgG组成，所以可以立即按比例生产，以生产安全的抗毒素库。或者，我们已经用全人IgG替代嵌合S25IgG，并使寡克隆Ab的效力增加了超过2倍。正在进行用全人同源物替代嵌合C25的工作。嵌合的、人源化的和人mAb代表着日益重要的治疗剂类别，它们的生产方式是已知的。10种mAb已经被FDA批准用于人治疗，且超过70种其它mAb治疗剂正在临床试验中(Reichert(2001)Nat.Biotechnol.19：819-822)。由于消除半衰期最高达4周，所以Ab可提供数月的抗毒素的保护，或可以用于治疗。寡克隆Ab适用于其它BoNT毒素血清型，以及其它A类试剂。炭疽是毒素-介导的疾病，且已经表明Ab对该试剂是保护性的(Little等(1997)Infect.Immun.65：5171-5175；Beedham等(2001)Vaccine 19：4409-4416)。牛痘免疫球蛋白可以用于预防或治疗天花或由无免疫应答的宿主的接种疫苗引起的并发症(Feery(1976)Vox Sang.31：68-76)。Ab也可以用于鼠疫和由出血热病毒造成的疾病(Hill等(1997)Infect.immun.65：4476-4482；Wilson等(2000)Science 287：1664-1666)。我们的数据支持了用于对抗BoNT和生物战和生物恐怖主义的其它试剂的寡克隆Ab的快速开发和评价。
实施例3
来自免疫和未免疫人噬菌体文库的抗-肉毒杆菌A型抗体的遗传学和免疫学对比
理解抗体在肉毒杆菌中毒中的应答，对于疫苗设计和被动预防是重要的。为了研究该活性，我们已经使用噬菌体展示，在分子水平研究了对BoNT/A(肉毒杆菌神经毒素血清型A)结合结构域(HC)的免疫应答。从由(a)用五价肉毒杆菌类毒素免疫的人志愿者和(b)未免疫人外周血淋巴细胞和脾细胞制备的V-基因谱，分离scFv抗体。从2个文库中，可以选择出一大组血清型特异性的表达结合肉毒杆菌的scFv的噬菌体。免疫scFv结合剂对BoNT/A HC的表位作图，令人惊奇地揭示了有限数目的识别与2个不同组(聚簇I和II)对应的构象表位的scFv。仅来自聚簇I的scFv在小鼠半膈测定中表现出中和活性。源自未免疫文库的抗-BoNT/A HC克隆可以方便地分成聚簇III-XI，且似乎与聚簇I或II没有共有重叠表位。另外，它们在生物学上显著的浓度没有表现出毒素的中和。因此，我们提出，基于五价肉毒杆菌类毒素的疫苗指导对结合结构域HC上暴露的有限数目的免疫显性表位的体液免疫应答。
简介
肉毒杆菌毒素是麻痹性神经毒素，其作为由梭菌属的许多细菌物种产生的7种不同血清型(A-G)而存在(Hatheway(1989)Pp.3-24 In：Simpson LL，编.Botulinum neurotoxin and tetanus toxin.San Diego：Academic Press)。它们作为单链蛋白产生(Mr：150,000)，且被有限的蛋白水解完全激活，这导致2条链的形成，重链(Mr：100,000)和轻链(Mr：50,000)其通过二硫键和非共价键结合到一起(Niemann(1991)Pp.303-348 In：Alouf JE，Freer JH，编.Sourcebook of bacterial proteintoxins.New York：Academic Press；Simpson(1990)J Physiol.，84：143-151)。中毒可因下述原因产生：摄食梭菌-污染的食物(食物传播的肉毒中毒)，婴儿肠感染(婴儿肉毒中毒)，和伤口的深度皮下感染(伤口肉毒中毒)。人肉毒中毒最经常由A、B和E型造成，且很少由F型造成(Dowell(1984)Rev Infect Dis.，6(Suppl 1)：202-207；Botulismin the United States.Handbook for epidemiologists，clinicians andlaboratory workers.Atlanta，Center for Disease Control，1980)。BoNT(肉毒杆菌神经毒素血清型)优先作用于胆碱能神经末梢，以阻断乙酰胆碱释放(Habermann等(1986)Curr Top Microbiol Immunol.，129：93-179；Montecucco等(1994)Mol Microbiol.，13：1-8)。BoNT的作用包括3步(Simpson(1986)Ann Rev Pharmacol Toxicol.，26：427-453)：(1)通过重链的C-末端HC，结合突触前膜上的受体；(2)通过重链的N-末端HN，轻链易位进胞质；和(3)通过轻链的锌蛋白酶活性，切割突触小泡停靠和融合蛋白复合物中的一种或多种关键组分(Montecucco等(1994)Mol Microbiol.，13：1-8；Schiavo(1992)J Biol Chem.，267：23479-23483；Schiavo等(1995)Curr Top Microbiol Immun.，195：257-275)。被动免疫治疗已经被公认为抗人病原体和它们的毒素的有价值的预防和治疗方法(综述参见Gronski等(1990)Mol Immunol.，28：1321-1332和Cross(1997)P.97 In：Cryz SJ，编.Immunotherapy and vaccines.Weinheim，Germany：VCH Verlagsgesellschaft)。在肉毒中毒的情况下，认为识别BoNT重链的C-末端结构域(HC)的抗体制剂能阻止毒素与它的细胞受体的结合。用重组HC免疫接种小鼠，赋予对最高达1,000,000小鼠腹膜内LD50攻击剂量的良好体内保护(Clayton等(1995)Infect Immun.，63：2738-2742；Byrne等(1998)Infect Immun.，66：10)。在过去，马血浆-衍生的多克隆抗-肉毒杆菌抗体制剂(马HIG)已经施用给超过80％的成年人肉毒中毒患者(Middlebrook和Brown(1995)Curr Top MicrobiolImmun.，195：89-122；Tacket等(1984)Am J Med.，76：794-798；Morris(1981)P.15 In：Lewis GE jr，编.Biomedical aspects of botulism.NewYork：Academic Press)。被多克隆抗体制剂识别出的大量不同表位，通常确保保护性抗体的存在，后者通常是总抗体的小亚群。对于预防，当在暴露前施用时，马抗体是最有效的，但是可以在暴露后最高达24小时预防疾病(Middlebrook和Brown(1995)Curr Top MicrobiolImmun.，195：89-122)。但是，马抗毒素的施用可能造成不良反应，例如在9％的病例中，造成血清病和过敏反应(Black和Gunn(1980)Am JMed.，69：567-570)。最近的努力已经集中在从免疫的志愿者供体的血清制备的人免疫球蛋白(人BIG)的生产(Arnon(1993)Pp.477-482In：DasGupta BR，编.Botulinum and tetanus neurotoxins，neurotransmission and biomedical aspects.New York：Plenum Press)。中和单克隆抗体，特别是如果属于人来源，会提供抗体的无限来源，并替代来自人或马的抗体的制备。
我们已经使用抗体噬菌体展示来生成能中和BoNT的单克隆抗体(Hoogenboom等(1991)Nucl Acids Res.，19：4133-4137；McCafferty等(1990)Nature，348：552-554；Skerra和Pluckthun(1988)Science，240：1038-1041)。使用从免疫的小鼠构建的噬菌体抗体文库，我们鉴别出2组单克隆，它们结合BoNT/A HC上的2种非重叠中和表位(Amersdorfer等(1997)Infect.Immun.，65：3743-3752)。在本实施例中，我们描述了从用五价肉毒杆菌类毒素(A-E)免疫的人志愿者构建的噬菌体抗体文库选择出的单克隆抗体的表征。将这些单克隆抗体识别出的亲和力和表位与用从未免疫人噬菌体文库选择的单克隆抗体识别出的亲和力和表位相比较。结果鉴别出了另外的中和表位，并提供了生成用于肉毒中毒预防和治疗的全人抗体的途径。
材料和方法：
免疫和未免疫V-基因抗体文库
为了构建免疫噬菌体抗体文库，人志愿者接受五价肉毒杆菌类毒素A-E型(Michigan Department of Public Health)的免疫接种。在0、2和12周，用0.5ml五价类毒素免疫志愿者，且1年后，用0.5ml类毒素加强。使用小鼠血清中和生物测定，测量抗BoNT/A的中和效价(Hatheway等(1984)J Infect Dis.，150：407-412)。通过在Histopaque1077中离心，分离PBL，并使用改进的Cathala等的方法(Cathala等(1983)DNA，2：329-335)，制备RNA。从用1.0x108B细胞制备的RNA，制备第一链cDNA，其中使用IgG恒定区引物(对于重链)或κ和λ恒定区引物(对于轻链)[26]。如(Marks等(1991)J Mol Biol.，222：581-597)所述，从第一链cDNA扩增VH、Vκ和Vλ基因。凝胶纯化PCR产物，从凝胶提取后进行乙醇沉淀，并如前所述用于构建scFv基因谱(同前)。凝胶纯化scFv基因谱，然后将其用作使用含有附加限制位点的侧接寡核苷酸进行再扩增的模板(同前)。凝胶纯化scFv基因谱(VH-Vκ、VH-Vλ)，用SfiI和NotI消化，用苯酚/氯仿提取，并连接进用SfiI和NotI消化的载体pCANTAB-5E(Pharmacia Biotech，Milwaukee，WI)(Sambrook等(1991)New York：Cold Spring HarborLaboratory)。用苯酚/氯仿提取连接混合物，乙醇沉淀，并电穿孔进50μl大肠杆菌TG1细胞(Gibson(1984)University of Cambridge：studieson the Epstein-Barr virus genome)。将细胞铺平板在含有100g/ml氨苄青霉素和1％(w/v)葡萄糖的TYE平板上。将菌落从平板刮到2ml 2x TY中，其中含有100μg/ml氨苄青霉素、1％(w/v)葡萄糖和15％(v/v)甘油，以在-70℃保藏。来自4次转化的产物产生了7.7x105个单个重组体的文库。对于未免疫文库，使用以前报道的噬菌体-展示的人单链抗体文库，它含有6.7x109个成员(Sheets等(1997)Proc Natl.AcadSci USA，95：6157-6162)。
噬菌体制备和选择
如(Marks等(1991)J Mol Biol.，222：581-597)以前所述的，通过用VCS-M13辅助噬菌体(Stratagene)拯救，制备来自2个文库的噬菌粒颗粒。纯化噬菌体颗粒，并通过2次PEG沉淀进行浓缩(Sambrook等(1991)New York：Cold Spring Harbor Laboratory)，重新悬浮于2ml磷酸缓冲盐水(PBS：25mM NaH2PO4，125mM NaCl，pH 7.4)中，并经0.45μm滤器(Nalgene)过滤，以达到约1013转导单位(TU)/ml的效价。
使用75mmx12mm免疫管(Nunc，Maxisorb)选择文库，所述免疫管用2ml溶于PBS，pH 7.4中的BoNT血清型A、B、C和E(各自50μg/ml)或BoNT/A HC(50μg/ml)在4℃包被过夜(Emanuel等(1996)J Immunol Meth.，193：189-97)。在室温(RT)，用溶于PBS中的2％脱脂奶粉封闭管1小时，然后如(Marks等(1991)J Mol Biol.，222：581-597)以前所述的，使用浓度为5.0x1012TU/ml的噬菌体，进行选择、洗涤和洗脱操作。500μl洗脱的噬菌体用于感染10ml对数期生长的大肠杆菌TG1，后者铺平板在2x TY-AMP-Glu平板上。拯救噬菌体，如上所述浓缩，并用于下一个选择轮次。拯救-选择-铺平板循环通常重复4轮。
ELISA筛选和指纹分析
每轮选择后，单个氨苄青霉素-抗性菌落用于接种微量滴定板孔，所述孔中含有150μl 2x TY-AMP-0.1％葡萄糖。使细菌生长，以达到A600约0.9，并通过加入异丙基-β-d-吡喃型硫代半乳糖苷(IPTG)至1mM的终浓度，诱导scFv表达(De Bellis和Schwartz(1990)Nucl AcidsRes.，18：1311)。在25℃，在摇动下，使细菌生长过夜，通过离心沉淀细胞，并收集含有可溶scFv的上清液。在用10μg/ml溶于PBS、pH 7.4中的抗原包被的96-孔微量滴定板(Falcon 3912)中，筛选scFv与BoNT和BoNT/A HC的结合。使用小鼠单克隆抗体9E10(1μg/ml)(Santa Cruz Biotechnology，CA)，它识别C-末端myc标记(Munro和Pelham(1986)Cell，46：291-300)，然后使用(Griffiths和Malmqvist(1993)EMBO J.，12：725-734)所述的过氧化物酶-缀合的抗-小鼠Fc抗体(Sigma)，检测源自未免疫文库的scFv。使用过氧化物酶-缀合的单克隆抗体抗-E(2.5μg/ml)(Pharmacia Biotech)，检测源自免疫文库的scFv。30分钟后，用NaF(3.2mg/ml)终止反应，并测量A405nm。通过PCR-指纹分析(Marks等(1991)J Mol Biol.，222：581-597)，然后通过来自每个指纹型的至少2个克隆的VH和VL基因的DNA测序，确定独特克隆的数目。使用10μg/ml的BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/E、BoNT/A HC和血清型A的重组易位结构域(BoNT/A HN)包被的孔，如上所述通过ELISA确定抗体的特异性。如果它们产生为背景的至少5倍的信号，则鉴定克隆是对选择的抗原特异性的。
scFv的亚克隆、表达和纯化
将通过ELISA测定的结合BoNT/A和BoNT/A HC的scFv抗体亚克隆进表达载体pUC119 Sfi-NotmycHis，从而产生在scFv的C-末端融合六组氨酸标记(Schier等(1995)Immunotech.，1：73-81)。如(Schier等(1996)J Mol Biol.，255：28-43)以前所述的，表达scFv，并通过固定化的金属亲和层析进行纯化，和分光光度地测定纯化的单体scFv的浓度，其中假定在1.0的A280nm与0.7mg/ml的scFv浓度关联。
表位作图和亲和力测定
使用表面等离振子共振，在BIAcore(Pharmacia Biosensor)中进行表位作图和动力学研究。在BIAcore流动室中，使用NHS-EDC化学(Johnson等(1991)Anal Biochem.，198：268-277)，将约600共振单位(RU)的BoNT/A HC(15μg/ml，溶于10mM乙酸钠中，pH 4.5)偶联到CM5传感器芯片上。该量偶联的BoNT/A HC导致scFv Rumax为100-175RU。结合scFv后，使用4M MgCl2再生表面。对于表位作图研究，测定对的每个成员结合的scFv的量(RU)，且然后将2种scFv混合到一起，产生的终浓度等于用于测量单一scFv的浓度(Amersdorfer等(1997)Infect.Immun.，65：3743-3752)。从在BIAcore中测得的结合速率常数(kon)和解离速率常数(koff)，计算scFv的Kd(Kd＝koff/kon)。使用浓度范围为50-1000nM的scFv，在5μl/分钟的连续流下，测量结合。从ln(dR/dt)/t与浓度的图，测定kon(Karlsson等(1991)J Immunol Meth.，145：229-240)。使用30μl/分钟的流速以阻止重新结合，从在最高浓度的分析的scFv处的传感器图的解离部分，测定koff。
体外生物测定
如(Desphande(1995)Toxicon，33：551-557)以前所述的，使用小鼠半膈制剂，进行体外中和研究。从雄性CD/1小鼠(25-33g)切除膈神经-半膈制剂，并悬浮于135mM NaCl，5mM KCl，1mM Na2PO4 15mMNaHCO3 1mM MgCl2 2mM CaCl2，和11mM葡萄糖中。使95％O2-5％CO2作泡状通过温育浴，并维持在36℃。在0.05Hz，以0.2ms持续时间的方波刺激膈神经。使用连接到图表记录器上的力位移转换器(Model FT03；Grass)，测量等长颤搐张力。将纯化的scFv抗体与BoNT/A在室温温育30分钟，然后加入组织浴，从而产生2.0x10-8M的终scFv浓度和2.0x10-11M的终BoNT/A浓度。将毒素诱导的麻痹定义为初始肌肉颤搐的50％减少。从抗体引起的50％减少值除以BoNT/A的50％减少的值，计算延长比。以各自2.0x10-8M的终浓度，研究3D12和C25的组合。通过双尾t检验，测定达到50％颤搐减少的时间之间的差异，认为P＜0.05是显著的。
肉毒杆菌毒素和肉毒杆菌毒素结构域的制备
从USAMRIID得到纯化的肉毒杆菌毒素血清型A、B、C和E(150kDa)。在大肠杆菌中表达肉毒杆菌毒素A型的结合结构域(BoNT/A HC)，并使用C-末端(His6)标记(Ophidian Pharmaceuticals，Inc.)，通过固定化的金属亲和层析(IMAC)进行纯化。肉毒杆菌毒素A型的易位结构域(BoNT/A HN)是R.Stevens博士(UC-Berkeley，CA)的赠品。
表10.选自免疫和未免疫噬菌体展示文库的BoNT结合性scFv的特异性
  scFv特异性   独特的scFv的数目
结果
合成免疫噬菌体展示文库的策略
来自用五价肉毒杆菌类毒素免疫的人志愿者的PBL，用于生成scFv噬菌体抗体文库。在小鼠中和生物测定(Hatheway等(1984)JInfect Dis.，150：407-412)中，供体多克隆血清对效价为2.56IU(国际单位)的BoNT/A是保护性的。从RNA扩增VH和VL基因，剪接到一起，以生成scFv基因谱，并克隆进pCANTAB-5E，以生成7.7x105转化体的噬菌体抗体文库。15个随机选择的克隆的PCR筛选表明，全部都携带全长插入片段，如通过种系基因特异性的轻链引物测得的，66％具有Vκ轻链，且34％具有Vλ轻链(未显示数据)。
噬菌体抗体文库的选择和ELISA筛选
在BoNT血清型A、B、C、E和BoNT/A HC上，选择免疫文库和大的未免疫人噬菌体抗体文库(Sheets等(1997)Proc Natl.Acad SciUSA，95：6157-6162)。在BoNT/A或BoNT/A HC上选择3轮后，ELISA阳性克隆的频率分别是79和100％来自免疫文库。对于其它血清型，观察到ELISA阳性的类似频率。在BoNT/A或BoNT/A HC上选择3轮后，ELISA阳性克隆的频率分别是28和94％来自未免疫文库。对于其它血清型，观察到ELISA阳性的类似频率。通过DNA指纹分析和随后DNA测序测定独特scFv的数目，并通过ELISA测定每种scFv的特异性。在筛选来自每个选择的100个菌落中，从免疫文库鉴别出48种独特抗体(23BoNT/A、16BoNT/B、6BoNT/C和3BoNT/E)，且从未免疫文库鉴别出27种独特抗体(14BoNT/A、5BoNT/B、5BoNT/C和3BoNT/E)(表10)。
通过ELISA，在重组BoNT/A HC和BoNT/A HN结构域上，测定每种BoNT/A scFv的细微特异性(图8)。在毒素上选择后分离的23种免疫BoNT/A抗体中，6种结合BoNT/A HC(3A6、3D12、2A1、3B8、3F10、2B11)，4种结合BoNT/A HN(3D4、3A11、4A4、3G4)(图8A)，且剩余的13种抗体推测结合轻链(Chen等(1997)Infect Immun.，65：1626-1630)。这些发现表明，肉毒杆菌类毒素的免疫接种指导朝向轻链的免疫应答，其中更少的抗体针对HC或HN结构域。
在BoNT/A HC上选择免疫文库，仅仅产生单一独特的抗体(2A1)，它与毒素选择的克隆3D12和3D6克隆相关(表11)。当分析6个抗-HC克隆的VL基因用法时，发现全部都使用Vκ1基因家族(表11)，尽管该文库含有2/3Vκ和1/3Vλ轻链基因。在BoNT/A全毒素上选择未免疫文库，产生4种抗体，但是它们都不结合BoNT/A HC。在BoNT/AHC上选择文库，产生10种独特的scFv，它们使用Vκ或Vλ轻链基因(表11)。总的来说，仅仅50％这样的scFv结合全毒素，这与HC表面的相当大部分埋入全毒素的观察相一致(Lacy等(1998)Nat StructBiol.，5：898-902)。所有scFv抗体都是血清特异性的和结构域特异性的，除了来自未免疫文库的克隆2B11以外，没有观察到交叉反应性，如通过ELISA测得的，所述克隆2B11结合BoNT/A HC和BoNT/A HN结构域(图8B)。
表11.在BoNT/A和BoNT/A HC上选择的、从免疫和未免疫文库分离的人scFv抗体的CDR 3-序列和亲和力a
Figure GSB00000347175700901
Figure GSB00000347175700911
a如V-BASE数据库(MRC Centre for Protein Engineering，Cambridge，UK)所详述的，指定人种系VH、Vκ和Vλ区段。列出的克隆(具有相同的VH或VL CDR 3区)表现出不同的CDR 1、CDR 2和构架区，正如它们来自种系基因的差异所指明的；可以从GenBank登记号AF090405-AF090420获得。
b在BoNT/A上选择的文库。
c在BoNT/A HC上选择的文库。
BoNT/A HC特异性的抗体片段的表位作图
对BoNT/A HC结合性scFv进行表位作图，以确定识别的非重叠表位的数目。在以导致芯片表面接近饱和和至少100RU的结合的scFv浓度，研究scFv对的BIAcoreTM中，使用表面等离振子共振进行表位作图。对于对中的每个成员，测定结合的scFv的量，然后将2种scFv混合到一起，产生的终浓度等于用于测量单一scFv的浓度。当一起注射时，识别相同表位的抗体表现出结合的RU的最小增加(图9A)，而识别不同表位的scFv表现出RU的加性增加(图9B)。如表2和3所示，scFv 3A6、3D12和2A1(称作聚簇I)共有VH和VL基因区段(分别是DP 50和L12)的高度同源性，并识别重叠表位。它们的序列差异仅在于通过体细胞突变导入的重链和轻链基因。scFv 3B8和3F10(称作聚簇II)形成第二组抗体，其结合与聚簇I相比不同的表位。由于较差的表达水平，不能分析代表可能的独特表位的克隆2B11。当分析源自未免疫文库的scFv抗体时，我们发现全部都结合独特的表位，称作聚簇III-XI，如表3所示。未免疫文库成员(聚簇III-XI)没有表现出与免疫文库成员(聚簇I和II)的重叠结合。被免疫和未免疫scFv识别的表位不与被2种以前报道的鼠scFv(C25和S25)结合的表位重叠(Amersdorfer等(1997)Infect.Immun.，65：3743-3752)。
动力学测量和中和测定
使用表面等离振子共振，在BIAcore中测量kon和koff，并用于计算平衡解离常数。从免疫文库选择的scFv具有3.69x10-8和7.8x10-9M的Kd，这些值与从杂交瘤生产的单克隆IgG的报道值相当(Foote和Milstein(1991)Nature，352：530-532)(表12)。未免疫scFv具有更低的Kd，其范围为4.6x10-7至2.61×10-8M。为了确定scFv中和毒素诱导的神经性麻痹的能力，使用膈神经-半膈制剂，在来自每个表位聚簇的一个代表性成员上进行体外研究。对于单独的BoNT/A和在有2.0x10-8M scFv存在下，将值报道为达到50％颤搐减少的时间。如表12和图10A和10B所示，发现了中和不同抗-BoNT/A HC scFv的显著差异，这取决于使用哪种文库。从免疫文库中，3D12(聚簇I)明显延长达到神经性麻痹的时间1.5倍，而3F10(聚簇II)没有表现出对毒素中和的作用。未免疫文库(聚簇III-XI)的代表在半膈测定中没有表现出保护作用，甚至在与终浓度为1.8x10-7M的聚簇III-XI所有成员组合后。当使用3D12(聚簇I)与以前分离的鼠scFv(C25)(Amersdorfer等(1997)Infect.Immun.，65：3743-3752)的组合时，达到麻痹的时间显著增加至3.2倍，从而证实了对毒素中和的协同作用。我们用鼠scFv S25和3D12观察到了类似的协同作用(未显示数据)。
表12.选自噬菌体抗体文库的scFv的亲和力、结合动力学和体外毒素中和结果
Figure GSB00000347175700931
a通过表面等离振子共振，测量变量kon和koff，并将Kd计算为koff/kon。
b与单独的BoNT/A的时间相比，使用20nM scFv+20pM BoNT/A在小鼠半膈测定中达到50％颤搐减少的时间(分钟)。每个值是至少3次观测值的平均值±S.E.M.
c在BoNT/A上选择的文库。
d与BoNT/A相比P＜0.01。
e不显著。
f在BoNT/A HC上选择的文库。
g与BoNT/A HC相比P＜0.01。
讨论
我们以前证实，用BoNT/A HC的重组结合结构域免疫接种小鼠，指导朝向产生抗体的免疫应答，所述抗体结合参与HC结合突触前毒素受体的表位(Amersdorfer等(1997)Infect.Immun.，65：3743-3752)。这些实验表明，scFv对毒素的中和，可以与scFv亲和力和与全毒素竞争受体结合位点的能力相关联。在这里，我们使用免疫和未免疫噬菌体展示文库进行了更系统的方法，以对BoNT/A的人体液免疫和未免疫应答作图。2个抗体文库的抗体基因来源是，(a)用五价类毒素(A-E)免疫的人志愿者的PBL，和(b)未免疫外周血淋巴细胞和脾细胞。该方法的一个限制是，用于这些研究的一种免疫人供体代表暴露于肉毒中毒后产生的广泛遗传多样性的程度。小鼠和人中的体液免疫应答导致非常有限数目的保护性表位的事实，暗示着赋予保护的抗原表位的相当保守。选择操作包含，针对4种固定化的肉毒杆菌神经毒素血清型A、B、C和E，淘选2个组合文库。3-4个淘选循环后，从2个文库得到针对每个血清型的抗体，频率递减的次序是，BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C和BoNT/E。对于未免疫文库，也观察到结合剂的类似频率，例外是BoNT/B。这些结果与Siegel(Siegel(1989)J ClinMicrobiol.，26：2351-2356)的发现相关联，在后者中，他们研究了来自25个肉毒杆菌五价类毒素的人受体的血清样品。通过小鼠血清中和生物测定，测定各种血清型的免疫原性：血清型A的范围是5.7-51.6IU/ml，其次血清型B是0.78-18IU/ml，且血清型E是0.61-10IU/ml。
人免疫接种类毒素导致抗体的产生，所述抗体主要针对毒素轻链，少数抗体结合HC。在用BoNT/A HC免疫接种小鼠、随后用全毒素加强后，观察到类似的结果。由于抗体中和活性主要源自HC对细胞受体结合的封闭，所以这些分析表明，HC疫苗比基于毒素的疫苗更有保护性，因为产生了更多的HC抗体。人免疫HC scFv识别至少2种非重叠表位。结合这些表位(聚簇I)之一的scFv，可以体外中和毒素。当scFv结合聚簇I与结合2种非重叠HC表位之一的免疫小鼠scFv相组合时，毒素中和的效力增加。该结果表明，HC与多种细胞受体对接，或对接发生在广表面区域(Mullaney等(2001)Infect Immun.，69：6511-6514)。
通过在BoNT/A上选择大的未免疫文库，可以将识别HC的人scFv谱延伸到其它表位(聚簇III-XI)的范围。令人感兴趣地，该结果与下述概念相一致，即基本免疫谱含有能识别大多数溶剂可接近的抗原区域的抗体，但是免疫接种指导识别有限数目的免疫显性的表位。但是，从未免疫文库得到的所有抗体都针对非中和表位(或至少不体外中和毒素)。不能中和的一种解释是，由于与毒素对它的受体的0.3-2.3nM的高亲和力相互作用相比，抗体对HC结构域(例如2B10、2E6、2B1、3D1)的107至460nM的低亲和力(Schengrund(1999)J Toxicol ToxinRev.，18：35-44)。
总之，我们在这里报道，使用从免疫和未免疫人供体制备的组合文库，成功地分离了针对肉毒杆菌神经毒素和它们的亚结构域的特异性人抗体。使用噬菌体展示来筛选具有感染性疾病或病原体的任意人的抗体谱，允许我们接近具有治疗和研究潜力的人单克隆抗体的非常大的库。
实施例4
进化更高亲和力的中和抗体
为了改善肉毒中毒的检测和治疗，使用分子进化和酵母展示来增加2种中和单链Fv(scFv)抗体结合BoNT血清型A(BoNT/A)HuC25和3D12的亲和力。
mAb HuC25的亲和力成熟
使用一系列突变型酵母展示文库，顺序增加HuC25对BoNT/A的亲和力(图20)。首先，将HuC25基因亚克隆进酵母展示载体pYD2，作为NcoI-NotI片段。scFv基因成功地展示在酵母表面上，且通过流式细胞术测得，展示的scFv对纯BoNT/A的KD是8.44x10-10M(图21)。这与以前使用SPR在BIAcore中测量的纯化的HuC25 scFv结合重组BoNT/A HC的KD(1.4x10-9M)相当。然后，使用易错条件，通过PCR随机突变HuC25 scFv基因，且使用缺口修复，将得到的基因谱克隆进pYD2，以生成2.0x105转化体的文库(图20)。使文库生长，诱导，然后通过流式细胞术分析scFv展示频率(27％)和抗原结合频率(3.65％)。
然后，使用递减浓度的纯BoNT/A，对文库进行4轮选择。从在最后一轮分选后得到的6个单个菌落，PCR扩增scFv基因，从而揭示了1个独特序列AR1的存在(图18)。使AR1克隆生长，诱导scFv展示，且测得展示的scFv对BoNT/A的KD是1.69x10-10M，为HuC25的5倍(图21)。
为了进一步增加亲和力，基于AR1的序列，构建了2个突变型酵母展示文库。对于1个文库，使用易错PCR，随机诱变AR1 scFv基因；对于第2个文库，使用定点诱变来使L3中的4个氨基酸(SNED)多样化。选择该环进行诱变，因为从AR1的选择表明，这里的突变可以增加亲和力，且该易错方法可能没有完全抽样该环中的突变。对于每个文库，进行4轮选择，通过用纯化的BoNT/A进行标记，然后在有阻止重新结合的BoNT/A结合结构域(HC)存在下解离12小时，进行最后一轮解离速率选择。然后，使用结合毒素的催化结构域的mAb(7C1)，分选BoNT/A标记的酵母。从最后一轮分选筛选单个菌落，仅仅揭示了位点定向文库的野生型AR1序列，从而表明L3已经被最优化。从易错的文库，分离出单个独特克隆(AR2，图18)，测得其酵母展示的scFv的KD是6.14x10-11M，是亲本AR1的2.8倍(图21)。
生成了另一个酵母展示文库，以进一步增加AR2的亲和力。它们包括其中将随机突变导入AR2基因的文库，和基于AR2序列的2个位点定向文库，它们的不同之处在于H1中的5个氨基酸或L2中的4个氨基酸。使用为选择AR1所述的策略，在纯BoNT/A上选择文库，对单个菌落测序，并测量独特的酵母展示的scFv的亲和力。从易错的文库或L2突变体文库，没有鉴别出更高亲和力的克隆。从H1文库鉴别出了2个更高亲和力的克隆(图18)，AR3和AR4(KD为1.9和2.3x10-11M，为AR2的亲和力的约3倍，图21)。
mAb 3D12的亲和力成熟
对于亲和力成熟，将3D12 scFv基因作为来自噬菌粒载体pCANTAB5E的NcoI-NotI片段克隆进酵母展示载体pYD2。然后，在易错条件下，使用PCR将随机突变导入3D12 scFv基因，并使用缺口修复，将得到的基因谱克隆进pYD2，以生成2.1x106转化体的文库。使文库生长，诱导，然后通过流式细胞术分析scFv展示频率(27％)和抗原结合频率(3.65％)。然后，使用递减浓度的BoNT/A，对文库进行5轮选择。通过用纯化的BoNT/A进行标记，然后在有阻止重新结合的BoNT/A结合结构域(HC)存在下解离15小时，进行最后一轮解离速率选择。然后，使用结合毒素的催化结构域的mAb(7C1)，分选BoNT/A标记的酵母。从最后一轮分选后得到的6个单个菌落，PCR扩增scFv基因，从而揭示了3个独特序列的存在(表13，克隆3-1(也称作RAZ1，图19A)、3-8和3-10)。使每个独特克隆生长，诱导scFv展示，且使用流式细胞术，测量展示的scFv和野生型3D12 scFv对BoNT/A的KD。所有3种突变型scFv都具有比野生型3D12scFv更高的亲和力。对于最高亲和力的scFv(RAZ1，KD，在图21中)，突变完全位于VL内，在CDR 1、2和3中(图19A)。
表13.亲和力成熟的和/或修饰的抗体的氨基酸序列
Figure GSB00000347175700981
Figure GSB00000347175700991
Figure GSB00000347175701001
*完整重链的序列是重链构架1+CDR1+构架2+CDR2+构架3+CDR3+构架4。
完整轻链的序列是轻链构架1+CDR1+构架2+CDR2+构架3+CDR3+构架4。酵母展示的scFv向IgG的转化对亲和力的影响
对于许多免疫测定以及体内中和研究而言，必需使用IgG。因此，我们通过将VH和Vk基因顺序克隆入由双CMV启动子驱动的哺乳动物表达载体，将HuC25、AR1、AR2、AR3、AR4、3D12和RAZ1转化为由人γ1恒定区和人κ恒定区组成的全长IgG。为7种抗体中的每一种，确立稳定的CHO DG44细胞系，并从细胞培养上清液纯化IgG，7种抗体中的6种的得率为5-20mg/L。我们不能表达任何显著量的AR3IgG。
通过动态排除分析(Kinexa)，测量每种IgG的亲和力。HuC25突变体家族和RAZ1作为IgG的亲和力显著高于酵母展示的scFv，但是IgG亲和力的相对增加，与在酵母展示的scFv上测得的相对亲和力相一致(表14)。例如，通过酵母展示测得，AR4 scFv的亲和力为HuC25scFv的37倍，且如通过Kinexa测得的，AR4IgG的亲和力为HuC25IgG的34倍。通过酵母展示测得，RAZ1 scFv的亲和力为3D12 scFv的45倍，且如通过Kinexa测得的，RAZ1 IgG的亲和力为3D12 IgG的35倍。
表14.抗体对A1和A2毒素的亲和力
  抗体   对Hall(A1)毒素的KD  对Honey(A2)毒素的KD
  HuC25   1.24nM  250nM
  AR1   200pM  100nM
  AR2   47pM  ND
  WR1(V)   450pM  9.0nM
  WR1(T)   310pM  3.7nM
  3D12   940pM  2.2nM
  3D12.3-1(RAZ1)   17pM  70pM
  3D12.3-8   21pM  67pM
  3D12.3-10   28pM  81pM
亲和力对通过流式细胞术检测BoNT/A的影响
与更低亲和力的酵母展示的scFv相比，在酵母上展示的更高亲和力的scFv能检测明显更低浓度的BoNT/A(图22)。最高亲和力的scFv(AR4)能检测少至0.1pM的BoNT/A，该值低于其它未扩增的BoNT检测系统的报道值。因而，该结果验证了递增的抗体亲和力在增加检测灵敏度中的应用。
亲和力对BoNT/A中和的影响
在体内小鼠中和测定中，研究了野生型和更高亲和力的抗体。对于单一抗体，更高亲和力导致用腹膜内BoNT/A攻击的小鼠的保护中的小(约2倍)增加(图23)，最高亲和力AR4抗体提供抗100只小鼠LD50的毒素的完全保护，但是不能抗200LD50。当组合2种抗体时，保护显著增加，其中AR4+3D12的组合提供保护的约2倍增加，从2500LD50至5000LD50。当用RAZ1替代抗体对中的3D12时，观察到AR4和RAZ1的组合的保护为10,000只小鼠LD50。因而数据表明，在抗体组合中使用更高亲和力的抗体导致更有效的毒素中和。对于3种抗体的组合，这更明显(表15)。
表15.抗体组合的中和效力
Figure GSB00000347175701021
这里，在HuC25/B4/3D12或RAZ1的组合中，用更高亲和力RAZ1替代3D12，提供了在10,000LD50攻击剂量的毒素的完全保护。在组合中使用野生型3D12时，没有小鼠在10,000LD50的攻击后存活。用更高亲和力ING1替代B4、并用更高亲和力CR1替代HuC25，允许抗体剂量从50ug降低至1ug，在10,000LD50攻击剂量的毒素仍然保持80％存活。因而，增加在抗体组合中使用的单一抗体的亲和力，增加效力并允许降低抗体剂量。
实施例5
肉毒杆菌神经毒素血清型内的序列变异影响抗体结合和中和材料和方法
毒素基因序列：
搜索NCBI数据库和Medline，以鉴别肉毒杆菌神经毒素基因或蛋白的公开的或存档的序列。为该工作(手稿在准备中)，将梭菌品系FRI-A2H的神经毒素基因测序。梭菌品系的神经毒素基因序列是Michael Peck的赠品。使基因序列进入Vector NTI(Invitrogen，SanDiego，CA)，翻译，根据血清型分类，和比对。使用ClustalW，构建系统树。
毒素和抗体：
纯化的纯的和复合的肉毒杆菌神经毒素A1(Hall hyper)和A2(FRI-A2H)购自Metabiologics Inc(Madison，WI)。抗体S25和C25源自从免疫的小鼠的V-基因构建的单链Fv噬菌体展示文库(Amersdorfer等(1997)Infect.Immun.65：3743-3752；Nowakowski等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99：11346-50)。抗体3D12源自从免疫的人志愿者供体的V-基因构建的单链Fv噬菌体展示文库(Amersdorfer等(2002)Vaccine 20：1640-1648；Amersdorfer等(1997)Infect.Immun.65：3743-3752)。抗体B4源自从免疫的对于人免疫球蛋白基因座转基因的小鼠(Xenomouse)(I.Geren和J.D.Marks，提交的)的V-基因构建的单链Fv噬菌体展示文库。如(Nowakowski等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99：11346-50)以前所述的，将这4种抗体中的每一种的V-基因克隆进含有人IgG1和κ恒定区的哺乳动物表达载体。确立稳定的CHO DG44细胞系，并如(Nowakowski等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99：11346-50)以前所述的使用G蛋白，纯化IgG。通过SDS-PAGE和在280nm的吸光度测定抗体纯度和浓度。抗体9D8(鼠IgG1/κ)和7C1(鼠IgG1/κ)源自从用rBoNT/A HC免疫、并用BoNT/A毒素加强的小鼠产生的杂交瘤。使用G蛋白从杂交瘤上清液纯化IgG，并通过SDS-PAGE和BCA测定(Pierce Chemical Co.)测定纯度和浓度。对于后续研究，以约1-3mg/ml将IgG抗体保藏在PBS，pH 7.4中。
毒素捕获ELISA：
对于毒素捕获ELISA，给96孔微量滴定板(Immunolon 2，Dynatech)包被2μg/ml的抗体，在4℃过夜。在5％脱脂乳-PBS中封闭30分钟后，将毒素一式两份地应用于100nM至1pM的半对数(half-log)稀释物，并在37℃温育90分钟。洗涤平板，并与稀释至0.2IU/ml的马抗-BoNT抗体(PerImmune)温育60分钟，然后洗涤，并与缀合到辣根过氧化物酶(KPL)上的山羊抗-马抗体的1∶1000稀释物温育60分钟。用ABTS(KPL)使平板显影。相对于毒素浓度，绘制减去背景对照后在405nm的平均吸光度的图。
测量毒素的抗体亲和力：
使用表面等离振子共振，在BIAcore 1000(Pharmacia Biosensor)中测量纯化的BoNT/A1或A2毒素的IgG结合和解离速率常数，并如(Nowakowski等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99：11346-11350)以前所述的，用于计算KD。简而言之，使用NHS-EDC化学，将约100-400RU的纯化的IgG(10-20ug/ml，溶于10mM乙酸盐中，pH3.5-4.5)偶联到CM5传感器芯片上。使用浓度范围为50nM-800nM的毒素，在15μl/分钟的连续流下，测量纯化的BoNT/A1或A2神经毒素的结合速率常数。从(ln(dR/dt))/t与浓度的图，确定结合速率常数(kon)。从使用30μl/分钟的流速来预防重新结合分析的最高毒素浓度处的传感器图解离部分，确定解离速率常数(koff)。将KD计算为koff/kon。
体内毒素中和的测量：
将50微克适宜的IgG加入指示数目的小鼠LD50的BoNT/A1神经毒素复合物(Hall品系)或BoNT/A2神经毒素复合物(FRI-A2H品系)，总体积为0.5ml的明胶磷酸盐缓冲液，且在室温温育30分钟。对于mAb对，加入25μg每种mAb，且对于3种mAb的组合，加入16.7μg每种mAb。然后，将混合物腹膜内地注射进雌性CD-1小鼠(接收16-22g)。将小鼠分成10只的组进行研究，且至少每天观察。注射后5天，测定最终的死亡记数。按照动物福利法案(Animal WelfareAct)和关于动物和涉及动物的实验的其它联邦法规和规章，并遵守Guide for the Care and Use of Laboratory Animals，National ResearchCouncil，1996所述的原则，使用小鼠进行研究。进行该研究的设施，得到了Association for Assessment and Accreditation of LaboratoryAnimal Care International的完全授权。
结果
肉毒杆菌神经毒素血清型内的序列变异
为了确定毒素血清型内序列变异性的程度，检索文献，从而揭示了60个公开的神经毒素序列。该数据包括49个完整毒素基因序列和11个部分毒素基因序列(表16)。根据血清型将49个完整序列分类，比对，并测定序列同一性的程度(表17和图11)。在分析的49个序列中，有7个BoNT/A、9个BoNT/B、6个BoNT/C、5个BoNT/D、17个BoNT/E、4个BoNT/F和1个BoNT/G。在血清型内，观察到2类毒素基因序列；事实上彼此相同的那些(见下文)，和在氨基酸水平相差至少2.6％的那些。在所有6种血清型内，观察了这样的序列变异性，其中超过1个毒素基因已经被测序(BoNT A、B、C、D、E和F)。在血清型内，变异性范围从BoNT/F的高达32％至BoNT/E的低至2.6％(表17)。对3种BoNT C/D和2种BoNT D/C嵌合品系进行测序。这些品系通常含有与它们的亲本血清型匹配的轻链和N末端重链，神经毒素序列的末端三分之一与嵌合体的替代血清型具有强的、但不是绝对的同一性(表16)。
表16.用于序列分析的梭菌品系。登记号来自NCI核苷酸数据库。
Figure GSB00000347175701061
Figure GSB00000347175701071
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表17.梭菌肉毒杆菌神经毒素基因序列的分类。根据氨基酸水平至少2.6％的差异，定义亚型。
  血清型   完整序列   部分序列   亚型   血清型内的最小和最大氨基酸差异
  A   7   2   10.1％
  B   9   3   4   3.6-7.7％
  C   6   2   24.0-24.2％
  D   5   2   23.7-23.9％
  E   17   6   3   2.6-5.1％
  F   4   2   4   10.7-31.6％
  G   1   1
  总计：   49   11   18
表18.BoNT A1和A2品系之间的百分比氨基酸同一性
Figure GSB00000347175701081
基于DNA和蛋白同源性，可以将9个公开的BoNT/B序列分成4个亚型(图13)。这些组包括二价BoNT/B(BoNT Ab 1436、BoNT Ab588、BoNT Ab 593和BoNT Bf 3281)、BoNT/B1(BoNT/B Danish)、BoNT/B2(BoNT/B品系111)和非蛋白水解的BoNT/B(BoNT/BEklund)。这些毒素彼此在氨基酸水平的差别是3.6％-7.7％，与轻链相比，重链的差异更大(表19)。
表19.BoNT B品系中的百分比氨基酸同一性
  全毒素   轻链   重链   HN   HC
  BoNT B1 vs：
  BoNT B2   95.7   99.5   93.6   95.8   91.8
  BoNT B np   92.8   97.7   90.2   92.5   88.2
  BoNT B二价   96.0-96.4   98.9-99.1   94.6-94.9   94.3-95.0   94.7-94.9
BoNT/A毒素序列变异和抗体结合的影响
为了确定BoNT/A毒素序列变异性对免疫识别的影响，我们通过捕获ELISA，测量了针对BoNT/A1产生的6种单克隆抗体结合BoNT/A1和BoNT/A2的能力。测定了与纯的神经毒素和神经毒素复合物的结合。如通过重组HC上的ELISA测得的，4种mAb(3D12、C25、B4和S25)结合BoNT/A HC上的非重叠表位。以前已经将3D12和S25表位作图到BoNT/A HC的C-末端亚结构域，而C25识别由2个HC亚结构域形成的复合物表位(Mullaney等(2001)Inf.Immun.，69：6511-6514)。如通过重组HN上的ELISA测得的，1种mAb(9D8)结合BoNT/A易位结构域(HN)(未显示数据)。如通过重组轻链上的ELISA测得的，1种mAb(7C1)结合BoNT/A轻链。
结合BoNT/A HC的4种抗体中的3种表现出与BoNT/A1毒素的结合比与BoNT/A2毒素的结合显著降低(图14)。相反地，不结合HC的mAb在A1和A2毒素上表现出相当的ELISA信号(图15)。为了定量结合A1和A2毒素的差异，测量了每种mAb与纯化的A1和A2毒素的结合的平衡解离常数和结合速率动力学(表17)。所有mAb都以高亲和力(KD范围为6-0.17nM)结合A1毒素。通过捕获ELISA证实了降低的与A2毒素的结合的3种mAb(C25、S25和B4)，表现出的与A2毒素的亲和力比与A1毒素的亲和力减少了553至超过1200倍。由于非常低亲和力的结合，不可能测量B4mAb结合BoNT/A2的KD。大部分亲和力减少是由于结合速率常数的大幅降低(表20)。相反地，3种mAb(3D12、9D8和7C1)表现出相当的对A1和A2毒素的高亲和力。
表20.BoNT/A IgG结合BoNT/A1和BoNT/A2的结合(kon)和解离(koff)速率常数和平衡解离常数(Kd)。通过表面等离振子共振，在BIAcore中测定结合和解离速率常数，并将KD计算为koff/kon。NM＝不可测
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抗体结合对A1和A2神经毒素中和的影响
我们以前研究了这里所述的3种mAb(3D12、S25和C25)对BoNT/A1毒素的体内中和能力。尽管表现出BoNT/A1的显著体外中和，但这3种mAb都没有表现出对接受50ug抗体和用20只小鼠LD50的BoNT/A1攻击的小鼠的显著体内保护(仅10-20％存活，(Nowakowski等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99：11346-11350))。类似地，当用20只小鼠LD50的BoNT/A1攻击小鼠时，这里报道的剩余3种mAb都没有表现出显著的体内保护(仅10-20％存活，未显示数据)。因为我们以前报道了当组合mAb时体内保护的显著协同作用，所以我们研究了mAb对和三联体体内中和毒素的能力。如以前观察到的，抗体对表现出比单一mAb明显更大的BoNT/A1中和，对于3种mAb的组合，观察到甚至更大的效力(图16和17A)。对于包含仅1种结合结构域抗体(C25+9D8)或没有结合结构域抗体(9D8+7C1)的mAb对(图16)，或包含仅1种结合结构域抗体(C25+9D8+7C1)的3种mAb的组合(图17A)，观察到了协同作用。关于BoNT/A2毒素的中和，仅含有以高亲和力结合BoNT/A2的mAb的mAb对或三联体，表现出显著的中和协同作用(图17B)。最有效的mAb三联体(3D12+9D8+7C1)能完全保护小鼠抗10,000只小鼠LD50的A1或A2毒素攻击。尽管该组合(3D12+9D8+7C1)不如3种结合结构域mAb的组合(C25+3D12+B4)一样有效地中和A1毒素，但仅一种结合结构域mAb以任意的亲和力结合A2毒素，且结果，C25+3D12+B4三联体中和低于200只小鼠LD50的A2毒素。
讨论
分析49个完整的公开的肉毒杆菌神经毒素序列，揭示了在血清型内，毒素基因序列是事实上相同的，或在氨基酸水平彼此相差至少3.6％。我们已经将具有该最小差异(3.6％)的那些毒素称作给定血清型的亚型。这样的分析揭示了6种血清型的平均2.8种亚型，其中超过一个毒素基因已经被测序(范围2-4亚型/血清型)。尽管该分析可能揭示最常见的毒素亚型，但在对相当小量的毒素基因测序的情况下(平均8个毒素基因/血清型)，可能鉴别其它毒素亚型。
毒素亚型的重要性，是它们对诊断试验和毒素治疗剂的开发的影响。显然，该水平的核苷酸多态性可以影响基于DNA探针的测定，例如PCR。重要的是，氨基酸置换的程度，可以影响用于ELISA的单克隆抗体的结合和基于其它免疫学的诊断试验。我们已经清楚地表明，BoNT/A1和BoNT/A2亚型之间的10％氨基酸差异对分析的6种单克隆抗体中的3种的结合亲和力和ELISA信号具有显著作用。令人感兴趣地，减少的mAb亲和力的动力学基础，很大程度上是由于结合速率常数的减少，而不是解离速率常数的增加。尚不清楚毒素氨基酸序列的差异对多克隆抗体的结合的影响。显然，需要使用不同毒素的亚型，验证基于免疫识别的毒素测定。
结合亲和力的差异转化成体内毒素中和效力的显著差异。由于我们没有观察到单一mAb的有效的体内毒素中和，所以我们研究了毒素序列变异对mAb组合的效力的影响。如同结合研究一样，仅牢固地结合A1和A2亚型的mAb组合有效地体内中和毒素。因而，在基于抗体的毒素治疗的开发中，无论这样的治疗是寡克隆的还是多克隆的，都必须评价亚型变异性对效力的影响。类似地，可能需要评价基于单一亚型的毒素疫苗的抗相关亚型的保护能力。
在这些研究中未预料到的发现是，结合BoNT的易位结构域和/或催化结构域的mAb具有中和活性，无论是在彼此组合时，还是在与识别BoNT受体结合结构域(HC)的mAb组合时。还已经报道了结合破伤风毒蛋白(Kozaki等(1995)Microbiol.Immunol.，39：767-774)和蓖麻毒蛋白(Lang等(1993)J.Immunol.151：466-472)的催化结构域的mAb的中和活性。由于不结合BoNT受体结合结构域的mAb不能严格阻断BoNT结合结构域表位与细胞受体的相互作用和随后的BoNT胞吞作用，所以尚不清楚它们为中和作出贡献的机理。可能的机理包括，在结合多个mAb后，增强BoNT从循环中的清除(Montero-Julian等(1995)Blood 85：917-924)，通过空间作用干扰受体结合，干扰需要的细胞内毒素加工(内体逃脱或催化活性)(Koriazova和Montal(2003)Nat.Struct.Biol.，10：13-18)，和/或改变细胞内BoNT运输。无论机理如何，非结合结构域mAb中和毒素的能力显著增加可用于中和mAb产生的表位的数目，从而增加发现结合和中和所有BoNT亚型的mAb的可能性。
尽管我们仅研究了序列变异性对抗体结合和单一血清型(BoNT/A)的中和的影响，但3种血清型(BoNT/C、D和F)具有亚型，它们彼此的差异为BoNT/A1和BoNT/A2之间超过10％的差异(10.7％-31.6％)。对于这3种血清型，序列变异性对免疫识别的影响可能大于BoNT/A。对于2种血清型(BoNT/B和E)，序列变异性低于对BoNT/A观察到的(2.6％-7.6％)。需要评价该水平的序列变异性的影响，但是显然在一定范围内其可影响mAb结合，如在MAb结合BoNT/B毒素的以前评价中所表明的(Gibson等(1988)J.Appl.Bacteriol.，64：285-291；Kozaki等(1998)Infect.Immun.，66：4811-4816)和BoNT E(Kozaki等(1986)Infect.Immun.，52：786-791)。
总之，我们报道了在7种肉毒杆菌神经毒素血清型中的6种中存在相当大的序列变异性，并表明该水平的变异性可以显著影响抗体结合和中和。测定这样的毒素多样性的完整范围，是开发免疫学肉毒杆菌毒素测定、治疗剂和疫苗的重要步骤。一旦已确定了序列变异性，就可能需要生产一些这样的毒素变体，以用于检测测定、治疗剂和疫苗的验证。
实施例6
为BoNT/A亚型A1、A2和A3的交叉中和选择和进化的中和抗体
肉毒杆菌神经毒素的不同亚型(包括BoNT/A)的发现，为诊断和治疗性抗体的开发提出了挑战。理想地，mAb或mAb混合物会结合和检测/中和大部分或所有的不同BoNT亚型。这会产生不会错过一些亚型的检测的检测系统。对于治疗性抗体，交叉反应性确保抗体成功地中和一种或多种亚型。
结合BoNT/A1和BoNT/A2的抗体的选择
为了生成能结合BoNT/A1和BoNT/A2的单克隆抗体，顺序选择了免疫噬菌体或酵母scFv抗体文库，首先在BoNT/A1上，然后在BoNT/A2上。多轮选择后，筛选噬菌体或酵母抗体对两种BoNT亚型的结合。鉴别出以相当的亲和力结合BoNT/A1和BoNT/A2两者的2种scFv抗体(ING1，scFv KD BoNT/A1＝1.17X10-9M；scFv KDBoNT/A2＝1.18x10-9M：和ING2，scFv KD BoNT/A1＝4.17X10-10M；scFv KD BoNT/A2＝4.5x10-10M。ING1和ING2的序列参见表13。对于体内研究，将这2种scFv转化成IgG。IgG维持对A1和A2 BoNT两者的高亲和力结合(表21)。
表21.以高亲和力结合BoNT/A1和A2两者的交叉反应性IgG的亲和力。通过流式荧光测定法，测定亲和力和结合动力学。
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能高亲和力地结合BoNT/A1和A2两者的HuC25变体的生成
HuC25和它的更高亲和力的衍生物都不高亲和力地结合BoNT/A2(AR2对boNt/A1和BoNT/A2的亲和力，参见表22)。为了增加对BoNT/A2的亲和力，我们从更高亲和力变体AR2开始。该抗体作为IgG对BoNT/A2的亲和力比对BoNT/A1低超过10,000，对BoNT/A2的非常低的亲和力是2.0x10-7M(表22)。
表22.AR2 IgG和酵母展示的scFv对BoNT/A1和BoNT/A2的亲和力和结合动力学
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使用掺料寡核苷酸或易错PCR，生成AR2突变体文库，并将突变体作为scFv展示在酵母表面上。对文库进行系列选择，首先在BoNT/A1和BoNT/A2上，从而产生突变体WR1(T)，KD BoNT/A2＝3.7nM，WR1(V)，KD BoNT/A2＝9.0nM和CR1 KD BoNT/A2＝850pM(序列见表20)。将最高亲和力scFv(CR1)转化成IgG，其对BoNT/A2毒素的亲和力为亲本AR2 IgG的约80倍，同时也使它对BoNT/A1的亲和力增加约10倍(表23)。为了进一步增加对BoNT/A2的亲和力，随机地突变CR1 scFv基因，在酵母上展示，并在BoNT/A1和BoNT/A2上顺序选择更高亲和力scFv，从而产生突变型CR2(序列参见序列表或表13)。转化成IgG后，CR2对BoNT/A2的亲和力为CR1的约6倍，并维持对BoNT/A1的高亲和力结合(表23)。
表23.通过流式荧光测定法测得的AR2、CR1和CR2 IgG对BoNT/A1和BoNT/A2的亲和力和结合动力学
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对BoNT/A2具有更高亲和力的抗体高效力地中和BoNT/A2
在实施例5中，表明50ug抗体HuC25、B4和3D12的组合会中和40,000只小鼠LD50的BoNT/A1，但是低于200LD50的BoNT/A2。B4和HuC25都不高亲和力地结合BoNT/A2。因此，我们研究了源自HuC25、但是对BoNT/A1和BoNT/A2具有高亲和力的CR1抗体的中和BoNT/A1和BoNT/A2的能力，所述CR1抗体与RAZ1和ING1或ING2任一种相组合。使用50ug总抗体的抗体剂量，CR1+RAZ1+ING1或ING2任一种的组合完全保护用40,000只小鼠LD50的BoNT/A1攻击的小鼠。相同剂量的抗体表现出对用BoNT/A2攻击的小鼠的显著保护，其中组合CR1+RAZ1+ING1是最有效的，其完全保护用40,000只小鼠LD50的BoNT/A2攻击的小鼠(图25)。因而，我们已经表明，可以生成以及进化以高亲和力结合多种BoNT亚型(在该情况下BoNT/A1和A2)的抗体，且当组合抗体时，这导致有效的中和。
应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于解释目的，且本领域技术人员会提出参考它们的各种修改或变化，且其包含在本申请的精神和范围、和所附权利要求书的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请，都在本文中为所有目的整体引作参考。
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Claims (18)

1.与肉毒杆菌神经毒素(BoNT)结合的经分离抗体，其中所述的抗体包含：
a)SEQ ID NO：49的氨基酸序列组成的VH CDR1；
b)SEQ ID NO：51的氨基酸序列组成的VH CDR2；
c)SEQ ID NO：75的氨基酸序列组成的VH CDR3；
d)SEQ ID NO：105的氨基酸序列组成的VL CDR1；
e)SEQ ID NO：107的氨基酸序列组成的VL CDR2；和
f)SEQ ID NO：131的氨基酸序列组成的VL CDR3；或
g)SEQ ID NO：49的氨基酸序列组成的VH CDR1；
h)SEQ ID NO：51的氨基酸序列组成的VH CDR2；
i)SEQ ID NO：75的氨基酸序列组成的VH CDR3；
j)SEQ ID NO：109的氨基酸序列组成的VL CDR1；
k)SEQ ID NO：111的氨基酸序列组成的VL CDR2；和
l)SEQ ID NO：134的氨基酸序列组成的VL CDR3。
2.如权利要求1所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含：
a)SEQ ID NO：49的氨基酸序列组成的VH CDR1；
b)SEQ ID NO：51的氨基酸序列组成的VH CDR2；
c)SEQ ID NO：75的氨基酸序列组成的VH CDR3；
d)SEQ ID NO：105的氨基酸序列组成的VL CDR1；
e)SEQ ID NO：107的氨基酸序列组成的VL CDR2；和
f)SEQ ID NO：131的氨基酸序列组成的VL CDR3。
3.如权利要求1所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含：
a)SEQ ID NO：49的氨基酸序列组成的VH CDR1；
b)SEQ ID NO：51的氨基酸序列组成的VH CDR2；
c)SEQ ID NO：75的氨基酸序列组成的VH CDR3；
d)SEQ ID NO：109的氨基酸序列组成的VL CDR1；
e)SEQ ID NO：111的氨基酸序列组成的VL CDR2；和
f)SEQ ID NO：134的氨基酸序列组成的VL CDR3。
4.如权利要求1所述的经分离的抗体，其中所述的抗体包含：
a)SEQ ID NO：12的氨基酸序列组成的VH；和
b)SEQ ID NO：14的氨基酸序列组成的VL。
5.如权利要求1所述的经分离抗体，其包含：
a)SEQ ID NO：12的氨基酸序列组成的VH；和
b)SEQ ID NO：15的氨基酸序列组成的VL。
6.如权利要求1-5中任一项所述的经分离抗体，其中，所述的抗体是单链Fv(scFv)，IgG，Fab，F(ab’)2，或(scFv)2。
7.用于中和肉毒杆菌神经毒素(BoNT)的组合物，其中，所述的组合物包含至少两种针对BoNT血清型的不同的抗体，其中，所述两种不同抗体中的第一抗体是权利要求1-6任一项中的抗体。
8.权利要求7所述的组合物，其中所述的两种不同抗体与BoNT/A1和BoNT/A2中的至少一种亚型结合。
9.如权利要求7所述的组合物，其中，所述的两种不同抗体中的第二抗体选自：
a)包含i)SEQ ID NO：11的氨基酸序列组成的VH和ii)SEQ IDNO：10或SEQ ID NO：354的氨基酸序列组成的VL的抗体；
b)包含i)SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：23的氨基酸序列组成的VH和ii)SEQ ID NO：22的氨基酸序列组成的VL的抗体；
c)包含i)SEQ ID NO：12的氨基酸序列组成的VH和ii)SEQ IDNO：358，SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15组成的氨基酸序列组成的VL的抗体；和
d)包含i)SEQ ID NO：16的氨基酸序列组成的VH和ii)SEQ IDNO：362的氨基酸序列组成的VL的抗体。
10.如权利要求7所述的组合物，其中，所述的两种不同抗体中的第二抗体选自：
a)包含i)SEQ ID NO：11的氨基酸序列组成的VH和ii)SEQ IDNO：10或SEQ ID NO：354的氨基酸序列组成的VL的抗体；
b)包含i)SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：23的氨基酸序列组成的VH和ii)SEQ ID NO：22的氨基酸序列组成的VL的抗体；
c)包含i)SEQ ID NO：16的氨基酸序列组成的VH和ii)SEQ IDNO：362的氨基酸序列组成的VL的抗体。
11.如权利要求7所述的组合物，其中，所述的抗体在药学上可接受的赋形剂中。
12.如权利要求7所述的组合物，其中，所述的组合物是单位剂量形式。
13.至少两种针对BoNT血清型的不同的抗体在制备用于中和哺乳动物中肉毒杆菌神经毒素(BoNT)所用试剂中的用途，其中，所述两种不同抗体中的第一抗体是权利要求1-6中的抗体。
14.如权利要求13所述的用途，其中，所述的两种不同抗体中的第二抗体选自：
a)包含i)SEQ ID NO：11的氨基酸序列组成的VH和ii)SEQ IDNO：10或SEQ ID NO：354的氨基酸序列组成的VL的抗体；
b)包含i)SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：23的氨基酸序列组成的VH和ii)SEQ ID NO：22的氨基酸序列组成的VL的抗体；
c)包含i)SEQ ID NO：12的氨基酸序列组成的VH和ii)SEQ IDNO：358，SEQ ID NO：14，或SEQ ID NO：15的氨基酸序列组成的VL的抗体；和
d)包含i)SEQ ID NO：16的氨基酸序列组成的VH和ii)SEQ IDNO：362的氨基酸序列组成的VL的抗体。
15.如权利要求13所述的用途，其中，所述的两种不同抗体中的第二抗体选自：
a)包含i)SEQ ID NO：11的氨基酸序列组成的VH和ii)如SEQ IDNO：10或SEQ ID NO：354的氨基酸序列组成的VL的抗体；
b)包含i)SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：23的氨基酸序列组成的VH和ii)SEQ ID NO：22的氨基酸序列组成的VL的抗体；和
c)包含i)SEQ ID NO：16的氨基酸序列组成的VH和ii)SEQ IDNO：362的氨基酸序列组成的VL的抗体。
16.中和肉毒杆菌神经毒素的试剂盒，其中，所述的试剂盒包含：
权利要求7-12中任一项所述的组合物，和
教导使用所述组合物来结合肉毒杆菌神经毒素的指导材料。
17.权利要求16的试剂盒，其中所述组合物保藏在一次性注射器中。
18.编码权利要求1-6中任一项所述抗体的核酸。
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