ES2586623T3 - Sistemas y métodos basados en citometría de flujo para la detección de microbios - Google Patents

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Abstract

Un método por citometría de flujo para detectar microbios objetivo en una muestra, comprendiendo dicho método: a) tratar la muestra con al menos un oxidante y al menos un detergente; b) desactivar el al menos un oxidante después de tratar la muestra; c) mezclar la muestra con al menos una sonda para formar una muestra etiquetada; en donde la al menos una sonda comprende al menos una etiqueta; y en donde la al menos una sonda se une a los microbios objetivo en la muestra etiquetada; d) introducir la muestra etiquetada en un citómetro de flujo; y e) analizar la muestra etiquetada; en donde el análisis comprende excitar la al menos una etiqueta con al menos una fuente de luz en el citómetro de flujo y detectar al menos una emisión fluorescente.

Description

DESCRIPCIÓN
Sistemas y métodos basados en citometría de flujo para la detección de microbios
Referencia cruzada con solicitudes relacionadas
Antecedentes
Los métodos actuales para detectar microbios en una muestra involucran usualmente etapas que consumen tiempo, 5 tales como cultivo y/o amplificación de ácidos nucleicos. Por ejemplo, la amplificación de ADN microbiano por la reacción en cadena de polimerasa (PCR), la cual se utiliza en muchos métodos de ensayo, puede tomar hasta varias horas. De la misma manera, el cultivo de microbios en una muestra puede tomar varios días o incluso semanas. Los resultados obtenidos a partir de tales ensayos típicamente son no cuantitativos. Además, las técnicas de cultivo y amplificación de ácidos nucleicos son susceptibles de producir resultados de falsos positivos así como 10 de falsos negativos.
Los retos antes mencionados en la detección de microbios se amplifican cuando muy pocos microbios objetivo de interés están presentes en una muestra particular. Por ejemplo, los métodos de detección convencionales carecen de la sensibilidad requerida para detectar del orden de 5-10 células microbianas en una muestra. La detección es adicionalmente problemática cuando hay microbios no objetivo copresentes con los microbios objetivo. Tales 15 microbios no objetivo se denominan frecuentemente flora de fondo. Los retos asociados con el análisis de muestras también se hacen más difíciles cuando las muestras son derivadas de fuentes complejas, tales, por ejemplo, soluciones líquidas diluidas, muestras biológicas y fuentes de alimentos procesados (por ejemplo mantequilla de cacahuete).
La recolección de muestras microbianas a partir de diversas fuentes también presenta ciertos retos, puesto que 20 muchas técnicas de recolección convencionales no proveen un ambiente suficientemente estéril para evitar la introducción de contaminación microbiana. Tales métodos de recolección estándar pueden ser especialmente imprácticos para recolectar y conservar muestras con muy pocos microbios objetivo de interés.
En años recientes, la citometría de flujo ha sido utilizada para detectar microbios a partir de diversas muestras. Sin embargo, tales métodos tienen también limitaciones puesto que muchas muestras tienen fluorescencia natural así 25 como partículas de fondo que pueden reducir la certeza de que las señales detectadas representan los microbios de interés. Adicionalmente, la calibración, estandarización y operación general de los citómetros de flujo para producir resultados consistentes puede generar retos, especialmente para usuarios con experiencia limitada en la citometría de flujo.
A la vista de lo anterior, hay una necesidad actual por métodos, sistemas y kits para ser utilizados en la detección de 30 microbios objetivo en una muestra utilizando protocolos rápidos, cuantitativos, específicos, consistentes y no complicados. Hay una necesidad adicional de que tales métodos, sistemas y kits sean apropiados para muestras que contiene pocos microbios objetivo de interés y para matices de muestra complicadas. Diversas realizaciones de la presente divulgación utilizan métodos y sistemas por citometría de flujo para dirigirse a una o más de estas necesidades no satisfechas. 35
La FR2847589 divulga un método para detectar microorganismos (A) en un fluido biológico (B) tratando una muestra con un medio de reacción (C) que contiene un agente marcador (I) y al menos un agente de penetración celular (II) para membranas de (A); filtrar para retener cualquier (A) marcado de detectar cualquier (A) retenido, marcado.
La US2006134729 divulga un proceso para detectar microorganismos presentes en un fluido biológico que incluye a) poner en contacto una muestra de fluido biológico con un ambiente de reacción que comprende un agente marcador 40 que es un derivado de cianinas y al menos un reactivo de penetración celular de la membrana de los microorganismos, b) filtrar la muestra sobre un filtro capaz de retener los microorganismos marcados presentes en la muestra, y c) detectar los microorganismos marcados retenidos en el filtro en la etapa (b).
Nobuyasu Yamaguchi et al, "Rapid detection of respiring Escherichia coli 0157:H7 in apple juice, milk and ground beef by flow cytometry", Cytometry, Vol. 54A, No. 1, páginas 27-35 divulga un método en el cual se utilizó CTC 45 (cloruro de 5-ciano-2,3-ditolil tetrazolio) para estimar la actividad respiratoria de bacterias. El anticuerpo directo anti-E. coli 0157:H7 marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (FA) fue utilizado para la detección específica de células objetivo. Muestras de alimento fueron inoculadas con las células de E. coli 0157:H7 y E. coli K-12 en ayuno, y analizadas por microscopia de fluorescencia y por citometría de flujo después de tinción doble con FA y CTC.
La EP1918385 divulga un método para detectar células vivas, células lesionadas, células VNC, células muertas de 50 un microorganismo en una muestra de prueba por citometría de flujo. El método involucra: a) la etapa de tratar la muestra de prueba con una enzima que tiene una actividad de descomposición de células diferentes a las del
microorganismo, partículas coloidales de proteínas o lípidos que existen en la muestra de prueba, b) la etapa de tratar la muestra de prueba con un veneno de topoisomerasa y/o un veneno del ADN griasa, c) la etapa de tratar la muestra de prueba tratada en las etapas a) y b) con un agente de tinción nuclear, y d) la etapa de detectar el microorganismo en la muestra de prueba tratada con el agente de tinción nuclear por citometría de flujo. La WO2006031544 divulga un método para diagnosticar un microorganismo parásito que reside en glóbulos rojos, tal 5 como Babesia microti.
Resumen
En diversas realizaciones, los métodos por citometría de flujo para detectar microbios objetivo en una muestra se divulgan aquí. Los métodos incluyen a) tratar la muestra con al menos un oxidante y al menos un detergente; b) desactivar el al menos un oxidante después de tratar la muestra; c) mezclar la muestra con al menos una sonda 10 para formar una muestra marcada; d) introducir la muestra marcada en un citómetro de flujo; y e) analizar la muestra marcada. La al menos una sonda incluye al menos una etiqueta. La al menos un sonda se une a los microbios objetivo. La etapa de análisis incluye excitar la al menos una etiqueta con al menos una fuente de luz en el citómetro de flujo y detectar al menos una longitud de onda de emisión fluorescente.
Lo anterior a delineado de manera más bien amplia las características de la presente divulgación con el fin de que la 15 descripción detallada que sigue pueda ser mejor entendida. En adelante se describirán características y ventajas adicionales de la divulgación, que forman parte de la materia de las reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
Para un entendimiento más completo de la presente divulgación y ventajas de la misma, se hace referencia ahora a las siguientes descripciones que deben tomarse en conjunto con los dibujos acompañantes que describen una 20 realización específica de la divulgación, en donde:
Las figuras 1A y 1B presentan esquemas ilustrativos de kits de frotis que pueden ser utilizados para recolectar muestras bacterianas objetivo;
La figura 8 representa un esquema que muestra una realización ilustrativa de la filtración electrónica;
La figura 10 presente gráficas de emisión del citómetro de flujo ilustrativas que muestran como el ruido en una región 25 de detección puede no estar presente en otra región de detección;
Las figuras 11A-11C presentan gráficas de emisión por citómetro de flujo con salida ilustrativas obtenidas por los métodos RAPID-B para matrices de ensalada empacada, masa para galletas y de salami;
Las figura 12A y 12B presentan gráficas de remisión por citómetro de flujo con salida ilustrativa obtenida por los métodos RAPID-B para matrices de pimientos jalapeños a diversos niveles de dilución; 30
La figura 13 presenta una gráfica de emisión por citometría de flujo con salida ilustrativa obtenida por métodos RAPID-B para una matriz de pimiento jalapeño de control negativo;
Las figuras 14A y 14B presentan gráficas de emisión con citómetros de flujo con salida ilustrativas obtenidas por los métodos RAPID-B que muestran que los reactivos de sonda y el esputo solo no producen fluorescencia de fondo en la región de detección Mtb de salida; y 35
Las figuras 15A-15C presentan gráficas de emisión por citómetro de flujo ilustrativas para recuentos bacterianos de Mtb obtenidos por los métodos RAPID-13 a partir de muestras de esputo de pacientes con tuberculosis.
Descripción detallada
En la descripción siguiente, se fijan ciertos detalles como cantidades, tamaños, etc., específicos de tal manera que proveen un entendimiento exhaustivo de las presentes realizaciones divulgadas aquí. Sin embargo. Será evidente 40 para las personas de experiencia normal en el arte que la presente divulgación puede ser practicada sin tales detalles específicos. En muchos casos, los detalles concernientes a tales consideraciones y similares han sido omitidos puesto que tales detalles no son necesarios para obtener un entendimiento completo de la presente divulgación y caen dentro de las habilidades de personas de habilidad ordinaria en el arte relevante.
Con referencia a los dibujos en general, se entenderá que las ilustraciones tienen el propósito de describir 45 realizaciones particulares de la divulgación y no pretenden ser limitantes para la misma.
Las definiciones y explicaciones que siguen pretenden y están previstas para controlar cualquier construcción futura a menos que se modifique claramente y de manera no ambigua en la Descripción Detallada siguiente o cuando la aplicación del significado haga cualquier construcción no significativa o esencialmente no significativa. En casos donde la construcción del término lo haga no significativo o esencialmente no significativo, la definición debería ser tomada del Webster Dictionary, 3rd Edition. Las definiciones y/o interpretaciones no deberían ser incorporadas a 5 partir de otras solicitudes de patente, patentes o publicaciones relacionadas o no, a menos que se establezca específicamente en esta especificación, o si la incorporación es necesaria para mantener la validez.
A parte de los ejemplos operativos, o en donde se indique de otra manera, todos los números que expresan cantidades de componentes utilizados aquí deben entenderse como modificados en todos los casos por el término “aproximadamente”. 10
Tal como se utiliza aquí, el término “ejemplo” y el término “realización” tendrán significados equivalentes.
Tal como se utiliza aquí, el término “microbios” se refiere en general, por ejemplo, a microorganismos tales como bacterias, hongos, protozoos, virus, parásitos (por ejemplo, malaria), como entidades biológicas y combinaciones de los mismos. Los términos microbios y microorganismos se utilizarán aquí de manera intercambiable.
Tal como se utiliza aquí, el término “muestra” se refiere en general, por ejemplo, a una composición que contiene 15 microbios. Las muestras pueden ser obtenidas de diversas fuentes, tales como, por ejemplo, humanos, animales, especímenes biológicos, suelos, fluidos, alimentos, objetos mecánicos, el ambiente, aire y objetos relacionados.
Tal como se utiliza aquí, el término “sonda” se refiere en general, por ejemplo, a una entidad que tiene afinidad para unirse a microbios. Las sondas pueden ser específicas para un microbio o clases de microbios en particular, o pueden ser no específicos en su unión. Las sondas pueden incluir, por ejemplo, anticuerpos (monoclonales, 20 policlonales y combinaciones de los mismos), sondas de ARN, sondas de ADN, colorantes para ADN (por ejemplo tiasol naranja, yoduro de propidio, LDS-751), ácidos nucleicos peptídicos (PNAs), aptámeros, moléculas pequeñas, moléculas biomiméticas, fagos virulentos y objetos relacionados.
Tal como se utiliza aquí, el término “etiquetas” se refiere en general, por ejemplo, a una molécula, partícula, composición y/o unidad estructural que emite luz después de la excitación mediante una fuente de energía. Tales 25 etiquetas pueden ser una parte inherente de una sonda (por ejemplo, colorantes para ADN) o pueden ser anexados a una sonda. Etiquetas ilustrativas utilizadas aquí pueden ser, por ejemplo, fluorocromos o fluoróforos.
Tal como se utiliza aquí, el término “clasificación de microorganismos”, se refiere en general, por ejemplo, a la clasificación de microbios por uno más criterios diversos, tales como, por ejemplo, género, especie, cepa o combinación de los mismos. Los microbios que pertenecen a la “misma clasificación” de microorganismos se 30 relacionan de manera sustancial por al menos uno de los diversos criterios.
Tal como se utiliza aquí, el término “microbios objetivo” se refiere en general, por ejemplo, los microbios que están siendo probados cuantitativa o cualitativamente en una muestra.
Tal como se utiliza aquí, el término “componentes microbianos no objetivo” se refiere en general, por ejemplo, a los microbios en una muestra que no están siendo probados en una muestra. Sin limitación, los componentes de 35 microbios no objetivo pueden incluir, por ejemplo, microorganismos indeseados, proteínas indeseadas, residuos celulares, objetos autofluorescentes y diversas combinaciones de los mismos.
Tal como se utiliza aquí, el término “FSC” se refiere en general, por ejemplo, a un canal de detección en citometría de flujo relacionado con luz dispersa de avance, que diverge típicamente de la dirección de la luz incidente por solamente unos pocos grados o menos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la luz dispersa de avance diverge de 40 la dirección de la luz incidente por menos de aproximadamente 10 grados. En otras realizaciones, la luz dispersa de avance diverge de la dirección de la luz incidente por menos de aproximadamente 5 grados.
Tal como se utiliza aquí, el término “SSC” se refiere en general, por ejemplo, a un canal de detección en citometría de flujo que se relaciona con luz dispersa lateral, que diverge típicamente de la dirección de la fuente de luz incidente en una cantidad mayor de aproximadamente 10 grados. En algunas realizaciones, la luz dispersa lateral 45 diverge de la dirección de la luz incidente en aproximadamente 60 grados hasta aproximadamente grados. En otras realizaciones, la luz dispersa lateral diverge de la dirección de la luz incidente en aproximadamente 20 grados hasta aproximadamente 60 grados.
Tal como se utiliza aquí, el término “FL-1”, se refiere, en general, por ejemplo, a un canal de detección en citometría de flujo capaz de detectar luz que tiene una longitud de onda de aproximadamente 525 mn. 50
Tal como se utiliza aquí, el término “FL-2”, se refiere, en general, por ejemplo, a un canal de detección en citometría
de flujo capaz de detectar luz que tiene una longitud de onda de aproximadamente 575 nm.
Tal como se utiliza aquí, el término “FL-3”, se refiere, en general, por ejemplo, a un canal de detección en citometría de flujo capaz de detectar luz que tiene una longitud de onda de aproximadamente 610 nm.
Tal como se utiliza aquí, el término “FL-4”, se refiere, en general, por ejemplo, a un canal de detección en citometría de flujo capaz de detectar luz que tiene una longitud de onda de aproximadamente 675 nm. 5
Definiciones adicionales además de las fijadas anteriormente también se incluyen aquí en la Descripción Detallada que sigue.
Principios de la citometría de flujo. La presente divulgación es pertinente en general a diversas realizaciones de sistemas, métodos y kits basados en citometría de flujo para detectar microbios objetivo en diversas muestras. La información básica sobre citometría de flujo puede encontrarse en numerosas referencias, tales como Shapiro’s 10 Practical Flow Cytometry, Third Edition (Alan R. Liss, Inc. 1995). Aunque los principios básicos de la citometría de flujo son conocidos para las personas de experiencia normal en el arte, los Solicitantes creen que las realizaciones presentadas en la presente divulgación son actualmente desconocidas en el arte.
La citometría de flujo puede ser utilizada para medir uno o más parámetros ópticos o eléctricos de células, microbios y/o otras partículas que pasan a través de un haz de luz, tal como, por ejemplo, un láser. En general, una muestra 15 fluida que va a ser analizada es introducida en un tubo de muestra en o cerca al centro de una corriente que fluye más rápidamente de fluido envolvente, la cual transporta la muestra fluida a través del centro de las corrientes combinadas, comprimiendo hidráulicamente la muestra y haciendo que las células en el volumen de muestra formen una columna. Este proceso permite que las células, microbios y/o otras partículas sean entregados en el centro del punto de medición en una zona de examen (por ejemplo, una celda de flujo). Después de esto, un láser de onda 20 continua enfoca un haz de láser sobre las células y/o partículas a medida que pasan a través de la zona de examen. Los detectores que están conectados ópticamente a la zona de examen obtienen la señal de esta zona o uno o más canales de detección (por ejemplo, FSC, SSC, FL-1, FL-2, FL-3 y FL-4).
Cuando un objeto de interés en la corriente de flujo es golpeado por el haz de láser, se generan ciertas señales y son detectadas por los detectores. Los detectores utilizan una pluralidad de canales de detección o una detección de 25 canal individual. Por ejemplo, estas señales incluyen intensidad de dispersión de avance, la cual provee información concerniente al tamaño de las células individuales, microbios y/o otras partículas. Otra señal común es la intensidad de dispersión lateral, que provee información concerniente a la granularidad (tamaño relativo, proporciones y propiedades de refracción) de células individuales, microbios y/o otras partículas. Otras señales pueden incluir emisiones de fluorescencia desde uno o más colorantes fluorescentes y/o moléculas fluorescentes asociados con 30 las células, microbios u otras partículas. En algunas realizaciones, las células individuales, microbios y/o otras partículas son fluorescentes de manera inherente, mientras que en otras realizaciones, se hacen fluorescentes anexando al menos una etiqueta.
Cuando se emplean diferentes moléculas fluorescentes (esto es, etiquetas) en un esquema analítico de citometría de flujo, tal como para sondear diversos objetos de interés en una muestra, los picos de emisión de fluorescencia de 35 las moléculas se seleccionan convencionalmente para minimizar o eliminar el solapamiento espectral entre los respectivos picos de emisión de fluorescencia. Por ejemplo, las moléculas fluorescentes pueden ser clasificadas en clases espectrales no solapables FL-1, FL-2, FL-3 y FL-4 con base en sus picos de emisión de fluorescencia. En diversas realizaciones presentadas aquí, dos o más etiquetas pueden tener emisiones espectrales sustancialmente solapables. En diversas otras realizaciones presentadas aquí, dos o más etiquetas pueden tener emisiones 40 espectrales sustancialmente no solapables.
La presente divulgación utiliza técnicas y sistemas de citometría de flujo para detectar microorganismos objetivo a través del uso de diversos métodos y kits. En diversas realizaciones, los métodos y kits pueden ser utilizados en combinación como parte de un protocolo de recolección de datos integrado. En otras diversas realizaciones, los métodos pueden ser llevados a cabo independientemente sin utilizar los kits para la recolección de muestras. 45 Adicionalmente, otras diversas realizaciones de la presente divulgación son pertinentes a la calibración, estandarización y uso óptimo de los citómetros de flujo.
En algunas realizaciones, los kits, métodos de citometría de flujo, métodos de calibración y métodos de estandarización se utilizan todos juntos como parte de procesos integrados que analizan la presencia de microbios objetivo. En otras realizaciones, tales procesos integrados pueden no utilizar los kits antes mencionados. En todavía 50 otras diversas realizaciones, cualquier método de citometría de flujo divulgado aquí puede ser puesto en práctica en combinación con cualquier otro método de citometría de flujo divulgado aquí. En algunas realizaciones, dos o más de los métodos de citometría de flujo divulgados aquí pueden ser combinados con otro. Adicionalmente, cualquier método de citometría de flujo divulgado aquí o combinaciones de cualquier método de citometría de flujo divulgado aquí pueden ser utilizados en combinación con cualquier método de calibración, estandarización o mejora de la 55
sensibilidad de la citometría de flujo divulgado aquí. Tales métodos, sistemas y kits serán descritos ahora en más detalle.
Recolección y tratamiento de muestras. En la presente divulgación, las muestras pueden ser recolectadas a partir de diversas fuentes para el análisis por citometría de flujo. Tales fuentes pueden incluir sin limitación humanos, animales, plantas, semillas, alimentos, suelo, fluidos, objetos mecánicos, superficies, aire, el ambiente y objetos 5 relacionados. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una muestra que va a ser analizada puede ser una muestra biológica, tal como un tejido o fluido biológico. Sin limitación, el tejido o fluido biológico puede contener cualquier patógeno microbiano detectable. En algunas realizaciones, el patógeno microbiano puede ser tuberculosis. En algunas realizaciones, una muestra que va a ser analizada puede ser una fuente de agua tal como, por ejemplo, de un lago. En todavía otras realizaciones, una muestra que va a ser analizada puede ser obtenida de una fuente de 10 alimento. Sin limitaciones, las fuentes de alimento pueden ser, por ejemplo, vegetales, carnes y alimentos procesados. Vegetales ilustrativos de los cuales pueden obtenerse muestras incluyen, por ejemplo, tomates, espinacas y pimientos jalapeños. Carnes ilustrativas incluyen, por ejemplo, res, cerdo, pollo y pescado. Alimentos procesados ilustrativos incluyen, por ejemplo, lotes de mantequilla de cacahuete, masa para galletas y salami. Los ejemplos ilustrativos de muestras incluidos más arriba no deberían considerarse como limitantes del alcance de la 15 divulgación.
Las muestras pueden ser recolectadas por diversos métodos bien conocidos para los de experiencia normal en el arte. Sin limitación, pueden utilizarse utensilios tales como, por ejemplo, torundas y espátulas para recolectar una muestra. En diversas realizaciones, las muestras pueden ser recolectadas en contenedores, particularmente aquellas muestras que están en forma líquida o gaseosa. Las muestras pueden ser procesadas posteriormente para 20 ser la muestra más adecuada para los métodos de citometría de flujo. Por ejemplo, las muestras pueden ser trituradas, cortadas, concentradas y/o filtradas antes del análisis por citometría de flujo.
Kits de torundas. En diversas realizaciones, un kit de torundas puede ser utilizado para recolectar microbios objetivo a partir de una muestra para análisis citométrico de flujo. En diversas realizaciones, tales kits de torundas pueden incluir una carcasa; una torunda en la carcasa para recolectar una muestra; una fuente líquida para suministrar un 25 líquido hacia la carcasa para disociar al menos algunos de los microbios de la torunda; un filtro permeable a los microbios para separar los microbios disociados de otros objetos en la muestra; y una unidad de recolección para recolectar los microbios separados. En otras diversas realizaciones, la fuente líquida en el kit de torunda puede ser un contenedor que almacena y dispensa el líquido hacia la carcasa. De la misma manera, el líquido puede ser un regulador. En algunas realizaciones, el líquido puede incluir un oxidante y/o un surfactante. Además, tales kits de 30 torunda pueden ser integrados o modulares. En la operación, tales kits de torunda pueden ayudar a recolectar, resuspender y filtrar las muestras.
Las figuras 1A y 1B presentan un esquema ilustrativo de los kits de torunda que pueden ser utilizados para recolectar muestras bacterianas objetivo. Con referencia a la figura 1A, el kit 10 de torunda se muestra en un primer ejemplo ilustrativo de un kit de torunda adecuado para uso en la presente divulgación. Tal como se muestra, el kit 10 35 de torunda incluye en general una carcasa 12, una torunda 14, un filtro 18, una unidad 20 de recolección y un contenedor 24. En este ejemplo, no limitante, la carcasa 12 es una estructura cilíndrica y trasparente con un extremo distal y un extremo proximal. De la misma manera, la torunda 14 en este ejemplo es una estructura en forma de pluma con una barra 15 y una punta 16. La punta 16 puede adquirir microbios objetivo y liberarlos después de exposición a un líquido o líquidos. En algunas realizaciones, la punta 16 puede ser un filtro de baja impedancia, tal 40 como por ejemplo, un filtro de polipropileno. En algunas realizaciones, la punta 16 comprende un material bajo en partículas, de tal manera que el material de la torunda no contamine la muestra.
Con referencia todavía a la figura 1A, el filtro 18 puede ser cualquier composición que pueda separar microbios de otros objetos. En algunas realizaciones, el filtro 18 puede ser una composición que es permeable a microbios pero impermeable a objetos y/o partículas más grandes. En diversas otras realizaciones, el filtro 18 puede estar 45 compuesto de polipropileno, policarbonato y/o otros polímeros similares. El filtro 18 también puede tener diversos tamaños de poro. En algunas realizaciones, el tamaño de poro puede ser desde aproximadamente 0.1 µm a aproximadamente 10 µm. En otras realizaciones, el tamaño de poro puede ir desde aproximadamente 3 µm hasta aproximadamente 7 µm. En todavía otras realizaciones, el tamaño de poro puede ir desde aproximadamente 4.5 µm hasta aproximadamente 5.5 µm. 50
La unidad 20 de recolección puede ser utilizada para recolectar microbios después de la filtración por el filtro 18. Como se muestra en la figura 1A, la unidad 20 de recolección puede estar localizada en el extremo distal de la carcasa 12, y deseablemente por debajo del filtro 18. También como se muestra en la figura 1A, la unidad 20 de recolección puede incluir adicionalmente un puerto 22 de dispensación para la dispensación de una muestra.
El kit 10 de torunda puede incluir adicionalmente un contenedor 24. En el ejemplo mostrado en la figura 1A, el 55 contenedor 24 puede incluir la parte 25 indentada con una barra 26 rompible. En algunas realizaciones, el contenedor 24 puede estar posicionado por encima del eje de la línea A en el extremo proximal de la carcasa 10. En realizaciones adicionales, el contenedor 24 puede contener un regulador. Por lo tanto, la ruptura de la barra 26
permite que el regulador fluya hacia la carcasa 12. Sin embargo, en otras realizaciones, pueden introducirse reguladores u otros líquidos en los kits de torunda a través de otros mecanismos. Por ejemplo, pueden introducirse reguladores en los kits de torunda directamente sin el uso de ningún contenedor o equipo especializado.
En diversas realizaciones de la presente divulgación, los reguladores asociados con los kits de torunda ayudan en general a liberar los microbios de una muestra obtenida sobre una torunda, estabilizar los microbios obtenidos, y/o 5 tratar la muestra por diversos métodos (por ejemplo, tratamiento con oxidantes, enzimas, detergentes y materiales similares). Los reguladores adecuados para uso con los kits de torunda pueden incluir por lo tanto diversos componentes adicionales tales como, por ejemplo detergentes (por ejemplo, Tween 20 o Tween 80), oxidantes (por ejemplo, H2O2), reguladores de fosfato (por ejemplo, PBS), enzimas y/o aditivos antimicrobianos (por ejemplo, azida de sodio). En ciertas realizaciones, un regulador puede incluir aproximadamente 0.1% en peso de azida de sodio, 10 aproximadamente 250 µm de EDTA y aproximadamente 0.01% en peso de Tween 20 en 1X-PBS. En ejemplos adicionales, los reguladores pueden estar en forma concentrada para dilución subsecuente en las unidades de recolección.
Los kits torunda de la presente divulgación pueden ser utilizados en diversos métodos. Por ejemplo, en un ejemplo, la torunda 14 puede ser retirada de la carcasa 12 y presionada contra una muestra que va a ser analizada de tal 15 manera que al menos una parte de la muestra se adhiera a la punta 16. Después de esto, la torunda 14 puede ser colocada de regreso en la carcasa 12. El contenedor 24 puede ser reposicionado en el extremo proximal de la carcasa 12. A continuación, la barra 26 puede ser presionada por un operador de tal manera que se rompa y libera cualquier regulador dentro del contenedor hacia la carcasa 12. El kit 12 de torunda puede ser sometido a vórtex entonces durante un período de tiempo zt suficiente para promover la liberación de al menos una parte de los 20 microbios sobre la punta 16 hacia el regulador. Tales períodos de tiempo pueden variar dependiendo de la muestra. Por ejemplo, en un caso, la muestra puede ser sometida a vórtex durante aproximadamente 5 minutos hasta aproximadamente 10 minutos. Subsecuentemente, el kit de torunda 10 puede ser posicionado verticalmente para permitir que el regulador fluya a través del filtro 18 y hacia la unidad 20 de recolección. La muestra puede ser recolectada entonces a través del puerto 22 de dispensación para análisis o tratamiento posterior. 25
Ventajosamente, el uso de kits de torunda en la presente divulgación puede permitir que los ensayos mantengan integridad y consistencia cuantitativa. Por ejemplo, los kits de torunda pueden excluir ventajosamente partículas suficientemente grandes que ocluyen el canal de la celda central u otros pasos de líquidos estrechos de un sistema de citometría de flujo. Adicionalmente, el uso de tales kits de torunda puede reducir la interferencia óptica durante la citometría de flujo debido a la eliminación de materiales de fondo ópticamente activos, tales como partículas de 30 alimentos y materiales similares.
El kit de torunda ilustrativo representado en la figura 1A es apenas un ejemplo de los kits de torunda utilizados para poner en práctica la presente divulgación. Otras diversas realizaciones de kits de torunda pueden ser igualmente útiles, y la realización representada en la figura 1A no debe considerarse como limitante. Por ejemplo, la figura 1B ilustra un kit 30 de torunda como otro kit de torunda adecuado para uso en las realizaciones de la presente 35 divulgación. El kit 30 de torunda se muestra con carcasa 32, torunda 34, filtro 38, unidad 40 de recolección y contenedor 44. La torunda 34 incluye adicionalmente una barra 35 y una punta 36. El contenedor 44 en este ejemplo puede incluir adicionalmente una unidad 46 de inmovilización y torunda 34 de soporte. De la misma manera, la unidad 40 de recolección puede incluir la tapa 52 con el código de barras 50, el cual puede ser utilizado para una identificación fácil de una muestra y/o ensayo en particular. 40
El kit 30 de torunda también puede ser usado en diversos métodos divulgados aquí. Por ejemplo, en un ejemplo, la torunda 34 puede ser retirada de la carcasa 32 y presionada contra una muestra que va a ser analizada como se describió previamente. Después de esto, la torunda 34 puede ser colocada de nuevo en la carcasa 32. Puede agregarse entonces un regulador adecuado a la carcasa 32. Después de reposicionar el contenedor 44 en el extremo proximal de la carcasa 32, el kit de torunda puede ser invertido de tal manera que el regulador que contiene 45 la muestra pase a través del filtro 38. En otras realizaciones, el puerto 48 de dispensación sobre el contenedor 44 puede ser posicionado en la parte superior de la unidad 40 de recolección después de retirar la tapa 52.
Los solicitantes también prevén el uso de kits de torunda en otras realizaciones de la presente divulgación que no incorporan todos los componentes antes mencionados. Por ejemplo, en una realización, un kit de torunda puede incluir solamente una carcasa y un filtro que es permeable a microbios. 50
Los solicitantes anotan adicionalmente que el uso de los kits de torunda es solamente una de las muchas maneras de recolectar y tratar una muestra. Independientemente del uso de los kits de torunda, las muestras obtenidas pueden ser tratadas por métodos diversos. Como se mencionó previamente, tales tratamiento pueden incluir sin limitación: tratamiento con detergentes; tratamiento con oxidantes; y tratamiento con enzimas. Además, las muestras pueden ser concentradas por diversos métodos. El contenido de proteína de diversas muestras puede también ser 55 reducido. En lo que sigue se definen detalles adicionales concernientes a estas realizaciones de la presente divulgación.
Concentración de la muestra. En otras realizaciones de la presente divulgación, las muestras pueden ser concentradas por diversos métodos. Tales etapas de concentración pueden ser particularmente beneficiosas cuando se desea detectar y/o cuantificar microbios objetivo en un gran volumen de una muestra líquida (por ejemplo, muestras de 100 ml a 4 L). Pueden utilizarse diversos métodos para concentrar tales muestras. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los microbios pueden ser recuperados a partir de un líquido para análisis por citometría de 5 flujo mediante (1) filtración de líquidos sobre un filtro que captura los microbios objetivo; (2) colocación del filtro en un tubo u otro contenedor; (3) lavado del filtro con el fin de liberar los microbios; (4) centrifugar el tubo u otro contenedor para trasportar los microbios liberados hacia la parte inferior del tubo; y (5) resuspensión de los microbios objetivo. En diversas realizaciones, los líquidos usados pueden ser agua. En diversas realizaciones, la centrifugación puede tener lugar durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 6.000 rpm. 10
En algunos casos, la muestra puede producir una suspensión que es tan pesada y espesa que la filtración inicial es impráctica. Por lo tanto, en otras realizaciones diversas, la separación de los microbios objetivo de las partículas no objetivo, puede proceder sin la etapa de filtración descrita más arriba mediante (1) centrifugación durante una duración corta para precipitar partículas grandes; (2) decantación del líquido sobrenadante que contiene microbios objetivo aun no precipitados; (3) filtración del líquido sobrenadante como se indico más arriba o ejecución de una 15 técnica de separación alternativa tal como, por ejemplo, fraccionamiento por flujo de campo, (4) resuspensión de los microbios objetivo.
En otras realizaciones, una solución líquida puede ser filtrada a través de un filtro de policarbonato de 0.22 µm durante un período de tiempo suficiente para retener las bacterias presentes inicialmente en el líquido (por ejemplo, 2.5 minutos). El filtro puede ser retirado entonces y colocado en un tubo de centrífuga de 15 ml, por ejemplo. A 20 continuación el filtro puede ser lavado con 10 ml de agua, por ejemplo (por ejemplo, utilizando una jeringa con una aguja). El lavado puede ser logrado, por ejemplo, haciendo retroflujo del filtro. Después de esto, el tubo puede ser centrifugado durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 6.000 rpm para proveer una pella sólida que contiene las bacterias. La mayor parte del líquido sobrenadante es retirado (por ejemplo, aproximadamente 9.2 ml de la parte superior), y los restantes 800 µl de la solución pueden ser sometidos a vórtex para resuspender la pella 25 así obtenida. La muestra resuspendida puede ser analizada entonces por los métodos de citometría de flujo.
Se pueden prever otras realizaciones de concentración de muestra. Por ejemplo, el tiempo de centrifugación de una muestra puede ser acortado o alargado, dependiendo de las ratas de recuperación deseadas. El volumen del liquido que va a ser filtrado también puede incrementarse hasta aproximadamente 1 L con el fin de proveer una sensibilidad cualitativa mayor o resultados cuantitativos más exactos recolectando más microbios. Además, el tiempo de filtración 30 puede variarse.
Recuperación de microbios a partir de muestras que tienen altos contenidos de proteínas. Muchas muestras que potencialmente contienen microbios objetivo también pueden contener altas concentraciones de proteínas que pueden interferir potencialmente con la interpretación y/o análisis de los resultados de citometría de flujo. Por ejemplo, las proteínas en tales muestras pueden enlazarse de manera no específica a diversas sondas usadas para 35 detectar microbios objetivo y llevar a la generación de resultados positivos falsos. Ejemplos no limitantes de tales muestras con contenido alto de proteínas pueden incluir, por ejemplo, leche, mantequilla de cacahuete, lisados celulares, orina, sangre y materiales relacionados. Por lo tanto, en otras diversas realizaciones de la presente divulgación, se presentan métodos para recuperar microbios de muestras con altos contenidos de proteína con el fin de facilitar los análisis por citometría de flujo de los microbios en estas muestras. 40
En diversas realizaciones, los métodos para recuperar microbios de muestras con alto contenido de proteína incluyen: (1) hacer disminuir el pH de la muestra para hacer que al menos algunas de las proteína en la muestra se aglomeren; (2) filtrar la muestra aglomerada sobre un filtro que es permeable a los microbios de interés; (3) refiltrar la muestra sobre un filtro que capture los microbios; (4) sumergir el filtro en un líquido; y (5) someter opcionalmente a vórtex el filtro para disociar los microbios hacia el líquido. En diversas otras realizaciones, las etapas de inmersión y 45 vórtex opcional pueden tener lugar en un tubo (por ejemplo, en un tubo de centrífugas) u otro contenedor adecuado. En realizaciones adicionales, el líquido puede ser un regulador, tal como 1X PBS.
El pH de una muestra puede hacerse disminuir hasta un punto adecuado para que ocurra la aglomeración agregando una solución ácida, tal como, por ejemplo, ácido acético al 10%, a la muestra. Otros diversos ácidos adecuados para inducir la aglomeración pueden ser previstos por las personas de experiencia normal en el arte. 50 Además, los rangos de pH de aglomeración adecuados pueden variar para diferentes muestras. Por ejemplo, una muestra de leche puede aglomerarse en el rango de pH de aproximadamente 4.7 a 4.2. El período de tiempo para que ocurra la aglomeración puede variar también para diferentes muestras. Por ejemplo, tales períodos de tiempo pueden variar desde aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 5 minutos para muestras con alto contenido de proteína tales como la leche. 55
Después de que ha ocurrido una aglomeración sustancial, la muestra puede ser filtrada sobre uno o más filtros que sean permeables a un microbio objetivo de interés pero que retenga sustancialmente las proteínas aglomeradas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, tal filtro adecuado puede ser un filtro de policarbonato con tamaños de poro que
varían desde 5 µm hasta 8 µm. En otras realizaciones, pueden usarse filtros múltiples sucesivamente con la disminución de tamaños de poro. En realizaciones adicionales, puede utilizarse una fuente de vacío para facilitar la filtración.
El filtrado puede ser entonces refiltrado a través de uno o más filtros que puedan capturar sustancialmente los microbios objetivo deseados en la muestra. En diversas realizaciones, tales filtros pueden ser filtros de policarbonato 5 con tamaños de poro que varían desde aproximadamente 0.2 µm hasta aproximadamente 0.45 µm. Después de esto, los microbios capturados pueden ser liberados desde los filtros para análisis, tal como se indicó aquí más anteriormente. Por ejemplo, en una realización, uno o más filtros que contienen los microbios objetivo capturados de interés pueden ser colocados en un tubo con un regulador adecuado (por ejemplo, 1X-PBS) y sometidos a vórtex durante un período de tiempo suficiente para permitir que los microbios objetivo capturados se desorban hacia la 10 suspensión. Los microbios objetivo desorbidos pueden ser aislados entonces por centrifugación, por ejemplo. En algunas realizaciones, el volumen del regulador puede ser desde aproximadamente 800 µl hasta aproximadamente 10 ml. En otras realizaciones, el vórtex puede hacerse durante aproximadamente 30 segundos hasta aproximadamente 10 minutos.
Tratamiento con detergentes. Las muestras analizadas por los métodos de citometría de flujo en cualquiera de las 15 diversas realizaciones de la presente divulgación pueden ser tratadas con detergentes o surfactantes individuales o múltiples con el fin de eliminar o sustancialmente reducir la presencia de diversas partículas que pueden interferir con el análisis por citometría de flujo. Por ejemplo, tales partículas pueden ser gotitas de aceite fluorescente que pueden estar presentes en alimentos grasos, tales como pollo, helado, mantequilla de cacahuete y similares. Si no se eliminan, tales partículas pueden ser tomadas erróneamente por bacterias u otros microbios durante la citometría 20 de flujo. En otras realizaciones, los detergentes pueden ser utilizados para suspender y/o estabilizar las muestras.
Los detergentes adecuados para uso en la presente divulgación pueden incluir sin limitación y en diversas combinaciones, polietilen glicol, EDTA, Triton 100, Tween 80, dodecil sulfato de sodio (SDS), y similares. Además, los detergentes pueden estar presentes en un regulador y/o otra solución a diversos rangos de concentración. En algunas realizaciones, tales rangos de concentración pueden variar desde aproximadamente 0.01% en peso hasta 25 aproximadamente 5% en peso de la solución. En otras realizaciones, tales rangos de concentración pueden variar desde aproximadamente 0.1% en peso hasta aproximadamente 5% en peso de la solución. En todavía otras realizaciones, tales rangos de concentración pueden variar desde aproximadamente 3% en peso hasta aproximadamente 5% en peso de la solución. En diversas realizaciones, una solución puede incluir desde aproximadamente 0.1% en peso hasta aproximadamente 5% en peso de Tween 80. Tales detergentes pueden ser 30 expuestos a una muestra como parte de un regulador del kit de torunda como se describió previamente aquí más arriba (por ejemplo, como parte de una punta de torunda o un regulador en el kit de torunda). Las muestras también pueden ser expuestas a detergentes por otros diversos mecanismos conocidos para personas de experiencia normal en el arte.
En diversas realizaciones, las muestras en la presente divulgación pueden ser tratadas con uno o más detergentes 35 por diversos períodos de tiempo que son suficientes para eliminar o sustancialmente reducir la presencia de partículas de fondo y otras interferencias. Por ejemplo, las muestras pueden ser mezcladas con un detergente durante un período de tiempo que varía desde aproximadamente 30 segundos hasta aproximadamente 120 minutos. En otras realizaciones, los períodos de mezcla pueden variar desde aproximadamente 1 minuto hasta aproximadamente 5 minutos. En todavía otras realizaciones, los períodos de mezcla pueden variar desde 40 aproximadamente 1 minuto hasta aproximadamente 20 minutos.
Uso de altas concentraciones de detergente. En diversas realizaciones de la presente divulgación, las concentraciones de detergente pueden variar, por ejemplo, desde aproximadamente 3% hasta aproximadamente 5% en peso. Se ha encontrado que tales concentraciones de detergente relativamente altas optimizan los resultados de la citometría de flujo. Sin estar limitados por ninguna teoría o mecanismo, se prevé que el uso de concentraciones 45 altas de detergente (por ejemplo, desde aproximadamente 3% en peso hasta aproximadamente 5% en peso de una solución de muestra), puede potenciar ventajosamente el enlazamiento de sondas particulares a sus respectivos epítopos sobre un microbio objetivo de interés. De acuerdo con la compresión mecanística actual se cree que tales concentraciones altas de detergentes pueden hacer que tales epítopos sean más accesibles a las sondas utilizadas en los métodos de citometría de flujo descritos aquí. Por ejemplo, el uso de Tween 80 a aproximadamente 5% en 50 peso de una solución de muestra regulada provee beneficios ventajosos en la estabilización del enlazamiento de anticuerpos a epítopos específicos sobre una superficie bacteriana en diversas realizaciones de los ensayos de citometría de flujo presentados aquí. Otra ventaja de utilizar concentraciones altas de detergente es que la disociación de agregados de macropartículas de microbios objetivo agrupados puede ser mejorada. Por ejemplo, los agregados de macropartículas de los microbios objetivo pueden formarse cuando la superficie de la célula es 55 cerosa. Tales agregados de macropartículas pueden no registrarse en un ensayo de citometría de flujo con el tamaño, forma o granularidad esperada de los microbios objetivo.
Puesto que altas concentraciones de detergentes pueden también afectar directamente la viabilidad de los microbios después de exposición prolongada, es deseable que la muestra que va a ser tratada con altas
concentraciones de detergentes sea expuesta a tales altas concentraciones solamente durante períodos de tiempo cortos tales como, por ejemplo, desde aproximadamente 30 segundos hasta aproximadamente 30 minutos en algunas realizaciones, o desde aproximadamente 30 segundos hasta aproximadamente 5 minutos y en otras realizaciones. En algunas realizaciones de los métodos de la presente divulgación, una muestra puede ser tratada inicialmente con una baja concentración (por ejemplo, menos de aproximadamente 3% en peso) de un detergente 5 para un período suficiente de tiempo para proveer la eliminación de partículas interferentes. Después de esto, la concentración de detergente puede incrementarse y la muestra puede mezclarse adicionalmente durante un período corto de tiempo (por ejemplo, aproximadamente 30 segundos hasta aproximadamente 5 minutos) antes del análisis.
Tratamiento con oxidantes. Las muestras en la presente divulgación también pueden ser tratadas con uno o más oxidantes antes de ser analizadas por citometría de flujo. Sin estar limitados por ninguna teoría, se cree que el uso 10 de uno o más oxidantes provee condiciones de citometría de flujo más óptimas para el análisis cuantitativo de microbios objetivo oxidando fluoróforos interferentes potenciales en una muestra. Tales fluoróforos interferentes pueden estar presentes en diversas muestras complejas, tales como, por ejemplo, alimentos (por ejemplo, plantas y vegetales) y especímenes biológicos (por ejemplo, esputo y sangre).
Especies oxidantes adecuadas para uso en los métodos de la presente divulgación pueden incluir sin limitación, 15 hipoclorito, clorito, clorato, perclorato, perácidos, peróxidos, peróxido de hidrógeno (H2O2), metil etil cetona peróxido, triacetona triperóxido, hexametilen triperóxido diamina, dietil éter peróxido, permanganato, sulfóxidos, tetróxidos de osmio, peryodato, óxido nitroso, ozono, OXONE (peroxomonosulfato de potasio) y oxidantes similares. Una persona de experiencia normal en el arte reconocerá que cuando la especie oxidante es un anión o catión, pueden combinarse diversos contraiones con la especie oxidante para formar diversas sales. Cualquiera de las diversas 20 sales de las diversas especies oxidantes puede ser utilizada de manera equivalente dentro del espíritu y alcance de la presente divulgación.
Tales especies oxidantes pueden ser utilizadas a lo largo de diversos rangos de concentración. Ejemplos no limitantes de tales rangos de concentración pueden incluir, por ejemplo, desde aproximadamente 0.1% en peso hasta aproximadamente 2% en peso con respecto a la cantidad de muestra, o desde aproximadamente 1% en peso 25 hasta aproximadamente 2% en peso con respecto a la cantidad de muestra.
Los oxidantes de la presente divulgación pueden ser incluidos en diversas composiciones, tales como en reguladores u otras soluciones. En algunas realizaciones, los oxidantes pueden estar presentes como parte de un kit de torunda como se describió previamente aquí más arriba. Por ejemplo, uno o más oxidantes pueden estar presentes en un regulador que puede ser utilizado en un kit de torunda. En otra realización, uno o más oxidantes 30 (tales como, H2O2) pueden estar presentes como parte de la torunda en el kit de torunda. Tales kits de torunda que contienen uno o más oxidantes pueden incluir adicionalmente uno o más surfactantes.
Las muestras de la presente divulgación pueden ser tratadas con oxidantes durante diversos períodos de tiempo. En algunas realizaciones, tales períodos de tiempo pueden variar desde aproximadamente 30 segundos hasta aproximadamente 60 minutos. En otras realizaciones, tales períodos de tiempo pueden variar desde 35 aproximadamente 5 minutos hasta aproximadamente 30 minutos.
De relevancia particular para los métodos de análisis por citometría de flujo, un problema que puede surgir con el uso de oxidantes en el procesamiento de una muestra es que los oxidantes en sí mismo puedan ser óptica o químicamente activos. Por ejemplo, el peróxido de hidrógeno es un ejemplo notable. Adicionalmente, tales oxidantes también pueden oxidar y degradar las etiquetas fluorescentes sobre las sondas utilizadas comúnmente en los 40 análisis por citometría de flujo una vez que son agregados a la muestra. Sin embargo, los métodos de la presente divulgación proveen métodos para desactivar los oxidantes antes de la adición de las sondas de citometría de flujo a las muestras. En otras palabras, los oxidantes son detenidos antes de mezclar las muestras con las sondas. La desactivación oxidante puede ser lograda por diversos mecanismos tales como, por ejemplo, disposición de la muestra a luz ultravioleta, incubación de la muestra a temperatura ambiente durante un período de tiempo suficiente 45 para permitir que el oxidante se degrade naturalmente, y/o mediante reducción química. Otros diversos métodos para desactivar oxidantes pueden ser específicos para un oxidante dado y serán evidentes para las personas de experiencia normal en el arte. Los métodos para desactivación de oxidantes presentados aquí no deberían ser considerados como limitantes del espíritu y alcance de la divulgación.
La exposición de una muestra tratada con oxidante a luz ultravioleta desactivará el oxidante si la exposición se lleva 50 a cabo durante un período de tiempo suficiente. En algunas realizaciones, tales períodos de tiempo pueden variar desde aproximadamente 1 milisegundo hasta aproximadamente 5 minutos. De la misma manera, la incubación de una muestra tratada con oxidante a temperatura ambiente desactivará el oxidante si la incubación se lleva a cabo durante un período de tiempo suficiente para que ocurra la degradación natural de los oxidantes en la muestra. Tales períodos de tiempo pueden variar generalmente dependiendo del oxidante particular que se está usando y 55 pueden variar típicamente desde aproximadamente 10 minutos hasta aproximadamente 60 minutos.
La reducción química de los oxidantes también puede ser llevada a cabo por diversos métodos. Por ejemplo, un
agente reductor químico puede ser agregado a una muestra tratada con un oxidante antes de la adición de sondas para análisis por citometría de flujo. Tales agentes reductores pueden incluir sin limitación, glutaniona, mercaptoetanol, DTT, y similares. En otras realizaciones, la reducción química puede incluir el tratamiento de la muestra con un compuesto que contiene sulfhidrilo tal como, por ejemplo, cisteína. La cisteína puede ser ventajosa para este propósito, puesto que no tiene cromóforos y puede ser utilizada para enlazar anticuerpos a fluoróforos. 5 Otros agentes reductores pueden ser previstos por las personas de experiencia normal en el arte.
Tratamiento con enzimas y/o solventes. En otras diversas realizaciones de la presente divulgación, las muestras pueden ser tratadas con una o más enzimas y/o solventes. Sin estar limitados por la teoría, se prevé que las enzimas y/o solventes pueden ayudar a proveer resultados de citometría de flujo más óptimos degradando, disociando o rompiendo muestras complejas en componentes más simples. Tales muestras complejas pueden 10 incluir diversos alimentos (por ejemplo, mantequilla de cacahuete, helado) y especímenes biológicos (por ejemplo, esputo, sangre, suero, bilis, fluido espinal) que pueden estar en forma agregada y pueden producir señales fluorescentes no especificas sin tal tratamiento.
Las enzimas adecuadas para uso en la presente divulgación pueden incluir sin limitación, tripsina, quimiotripsina, pepsina, lisozima, proteasas, cisteína proteasas, fosfatasas ácidas, peroxidasas, sabinasas, proteinasa K y enzimas 15 similares. En diversas realizaciones, tales enzimas pueden ser desactivadas subsecuentemente por dilución (por ejemplo, diluyendo 10:1 usando NaCl 150 mM u otro diluyente apropiado). Además, pueden utilizarse solventes tales como, por ejemplo, isopropanol, dimetilcarbinol propilen glicol y metil éter en diversas concentraciones para preparar muestras con matrices de alimentos o fluidos complejas con o sin tratamiento enzimático.
Además, tales enzimas y/o solventes pueden ser utilizados a diversos rangos de concentración. Ejemplos no 20 limitantes de tales rangos de concentración pueden incluir desde aproximadamente 0.01% en peso hasta aproximadamente 2% en peso con respecto a la muestra en algunas realizaciones y desde aproximadamente 0.01% en peso hasta aproximadamente 50% en peso con respecto a la muestra en otras realizaciones.
En diversas realizaciones, las enzimas y/o solventes de la presente divulgación también pueden estar presentes en diversas composiciones, tales como en reguladores u otras soluciones. En otras realizaciones, las enzimas y/o 25 solventes pueden estar presentes como parte de un kit de torunda como se describió previamente.
Las muestras de la presente divulgación pueden ser tratadas con enzimas por diversos períodos de tiempo. Tales períodos de tiempo pueden variar desde aproximadamente 30 segundos hasta aproximadamente 60 minutos en algunas realizaciones y desde aproximadamente 5 minutos hasta aproximadamente 30 minutos en otras realizaciones. 30
La desactivación de las enzimas es deseable por al menos tres razones que la desactivación de los oxidantes deseable antes de agregar sondas de citometría de flujo y analizar subsecuentemente. Un problema adicional que puede surgir con el uso de las enzimas es que las enzimas también pueden digerir o romper diversas sondas, tales como, por ejemplo, anticuerpos que se utilizan en diversas realizaciones de la presente divulgación. La desactivación enzimática antes de la adición de la sonda de citometría de flujo puede lograrse por diversos medios 35 no limitantes tales como, por ejemplo, la adición de una o más enzimas inhibidoras, inactivación por calentamiento, desnaturalización, dilución o combinaciones de los anteriores. Otros métodos de desactivación enzimáticos pueden ser previstos por las personas de experiencia normal en el arte y pueden ser utilizados dentro del espíritu y alcance de los métodos de citometría de flujo presentados en la presente divulgación.
Digestión química. En otras realizaciones de la presente divulgación, las muestras pueden ser tratadas con uno o 40 más agentes químicos que degradan diversas macromoléculas presentes en una muestra. Tales macromoléculas pueden interferir con el análisis de un microbio objetivo, por ejemplo. A manera de ejemplo no limitante, en algunas realizaciones, una muestra puede ser tratada con n-acetil-L-cisteína (NALC). A manera de fondo, la NALC es un agente reductor mucolítico que reduce los grupos sulfhidrilos de los enlaces disulfuro de los excretos polipeptídicos en la red macromolecular del moco. En diversas realizaciones, el agente de digestión químico puede ser 45 desactivado antes de agregar las sondas para citometría de flujo. La NALC, por ejemplo, puede ser desactivada reduciendo el pH de la solución.
En un ejemplo más específico, la NALC puede ser agregada a una muestra recolectada con torunda a una concentración final de aproximadamente 1% en peso en una mezcla 1:1 de NaOH al 4% e Ix PBS (concentración final de NaOH al 2%). La mezcla puede ser llevada a cabo durante aproximadamente 15 minutos a temperatura 50 ambiente. Después de esto, el NALC puede ser suspendido haciendo disminuir el pH de la solución.
Citometría de flujo después de tratamiento con oxidante. En diversas realizaciones, la presente divulgación provee métodos de citometría de flujo para detectar microbios objetivo en una muestra. Los métodos que siguen incluyen etapas para tratar la muestra con un oxidante y luego desactivar el oxidante.
En diversas realizaciones, los métodos incluyen a) tratar la muestra con al menos un oxidante y al menos un detergente; b) desactivar el al menos un oxidante después de tratar la muestra; c) mezclar la muestra con al menos una sonda para formar una muestra etiquetada; d) introducir la muestra etiquetada en un citómetro de flujo; y e) analizar la muestra etiquetada. La al menos una sonda incluye al menos una etiqueta. La al menos una sonda se une a los microbios objetivo. La etapa de análisis incluye excitar la al menos una etiqueta mediante al menos una 5 fuente de luz en el citómetro de flujo y detectar al menos una longitud de onda de emisión fluorescente. La divulgación adicional concerniente a las sondas y etiquetas se presenta aquí más adelante. También se presentan aquí más adelante realizaciones y detalles adicionales concernientes a los diversos métodos de citometría de flujo.
En diversas realizaciones, la etapa de mezcla ocurre después de la etapa de desactivación. En diversas realizaciones, los métodos incluyen adicionalmente tratar la muestra con al menos una enzima antes de la etapa de 10 mezcla. En diversas realizaciones, la al menos una enzima se desactiva en la etapa de mezcla. En diversas realizaciones, la etapa de mezcla tiene lugar durante aproximadamente 30 segundos hasta aproximadamente 5 minutos. En otras realizaciones, la etapa de mezcla tiene lugar durante aproximadamente 30 segundos hasta aproximadamente 20 minutos. En algunas realizaciones, la etapa de mezcla tiene lugar a concentraciones de sondas no saturadoras. Tales concentraciones de sonda no saturadoras no son convencionales en el arte. En 15 diversas realizaciones, la muestra etiquetada incluye aproximadamente 3% hasta aproximadamente 5% en peso del al menos un detergente tal como, por ejemplo, Tween-80. En diversas realizaciones, la etapa de mezcla tiene lugar en la presencia de un aditivo tal como, por ejemplo, albumina de suero bovino, glicerol y combinaciones de los mismos.
En diversas realizaciones, la al menos una fuente de luz incluye, por ejemplo, luz ultravioleta, luz violeta, luz de 20 xenón, luz azul y combinaciones de las mismas. En otras diversas realizaciones, la al menos una fuente de luz es una fuente de luz de infrarrojo cercano. En realizaciones en donde la al menos una fuente de luz es una fuente de luz infrarroja cercana, la detección puede estar en la región infrarroja del espectro electromagnético. En todavía otras diversas realizaciones, la al menos una fuente de luz es una fuente de luz visible tal como, por ejemplo, amarilla o verde. En diversas realizaciones, la al menos una fuente de luz es un láser. 25
En diversas realizaciones, los métodos incluyen adicionalmente mezclar la muestra con al menos una sonda no etiquetada. La al menos una sonda no etiquetada se dirige a al menos un componente microbiano no objetivo de la muestra. Los componentes microbianos no objetivo de la muestra incluyen sin limitación microorganismos no objetivo indeseados, proteínas indeseadas, residuos celulares, objetos autofluorescentes y combinaciones de los mismos. El uso de sondas no etiquetadas puede enmascarar sitios dentro de componentes microbianos no objetivo 30 que de otra manera darían una señal falsa cuando se agregan las sondas etiquetadas.
En algunas realizaciones, los métodos incluyen adicionalmente optimizar el rendimiento del citómetro de flujo antes de la etapa de análisis. En algunas realizaciones, los métodos incluyen adicionalmente estandarizar el rendimiento del citómetro de flujo contra el rendimiento de un segundo citómetro de flujo.
En otras diversas realizaciones, la presente divulgación provee diversos métodos de citometría de flujo para detectar 35 microbios en una muestra. Tales métodos pueden incluir 1) tratar la muestra con diversas combinaciones de oxidantes, detergentes, enzimas y combinaciones de los mismos; 2) desactivar los oxidantes y/o enzimas; 3) mezclar la muestra con una o más sondas que tengan una o más etiquetas fluorescentes; 4) introducir la muestra en un citómetro de flujo; y 5) analizar la muestra excitando las etiquetas fluorescentes sobre las sondas mediante una o más fuentes de luz tales como, por ejemplo, luz ultravioleta, luz visible, luz violeta, luz de xenón, luz azul y 40 combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, la mezcla puede tener lugar en rangos de concentración de sonda no saturadores durante aproximadamente 30 segundos hasta aproximadamente 5 minutos. En otras realizaciones, la mezcla puede tener lugar durante aproximadamente 30 segundos hasta aproximadamente 20 minutos. Tales etapas de mezcla pueden tener lugar en la presencia de aditivos tales como, por ejemplo, proteínas estabilizadoras (por ejemplo, albúmina de suero bovino), aditivos de estabilización (por ejemplo, glicerol) y 45 combinaciones de los mismos.
Sondas, etiquetas y citómetros de flujo: De acuerdo con los métodos de citometría de flujo de la presente divulgación, los microbios objetivo de diversas muestras pueden ser sondeados por diversos métodos y reactivos de sondeo. Las muestras sondeadas son analizadas por varias técnicas analíticas por citometría de flujo. En diversas realizaciones, el sondeo puede ocurrir antes, durante o después de cualquier etapa de recolección o tratamiento de 50 muestra. Tal sondeo puede ocurrir también sin el tratamiento de las muestras.
En diversas realizaciones de la presente divulgación, los métodos de citometría de flujo utilizan al menos una sonda. En diversas realizaciones, las sondas pueden incluir, por ejemplo, anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales y combinaciones de los mismos), sondas de ARN, sondas de ADN, colorantes de ADN (por ejemplo tiazol naranja, yoduro de propidio, LDS-751), ácidos nucleicos peptídicos (PNAs), 55 aptámeros, moléculas pequeñas, moléculas biomiméticas, fagos virulentos, y similares. Una sonda individual puede ser utilizada para sondear la muestra, o puede usarse una combinación de dos o más sondas.
Las sondas usadas en los métodos de citometría de flujo descritos aquí pueden incluir al menos una etiqueta que va a ser usada para la detección de señales en el citómetro de flujo. Tales etiquetas son moléculas o especies similares que emiten luz de una longitud de onda o de un rango de emisión de longitud de onda conocidos después de la citación mediante una fuente de energía (por ejemplo, una fuente de luz). Etiquetas ilustrativas adecuadas para poner en práctica las diversas realizaciones de la presente divulgación incluyen, sin limitación, moléculas 5 fluorescentes, colorantes, puntos cuánticos, partículas de oro, esferas de quantum y similares. Ejemplos de tales etiquetas son bien conocidos para las personas de experiencia normal en el arte.
En un ejemplo no limitante las moléculas fluorescentes excitadas por la luz azul que tienen una longitud de onda de 488 nm pueden ser utilizadas como etiquetas en diversas realizaciones de la presente divulgación. En algunas realizaciones, tales moléculas fluorescentes emiten en las regiones de recuento FL-1, FL-2, FL-3 y/o FL-4 (esto es, 10 canales de detección) de un citómetro de flujo. Ejemplos ilustrativos de tales moléculas fluorescentes aparecen en la lista en la Tabla 1 a continuación.
Tabla 1: Etiquetas de moléculas fluorescentes ilustrativas que emiten en FL-1, FL-2, FL-3 y FL-4
Nombre
PM (Daltons, Da) Excitación láser λ (nm) Pico de emisión (nm) Intensidad (1=más baja, 5=más alta) Canales de detección (los más comunes)
FITC (isotiocianato de fluoresceína
389 488 518 3 FL-1
ALEXA FLUOR 488
643 488 519 3 FL-1
R-PE (R-ficoeritrina)
240K 488 575 5 FL-2
PE-Rojo de Texas
243K 488 615 3 FL-3
PE-ALEXA FLUOR 610
242K 488 628 3 FL-3
PE-Cy5
242K 488 670 4 FL-3 o FL-4
PE-Cy5.5
242K 488 690 3 FL-3 o FL-4
PerCP-Cy5.5
35K 488 690 3 FL-3 o FL-4
PE-Cy7
242K 488 760 3 Con base en el instrumento
7-ADD
1270 488 647 FL-3
Yoduro de propidio (PI)
668 488 617 FL-2 y FL-3
Ejemplos ilustrativos de puntos cuánticos adecuados para poner en práctica las diversas realizaciones de la 15 presente divulgación pueden incluir, por ejemplo, EviTag Water Soluble Quantum Dot Labels. Un amplio rango de etiquetas con puntos cuánticos adecuados están disponibles comercialmente en una serie de proveedores, incluyendo Invitrogen, Sigma, y Molecular Probes.
Después de mezclar las muestras con diferentes sondas bajo condiciones de sondeo adecuadas, las muestras pueden ser analizadas por diversos métodos analíticos de citometría de flujo. Tales análisis pueden tener lugar 20 utilizando diversos citómetros de flujo comerciales. Ejemplos no limitantes de citómetros de flujo adecuados incluyen sin limitación, el citómetro de flujo de Becton Dickinson FACScan, el Beckman Coulter EPICS Altra, los sistemas de citometría de flujo de Cytomics FC 500, la serie de citómetros de flujo Apogee A40 (por ejemplo, A40-MiniFCM), los citómetros de flujo Beckman-Coulter Quanta SC, Becton Dickinson FACSCalibur,Accuri C6 Flow Cytometer, Microcyte por Optoflow AS, el Partec PAS III, y otros equipos similares. Los diversos métodos de sondeo y analíticos 25 por citometría de flujo adecuados para poner en práctica otras diversas realizaciones de la presente divulgación
serán descritos ahora en más detalle.
Concentraciones de sonda típicas. En algunas realizaciones de la presente divulgación, la concentración de la sonda es menor que la concentración de saturación del microbio objetivo (esto es, rangos de concentración no saturadores). En diversas realizaciones, la concentración de las sondas está a un nivel mínimo suficiente para alcanzar un resultado significativo estadísticamente cuando la muestra sondeada es probada por los métodos de 5 citometría de flujo descritos aquí. Por ejemplo, la concentración de las sondas es suficiente para detectar los microbios objetivo pero no lo suficientemente grande para interactuar con microorganismos no objetivo. De la misma manera, tales concentraciones de sonda mínimas también pueden referirse generalmente a concentraciones de sonda donde el número de moléculas de sonda disponibles es sustancialmente menor que el número de microbios objetivo dentro de una muestra. En otras realizaciones, tales concentraciones mínimas de sonda pueden también 10 referirse en general a concentraciones de sonda que están por debajo de los rangos de concentración estándar que se utiliza comúnmente para una sonda en particular. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las concentraciones mínimas de sonda pueden variar desde aproximadamente 1.000 veces hasta aproximadamente 1.000.000 de veces por debajo de la concentración estándar utilizada comúnmente para la sonda en particular. Los rangos de concentración usados comúnmente de tales sondas en citometría de flujo serán reconocibles por las personas que 15 tengan experiencia normal en el arte. Más específicamente, una concentración mínima para una sonda de anticuerpo monoclonal puede variar en algunas realizaciones desde aproximadamente 1 pg/ml hasta aproximadamente 0.01 pg/ml. El rango de concentración de anticuerpo mínimo antes mencionado puede producir un rango dinámico del método de aproximadamente 10 células objetivo/ml hasta aproximadamente 106 células objetivo/ml. 20
Sin estar limitados por ninguna teoría, se prevé que el uso de concentraciones mínimas de sonda puede reducir el enlazamiento no específico a microbios objetivo y los componentes de microbios no objetivo de la muestra que puede presentarse a concentraciones de sonda más altas. Por ejemplo, el uso de concentraciones diluidas de anticuerpo para un epítopo de célula bacteriana puede sacrificar un rango dinámico lineal enlazándose para el recuento de objetivos de concentración alta en favor de un conteo óptimo de especies objetivo de concentración 25 baja. Bajo tales condiciones, los microbios no objetivo con reactividad cruzada, incluso cepas relacionadas con los microbios objetivo, pueden no ser etiquetadas tan eficientemente como las cepas de microbio objetivo, haciendo por lo tanto que los microbios no objetivo reactivos caigan por fuera de la región de recuento de los microbios objetivo en un histograma de citometría de flujo. Ventajosamente, tales métodos pueden reducir o eliminar los resultados falso positivos, lo que puede ser deseable para ensayos en los cuales la sensibilidad y/o selectividad para el microbio 30 objetivo puede ser solamente de una célula (por ejemplo, E. coli 0157 en una muestra).
Aditivos estabilizadores. Un problema que puede surgir con el uso de concentraciones mínimas de sonda es la estabilidad de la sondas. Por ejemplo, a concentraciones diluidas, muchas sondas pueden aglomerarse con el tiempo y/o precipitar. Tales problemas pueden ocurrir particularmente cuando la sonda es una proteína o polipéptido, tal como, por ejemplo, un anticuerpo. Por lo tanto, en otro aspecto de la presente divulgación las soluciones de 35 sondas diluidas pueden estabilizarse mediante el uso de proteínas y/o otros aditivos de estabilización. Ventajosamente, el uso de aditivos y/o proteínas de estabilización con concentraciones diluidas de proteína pueden hacer posible la manufactura de reactivos y/o kits con vidas útiles prolongadas.
En diversas realizaciones, las proteínas y aditivos de estabilización antes mencionados son no fluorescentes o sustancialmente no fluorescentes a la longitud de onda de detección de interés. También es ventajoso que tales 40 proteínas y aditivos de estabilización no interfieran de manera sustancial con las actividades de enlazamiento de las sondas a los microbios objetivo. Ejemplos no limitantes de proteínas adecuadas pueden incluir sin limitación albúmina de suero bovino (BSA), albumina de suero humano, ovalbúmina, caseína y proteínas similares. Ejemplos no limitantes de aditivos estabilizadores pueden incluir sin limitación osmolitos (por ejemplo, trehalosa, trimetil amina n-óxido (TMAO)), citratos, oxalatos, polietilen glicol (PEG), ditiotreitol (DTT), glicerol, 2-mercaptoetanol, ácido etilen 45 diamino tetraacético (EDTA), ácido etilenbis (oxietilen nitrilio)-tetraacético (EGTA), y moléculas similares.
Tiempos de sondeo. En otras realizaciones de la presente divulgación, una o más sondas pueden ser mezcladas con una muestra durante un período de tiempo breve. Tales períodos de tiempo breve pueden variar desde aproximadamente 15 segundos hasta aproximadamente 15 minutos en algunas realizaciones, y desde aproximadamente 30 segundos hasta aproximadamente 5 minutos en otras realizaciones. Sin estar limitados por la 50 teoría, se prevé que el uso de tiempos de sondeo breves puede reducir el enlazamiento no específico de las sondas a componentes microbianos no objetivo de la muestra, reduciendo por lo tanto los resultados de falsos positivos. Sin embargo, el uso de tales tiempos de sondeo breves son todavía suficientes para que la sonda se enlace específicamente a su microbio objetivo. Tales tiempos de sondeos breves pueden combinarse con concentraciones de sondeo no saturadoras referenciadas más arriba. 55
Un problema que puede surgir con tiempos de sondeo breve es que la eficiencia en el enlazamiento a un objetivo específico puede ser baja, poniendo por lo tanto en riesgo la detección. Los solicitantes prevén que los períodos de enlazamiento que van desde aproximadamente 30 segundos hasta aproximadamente 60 segundos pueden ser suficientes para al menos el análisis cualitativo de enlazamiento específico a un microbio objetivo utilizando análisis
por citometría de flujo. De la misma forma, los Solicitantes prevén que los periodos de enlazamiento que van desde aproximadamente 60 segundos hasta aproximadamente 5 minutos o aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 20 minutos pueden ser suficientes para el análisis cuantitativo del enlazamiento en un citómetro de flujo (por ejemplo, detección y recuento de bacterias objetivo). En otras diversas realizaciones de la presente divulgación, se utilizan tiempos de sondeo de aproximadamente 30 segundos hasta aproximadamente 5 minutos o 5 aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 20 minutos. Tales tiempos de sondeo durante una etapa de mezcla pueden ser utilizados ventajosamente para análisis tanto cualitativos como cuantitativos según lo desee el operador.
Bloqueo de epítopos no objetivo. En otras realizaciones de la presente divulgación, se pueden reducir o eliminar sustancialmente resultados de falsos positivos mediante el uso de sondas no etiquetadas que son específicas para 10 epítopos no etiquetados, tales como uno o más componentes microbianos no objetivo de una muestra. Tales sondas no etiquetadas no contienen al menos una etiqueta tal como, por ejemplo, un fluoróforo. En algunas realizaciones, se puede mezclar una muestra con una o más sondas no etiquetadas que se enlazan específicamente a los epítopos de microbios no deseados. Después de esto, la muestra puede ser mezclada con una o más sondas etiquetadas que son específicas para un microbio de interés. En realizaciones adicionales, las muestras pueden ser 15 mezcladas con las sondas etiquetadas y no etiquetadas al mismo tiempo. En otras realizaciones, también pueden incluirse sondas desviadas etiquetadas.
Sin estar limitados por la teoría, se prevé que tales sondas no etiquetadas se unen a sus objetivos designados (por ejemplo, un epítopo reactivo cruzado o un microbio indeseado) y bloqueen el enlazamiento de las sondas etiquetadas a esos epítopos. Por lo tanto, el uso de sondas no etiquetadas puede no interferir sustancialmente con 20 el enlazamiento de sondas etiquetadas a sus epítopos objetivo.
En diversas realizaciones, el uso de sondas no etiquetadas puede ser utilizado en métodos de Identificación de Objetivo Equivalente en Panel, métodos de triangulación fuera de objetivo, y cualquier otro método de citometría de flujo para detectar microbios objetivo divulgado aquí.
Filtración electrónica. También pueden surgir problemas en la detección de microbios con muchas muestras que 25 contienen solamente pocos microbios objetivo de interés. En particular, el número total de eventos detectados durante un análisis de citometría de flujo típico puede variar frecuentemente desde aproximadamente 25.000 hasta aproximadamente 100.000 eventos. Para muchas muestras, los microbios objetivo pueden representar solamente un número muy pequeño del número total de eventos detectados. Adicionalmente, otras partículas pequeñas (por ejemplo, polvo, proteínas pequeñas, partículas pequeñas y similares) dentro de una muestra pueden poseer una o 30 más de las características típicas de un microbio objetivo de interés. Las señales provenientes de tales partículas (denominadas aquí como “ruido químico” o “ruido aleatorio”) pueden oscurecer frecuentemente la detección de un microbio objetivo de interés en una muestra, particularmente cuando hay solamente muy pocos microbios objetivo en la muestra (por ejemplo, menos de aproximadamente 50 bacterias objetivo en algunas realizaciones y menos de aproximadamente 10 bacterias en otras realizaciones). 35
En diversas realizaciones, la presente divulgación también provee métodos para identificar de manera más efectiva microbios objetivo dentro de una muestra. Tales métodos que incluyen técnicas para seleccionar eventos y eliminar no eventos de citometría de flujo se denominan aquí como “Filtración Electrónica”. En diversas realizaciones, los métodos de Filtración Electrónica pueden utilizar una lógica de salida en serie de citometría de flujo para lograr la reducción del ruido químico y el aislamiento de la señal del objetivo. 40
La figura 8 representa un esquema que muestra una realización ilustrativa de la Filtración Electrónica para optimizar el rendimiento de un citómetro de flujo. En estas realizaciones, la sensibilidad de cada canal del detector de citometría de flujo fue reducida al hacer disminuir el voltaje de fotomultiplicador (PMT) (esto es, la ganancia) al nivel mínimo suficiente para detectar eventos provenientes de microbios objetivo. Incluso en esta selección de PMT más bajo, el ruido químico y el aleatorio no son separados discretamente de la señal verdadera. Haciendo referencia a 45 todos los parámetros de canal para cada evento, como se registra en el tiempo, la combinación de todos los canales puede ser utilizada para discriminar ruido químico y/o electrónico a partir de la señal verdadera de los microbios objetivo. Por ejemplo, los canales de detección utilizados pueden incluir FSC, SSC, FL-1, FL-2, y FL-3. Los valores de umbral para cada canal de detección son fijados, con lo cual las salidas del canal de detección de un valor inferior son excluidas de consideración. En la realización mostrada en la figura 8, los valores umbral para FSC y SSC fueron 50 fijados a 0.2, mientras que los valores umbral para FL-1, FL-2 y FL-3 fueron fijados a 0.05. Cada uno de los datos dentro de un intervalo de tiempo recolectados fueron registrados a través de un sello de tiempo representado en la primera columna de las tablas en la figura 8. Tales datos incluían señales de los microbios objetivo así como no señales de cada uno de los canales de detección. A continuación, los intervalos de registro de tiempo donde las señales de uno de los canales no excedía ninguno de los valores de umbral asignados fueron considerados como 55 “no eventos” y eliminados. De la misma manera, los intervalos de tiempo donde las señales de cada uno de los canales excedían el valor umbral asignado fueron seleccionados para análisis posterior. ≥
Una persona de experiencia normal en el arte reconocerá que la Filtración Electrónica tal como se describió aquí
más arriba puede incluir diversas realizaciones. Por ejemplo, el criterio de selección que es utilizado para eliminar diversos intervalos de tiempo puede variar en diferentes realizaciones. De la misma manera, en diversas otras realizaciones, la sensibilidad de los canales de detección en un citómetro de flujo puede o puede no ser reducida. Por ejemplo, en vez de reducir la sensibilidad al reducir la ganancia, la sensibilidad puede ser incrementada incrementando la ganancia. Aunque puede incrementarse el ruido electrónico al incrementar la ganancia, tal ruido 5 electrónico puede ser filtrado de la señal de muestra utilizando los protocolos de salida en serie divulgados aquí. De la misma manera en todavía otras realizaciones, la sensibilidad de los canales de detección en un citómetro de flujo puede ser incrementada incrementando el voltaje de un tubo fotomultiplicador. Adicionalmente, en todavía otras realizaciones, la sensibilidad puede ser incrementada incrementando tanto la ganancia como el voltaje del tubo fotomultiplicador. En todavía realizaciones adicionales, pueden utilizarse canales de detección menores o 10 adicionales. Adicionalmente, tales canales de detección pueden ser asignados con diferentes valores de umbral. En diversas realizaciones, la filtración electrónica puede ser llevada a cabo manualmente. En otras realizaciones, la filtración electrónica puede ser llevada a cabo automáticamente.
Análisis de muestras complejas. Pueden surgir problemas especiales en los análisis por citometría de flujo cuando las muestras que se van a analizar contienen numerosos fluoróforos. Ejemplos no limitantes de tales muestras 15 complejas pueden incluir alimentos (por ejemplo, mantequilla de cacahuete, vegetales, helados), fluidos biológicos (por ejemplo, esputo, orina, sangre), y similares. A manera de fondo, muchos alimentos tiene color y producen alguna fluorescencia natural cuando se excitan con una longitud de onda similar a la usada en el análisis. Por lo tanto, muchas muestras de alimento así como muestras biológicas complejas pueden mostrar emisión en los canales de detección FL-1, FL-2 y FL-3 por excitación con luz azul (tal como se utiliza en citómetros de flujo). Más 20 particularmente, las muestras de alimentos basados en vegetales tales como espinacas pueden tener compuestos autofluorescentes, tales como clorofila, que pueden emitir luz en la región de recuento de FL-3 después de la excitación. De la misma manera, muchas muestras de alimentos pueden ser ricas en proteínas que pueden emitir luz en las regiones de recuento de FL-2 y FL-3 con desplazamientos de Stokes típicamente pequeños.
Por lo tanto, en diversas realizaciones de la presente divulgación, el ruido químico proveniente de tales muestras 25 complejas puede ser reducido o eliminado excitando la muestra con una fuente de energía más alta. Ejemplos no limitantes de tales fuentes puede incluir sin limitación luz ultravioleta, luz violeta, luz de xenón, luz de infrarrojo cercano y similar. Sin estar limitados por la teoría, los Solicitantes creen que el uso de tales fuentes de luz puede reducir y/o eliminar las señales de fondo porque algunos o muchos de los fluoróforos en muestras complejas pueden no ser excitados fluorescentemente por tales fuentes alternativas de luz. También se puede prever que algunos 30 componentes de muestra complejos pueden absorber las fuentes de luz antes mencionadas pero emitirían en una región del espectro (UV, violeta, o azul) que puede no ser usada para la detección.
Otras medidas también pueden ser adecuadas para presentar señales de fondo de muestras complejas, bien sea individualmente o en combinación con las etapas antes mencionadas. Por ejemplo, si una o más de las sondas que se va a utilizar para análisis incluye puntos cuánticos, partículas de oro, esferas de quantum y/o otras etiquetas 35 complejas, puede ser posible para tales etiquetas ser conjugadas a las sondas a niveles de concentración que son sustancialmente menores que las concentraciones de sonda. Tales medidas pueden ayudar a eliminar grumos y/o agregados de etiquetas que pueden contribuir a señales de fondo. En diversas realizaciones, tales rangos de concentración pueden incluir rangos de concentración que colocan la relación molecular de sonda a etiqueta entre aproximadamente 0.25 hasta aproximadamente 1 (por ejemplo, 0.25 moléculas de anticuerpo por una molécula de 40 punto cuántico, por ejemplo). Otras maneras de reducir las señales de fondo de muestras complejas puede ser procesar las muestras por una o más de las etapas de tratamiento descritas previamente o mediante el uso de kits de torunda como se describió previamente para recolectar y tratar las muestras.
Kits y compilaciones. La presente divulgación también describe diversas realizaciones de kits o compilaciones que permiten a los usuarios utilizar los diversos aspectos de la presente divulgación de una manera efectiva y 45 conveniente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la presente divulgación puede proveer un sistema que incluye cualquier combinación de lo siguiente: (1) kits de torundas; (2) sondas específicas para un microbio de interés; (3) software pertinente a la instrumentación para citometría de flujo, lógica de salida, adquisición de datos, entrada de ID de muestra escaneada, postprocesamiento y/o despliegue; (4) manuales de instrucción; (5) equipo relacionado con BBI, incluyendo perlas e instrucciones de calibración; (6) estándares de control positivos para microbios de interés; y 50 (7) instrucciones y/o especificaciones asociados con la preparación de reactivos, formulación de reactivos, desarrollo del ensayo, prueba y otras selecciones.
En realizaciones adicionales, la presente divulgación provee diversos kits que permiten a los usuarios usar las diversas realizaciones presentes en una manera efectiva y conveniente. En algunas realizaciones, tales kits pueden incluir un primer juego de sondas y un segundo juego de sondas, en donde el primer juego de sondas incluye una 55 primera sonda con una primera etiqueta, y un segundo juego con una segunda etiqueta. De la misma manera, el segundo juego de sondas puede incluir una primera sonda con la segunda etiqueta, y una segunda sonda con la primera etiqueta. En esta realización, la primera etiqueta y la segunda etiqueta tienen rangos de emisión de longitud de onda diferente.
En otras realizaciones de la presente divulgación, los kits pueden incluir diferentes conjuntos de reactivos para la detección de microbios objetivo. Tales kits también pueden contener protocolos especializados que son pertinentes al uso de tales reactivos. Tales variaciones pueden ser aplicables si el usuario no obtiene resultados óptimos después de la utilización de un conjunto de reactivos. Después de esto, el usuario puede simplemente conmutar el conjunto de reactivos que está siendo utilizado para obtener mejores resultados. 5
Por ejemplo, en algunas realizaciones, un kit puede proveer a un usuario con una primera sonda y una segunda sonda. La primera sonda puede tener una primera etiqueta y la segunda sonda puede tener una segunda etiqueta. En esta realización, la primera sonda puede ser la misma que la segunda sonda y/o enlazarse al mismo objetivo. Sin embargo, la primera etiqueta y la segunda etiqueta pueden tener diferentes rangos de emisión de longitud de onda. En algunas realizaciones, la primera sonda puede ser un anticuerpo etiquetado con FL-1 específico para un microbio 10 de interés (por ejemplo, primera sonda). Por el contario, la segunda sonda puede ser el mismo anticuerpo que esta anexado a una etiqueta FL-3. Además, el kit puede instruir al usuario sobre cómo conmutar de la primera sonda a la segunda sonda en el evento de que el usuario observe señales de fondo significativas en un despliegue 2-D. La figura 10 representa gráficas de emisión de citometría de flujo ilustrativas que muestran como el ruido en una región de detección puede no estar presente en otra región de detección. Por ejemplo, como se muestra en la gráfica 1000 15 de emisión, ambas señales específicas A y señales de fondo B fueron observadas en la región de recuento FL-1. Sin embargo, como se muestra en la gráfica 1010 de emisión, el uso alternativo de una sonda etiquetada con FL-3 para el microbio desplazo la señal A la región de recuento de FL-3 desde la señal B de fondo en la región de recuento FL-1. Por lo tanto, si el usuario detecta señales B de fondo significativas en la región de recuento FL-1 después de sondear el microbio de interés con la primera sonda etiquetada FL-1, el usuario puede seguir las instrucciones y 20 conmutar a la segunda sonda.
En otras diversas realizaciones, puede desarrollarse un kit similar para ensayos de viabilidad bacteriana. Por ejemplo, tal kit puede contener un primer conjunto de colorantes de ADN para detectar células viables en la región de recuento FL-1 y células no viables en la región de recuento FL-3. Además, el kit también puede contener un segundo conjunto de colorantes de ADN para detectar células viables en la región de recuento FL-3 y células no 25 viables en la región de recuento FL-1 en el evento de que el primer conjunto de colorantes provea al usuario con señales de fondo significativas. Tal kit también puede contener protocolos acerca de cómo usar los diferentes conjuntos de reactivos.
En todavía otras diversas realizaciones de la presente divulgación, un kit puede incluir un primer conjunto de sondas y un segundo conjunto de sondas. En esta realización, el primer conjunto de sondas puede incluir una primera sonda 30 con una primera etiqueta y una segunda sonda con una segunda etiqueta. De la misma forma, el segundo conjunto de sondas puede incluir una tercera sonda con la segunda etiqueta y una cuarta sonda con la primera etiqueta. En algunas realizaciones, la primera sonda puede ser un anticuerpo para un microbio, y la primera etiqueta puede emitir en FL-1. De la misma forma, la segunda sonda puede ser una “sonda desviada” (como se describió previamente), y la segunda sonda puede emitir en FL-3. Además, la tercera sonda puede ser el mismo anticuerpo de la primera 35 sonda excepto que la segunda etiqueta emite en FL-3. De la misma forma, la cuarta sonda puede ser la misma sonda desviada que la segunda sonda con la primera etiqueta que emite en FL-1.
El uso de tales kits puede ser particularmente aplicable cuando se desea detectar bacterias en alimentos. A manera de fondo, los alimentos tienen color y fluorescencia natural. Además, el alimento puede tener partículas en un rango de tamaño de células bacterianas que pueden emitir colores cuando se excitan. Por ejemplo, los vegetales verdes 40 contienen clorofilas que emiten en la región de recuento FL-3 pero no en la región de recuento FL-1. Por lo tanto, un ensayo para bacterias en espinaca, por ejemplo, que cuenta la emisión en FL-1 y utiliza FL-3 para el canal de desvío no experimentará interferencia proveniente de la matriz del alimento. Sin embargo, componentes saborizantes y naturales en pollo cocinado pueden frecuentemente mostrar emisión de fondo en el canal FL-1 pero no en el canal FL-3. Por lo tanto, para el análisis efectivo de tales elementos, un kit puede contener un conjunto de sondas para un 45 microbio de interés que está etiquetado con moléculas que emiten luz en la región de recuento FL-1. De la misma forma, el mismo kit puede contener otro conjunto de las mismas sondas que esta etiquetado con moléculas que emiten luz en la región de recuento FL-3. El kit también puede contener protocolos acerca de cómo usar los diferentes conjuntos de reactivos.
Aplicaciones. Una persona de experiencia normal en el arte reconocerá que los numerosos aspectos de la presente 50 divulgación pueden ser combinados en diferentes variaciones para proveer sistemas y métodos basados en citometría de flujo útiles para la detección microbiana. Tales sistemas y métodos pueden permitir que los usuarios detecten, caractericen y cuantifiquen microbios de interés en tiempo real a partir de diversas muestras, tales como alimentos, especímenes biológicos, objetos diversos, fuentes de agua y similares. Además, tales sistemas no requieren el uso de técnicas de cultivo celular o amplificación de ADN/ARN. De acuerdo con lo anterior, se pueden 55 prever numerosas aplicaciones de cualquiera de las diversas realizaciones de la presente divulgación.
Por ejemplo, los sistemas y métodos de la presente divulgación pueden permitir que el personal profesional en cuidado de salud responda más efectivamente a casos que son pertinentes a contaminación con alimentos o epidemias. Tales sistemas y métodos también pueden ser utilizados para ensayos direccionados en tiempo real para
detectar armas biológicas. También se puede prever el uso de los sistemas y métodos de la presente divulgación en ensayos específicos de patógenos para detectar microbios, tales como, por ejemplo, E. coli 0157, Salmonella y Listeria monocytogenes. De la misma manera, tales sistemas y métodos pueden permitir la detección en tiempo real de células TB en esputo, sin requerir semanas de incubación celular.
Ejemplos experimentales 5
Los siguientes ejemplos se proveen para ilustrar de manera más completa algunas de las realizaciones divulgadas aquí anteriormente. Es evidente para las personas experiencia normal en el arte que las técnicas divulgadas en los ejemplos que siguen representan técnicas que constituyen modos de ejemplo para la práctica de la divulgación. Las personas de experiencia normal en el arte deberían apreciar, a la luz de la presente divulgación, que pueden hacerse muchos cambios en las realizaciones específicas que están divulgadas y obtener todavía un resultado igual 10 o similar sin apartarse del espíritu y alcance de la divulgación.
En los ejemplos que siguen, los métodos de citometría de flujo definidos más arriba aquí se denominan colectivamente como métodos RAPID-B o LRB.
Ejemplo 1: Evaluación por citometría de flujo de E. coli en ensalada empacada, masa para galletas y salami. Se obtuvieron ensalada empacada, masa para galletas y salami de diversos mercados de víveres. Cada muestra fue 15 preparada para probar de acuerdo con el Manual Analítico Bacteriológico de la FDA (BAM) Capítulo 4a el día antes de la prueba. Todos los pesos de las muestras preparadas fueron de 25 gramos, pesados antes de la inoculación o de la adición de caldo de enriquecimiento. Todas las muestras para un producto dado fueron “procesadas”, manipuladas y probadas como un lote individual. El BAM específica una proporción de 9:1 de medio de crecimiento a muestra como se observó en todas las pruebas. El caldo de enriquecimiento EHEC mTSB (caldo de triticasa soya 20 modificado, Opción 1 BAM) fue utilizado para todas las pruebas de referencia. Los niveles de inoculación por siembra fueron verificados mediante un arreglo de 5 placas 5 PCA para cada nivel de inoculación; los niveles de inoculación fueron calculados con base en el promedio de los resultados del arreglo.
Todas las muestras de producto fueron sembradas con la E. coli 0157:H7, código de referencia ATCC 43888 no productora de la toxina Shiga. Las muestras de salami y ensalada empacada fueron cortadas primero porque un 25 empaquetamiento rápido sin corte, como se específica en el BAM, no da como resultado consistentemente una homogeneidad de la muestra. Se utilizaron procedimientos de manipulación aséptica en todo el procesamiento. Las muestras de producto fueron agregadas a bolsas de filtración Whirlpak® e inoculadas con 100 µL de E. coli 0157 ATCC 43888. Las muestras fueron añejadas durante 4 horas según la guía del Food Emergency Response Network (FERN) nivel 2, seguida por la adición de 225 mL de caldo de enriquecimiento (mTSB para muestras de referencia o 30 caldo tripticasa soya (TSB) para muestras RAPID-B). Las muestras fueron empaquetadas durante 5 minutos y colocadas en una incubadora a 37°C para crecimiento nocturno. Todas las muestras fueron preparadas y colocadas al mismo tiempo en la misma incubadora después de 30 minutos de la preparación.
Después de crecimiento nocturno, cada bolsa Whirlpak® fue agitada ligeramente y luego se tomo una alícuota de 1 mL de cada una. La muestra de 1 mL para la prueba de citometría de flujo RAPID-B fue filtrada a través de un filtro 35 de 5 µm antes de preparar las diluciones LOG. Las diluciones seriadas LOG fueron preparadas de la misma manera para RAPID-B y para el método de referencia como sigue: el volumen de 1 mL fue agregado a 9 mL de solución salina regulada con fosfato, repetido en serie, hasta el 4º LOG. Las placas extendidas para el método de referencia utilizaron un volumen de muestra de 100 µL sobre placas TCSMAC (total 4 placas a partir de tres diluciones). Adicionalmente, una placa de extensión TCSMAC fue preparada para cada muestra. Las placas que exhibieron 40 crecimiento de colonias fueron procesadas adicionalmente de acuerdo con los métodos BAM para generar resultados confirmados “positivos” o “negativos”. Las muestras RAPID-B fueron preparadas agregando 100 µL de muestra diluida LOG a 900 µL de solución salina regulada con fosfato, 240 µL de sonda B fluorescente y 10 µL de sonda A fluorescente (generando un total de volumen preparado de 1.25 mL). La muestra RAPID-B preparada fue sometida a vórtex durante 10 minutos antes del análisis del volumen preparado de 1.25 mL. Cada una de estas 45 muestras de 1.25 mL produjeron tres ensayos en replicado que permitieron un establecimiento burdo de la homogeneidad de la muestra y la consistencia de análisis a análisis para los resultados.
Los análisis por citometría de flujo fueron llevados a cabo como sigue: la mezcla de muestra fue cargada sobre un citómetro de flujo que había sido calibrado previamente con un protocolo de salida de E, coli 0157. En cada análisis por citometría de flujo RAPID-B, se aspiraron 200 µL de muestra hacia el instrumento (aproximadamente 30 50 segundos). Se analizó un volumen de 100 µL por parte del instrumento a una rata de flujo de 100 µL/minuto. Los recuentos bacterianos en la región objetivo de “E. coli 0157 viva” fueron registrados y el Análisis fue salvado para observación posterior. Se llevaron a cabo otras purgas (definición instrumental estándar, aproximadamente 45 segundos de tiempo total para las tres purgas) entre los análisis. Subsecuentemente, se analizan dos replicados adicionales de la muestra preparada, produciendo 3 ensayos en total para cada muestra. Se utilizó un umbral de 10 55 recuentos (por ejemplo sustraído de los recuentos reportados).
Los resultados de las pruebas para la ensalada empacada, masa para galletas y salami se resumen en las Tablas 4-
6. Las figuras 11A-11C representan gráficas de emisión por citometría de flujo con salida ilustrativas obtenidas por los métodos RAPID-B para matrices de ensalada empacada (figura 11A), masa para galletas (figura 11B) y salami (figura 11C) En resumen, los métodos de citometría de flujo RAPID-B identificaron correctamente todas las muestras positivas y negativas generando una rata de sensibilidad global de 1.0 y una rata de falsos negativos de 0.00 para las tres matrices de producto. Comparativamente, el Método de Referencia produjo una rata de sensibilidad de 0.83 5 y una rata de falsos negativos de 0.17 para las mismas matrices de producto. Estos resultados indican que los métodos RAPID-B son superiores que el Método de Referencia.
Tabla 4. Prueba de E. coli 0157 de ensalada empacada utilizando métodos de citometría de flujo RAPID-B
Resultado cualitativo Recuento celular LRB
ID
Marca Peso (g) Volumen caldo (ml) Inóculo aproximado BAM Muestras (cfu) Inóculo aproximado LRB Muestras (cfu) Resultado BAM final Resultado LRB final LRB análisis 1 LRB análisis 2 LRB análisis 3
S-1
DOLE-TG 25 225 0 0 - - 0 0 0
S-2
DOLE-TG 25 225 6 6 - - 204 243 221
S-3
DOLE-TG 25 225 70 70 - - 482 521 513
S-4
DOLE-TG 25 225 0 0 - - 0 1 1
S-5
DOLE-TG 25 225 6 6 - - 52 54 65
S-6
DOLE-TG 25 225 70 70 - - 70 63 72
S-7
DOLE-7L 25 225 0 0 - - 1 1 2
S-8
DOLE-7L 25 225 6 6 - - 973 1014 1030
S-9
DOLE-7L 25 225 70 70 - - 8470 8772 8565
S-10
F.E.-Ital 25 225 0 0 - - 0 0 0
S-11
F.E.-Ital 25 225 6 6 - - 48 53 45
S-12
F.E.-Ital 25 225 70 70 - - 775 876 774
S-13
F.E.-5 25 225 0 0 - - 1 1 1
S-14
F.E.-5 Lmix 25 225 6 6 - - 97871 97026 97108
S-15
F.E.-5 Lmix 25 225 70 70 - - 110690 153208 131376
S-16
F.E.-Amer 25 225 0 0 - - 2 2 0
Resultado cualitativo Recuento celular LRB
ID
Marca Peso (g) Volumen caldo (ml) Inóculo aproximado BAM Muestras (cfu) Inóculo aproximado LRB Muestras (cfu) Resultado BAM final Resultado LRB final LRB análisis 1 LRB análisis 2 LRB análisis 3
S-17
F.E.-Amer 25 225 6 6 - - 1533 1508 1531
S-18
F.E.-Amer. 25 225 70 70 - - 36488 38270 40599
SN
SN
0 225 0 0 - - 1 0 1
Tabla 5: Prueba de E. coli 0157 de masa para galletas usando métodos de citometría de flujo RAPID-B
Resultado cualitativo Recuento celular LRB
ID de muestra
Sabor de la masa Peso (g) Volumen caldo (ml) Inóculo aproximado BAM Muestras (cfu) Inóculo aproximado LRB Muestras (cfu) Resultado BAM final Resultado LRB final LRB análisis 1 LRB análisis 2 LRB análisis 3
CD-1
Sug 25 225 0 0 - - 0 0 0
CD-1
Sug 25 225 5 5 + + 170 177 209
CD-3
Sug 25 225 65 65 + + 2507 2545 2652
CD-4
PB 25 225 0 0 - - 1 1 1187
CD-5
PB 25 225 5 5 + + 159 196 187
CD-6
PB 25 225 65 65 + + 1141 1141 11400
CD-7
CC 25 225 0 0 - - 1 0 0
CD-8
CC 25 225 5 5 + + 355
CD-9
CC 25 225 65 65 + + 4533 4686 4738
CD-10
OMRais 25 225 0 0 - - 1 0 1
CD-11
OMRais 25 225 5 5 + + 289 242 276
CD-12
OMRais 25 225 65 65 + + 794 800 857
CD-13
SugP 25 225 0 0 - - 1 0 0
CD-14
SugP 25 225 5 5 + + 747 748 781
CD-15
SugP 25 225 65 65 + + 3051 2984 3088
Resultado cualitativo Recuento celular LRB
ID de muestra
Sabor de la masa Peso (g) Volumen caldo (ml) Inóculo aproximado BAM Muestras (cfu) Inóculo aproximado LRB Muestras (cfu) Resultado BAM final Resultado LRB final LRB análisis 1 LRB análisis 2 LRB análisis 3
CD-16
CinSug 25 225 0 0 - - 0 0 2
CD-17
CinSug 25 225 5 5 + + 1368 1386 1475
CD-18
CinSug 25 225 65 65 + + 8194 13488 16687
SN
0 225 0 0 - - 0 0 0
Tabla 6: Prueba de E. coli 0157 de salami usando métodos de citometría de flujo RAPID-B
Resultado cualitativo Recuento celular LRB
ID
Sabor de salami Peso (g) Volumen caldo (ml) Inóculo aproximado BAM Muestras (cfu) Inóculo aproximado LRB Muestras (cfu) Resultado BAM final Resultado LRB final LRB análisis 1 LRB análisis 2 LRB análisis 3
SM-1
Hormel 25 225 0 0 - - 1 1 2
SM-2
Hormel 25 225 9.6 9.6 + - 9552 10211 10262
SM-3
Hormel 25 225 9.6 9.6 + + 34854 32903 41621
SM-4
Fiorucci 25 225 0 0 - - 8 4 3
SM-5
Fiorucci 25 225 9.6 9.6 + + 1352 1576 1568
SM-6
Fiorucci 25 225 9.6 9.6 + + 32218 35723 36433
SM-7
Daniele 25 225 0 0 - - 6 4 4
SM-8
Daniele 25 225 9.6 9.6 + + 7843 7294 7660
SM-9
Daniele 25 225 9.6 9.6 + + 9775 9664 9885
SM-10
Busseto 25 225 0 0 - - 1 0 2
SM-11
Busseto 25 225 9.6 9.6 + + 4341 4235 4332
SM-12
Busseto 25 225 9.6 9.6 + + 23523 23625 23632
SM-13
B-Head 25 225 0 0 - - 3 4 4
SM-14
B-Head 25 225 9.6 9.6 + + 12340 12458 12680
SM-15
B-Head 25 225 9.6 9.6 + + 30038 32737 33818
Resultado cualitativo Recuento celular LRB
ID
Sabor de salami Peso (g) Volumen caldo (ml) Inóculo aproximado BAM Muestras (cfu) Inóculo aproximado LRB Muestras (cfu) Resultado BAM final Resultado LRB final LRB análisis 1 LRB análisis 2 LRB análisis 3
SM-16
Priv.Sel 25 225 0 0 - - 0 3 2
SM-17
Priv.Sel 25 225 9.6 9.6 + + 31817 30387 32878
SM-18
Priv.Sel 25 225 9.6 9.6 + + 66738 63271
SN
0 225 0 0 - - 1 2 0
Ejemplo 2: Evaluación por citometría de flujo de E. coli en espinaca, pimientos jalapeños y carne molida. Se obtuvieron la espinaca, pimientos jalapeños y carne molida de diversos mercados de víveres. La preparación de las muestras y la adquisición de datos para RAPID-B y el Método de Referencia fueron llevadas a cabo esencialmente como se delineo en el Ejemplo 1.
Los resultados de la prueba para espinaca, pimientos jalapeños y carne molida se resumen en las Tablas 7-9. Las 5 figuras 12A y 12B presentan gráficas de emisión por citometría de flujo con salida ilustrativas obtenidas por los métodos RAPID-B para matrices de pimiento jalapeño a varios niveles de dilución. La figura 13 presente una gráfica de emisión por citometría de flujo con salida ilustrativa para una matriz de pimiento jalapeño de control negativo. Se observaron sensibilidades y ratas de falsos negativos comparables a las del Ejemplo 1. El método de referencia en este caso produjo un falso positivo para la muestra B-7. 10
Tabla 7: Prueba de E. coli 0157 de espinaca usando métodos de citometría de flujo RAPID-B
Resultado cualitativo Recuento celular LRB
ID
Peso (g) Volumen caldo (ml) Inóculo aproximado BAM Muestras (cfu) Inóculo aproximado LRB Muestras (cfu) Resultado BAM final Resultado LRB final LRB análisis 1 LRB análisis 2 LRB análisis 3
S-1
25 225 0 0 - - 0 0 0
S-2
25 225 5 5 + + 691 706 758
S-3
25 225 50 50 + + 1496 1780 1777
S-4
25 225 0 0 - - 0 0 0
S-5
25 225 5 5 + + 170 174 174
S-6
25 225 50 50 + + 3420 4149 3279
S-7
25 225 0 0 - - 0 0 0
S-8
25 225 5 5 + + 226 215 205
S-9
25 225 50 50 + + 2224 1989 2034
S-10
25 225 0 0 - - 0 1 0
S-11
25 225 5 5 + + 251 233 216
S-12
25 225 50 50 + + 1816 1488 1489
S-13
25 225 0 0 - - 0 0 0
S-14
25 225 5 5 + + 8456 671 804
S-15
25 225 50 50 + + 2219 2307 2417
Resultado cualitativo Recuento celular LRB
ID
Peso (g) Volumen caldo (ml) Inóculo aproximado BAM Muestras (cfu) Inóculo aproximado LRB Muestras (cfu) Resultado BAM final Resultado LRB final LRB análisis 1 LRB análisis 2 LRB análisis 3
S-16
25 225 0 0 - - 0 0 0
S-17
25 225 5 5 + + 3584 4103 3790
S-18
25 225 50 50 + + 1457 1507 1667
SN
0 225 0 0 - - 0 0 0
Tabla 8: Prueba de E. coli 0157 de pimientos jalapeños utilizando métodos de citometría de flujo RAPID-B
Resultado cualitativo Recuento celular LRB
ID
Peso (g) Volumen caldo (ml) Inóculo aproximado BAM Muestras (cfu) Inóculo aproximado LRB Muestras (cfu) Resultado BAM final Resultado LRB final LRB análisis 1 LRB análisis 2 LRB análisis 3
P-1
25 225 0 0 - - 0 0 0
P-2
25 225 20 25 + + 113 107 129
P-3
25 225 200 250 + + 395 475 371
P-4
25 225 0 0 - - 0 0 0
P-5
25 225 20 25 + + 235 319 355
P-6
25 225 200 250 + + 431 463 437
P-7
25 225 0 0 - - 0 0 0
P-8
25 225 20 25 + + 266 298 299
P-9
25 225 200 250 + + 398 435 456
P-10
25 225 0 0 - - 1 0 0
P-11
25 225 20 25 + + 100 150 107
P-12
25 225 200 250 + + 611 624 650
P-13
25 225 0 0 - - 0 0 0
P-14
25 225 20 25 + + 50 44 36
Resultado cualitativo Recuento celular LRB
ID
Peso (g) Volumen caldo (ml) Inóculo aproximado BAM Muestras (cfu) Inóculo aproximado LRB Muestras (cfu) Resultado BAM final Resultado LRB final LRB análisis 1 LRB análisis 2 LRB análisis 3
P-15
25 225 200 250 + + 365 379 320
P-16
25 225 0 0 - - 0 0 0
P-17
25 225 20 25 + + 103 102 93
P-18
25 225 200 250 + + 446 605 573
SN
0 225 0 0 - - 0 0 0
Tabla 9: Prueba de E. coli 0157 de carne molida utilizando métodos de citometría de flujo RAPID-B
Resultado cualitativo Recuento celular LRB
ID
Peso (g) Volumen caldo (ml) Inóculo aproximado BAM Muestras (cfu) Inóculo aproximado LRB Muestras (cfu) Resultado BAM final Resultado LRB final LRB análisis 1 LRB análisis 2 LRB análisis 3
B-1
25 225 0 0 - - 0 0 0
B-2
25 225 10 10 + + 130 172 127
B-3
25 225 100 100 + + 1164 1192 972
B-4
25 225 0 0 - - 0 0 00
B-5
25 225 10 10 + + 101 100 99
B-6
25 225 100 100 + + 1178 1158 1228
B-7
25 225 0 0 - - 0 0 0
B-8
25 225 10 10 + + 754 699 749
B-9
25 225 100 100 + + 3269 3463 3776
B-10
25 225 0 0 - - 1 0 0
B-11
25 225 10 10 + + 980 947 941
B-12
25 225 100 100 + + 4578 4612 4710
B-13
25 225 0 0 - - 1 1 0
B-14
25 225 10 10 + + 1066 10894 1128
B-15
25 225 100 100 + + 843 857 802
Resultado cualitativo Recuento celular LRB
ID
Peso (g) Volumen caldo (ml) Inóculo aproximado BAM Muestras (cfu) Inóculo aproximado LRB Muestras (cfu) Resultado BAM final Resultado LRB final LRB análisis 1 LRB análisis 2 LRB análisis 3
B-16
25 225 0 0 - - 1 1 1
B-17
25 225 10 10 + + 148 144 165
B-18
25 225 100 100 + + 884 933 899
SN
0 225 0 0 - - 0 0 0
Ejemplo 3: Evaluación por citometría de flujo de Salmonella en mantequilla de cacahuete, pimientos jalapeños y tomates. Se obtuvieron la mantequilla de cacahuete, los pimientos jalapeños y los tomates de un proveedor local. La proporción especificada de 9:1 del BAM de medio de crecimiento a muestra fue observada en toda la prueba. Los tomates y los pimientos fueron picados groseramente antes de la prueba. La mantequilla de cacahuete no requirió de preparación. En cada caso, el volumen de muestra fue pesado y colocado en una bolsa de filtro Whirlpak®. Todas 5 las muestras fueron inoculadas (in situ) con niveles conocidos de bacterias de Salmonella y se dejaron asentar sin la adición de caldo de enriquecimiento durante una hora. El caldo de enriquecimiento (90 mL) fue agregado a cada bolsa de muestra. Todas las muestras fueron digeridas entonces durante 5 minutos y colocadas en una incubadora a 37ºC para su crecimiento. Solamente se prepararon muestras en caldo de enriquecimiento con un volumen de muestra de 90 mL en bolsas de filtro Whirlpak y se inocularon directamente con bacterias a niveles de concentración 10 conocidos sin digestión.
Todas las muestras fueron preparadas y colocadas en la misma incubadora al cabo de 30 minutos de la preparación al mismo tiempo. Después del crecimiento, se recolecto una alícuota de 2 mL de muestra de cada bolsa Whirlpak y luego se filtro a través de un filtro de 5 µm y se diluyo 4-LOGs. La muestra fue dividida, siendo utilizada una porción con la adición de sondas fluorescentes para RAPID-B y la otra usada para inocular directamente placas de superficie 15 prepreparadas. Las placas de superficie prepreparadas fueron utilizadas de tal forma que todas las placas fueron inoculadas al cabo de 10 minutos del análisis con RAPID-B. De la misma forma, se utilizo un volumen en placa de 100 µL para maximizar la separación de organismos sobre la placa, minimizando el potencial de subrecuento de colonias postincubación. Los análisis por citometría de flujo fueron logrados sustancialmente similares a los del Ejemplo 1, excepto que el citómetro de flujo había sido calibrado previamente con un protocolo de salida para 20 Salmonella.
Los resultados de las pruebas para mantequilla de cacahuete, pimientos jalapeños y tomates se resumen en las Tablas 10-12. Se observaron sensibilidades y ratas de falsos negativos comparables al Ejemplo 1. Los resultados para pimientos jalapeños presentados en la Tabla 11 demuestran que los dos citómetros de flujo que habían sido estandarizados uno contra otro proveen recuentos celulares que son consistentes uno con otro entre instrumentos. 25 La muestra TM14 produjo un resultado positivo marginal a la vez que se esperaba un resultado negativo.
Tabla 10: Salmonella. Prueba de Salmonella en mantequilla de maní utilizando métodos de citometría de flujo RAPID-B
Recuento celular LRB
Muestra ID
Peso mantequilla cacahuete (g) Volumen caldo (ml) Número aproximado de bacterias agregadas Dilución Análisis 1 Análisis 2 Análisis 3 Resultado placa
Neg
90 0 1 2 3 -
PB01
10 90 1800 10^-4 4014 4580 4767 +
PB02
10 90 18 10^-4 1394 1420 1412 +
PB03
10 90 18 10^-4 1423 1434 1449 +
PB04
10 90 1800 10^-4 4474 4651 4494 -
PB05
10 90 0 10^-4 6 1 1 -
PB06
10 90 0 10^-4 0 1 2 -
PB07
10 90 0 10^-4 0 0 1 -
PB08
10 90 18 10^-4 2827 2930 3014 +
PB09
10 90 18 10^-4 2811 2888 2907 +
PB010
10 90 1800 10^-4 4730 4688 4699 +
PB011
10 90 18 10^-4 6442 6471 6436 +
PB012
10 90 0 10^-4 0 0 8 -
PB013
10 90 0 10^-4 1 2 2 -
PB014
10 90 1800 10^-4 7921 8209 8002 +
PB015
10 90 18 10^-4 2878 2874 2930 +
Tabla 11: Prueba de Salmonella en pimientos jalapeños utilizando métodos de citometría de flujo RAPID-B
Recuento celular LRB Instrumento # 1 Recuento celular LRB Instrumento # 2
ID
Jalapeño peso (g) Volumen caldo (ml) Número aproximado de bacterias agregadas Dilución Análisis 1 Análisis 2 Análisis 3 Análisis 1 Análisis 2 Análisis 3
Neg
90 n 10^-4 0 0 0 8 4 1
JP01
10 90 0 10^-4 5 3 2 3 1 2
JP02
10 90 0 10^-4 1 3 3 2 2 2
JP03
10 90 800 10^-4 2250 2230 2243 2222 2275 2268
JP04
10 90 8 10^-4 194 196 207 189 190 195
JP05
10 90 800 10^-4 922 986 1020 915 1086 947
JP06
10 90 8 10^-4 11 18 41 6 9 21
JP07
10 90 800 10^-4 300 311 334 311 335 379
JP08
10 90 8 10^-4 23 30 30 27 17 22
JP09
10 90 0 10^-4 4 9 8 6 7 9
JP10
10 90 800 10^-4 2255 2355 2593 2297 2231 2261
JP11
10 90 800 10^-4 2181 2298 2573 2268 2184 2341
JP12
10 90 8 10^-4 335 471 536 295 324 382
JP13
10 90 0 10^-4 3 8 7 1 6 9
JP14
10 90 8 10^-4 626 651 761 563 688 654
Recuento celular LRB Instrumento # 1 Recuento celular LRB Instrumento # 2
ID
Jalapeño peso (g) Volumen caldo (ml) Número aproximado de bacterias agregadas Dilución Análisis 1 Análisis 2 Análisis 3 Análisis 1 Análisis 2 Análisis 3
JP15
10 90 0 10^-4 5 5 5 5 5 3
Neg
90 n 10^-2 4 2
JP01
10 90 0 10^-2 133 93
JP02
10 90 0 10^-2 89 105
JP06
10 90 8 10^-2 1573 1611
JP08
10 90 0 10^-2 8493 8435
JP09
10 90 0 10^-2 101 59
JP13
10 90 0 10^-2 41 103
JP14
10 90 8 10^-2 97557
JP15
10 90 0 10^-2 79 82
Tabla 12: Prueba de Salmonella en tomates utilizando métodos de citometría de flujo RAPID-B
Recuento celular LRB
ID
Peso tomates (g) Volumen caldo (ml) Número aproximado de bacterias agregadas Dilución Análisis 1 Análisis 2 Análisis 3 Resultado placa
Reactivo
3 1 1
Neg
90 0 10^-4 10 0 6 -
TM01
10 90 0 10^-4 2 1 3 -
TM02
10 90 0 10^-4 3 1 2 -
TM03
10 90 500 10^-4 1 3 1 -
TM04
10 90 5 10^-4 59 50 73 +
TM05
10 90 500 10^-4 2718 2672 2734 +
TM06
10 90 5 10^-4 68 67 85 +
TM07
10 90 500 10^-4 2077 2470 2537 +
TM08
10 90 5 10^-4 94 99 82 +
TM09
10 90 0 10^-4 5 4 8 -
TM10
10 90 500 10^-4 557 568 586 +
TM11
10 90 500 10^-4 2235 2218 2245 +
TM12
10 90 5 10^-4 40 30 30 +
TM13
10 90 0 10^-4 7 5 9 -
TM14
10 90 5 10^-4 10 13 8 -
Recuento celular LRB
ID
Peso tomates (g) Volumen caldo (ml) Número aproximado de bacterias agregadas Dilución Análisis 1 Análisis 2 Análisis 3 Resultado placa
TM15
10 90 0 10^-4 0 2 1 -
NEG
10^-3 2 1 1
TM04
10 90 5 10^-3 738
TM06
10 90 5 10^-3 689
TM08
10 90 5 10^-3 919
TM12
10 90 5 10^-3 427
TM12
10 90 5 10^-3 427
Ejemplo 4: Evaluación por citometría de flujo de Salmonella en pimientos jalapeños en la presencia de microorganismos no objetivo. La preparación de la muestra se logró como se delineó más arriba en el Ejemplo 3, excepto que los pimientos jalapeños fueron inoculados primero con los microorganismos, y luego se dejaron secar al aire.
El propósito de este estudio es establecer la influencia de microorganismos no objetivo sobre el ensayo del 5 organismo objetivo Salmonella. Los resultados de la prueba para los pimientos jalapeños en la presencia de diversos microorganismos no objetivo (E. coli, Shigella y Citrobacter) se resumen en la Tabla 13. Los niveles de inoculación de Salmonella serotipo Typhimurium fueron variados entre 101 y 103 CFU. Las muestras de pimientos jalapeños no fueron pretratadas para reducir la flora de fondo de origen natural. Los niveles de carga en la muestra de flora de fondo fueron establecidos con placas de agar PCA. En todos los casos, el ensayo de Salmonella por RAPID-B indicó 10 correctamente la presencia de Salmonella. Las muestras inoculadas solamente con bacterias competitivas no produjeron resultados falsos positivos mediante el ensayo para Salmonella RAPID-B, incluso cuando se utilizó caldo de crecimiento selectivo. Los métodos de referencia FDA BAM también identificaron correctamente las muestras positivas en Salmonella (cuando se utilizó el caldo de crecimiento requerido de selenito cistina), con la excepción del Punto de Prueba 18, que fue inoculado a un nivel demasiado bajo para producir resultados. 15
Tabla 13: Ensayo de competición de Salmonella por métodos de citometría de flujo RAPID-B en la presencia de microorganismos competidores
Recuento celular LRB Cultivo por el método de referencia estándar
ID
Volumen caldo (ml) Est # de Sal (cfu) 2º Bact. Est # de 2º bact. Peso JP (g) Dilución Análisis 1 Análisis 2 Análisis 3 HE negro @ 10^-6 HE negro @ 10^-3 HE otro @ 10^-6 HE otro @ 10^-3 PCA @ 10^-6 PCA @ 10^-3
Real Corr. Real Corr. Real Corr.
Neg TSB
TSB/100 10^-3 0 0 2 0 0 0 0 0 0
Neg SC
SC/100 10^-3 1 2 2 0 0 0 0 0 0
Lavado JP
TSB/100 10^-3 15 22 25 2 2000 150 150000 TNTC TNTC +
1
TSB/100 Citro 20 10^-3 2 1 1 53 53000 0 0 TNTC TNTC +
2
TSB/100 Shig 5 10^-3 1 2 1 0 0 58 58000 54 54000
3
TSB/100 E.coli 1 10^-3 0 3 1 0 0 0 0 0 0
4
TSB/100 18 10^-3 67803 67675 63328 225 225000 0 0 201 201000
5
TSB/100 1800 Citro 2000 10^-3 38345 32345 33334 202 202000 0 0 TNTC TNTC +
6
SC/100 1800 Citro 2000 10^-3 10230 10979 11215 20 20000 0 0 111 111000
7
TSB/100 1800 Shig 500 10^-3 66077 71283 79766 126 126000 9 9000 TNTC TNTC +
8
SC/100 1800 Shig 500 10^-3 13667 13027 13482 44 44000 0 0 124 12
Recuento celular LRB Cultivo por el método de referencia estándar
Recuento celular LRB Cultivo por el método de referencia estándar
ID
Volumen caldo (ml) Est # de Sal (cfu) 2º Bact. Est # de 2º bact. Peso JP (g) Dilución Análisis 1 Análisis 2 Análisis 3 HE negro @ 10^-6 HE negro @ 10^-3 HE otro @ 10^-6 HE otro @ 10^-3 PCA @ 10^-6 PCA @ 10^-3
9
TSB/100 1800 E.coli 100 10^-3 44322 43121 42692 103 103000 0 0 TNTC TN
10
SC/100 1800 E.coli 100 10^-3 11511 9511 10603 49 49000 0 0 TNTC TN
11
SC/100 18 Citro 20 10^-3 6716 6249 7443 19 19000 0 0 TNTC TNTC +
12
SC/100 18 Shig 5 10^-3 10732 7344 6632 19 19000 0 0 30 30000
13
SC/100 18 E.coli 1 10^-3 5415 7639 9123 76 76000 0 0 TNTC TNTC +
14
SC/100 18 10^-3 21373 22355 22891 16 16000 0 0 TNTC TNTC
15
SC/90 1800 Shig 500 10 10^-3 54330 62491 65519 76 76000 21 21000 TNTC TN
16
SC/90 18 10 10^-3 6799 6981 4483 8 8000 50 50000 TNTC TN
17
SC/90 1800 10 10^-3 29272 35789 37292 88 88000 98 98000 TNTC TN
18
SC/90 18 E.coli 1 10 10^-3 1548 1507 1475 0 0 39 39000 151 15
19
SC/90 18 Citro 20 10 10^-3 8489 8068 7738 8 8000 49 49000 97 970
20
SC/90 10 10^-3 21 7 1 0 0 124 124000 TNTCC TN
21
TSB/90 10 10^-3 2 1 0 0 0 33 33000 TNCT TN
22
SC/100 Citro 2000 10^-3 3 1 0 0 0 0 0 0 0
23
SC/100 Shig 500 10^-3 1 1 1 0 0 0 0 0 0
ID
Volumen caldo (ml) Est # de Sal (cfu) 2º Bact. Est # de 2º bact. Peso JP (g) Dilución Análisis 1 Análisis 2 Análisis 3 HE negro @ 10^-6 HE negro @ 10^-3 HE otro @ 10^-6 HE otro @ 10^-3 PCA @ 10^-6 PCA @ 10^-3
24
SC/100 E.coli 100 10^-3 1 1 0 0 0 0 0 0 0
Ejemplo 5: Evaluación por citometría de flujo de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) en muestras de esputo humano. Se obtuvieron cinco muestras de esputo humano del Arkansas Departament of Health (ADH). Las muestras de esputo habían identificadas previamente por ADH como positivas para Mtb. El análisis por citometría de flujo fue llevado a cabo utilizando un citómetro de flujo que había sido calibrado previamente utilizando un protocolo de salida Mtb. El procesamiento de la muestra se logró por modificaciones de los métodos usados para procesar alimentos 5 definidos más arriba. Específicamente, se diluyó el esputo, se pretrató y se mezcló con reactivos de sonda para Mtb. Como controles de ensayo, las muestras que contenían reactivos de sonda solos (esto es, sin esputo) y las muestras que contenían solo esputo (esto es, sin reactivos de sonda) también fueron analizadas por citometría de flujo para determinar el nivel del ruido de fondo en el ensayo. Las figuras 14A y 14B presentan gráficas de emisión por citometría de flujo ilustrativas obtenidas por los métodos RAPID-B que muestran que los reactivos de sonda y el 10 esputo solos no produjeron fluorescencia de fondo en la región de detección para Mtb de salida 1400. En contraste, cuando cada una de las muestras con esputo fue mezclada con los reactivos de sonda Mtb, se detectaron señales fluorescentes en la región de detección de Mtb de salida 1400. Las figuras 15A-15C presentan graficas de emisión por citometría de flujo ilustrativas para recuentos bacterianos de Mtb obtenidos por los métodos RAPID-B a partir de muestras de esputo de pacientes con tuberculosis. Los ensayos replicados hechos con separación de un día dieron 15 el mismo nivel de recuento celular. El ensayo fue semicuantitativo en la medición de la carga bacteriana. Con base en los resultados presentados en las figuras 15A-15C, el orden de severidad para la infección por Mtb en los sujetos fue estimada como C>B>A. Este orden de severidad de la infección fue confirmado finalmente por ADH. Las muestras de control negativo de esputo obtenido de voluntarios saludables no proveyó recuentos de Mtb en la región de detección de Mtb de salida. 20
A partir de la descripción anterior, una persona de experiencia normal en el arte puede establecer fácilmente las características esenciales de esta divulgación, y puede hacer diversos cambios y modificaciones para adaptar la divulgación a diversos usos y condiciones. Se entenderá que algunas de las estructuras, funciones y operaciones descritas más arriba de las realizaciones anteriormente descritas no son necesarias para poner en la práctica la presente divulgación y están incluidas en la descripción simplemente para exhaustividad de una realización o 25 realizaciones de ejemplo. Además, se entenderá que estructuras, funciones y operaciones específicas fijadas en las patentes y publicaciones de referencia descritas más arriba pueden ponerse en práctica en conjunto con la divulgación presente, pero no son esenciales para su práctica. Las realizaciones descritas aquí más arriba pretenden ser ilustrativas solamente y no deberían considerarse como limitantes del alcance de la divulgación, el cual está definido en las reivindicaciones siguientes. 30

Claims (12)

  1. Reivindicaciones
    1. Un método por citometría de flujo para detectar microbios objetivo en una muestra, comprendiendo dicho método:
    a) tratar la muestra con al menos un oxidante y al menos un detergente;
    b) desactivar el al menos un oxidante después de tratar la muestra;
    c) mezclar la muestra con al menos una sonda para formar una muestra etiquetada; en donde la al menos una 5 sonda comprende al menos una etiqueta; y en donde la al menos una sonda se une a los microbios objetivo en la muestra etiquetada;
    d) introducir la muestra etiquetada en un citómetro de flujo; y
    e) analizar la muestra etiquetada; en donde el análisis comprende excitar la al menos una etiqueta con al menos una fuente de luz en el citómetro de flujo y detectar al menos una emisión fluorescente. 10
  2. 2. El método de la reivindicación 1, en donde la etapa de mezcla ocurre después de la etapa de desactivación.
  3. 3. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente: tratar la muestra con al menos una enzima antes de la etapa de mezcla.
  4. 4. El método de la reivindicación 1, en donde la etapa de mezcla tiene lugar durante aproximadamente 30 segundos hasta aproximadamente 20 minutos. 15
  5. 5. El método de la reivindicación 1, en donde la muestra etiquetada comprende aproximadamente 3% en peso hasta aproximadamente 5% en peso del al menos un detergente.
  6. 6. El método de la reivindicación 1, en donde la al menos una sonda está presente a una concentración no saturadora.
  7. 7. El método de la reivindicación 1, en donde la etapa de mezcla tiene lugar en la presencia de un aditivo 20 seleccionado del grupo consistente de albúmina de suero bovino, glicerol y combinaciones de los mismos.
  8. 8. El método de la reivindicación 1, en donde la al menos una fuente de luz es seleccionada del grupo consistente de luz ultravioleta, luz violeta, luz de xenón y luz azul.
  9. 9. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente: mezclar la muestra con al menos una sonda no etiquetada, en donde la al menos una sonda no etiquetada apunta hacia al menos un componente microbiano no 25 etiquetado de la muestra.
  10. 10. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente: optimizar un rendimiento del citómetro de flujo;
    en donde optimizar comprende:
    a) incrementar una sensibilidad de al menos un canal de detección del citómetro de flujo incrementando una ganancia en el al menos un canal de detección; 30
    b) asignar un umbral de señal para cada al menos un canal de detección;
    c) recolectar datos en bruto del citómetro de flujo para un rango de tiempo; en donde el rango de tiempo comprende una pluralidad de intervalos; y en donde los datos en bruto comprende señales y no señales para cada al menos un canal de detección;
    y 35
    d) analizar los datos en bruto de cada uno de la pluralidad de intervalos para proveer datos procesados;
    en donde el análisis comprende: eliminar datos en bruto de cada uno de la pluralidad de intervalos en los cuales la señal no excede el umbral de señal asignado para cada al menos un canal de detección; y seleccionar datos en bruto de cada uno de la pluralidad de subintervalos en los cuales la señal no excede el umbral de señal asignado para cada al menos un canal de detección. 40
  11. 11. El método de la reivindicación 1, en donde el citómetro de flujo está estandarizado contra el rendimiento de un segundo citómetro de flujo.
  12. 12. El método de la reivindicación 1, en donde el al menos un oxidante está empacado en un kit de torunda.
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