ES2876048A1 - Método para la licuación de una muestra respiratoria y para la posterior detección de infecciones respiratorias en dicha muestra - Google Patents

Método para la licuación de una muestra respiratoria y para la posterior detección de infecciones respiratorias en dicha muestra Download PDF

Info

Publication number
ES2876048A1
ES2876048A1 ES202030403A ES202030403A ES2876048A1 ES 2876048 A1 ES2876048 A1 ES 2876048A1 ES 202030403 A ES202030403 A ES 202030403A ES 202030403 A ES202030403 A ES 202030403A ES 2876048 A1 ES2876048 A1 ES 2876048A1
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
sample
respiratory
detection
hydrogen peroxide
pathogenic microorganisms
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
ES202030403A
Other languages
English (en)
Inventor
La Rica Quesada Roberto De
Ximenis Antonio Clemente
Palomo Antonio Oliver
Molinero Estrella Rojo
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Servei de Salut de Les Illes Balears IBSalut
Fundacio dInvestigacio Sanitaria de les Illes Balears IDISBA
Original Assignee
Servei de Salut de Les Illes Balears IBSalut
Fundacio dInvestigacio Sanitaria de les Illes Balears IDISBA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Servei de Salut de Les Illes Balears IBSalut, Fundacio dInvestigacio Sanitaria de les Illes Balears IDISBA filed Critical Servei de Salut de Les Illes Balears IBSalut
Priority to ES202030403A priority Critical patent/ES2876048A1/es
Priority to US17/923,346 priority patent/US20230194521A1/en
Priority to EP21727193.1A priority patent/EP4148411A1/en
Priority to PCT/ES2021/070307 priority patent/WO2021224529A1/es
Publication of ES2876048A1 publication Critical patent/ES2876048A1/es
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/30—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving catalase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/38—Diluting, dispersing or mixing samples
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/38—Diluting, dispersing or mixing samples
    • G01N2001/383—Diluting, dispersing or mixing samples collecting and diluting in a flow of liquid
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/12—Pulmonary diseases
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

Método para la licuación de una muestra respiratoria y para la posterior detección de infecciones respiratorias en dicha muestra. La presente invención se refiere a un método para la licuación de muestras respiratorias, tales como muestras de esputo. Este tipo de muestras se caracterizan por ser muy viscosas o semisólidas por lo que, para la detección de microorganismos patógenos en ellas, precisan de un tratamiento previo a fin de hacerlas más líquidas y homogéneas. El método de licuación propuesto en la presente invención permite la posterior detección de microorganismos patógenos causantes de infecciones respiratorias.

Description

DESCRIPCIÓN
Método para la licuación de una muestra respiratoria v para la posterior detección de infecciones respiratorias en dicha muestra
La presente invención se refiere a un método para la licuación de muestras respiratorias, tales como muestras de esputo. Este tipo de muestras se caracterizan por ser muy viscosas o semisólidas por lo que, para la detección de microorganismos patógenos en ellas, precisan de un tratamiento previo a fin de hacerlas más líquidas y homogéneas. El método de licuación propuesto en la presente invención permite la posterior detección de microorganismos patógenos causantes de infecciones respiratorias.
Por tanto, la presente invención se encuadra en el campo de la medicina y, en particular, en lo referente a la detección de infecciones del tracto respiratorio.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las infecciones del tracto respiratorio son el origen de un elevado porcentaje de los casos de sepsis y son particularmente preocupantes en pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y fibrosis quística. De entre estas, las infecciones nosocomiales, como, por ejemplo, las producidas por la bacteria Pseudomonas aeruginosa, deben detectarse lo más rápidamente posible ya que requieren un tratamiento antibiótico diferente al resto de patógenos debido a su multiresistencia a la mayoría de los mismos. Actualmente esto requiere cultivar el esputo del paciente, lo que puede tardar varios días. Por lo tanto, aunque el cultivo bacteriológico es el estándar de oro para la detección de bacterias, no es adecuado para guiar la primera tanda de antibiótico. En casos de sepsis o exacerbaciones de EPOC, la administración de una terapia antimicrobiana inadecuada puede dar lugar a graves secuelas o incluso a la defunción del paciente. Además, el hecho de requerir demasiado tiempo e infraestructura, no lo hace un procedimiento adecuado para la detección rápida en el punto de atención sanitaria.
También se conocen métodos para la detección de patógenos en muestras de esputo que requieren la extracción de ácidos nucleicos, pero esto de nuevo requiere de un laborioso método adicional difícil de realizar fuera de un laboratorio especializado (Kukhtin A. V. et al. Anal. Chem. 2020, 92, 5311-5318).
En los últimos años una nueva generación de biosensores ha surgido como alternativa rápida a los métodos de cultivo microbiológico y de extracción de ácidos nucleicos para la detección de bacterias. En el contexto de la detección de bacterias en esputo, dichos dispositivos podrían reducir el tiempo necesario para identificar este patógeno, permitiendo así personalizar el tratamiento antibiótico. Sin embargo, la detección de bacterias y, en general, de cualquier microorganismo patógeno en muestras de esputo, o en otro tipo de muestra respiratoria, es problemática porque dichas muestras son muy viscosas o semisólidas y los patógenos no tienen por qué estar distribuidos homogéneamente en ellas.
El principal componente de las muestras respiratorias son las mucinas, unas glicoproteínas que oligomerizan para dar lugar a un entramado entrecruzado en el que se encuentran atrapados los microorganismos patógenos. Además, en el caso de algunas bacterias, como es el caso de la Pseudomonas aeruginosa, suelen encontrarse en forma de biofilms (biopelículas) lo que complica todavía más su detección ya que, aunque la concentración total de bacterias en la muestra puede ser elevada, muchas pueden encontrarse ocultas dentro del biofilm y, por lo tanto, no dar señal. Por ello, para hacer posible la detección rápida de patógenos en muestras respiratorias, es necesario un método que licúe la muestra y al mismo tiempo disgregue biofilms bacterianos en caso de que éstos se formen, todo ello en unos pocos segundos y con un procedimiento sencillo que pueda realizarse en el punto de atención médica.
A día de hoy se conocen algunos métodos para procesar muestras de esputo para la posterior detección de microorganismos patógenos con un biosensor que se detallan a continuación. Ha sido propuesta la utilización de compuestos tiolados como la N-acetilcisteína (He, F. & Zhang, L. Anal. Sci. 18, 397-401 (2002); Kim, J. H. et al. Lab Chip 12, 1437-1440 (2012)) o un preparado de ditriotreitol comercial llamado Sputasol (Massai, F. et al. Biosens. Bioelectron. 26, 3444-3449 (2011)) para licuar el esputo. Estos métodos requieren de tiempos de incubación de entre 10 minutos y 1 hora, y pueden requerir de instrumentación adicional como un agitador tipo vórtex para disgregar la muestra o un baño termostático, lo cual las hace más difíciles de implementar en aplicaciones de campo. Además, estos compuestos se utilizan para disgregar el esputo, pero no son capaces de disgregar el biofilm bacteriano en el caso en el que dicho biofilm esté presente en la muestra. Otros métodos basados en la utilización de NaOH y surfactantes sufren de los mismos problemas (Inoue, S. et al. PLoS One 9, 1-7 (2014)). Finalmente se han propuesto otros métodos que se basan en la utilización de disolventes orgánicos como cloroformo (Buzid, A. et al. Sci. Rep. 6, 1-9 (2016)) o diclorometano (Wen, K. Y. et al. ACS Synth. Biol. 6, 2293-2301 (2017)) que son inflamables y sólo pueden manipularse dentro de una campana de extracción, haciéndolos de nuevo inadecuados para la detección de microorganismos patógenos en el punto de atención sanitaria. Entre los biosensores conocidos para la detección de microorganismos podemos citar, a modo de ejemplo, los divulgados en los siguientes documentos: Kumar N. et al. Analyst. 2018;143(2):359-373; Radhakrishnan R. et al. Biosensors. 2017;7(4):1-12; Cesewski E. et al. Biosensors and Bioelectronics.
2020, 159: 12214.
A la vista de los inconvenientes existentes en los métodos actuales para procesar muestras respiratorias para la posterior detección de microorganismos patógenos en las mismas, la presente invención propone un método de procesamiento ultrarrápido, sencillo y económico, de manera que es posible la licuación y homogeneización de la muestra en pocos segundos. Esto permite, asimismo, llevar a cabo una detección de microorganismos patógenos en la muestra de forma rápida, precisa y eficaz, así como su aplicación en los puntos de atención sanitaria.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Los inventores han descubierto que la adición exclusiva de una solución acuosa de peróxido de hidrógeno (H2O2) sobre una muestra de esputo da lugar a la licuación y homogeneización de dicha muestra en un tiempo de un minuto aproximadamente.
El peróxido de hidrógeno se descompone en oxígeno y agua en presencia de la enzima catalasa presente en las muestras respiratorias, así como en los posibles microorganismos patógenos existentes en ella, de manera que se generan burbujas. La generación de burbujas en el seno de la muestra es lo que favorece su disgregación hasta su total licuación y homogeneización.
Luego, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para la licuación de una muestra respiratoria, caracterizado porque consiste en la adición de una solución acuosa de peróxido de hidrógeno a dicha muestra.
El método no precisa de ninguna instrumentación específica (agitador tipo vórtex, baño termostático, etc.), ni de ningún otro reactivo o compuesto, ni de ninguna etapa adicional. Es decir, es suficiente con añadir la disolución acuosa de peróxido de hidrógeno a la muestra durante un tiempo aproximado de 1 minuto para obtener la muestra licuada y homogénea, lista para ser utilizada en la detección de cualquier microorganismo patógeno en ella.
En la presente invención, “disolución acuosa de peróxido de hidrógeno” se refiere a una disolución que comprende agua (solvente) y peróxido de hidrógeno. De manera más preferida, se refiere a una disolución que consiste en agua y peróxido de hidrógeno. En otra realización preferida, se refiere a una disolución salina que comprenda peróxido de hidrógeno.
De acuerdo con la presente invención “disolución salina” es una disolución acuosa que contiene al menos una sal disuelta. A modo de ejemplo, la disolución salina es la disolución tampón fosfato salino o buffer fosfato salino (conocido también por sus siglas en inglés, PBS, de phosphate buffered saline). Esta solución PBS es una solución de tampón fosfato 10 mM, cloruro de sodio 0.14 M, cloruro potásico 0.003 M pH 7.4.
En una realización preferida de la invención, la solución acuosa tiene una concentración de peróxido de hidrógeno de entre 0,01 M y 1 M. Más preferiblemente, la concentración de peróxido de hidrógeno es de 0,3 M
En otra realización preferida, la cantidad de la solución acuosa de peróxido de hidrógeno añadida a dicha muestra es de entre 10 y 20 microlitros por gramo de muestra; más preferiblemente, de 20 microlitros por gramo de muestra.
De acuerdo con la presente invención, el término "muestra respiratoria" se refiere a una muestra biológica aislada procedente del tracto respiratorio de un individuo. Esta muestra se origina en el tracto respiratorio superior, que comprende la cavidad nasal, los senos paranasales, la faringe y la laringe, o del tracto respiratorio inferior, que comprende la tráquea, los bronquios primarios y los pulmones. Se trata de muestras viscosas o semisólidas. De forma más preferida, las muestras respiratorias de la presente invención son las originadas en el tracto respiratorio inferior.
En una realización preferida, la muestra respiratoria es una muestra de esputo, una muestra de aspirado bronquial, de lavado broncoalveolar, de raspado nasofaríngeo, de cepillado bronquial o cualquier otra secreción generada en el tracto respiratorio.
El método de procesamiento descrito en este primer aspecto de la invención permite la licuación y homogeneización de la muestra respiratoria en cuestión de segundos, por lo que supone un método ultrarrápido para el pretratamiento de las mismas. Además, presenta la ventaja de ser económico y muy sencillo de llevar a cabo, por lo que resulta especialmente útil para aplicar en el punto de atención médica. La muestra resultante, ya licuada, puede utilizarse directamente para la detección de microorganismos patógenos en la misma, preferiblemente, mediante el uso de un biosensor.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método para la detección de infecciones respiratorias causadas por microorganismos patógenos en una muestra respiratoria, caracterizado por comprender:
a) una primera etapa para la licuación de la muestra respiratoria según el método definido en el primer aspecto de la invención y
b) una segunda etapa que comprende la detección del microorganismo patógeno en la muestra respiratoria licuada obtenida en la primera etapa.
En la presente invención se entiende por “microorganismo patógeno” a un microorganismo, tal como un virus, una bacteria o un hongo, que causa enfermedad o infección respiratoria humana o animal.
En una realización preferida, el microorganismo patógeno es un virus, una bacteria o un hongo que puedan infectar las vías respiratorias.
En otra realización preferida, el microorganismo patógeno es una bacteria seleccionada de la lista que comprende: Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pneumoniae, enterobacterias, Haemophilus influenzae o Legionella pneumophila.
En otra realización preferida, el microorganismo patógeno es un virus seleccionado de la lista que comprende: coronavirus, virus influenza, rotavirus, citomegalovirus y virus sincitial respiratorio.
De manera más preferida, el coronavirus es seleccionado de: COVID-19, SARS-CoV-2, SARS y MERS y el virus influenza es seleccionado de: virus de la gripe común (humanos) y el virus de la gripe aviar.
En otra realización preferida, el microorganismo patógeno es un hongo seleccionado de la lista que comprende: Histoplasma capsulatum, Paracoccidioides brasiliensis, Blastomyces dermatitis, Coccidioides immitis, Sporothrix schenckii, Candida spp, Aspergillus fumigatos, Turulopsis glabrata, Aspergillus spp., Seudoallescheria boyii, Cryptococcous neoformans, y Zigomicetos (tales como Rhizopus sp., Mucor sp. y Absidia sp. etc).
La segunda etapa de detección de microorganismos patógenos se puede llevar a cabo mediante cualquier método conocido que detecte el propio patógeno o moléculas propias del mismo, como por ejemplo enzimas, carbohidratos, ácidos nucleicos, antígenos y metabolitos como moléculas de percepción de cuórum. Preferiblemente, la segunda etapa se lleva a cabo mediante un biosensor, y preferiblemente mediante un inmunosensor.
El término "biosensor" se refiere a cualquier dispositivo de detección compuesto por un transductor y un elemento de reconocimiento, el cual consiste en una biomolécula, por ejemplo, un enzima, un aptámero, un ácido nucleico, un carbohidrato o un anticuerpo. En el caso de un inmunosensor, la biomolécula es un anticuerpo. Son conocidos en el estado de la técnica una amplia variedad de biosensores para detectar microorganismos patógenos que pueden ser usados en la presente invención en la etapa de detección, como el experto en la materia conoce.
Otro aspecto de la invención se refiere a un kit para la detección de infecciones respiratorias causadas por microorganismos patógenos en una muestra respiratoria caracterizado por comprender o consistir en una solución acuosa de peróxido de hidrógeno y un biosensor configurado para detectar el microorganismo patógeno en cuestión.
En una realización preferida del kit, la solución acuosa tiene una concentración en peróxido de hidrógeno de entre 0,01 M .y 1M más preferiblemente de 0,3 M.
Un último aspecto de la invención se refiere al uso del kit descrito anteriormente para la detección de infecciones respiratorias en una muestra respiratoria.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Por el contrario, la palabra “consiste” es una expresión de tipo cerrado, que no puede interpretarse como que comprende productos o procedimientos que a su vez incluyen elementos estructurales o fases de procedimiento distintos de los expuestos en la reivindicación. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Representación esquemática del método de licuación de una muestra respiratoria como es el esputo. A la muestra de esputo semisólida (i) se añade una solución de peróxido de hidrógeno (ii) de manera que la catalasa presente en la muestra genera burbujas de oxígeno (iii) que disgregan la muestra. Tras 1 minuto la muestra se ha licuado (iv) y puede aplicarse sobre un biosensor (v) para la detección de los patógenos.
Fig. 2. Immunodetección de Pseudomonas aeruginosa después de la disgregación de un esputo de paciente que sufre una infección por Pseudomonas aeruginosa (círculo rojo) o no infectado (cuadrado negro) con el método propuesto. La señal colorimétrica S aumenta al aumentar la concentración de peróxido porque al generarse más burbujas se liberan más bacterias del esputo infectado con Pseudomonas aeruginosa. Las barras de error son la desviación estándar de 3 experimentos.
Fig. 3. Muestra el incremento de luminosidad medido como el valor absoluto de la variación de la intensidad de pixel de una muestra de esputo de acuerdo con el ensayo realizado en el ejemplo 3 en el que se añade un inhibidor de la enzima catalasa.
EJEMPLOS
A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad de los métodos de la invención.
Ejemplo 1: Licuación de una muestra de esputo
En primer lugar, se prepararon disoluciones de concentraciones 0,01 M; 0,03 M, 0,1 M 0 ,3 My 1M de peróxido de hidrógeno en PBS.
Se añadieron 200 microlitros de cada disolución sobre 10 mg de esputo provenientes de un paciente con una infección respiratoria confirmada por Pseudomonas aeruginosa.
Al adicionar la disolución, se observó la generación de burbujas. El tamaño y cantidad de burbujas aumentó con la concentración de peróxido en la disolución. Se comparó con la adición de agua o PBS (sin peróxido) que no produjo ninguna burbuja ni, por tanto, la licuación de la muestra de esputo. Cuando la concentración de peróxido es 0,3 M la muestra se licúa en menos de 1 minuto.
Las muestras licuadas y homogeneizadas obtenidas en este ejemplo se utilizaron directamente para la detección de P. aeruginosa en ellas, tal y como se explica en el ejemplo 2.
Ejemplo 2: Detección de P. aeruginosa en las muestras de esputo licuadas obtenidas en el ejemplo 1
Las muestras de esputo que se licuaron previamente tal y como se ha indicado en el ejemplo 1 provenían de un paciente infectado con Pseudomonas aeruginosa y otro sin infectar.
Pseudomonas aeruginosa se detectó en las muestras de esputo licuada con inmunosensores de papel utilizando nanopartículas de oro como sondas colorimétricas. El método de fabricación de biosensores de papel ha sido divulgado en varias publicaciones: Russell SM et al. ACS Sensors. 2017; 2:848-853; Russell SM et al. ACS Sensors. 2018;3(9):1712-1718; Alba-Patiño A. et al. Sensors Actuators, B Chem. 2018;273:951-954; Alba-Patiño A et al. ACS Sensors. 2020;5:147-153 y Alba-Patiño A. et al. Nanoscale Adv. 2020;2:253-1260. El método de fabricación del biosensor utilizado en este ejemplo particular ha sido previamente divulgado en detalle en la publicación Alba-Patiño A. et al. ACS Sensors. 2020, 5:147-153.
Para detectar Pseudomonas aeruginosa, 10 pl de esputo (10 mg) licuado con 200 p,L de H2O2 a diferentes concentraciones entre 0 y 0,3 M en PBS, se depositaron sobre la superficie receptora de una tira de papel de 2x8 cm y se dejaron secar a temperatura ambiente (entre 15 y 30 grados) durante 15 minutos. A continuación, se añadió 1 mL de PBS suplementado con albúmina de suero bovino (5 mg/mL) para evitar la formación de interacciones no específicas entre nanopartículas y el sustrato de papel. A continuación, se dobló el papel para que el reservorio con las nanopartículas decoradas con anticuerpo anti-Pseudomonas aeruginosa entre en contacto con la zona que contienen las bacterias, presionando ambas superficies con la ayuda de una pinza. Transcurridos 5 minutos, se eliminó el exceso de nanopartículas lavando la tira de papel con PBS suplementado con Tween-20 (0,1%) y la señal colorimétrica S generada por las nanopartículas sobre la superficie receptora del inmunosensor, dependiente de la presencia de Pseudomonas aeruginosa en la muestra aplicada, se midió mediante densitometría. Para ello se escanearon los tests de papel con una impresora Brother MFC-1910 y se calculó la intensidad de píxel con la función Histograma del software Image J. La señal S se toma como el valor absoluto del número obtenido al restar 255 al valor de intensidad de píxel. El número 255 corresponde a la intensidad de píxel del color blanco puro.
Los resultados obtenidos se muestran en la figura 2. Como se puede observar en dicha figura, la muestra con infección por Pseudomonas aeruginosa tratada sólo con PBS sin peróxido de hidrógeno (0 M) da lugar a una señal muy baja e indistinguible de la señal de la muestra sin infección por Pseudomonas aeruginosa. A medida que la concentración de peróxido de hidrógeno aumenta la señal de la muestra con infección por Pseudomonas aeruginosa aumenta porque se liberan más antígenos. La señal generada por las muestras sin Pseudomonas aeruginosa no varía cuando la concentración de peróxido de hidrógeno aumenta, lo que demuestra que el aumento de señal observado en muestras que contienen Pseudomonas aeruginosa es producida por la bacteria y no por el tratamiento con peróxido de hidrógeno. La señal más alta se consiguió con muestras infectadas por Pseudomonas aeruginosa cuando el paso de licuación se llevó a cabo con peróxido de hidrógeno 0.3 M.
Ejemplo 3: Tratamiento de una muestra de esputo con peróxido de hidrógeno y un inhibidor de catalasa
Se pesaron 10 mgde esputo y se añadieron 100 microlitros de soluciones de PBS (tampón fosfato salino) con concentraciones crecientes de azida sódica (0, 0,01, 0,1 y 1 M) que es un inhibidor de la enzima catalasa. Se incubaron las muestras 2 horas a temperatura ambiente. Tras el pretratamiento se aspiró la azida con una micropipeta sin tocar los esputos. Seguidamente se añadieron 200 microlitros de PBS con 0,3 M de peróxido de hidrógeno durante 1 minuto. Se tomaron fotos antes y después del tratamiento. En la muestra sin azida (0 M), el esputo se disolvió totalmente y se registró el máximo incremento de luminosidad al calcular la intensidad de pixel con un software de tratamiento de imágenes como ImageJ o Adobe Photoshop seleccionando el área de interés y usando la función Histograma. A medida que fue aumentando la concentración de azida se fue reduciendo el número de burbujas producidas y el esputo se disolvió menos. Por lo tanto, el incremento de luminosidad fue disminuyendo.
Los resultados obtenidos en este experimento han demostrado que la actividad catalasa presente en las muestras es crucial para la generación de burbujas y, por tanto, para disolver o licuar el esputo, ya que cuando se añade un inhibidor de esta enzima, no se consigue la disolución o licuación de la muestra.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Método para la licuación de una muestra respiratoria, caracterizado porque consiste en la adición de una solución acuosa de peróxido de hidrógeno a dicha muestra.
2. Método, según la reivindicación 1 donde la solución acuosa tiene una concentración de peróxido de hidrógeno de entre 0,01 My1M.
3. Método, según la reivindicación 2 donde la solución acuosa tiene una concentración de peróxido de hidrógeno de 0,3 M.
4. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 3, donde la cantidad de la solución acuosa de peróxido de hidrógeno añadida a dicha muestra es de entre 10y20 microlitros por gramo de muestra.
5. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 4, donde la muestra respiratoria es una muestra de esputo, una muestra de aspirado bronquial, de lavado broncoalveolar, de raspado nasofaríngeo o de cepillado bronquial.
6. Método para la detección de infecciones respiratorias causadas por microorganismos patógenos en una muestra respiratoria, caracterizado por comprender:
a) una primera etapa para la licuación de la muestra respiratoria según el método definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-5,
b) una segunda etapa que comprende la detección del microorganismo patógeno en la muestra respiratoria licuada obtenida en la primera etapa.
7. Método, según reivindicación 6, donde los microorganismos patógenos son virus, bacterias u hongos.
8. Método, según reivindicación 7, donde los microorganismos patógenos son bacterias seleccionadas de la lista que comprende: Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pneumoniae, enterobacterias, Haemophilus influenzae o Legionella pneumophila
9. Método, según reivindicación 7, donde los microorganismos patógenos son virus seleccionadas de la lista que comprende coronavirus, virus influenza, rotavirus, citomegalovirus y virus sincitial respiratorio.
10. Método, según reivindicación 7, donde los microorganismos patógenos son hongos seleccionadas de la lista que comprende: Histoplasma capsulatum, Paracoccidioides brasiliensis, Blastomyces dermatitis, Coccidioides immitis, Sporothrix schenckii, Candida spp, Aspergillus fumigatos, Turulopsis glabrata, Aspergillus spp., Seudoallescheria boyii, Cryptococcous neoformans, y Zigomicetos
11. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 9, donde la detección de microrganismo patógenos en la segunda etapa se lleva a cabo mediante un biosensor.
12. Kit para la detección de infecciones respiratorias causadas por microorganismos patógenos en una muestra respiratoria caracterizado por que comprende o consiste en una solución acuosa de peróxido de hidrógeno y un biosensor configurado para detectar el microorganismo patógeno en cuestión.
13. Kit, según reivindicación 12, donde la solución acuosa tiene una concentración en peróxido de hidrógeno de entre 0,01 My1M.
14. Uso del kit descrito en cualquiera de las reivindicaciones 12 o 13 para la detección de infecciones respiratorias en una muestra respiratoria.
ES202030403A 2020-05-07 2020-05-07 Método para la licuación de una muestra respiratoria y para la posterior detección de infecciones respiratorias en dicha muestra Withdrawn ES2876048A1 (es)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES202030403A ES2876048A1 (es) 2020-05-07 2020-05-07 Método para la licuación de una muestra respiratoria y para la posterior detección de infecciones respiratorias en dicha muestra
US17/923,346 US20230194521A1 (en) 2020-05-07 2021-05-05 Method for liquefying a respiratory sample and for the subsequent detection of respiratory infections in said sample
EP21727193.1A EP4148411A1 (en) 2020-05-07 2021-05-05 Method for liquefying a respiratory sample and for the subsequent detection of respiratory infections in said sample
PCT/ES2021/070307 WO2021224529A1 (es) 2020-05-07 2021-05-05 Método para la licuación de una muestra respiratoria y para la posterior detección de infecciones respiratorias en dicha muestra

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES202030403A ES2876048A1 (es) 2020-05-07 2020-05-07 Método para la licuación de una muestra respiratoria y para la posterior detección de infecciones respiratorias en dicha muestra

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2876048A1 true ES2876048A1 (es) 2021-11-11

Family

ID=76059914

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES202030403A Withdrawn ES2876048A1 (es) 2020-05-07 2020-05-07 Método para la licuación de una muestra respiratoria y para la posterior detección de infecciones respiratorias en dicha muestra

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20230194521A1 (es)
EP (1) EP4148411A1 (es)
ES (1) ES2876048A1 (es)
WO (1) WO2021224529A1 (es)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2586623T3 (es) * 2008-08-15 2016-10-17 Aperture Bio, LLC Sistemas y métodos basados en citometría de flujo para la detección de microbios
GB2561242A (en) * 2017-04-07 2018-10-10 Medical Wire & Equipment Co Bath Ltd Specimen collection composition and system
KR102143182B1 (ko) * 2019-09-18 2020-08-10 순천향대학교 산학협력단 호흡기 내 마이크로바이옴을 측정하는 제제를 포함하는 천식 진단용 조성물

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DIPPY J E ET AL. RHEOLOGICAL ASSESSMENT OF MUCOLYTIC AGENTS ON SPUTUM OF CHRONIC BRONCHITICS. Thorax 1969. , 30/11/1968, Vol. 24, Páginas 707-713 ISSN 0040-6376, página 707, columna derecha, cuanto párrafo; página 708, columna izquierda, segundo párrafo; página 711, columna derecha, último párrafo. *
K.ANDERSON ET AL. Use and abuse of Jungmann¿s method for the liquefaction of tuberculosis sputa.. J. Clin. Path., 1953, Vol. 6, Páginas 124-127 <p>página 124, columna derecha, tercer párrafo página 125, columna izquierda, tercer párrafo.</p> *
PILLAI KRISHNA ET AL. Mucolysis by Ascorbic Acid and Hydrogen Peroxide on Compact Mucin Secreted in Pseudomyxoma Peritonei. Journal of Surgical Research MAY 15 2012. , 15/05/2012, Vol. 174, Páginas E69-E73 ISSN 0022-4804(print) ISSN 1095-8673(electronic), (DOI: doi:10.1016/j.jss.2011.10.038) página e69, columna izquierda, primer, segundo, tercer párrafos; página e70, columna izquierda, tercer, cuarto párrafos; página e70, columna derecha primer, segundo, párrafos; página e70, figura 1; página e71, figura 2; página e72, columna izquierda, último párrafo- columna derecha, primer párrafo. *
WILLIAM V B ROBERTSON ET AL. The degradation of mucins and polysaccharides by ascorbic acid and hydrogen peroxide. Biochemical Journal, 19410901 Published by Portland Press on behalf of the Biochemical Society. , 01/09/1941, Vol. 35, Páginas 903 - 908 ISSN 0264-6021, (DOI: doi:10.1042/bj0350903) páginas 903-906 y 908. *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021224529A1 (es) 2021-11-11
EP4148411A1 (en) 2023-03-15
US20230194521A1 (en) 2023-06-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10696999B2 (en) Rapid method for detection of Salmonella live vaccine strains
Chin et al. A high-frequency phenotypic switch links bacterial virulence and environmental survival in Acinetobacter baumannii
Kerry et al. A comprehensive review on the applications of nano-biosensor-based approaches for non-communicable and communicable disease detection
BR112016004994A2 (pt) Sistemas e métodos para detectar doenças infecciosas
ES2660969T3 (es) Método basado en euglobulina para determinar la actividad biológica de defibrotida
ES2263476T3 (es) Procedimiento de pretratamiento de una muestra para cuantificar el colesterol y procedimiento para cuantificar el colesterol en lipoproteinas especificas usando dicho procedimiento.
He et al. An electrochemical sensing method based on CRISPR/Cas12a system and hairpin DNA probe for rapid and sensitive detection of Salmonella Typhimurium
Han et al. Localized surface plasmon-enhanced electrochemiluminescence biosensor for rapid, label-free, and single-step detection of broad-spectrum bacteria using urchin-like Au and Ag nanoparticles
Vyas et al. Assessing the role of pharyngeal cell surface glycans in Group A Streptococcus biofilm formation
Billard-Pomares et al. Application of quantitative PCR to the diagnosis and monitoring of Pseudomonas aeruginosa colonization in 5–18-year-old cystic fibrosis patients
Abshirini et al. Prevalence of rhinovirus and respiratory syncytial virus among patients with chronic rhinosinusitis
Breen et al. The Vibrio cholerae type six secretion system is dispensable for colonization but affects pathogenesis and the structure of zebrafish intestinal microbiome
CA3137620A1 (en) Electrochemical d-lactate measurement for diagnosis and prognosis of an infectious disease
Basso et al. A methodology for porcine circovirus 2 (PCV-2) quantification based on gold nanoparticles
Kviatkovski et al. Smelling Pseudomonas aeruginosa infections using a whole-cell biosensor–An alternative for the gold-standard culturing assay
ES2876048A1 (es) Método para la licuación de una muestra respiratoria y para la posterior detección de infecciones respiratorias en dicha muestra
JP2010187634A (ja) βグルカンの濃度測定方法および濃度測定用キット
Martinkova et al. Colorimetric sensor based on bubble wrap and camera phone for glucose determination
PT1639122E (pt) Sistema de teste aperfeiçoado para determinar a presença de um antibiótico num fluido
ES2781322T3 (es) Determinación de sarcosina utilizando sarcosina oxidasa y peroxidasa de rábano picante unidas a nanopartículas de Fe2O3/AU mediante quitosano
Casado et al. Analysis of cerebrospinal fluid γ‐aminobutyric acid by capillary electrophoresis with laser‐induced fluorescence detection
Modh et al. Specific detection of tetanus toxoid using an aptamer-based matrix
Ramezani et al. Optical and electrochemical aptasensors for sensitive detection of streptomycin in blood serum and milk
Carlson-Jones et al. Enumerating virus-like particles and bacterial populations in the sinuses of chronic rhinosinusitis patients using flow cytometry
Yuan et al. Biological effect abundance analysis of hemolytic pathogens based on engineered biomimetic sensor

Legal Events

Date Code Title Description
BA2A Patent application published

Ref document number: 2876048

Country of ref document: ES

Kind code of ref document: A1

Effective date: 20211111

FA2A Application withdrawn

Effective date: 20220228