JP2009185037A - EhrlichiacanisおよびEhrlichiachaffeensis抗体の検出のための組成物および方法 - Google Patents
EhrlichiacanisおよびEhrlichiachaffeensis抗体の検出のための組成物および方法 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】エールリヒア(Ehrlichia canisおよびEhrlichia chaffeensis)抗体および抗体フラグメントの検出のための方法および組成物を提供する。
【解決手段】特定のアミノ酸配列からなるポリペプチド群から選ばれる単離されたポリペプチドを含む組成物、前記ポリペプチドを、ポリペプチド/抗体複合体が形成できる条件下で、エールリヒアに対する抗体を含むと疑われる試験サンプルに接触させることを含む、エールリヒアに対する抗体の存在の検出方法。
【選択図】なし
【解決手段】特定のアミノ酸配列からなるポリペプチド群から選ばれる単離されたポリペプチドを含む組成物、前記ポリペプチドを、ポリペプチド/抗体複合体が形成できる条件下で、エールリヒアに対する抗体を含むと疑われる試験サンプルに接触させることを含む、エールリヒアに対する抗体の存在の検出方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、Ehrlichia canisおよびEhrlichia chaffeensis抗体および抗体フラグメントの検出および定量のための組成物および方法を提供する。
エールリヒア(Ehrlichia)は、哺乳動物宿主の循環するリンパ球に感染する真正の細胞内病原である。Ehrlichia canisおよびEhrlichia chaffeensisは、イヌおよびヒトに感染してそれぞれイヌ単球エールリヒア症(CME)およびヒト単球エールリヒア症(HME)を引き起こす、同じ亜属の構成員である。イヌの疾患は、熱、リンパ節炎、体重減少、および汎血球減少により特徴づけられる。ヒトにおいてこの疾患は、熱、頭痛、筋肉痛、および白血球減少により特徴づけられる。早期の検出および処置が、イヌおよびヒト両方のエールリヒア症の処置に重要である。
間接免疫蛍光アッセイ(IFA)および酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA)は、これらの疾患の診断の補助としてしばしば用いられる。これらのアッセイは、患者の血液、血漿、または血清からの抗−エールリヒア抗体の、感染した細胞、細胞溶解産物、または精製したエールリヒアタンパク質、への結合を測定する、若しくは検出するものである。しかし、抗−エールリヒア抗体またはそれらのフラグメントを検出する現在知られたアッセイは、これらの試験に用いられるエールリヒア抗原の純粋でない性質に直接関連する感受性および特異性の問題のために、非常に限られた有用性しかない。高度に精製された試薬が、より正確なアッセイを構築するために必要とされる。
(発明の概要)
本発明の目的は、抗−Ehrlichia canis抗体および抗−Ehrlichia chaffeensis抗体を検出するための試薬および方法を提供することにある。本発明のこのおよび他の目的は、以下に記載する1またはそれ以上の態様により提供される。
本発明の目的は、抗−Ehrlichia canis抗体および抗−Ehrlichia chaffeensis抗体を検出するための試薬および方法を提供することにある。本発明のこのおよび他の目的は、以下に記載する1またはそれ以上の態様により提供される。
本発明の1つの態様は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7およびそれらの変異体からなる群より選ばれる単離されたポリペプチドを含む組成物を提供する。
本発明の他の態様は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7およびそれらの変異体からなる群より選ばれる単離されたポリペプチド、およびキャリアを含む組成物を提供する。
本発明のまた他の態様は、エールリヒアに対する抗体の存在の検出方法を提供する。その方法は、ポリペプチド/抗体複合体が形成できる条件下で、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7で示されるポリペプチドおよびそれらの変異体からなる群より選ばれる1またはそれ以上のポリペプチドを、エールリヒアに対する抗体を含むと疑われる試験サンプルに接触させることを含む。ポリペプチド/抗体複合体が検出される。ポリペプチド/抗体複合体の検出は、エールリヒアに対する抗体が試験サンプル中に存在することの表示である。
本発明のさらなる他の態様は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7で示されるポリペプチドおよびそれらの変異体からなる群より選ばれる1またはそれ以上のポリペプチドを、含む装置、および哺乳動物においてエールリヒア感染の同定のための1またはそれ以上のポリペプチドの使用説明を提供する。
本発明のまた他の態様は、包材、および包材に入れられた、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7で示されるポリペプチドおよびそれらの変異体からなる群より選ばれる1またはそれ以上のポリペプチド、を含む製品を提供する。その包材は、1またはそれ以上のポリペプチドが哺乳動物におけるエールリヒア感染の同定に使用できると表示するラベルを含む。
本発明のさらなる他の態様は、哺乳動物におけるエールリヒア感染の診断方法を提供する。その方法は、エールリヒア感染を有していると疑われる哺乳動物から生物学的サンプルを得ること、およびポリペプチド/抗体複合体が形成できる条件下で、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7で示されるポリペプチドおよびそれらの変異体からなる群より選ばれる1またはそれ以上のポリペプチドを、生物学的サンプルに接触させることを含む。ポリペプチド/抗体複合体が検出され、ここでポリペプチド/抗体複合体の検出は、その哺乳動物がエールリヒア感染を有していることの表示である。
本発明の他の態様は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、および配列番号7からなる群より選ばれるEhrlichia canisまたはEhrlichia chaffeensisのポリペプチドの少なくとも1つのエピトープに特異的に結合する、モノクローナル抗体を提供する。
したがって、本発明は、エールリヒアの抗体および抗体フラグメントの検出のための正確なアッセイに使用する、高度に精製されたポリペプチドおよび抗体を提供する。
(発明の詳細な記載)
本発明のポリペプチド
本発明は、E.canisおよびE.chaffeensis抗体および抗体フラグメントの検出のための高度に精製された試薬を提供する。特に、本発明は、配列番号1〜7で示されるポリペプチド配列に対して、少なくとも85%の同一性、より好ましくは少なくとも90%の同一性、さらにより好ましくは少なくとも96%、97%、98%または99%の同一性を有するポリペプチドを提供する。表1を参照のこと。配列番号1〜7で示されるポリペプチド配列に対して100%の同一性を含まないポリペプチドは、「変異体」と見なされ、そして本発明のポリペプチドと見なされる。
本発明のポリペプチド
本発明は、E.canisおよびE.chaffeensis抗体および抗体フラグメントの検出のための高度に精製された試薬を提供する。特に、本発明は、配列番号1〜7で示されるポリペプチド配列に対して、少なくとも85%の同一性、より好ましくは少なくとも90%の同一性、さらにより好ましくは少なくとも96%、97%、98%または99%の同一性を有するポリペプチドを提供する。表1を参照のこと。配列番号1〜7で示されるポリペプチド配列に対して100%の同一性を含まないポリペプチドは、「変異体」と見なされ、そして本発明のポリペプチドと見なされる。
E.canisペプチドは、天然E.canis抗原に対して生じさせたマウスモノクローナル抗体(IIIH7)に結合したアミノ酸配列を測定することによるファージディスプレイ技術を用いて同定された。IIIH7モノクローナル抗体を用いて、PDH10ファージディスプレイライブラリーにおいてウイルス発現ペプチドをアフィニティー精製した。IIIH7に結合した配列またはミメトープ(mimetopes)は、E.canisおよびE.chaffeensisの外膜タンパク質に対して強い配列相同性を示した。両種の外膜タンパク質は、多形遺伝子ファミリーによりエンコードされ、これは、タンパク質の多重再生産をもたらす。
同一性は、アミノ酸配列の類似性を意味し、この分野で認識される意味を有する。同一性を有する配列は、同一若しくは類似のアミノ酸を共有し、ここで類似のアミノ酸は、好ましくは保存されたアミノ酸である。保存されたアミノ酸は、参照配列によりエンコードされるアミノ酸と類似の側鎖および性質(例えば、親水性、疎水性、芳香族)を有するアミノ酸である。したがって、参照配列(即ち、配列番号1〜7)と85%のアミノ酸配列同一性を共有する候補配列は、候補配列の参照配列とのアライメントの後、候補配列のアミノ酸の85%が、参照配列の対応するアミノ酸と同一性を有すること、および/または保存されたアミノ酸変異を構成すること、を必要とする。
配列は、KarlinおよびAltschul(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264−2268、KarlinおよびAltschulに修正された(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873−5877のアルゴリムのような、数学的アルゴリズムを用いて同一性の計算のためにアラインされる。このようなアルゴリズムは、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403−410のXBLASTプログラムに取り込まれる。XBLASTプログラム、スコア=50、ワードレングス=3により、BLASTタンパク質検索を実行して、本発明のポリペプチドと同一性を有するアミノ酸配列を得ることができる。比較の目的のためにギャップのあるアライメントを得るには、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389−3402に記載されたようなGapped BLASTを利用することができる。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを利用した場合、それぞれのプログラム(例えば、XBLAST)の既定のパラメータを用いることができる。アラインされた候補配列の内部ギャップおよびアミノ酸挿入は、同一性の計算を行う際には無視される。
本発明のポリペプチドのアミノ酸がいずれもの組み合わせで置換、欠失、若しくは付加された変異体は、本発明により企図される。自然発生する変異体および自然発生しない変異体は、本発明に含まれ、変異技術または直接合成により製造されてもよい。
タンパク質工学および組み換えDNA技術の知られた方法を用いて、本発明のポリペプチドの特徴を改善若しくは変化させるために、変異体を作製してもよい。このような変異体には、活性にほとんど影響しないようなこの分野で知られた一般的な規則に従って選択された、欠失、挿入、転移、繰り返し、および置換が含まれる。例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換の作製方法に関する手引きは、Bowie et al., Science, 247:1306−1310 (1990)に提供され、ここでは筆者は、アミノ酸配列が変化することについての許容性を研究する2つの主要な戦略があると、示している。
第1の戦略は、進化の過程での自然淘汰によるアミノ酸置換の許容性を利用する。異なる種におけるアミノ酸配列を比較することにより、種間で保存されてきたアミノ酸位置が同定できる。これらの保存されたアミノ酸は、タンパク質機能に重要であると考えられる。対照的に、置換が自然淘汰により許容されてきたアミノ酸位置は、タンパク質機能に決定的ではない位置であることを示す。したがって、アミノ酸置換を許容する位置は修飾されたとしても、抗−エールリヒア抗体若しくは抗体フラグメントへのポリペプチドの特異的結合活性を依然維持する。
第2の戦略は、遺伝子工学を利用して、クローニングされた遺伝子の特定の位置においてアミノ酸の変異を導入し、タンパク質機能に決定的な領域を同定するものである。例えば、部位誘導変異若しくはアラニン走査変異(分子中のすべての残基における単一のアラニン変異の導入)を用いることができる(Cunningham et al., Science, 244:1081−1085 (1989))。得られた変異体分子は、抗−エールリヒア抗体若しくは抗体フラグメントに対する特異的な結合について試験される。
Bowie et al.によると、これらの2つの戦略は、タンパク質がアミノ酸置換に対して驚くほど許容性を有していることを明らかにした。筆者らは、アミノ酸変異がタンパク質中のある特定のアミノ酸位置において許容的でありそうなことをさらに示した。例えば、最も埋没したまたは内側の(タンパク質の3次構造内の)アミノ酸残基は、無極性側鎖を必要とし、ここでは表面または外側の側鎖の特徴は一般的にほとんど保存されない。さらに、許容された保存性アミノ酸置換は、脂肪族または疎水性アミノ酸であるAla、Val、LeuおよびIleの置き換え;ヒドロキシル残基であるSerおよびThrの置き換え;酸性残基であるAspおよびGluの置き換え;アミド残基であるAsnおよびGlnの置き換え;塩基性残基であるLys、Arg、およびHisの置き換え;芳香族残基であるPhe、Tyr、およびTrpの置き換え;並びに小型アミノ酸であるAla、Ser、Thr、Met、およびGlyの置き換え;を伴う。
保存的アミノ酸置換に加えて、本発明の変異体には、(i)1またはそれ以上の非保存的アミノ酸残基による置換、ここで置換されたアミノ酸残基は、遺伝子コードによりエンコードされていてもされていなくてもよい;(ii)置換基を有する1またはそれ以上のアミノ酸残基による置換;(iii)ポリペプチドの安定性および/または溶解性を増加させる化合物(例えば、ポリエチレングリコール)のような、成熟ポリペプチドの他の化合物との融合;(iv)IgG Fc融合領域ペプチド、リーダー若しくは分泌配列、または精製を容易にする配列のような、さらなるアミノ酸とのポリペプチドの融合;が含まれる。このような変異体ポリペプチドは、本明細書の教示から当業者の範囲内にあるとみなされる。
本発明のポリペプチドは、抗−エールリヒア抗体に特異的に結合する。この文脈において「特異的に結合する」は、ポリペプチドは抗−エールリヒア抗体を認識しこれに結合するが、試験サンプル中の他の分子を実質的に認識せず、これらに結合しないことを意味する。
本発明のポリペプチドは、抗−エールリヒア抗体により認識される少なくとも1つのエピトープを含む。エピトープは、ポリペプチドの抗原決定基である。エピトープは、直線状、連続エピトープ、またはコンホメーションエピトープでもよい。本発明のポリペプチド内のエピトープは、いくつかの方法により同定できる。例えば、米国特許番号4,554,101号;JamesonおよびWolf, CABIOS 4:181−186 (1988)を参照のこと。例えば、本発明のポリペプチドは、単離しスクリーニングすることができる。一連の短鎖ペプチドは、全ポリペプチド配列に渡るものであり、タンパク質分解による切断により調製できる。はじめとして、例えば、20量体のポリペプチドフラグメントにつき、各々のフラグメントが、例えば、酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA)で認識されるエピトープの存在について試験できる。ELISAアッセイにおいて、20量体ポリペプチドフラグメントのようなポリペプチドは、プラスチックの多重ウェルプレートの壁のような固体担体に結合する。抗体の集合はラベル化され、非特異的吸着が遮蔽される条件下で、固体担体に添加され、ラベル化されていない抗原に結合し、結合していない抗体および他のタンパク質は洗い流される。抗体の結合は、例えば、無色の指標試薬が着色した反応産物に変換する反応により、検出される。段階的により小さく、重なったフラグメントを、同定された20量体から試験し、目的のエピトープをマッピングすることができる。
好ましくは、本発明のポリペプチドは、通常のペプチド合成器を用いて合成され、この合成器はこの分野でよく知られたものである。本発明のポリペプチドは、組み換えにより製造することもできる。エールリヒアポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドは、この分野でよく知られた技術を用いて適当な発現系で発現できる発現ベクター中に導入することができる。種々の細菌、酵母、植物、哺乳動物、および昆虫の発現系が、この分野で利用可能であり、このような発現系のいずれも使用することができる。任意に、エールリヒアポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドは、細胞を含まない翻訳系で翻訳されることができる。
所望により、エールリヒアポリペプチドは、融合タンパク質として製造することができ、これは、アミノ酸リンカーやシグナル配列のような他のアミノ酸配列、並びにグルタチオン−S−トランスフェラーゼ、ヒスチジンタグ、およびスタフィロコッカルタンパク質Aのようなタンパク質精製において有用なリガンド、を含むことができる。1つ以上のエールリヒアポリペプチドが、融合タンパク質中に存在できる。所望により、異なるエールリヒア株または単離体からのエールリヒアポリペプチドの種々の組み合わせも、融合タンパク質に含めることができる。
本発明のポリペプチドは、いくつかの繰り返しのエールリヒアポリペプチドを含むように合成することができる。これは、多量体ポリペプチドである。これらの繰り返しのポリペプチドは、例えば配列番号1で示されるポリペプチドのように、2またはそれ以上繰り返される1つの特異的なポリペプチドを含むことができる。あるいは、繰り返しのポリペプチドは、1またはそれ以上の他の異なるエールリヒアポリペプチドのコピーを伴う特定のエールリヒアポリペプチドの1またはそれ以上のコピーを含む。本発明のポリペプチドは、1またはそれ以上のポリペプチド、ポリペプチドのフラグメント、または完全長ポリペプチドとともに組み合わせること、または合成することができる。好ましくは、1またはそれ以上のポリペプチドは、本発明の他のポリペプチドまたは他のエールリヒアタンパク質である。
本発明のポリペプチドは、配列番号1〜7で示されるポリペプチド若しくはそれらの変異体のフラグメントを含むこともできる。例えば、ポリペプチドのフラグメントは、6から20アミノ酸のいずれの数のアミノ酸をも含むことができる。
本発明のポリペプチドは、好ましくはキャリアと組み合わされる。キャリアは、本発明のポリペプチドの媒体である。キャリアには、例えば、賦形剤、希釈材、アジュバント、および安定剤が含まれる。このような安定剤の例としては、血清アルブミンおよびゼラチンのようなタンパク質;グルコース、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ソルビトール、マルチトール、マンニトール、およびラクチトールのような糖類;およびリン酸若しくはコハク酸から主として構成されるバッファー;がある。
Ehrlichia canisおよびEhrlichia chaffeensisの種々の株および単離体が発生し、これらの株および単離体のいずれのポリペプチドも、本発明に用いることができる。エールリヒア遺伝子およびポリペプチドの核酸およびアミノ酸配列は、この分野で知られている。例えば、E.chaffeensis OMP遺伝子ファミリーのいくつかの配列およびE.canis P30遺伝子ファミリーのいくつかの配列は、WO99/13720に開示されている。
検出方法
本発明の方法は、生物学的サンプル、環境サンプル、または実験室サンプルのような試験サンプル中のEhrlichia canisまたはEhrlichia chaffeensis抗体または抗体フラグメントを検出する。生物学的サンプルには、例えば、イヌやヒトのような哺乳動物からの血清、血液、細胞、血漿、または組織を含めることができる。試験サンプルは、本発明のポリペプチドと組み合わせる前に、未処理のもの、沈殿されたもの、分画されたもの、分離されたもの、希釈されたもの、濃縮されたもの、または精製されたもの、でもよい。
本発明の方法は、生物学的サンプル、環境サンプル、または実験室サンプルのような試験サンプル中のEhrlichia canisまたはEhrlichia chaffeensis抗体または抗体フラグメントを検出する。生物学的サンプルには、例えば、イヌやヒトのような哺乳動物からの血清、血液、細胞、血漿、または組織を含めることができる。試験サンプルは、本発明のポリペプチドと組み合わせる前に、未処理のもの、沈殿されたもの、分画されたもの、分離されたもの、希釈されたもの、濃縮されたもの、または精製されたもの、でもよい。
本方法は、ポリペプチド/抗体複合体が形成できる条件下で、本発明のポリペプチドを試験サンプルに接触させることを含む。サンプル中でのポリペプチドと抗−エールリヒア抗体との複合体の形成が、検出される。本発明の1つの態様として、ポリペプチド/抗体複合体は、酵素のような、抗体に結合する指標試薬が検出可能な反応を触媒する時に、検出される。任意に、シグナル発生化合物を含む指標試薬は、ポリペプチド/抗体/指標複合体を形成できる条件下でポリペプチド/抗体複合体に適用できる。ポリペプチド/抗体/指標複合体が、検出される。任意に、ポリペプチドまたは抗体は、ポリペプチド/抗体複合体の形成前に、指標試薬によりラベル化することができる。本方法は、任意に正または負のコントロールを含むことができる。
本発明のアッセイには、限定されないが、競争に基づくもの、直接反応またはサンドウィッチ型アッセイ、が含まれる。アッセイは、固相若しくは基材を使用でき、または免疫沈降若しくは固相を利用しない他の方法により実行できる。固相若しくは基材を使用する場合、本発明のポリペプチドは、ミクロタイターウェル、マグネチックビーズ、非マグネチックビーズ、カラム、マトリックス、膜、合成若しくは天然繊維(例えば、ガラスまたはセルロースに基づく物質、またはポリエチレン、ポリプロピレン、若しくはポリエステルのような熱可塑性ポリマー)から構成される繊維状マット、粒子状物質(例えば、ガラスまたは種々の熱可塑性ポリマー)から構成される焼結構造、またはニトロセルロース、ナイロン、ポリスルホン等(一般的に元来合成されたもの)から構成されるキャストされた膜状フィルム、のような固体担体若しくは基材に直接的または間接的に結合する。好ましい基材は、焼結した、ポリエチレンの微細粒子であり、多孔質ポリエチレンとして一般的に知られた、例えば、Chromex Corporationの10〜15ミクロンの多孔質ポリエチレンである。これらの基材物質のすべては、フィルム、シート、若しくはプレートのような適当な形で用いてもよく、または紙、ガラス、プラスチックフィルム、若しくは繊維のような適切な不活性キャリア上に被覆され、結合し、またはラミネートされてもよい。ペプチドを固相に固定化する適当な方法には、イオン性、疎水性、共有結合性相互作用等が含まれる。
本発明のポリペプチドを用いて、限定されないが、酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA)、ウエスタンブロット、IFA、ラジオイムノアッセイ(RIA)、血球凝集(HA)、および蛍光偏光イムノアッセイ(FPIA)等のアッセイにより、抗−エールリヒア抗体若しくは抗体フラグメントを検出できる。本発明の好ましいアッセイは、リバーシブルフロークロマトグラフィック結合アッセイ、例えば、SNAP(登録商標)アッセイである。米国特許番号5,726,010号を参照のこと。
1つの型のアッセイ形式として、1またはそれ以上のポリペプチドが、固相または基材上に被覆できる。抗−エールリヒア抗体を含んでいると疑われる試験サンプルは、固相のポリペプチドに対する試験サンプルの抗体か、または、固相のポリペプチドに対するエールリヒアに対して特異的な抗体にコンジュゲートした指標試薬化合物のいずれか、の抗原/抗体複合体を形成するのに充分な条件下で、エールリヒアに対して特異的な抗体にコンジュゲートしたシグナル発生化合物を含む指標試薬と伴に、一定時間インキュベートされる。抗−エールリヒア抗体にコンジュゲートした指標試薬の固相への結合の低下は、定量的に測定できる。確認されたエールリヒア陰性試験サンプルから発生したシグナルと比べたシグナルの測定可能な低下は、試験サンプル中の抗−エールリヒア抗体の存在を示す。この型のアッセイは、試験サンプル中の抗−エールリヒア抗体の量を定量することができる。
他の型のアッセイ形式として、本発明の1またはそれ以上のポリペプチドが、担体または基材上に被覆される。本発明のポリペプチドは、指標試薬にコンジュゲートし、試験サンプルに添加される。この混合物は、担体または基材に適用される。エールリヒア抗体が試験サンプル中に存在すると、これらは、指標試薬にコンジュゲートしたポリペプチドおよび担体に固定化されたポリペプチドに結合することとなる。ポリペプチド/抗体/指標複合体は、検出することができる。この型のアッセイは、試験サンプル中の抗−エールリヒア抗体の量を定量することができる。
ポリペプチド/抗体複合体またはポリペプチド/抗体/指標複合体の形成は、放射性測定、色測定、蛍光測定、大きさ分離、または沈殿方法により検出することができる。任意に、ポリペプチド/抗体複合体の検出は、シグナル発生化合物を含む指標試薬に結合する第2の抗体の添加による。ポリペプチド/抗体複合体に関連するシグナル発生化合物(ラベル)を含む指標試薬は検出することができ、これには、発色剤、酵素のような触媒、フルオロセインやローダミンのような蛍光化合物、ジオキセタン、アクリジニウム、フェナントリジニウム、ルテニウム、およびルミノールのような化学発光化合物、放射性元素、直接視覚化ラベル、さらに補因子、阻害因子、マグネティックパーティクル等が含まれる。酵素の例としては、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ等が含まれる。特定のラベルの選択は、決定的なものではないが、それ自身または1またはそれ以上の他の物質と組み合わせることのいずれかにより、シグナルを発生できることとなる。
複合体の形成は、試験サンプル中における抗−E.canisまたは抗−E.chaffeensis抗体の存在の指標となる。したがって、本発明の方法を用いて、患者におけるE.canisまたはE.chaffeensis感染を診断することができる。本発明の各々のポリペプチドは、E.canis若しくはE.chaffeensis、またはポリペプチドと抗体の交差反応によりその両方を検出することができる。
本発明の方法は、試験サンプル中のエールリヒア抗体の量または数を示すこともできる。酵素のような多数の指標試薬により、存在する抗体の量は、発生するシグナルに比例する。試験サンプルの型に依存して、適当なバッファー試薬により希釈でき、濃縮でき、または何ら操作をすることなく固相に接触できる。例えば、存在する抗体の存在および/または量を測定するために、あらかじめ希釈された血清や血漿サンプル、または尿のように濃縮された標本を試験することが好ましい。
本発明は、サンプル中の抗−エールリヒア抗体を検出するためのアッセイキットをさらに含む。キットは、本発明の1またはそれ以上のポリペプチド、およびサンプル中でのポリペプチドのエールリヒア抗体への結合を検出する手段、を含む。キットは、本発明の1またはそれ以上のポリペプチド、および哺乳動物におけるエールリヒア感染の同定のための1またはそれ以上のポリペプチドの使用説明を含む装置、を含むことができる。キットは、また、キットの1またはそれ以上のポリペプチドがエールリヒア感染の同定のために用いられることを示すラベルを含む包材、を含むことができる。バッファー、コントロール等のような、当業者に知られた他の成分が、このような試験キットに含まれてもよい。本発明のポリペプチド、アッセイ、およびキットは、例えば、患者におけるエールリヒア感染の個々のケースを診断するのに有用であり、またエールリヒア流行の疫学的研究に有用である。
本発明のポリペプチドおよびアッセイを、他のポリペプチドまたはアッセイと組み合わせて、他の微生物とともにエールリヒアの存在を検出することができる。例えば、本発明のポリペプチドおよびアッセイは、心糸状虫および/またはBorrelia burgdorferを検出する試薬と組み合わせることができる。
モノクローナル抗体
本発明のポリペプチドを用いて、本発明のポリペプチドに存在するE.canisまたはE.chaffeensisの免疫学的エピトープに特異的に結合するモノクローナルおよび/またはポリクローナル抗体を開発することができる。
本発明のポリペプチドを用いて、本発明のポリペプチドに存在するE.canisまたはE.chaffeensisの免疫学的エピトープに特異的に結合するモノクローナルおよび/またはポリクローナル抗体を開発することができる。
抗体またはそれらのフラグメントを、リバーシブルフロークロマトグラフィック結合アッセイ、酵素結合イムノソルベントアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、または間接イムノ蛍光アッセイのようなアッセイ系に利用して、存在する場合には、試験サンプル中のエールリヒアポリペプチドの存在を測定することができる。さらに、これらの抗体、特にモノクローナル抗体は、CNBr活性化セファロースに似たマトリックスに結合することができ、組み換えおよび天然エールリヒア抗原およびタンパク質を精製するようなために、例えば、細胞培養物若しくは血液血清から特定のエールリヒアタンパク質のアフィニティー精製に用いることができる。本発明のモノクローナル抗体は、治療用途または他の同様の応用のためにキメラ抗体を製造するために用いることもできる。
エールリヒアエピトープに対して誘導されたモノクローナル抗体は、当業者により製造することができる。このような抗体を製造するための一般的な方法はよく知られており、例えば、KohlerおよびMilstein, Nature 256:494 (1975)に記載されており、また、J.G.R.Hurrel編, Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press Inc., Boca Raton, Fla.(1982)に総説されており、さらに、L. T. Mimms et al., Virology 176:604−619(1990)により教示される。無限増殖する抗体産生細胞系は、細胞融合により作製でき、またBリンパ球の発癌性DNAへの直接の形質転換、またはエプスタインバーウイルスによる形質導入のような他の技術によっても作製できる。
以下は、例示の目的のためのみに提供され、上記の広い用語として記載された本発明の範囲を限定するためのものではない。この開示の中に引用されたすべての参照文献は、参照することにより本明細書に取り込まれる。
イヌ血清中のE.canis抗体の検出
合成ペプチドSNAP(登録商標)アッセイの性能を、部分的に精製されたE.canis抗原を使用する市販のE.canisSNAP(登録商標)アッセイの性能と比較した。部分的に精製された天然抗原を、組織培養物中で成長させたE.canis微生物から得、分画遠心およびカラムクロマトグラフィーにより部分的に精製した。合成ペプチドSNAP(登録商標)アッセイに使用する合成ペプチドは、E.canis P30−1またはE.canis P−30ペプチドの単量体形態であり、それぞれ配列番号1および配列番号2で示される。
合成ペプチドSNAP(登録商標)アッセイの性能を、部分的に精製されたE.canis抗原を使用する市販のE.canisSNAP(登録商標)アッセイの性能と比較した。部分的に精製された天然抗原を、組織培養物中で成長させたE.canis微生物から得、分画遠心およびカラムクロマトグラフィーにより部分的に精製した。合成ペプチドSNAP(登録商標)アッセイに使用する合成ペプチドは、E.canis P30−1またはE.canis P−30ペプチドの単量体形態であり、それぞれ配列番号1および配列番号2で示される。
E.canis陽性イヌサンプルと疑われる70の集合を、アリゾナ、テキサス、およびアーカンソンから得、合成ペプチドSNAP(登録商標)アッセイおよび天然抗原SNAP(登録商標)アッセイを用いて試験した。サンプルをまた、間接IFAを用いて試験した。要約すると、IFAアッセイは、IFAスライド上に被覆されたE.canis感染細胞およびフルオロセインイソチオシアネート(FITC)ラベル化ウサギ抗−イヌIgGを用いて行った。E.canisを、細胞培養物から採取し、バッファーで希釈してIFAスライド上に被覆した。試験サンプルの希釈をバッファーにて行い、被覆されたIFAスライドと伴にインキュベートし、その後洗浄し、FITCラベル化抗−イヌコンジュゲートと伴にインキュベートした。スライドを洗浄し、紫外線光学顕微鏡により観察した。IFAの結果を、フルオロセイン活性の力価により記録する。これは、IFAスライドに反応する最後のサンプル希釈を示す。1:100より大きいかまたは等しいIFA力価のサンプルは、陽性である。
一致しない結果については、E.canisウエスタンブロットを確認アッセイとして用いた。要約すると、E.canis抗原を、組織培養物から採取し、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)により分離し、その後ニトロセルロース膜に転写した。転写の後、膜を異種タンパク質により一晩4℃で遮蔽した。イヌのE.canis抗体陽性および陰性血清サンプルの希釈した試験サンプルを、ブロットと伴に室温で2時間インキュベートした。そして、ブロットを洗浄し、市販の抗−イヌIgG:ペルオキシダーゼコンジュゲート試薬と伴に1時間インキュベートし、洗浄した。シグナルを、市販のペルオキシダーゼ指標試薬と伴に細片のインキュベーションにより発生させた。30,000ドルトンの分子量のイムノドミナントバンドに対する反応が、ウエスタンブロットによる陽性結果確認に必要であった。例えば、Suksawat et al. J. Vet. Internal Med. 14:50−55 (2000)を参照のこと。
合成ペプチドSNAP(登録商標)アッセイおよび天然抗原SNAP(登録商標)アッセイは、米国特許番号5,726,010号に記載されたものと同様のアッセイ系を含んでいた。要約すると、試験サンプルをリバースフロークロマトグラフィック結合アッセイ装置に適用して流し、フローマトリックスに飽和させた。これは、連続した複合体の形成を容易にする。これにより、試験サンプル中のエールリヒア抗体は、固定化されていないラベル化された特異的結合試薬に最初に結合する。合成ペプチドSNAP(登録商標)アッセイの場合は、固定化されていないラベル化された特異的結合試薬は、ホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートした本発明のポリペプチドである。天然抗原SNAP(登録商標)アッセイとしては、試薬は、部分的に精製された天然抗原を含む。この複合体は、固定化された分析物捕捉試薬に結合する。合成ペプチドSNAP(登録商標)アッセイとしては、固定化された分析物捕捉試薬は、ウシ血清アルブミンにコンジュゲートした本発明の1またはそれ以上のポリペプチドである。天然抗原SNAP(登録商標)アッセイとしては、捕捉試薬は、部分的に精製された天然抗原である。吸収性のリザーバが飽和したフローマトリックスに接触し、それにより流体の流れを逆転させる。検出器および洗浄溶液をフローマトリックスに付与する。液体試薬は、結合していないサンプルおよび結合していないラベル化された特異的結合試薬を除去し、固定化された分析物捕捉試薬の位置における分析物複合体の検出を容易にする。これらの実験で用いた基材は、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)であった。
結果
アッセイ結果を、表2に示す。結果は、5つのグループに分けることができる。
第1グループは、合成ペプチドSNAP(登録商標)アッセイ、天然抗原SNAP(登録商標)アッセイ、およびIFAにおいて陽性であった47サンプルを含む。これらは、抗体陽性サンプルであり、これらのサンプルについては、追加の試験を行わなかった。
アッセイ結果を、表2に示す。結果は、5つのグループに分けることができる。
第1グループは、合成ペプチドSNAP(登録商標)アッセイ、天然抗原SNAP(登録商標)アッセイ、およびIFAにおいて陽性であった47サンプルを含む。これらは、抗体陽性サンプルであり、これらのサンプルについては、追加の試験を行わなかった。
第2グループは、合成ペプチドSNAP(登録商標)アッセイにおいて陽性、天然抗原SNAP(登録商標)アッセイにおいて陰性、IFAにおいて陽性であり、ウエスタンブロット分析により確認した10サンプル(No.15、17、18、20、22、23、24、41、42および46)を含む。これらは、合成ペプチドSNAP(登録商標)アッセイで陽性であり、天然抗原SNAP(登録商標)アッセイで偽陰性であった、真陽性サンプルである。
第3グループは、IFAにおいて陽性であり、ウエスタンブロット分析により陰性であることを確認した5サンプル(No.1、2、3、4、および5)を含む。これらは、IFAで偽陽性であった、真陰性サンプルである。これらのサンプルの5つすべては、合成ペプチドSNAP(登録商標)アッセイにより陰性であると正しく同定された。天然抗原SNAP(登録商標)アッセイでは、3つのサンプル(No.1、2および5)を陰性であると正しく同定したが、2つのサンプル(No.3および4)については、偽陽性の結果を与えた。
第4グループは、IFAにおいて陰性であり、ウエスタンブロット分析により陽性であることを確認した7サンプル(No.6、7、8、9、10、11、および12)を含む。これらは、IFAで偽陰性であった、陽性サンプルである。すべての7つのサンプルは、合成ペプチドSNAP(登録商標)アッセイにより真陽性であった。天然抗原SNAP(登録商標)アッセイでは、7サンプルのうちわずか2つしか(No.7および11)を陽性として正しく同定できず、7サンプルのうち5つ(No.6、8、9、10、および12)については、これら5サンプルについて偽陰性の結果として、間違って同定した。
第5グループは、IFAにおいて陽性であり、ウエスタンブロット分析により陽性であることを確認した1サンプル(No.21)を含む。合成ペプチドSNAP(登録商標)アッセイおよび天然抗原SNAP(登録商標)アッセイは、陰性の結果を与えた。これは、合成ペプチドSNAP(登録商標)アッセイおよび天然抗原SNAP(登録商標)アッセイ両方において偽陰性であった、陽性サンプルである。
したがって、70サンプルが試験され、これらのサンプルの65が真陽性サンプルであった。合成ペプチドSNAP(登録商標)アッセイは、98.5%(64/65)の感度で、64の陽性サンプルを正しく同定した。天然抗原SNAP(登録商標)アッセイは、75.3%(49/65)の感度で、49のサンプルを正しく同定した。5つの真陰性サンプルについては、合成ペプチドSNAP(登録商標)アッセイは、100%(5/5)の感度で5つの陰性サンプルを正しく同定した。天然抗原SNAP(登録商標)アッセイは、60%(3/5)の感度で3の陰性サンプルを正しく同定した。したがって、合成ペプチドSNAP(登録商標)アッセイは、天然抗原SNAP(登録商標)アッセイに比べ、より感度が高く、特異的である。
Claims (34)
- 配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群から選ばれる単離されたポリペプチドを含む組成物。
- さらにキャリアを含む、請求項1に記載の組成物。
- (a)ポリペプチド/抗体複合体が形成できる条件下で、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群から選ばれる1またはそれ以上のポリペプチドを、エールリヒアに対する抗体を含むと疑われる試験サンプルに接触させること;
(b)ポリペプチド/抗体複合体を検出すること;
を含み、ここでポリペプチド/抗体複合体の検出は、エールリヒアに対する抗体が試験サンプル中に存在することの表示である、エールリヒアに対する抗体の存在の検出方法。 - 工程(b)の実行前に、工程(a)の複合体を測定可能なシグナルを発生するシグナル発生化合物を含む指標試薬に接触させること、をさらに含む、請求項3に記載の方法。
- Ehrlichia canisに対する抗体の存在が検出される、請求項3に記載の方法。
- Ehrlichia chaffeensisに対する抗体の存在が検出される、請求項3に記載の方法。
- 抗体が抗体のフラグメントである、請求項3に記載の方法。
- 試験サンプル中の抗体の量が測定される、請求項3に記載の方法。
- ポリペプチドが基材に結合する、請求項3に記載の方法。
- ポリペプチドが配列番号1で示される、請求項3に記載の方法。
- ポリペプチドが配列番号2で示される、請求項3に記載の方法。
- ポリペプチドが配列番号3で示される、請求項3に記載の方法。
- ポリペプチドが配列番号4で示される、請求項3に記載の方法。
- ポリペプチドが配列番号5で示される、請求項3に記載の方法。
- ポリペプチドが配列番号6で示される、請求項3に記載の方法。
- ポリペプチドが配列番号7で示される、請求項3に記載の方法。
- 1またはそれ以上のポリペプチドが多量体として提供される、請求項3に記載の方法。
- 試験サンプルが哺乳動物から得られる生物学的サンプルである、請求項3に記載の方法。
- 哺乳動物が、ヒトおよびイヌからなる群より選ばれる、請求項18に記載の方法。
- 方法が、リバーシブルフロークロマトグラフィック結合アッセイ、酵素結合イムノソルベントアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、および間接イムノ蛍光アッセイからなるアッセイ群より選ばれるアッセイを含む、請求項3に記載の方法。
- 配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群から選ばれる1またはそれ以上のポリペプチドを含む装置。
- 哺乳動物中でのエールリヒア感染の同定のための1またはそれ以上のポリペプチドの使用説明をさらに含む、請求項21に記載の装置。
- エールリヒア感染の同定が、以下の(a)および(b)を含むエールリヒアに対する抗体の存在の検出方法を用いて行われる、請求項22に記載の装置:
(a)ポリペプチド/抗体複合体が形成できる条件下で、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群から選ばれる1またはそれ以上のポリペプチドを、エールリヒアに対する抗体を含むと疑われる試験サンプルに接触させること;
(b)ポリペプチド/抗体複合体を検出すること;ここでポリペプチド/抗体複合体の検出は、エールリヒア感染が存在することの表示である。 - エールリヒア感染がEhrlichia canisまたはEhrlichia chaffeensisにより引き起こされる、請求項22に記載の装置。
- 包材、および包材に入れられた、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群から選ばれる1またはそれ以上のポリペプチド、を含む製品。
- 包材が、1またはそれ以上のポリペプチドが哺乳動物におけるエールリヒア感染の同定に使用できると表示するラベルを含む、請求項25に記載の製品。
- エールリヒア感染の同定が、以下の(a)および(b)を含むエールリヒアに対する抗体の存在の検出方法を用いて行われる、請求項26に記載の製品:
(a)ポリペプチド/抗体複合体が形成できる条件下で、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群から選ばれる1またはそれ以上のポリペプチドを、エールリヒアに対する抗体を含むと疑われる試験サンプルに接触させること;
(b)ポリペプチド/抗体複合体を検出すること;ここでポリペプチド/抗体複合体の検出は、エールリヒア感染が存在することの表示である。 - エールリヒア感染がEhrlichia canisまたはEhrlichia chaffeensisにより引き起こされる、請求項26に記載の製品。
- (a)エールリヒア感染を有していると疑われる哺乳動物から得た生物学的サンプルを調製すること;
(b)ポリペプチド/抗体複合体が形成できる条件下で、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群から選ばれる1またはそれ以上のポリペプチドを、生物学的サンプルに接触させること;
(c)ポリペプチド/抗体複合体を検出すること;
を含み、ここでポリペプチド/抗体複合体の検出は、哺乳動物がエールリヒア感染を有していることの表示である、哺乳動物におけるエールリヒア感染の検出方法。 - 工程(c)の実行前に、工程(b)の複合体を測定可能なシグナルを発生するシグナル発生化合物を含む指標試薬に接触させること、をさらに含む、請求項29に記載の方法。
- エールリヒア感染がEhrlichia canisにより引き起こされる、請求項29に記載の方法。
- エールリヒア感染がEhrlichia chaffeensisにより引き起こされる、請求項29に記載の方法。
- 哺乳動物がヒトまたはイヌである、請求項29に記載の方法。
- 配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群から選ばれる1またはそれ以上のポリペプチドであって、エールリヒアタンパク質全体に対するよりも抗エールリヒア抗体に対して高い感度と高い特異性を有する、ポリペプチド。
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