ES2596952T3

ES2596952T3 - Péptidos, dispositivos y procedimientos para la detección de anticuerpos de Ehrlichia

Info

Publication number: ES2596952T3
Application number: ES10832262.9T
Authority: ES
Inventors: Rajesh K. Mehra; Kenneth P. Aron; Dennis M. Bleile
Original assignee: Abay SA; Abaxis Inc
Current assignee: Abay SA; Abaxis Inc
Priority date: 2009-11-20
Filing date: 2010-11-19
Publication date: 2017-01-13
Anticipated expiration: 2030-11-19
Also published as: JP2013511546A; CN105203755A; CN102834411B; WO2011063235A2; AU2010321790A1; US20150024417A1; EP2501718A2; CN105203755B; US8828675B2; KR20120117778A; US20110124125A1; CN102834411A; WO2011063235A3; JP6161291B2; CA2781117A1; AU2010321790B2; CA2781117C; EP2501718A4; JP2016175908A; EP2501718B1

Abstract

Una mezcla de péptidos aislados que comprende tres o más péptidos aislados diferentes, donde cada péptido aislado comprende la secuencia de SEQ ID NO: 59, F-S-A-K-X5-X6-X7-A-E-T-X11-X12-T-F-G-X16-X17-X18-X19-X20-D-G-A-X24-X25-X26- X27-N-X29-V-X31-N-X33-F-T-I-S-N (SEQ ID NO: 59) donde X5 es un aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en E y Q, X6 es un aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en E y Q, X7 es cualquier aminoácido, X11 es un aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en K y R, X12 es cualquier aminoácido, X16 es un aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en L e I, X17 es cualquier aminoácido, X18 es un aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en R y K, X19 es un aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en Q y N, X20 es un aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en Y y T, X24 es cualquier aminoácido, X25 es un aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en I y L, X26 es cualquier aminoácido, X27 es un aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en D y E, X29 es un aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en E y Q, X31 es un aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en E y Q y X33 es un aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en K y R; y donde cualquier secuencia peptídica N-terminal o C-terminal de la secuencia de SEQ ID NO: 59 es una secuencia no nativa.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

imagen7

15

25

35

45

55

65

D-P-S-E-T-S-P-G-Q-E (SEQ ID NO; 53): S-A-K-E-E-K-Q-P-T-V-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-S-A-A-P-K-Q-R-K-N-D-P-S-E-T-S-P-G-Q-E (SEQ ID NO: 54); S-A-K-E-E-K-Q-T-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-V-A-A-P-K-Q-R-K-N-D-P-S-E-T-S-P-G-Q-E (SEQ ID NO: 55); S-A-K-E-E-K-Q-P-T-T-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-V-A-A-P-K-Q-R-K-N-D-P-S-E-T-S-P-G-Q-E (SEQ ID NO: 56); S-A-K-E-E-K-Q-T-T-Y-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-Y-A-A-P-K-Q-R-K-N-D-P-S-E-T-S-P-G-Q-E (SEQ ID NO: 57) o S-A-K-E-E-K-Q-P-T-V-G-L-Y-G-L-K-Q-D-W-D-G-V-A-A-P-K-Q-R-K-N-D-P-S-E-T-S-P-G-Q-E (SEQ ID NO: 58). En cualquiera de las realizaciones de este párrafo, los primeros 6 residuos aminoacídicos del péptido pueden reemplazarse por una secuencia seleccionada de entre el grupo consistente en S-V-K-E-E-K (SEQ ID NO: 23), S-A-K-E-D-K (SEQ ID NO: 24), S-A-K-E-E-K (SEQ ID NO: 25) y K-R-D-E-N-Q (SEQ ID NO: 26). En cualquiera de las realizaciones de este párrafo, los 14 últimos residuos aminoacídicos del péptido pueden reemplazarse por una secuencia seleccionada de entre el grupo consistente en Q-R-K-N-D-P-S-E-T-S-P-G-Q-E (SEQ ID NO: 3), M-A-P-F-H-E-L-D-V-N-N-H-P-N (SEQ ID NO: 4), S-L-N-V-S-F-L-I-D-P-M-A-P-F (SEQ ID NO: 5) y Q-D-S-N-L-Y-S-S-I-F-F-V-P-Q (SEQ ID NO: 6).

Como se precisa en las reivindicaciones, los péptidos de la invención comprenden o consisten en una secuencia de SEQ ID NO: 59, F-S-A-K-X5-X6-X7-A-E-T-X11-X12-T-F-G-X16-X17 -X18-X19-X20-D-G-A-X24-X25-X26-X27-N-X29-V-X31-N-X33-F-T-I-S-N (SEQ ID NO; 59) donde X5 es un aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en E y Q, X6 es un aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en E y Q, X7 es cualquier aminoácido, X11 es un aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en K y R, X12 es cualquier aminoácido, X16 es un aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en L e I, X17 es cualquier aminoácido, X18 es un aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en R y K, X19 es un aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en Q y N, X20 es un aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en Y y T, X24 es cualquier aminoácido, X25 es un aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en I y L, X26 es cualquier aminoácido, X27 es un aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en D y E, X29 es un aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en E y Q, X31 es un aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en E y Q y X33 es un aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en K y R.

En ciertas realizaciones, los péptidos de la invención comprenden o consisten en una secuencia de SEQ ID NO: 59 donde X5 es E, X6 es E, X16 es L, X18 es K, X20 es Y, X25 es I, X29 es Q, X31 es Q y X33 es K. En otras realizaciones, los péptidos de la invención comprenden o consisten en una secuencia de SEQ ID NO: 59 donde X7 es K, X12 es un aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en K y R, X17 es un aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en E y D, X24 es un aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en K y Q y X26 es un aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en E y T.

En ciertas realizaciones, un péptido de la invención comprende o consiste en la secuencia F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-K-K-T-F-G-L-E-K-N-Y-D-G-A-K-I-E-D-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N (SEQ ID NO: 60); F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-K-K-T-F-G-L-E-K-N-Y-D-G-A-K-I-T-D-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N (SEQ ID NO: 61); F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-K-K-T-F-G-L-E-K-N-Y-D-G-A-Q-I-E-D-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N (SEQ ID NO: 62); F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-K-K-T-F-G-L-E-K-N-Y-D-G-A-Q-I-T-D-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N (SEQ ID NO: 63); F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-K-K-T-F-G-L-D-K-N-Y-D-G-A-K-I-E-D-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N (SEQ ID NO: 64); F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-K-K-T-F-G-L-D-K-N-Y-D-G-A-K-I-T-D-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N (SEQ ID NO: (65); F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-K-K-T-F-G-L-D-K-N-Y-D-G-A-Q-I-E-D-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N (SEQ ID NO: 66); F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-K-K-T-F-G-L-D-K-N-Y-D-G-A-Q-I-T-D-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N (SEQ ID NO: (67); F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-K-R-T-F-G-L-E-K-N-Y-D-G-A-K-I-E-D-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N (SEQ ID NO: (68); F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-K-R-T-F-G-L-E-K-N-Y-D-G-A-K-I-T-D-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N (SEQ ID NO: 69); F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-K-R-T-F-G-L-E-K-N-Y-D-G-A-Q-I-E-D-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N (SEQ ID NO: 70); F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-K-R-T-F-G-L-E-K-N-Y-D-G-A-Q-I-T-D-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N (SEQ ID NO: 71); F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-K-R-T-F-G-L-D-K-N-Y-D-G-A-K-I-T-D-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N (SEQ ID NO: 72); F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-K-R-T-F-G-L-D-K-N-Y-D-G-A-K-I-E-D-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N (SEQ ID NO: 73); F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-K-R-T-F-G-L-D-K-N-Y-D-G-A-Q-I-E-D-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N (SEQ ID NO: 74) o F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-K-R-T-F-G-L-D-K-N-Y-D-G-A-Q-I-T-D-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N (SEQ ID NO: 75).

En otras realizaciones, un péptido de la invención comprende o consiste en la secuencia F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N (SEQ ID NO: 76); F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-T-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N (SEQ ID NO: 77): F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-C-A-Q-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N (SEQ ID NO: 78); F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-Q-I-T-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N (SEQ ID NO: 79); F-S-A-K-E-E-K-A-E-I-R-K-T-F-C-L-D-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N (SEQ ID NO: 80); F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-D-K-Q-Y-D-G-A-K-I-T-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N (SEQ ID NO: 81); F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-P-G-L-D-K-Q-Y-D-Q-A-Q-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N (SEQ lD NO: 82); F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-K-T-F-G-L-D-K-Q-Y-D-G-A-Q-I-T-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N (SEQ ID NO: 83); F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-R-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N (SEQ ID NO: 84); F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-R-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-K-I-T-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N (SEQ ID NO: 85); F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-R-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-Q-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N (SEQ ID NO: 86); F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-R-T-F-G-L-E-K-Q-Y-D-G-A-Q-I-T-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N (SEQ ID NO: 87); F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-R-T-F-G-L-D-K-Q-Y-D-G-A-K-I-T-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N (SEQ ID NO: 88); F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-R-T-F-G-L-D-K-Q-Y-D-G-A-K-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N (SEQ ID NO: 89); F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-R-T-F-G-L-D-K-Q-Y-D-G-A-Q-I-E-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N (SEQ ID NO: 90) o F-S-A-K-E-E-K-A-E-T-R-R-T-F-G-L-D-K-Q-Y-D-G-A-Q-I-T-E-N-Q-V-Q-N-K-F-T-I-S-N (SEQ ID NO: 91).

En algunas realizaciones, los péptidos de la divulgación comprenden o consisten en una secuencia de SEQ ID NO:

15

25

35

45

55

65

92, G-X2-F-S-A-K-X7-X8-K-X10-A-D-T-R-X15-T-F-G-L-X20-K-Q-T-D-G-A-X27-I-X29-E-N-X32-V-X34-N-X36-F-T-I-S-N (SEQ ID NO: 92) donde X2 es un aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en D y N, X7 es un aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en E y Q, X8 es un aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en E y Q, X10 es cualquier aminoácido, X15 es cualquier aminoácido, X20 es cualquier aminoácido, X27 es cualquier aminoácido, X29 es cualquier aminoácido, X32 es un aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en E y Q, X34 es un aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en E y Q y X36 es un aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en K y R. En ciertas realizaciones, los péptidos comprenden o consisten en una secuencia de SEQ ID NO: 92 donde X2 es N, X7 es E, X8 es E, X32 es Q, X34 es Q y X36 es K. En otras realizaciones, los péptidos comprenden o consisten en una secuencia de SEQ ID NO: 93, DNQVQNKFTISNYSFKYEDNP (SEQ ID NO: 93).

En ciertas realizaciones, los péptidos divulgados en la presente memoria comprenden una secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 92 y una secuencia peptídica N-terminal adicional (p.ej. una extensión N-terminal). Los péptidos de la invención pueden comprender una secuencia de SEQ ID NO: 59 como se define en las reivindicaciones y una secuencia peptídica N-terminal adicional (p.ej. una extensión N-terminal). La secuencia peptídica N-terminal adicional puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25 o más aminoácidos. En ciertas realizaciones, la secuencia peptídica N-terminal tiene una longitud de aproximadamente 5 a aproximadamente 10, de aproximadamente 10 a aproximadamente 15, de aproximadamente 15 a aproximadamente 20, de aproximadamente 20 a aproximadamente 25, de aproximadamente 25 a aproximadamente 30, de aproximadamente 30 a aproximadamente 40 o de aproximadamente 40 a aproximadamente 50 aminoácidos. En una realización, la secuencia peptídica N-terminal puede ser G-N o G-D. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, los péptidos de la invención comprenden una secuencia de SEQ ID NO: 59 y una secuencia peptídica N-terminal adicional G-N o G-D. La secuencia peptídica N-terminal adicional puede ser una secuencia nativa. Como se usa en la presente memoria, una secuencia “nativa” es una secuencia peptídica de una secuencia de OMP-1 de Ehrlichia de origen natural, o una variante de la misma. En ciertas realizaciones, la secuencia peptídica es un fragmento de una secuencia de OMP-1 de Ehrlichia de origen natural. La secuencia peptídica puede ser, p.ej., de una región conservada o no conservada de OMP-1. La secuencia peptídica puede comprender, p.ej., un epítopo tal como un epítopo inmunodominante o cualquier otro epítopo reconocible por el sistema inmunitario del hospedador (p.ej., humano, de perro, etc.). Se han descrito proteínas OMP-1 y péptidos de las mismas, p.ej., en las patentes de EE.UU. nº 6.544.517, 6.893.640, 6.923.963, 7.063.846 y 7.407.770, las solicitudes de patente de EE.UU. 2004/0265333 y 2009/0075368 y la patente europea nº 1026949.

Los polipéptidos variantes son al menos aproximadamente un 80, 85, 90, 95, 98 o 99 % idénticos a un péptido mostrado en las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7-22 y SEQ ID NO: 27-94 y se divulgan también. La identidad porcentual de secuencia tiene el significado reconocido en la materia y hay una serie de procedimientos para medir la identidad entre dos secuencias polipeptídicas o polinucleotídicas. Véanse, p.ej., Lesk, Ed., “Computational Molecular Biology”, Oxford University Press, Nueva York, (1988); Smith, Ed., “Biocomputing: Informatics And Genome Projects”, Academic Press, Nueva York, (1993); Griffin & Griffin, Eds., “Computer Analysis Of Sequence Data, Part I”, Humana Press, Nueva Jersey, (1994); von Heinje, “Sequence Analysis In Molecular Biology”, Academic Press, (1987) y Gribskov & Devereux, Eds., “Sequence Analysis Primer”, M Stockton Press, Nueva York, (1991). Los procedimientos para alinear polinucleótidos o polipéptidos están codificados en programas informáticos, incluyendo el paquete de programas GCG (Devereux et al., Nuc. Acids Res. 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul et al., J. Molec. Biol. 215: 403 (1990)) y el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711) que usa el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (Adv. App. Math., 2: 482-489 (1981)). Por ejemplo, puede usarse el programa informático ALIGN que emplea el algoritmo FASTA, con una búsqueda de hueco afín con una penalización por hueco abierto de -12 y una penalización por extensión de hueco de -2.

Cuando se usa cualquiera de los programas de alineamiento de secuencia para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, aproximadamente un 95 % idéntica a una secuencia de referencia, se fijan los parámetros de modo que se calcule el porcentaje de identidad para toda la longitud del polinucleótido de referencia y que se permitan huecos en la identidad de hasta un 5 % del número total de nucleótidos en el polinucleótido de referencia.

Las variantes de las secuencias peptídicas pueden seleccionarse fácilmente por un especialista en la materia basándose en parte en las propiedades conocidas de la secuencia. Por ejemplo, un péptido variante puede incluir sustituciones aminoacídicas (p.ej., sustituciones aminoacídicas conservativas) y/o deleciones (p.ej., deleciones aminoacídicas pequeñas de un aminoácido o deleciones que engloban 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 o más aminoácidos contiguos). Por tanto, en ciertas realizaciones, es una variante de un péptido nativo aquella que difiere de una secuencia de origen natural en (i) uno o más (p.ej. 2, 3, 4, 5, 6 o más) sustituciones aminoacídicas conservativas, (ii) la deleción de 1 o más ((p.ej., 2, 3, 4, 5, 6 o más) aminoácidos o (iii) una combinación de los mismos. Los aminoácidos eliminados pueden ser contiguos o no contiguos. Las sustituciones aminoacídicas conservativas son aquellas que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales y propiedades químicas. Estas incluyen, p.ej., (1) aminoácidos ácidos: aspartato y glutamato; (2) aminoácidos básicos: lisina, arginina e histidina; (3) aminoácidos no polares: alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina y triptófano; (4) aminoácidos polares no cargados: glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina y tirosina; (5) aminoácidos alifáticos: glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina y treonina, con serina y

15

25

35

45

55

65

treonina agrupados opcionalmente como hidroxilo alifático; (6) aminoácidos aromáticos: fenilalanina, tirosina y triptófano; (7) aminoácidos de amida: asparagina y glutamina y (9) aminoácidos que contienen azufre: cisteína y metionina. Véase, p. ej. “Biochemistry”, 2ª ed., Ed. por L. Stryer, WH Freeman and Co.: 1981. Los procedimientos para confirmar que los péptidos variantes son adecuados son convencionales y rutinarios.

Las variantes de las secuencias peptídicas engloban variaciones de secuencias peptídicas definidas anteriormente. Por ejemplo, una secuencia peptídica anteriormente descrita que comprende un epítopo conocido puede alargarse o acortarse, en uno o ambos extremos (p.ej. en aproximadamente 1-3 aminoácidos) y/o pueden sustituirse 1, 2, 3, 4 o más aminoácidos por aminoácidos conservativos, etc. Además, si se ha identificado una región de una proteína que contiene un epítopo de interés, un investigador puede “desplazar” la región de interés (p.ej. en aproximadamente 5 aminoácidos en cualquier dirección) desde los puntos finales de la región bruta original para optimizar la actividad.

En ciertas realizaciones, la secuencia peptídica N-terminal adicional puede comprender o consistir en otro péptido que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 59 o SEQ ID 92. Por tanto, en algunas realizaciones, un péptido divulgado en la presente memoria puede ser un multímero de secuencias que tienen una secuencia de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 59 o SEQ ID NO: 92. En otras realizaciones, la secuencia peptídica N-terminal es una secuencia peptídica de OMP-1 nativa que está naturalmente adyacente al extremo N-terminal de una secuencia de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 59 o SEQ ID NO: 92. Por ejemplo, en una realización, el péptido puede comprender un multímero de SEQ ID NO: 94, (KEEKAETRKTFGLEKQYDGAKlEENQVQNKGGGGG)N donde N= 1-10. En otras realizaciones, el péptido puede comprender una fusión de secuencias de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 92 o SEQ ID NO: 94 opcionalmente a través de uno o más aminoácidos ligadores. Por ejemplo, en una realización, el péptido puede comprender una secuencia de SEQ ID NO: 1 ligada a la SEQ ID NO: 94 opcionalmente a través de uno o más aminoácidos ligadores (p.ej. residuos de glicina). En otra realización, el péptido puede comprender una secuencia de SEQ ID NO: 1 ligada a la SEQ ID NO: 92 opcionalmente a través de uno o más aminoácidos ligadores (p.ej., residuos de glicina).

Como se precisa en las reivindicaciones, cualquier secuencia peptídica N-terminal adicional es una secuencia no nativa. Como se usa en la presente memoria, una secuencia “no nativa” es cualquier secuencia proteica, tanto de una proteína de Ehrlichia como de otra, distinta de una secuencia peptídica de OMP-1 nativa. En ciertas realizaciones, la secuencia peptídica N-terminal adicional comprende un epítopo de un antígeno de superficie de Ehrlichia. En ciertas realizaciones, la secuencia peptídica N-terminal adicional comprende un epítopo antigénico de Ehrlichia tal como p38, p43, p120, p140, p153, p156, p200, gp19, gp36, gp47, gp200 o HGE-3. Se han descrito secuencias proteicas y peptídicas correspondientes a antígenos de Ehrlichia. Véanse, p.ej., las patentes de EE.UU. nº 6.306.402, 6.355.777, 7.204.992 y 7.407.770 y el documento WO2006/138509. Pueden usarse también polipéptidos o péptidos derivados de otros microorganismos.

En ciertas realizaciones, la secuencia peptídica N-terminal adicional es una combinación de secuencias. Por ejemplo, la secuencia peptídica N-terminal adicional puede comprender una secuencia nativa, una secuencia no nativa o cualquier combinación de dichas secuencias (p.ej., dos o más secuencias nativas, dos o más secuencias no nativas o una o más secuencias nativas en combinación con una o más secuencias no nativas).

En ciertas realizaciones, los péptidos divulgados en la presente memoria comprenden una secuencia definida por la SEQ ID NO: 1, o SEQ ID NO: 92 y comprenden además una secuencia C-terminal adicional. Los péptidos de la invención pueden comprender una secuencia de SEQ ID NO: 59 como se define en las reivindicaciones y una secuencia C-terminal adicional. La secuencia peptídica C-terminal adicional puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25 o más aminoácidos. En ciertas realizaciones, la secuencia C-terminal adicional tiene una longitud de aproximadamente 5 a aproximadamente 10, de aproximadamente 10 a aproximadamente 15, de aproximadamente 15 a aproximadamente 20, de aproximadamente 20 a aproximadamente 25, de aproximadamente 25 a aproximadamente 30, de aproximadamente 30 a aproximadamente 40 o de aproximadamente 40 a aproximadamente 50 aminoácidos. La secuencia peptídica C-terminal adicional puede ser una secuencia de OMP-1 nativa. En ciertas realizaciones, la secuencia peptídica C-terminal es un fragmento de una secuencia de OMP-1 de Ehrlichia de origen natural. La secuencia peptídica puede ser, p.ej., de una región conservada o no conservada de OMP-1. La secuencia peptídica puede comprender, p.ej. un epítopo tal como un epítopo inmunodominante o cualquier otro epítopo reconocible por el sistema inmunitario del hospedador (p.ej., humano, de perro, etc.). En ciertas realizaciones, la secuencia peptídica C-terminal adicional puede comprender o consistir en otro péptido que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 59 o SEQ ID NO: 92. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un péptido de la invención puede ser un multímero de secuencias que tienen cada una una secuencia de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 59 o SEQ ID NO: 92. En otras realizaciones, la secuencia nativa es una secuencia de OMP-1 que está naturalmente adyacente al extremo C-terminal de una secuencia de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 59 o SEQ ID NO: 92.

En ciertas realizaciones, la secuencia peptídica C-terminal adicional es una secuencia no nativa. En ciertas realizaciones, la secuencia peptídica C-terminal adicional comprende un epítopo de un antígeno de superficie de Ehrlichia distinto de OMP-1. En ciertas realizaciones, la secuencia peptídica C-terminal adicional comprende un epítopo antigénico de Ehrlichia tal como p38, p43, p120, p140, p153, p156, p200, gp19, gp36, gp47, gp200 o HGE-3. Pueden usarse también polipéptidos o péptidos derivados de otros microorganismos.

15

25

35

45

55

65

En ciertas realizaciones, la secuencia peptídica C-terminal adicional es una combinación de secuencias. Por ejemplo, la secuencia peptídica C-terminal adicional puede comprender una secuencia nativa, una secuencia no nativa o cualquier combinación de dichas secuencias (p.ej. dos o más secuencias nativas, dos o más secuencias no nativas o una o más secuencias nativas en combinación con una o más secuencias no nativas).

En ciertas realizaciones, los péptidos divulgados en la presente memoria comprenden una secuencia definida por la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 59 o SEQ ID NO: 92 y comprenden además una secuencia peptídica N-terminal adicional y una secuencia peptídica C-terminal adicional. Las secuencias peptídicas N-terminales y C-terminales adicionales pueden ser como se describe anteriormente. Los péptidos divulgados en la presente memoria no consisten en una proteína OMP-1 completa. Sin embargo, en ciertas realizaciones, los péptidos pueden comprender una proteína OMP-1 completa. En otras realizaciones, los péptidos no comprenden una proteína OMP-1 completa.

Puede diseñarse un péptido que comprende una secuencia peptídica N-terminal y/o C-terminal adicional para diagnosticar infecciones por Ehrlichia tempranamente después de la infección (p.ej. al cabo de una a dos semanas después del inicio de la infección). Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la secuencia peptídica N-terminal y/o Cterminal adicional comprende un antígeno o epítopo asociado a las etapas tempranas de la infección por Ehrlichia.

Además de las secuencias descritas anteriormente, las secuencias N-terminales y C-terminales adicionales pueden comprender o consistir en una secuencia flexible, diseñada para presentar mejor los péptidos de la invención para detección en un inmunoensayo (p.ej., ensayo ELISA, inmunoensayo de flujo lateral, ensayo de aglutinación, etc.). Dichas secuencias flexibles pueden identificarse fácilmente por especialistas en la materia.

En ciertas realizaciones, los péptidos divulgados en la presente memoria comprenden o consisten en 25 o más (p.ej. 26, 27, 28, 29 o más) residuos aminoacídicos. En ciertas realizaciones, los péptidos comprenden o consisten en 30 o más (p.ej., 31, 32, 33, 34 o más) residuos aminoacídicos. En ciertas realizaciones, los péptidos comprenden o consisten en 35 o más (p.ej. 36, 37, 38, 39 o más) residuos aminoacídicos. En ciertas realizaciones, los péptidos comprenden o consisten en 40 o más (p.ej., 41, 42, 43, 44 o más) residuos aminoacídicos. En ciertas realizaciones, los péptidos comprenden o consisten en 45 o más (p.ej. 46, 47, 48, 49 o más) residuos aminoacídicos. En ciertas realizaciones, los péptidos comprenden o consisten en 50 o más (p.ej. 51, 52, 53, 54 o más) residuos aminoacídicos. En ciertas realizaciones, los péptidos comprenden o consisten en 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más residuos aminoacídicos.

En ciertas realizaciones, los péptidos divulgados en la presente memoria comprenden un epítopo de una secuencia peptídica descrita en la presente memoria. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, los péptidos comprenden un epítopo de una secuencia seleccionada de entre el grupo consistente en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7 a SEQ ID NO: 22y SEQ ID NO: 27a SEQ ID NO: 94.

En ciertas realizaciones, los péptidos divulgados en la presente memoria comprenden un fragmento de una secuencia peptídica descrita en la presente memoria. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, los péptidos comprenden un fragmento de una secuencia seleccionada de entre el grupo consistente en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7 a SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 27 a SEQ ID NO: 94. El fragmento puede ser, p.ej., de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 o 44 aminoácidos de longitud. El fragmento puede ser contiguo o puede incluir una o más deleciones (p.ej. una deleción de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más residuos aminoacídicos). En ciertas realizaciones, el fragmento comprende una secuencia expuesta en las patentes de EE.UU. nº 6.306.402, 6.355.777, 7.204.992 o

7.407.770 o en el documento WO2006/138509. En ciertas realizaciones, el fragmento no consiste en una secuencia expuesta en una o más de las patentes de EE.UU. nº 6.306.402, 6.355.777, 7.204.992 y 7.407.770 y el documento WO2006/138509. Los péptidos que comprenden un fragmento de una secuencia peptídica descrita en la presente memoria pueden comprender además una secuencia peptídica N-terminal adicional, una secuencia peptídica Cterminal adicional o una combinación de las mismas. Las secuencias peptídicas N-terminales o C-terminales adicionales pueden ser como se describe anteriormente.

Los péptidos de la invención que comprenden una secuencia peptídica N-terminal o C-terminal adicional pueden comprender además un ligador que conecta el péptido (p.ej. un péptido de SEQ ID NO: 59) con la secuencia peptídica N-terminal o C-terminal adicional. El ligador puede ser, p.ej., un espaciador peptídico. Dicho espaciador puede consistir, por ejemplo, en entre aproximadamente 1 y 5 (p.ej. aproximadamente 3) residuos aminoacídicos, preferiblemente aminoácidos no cargados, p.ej., residuos alifáticos tales como glicina o alanina. En una realización, el espaciador es un espaciador de triplete de glicina. En otra realización, el espaciador es un espaciador de triplete de alanina. En aún otra realización, el espaciador comprende tanto residuos de glicina como de alanina. Como alternativa, el ligador puede ser un ligador químico (p.ej. no peptídico).

En ciertas realizaciones, los péptidos de la invención se producen mediante química sintética (concretamente un “péptido sintético”). En otras realizaciones, los péptidos de la invención se producen biológicamente, concretamente mediante la maquinaria celular, tal como ribosomas). Los péptidos de la invención están aislados. Como se usa en la presente memoria, un péptido “aislado” es un péptido que se ha producido sintética o biológicamente y después purificado, al menos parcialmente, de los productos químicos y/o la maquinaria celular usados para producir el

imagen8

imagen9

15

25

35

45

55

65

comprenden las mismas adiciones N-terminales y/o C-terminales. En otras realizaciones, los péptidos comprenden diferentes adiciones N-terminales y/o C-terminales. En aún otras realizaciones, se proporciona una composición que comprende un péptido que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 59 o SEQ ID NO: 92 o mezclas de las mismas. En ciertas realizaciones, la composición comprende una mezcla de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 o más péptidos (p.ej. todos los péptidos posibles definidos por la SEQ ID NO: 59 o SEQ ID NO: 92).

En ciertas realizaciones, las composiciones comprenden uno o más péptidos divulgados en la presente memoria y uno o más péptidos adicionales, tales como un péptido o antígeno de Ehrlichia, un péptido o antígeno de una o más especies de Ehrlichia infecciosas o un péptido o antígeno de uno o más agentes causantes de ehrliquiosis monocítica. El péptido o antígeno de Ehrlichia puede ser cualquier péptido o antígeno de superficie descrito en la presente memoria (p.ej. cualquier péptido o antígeno de una proteína OMP-1, p38, p43, p120, p140, p153, p156, p200, gp19, gp36, gp47, gp200 o HGE-3, o cualquier fragmento o epítopo del mismo. La combinación pueden comprender un cóctel (mezcla sencilla) de péptidos o polipéptidos individuales, puede estar en forma de un péptido o polipéptido de fusión (p.ej. un péptido multimérico) o los péptidos pueden ligarse por un dendrímero (p.ej. como en una estructura de MAPS). Un péptido puede fusionarse en su extremo N o extremo C con otro péptido adecuado. Dos o más copias de un péptido pueden unirse entre sí, solas o en combinación con uno o más péptidos adicionales. Pueden usarse combinaciones de péptidos o polipéptidos fusionados y no fusionados. En una realización, el péptido

o péptidos adicionales contienen epítopos de linfocitos B o linfocitos T de un péptido o antígeno de Ehrlichia, un péptido o antígeno de una especie de Ehrlichia infecciosa o un péptido o antígeno de un agente causante de ehrliquiosis monocítica.

En otro aspecto, se divulgan en la presente memoria ácidos nucleicos que comprenden una secuencia que codifica un péptido de la invención. Los ácidos nucleicos de la divulgación contienen menos de un genoma microbiano entero y pueden ser monocatenarios o bicatenarios. El ácido nucleico puede ser ARN, ADN, ADNc, ADN genómico, ARN o ADN sintetizado químicamente o combinaciones de los mismos. Los ácidos nucleicos pueden purificarse de otros componentes, tales como proteínas, lípidos y otros polinucleótidos. Por ejemplo, los ácidos nucleicos pueden purificarse un 50, 75, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 %. Los ácidos nucleicos codifican los péptidos descritos en la presente memoria. En ciertas realizaciones, los ácidos nucleicos codifican un péptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO; 1, SEQ ID NO: 7-22 o SEQ ID NO: 27-94 o combinaciones de las mismas. Los ácidos nucleicos de la invención pueden comprender otras secuencias nucleotídicas tales como secuencias de codificación de ligadores, secuencias señal, secuencias de terminación de transferencia TMR, dominios transmembrana o ligandos útiles en la purificación de proteínas tales como glutation-S-transferasa, marcaje de histidina y proteína A estafilocócica.

Los ácidos nucleicos divulgados en la presente memoria pueden aislarse. Un ácido nucleico “aislado” es aquel que no es inmediatamente contiguo a una o ambas de las secuencias genómicas flanqueantes 5’ y 3’ con las que está naturalmente asociado. Un ácido nucleico aislado puede ser, p.ej., una molécula de ADN recombinante de cualquier longitud, a condición de que se retiren o estén ausentes las secuencias de ácido nucleico encontradas naturalmente que flanquean inmediatamente a la molécula de ADN recombinante en un genoma de origen natural. Los ácidos nucleicos aislados incluyen también moléculas de ácido nucleico de origen no natural. Los ácidos nucleicos divulgados en la presente memoria pueden comprender también fragmentos que codifican péptidos inmunogénico. Los ácidos nucleicos divulgados en la presente memoria pueden codificar polipéptidos completos, fragmentos peptídicos y péptidos variantes o de fusión.

Los ácidos nucleicos divulgados en la presente memoria pueden aislarse, al menos en parte, de secuencias de ácido nucleico presentes, por ejemplo, en una muestra biológica tal como sangre, suero, saliva o tejido de un individuo infectado. Los ácidos nucleicos pueden sintetizarse también en el laboratorio, por ejemplo usando un sintetizador automático. Puede usarse un procedimiento de amplificación tal como PCR para amplificar ácidos nucleicos, al menos en parte, a partir de ADN genómico o ADNc que codifica los polipéptidos.

Los ácidos nucleicos divulgados en la presente memoria pueden comprender secuencias de codificación de polipéptidos de origen natural o pueden codificar secuencias alteradas que no aparecen en la naturaleza. Si se desea, los ácidos nucleicos pueden clonarse en un vector de expresión que comprende elementos de control de la expresión incluyendo, por ejemplo, orígenes de replicación, promotores, potenciadores u otros elementos reguladores que impulsan la expresión de los polinucleótidos de la invención en células hospedadoras. Un vector de expresión puede ser, por ejemplo, un plásmido tal como pBR322, pUC o ColE1, o un vector adenovírico tal como un vector adenovírico de tipo 2 o de tipo 5. Opcionalmente, pueden usarse otros vectores incluyendo, pero sin limitación, vectores del virus Sindbis, virus de simio 40, alfavirus, vectores de poxvirus y vectores de citomegalovirus y retrovirus tales como virus de sarcoma de murino, virus de tumor mamario de ratón, virus de leucemia de murino de Moloney y virus de sarcoma de Rous. Pueden usarse también minicromosomas tales como MC y MC1, bacteriófagos, fagémicos, cromosomas artificiales de levadura, cromosomas artificiales bacterianos, partículas víricas, partículas de tipo vírico, cósmidos (plásmidos en que se han insertado sitios cos de fago lambda) y replicones (elementos genéticos que son capaces de replicación bajo su propio control en una célula).

Son bien conocidos en la materia los procedimientos para preparar polinucleótidos ligados operativamente con una secuencia de control de la expresión y expresarlos en una célula hospedadora. Véase, p.ej., la patente de EE.UU. nº

15

25

35

45

55

65

4.366.246. Un ácido nucleico está ligado operativamente cuando está dispuesto adyacente o cercano a uno o más elementos de control de la expresión, que dirigen la transcripción y/o traducción del polinucleótido.

Por tanto, por ejemplo, un péptido divulgado en la presente memoria puede producirse recombinantemente siguiendo técnicas de ingeniería genética convencionales. Para producir un péptido recombinante, se inserta un ácido nucleico que codifica el péptido en un sistema de expresión adecuado. Generalmente, se construye una molécula o vector recombinante en que la secuencia polinucleotídica que codifica el péptido seleccionado se liga operativamente con una secuencia de control de la expresión permitiendo la expresión del péptido. Son conocidos en la materia numerosos tipos de vectores de expresión apropiados incluyendo, p.ej., vectores que contienen sistemas de expresión bacterianos, víricos, de levadura, fúngicos, de insecto o mamífero. Son bien conocidos los procedimientos para obtener y usar dichos vectores de expresión. Para orientación en estas y otras técnicas de biología molecular usadas para composiciones o procedimientos de la invención, véanse, p.ej. Sambrook et al., “Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, edición actual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York; Miller et al., “Genetic Engineering”, 8: 277-298 (Plenum Press, edición actual), Wu et al., “Methods in Gene Biotechnology” (CRC Press, Nueva York, N.Y., edición actual), “Recombinant Gene Expression Protocols, in Methods in Molecular Biology”, vol. 62, (Tuan, ed., Humana Press, Totowa, N..L, edición actual) y “Current Protocols in Molecular Biology”, (Ausabel y col, Eds.,) John Wiley & Sons, NY (edición actual) y las referencias citadas en los mismos.

Por consiguiente se proporcionan también vectores que comprenden ácidos nucleicos de la invención y células hospedadoras que comprenden dichos vectores. En ciertas realizaciones, el vector es un vector lanzadera. En otras realizaciones, el vector es un vector de expresión (p.ej. un vector de expresión bacteriano o eucariótico). En ciertas realizaciones, la célula hospedadora es una célula bacteriana. En otras realizaciones, la célula hospedadora es una célula eucariótica.

Las células hospedadoras o líneas celulares adecuadas para la transfección de los ácidos nucleicos o vectores recombinante de la divulgación incluyen células bacterianas. Por ejemplo, son bien conocidas diversas cepas de E. coli (p.ej. HB101, MC1061) como células hospedadoras en el campo de la biotecnología. Pueden emplearse también en este procedimiento diversas cepas de B. subtilis, Pseudomonas, Streptomyces y otros bacilos y similares. Como alternativa, puede expresarse un péptido en levadura, insecto, mamífero u otro tipo celular usando procedimientos convencionales.

Se proporciona también un procedimiento para producir un péptido o polipéptido recombinante que implica transfectar o transformar, p.ej. por medios convencionales tales como electroporación, una célula hospedadora con al menos un vector de expresión que contiene un polinucleótido de la divulgación bajo el control de una secuencia de control de la expresión (p.ej., una secuencia reguladora transcripcional). La célula hospedadora transfectada o transformada se cultiva entonces en condiciones que permitan la expresión del péptido o polipéptido. El péptido o polipéptido expresado se recupera, se aísla y opcionalmente se purifica de la célula (o del medio de cultivo, si se expresa de forma extracelular) mediante medios apropiados conocidos por el especialista en la materia, incluyendo cromatografía líquida tal como normal o en fase inversa, usando HPLC, FPLC y similares, cromatografía de afinidad tal como con ligandos inorgánicos o anticuerpos monoclonales, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de quelato metálico inmovilizado, electroforesis en gel y similares. Un especialista en la materia puede seleccionar las técnicas de aislamiento y purificación más apropiadas sin apartarse del alcance de esta invención. Un especialista en la materia puede determinar la pureza del péptido o polipéptido usando procedimientos estándares incluyendo, p.ej. electroforesis en gel de poliacrilamida (p.ej. PAGE-SDS), electroforesis capilar, cromatografía en columna (p.ej. cromatografía líquida de alta resolución) (HPLC) o análisis aminoacídico aminoterminal.

Procedimientos

En otro aspecto, la invención proporciona procedimientos de detección en una muestra de un anticuerpo contra un epítopo de un antígeno de Ehrlichia. Los procedimientos comprenden poner en contacto una muestra con una mezcla de péptidos aislados de la invención y detectar la formación de un complejo de anticuerpo-péptido que comprende dichos péptidos, donde la formación de dicho complejo es indicativa de la presencia de un anticuerpo contra un epítopo de un antígeno de Ehrlichia en dicha muestra. En ciertas realizaciones, el antígeno de Ehrlichia es de una especie de Ehrlichia infecciosa. En ciertas realizaciones, el antígeno de Ehrlichia es de una especie de Ehrlichia patogénica, tal como Ehrlichia chaffeensis o Ehrlichia canis. Pueden detectarse también usando los procedimientos de la invención otras especies de Ehrlichia que se han implicado en la ehrliquiosis monocítica, a condición de que induzcan anticuerpos que puedan reaccionar específicamente con una mezcla de péptidos aislados de la invención. Por tanto, ha de entenderse que el término “Ehrlichia patogénica” como se usa en la presente memoria, hace referencia a cualquier especie de Ehrlichia que cause ehrliquiosis monocítica.

Los procedimientos comprenden poner en contacto la muestra con una mezcla de 3, 4 o más (p.ej. 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 o más) péptidos diferentes de la invención. Los procedimientos divulgados en la presente memoria pueden comprender poner en contacto la muestra con una mezcla de uno o más péptidos de la invención y uno o más de otros péptidos (p.ej. un péptido de Ehrlichia o fragmento antigénico o epítopo del mismo, tal como un antígeno de superficie de Ehrlichia o una proteína OMP-1,

15

25

35

45

55

65

p38, p43, p120, p140, p153, p156, p200, gp19, gp36, gp47, gp200 o HGE-3).

Cada péptido de la mezcla es un péptido aislado (p.ej. sintético y/o purificado). En ciertas realizaciones, la mezcla de péptidos se enlaza con o se inmoviliza sobre un soporte sólido. En ciertas realizaciones, el soporte sólido es una perla (p.ej. una partícula coloidal, una nanopartícula, una perla de látex, etc.), una ruta de flujo de un dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral (p.ej. una membrana porosa), una ruta de flujo de un rotor analítico, un tubo o un pocillo (p.ej. en una placa adecuada para un ensayo ELISA) o un sensor (p.ej. un sensor electroquímico, óptico u optoelectrónico).

En ciertas realizaciones, la etapa de detección comprende efectuar un ensayo ELISA. En otras realizaciones, la etapa de detección comprende efectuar un inmunoensayo de flujo lateral. En otras realizaciones, la etapa de detección comprende efectuar un ensayo de aglutinación (p.ej. un ensayo de hemaglutinación o aglutinación de partícula/perla). En otras realizaciones, la etapa de detección comprende centrifugar la muestra en un rotor analítico. En aún otras realizaciones, la etapa de detección comprende analizar la muestra con un sensor electroquímico, óptico u optoelectrónico.

Hay una serie de ensayos convencionales diferentes para detectar la formación de un complejo de anticuerpopéptido. Por ejemplo, la etapa de detección puede comprender efectuar un ensayo ELISA, efectuar un inmunoensayo de flujo lateral, efectuar un ensayo de aglutinación, analizar la muestra en un rotor analítico o analizar la muestra con un sensor electroquímico, óptico u optoelectrónico. Estos diferentes ensayos se describen anteriormente y/o son bien conocidos por los especialistas en la materia.

En una realización, los procedimientos implican detectar la presencia de anticuerpos de origen natural contra un antígeno de Ehrlichia (p.ej., el antígeno de una Ehrlichia patogénica, tal como E. chaffeensis o E. canis) que se producen por el sistema inmunitario del sujeto infectado en sus fluidos biológicos o tejidos, y que son capaces de unirse específicamente a un péptido de la invención o a combinaciones de un péptido de la invención y, opcionalmente, uno o más polipéptidos o péptidos antigénicos adicionales adecuados.

Los procedimientos de inmunoensayo adecuados incluyen típicamente: recibir u obtener (p.ej. de un paciente) una muestra de fluido corporal o tejido que es probable que contenga anticuerpos; poner en contacto (p.ej. incubar o hacer reaccionar) una muestra para ensayar con un péptido de la invención en condiciones efectivas para la formación de un complejo de péptido-anticuerpo específico (p.ej., para la unión específica del péptido al anticuerpo) y ensayar en la muestra puesta en contacto (reaccionada) la presencia de una reacción de anticuerpo-péptido (p.ej., determinar la cantidad de complejo de anticuerpo-péptido). La presencia de una cantidad elevada de complejo de anticuerpo-péptido indica que el sujeto se ha expuesto a e infectado con una especie de Ehrlichia infecciosa. Un péptido, incluyendo una forma modificada del mismo, que se “une específicamente” a (p.ej. “es específico de” o se une “preferencialmente a”) un anticuerpo contra un antígeno de Ehrlichia interacciona con el anticuerpo, o forma o experimenta una asociación física con él, en una medida y durante un tiempo suficiente para permitir la detección del anticuerpo. Se entiende por “específicamente” o “preferencialmente” que el péptido tiene una mayor afinidad (concretamente un mayor grado de selectividad) por dicho anticuerpo que por otros anticuerpos de una muestra. Por ejemplo, el péptido puede tener una afinidad por el anticuerpo de al menos aproximadamente 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces o más que por otros anticuerpos de la muestra. Dicha afinidad o grado de especificidad puede determinarse mediante una variedad de procedimientos rutinarios incluyendo, p.ej., estudios de unión competitiva. En un ensayo ELISA, se define una respuesta positiva como un valor 2 o 3 desviaciones estándares mayor que el valor medio de un grupo de controles sanos. En algunas realizaciones, se requiere un ensayo de segundo nivel para proporcionar un serodiagnóstico inequívoco de ehrliquiosis monocítica.

Frases tales como “muestra que contiene un anticuerpo” o “detectar un anticuerpo en una muestra” no pretenden excluir las muestras o determinaciones (p.ej. intentos de detección) donde no está contenido ni es detectado anticuerpo. En sentido general, esta invención implica ensayos para determinar si un anticuerpo producido en respuesta a la infección con una Ehrlichia infecciosa está presente en una muestra, independientemente de si se detecta o no.

Las condiciones para hacer reaccionar péptidos y anticuerpos de modo que reaccionen específicamente son bien conocidas por los especialistas en la materia. Véase, p.ej., “Current Protocols in Immunology” (Coligan et al., editores, John Wiley & Sons, Inc).

Los procedimientos divulgados en la presente memoria comprenden recibir u obtener una muestra de fluido corporal

o tejido que es probable que contenga anticuerpos de un sujeto. Los anticuerpos pueden ser, p.ej. de tipo IgG, IgE, IgD, IgM o IgA. Generalmente, se detectan anticuerpos de IgM y/o IgA, p.ej. para detección en etapas tempranas de infección. Los anticuerpos de IgG pueden detectarse cuando se usan algunos de los péptidos adicionales discutidos anteriormente en el procedimiento (concretamente péptidos para la detección de proteínas de flagelo). La muestra es preferiblemente fácil de obtener y puede ser sangre completa, plasma o suero derivado de una muestra de sangre venosa o incluso de una punción digital. Es conocido que los tejidos de otras partes del cuerpo u otro fluidos corporales, tales como líquido cefalorraquídeo (LCR), saliva, secreciones gástricas, moco, orina, etc. contienen anticuerpos y pueden usarse como fuente de la muestra.

imagen10

15

25

35

45

55

65

detección. Pueden usarse marcajes convencionales que pueden, solos o concertados con otras composiciones o compuestos, proporcionar una señal detectable. Los marcajes adecuados incluyen, pero sin limitación, enzimas (p.ej. HRP, beta-galactosidasa, etc.), marcajes fluorescentes, marcajes radiactivos y marcajes conjugados con metal (p.ej. marcajes conjugados con oro coloidal). Los procedimientos de detección adecuados incluyen, p.ej. la detección de un agente que está marcado, directa o indirectamente, con un ensayo colorimétrico, p.ej., para la detección de HRP o actividad de beta-galactosidasa), la inspección visual usando microscopia óptica, microscopia por inmunofluorescencia, incluyendo microscopia confocal, o citometría de flujo (FACS), autorradiografía (p.ej. para la detección de un agente marcado con radiactividad), microscopia electrónica, inmunotinción, fraccionamiento subcelular o similares. En una realización, se incorpora un elemento radiactivo (p.ej. un aminoácido radiactivo) directamente a una cadena peptídica; en otra realización, se asocia un marcaje fluorescente con un péptido mediante interacción de biotina/avidina, asociación con un anticuerpo conjugado con fluoresceína o similar. En una realización, se añade a la mezcla un ligando de unión específico detectable para el anticuerpo. Por ejemplo, el ligando de unión puede ser un anticuerpo secundario detectable u otro agente de unión (p.ej., proteína A, proteína G, proteína L) que se une al primer anticuerpo. Este anticuerpo secundario u otro agente de unión puede marcarse, p.ej., con un marcaje radiactivo, enzimático, fluorescente, luminiscente u otro detectable, tal como un sistema de avidina/biotina. En otra realización, el ligando de unión es un péptido de la invención que puede conjugarse directa o indirectamente (p.ej. mediante interacción de biotina/avidina) con una enzima, tal como peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina. En dichas realizaciones, la señal detectable se produce añadiendo un sustrato de la enzima que produce una señal detectable, tal como un sustrato cromogénico, fluorogénico o quimioluminiscente.

Un “sistema de detección” para detectar péptido unido, como se usa en la presente memoria, puede comprender un ligando de unión detectable, tal como un anticuerpo específico del péptido. En una realización, el ligando de unión se marca directamente. En otra realización, el ligando de unión se enlaza con un reactivo generador de señal, tal como una enzima que, en presencia de un sustrato adecuado, puede producir una señal detectable. Puede acompañar opcionalmente al sistema de detección una superficie para inmovilizar el péptido.

En realizaciones de la invención, el procedimiento de detección comprende inspeccionar visualmente en el complejo de anticuerpo-péptido un cambio de color, o inspeccionar en el complejo de anticuerpo-péptido un cambio fisicoquímico. Los cambios fisicoquímicos pueden aparecer con reacciones de oxidación u otras reacciones químicas. Pueden detectarse visualmente, usando un espectrofotómetro o similares.

Es un formato de ensayo particularmente útil el formato de inmunoensayo de flujo lateral. Los anticuerpos contra inmunoglobulinas humanas o animales (p.ej., perro, ratón, venado, etc.) o proteínas Staph A, G o L pueden marcarse con un generador de señal o indicador (p.ej. oro coloidal) que se seca y se dispone sobre una almohadilla de fibra de vidrio (almohadilla de aplicación de muestra o almohadilla de conjugado). Se inmoviliza el péptido de diagnóstico sobre una membrana tal como nitrocelulosa o membrana de PVDF (poli(fluoruro de vinilideno)) (p.ej., membrana Immobilon™). Cuando se aplica una solución de muestra (sangre, suero, etc.) a la almohadilla de aplicación de muestra (o fluye a través de la almohadilla de conjugado), se disuelve el indicador marcado, que se une entonces a todos los anticuerpos de la muestra. Se transportan entonces los complejos resultantes a la siguiente membrana (PVDF o nitrocelulosa que contiene el péptido de diagnóstico) mediante acción capilar. Si están presentes anticuerpos contra el péptido de diagnóstico, se unen al péptido de diagnóstico extendido sobre la membrana, generando así una señal (por ejemplo una banda que puede verse o visualizarse). Puede usarse para producir la señal de control un anticuerpo adicional específico del anticuerpo marcado o un segundo anticuerpo marcado. Como variación de este formato de ensayo, la muestra puede aplicarse a la almohadilla de aplicación de muestra de manera que permita que los anticuerpos de la muestra se desplacen y se unan a los péptidos de la tira de diagnóstico, y puede añadirse una segunda solución “reveladora” a la almohadilla de aplicación de muestra, donde la solución reveladora contiene indicador marcado (o, p.ej., se solubiliza el indicador marcado presente en la almohadilla de aplicación de muestra o almohadilla de conjugado). La solución reveladora porta entonces, por acción capilar, el indicador marcado a la tira de diagnóstico, donde el indicador marcado puede unirse a cualquier anticuerpo de muestra unido a los péptidos localizados en la tira de diagnóstico.

Un formato alternativo al inmunoensayo de flujo lateral comprende conjugar los péptidos o composiciones divulgados en la presente memoria con un ligando (p.ej. biotina) y complejar con receptor de ligando marcado (p.ej. estreptavidina-oro coloidal). Los complejos peptídicos marcados pueden disponerse en la almohadilla de aplicación de muestra o almohadilla de conjugado. Los anticuerpos anti-IgG/IgM humana o anti-IgG/IgM de animal (p.ej. perro, ratón, venado) u otros péptidos divulgados en la presente memoria se inmovilizan sobre una membrana, tal como de nitrocelulosa o PVDF, en un sitio de prueba (p.ej. una línea de prueba). Cuando se añade muestra a la almohadilla de aplicación de muestra, los anticuerpos de la muestra reaccionan con los complejos peptídicos marcados de tal modo que los anticuerpos que se unen a péptidos de la divulgación se marquen indirectamente. Se transportan entonces los anticuerpos de la muestra a la siguiente membrana (PVDF o nitrocelulosa que contiene el péptido de diagnóstico) mediante acción capilar y se unen a los anticuerpos anti-IgG/IgM humana o anti-IgG/IgM de animales (o proteína A, proteína G, proteína L o combinaciones de las mismas) o péptidos inmovilizados divulgados en la presente memoria. Si algunos de los anticuerpos de muestra se unen a los péptidos marcados divulgados en la presente memoria, puede verse o visualizarse el marcaje asociado a los péptidos en el sitio de prueba. Se muestra una realización de este tipo de dispositivo de flujo lateral en la Figura 2. Se muestra otra realización de este tipo de dispositivo de flujo lateral en la Figura 3, en que se usan los péptidos divulgados en la presente memoria tanto como

15

25

35

45

55

65

agente de captura inmovilizado en un sitio de prueba como complejo marcado soluble para reaccionar con anticuerpos de una muestra. Los controles adecuados para este ensayo pueden incluir, p.ej., conjugado de IgY de pollo-oro coloidal localizado en la almohadilla de aplicación de muestra o almohadilla de conjugado, y anticuerpo anti-IgY de pollo inmovilizado en un sitio de control localizado proximal al sitio de ensayo. Este formato puede modificarse también para tener una solución “reveladora”. Por ejemplo, la solución reveladora podría contener (o solubilizar) el receptor de ligando marcado.

Es otro ensayo para el cribado de productos sanguíneos u otros fluidos fisiológicos o biológicos un ensayo de inmunosorción ligado a enzima, concretamente un ELISA. Típicamente, se adsorben en un ELISA péptidos aislados de la invención sobre la superficie de un pocillo de microvaloración directamente o mediante una matriz de captura (p.ej. un anticuerpo). Se bloquean entonces los sitios de unión a proteína no específicos residuales sobre la superficie con un agente apropiado, tal como seroalbúmina bovina (BSA), suero de cabra normal termoinactivado (NGS) o BLOTTO (una solución tamponada de leche desnatada desecada que contiene también un conservante, sales y un agente antiespumante). Se incuba entonces el pocillo con una muestra biológica sospechosa de contener anticuerpo específico anti-Ehrlichia (p.ej., anti-E. chaffeensis o anti-E. canis). La muestra puede aplicarse pura o, más a menudo, puede diluirse, habitualmente en una solución tamponada que contiene una pequeña cantidad (0,15,0 % en peso) de proteína tal como BSA, NGS o BLOTTO. Después de incubar durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que ocurra la unión específica, se lava el pocillo para retirar la proteína no unida y se incuba entonces con una concentración óptima de un anticuerpo anti-inmunoglobulina apropiado (p.ej. para sujetos humanos, una inmunoglobulina anti-humana (-HuIg) de otro animal tal como perro, ratón, vaca, etc.) u otro péptido de la invención que esté conjugado con una enzima u otro marcaje mediante procedimientos estándares y se disuelve en tampón de bloqueo. El marcaje puede elegirse de una variedad de enzimas, incluyendo peroxidasa de rábano picante (HRP), beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa, etc. Se deja suficiente tiempo para que ocurra de nuevo la unión específica, se lava entonces de nuevo el pocillo para retirar el conjugado no unido y se añade un sustrato adecuado para la enzima. Se deja revelar el color y se determina la densidad óptica de los contenidos del pocillo visual o instrumentalmente (medido a una longitud de onda apropiada). El valor de corte de DO puede definirse como la DO media + 3 desviaciones estándares (DE) de al menos 50 muestras de suero recogidas de individuos de una zona donde la ehrliquiosis no sea endémica, o mediante otras de dichas definiciones convencionales. En el caso de un ensayo muy específico, puede usarse DO+2 DE como valor de corte.

En una realización de ELISA, se inmoviliza un péptido de la invención sobre una superficie, tal como una placa ELISA de 96 pocillos o fase sólida equivalente que está recubierta con estreptavidina o un compuesto de unión a biotina equivalente, tal como avidina o neutravidina, a una concentración óptima en un tampón de recubrimiento alcalino y se incuba a 4 ºC durante una noche. Después de un número adecuado de lavados con tampones de lavado estándares, se aplica a cada pocillo una concentración óptima de una forma biotinilada de un péptido o composición de la invención, disuelta en un tampón de bloqueo convencional. Se añade entonces una muestra y el ensayo prosigue como anteriormente. Las condiciones para efectuar ensayos ELISA son bien conocidas en la materia.

Un formato alternativo para el ensayo ELISA presenta el péptido o péptidos de la invención enlazados (p.ej. fusionados) con una enzima apropiada tal como HRP. Las etapas para llevar a cabo dicho ELISA incluyen: recubrir los pocillos de una placa con IgG/IgM anti-perro o anti-humana; incubar las muestras sospechosas de contener anticuerpos contra el péptido de la invención con las IgG/IgM inmovilizadas anti-especies; retirar la muestra no reaccionada y lavar los pocillos con un tampón de lavado adecuado; aplicar péptido acoplado con enzima (p.ej. acoplado con HRP) de la invención y dejarlo reaccionar con cualquier anticuerpo anti-Ehrlichia capturado y visualizar el péptido acoplado con enzima aplicando un sustrato enzimático apropiado (p.ej. TMB).

En otra realización, los procedimientos comprenden un ensayo de aglutinación. Por ejemplo, en ciertas realizaciones se conjugan partículas coloidales (p.ej. oro coloidal, etc.) o perlas de látex con péptidos de la invención. Posteriormente, se incuba el fluido biológico con el conjugado de perla/péptido, formando así una mezcla de reacción. Se analiza entonces la mezcla de reacción para determinar la presencia de anticuerpos. En ciertas realizaciones, los ensayos de aglutinación comprenden el uso de una segunda población de partículas tales como partículas coloidales (p.ej. oro coloidal, etc.) o perlas de látex conjugadas con (1) anticuerpos específicos de los péptidos de la invención, en el caso de un ensayo competitivo, o (2) anticuerpos capaces de detectar anticuerpos de la muestra (p.ej., anticuerpos anti-IgG o IgM humanos, anticuerpos anti-IgG o IgM de perro, etc.), en el caso de un ensayo de tipo sándwich. Los procedimientos de aglutinación adecuados pueden comprender la centrifugación como medio de valoración de la extensión de la aglutinación.

En aún otra realización, los péptidos de la invención se electrotransfieren o transfieren puntualmente a papel de nitrocelulosa. Posteriormente, se incuba una muestra tal como un fluido biológico (p.ej. suero o plasma) con el antígeno transferido y se deja unir el fluido biológico al antígeno o antígenos. El anticuerpo unido puede detectarse entonces, p.ej., mediante procedimientos inmunoenzimáticos estándares o mediante visualización usando nanopartículas coloidales acopladas con anticuerpos secundarios u otros agentes de unión a anticuerpo, tales como proteína A, proteína G, proteína L o combinaciones de los mismos.

Debería entenderse por un especialista en la materia que puede designarse cualquier número de formatos de

imagen11

imagen12

imagen13

Claims

imagen1

imagen2