ES2767183T3

ES2767183T3 - Péptidos, dispositivos y procedimientos para la detección de anticuerpos de Anaplasma

Info

Publication number: ES2767183T3
Application number: ES15740392T
Authority: ES
Inventors: Rajesh K Mehra; Kenneth P Aron; Dennis M Bleile; Andrew P Rogers; Timothy P Forsyth; Jeremy D Walker; Cristina R Cuesico
Original assignee: Abay SA; Abaxis Inc
Current assignee: Abay SA; Abaxis Inc
Priority date: 2014-01-21
Filing date: 2015-01-21
Publication date: 2020-06-16
Anticipated expiration: 2035-01-21
Also published as: CA2933376C; US11131675B2; AU2015209461B2; EP3636277A1; WO2015112558A3; US20160109457A1; EP3096784A4; CA2933376A1; BR112016016737A2; KR102559678B1; EP3096784A2; EP3096784B1; HUE047156T2; US10330687B2; AU2015209461A1; EP3636277B1; US9194870B2; JP6738274B2; BR112016016737B1; CN105916518A

Abstract

Una composición que comprende una población de péptidos aislados, comprendiendo dicha población tres o más péptidos diferentes, en la que cada péptido en la población comprende una secuencia de: (i) SEQ ID NO: 3, en la que X5 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V o A, X7 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, I o H, X11 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E, N o Q, X18 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D o N, X21 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R, D o N, X25 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q, D o E, X28 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E o N, X31 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L o V, X45 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K o Q, X48 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F o V, X51 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D o N, X54 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E o Q, X57 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S o Q, X60 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F o W, X63 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I o V, y X66 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q o D; (ii) SEQ ID NO: 1, en la que X9 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, P o H, X17 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, W o Y, X21 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R, D o N, X28 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E o N y X31 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L o V; o (iii) SEQ ID NO: 9, en la que X5 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V o A, X7 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, I o H, X11 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E, N o Q, X21 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R, D o N, X25 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q, D o E, X28 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E o N y X31 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L o V.

Description

DESCRIPCIÓN

Péptidos, dispositivos y procedimientos para la detección de anticuerpos de Anaplasma

Antecedentes de la invención

Anaplasma es un género de bacterias gramnegativas que son patógenos intracelulares obligados capaces de infectar granulocitos, plaquetas y eritrocitos en hospedadores vertebrados. Las bacterias Anaplasma se transmiten a los hospedadores a través de vectores artrópodos, particularmente diversas especies de garrapatas. A. phagocytophilum infecta neutrófilos y provoca anaplasmosis en mamíferos, incluyendo seres humanos. La incidencia de anaplasmosis granulocitotrópica (o granulocítica) humana (HGA, anteriormente conocida como ehrlichiosis granulocitotrópica humana) ha aumentado de manera constante, de 1,4 casos por millón de personas en 2000 a 6,1 casos por millón de personas en 2010. A. phagocytophilum se transmite principalmente por Ixodes spp. de garrapatas. Debido a que estas garrapatas de especies de Ixodes también transmiten Borrelia burgdorferi (el agente causante de la enfermedad de Lyme), la infección simultánea con A. Phagocytophilum y B. burgdorferi es común.

A. platys provoca trombocitopenia cíclica infecciosa al infectar plaquetas y se cree que se transmite por garrapatas Rhipicephalus y Dermacentor spp. Aunque los perros son el hospedador más común para la infección por A. platys, se ha informado la infección en otros mamíferos, incluyendo gatos, impalas y ovejas. Se ha sabido que se produce la coinfección de A. platys y Ehrlichia canis debido al vector común de transmisión.

Los ensayos de inmunofluorescencia indirecta (IFA) y los ensayos de inmunosorción enzimática (ELISA) se han usado típicamente para detectar la infección por Anaplasma. Estos ensayos detectan la unión de anticuerpos anti-Anaplasma de la sangre, el plasma o el suero de un sujeto a células infectadas, lisados celulares o proteínas de Anaplasma enteras parcialmente purificadas. Sin embargo, estos ensayos para detectar anticuerpos anti-Anaplasma tienen una utilidad limitada debido a problemas de sensibilidad y especificidad directamente relacionados con la naturaleza de los antígenos de Anaplasma usados en estas pruebas. Aunque se han desarrollado pruebas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con especificidad y sensibilidad mejoradas, existe una necesidad continua en la técnica de ensayos sensibles y específicos adicionales para detectar antígenos de Anaplasma y serodiagnóstico de anaplasmosis.

Sumario de la invención

La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Está basada, en parte, en el descubrimiento de que ciertas variantes de secuencia de fragmentos de las proteínas de la membrana externa de Anaplasma proporcionan una detección robusta de una respuesta de anticuerpos contra especies de Anaplasma. En consecuencia, la invención proporciona composiciones, procedimientos y kits útiles para la detección de anticuerpos que se unen a antígenos de Anaplasma y el diagnóstico de anaplasmosis.

En una realización, la presente invención proporciona una composición que comprende una población de péptidos aislados capaces de unirse a anticuerpos que reconocen antígenos de Anaplasma. La población de péptidos aislados comprende tres o más péptidos diferentes, en la que cada péptido en la población comprende una secuencia de: (i) Abaxis ID 2, E-T-R-V-A-Y-P-Y-X⁹-K-D-G-R-T-V-K-X¹⁷-D-S-H-X²¹-F-D-W-Q-T-P-X²⁸-P-K-X³¹-G-F-K-D-C (SEQ ID NO: 1), en la que X^ges un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, P o H, X ¹⁷es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, W o Y, X²¹es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R, D o N, X²⁸es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E o N y X ³¹es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L o V; (ii) APL-ID1, E-T-K-V-X⁵-Y-X⁷-Y-L-K-X¹¹-G-R-T-V-K-L-X¹⁸-S-H-X²¹-F-D-W-X²⁵-T-P-X²⁸-P-K-X³¹-G-F-K-D-G-G-G-G-G-K-D-G-T-X⁴⁵-V-E-X⁴⁸-K-A-X⁵¹-K-F-X⁵⁴-W-N-X⁵⁷-P-D-X⁶⁰-R-I-X⁶³-F-K-X⁶⁶-C (SEQ ID NO: 3), en la que X⁵es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V o A, X⁷es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, I o H, X ¹¹es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E, N o Q, X ¹⁸es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D o N, X²¹es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R, D o N, X²⁵es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q, D o E, X²⁸es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E o N, X³¹es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L o V, X⁴⁵es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K o Q, X⁴⁸es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F o V, X⁵¹es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D o N, X⁵⁴es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E o Q, X⁵⁷es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S o Q, X⁶⁰es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F o W, X⁶³es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I o V, y X⁶⁶es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q o D; o (iii) APID 2-1, E-T-K-V-X⁵-Y-X⁷-Y-L-K-X¹¹-G-R-T-V-K-L-D-S-H-X²¹-F-D-W-X²⁵-T-P-X²⁸-P-K-X³¹-G-F-K-D-C (SEQ ID NO: 9) o un fragmento de la misma, en la que X⁵es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V o A, X⁷es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, I o H, X ¹¹es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E, N o Q, X²¹es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R, D o N, X²⁵es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q, D o E, X²⁸es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E o N y X³¹es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L o V.

En determinadas realizaciones, la composición comprende además uno o más péptidos antigénicos de otra especie microbiana. En una realización, la composición comprende además uno o más péptidos antigénicos de una especie de Ehrlichia (por ejemplo, E. canis, E. chaffeensis, E. ewingii y E. muris), y/o una especie de Borrelia (por ejemplo, B. burgdorferi, B. afzelli, o B. garinii).

Los péptidos de la invención pueden comprender al menos 20, 30, 35, 40, 45, 50 o más aminoácidos. En algunas realizaciones, los péptidos de la invención son péptidos aislados (por ejemplo, péptidos sintéticos y/o purificados). En realizaciones particulares, los péptidos de la invención se conjugan con un ligando. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, los péptidos están biotinilados. En otras realizaciones, los péptidos se conjugan con estreptavidina, avidina o neutravidina. En otras realizaciones, los péptidos se conjugan con una proteína vehículo (por ejemplo, seroalbúmina, hemocianina de lapa californiana (KLH) o un dominio Fc de inmunoglobulina). En otras realizaciones más, los péptidos se conjugan con un dendrímero y/o son parte de un sistema de péptidos antigénicos múltiples (MAPS). En determinadas realizaciones, los péptidos se conjugan con una entidad o marcador detectable, tales como una enzima, un nanomaterial metálico o un fluoróforo. En determinadas realizaciones, los péptidos se conjugan con nanopartículas metálicas, nanosferas, nanoplacas, nanoanillos o nanovaras.

En determinadas realizaciones, los péptidos de la invención están unidos o inmovilizados sobre un soporte sólido. En una realización, los péptidos de la invención están unidos a un soporte sólido a través de una nanocapa metálica. En determinadas realizaciones, el soporte sólido es una perla o una pluralidad de perlas (por ejemplo, una partícula coloidal, un nanomaterial metálico tales como nanopartícula, nanoplaca o nanosfera, una perla de látex, etc.), una ruta de flujo en un dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral (por ejemplo, una membrana porosa), una transferencia (transferencia Western, una transferencia de ranura o transferencia de puntos), una ruta de flujo en un rotor analítico o centrífugo, o un tubo o pocillo (por ejemplo, en una placa adecuada para un ensayo ELISA).

En determinadas realizaciones, la composición comprende además una segunda población de péptidos aislados, en la que la segunda población de péptidos se define por APL-ID6, C-K-D-G-X⁵-R-V-E-X⁹-K-A-E-X¹³-F-N-X¹⁶-Q-X¹⁸-P-N-P-X²²-I-K-Y-R-X²⁷(SEQ ID NO: 7), en la que X⁵es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S o Q, X⁹es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F o Y, X ¹³es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R o H, X ¹⁶es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en W o Y, X ¹⁸es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S o Q, X²²es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K o H y X²⁷es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en N o D. En algunas realizaciones distintas, la composición comprende una tercera población de péptidos aislados que comprende la secuencia de APL-ID5.1, C-G-K-I-L-N-L-V-S-A-V-Q-E-K-K-P-P-E-A-P-A-A-D-E-A-A-G-P-A-T-H (SEQ ID NO: 6).

En algunas realizaciones, la composición comprende además al menos dos poblaciones de péptidos aislados, y en la que al menos una de las poblaciones de péptidos está definida por SEQ ID NO: 6.

En otro aspecto, la presente invención también proporciona un procedimiento para detectar en una muestra un anticuerpo contra un epítopo de un antígeno de Anaplasma. El procedimiento comprende poner en contacto una muestra con una composición de la invención; y detectar la formación de un complejo anticuerpo-péptido que comprende uno o más péptidos en la composición, en el que la formación del complejo es indicativa de un anticuerpo contra un epítopo de un antígeno de Anaplasma presente en la muestra. Los procedimientos pueden usarse para detectar anticuerpos contra antígenos de especies A. phagocytophilum, A. platys, o A. marginale.

En otra realización, la presente invención proporciona un procedimiento para diagnosticar la anaplasmosis en un sujeto. El procedimiento comprende poner en contacto una muestra del sujeto con una composición de la invención; y detectar la formación de un complejo anticuerpo-péptido que comprende uno o más péptidos en la composición, en el que la formación del complejo es indicativa de que el sujeto tiene anaplasmosis.

En cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente y en el presente documento, el péptido o población de péptidos puede, en algunas realizaciones, estar sujeto o inmovilizado sobre un soporte sólido. En una de tales realizaciones, el péptido o la población de péptidos se une al soporte sólido a través de una nanocapa metálica (por ejemplo, oro). En determinadas realizaciones, el soporte sólido es una perla o una pluralidad de perlas (por ejemplo, una partícula coloidal, un nanomaterial metálico tales como nanopartícula, nanoplaca, nanosfera, nanovarilla, una perla de látex, etc.), una ruta de flujo en un dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral (por ejemplo, una membrana porosa), una ruta de flujo en un rotor analítico o centrífugo, una transferencia (transferencia Western, una transferencia de ranura, o transferencia de puntos), o un tubo o un pozo (por ejemplo, en una placa adecuada para un ensayo ELISA). En algunas realizaciones, el soporte sólido comprende metal, vidrio, un material a base de celulosa (por ejemplo, nitrocelulosa) o un polímero (por ejemplo, poliestireno, polietileno, polipropileno, poliéster, nailon, polisulfona, etc.). En otras realizaciones, el péptido o la población de péptidos diferentes se une a un dendrímero y/o se incorpora a un sistema de sistema de péptido antigénico múltiple (MAPS). En determinadas realizaciones distintas, el péptido o población de péptidos diferentes está unido a BSA, KLH, ovoalbúmina o un vehículo similar.

En cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente y en el presente documento, la etapa de detección puede comprender realizar un ensayo ELISA. En otras realizaciones, la etapa de detección comprende realizar un inmunoensayo de flujo lateral. En otras realizaciones, la etapa de detección comprende realizar un ensayo de aglutinación. En otras realizaciones, la etapa de detección comprende hacer girar la muestra en un rotor analítico o centrífugo. En otras realizaciones, la etapa de detección comprende analizar la muestra usando una transferencia Western, una transferencia de ranura o transferencia de puntos. En otras realizaciones más, la etapa de detección comprende analizar la muestra con un sensor electroquímico, un sensor óptico o un sensor optoelectrónico. En determinadas realizaciones, la etapa de detección comprende realizar un ensayo de desplazamiento de longitud de onda. En determinadas realizaciones, la etapa de detección consiste en realizar una prueba indirecta de anticuerpos fluorescentes.

La muestra del sujeto usada en cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente y en el presente documento, en algunas realizaciones, es un fluido corporal, tales como sangre, suero, plasma, líquido cefalorraquídeo, orina, moco o saliva. En otras realizaciones, la muestra es un tejido (por ejemplo, un homogeneizado de tejido) o un lisado celular. En determinadas realizaciones, la muestra es de un animal salvaje (por ejemplo, un ciervo o un roedor, tales como un ratón, ardillas listadas, ardillas, etc.). En otras realizaciones, la muestra es de un animal de laboratorio (por ejemplo, un ratón, una rata, una cobaya, un conejo, un mono, un primate, etc.). En otras realizaciones, la muestra es de un animal domesticado o salvaje (por ejemplo, un perro, un gato, un caballo). En otras realizaciones más, la muestra es de un ser humano.

La presente invención también incluye kits que comprenden una composición de la invención. En una realización, el kit comprende al menos una composición que comprende una población de péptidos aislados de la invención y un reactivo marcador capaz de unirse a un anticuerpo que reconoce un epítopo de uno o más péptidos en la composición. El reactivo de marcaje puede ser un anticuerpo IgG o IgM antihumano, anti-canino o anti-felino conjugados con un marcador detectable. En otras realizaciones, el reactivo de marcaje es la proteína A, proteína G y/o una proteína de fusión de proteína A/G conjugada a un marcador detectable. En realizaciones relacionadas, la etiqueta detectable es una enzima, un nanomaterial metálico, fluoróforo o partículas de látex coloreadas. Los ejemplos de nanomateriales metálicos incluyen, pero no se limitan a, nanopartículas metálicas, nanosferas, nanoanillos, nanovaras y nanoplacas.

En determinadas realizaciones, los péptidos en el kit están unidos o inmovilizados en un soporte sólido opcionalmente a través de una nanocapa metálica. En determinadas realizaciones, el soporte sólido es una perla (por ejemplo, una partícula coloidal, un nanomaterial metálico tales como nanopartícula, nanoplaca o nanosfera, una perla de látex, etc.), una ruta de flujo en un dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral, una ruta de flujo en un rotor analítico o centrífugo, o un tubo o un pocillo (por ejemplo, en una placa). En algunas realizaciones, el péptido o péptidos en el kit se unen a un dendrímero y/o se incorporan a un sistema MAPS. En determinadas realizaciones distintas, el péptido o la mezcla de diferentes péptidos está unido a BSA.

En algunas realizaciones, los kits comprenden además una población de perlas o una placa (por ejemplo, una placa adecuada para un ensayo ELISA). En otras realizaciones, los kits comprenden además un dispositivo, tales como un dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral, un rotor analítico o centrífugo, una transferencia Western, una transferencia de puntos, una transferencia de ranura, un sensor electroquímico, un sensor óptico o un sensor optoelectrónico. En determinadas realizaciones, la población de perlas, la placa o el dispositivo es útil para realizar un inmunoensayo. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, la población de perlas, la placa o el dispositivo es útil para detectar la formación de un complejo anticuerpo-péptido que comprende un anticuerpo de una muestra y un péptido de la invención. En determinadas realizaciones, un péptido o población de diferentes péptidos de la invención está unido o inmovilizado sobre las perlas, la placa o el dispositivo.

Los kits de la invención pueden comprender además un conjunto de instrucciones que indican, por ejemplo, cómo usar un péptido o población de péptidos de la invención para detectar un anticuerpo contra un antígeno de Anaplasma o para diagnosticar anaplasmosis o trombocitopenia cíclica en un sujeto. En determinadas realizaciones, los kits comprenden unas instrucciones que indican cómo usar una población de perlas, una placa o un dispositivo (por ejemplo, que comprende un péptido o una población de péptidos diferentes de la invención) para detectar un anticuerpo contra uno o más antígenos de Anaplasma o para diagnosticar anaplasmosis o trombocitopenia cíclica.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un diagrama de un ensayo sándwich de doble antígeno que puede usarse para detectar anticuerpos contra antígenos de Anaplasma. En esta realización, los péptidos de la invención se inmovilizan en un sustrato adecuado (por ejemplo, membrana de nitrocelulosa, pocillo de una placa ELISA) en un sitio de prueba. Los anticuerpos contra los antígenos de Anaplasma en una muestra de prueba están unidos por los péptidos inmovilizados de la invención. Los anticuerpos de muestra de prueba contra los antígenos de Anaplasma apropiados se unirán después a un segundo conjunto de péptidos de la invención que se conjugan con un marcador detectable (por ejemplo, nanomaterial metálico tales como nanopartícula, nanoplaca o nanocápsula (por ejemplo, oro coloidal), peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina (ALP), p-galactosidasa (p-GAL), fluoróforo, partícula de látex coloreada, punto cuántico), que detecta la presencia de los anticuerpos unidos al primer conjunto de péptidos inmovilizados en el sitio de prueba. En determinadas realizaciones, para amplificar la señal de detección, moléculas de proteína A y/o proteína G conjugadas con un marcador detectable (por ejemplo, nanomateriales metálicos tales como nanopartícula, nanoplaca o nanocápsula (por ejemplo, oro coloidal), HRP, ALP, p-GAL, fluoróforo, partícula de látex coloreada, punto cuántico) pueden aplicarse al sitio de prueba en el que se unirán a la región Fc de cualquier anticuerpo contra antígenos de Anaplasma capturados por los péptidos inmovilizados de la invención.

La Figura 2 es un diagrama de un tipo de ensayo sándwich indirecto que puede usarse para detectar anticuerpos contra antígenos de Anaplasma. En esta realización, los anticuerpos IgG/IgM antihumano, IgG/IgM anti-perro o IgG/IgM anti-gato se inmovilizan en un sustrato adecuado (por ejemplo, membrana de nitrocelulosa, pocillo de una placa ELISA) en un sitio de prueba. Los anticuerpos contra los antígenos de Anaplasma en una muestra de prueba están unidos por los anticuerpos inmovilizados. Los anticuerpos de muestra de prueba contra los antígenos de Anaplasma apropiados se unirán después a péptidos de la invención que se conjugan con un marcador detectable (por ejemplo, nanomaterial metálico tales como nanopartícula, nanoplaca o nanocápsula (por ejemplo, oro coloidal), HRP, ALP, p-GAL, fluoróforo, partícula de látex coloreada o punto cuántico).

La Figura 3 es un diagrama de otro tipo de ensayo sándwich indirecto que puede usarse para detectar anticuerpos contra antígenos de Anaplasma. En esta realización, los péptidos de la invención pueden inmovilizarse en un sustrato (por ejemplo, membrana de nitrocelulosa, pocillo de una placa ELISA) para capturar anticuerpos anti-Anaplasma en una muestra de prueba. Los anticuerpos IgG/IgM antihumano, IgG/IgM anti-perro o IgG/IgM anti gato conjugados con una etiqueta detectable (por ejemplo, nanomateriales metálicos tales como nanopartícula, nanoplaca o nanocápsula (por ejemplo, oro coloidal), h Rp , ALP, p-GAL, fluoróforo, partícula de látex coloreada, punto cuántico) pueden usarse para detectar la presencia de los anticuerpos unidos a los péptidos inmovilizados en el sitio de prueba.

La Figura 4 es un diagrama de un dispositivo de inmunoensayo que puede usarse para detectar anticuerpos contra antígenos de Anaplasma. En esta realización de un dispositivo de inmunoensayo, los péptidos de la invención se inmovilizan en un sustrato adecuado (por ejemplo, membrana de nitrocelulosa, pocillo de una placa ELISA) en un sitio de prueba. Los anticuerpos anti-Anaplasma en una muestra de prueba están unidos por los péptidos inmovilizados de la invención. La Proteína A, Proteína G o una proteína de fusión de proteína A/G conjugada con una etiqueta detectable (por ejemplo, nanomaterial metálico tales como nanopartícula, nanoplaca o nanocápsula (por ejemplo, oro coloidal), HRP, ALP, p-GAL, fluoróforo, partícula de látex coloreada, punto cuántico) se añade al sistema y se une a la porción Fc del anticuerpo anti-Anaplasma capturado, produciendo de esta manera una señal positiva. En esta realización, el dispositivo puede comprender además un sitio de control en el que los compañeros de unión que reconocen la proteína A conjugada con el marcador detectable, la proteína G conjugada con el marcador detectable y/o la proteína de fusión A/G conjugada con el marcador detectable están inmovilizadas. Dichos compañeros de unión pueden incluir, pero no se limitan a, anti-proteína A, anti-proteína G, IgG de ratón y/u otras moléculas de IgG similares.

La Figura 5 es un gráfico lineal de puntuaciones de ELISA (DO650 nm) con péptidos APL-ID1 de muestras de plasma extraídas a diversos intervalos de perros infectados con A. phagocytophilum (perro 3-13) o bien A. platys (perro 15-13).

La Figura 6 es un gráfico lineal de puntuaciones de ELISA (DO650 nm) con péptidos APL-ID2 de muestras de plasma extraídas a diversos intervalos de perros infectados con A. phagocytophilum (perro 3-13) o bien A. platys (perro 15-13).

La Figura 7 representa un ejemplo de un dispositivo de ensayo de flujo lateral que puede usarse para detectar anticuerpos contra antígenos de Anaplasma. Los péptidos de la invención se enlazan a una proteína vehículo (por ejemplo, albúmina de suero bovino) y los conjugados de péptido BSA resultantes se inmovilizan en una membrana de nitrocelulosa (NC) en un sitio de prueba (T). Los mismos conjugados de BSA-péptido se conjugan con un marcador detectable (por ejemplo, oro coloidal) y se depositan en una almohadilla de conjugado colocada aguas arriba del sitio de prueba. La proteína A conjugada con oro y la proteína G conjugada con oro (es decir, amplificador) se añade a la almohadilla conjugada para mejorar la señal uniéndose a la porción Fc del anticuerpo anti-Anaplasma capturado. El dispositivo comprende además un sitio de control (C) en el que los socios de unión que reconocen la proteína A conjugada con oro y/o la proteína G conjugada con oro están inmovilizados.

La Figura 8 ilustra el funcionamiento del dispositivo de ensayo de flujo lateral en la Figura 7. Se aplica una muestra de prueba al puerto de muestra del dispositivo y moviliza los conjugados peptídicos presentes en la almohadilla de conjugado. Cualquier anticuerpo anti-Anaplasma presente en la muestra de prueba se unirá específicamente a los conjugados peptídicos y los complejos formados migrarán a la membrana de nitrocelulosa que contiene los sitios de prueba y control. Los complejos péptido-anticuerpo marcados son capturados por péptidos inmovilizados de la invención en el sitio de prueba. La proteína A conjugada con oro y la proteína G conjugada con oro también presentes en la almohadilla conjugada son movilizadas por la muestra y se unen a las regiones Fc de las moléculas IgG e IgM presentes en la muestra. La unión de la proteína A y/o proteína G conjugada con oro a los complejos péptido-anticuerpo capturados amplifica la señal en el sitio de prueba. La proteína A conjugada con oro y/o la proteína G conjugada con oro se captura por un compañero de unión (por ejemplo, el anticuerpo anti-proteína A y/o anti-proteína G) inmovilizado en el sitio de control, produciendo de esta manera una señal que indica que el dispositivo está operativo.

Descripción detallada

La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Está basada, en parte, en el descubrimiento de que ciertas variantes de secuencia de fragmentos de las proteínas de la membrana externa de Anaplasma proporcionan una detección robusta de una respuesta de anticuerpos contra especies de Anaplasma. En consecuencia, la invención proporciona composiciones, procedimientos y kits útiles para la detección de anticuerpos que se unen a antígenos de Anaplasma y para el diagnóstico de anaplasmosis.

El término "antígeno", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula capaz de ser reconocida por un anticuerpo. Un antígeno puede ser, por ejemplo, un péptido o una forma modificada del mismo. Un antígeno puede comprender uno o más epítopos.

El término "epítopo", como se usa en el presente documento, es una porción de un antígeno que se reconoce específicamente por un anticuerpo. Un epítopo, por ejemplo, puede comprender o consistir en una porción de un péptido (por ejemplo, un péptido de la invención). Un epítopo puede ser un epítopo lineal, un epítopo secuencial o un epítopo conformacional. En determinadas realizaciones, los epítopos pueden comprender regiones no contiguas.

Las expresiones "ácido nucleico", "oligonucleótido" y "polinucleótido" se usan indistintamente en el presente documento y abarcan ADN, ARN, ADNc, ya sea monocatenario o bicatenario, así como modificaciones químicas de los mismos.

Las abreviaturas de los aminoácidos de una sola letra usadas en el presente documento tienen su significado convencional en la técnica, y todas las secuencias peptídicas descritas en este documento están escritas de acuerdo con la convención, con el extremo N-terminal a la izquierda y el extremo C-terminal a la derecha.

Composiciones y dispositivos

La divulgación proporciona péptidos aislados capaces de unirse a anticuerpos que reconocen antígenos de Anaplasma y dispositivos que incorporan tales péptidos. En una realización, la presente divulgación proporciona una población de péptidos aislados que comprende tres o más péptidos diferentes, en la que cada péptido en la población comprende una secuencia de Abaxis ID 2 (SEQ ID NO: 1), Abaxis ID 3 (SEQ ID NO: 2), APL-ID1 (SEQ ID NO: 3), APL-ID2 (SEQ ID NO: 4), APL-ID3 (SEQ ID NO: 5), APL-ID5.1 (SEQ ID NO: 6), APL-ID6 (SEQ ID NO: 7), APL-ID7 (SEQ ID NO: 8), APID 2-1 (SEQ ID NO: 9) o fragmentos de las mismas. Por ejemplo, en una realización, la población de péptidos aislados comprende tres o más péptidos diferentes, en la que cada péptido en la población comprende una secuencia de E-T-R-V-A-Y-P-Y-X⁹-K-D-G-R-T-V-K-X¹⁷-D-S-H-X²¹-F-D-W-Q-T-P-X²⁸-P-K-X³¹-G-F-K-D-C (SEQ ID NO: 1) o un fragmento de la misma, en la que X⁹es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, P o H, X ¹⁷es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, W o Y, X²¹es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R, D o N, X²⁸es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E o N y X³¹es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L o V.

En algunas realizaciones, los péptidos comprenden una secuencia de SEQ ID NO: 1, en la que X²⁸es N y/o X³¹es V. En otras realizaciones, los péptidos comprenden una secuencia de SEQ ID NO: 1, en la que X⁹es P, X ¹⁷es I y/o X²¹es N. En determinadas realizaciones, la población de péptidos aislados comprende tres o más péptidos que comprenden o consisten en una cualquiera de las secuencias en la Tabla 1.

Tabla 1. Pé tidos Abaxis ID 2

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continuación

continuación

En otra realización de la divulgación, la población de péptidos aislados comprende tres o más péptidos diferentes, en la que cada péptido en la población comprende una secuencia de I-E-X³-G-Y-E-X⁷-F-K-T-X¹¹-G-I-R-X¹⁵-S-G-T-K-E-C (SEQ ID NO: 2) o un fragmento de la misma, en la que X³es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L, V o A, X⁷es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K, N o Q, X ¹¹es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R, D o N y X ¹⁵es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E, N o Q. En algunas realizaciones, los péptidos comprenden una secuencia de SEQ ID NO: 2, en la que X³es A y/o X⁷es N. En otras realizaciones, los péptidos comprenden una secuencia de SEQ ID NO: 2, en la que X ¹¹es R y/o X ¹⁵es Q. En realizaciones particulares, la población de péptidos aislados comprende tres o más péptidos que comprenden o consisten en una cualquiera de las secuencias en la Tabla 2.

Tabla 2. Pé tidos Abaxis ID 3

continuación

En determinadas realizaciones, la población de péptidos aislados comprende tres o más péptidos diferentes, en la que cada péptido en la población comprende una secuencia de E-T-K-V-Xs-Y-X⁷-Y-L-K-X¹¹-G-R-T-V-K-L-X¹⁸-S-H-X²¹-F-D-W-X²⁵-T-P-X²⁸-P-K-X³¹-G-F-K-D-G-G-G-G-G-K-D-G-T-X⁴⁵-V-E-X⁴⁸-K-A-X⁵¹-K-F-X⁵⁴-W-N-X⁵⁷-P-D-X⁶⁰-R-I-X⁶³-F-K-X⁶⁶-C (SEQ ID NO: 3) o un fragmento de la misma, en la que X⁵es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V o A, X⁷es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, I o H, X ¹¹es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E, N o Q, X ¹⁸es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D o N, X²¹es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R, D o N, X²⁵es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q, D o E, X²⁸es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E o N, X³¹es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L o V, X⁴⁵es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K o Q, X⁴⁸es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F o V, X⁵¹es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D o N, X⁵⁴es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E o Q, X⁵⁷es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S o Q, X⁶⁰es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F o W, X⁶³es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I o V y X⁶⁶es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q o D.

En realizaciones relacionadas, los péptidos comprenden una secuencia de SEQ ID NO: 3, en la que X⁵es A, X ¹⁸es D y/o X³¹es V. En otras realizaciones, los péptidos comprenden una secuencia de SEQ ID NO: 3, en la que X⁴⁵es Q, X⁴⁸es F y/o X⁵¹es N. En otras realizaciones más, los péptidos comprenden una secuencia de SEQ ID NO: 3, en la que X⁵⁴es E, X⁵⁷es S y/o X⁶⁰es W. En algunas realizaciones, los péptidos comprenden una secuencia de SEQ ID NO: 3, en la que X⁶³es I y/o X⁶⁶es D. En realizaciones particulares, la población de péptidos aislados comprende tres o más péptidos que comprenden o consisten en una cualquiera de las secuencias en la Tabla 3.

Tabla 3. Pé tidos APL-ID1

continuación

continuación

continuación

continuación

continuación

continuación

(continuación)

Secuencia SEQ ID NO.

E - T - K - V - V - Y - I - Y - L - K - N - G - R - T - V —K - L - N - S - H - N - F —D - W - Q - T - P - E - P — 296 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - S - P -D - F - R - I - I - F - K - Q - C

E - T - K - V - V - Y - H - Y - L - K - N - G - R - T - V - K - L - N - S - H - N - F - D - W - Q - T - P - E - P - 297 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - S - P -D - F - R - I - I - F - K - Q - C

E - T - K - V - A - Y - G - Y - L - K - N - G - R - T - V - K - L - N - S - H - N - F - D - W - Q - T - P - E - P - 298 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - S - P -D - F - R - I - I - F - K - Q - C

E - T - K - V - A - Y - I - Y - L - K - N - G - R - T - V —K - L - N - S - H - N - F —D - W - Q - T - P - E - P — 299 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - S - P -D - F - R - I - I - F - K - Q - C

E - T - K - V - A - Y - H - Y - L - K - N - G - R - T - V - K - L - N - S - H - N - F - D - W - Q - T - P - E - P - 300 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - S - P -D - F - R - I - I - F - K - Q - C

E - T - K - V - V - Y - G - Y - L - K - Q - G - R - T - V - K - L - N - S - H - N - F - D - W - Q - T - P - E - P - 301 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - S - P -D - F - R - I - I - F - K - Q - C

E - T - K - V - V - Y - I - Y - L - K - Q - G - R - T - V - K - L - N - S - H - N - F - D - W - Q - T - P - E - P - 302 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - S - P -D - F - R - I - I - F - K - Q - C

E - T - K - V - V - Y - H - Y - L - K - Q - G - R - T - V - K - L - N - S - H - N - F - D - W - Q - T - P - E - P - 303 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - S - P -D - F - R - I - I - F - K - Q - C

E - T - K - V - A - Y - G - Y - L - K - Q - G - R - T - V - K - L - N - S - H - N - F - D - W - Q - T - P - E - P - 304 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - S - P -D - F - R - I - I - F - K - Q - C

E - T - K - V - A - Y - I - Y - L - K - Q - G - R - T - V - K - L - N - S - H - N - F - D - W - Q - T - P - E - P - 305 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - S - P -D - F - R - I - I - F - K - Q - C

E - T - K - V - A - Y - H - Y - L - K - Q - G - R - T - V - K - L - N - S - H - N - F - D - W - Q - T - P - E - P - 306 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - S - P -D - F - R - I - I - F - K - Q - C

E - T - K - V - V - Y - G - Y - L - K - E - G - R - T - V - K - L - D - S - H - R - F - D - W - Q - T - P - E - P - 307 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - S - P -D - F - R - I - I - F - K - D - C

E —T —K —V —V —Y —I —Y —L —K —E —G—R —T —V —K —L —D —S —H—R —F —D —W—Q—T —P —E —P — 308 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - S - P -D - F - R - I - I - F - K - D - C

E - T - K - V - V - Y - H - Y - L - K - E - G - R - T - V - K - L - D - S - H - R - F - D - W - Q - T - P - E - P - 309 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - S - P -D - F - R - I - I - F - K - D - C

E - T - K - V - A - Y - G - Y - L - K - E - G - R - T - V - K - L - D - S - H - R - F - D - W - Q - T - P - E - P - 310 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - S - P -D - F - R - I - I - F - K - D - C

E - T - K - V - A - Y - I - Y - L - K - E - G - R - T - V - K - L - D - S - H - R - F - D - W - Q - T - P - E - P - 311 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - S - P -D - F - R - I - I - F - K - D - C

(continuación)

Secuencia SEQ ID NO.

E - T - K - V - A - Y - H - Y - L - K - E - G - R - T - V - K - L - D - S - H - R - F - D - W - Q - T - P - E - P - 312 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - S - P -D - F - R - I - I - F - K - D - C

E - T - K - V - V - Y - G - Y - L - K - N - G - R - T - V - K - L - D - S - H - R - F - D - W - Q - T - P - E - P - 313 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - S - P -D - F - R - I - I - F - K - D - C

E - T - K - V - V - Y - I - Y - L - K - N - G - R - T - V - K - L - D - S - H - R - F - D - W - Q - T - P - E - P - 314 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - S - P -D - F - R - I - I - F - K - D - C

E - T - K - V - V - Y - H - Y - L - K - N - G - R - T - V - K - L - D - S - H - R - F - D - W - Q - T - P - E - P - 315 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - S - P -D - F - R - I - I - F - K - D - C

E - T - K - V - A - Y - G - Y - L - K - N - G - R - T - V - K - L - D - S - H - R - F - D - W - Q - T - P - E - P - 316 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - S - P -D - F - R - I - I - F - K - D - C

E - T - K - V - V - Y - G - Y - L - K - E - G - R - T - V - K - L - D - S - H - R - F - D - W - Q - T - P - E - P - 317 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - S - P -D - F - R - I - V - F - K - D - C

E - T - K - V - V - Y - I - Y - L - K - E - G - R - T - V —K - L - D - S - H - R - F —D - W - Q - T - P - E - P — 318 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - S - P -D - F - R - I - V - F - K - D - C

E - T - K - V - V - Y - H - Y - L - K - E - G - R - T - V - K - L - D - S - H - R - F - D - W - Q - T - P - E - P - 319 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - S - P -D - F - R - I - V - F - K - D - C

E - T - K - V - A - Y - G - Y - L - K - E - G - R - T - V - K - L - D - S - H - R - F - D - W - Q - T - P - E - P - 320 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - S - P -D - F - R - I - V - F - K - D - C

E - T - K - V - A - Y - I - Y - L - K - E - G - R - T - V - K - L - D - S - H - R - F - D - W - Q - T - P - E - P - 321 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - S - P -D - F - R - I - V - F - K - D - C

E - T - K - V - A - Y - H - Y - L - K - E - G - R - T - V - K - L - D - S - H - R - F - D - W - Q - T - P - E - P - 322 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - S - P -D - F - R - I - V - F - K - D - C

E - T - K - V - V - Y - G - Y - L - K - N - G - R - T - V - K - L - D - S - H - R - F - D - W - Q - T - P - E - P - 323 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - S - P -D - F - R - I - V - F - K - D - C

E - T - K - V - V - Y - I - Y - L - K - N - G - R - T - V - K - L - D - S - H - R - F - D - W - Q - T - P - E - P - 324 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - S - P -D - F - R - I - V - F - K - D - C

E - T - K - V - V - Y - H - Y - L - K - N - G - R - T - V - K - L - D - S - H - R - F - D - W - Q - T - P - E - P - 325 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - S - P -D - F - R - I - V - F - K - D - C

E - T - K - V - A - Y - G - Y - L - K - N - G - R - T - V - K - L - D - S - H - R - F - D - W - Q - T - P - E - P - 326 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - S - P -D - F - R - I - V - F - K - D - C

E - T - K - V - V - Y - G - Y - L - K - E - G - R - T - V - K - L - D - S - H - R - F - D - W - Q - T - P - E - P - 327 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - S - P -D - W - R - I - V - F - K - D - C

(continuación)

Secuencia SEQ ID NO.

E - T - K - V - V - Y - I - Y - L - K - E - G - R - T - V —K - L - D - S - H - R - F - D - W - Q —T - P - E - P - 328 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - S - P -D - W - R - I - V - F - K - D - C

E - T - K - V - V - Y - H - Y - L - K - E - G - R - T - V - K - L - D - S - H - R - F - D - W - Q - T - P - E - P - 329 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - S - P -D - W - R - I - V - F - K - D - C

E - T - K - V - A - Y - G - Y - L - K - E - G - R - T - V - K - L - D - S - H - R - F - D - W - Q - T - P - E - P - 330 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - S - P -D - W - R - I - V - F - K - D - C

E —T —K —V —A —Y —I —Y —L —K —E —G—R —T —V - K —L —D —S —H—R —F —D —W—Q—T —P —E —P — 331 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - S - P -D - W - R - I - V - F - K - D - C

E - T - K - V - A - Y - H - Y - L - K - E - G - R - T - V - K - L - D - S - H - R - F - D - W - Q - T - P - E - P - 332 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - S - P -D - W - R - I - V - F - K - D - C

E - T - K - V - V - Y - G - Y - L - K - N - G - R - T - V - K - L - D - S - H - R - F - D - W - Q - T - P - E - P - 333 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - S - P -D - W - R - I - V - F - K - D - C

E - T - K - V - V - Y - I - Y - L - K - N - G - R - T - V - K - L - D - S - H - R - F - D - W - Q - T - P - E - P - 334 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - S - P -D - W - R - I - V - F - K - D - C

E - T - K - V - V - Y - H - Y - L - K - N - G - R - T - V - K - L - D - S - H - R - F - D - W - Q - T - P - E - P - 335 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - S - P -D - W - R - I - V - F - K - D - C

E - T - K - V - A - Y - G - Y - L - K - N - G - R - T - V - K - L - D - S - H - R - F - D - W - Q - T - P - E - P - 336 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - S - P -D - W - R - I - V - F - K - D - C

E - T - K - V - V - Y - G - Y - L - K - E - G - R - T - V - K - L - D - S - H - R - F - D - W - Q - T - P - E - P - 337 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - Q - P -D - W - R - I - V - F - K - D - C

E —T —K —V —V —Y —I —Y —L —K —E —G—R —T —V - K —L —D —S —H—R —F —D —W—Q—T —P —E —P — 338 K —L —G—F —K —D —G—G—G—G—G—K —D —G—T - K —V —E —F —K —A —D—K —F —E —W—N —Q—P —

D - W - R - I - V - F - K - D - C

E - T - K - V - V - Y - H - Y - L - K - E - G - R - T - V - K - L - D - S - H - R - F - D - W - Q - T - P - E - P - 339 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - Q - P -D - W - R - I - V - F - K - D - C

E - T - K - V - A - Y - G - Y - L - K - E - G - R - T - V - K - L - D - S - H - R - F - D - W - Q - T - P - E - P - 340 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - Q - P -D - W - R - I - V - F - K - D - C

E —T —K —V —A —Y —I —Y —L —K —E —G—R —T —V - K —L —D —S —H—R —F —D —W—Q—T —P —E —P — 341 K —L —G—F —K —D —G—G—G—G—G—K —D —G—T - K —V —E —F —K —A —D—K —F —E —W—N —Q—P —

D - W - R - I - V - F - K - D - C

E - T - K - V - A - Y - H - Y - L - K - E - G - R - T - V - K - L - D - S - H - R - F - D - W - Q - T - P - E - P - 342 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - Q - P -D - W - R - I - V - F - K - D - C

E - T - K - V - V - Y - G - Y - L - K - N - G - R - T - V - K - L - D - S - H - R - F - D - W - Q - T - P - E - P - 343 K - L - G - F - K - D - G - G - G - G - G - K - D - G - T - K - V - E - F - K - A - D - K - F - E - W - N - Q - P -D - W - R - I - V - F - K - D - C

continuación

En algunas realizaciones, la población de péptidos aislados comprende tres o más péptidos diferentes, en la que cada péptido en la población comprende una secuencia de C-K-D-G-T-X⁶-V-E-X⁹-K-A-X¹²-K-F-X¹⁵-W-N-X¹⁸-P-D-X²¹-R-I-X²⁴-F-K-X²⁷(SEQ ID NO: 4) o un fragmento de la misma, en la que X⁶es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K o Q, X⁹es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F o V, X ¹²es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D o N, X¹⁵es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E o Q, X ¹⁸es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S o Q, X²¹es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F o W, X²⁴es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I o V y X²⁷es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q o D. En realizaciones relacionadas, los péptidos comprenden una secuencia de SEQ ID NO: 4, en la que X⁶es Q, X⁹es F y/o X ¹²es N. En otras realizaciones, los péptidos comprenden una secuencia de SEQ ID NO: 4, en la que X ¹⁵es E, X ¹⁸es S y/o X²¹es W. En otras realizaciones más, los péptidos comprenden una secuencia de SEQ ID NO: 4, en la que X²⁴es I y/o X²⁷es D. En realizaciones particulares, la población de péptidos aislados comprende tres o más péptidos que comprenden o consisten en una cualquiera de las secuencias en la Tabla 4.

Tabla 4. Pé tidos APL-ID2

continuación

En otra realización de la divulgación, la población de péptidos aislados comprende tres o más péptidos diferentes, en la que cada péptido en la población comprende una secuencia de C-X²-G-G-K-S-P-A-R-X¹⁰-T-E-E-R-V-A-G-D-L-D-H-K-X²³-V-D-S-D-K-K-H-D-A-E-K-T-E-E-K-R-H (SEQ ID NO: 5) o un fragmento de la misma, en la que X²es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I o V, X ¹⁰es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S o Y y X²³es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E o N. En realizaciones relacionadas, los péptidos comprenden una secuencia de SEQ ID NO: 5, en la que X²es V. En otras realizaciones, los péptidos comprenden una secuencia de SEQ ID NO: 5, en la que X ¹⁰es Y. En otras realizaciones más, los péptidos comprenden una secuencia de SEQ ID NO: 5, en la que X²³es E. En algunas realizaciones, la población de péptidos aislados comprende tres o más péptidos que comprenden o consisten en una cualquiera de las secuencias en la Tabla 5.

Tabla 5. Pé tidos APL-ID3

continuación

En una realización, los péptidos comprenden una secuencia de C-G-K-I-L-N-L-V-S-A-V-Q-E-K-K-P-P-E-A-P-A-A-D-E-A-A-G-P-A-T-H (SEQ ID NO: 6) o un fragmento de la misma. La población de péptidos aislados puede comprender tres o más péptidos, comprendiendo cada péptido una secuencia de SEQ ID NO: 6 o fragmentos de esta secuencia. En algunas realizaciones, los péptidos que comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 6 pueden incluirse en otras poblaciones de péptidos descritas en el presente documento.

En otra realización, la población de péptidos aislados comprende tres o más péptidos diferentes, en la que cada péptido en la población comprende una secuencia de C-K-D-G-Xs-R-V-E-X^g-K-A-E-X¹³-F-N-X¹⁶-Q-X-ⁱ⁸-P-N-P-X²²-I-K-Y-R-X²⁷(SEQ ID NO: 7) o un fragmento de la misma, en la que X⁵es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S o Q, X^ges un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F o Y, X ¹³es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R o H, X ¹⁶es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en W o Y, X ¹⁸es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S o Q, X²²es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K o H y X²⁷es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en N o D.

En realizaciones relacionadas, los péptidos comprenden una secuencia de SEQ ID NO: 7, en la que X⁵es Q, X^ges Y y/o X ¹³es H. En otras realizaciones, los péptidos comprenden una secuencia de SEQ ID NO: 7, en la que X ¹⁶es W y/o X²²es K. En otras realizaciones más, los péptidos comprenden una secuencia de SEQ ID NO: 7, en la que X ¹⁸es S y/o X²⁷es D. En algunas realizaciones, la población de péptidos aislados comprende tres o más péptidos que comprenden o consisten en una cualquiera de las secuencias en la Tabla 6.

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continuación

En algunas realizaciones, la población de péptidos aislados comprende tres o más péptidos diferentes, en la que de cada péptido en la población comprende una secuencia de C-G-K-I-L-N-L-V-S-X¹⁰-X¹¹-N-E-K-K-P-P-E-A-P-A-A-D-E-A-A-G-P-A-T-H (SEQ ID NO: 8) o un fragmento de la misma, en la que X ¹⁰es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V, L o I y X¹¹es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A o L. En tales realizaciones, los péptidos comprenden una secuencia de SEQ ID NO: 8, en la que X ¹¹es A. En otras realizaciones, los péptidos comprenden una secuencia de SEQ ID NO: 8, en la que X ¹⁰es I. En otras realizaciones más, la población de péptidos aislados comprende tres o más péptidos que comprenden o consisten en una cualquiera de las secuencias en la Tabla 7.

Tabla 7. Pé tidos APL-ID7

En otras realizaciones, la población de péptidos aislados comprende tres o más péptidos diferentes, en la que cada péptido en la población comprende una secuencia de E-T-K-V-Xs-Y-X⁷-Y-L-K-Xⁿ-G-R-T-V-K-L-D-S-H-X²¹-F-D-W-X²⁵-T-P-X²⁸-P-K-X³¹-G-F-K-D-C (SEQ ID NO: 9) o un fragmento de la misma, en la que X⁵es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V o A, X⁷es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, I o H, X ¹¹es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E, N o Q, X²¹es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R, D o N, X²⁵es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q, D o E, X²⁸es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E o N y X³¹es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L o V.

En realizaciones relacionadas, los péptidos comprenden una secuencia de SEQ ID NO: 9, en la que X⁵es V, X⁷es G y/o X ¹¹es N. En otras realizaciones, los péptidos comprenden una secuencia de SEQ ID NO: 9, en la que X²¹es R y/o X²⁵es E. En otras realizaciones más, los péptidos comprenden una secuencia de SEQ ID NO: 9, en la que X²⁸es N y/o X³¹es L. En algunas realizaciones, la población de péptidos aislados comprende tres o más péptidos que comprenden o consisten en una cualquiera de las secuencias en la Tabla 8.

Tabla 8. Pé tidos APID 2-1

continuación

continuación

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En determinadas realizaciones, los péptidos comprenden una secuencia de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 9 y una secuencia peptídica N-terminal adicional (por ejemplo, una extensión N-terminal). La secuencia peptídica N-terminal adicional puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25 o más aminoácidos. En determinadas realizaciones, la secuencia peptídica N-terminal tiene una longitud de aproximadamente 5 a aproximadamente 10, de aproximadamente 10 a aproximadamente 15, de aproximadamente 15 a aproximadamente 20, de aproximadamente 20 a aproximadamente 25, de aproximadamente 25 a aproximadamente 30, de aproximadamente 30 a aproximadamente 40 o de aproximadamente 40 a aproximadamente 50 aminoácidos. En una realización, la secuencia peptídica N-terminal puede ser uno o más restos de enlace (por ejemplo, uno o más restos de glicina, cisteína o serina). Por ejemplo, en determinadas realizaciones, el resto de cisteína carboxilo terminal en cualquiera de las secuencias descritas en el presente documento puede ubicarse en su lugar en el extremo amino terminal. De una manera similar, el resto de cisteína amino terminal en cualquiera de las secuencias descritas en el presente documento puede ubicarse en su lugar en el extremo carboxilo.

La secuencia peptídica N-terminal adicional puede ser una secuencia nativa. Como se usa en el presente documento, una secuencia "nativa" es una secuencia peptídica de una secuencia de la proteína de superficie mayor 2 (MSP2)/p44 u OMP/p44 de Anaplasma de origen natural o una variante de la misma. En determinadas realizaciones, la secuencia peptídica es un fragmento de una secuencia MSP 2/p44 u OMP/p44 de Anaplasma de origen natural. La secuencia peptídica puede ser, por ejemplo, de una región conservada o no conservada de MSP 2/p44 u OMP/p44. La secuencia peptídica puede comprender, por ejemplo, un epítopo, tales como un epítopo inmunodominante o cualquier otro epítopo reconocible por un sistema inmunológico del hospedador (por ejemplo, ser humano, perro, etc.). Las proteínas MSP 2/p44 u OMP/p44 de Anaplasma y péptidos de las mismas se han descrito, por ejemplo, en los N.° de referencia de Genebank AAO30097.1, ACV85580.1, ACV85559.1, AEH96270.1, ADU56850.1, AEH96270.1 y AAQ91849.1, así como en las patentes de EE.UU. N.° 7.507.789, 8.303.959, 8.158.370 y la publicación de patente de EE.UU. N.° 2013/0064842.

Los polipéptidos variantes son al menos aproximadamente un 80, un 85, un 90, un 95, un 98 o un 99 % idénticos a un péptido que se muestra en SEQ ID NO: 1-543 y también se describen en el presente documento. El porcentaje de identidad de secuencia tiene un significado reconocido en la técnica y existen varios procedimientos para medir la identidad entre dos secuencias de polipéptidos o polinucleótidos. Véanse, por ejemplo, Lesk, Ed., Computational Molecular Biology, Oxford University Press, Nueva York, (1988); Smith, Ed., Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Academic Press, Nueva York, (1993); Griffin y Griffin, Eds., Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Humana Press, Nueva Jersey, (1994); von Heinje, Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press, (1987); y Gribskov y Devereux, Eds., Sequence Analysis Primer, M. Stockton Press, Nueva York, (1991). Los procedimientos para alinear polinucleótidos o polipéptidos se codifican en programas de ordenador, incluyendo el paquete del programa GCG (Devereux y col., Nuc. Acids Res. 12:387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul y col., J Molec. Biol. 215:403 (1990)) y el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711) que usa el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (Adv. App. Math., 2:482-489 (1981)). Por ejemplo, puede usarse el programa de ordenador ALIGN que emplea el algoritmo FASTA, usando una búsqueda de espacio afín con una penalización abierta de -12 y penalización de extensión de hueco de -2.

Al usar cualquiera de los programas de alineación de secuencias para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, aproximadamente un 95 % idéntica a una secuencia de referencia, los parámetros se establecen de modo que el porcentaje de identidad se calcule sobre la longitud total del polinucleótido de referencia y que se permitan huecos en la identidad de hasta el 5 % del número total de nucleótidos en el polinucleótido de referencia.

Un experto en la materia puede seleccionar fácilmente las variantes de las secuencias peptídicas, basándose en parte en propiedades conocidas de la secuencia. Por ejemplo, un péptido variante puede incluir sustituciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones conservativas de aminoácidos) y/o deleciones (por ejemplo, deleciones pequeñas de aminoácidos individuales o deleciones que abarcan 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 o más aminoácidos contiguos). De esta manera, en determinadas realizaciones, una variante de una secuencia peptídica nativa es una que difiere de una secuencia de origen natural en (i) una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6 o más) sustituciones conservativas de aminoácidos, (ii) deleción de 1 o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6 o más) aminoácidos o (iii) una combinación de los mismos. Los aminoácidos eliminados pueden ser contiguos o no contiguos. Las sustituciones conservativas de aminoácidos son aquellas que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionadas en sus cadenas laterales y propiedades químicas. Estas incluyen, por ejemplo, (1) aminoácidos ácidos: aspartato, glutamato; (2) aminoácidos básicos: lisina, arginina, histidina; (3) aminoácidos no polares: alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; (4) aminoácidos polares sin carga: glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina; (5) aminoácidos alifáticos: glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, agrupadas opcionalmente serina y treonina por separado como hidroxilo alifático; (6) aminoácidos aromáticos: fenilalanina, tirosina, triptófano; (7) aminoácidos amida: asparagina, glutamina; y (9) aminoácidos que contienen azufre: cisteína y metionina. Véase, por ejemplo, Biochemistry, 2a ed., Ed. por L. Stryer, W H Freeman y Co.: 1981. Los procedimientos para confirmar que los péptidos variantes son adecuados son convencionales y rutinarios.

Las variantes de las secuencias peptídicas abarcan variaciones en secuencias peptídicas previamente definidas. Por ejemplo, una secuencia peptídica descrita previamente que comprende un epítopo conocido puede alargarse o acortarse, en uno o ambos extremos (por ejemplo, con aproximadamente 1-3 aminoácidos) y/o uno, dos, tres, cuatro o más aminoácidos pueden estar sustituidos por aminoácidos conservativos, etc. Adicionalmente, si se ha identificado que una región de una proteína contiene un epítopo de interés, un investigador puede "desplazar" la región de interés (por ejemplo, aproximadamente 5 aminoácidos en cualquier dirección) desde los puntos finales de la región aproximada original para optimizar la actividad.

En determinadas realizaciones, la secuencia peptídica N-terminal adicional puede comprender o consistir en otro péptido que tenga una secuencia de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 9. De esta manera, en algunas realizaciones, el péptido puede ser un multímero de secuencias que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID No : 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 9. En otras realizaciones, la secuencia peptídica N-terminal es una secuencia peptídica MSP 2/p44 u OMP/p44 nativa que está naturalmente adyacente al extremo N-terminal de una secuencia de una cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 9. En otras realizaciones, el péptido puede comprender una fusión de secuencias de una cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 9 opcionalmente a través de uno o más aminoácidos de enlace. Por ejemplo, en una realización, el péptido puede comprender una secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 enlazada a SEQ ID NO: 4 opcionalmente a través de uno o más aminoácidos de enlace (por ejemplo, restos de glicina, serina o cisteína). En otra realización, el péptido puede comprender una secuencia de SEQ ID NO: 5 enlazada a SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6 opcionalmente a través de uno o más aminoácidos de enlace (por ejemplo, restos de glicina, serina o cisteína). En otra realización, el péptido puede comprender una secuencia de SEQ ID NO: 9 enlazada a SEQ ID NO: 4, Se Q ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8 opcionalmente a través de uno o más aminoácidos de enlace (por ejemplo, restos de glicina, serina o cisteína).

En determinadas realizaciones, la secuencia peptídica N-terminal adicional es una secuencia no nativa. Como se usa en el presente documento, una secuencia "no nativa" es cualquier secuencia proteica, ya sea de una proteína de Anaplasma o de otra manera, distinta de una secuencia del péptido MSP 2/p44 u OMP/p44 nativa. En determinadas realizaciones, la secuencia peptídica N-terminal adicional comprende un epítopo de un antígeno de superficie de Anaplasma. Otros antígenos de Anaplasma incluyen, pero no se limitan a MSP5, HSP60, Asp14 (Kahlon y col., Infect Immun., Vol. 81(1): 65-79, 2013) y los antígenos descritos en Zhi y col., J. Clin. Microbiol., Vol. 35(10): 2606-2611, 1997. También pueden usarse polipéptidos o péptidos derivados de otros microorganismos, incluyendo antígenos de Ehrlichia y antígenos de Borrelia. Se han descrito secuencias proteicas y peptídicas correspondientes a antígenos de Ehrlichia. Véanse, por ejemplo, la Solicitud de EE.UU. N.° 14/052.296, las Patentes de EE.UU. N.° 6.306.402, 6.355.777, 7.204.992, 7.407.770, 8.828.675 y el documento WO2006/138509. Se han descrito secuencias proteicas y peptídicas correspondientes a antígenos de Borrelia. Véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N.° 6.716.574, 5.618.533, 5.643.733, 5.643.751, 5.932.220, 6.617.441, 7.887.815, 8.568.989 y 8.758.772.

En determinadas realizaciones, la secuencia peptídica N-terminal adicional es una combinación de secuencias. Por ejemplo, la secuencia peptídica N-terminal adicional puede comprender una secuencia nativa, una secuencia no nativa, o cualquier combinación de tales secuencias (por ejemplo, dos o más secuencias nativas, dos o más secuencias no nativas o una o más secuencias nativas en combinación con una o más secuencias no nativas).

En determinadas realizaciones, los péptidos descritos en el presente documento comprenden una secuencia de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 9 y una secuencia C-terminal adicional (por ejemplo, una extensión C-terminal). La secuencia peptídica C-terminal adicional puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25 o más aminoácidos. En determinadas realizaciones, la secuencia C-terminal adicional tiene una longitud de aproximadamente 5 a aproximadamente 10, de aproximadamente 10 a aproximadamente 15, de aproximadamente 15 a aproximadamente 20, de aproximadamente 20 a aproximadamente 25, de aproximadamente 25 a aproximadamente 30, de aproximadamente 30 a aproximadamente 40 o de aproximadamente 40 a aproximadamente 50 aminoácidos. La secuencia peptídica C-terminal adicional puede ser una secuencia MSP 2/p44 u OMP/p44 nativa. En determinadas realizaciones, la secuencia peptídica C-terminal es un fragmento de una secuencia MSP 2/p44 u OMP/p44 de Anaplasma de origen natural. La secuencia peptídica puede ser, por ejemplo, de una región conservada o no conservada de MSP 2/p44 u OMP/p44. La secuencia peptídica puede comprender, por ejemplo, un epítopo, tales como un epítopo inmunodominante o cualquier otro epítopo reconocible por un sistema inmunológico del hospedador (por ejemplo, ser humano, perro, etc.).

En determinadas realizaciones, la secuencia peptídica C-terminal adicional puede comprender o consistir en otro péptido que tenga una secuencia de SEQ ID n O: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 9. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, un péptido puede ser un multímero de secuencias teniendo cada una una secuencia de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 9. En otras realizaciones, la secuencia nativa es una secuencia (por ejemplo, una secuencia MSP 2/p44 u OMP/p44) que es naturalmente adyacente al extremo C-terminal de una secuencia de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ iD No : 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 9.

En determinadas realizaciones, la secuencia peptídica C-terminal adicional es una secuencia no nativa. En algunas realizaciones, la secuencia peptídica C-terminal adicional comprende un epítopo de un antígeno de superficie de Anaplasma distinto de MSP 2/p44 u OMP/p44. También pueden usarse polipéptidos o péptidos derivados de otros microorganismos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la secuencia peptídica de Anaplasma puede comprender además un epítopo de un antígeno de Ehrlichia o de Borrelia.

En determinadas realizaciones, la secuencia peptídica C-terminal adicional es una combinación de secuencias. Por ejemplo, la secuencia peptídica C-terminal adicional puede comprender una secuencia nativa, una no nativa o cualquier combinación de tales secuencias (por ejemplo, dos o más secuencias nativas, dos o más secuencias no nativas o una o más secuencias nativas en combinación con una o más secuencias no nativas).

En determinadas realizaciones, los péptidos descritos en el presente documento comprenden una secuencia definida por SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 9 y además comprenden una secuencia peptídica N-terminal adicional y una secuencia peptídica C-terminal adicional. Las secuencias peptídicas N-terminal y C-terminal adicionales pueden ser como se describió anteriormente. Los péptidos generalmente no consisten en una proteína MSP 2/p44 u OMP/p44 de longitud completa. Sin embargo, en determinadas realizaciones, los péptidos pueden comprender una proteína MSP 2/p44 u OMP/p44 de longitud completa. En otras realizaciones, los péptidos no comprenden una proteína MSP 2/p44 u OMP/p44 de longitud completa.

Un péptido descrito en el presente documento que comprende una secuencia peptídica N-terminal y/o C-terminal adicional puede diseñarse para diagnosticar infecciones de Anaplasma (por ejemplo, anaplasmosis) temprano después de la infección (por ejemplo, dentro de una o dos semanas después del inicio de la infección). Por ejemplo, en determinadas realizaciones, la secuencia peptídica N-terminal y/o C-terminal adicional comprende un antígeno o epítopo asociado a etapas tempranas de infección por Anaplasma.

Además de las secuencias descritas anteriormente, las secuencias N-terminal y C-terminal adicionales pueden comprender o consistir en una secuencia flexible, diseñada para presentar mejor los péptidos para la detección en un inmunoensayo (por ejemplo, ensayo ELISA, inmunoensayo de flujo lateral, ensayo de aglutinación, etc.). Dichas secuencias flexibles pueden identificarse fácilmente por los expertos en la materia.

En determinadas realizaciones, los péptidos comprenden o consisten en 20 o más (por ejemplo, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o más) restos de aminoácidos. En determinadas realizaciones, los péptidos comprenden o consisten en 30 o más (por ejemplo, 31, 32, 33, 34 o más) restos de aminoácidos. En determinadas realizaciones, los péptidos comprenden o consisten en 35 o más (por ejemplo, 36, 37, 38, 39 o más) restos de aminoácidos. En determinadas realizaciones, los péptidos comprenden o consisten en 40 o más (por ejemplo, 41, 42, 43, 44 o más) restos de aminoácidos. En determinadas realizaciones, los péptidos comprenden o consisten en 45 o más (por ejemplo, 46, 47, 48, 49 o más) restos de aminoácidos. En determinadas realizaciones, los péptidos comprenden o consisten en 50 o más (por ejemplo, 51, 52, 53, 54 o más) restos de aminoácidos. En determinadas realizaciones, los péptidos comprenden o consisten en 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más restos de aminoácidos. En algunas realizaciones, los péptidos comprenden o consisten en aproximadamente 20 a aproximadamente 75 aminoácidos, aproximadamente 25 a aproximadamente 65 aminoácidos o aproximadamente 30 a aproximadamente 55 aminoácidos.

En determinadas realizaciones, los péptidos comprenden un epítopo de una secuencia peptídica descrita en el presente documento. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, los péptidos comprenden un epítopo de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-543.

En algunas realizaciones, los péptidos comprenden un fragmento de una secuencia peptídica descrita en el presente documento. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, los péptidos comprenden un fragmento de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-543. El fragmento puede tener, por ejemplo, al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 o 44 aminoácidos de longitud. El fragmento también puede tener al menos 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65 o 66 aminoácidos de largo. En algunas realizaciones, el fragmento no tiene más de 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65 o 66 aminoácidos de largo. El fragmento puede ser contiguo o puede incluir una o más deleciones (por ejemplo, una deleción de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más restos de aminoácidos). Por ejemplo, en una realización, los péptidos comprenden un fragmento de SEQ ID NO: 3. Tales fragmentos pueden comprender al menos 10, 15, 20, 25, 30 o 35 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, los fragmentos comprenden los aminoácidos 1 a 35 de SEQ ID NO: 3. De esta manera, en una realización, un péptido comprende o consiste en una secuencia de E-T-K-V-X⁵-Y-X⁷-Y-L-K-X¹¹-G-R-T-V-K-L-X¹⁸-S-H-X²¹-F-D-W-X²⁵-T-P-X²⁸-P-K-X³¹-G-F-K-D (SEQ ID NO: 543), en la que X⁵es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V o A, X⁷es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, I o H, X ¹¹es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E, N o Q, X ¹⁸es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D o N, X²¹es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R, D o N, X²⁵es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q, D o E, X²⁸es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E o N y X³¹es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L o V.

Los péptidos descritos en el presente documento que comprenden un fragmento de una secuencia peptídica descrita en el presente documento pueden comprender además una secuencia peptídica N-terminal adicional, una secuencia peptídica C-terminal adicional o una combinación de las mismas. Las secuencias peptídicas N-terminal y C-terminal adicionales pueden ser como se describió anteriormente.

Los péptidos descritos en el presente documento que comprenden una secuencia peptídica N-terminal o C-terminal adicional pueden comprender además un enlazador que conecta el péptido (por ejemplo, un péptido de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 9, o un fragmento de las mismas) con la secuencia peptídica N-terminal o C-terminal adicional. El enlazador puede ser, por ejemplo, un espaciador peptídico. Tal espaciador puede consistir en, por ejemplo, entre aproximadamente uno y cinco (por ejemplo, aproximadamente tres) restos de aminoácidos, preferentemente aminoácidos no cargados, por ejemplo, restos alifáticos tales como glicina o alanina. En una realización, el espaciador es un espaciador de glicina triplete. En otra realización, el espaciador es un espaciador de alanina triplete. En otra realización, el espaciador consiste en cinco aminoácidos de glicina. En aún otra realización, el espaciador comprende tanto restos de glicina como de alanina. Alternativamente, el enlazador puede ser un enlazador químico (es decir, no peptídico).

En determinadas realizaciones, los péptidos se producen por química sintética (es decir, un "péptido sintético"). En otras realizaciones, los péptidos se producen biológicamente (es decir, por la maquinaria celular, tales como un ribosoma, en sistemas de expresión celular o sistemas de traducción in vitro). En determinadas realizaciones, los péptidos están aislados. Como se usa en el presente documento, un péptido "aislado" es un péptido que se ha producido sintética o biológicamente y después se purifica, al menos parcialmente, de los productos químicos y/o la maquinaria celular usados para producir el péptido. En determinadas realizaciones, un péptido aislado está sustancialmente purificado. La expresión "sustancialmente purificado", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula, tales como un péptido, que está sustancialmente libre de material celular (proteínas, lípidos, carbohidratos, ácidos nucleicos, etc.), medio de cultivo, precursores químicos, productos químicos usados en la síntesis del péptido o combinaciones de los mismos. Un péptido que está sustancialmente purificado tiene menos de aproximadamente el 40 %, el 30 %, el 25 %, el 20 %, el 15 %, el 10 %, el 5 %, el 2 %, el 1 % o menos del material celular, medio de cultivo, otros polipéptidos, precursores químicos y/o productos químicos usados en la síntesis del péptido. En consecuencia, una molécula sustancialmente pura, tales como un péptido, puede ser al menos aproximadamente el 60 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 99 %, por peso seco, la molécula de interés. Un péptido aislado puede estar en agua, un tampón o en forma seca en espera de reconstitución, por ejemplo, como parte de un kit. Un péptido aislado puede estar en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Los ácidos y bases adecuados que son capaces de formar sales con los péptidos son bien conocidos por aquellos expertos en la materia e incluyen ácidos y bases inorgánicos y orgánicos.

En determinadas realizaciones, los péptidos se purifican por afinidad. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, los péptidos se purifican por medio de su capacidad de unirse a anticuerpos anti-Anaplasma (por ejemplo, anticuerpos contra proteínas MSP 2/p44 u OMP/p44 y, opcionalmente, otros antígenos de Anaplasma) al poner en contacto dichos anticuerpos con los péptidos de manera que los complejos péptido-anticuerpo sean capaces de formarse, lavar los complejos péptido-anticuerpo para retirar impurezas y después eluir los péptidos de los anticuerpos. Los anticuerpos pueden estar, por ejemplo, unidos a un soporte sólido. Los procedimientos de purificación por afinidad son bien conocidos y rutinarios para aquellos expertos en la materia.

En determinadas realizaciones, los péptidos están modificados. Los péptidos pueden modificarse mediante una diversidad de técnicas, tales como por desnaturalización con calor y/o un detergente (por ejemplo, SDS). Alternativamente, los péptidos pueden modificarse por asociación con uno o más restos adicionales. La asociación puede ser covalente o no covalente, y puede ser, por ejemplo, a través de un conector de aminoácidos terminal, tales como lisina o cisteína, un agente de acoplamiento químico o un enlace peptídico. El resto adicional puede ser, por ejemplo, un ligando, un receptor de ligando, un compañero de fusión, un marcador detectable, una enzima o un sustrato que inmoviliza el péptido.

Los péptidos descritos en el presente documento pueden conjugarse con un ligando, tales como la biotina (por ejemplo, a través de un resto de cisteína o lisina), una molécula lipídica (por ejemplo, a través de un resto de cisteína) o una proteína vehículo (por ejemplo, seroalbúmina, dominio Fc de inmunoglobulina, hemocianina de lapa californiana (KLH) a través de, por ejemplo, un resto de cisteína o lisina). La fijación a ligandos, tales como la biotina, puede ser útil para asociar el péptido a receptores de ligando, tales como avidina, estreptavidina, estreptavidina polimérica (véase, por ejemplo, el documento US 2010/0081125 y el documento US 2010/0267166) o neutravidina. La avidina, estreptavidina, estreptavidina polimérica o neutravidina, a su vez, pueden vincularse a un resto de señalización (por ejemplo, una enzima, tales como la peroxidasa de rábano picante (HRP) o la fosfatasa alcalina (ALP) o la p-galactosidasa (p-GAL) u otro resto que puede visualizarse, tales como un nanomaterial metálico tales como una nanopartícula, nanoplaca o nanocápsula (por ejemplo, oro coloidal), un resto fluorescente o un punto cuántico) o un sustrato sólido (por ejemplo, una membrana Immobilon™ o nitrocelulosa o membrana Porex®). Alternativamente, los péptidos pueden fusionarse o unirse a un receptor de ligando, tales como avidina, estreptavidina, estreptavidina polimérica o neutravidina, facilitando de esta manera la asociación de los péptidos al ligando correspondiente, tales como biotina y cualquier resto (por ejemplo, resto de señalización) o sustrato sólido unido al mismo. Los ejemplos de otros pares ligandoreceptor son bien conocidos en la técnica y pueden usarse de manera similar.

Los péptidos pueden fusionarse con un compañero de fusión (por ejemplo, un péptido u otro resto) que puede usarse para mejorar la purificación, para potenciar la expresión del péptido en una célula hospedadora, para ayudar en la detección, para estabilizar el péptido, etc. Los ejemplos de compuestos adecuados para compañeros de fusión incluyen proteínas vehículo (por ejemplo, seroalbúmina, dominio Fc de inmunoglobulina, KLH), enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante (HRP), beta-galactosidasa, glutatión-S-transferasa, fosfatasa alcalina), proteína de unión a maltosa (MBP) o una etiqueta de histidina, etc. La fusión se puede lograr por medio de, por ejemplo, un enlace peptídico. Por ejemplo, los péptidos y los compañeros de fusión pueden ser proteínas de fusión y pueden fusionarse directamente en el marco o pueden comprender un enlazador peptídico, como se discutió anteriormente en el contexto de secuencias peptídicas N-terminales y C-terminales adicionales. En determinadas realizaciones, una población de péptidos puede estar enlazada por un dendrímero, por ejemplo, como en una estructura MAPS.

Además, los péptidos pueden modificarse para incluir cualquiera de una diversidad de grupos químicos o moléculas conocidos. Dichas modificaciones incluyen, pero no se limitan a, glucosilación, acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente al polietilenglicol (por ejemplo, PEGilación), unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado lipídico, fijación covalente de fosfatidilinositol, reticulación, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, gamma carboxilación, glucosilación, formación de anclaje GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatos, ubiquitinación, modificaciones con ácidos grasos, adición de aminoácidos mediada por ARN de transferencia a proteínas tales como la arginilación, etc. También se incluyen los análogos de un aminoácido (incluyendo aminoácidos no naturales) y péptidos con enlaces sustituidos. Los péptidos que consisten en cualquiera de las secuencias discutidas en el presente documento pueden modificarse por cualquiera de las modificaciones discutidas. Tales péptidos todavía "consisten en" los aminoácidos.

Las modificaciones establecidas anteriormente son bien conocidas por los expertos en la materia y se han descrito con gran detalle en las referencias científicas. Varias modificaciones particularmente comunes, glucosilación, unión de lípidos, sulfatos, gamma-carboxilación de restos de ácido glutámico, hidroxilación y ADP-ribosilación, por ejemplo, se describen en muchos textos básicos, tales como Proteins-Structure and Molecular Properties, 2a ed., T. E. Creighton, W.H. Freeman and Company, Nueva York (1993). Muchas revisiones detalladas están disponibles sobre esta materia, tales como por Wold, F., Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nueva York 1-12 (1983); Seifter y col. (1990) Meth. Enzymol. 182:626-646 y Rattan y col. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:48-62.

En determinadas realizaciones, los péptidos están unidos a o inmovilizados sobre un sustrato, tales como un soporte sólido o semisólido. La unión puede ser covalente o no covalente, y puede facilitarse por un resto asociado al péptido que permite la unión covalente o no covalente, tales como un resto que tiene una alta afinidad con un componente unido al vehículo, soporte o superficie. Por ejemplo, el péptido puede asociarse a un ligando, tales como la biotina, y el componente asociado a la superficie puede ser un receptor de ligando correspondiente, tales como avidina. En algunas realizaciones, el péptido puede asociarse a un compañero de fusión, por ejemplo, seroalbúmina bovina (BSA), lo que facilita la unión del péptido a un sustrato. En otras realizaciones, los péptidos están unidos a o inmovilizados sobre un sustrato a través de una nanocapa metálica. En una realización, la nanocapa metálica está compuesta por cadmio, cinc, mercurio o un metal noble, tales como oro, plata, cobre y platino. El péptido o la población de péptidos puede unirse a o inmovilizarse sobre el sustrato antes o después de la adición de una muestra que contiene anticuerpo durante un inmunoensayo.

En determinadas realizaciones, el sustrato es una perla o una pluralidad de perlas, tales como una partícula coloidal (por ejemplo, una nanopartícula coloidal hecha de oro, plata, platino, cobre, cadmio, compuestos metálicos, otros metales blandos, partículas de estructura núcleo-cubierta o nanosferas de oro huecas) u otro tipo de partículas (por ejemplo, una cuenta magnética o una partícula o nanopartícula que comprende sílice, látex, poliestireno, policarbonato, poliacrilato, PVDF o PMMA). Dichas partículas pueden comprender un marcador (por ejemplo, un marcador colorimétrico, quimioluminiscente, punto cuántico o fluorescente) y puede ser útil para visualizar la ubicación de los péptidos durante los inmunoensayos. En determinadas realizaciones, se usa una cisteína terminal de un péptido para unir el péptido directamente a un nanomaterial o nanoestructura metálicos.

Los nanomateriales o nanoestructuras metálicos pueden estar hechos de oro, plata, platino, paladio, cobre, cadmio, compuestos metálicos u otros metales blandos. En algunas realizaciones, los nanomateriales o nanoestructuras metálicos, incluyendo las nanoestructuras compuestas, tienen una geometría seleccionada de nanopartículas esféricas, nanopartículas piramidales, nanopartículas hexagonales, nanosferas, nanoplacas, nanotubos, nanocables y combinaciones de los mismos. Algunos ejemplos de nanocapas metálicas incluyen esferas huecas de oro, nanosferas de sílice recubiertas de oro y cáscaras de oro recubiertas de sílice. Las nanoplacas tienen dimensiones laterales (por ejemplo, longitudes de borde) que son mayores que su grosor. Las nanoplacas incluyen nanodiscos, nanopolígonos, nanohexágonos, nanocubos, nanoanillos, nanoestrellas y nanoprismas. En algunas realizaciones, las nanoestructuras metálicas tienen otras formas o formas irregulares. En determinadas realizaciones, el tamaño y la forma de las nanoestructuras metálicas no son uniformes, es decir, las nanoestructuras metálicas son una mezcla heterogénea de diferentes formas y tamaños de nanoestructuras.

Para nanopartículas esféricas, los intervalos de diámetro adecuados incluyen de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 200 nm, de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 100 nm y de aproximadamente 20 nm a aproximadamente 60 nm. Para nanoplacas, las longitudes de los bordes pueden ser de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 800 nm, de aproximadamente 20 nm a aproximadamente 500 nm, de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 200 nm, de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 100 nm o de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 300 nm. El grosor de las nanoplacas puede variar de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 50 nm o de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 20 nm.

En algunas realizaciones, las nanoplacas tienen una relación de aspecto mayor que 2. La relación de aspecto es la relación entre la longitud del borde y el grosor. Preferentemente, las nanoplacas tienen una relación de aspecto de aproximadamente 2 a aproximadamente 25, de aproximadamente 3 a aproximadamente 20, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10, de aproximadamente 2 a aproximadamente 15 o de aproximadamente 10 a aproximadamente 30.

En determinadas realizaciones, el sustrato es una transferencia de puntos o una ruta de flujo en un dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral. Por ejemplo, los péptidos pueden unirse a o inmovilizarse sobre una membrana porosa, tales como una membrana de PVDF (por ejemplo, una membrana Immobilon™), una membrana de nitrocelulosa, membrana de polietileno, membrana de nailon o un tipo similar de membrana.

En determinadas realizaciones, el sustrato es un camino de flujo en un rotor analítico o centrífugo. En otras realizaciones, el sustrato es un tubo o un pocillo, tales como un pocillo en una placa (por ejemplo, una placa de microtitulación) adecuada para su uso en un ensayo ELISA. Tales sustratos pueden comprender vidrio, materiales a base de celulosa, polímeros termoplásticos, tales como polietileno, polipropileno o poliéster, estructuras sinterizadas compuestas por materiales particulados (por ejemplo, vidrio o diversos polímeros termoplásticos) o película de membrana fundida compuesta por nitrocelulosa, nailon, polisulfona o similares. Un sustrato puede ser partículas finas de polietileno sinterizado, comúnmente conocido como polietileno poroso, por ejemplo, polietileno poroso de 0,2-15 micrómetros de Chromex Corporation (Albuquerque, NM). Todos estos materiales de sustrato pueden usarse en formas adecuadas, tales como películas, láminas o placas, o pueden recubrirse sobre o unidas o laminadas a soportes inertes apropiados, tales como papel, vidrio, películas de plástico o telas. Los procedimientos adecuados para inmovilizar péptidos en fases sólidas incluyen interacciones iónicas, hidrófobas, covalentes y similares.

En consecuencia, en otro aspecto, la divulgación proporciona dispositivos. En determinadas realizaciones, los dispositivos son útiles para realizar un inmunoensayo. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, el dispositivo es un dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral. Un ejemplo de dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral se describe en el Ejemplo 2. En determinadas realizaciones, el dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral comprende una población de péptidos, en el que cada péptido en la población comprende una secuencia de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o Se Q ID NO: 9. En algunas realizaciones, el dispositivo es un portaobjetos compuesto por una pluralidad de perlas a las que se une un péptido o población de péptidos. Un ejemplo de dicho dispositivo que comprende péptidos de la divulgación adecuados para su uso, por ejemplo, en un ensayo indirecto de anticuerpos fluorescentes se describe en el Ejemplo 3. En otras realizaciones, el dispositivo es un rotor analítico o centrífugo. En otras realizaciones, el dispositivo es una transferencia de puntos, transferencia de ranura o transferencia Western. En otras realizaciones, el dispositivo es un tubo o un pocillo, por ejemplo, en una placa adecuada para un ensayo ELISA. Un dispositivo ejemplar que comprende péptidos de la divulgación para su uso en un ensayo ELISA se describe en el Ejemplo 1. En otras realizaciones más, el dispositivo es un sensor electroquímico, un sensor óptico o un sensor optoelectrónico.

En determinadas realizaciones, el dispositivo comprende un péptido o población de péptidos de la divulgación. En otras realizaciones, el dispositivo comprende una mezcla de diferentes péptidos de la divulgación. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, el dispositivo comprende dos, tres, cuatro o más péptidos diferentes de la divulgación. En determinadas realizaciones, el péptido o cada péptido en la población comprende una secuencia de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 9 o un fragmento de las mismas. En otras realizaciones, el péptido o cada péptido en la población comprende una secuencia de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o un fragmento de las mismas. En determinadas realizaciones, la población de péptidos está unida o inmovilizada sobre el dispositivo opcionalmente a través de una nanocapa metálica. Los dispositivos pueden usarse para detectar la presencia de anticuerpos contra antígenos de Anaplasma de múltiples especies (por ejemplo, A. phagocytophilum, A. platys y A. margínale) en una muestra simultáneamente. En una realización, el dispositivo comprende una población de péptidos aislados que comprenden tres o más péptidos diferentes, en el que cada péptido en la población comprende una secuencia de SEQ ID NO: 3. En otra realización, el dispositivo comprende una población de péptidos aislados que comprenden tres o más péptidos diferentes, en el que cada péptido en la población comprende una secuencia de SEQ ID NO: 4. En otra realización, el dispositivo comprende una población de péptidos aislados que comprenden tres o más péptidos diferentes, en el que cada péptido en la población comprende una secuencia de SEQ ID NO: 1. En otra realización más, el dispositivo comprende una población de péptidos aislados que comprenden tres o más péptidos diferentes, en el que cada péptido en la población comprende una secuencia de SEQ ID NO: 8. En otras realizaciones, el dispositivo comprende una población de péptidos aislados que comprenden tres o más péptidos diferentes, en el que cada péptido en la población comprende una secuencia de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 9.

En otro aspecto, La divulgación proporciona composiciones que comprenden uno o más péptidos de la divulgación. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, la divulgación proporciona una composición que comprende un péptido que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 3, o poblaciones de los mismos. En determinadas realizaciones, la composición comprende una población de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 o más péptidos (por ejemplo todos los péptidos posibles definidos por la SEQ ID NO: 3). De esta manera, se describe en el presente documento una población de péptidos aislados que comprende tres o más péptidos diferentes, en el que cada péptido en la población comprende una secuencia de SEQ ID NO: 3. En determinadas realizaciones, los péptidos en la población o mezcla comprenden una adición N-terminal y/o C-terminal y/o están modificados (por ejemplo, por asociación con uno o más restos adicionales), como se describe en el presente documento. En determinadas realizaciones, los péptidos comprenden las mismas adiciones N-terminal y/o C-terminal. En otras realizaciones, los péptidos comprenden diferentes adiciones de N-terminal y/o C-terminal.

En algunas realizaciones, la divulgación proporciona una composición que comprende un péptido que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 4, o poblaciones de los mismos. En determinadas realizaciones, la composición comprende una población de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 o más péptidos (por ejemplo, todos los péptidos posibles definidos por la SEQ ID NO: 4). De esta manera, la divulgación proporciona una población de péptidos aislados que comprende tres o más péptidos diferentes, en el que cada péptido en la población comprende una secuencia de SEQ ID NO: 4. En determinadas realizaciones, los péptidos en la población o mezcla comprenden una adición N-terminal y/o C-terminal y/o están modificados (por ejemplo, por asociación con uno o más restos adicionales), como se describe en el presente documento. En determinadas realizaciones, los péptidos comprenden las mismas adiciones N-terminal y/o C-terminal. En otras realizaciones, los péptidos comprenden diferentes adiciones de N-terminal y/o C-terminal.

En otras realizaciones más, la divulgación proporciona una composición que comprende un péptido que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 543 o poblaciones de los mismos. En determinadas realizaciones, la composición comprende una población de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 o más péptidos (por ejemplo, todos los péptidos posibles definidos por la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, Se Q ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 543). De esta manera, la divulgación proporciona una población de péptidos aislados que comprende tres o más péptidos diferentes, en el que cada péptido en la población comprende una secuencia de s Eq ID NO: 1. En otra realización, la divulgación proporciona una población de péptidos aislados que comprende tres o más péptidos diferentes, en el que cada péptido en la población comprende una secuencia de SEQ ID NO: 2. En otras realizaciones, la divulgación proporciona una población de péptidos aislados que comprende tres o más péptidos diferentes, en el que cada péptido en la población comprende una secuencia de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 543. Los péptidos en la población o mezcla pueden comprender una adición N-terminal y/o C-terminal, y/o pueden modificarse (por ejemplo, por asociación con uno o más restos adicionales), como se describe en el presente documento.

En algunas realizaciones, la composición comprende una población de péptidos aislados, comprendiendo dicha población tres o más péptidos diferentes, en la que cada péptido en la población comprende una secuencia, o un fragmento de la misma, de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9.

En algunas realizaciones, la composición comprende al menos dos poblaciones diferentes de péptidos descritos en el presente documento. En determinadas realizaciones, al menos una de las poblaciones de péptidos se define por SEQ ID NO: 3 (es decir, que comprende tres o más péptidos diferentes, en la que cada péptido en la población comprende una secuencia, o un fragmento de la misma, de SEQ ID NO: 3).

En determinadas realizaciones, la composición comprende además una segunda población de péptidos aislados. En algunas realizaciones, la segunda población de péptidos está definida por SEQ ID NO: 7. En algunas otras realizaciones, cada péptido en la segunda población de péptidos comprende la secuencia, o un fragmento de la misma, de SEQ ID NO: 6.

En algunas realizaciones, la composición comprende además una tercera población de péptidos aislados que es diferente de la primera y segunda poblaciones de péptidos. En determinadas realizaciones, cada péptido en la tercera población de péptidos comprende la secuencia, o un fragmento de la misma, de SEQ ID NO: 6.

En una realización particular, la composición comprende tres poblaciones diferentes de péptidos, una primera población de péptidos que se define por SEQ ID NO: 3, una segunda población de péptidos que se define por la SEQ ID NO: 7, y una tercera población de péptidos en la que cada péptido comprende la secuencia, o un fragmento de la misma, de SEQ ID NO: 6.

En determinadas realizaciones, las composiciones comprenden uno o más péptidos (o una o más poblaciones de péptidos) de la divulgación y uno o más péptidos adicionales, tales como un péptido o antígeno de Anaplasma, un péptido o antígeno de una o más especies de Ehrlichia y/o un péptido o antígeno de una o más especies de Borrelia. El péptido o antígeno de Anaplasma puede ser cualquier péptido o antígeno de superficie de Anaplasma o cualquier péptido o antígeno descrito en el presente documento. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, las composiciones comprenden una mezcla de péptidos, en la que cada péptido tiene una secuencia de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 7. En otras realizaciones, las composiciones comprenden una mezcla de péptidos, en la que cada péptido tiene una secuencia de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6.

Los péptidos de Ehrlichia adecuados que pueden mezclarse con los péptidos de Anaplasma descritos en el presente documento incluyen cualquier péptido o antígeno de superficie de Ehrlichia incluyendo, pero no limitado a, OMP-1, p38, p43, p120, p140, p153, p156, p200, gp19, gp36, gp47, gp200 o proteína HGE-3, o cualquier fragmento o epítopo de las mismas. Otros péptidos adecuados de Ehrlichia incluyen péptidos descritos en la Solicitud de EE.UU. N.° 14/052.296 y la Patente de EE.UU. N.° 8.828.675. Los péptidos de Borrelia adecuados que pueden mezclarse con los péptidos de Anaplasma descritos en el presente documento incluyen cualquier péptido o antígeno de superficie de Borrelia incluyendo, pero no limitado a, OspA, OspB, DbpA, proteínas asociadas a flagelos FlaA (p37) y FlaB (p41), OspC (25 kd), BBK32, BmpA (p39), p21, p39, p66 o proteína p83, o cualquier fragmento o epítopo de las mismas. Otros péptidos adecuados de Borrelia incluyen péptidos descritos en las patentes de EE.UU. N.° 8.568.989 y 8.758.772. La combinación puede comprender un cóctel (una mezcla sencilla) de péptidos o polipéptidos individuales, puede estar en forma de un péptido o polipéptido de fusión (por ejemplo, un péptido multimérico) o los péptidos pueden estar enlazados por un dendrímero (por ejemplo, como en una estructura MAPS) opcionalmente a través de un resto de enlace (por ejemplo, resto de lisina o cisteína). Por ejemplo, en determinadas realizaciones, una composición comprende uno o más péptidos de la divulgación (por ejemplo, un péptido que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 543) y uno o más péptidos de Ehrlichia antigénicos y/o uno o más péptidos de Borrelia antigénicos.

Cuando una composición comprende múltiples péptidos o poblaciones de péptidos, la proporción entre los diversos péptidos o poblaciones de péptidos puede variarse para adaptar el rendimiento de la composición, por ejemplo, en términos de sensibilidad y selectividad. Por ejemplo, en una composición que comprende dos poblaciones de péptidos, la relación molar de las dos poblaciones de péptidos puede variar en cualquier punto entre 20:1 y 1:20, por ejemplo, 20:1, 10:1, 5:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:5, 1:10 o 1:20. O, el porcentaje de la relación en peso puede variar entre 95:5 y 5:95, por ejemplo, 95:5, 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80, 10:90 o 5:95. En una composición que comprende tres o más poblaciones de péptidos, el porcentaje de moles o peso de cada población de péptidos puede variar del 1 % al 98 % del total de moles o peso de las tres poblaciones de péptidos, por ejemplo, el 1 %, el 2 %, el 5 %, el 10 %, el 15 %, el 20 %, el 25 %, el 30 %, el 33 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, el 95 %, el 98 %, etc. En una determinada realización, la composición comprende tres poblaciones de péptidos, APL-ID1 (definido por SEQ ID NO: 3), APL-ID5.1 (comprendiendo cada péptido SEQ ID NO: 6) y APL-ID6 (definido por SEQ ID NO: 7) en una relación en peso de 50:25:25. En otra realización, la composición comprende tres poblaciones de péptidos, APL-ID1 (definido por SEQ ID NO: 3), APL-ID5.1 (comprendiendo cada péptido SEQ ID n O: 6) y APL-ID6 (definido por SEQ ID NO: 7), en la que cada población de péptidos constituye un tercio de la composición en peso.

Un péptido descrito en el presente documento puede fusionarse en su extremo N-terminal o C-terminal con otro péptido adecuado. Dos o más copias de un péptido pueden unirse entre sí, solas o en combinación con uno o más péptidos adicionales. Pueden usarse combinaciones de péptidos o polipéptidos fusionados y no fusionados. En una realización, los péptidos adicionales contienen epítopos de linfocitos B y/o linfocitos T de un péptido o antígeno de Anaplasma, un péptido o antígeno de una especie de Anaplasma infecciosa o un péptido o antígeno de un agente causante de anaplasmosis.

En otro aspecto, la divulgación proporciona ácidos nucleicos que comprenden una secuencia que codifica un péptido de la divulgación. Los ácidos nucleicos contienen menos de un genoma microbiano completo y pueden ser monocatenarios o bicatenarios. Un ácido nucleico puede ser ARN, ADN, ADNc, ADN genómico, ARN o ADN sintetizados químicamente o combinaciones de los mismos. Los ácidos nucleicos pueden purificarse sin otros componentes, tales como proteínas, lípidos y otros polinucleótidos. Por ejemplo, los ácidos nucleicos pueden estar el 50 %, el 75 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % purificados. Los ácidos nucleicos codifican los péptidos descritos en el presente documento. En determinadas realizaciones, los ácidos nucleicos codifican un péptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1-543 o combinaciones de los mismos. Los ácidos nucleicos pueden comprender otras secuencias de nucleótidos, tales como secuencias de codificación para enlazadores, secuencias señal, secuencias de transferencia de detención TMR, dominios transmembrana o ligandos útiles en la purificación de proteínas tales como glutatión-S-transferasa, etiqueta de histidina, etiqueta MBP y proteína A estafilocócica.

Los ácidos nucleicos pueden aislarse. Un ácido nucleico "aislado" es uno que no es inmediatamente contiguo con una o ambas secuencias genómicas flanqueantes 5' y 3' con las que está naturalmente asociado. Un ácido nucleico aislado puede ser, por ejemplo, una molécula de ADN recombinante de cualquier longitud, con la condición de que las secuencias de ácido nucleico que se encuentran de forma natural que flanquean inmediatamente la molécula de ADN recombinante en un genoma natural se retiran o están ausentes. Los ácidos nucleicos aislados también incluyen moléculas de ácido nucleico no naturales. Los ácidos nucleicos también pueden comprender fragmentos que codifican péptidos inmunogénicos. Los ácidos nucleicos pueden codificar polipéptidos de longitud completa, fragmentos de péptidos y péptidos variantes o de fusión.

Los ácidos nucleicos de la divulgación pueden aislarse, al menos en parte, a partir de secuencias de ácido nucleico presentes en, por ejemplo, una muestra biológica, tales como sangre, suero, saliva o tejido de un individuo infectado. Los ácidos nucleicos también pueden sintetizarse en el laboratorio, por ejemplo, usando un sintetizador automático. Puede usarse un procedimiento de amplificación tales como PCR para amplificar ácidos nucleicos, al menos en parte, a partir de ADN genómico o bien ADNc que codifican los polipéptidos.

Los ácidos nucleicos de la divulgación pueden comprender secuencias codificantes para polipéptidos naturales o pueden codificar secuencias alteradas que no se producen en la naturaleza. Si se desea, los ácidos nucleicos pueden clonarse en un vector de expresión que comprende elementos de control de expresión, incluyendo por ejemplo, orígenes de replicación, promotores, potenciadores u otros elementos reguladores que dirigen la expresión de los polinucleótidos en las células hospedadoras. Un vector de expresión puede ser, por ejemplo, un plásmido, tales como pBR322, pUC, o ColE1, o un vector de adenovirus, tales como un vector Tipo 2 o un vector Tipo 5 de adenovirus. Opcionalmente, pueden usarse otros vectores, incluyendo pero no limitado a virus Sindbis, virus de simio 40, vectores de alfavirus, vectores de poxvirus y citomegalovirus y vectores retrovíricos, tales como el virus del sarcoma murino, virus de tumor mamario de ratón, virus de la leucemia murina de Moloney y virus del sarcoma de Rous. Minicromosomas tales como MC y MC1, bacteriófagos, fagémidos, cromosomas artificiales de levadura, cromosomas bacterianos artificiales, partículas de virus, partículas parecidas a virus, cósmidos (plásmidos en los que se han insertado sitios cos del fago lambda) y replicones (elementos genéticos que son capaces de replicarse bajo su propio control en una célula) también pueden usarse.

Los procedimientos para preparar polinucleótidos unidos operativamente a una secuencia de control de expresión y expresarlos en una célula hospedadora son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la Pat. de EE.UU. N.° 4.366.246. Un ácido nucleico está unido operativamente cuando se coloca adyacente o cerca de uno o más elementos de control de expresión, que dirigen la transcripción y/o traducción del polinucleótido.

De esta manera, por ejemplo, puede producirse un péptido recombinantemente siguiendo técnicas de ingeniería genética convencionales. Para producir un péptido recombinante, un ácido nucleico que codifica el péptido se inserta en un sistema de expresión adecuado. Generalmente, se construye una molécula o vector recombinante en los que la secuencia de polinucleótidos que codifica el péptido seleccionado está unida operativamente a una secuencia de control de expresión que permite la expresión del péptido. Se conocen numerosos tipos de vectores de expresión apropiados en la técnica, incluyendo, por ejemplo, vectores que contienen sistemas de expresión bacterianos, víricos, de levaduras, fúngicos, de insectos o de mamíferos. Los procedimientos para la obtención y el uso de tales vectores de expresión son bien conocidos. Para orientación en esta y otras técnicas de biología molecular usadas para las composiciones o los procedimientos descritos en el presente documento, véanse, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, edición actual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York; Miller y col., Genetic Engineering, 8:277-298 (Plenum Press, edición actual), Wu y col., Methods in Gene Biotechnology (CRC Press, Nueva York, N.Y., edición actual), Recombinant Gene Expression Protocols, en Methods in Molecular Biology, Vol. 62, (Tuan, ed., Humana Press, Totowa, N.J., edición actual) y Current Protocols in Molecular Biology, (Ausubel y col., Eds.,) John Wiley & Sons, NY (edición actual) y las referencias citadas en los mismos.

En consecuencia, la divulgación también proporciona vectores que comprenden ácidos nucleicos de la divulgación y células hospedadoras que comprenden tales vectores. En determinadas realizaciones, el vector es un vector lanzadera. En otras realizaciones, el vector es un vector de expresión (por ejemplo, un vector de expresión bacteriano o eucariota). En determinadas realizaciones, la célula hospedadora es una célula bacteriana. En otras realizaciones, la célula hospedadora es una célula eucariota.

Las células o líneas celulares hospedadoras adecuadas para la expresión de los ácidos nucleicos o vectores recombinantes incluyen células bacterianas. Por ejemplo, diversas cepas de E. coli (por ejemplo, HB101, MC1061) son bien conocidas como células hospedadoras en el campo de la biotecnología. Diversas cepas de B. subtilis, Pseudomonas, Streptomyces, y otros bacilos y similares también pueden emplearse para expresar los ácidos nucleicos o vectores. Alternativamente, un péptido puede expresarse en levaduras, insectos, mamíferos u otros tipos de células, usando procedimientos convencionales. También pueden usarse síntesis in vitro libres de células y/o maquinarias sintéticas mediadas por enzimas.

La divulgación también proporciona un procedimiento para producir un péptido o polipéptido recombinante, que implica transfectar o transformar, por ejemplo, por medios convencionales tales como la electroporación, una célula hospedadora con al menos un vector de expresión que contiene un polinucleótido de la divulgación bajo el control de una secuencia de control de la expresión (por ejemplo, una secuencia reguladora transcripcional). La célula hospedadora transfectada o transformada se cultiva después en condiciones que permitan la expresión del péptido o polipéptido. El péptido o polipéptido expresado se recupera, se aísla y opcionalmente se purifica de la célula (o del medio de cultivo, si se expresa extracelularmente) por medios apropiados conocidos por un experto en la materia, incluyendo cromatografía líquida tales como fase normal o inversa, usando HPLC, FPLC y similares, cromatografía de afinidad, tales como con ligandos inorgánicos o anticuerpos monoclonales, cromatografía de exclusión molecular, cromatografía de quelato metálico inmovilizado, electroforesis en gel y similares. Un experto en la materia puede seleccionar las técnicas de aislamiento y purificación más apropiadas. Un experto en la materia puede determinar la pureza del péptido o polipéptido usando procedimientos convencionales que incluyen, por ejemplo, electroforesis en gel de poliacrilamida (por ejemplo, SDS-PAGE), electroforesis capilar, cromatografía en columna (por ejemplo, cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)), análisis de aminoácidos amino terminales y análisis cuantitativo de aminoácidos.

Procedimientos

En otro aspecto, la divulgación proporciona procedimientos para detectar en una muestra un anticuerpo contra un epítopo de un antígeno de Anaplasma. En una realización, el procedimiento comprende poner en contacto una muestra con un péptido de la divulgación y detectar la formación de un complejo anticuerpo-péptido que comprende dicho péptido, en el que la formación de dicho complejo es indicativa de la presencia de un anticuerpo contra un epítopo de un antígeno de Anaplasma en dicha muestra. En algunas realizaciones, el antígeno de Anaplasma es de una especie de Anaplasma infecciosa, tales como Anaplasma phagocytophilum, Anaplasma platys, o Anaplasma margínale. Otras especies de Anaplasma que han estado implicadas en la anaplasmosis también pueden detectarse usando los procedimientos descritos en el presente documento, con la condición de que induzcan anticuerpos que puedan reaccionar específicamente con un péptido de la divulgación. De esta manera, ha de entenderse que la expresión "Anaplasma patogénico", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier especie de Anaplasma que provoca anaplasmosis en un humano o un animal. En realizaciones particulares, los procedimientos proporcionan la detección de anticuerpos contra antígenos de Anaplasma de múltiples especies en una muestra simultáneamente.

En determinadas realizaciones, el procedimiento para detectar en una muestra un anticuerpo contra un epítopo de un antígeno de Anaplasma comprende poner en contacto la muestra con una población de dos, tres, cuatro o más (por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 o más) péptidos diferentes de la divulgación y detectar la formación de un complejo anticuerpo-péptido que comprende dichos uno o más péptidos en la población, en el que la formación de dicho complejo es indicativa de un anticuerpo contra un epítopo de un antígeno de Anaplasma presente en dicha muestra. Por ejemplo, en una realización particular, el procedimiento comprende poner en contacto la muestra con una población de dos o más péptidos aislados diferentes, en la que cada péptido aislado comprende una secuencia de SEQ ID NO: 3. En otra realización particular, el procedimiento comprende poner en contacto la muestra con una población de dos o más péptidos aislados diferentes, en la que cada péptido aislado comprende una secuencia de SEQ ID NO: 4. En otra realización más, el procedimiento comprende poner en contacto la muestra con una población de dos o más péptidos aislados diferentes, en la que cada péptido aislado comprende una secuencia de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende poner en contacto la muestra con una población de dos o más péptidos aislados diferentes, en la que cada péptido aislado comprende una secuencia de Se Q ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 543. En determinadas realizaciones, el procedimiento comprende poner en contacto la muestra con una mezcla de uno o más péptidos de la divulgación y uno o más péptidos distintos (por ejemplo, un péptido de Ehrlichia o un fragmento antigénico o un epítopo del mismo y/o un péptido de Borrelia o un fragmento antigénico o un epítopo del mismo).

En determinadas realizaciones, el péptido o cada péptido en la población es un péptido aislado (por ejemplo, sintético y/o purificado). En algunas realizaciones, el péptido o la población de péptidos está unido o inmovilizado sobre un soporte sólido. En dichas realizaciones, el soporte sólido es una perla o una pluralidad de perlas (por ejemplo, un nanomaterial metálico tales como una nanopartícula, nanoplaca o nanosfera, una nanopartícula, una perla de látex, etc.), una ruta de flujo en un dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral (por ejemplo, una membrana porosa), una ruta de flujo en un rotor analítico o centrífugo, una transferencia (transferencia Western, transferencia de puntos o transferencia de ranura), un tubo o un pocillo (por ejemplo, en una placa adecuada para un ensayo ELISA) o un sensor (por ejemplo, un sensor electroquímico, óptico u optoelectrónico). En algunas realizaciones, el péptido o población de péptidos está unido a o inmovilizado sobre un soporte sólido a través de una nanocapa metálica que, en algunas realizaciones, puede estar compuesta por cadmio, cinc, mercurio o un metal noble (por ejemplo, oro, plata, cobre y platino). En algunas realizaciones, los péptidos o poblaciones de péptidos de la divulgación se inmovilizan sobre una nanocapa compuesta (por ejemplo que comprende plata y oro) o nanocapas de plata recubiertas de oro.

Existen varios ensayos convencionales diferentes para detectar la formación de un complejo anticuerpo-péptido que comprende un péptido de la divulgación. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la etapa de detección comprende realizar un ELISA o un ensayo de inmunofluorescencia. En otras realizaciones, la etapa de detección comprende realizar un inmunoensayo de flujo lateral. En otras realizaciones, la etapa de detección comprende realizar un ensayo de aglutinación (por ejemplo, un ensayo de hemaglutinación o aglutinación de partículas/perlas). En otras realizaciones más, la etapa de detección comprende hacer girar la muestra en un rotor analítico o centrífugo. En algunas realizaciones, la etapa de detección comprende realizar una transferencia Western, transferencia de ranura o transferencia de puntos. En determinadas realizaciones, la etapa de detección comprende realizar un ensayo de desplazamiento de longitud de onda. Dichos ensayos de desplazamiento de longitud de onda pueden implicar medir o determinar un cambio en la resonancia de plasmón superficial o la longitud de onda de resonancia de plasmón superficial localizada resultante de la unión de anticuerpos a péptidos unidos a nanocapas metálicas o nanopartículas/nanocapas/nanoplacas metálicas. En otras realizaciones, la etapa de detección consiste en realizar una prueba indirecta de anticuerpos fluorescentes. En algunas realizaciones, la prueba indirecta de anticuerpos fluorescentes comprende la reacción de muestras sospechosas de contener anticuerpos contra antígenos de Anaplasma con perlas (por ejemplo, perlas de látex) recubiertas con los péptidos de la divulgación, que se inmovilizan adicionalmente en un portaobjetos de vidrio y posteriormente, hacen reaccionar el portaobjetos con anticuerpos IgG o IgM anti-perro marcados fluorescentemente para detectar anticuerpos anti-Anaplasma unidos. Un ejemplo de prueba indirecta de anticuerpos fluorescentes se describe en el Ejemplo 3. En otras realizaciones más, la etapa de detección comprende analizar la muestra con un sensor electroquímico, óptico u optoelectrónico. Estos ensayos diferentes se describen en el presente documento y/o son bien conocidos por los expertos en la materia.

En una realización, el procedimiento implica detectar la presencia de anticuerpos naturales contra uno o más antígenos de Anaplasma (por ejemplo, el antígeno de un Anaplasma patogénico, tales como A. phagocytophilum, A. platys o A. margínale) que se producen por el sistema inmunitario del sujeto infectado en sus fluidos o tejidos biológicos, y que son capaces de unirse específicamente a un péptido de la divulgación o combinaciones de un péptido de la divulgación y, opcionalmente, uno o más polipéptidos o péptidos antigénicos adicionales adecuados.

Los procedimientos de inmunoensayo adecuados incluyen típicamente: recibir u obtener (por ejemplo, de un paciente) una muestra de fluido corporal o tejido que probablemente contenga anticuerpos; poner en contacto (por ejemplo, incubar o hacer reaccionar) una muestra a ensayar con un péptido o población de péptidos de la divulgación, en condiciones eficaces para la formación de un complejo péptido-anticuerpo específico (por ejemplo, para la unión específica del péptido al anticuerpo); y analizar la muestra puesta en contacto (reaccionada) para detectar la presencia de una reacción anticuerpo-péptido (por ejemplo, determinar la cantidad de un complejo anticuerpo-péptido). La presencia de una cantidad elevada del complejo anticuerpo-péptido indica que el sujeto estuvo expuesto e infectado con una especie de Anaplasma infecciosa. Un péptido, incluyendo una forma modificada del mismo, que "se une específicamente" a (por ejemplo, "es específico para" o se une "preferencialmente" a) un anticuerpo contra un antígeno de Anaplasma interactúa con el anticuerpo, o forma o sufre una asociación física con él, en una cantidad y durante un tiempo suficiente para permitir la detección del anticuerpo. Por "específicamente" o por "preferencialmente", se entiende que el péptido tiene una afinidad más alta (por ejemplo, un grado de selectividad más alto) por dicho anticuerpo que por otros anticuerpos en una muestra. Por ejemplo, el péptido puede tener una afinidad por el anticuerpo de al menos aproximadamente 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces o más que para otros anticuerpos en la muestra. Dicha afinidad o grado de especificidad puede determinarse mediante una diversidad de procedimientos de rutina, incluyendo, por ejemplo, estudios de unión competitiva. En un ensayo de ELISA, una respuesta positiva se define como un valor de 2 o 3 desviaciones estándar mayor que el valor medio de un grupo de controles sanos. En algunas realizaciones, se requiere un ensayo de segundo nivel para proporcionar un serodiagnóstico inequívoco de anaplasmosis.

Las frases tales como "muestra que contiene un anticuerpo" o "detección de un anticuerpo en una muestra" no pretenden excluir muestras o determinaciones (por ejemplo, intentos de detección) en las que no se contiene ni detecta anticuerpo. En un sentido general, esta divulgación implica ensayos para determinar si un anticuerpo producido en respuesta a la infección con una especie de Anaplasma infecciosa está presente en una muestra, independientemente de si se detecta o no.

Las condiciones para hacer reaccionar péptidos y anticuerpos para que reaccionen específicamente son bien conocidas por aquellos expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Current Protocols in Immunology (Coligan y col., editores, John Wiley & Sons, Inc).

Los procedimientos de la divulgación comprenden recibir u obtener una muestra de fluido corporal o tejido que probablemente contenga anticuerpos de un sujeto. Los anticuerpos pueden ser, por ejemplo, de tipo IgG, IgE, IgD, IgM o IgA. Generalmente, se detectan anticuerpos IgM y/o IgA, por ejemplo, para la detección en las primeras etapas de la infección. Los anticuerpos IgG pueden detectarse cuando algunos de los péptidos adicionales discutidos anteriormente se usan en el procedimiento (por ejemplo, péptidos para la detección de proteínas de flagelo). La muestra es preferentemente fácil de obtener y puede ser sangre completa, plasma o suero derivado de una muestra de sangre venosa o incluso de un pinchazo en el dedo. Los tejidos de otras partes del cuerpo u otros fluidos corporales, tales como líquido cefalorraquídeo (LCR), saliva, secreciones gástricas, moco, orina, etc., se sabe que contienen anticuerpos y pueden usarse como fuente de la muestra. La muestra también puede ser un extracto de tejido o un lisado celular.

Una vez que se permite que el péptido o la población de péptidos de la divulgación y el anticuerpo de muestra reaccionen en un medio adecuado, se lleva a cabo un ensayo para determinar la presencia o ausencia de una reacción anticuerpo-péptido. Entre los muchos tipos de ensayos adecuados, que serán evidente para un trabajador calificado, están los ensayos de inmunoprecipitación y aglutinación.

En determinadas realizaciones de la divulgación, el ensayo comprende: inmovilizar el anticuerpo o anticuerpos en la muestra; añadir un péptido o población de péptidos de la divulgación; y detectar el grado de anticuerpo unido al péptido o péptidos, por ejemplo, marcando el péptido o añadiendo una sustancia marcada, tales como un compañero de unión marcado (por ejemplo, estreptavidina-HRP o estreptavidina-complejo de oro coloidal) o un anticuerpo marcado que reconoce específicamente el péptido o péptidos. Véase, por ejemplo, la Figura 2. En otras realizaciones, el ensayo comprende: inmovilizar un péptido o población de péptidos de la divulgación; añadir la muestra que contiene anticuerpos; y detectar la cantidad de anticuerpo unida al péptido o péptidos, por ejemplo, añadiendo otro péptido o población de péptidos de la divulgación conjugados, directa o indirectamente, a un marcador (por ejemplo, nanomaterial metálico tales como nanopartícula, nanoplaca o nanosfera, marcador fluorescente, enzima (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina)) o mediante la adición de una sustancia marcada, tales como un compañero de unión o un anticuerpo marcado que reconoce específicamente los anticuerpos de la muestra (por ejemplo, anticuerpos IgG antihumano, anticuerpos IgM antihumano, anticuerpos IgG anti-perro, anticuerpos IgM anti perro, anticuerpos IgG anti-gato, anticuerpos IgM anti-gato, proteína A, proteína G, proteínas de fusión de proteína A/G, proteína L, o combinaciones de los mismos, etc.). Véanse, por ejemplo, las Figuras 1, 3 y 4.

En otras realizaciones, el ensayo comprende: inmovilizar un péptido o población de péptidos de la divulgación; añadir la muestra que contiene anticuerpos; y detectar la cantidad de anticuerpo unida al péptido o péptidos, por ejemplo, mediante la adición de un primer compañero de unión que reconoce específicamente los anticuerpos de la muestra (por ejemplo, anticuerpos IgG antihumano, anticuerpos IgM antihumano, anticuerpos IgG anti-perro, anticuerpos IgM anti-perro, anticuerpos IgG anti-gato, anticuerpos IgM anti-gato, proteína A, proteína G, proteínas de fusión de proteína A/G, proteína L, etc.) y mediante la adición adicional de un segundo compañero de unión (por ejemplo, proteína A, proteína G, proteínas de fusión de proteína A/G, proteína L, etc.), en el que el segundo compañero de unión está marcado y reconoce dicho primer compañero de unión. En otras realizaciones más, el ensayo comprende: hacer reaccionar el péptido o la población de péptidos y la muestra que contiene anticuerpos sin que ninguno de los reactivos se inmovilice y después detectar la cantidad de complejos de anticuerpo y péptido o péptidos, por ejemplo, marcando el péptido o añadiendo una sustancia marcada, tales como un compañero de unión marcado (por ejemplo, estreptavidina-HRP o estreptavidina-complejo de oro coloidal) o un anticuerpo marcado que reconoce específicamente el péptido.

La inmovilización de un péptido o una población de péptidos de la divulgación puede ser covalente o no covalente y la inmovilización no covalente puede ser no específica (por ejemplo, unión no específica a una superficie de poliestireno en, por ejemplo, un pocillo de microtitulación). La unión específica o semi-específica a un vehículo sólido o semisólido, soporte o superficie, puede lograrse por el péptido que tiene, asociado a él, un resto que permite su unión covalente o no covalente al vehículo sólido o semisólido, soporte o superficie. Por ejemplo, el resto puede tener afinidad con un componente unido al vehículo, soporte o superficie. En este caso, el resto puede ser, por ejemplo, un grupo biotina o biotinilo o un análogo del mismo unido a un grupo aminoacídico del péptido, tales como ácido 6-aminohexanoico, y el componente es entonces avidina, estreptavidina, neutravidina, o un análogo de las mismas. Una alternativa es una situación en la que el resto es una etiqueta de histidina (por ejemplo, seis aminoácidos histidina consecutivos) y el vehículo comprende un derivado de ácido nitrilotriacético (NTA) cargado con iones Ni++ o Co++. En determinadas realizaciones, el resto es un compañero de fusión, por ejemplo, BSA. En realizaciones ejemplares, los péptidos de la divulgación pueden conjugarse con BSA a través de restos N-terminales y/o C-terminales de los péptidos. En una realización, uno, dos, tres, cuatro, cinco, 10, 15, 20, 25, 30 o más péptidos de la divulgación pueden estar sustituidos en, por ejemplo, conjugados con BSA. Como comprenderá un experto en la materia, los niveles de sustitución pueden afectar la sensibilidad del ensayo. Se necesitan concentraciones más bajas de BSA altamente sustituido para lograr la sensibilidad que ofrecen las altas concentraciones de péptido BSA que contienen menos moléculas de péptido. En determinadas realizaciones distintas, el compañero de fusión puede ser MAPS. En determinadas realizaciones ejemplares, MAPS pueden consistir en 4, 8 o más ramas asimétricas.

Los vehículos, soportes y superficies adecuados incluyen, pero no se limitan a, nanocapas metálicas, perlas (por ejemplo, perlas magnéticas, partículas coloidales o nanomateriales metálicos, tales como nanopartículas metálicas, nanoplacas o nanosferas, tales como oro coloidal, o partículas o nanopartículas que comprenden sílice, látex, poliestireno, policarbonato o PDVF), látex o copolímeros tales como estireno-divinilbenceno, estireno-divinilbenceno hidroxilado, poliestireno, poliestireno carboxilado, perlas de negro de carbono, vidrio no activado o de poliestireno o activado de cloruro de polivinilo, vidrio magnético poroso activado con epoxi, partículas de gelatina o polisacárido u otras partículas de proteínas, células rojas de la sangre, anticuerpos mono o policlonales o fragmentos Fab de dichos anticuerpos.

Los protocolos para inmunoensayos que usan antígenos para la detección de anticuerpos específicos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede usarse un ensayo sándwich convencional o puede usarse un formato de ensayo competitivo convencional. Para una discusión de algunos tipos adecuados de ensayos, véase Current Protocols in Immunology (supra). En determinadas realizaciones, un péptido o población de péptidos de la divulgación se inmoviliza sobre una superficie o vehículo sólido o semisólido mediante unión covalente o no covalente, antes o después de la adición de la muestra que contiene el anticuerpo.

Los dispositivos para realizar ensayos de unión específicos, especialmente inmunoensayos, son conocidos y pueden adaptarse fácilmente para su uso en los presentes procedimientos. Los ensayos en fase sólida, en general, son más fáciles de realizar que los procedimientos de ensayo heterogéneos que requieren una etapa de separación, tales como precipitación, centrifugación, filtración, cromatografía o magnetismo, porque la separación de reactivos es más rápida y sencilla. Los dispositivos de ensayo en fase sólida incluyen placas de microtitulación, dispositivos de ensayo de flujo continuo (por ejemplo, dispositivos de inmunoensayo de flujo lateral), tiras reactivas y dispositivos inmunocapilares o inmunocromatográficos.

En realizaciones de la divulgación, la superficie o soporte sólido o semisólido es el suelo o la pared en un pocillo de microtitulación, una superficie o membrana de filtro (por ejemplo, una membrana de nitrocelulosa o una membrana de PVDF (fluoruro de polivinilideno), tales como una membrana Immobilon™), membrana de polietileno tales como la membrana Porex®, una fibra hueca, un medio cromatográfico con perlas (por ejemplo, un gel de agarosa o poliacrilamida), una perla magnética, una matriz fibrosa de celulosa, una matriz de HPLC, una matriz de FPLC, una sustancia que tiene moléculas de un tamaño tal que las moléculas con el péptido unido a las mismas, cuando se disuelve o se dispersa en una fase líquida, puede retenerse por medio de un filtro, una sustancia capaz de formar micelas o participar en la formación de micelas que permite cambiar o intercambiar una fase líquida sin arrastrar las micelas, un polímero hidrosoluble o cualquier otro vehículo, soporte o superficie adecuados.

En algunas realizaciones de la divulgación, el péptido está provisto de (por ejemplo, conjugado a) una etiqueta adecuada que permite la detección. Pueden usarse marcadores convencionales que sean capaces, solos o en concierto con otras composiciones o compuestos, de proporcionar una señal detectable. Los marcadores adecuados incluyen, pero no se limitan a, enzimas (por ejemplo, HRP, beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina, etc.), marcadores fluorescentes, puntos cuánticos, marcadores radiactivos, partículas de látex coloreadas y marcadores conjugados con metal (por ejemplo, nanocapas metálicas, marcadores conjugados con nanomateriales metálicos). Los nanomateriales metálicos adecuados incluyen, pero no se limitan a, nanopartículas metálicas, nanoplacas metálicas y nanosferas metálicas. Los marcadores de nanomateriales metálicos adecuados incluyen, pero no se limitan a, partículas o nanoplacas de oro, partículas o nanoplacas de plata, partículas o nanoplacas de cobre, partículas o nanoplacas de platino, partículas o nanoplacas de paladio, partículas o nanoplacas de cadmio, partículas o nanoplacas de composite, esferas huecas de oro, nanosferas de sílice recubiertas de oro y cáscaras de oro recubiertas de sílice. Las nanocapas metálicas adecuadas para capas detectables incluyen nanocapas comprendidas por cadmio, cinc, mercurio y metales nobles, tales como oro, plata, cobre y platino. En algunas realizaciones, las nanocapas metálicas comprenden nanocapas de composite de oro-plata o plata recubiertas con oro.

Los procedimientos de detección adecuados incluyen, por ejemplo, detección de un agente que está etiquetado, directa o indirectamente, con un ensayo colorimétrico (por ejemplo, para la detección de HRP o actividad betagalactosidasa), inspección visual usando microscopía óptica, microscopía de inmunofluorescencia, incluyendo microscopía confocal, o por citometría de flujo (FACS), autorradiografía (por ejemplo, para la detección de un agente marcado radiactivamente), microscopía electrónica, inmunotinción, fraccionamiento subcelular o similares. En una realización, un elemento radiactivo (por ejemplo, un aminoácido radiactivo) se incorpora directamente en una cadena peptídica; en otra realización, un marcador fluorescente se asocia a un péptido a través de la interacción biotina/avidina, asociación a un anticuerpo conjugado con fluoresceína, o similares. En una realización, se añade un compañero de unión específico detectable para el anticuerpo a la mezcla. Por ejemplo, el compañero de unión puede ser un anticuerpo secundario detectable u otro agente de unión (por ejemplo, proteína A, proteína G, proteína L o combinaciones de las mismas) que se une al primer anticuerpo. Este anticuerpo secundario u otro agente de unión puede marcarse, por ejemplo, con un marcador radioactivo, enzimático, fluorescente, punto cuántico, luminiscente, nanomaterial metálico tales como una nanopartícula metálica, nanoplaca metálica o nanocapa metálica (por ejemplo, oro coloidal) u otro marcador detectable, tales como un sistema de avidina/biotina. En otra realización, el compañero de unión es un péptido o población de péptidos de la divulgación, que puede conjugarse directa o indirectamente (por ejemplo, a través de la interacción biotina/avidina) a una enzima, tales como peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina u otro resto de señalización. En dichas realizaciones, la señal detectable se produce al añadir un sustrato de la enzima que produce una señal detectable, tales como un sustrato cromogénico, fluorogénico o quimioluminiscente.

Un "sistema de detección" para detectar péptidos unidos, como se usa en el presente documento, puede comprender un compañero de unión detectable, tales como un anticuerpo específico para el péptido. En una realización, el compañero de unión se marca directamente. En otra realización, el compañero de unión se fija a un reactivo generador de señal, tales como una enzima que, en presencia de un sustrato adecuado, puede producir una señal detectable. Una superficie para inmovilizar el péptido puede acompañar opcionalmente al sistema de detección.

En algunas realizaciones de la divulgación, el procedimiento de detección comprende inspeccionar visiblemente el complejo anticuerpo-péptido para un cambio de color, o inspeccionar el complejo anticuerpo-péptido para un cambio físico-químico. Pueden producirse cambios físico-químicos con reacciones de oxidación u otras reacciones químicas. Pueden detectarse a simple vista, usando un espectrofotómetro, o similares.

Un formato de ensayo particularmente útil es un formato de inmunoensayo de flujo lateral. Los anticuerpos contra inmunoglobulinas humanas o animales (por ejemplo, perro, ratón, ciervo, etc.) o proteínas staph A, G o L, pueden marcarse con un generador de señal o indicador (por ejemplo, oro coloidal) que se seca y se coloca en una almohadilla de fibra de vidrio (almohadilla de aplicación de muestra o almohadilla conjugada). El péptido de diagnóstico o la población de péptidos de la divulgación se inmoviliza en la membrana, tales como nitrocelulosa o una membrana de PVDF (fluoruro de polivinilideno) (por ejemplo, una membrana Immobilon™). Cuando una solución de muestra (sangre, suero, etc.) se aplica a la almohadilla de aplicación de muestra (o fluye a través de la almohadilla conjugada), disuelve el indicador marcado, que después se une a todos los anticuerpos en la muestra. Los complejos resultantes se transportan a la siguiente membrana (PVDF o nitrocelulosa que contiene el péptido de diagnóstico) por acción capilar. Si los anticuerpos contra el péptido de diagnóstico o la población de péptidos están presentes en la muestra, se unen al péptido de diagnóstico o población de péptidos rayados en la membrana, generando así una señal (por ejemplo, una banda que puede verse o visualizarse). Puede usarse un anticuerpo adicional específico para el anticuerpo marcado o un segundo anticuerpo marcado para producir una señal de control.

Un formato alternativo para el inmunoensayo de flujo lateral comprende los péptidos o composiciones de la divulgación que se conjugan con un ligando (por ejemplo, biotina) y se complejan con el receptor de ligando marcado (por ejemplo, estreptavidina-oro coloidal). Los complejos peptídicos marcados pueden colocarse en la almohadilla de aplicación de muestra o en la almohadilla conjugada. Los anticuerpos IgG/IgM antihumanos o IgG/IgM anti-animales (por ejemplo, perro, ratón, ciervo) u otros péptidos de la divulgación se inmovilizan en una membrana, tales como nitrocelulosa o PVDF, o membrana Porex® en un sitio de prueba (por ejemplo, una línea de prueba). Cuando la muestra se añade a la almohadilla de aplicación de muestra, los anticuerpos en la muestra reaccionan con los complejos peptídicos marcados de tal manera que los anticuerpos que se unen a los péptidos de la divulgación se marcan indirectamente. Los anticuerpos en la muestra se transportan a la siguiente membrana (PVDF, membrana Porex® o nitrocelulosa que contiene el péptido de diagnóstico) por acción capilar y se unen a los anticuerpos inmovilizados IgG/IgM antihumano o IgG/IgM anti-animal (o proteína A, proteína G, proteínas de fusión de proteína A/G, proteína L, o combinaciones de las mismas) o péptidos inmovilizados de la divulgación. Si alguno de los anticuerpos de la muestra está unido a los péptidos marcados de la divulgación, el marcador asociado a los péptidos puede verse o visualizarse en el sitio de prueba. Otra realización de este tipo de dispositivo de flujo lateral en el que los péptidos de la divulgación se usan tanto como agente de captura inmovilizado en un sitio de prueba y como complejo marcado soluble para reaccionar con anticuerpos en una muestra se muestra en la Figura 1. En dichas realizaciones, para amplificar la señal de detección, proteína A, proteína G y/o proteínas de fusión de proteína A/G conjugadas con un marcador detectable (por ejemplo, nanomateriales metálicos tales como nanopartículas, nanoplaca o nanosfera, HRP, p-GAL, ALP, fluoróforo, partícula de látex coloreada o puntos cuánticos) pueden aplicarse al sitio de prueba en el que se unirán a la región Fc de cualquier anticuerpo contra antígenos de Anaplasma capturados por los péptidos inmovilizados. Los controles adecuados para este ensayo pueden incluir, por ejemplo, un conjugado de oro coloidal IgY de pollo ubicado en la almohadilla de aplicación de muestra o almohadilla conjugada, y un anticuerpo IgY anti-pollo inmovilizado en un sitio de control ubicado próximo al sitio de prueba. La anti-proteína A de pollo también puede usarse como línea de control de procedimiento.

Otro ensayo para la detección de productos sanguíneos u otros fluidos fisiológicos o biológicos es un ensayo inmunosorbente ligado a enzimas, es decir, un ELISA. Típicamente en un ELISA, péptidos aislados o mezclas o poblaciones de péptidos de la divulgación se adsorben en la superficie de un pocillo de microtitulación directamente o a través de una matriz de captura (por ejemplo, un anticuerpo). Los sitios de unión a proteínas no específicos residuales en la superficie se bloquean con un agente apropiado, tales como albúmina de suero bovino (BSA), suero de cabra normal (NGS) inactivado por calor o tampón de bloqueo BLOTTO (una solución tamponada de leche en polvo sin grasa que también contiene un conservante, sales y un agente antiespumante, disponible de Thermo Scientific como Blocker™ BLOTTO). El pocillo después se incuba con una muestra biológica sospechosa de contener anticuerpo específico anti-Anaplasma (por ejemplo, anti-A. phagocytophilum o anti-A. platys). La muestra puede aplicarse limpia, o más a menudo puede diluirse, generalmente en una solución tamponada que contiene una pequeña cantidad (0,1 5,0 % en peso) de proteína, tales como BSA, NGS o BLOTTO. Después de incubar durante un período de tiempo suficiente para permitir que se produzca una unión específica, el pocillo se lava para retirar la proteína no unida y después se incuba con una concentración óptima de un anticuerpo anti-inmunoglobulina apropiado (por ejemplo, para sujetos humanos, una inmunoglobulina antihumana (aHuIg) de otro animal, tales como perro, ratón, vaca, etc.) u otro péptido o población de péptidos que se conjuga con una enzima u otro marcador mediante procedimientos convencionales y se disuelve en tampón de bloqueo. El marcador puede elegirse de una diversidad de enzimas, incluyendo peroxidasa de rábano picante (HRP), beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina (ALP), glucosa oxidasa, p-GAL, etc. Se permite tiempo suficiente para que vuelva a producirse una unión específica, después el pocillo se lava nuevamente para retirar el conjugado no unido y se añade un sustrato adecuado para la enzima. Se permite que se desarrolle el color y la densidad óptica de los contenidos del pocillo se determina visual o instrumentalmente (medida a una longitud de onda apropiada). El valor de corte de DO puede definirse como la media de desviaciones estándar de DO+3 (SD) de al menos 5o muestras de suero recolectadas de individuos de un área en la que la anaplasmosis no es endémica, o por otras definiciones convencionales tales. En el caso de un ensayo muy específico, DO+2 SD puede usarse como valor de corte.

En una realización de un ELISA, un péptido o población de péptidos de la divulgación se inmoviliza en una superficie, tales como una placa ELISA de noventa y seis pocillos o una fase sólida equivalente que está recubierta con estreptavidina o un compuesto de unión a biotina equivalente, tales como avidina o neutravidina, a una concentración óptima en un tampón de recubrimiento alcalino e incubado a 4 °C durante la noche. Después de un número adecuado de lavados con tampones de lavado convencionales, una concentración óptima de una forma biotinilada de un péptido o composición, disuelto en un tampón de bloqueo convencional, se aplica a cada pocillo. Después se añade una muestra y el ensayo continúa como anteriormente. Las condiciones para realizar ensayos ELISA son bien conocidas en la técnica.

En otra realización de un ELISA, un péptido o población de péptidos de la divulgación se inmoviliza en una superficie, tales como una placa ELISA de noventa y seis pocillos o una fase sólida equivalente a través de un compañero de fusión, por ejemplo, BSA o MAPS. Después se añade una muestra y el ensayo continúa como anteriormente.

Un formato alternativo para el ensayo ELISA presenta el péptido o péptidos de la divulgación que se unen (por ejemplo, se fusionan) a una enzima apropiada, tales como HRP. Las etapas para llevar a cabo tal ELISA incluyen: revestir los pocillos de una placa con IgG/IgM anti-perro, anti-gato o antihumano; incubar muestras sospechosas de contener anticuerpos contra los péptidos de la divulgación con las IgG/IgM anti-especies inmovilizadas; retirar la muestra sin reaccionar y lavar los pocillos con un tampón de lavado adecuado; aplicar el péptido o la población de péptidos acoplados a enzima (por ejemplo, acoplados a HRP) de la divulgación y permitirlo reaccionar con cualquier anticuerpo anti-Anaplasma capturado; y visualizar el péptido acoplado a enzima aplicando un sustrato enzimático apropiado (por ejemplo, TMB).

En otra realización, los procedimientos comprenden un ensayo de aglutinación. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, nanopartículas metálicas, nanoplacas metálicas o nanosferas metálicas (por ejemplo, oro coloidal, etc.) o perlas de látex se conjugan con péptidos o composiciones de la divulgación. Posteriormente, el fluido biológico se incuba con el conjugado perla/péptido, formando de esta manera una mezcla de reacción. La mezcla de reacción se analiza después para determinar la presencia de los anticuerpos. En determinadas realizaciones, los ensayos de aglutinación comprenden el uso de una segunda población de partículas, tales como nanopartículas metálicas, nanoplacas metálicas o nanosferas metálicas (por ejemplo, oro coloidal, etc.) o perlas de látex, conjugado con (1) anticuerpos específicos para los péptidos o composiciones de la divulgación, en el caso de un ensayo de competición, o (2) anticuerpos capaces de detectar muestras de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos IgG o IgM antihumano, anticuerpos IgG o IgM anti-perro, anticuerpos IgG o IgM anti-gato, etc.), en el caso de un ensayo sándwich. Los procedimientos de aglutinación adecuados pueden comprender la centrifugación como un medio para evaluar el grado de aglutinación.

En otras realizaciones más, el péptido o las composiciones de la divulgación se someten a electro-transferencia o transferencia de puntos sobre papel de nitrocelulosa. Posteriormente, una muestra, tales como un fluido biológico (por ejemplo, suero o plasma) se incuba con el antígeno transferido, y se permite que el anticuerpo en el fluido biológico se una al antígeno o antígenos. El anticuerpo unido puede entonces detectarse, por ejemplo, por procedimientos inmunoenzimáticos convencionales o por visualización usando nanomateriales metálicos tales como nanopartículas, nanoplacas o nanosferas acopladas a anticuerpos secundarios u otros agentes de unión a anticuerpos, tales como proteína A, proteína G, proteínas de fusión de proteína A/G, proteína L o combinaciones de los mismos.

Un experto en la materia debe entender que cualquier número de formatos convencionales de análisis de proteínas, particularmente formatos de inmunoensayo, puede diseñarse para utilizar los péptidos aislados o poblaciones de péptidos de esta divulgación para la detección de anticuerpos de Anaplasma e infección por Anaplasma patogénicos (por ejemplo, A. phagocytophilum, A. platys, o A. margínale) en un sujeto. Por lo tanto esta divulgación no está limitada por la selección del formato de ensayo particular, y se cree que abarca formatos de ensayo que son conocidos por aquellos expertos en la materia.

En determinadas realizaciones, la muestra usada en los procedimientos es un fluido corporal, tales como sangre, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, orina o saliva. En otras realizaciones, la muestra es un tejido (por ejemplo, un homogeneizado de tejido) o un lisado celular. En determinadas realizaciones, la muestra es de un animal salvaje (por ejemplo, un ciervo o un roedor, tales como un ratón, ardillas listadas, ardillas, etc.). En otras realizaciones, la muestra es de un animal de laboratorio (por ejemplo, un ratón, una rata, una cobaya, un conejo, un mono, un primate, etc.). En otras realizaciones, la muestra es de un animal domesticado o salvaje (por ejemplo, un perro, un gato, un caballo). En otras realizaciones más, la muestra es de un ser humano.

Gran parte de la discusión anterior está dirigida a la detección de anticuerpos contra Anaplasma patogénicos. Sin embargo, debe entenderse que la discusión también se aplica a la detección de linfocitos T sensibilizados, ya sea in vitro o in vivo.

Se espera que se genere una respuesta inmune mediada por células (por ejemplo, una respuesta T-ayudante), desde que se produce IgG. Por lo tanto, se espera que sea posible determinar la reactividad inmunológica entre los linfocitos T sensibilizados y un péptido de la divulgación. Esto puede hacerse in vitro incubando linfocitos T aislados del sujeto con un péptido o población de péptidos de la divulgación y midiendo la inmunoreactividad, por ejemplo, midiendo la posterior proliferación de linfocitos T o midiendo la liberación de citocinas de los linfocitos T, tales como IFN-y. Estos procedimientos son bien conocidos en la técnica.

Cuando se lleva a cabo un procedimiento de la divulgación in vivo, puede usarse cualquiera de una diversidad de ensayos convencionales. Por ejemplo, uno puede realizar un ensayo en forma de prueba cutánea, por ejemplo, mediante inyección intradérmica, en el sujeto, de un péptido o población de péptidos de la divulgación. Una reacción cutánea positiva en el lugar de la inyección indica que el sujeto ha estado expuesto e infectado con una especie de Anaplasma patogénica capaz de provocar anaplasmosis, y una respuesta negativa de la piel en el lugar de la inyección indica que el sujeto no ha estado tan expuesto/infectado. Esta u otras pruebas in vivo se basan en la detección de una respuesta de linfocitos T en el sujeto.

La presente divulgación también proporciona un procedimiento para diagnosticar la anaplasmosis en un sujeto. La anaplasmosis en humanos se conocía anteriormente como ehrlichiosis granulocítica humana y recientemente se ha denominado anaplasmosis granulocítica humana. Algunas cepas de Anaplamsa (por ejemplo, A. platys) provocan trombocitopenia cíclica en animales (por ejemplo, en perros, la enfermedad se denomina trombocitopenia cíclica canina infecciosa (ICCT)). De esta manera, La divulgación también proporciona un procedimiento para diagnosticar trombocitopenia cíclica o ICCT en un sujeto. El sujeto puede ser un sujeto sospechoso de tener anticuerpos contra un agente causante de anaplasmosis o trombocitopenia cíclica. El procedimiento de diagnóstico es útil para diagnosticar sujetos que presentan síntomas clínicos de anaplasmosis o trombocitopenia cíclica. Los síntomas clínicos de anaplasmosis humana (es decir, anaplasmosis granulocítica humana) incluyen, entre otros, fiebre, dolor de cabeza, malestar general, escalofríos, mialgia, dolor abdominal, tos, confusión, trombocitopenia, leucopenia y niveles elevados de transaminasas séricas. Los síntomas clínicos de anaplasmosis o trombocitopenia cíclica en animales (por ejemplo, caninos) incluyen, pero no se limitan a, anemia profunda, taquicardia, disnea, diarrea, anorexia, pérdida de peso, ataxia, leucopenia, letargia, linfadenomegalia, membranas mucosas pálidas, fiebre, secreción nasal mucopurulenta, inapetencia, extremidades débiles o dolorosas y cojera.

En algunas realizaciones, los procedimientos comprenden poner en contacto una muestra del sujeto con un péptido de la divulgación y detectar la formación de un complejo anticuerpo-péptido que comprende dicho péptido, en los que la formación de dicho complejo es indicativo de que el sujeto tiene anaplasmosis o trombocitopenia cíclica. En determinadas realizaciones, los procedimientos comprenden poner en contacto la muestra con una población de dos, tres, cuatro o más (por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 o más) péptidos diferentes de la divulgación y detectar la formación de un complejo anticuerpo-péptido que comprende dichos uno o más péptidos en la población, en los que la formación del complejo es indicativo de que el sujeto tiene anaplasmosis o trombocitopenia cíclica. Por ejemplo, en una realización particular, los procedimientos comprenden poner en contacto la muestra con una población de dos o más péptidos aislados diferentes, en la que cada péptido aislado comprende una secuencia de SEQ ID NO: 1. En otra realización particular, los procedimientos comprenden poner en contacto la muestra con una población de dos o más péptidos aislados diferentes, en la que cada péptido aislado comprende una secuencia de SEQ ID NO: 3. En otra realización más, los procedimientos comprenden poner en contacto la muestra con una población de dos o más péptidos aislados diferentes, en la que cada péptido aislado comprende una secuencia de SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, los procedimientos comprenden poner en contacto la muestra con una población de dos o más péptidos aislados diferentes, en la que cada péptido aislado comprende una secuencia de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 543.

En determinadas realizaciones, los procedimientos comprenden poner en contacto la muestra con una mezcla de uno o más péptidos de la divulgación y uno o más péptidos distintos (por ejemplo, un péptido de Ehrlichia o un fragmento antigénico o un epítopo del mismo o un péptido de Borrelia o un fragmento antigénico o un epítopo del mismo). Las coinfecciones con especies de Anaplasma y Ehrlichia o Borrelia son comunes. De esta manera, los procedimientos de diagnóstico descritos en el presente documento que emplean poblaciones de péptidos que comprenden los péptidos de Anaplasma descritos en el presente documento y uno o más péptidos de una especie de Ehrlichia o Borrelia son útiles para detectar tales coinfecciones. Los péptidos antigénicos de Ehrlichia ejemplares que pueden usarse con los péptidos de Anaplasma de la divulgación se describen en la Solicitud de EE.UU. N.° 14/052.296 y la Patente de EE.UU. N.° 8.828.675. Los péptidos antigénicos de Borrelia ejemplares que pueden usarse con los péptidos de Anaplasma de la divulgación se describen en las Patentes de EE.UU. N.° 8.568.989 y 8.758.772. Otros antígenos de Ehrlichia y Borrelia se conocen en la técnica y pueden usarse en combinación con los péptidos de Anaplasma de la divulgación para detectar coinfecciones en un sujeto.

En determinadas realizaciones, el péptido o cada péptido en la población es un péptido aislado (por ejemplo, sintético y/o purificado). En algunas realizaciones, el péptido o población de péptidos diferentes está unido o inmovilizado sobre un sustrato (por ejemplo, un soporte sólido o semisólido). Por ejemplo, en determinadas realizaciones, el sustrato es una perla o una pluralidad de perlas (por ejemplo, una coloidal u otro tipo de partículas o nanomateriales metálicos tales como nanopartícula, nanoplaca o nanosfera), una ruta de flujo en un dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral (por ejemplo, una membrana porosa), una ruta de flujo en un rotor analítico o centrífugo, una transferencia (por ejemplo, una transferencia Western, una transferencia de puntos o una transferencia de ranura), un tubo o un pocillo (por ejemplo, en una placa adecuada para un ensayo ELISA) o un sensor (por ejemplo, un sensor electroquímico, óptico u opto-electrónico). En algunas realizaciones, el péptido o población de péptidos está unido a o inmovilizado sobre un soporte sólido a través de una nanocapa metálica que, en algunas realizaciones, puede estar compuesta por cadmio, cinc, mercurio o un metal noble (por ejemplo, oro, plata, cobre y platino).

Existen varios ensayos convencionales diferentes para detectar la formación de un complejo anticuerpo-péptido que comprende un péptido de la divulgación. Por ejemplo, la etapa de detección puede comprender realizar un ensayo ELISA, realizar un inmunoensayo de flujo lateral, realizar un ensayo de aglutinación, realizar un ensayo de desplazamiento de longitud de onda, analizar la muestra usando una transferencia Western, una transferencia de ranura o transferencia de puntos, realizar una prueba indirecta de anticuerpos fluorescentes, analizar la muestra en un rotor analítico o centrífugo, o analizar la muestra con un sensor electroquímico, óptico u opto-electrónico. Estos ensayos diferentes se describen anteriormente y/o son bien conocidos por los expertos en la materia.

En determinadas realizaciones, la muestra usada en los procedimientos de diagnóstico de la divulgación es un fluido corporal, tales como sangre, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, orina o saliva. En otras realizaciones, la muestra es un tejido (por ejemplo, un homogeneizado de tejido) o un lisado celular. En determinadas realizaciones, el sujeto es un animal salvaje (por ejemplo, un ciervo o un roedor, tales como un ratón, ardillas listadas, ardillas, etc.). En otras realizaciones, el sujeto es un animal de laboratorio (por ejemplo, un ratón, una rata, una cobaya, un conejo, un mono, un primate, etc.). En otras realizaciones, el sujeto es un animal domesticado o salvaje (por ejemplo, un perro, un gato, un caballo). En otras realizaciones más, el sujeto es un ser humano.

La presente divulgación también incluye un procedimiento para identificar las especies de Anaplasma que infectan a un sujeto. Tales procedimientos ayudan en el tratamiento de la infección en el sujeto porque los regímenes de tratamiento pueden diferir dependiendo de la especie particular de Anaplasma que provoca la infección. Los procedimientos de identificación de especies también son útiles en la epidemiología de infecciones de Anaplasma y anaplasmosis. En determinadas realizaciones, el procedimiento distingue entre infecciones provocadas por A. phagocytophilum e infecciones provocadas por A. platys. En una realización, el procedimiento comprende poner en contacto una muestra del sujeto con un primer péptido o población de péptidos aislados y un segundo péptido o población de péptidos aislados, en el que el primer péptido o población de péptidos aislados se une específicamente a anticuerpos contra antígenos de múltiples especies de Anaplasma y en el que el segundo péptido o población de péptidos aislados se une específicamente a anticuerpos contra antígenos de una sola especie de Anaplasma. Se detecta la formación de un primer complejo anticuerpo-péptido que comprende dicho primer péptido o uno o más péptidos en la primera población y la formación de un segundo complejo anticuerpo-péptido que comprende dicho segundo péptido o uno o más péptidos en la segunda población, en los que la formación del primer y segundo complejos anticuerpo-péptido indica que el sujeto está infectado con la especie Anaplasma que está unida específicamente por el segundo péptido o población de péptidos aislados.

En algunas realizaciones, el primer péptido o la primera población de péptidos se une específicamente a anticuerpos contra antígenos de A. phagocytophilum, A. platys, y A. margínale. En determinadas realizaciones, el primer péptido o la primera población de péptidos se une específicamente a anticuerpos contra antígenos de ambos A. phagocytophilum y A. platys. Por ejemplo, en una realización, el primer péptido comprende una secuencia de SEQ ID NO: 3. En otra realización, la primera población de péptidos comprende tres o más péptidos diferentes, en la que cada péptido en la población comprende una secuencia de SEQ ID NO: 3 o un fragmento de la misma. En dichas realizaciones, la primera población de péptidos puede comprender tres o más péptidos listados en la Tabla 3 (es decir, tres o más péptidos que comprenden o consisten en secuencias de SEQ ID NO: 199-350).

En determinadas realizaciones, el segundo péptido o la segunda población de péptidos se une específicamente a anticuerpos contra antígenos de A. platys. Por ejemplo, en una realización, el segundo péptido comprende una secuencia de SEQ ID NO: 4. En otra realización, la segunda población de péptidos comprende tres o más péptidos diferentes, en la que cada péptido en la población comprende una secuencia de SEQ ID NO: 4 o un fragmento de la misma. En dichas realizaciones, la primera población de péptidos puede comprender tres o más péptidos listados en la Tabla 4 (es decir, tres o más péptidos que comprenden o consisten en secuencias de SEQ ID NO: 351-398). En otras realizaciones, el segundo péptido o la segunda población de péptidos pueden comprender una secuencia de SEQ ID NO. 6-8. En realizaciones relacionadas, la segunda población de péptidos comprende tres o más péptidos diferentes listados en las Tablas 6 o 7 (es decir, tres o más péptidos que comprenden o consisten en secuencias de SEQ ID NO: 407-464).

En tales realizaciones en las que el segundo péptido o la segunda población de péptidos se une específicamente a anticuerpos contra antígenos de A. platys, la formación del primer y segundo complejos anticuerpo-péptido indica que el sujeto está infectado con A. platys. En realizaciones relacionadas, la formación del primer complejo anticuerpopéptido, pero no el segundo complejo anticuerpo-péptido indica que el sujeto está infectado con A. phagocytophilum.

Por ejemplo, en determinadas realizaciones, la primera población de péptidos aislados se define por SEQ ID NO: 3 y la segunda población de péptidos aislados se define por SEQ ID NO: 4 y se detecta la formación del primer y el segundo complejos anticuerpo-péptido indicando que el sujeto está infectado con A. platys. En otras realizaciones, la primera población de péptidos aislados se define por SEQ ID NO: 3 y la segunda población de péptidos aislados se define por una cualquiera de SEQ ID NO: 6 a 8 y se detecta la formación del primer y segundo complejos anticuerpopéptido indicando que el sujeto está infectado con A. platys. En algunas realizaciones, la primera población de péptidos aislados se define por SEQ ID NO: 3 y la segunda población de péptidos aislados se define por SEQ ID NO: 4, y la formación del primer complejo anticuerpo-péptido, pero no se detecta el segundo complejo anticuerpo-péptido indicando que el sujeto está infectado con A. phagocytophilum. En otras realizaciones, la primera población de péptidos aislados se define por SEQ ID NO: 3 y la segunda población de péptidos aislados se define por una cualquiera de SEQ ID NO: 6 a 8 y la formación del primer complejo anticuerpo-péptido, pero no se detecta el segundo complejo anticuerpo-péptido indicando que el sujeto está infectado con A. phagocytophilum.

En realizaciones alternativas, el segundo péptido o la segunda población de péptidos se une específicamente a anticuerpos contra antígenos de A. phagocytophilum. Por ejemplo, en una realización, el segundo péptido comprende una secuencia de SEQ ID NO: 1. En otra realización, la segunda población de péptidos comprende tres o más péptidos diferentes, en la que cada péptido en la población comprende una secuencia de SEQ ID NO: 1 o un fragmento de la misma. En dichas realizaciones, la primera población de péptidos puede comprender tres o más péptidos listados en la Tabla 1 (es decir, tres o más péptidos que comprenden o consisten en secuencias de SEQ ID NO: 10-117). En otras realizaciones, el segundo péptido o la segunda población de péptidos pueden comprender una secuencia de SEQ ID NO. 2, 5 o 9. En realizaciones relacionadas, la segunda población de péptidos comprende tres o más péptidos diferentes listados en las Tablas 2, 5 u 8 (es decir, tres o más péptidos que comprenden o consisten en secuencias de SEQ ID NO: 118-198, 399-406 o 465-542).

En tales realizaciones en las que el segundo péptido o la segunda población de péptidos se une específicamente a anticuerpos contra antígenos de A. phagocytophilum, la formación del primer y segundo complejos anticuerpo-péptido indica que el sujeto está infectado con A. phagocytophilum. En realizaciones relacionadas, la formación del primer complejo anticuerpo-péptido, pero no el segundo complejo anticuerpo-péptido indica que el sujeto está infectado con A. platys. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, la primera población de péptidos aislados se define por SEQ ID NO: 3 y la segunda población de péptidos aislados se define por SEQ ID NO: 1 y se detecta la formación del primer y el segundo complejos anticuerpo-péptido indicando que el sujeto está infectado con A. phagocytophilum. En otras realizaciones, la primera población de péptidos aislados se define por SEQ ID NO: 3 y la segunda población de péptidos aislados se define por una cualquiera de SEQ ID NO: 2, 5 o 9 y se detecta la formación del primer y segundo complejos anticuerpo-péptido indicando que el sujeto está infectado con A. phagocytophilum. En algunas realizaciones, la primera población de péptidos aislados se define por SEQ ID NO: 3 y la segunda población de péptidos aislados se define por SEQ ID NO: 1, y la formación del primer complejo anticuerpo-péptido, pero no se detecta el segundo complejo anticuerpo-péptido indicando que el sujeto está infectado con A. platys. En otras realizaciones, la primera población de péptidos aislados se define por SEQ ID NO: 3 y la segunda población de péptidos aislados se define por una cualquiera de SEQ ID NO: 2, 5 o 9 y la formación del primer complejo anticuerpopéptido, pero no se detecta el segundo complejo anticuerpo-péptido indicando que el sujeto está infectado con A. platys.

El primer y el segundo complejos anticuerpo-péptido pueden detectarse usando diversos procedimientos que incluyen, pero no limitados a, realizar un ensayo ELISA, ejecutar un ensayo de flujo lateral, realizar un ensayo de aglutinación, realizar una transferencia Western, una transferencia de ranura o transferencia de puntos, realizar un ensayo de desplazamiento de longitud de onda, realizar una prueba indirecta de anticuerpos fluorescentes o ejecutar la muestra a través de un rotor analítico o centrífugo. Dichos procedimientos y dispositivos para su uso en los procedimientos se describen en detalle anteriormente.

En otras realizaciones, el procedimiento para identificar la especie de Anaplasma que infecta a un sujeto comprende poner en contacto una muestra del sujeto con una primera población de péptidos y un extracto celular de una sola especie de Anaplasma, en el que la primera población de péptidos aislados se une específicamente a anticuerpos contra antígenos de múltiples especies de Anaplasma; detectar la formación de un primer complejo anticuerpo-péptido que comprende uno o más péptidos en la primera población; y detectar la formación de un complejo de extracto de células de anticuerpos que comprende uno o más componentes en el extracto celular, en el que la formación tanto del primer complejo anticuerpo-péptido como del complejo extracto de anticuerpo-célula indica que el sujeto está infectado con la especie de Anaplasma que produjo el extracto celular. En algunas realizaciones, el extracto celular es de A. phagocytophilum.

Un extracto celular comprende componentes de células. Puede generarse mediante la lisis de las células (por ejemplo, con detergentes) y la eliminación de componentes no deseados (por ejemplo, mediante centrifugación para retirar la materia insoluble tales como fragmentos de membrana, vesículas y núcleos). Un extracto celular puede ser un lisado de células enteras o un lisado de células parciales. Los extractos celulares generalmente consisten principalmente en citosol. Los expertos en la materia conocen bien diversos procedimientos para elaborar extractos celulares. Los kits comerciales están disponibles para generar extractos celulares.

Kits

En otro aspecto más, la divulgación proporciona kits para su uso en los ensayos de detección y diagnóstico descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, los kits comprenden uno o más péptidos de la divulgación. En determinadas realizaciones, los kits comprenden una población de péptidos de la divulgación. Los péptidos pueden comprender una secuencia de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 543 o fragmentos de los mismos. En una realización, los kits comprenden dos o más poblaciones de péptidos de la divulgación. Por ejemplo, en una realización, los kits comprenden una primera población de péptidos definida por SEQ ID NO: 3 y una segunda población de péptidos definida por SEQ ID NO: 4. En realizaciones particulares, los péptidos están unidos o inmovilizados en un soporte sólido. En algunas realizaciones, los péptidos están unidos o inmovilizados en un soporte sólido a través de una nanocapa metálica (por ejemplo, nanocapa de cadmio, cinc, mercurio, oro, plata, cobre o platino). En determinadas realizaciones, el soporte sólido es una perla o una pluralidad de perlas (por ejemplo, una partícula coloidal o un nanomaterial metálico tales como nanopartículas, nanoplacas o nanosferas), una ruta de flujo en un dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral, una ruta de flujo en un rotor analítico o centrífugo, un tubo o un pocillo (por ejemplo, en una placa) o un sensor (por ejemplo, un sensor electroquímico, óptico u optoelectrónico).

Los reactivos para tipos particulares de ensayos también pueden proporcionarse en kits de la divulgación. De esta manera, los kits pueden incluir una población de perlas (por ejemplo, adecuadas para un ensayo de aglutinación o un ensayo de flujo lateral), o una placa (por ejemplo, una placa adecuada para un ensayo ELISA). En otras realizaciones, los kits comprenden un dispositivo, tales como un dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral, un rotor analítico o centrífugo, una transferencia Western, una transferencia de puntos, una transferencia de ranura o un sensor electroquímico, óptico u opto-electrónico. La población de perlas, la placa y los dispositivos son útiles para realizar un inmunoensayo. Por ejemplo, pueden ser útiles para detectar la formación de un complejo anticuerpo-péptido que comprende un anticuerpo de una muestra y un péptido de la divulgación. En determinadas realizaciones, un péptido, una población de péptidos diferentes de la divulgación o una composición peptídica de la divulgación está unida o inmovilizada en las perlas, la placa o el dispositivo.

Además, los kits pueden incluir diversos diluyentes y tampones, conjugados marcados u otros agentes para la detección de antígenos o anticuerpos unidos específicamente (por ejemplo, reactivos de marcado) y otros reactivos generadores de señales, tales como sustratos enzimáticos, cofactores y cromógenos. En una realización, los kits comprenden un reactivo marcador capaz de unirse a un anticuerpo que reconoce un epítopo de uno o más péptidos de la divulgación. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el kit comprende un anticuerpo IgG o IgM antihumano, anti canino o anti-felino conjugado con un marcador detectable (por ejemplo, un nanomaterial metálico como una nanopartícula, una nanoplaca o una nanosfera metálica, una nanocapa metálica, un fluoróforo, un punto cuántico, una partícula de látex coloreada o una enzima) como reactivo de marcaje. En otras realizaciones, el kit comprende proteína A, proteína G, proteínas de fusión de proteína A/G, proteína L o combinaciones de las mismas conjugadas con un marcador detectable (por ejemplo, un nanomaterial metálico tales como una nanopartícula metálica, una nanoplaca metálica, una nanosfera metálica, una nanocapa metálica, un fluoróforo, un punto cuántico, una partícula de látex coloreada o una enzima) como reactivo de marcaje. Una proteína de fusión de proteína A/G ejemplar combina cuatro dominios de unión a Fc de la proteína A con dos de la proteína G. Véanse, por ejemplo, Sikkema, J.W.D., Amer. Biotech. Lab, 7:42, 1989 y Eliasson y col., J. Biol. Chem. 263, 4323-4327, 1988. En otras realizaciones más, los reactivos de marcaje del kit son una segunda población de péptidos de la divulgación conjugados con un marcador detectable (por ejemplo, un nanomaterial metálico tales como una nanopartícula metálica, una nanoplaca metálica, una nanosfera metálica, una nanocapa metálica, un fluoróforo, una partícula de látex coloreada o una enzima). La segunda población de péptidos puede ser igual o diferente a la primera población de péptidos, que opcionalmente puede unirse o inmovilizarse sobre un soporte sólido.

Un experto en la materia puede determinar fácilmente otros componentes de un kit. Dichos componentes pueden incluir reactivos de recubrimiento, anticuerpos policlonales o monoclonales de captura específicos para un péptido de la divulgación, o un cóctel de dos o más de los anticuerpos, extractos purificados o semipurificados de estos antígenos como patrones, anticuerpos detectores de anticuerpos monoclonales, un anticuerpo anti-ratón, anti-perro, anti-gato, anti-pollo o antihumano conjugado a un marcador detectable, tablas de indicadores para comparaciones colorimétricas, guantes desechables, instrucciones de descontaminación, palos aplicadores o recipientes, una muestra de copa preparatoria, etc. En una realización, un kit comprende tampones u otros reactivos apropiados para constituir un medio de reacción que permita la formación de un complejo péptido-anticuerpo.

Dichos kits proporcionan una forma conveniente y eficiente para que un laboratorio clínico diagnostique la infección por una especie deAnaplasma patogénica, tales como A. phagocytophilum, A. platys, o A. margínale. De esta manera, en determinadas realizaciones, los kits comprenden además unas instrucciones. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, los kits comprenden unas instrucciones que indican cómo usar un péptido o una población de péptidos de la divulgación para detectar un anticuerpo para uno o más antígenos de Anaplasma o para diagnosticar anaplasmosis o trombocitopenia cíclica. En determinadas realizaciones, los kits comprenden unas instrucciones que indican cómo usar una población de perlas, una placa o un dispositivo (por ejemplo, que comprende un péptido o una población de péptidos diferentes de la divulgación) para detectar un anticuerpo contra uno o más antígenos de Anaplasma o para diagnosticar anaplasmosis o trombocitopenia cíclica.

Los péptidos, las composiciones y los dispositivos que comprenden los péptidos, kits y procedimientos de la divulgación ofrecen una serie de ventajas. Por ejemplo, permiten la detección sencilla, barata, rápida, sensible y precisa de anaplasmosis o trombocitopenia cíclica y evitan la reactividad cruzada serológica con otras afecciones con síntomas similares. Esto permite un diagnóstico preciso. Adicionalmente, una prueba de diagnóstico (por ejemplo, un ensayo ELISA, inmunoensayo de flujo lateral o ensayo de aglutinación) es útil en muestras de suero que contienen anticuerpos anti-MSP 2/p44 o anti-OMP/p44 u otros anticuerpos producidos en respuesta a una vacuna basada en las proteínas de la superficie externa de Anaplasma.

Los siguientes ejemplos ilustran diversos aspectos de la invención. Los ejemplos deberían, por supuesto, entenderse que son meramente ilustrativos de solo ciertas realizaciones de la invención y no constituye limitaciones sobre el ámbito de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1. Ensayo ELISA

Se sintetizaron dos poblaciones diferentes de péptidos usando procedimientos de síntesis convencionales. Cada péptido en la primera población de péptidos (APL-ID1) contenía una secuencia de SEQ ID NO: 3. La primera población de péptidos se une específicamente a los anticuerpos provocados por ambos A. phagocytophilum y A. platys. Cada péptido en la segunda población de péptidos (APL-ID2) contenía una secuencia de SEQ ID NO: 4. La segunda población de péptidos se une específicamente a los anticuerpos provocados principalmente por A. platys.

Cada péptido en las dos poblaciones se unió por separado a la proteína vehículo de albúmina de suero bovino (BSA) usando química de tio-éter. Los conjugados de péptido BSA resultantes se usaron como entidades de captura en placas ELISA de 96 pocillos para crear dos ensayos ELISA separados (una población de péptidos por placa). Las placas se bloquearon con leche en polvo sin grasa al 5 % disuelta en tampón borato 25 mM (pH 9,5) para evitar la unión no específica indeseable.

Los perros se inocularon con cultivos celulares de garrapatas infectadas con A. phagocytophilum para iniciar la exposición de los perros a A. phagocytophilum. La sangre estabilizada obtenida de animales conocidos por albergar la infección de A. platys como se determinó por PCR y examen microscópico se inoculó en un grupo separado de perros para iniciar la infección con A. platys. Se recogieron muestras de sangre de cada grupo de perros inoculados diversos días después de la inoculación.

El plasma preparado a partir de las muestras de sangre se analizó para determinar la reactividad con los péptidos APL-ID1 y APL-ID2 usando las placas ELISA descritas anteriormente. Las muestras de plasma se diluyeron 1:250 a 1:1000 en solución de bloqueo y se añadieron a los pocillos bloqueados en cada una de las dos placas ELISA. Después de un período de incubación de una hora, los materiales sin reaccionar se retiraron lavando los micro pocillos. Las IgG o IgM de perro anti-péptido capturadas específicamente se detectaron por reacción con la proteína A marcada con HRP. La HRP se analizó utilizando un sustrato TMB comercial. La densidad óptica de cada pocillo se leyó a 650 nm con un lector de placas.

La reactividad de muestras de plasma obtenidas de un perro (15-13) infectado con A. platys y un perro (3-13) infectado con A. phagocytophilum con péptidos APL-ID1 y péptidos APL-ID2 se muestran en las Figuras 5 y 6, respectivamente. Las muestras del perro (perro 3-13) infectado con A. phagocytophilum mostró una reactividad significativa con los péptidos APL-ID1, mientras que la reactividad de tales muestras con péptidos APL-ID2 fue mucho menor. En contraste, las muestras del perro (perro 15-13) infectado con A. platys mostraron una reactividad similar hacia ambas poblaciones de péptidos. Estos resultados experimentales muestran que las poblaciones de péptidos definidos por SEQ ID NO: 3 (APL-ID1) y SEQ ID NO: 4 (APL-ID2) tienen un alto grado de sensibilidad para detectar la presencia de anticuerpos contra antígenos de Anaplasma. Además, los resultados muestran que estas dos poblaciones de péptidos pueden usarse para identificar las especies infectantes de Anaplasma. Una muestra que da positivo por reactividad con péptidos APL-ID1, pero no con péptidos APL-ID2, es positiva para A. phagocytophilum, mientras que una muestra que da positivo por reactividad para ambos péptidos es positiva para A. platys.

Ejemplo 2. Ensayo de flu jo lateral

Se construyó un inmunoensayo de flujo lateral en formato sándwich de doble antígeno para detectar la presencia de anticuerpos específicos para antígenos de Anaplasma. Una población de péptidos que comprende péptidos con una secuencia de SEQ ID NO: 3 (APL-ID1), SEQ ID NO: 6 (APL-ID5.1) o SEQ ID NO: 7 (APL-ID6) se enlazó a BSA y los complejos resultantes se usaron como conjugado de prueba (péptidos marcados con nanopartículas de oro) y como captura (inmovilizado en la línea de prueba del dispositivo). La señal producida en la línea de prueba se mejoró mediante conjugados de proteína A y proteína G-oro (amplificador) añadidos al conjugado de péptido marcado. El dispositivo se representa en la Figura 7.

El funcionamiento del dispositivo se ilustra en la Figura 8. Para llevar a cabo el ensayo, una gota de sangre entera anticoagulada, suero o plasma se aplica al puerto de muestra del dispositivo. La almohadilla de separación de sangre filtra las células sanguíneas de la sangre completa. El plasma (o suero) se moviliza y se une específicamente al conjugado de prueba presente en la almohadilla de conjugado y cualquier complejo de anticuerpo-péptido formado migra a la membrana de nitrocelulosa que contiene las regiones de prueba y de control. La aplicación de un tampón de persecución después de la aplicación de la muestra mueve los conjugados de prueba libres y los unidos a través de la membrana de nitrocelulosa hacia la almohadilla absorbente superior. Los complejos péptido-anticuerpo marcados se mueven a la línea de prueba en la que los péptidos inmovilizados capturan los complejos péptidoanticuerpo marcados a través de los segundos sitios de unión en los anticuerpos. Los conjugados de Proteína A-oro y Proteína G-oro en la mezcla de conjugado se unen a anticuerpos capturados que amplifican la señal de detección. La aparición de una línea roja en el sitio de prueba y una segunda línea roja en el sitio de control indica la presencia de anticuerpos contra Anaplasma spp. (por ejemplo, phagocytophilum o platys) en la muestra. La aparición de una línea roja solo en el sitio de control indica la ausencia de anticuerpos contra todas las Anaplasma spp. en la muestra. La prueba se considera inválida si (i) aparece una señal en la línea de prueba pero no hay señal en la línea de control o (ii) no se observa ninguna señal en las líneas de control o prueba.

Noventa y cinco muestras de plasma de perros positivas para Anaplasma spp. según lo determinado por el ensayo de inmunofluorescencia indirecta, IDEXX s Na P 4Dx Plus™ y ELISA usando la misma mezcla de péptidos, se probaron en el dispositivo de flujo lateral. Además, cincuenta y una muestras de plasma de perro que se determinaron negativas para Anaplasma spp. por los mismos procedimientos también se evaluaron. Cada muestra se probó dos veces en el dispositivo. Cada prueba se realizó por un operador diferente. Al final del periodo de prueba, cada prueba se marcó por el operador como positiva o negativa. Adicionalmente, las imágenes escaneadas de cada prueba se obtuvieron y se analizaron por el procedimiento ImageJ. Una prueba en la que ambos operadores acordaron la designación se registró como la misma designación (pos/neg). Cuando los operadores no estaban de acuerdo, un tercer operador realizó una tercera prueba y se tomó como resultado final (pos/neg) para esa muestra. Los resultados se resumen en la Tabla 9 siguiente. El ensayo de flujo lateral tuvo una sensibilidad del 97,9 % y una especificidad del 90,2 %. Este ejemplo demuestra que una población de péptidos que comprende péptidos que tienen una secuencia de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 7 puede detectar eficazmente anticuerpos contra antígenos de Anaplasma cuando se emplean en un formato de ensayo de flujo lateral.

Tabl . R l l n fl l r l m r n i An l m i iv n tivas

Ejemplo 3. Ensayo indirecto de anticuerpos fluorescentes

Se construye una prueba indirecta de anticuerpos fluorescentes usando perlas de látex recubiertas con uno o más péptidos de la invención. En determinadas realizaciones, se usan los péptidos definidos por SEQ ID NO: 3 (APL-ID1), SEQ ID NO: 4 (APL-ID2) y/o SEQ ID NO: 6 (APL-ID5.1). Los péptidos de la invención se recubren sobre perlas de látex derivatizadas de maleimida usando química de tio-éter. Alternativamente, los péptidos de la invención pueden conjugarse con BSA a través de tioéter o productos químicos similares y se absorben pasivamente en perlas de látex. Después se inmoviliza una población de tales perlas en un portaobjetos de vidrio usando técnicas conocidas.

Para llevar a cabo el ensayo, una gota de suero o plasma (diluido adecuadamente con un tampón adecuado) de perros sospechosos de tener anticuerpos anti-Anaplasma, se aplica al portaobjetos de vidrio recubierto con perlas de látex. Después de un tiempo de incubación adecuado, los materiales sin reaccionar se lavan y se aplica una gota de IgG (o IgM) anti-perro marcada con fluorescencia y los portaobjetos se incuban durante un período de tiempo adicional. La preparación final se observa bajo un microscopio fluorescente para determinar perlas de látex etiquetadas con fluorescencia. La clasificación del suero/plasma de prueba como positiva o negativa se basa en la comparación con los controles apropiados. Puede usarse una etiqueta enzimática en lugar del marcador fluorescente, en cuyo caso la etapa de visualización emplea un sustrato enzimático. Por ejemplo, la IgG/IgM anti-perro marcada con fosfatasa alcalina puede visualizarse exponiendo el portaobjetos a un sustrato BCIP-nitro BT. La Proteína A, la proteína G o la fusión de Proteína A/G marcadas pueden usarse en lugar de IgG anti-perro e IgM anti-perro marcadas para detectar anticuerpos unidos a las perlas recubiertas con péptido.

Ejemplo 4. Identificación de las especies de Anaplasma que infectan perros en muestras desconocidas

Este ejemplo demuestra la identificación exitosa de las especies de Anaplasma que infectan perros usando las poblaciones de péptidos de la invención y extractos celulares de Anaplasma.

Cuarenta y una muestras de plasma de perro, que se probaron y se clasificaron por inspección visual como positivos para infección de Anaplasma usando el ensayo IDEXX SNAP 4Dx Plus™, se probaron en un ensayo ELISA similar a aquel descrito en el Ejemplo 1. Se recubrieron tres placas ELISA de 96 pocillos con diversos péptidos o extracto celular (preparado usando un kit comercial de Sigma-Aldrich) a temperatura ambiente durante 1 hora. La placa 1 se revistió con 100 jl/pocillo de una mezcla de tres poblaciones de péptidos: APL-ID1 (SEQ ID NO: 3, concentración final 7 |jg/ml), APL-ID5.1 (SEQ ID NO: 6, concentración final 7 jg/m l) y APL-ID6 (SEQ ID NO: 7, concentración final 7 jg/ml). La placa 2 se revistió con 100 jl/pocillo de una mezcla de dos poblaciones de péptidos: APL-ID5.1 (SEQ ID NO: 6, concentración final 7 jg/m l) y APL-ID6 (SEQ ID NO: 7, concentración final 7 jg/ml). La placa 3 se revistió con 100 jl/pocillo de un lisado de células enteras de A. phagocytophilum (concentración final 5 jg/ml). La mezcla de péptidos en la placa 1 se une específicamente a los anticuerpos provocados por ambos A. phagocytophilum y A. platys. La mezcla de péptidos en la placa 2 se une específicamente a los anticuerpos provocados principalmente por A. platys. El lisado de células enteras en la placa 3 se une específicamente a los anticuerpos provocados principalmente por A. phagocytophilum. Después se lavaron las placas.

Las placas se bloquearon después con 300 jl/pocillo de leche desnatada al 7 % en tampón borato 250 mM (pH 9,5) a temperatura ambiente durante 1 hora para evitar una unión no específica indeseable. Las placas se lavaron nuevamente.

Las muestras de plasma de perros con o sin infección de Anaplasma (las "muestras desconocidas") se diluyeron 1/100 en leche al 7% y se añadieron 100 jl/pocillo de cada muestra a las placas ELISA y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron nuevamente.

Las placas se incubaron después con 100 jl/pocillo de conjugado de Proteína A-HRP (diluido 1:1000) a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron nuevamente y se añadieron 100 jl/pocillo de sustrato (TMB) y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se obtuvieron lecturas de DO de todas las muestras y se c o m p a r a r o n c o n l a s c u r v a s p a t r ó n . P a r a la p l a c a 1 y la p l a c a 2 ( l a s d o s p l a c a s " p e p t íd i c a s " ) , s e u s a r o n d i l u c i o n e s e n s e r i e d e m u e s t r a s p o s i t i v a s a g r u p a d a s p a r a c r e a r c u r v a s p a t r ó n . P a r a la p l a c a 3 ( l a p l a c a d e l i s a d o ) , s e r e a l i z ó u n a c u r v a d e d o s p u n t o s u t i l iz a n d o u n a m u e s t r a n e g a t iv a y u n a m u e s t r a c a n i n a d e u n p e r r o q u e f u e in f e c t a d o e x p e r im e n t a l m e n t e c o n A. p h a g o cy to p h ilu m ( " 3 - 13 " ) .

Claims

REIVINDICACIONES

1. U n a c o m p o s i c i ó n q u e c o m p r e n d e u n a p o b l a c ió n d e p é p t id o s a i s l a d o s , c o m p r e n d i e n d o d i c h a p o b l a c ió n t r e s o m á s p é p t id o s d i f e r e n t e s , e n la q u e c a d a p é p t id o e n la p o b l a c ió n c o m p r e n d e u n a s e c u e n c i a d e :

( i) S E Q ID N O : 3 , e n la q u e X 5 e s u n a m in o á c i d o s e l e c c i o n a d o d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n V o A , X 7 e s u n a m in o á c i d o s e l e c c i o n a d o d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n G , I o H , X 11 e s u n a m i n o á c i d o s e l e c c i o n a d o d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n E , N o Q , X 18 e s u n a m i n o á c i d o s e l e c c i o n a d o d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n D o N , X 21 e s u n a m i n o á c i d o s e l e c c i o n a d o d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n R , D o N , X 25 e s u n a m i n o á c i d o s e l e c c i o n a d o d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n Q , D o E , X 28 e s u n a m i n o á c i d o s e l e c c i o n a d o d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n E o N , X 31 e s u n a m i n o á c i d o s e l e c c i o n a d o d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n L o V , X 45 e s u n a m i n o á c i d o s e l e c c i o n a d o d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n K o Q , X 48 e s u n a m i n o á c i d o s e l e c c i o n a d o d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n F o V , X 51 e s u n a m i n o á c i d o s e l e c c i o n a d o d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n D o N , X 54 e s u n a m i n o á c i d o s e l e c c i o n a d o d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n E o Q , X 57 e s u n a m i n o á c i d o s e l e c c i o n a d o d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n S o Q , X 60 e s u n a m i n o á c i d o s e l e c c i o n a d o d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n F o W , X 63 e s u n a m i n o á c i d o s e l e c c i o n a d o d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n I o V , y X 66 e s u n a m i n o á c i d o s e l e c c i o n a d o d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n Q o D ;

( ii) S E Q ID N O : 1, e n la q u e X g e s u n a m i n o á c i d o s e l e c c i o n a d o d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n I, P o H , X 17 e s u n a m i n o á c i d o s e l e c c i o n a d o d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n I, W o Y , X 21 e s u n a m i n o á c i d o s e l e c c i o n a d o d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n R , D o N , X 28 e s u n a m i n o á c i d o s e l e c c i o n a d o d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n E o N y X 31 e s u n a m i n o á c i d o s e l e c c i o n a d o d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n L o V ; o

( i i i) S E Q ID N O : 9 , e n la q u e X 5 e s u n a m i n o á c i d o s e l e c c i o n a d o d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n V o A , X 7 e s u n a m i n o á c i d o s e l e c c i o n a d o d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n G , I o H , X 11 e s u n a m i n o á c i d o s e l e c c i o n a d o d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n E , N o Q , X 21 e s u n a m i n o á c i d o s e l e c c i o n a d o d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n R , D o N , X 25 e s u n a m in o á c i d o s e l e c c i o n a d o d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n Q , D o E , X 28 e s u n a m i n o á c i d o s e l e c c i o n a d o d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n E o N y X 31 e s u n a m i n o á c i d o s e l e c c i o n a d o d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n L o V .

2. L a c o m p o s i c i ó n d e u n a c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s a n t e r io r e s , e n la q u e u n o o m á s d e lo s p é p t id o s s e c o n j u g a n c o n b io t in a , a v id in a , e s t r e p t a v id in a , n e u t r a v id in a , s e r o a l b ú m i n a , h e m o c i a n i n a d e la p a c a l i f o r n ia n a ( K L H ) , u n a e n z i m a o u n n a n o m a t e r i a l m e t á l ic o .

3. L a c o m p o s i c ió n d e u n a c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s a n t e r io r e s , e n la q u e la p o b l a c ió n d e p é p t id o s s e in m o v i l iz a e n u n s o p o r t e s ó l id o o p c io n a l m e n t e a t r a v é s d e u n a n a n o c a p a m e t á l ic a .

4. L a c o m p o s i c i ó n d e la r e i v i n d i c a c i ó n 3 , e n la q u e e l s o p o r t e s ó l id o e s u n a p l u r a l id a d d e p e r l a s , u n a r u t a d e f lu jo e n u n d is p o s i t iv o d e i n m u n o e n s a y o d e f lu jo la t e r a l , u n p o c i l lo e n u n a p l a c a d e m ic r o t it u la c ió n o u n a r u t a d e f lu jo e n u n r o t o r .

5. L a c o m p o s i c i ó n d e u n a c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s a n t e r io r e s , e n la q u e la c o m p o s i c i ó n c o m p r e n d e a d e m á s ^{u n o o m á s p é p t id o s a n t i g é n i c o s d e u n a e s p e c i e d e} Anaplasma, ^{u n a e s p e c i e d e} Ehrlichia ^{y / o u n a e s p e c i e d e} Borrelia.

6 ^{. L a c o m p o s i c i ó n d e u n a c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s a n t e r io r e s , e n la q u e la c o m p o s i c i ó n c o m p r e n d e u n a}s e g u n d a p o b l a c ió n d e p é p t id o s a i s l a d o s , e n la q u e c a d a p é p t id o c o m p r e n d e la s e c u e n c i a d e S E Q . I D . N O : 6.

7. L a c o m p o s i c ió n d e u n a c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 1 - 5 , e n la q u e la c o m p o s i c i ó n c o m p r e n d e u n a s e g u n d a p o b l a c ió n d e p é p t id o s a i s l a d o s d e f in i d a p o r S E Q ID N O : 7 y o p c io n a l m e n t e u n a t e r c e r a p o b l a c ió n d e p é p t id o s a i s l a d o s , e n la q u e c a d a p é p t id o e n la t e r c e r a p o b l a c ió n c o m p r e n d e la s e c u e n c i a d e S E Q ID N O : 6.

8 ^{. U n p r o c e d im i e n t o d e d e t e c c ió n e n u n a m u e s t r a d e u n a n t ic u e r p o c o n t r a u n e p ít o p o d e u n a n t í g e n o d e} Anaplasma^, c o m p r e n d i e n d o e l p r o c e d im i e n t o :

p o n e r e n c o n t a c t o u n a m u e s t r a c o n la c o m p o s i c i ó n d e u n a c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 1 - 7 ; y

d e t e c t a r la f o r m a c ió n d e u n c o m p l e jo a n t ic u e r p o - p é p t id o q u e c o m p r e n d e u n o o m á s p é p t id o s e n la c o m p o s i c ió n , e n e l q u e la f o r m a c ió n d e d ic h o c o m p l e j o e s in d i c a t i v a d e q u e u n a n t i c u e r p o c o n t r a u n e p ít o p o d e u n a n t í g e n o d e Anaplasma está ^{p r e s e n t e e n d i c h a m u e s t r a .}

^{9. E l p r o c e d im i e n t o d e la r e iv in d ic a c i ó n 8 , e n e l q u e d ic h o a n t íg e n o d e} Anaplasma ^{e s d e} Anaplasma phagocytophilum, Anaplasma platys, ^o Anaplasma marginale.

10. U n p r o c e d im i e n t o p a r a d i a g n o s t i c a r a n a p l a s m o s i s e n u n s u je t o , c o m p r e n d i e n d o e l p r o c e d im i e n t o :

p o n e r e n c o n t a c t o u n a m u e s t r a d e l s u je t o c o n la c o m p o s i c i ó n d e u n a c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 1 - 7 ; y d e t e c t a r la f o r m a c ió n d e u n c o m p l e jo a n t ic u e r p o - p é p t id o q u e c o m p r e n d e u n o o m á s p é p t id o s e n la c o m p o s i c ió n , e n e l q u e la f o r m a c ió n d e l c o m p l e jo e s i n d ic a t i v a d e q u e e l s u je t o t ie n e a n a p l a s m o s i s .

11 . U n k it q u e c o m p r e n d e la c o m p o s i c ió n d e u n a c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 1 - 7 ; y u n r e a c t iv o m a r c a d o r c a p a z d e u n i r s e a u n a n t ic u e r p o q u e r e c o n o c e u n e p ít o p o d e u n o o m á s p é p t id o s e n la c o m p o s i c ió n .