CN107137060B - 一种易代谢的金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针及其制备 - Google Patents

一种易代谢的金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针及其制备 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种易代谢的金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针及其制备，所述的复合纳米光声探针由十二氨修饰的金纳米球，和包裹所述金纳米球的鸡卵清蛋白分子复合而成，其中，金纳米球和鸡卵清蛋白分子的质量比为0.1～10:1。与现有技术相比，本发明的复合纳米光声探针在600‑950nm脉冲光波辐照下，具有光声效应，由于肿瘤微环境中谷胱甘肽的含量较高，该金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针可在肿瘤组织中被还原，释放金纳米球，而5nm级别的小尺寸金纳米球可在体内循环中通过肾脏代谢，避免在生物组织中积聚以及造成损伤等。

Description

一种易代谢的金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针及其 制备
技术领域
本发明涉及肿瘤光声成像检测领域，尤其是涉及一种易代谢的金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针及其制备。
背景技术
光声成像是一种新兴的生物检测技术，因其具有较高的空间分辨率和成像深度，能够实时动态成像，且操作简单方便等优点，在临床应用方面拥有巨大潜力。在光声成像测试中，光声探针的信号强度对成像质量起关键性作用，因此对具有超强光声信号的光声探针的研发已得到广泛关注。根据来源划分，光声探针分为内生光声探针和外生光声探针，内生光声探针来源于生物体内，具有较好的生物相容性和较小的生物毒性，外生光声探针要求有高于内生光声探针的信号强度，以获得较好的成像对比度。
中国专利201510884853.0公开了一种基于荧光淬灭效应实现复合探针光声信号增强的方法，并据此方法构建了复合探针并实现了复合探针光声信号的增强。该探针由氧化石墨烯和荧光染料构成。氧化石墨烯作为基底材料既可用于负载染料，又可以通过荧光能量共振转移效应焠灭负载在其表面的染料的荧光。但是该复合探针的生物相容性较差，生物毒性较高，很容易在生物组织中积聚而造成损伤。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种易代谢的金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针及其制备。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种易代谢的金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针，由十二氨修饰的金纳米球，和包裹所述金纳米球的鸡卵清蛋白分子复合而成，其中，金纳米球和鸡卵清蛋白分子的质量比为0.1～10:1。
优选的，该复合纳米光声探针呈球状的复合纳米颗粒，其粒径为20-300nm。
优选的，所述的金纳米球的粒径为2-10nm。更优选的，金纳米球的粒径约为5nm左右。
优选的，所述的金纳米球通过以下步骤制成：
(A)取四辛基溴化氨和十二氨溶解于甲苯中，再加入氯金酸水溶液，混合均匀；
(B)继续加入冰冷的硼氢化钠，剧烈搅拌；
(C)最后加入不良溶剂乙醇，收集沉淀得到所述十二氨修饰的金纳米球。
更优选的，四辛基溴化氨、十二氨、甲苯、氯金酸、硼氢化钠和乙醇的加入量之比为(0.02-0.03)mmol：(0.04-0.08)mmol：(0.3-0.8)mL：(0.04-0.06)mmol：(0.1-0.3)mmol：(2-5)mL。
优选的，步骤(B)中：剧烈搅拌的时间为20-40min。
易代谢的金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)取十二氨修饰的金纳米球溶于四氢呋喃溶剂中，制得金纳米球溶液；
(2)取鸡卵清蛋白分子置于MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)溶液中，配置成鸡卵清蛋白分子溶液；
(3)将金纳米球溶液逐滴加入鸡卵清蛋白分子溶液中，搅拌，再进行超声反应，即得到所述金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针。
优选的，步骤(1)中，金纳米球溶液的浓度为0.1-1mg/mL。
优选的，步骤(2)中，鸡卵清蛋白分子溶液的浓度为0.1-2mg/mL，其中，MES溶液的pH值为6。
优选的，步骤(3)中，搅拌的时间为0.5-6h，搅拌速度为200-600rpm；
超声反应的工艺条件为：在冰水浴中反应5-30min，其中，超声功率100-600W，工作时间1-20s，超声间隙3-10s。
本发明的复合纳米光声探针采用鸡卵清蛋白分子和金纳米球复合制得，其中，鸡卵清蛋白是鸡卵蛋白的主要成分，其安全无毒，来源简单易得，成本低，经济效益高，同时，鸡卵清蛋白具有良好的水溶性与生物相容性，可作为治疗性和检测性纳米药物的良好载体。而本发明制得的金纳米球在530nm波长具有良好的光学吸收，吸收峰较宽，用短脉冲激光照射吸收体时，吸收体中的分子吸收光子后，其电子从低能级跃迁到高能级而处于激发态，而处于激发态的极不稳定的电子从高能级向低能级跃迁时，会以光或热量的形式释放能量，释放的热量导致吸收体局部温度升高，温度升高后导致热膨胀从而产生压力波，即光声信号，可用于肿瘤的光声检测。金纳米颗粒生物惰性高，形状及尺寸可调，但是，较大尺寸的金纳米球易在生物内脏器官中堆积，产生生物毒性，而5nm左右小尺寸的金纳米球可通过肾脏代谢，避免堆积造成的损伤。本发明通过使用鸡卵清蛋白作为载体，包裹5nm的金纳米球，制备得到一种易代谢的20-300nm的金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声针。
与现有技术相比，本发明复合纳米光声探针在600-950nm脉冲光波辐照下，具有光声效应。鸡卵清蛋白分子中含有巯基，易与金纳米球表面的原子以Au-S键紧密结合，形成20-300nm粒径的稳定结构，有利于其在体内循环，并安全有效到达肿瘤部位，实现光声成像功能。由于肿瘤微环境中谷胱甘肽的含量较高，该金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针可在肿瘤组织中被还原，释放金纳米球，而5nm级别的小尺寸金纳米球可在体内循环中通过肾脏代谢，避免在生物组织中积聚以及造成损伤。
附图说明
图1为金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针的透射电子显微镜照片；
图2为金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针的水合粒径分布图；
图3为浓度为1mg/ml、0.5mg/ml的复合光声探针水溶液进行光声成像测试结果，其中，左图为不同的复合光声探针水溶液在680-960nm连续脉冲激光照射下光声信号平均值的曲线，右图为相应的光声成像照片；
图4为纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针的透射电子显微镜照片；
图5为金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针的水合粒径分布图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施案例中所述的实验方法和实验试剂，如无特别说明，均采用该领域内的常规实验技术，实验试剂均为常规试剂。
实施例1
一种易代谢的金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针的制备，包括以下步骤：
(1)使用pH为6的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(简称MES)溶液，将鸡卵清蛋白分子配制成0.5mg/ml的溶液，搅拌均匀。
(2)将1ml浓度为1mg/ml的金纳米球溶液逐滴缓慢加入步骤(1)中2ml的鸡卵清蛋白溶液中，搅拌1h，搅拌速度为450rpm。金纳米球具体通过以下方法制成：将0.025mmol的四辛基溴化氨和0.06mmol的十二氨溶解于0.5ml的甲苯，再加入0.053mmol的氯金酸水溶液(浓度为0.5M)，混合均匀，然后加入0.2mmol冰冷的硼氢化钠，剧烈搅拌半小时，最后加入4ml的不良溶剂乙醇，收集沉淀得到尺寸约为5nm的十二氨修饰的金纳米球。金纳米球溶解于水溶性和油溶性惧佳的四氢呋喃溶剂中，配制浓度为0.1-1mg/ml的金纳米球溶液，溶液为酒红色。
(3)将步骤(2)中的混合溶液放入探针式超声仪，超声反应20min(超声功率400W，工作时间10s，超声间隙5s)，最终制得金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针的混合体系。超声过程中，溶液放置于冰水浴，以防超声导致溶液升温。
(4)将步骤(3)的混合体系经8小时透析，得到纯化的金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针。
(5)冷冻干燥步骤(4)的纯化的金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针，得到粉末状的金纳米球/鸡卵清蛋白的复合纳米光声探针。
所制备得到的金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针的测试和表征如下：图1为金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针的透射电子显微镜照片，结构为5nm金纳米球被紧凑的包裹在鸡卵清蛋白中，形成球状的复合纳米颗粒，尺寸为20-100nm。图2为为金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针的水合粒径分布图，其水合粒径约为30-100nm。由于不同测试制样方法的差异，场发射扫描电子显微镜照片显示的干态的金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针粒径小于水合粒径。
表一列出了不同纳米粒子的电位值，具体为1mg/mL的5nm金纳米球的四氢呋喃溶液溶于十倍的水中的电位值为44.7mV，鸡卵清蛋白纳米粒子的MES溶液(pH值为6)的电位值为-24.6mV，金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针的电位值为-33.5mV。在2.4W的650nm光的照射下，1mg/ml金纳米球/鸡卵清蛋白纳米光声探针水溶液从30℃升温至38.8℃。
表一
对金纳米球/鸡卵清蛋白纳米复合光声探针水溶液进行光声成像测试，图3为浓度为1mg/ml和0.5mg/ml的复合光声探针水溶液进行光声成像测试结果，其中左图分别为1mg/ml和0.5mg/ml的复合光声探针水溶液在680-960nm连续脉冲激光照射下光声信号平均值的曲线，右图为相应的光声成像照片，在选定的0.220mm2面积范围内，两种浓度的复合光声探针的平均光声信号对比值分别为0.833和0.571。
实施例2
一种易代谢的金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针的制备，包括以下步骤：
(1)使用pH为6的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(简称MES)溶液，将鸡卵清蛋白分子配制成0.5mg/ml的溶液，搅拌均匀。
(2)将0.2ml浓度为0.5mg/ml的金纳米球溶液(制备方法同实施例1)逐滴缓慢加入步骤(1)中2ml的鸡卵清蛋白溶液中，搅拌2h，搅拌速度为450rpm。
(3)将步骤(2)中的混合溶液放入探针式超声仪，超声反应20min(超声功率400W，工作时间10s，超声间隙5s)，最终制得金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针的混合体系。超声过程中，溶液放置于冰水浴，以防超声导致溶液升温。
(4)将步骤(3)的混合体系经8小时透析，得到纯化的金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针。
(5)冷冻干燥步骤(4)的纯化的金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针，得到粉末状的金纳米球/鸡卵清蛋白的复合纳米光声探针。
所制备得到的金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针的测试和表征如下：图4为金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针的透射电子显微镜照片，结构为5nm金纳米球被紧凑的包裹在鸡卵清蛋白中，形成球状的复合纳米颗粒，尺寸为30-100nm。图5为为金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针的水合粒径分布图，其水合粒径约为50-150nm。由于不同测试制样方法的差异，场发射扫描电子显微镜照片显示的干态的金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针粒径小于水合粒径。
实施例3
一种易代谢的金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针的制备，包括以下步骤：
(1)使用pH为6的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(简称MES)溶液，将鸡卵清蛋白分子配制成0.1mg/ml的溶液，搅拌均匀。
(2)将2ml浓度为1mg/ml的金纳米球溶液(制备方法同实施例1)逐滴缓慢加入步骤(1)中2ml的鸡卵清蛋白溶液中，搅拌0.5h，搅拌速度为200rpm。
(3)将步骤(2)中的混合溶液放入探针式超声仪，超声反应5min(超声功率100W，工作时间20s，超声间隙3s)，最终制得金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针的混合体系。超声过程中，溶液放置于冰水浴，以防超声导致溶液升温。
(4)将步骤(3)的混合体系经8小时透析，得到纯化的金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针。
(5)冷冻干燥步骤(4)的纯化的金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针，得到粉末状的金纳米球/鸡卵清蛋白的复合纳米光声探针。
实施例4
一种易代谢的金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针的制备，包括以下步骤：
(1)使用pH为6的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(简称MES)溶液，将鸡卵清蛋白分子配制成1mg/ml的溶液，搅拌均匀。
(2)将1ml浓度为0.1mg/ml的金纳米球溶液(制备方法同实施例1)逐滴缓慢加入步骤(1)中1ml的鸡卵清蛋白溶液中，搅拌6h，搅拌速度为600pm。
(3)将步骤(2)中的混合溶液放入探针式超声仪，超声反应30min(超声功率600W，工作时间6s，超声间隙3s)，最终制得金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针的混合体系。超声过程中，溶液放置于冰水浴，以防超声导致溶液升温。
(4)将步骤(3)的混合体系经8小时透析，得到纯化的金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针。
(5)冷冻干燥步骤(4)的纯化的金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针，得到粉末状的金纳米球/鸡卵清蛋白的复合纳米光声探针。
实施例5
一种易代谢的金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针的制备，包括以下步骤：
(1)使用pH为6的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(简称MES)溶液，将鸡卵清蛋白分子配制成2mg/ml的溶液，搅拌均匀。
(2)将1ml浓度为0.5mg/ml的金纳米球溶液(制备方法同实施例1)逐滴缓慢加入步骤(1)中1ml的鸡卵清蛋白溶液中，搅拌3h，搅拌速度为300pm。
(3)将步骤(2)中的混合溶液放入探针式超声仪，超声反应15min(超声功率300W，工作时间12s，超声间隙2s)，最终制得金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针的混合体系。超声过程中，溶液放置于冰水浴，以防超声导致溶液升温。
(4)将步骤(3)的混合体系经8小时透析，得到纯化的金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针。
(5)冷冻干燥步骤(4)的纯化的金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针，得到粉末状的金纳米球/鸡卵清蛋白的复合纳米光声探针。
实施例6
与实施例1相比，绝大部分都一样，除了本实施例的金纳米球溶液改为按以下方法制备：
将0.02mmol的四辛基溴化氨和0.04mmol的十二氨溶解于0.3ml的甲苯，再加入0.04mmol的氯金酸水溶液(浓度为0.5M)，混合均匀，然后加入0.1mmol冰冷的硼氢化钠，剧烈搅拌半小时，最后加入2ml的不良溶剂乙醇，收集沉淀得到尺寸约为5nm的十二氨修饰的金纳米球。将金纳米球溶解于水溶性和油溶性惧佳的四氢呋喃溶剂中，配制浓度为0.1-1mg/ml的金纳米球溶液，溶液为酒红色。
实施例7
与实施例1相比，绝大部分都一样，除了本实施例的金纳米球溶液改为按以下方法制备：
将0.03mmol的四辛基溴化氨和0.08mmol的十二氨溶解于0.8ml的甲苯，再加入0.06mmol的氯金酸水溶液(浓度为0.5M)，混合均匀，然后加入0.3mmol冰冷的硼氢化钠，剧烈搅拌半小时，最后加入5ml的不良溶剂乙醇，收集沉淀得到尺寸约为5nm的十二氨修饰的金纳米球。将金纳米球溶解于水溶性和油溶性惧佳的四氢呋喃溶剂中，配制浓度为0.1-1mg/ml的金纳米球溶液，溶液为酒红色。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种易代谢的金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针，其特征在于，由十二氨修饰的金纳米球，和包裹所述金纳米球的鸡卵清蛋白分子复合而成，其中，金纳米球和鸡卵清蛋白分子的质量比为0.1～10:1。
2.根据权利要求1所述的一种易代谢的金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针，其特征在于，该复合纳米光声探针呈球状的复合纳米颗粒，其粒径为20-300nm。
3.根据权利要求1所述的一种易代谢的金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针，其特征在于，所述的金纳米球的粒径为2-10nm。
4.根据权利要求1所述的一种易代谢的金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针，其特征在于，所述的金纳米球通过以下步骤制成：
(A)取四辛基溴化氨和十二氨溶解于甲苯中，再加入氯金酸水溶液，混合均匀；
(B)继续加入冰冷的硼氢化钠，剧烈搅拌；
(C)最后加入不良溶剂乙醇，收集沉淀得到所述十二氨修饰的金纳米球。
5.根据权利要求4所述的一种易代谢的金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针，其特征在于，四辛基溴化氨、十二氨、甲苯、氯金酸、硼氢化钠和乙醇的加入量之比为(0.02-0.03)mmol：(0.04-0.08)mmol：(0.3-0.8)mL：(0.04-0.06)mmol：(0.1-0.3)mmol：(2-5)mL。
6.根据权利要求4所述的一种易代谢的金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针，其特征在于，步骤(B)中：剧烈搅拌的时间为20-40min。
7.如权利要求1-6任一所述的易代谢的金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取十二氨修饰的金纳米球溶于四氢呋喃溶剂中，制得金纳米球溶液；
(2)取鸡卵清蛋白分子置于MES溶液中，配置成鸡卵清蛋白分子溶液；
(3)将金纳米球溶液逐滴加入鸡卵清蛋白分子溶液中，搅拌，再进行超声反应，即得到所述金纳米球/鸡卵清蛋白复合纳米光声探针。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，金纳米球溶液的浓度为0.1-1mg/mL。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，鸡卵清蛋白分子溶液的浓度为0.1-2mg/mL，其中，MES溶液的pH值为6。
10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，搅拌的时间为0.5-6h，搅拌速度为200-600rpm；
超声反应的工艺条件为：在冰水浴中反应5-30min，其中，超声功率100-600W，工作时间1-20s，超声间隙3-10s。
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