CN102743770A - 一种靶向性分子成像探针及活体分子成像方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医用技术领域，特别涉及一种活体分子成像方法及靶向性分子成像探针。本发明所述活体分子成像方法通过引入可供影像学设备检测的靶向性分子成像探针，以图像的形式反映心血管系统疾病（尤其是心律失常）和肿瘤等疾病的缝隙连接蛋白43（Cx43）的生物化学变化特征，检测结果准确，可直观的显示Cx43的分布和数量，可直接应用于人体。本发明公开的Cx43靶向性分子成像探针，由信号组分、Cx43靶向亲和组分以及连接体三部分组成，具有良好的药代动力学特征和生物学分布特征。
Description
技术领域
本发明涉及医用技术领域，特别涉及一种Cx43靶向性分子成像探针及活体分子成像方法。
背景技术
缝隙连接重构（gap junction remodeling）是参与心律失常、肿瘤、动脉粥样硬化等疾病发生、发展的共同病理基础之一，而缝隙连接蛋白43（connexin43，Cx43）则是组成缝隙连接的基本结构单位,是构成心肌细胞间缝隙连接的主要结构基础。Cx43是分子量为43Kd的一种连接蛋白，其主要作用是介导相邻细胞之间的直接通讯。在心脏，其主要作用是形成细胞间快速的电冲动，保证心脏整体电活动同步性和协调性，维持心肌细胞的电活动以及机械收缩和舒张功能的同步性。因此，Cx43在数量、分布、功能和磷酸化状态等方面发生改变（即缝隙连接重构）时必然会引起心肌细胞间电耦联障碍。主要表现为细胞间电活动的同步性、协调性改变，电传导速度的减慢及各向异性的改变等。多种成年获得性心血管病，如心肌缺血、心律失常、心力衰竭、高血压、动脉粥样硬化等均出现了不同程度的Cx43缝隙连接重构。Cx43缝隙连接重构是各种心律失常，尤其是折返性心动过速产生的重要结构基础，也是各种心脏疾病死亡和猝死的最主要原因。
同时，Cx43参与多种细胞生命周期从生长到死亡的各个环节，直接介导细胞生长调控信号在相邻细胞之间的传递，调控细胞生长、分化和凋亡。Cx43的异常将直接导致细胞生长调控异常，接触抑制作用、 终末分化和凋亡能力消失，表现为延长的或永生的细胞生命周期，从而引起肿瘤发生。
因此，Cx43作为抗心律失常治疗和抗肿瘤治疗的共同分子靶点，已成为国内外心血管疾病和肿瘤研究领域的新的研究热点。多种体外研究方法也被相应的开发出来，用于Cx43的数量和功能（包括磷酸化状态）分析。这些研究方法包括：应用PCR或RT-PCR在mRNA水平检测Cx43的表达情况；应用Western Blot对Cx43蛋白进行半定量研究；通过免疫组织荧光染色技术，观察Cx43的亚细胞水平定位和缝隙连接重构等；通过引入Cx43不同磷酸化位点的特异性抗体，利用基质辅助激光解析/电离质谱、固定金属亲和层析、液相串联质谱分析Cx43的不同磷酸化位点的磷酸化状态；利用荧光染料细胞间传递实验，通过显微注射方法将小分子荧光染料引入到细胞浆，结合荧光显微镜技术，在细胞水平评价Cx43介导的细胞间直接通讯功能等。但是，这些体外检测方法主要依靠对大量的、细胞水平或离体组织的实验结果的分析。
体外检测方法虽可判断、分析细胞或组织的Cx43表达水平和功能状态，但从技术层面上分析，都存在着一定的局限性：
①需要通过细胞培养、活检或尸检取得标本，不能直接应用于人体；
②体外实验结果可能与活体状态下的真实情况不符：体外实验受实验条件、实验设备、实验方法的影响较大，在样品的处理过程中，可能会遗失某些重要的成分，误差较大，使得实验结果与活体状态下的真实情况不符；
③体外实验不利于动态研究：体外实验需要在不同的时间点处死实验动物来获取组织或反复活检取材，只能观察疾病的某一阶段，无 法实现在同一动物体内真正的动态研究，不易在如此复杂的、进展的疾病全过程得到准确的结论；
④操作复杂，费时耗财，随机性很大。因此，Cx43的活体可视化研究可能为解决这些问题，提供了一种新的思路，而分子影像学技术的出现使之成为可能。
分子影像学是指在活体状态下，应用影像学方法对人或动物体内的细胞和分子水平生物学过程进行成像、定性和定量研究的一门学科。它以应用分子探针为显著特点，采用多种成像手段，对体内特定靶点进行成像。成像手段包括：放射性核素成像（radionuclide imaging）、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）、磁共振波谱成像（MR spectroscopy，MRS）、光学成像（optical imaging，OI）、超声成像（ultrasound imaging，US）及多模式融合成像（integration of multi-mode imaging）等。借助这些成像技术，生命系统内部某些特定的生理或者病理过程，如基因表达，蛋白质之间相互作用，信号传导，细胞的代谢以及细胞示踪等等可变为直观的图像显现出来。
V Baklaushev等进行的Cx43可视化方案，合成了以Cx43蛋白细胞外E2段的特异性抗体为靶向亲和组件，以放射性同位素125I和荧光染料Alexa660为信号组件的探针，利用γ射线计数器和荧光显微镜进行检测脑胶质瘤中Cx43的表达异常情况，但仍没有摆脱体外检查方法的局限：
①125I并不是一种适合活体显像的核素，只能应用γ射线计数器进行检测，且检查结果不够直观。所以该研究在静脉注射探针 125I-MAbE2Cx43后，处死动物，获取组织，应用γ射线计数器进行了放射性分析；
②Alexa660也并不是适用于活体成像的荧光染料，只能用于免疫 组织染色分析，因此该研究在静脉注射探针Alexa660-MAbE2Cx43后，处死动物，获取组织，制成冰冻切片，应用荧光显微镜对组织进行了分析；
③采用MAbE2Cx43抗体作为亲和组件，抗体价格昂贵，并可能会引起免疫原性反应从而引发副作用。更重要的是，由于抗体分子量较大，非特异性吸收会较高，注射入体内后不易获得理想的药代动力学特征和生物学分布特征，导致检测结果不准确，应用起来不方便。
目前亟需活体检测和定量Cx43的方法。
发明内容
本发明主要解决的技术问题就是Cx43的活体检测和定量问题。通过活体分子成像技术对Cx43进行过活体检测和定量，可在活体确定Cx43的表达数量、分布、功能和疾病发展过程中Cx43的动态变化情况，明确Cx43靶向治疗干预的最佳时间、剂量，并对“重建Cx43”治疗的疗效进行准确客观的评价，从而实现快速折返性心律失常和恶性肿瘤等疾病的预后评估、Cx43靶向治疗疗效监测。
一方面，本发明提供一种活体分子成像的方法，所述方法包括：
提供Cx43靶向性分子探针，所述靶向性分子探针由信号组分、靶向亲和组分以及连接体三部分组成，所述信号组分为可供影像学设备检测的部分，所述靶向亲和组分为与Cx43特异性结合的部分，所述连接体将信号组分和靶向亲和组分连接起来；
用所述的Cx43靶向性分子探针对所述患者待测位置实施光学成像、正电子发射断层成像、单光子发射断层成像、磁共振成像、光声成像、超声成像或其他活体影像学融合成像技术优选PET/CT，PET/MRI。
作为优选，所述靶向亲和组分与Cx43的羧基末端特异性结合。更优选地，所述靶向亲和组分选自：
Ⅰ、Cx43SP1，Gly-Ala-Pro-Gly-4Hyp-Pro-Tyr
Ⅱ、Cx43SP2，Gly-D-Tyr-D-Pro-D-Hyp-Gly-D-Ala-Gly
Ⅲ、Cx43SP3，其结构式如下：
Ⅳ、Cx43SP4，包括5种具有RXP-X结构的类似物，具体如下：
RXP-A，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；
RXP-B，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；
RXP-C，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；
RXP-D，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；
RXP-E，其氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。
作为优选，所述信号组分选自放射性同位素、荧光染料、量子点、顺磁性性材料、磁性纳米粒子、超顺磁性材料、超声微泡、光声纳米颗粒的一种或几种。
作为优选，所述连接体选自DTPA、DOTA、DOTAGA、NOTA、NODAGA、TETA、CB-TE2A、Sar、NODA等螯合剂或者其他可直接将信号组件和Cx43靶向亲和组件直接相连的化学方法。
另一方面，本发明提供一种靶向性分子探针，由信号组分、靶向亲和组分以及将信号组分和靶向亲和组分连接起来的连接体三部分组成，所述信号组分为可供影像学设备检测的部分，所述靶向亲和组分为与Cx43特异性结合的部分，所述连接体将信号组分和靶向亲和组 分连接起来。
作为优选，所述靶向性分子探针的靶向亲和组分与Cx43的羧基末端特异性结合。
更优选地，所述靶向亲和组分选自：
Ⅰ、Cx43SP1，Gly-Ala-Pro-Gly-4Hyp-Pro-Tyr
Ⅱ、Cx43SP2，Gly-D-Tyr-D-Pro-D-Hyp-Gly-D-Ala-Gly
Ⅲ、Cx43SP3，其结构如下：
Ⅳ、Cx43SP4，包括5种具有RXP-X结构的类似物，序列如下：
| RXP-X | 序列 |
| RXP-A | DVPGRDPGYIKGGGSAHARVPFF SHSLNRNRKP SLYQ |
| RXP-B | EIQPRSPLMFSGGGSAHARVPFFSHSAKEARWPRAHR |
| RXP-C | GIAAREPNSHDGGGSAHARVPFFSHSRDLWRKPAKSL |
| RXP-D | WEEPRRPFTMSGGGSAETHARVPFYSHSPMRHRLPGVHL |
| RXP-E | SDDLRSPQLHNGGGSAVPFYSHSHMVRRKPRNPR |
作为优选，所述信号组分选自放射性同位素、荧光染料、量子点、顺磁性性材料、磁性纳米粒子、超顺磁性材料、超声微泡、光声纳米颗粒的一种或几种。
作为优选，所述连接体选自DTPA、DOTA、DOTAGA、NOTA、NODAGA、TETA、CB-TE2A、Sar、NODA等螯合剂，或利用其他直接的化学反应将信号组件和Cx43亲和组件直接连接。
分子探针（molecular probe）：是能够与某一特定生物分子（如蛋白质、DNA、RNA）或者细胞结构靶向特异性的结合、并可供体内或（和）体外影像学示踪的标记化合物分子，这些标记化合物分子能够在活体或（和）离体反映其靶生物分子的量和（或）功能。可以简单理解为分子影像学诊断类药物。
分子成像探针必须具备以下2个重要特征：①对与疾病密切相关的靶分子具有高度亲和力和靶向特异性；②可供影像学设备在活体外进行示踪。探针主要用于在活体内对生物过程进行成像、定量和测量研究。基本结构一般分为三个部分：信号组件（signaling component）、亲和组件（affinity component）和连接体（linker）。信号组件是指能产生影像学信号且能被高精度的成像技术探测的造影剂或标记物部分（如放射性核素、荧光素、顺磁性原子及超声微泡等）；亲和组件即靶向分子，是与成像靶点特异性结合的部分（如配体或抗体等）。通过放射性化学或者生物分子链接化学技术可直接把信号组件和亲和组件连接起来，也可通过linker，即引入交联试剂或衍生化试剂（crosslinking or derivatizing reagents）把二者连接起来。
本发明提供一种Cx43分子靶向特异性探针，该类探针由放射性同位素、荧光染料、量子点、纳米粒子、磁性材料、超声微泡、光声成像材料和多模式成像等影像学方法标记Cx43靶向特异性结合多肽而成。引入该类探针，应用正电子发射断层显像（PET），单光子发射断层显像（SPECT），光学成像、超声成像、磁共振成像、光声成像和多模式成像等影像学手段可在活体内检测到正常生理及病理情况下，感兴趣区域的Cx43的数量、分布和功能，及其在疾病发展的不同阶段的变化特征。
经研究已经证实该探针在活体内稳定性良好，Cx43靶向分子成像 特异性高，准确性高，图像的对比度佳，适用于心血管系统疾病（尤其是心律失常）、肿瘤的诊断、Cx43靶向治疗疗效监测，明确靶向治疗干预的最佳时间、剂量，并对“重建Cx43”治疗的疗效进行准确客观的评价。同时，也为肿瘤和心血管系统疾病的基础研究提供了有效的方法，为研究Cx43与疾病的发生、发展特征之间的相关性提供了新的手段。
本发明还提供一种成像组合物，包含上述的靶向性分子探针。
本发明还提供所述靶向性分子探针在制备诊断Cx43表达异常相关疾病的试剂中的用途。
作为优选，所述Cx43表达异常相关疾病为以Cx43表达或功能异常为分子特征的疾病，主要包括心律失常或肿瘤。
本发明建立无创、直观的Cx43活体分子成像方法，合成可供影像学设备检测的探针，直观的显示Cx43的分布和数量，初步评价其功能，该技术具有建立安全、无创、活体、动态、直观、准确、可直接应用于人体的特征。
本发明开发的一类Cx43靶向性影像学诊断类药物（分子探针），具有良好的药代动力学特征和生物学分布特征，检测结果更加准确，应用更加方便，以图像的形式直观反映心律失常和肿瘤等疾病的生物化学特征。
本发明的靶向特异性探针具有如下优点：
1).具有Cx43靶向特异性，确保Cx43分子成像靶向检测的准确性
一般影像学和核医学检查所用的非特异性探针不能特异性识别并结合体内的生物分子，因此只能提供疾病分子改变下游的信息（解剖、病理和生理学改变），或者疾病的整体形态和功能信息，例如血流 量的改变、血流灌注的改变。若想准确检测疾病发展过程中的关键标志物分子，则要求探针可特异性识别并结合体内分子标志物，提供疾病分子水平的信息，加深对疾病生物过程的理解。另外，利用靶向特异性探针，可有效地减少探针与其他非成像靶点的非特异性结合，更加有助于对成像靶点进行准确的定量。
2).Cx43的活体可视化，确保Cx43分子成像检测的安全、无创和直观性
实现疾病发展过程中关键分子标志物的活体可视化，要求探针具有发射影像学信号，可供无创的影像学设备在体外检测的性能，通过图像直观的显示出分子标志物的分布情况。因为影像学检查具有安全、无创、直观的特点。
3).分子探针与靶点Cx43的高亲和力
实现Cx43活体检测，获得理想的分子成像图像的前提是分子探针在成像靶点的高浓度聚集，即要求探针到达靶区后早期就与靶点结合，解离的时间相对较晚，确保在几个血液循环周期后，探针在靶点达到理想的聚集状态。
4).分子探针检测Cx43的高敏感性
在疾病早期，或者治疗干预的早期检测到分子标志物的变化情况，通常要求探针可检测到非常少量的生物标志物，即具有高度敏感性。另外，与治疗药物不同，理想的分子探针必须确保其产生的生物学影响或药理学作用尽量低，因此需要探针的敏感性足够高，只需要少量的探针就可获得理想的图像，尽量减少引入体内探针的数量，降低探针引发的药理学作用。
5).Cx43活体分子成像的高对比度
高对比度的图像要求病变区域的信号强度足够高，即靶/背景比值 和信号/噪声比值很高。这就要求探针具有理想的生物学分布特征，即探针在靶区浓聚的量大，停留的时间长，而在正常组织器官内摄取率低，清除速度快。
6).分子探针的活体稳定性
尽管分子探针的引入量可能很少，但是维持分子探针在活体内的稳定性和完整性依然是一个难题，因为血浆内或者靶组织内存在许多酶，可将探针降解。图像质量和定量研究的准确性依赖于探针在活体内的稳定性。
7).分子探针的免疫源性和毒性低
应用于人体的分子探针必须安全、没有免疫源性和毒性。产生的药理学作用尽量低。
8).分子探针的生产过程简便易行，成本低
分子探针的制备过程方便易行，成本低廉，有助于在临床广泛的应用。如果生产过程复杂，成本高则势必会影响分子探针的临床转化。
附图说明
图1为Cx43靶向分子成像探针的结构示意图；
图2为探针在体外与HeLa-Cx43细胞结合实验的荧光显微镜照片：
a：Cy5.5-Cx43SP与HeLa-Cx43细胞共孵育后，HeLa-Cx43细胞摄取了大量的探针Cy5.5-Cx43SP（绿色）；
b：Cy5.5-Cx43SP与HeLa细胞共孵育后，Cy5.5-Cx43SP未被对照组HeLa细胞摄取；
c：引入过量未经标记的Cx43SP预先阻断，再将Cy5.5-Cx43SP与HeLa-Cx43细胞共孵育后，HeLa-Cx43细胞摄取Cy5.5-Cx43SP的 量明显减少，几乎没有摄取；
d：引入过量未经标记的Cx43SP阻断，Cy5.5-Cx43SP与HeLa细胞共孵育后，HeLa细胞依然没有摄取Cy5.5-Cx43SP。证实探针具有良好的靶向特异性。
图3为以肌肉作为对照的组织冰冻切片荧光显微镜照片:
a：尾静脉注射Cy5.5-Cx43SP后1h，肌肉冰冻切片荧光显微镜下显示，Cy5.5-Cx43SP在肌肉组织内无聚集;
b：肌肉冰冻切片bright field图片，显示肌肉组织形态;
c：肌肉冰冻切片和荧光显微镜下图融合图片。
图4为活体注射探针后，心肌组织冰冻切片荧光显微镜照片：
a：尾静脉注射Cy5.5-Cx43SP后1h，心肌冰冻切片荧光显微镜下图片，Cy5.5-Cx43SP在心肌组织大量聚集;
b：尾静脉注射Cy5.5-Cx43SP后1h，心肌冰冻切片bright field图片显示心肌组织形态；
c：尾静脉注射Cy5.5-Cx43SP后1h，心肌冰冻切片和荧光显微镜下图融合图片显示Cy5.5-Cx43SP在心肌组织大量聚集，且主要分布于心肌细胞间缝隙连接所在部位。
图5为64Cu-NODA-Cx43SP1与Hela-Cx43细胞结合和阻断实验
图6为离体主要组织器官近红外荧光成像：小鼠尾静脉注射探针Cy5.5-Cx43SP后1h，探针在心脏、胃、肝脏、胆囊和肠道明显聚集，大部分经肝肠道排泄。
图7为64Cu-NOTA-Cx43SP1在正常大鼠中不同时间点的PET成像，显示探针在心脏聚集明显。64Cu-NOTA-Cx43SP1注射量约200微居。
图8为64Cu-NOTA-Cx43SP1在正常小鼠中1小时的PET成像，显示 探针在心脏聚集明显。64Cu–NOTA-Cx43SP1注射量约50微居。
图9：活体小鼠肿瘤近红外成像实验：小鼠尾静脉注射探针Cy5.5-Cx43SP1后1h，在过表达Cx43的HeLa-Cx43肿瘤部位大量聚集，而在右侧对照组HeLa肿瘤部位无浓聚。
图10：体内小鼠肿瘤PET成像实验：小鼠尾静脉注射探针 64Cu-NODA-Cx43SP1后1h，探针在过表达Cx43的HeLa-Cx43肿瘤部位大量聚集（左侧）。
具体实施方式
本发明公开了一种Cx43靶向性分子成像探针及活体分子成像方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：Cx43靶向亲和组分--Cx43靶向性结合肽（Cx43SP）
以下4类多肽（Cx43靶向性结合肽）的任何一类均可以与Cx43的羧基末端特异性结合，因此可用来合成Cx43靶向分子探针。
1）、Cx43SP1的结构：
Gly-Ala-Pro-Gly-4Hyp-Pro-Tyr，又称为：AAP10，分子式：C26H37N7O8，分子量：575.6，其结构如下所示：
Cx43SP1是本发明分子探针中最重要的靶向亲和组分，是1种能够在活体内特异性识别Cx43，并与之结合的6个氨基酸组成的多肽。Cx43SP1是1980年Aonuma S等在牛的心房组织中提取出来的一系列通过作用于Cx43而起作用的抗心律失常多肽，因此曾被命名为antiarrhythmic peptide10(AAP10)。但是由于AAP10在血浆中结构不稳定，未能有进一步的临床应用。本专利发明者对AAP10结构进行了化学修饰，合成了用于Cx43活体成像的探针，并验证了该探针具有理想的活体稳定性。由于在本发明中，该化学结构不再作为抗心律失常药物，而是作为Cx43靶向分子成像探针的靶向亲和组分，因此命名为Cx43特异性结合肽1(Cx43 Specific Peptide 1)。Cx43SP1的马蹄形结构域可与Cx43的羧基末端的受体结构域特异性结合。
2）、Cx43SP2的结构：
Gly-D-Tyr-D-Pro-D-Hyp-Gly-D-Ala-Gly，其结构如下所示：
Cx43SP2是Cx43SP1的类似物，用D型氨基酸代替了Cx43SP 中的部分L型氨基酸，从而增加了稳定性，目前作为抗心律失常药物已经进入到临床试验阶段。Cx43SP2的商品名：rotigaptide，又称：CHEMBL450656,GAP-486，ZP123。分子式：C28H39N7O9，分子量：617.65076。
3）Cx43SP3的结构：
Cx43SP3是Cx43SP2的功能类似物，又称为GAP 134，分子量为291.3，其结构如下所示：
4）Cx43SP4为包含RXP-E特征性结构的5种氨基酸序列，如表1所示：
表1 Cx43SP4的氨基酸序列
| RXP-X | 序列 |
| RXP-A | DVPGRDPGYIKGGGSAHARVPFFSHSLNRNRKPSLYQ |
| RXP-B | EIQPRSPLMFSGGGSAHARVPFFSHSAKEARWPRAHR |
| RXP-C | GIAAREPNSHDGGGSAHARVPFFSHSRDLWRKPAKSL |
| RXP-D | WEEPRRPFTMSGGGSAETHARVPFYSHSPMRHRLPGVHL |
| RXP-E | SDDLRSPQLHNGGGSAVPFYSHSHMVRRKPRNPR |
Cx43SP3是Mario Delmar等人2006年通过噬菌体展示技术筛选出来的一类可以与Cx43的羧基末端（氨基酸255-382）特异性结合的 多肽，由34个氨基酸构成。基本结合模序是RXP-X，因此又叫做RXP系列多肽，拟用于抗心律失常治疗。其中RXP-E较其他多肽更具有应用前景。
实施例2：制备Cx43靶向性分子探针
本发明Cx43靶向性分子探针的结构通式如图1所示。
（1）成像靶点为缝隙连接蛋白43(Connexin 43,Cx43)，Cx43的羧基末端(C末端)有一个门控颗粒状结构，功能相当于特异性的受体结构域，是Cx43SP的主要结合靶点，是本发明Cx43靶向成像的靶点。
（2）信号组分：是探针可供影像学设备检测的部分，本专利中主要为放射性同位素（PET和SPECT成像）、荧光染料和量子点（光学成像）、顺磁性材料和超顺磁性材料和磁性纳米粒子（磁共振成像）、超声微泡（超声成像）、各种光声纳米颗粒（光声成像）及以上各种组分进行组合而成的多模式成像技术检测的影像学材料。
（3）靶向亲和组分：是探针与成像的分子靶点特异性结合的部分，二者之间的结合具有高度特异性和高亲和力，相当于“钥匙和锁”的关系。本发明中主要涉及到实施例1中的多肽和小分子结构。
（4）连接体：将信号组分和靶向亲和组分连接起来的部分。也可不引入连接体，而是采用化学方法直接将信号组件和Cx43亲和组件直接连接。
实施例3：放射性同位素标记的Cx43靶向分子探针的制备
实施例1中4类多肽均可以与Cx43的羧基末端特异性结合，因此均可用制备成标记Cx43靶向分子探针。以下的合成过程举例中， 均用Cx43SP1作为代表性多肽。
信号组分为正电子发射性放射性同位素或者单光子放射性核素，可用于临床和小动物正电子发射断层显像(PET)或单光子发射断层显像（SPECT）。选择恰当的连接体，通过放射性化学方法可将放射性同位素和靶向性多肽连接在一起。采用的连接体又叫做双功能螯合剂。双功能螯合剂既具有与放射性金属结合的功能模序基团，也有与Cx43SP结合的基团，将二者连接起来，成为Cx43靶向性分子探针。
1）二价（M2+）或者三价金属离子（M3+）标记Cx43SP
可根据放射性核素的不同特性，选择不同的连接体，详见表2。
表2常用放射性同位素、双功能螯合剂及由此合成Cx43靶向性探针
注：R为Cx43SP。
DTPA：diethylene triamine pentaacetic acid二乙三胺五乙酸
DOTA：1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid 1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸
DOTAGA：
1-(1-carboxy-3-carboxypropyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-triacetic acid
1-(1-羧基-3-羧丙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸
NOTA：1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid 1,4,7-叠氮酸钠-1,4,7-三乙酸
NODAGA：NOTA通过戊二酸臂进行功能修饰
2-(p-SCN-Bz)-NOTA：NOTA通过苄基异硫氰酸进行功能修饰
TETA：1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-1,4,8,11,tetraacetic acid1,4,8,11-大环四胺四乙酸-1,4,7,10-四乙酸
CB-TE2A：Attachment of two carboxymethyl pendant arms to cross-bridged(CB)-cyclam leads to CB-TE2A
Sar：sarcophagine(3,6,10,13,16,19-hexa azabicyclo[6.6.6]icosane)
钴离子（3,6,10,13,16,19-六溴氮杂双环[6.6.6]二十碳烷）
SarAr和AmBa Sar是Sar的羧酸和氨基衍生物
NODA：1,4,7-triazacyclononane-1,4-diacetate 1,4,7-叠氮酸钠-1,4-双乙酸钠
由于以上涉及到多种放射性同位素和双功能螯合剂，在此以64Cu标记Cx43SP为例，说明放射性同位素的二价（M2+）或者三价金属离子（M3+）标记Cx43SP的方法。
NODA修饰Cx43SP:NODA过量，加适量的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和2%的N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA)，室温震荡过夜。高效液相色谱(HPLC)分离纯化，质谱分析鉴定产物。NODA修饰Cx43SP1的化学反应式如下：
NODA修饰Cx43SP1的化学反应式
64Cu标记：将其10μg的Cx43SP-NODA溶于pH介于4-5之间的醋酸铵200μl缓冲液中，再加入50μL的64CuCl2（pH介于5-6之间）。混合液于37°C反应1小时。放射性标记的产品经放射性探测器-高效液相色谱(RP-HPLC)分离纯化，测定标记率，放射化学纯，比活度。 64Cu标记NODA-Cx43SP1的化学反应式如下：
64Cu标记NODA-Cx43SP1的化学反应式
2）18F标记Cx43SP
18F是临床最常用的放射性核素，应用亲和性的18F-F-直接标记多肽难度很大，一般利用经过修饰的18F前体，如4-硝基苯2-[18F]氟丙酸（18F-NFP）。通过本技术，可得到适合用于心脏和肿瘤Cx43靶向分子成像的18F标记的Cx43探针，该探针的特点是更具有临床应用潜力。
18F-FP-Cx43SP的合成：
18F标记的前体18F-NFP(4-nitrophenyl 2-[18F]-fluoropropionate，Rt=22–23min)，Cx43靶向结合肽500μg溶于150μL无水二甲基亚砜（DMSO）中，并加入18F-NFP和20μL的N，N-二异丙基乙胺（DIPEA）。混合液室温下反应30分钟后加入800μL的5%乙酸中和。产物经半制备型HPLC C-18柱纯化。纯化产物加入20μL水稀释。制备过程中用5mL乙醇及10mL水反复冲洗C-18柱子洗脱产物，最终产物在60°C用氮气吹干。最后，18F标记的多肽溶于PBS中并通过0.22μm超微过滤到消毒剂量瓶中，用于体外和活体实验。同样，用HPLC测定标记率，放射化学纯，比活度等。18F标记Cx43SP1的化学反应式如下：
18F标记Cx43SP1的化学反应式
18F-AlF-NODA-Cx43SP的合成：
用NODA-Cx43SP，合成NODA-Cx43SP。采用QMA-SepPak柱吸附30mCi(1.1GBq)18F-氟化铝，用2.5mL的无金属离子水溶液冲洗18F-氟化铝，并用400μL的0.4M KHCO3溶液淋洗18F-氟化铝，取200μL的 18F-氟化铝溶液备用。用不含金属离子的醋酸将溶液pH值调至4.0。向溶液中按顺序加入氯化铝（AlCl3，2mM，3μL，溶于0.1M醋酸钠缓冲液，pH4)和5μL的NOTA-Cx43SP（60mg/mL溶于DMSO)。反应混合物100°C孵育15分钟后，用1mL无金属离子水稀释，产物经半制备HPLC纯化，收集18F-AlF-NOTA-Cx43SP类似物，蒸干，溶于PBS中并通过0.22μm超微过滤到消毒剂量瓶中，用于体外和活体实验。同样，用HPLC测定标记率，放射化学纯，比活度等，18F标记Cx43SP1的化学反应式如下。
18F标记Cx43SP1的化学反应式
除了18F-NFP之外，也可以通过其他18F前体（就是辅助基团），采用类似的方法标记Cx43SP。常用的18F标记前体结构式[18F]FBA:[18F] 邻氟苯甲酸；[18F]FSB：[18F]氟苯甲酸酯；[18F]FBEM[18F]FBBO如下所示：
除了18F之外，还可应用11C、13N、15O等放射性核素，选取相应的前体，对Cx43SP进行标记。正电子发射的放射性核素标记的探针的优点：敏感性高，可准确定量，可临床转化，探针分子量小，药物代谢动力学特征佳。
3）：99mTc标记Cx43SP
举例：99mTcO3+或者99mTcO2+，采用HYNIC作为双功能螯合剂。具体步骤如下：
1．双功能螯合剂HYNIC-NHS与Cx43SP上的氨基（-NH2）反应，以DMF为溶剂，2%DIPEA作为催化剂，经高压液相(HPLC)纯化后，产品，质谱加以确认。
2．锝-99m标记HYNIC-Cx43SP：通过“3+1”的二元混合配体络合的方案，以三齿配体tricine作协同试剂，用氯化亚锡(SnCl2·H2O）作还原剂，室温反应20min后，测定标记化合物的放射化学纯度，铸的胶体小于1％。
3．分析：用薄层层析(ITLC)和高压液相(HPLC)的方法来分析标记化合物中胶体的含量及产品的含量。
99mTc标记Cx43SP1的化学反应式如下：
99mTc标记Cx43SP1的化学反应式
根据不同的99mTc-核，选择不同的连接体，通过不同的反应过程，可得到不同结构的产品。99mTc标记Cx43SP，常见的双功能螯合剂及合成的探针，R代表Cx43SP如表2所示：
表2
4）123/124I标记Cx43SP
选择适当的氧化剂，接可将放射性同位素碘标记在Cx43SP上。主要有2种标记方法，直接标记和间接标记。
①直接标记：碘化反应可直接通过“碘质子化”来实现。123/124I直接标记Cx43SP常采用的氧化剂结构式如下：
123/124I直接标记Cx43SP1的化学反应式如下：
②间接标记：123/124I间接标记Cx43SP常采用的氧化剂结构式如下：
123/124I间接标记Cx43SP1的化学反应式如下：
实施例4：光学标记的Cx43靶向分子探针的制备
1）近红外荧光染料标记Cx43SP1
波长在700–900nm的近红外荧光染料由于穿透力较强，可到达较深部的组织，因此常用来进行活体光学成像。常用的近红外荧光染料见图。可选择不同的双功能螯合剂，将近红外荧光染料标记在Cx43SP上。花菁染料化学结构通式如下：
常用4类近红外荧光染料的化学结构如下：
(1a)cyanine，(1b)ICG，(1c)SIDAG，(1d)PPCy
花菁染料化学结构通式
Cy5.5标记：Cx43特异性结合肽溶于100μL的DMSO中，避光条件下与Cy5.5-NHS（1 equiv.）混合，共溶于2%的DIPEA中，室温，震动孵育过夜。产品经半制备HPLC C18柱子(250×10mm)分离纯化，收集产物，冻干，计算产率，用质谱（MALDI-TOF-MS）测定分子量。Cy5.5标记Cx43SP1的化学反应式如下：
2）、近红外纳米材料标记Cx43SP
目前最常用的有以下四类纳米材料，包括：包含有近红外荧光染料的纳米探针、量子点、碳纳米管、金纳米簇。
以近红外量子点为例，应用量子点标记Cx43SP：取Cx43SP1000eq，溶于水中，与1eq的量子点混合，加入1000eq的EDC，室温搅拌反应1小时，用PD10柱子分离，用离心管浓缩，测浓度。一个量子点上可标记上500-600个Cx43SP分子。合成的探针经近红外荧光成像进行活体检测。
实施例5：磁性标记的Cx43靶向分子探针的制备
1）超顺磁性纳米粒子（Fe3O4）
应用超顺磁性纳米粒子标记Cx43SP合成探针，用于磁共振成像。以超顺磁性纳米粒子为例，应用超顺磁性纳米粒子标记Cx43SP：取Cx43SP 1000eq，溶于水中，与1eq的超顺磁性纳米粒子混合，加入1000eq的EDC，室温搅拌反应1小时，用PD10柱子分离，用离心管 浓缩，测浓度。超顺磁性氧化铁标记Cx43SP1的化学反应式如下：
2）顺磁性金属螯合物：通过选择适当的双功能螯合剂，还可将顺磁性金属螯合物标记在Cx43SP上，形成探针，用于磁共振成像。顺磁性金属元素主要包括：钆（Gd3+）、Dy3+、Tm3+、Mn2+，CEST试剂3He，129Xe。由于顺磁性金属螯合物产生的弛豫能力较弱，而磁共振分子成像的敏感性较低，也可以引入有效的信号放大机制，即利用繁枝体、脂质体等大分子，表面携带多个功能基团，将多个Cx43SP分子和大量的顺磁性金属螯合其表面，形成一个探针。顺磁性金属螯合物标记Cx43SP1的化学反应式如下：
实施例6:超声微泡标记的Cx43靶向分子探针的制备
取Cx43SP 1000eq，溶于水中，与1eq的超声微泡混合，加入1000eq的EDC，室温搅拌反应1小时。超声微泡标记Cx43SP1的化学反应式如下：
实施例7：光声材料标记的Cx43靶向分子探针的制备
目前，有一些金纳米粒子也可用来标记Cx43SP，进行光声成像，例如金纳米棒。应用金纳米棒标记Cx43SP：取Cx43SP 1000eq，溶于水中，与1eq的金纳米棒混合，加入1000eq的EDC，室温搅拌反应1小时，用PD10柱子分离，用离心管浓缩，测浓度。金纳米棒标记Cx43SP1的化学反应式如下：
实施例8：多模式标记的Cx43靶向分子探针的制备
将以上2种或者多种影像学标记方法同时使用，产生可供2种或2种以上影像学检查手段探测的Cx43靶向性探针，即多模式分子成像探针。例如在纳米材料表面连上不同的功能基团，用于连接多肽、放射性核素、荧光染料等其他模式的显像剂。
在近红外量子点表面经巯基和羧基修饰，先连接上Cx43SP1，用NODA-MAL修饰量子点，通过马来甘与巯基的反应，将NODA连接在量子点上。再用64Cu标记，放射性标记的产品经PD10分离纯化，测定标记率，放射化学纯，比活度，探针可供近红外荧光成像和PET 成像同时检测。64Cu和量子点双模式标记Cx43SP1的化学反应式如下：
实施例9：离体实验证明
1）、Cx43高表达细胞系的建立：用Cx43基因转染了宫颈癌HeLa细胞，成功制备Cx43过表达宫颈癌肿瘤细胞系HeLa-Cx43，将为转基因的Hela细胞（无C43表达）作为对照。
2）Cy5.5-Cx43SP1细胞结合和阻断实验：Hela-Cx43细胞和对照组Hela-Control细胞，0.5X106/孔，实验前一天铺于12孔板，共四组： A组：Hela-Cx43细胞组，B组：Hela-Control细胞组，C组：Hela-Cx43细胞阻断组，D组：Hela-Control细胞阻断组。每组3孔，实验重复3次。每孔加入Cy5.5-Cx43SP1，浓度为500nmol/L，1ml。阻断组加入没标记的Cx43SP1，浓度为5μmol/L。
结果显示：Cy5.5-Cx43SP1与HeLa-Cx43细胞存在明显的特异性结合，与未转染Cx43基因的对照组HeLa细胞则无结合（图2-a，图2-b）。引入过量未经标记的5μmol/L的Cx43SP阻断后，Cy5.5-Cx43SP与HeLa-Cx43细胞的结合明显的大大减低（图2-c）。以上结果表明，近红外荧光探针Cy5.5-Cx43SP可被过表达Cx43的HeLa细胞特异性摄取，Cy5.5-Cx43SP与HeLa-Cx43的结合具有靶向特异性。
同时，进一步制作了组织冰冻切片，在荧光显微镜下显像。以肌肉作为对照（图3-a,3-b,3-c），荧光显微镜下观察探针Cy5.5-Cx43SP在心脏的分布情况，尾静脉注射Cy5.5-Cx43SP后1h，心肌冰冻切片荧光显微镜下显示，Cy5.5-Cx43SP在心肌组织大量聚集，且主要分布于心肌细胞间缝隙连接所在部位（图4-a,4-b,4-c）。在组织水平证实探针对心肌缝隙连接具有靶向特异性。
3)、64Cu-NODA-Cx43SP1细胞结合和阻断实验
Hela-Cx43细胞和对照组Hela-Control细胞，0.5X106/孔，实验前一天铺于12孔板，共四组：A组：Hela-Cx43细胞组，B组：Hela-Control细胞组，C组：Hela-Cx43细胞阻断组，D组：Hela-Control细胞阻断组。每组3孔，实验重复3次。每孔加入64Cu-NODA-Cx43SP1，浓度为3.2μCi/孔，1ml。阻断组加入没标记的NODA-Cx43SP1，浓度为50μg/孔（10倍于64Cu-NODA-Cx43SP1）。结果显示：64Cu-NODA-Cx43SP1与HeLa-Cx43细胞存在明显的特异性结合，与未转染Cx43基因的对 照组HeLa细胞则无结合。阻断实验，64Cu-NODA-Cx43SP1与HeLa-Cx43细胞的结合明显的大大减低（图5）。结果表明，-NODA-Cx43SP1可被过表达Cx43的HeLa细胞特异性摄取，-NODA-Cx43SP1与HeLa-Cx43的结合具有靶向特异性和高亲和力。
实施例10：、动物实验
1）、探针活体生物学分布特征：
Cy5.5-Cx43SP在正常小鼠中的生物分布
注射Cy5.5-Cx43SP一小时后，处死小鼠，取出器官，进行离体主要器官近红外荧光成像显示，结果显示：探针Cy5.5-Cx43SP主要分布于心脏、肝脏，胃肠道，主要经肝肠道排泄，部分经肾脏，泌尿系统排泄。尤其是其较高的心脏摄取，这是和正常心脏表达较高Cx43是非常一致的（图6）。
2）、正常大鼠PET心脏成像：
前期实验在活体水平验证了64Cu-NOTA-Cx43SP在正常大鼠心脏的靶向聚集能力及探针的生物学分布特性。结果表明， 64Cu-NOTA-Cx43SP在静脉注射后30min即在心脏部位出现明显聚集，一直持续到3h依然有聚集(图7)，而在肝脏、肺脏的聚集很少，心肌显影清晰。由于Cx43为心肌主要缝隙连接蛋白，结果说明 64Cu-NOTA-Cx43SP在心肌靶向性聚集。静脉注射1h后，探针在 64Cu-NOTA-Cx43SP小鼠主要分布于心脏、肠道。这些结果与小鼠Cy5.5-Cx43SP体外光学成像结果一致。该实验结果，表明了预实验所设计的Cx43靶向分子探针64Cu-NOTA-Cx43S能对心肌进行活体成像。
3）、正常小鼠PET心脏成像：
同时进行了64Cu-NOTA-Cx43SP在正常小鼠的PET显像实验。结果如图8。64Cu-NOTA-Cx43SP在静脉注射后1小时后在心脏部位现明显聚集，同时在肝脏有吸收，并很多通过肾脏和膀胱排泄。这些结果与大鼠试验具有一致性，但心脏显像结果较大鼠中差。说明探针在不同的动物种类中，生物分布具有一定差异。同时，64Cu-NOTA-Cx43SP探针也有进一步优化的空间和需求。
4）荷瘤裸鼠光学肿瘤成像：
利用过表达Cx43的HeLa-Cx43细胞建立了裸鼠皮下移植瘤模型（图9，左侧），并以未转染Cx43的常规HeLa细胞皮下移植瘤模型作为对照组（图9，右侧）。进行活体Cy5.5-Cx43SP1肿瘤近红外荧光成像，结果表明：探针Cy5.5-Cx43SP1在尾静脉注射一小时后，在过表达Cx43的HeLa-Cx43肿瘤部位呈高浓度聚集，而在对照组HeLa肿瘤部位未见明显聚集。该结果再次显示：在活体水平上，Cx43靶向分子探针Cy5.5-Cx43S对Cx43阳性的肿瘤具有一定的靶向特异性。
5）、荷瘤裸鼠PET肿瘤成像：
利用过表达Cx43的HeLa-Cx43细胞建立了裸鼠皮下移植瘤模型（图10，左侧）。静脉注射64Cu-NODA-Cx43SP，浓度为40微居。Micro PET成像结果表明：探针64Cu-NODA-Cx43SP在尾静脉注射一小时后，在过表达Cx43的HeLa-Cx43肿瘤部位呈高浓度聚集。该结果再次显示：在活体水平上，Cx43靶向分子探针64Cu-NODA-Cx43SP对Cx43阳性的肿瘤具有一定的靶向特异性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (14)
1.一种活体分子成像的方法，所述方法包括：
提供Cx43靶向性分子探针，所述Cx43靶向性分子探针由信号组分、Cx43靶向亲和组分以及连接体三部分组成，所述信号组分为可供影像学设备检测的部分，所述Cx43靶向亲和组分为与Cx43特异性结合的多肽部分，所述连接体将信号组分和靶向亲和组分连接起来；
用所述的Cx43靶向性分子探针对所述患者待测位置实施光学成像、正电子发射断层成像、单光子发射断层成像、磁共振成像、光声成像、超声成像或其他活体影像学融合成像技术优选PET/CT或PET/MRI。
2.权利要求1的方法，其特征在于，所述Cx43靶向亲和组分与Cx43的羧基末端特异性结合。
3.权利要求1或2的方法，其特征在于，所述Cx43的靶向亲和组分选自：
Ⅰ、Cx43S P1，Gly-Ala-Pro-Gly-4Hyp-Pro-Tyr
Ⅱ、Cx43SP2，Gly-D-Tyr-D-Pro-D-Hyp-Gly-D-Ala-Gly
Ⅲ、Cx43SP3，其结构式如下：
Ⅳ、Cx43SP4，是一组基于RXP-X结构的多肽，共有5个相似的序列：
RXP-A，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；
RXP-B，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；
RXP-C，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；
RXP-D，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；
RXP-E，其氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。
4.权利要求1-3任一项的方法，其特征在于，所述Cx43靶向性探针的信号组分选自放射性同位素、荧光染料、量子点、顺磁性材料、磁性纳米粒子、超顺磁性材料、超声微泡、光声纳米颗粒的一种或几种材料组合。
5.权利要求1-4中任一项的方法，所述连接体选自DTPA、DOTA、DOTAGA、NOTA、NODAGA、TETA、CB-TE2A、Sar、NODA等螯合剂，或利用其他直接的化学反应将信号组件和Cx43亲和组件直接连接。
6.Cx43的靶向性分子探针，由信号组分、Cx43靶向亲和组分以及将信号组分和靶向亲和组分连接起来的连接体三部分组成，所述信号组分为可供影像学设备检测的部分，所述靶向亲和组分为与Cx43特异性结合的部分，所述连接体将信号组分和靶向亲和组分连接起来。
7.权利要求6的靶向性分子探针，其特征在于，所述靶向亲和组分与Cx43的羧基末端特异性结合。
8.权利要求7的靶向性分子探针，其特征在于，所述靶向亲和组分选自：
Ⅰ、Cx43S P1，Gly-Ala-Pro-Gly-4Hyp-Pro-Tyr
Ⅱ、Cx43SP2，Gly-D-Tyr-D-Pro-D-Hyp-Gly-D-Ala-Gly
Ⅲ、Cx43SP3，其结构式如下：
Ⅳ、Cx43SP4，是一组基于RXP-X结构的多肽，共有5个相似的序列：
RXP-A，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；
RXP-B，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；
RXP-C，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；
RXP-D，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；
RXP-E，其氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。
9.权利要求6-8任一项所述的靶向性分子探针，其特征在于，所述信号组分选自放射性同位素、荧光染料、量子点、顺磁性性材料、磁性纳米粒子、超顺磁性材料、超声微泡、光声纳米颗粒的一种或几种。
10.权利要求6-9任一项所述的靶向性分子探针，其特征在于，所述连接体选自DTPA、DOTA、DOTAGA、NOTA、NODAGA、TETA、CB-TE2A、Sar、NODA等螯合剂，或利用其他直接的化学反应将信号组件和Cx43亲和组件直接连接。
11.一种分子成像探针的组合物，包含权利要求6-10任一项所述的靶向性分子探针。
12.权利要求6-10任一项所述靶向性分子探针在制备诊断Cx43表达异常相关疾病的试剂中的用途。
13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，所述Cx43表达异常相关疾病为所有伴随Cx43表达和功能异常的先天性或后天获得性疾病。
14.根据权利要求13所述的用途，其特征在于，所述Cx43表达异常相关疾病为肿瘤或心血管系统疾病优选为心律失常。
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