BR102017002668A2 - peptídeo híbrido, conjunto de peptídeos híbridos, composição, usos do peptídeo híbrido, método de induzir resposta imune e kits - Google Patents

Abstract

peptídeo híbrido, conjunto de peptídeos híbridos, composição, usos do peptídeo híbrido, método de induzir resposta imune e kits a presente invenção se refere a novos peptídeos híbridos, desenvolvidos a partir da combinação de fragmentos peptídicos de proteínas de superfície de membrana presentes em micro-organismos causadores da anaplasmose, e em particular, bactérias da espécie anaplasma marginate. a presente invenção se refere ainda a conjuntos de peptídeos híbridos, a composições e a kits compreendendo tais novos peptídeos híbridos, aos usos dos mesmos e aos métodos de induzir resposta imune. cada peptídeo híbrido, de acordo com a presente invenção, compreende dois ou mais fragmentos peptídicos das sequências de aminoácidos, conforme definidas na presente invenção, ligados entre si por meio de um elemento espaçador. os fragmentos peptídicos combinados são fragmentos peptidicos das proteínas msp1, msp1 a, msp1 b, msp2, msp2-hrv, msp3, omp7, omp8, virb9 e virb10.

Description

(54) Título: PEPTÍDEO HÍBRIDO, CONJUNTO DE PEPTÍDEOS HÍBRIDOS, COMPOSIÇÃO, USOS DO PEPTÍDEO HÍBRIDO, MÉTODO DE INDUZIR RESPOSTA IMUNE E KITS (51) Int. Cl.: C07K 19/00; A61K 39/116; G01N 33/569 (73) Titular(es): BIOTICK PESQUISA E DESENVOLVIMENTO TECNOLÓGICO LTDA., FUNDAÇÃO BUTANTAN (72) Inventor(es): ANA MARISA CHUDZINSKITAVASSI; BÁRBARA ATHAYDE VAZ GALVÃO DA SILVA; KERLY FERNANDA MESQUITA PASQUALOTO; LEO KEI IWAI; RAFAEL MARQUES PORTO (85) Data do Início da Fase Nacional:

09/02/2017 (57) Resumo: PEPTÍDEO HÍBRIDO, CONJUNTO DE PEPTÍDEOS HÍBRIDOS, COMPOSIÇÃO, USOS DO PEPTÍDEO HÍBRIDO, MÉTODO DE INDUZIR RESPOSTA IMUNE E KITS A presente invenção se refere a novos peptídeos híbridos, desenvolvidos a partir da combinação de fragmentos peptídicos de proteínas de superfície de membrana presentes em micro-organismos causadores da anaplasmose, e em particular, bactérias da espécie Anaplasma marginate. A presente invenção se refere ainda a conjuntos de peptídeos híbridos, a composições e a kits compreendendo tais novos peptídeos híbridos, aos usos dos mesmos e aos métodos de induzir resposta imune. Cada peptídeo híbrido, de acordo com a presente invenção, compreende dois ou mais fragmentos peptídicos das sequências de aminoácidos, conforme definidas na presente invenção, ligados entre si por meio de um elemento espaçador. Os fragmentos peptídicos combinados são fragmentos peptídicos das proteínas MSP1, MSP1 a, MSP1 b, MSP2, MSP2-HRV, MSP3, OMP7, OMP8, VirB9 e VirBIO.

1/81 “PEPTÍDEO HÍBRIDO, CONJUNTO DE PEPTÍDEOS HÍBRIDOS, COMPOSIÇÃO, USOS DO PEPTÍDEO HÍBRIDO, MÉTODO DE INDUZIR

RESPOSTA IMUNE E KITS”

Campo da Invenção [001] A presente invenção se refere a novos peptídeos híbridos, desenvolvidos a partir da combinação de fragmentos peptídicos de proteínas de superfície de membrana presentes em micro-organismos causadores da anaplasmose, em particular, bactérias da espécie Anaplasma marginale. A presente invenção se refere ainda a conjuntos de peptídeos híbridos, a composições e a kits compreendendo tais novos peptídeos híbridos, aos usos dos mesmos e aos métodos de induzir resposta imune.

[002] Cada peptídeo híbrido, de acordo com a presente invenção, compreende dois ou mais fragmentos peptídicos das sequências de aminoácidos, conforme definidas na presente invenção, ligados entre si por meio de um elemento espaçador. Os fragmentos peptídicos combinados são fragmentos peptídicos das proteínas MSP1, MSP1a, MSP1b, MSP2, MSP2HRV, MSP3, OMP7, OMP8, VirB9 e VirBIO.

Antecedentes da Invenção [003] A anaplasmose é uma doença hemolítica causada principalmente por bactérias do gênero Anaplasma, e em particular, Anaplasma marginale, as quais podem ser transmitidas de diversas formas. Mais comunmente, a transmissão pode ocorrer mecanicamente por meio de artrópodes (tais como moscas hematófagas) e por meio de instrumentos contaminados (tais como agulhas, instrumentos de tatuagem bovina, equipamentos de descorna, entre outros); biologicamente (por meio de vetores carrapatos); por via iatrogênica; ou, ainda, por via transplacentária. Diversos ruminantes, tais como bovinos, búfalos, bisão, antílope, cervos, entre outros, bem como, em menor grau, os seres humanos, podem tornar-se infectados por

2/81 tais bactérias. Em humanos, A. phagocytophilum é reportada como causadora da anaplasmose granulocítica humana. A contribuição de cada fator de transmissão vai depender do animal em questão e da região geográfica em que se encontram.

[004] Em particular, a infecção de rebanhos de gado por bactérias da espécie Anaplasma marginale (Rickettsiales: Anaplasmataceae) possui importante impacto econômico ao setor pecuário. Isso decorre das altas taxas de morbidade e mortalidade, levando à perda de milhões de dólares por ano. No gado, os eritrócitos correspondem ao único sítio da infecção. Após a detecção da infecção eritrocítica, o número de eritrócitos parasitados aumenta exponencialmente, levando à anemia e à icterícia. Ainda, os sintomas clínicos incluem febre, letargia, perda de peso, redução da produção de leite e aborto, frequentemente levando animais com idade superior a 2 anos à morte.

[005] Seguindo a infecção inicial, o período de incubação é de 17-45 dias. A. marginale invade os eritrócitos e inicia os ciclos de replicação. Eritrócitos infectados são removidos pelo sistema retículoendotelial e subsequente reinvasão de eritrócitos. Durante a infecção inicial há um aumento geométrico em que o número de eritrócitos infectados dobra a cada 24 horas. Durante a fase aguda, o número de eritrócitos infectados pode ser alto como 10⁹ células por mL de sangue (Palmer et al., 1999).

[006] Dependendo da cepa de A. marginale e a susceptibilidade do hospedeiro, de 10% a 90% dos eritrócitos podem ser parasitados na fase aguda da infecção. A concentração de eritrócitos infectados varia marcadamente a intervalos de dois meses de 10³ a 10⁵ células infectadas por mL de sangue (Eriks et al., 1989), muito mais baixa que no animal agudamente infectado (> 10⁹). Dado que a média de vida das células vermelhas é de 160 dias, para manter a infecção persistente, novos eritrócitos devem ser reinfectados continuamente. Isto é acompanhado pelo mecanismo de evasão

3/81 da resposta imune em reservatório persistentemente infectado, seguido de emergência e replicação de variantes antigênicas de A. marginale. Cada ciclo reflete a emergência de um ou mais, comumente múltiplos clones que expressam a única região hipervariável (HVR) da MSP2 (French et al., 1998) e MSP3 (Brayton et al., 2003; Futse et al., 2009). Estas “variantes escape” não são reconhecidas pelos anticorpos presentes no período de emergência e são controladas concomitantemente pelo desenvolvimento de lgG2 dirigido à região específica HVR da MSP2 e MSP3 (Palmer et al., 2000). Esse ciclo de emergência e controle continua sem redução permitindo a persistência da infecção por toda a vida (Palmer et ai., 2006).

[007] Os custos dos tratamentos são significativos, e os tratamentos em si, nem sempre efetivos. As medidas de manejo da doença consistem principalmente no combate aos vetores biológicos e de moscas hematófagas, por exemplo, com o uso de carrapaticidas e mosquicidas, respectivamente. Mas também na administração de antibióticos, em transfusões sanguíneas em animais altamente infectados, na administração de fármacos para incentivar a produção de novos eritrócitos e na vacinação. Por ser considerada a medida mais efetiva e econômica dentre as citadas, a vacinação costuma ser a forma escolhida para o controle da anaplasmose bovina. No entanto, as vacinas atualmente disponíveis são escassas, além de possuírem muitas desvantagens.

[008] As abordagens tradicionais para elaboração de vacinas para controle da anaplasmose são basicamente de dois tipos: a partir de organismos vivos ou atenuados e a partir de organismos mortos ou inativados. Ambas protegem apenas parcialmente e induzem imunidade protetora que reduz ou impede a doença clinica, mas não impedem o gado de se tornar persistentemente infectado com A. marginale - servindo como reservatórios.

[009] Outras desvantagens das abordagens tradicionais de

4/81 elaboração de vacinas para controle da anaplasmose são as seguintes: são processos trabalhosos, demorados, despadronizados, custosos e essencialmente rudimentares de produção. Além disso, são essencialmente dependentes de material biológico, motivo pelo qual incorrem em todas as desvantagens recém-citadas, não permitindo a produção de vacinas em larga escala. Ainda, quando são à base de sangue, conferem risco inerente de contaminação por outros patógenos. De maneira geral, podem induzir a produção de anticorpos, sem conferir imunoproteção.

[010] Por exemplo: o documento de patente norte-americano US3511908A revela um método de produção de vacina contra a anaplasmose, que inclui as etapas de exsanguinação de bovino infectado, mistura de anticoagulante com o sangue obtido, centrifugação do sangue anticoagulado para sedimentar os eritrócitos sem ruptura dos mesmos, suspensão dos eritrócitos em solução salina fisiológica, ultrassonicação da solução suspendida para ruptura dos eritrócitos e liberação dos corpos de anaplasma sem destruição dos mesmos, centrifugação da solução suspendida para sedimentar os corpos de anaplasma, suspensão dos corpos de anaplasma em água destilada e, finalmente, liofilização dos corpos de anaplasma para obtenção de antígenos. Os antígenos assim obtidos são misturados em adjuvante e utilizados para vacinação dos animais.

[011] O documento de patente norte-americano US3674860 revela método de produção de vacina contra a anaplasmose a partir de cepas atenuadas de bactérias A. marginale, que inclui as etapas de exposição de eritrócitos derivados de bovino infectado à radiação, inoculação de tais células irradiadas em hospedeiro ruminante não bovino suscetível (cervos, ovinos ou caprinos), cultivo do sangue de tal hospedeiro contendo as bactérias A. marginale atenuadas, inoculação em série do sangue cultivado em uma pluralidade de ditos hospedeiros, continuação de

5/81 dita inoculação em série até que as bactérias A. marginale sejam confirmadas como atenuadas em sangue cultivado por meio de exames específicos e cultivo do sangue de ditos hospedeiros com as bactérias confirmadas como atenuadas. O sangue contendo bactérias A. marginale assim atenuadas é utilizado para vacinação dos animais.

[012] O documento de patente norte-americano US4956278 revela método de produção de vacina contra a anaplasmose de forma que não induza hemólise neonatal, e inclui as etapas de lise seletiva de eritrócitos infectados com A. marginale, concentração de A. marginale e eritrócitos lisados enquanto há separação dos leucócitos ali presentes, submissão do concentrado a fracionamento sob pressão para liberar os corpos iniciais de A. marginale, concentração de tais corpos por centrifugação em gradiente, cultivo e lavagem dos mesmos para obtê-los de forma substancialmente pura. Tais corpos assim purificados são utilizados para a vacinação dos animais.

[013] Lasmar et al. (2012) ensaiaram vacina inativada de A. marginale, cultivada em cultura de células de carrapato Ixodes scapularis IDE8. As células de carrapato foram infectadas a partir de sangue contendo isolados de bactérias. Cerca de 14 dias após a inoculação, colônias de A. marginale foram observadas e infecção subsequente de células foi obtida pela transferência de células infectadas para células não infectadas. Quando o nível de infecção atingiu 70 a 80% das células, estas foram centrifugadas, o botão celular formado foi homogeneizado e incubado com tripsina, os corpos iniciais de A. marginale do sobrenadante foram quantificados, ajustados em doses e inativados. Subsequentemente, os antígenos foram emulsionados em adjuvante, agitados e incubados à temperatura ambiente para posterior vacinação dos animais.

[014] Hammac et al. (2013) obtiveram uma vacina experimental a partir de suspensão de células de carrapato de Ixodes scapularis ISE6 intactas,

6/81 frescas e não purificadas, infectadas com cepas de A. marginale.

[015] Em outras abordagens de vacinação, a estratégia foi direcionada para o papel de proteínas de superfície de membrana de microorganismos responsáveis pela infecção. As proteínas de superfície de membrana de tais micro-organismos, tais como as proteínas de superfície principais - MSPs (MSP, major surface protein) - ou as proteínas externas de membrana - OMPs (OMP, outer membrane proteins) - têm papel crucial no processo de infecção do eritrócito e na sobrevida da rickettsia no hospedeiro. Portanto, tais abordagens também têm sido objeto de pesquisa e desenvolvimento de vacinas experimentais contra a anaplasmose.

[016] Embora alguns dos estudos e desenvolvimentos experimentais nesta direção, com resultados mais ou menos satisfatórios, tivessem aprimorado em parte as desvantagens dos métodos tradicionais de vacinação, não se mostraram ideais, seja do ponto de vista de imunização, seja do ponto de vista de processo de fabricação para larga escala.

[017] De acordo com Palmer e colaboradores (1989), bovinos imunizados com as proteínas nativas de superfície de A. marginale MSP1 e MSP2 foram parcialmente protegidos contra desafio homólogo ou heterólogo com cepa de A. marginale virulenta (Palmer et al., 1989).

[018] Em 1995, Palmer e McEIwain demonstraram que a proteína nativa de superfície MSP1a não conferiu proteção aos animais vacinados (Palmer; McEIwain, 1995).

[019] O documento de patente norte-americano US6979451, por exemplo, revela método de produção de vacina contra a anaplasmose a partir de uma composição compreendendo a proteína de superfície principal MSP 1a recombinante combinada ou não com um preparado antigênico derivado de linhagem de células de carrapato IDE8 infectada com A. marginale.

[020] Em 2005, Abbot e colaboradores verificaram que a proteína

7/81 nativa de superfície MSP2, associada à interleucina 12 (IL-12) e a adjuvantes, que estimulam a resposta imunológica do tipo Th1 (celular; produção de citocinas) em bovinos, não estimulou a resposta protetora contra desafio homólogo com A. marginale (Abbott et al., 2005).

[021] Lopez et al. (2005) não verificaram imunoproteção frente às proteínas externas de membrana OMP. No entanto, soros de bovinos imunizados com membrana de A. marginale reconheceram as proteínas externas de membrana OMP4, OMP7, OMP10 e OMP14.

[022] Brayton et al. (2005) demonstraram que as proteínas OMP4, OMP7, OMP10 e OMP14 foram reconhecidas por soros de bovinos imunizados com membrana de A. marginale e, portanto, seriam promissoras para desenvolvimento de imunógenos.

[023] A associação das proteínas recombinantes MSP1a (região C-terminal) e MSP2 em adjuvante (CpG ODN 2006) não conferiu proteção contra desafio heterólogo, apesar de significativa produção de imunoglobulina G (IgG) total contra as duas proteínas, e de lgG2 contra MSP1a (Araújo, 2005).

[024] Kawasaki et al. (2007) demonstraram que uma vacina contendo subunidades das proteínas recombinantes MSP1a, MSP1b, MSP4 e MSP5, em adjuvante ISCOM e Freund induzia a resposta humoral em camundongos BALB/c, sugerindo que uma vacina contendo proteínas recombinantes MSP poderia ser eficiente na infecção aguda.

[025] Agnes et al. (2011) e Noh et al. (2008) testaram frações da membrana de A. marginale contendo diferentes proteínas de superfície de membrana, OMP e MSP. Como resultado, verificaram a produção de anticorpos lgG2 e redução da bacteremia.

[026] Testes de imunogenicidade de fragmentos de MSP1a recombinante, em camundongos BALB/c, indicaram estímulo de resposta humoral e celular, produção de anticorpos lgG2 e liberação de citocinas pró8/81 inflamatórias (Santos et al., 2013; Silvestre et al., 2014).

[027] Finalmente, cabe chamar a atenção para os fatores de virulência, os quais são secretados por um complexo presente em tais microorganismos, chamado T4SS (type IV secretion system proteins), que promove a invasão celular no hospedeiro e a sobrevivência intracelular dos microorganismos. Ensaios realizados em bovinos demonstraram que os fatores VirB9 e VirBIO de bactérias estimulam a resposta imune tanto celular quanto humoral (Lopez et al., 2007; Araújo et al., 2008; Morse et al., 2012a; Morse et al., 2012b).

[028] Lopez et al. (2007) imunizaram gado com frações da membrana externa de A. marginale e verificaram que houve produção de anticorpos contra fatores de virulência secretados pelo complexo T4SS da rickettsia, aumento da proliferação de linfócitos T e secreção de interferongama (INF-gama).

[029] Apesar do aumento do conhecimento científico acerca do papel destas proteínas na capacidade de infecção das células pelos microorganismos, bem como na capacidade de indução de resposta imune (a qual pode ou não estar associada à proteção e/ou redução de sintomas dos animais imunizados), as abordagens até então não se mostraram promissoras o suficiente para a fabricação de uma vacina contra a anaplasmose em larga escala a contento, de modo que estratégias melhoradas, mais eficientes e/ou producentes de imunização, em especial para vacinação em larga escala, ainda se fazem necessárias.

[030] Neste sentido, para satisfazer as necessidades da arte anterior, desenvolveu-se a presente invenção, que revela novas entidades ou construções peptídicas (peptídeos híbridos) como epítopos vacinais, em particular contra a anaplasmose. Os peptídeos híbridos, de acordo com a presente invenção, utilizados, por exemplo, para vacinação de bovinos contra a

9/81 anaplasmose, permitiram proteção dos animais. Além de eficácia bastante elevada, a utilização de peptídeos sintéticos permite completa independência de uso de material biológico para a fabricação dos mesmos, possibilitando a desejada produção em larga escala e, por conseguinte, resolvendo, pelo menos em parte, as desvantagens citadas do estado da técnica. Aliar em uma vacina contra a anaplasmose eficácia com capacidade de produção em larga escala representa, de forma até então não obtida, um grande avanço em relação ao estado da técnica.

Breve Descrição das Sequências [031] SEQ ID NO; 1 se refere à sequência de um fragmento peptídico da proteína MSP1a.

[032] SEQ ID NO: 2 se refere à sequência de um fragmento peptídico da proteína MSP1b.

[033] SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5 se referem às sequências de fragmentos peptídicos da proteína MSP1.

[034] SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO; 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10 se referem às sequências de fragmentos peptídicos da proteína MSP2.

[035] SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12 se referem às sequências de fragmentos peptídicos da proteína MSP2-HRV.

[036] SEQ ID NO: 13 se refere à sequência de um fragmento peptídico da proteína MSP3.

[037] SEQ ID NO: 14 se refere à sequência de um fragmento peptídico da proteína OMP8.

[038] SEQ ID NO: 15 se refere à sequência de um fragmento peptídico da proteína OMP7.

[039] SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 17 se referem às sequências de fragmentos peptídicos da proteína VirB9.

10/81 [040] SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 19 se referem às sequências de fragmentos peptídicos da proteína VirBIO.

[041] SEQ ID NO: 20 se refere ao peptídeo híbrido originado da ligação entre os fragmentos peptídicos das sequências SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6, por meio de um elemento espaçador constituído por 4 resíduos de glicina, de acordo com a construção (SEQ ID NO: 5)-GGGG-(SEQ ID NO: 6) (P28).

[042] SEQ ID NO: 21 se refere ao peptídeo híbrido originado da ligação entre os fragmentos peptídicos das sequências SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 17, por meio de um elemento espaçador constituído por 3 resíduos de glicina, de acordo com a construção (SEQ ID NO: 3)-GGG-(SEQ ID NO: 17) (P41).

[043] SEQ ID NO: 22 se refere ao peptídeo híbrido originado da ligação entre os fragmentos peptídicos das sequências SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 12, por meio de um elemento espaçador constituído por 3 resíduos de glicina, de acordo com a construção (SEQ ID NO: 13)-GGG-(SEQ ID NO: 12) (P42).

[044] SEQ ID NO: 23 se refere ao peptídeo híbrido originado da ligação entre os fragmentos peptídicos das sequências SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 15, por meio de um elemento espaçador constituído por 4 resíduos de glicina, de acordo com a construção (SEQ ID NO: 14)-GGGG-(SEQ ID NO: 15) (P44).

[045] SEQ ID NO: 24 se refere ao peptídeo híbrido originado da ligação entre os fragmentos peptídicos das sequências SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 16, por meio de um elemento espaçador constituído por 4 resíduos de glicina, de acordo com a construção (SEQ ID NO: 14)-GGGG-(SEQ ID NO: 16) (P50).

[046] SEQ ID NO: 25 se refere ao peptídeo híbrido originado da

11/81 ligação entre os fragmentos peptídicos das sequências SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 19, por meio de um elemento espaçador constituído por 4 resíduos de glicina, de acordo com a construção (SEQ ID NO: 13)-GGGG-(SEQ ID NO: 19) (P51).

[047] SEQ ID NO: 26 se refere ao peptídeo híbrido originado da ligação entre os fragmentos peptídicos das sequências SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 17, por meio de um elemento espaçador entre os fragmentos constituído por 4 resíduos de glicina, de acordo com a construção (SEQ ID NO: 5)-GGGG-(SEQ ID NO: 6)-GGGG-(SEQ ID NO: 17) (P53).

[048] SEQ ID NO: 27 se refere ao peptídeo híbrido originado da ligação entre os fragmentos peptídicos das sequências SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 18, por meio de um elemento espaçador constituído por 4 resíduos de glicina, de acordo com a construção (SEQ ID NO: 1)-GGGG-(SEQ ID NO: 18) (P54).

[049] SEQ ID NO: 28 se refere ao peptídeo híbrido originado da ligação entre os fragmentos peptídicos das sequências SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 18, por meio de um elemento espaçador constituído por 4 resíduos de glicina, de acordo com a construção (SEQ ID NO: 4)-GGGG-(SEQ ID NO: 18) (P48).

[050] SEQ ID NO: 29 se refere ao peptídeo híbrido originado da ligação entre os fragmentos peptídicos das sequências SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 17, por meio de um elemento espaçador entre os fragmentos constituído por 4 resíduos de glicina, de acordo com a construção (SEQ ID NO: 2)-GGGG-(SEQ ID NO: 14)-GGGG-(SEQ ID NO: 17) (P73).

[051] SEQ ID NO: 30 se refere ao peptídeo híbrido originado da ligação entre os fragmentos peptídicos das sequências SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 18, por meio de um elemento espaçador constituído por 4 resíduos de glicina, de acordo com a construção (SEQ ID NO: 7)-GGGG-(SEQ ID NO: 18)

12/81 (Ρ55).

[052] SEQ ID NO: 31 se refere ao peptídeo híbrido originado da ligação entre os fragmentos peptídicos das sequências SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 16, por meio de um elemento espaçador constituído por 5 resíduos de glicina, de acordo com a construção (SEQ ID NO: 8)-GGGGG-(SEQ ID NO: 16) (P52).

[053] SEQ ID NO: 32 se refere ao peptídeo híbrido originado da ligação entre os fragmentos peptídicos das sequências SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 18, por meio de um elemento espaçador constituído por 4 resíduos de glicina, de acordo com a construção (SEQ ID NO: 9)-GGGG-(SEQ ID NO: 18) (P57).

[054] SEQ ID NO: 33 se refere ao peptídeo híbrido originado da ligação entre os fragmentos peptídicos das sequências SEQ ID NO:11, SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 15, por meio de um elemento espaçador entre os fragmentos constituído por 4 resíduos de glicina, de acordo com a construção (SEQ ID NO: 11)-GGGG-(SEQ ID NO: 1)-GGGG-(SEQ ID NO: 15) (P68).

[055] SEQ ID NO: 34 se refere ao oligonucleotídeo direto 5’-3’ (forward ou F) do gene que codifica a interleucina-2 (IL-2) (Tabela 5) utilizado no experimento de PCR em tempo Real Quantitativa.

[056] SEQ ID NO: 35 se refere ao oligonucleotídeo inverso 5-3’ (reverse ou R) de IL-2 (Tabela 5) utilizado no experimento de PCR em tempo Real Quantitativa.

[057] SEQ ID NO: 36 se refere ao oligonucleotídeo direto 5’-3’ do gene que codifica o interferon-γ (IFN-γ) (Tabela 5) utilizado no experimento de PCR em tempo Real Quantitativa.

[058] SEQ ID NO: 37 se refere ao oligonucleotídeo inverso 5’-3’ de IFN-y (Tabela 5) utilizado no experimento de PCR em tempo Real Quantitativa.

13/81 [059] SEQ ID NO: 38 se refere ao oligonucleotídeo direto 5’-3’ do gene que codifica o fator de necrose tumoral-α (TNF-a) (Tabela 5) utilizado no experimento de PCR em tempo Real Quantitativa.

[060] SEQ ID NO: 39 se refere ao oligonucleotídeo inverso 5’-3’ de TNF-α (Tabela 5) utilizado no experimento de PCR em tempo Real Quantitativa.

[061] SEQ ID NO: 40 se refere ao oligonucleotídeo direto 5’-3’ do gene que codifica a interleucina-12 (IL-12) (Tabela 5) utilizado no experimento de PCR em tempo Real Quantitativa.

[062] SEQ ID NO: 41 se refere ao oligonucleotídeo inverso 5’-3’ de IL-12 (Tabela 5) utilizado no experimento de PCR em tempo Real Quantitativa.

[063] SEQ ID NO: 42 se refere ao oligonucleotídeo direto 5-3’ do gene que codifica a interleucina-10 (IL-10) (Tabela 5) utilizado no experimento de PCR em tempo Real Quantitativa.

[064] SEQ ID NO: 43 se refere ao oligonucleotídeo inverso 5’-3’ de IL-10 (Tabela 5) utilizado no experimento de PCR em tempo Real Quantitativa.

[065] SEQ ID NO: 44 se refere ao oligonucleotídeo direto 5’-3’ do gene que codifica a histona H3, família 3A (H3F3A) (Tabela 5) utilizado no experimento de PCR em tempo Real Quantitativa.

[066] SEQ ID NO: 45 se refere ao oligonucleotídeo inverso 5’-3’ de H3F3A (Tabela 5) utilizado no experimento de PCR em tempo Real Quantitativa.

[067] SEQ ID NO: 46 se refere ao oligonucleotídeo direto 5’-3’ do gene que codifica a MSP1b de Anaplasma marginale utilizado no experimento de PCR em tempo Real Quantitativa.

[068] SEQ ID NO: 47 se refere ao oligonucleotídeo inverso 5'-3’

14/81 de MSP1b de Anaplasma marginale utilizado no experimento de PCR em tempo Real Quantitativa.

[069] SEQ ID NO: 48 se refere ao oligonucleotídeo 5’-3’ da sonda de hidrólise utilizado no experimento de PCR em tempo Real Quantitativa.

Descrição Resumida da Invenção [070] A presente invenção se refere a novos peptídeos híbridos, desenvolvidos a partir da combinação de fragmentos peptídicos de proteínas de superfície de membrana presentes em micro-organismos causadores da anaplasmose, em particular, bactérias da espécie Anaplasma marginale. Os fragmentos foram definidos como epítopos vacinais a partir de abordagem racional dos inventores, com auxílio de banco de dados de imunogenicidade. A presente invenção se refere ainda a conjuntos de peptídeos híbridos, a composições e a kits compreendendo tais novos peptídeos híbridos, aos usos dos mesmos e aos métodos de induzir resposta imune.

[071] Assim, um primeiro objeto da presente invenção é um peptídeo híbrido compreendendo dois ou mais fragmentos peptídicos das sequências de aminoácidos dentre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 19, ligados entre si por meio de um elemento espaçador.

[072] Uma realização preferencial da presente invenção é um peptídeo híbrido, compreendendo dois ou três fragmentos peptídicos das sequências de aminoácidos dentre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 19, ligados entre si por meio de um elemento espaçador.

15/81 [073] Preferencialmente, o dito elemento espaçador é constituído por um ou mais resíduos de glicina ou um ou mais resíduos de prolina ou quaisquer combinações dos mesmos. Mais preferencialmente, o elemento espaçador é constituído por 2 a 15 resíduos de glicina, particularmente 2 a 10 resíduos de glicina, mais particularmente 3 a 5 resíduos de glicina.

[074] Outra realização preferencial da presente invenção é o peptídeo híbrido consistindo, cada um, na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 33, preferencialmente na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 27.

[075] Um segundo objeto da presente invenção é um conjunto de peptídeos híbridos, compreendendo pelo menos dois peptídeos híbridos, conforme definidos pela presente invenção. Por exemplo, é um conjunto de peptídeos híbridos, compreendendo pelo menos dois peptídeos híbridos, em que cada peptídeo híbrido compreende dois ou mais fragmentos peptídicos das sequências de aminoácidos dentre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO. 18 e SEQ ID NO: 19, ligados entre si por meio de um elemento espaçador.

[076] Preferencialmente, cada peptídeo híbrido do conjunto de peptídeos híbridos compreende dois ou três fragmentos peptídicos das sequências de aminoácidos dentre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:

16/81

13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 19, ligados entre si por meio de um elemento espaçador.

[077] O elemento espaçador de cada peptídeo híbrido do conjunto de peptídeos híbridos é constituído por um ou mais resíduos de glicina ou um ou mais resíduos de prolina ou quaisquer combinações dos mesmos. Mais preferencialmente, o elemento espaçador é constituído por 2 a 15 resíduos de glicina, particularmente 2 a 10 resíduos de glicina, mais particularmente 3 a 5 resíduos de glicina.

[078] Em uma realização preferencial da presente invenção, o conjunto de peptídeos híbridos compreende pelo menos dois peptídeos híbridos das sequências de aminoácidos dentre SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO:

21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 33, mais preferencialmente das sequências de aminoácidos dentre SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27.

[079] Em outra realização preferencial da presente invenção, o conjunto de peptídeos híbridos compreende todos os peptídeos híbridos das sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO:

22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27.

[080] Em ainda outra realização preferencial da presente invenção, o conjunto de peptídeos híbridos compreende pelo menos dois peptídeos híbridos das sequências de aminoácidos dentre SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26. Preferencialmente, o conjunto de peptídeos híbridos compreende todos os peptídeos híbridos das sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, SEQ ID

17/81

NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26.

[081] Um terceiro objeto da presente invenção é uma composição compreendendo pelo menos um peptídeo híbrido, conforme definido pela presente invenção. Por exemplo, é uma composição compreendendo pelo menos um peptídeo híbrido, em que o pelo menos um peptídeo híbrido compreende dois ou mais fragmentos peptídicos das sequências de aminoácidos dentre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:

3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:

13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 19, ligados entre si por meio de um elemento espaçador.

[082] Preferencialmente, o pelo menos um peptídeo híbrido da composição compreende dois ou três fragmentos peptídicos das sequências de aminoácidos dentre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:

4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO:

14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 19, ligados entre si por meio de um elemento espaçador.

[083] O elemento espaçador do pelo menos um peptídeo híbrido da composição é constituído por um ou mais resíduos de glicina ou um ou mais resíduos de prolina ou quaisquer combinações dos mesmos. Mais preferencialmente, o elemento espaçador é constituído por 2 a 15 resíduos de glicina, particularmente 2 a 10 resíduos de glicina, mais particularmente 3 a 5 resíduos de glicina.

[084] Em uma realização preferencial da presente invenção, a composição compreende pelo menos um peptídeo híbrido, em que o pelo menos um peptídeo híbrido consiste, cada um, na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID

18/81

NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 33.

[085] Em outra realização preferencial da presente invenção, a composição compreende pelo menos um peptídeo híbrido, em que o pelo menos um peptídeo híbrido consiste, cada um, na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27. Preferencialmente, a composição da presente invenção compreende de 2 a 8 peptídeos híbridos, preferencialmente de 3 a 7 peptídeos híbridos, mais preferencialmente de 4 a 6 peptídeos híbridos.

[086] A composição, de acordo com a presente invenção, compreende preferencialmente um ou mais diluentes e/ou um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis e/ou um ou mais compostos biologicamente ativos adicionais.

[087] A composição, de acordo com a presente invenção, compreende preferencialmente um ou mais adjuvantes adicionais. Preferencialmente, o um ou mais adjuvantes são selecionados dentre adjuvante completo de Freund, adjuvante incompleto de Freund, hidróxido de alumínio, sílica e saponina. Ainda mais preferencialmente, o um ou mais adjuvantes são selecionados dentre adjuvante completo de Freund e adjuvante incompleto de Freund.

[088] A composição, de acordo com a presente invenção, é preferencialmente na forma de solução, mistura, pó, grânulos, aerossol ou liofilizada.

[089] Em uma realização preferencial da presente invenção, a composição é uma vacina, particularmente para imunizar, tratar, proteger, amenizar e/ou prevenir doenças ou sintomas de doenças e/ou novas infecções com ausência ou redução de sintomas clínicos, causadas por bactérias,

19/81 rickettsias ou protozoários, em que as bactérias são particularmente do gênero Anaplasma, mais particularmente Anaplasma marginale, e em que os protozoários são particularmente Babesia bovis ou Babesia bigemina.

[090] Preferencialmente, as bactérias, rickettsias ou protozoários são transmitidos por artrópodes, por infecção mecânica, por via iatrogênica ou por via transplacentária, em que os artrópodes são particularmente carrapatos ou insetos, mais particularmente carrapatos. Preferencialmente, o carrapato é da família Ixodidae, particularmente do gênero Rhipicephalus spp., mais particularmente o Rhipicephalus (Boophilus) microplus.

[091] Um quarto objeto da presente invenção é o uso de pelo menos um peptídeo híbrido, conforme definido pela presente invenção, para a fabricação de uma composição, conforme definida pela presente invenção. Preferencialmente, a composição da presente invenção é para imunizar, tratar, proteger, amenizar e/ou prevenir doenças ou sintomas de doenças e/ou novas infecções com ausência ou redução de sintomas clínicos, causadas por bactérias, particularmente do gênero Anaplasma, mais particularmente Anaplasma marginale, em um humano ou animal, particularmente um ruminante, mais particularmente um bovino.

[092] Um quinto objeto da presente invenção é o uso de pelo menos um peptídeo híbrido, conforme definido pela presente invenção, em um processo de cultivo in vitro de células.

[093] Um sexto objeto da presente invenção é o uso de pelo menos um peptídeo híbrido, conforme definido pela presente invenção, para diagnóstico.

[094] Um sétimo objeto da presente invenção é um método de induzir resposta imune, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição, conforme definida pela presente invenção, a um humano ou animal. Preferencialmente, a quantidade

20/81 terapeuticamente eficaz é de 50 a 150 pg, mais preferencialmente de 80 a 130 pg, mais preferencialmente ainda de 100 pg, de cada peptídeo híbrido por humano ou animal. Preferencialmente, a resposta imune é para imunizar, tratar, proteger, amenizar e/ou prevenir doenças ou sintomas de doenças e/ou novas infecções com ausência ou redução de sintomas clínicos, causadas por bactérias, particularmente do gênero Anaplasma, mais particularmente Anaplasma marginale, em um animal, particularmente em um ruminante, mais particularmente em um bovino. Preferencialmente, a resposta imune é por meio do auxílio de um carreador.

[095] Um oitavo objeto da presente invenção é um kit, compreendendo pelo um peptídeo híbrido, conforme definido pela presente invenção. Um nono objeto da presente invenção é um kit, compreendendo uma composição, conforme definida pela presente invenção. Preferencialmente, os kits do oitavo e nono objetos são para diagnóstico e/ou para vacinação.

[096] Qualquer um dentre os objetos ou suas realizações preferenciais acima descritos podem servir de base para compor os outros objetos e suas realizações preferenciais, ainda que tal(tais) relação(ões) não tenha(m) sido explicitamente descrita(s).

[097] Os inventores da presente invenção revelaram que, por meio da vacinação de bovinos com os peptídeos híbridos, conforme definidos no presente documento, atingiu-se proteção dos animais.

Descrição Detalhada da Invenção

Definições [098] Salvo se definido de outro modo, todos os termos da técnica, anotações e outras terminologias científicas aqui utilizadas destinamse a ter os significados normalmente compreendidos pelos técnicos no assunto do campo da presente invenção. Em alguns casos, os termos com significados comumente entendidos são definidos no presente documento com a finalidade

21/81 de trazer clareza e/ou para pronta referência, e a inclusão de tais definições no presente documento não deve ser interpretada, necessariamente, como representando uma diferença substancial em relação ao que é geralmente entendido no estado da técnica.

[099] As técnicas e os procedimentos descritos ou referidos pelo presente documento são geralmente bem compreendidos e empregados usando a metodologia convencional pelos técnicos no assunto. Conforme apropriado, os processos que envolvem o uso de kits e reagentes disponíveis comercialmente são geralmente realizados de acordo com protocolos e/ou parâmetros definidos pelo fabricante, salvo quando indicado de outra forma.

[0100]Vale ressaltar que a presente invenção, onde for apropriado, não se limita à metodologia, protocolos, linhagem de células, gêneros ou espécies de animais, construções e reagentes específicos descritos, os quais, de forma óbvia, podem variar. Além disso, a terminologia utilizada no presente documento é apenas para o propósito de descrever exemplos de realizações específicas, e não se destina a limitar o escopo da presente invenção.

[0101] Ao longo do presente documento, as formas singulares “um”, “uma” e “o”, “a, ou formas singulares de qualquer termo ou expressão, incluem as referências ao plural, a menos que o contexto dite claramente de outra forma.

[0102] Ao longo do presente documento, a palavra “compreende”, e quaisquer variações como “compreendem” ou “compreendendo”, devem ser interpretadas como “termos abertos”, podendo implicar na inclusão de elementos ou grupos de elementos adicionais, os quais não foram explicitamente descritos, não possuindo caráter limitativo.

[0103] Ao longo do presente documento, a palavra “consiste”, e quaisquer variações como “consistem ou “consistindo”, devem ser

22/81 interpretadas “termos fechados”, não podendo implicar na inclusão de elementos ou grupos de elementos adicionais, os quais não foram explicitamente descritos, possuindo caráter limitativo.

[0104]Ao longo do presente documento, os valores exatos ou faixas de valores exatos fornecidos com relação a um fator, quantidade, concentração ou preferência particular devem ser interpretados como também fornecendo valores ou faixas de valores aproximados correspondentes, tal como por meio da expressão “cerca de”.

[0105] Ao longo do presente documento, palavras e expressões como “preferencialmente”, “particularmente, “por exemplo”, “como”, “tal como”, “mais particularmente” e similares, e suas variações, devem ser interpretadas como características inteiramente opcionais, realizações preferenciais ou exemplificações possíveis não exaustivas, sem conferir caráter limitativo de escopo.

[0106] Ao longo do presente documento, todos os títulos e subtítulos são utilizados apenas por conveniência e não deverão ser interpretados como limitações da presente invenção.

[0107]Ao longo do presente documento, a palavra “peptídeo”, deve ser interpretada como uma única cadeia linear de monômeros de aminoácidos ligados por ligações peptídicas. Aminoácidos que tenham sido incorporados em peptídeos são denominados “resíduos”. Todo peptídeo possui um resíduo N-terminal e um resíduo C-terminal nas extremidades correspondentes do peptídeo. Ainda, ao longo do presente documento, a palavra “peptídeo” deve ser interpretada como compreendendo qualquer número de resíduos consecutivos. Ainda, as palavras “peptídeo”, “polipeptídeo” e “proteína devem ser interpretadas como sinônimas, podem ser intercambiáveis entre si e não devem ser interpretadas como possuindo um número determinado de resíduos.

23/81 [0108] Ao longo do presente documento, a expressão “peptídeo híbrido” deve ser interpretada como um peptídeo originado pela junção, ligação, união ou conexão de dois ou mais fragmentos peptídicos iguais ou diferentes, conforme definidos pela presente invenção, em qualquer ordem, em que tal junção, ligação, união ou conexão entre fragmentos peptídicos é realizada por meio de um elemento espaçador. A ligação peptídeo-elemento espaçador é realizada preferencialmente por meio de ligação peptídica.

[0109]Ainda, ao longo do presente documento, as palavras “peptídeo”, “peptídeo híbrido”, “polipeptídeo”, “fragmento peptídico” e “proteína” devem ser interpretadas como possuindo qualquer forma, sendo linear ou com conformação tridimensional nativa ou particular de interesse. Os fragmentos peptídicos a serem ligados podem ser originados a partir de micro-organismos da mesma espécie ou de espécies diferentes. Ainda, os fragmentos peptídicos e os peptídeos híbridos podem ser sinteticamente sintetizados (por exemplo, por técnicas de síntese de fase sólida), originados de forma recombinante (por exemplo, por meio do uso cassete de expressão sob o controle de um promotor específico) ou a partir de quaisquer tecnologias pertinentes do campo da invenção conhecidas por um técnico no assunto. Técnicas suficientes para guiá-lo são encontradas também na literatura.

[0110] De acordo com a presente invenção, modificações estruturais para melhorar a estabilidade in vivo dos peptídeos, bem como aprimorar as propriedades moleculares relacionadas ao mecanismo de ação, resultando em melhoria da atividade farmacológica (peptideomiméticos), se houver, devem ser consideradas como dentro do escopo da presente invenção.

[0111]Tais modificações podem estar limitadas especificamente a proteger ou substituir a ligação lábil (ligação peptídica), a partir da introdução de fragmentos/porções atípicas (não peptídicas), ou mesmo alterar a conformação do peptídeo. Modificações moleculares promissoras (não

24/81 peptídicas) seriam aquelas que tentam mimetizar a estrutura e propriedades moleculares do peptídeo.

[0112] Exemplos de modificações moleculares possíveis seriam (Gentilucci et al., 2010): pseudopepdídeos, os quais apresentam modificação na cadeia principal de pelo menos uma ligação peptídica com grupos isósteros ou isoeletrônicos, tais como amidas reduzidas, azopeptídeos, peptídeos retroinversos, peptóides; substituição por aminoácidos não-naturais, tais como substituição de L-aminoácidos por respectivos D-enantiômeros; utilização de Nalquil aminoácidos, alfa-aminoácidos alfa-substituídos, alfa-aminoácidos betasubstituídos, análogos de prolina, gama- e beta-aminoácidos; ciclização, tais como macrolactonas; pontes de éter, biaril, dissulfeto ou outras que mimetizem as já citadas; ligação da porção N e C terminal da cadeia principal, ou da porção N ou C terminal com cadeias laterais de aminoácidos.

[0113]Além disso, um técnico no assunto irá reconhecer que, substituições conservadoras que resultam na alteração de um aminoácido por outro aminoácido quimicamente semelhante em uma sequência, estão dentro do escopo da presente invenção. Tais substituições conservadoras fornecendo aminoácidos funcionalmente semelhantes são conhecidas na técnica.

[0114] Ao longo do presente documento, a expressão “elemento espaçador” deve ser interpretada como um elemento de junção, ligação, união ou conexão dos peptídeos, conforme definidos pela presente invenção. Por exemplo, o elemento espaçador pode ser constituído por um ou mais resíduos de glicina (Gly ou G) ou um ou mais resíduos de prolina (Pro ou P) ou quaisquer combinações dos mesmos. Por exemplo, o elemento espaçador pode ser GPGPG. Preferencialmente, o elemento espaçador é constituído por um ou mais resíduos de glicina. Mais preferencialmente, o elemento espaçador é constituído por 2 a 15 resíduos de glicina, particularmente 2 a 10 resíduos de glicina, mais particularmente 3 a 5 resíduos de glicina. Tais resíduos de glicina

25/81 foram selecionados para conferir liberdade conformacional (flexibilidade) ao peptídeo híbrido resultante, sem comprometer de forma impactante a ação prevista. Assim, a natureza do elemento espaçador não é de particular relevância ou crítica para a presente invenção. Neste sentido, deve ser entendido, de acordo com a presente invenção, que qualquer elemento espaçador que confira ao peptídeo híbrido resultante função equivalente, está dentro do escopo da presente invenção.

[0115] Ao longo do presente documento, a expressão “conjunto de peptídeos híbridos” deve ser interpretada como um agrupamento, coleção ou agregado compreendendo pelo menos dois peptídeos híbridos, conforme definidos pela presente invenção. Neste contexto, a expressão “pelo menos dois” se refere à quantidade de 2 a 30 peptídeos híbridos, bem como a qualquer faixa entre tais valores. Preferencialmente, o conjunto de peptídeos híbridos, de acordo com a presente invenção, compreende de 2 a 8 peptídeos híbridos, particularmente de 3 a 7 peptídeos híbridos, mais particularmente de 4 a 6 peptídeos híbridos.

[0100] Ao longo do presente documento, a palavra “diluente” deve ser interpretada como qualquer substância que tenha a função de diluir, preservando as propriedades do que está sendo diluido. Assim, deve ser entendido, de acordo com a presente invenção, que qualquer diluente convencional, em qualquer forma, usualmente empregado para diluir, está dentro do escopo da presente invenção. Diluentes aceitáveis são devidamente conhecidos por um técnico no assunto. O diluente inclui, mas não está limitado a: água, álcool e soluções estéreis.

[0116] Ao longo do presente documento, a expressão “excipiente farmaceuticamente aceitável” deve ser interpretada como qualquer veículo, ou substância que não seja um ingrediente farmaceuticamente ativo. Assim, deve ser entendido, de acordo com a presente invenção, que qualquer excipiente

26/81 farmaceuticamente aceitável convencional, em qualquer forma, usualmente empregado para atuar como excipiente, está dentro do escopo da presente invenção. Excipientes farmaceuticamente aceitáveis são devidamente conhecidos por um técnico no assunto, bem como podem ser escolhidos a partir de Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Remington, 22^a edição ou Handbook of pharmaceutical excipients, Rowe, 8^a edição, incorporados no presente documento como referência. O excipiente farmaceuticamente aceitável inclui, mas não está limitado a: tampão ou solução salina, estabilizante, tensoativo, solubilizante, emulsificante e conservante.

[0117] Ao longo do presente documento, a palavra “adjuvante” deve ser interpretada como qualquer substância que module ou aumente a imunogenicidade dos peptídeos híbridos da presente invenção. Assim, deve ser entendido, de acordo com a presente invenção, que qualquer adjuvante convencional, em qualquer forma, usualmente empregado em composições com este fim, está dentro do escopo da presente invenção. O adjuvante inclui, mas não está limitado a: adjuvante completo de Freund, adjuvante incompleto de Freund, hidróxido de alumínio, sílica e saponina.

[0118] Ao longo do presente documento, a palavra “carreador” deve ser interpretada como um transportador, um grupo diretor ou qualquer estrutura na qual o peptídeo pode ser incorporado ou com o qual pode ser associado, de forma a direcionar e/ou facilitar e/ou melhorar o desencadeamento de uma resposta imune por um ser humano ou um animal. Assim, deve ser entendido, de acordo com a presente invenção, que qualquer carreador convencional, em qualquer forma, usualmente empregado para atuar como carreador está dentro do escopo da presente invenção. Carreadores adequados são devidamente conhecidos por um técnico no assunto. O carreador inclui, mas não está limitado a: partículas de ouro coloidal, anticorpos ou fragmentos de anticorpos, polímeros, vesículas e nanovesículas.

27/81 [0119] Ao longo do presente documento, a expressão “substância ou composto biologicamente ativo adicional” deve ser entendida como qualquer substância ou composto que exerce efeito biologicamente ativo. Assim, deve ser entendido, de acordo com a presente invenção, que qualquer substância ou composto biologicamente ativo adicional convencional, em qualquer forma, usualmente empregado para atuar como tal, está dentro do escopo da presente invenção. Podem exercer sua função pelo mesmo mecanismo ou por mecanismos similares ou diferentes. Podem ter uma multiplicidade de mecanismos de ação relacionados e/ou ter mecanismos de ação independentes. Os compostos ou substâncias biologicamente ativos adicionais incluem, mas não estão limitados a: potencializadores, agonistas, etc.

[0120] Ao longo do presente documento, a expressão “quantidade terapeuticamente eficaz” refere-se à quantidade de peptídeo que é suficiente para resultar em um efeito terapêutico no dito humano ou animal. A quantidade terapeuticamente eficaz pode tanto ser prontamente determinada por um técnico no assunto seguindo procedimentos de rotina, sem experimentação indevida, considerando a via de administração, a composição específica utilizada, os fatores clínicos, a idade e o peso do humano ou animal, entre outros, se for o caso, quanto ser a mesma independente dos fatores citados. Preferencialmente, a quantidade terapeuticamente eficaz é de 50 a 150 pg, mais preferencialmente de 80 a 130 pg, mais preferencialmente ainda de 100 pg, de cada peptídeo híbrido por humano ou animal.

[0121] Pelo menos um peptídeo híbrido da presente invenção pode ser utilizado para a fabricação de uma composição. Neste contexto, a expressão “pelo menos um” se refere à quantidade de 1 a 30 peptídeos híbridos, bem como a qualquer faixa entre tais valores. Preferencialmente, o pelo menos um peptídeo híbrido, de acordo com a presente invenção, compreende de 2 a 8 peptídeos híbridos, particularmente de 3 a 7 peptídeos

28/81 híbridos, mais particularmente de 4 a 6 peptídeos híbridos.

[0122] A composição da presente invenção pode ser formulada de acordo com a metodologia padrão conhecida por um técnico no assunto, não sendo de particular importância para a presente invenção. Ainda, a composição da presente invenção pode ser em qualquer forma, considerando a função da composição, a via de administração e o efeito desejado. Formas possíveis incluem, mas não estão limitadas a: solução, mistura, pó, grânulos, aerossol ou Iiofilizada.

[0123] A composição da presente invenção pode ser administrada a um humano ou animal por diversas vias de administração padrão, considerando a forma da composição e o efeito desejado. Pode ser para efeito predominantemente local ou sistêmico. A composição da presente invenção pode, por exemplo, ser em forma de solução para administração subcutânea, em forma de aerossol para administração intranasal ou mesmo em forma de solução para administração intramuscular, por exemplo, na região da tábua do pescoço. Outras vias de administração incluem, mas não estão limitadas a: oral, tópica, implantável, intravenosa, intra-arterial, intradérmica, intraperitoneai e parenteral.

[0124] A composição da presente invenção é preferencialmente uma vacina. Preferencialmete, a forma da composição de vacina da presente invenção é solução, para administração intramuscular.

[0125] A composição da presente invenção é preferencialmente para imunizar, tratar, proteger, amenizar e/ou prevenir doenças ou sintomas de doenças e/ou novas infecções com ausência ou redução de sintomas clínicos, causadas por bactérias, rickettsias ou protozoários. As bactérias e/ou rickettsias incluem, mas não estão limitadas às da classe Alphaproteobacteria, preferencialmente às da família Anaplasmataceae, como, por exemplo, Anaplasma marginale, Anaplasma phagocytophilum, Anaplasma ovis,

29/81

Anaplasma centrale, Anaplasma bovis. Os protozoários incluem, mas não estão limitados aos da classe Sarcodina, preferencialmente os da ordem Piroplasmida, como, por exemplo, Babesia bovis e Babesia bigemina. Em particular, a composição da presente invenção é para imunizar, tratar, proteger, amenizar e/ou prevenir doenças ou sintomas de doenças e/ou novas infecções com ausência ou redução de sintomas clínicos, causadas por bactérias do gênero Anaplasma, mais particularmente Anaplasma marginale. Em particular, a composição da presente invenção é para imunizar, tratar, proteger, amenizar e/ou prevenir doenças ou sintomas de doenças e/ou novas infecções com ausência ou redução de sintomas clínicos, causadas por protozoários, particularmente Babesia bovis ou Babesia bigemina. Em particular, composição da presente invenção é para imunizar, tratar, proteger, amenizar e/ou prevenir doenças ou sintomas de doenças e/ou novas infecções com ausência ou redução de sintomas clínicos, causadas por bactérias, particularmente do gênero Anaplasma, mais particularmente Anaplasma marginale, em um humano ou animal, particularmente um ruminante, mais particularmente um bovino.

[0126] A transmissão de tais bactérias, rickettsias ou protozoários pode ser realizada mecanicamente ou biologicamente por artrópodes. Usualmente, a transmissão mecânica por artrópodes é realizada por meio de mosquitos. Usualmente, a transmissão biológica por artrópodes é realizada por meio de carrapatos. Ainda, a transmissão pode ser realizada por infecção mecânica, por meio de instrumentos contaminados (tais como agulhas, instrumentos de tatuagem bovina, equipamentos de descorna, entre outros). Ainda, a transmissão pode ser realizada por via iatrogênica ou por via transplacentária. Preferencialmente, a composição da presente invenção é para imunizar, tratar, proteger, amenizar e/ou prevenir doenças ou sintomas de doenças e/ou novas infecções com ausência ou redução de sintomas clínicos,

30/81 causadas por bactérias ou rickettsias, particularmente bactérias do gênero Anaplasma, mais particularmente A. marginale, transmitidas por carrapatos. Preferencialmente, o carrapato é da família Ixodidae, particularmente do gênero Rhipicephalus spp., mais particularmente o Rhipicephalus (Boophilus) microplus.

[0127]Ainda, pelo menos um peptídeo híbrido da presente invenção pode ser utilizado para a fabricação de uma composição, conforme definida pela presente invenção, por qualquer método conhecido por um técnico no assunto, sem qualquer experimentação indevida. Ainda, pelo menos um peptídeo híbrido da presente invenção pode ser utilizado em um processo de cultivo in vitro de células. Tal processo inclui qualquer processo que envolve pelo menos uma etapa de cultivo in vitro de células, ou em que todas as etapas são realizadas in vitro. Tais processos incluem, mas não estão limitados a: processos de elaboração de vacinas, reagentes ou medicamentos, em que há utilização de células ou culturas de células humanas, vegetais, animais ou de micro-organismos, tais como, por exemplo, em um processo que utiliza culturas de células de carrapato. Ainda, pelo menos um peptídeo híbrido da presente invenção pode ser utilizado para realização de diagnóstico. Por exemplo, os peptídeos híbridos da presente invenção podem ser utilizados para diagóstico de doenças ou condições associadas à resposta imune, seja em humano ou animal.

[0128] A composição, de acordo com a presente invenção, pode ser utilizada em um método para indução de resposta imune. Ou em outras palavras, a presente invenção também se refere a um método de induzir resposta imune, que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição, conforme definida pela presente invenção, a um humano ou animal. De acordo com o presente documento, a expressão “indução de resposta imune ou apenas “resposta imune”, deve ser

31/81 interpretada como a resposta de modulação, particularmente de aumento ou incentivo de produção de anticorpos por linfócitos B, células T auxiliares e/ou outras células imunes, seja diretamente, seja indiretamente por meio do desencadeamento coordenado da resposta, frente ao estimulo dado a humanos ou a animais. Preferencialmente, a resposta imune é para imunizar, tratar, proteger, amenizar e/ou prevenir doenças ou sintomas de doenças e/ou novas infecções com ausência ou redução de sintomas clínicos. Preferencialmente, as doenças ou sintomas de doenças são causadas por bactérias, rickettsias ou protozoários. Mais preferencialmente por bactérias, particularmente do gênero Anapiasma, mais particularmente Anaplasma marginale. Preferencialmente, a resposta imune é para imunizar, tratar, proteger, amenizar e/ou prevenir doenças ou sintomas de doenças e/ou novas infecções com ausência ou redução de sintomas clínicos, em um ruminante, mais particularmente em um bovino. Preferencialmente, a resposta imune pode ser desencadeada, auxiliada ou dirigida por meio do uso de pelo menos um carreador.

[0129] O método de induzir resposta imune pode ser por administração de dose única ou administração de doses repetidas da vacina em intervalos de tempo predeterminados. Preferencialmente, o regime de administração é por imunização com 3 doses, com intervalo de 15 dias entre elas.

[0130] Em uma modalidade adicional, a presente invenção fornece um kit compreendendo pelo menos um peptídeo híbrido da presente invenção. Em outra modalidade adicional, a presente invenção fornece um kit compreendendo pelo menos uma composição da presente invenção, que compreende pelo menos um peptídeo híbrido da presente invenção.

[0131] Preferencialmente, o kit é para diagnóstico, particularmente para diagnóstico de doenças ou condições associadas à resposta imune, seja em humano ou animal. Assim, o kit inclui preferencialmente um recipiente,

32/81 compreendendo pelo menos um peptídeo ou pelo menos uma composição, de acordo com a presente invenção, e instruções de uso e/ou pelo menos um segundo recipiente com outra composição, tal como um reagente, particularmente um reagente de detecção, tal como um anticorpo.

Preferencialmente, inclui adicionalmente instrumento ou dispositivo para auxílio de diagnóstico.

[0132] Em outra modalidade da presente invenção, o kit é preferencialmente para vacinação. Preferencialmente, a vacina é para imunizar, tratar, proteger, amenizar e/ou prevenir doenças ou sintomas de doenças e/ou novas infecções com ausência ou redução de sintomas clínicos, causadas por bactérias, rickettsias ou protozoários, em que as bactérias são particularmente do gênero Anaplasma, mais particularmente Anaplasma marginale, e em que os protozoários são particularmente Babesia bovis ou Babesia bigemina. Assim, o kit inclui preferencialmente um recipiente, compreendendo pelo menos um peptídeo ou pelo menos uma composição, de acordo com a presente invenção, e instruções de uso e/ou pelo menos um segundo recipiente com outra composição, tal como um segundo composto biologicamente ativo adicional. Ainda, pode incluir instrumento ou dispositivo de aplicação.

[0133] A presente invenção também é ilustrada pelos exemplos a seguir que, todavia, não devem ser interpretados como limitações do escopo de proteção da invenção. As características descritas no relatório descritivo acima e nos exemplos a seguir podem, separadamente e em qualquer combinação, servir de base para a realização da presente invenção em suas diversas formas de concretização e realização possíveis.

Exemplos

Vacina Experimental [0134] Inicialmente, procedeu-se com a obtenção de corpúsculos

33/81 de Anaplasma marginale e antígenos vacinais (proteínas de membranas de A. marginale) a serem utilizados na imunização de bovinos (vacina experimental). A partir dos soros dos animais naturalmente infectados por A. marginale e animais imunizados com a vacina experimental realizaram-se ensaios subsequentes de análise proteômica que culminaram na revelação de fragmentos peptídicos, que foram posteriormente avaliados em bancos de dados para a identificação de potenciais epítopos (análise in silico). Os epítopos potenciais foram classificados de acordo com o tipo de resposta imune (humoral e celular) e, então, selecionados para compor as sequências dos peptídeos híbridos sintéticos da presente invenção.

Animais Experimentais e Manejo [0135] Utilizaram-se bezerros machos mestiços da raça Holandesa (HPB X Gir). Em intervalos regulares de 30 dias, logo após o nascimento e até o final do experimento, os bezerros foram tratados com carrapaticida fluazuron para impedir uma possível infestação natural por B. microplus.

[0136] Desde os primeiros dias de vida e até o final do ensaio, os animais foram submetidos ao aleitamento artificial e receberam ração balanceada para bezerros em crescimento. Durante este período (4-5 meses), os animais também foram vacinados contra carbúnculo sintomático e febre aftosa e receberam vermífugo e sal mineral ad libitum. A temperatura retal de cada bezerro foi anotada diariamente, pela manhã e à tarde. Ainda, os animais foram testados periodicamente para possível infecção por Babesia bovis, B. bigemina e Anaplasma marginale (pesquisa de hematozoários e detecção de imunidades humoral). Para pesquisa de hematozoários e determinação de parasitemia, amostras de sangue dos animais experimentais foram obtidas por meio da punção da veia marginal da orelha. A pesquisa de hematozoários foi realizada em esfregaços sanguíneos corados com Giemsa e a parasitemia

34/81 determinada mediante contagem do número de eritrócitos parasitados em 1000 células vermelhas, com auxílio de uma ocular reticulada e objetiva de imersão em óleo (1000x). Somente os animais negativos foram esplenectomizados.

Esplenectomia [0137] Bezerros entre 4 e 5 meses de idade, negativos para os hemoparasitas descritos acima, após terem recebido tranquilizante (cloridrato de xilazina a 2%), foram submetidos à tricotomia da região lombar esquerda, desde a 12^a costela até a tuberosidade iliaca, tendo como limite superior a coluna vertebral. Em seguida, em ato contínuo, procedeu-se a anestesia local infiltrativa mediante administração de cloridrato de xilocaína a 2% em “L” invertido na região da fossa paralombar esquerda. Os animais, na mesa cirúrgica, foram mantidos em decúbito lateral direito e a antissepsia do campo operatório foi realizada com álcool iodado. Após a colocação dos panos de campo e com auxílio de bisturi, incidiu-se a pele desde a apófise transversa da primeira vértebra lombar até aproximadamente 2 cm da borda caudal da 13^a costela. Em segundo plano, com auxílio de tesoura curva, incidiu-se os músculos oblíquos e transverso do abdome, e desta forma, incidiu-se também o peritônio. Após exposição da cavidade, introduziu-se a mão no espaço subcostal junto ao diafragma deslocando o baço deste último e do rúmen, mediante técnica de divulsão manual da serosa, a qual mantêm o baço aderido ao rúmen. Desta forma, isolou-se o hilo esplênico, o qual foi ligado com fio de algodão 000. Após rigorosa inspeção do coto ligado, a cavidade foi fechada com sutura contínua, do tipo festonada, com categute cromado número 1, fixando-se no primeiro plano de sutura, o peritônio e o músculo transverso e, no segundo plano, os músculos oblíquos. Posteriormente, aplicaram-se pontos de “U” horizontais com fio de algodão 000 na pele. O pós-operatório constou de curativos com aplicação local de tintura de iodo a 2% e antibioticoterapia à base de penicilina e estreptomicina durante cinco dias consecutivos. Os pontos

35/81 foram retirados 10 dias após a intervenção cirúrgica.

Infecção Experimental [0138] A infecção experimental por Anaplasma marginale foi realizada por via endovenosa, em bezerros esplenectomizados de quatro a cinco meses de idade. Foi empregada, para estudo, amostra patogênica de A. marginale (cepa Jaboticabal), conforme utilizada em outros estudos (Barbosa da Silva, et al., 2014), número de acesso Genbank KJ398398. Esta amostra tem sido mantida em animais esplenectomizados e em dimetilsulfoxido (DMSO) a 10%, criopreservada em nitrogênio líquido a -196 °C. Após a administração do inóculo por via endovenosa, a parasitemia ocorreu por volta do vigésimo terceiro dia, com nível de parasitemia máximo de 20%. Deste animal colheu-se 200 a 300 mL de sangue e transfundiu-se para um segundo bezerro esplenectomizado. Neste animal, o início da infecção e o nível de parasitemia máximo (40%) ocorreram por volta do terceiro dia ao sétimo dia após a inoculação.

Pesquisa de Anticorpos Anti-parasitas por meio da Reação de

IMUNOFLUORESCÉNCIA INDIRETA E ELISA-TESTE [0139] Para evidenciar uma possível exposição dos animais experimentais à Babesia bovis, B. bigemina e Anaplasma marginale, antes da esplenectomia, amostras de soro sanguíneo de cada bezerro foram submetidas à Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e ELISA-teste. Em bezerros esplenectomizados, as amostras de soro sanguíneo foram colhidas 15 dias antes e 7 dias após a esplenectomia. Somente os animais negativos foram utilizados para a infecção experimental.

Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI)

Antígeno [0140] O antígeno utilizado na RIFI constituiu-se de formas intraeritrocíticas de Babesia bovis, B. bigemina e Anaplasma marginale, as

36/81 quais foram colhidas de bezerro esplenectomizado com elevado grau de parasitemia (20%-40%). Sangue parasitado por Babesia sp. e Anaplasma marginale colhido em igual volume de solução de Alsever, foi lavado em PBS pH 7,2 por cinco vezes consecutivas, eliminando-se a papa leucocitária a partir da primeira lavagem. O sedimento contendo hemácias parasitadas foi utilizado para confecção de esfregaços espessos, em lâminas de microscopia extrafinas e previamente desengorduradas. Esfregaços fixados com Metanol P.A. e corados com Giemsa revelaram elevada concentração dos parasitas, ou seja, 20-30 hemácias parasitadas por campo microscópico. Nessas condições, esfregaços preparados em lâminas foram secos à temperatura ambiente, embrulhados em papel higiênico extrafino e posteriormente separados em blocos contendo cinco lâminas, os quais, depois de devidamente etiquetados, acondicionados em recipiente hermeticamente fechado, foram mantidos em “freezer” a -70 °C até o momento do uso.

Descrição da Reação RIFI [0141] A técnica utilizada foi a estabelecida para a Babesia bovis e B. bigemina segundo metodologia de Machado et al., 1994. As lâminas preparadas para RIFI, conforme descrito acima, foram descongeladas, secas e as áreas, contendo o antígeno, delimitadas em círculos com auxílio de esmalte vermelho. Soros controle positivo e negativo e aqueles em estudo foram diluídos a 1:80 em solução salina a 0,85% e incubados com antígeno em câmara úmida a 37 °C, durante 40 minutos. Após este período de incubação, as lâminas foram submetidas a três lavagens de 5 minutos cada, com PBS pH 7,2 e a seguir, secas e recobertas com conjugado (conjugado anti-bovino, Sigma), diluído conforme recomendação do fabricante em PBS pH 7,2 contendo 0,01% de Azul de Evans. As lâminas foram novamente incubadas em câmara úmida por 40 minutos a 37 °C. Decorrido esse prazo, foram submetidas a três lavagens em PBS pH 7,2 e mergulhadas em água destilada por 30

37/81 segundos. Em seguida, as lâminas foram secas e montadas com lamínulas, utilizando-se uma solução glicerina tamponada a uma relação glicerina/tampão carbonato-bicarbonato 0,5 M pH 9,5 de 9:1, sendo então examinadas em microscópio equipado com luz fluorescente.

Preparo de Antígenos de Anaplasma marginale - Proteínas de Superfície de Membrana para Caracterização das MSPs e Realização do ELISA-teste

Antígeno [0142] Sangue de bezerros parasitados por Anaplasma marginale foi colhido em igual volume de solução de Alsever, centrifugado para a eliminação do plasma e o sedimento de eritrócitos lavado por três vezes com salina 0,85% estéril. Após a centrifugação, o sedimento contendo eritrócitos parasitados foi diluído em solução salina estéril a 0,85% a uma relação eritrócito/diluente de 1:4. Para lise de eritrócitos parasitados, utilizou-se a técnica descrita por Machado et al., 1994. Para tanto, preparou-se uma solução de cloreto de amônio a 0,83% e a nove volumes desta solução adicionou-se um volume de tampão Tris 0,17 M pH 7,65. A seguir, esta solução foi aquecida em banho-maria a 37 °C. A cada nove volumes desta solução foi adicionado um volume de suspensão de eritrócitos. A mistura foi então incubada em banho-maria a 37 °C durante 3 minutos, observando-se visível hemólise. Em seguida, à temperatura de 5 °C, a mistura foi centrifugada a 2500 x g por 15 minutos e o sedimento livre do estroma eritrocitico foi lavado em solução salina estéril a 0,85%, por três vezes consecutivas. Desse modo, corpúsculos de Anaplasma marginale livres foram utilizados para o preparo de antígeno solúvel bruto. Parte deste material foi utilizada, juntamente com soros negativos e positivos (oriundos de animais infectados naturalmente por A. marginale), nos experimentos de análise de proteômica subsequentemente descritos. Parte do material foi submetida ao processo de sonicação (Sonicador Q55), com potência de 100%, pulso a cada 10 segundos, durante 5 minutos. O lisado

38/81 celular foi centrifugado a 1500 x g (Sorvall Legend Mach 1.6R), durante 15 minutos, a 4 °C. O botão celular obtido continha antígeno solúvel total de Anaplasma marginale, sendo sua concentração protéica dosada pelo método de Hartree (1972). A seguir, foi aliquotado, liofilizado e mantido à temperatura de -70 °C até o momento do uso. O mesmo procedimento foi adotado para obtenção de antigenos de superfície de hemácias normais, ou seja, não infectadas.

Descrição da Reação do ELISA-teste [0143] Após a obtenção do antígeno, o conteúdo protéico foi determinado pelo método do ácido bicincônico, utilizando-se o kit de reagentes BCA (BCA Reagents Kit-Pierce Chemical Company, UK), de acordo com as recomendações do fabricante. À cavidade das microplacas de fundo plano (Nunclon TM Surface, Nunc. Denmark) foram adicionados 100 pL da proteína de A. marginale diluída na concentração de reatividade de 10 pg/mL em tampão carbonato-bicarbonato de sódio 0,05 M ph 9,6. Após incubação, durante 12 horas em câmara úmida a 4 °C, o excesso de antígeno foi removido por três lavagens consecutivas com tampão PBS 0,01 M pH 7,4, contendo 0,05% de Tween 20 (PBS-Tween 20). As placas foram bloqueadas com PBSTween 20, acrescido de 6% de soro normal de coelho, em câmara úmida a 37 °C durante 90 minutos. Após nova lavagem para remoção do agente bloqueante, foram adicionados, em duplicata, 100 pL dos soros testes e soros de referência positivos e negativos, na diluição de 1:400 em PBS-Tween 20. As microplacas foram incubadas a 37 °C durante 1 hora em câmara úmida e a seguir lavadas conforme descrito anteriormente. Cem microlitros do conjugado bovino acoplado à fosfatase alcalina (IgG de coelho anti-lgG de bovino, Sigma) diluído em PBS-Tween 20, foram adicionados a cada cavidade da placa, seguindo-se nova incubação e lavagem, tal como na etapa anterior. O substrato da enzima fosfatase alcalina (paranitrofenilfosfato - pNPP, Sigma) foi

39/81 adicionado, incubando-se a reação por 30 minutos à temperatura ambiente. Decorrido esse período, a leitura da reação foi realizada em leitor de microplacas de ELISA (Microplate Reader MRX TC Plus, Dynex Technology,USA), a um comprimento de onda de 405 nm.

[0144] A atividade imunológica de cada soro testado foi calculada mediante a determinação do valor A/P (amostra em relação ao positivo), conforme descrito por Machado et al. (1997) e Andrade et al. (2004). Adicionalmente, os valores de densidade óptica (D.O.) dos soros foram agrupados em níveis de ELISA (NE).

Análise Proteòmica

Eletroforese Bidimensional [0145] Amostras de soros de animais bovinos mestiços da raça Holandesa infectados com cepa altamente virulenta de Anaplasma marginale (cepa Jaboticabal), de animais não infectados e de animais infectados com cepa Jaboticabal e vacinados (vacina experimental), conforme descrito acima, foram submetidos à análise por eletroforese bidimensional. De acordo com tal técnica, permite-se a separação de proteínas pelo seu ponto isoelétrico (primeira dimensão) e pela massa molecular (segunda dimensão).

[0146] A amostra enriquecida em membranas de Anaplasma marginale de hemácias de bovinos foi inicialmente preparada para eletroforese bidimensional por precipitação das proteínas utilizando-se o kit comercial Readyprep 2-D Cleanup Kit, da empresa Bio-Rad, seguindo instruções do fabricante.

[0147] Para a separação na primeira dimensão por ponto isoelétrico, as proteínas precipitadas (100 pg) foram dissolvidas em 125 pL de solução de reidratação contendo 7 M de uréia, 2 M de tiouréia, 4% p/v CHAPS, 0,2% de anfolito 3/10 da Bio-Rad v/v, 50 mM de ditiotreitol (DTT) e 0,002% de azul de bromofenol. A solução contendo as proteínas foi adicionada sobre as

40/81 fitas de focalização isoelétrica de 7 cm da Bio-Rad para separação entre pH 4 a pH 7 para reidratação por 16 horas à temperatura ambiente. Em seguida, as fitas foram colocadas em bandeja apropriada e focalizadas em aparelho Protean Í12 IEF System da Bio-Rad utilizando a seguinte programação: 250 V por 20 minutos, subindo gradualmente para 4000 V em 2 horas e permanecendo a 4000 V até completar 14000 V-h. Após focalização, as fitas foram equilibradas em tampão de equilíbrio I (6 M ureia, 2% SDS, 0,375 M TrisHCI (pH 8,8), 20% glicerol e 25 nM de DTT, por 10 minutos sob agitação. As fitas foram então transferidas para solução de equilíbrio II (6 M ureia, 2% SDS, 0,375 M Tris-HCI (pH 8,8), 20% glicerol). Após este período, as fitas foram colocadas no topo de géis de 12,5% poliacrilamida, em kit Mini Protean da BioRad, para separação na segunda dimensão por massa molecular, a uma tensão de 140 V.

[0148]A análise por eletroforese de duas dimensões permitiu a separação das proteínas de anaplasma pelo ponto isoelétrico e massa molecular.

[0149] Os géis da eletroforese foram então corados por Commassie Blue ou transferidos para membrana de PVDF para análise por Western-blotting.

Wes tern-bl otting [0150] O ensaio de Western-blotting permite a detecção de proteínas separadas em gel uni ou bidimensional e transferidas a membranas poliméricas para serem especificamente reconhecidas por anticorpos antiproteínas de interesse.

[0151]Após a corrida do SDS-PAGE, as proteínas do gel foram transferidas pelo método semisseco (Trans-Blot SD semi-dry transfer cell, Biorad) à uma membrana de PVDF utilizando as seguintes condições: 25 V, 0,5 A e 50 W por 50 minutos a uma hora.

41/81 [0152] Após a transferência, as membranas de PVDF foram bloqueadas em solução de 5% de leite desnatado em TBS por 16 horas a 4 °C e incubadas sob agitação por mais 1 hora com soro de animais infectados e não protegidos ou de animais imunizados e protegidos, diluído 100 x na mesma solução, à temperatura ambiente. As membranas foram então lavadas 4 x com solução TBS + 1% de Tween 20 e incubadas por mais 1 hora com o segundo anticorpo de camundongo anti-lgG de bovinos, marcado com peroxidase. As membranas foram novamente lavadas 4 x com solução TBS + 1% de Tween 20 e reveladas com kit Clarity Western ECL da Bio-Rad. As imagens foram adquiridas com auxílio do equipamento ChemiDoc MP Imaging System da BioRad.

[0153] Os pontos corados nos géis, correspondentes a pontos revelados nas membranas, foram cortados e submetidos à análise proteômica para identificação das proteínas neles presentes.

IMUNOPRECIPITAÇÃO [0154] A imunoprecipitação separa especificamente as proteínas do lisado que são reconhecidas pelos anticorpos do animal infectado. Esta metodologia fornece informações mais precisas a respeito daquelas proteínas que de fato induzem uma resposta imune no animal infectado.

[0155] Anticorpos do soro de bovinos infectados não protegidos e de bovinos imunizados e protegidos são ligados a uma resina através de proteína A/G. Em seguida, um lisado de membrana de Anaplasma marginale, obtida de hemácias de bovinos infectados é incubado com a resina ligada aos anticorpos. A resina é lavada e, em seguida, as proteínas que se ligaram aos anticorpos são removidas. Por meio de análise proteômica por espectrometria de massas as proteínas com potencial de induzir a expressão de anticorpos protetores foram identificadas.

[0156] Os anticorpos de soros de bovinos infectados e doentes,

42/81 imunizados e protegidos ou de bovinos saudáveis, foram acoplados à resina ligada com proteína A/G e a imunoprecipitação de proteínas de A. marginale reconhecidas por soros de bovinos infectados não protegidos e imunizados e protegidos foi realizada utilizando o kit Pierce Crosslink IP kit da Thermo Scientific, seguindo instruções do fabricante. Os soros utilizados eram constituídos de pools de soros de diversos animais na mesma condição. As soluções contendo as proteínas imunoprecipitadas foram submetidas à análise proteômica para identificação das proteínas reconhecidas pelo anticorpo.

Análise Proteômica [0157] A análise proteômica do tipo shotgun consiste em identificar o conjunto de proteínas de uma determinada amostra. Nesta etapa, amostras no spot do gel ou em solução obtidas na eluição por imunoprecipitação são analisadas por espectrometria de massas. Para tal, as proteínas das amostras passam por um processo de: (1) redução onde se quebra as pontes dissulfeto, (2) alquilação onde os grupos -SH são alquilados para evitar a formação das pontes de dissulfeto, (3) digestão com enzima tripsina e (4) dessalinização. As amostras são então analisadas no espectrômetro de massas. A identificação das proteínas é feita analisando-se os dados com auxílio do programa Mascot que faz uma busca dos peptídeos identificados contra um banco de dados das sequências proteicas do Anaplasma.

Digestão in gel com Tripsina [0158] As etapas de digestão in gel com tripsina foram realizadas segundo Hanna et al. (2000), onde os spoís de interesse do gel foram recortados dos géis de SDS-poliacrilamida de duas dimensões (com cerca de 1 mm x 5 mm) e colocadas em tubos de centrífuga de 1500 pL, previamente lavados com etanol absoluto e secos em estufa.

[0159] Cada spot de gel foi incubado em solução de metanol 50%

43/81 e ácido acético 5% durante 3 horas para remoção do SDS (dodecil sulfato de sódio). Após este período a solução foi removida e o gel foi desidratado com acetonitrila 100% durante 5 minutos por duas vezes; o gel então foi seco por centrifugação a vácuo (Speed Vac - SC210A Savant) por 3 minutos e após secagem foi adicionada uma solução de DTT (ditiotreitol) 10 mM em bicarbonato de amônio 100 mM (30 pL), para redução de pontes dissulfeto, por um período de 30 minutos. Após uma rápida centrifugação, a solução de DTT foi removida e foram adicionados 30 pL de iodoacetamida 50 mM em bicarbonato de amônio 100 mM por 30 minutos para alquilação dos grupos SH das cadeias laterais de cisteína. Após uma rápida centrifugação, o sobrenadante foi removido e o gel foi lavado com solução de bicarbonato de amônio 100 mM e novamente desidratado com acetonitrila 100% por 5 minutos, reidratado com bicarbonato de amônio 100 mM por 10 minutos e desidratado com acetonitrila 100% por 5 minutos por duas vezes.

[0160] Após secagem do gel por centrifugação a vácuo por 3 minutos, foram adicionados 30 pL de solução de tripsina 50 pg/mL (Sigma) preparada em bicarbonato de amônio 50 mM gelado. A incubação foi realizada durante 30 minutos em banho de gelo. Depois desta etapa, a solução de tripsina foi removida (sobrenadante) e ao fragmento de gel foram adicionados 20 pL de bicarbonato de amônio 50 mM e a incubação foi prolongada por 16 horas a 37 °C.

Digestão Tripsínica em Solução [0161] Às amostras lisadas foram adicionados 5 pL de DTT 1 M para redução das pontes dissulfeto, e estas foram incubadas por 1,5 hora em temperatura ambiente. Após a incubação com DTT, foram adicionados 20 pL de iodoacetamida para a alquilação das cisteínas por 1 hora no escuro em temperatura ambiente. Para consumir a iodoacetamida que não reagiu, foram adicionados 20 pL de DTT e as amostras foram incubadas por mais 1 hora.

44/81

Após a incubação, foram adicionados 775 μΙ_ de água Milli-Q e 2 pl_ de tripsina (Sigma) em quantidade suficiente para se obter uma razão protéica de 1:50, e as amostras foram então incubadas a 37 °C ovemight. No dia seguinte, a reação foi interrompida adicionando-se 2 pL de ácido acético 100%.

Dessalinização das Amostras [0162] As amostras foram dessalinizadas utilizando colunas de extração em fase sólida Sep-Pak Light tC18 (Waters Corporation, Estados Unidos). Inicialmente, as colunas foram condicionadas com 2 mL de metanol, seguido de 2 mL de ácido trifluoroacético (TFA) 0,1% e acetonitrila (ACN) 50% e 1 mL de TFA 0,1%. Após o condicionamento, as amostras foram carregadas com 1 mL de TFA 0,1% duas vezes, lavadas com TFA 0,1%, e eluidas da coluna com 2 mL de TFA 0,1% e ACN 50% transferindo lentamente para um tudo de centrífuga novo de 2 mL. Em seguida, o Sep-Pak foi lavado com 2 mL de ACN 100%.

[0163] As amostras foram secas e concentradas em Speed-Vac (RVC 2-18, CHRIST, Analítica). Após a secagem completa, as amostras foram ressuspendidas em 20 pL de ácido fórmico 0,1% e centrifugadas a 1000 rpm por 5 minutos para análise no espectrômetro de massas.

Análise por Espectrômetro de Massas [0164] As amostras foram analisadas no espectrômetro de massas LTQ Orbitrap Velos (Thermo Scientific, Estados Unidos) acoplado ao cromatógrafo líquido de nano-fluxo EASY-nLC (Thermo Scientific, Estados Unidos). Os peptídeos foram separados por um programa de gradiente de 120 minutos, da seguinte forma: 5-40% do solvente B (90% acetonitrila em 0,1% de ácido fórmico) por 90 minutos, seguido por 40-90% do solvente B por 20 minutos no fluxo de 200 nL/min usando uma pré coluna empacotada com 5 cm de beads de C18 de 10 pm (Júpiter, Phenomenex) em um capilar de dimensões ID 100 pm x OD 360 pm e uma coluna analítica de ponta com frit

45/81 empacotada com 15 cm de beads C18 de 5 pm (Aqua, Phenomenex) em um capilar de dimensões ID 75 pm x OD 360 pm.

[0165]O espectrômetro de massas foi operado em modo de aquisição dependente de dados (DDA, Data Dependent Acquisitiori), onde os 10 íons mais intensos de cada amostra foram selecionados para a fragmentação no ion trap linear utilizando a dissociação por fragmentação por colisão induzida por dissociação (CID) em MS/MS. A aquisição dos dados foi controlada pelo programa Xcalibur 1.4 (Thermo Scientific). As condições de análise foram: voltagem no capilar do nano-electrospray de 2,3 kV, temperatura da fonte a 250 °C, tempo de injeção no ion-trap ajustado a 100 ms e no FT-MS em 1000 ms com uma resolução de 60.000 em m/z 300-1800. O tempo de exclusão dinâmica foi ajustado para 70 segundos. Os arquivos de dados de massa (.raw) foram convertidos para .mgf usando o programa MS Convert (v.3.0.4445, ProteoWizard, SourceForge) e analisados no Mascot (v.2.4, Matrix Science Ltd, Boston, MA, USA). As proteínas foram identificadas por meio da pesquisa de dados MS e MS/MS em banco de dados de Anaplasma SP. baixados do Uniprot. A tripsina foi definida para a especificidade das enzimas com no máximo duas miss cleavages, a tolerância da massa dos íons precursores foi ajustada para 0,17. Na busca dos espectros MS/MS, foi determinada como modificação fixa a carbamidometilação de resíduos de cisteína, enquanto que a oxidação de metionina e acetilação de proteína N-terminal foram definidas como modificações variáveis.

[0166] Cada spot foi tratado e analisado no espectrômetro de massas do tipo Orbitrap acoplado a um cromatógrafo-nano, que permitiu a identificação das proteínas naquele spot determinado. A Tabela 1A-M apresenta as proteínas identificadas por análise proteômica de cada spot correspondente ao spot na membrana de PVDF reconhecido pelo soro de

46/81 animais imunizados e protegidos identificados pela análise por Westernblotting.

Tabela 1: Proteínas reconhecidas nos spots do gel por soro (COMPREENDENDO ANTICORPOS) DE BOI VACINADO NA ANÁLISE PROTEÔMICA

Tabela 1A-Spot1

50S ribosomal protein L7/L12 OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

ATP synthase F1, gamma subunit OS=Anaplasma phagocytophilum (strain HZ)

Citrate synthase (Fragment) OS=uncultured Bartonella sp.

DNA-directed RNA polymerase subunit alpha OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

Lon protease OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Major surface protein 2 (Fragment) OS=Anaplasma marginale Major surface protein 2 (Fragment) OS=Anaplasma marginale Membrane protein OS=Anaplasma marginale str. Gypsy Plains Msp2 (Fragment) OS=Anaplasma marginale OMP10 (Fragment) OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

OMP14 (Fragment) OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

OMP4 OS=Anaplasma marginale (strain Florida)

OMP8 OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

OMP9 OS=Anaplasma marginale (strain Florida)

Outer membrane protein 14 OS=Anaplasma marginale Outer membrane protein 8 OS=Anaplasma marginale Phosphoribosylamine--glycine ligase OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Putative isomerase OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Putative uncharacterized protein OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Putative uncharacterized protein OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

Uncharacterized protein OS=Anaplasma marginale str. Gypsy Plains Uncharacterized protein OS=Anaplasma phagocytophilum str

Tabela 1B-Spot4

1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase OS=A. marginale (strain St. Maries) BolA-like protein OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

DNA-directed RNA polymerase subunit alpha OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries) Immunogenic protein OS=Anaplasma phagocytophilum (strain HZ)

Iron binding protein FbpA OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

Major surface protein 2 (Fragment) OS=Anaplasma marginale Major surface protein 2 OS=Anaplasma marginale

Major surface protein 2 OS=Anaplasma ovis

Major surface protein 2 variant 9H1 (Fragment) OS=Anaplasma marginale

Major surface protein 3 OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Major surface protein 3 OS=Anaplasma marginale

Msp2 (Fragment) OS=Anaplasma marginale

0MP14 (Fragment) OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

47/81

ΟΜΡ7 (Fragment) OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

OMP9 OS=Anaplasma marginale (strain Florida)

Putative serine protease OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Putative uncharacterized protein OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Putative uncharacterized protein OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

Ribosomal RNA small subunit methyltransferase A OS=A. phagocytophilum (strain HZ) Type IV secretion system protein VirBIO OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Tabela 1C-Spot5

2- oxoglutarate dehydrogenase E1 component (Fragment) OS=A. phagocytophilum AnkA OS=Anaplasma phagocytophilum

BolA-like protein OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

DNA-directed RNA polymerase subunit alpha OS=A. phagocytophilum (strain HZ) DNA-directed RNA polymerase subunit beta OS=Wolbachia pipientis MSP2 family outer membrane protein OS=Anaplasma phagocytophilum str.

Major surface protein 2 (Fragment) OS=Anaplasma marginale Major surface protein 2 OS=Anaplasma marginale

Major surface protein 2 variant 9H1 (Fragment) OS=Anaplasma marginale

Msp2 (Fragment) OS=Anaplasma marginale

Putative NADH-quinone oxidoreductase, degenerate OS=A. phagocytophilum (strain HZ) Putative serine protease OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Putative uncharacterized protein OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Ribosomal RNA small subunit methyltransferase A OS=A. phagocytophilum (strain HZ) Succinyl-CoA ligase [ADP-forming] subunit beta OS=Anaplasma centrale (strain Israel) Type IV secretion system protein VirBIO OS=Anaplasma centrale (strain Israel) Uncharacterized protein OS=Anaplasma phagocytophilum (strain HZ)

Uncharacterized protein OS=Anaplasma phagocytophilum str. CRT38

Tabela 1D-Spot6

3- hydroxyacyl-CoA dehydrogenase OS=Anaplasma marginale str. Gypsy Plains Citrate synthase OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

DNA-directed RNA polymerase subunit alpha OS=Anaplasma centrale (strain Israel) DNA-directed RNA polymerase subunit beta OS=Anaplasma centrale (strain Israel) Elongation factor Tu OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

Fumarate hydratase class II OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

GMP synthase [glutamine-hydrolyzing] OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

Major surface protein 2 (Fragment) OS=Anaplasma marginale

Major surface protein 2 variant 9H1 (Fragment) OS=Anaplasma marginale

Major surface protein 3 (Fragment) OS=Anaplasma marginale

Major surface protein 3 OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Major surface protein 3 OS=Anaplasma marginale

Msp2 (Fragment) OS=Anaplasma marginale

OMP8 OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

Outer membrane protein 8 OS=Anaplasma marginale

Peptide Chain release factor 1 OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

48/81

Phosphoribosylamine--glycine ligase OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

Probable cytosol aminopeptidase OS=Anaplasma centrale (strain Israel) GN=pepA

Proline--tRNA ligase OS=Anaplasma marginale str. Gypsy Plains

Putative dihydrolipoamide acetyltransferase OS=Anaplasma centrale (strain Israel) Putative glutamate synthase OS=Anaplasma centrale (strain Israel) GN=ACIS_00837 Putative serine protease OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Putative uncharacterized protein OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Putative uncharacterized protein OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries) Ribosomal RNA small subunit methyltransferase A OS=A. phagocytophilum (strain HZ) Serine hydroxymethyltransferase OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Succinyl-CoA ligase [ADP-forming] subunit beta OS=Anaplasma centrale (strain Israel) Transcription termination factor Rho OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Type IV secretion system protein VirBIO OS=Anaplasma centrale (strain Israel) Uncharacterized protein OS=Anaplasma marginale str. Gypsy Plains Uncharacterized protein OS=Anaplasma phagocytophilum (strain HZ) tRNA (guanine-N(1)-)-methyltransferase OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Tabela 1E-SPQ7 7

Aspartate aminotransferase OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

DNA polymerase III, delta subunit OS=Anaplasma phagocytophilum (strain HZ) DNA-directed RNA polymerase subunit alpha OS=Anaplasma centrale (strain Israel) DNA-directed RNA polymerase subunit beta OS=Wolbachia pipientis

Iron binding protein FbpA OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

MSP2 family outer membrane protein OS=Anaplasma phagocytophilum str. CRT38

Major surface protein 2 (Fragment) OS=Anaplasma marginale

Major surface protein 2 (Fragment) OS=Anaplasma marginale

Major surface protein 2 (MSP2) OS=Anaplasma marginale (strain Florida)

Major surface protein 2 OS=Anaplasma marginale Major surface protein 2 OS=Anaplasma marginale Malate dehydrogenase OS=Anaplasma marginale str. Gypsy Plains Msp2 (Fragment) OS=Anaplasma marginale

0MP5 OS=Anaplasma marginale (strain Florida)

OMP9 OS=Anaplasma marginale (strain Florida)

Outer membrane protein 7 OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

Primosomal protein N~ OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Putative uncharacterized protein OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries) Transcription termination/antitermination protein NusA OS=A. phagocytophilum (st HZ) Type IV secretion system protein VirBIO OS=Anaplasma centrale (strain Israel) Uncharacterized protein OS=Anaplasma phagocytophilum (strain HZ)

Tabela 1F-Spor 8

Adenylosuccinate synthetase OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Immunogenic protein OS=Anaplasma phagocytophilum (strain HZ)

Major surface protein 2 (Fragment) OS=Anaplasma marginale

Major surface protein 2 OS=Anaplasma marginale

49/81

Major surface protein 2 variant 9H1 (Fragment) OS=Anaplasma marginale

Major surface protein 2 variant 9H1/G11/E6F7 (Fragment) OS=Anaplasma marginale

Major surface protein 3 (Fragment) OS=Anaplasma marginale

Malate dehydrogenase OS=Anaplasma marginale str. Gypsy Plains

Msp2 (Fragment) OS=Anaplasma marginale

OMP5 OS=Anaplasma marginale (strain Florida)

OMP9 OS=Anaplasma marginale (strain Florida)

Outer membrane protein 7 OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

Putative uncharacterized protein OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Putative uncharacterized protein OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries) Uncharacterized protein OS=Anaplasma phagocytophilum (strain HZ)

Tabela 1G-Spor 9

Major surface protein 2 (Fragment) OS=Anaplasma marginale

Major surface protein 2 (Fragment) OS=Anaplasma marginale

Major surface protein 2 (Fragment) OS=Anaplasma phagocytophilum

Major surface protein 2 (MSP2) OS=Anaplasma marginale (strain Florida)

Major surface protein 2 OS=Anaplasma marginale Major surface protein 2 OS=Anaplasma marginale

Major surface protein 2 hypervariable region (Fragment) OS=Anaplasma marginale Major surface protein 2 variable region (Fragment) OS=Anaplasma phagocytophilum Major surface protein 2 variant 9H1/G11/E6F7 (Fragment) OS=Anaplasma marginale Major surface protein 3 OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Major surface protein 3 OS=Anaplasma marginale

Malate dehydrogenase OS=Anaplasma marginale str. Gypsy Plains

Msp2 (Fragment) OS=Anaplasma marginale

OMP13 OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

OMP5 OS=Anaplasma marginale (strain Florida)

OMP7 (Fragment) OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

Outer membrane protein 4 OS=Anaplasma marginale

Putative uncharacterized protein OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Putative uncharacterized protein OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

Tabela 1H - Spot 10

30S ribosomal protein S2 OS=Anaplasma phagocytophilum (strain HZ)

AnkA OS=Anaplasma phagocytophilum

Cell division protein ftsA OS=Anaplasma phagocytophilum (strain HZ)

Immunogenic protein OS=Anaplasma phagocytophilum (strain HZ)

Iron binding protein FbpA OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

Major surface protein 2 (Fragment) OS=Anaplasma marginale

Major surface protein 4 (Fragment) OS=Anaplasma marginale

Malate dehydrogenase OS=Anaplasma marginale str. Gypsy Plains

Msp2 (Fragment) OS=Anaplasma marginale

Proline--tRNA ligase OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

Putative uncharacterized protein OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

50/81

Putative uncharacterized protein OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries) Succinyl-CoA ligase [ADP-forming] subunit alpha OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Tabela 11-Spot 11

30S ribosomal protein S2 OS=Anaplasma phagocytophilum (strain HZ)

50S ribosomal protein L7/L12 OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

CvpA family protein OS=Anaplasma phagocytophilum (strain HZ)

Immunogenic protein OS=Anaplasma phagocytophilum (strain HZ)

Major surface protein 2 (Fragment) OS=Anaplasma marginale

Major surface protein 3 (Fragment) OS=Anaplasma marginale

OMP1 OS=Anaplasma marginale (strain Florida)

OMP4 OS=Anaplasma marginale (strain Florida)

Outer membrane protein 4 OS=Anaplasma marginale

Putative 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase OS=A. phagocytophilum (strain Putative uncharacterized protein OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

Quinone oxidoreductase OS=Anaplasma centrale (strain Israel) GN=qor PE=4 SV=1 Succinyl-CoA ligase (ADP-forming] subunit alpha OS=Anaplasma centrale (strain Israel) Uncharacterized protein OS=Anaplasma marginale str. Gypsy Plains Uncharacterized protein OS=Anaplasma phagocytophilum str, CRT38

Tabela 1J-Spot 14 kDa chaperonin (Fragment) OS=Anaplasma phagocytophilum

ATP synthase subunit beta OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

Ana29 OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

Aspartyl/glutamyl-tRNA(Asn/Gln) amidotransferase subunit B OS=A. centrale (str Israel) Dihydrolipoamide acetyltransferase component OS=A. marginale (strain St. Maries) Elongation factor Tu OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Major surface protein 2 (Fragment) OS=Anaplasma marginale

Major surface protein 2 variant 9H1 (Fragment) OS=Anaplasma marginale

Msp1B OS=Anaplasma marginale

P44-new outer membrane protein OS=Anaplasma phagocytophilum str. CRT38 Peptidase M16 OS=Anaplasma marginale str. Dawn PmbA protein OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

Probable cytosol aminopeptidase OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

Putative serine protease OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Putative uncharacterized protein OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Putative uncharacterized protein OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries) Succinyl-CoA ligase [ADP-forming] subunit beta OS=Anaplasma centrale (strain Israel) Uncharacterized protein OS=Anaplasma phagocytophilum str. HZ2 VirBIO protein OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

Tabela 1K-Spot 15

50S ribosomal protein L7/L12 OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Adenylosuccinate synthetase OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Adenylosuccinate synthetase OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

51/81

AnkA OS=Anaplasma phagocytophilum

DNA polymerase III subunit beta OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Elongation factor Tu OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

Immunogenic protein OS=Anaplasma phagocytophilum (strain HZ)

Major surface protein 2 (Fragment) OS=Anap:asma marginale

Major surface protein 2 variant 9H1 (Fragment) OS=Anaplasma marginale

Major surface protein 3 (Fragment) OS=Anaplasma marginale

Major surface protein 3 (MSP3) OS=Anaplasma marginale (strain Florida)

Major surface protein 3 OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Msp2 (Fragment) OS=Anaplasma marginale

P44-new outer membrane protein OS=Anaplasma phagocytophilum str. CRT38 Peptidase M16 OS=Anaplasma marginale str. Dawn Phosphoribosylamine-glycine ligase OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

PmbA protein OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

Probable cytosol aminopeptidase OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries) Protease DO family protein OS=Anaplasma phagocytophilum (strain HZ)

Putative dihydrolipoamide acetyltransferase OS=Anaplasma centrale (strain Israel) Putative serine protease OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Putative uncharacterized protein OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries) Succinyl-CoA ligase [ADP-forming] subunit beta OS=A. marginale (strain St. Maries) Type IV secretion system protein VirBIO OS=Anaplasma centrale (strain Israel) Uncharacterized protein OS=Anaplasma phagocytophilum str. HZ2 Uncharacterized protein OS=Anaplasma phagocytophilum str. HZ2 p44 outer surface protein (Fragment) OS=Anaplasma phagocytophilum

Tabela 1L-Spot1 6

2-oxoglutarate dehydrogenase E1 component (Fragment) OS=A. phagocytophilum Adenylosuccinate synthetase OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

AnkA OS=Anaplasma phagocytophilum

Elongation factor Tu OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

Major surface protein 1b (Fragment) OS=Anaplasma marginale

Major surface protein 2 (Fragment) OS=Anaplasma marginale

Major surface protein 3 (Fragment) OS=Anaplasma marginale

Major surface protein 3 (MSP3) OS=Anaplasma marginale (strain Florida)

Major surface protein 3 OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Msp2 (Fragment) OS=Anaplasma marginale

Peptidase M16 OS=Anaplasma marginale str. Dawn

Peptidase pmbA OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Peptide chain release factor 1 OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Phosphoribosylamine--glycine ligase OS=Anaplasma centrale (strain Israel) Probable cytosol aminopeptidase OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries) Protease DO family protein OS=Anaplasma phagocytophilum (strain HZ)

Putative dihydrolipoamide acetyltransferase OS=Anaplasma centrale (strain Israel) Putative serine protease OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Putative transcriptional regulator OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

52/81

Putative uncharacterized protein OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Putative uncharacterized protein OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

Succinyl-CoA ligase [ADP-forming] subunit beta OS=A. marginale (strain St. Maries)

Type IV secretion system protein VirBIO OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Uncharacterized protein OS=Anaplasma phagocytophilum str. CRT38 tRNA (guanine-N(1)-)-methyltransferase OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Tabela 1IVI-Spot17

30S ribosomal protein S2 OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

ΑΤΡ synthase subunit beta OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Aminomethyl transferase family protein OS=Anaplasma phagocytophilum (strain HZ)

AnkA OS=Anaplasma phagocytophilum

Citrate synthase OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

CvpA family protein OS=Anaplasma phagocytophilum (strain HZ)

DNA-directed RNA polymerase subunit alpha OS=Anaplasma centrale (strain Israel) DNA-directed RNA polymerase subunit beta OS=Anaplasma centrale (strain Israel Dihydrolipoyl dehydrogenase OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

Elongation factor Tu OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

GMP synthase [glutamine-hydrolyzing] OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries) Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit A OS=Anaplasma centrale (strain Israel) Immunogenic protein OS=Anaplasma phagocytophilum (strain HZ)

Major surface protein 1 beta 2 OS=Anaplasma marginale

Major surface protein 2 (Fragment) OS=Anaplasma marginale

Major surface protein 2 variant 9H1 (Fragment) OS=Anaplasma marginale

Major surface protein 3 (Fragment) OS=Anaplasma marginale

Major surface protein 3 OS=Anaplasma marginale

Msp2 (Fragment) OS=Anaplasma marginale

Phosphoribosylamine-glycine ligase OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries) PmbA protein OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

Probable cytosol aminopeptidase OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries) Probable cytosol aminopeptidase OS=Anaplasma marginale Putative DNA gyrase control protein TldD OS=Anaplasma centrale (strain Israel) Putative dihydrolipoamide acetyltransferase OS=Anaplasma centrale (strain Israel) Putative serine protease OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Putative uncharacterized protein OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Putative uncharacterized protein OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

Putative uncharacterized protein pep1 OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries) Ribosomal RNA small subunit methyltransferase A OS=A. phagocytophilum (strain HZ) Serine hydroxymethyltransferase OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Succinyl-CoA ligase [ADP-forming] subunit beta OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Trigger factor OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

Trigger factor OS=Anaplasma marginale str. Gypsy Plains

Uncharacterized protein OS=Anaplasma phagocytophilum str. JM p44 outer surface protein (Fragment) OS=Anaplasma phagocytophilum tRNA (guanine-N(1)-)-methyltransferase OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

53/81

Tabela IN-Spot 18

3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase OS=Anaplasma marginale str. Gypsy Plains Citrate synthase OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

DNA-directed RNA polymerase subunit alpha OS=Anaplasma centrale (strain Israel) DNA-directed RNA polymerase subunit beta OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Elongation factorTu OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

Fumarate hydratase class II OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

GMP synthase [glutamine-hydrolyzing] OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

Major surface protein 2 (Fragment) OS=Anaplasma marginale Major surface protein 2 variant 9H1 (Fragment) OS=Anaplasma marginale Major surface protein 3 (Fragment) OS=Anaplasma marginale Major surface protein 3 OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Major surface protein 3 OS=Anaplasma marginale Msp2 (Fragment) OS=Anaplasma marginale

OMP8 OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

Outer membrane protein 8 OS=Anaplasma marginale

Peptide chain release factor 1 OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Phosphoribosylamine-glycine ligase OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

Probable cytosol aminopeptidase OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Proline--tRNA ligase OS=Anaplasma marginale str. Gypsy Plains

Putative dihydrolipoamide acetyltransferase OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Putative glutamate synthase OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Putative serine protease OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Putative uncharacterized protein OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Putative uncharacterized protein OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

Ribosomal RNA small subunit methyltransferase A OS=A. phagocytophilum (strain HZ)

Serine hydroxymethyltransferase OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Succinyl-CoA ligase [ADP-forming] subunit beta OS=Anaplasma centrale (strain Israel) Transcription termination factor Rho OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Type IV secretion system protein VirBIO OS=Anaplasma centrale (strain Israel) Uncharacterized protein OS=Anaplasma marginale str. Gypsy Plains Uncharacterized protein OS=Anaplasma phagocytophilum (strain HZ) tRNA (guanine-N(1)-)-methyltransferase OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Estratégia Racional de Triagem in silico [0167] Os dados provenientes da análise proteômica do soro de bovinos infectados com A marginale e vacinados (vacina experimental) (grupo vacinados) foram utilizados para direcionar a triagem in silico de fragmentos peptídicos com potencial imunogênico. No entanto, a análise proteômica permitiu a identificação de fragmentos proteicos reconhecidos por anticorpos em 3 grupos de animais: animais infectados e vacinados (grupo vacinados),

54/81 animais infectados (grupo positivo) e animais não infectados (grupo negativo).

[0168] Identificaram-se 153 proteínas no grupo de animais infetados e vacinados (grupo vacinados) e dentre tais proteínas encontraramse 80 fragmentos proteicos diferentes (alguns fragmentos menores estavam contidos nos fragmentos maiores), que foram separados de acordo com as respectivas famílias de proteínas. Cabe ressaltar que 50% dos fragmentos identificados no soro de animais vacinados pertenciam às proteínas principais de superfície MSP: MSP1a, MPS2 e MPS3, e de membrana externa OMP: OMP7 e OMP8 de A. marginale.

[0169] A busca por epítopos de A. marginale, com dados experimentais de imunogenicidade publicados (ensaios de proliferação de linfócitos TCD4 e produção de anticorpos lgG2) foi realizada no banco de dados de livre acesso IEDB (Immune Epitope Database and Analysis Resource; Vita et al., 2014), que tem um número expressivo de citações em artigos científicos.

[0170]As condições utilizadas na busca foram as seguintes: hospedeiro ruminante; ensaios positivos para reposta mediada por linfócito T e linfócito B; antígenos disponíveis para Anaplasma marginale contemplando a família de proteínas MSP (MSP1a, MSP2, MSP3) e os fatores de virulência (VirB9, VirBIO). Os fatores de virulência são secretados por um complexo da rickettsia, chamado T4SS, que promove a invasão celular no hospedeiro e a sobrevivência intracelular da rickettsia. Ensaios realizados em bovinos demonstraram que os fatores VirB9 e VirBIO estimulam a resposta imune tanto celular (proliferação de linfócitos T) quanto humoral (produção de anticorpos IgG) (Lopez et al., 2007; Araújo et al., 2008; Morse et al., 2012a; Morse et al., 2012b). As proteínas OMP7 e OMP8 não estão disponíveis no banco de dados IEDB e, portanto, a busca de potenciais epítopos para estas proteínas considerou os dados de imunogenicidade publicados em artigos científicos.

55/81

Tais proteínas têm sido descritas como antigênicas e estimulam a resposta humoral em bovinos (resposta envolvendo produção de anticorpos contra estas proteínas) (Junior et al., 2010; Crosby et al., 2015).

[0171] A triagem no banco de dados resultou em 139 epítopos potenciais, com dados experimentais disponíveis em relação aos antígenos previamente selecionados (MSP1a, MSP2, MSP3, VirB9 e VirBIO). De acordo com as respostas celular e humoral que cada epítopo apresentou em ensaios de imunogenicidade com camundongos BALB/c e/ou bovinos, selecionaram-se os epítopos mais promissores.

[0172]As proteínas MSP1a, MSP2 e MSP3, identificadas na vacina experimental (análise proteômica), apresentaram epítopos com dados experimentais depositados no banco IEDB. A proteína de superfície MSP1a tem função de adesão no eritrócito bovino e estimula a resposta imune tanto humoral quanto celular (Garcia-Garcia et al., 2004; Santos et al., 2013; McGuire et al., 1994). MSP2 e MSP3 são as proteínas de superfície de membrana prevalentes na membrana da rickettsia A. marginale e estimulam a resposta humoral. No entanto, como apresentam regiões hipervariáveis (mutações), a proteção conferida não é efetiva (Abbott et al., 2004; Abbott et al., 2005; Noh et al., 2010). É desejável que os dois subtipos de resposta, humoral e celular, sejam desencadeados para que se tenha maior proteção contra a rickettsia.

[0173]Como resultado da triagem, a partir do direcionamento pelos inventores, obtiveram-se 19 fragmentos peptídicos, de acordo com as SEQ ID NO: 1 a 19. A combinação de epítopos separados por um agente espaçador na mesma sequência, de acordo com os peptídeos híbridos revelados pela presente invenção, visa uma ação e resposta melhoradas, podendo inclusive levar ao sinergismo. O agente espaçador utilizado também tem natureza peptídica (3 a 5 resíduos de glicina, Gly ou G). A

56/81 glicina é um aminoácido não substituído (cadeia lateral = H) e, portanto, não interfere nas propriedades eletrônicas, nem tampouco na flexibilidade (arranjo conformacional) da cadeia peptídica principal dos fragmentos híbridos.

[0174] Considerou-se também no planejamento dos peptídeos híbridos o tamanho preferencial para serem apresentados como epítopos pela via do complexo principal de histocompatibilidade de classe II (MHC II, major histocompatibility complex) (Kim, Sette, Peters, 2011).

[0175]Vale ressaltar que a análise racional, ainda que conduzida pelo inventor de forma a aumentar as chances de sucesso na obtenção de peptídeos híbridos eficazes no desencadeamento de uma resposta imune protetora, não garante de forma alguma, com expectativa razoável de sucesso, que de fato o seja, quando transposta para um sistema in vivo. São muitas as variáveis presentes no contexto de uma resposta imunológica, com a participação orquestrada de diversos componentes, os quais são direta e indiretamente influenciados por outras tantas variáveis. Neste sentido, por ser impossíveis prever ou controlar de antemão toda esta gama complexa de fatores, a elaboração de novas entidades peptídicas sintéticas que funcionem a contento como vacinas protetoras representa um legitimo desafio.

[0176]A presente invenção demonstra abaixo os resultados experimentais de ensaios de imunogenicidade com soro de camundongos BALBc e de boi de 8 (P28, P41, P42, P44, P50, P51, P53 e P54) dos 14 peptídeos híbridos revelados pela presente invenção, e sintetizados pela empresa GenOne Biotechnologies®.

[0177] Os novos peptídeos híbridos desenvolvidos pela presente invenção receberam siglas: P de peptídeo + o número corresponde à quantidade de resíduos de aa em cada fragmento.

57/81

Tabela 2: Peptídeos híbridos

Sigla*	Sequência	Número de resíduos	SEQ ID NO:
P28	SKVASVEYILAARGGGGQVDRLANALGK	28aa	20
P41	SSVSSQSDQASTSSQLGGGGAMGDSVHWKVKPVDN KLFIMP	41aa	21
P42	LAESTEGNLEEVWILGKGGGGDELSKKVCGKGTTSGS TNQCG	42aa	22
P44	GASTDDAAAAAKIVAMAYGRGGGGGASSVDALTATKL VAAALGH	44aa	23
P50	GASTDDAAAAAKIVAMAYGRGGGGTIVPVKTFDDGALT YFQFYDNNKVIP	50aa	24
P51	LAESTEGNLEEVWILGKGGGGFSESMKALIKKYVDTSK PTIYVDQGTVMKV	51aa	25
P53	SKVASVEYILAARGGGGQVDRLANALGKGGGGAMGD SVHWKVKPVDNKLFIMP	53aa	26
P54	SECVSLQPTDSSSASGQQQEGGGGLQGHMIDAVLET AINSDIPGVLRAIVSRDV	54aa	27
P48	SSAGGQQQESSVSSGGGGLQGHMIDAVLETAINSDIP GVLRAIVSRDV	48aa	28
P73	AEDDKQQQQNQSNWQAISAVFQRGGGGGASTDDAA AAAKIVAMAYGRGGGGAMGDSVHWKVKPVDNKLFIMP	73aa	29
P55	DAAGRVDFKVHNFDWSAPEPKGGGGLQGHMIDAVLE TAINSDIPGVLRAIVSRDV	55aa	30
P52	NKDTGIASFNFAYFGGELGVRGGGGGTIVPVKTFDDG ALTYFQFYDNNKVIP	52aa	31
P57	KKSNEDTASVFLLGKELAYDTARGGGGLQGHMIDAVL ETAINSDIPGVLRAIVSRDV	57aa	32
P68	TKGEAKKWGNAIESATGTTSGGGGSECVSLQPTDSSS ASGQQQEGGGGGASSVDALTATKLVAAALGH	68aa	33

* Sigla: P = peptídeo + número correspondente ao tamanho da sequência peptídica (número de resíduos de aminoácidos (aa).

Teste de Imunogenicidade

Peptídeos Sintéticos [0178] Os peptídeos sintéticos liofilizados foram ressuspendidos em água ultrapura estéril, conforme concentração indicada para cada um, sendo que a concentração variou de 1,0 a 1,3 mg/mL.

Imunização dos camundongos [0179] A imunogenicidade de cada peptídeo foi verificada imunizando-se camundongos BALB/c, com aproximadamente seis semanas de idade, com 10 mg de proteina (Machado et al., 1994). Os camundongos foram divididos em grupos de três animais cada. Os grupos foram: P28, P41, P42, P44, P50, P51, P53, P54, Pool (camundongos inoculados com um pool de

58/81 peptídeos, no caso, com todos os 8 peptídeos híbridos) e o grupo controle negativo. Para as inoculações, os peptídeos foram emulsionados em adjuvante completo de Freund (Sigma) e, inoculadas por via intramuscular no quadríceps. Duas outras imunizações, no 14° e 28° dia após a inoculação, foram realizadas utilizando-se adjuvante incompleto de Freund (Sigma). Cada inoculação foi feita utilizando 10 pg/mL de cada peptídeo. Os camundongos do controle negativo foram inoculados com salina estéril no lugar dos peptídeos e, também, emulsionadas em adjuvante. Amostras de sangue foram coletadas, por punção intracardíaca, no 10° dia após a última imunização e os soros obtidos foram armazenados a -20 °C até serem avaliados por meios dos ensaios de DotELISA e Western-blotting.

Imunização do bezerro [0180]A imunogenicidade dos peptídeos sintéticos foi verificada imunizando-se um bezerro que foi previamente testado e com resultados negativos para Anaplasma marginale, Babesia bovis e Babesia bigemina por meio de sorologia e PCR. Para as inoculações, um pool de peptídeos (SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26) foi emulsionado em adjuvante completo de Freund (Sigma) e, inoculadas por via intramuscular no quadríceps. Duas outras imunizações, no 14° e 28° dia após a inoculação, foram realizadas utilizando-se adjuvante incompleto de Freund (Sigma). Cada inoculação foi feita utilizando 100 pg/mL de cada peptídeo. Amostras de sangue foram coletadas, por punção da jugular, no 10° dia após a última imunização e os soros obtidos foram armazenados a -20 °C até serem avaliados por meios dos ensaios de Dot-ELISA e Western-blotting.

Análise da Imunogenicidade dos Peptídeos por Dot-ELISA [0181] Os peptídeos sintéticos foram utilizados como antígeno na técnica de Dot-ELISA, a fim de verificar suas capacidades de reagirem com anticorpos específicos presentes no soro dos camundongos BALB/c, assim

59/81 como no soro do bezerro, todos imunizados. A técnica foi realizada conforme descrito por Machado et al. (1994), com pequenas modificações. Resumidamente, pequenos discos de nitrocelulose foram cortados utilizandose um perfurador de papéis e, cada disco disposto em uma cavidade de uma placa de cultura, de 24 poços, fundo chato. Foram depositados sobre cada um dos discos, 4 pg/mL de cada peptídeo sintético isoladamente, assim como do pool de peptídeos. Os discos foram secos a temperatura ambiente e, em seguida, bloqueados por 12 horas a temperatura ambiente com 300 mL de tampão TBS (Tris 0,1 M, NaCI 0,1 M e 0,5% de Tween 20; TBS-Tween 20), acrescido de 5% de leite em pó desnatado. Os soros testes foram diluídos 1:25 (camundongos e bezerro) em TBS-Tween 20, contendo 5% de leite em pó desnatado e incubados durante 120 minutos a temperatura ambiente e sob agitação constante. Em seguida, os discos foram submetidos a duas lavagens com TBS-Tween 20 acrescido de 5% de leite em pó desnatado e uma lavagem com TBS-Tween 20 (intervalo de 5 minutos entre cada lavagem). Adicionou-se a cada disco com soro de camundongos o conjugado anticamundongo acoplado à fosfatase alcalina (IgG de caprino anti-lgG de camundongo, Sigma A-3562) diluído 1:30.000 em TBS-Tween 20, acrescido de 5% de leite em pó desnatado. Aos discos contendo soro do bezerro foi adicionado o conjugado antibovino acoplado à fosfatase alcalina (IgG de coelho anti-lgG de bovino, Sigma A-0705) diluído 1:30.000 em TBS-Tween 20, acrescido de 5% de leite em pó desnatado. Após uma hora de incubação com os devidos conjugados, seguiram-se as lavagens, tal como na etapa anterior. A reação foi revelada pela adição do substrato da enzima 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato e cloreto azul nitroetanólico, utilizando-se o kit Alkaline Phosphatase Conjugate Substrate (Bio-Rad), de acordo com as especificações do fabricante.

Reativioade dos Peptídeos Sintéticos por Western-blotting [0182] As amostras dos peptídeos sintéticos foram analisadas por

60/81

Western-blotting. Para isso, inicialmente, as amostras foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida, sob condições desnaturantes, de acordo com técnica preconizada por Laemmli (1970). Baseado no volume das amostras foi adicionado tampão da amostra 2x concentrado (250 mM Tris-HCI pH 6,8, 40% glicerol, 8% SDS, 20% β-mercaptoetanol e 0,008% de azul de bromofenol). As amostras foram homogeneizadas, incubadas por 5 minutos a 100 °C e aplicadas no gel. O gel de separação foi preparado na concentração de 12% de poliacrilamida em tampão (1,875 M Tris, pH 8,8 e 1% SDS) e de 5% de poliacrilamida para o gel de empacotamento em tampão (1,875 M Tris, pH 6,8 e 0,5% SDS). A eletroforese foi realizada em tampão de corrida Tris-Glicina (50 mM Tris, pH 8,6, 1,92 M glicina e 1% SDS), a 100 V por até 3 horas e 30 minutos à 0 °C, no sistema Mini-Protean II (Bio-Rad).

[0183] Os peptídeos sintéticos processados no gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) foram transferidos para a membrana de nitrocelulose, para serem analisados por Wester blot (TOWBIN et al., 1979). A membrana de nitrocelulose (Merck) foi previamente incubada em tampão de transferência gelado (0,58% Tris Base pH 8,3, 20% metanol e 0,29% glicina). Para tanto, a membrana foi colocada no sistema de eletrotransferência “Mini Trans-Blot” (Bio-Rad) contendo o mesmo tampão e a transferência foi realizada a 100 V durante 90 minutos. A membrana foi incubada em TBS-Tween (10 mM Tris-HCI pH 7,5; 150 mM NaCl, 0,05% Tween-20) acrescido de 5% de leite em pó desnatado por 12 horas, à 4 °C, sob baixa agitação, para saturação de sítios de ligação inespecíficos. A membrana foi então incubada com cada soro de cada camundongo isoladamente ou incubada com soro do bezerro, durante 2 horas à temperatura ambiente, sob agitação lenta. Em seguida, foi submetida a três lavagens consecutivas de 10 minutos com a mesma solução, sob agitação lenta.

[0184] Para a detecção do complexo antígeno-anticorpo, a

61/81 membrana foi incubada em conjugado anticamundongo acoplado à fosfatase alcalina (IgG de cabra anti-lgG de camundongo, Sigma A-3562) diluído 1:30.000 em TBS-Tween ou conjugado antibovino acoplado à fosfatase alcalina (Ig de coelho anti-lgG de bovino, Sigma A-0705), diluído 1:30.000 em TBSTween. A membrana foi submetida a três lavagens, conforme descrito anteriormente, e a revelação se deu pela adição do substrato da enzima BCIPNBT, utilizando-se o kit Alkaline Phosphatase Conjugate Substrate (Bio-Rad, Cat # 170-6432), de acordo com as instruções do fabricante.

Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) [0185]As lâminas de esfregaço sanguíneo contendo antígeno de A. marginale preparadas foram retiradas do freezer e descongeladas à temperatura ambiente. Em cada círculo contendo o antígeno, adicionou-se 10 ml_ de cada soro teste diluído na concentração de 1:25 (para camundongos) e 1:80 (para bovinos). As lâminas foram então incubadas, em câmara úmida a 37 °C, por 30 minutos e, a seguir, submetidas a três lavagens em PBS por imersão, durante cinco minutos cada. Após secagem à temperatura ambiente, os círculos das lâminas foram recobertos com 10 mL do anticorpo anti-lgG de camundongo/bovino conjugado ao isotiocianato de fluoresceína (Sigma), diluído a 1:64 para camundongos e 1:300 para bovinos, em solução de PBS, contendo azul de Evans 1 mg%. As lâminas foram novamente incubadas e lavadas conforme descrito acima. Após a secagem das lâminas, estas foram montadas com lamínula, utilizando-se glicerina tamponada a uma relação de 9:1 de glicerina/tampão carbonato-bicarbonato 0,5 M pH 9,6 e, posteriormente, observadas em microscópio equipado para fluorescência (Olympus, BX-FLA).

Análise do Dqt-ELISA [0186] Soros dos camundongos e do bezerro imunizados com os peptídeos híbridos sintéticos, isoladamente ou em pool, conforme o caso, demonstraram reatividade, de acordo com os resultados indicados nas Tabelas

62/81 e4.

[0187] Particularmente, observou-se que o soro do bezerro inoculado com o pool de peptídeos reagiu com os peptídeos P41, P44, P51 e P53, bem como com o pool de peptídeos. Um bovino conhecido como sorologicamente positivo para A. marginale reagiu com o pool de peptídeos, bem como o soro de um bovino conhecido como sorologicamente negativo para A. marginale não reagiu no teste.

[0188] Ainda, observou-se que soros de camundongos inoculados com peptídeos híbridos isoladamente apresentaram reatividade com os peptídeos P42, P44, P51 e P54. Também reagiram com P28, P51, P53 e P54, soros de camundongos inoculados com o pool de peptídeos. Soros de camundongos do controle negativo não apresentaram reatividade no teste.

Tabela 3: Resultado do Dot-ELISA para Reatividade de Cada Peptídeo

Híbrido Sintético Com o Soro de Animais Imunizados

	Soro camundongos inoculados com peptídeos isolados	Soro camundongo inoculado com pool	Soro camundongos inoculados com salina (controle negativo)	Soro bezerro inoculado com pool
Reatividade com peptídeos	1	2	3
P28	-	-	-	-	-	-
P41	-	-	-	-	-	X
P42	X	-	-	-	-	-
P44	x	X	X	-	-	X
P50	-	-	-	-	-	-
P51	-	X	X	X	-	X
P53	-	-	-	X	-	X
P54	X	X	X	X	-	-

- = Não reagiu; X = Reagiu

Tabela 4: Resultado do Dot-ELISA para Reatividade do Pool de Peptídeos

Híbridos Sintéticos Com o Soro de Animais Imunizados

Soro de animal		Inoculado com	Reação com pool de peptídeos
Camundongo	1 2 3	P28	-
X
-
1 2 3	P41	-
-
-

63/81

Soro de animal		Inoculado com	Reação com pool de peptídeos
	1		-
	2	P42	-
	3		-
	1		-
	2	P44	-
	3		-
	1		-
	2	P50	-
	3		-
	1		-
	2	P51	X
	3		-
	1		X
	2	P53	x
	3		x
	1		-
	2	P54	X
	3		-
	1		-
	2	Salina (controle negativo)	-
	3		-
Bezerro		Pool	x
Bovino positivo para A. marginale		X
Bovino negativo para A. marginale		-

- = Não reagiu; X = Reagiu [0189] Ainda, os soros de bovinos sorologicamente positivos para A. marginale reagiram com os peptídeos sintéticos P28, P44, P53 e P54. Os soros de bovinos vacinados para A. marginale também reagiram com os peptídeos sintéticos P28 e P44. O soro do bovino sorologicamente negativo para A. marginale não reagiu com peptídeo sintético algum.

Análise do Western-blotting [0190] Os peptídeos sintéticos que obtiveram reatividade, seja

64/81 com o soro dos camundongos ou com o soro do bezerro inoculado com o pool de peptídeos, pelo teste de Dot-ELISA, também foram analisados por Westernblotting. O Western-blotting corroborou os dados obtidos com o Dot-ELISA, sendo que o soro do bezerro apresentou reatividade para os peptídeos P41, P44, P51 e P53. O soro do bezerro reagiu inclusive com o pool de peptídeos. O soro do bovino sorologicamente positivo para A. marginale (controle positivo) também reagiu com o pool de peptídeos no teste, enquanto o soro do bovino sorologicamente negativo para A. marginale (controle negativo) não obteve reação. Observou-se a detecção de bandas abaixo de 10 kDa, correspondendo aos peptídeos sintéticos.

[0191] Reagiram no teste soro dos camundongos inoculados com os peptídeos sintéticos P42, P44, P53 e P54.

Análise da Reação de Imunofluorescéncia Indireta (RIFI) [0192] O bezerro inoculado com pool de peptídeos foi positivo para A. marginale. Foram positivos também para A. marginale os camundongos inoculados com os peptídeos sintéticos P42, P50 e animais inoculados com pool de peptídeos.

Teste de Eficiência da Vacina em Campo Imunização de Bovinos com Pool de Peptídeos Híbridos Sintéticos

Seleção de Animais [0193] Foram selecionados 23 bovinos para a realização dos experimentos de campo. Todos os animais selecionados eram comprovadamente negativos para A. marginale pela Reação de Imunofluorescéncia Indireta (RIFI) e pelo ensaio imunoenzimático indireto (ELISA-teste), conforme protocolos anteriormente descritos. Os animais foram distribuídos em dois grupos conforme o parâmetro a ser analisado, sendo o grupo vacinado composto por 18 animais de raça pura Holandesa, com idades variando entre 16-20 meses e que receberam imunização com os peptídeos

65/81 híbridos sintéticos, e o grupo não-vacinado, quando aplicável, composto por cinco animais que não receberam a imunização com os peptídeos híbridos sintéticos. É importante ressaltar que na fazenda onde a vacina foi testada, a anaplasmose era doença prevalente, levando a gastos consideráveis com o manejo de tratamento dos animais.

Preparo da Vacina [0194] A vacina foi constituída por um pool de peptídeos híbridos sintéticos (SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26). Em todas as imunizações, o imunógeno se constituía de 100 pg de cada peptídeo do pool de peptídeos sintéticos informado acima (totalizando 500 pg de peptídeos sintéticos por animal). Os peptídeos sintéticos liofilizados foram ressuspendidos em cerca de 1,0 mL) de água ultrapura estéril, conforme concentração indicada para cada um, variando de 1,0 a 1,3 mg/mL.

Imunização dos Bovinos [0195] Cada animal do grupo vacinado recebeu 3 doses da vacina, com intervalo de 15 dias entre elas. A primeira dose constituiu-se dos peptídeos sintéticos emulsionados com adjuvante completo de Freund (Sigma). A segunda e a terceira doses constituíram-se dos peptídeos sintéticos emulsionados com adjuvante incompleto de Freund (Sigma). Todas as inoculações ocorreram por via intramuscular, na região da tábua do pescoço. Após 15 dias da terceira dose da vacina, os animais foram desafiados com sangue de bezerro parasitado com A. marginale, sendo 500 pL/animal, ou seja, 1,02 x 10⁵ parasitas/mL, pela via subcutânea.

Coleta das Amostras e Parâmetros Avaliados [0196] Amostras de sangue de cada animal foram coletadas, por punção da veia jugular, de acordo com o seguinte delineamento: antes da primeira dose (coleta 1), no dia e imediatamente antes da terceira dose (coleta

66/81

2) e 15 dias após a terceira dose (coleta 3). Trinta e dois dias após a terceira dose, os animais foram desafiados, e as seguintes coletas foram ainda realizadas: 35 dias após o desafio (coleta 4) e 45 dias após o desafio (coleta 5).

[0197] Amostras de sangue dos animais foram coletadas em tubos apropriados contendo anticoagulante EDTA, e as seguintes análises para caracterização da saúde e da resposta imune dos animais foram realizadas, de acordo com os protocolos descritos no presente documento e/ou conhecidos por um técnico no assunto: avaliação hematológica, imunofenotipagem de linfócitos T CD4⁺ e T CD8⁺, avaliação da expressão de RNA mensageiro de citocinas por células sanguíneas e avaliação da carga parasitária no sangue dos animais. Ainda, soros obtidos da colheita de sangue sem EDTA foram utilizados para detecção de anticorpos ar\t\-Anaplasma marginale pelos testes de ELISA e Dot-ELISA. Além disso, coletaram-se dados de temperatura e peso corporal de cada animal. Por fim, ao longo de todo o período, realizou-se também a avaliação comportamental e de coloração de mucosas, a fim de somar às demais observações e possibilitar a conclusão quanto à saúde dos bovinos experimentais (doentes ou não doentes).

[0198] Animais que durante o curso do experimento apresentaram alterações de comportamento (tristeza bovina e falta de apetite) e de coloração de mucosas conjuntival e vaginal ou prepucial (coloração tornando-se brancoamarelada) foram considerados com sintomatologia clínica da doença, podendo ser tratados após exames laboratoriais.

Desafio dos Animais [0199] Para verificar a eficácia da vacina e proteção dos animais imunizados com os peptídeos híbridos sintéticos, os animais foram desafiados com cepa de A. marginale trinta e dois dias após a 3^a dose da vacina.

[0200] Para tanto, uma amostra da cepa de A. marginale (cepa Jaboticabal) mantida em nitrogênio líquido foi descongelada e inoculada em

67/81 bezerro intacto e com testes sorológicos e moleculares negativos para Anaplasma marginale, Babesia bovis e Babesia bigemina. A carga parasitêmica do Anaplasma marginale alcançou seu maior valor de 1,385 x 10⁵ cópias de DNA, 23 dias após infecção. Deste animal coletaram-se 50 mL de sangue para o preparo do inóculo de desafio. Realizou-se a contagem dos parasitas em esfregaços corados pelo corante Giemsa em áreas quadriculadas de objetiva de 100, contando-se em 1000 eritrócitos o número de hemácias parasitadas, estabelecendo-se assim a parasitemia em 1,02 x 10⁸ parasitas. Os animais foram inoculados com sangue de bezerro parasitado com A. marginale, sendo 500 pL/animal, ou seja, 1,02x10⁵ parasitas/mL pela via subcutânea.

Avaliação Hematològica [0201] Para avaliação hematològica dos animais antes do início da vacinação e após o desafio (coletas 4 e 5), hemograma completo foi realizado em laboratório comercial. De particular relevância, analisou-se a porcentagem de hematócrito, indicativa da redução do número de hemácias sanguíneas (anemia). Considerou-se para os bovinos como alteração da porcentagem do hematócrito, valores abaixo de 24%.

IMUNOFENOTIPAGEM DE LlNFÓCITOS T CD4+ E CD8+ EM CÉLULAS DE SANGUE DOS

Bovinos por Citometria de Fluxo [0202] A análise por citometria de fluxo da população de células T (porcentual de células T CD4⁺ e CD8⁺ e Intensidade Mediana de Fluorescência (MFI) de cada marcador (CD4⁺e CD8⁺) na superfície das células), indicativa da resposta imune produzida, foi realizada conforme metodologia de Lollo et al. (2016) a partir de sangue periférico (coletas 1,2, 3 e 5).

[0203] Brevemente, 100 pL de sangue total com EDTA foram transferidos para microtubos cônicos de 1,5 mL e 2 pL de cada anticorpo (antiCD4 MCA1653F - Bio-Rad e anti-CD8 - MCA837PE - Bio-Rad) foi adicionado. O sangue contendo os anticorpos foi incubado por 30 minutos, a 4 °C, no

68/81 escuro. Em seguida, adicionou-se 1,8 mL do tampão de lise (Tris-Cloreto de amônio 0,83% estéril) pré-aquecido a 37 °C e incubou-se por 10 minutos a 37 °C. O material foi então centrifugado a 1.800 rpm por 10 minutos em temperatura ambiente e o sobrenadante desprezado. As amostras foram lavadas por duas vezes com 1 mL de PBS estéril, centrifugando nas mesmas condições, de forma a eliminar anticorpos não ligados. O botão celular final foi ressuspendido em 200 pL de PBS-Formaldeído 1% e transferido para tubosteste de poliestireno, específicos para o aparelho de citometria (BD Pharmingen, Cat. N. 352008) e mantidos em geladeira coberto com papel alumínio. As preparações celulares foram analisadas no citômetro de fluxo FACScanto (Becton, Dickison and Company; San Jose, CA, USA) (20.000 eventos por amostra). A seleção das subpopulações celulares encontradas nas diferentes amostras analisadas foi possível por meio de protocolos de aquisição pré-estabelecidos (Byrne et. al., 2000).

Avaliação expressão de mRNA de Citocinas por Células Sanguíneas [0204] Para caracterizar o tipo de resposta produzido pelas células do sistema imune dos bovinos vacinados nas coletas 3 e 4, avaliou-se a expressão de RNA mensageiro (mRNA) das citocinas IL-2, TNF-a, IFN-γ, IL-12 e IL-10 a partir das células presentes no sangue periférico. Amostras relativas à coleta 1 foram utilizadas como calibradoras.

Extração de RNA total [0205] As amostras de sangue foram acondicionadas em microtubos cônicos de 2,0 mL, contendo 1,2 mL de RNALater - RNA Stabilization Reagent (Ambion, Life Technologies do Brasil) para cada 500 pL de sangue de cada amostra. A extração de RNA total de sangue foi realizada com o RiboPure - Blood (Ambion, Life Technologies do Brasil), seguindo-se as orientações do fabricante. O RNA total obtido de todas as amostras foi dosado no espectofotômetro Nanodrop ND1000 (Thermo Scientific, USA) a 260 e 280nm. Foram também analisadas com

69/81 auxílio do equipamento Bioanalyser. Essas amostras foram estocadas a -20 °C, até o momento da realização da transcrição reversa do mRNA.

RT-PCR (Transcrição Reversa- Reação em Cadeia da Polimerase) [0206] A transcrição reversa foi realizada utilizando o GoScrípt Transcríption System (Promega, USA) para obtenção de DNA complementar (cDNA) a partir de mRNA, utilizando-se a mesma quantidade de 1 pg de RNA total para todas as amostras, e de acordo com as condições de reação do fabricante. O cDNA, por sua vez, foi utilizado como molde na técnica de PCR em Tempo Real Quantitativa (qPCR), com o objetivo de determinar o perfil de expressão das citocinas de interesse. O cDNA foi estocado a -20 °C até o momento do uso.

PCR em Tempo Real Quantitativa [0207] A qPCT foi realizada em um volume final de 20 pL para as seguintes citocinas e gene endógeno: IL-2, IL-10, IL-12, IFN-γ e H3F3A, contendo 10 pL de Master Mix (SYBR Green JumStart Taq ReadMix, SIGMA), 2 pL de PrímeTime Assay 10X concentrado, específico para cada citocina (PrimeTime Std qPCR Assay, IDT, USA), 5 pL de água livre de DNAse e RNAse e 1 pL de cDNA. A reação de qPCR foi realizada em um volume final de 25 pL para a citocina TNF-α, contendo 12,5 pL de Master Mix (SYBRGreen JumStart Taq ReadMix, SIGMA), 0,75 pL de PrimeTime Assay 10X concentrado, específico para cada citocina (PrimeTime Std qPCR Assay, IDT, USA), 9,5 pL de água livre de DNAse e RNAse e 1,5 pL de cDNA. A reação aconteceu em aparelho CFX-96 (Bio-Rad), sendo utilizadas placas de 96 poços (Low 96-well Clear, Bio-Rad) e adesivos (Microseal ‘B’ Film, Bio-Rad). Para cada citocina e gene endógeno foi adquirido PrímeTime Assay específico, conforme Tabela 5 (Puech et al., 2015; Konnai et al., 2003). As condições de reação para a citocina TNF-α e gene endógeno H3F3A foram de 95 °C por 10 minutos, seguidos de 44 ciclos de 95 °C por 30 segundos, 60 °C por 30 segundos e 72 °C por 45 segundos. As condições de reação para a citocina IL70/81 foi de 94 °C por 2 minutos, seguidos de 44 ciclos de 94 °C por 15 segundos, 53 °C por 30 segundos e 72 °C por 45 segundos. As condições de reação para a citocina IL-10 foi de 94 °C por 2 minutos, seguidos de 44 ciclos de 94 °C por 15 segundos, 56 °C por 30 segundos e 72 °C por 45 segundos. As condições de reação para a citocina IL-12 foi de 94 °C por 2 minutos, seguidos de 44 ciclos de 94 °C por 15 segundos, 55 °C por 30 segundos e 72 °C por 45 segundos. As condições de reação para a citocina IFN-γ foi de 94 °C por 2 minutos, seguidos de 44 ciclos de 94 °C por 15 segundos, 55 °C por 30 segundos e 72 °C por 45 segundos. Para cada reação, as amostras foram processadas em duplicata. Os controles negativos consistiram de água ultrapura autoclavada no lugar de cDNA, e o controle positivo consistiu nas curvas-padrão utilizadas em cada reação. O resultado da amplificação foi utilizado para normalizar a reação e utilizou-se como calibrador as amostras dos bovinos da coleta 1. A quantificação relativa foi feita por meio da equação 2 ^^CT, sendo o ACt = Ct (alvo) - Ct (controle gene de referência) e o AACt = ACt (amostra) - ACt (calibrador) (Livak e Schmittgen, 2001).

Tabela 5: Oligonucleotídeos Iniciadores

Alvo	Sequência	SEQ ID NO:
IL-2	5’-TTTTACGTGCCCAAGGTTAA-3' (F)	34
5’-CGTTTACTGTTGCATCATCA-3' (R)	35
IFN-y	5'-ATAACCAGGTCATTCAAAGG-3’ (F)	36
	5'-ATTCTGACTTCTCTTCCGCT-3* (R)	37
TNF-a	5’-CCAGAGGGAAGAGCAGTCC-3' (F)	38
5'-GGCTACAACGTGGGCTACC-3’ (R)	39
IL-12	5'-AACCTGCAACTGAGACCATT-3’ (F)	40
5’-ATCCTTGTGGCATGTGACTT-3’ (R)	41
IL-10	5’-TGCTGGATGACTTTAAGGG-3' (F)	42
5’-AGGGCAGAAAGCGATGACA -3' (R)	43
H3F3A	5’-GAGGTCTCTATACCATGGCTC-3’ (F)	44
5'-GTACCAGGCCTGTAACGATG-3' (R)	45

Avaliação da Carga Parasitária dos Bovinos

Extração de DNA a partir de Sangue dos Bovinos para Detecção de

Infecção [0208] Para verificação da carga parasitária de Anaplasma

71/81 marginale nas amostras de sangue dos bovinos (coletas 1 a 5) realizou-se a extração de DNA utilizando-se o kit comercial DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen), de acordo com as instruções do fabricante. Como controle positivo da reação, foram utilizadas amostras de Anaplasma marginale mantidas em cultivo. Após a extração e dosagem da concentração, o DNA foi armazenado a -20 °C para realização da qPCR.

Amplificação dos Fragmentos de DNA pela PCR em Tempo Real

Quantitativa para o Gene msp1b de A. marginale [0209] A qPCR foi realizada pelo método descrito por Carelli et al.

(2007), com modificações para o gene msplfi. A reação foi realizada com volume final de mistura de 10 pL, contendo 1 pl_ de DNA genômico, 5,0 pL de GoTaq Probe qPCR Master Mix (Promega), 0,9 pM de cada oligonucleotídeo iniciador (direto: 5'-TTGGCAAGGCAGCAGCTT-3' (SEQ ID NO: 46) e inverso: 5-'TTCCGCGAGCATGTGCAT-3' (SEQ ID NO: 47)) e 0,2 pM da sonda de hidrólise (6FAM-5’-TCGGTCTAACATCTCCAGGCTTTCAT-3’-BHQ1 (SEQ ID NO: 48)). Os ciclos foram realizados sob as seguintes condições: 2 minutos a 50 °C, 10 minutos a 95 °C e 40 ciclos de 15 segundos a 95 °C e 1 minuto a 60 °C. As reações de amplificação foram conduzidas em aparelho termociclador CFX96 Thermal Cycler (BioRad, Hercules, CA, Estados Unidos). Todas as amostras foram testadas em duplicatas. A quantificação do número de cópias de DNA-alvo/pL foi realizada com a utilização do plasmídeo pSMART (Integrated DNA Technologies, Coralville, lowa, EUA) contendo a sequência alvo de 95 bp para amplificação do DNA do A. marginale (gene msplfi). A eficiência da reação foi calculada por meio de uma curva padrão obtido a partir de diluições seriadas do DNA plasmidial contendo a sequência-alvo. Para isso, diluições seriadas foram feitas a fim de construir uma curva padrão com diferentes concentrações de DNA plasmidial contendo a sequência-alvo (2,0 x 10⁷ cópias/ pL a 2,0 x 10° cópias/ pL). O número de cópias de plasmídeos foi

72/81 determinado de acordo com a fórmula (Xg/pL DNA/[tamanho do plasmídeo (pb) x 660]) x 6,022 x 10²³ x cópias do plasmídeo/pL. Água ultrapura estéril (Qiagen, Madison, Estados Unidos) foi utilizada como controle negativo da reação. Avaliação da Imunogenicidade dos Peptídeos por ELISA-Teste e Dot-ELISA [0210] Os peptídeos sintéticos foram utilizados como antígeno na técnica de Dot-ELISA, bem como os soros foram utilizados para detecção de anticorpos por ELISA-teste, de forma a verificar suas capacidades de reação com anticorpos específicos presentes no soro dos bovinos (imunizados e não imunizados) (coletas 1, 2 e 3). As técnicas foram realizadas conforme descrito anteriormente no presente.

Avaliação da Temperatura Corporal [0211] A temperatura dos animais do grupo vacinado foi avaliada nos 3 dias anteriores ao desafio dos animais - pré-infecção. A temperatura dos animais de ambos os grupos também foi avaliada a cada 1 ou 2 dias após a infecção (total de 41 tempos avaliados). A avaliação foi realizada por meio da inserção de termômetro na região anal, conforme procedimento conhecido por um técnico no assunto. A temperatura foi considerada alterada quando acima de 39,5 °C.

Avaliação do Peso [0212] O peso dos animais do grupo vacinado foi avaliado antes da vacinação, no dia do desafio e após o desafio (coleta 5) por meio do uso de fita métrica na região abdominal de maior circunferência, conforme técnica conhecida por um técnico no assunto.

Resultados do Teste de Eficiência da Vacina em Campo

Análise do Hematócrito [0213] Quatorze animais do grupo vacinado apresentaram valores de hematócrito abaixo de 30%, mas foram capazes de recuperar ao final da observação, indicando que passaram pelo desafio e conseguiram resistir à

73/81 multiplicação do agente. Nenhum animal do grupo vacinado apresentou valores inferiores a 24%, não sendo considerados anêmicos.

Anáuse da População de Células T [0214]A análise da população de células T CD4⁺ e CD8⁺ nos bovinos vacinados indicou ligeiro aumento na porcentagem de população de células T CD4⁺ e T CD8⁺ das coletas 2, 3 e 5 em relação à coleta 1, em que o aumento de células T CD4⁺ foi um pouco maior que de células T CD8⁺. Já a análise da MFI indicou aumento destes marcadores na superfície das células. De modo geral, estes dados revelam a ativação celular e de capacidade de resposta dos animais aos estímulos (vacinação e desafio).

Análise das Citocinas Produzidas [0215] A análise das citocinas produzida em resposta à imunização (coleta 3) e desafio (coleta 4) em relação à coleta 1 indicou aumento de expressão de IFN-γ e IL-12 da coleta 3 para a 4, indicando possível aumento da expressão ou população de linfócitos CD4 produtores de IFN-y. Este resultado indica a importância da resposta imune celular.

Carga Parasitária [0216] Com exceção das amostras utilizadas como controle negativo, todas as amostras de sangue dos bovinos foram consideradas positivas, em vista do constante desafio em campo, nos tempos avaliados. No entanto, os valores foram considerados baixos (em média, de cerca de 0,5-1 x 10⁵ eritrócitos infectados por mL de sangue nas coletas 1, 3 e 5), e suficientes para manter a estimulação sem sintomas clínicos nos animais vacinados. Avaliação da Imunogenicidade dos Peptídeos por Dot-ELISA e ELISA-teste [0217] Apenas 2 animais do grupo vacinado não responderam a nenhum peptídeo. Os demais apresentaram resposta aos peptídeos vacinais (3 a 5 peptídeos) por Dot-ELISA, indicando que foi possível desencadear resposta imune frente aos peptídeos sintéticos. No entanto, mesmo aqueles que não

74/81 apresentaram resposta no ensaio realizado, não adoeceram.

[0218] Ainda, todos os animais (com detecção de anticorpos por ELISA-teste) (com exceção de 4 animais do grupo vacinado) estavam sorologicamente negativos após a terceira vacinação com os peptídeos, mas após o desafio, tornaram-se positivos (com exceção de dois animais). A presença de anticorpos indica que o animal entrou em contato com o parasita, podendo ou não induzir proteção. Ainda, a não resposta de alguns animais não significa que não estariam protegidos.

Temperatura [0219] Do grupo vacinado, 5 animais apresentaram um a dois picos de temperatura no tempo avaliado. No entanto, apenas 2 destes apresentaram os demais sintomas esperados da doença (alteração da coloração das mucosas e comportamento), necessitando de tratamento. Os 3 animais restantes não foram tratados pois a temperatura foi normalizada naturalmente e não apresentaram os demais sintomas esperados da doença. No grupo controle, 3 animais apresentaram alterações de temperatura, e 2 necessitaram de tratamento.

Peso dos Animais [0220] Todos os animais aumentaram de peso no período de 42 dias após a infecção experimental, mesmo sendo desafiados pelo agente. Em média, cada animal ganhou cerca de 25,6 kg, indicando que passaram pela infecção sem apresentação da diminuição característica de peso conforme observada nos animais doentes.

Conclusão [0221] Tomados em conjunto, os resultados das análises indicaram que 88,9% dos animais vacinados foram capazes de controlar a infecção (16/18 bovinos vacinados e desafiados), não necessitando de tratamento (seja pela ausência de sintomas característicos da doença,

75/81 conforme observados, seja pela normalização natural dos parâmetros durante a avaliação). Todos os animais (incluindo aqueles que foram tratados) seguem protegidos mesmo após 5 meses da vacinação, levando à economia financeira. No mesmo período, animais não vacinados adoeceram e necessitaram de tratamento recorrente.

[0222] Tal eficiência, somada à vantagem de produção sintética dos peptídeos híbridos de acordo com a presente invenção, representa um avanço importante em relação às demais vacinas já testadas contra a anaplasmose.

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1/6

Claims (36)

1. Reivindicações

   1. PEPTÍDEO HÍBRIDO, caracterizado por compreender dois ou mais fragmentos peptídicos das sequências de aminoácidos dentre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 19, ligados entre si por meio de um elemento espaçador.
2. 2. PEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por compreender dois ou três fragmentos peptídicos das sequências de aminoácidos dentre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 19, ligados entre si por meio de um elemento espaçador.
3. 3. PEPTÍDEO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo elemento espaçador ser constituído por um ou mais resíduos de glicina ou um ou mais resíduos de prolina ou quaisquer combinações dos mesmos.
4. 4. PEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo elemento espaçador ser constituído por 2 a 15 resíduos de glicina, particularmente 2 a 10 resíduos de glicina, mais particularmente 3 a 5 resíduos de glicina.
5. 5. PEPTÍDEO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por consistir, cada um, na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 33.

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6. 6. PEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por consistir, cada um, na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO; 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 27.
7. 7. CONJUNTO DE PEPTÍDEOS HÍBRIDOS, caracterizado por compreender pelo menos dois peptídeos híbridos, conforme definidos em uma das reivindicações 1 a 4.
8. 8. CONJUNTO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por compreender pelo menos dois peptídeos híbridos das sequências de aminoácidos dentre SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO; 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 33.
9. 9. CONJUNTO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por compreender pelo menos dois peptídeos híbridos das sequências de aminoácidos dentre SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 27.
10. 10. CONJUNTO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por compreender todos os peptídeos híbridos das sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 27.
11. 11. CONJUNTO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por compreender pelos menos dois peptídeos híbridos das sequências de aminoácidos dentre SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26.
12. 12. CONJUNTO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por compreender todos os peptídeos híbridos das sequências de

    3/6 aminoácidos de SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26.
13. 13. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender pelo menos um peptídeo híbrido, conforme definido em uma das reivindicações 1 a 4.
14. 14. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada por compreender pelo menos um peptídeo híbrido, em que o pelo menos um peptídeo híbrido consiste, cada um, na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 33.
15. 15. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por compreender pelo menos um peptídeo híbrido, em que o pelo menos um peptídeo híbrido consiste, cada um, na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 27.
16. 16. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por compreender de 2 a 8 peptídeos híbridos, preferencialmente de 3 a 7 peptídeos híbridos, mais preferencialmente de 4 a 6 peptídeos híbridos.
17. 17. COMPOSIÇÃO, de acordo com uma das reivindicações 13 a 16, caracterizada por compreender adicionalmente um ou mais diluentes e/ou um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis e/ou um ou mais compostos biologicamente ativos.
18. 18. COMPOSIÇÃO, de acordo com uma das reivindicações 13 a 17, caracterizada por compreender adicionalmente um ou mais adjuvantes.
19. 19. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo um ou mais adjuvantes serem selecionados dentre

    4/6 adjuvante completo de Freund, adjuvante incompleto de Freund, hidróxido de alumínio, sílica e saponina.
20. 20. COMPOSIÇÃO, de acordo com uma das reivindicações 13 a 19, caracterizada por ser na forma de solução, mistura, pó, grânulos, aerossol ou liofilizada.
21. 21. COMPOSIÇÃO, de acordo com uma das reivindicações 13 a 20, caracterizada por ser uma vacina.
22. 22. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada por ser para imunizar, tratar, proteger, amenizar e/ou prevenir doenças ou sintomas de doenças e/ou novas infecções com ausência ou redução de sintomas clínicos, causadas por bactérias, rickettsias ou protozoários, em que as bactérias são particularmente do gênero Anaplasma, mais particularmente Anaplasma marginale, e em que os protozoários são particularmente Babesia bovis ou Babesia bigemina.
23. 23. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelas bactérias, rickettsias ou protozoários serem transmitidos por artrópodes, por infecção mecânica, por via iatrogênica ou por via transplacentária, em que os artrópodes são particularmente carrapatos ou insetos, mais particularmente carrapatos.
24. 24. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo carrapato ser da família Ixodidae, particularmente do gênero Rhipicephalus spp., mais particularmente o Rhipicephalus (Boophilus) microplus.
25. 25. USO DE PELO MENOS UM PEPTÍDEO HÍBRIDO, conforme definido em uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por ser para a fabricação de uma composição, conforme definida em uma das reivindicações 13 a 24.
26. 26. USO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pela

    5/6 composição ser para imunizar, tratar, proteger, amenizar e/ou prevenir doenças ou sintomas de doenças e/ou novas infecções com ausência ou redução de sintomas clínicos, causadas por bactérias, particularmente do gênero Anaplasma, mais particularmente Anaplasma marginale, em um humano ou animal, particularmente um ruminante, mais particularmente um bovino.
27. 27. USO DE PELO MENOS UM PEPTÍDEO HÍBRIDO, conforme definido em uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por ser em um processo de cultivo in vitro de células.
28. 28. USO DE PELO MENOS UM PEPÍDEO HÍBRIDO, conforme definido em uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por ser para diagnóstico.
29. 29. MÉTODO DE INDUZIR RESPOSTA IMUNE, caracterizado por compreender a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição, conforme definida em uma das reivindicações 13 a 24, a um humano ou animal.
30. 30. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pela quantidade terapeuticamente eficaz ser de 50 a 150 pg, mais preferencialmente de 80 a 130 pg, mais preferencialmente ainda de 100 pg, de cada peptídeo híbrido por humano ou animal.
31. 31. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 29 a 30, caracterizado pela resposta imune ser para imunizar, tratar, proteger, amenizar e/ou prevenir doenças ou sintomas de doenças e/ou novas infecções com ausência ou redução de sintomas clínicos, causadas por bactérias, particularmente do gênero Anaplasma, mais particularmente Anaplasma marginale, em um animal, particularmente em um ruminante, mais particularmente em um bovino.
32. 32. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pela resposta imune ser por meio do auxílio de pelo menos um carreador.

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33. 33. KIT, caracterizado por compreender pelo menos um peptídeo híbrido, conforme definido em uma das reivindicações 1 a 6.
34. 34. KIT, caracterizado por compreender uma composição, conforme definida em uma das reivindicações 13 a 24.
35. 35. KIT, de acordo com uma das reivindicações 32 a 33, caracterizado por ser para diagnóstico.
36. 36. KIT, de acordo com uma das reivindicações 32 a 33, caracterizado por ser para vacinação.

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