BR102021006932A2

BR102021006932A2 - Método e conjunto para detectar um anticorpo e aplicação dos mesmos

Info

Publication number: BR102021006932A2
Application number: BR102021006932-5A
Authority: BR
Inventors: Liangyu XIA; Weihua LV; Aijun Zhao; Xian Yu; Zeyang Cai; Dehao Mai; Zijian Zhai
Original assignee: Guangdong Feipeng Biological Co., Ltd
Priority date: 2021-01-12
Filing date: 2021-04-12
Publication date: 2022-07-19
Also published as: CN112881706B; CN112881706A; WO2022151562A1

Abstract

MÉTODO E CONJUNTO PARA DETECTAR UM ANTICORPO E APLICAÇÃO DOS MESMOS. O presente pedido se refere ao campo de detecções de anticorpos e, mais particularmente, se refere a um método de detecção e a um conjunto de detecção. O reagente de detecção de SARS-COV-2 e o método de detecção fornecido pelo presente pedido são capazes de detectar simultaneamente anticorpos totais e anticorpos neutralizantes e detectar uma condição de proteção imunológica após a vacinação.

Description

MÉTODO E CONJUNTO PARA DETECTAR UM ANTICORPO E APLICAÇÃO DOS MESMOS

Campo Técnico

[001] A invenção se refere ao campo das biotecnologias e, em particular, a um método, um conjunto para detectar um anticorpo e uma aplicação do mesmo.

Antecedentes da Invenção

[002] Em um processo de microrganismos patogênicos, que infectam células, uma proteína de ligação ao receptor de superfície do vírus é uma "chave" para os microrganismos patogênicos entrarem nas células e pode abrir uma "trava" de uma proteína receptora celular, para entrar nas células e iniciar um processo de replicação das mesmas.

[003] Os anticorpos neutralizantes são determinados anticorpos gerados por linfócitos B e podem se ligar a antígenos (ligantes) na superfície dos microrganismos patogênicos, impedindo desse modo que os microrganismos patogênicos adiram a um receptor de célula alvo e invadam as células.

[004] A detecção de anticorpos neutralizantes relacionados é realizada principalmente em um Laboratório de Nível de Biossegurança 3 (BSL3). A detecção do teste de neutralização usando cultura de células de vírus vivos requer um alto nível de laboratório, portanto, a promoção e aplicação clínica em larga escala são severamente limitadas. É de grande importância desenvolver um método rápido de detecção de anticorpos neutralizantes que pode ser realizado em um Laboratório de Nível de Biossegurança 2 (BSL2) ou em um laboratório geral. Atualmente, algumas equipes de pesquisa também desenvolvem testes ELISA para atender às necessidades de detecção de BSL2, mas os reagentes de detecção podem detectar apenas anticorpos neutralizantes isolados e podem não detectar anticorpos totais simultaneamente. A detecção dos anticorpos totais pode refletir se os anticorpos são gerados após a vacinação, e a detecção dos anticorpos neutralizantes pode refletir se um efeito imunológico do anticorpo neutralizante é obtido após a vacinação, o ajuste de um esquema de imunização individual é orientado e é determinado se uma estratégia de imunização tiver que ser ajustada. Portanto, o apoio auxiliar para aumentar a proteção da imunidade de rebanho tem grande importância. A detecção dos anticorpos totais e dos anticorpos neutralizantes pode não apenas refletir um estado imunológico existente de um corpo de forma mais objetiva, mas também pode ser usada para analisar o julgamento sobre o sistema imunológico passado ou futuro e a previsão do corpo em relação aos microrganismos patogênicos.

[005] Uma proteína S spike (proteína spike) na superfície do SARS-CoV-2 é um importante sítio de ligação ao receptor na superfície do coronavírus, ela pode se ligar a um receptor específico do vírus na superfície celular, mediar a fusão de uma membrana externa do vírus e da célula, adsorver o vírus e penetrar na membrana; e o domínio de ligação ao receptor da proteína S do coronavírus (RBM) permite que o vírus se ligue à enzima de conversão da angiotensina 2 (ACE2) na superfície de uma célula hospedeira e permite que o vírus entre na célula hospedeira. Enquanto o SARS-CoV-2 invade o corpo, ele pode estimular o corpo a gerar os anticorpos neutralizantes com efeitos protetores, os microorganismos patogênicos são especificamente impedidos de entrar nas células e a infecção é prevenida. Uma quantidade de anticorpos neutralizantes é um indicador importante do efeito protetor da imunidade vacinal e é uma base importante para a avaliação e controle de qualidade da vacina.

[006] Após ser vacinado, um indivíduo pode gerar anticorpos protetores por meio de uma resposta imune, ou seja, os anticorpos neutralizantes. Uma titulação dos anticorpos neutralizantes pode ser medida para determinar a eficácia clínica de uma vacina. Portanto, a detecção de anticorpos neutralizantes pode ser aplicada ao desenvolvimento e avaliação da vacina, bem como à avaliação de um efeito autoimune individual após a vacinação. Além disso, é possível determinar se há risco de reinfecção na detecção em um paciente com Doença do Coronavírus 2019 (COVID-19) após a cura.

[007] Uma ideia de desenvolvimento de vacina relacionada é baseada em um mecanismo de infecção RBD-ACE2, e um fragmento de núcleo do mesmo é projetado para RBD, e alguns esquemas de tratamento também são baseados no desenvolvimento de anticorpos que bloqueiam uma via RBD-ACE2.

[008] Junto com a promoção e inoculação de uma vacina de COVID-19, há uma necessidade urgente de desenvolver um reagente que seja conveniente, rápido e não requeira a detecção dos anticorpos totais e dos anticorpos neutralizantes em condições laboratoriais BSL3.

[009] Reagentes de detecção de anticorpos SARS-COV-2 relacionados podem detectar apenas os anticorpos totais ou os anticorpos neutralizantes isolados, e os anticorpos totais e os anticorpos neutralizantes podem não ser detectados simultaneamente.

[010] Diante do exposto, é proposta a invenção.

Sumário

[011] A invenção fornece pelo menos uma das seguintes modalidades:

[012] A invenção fornece um método de detecção, incluindo: um método para detectar um anticorpo, o método inclui:
Etapa 1: colocar em contato uma amostra com um ligante ou um fragmento contendo ligante e detectar um sinal de reação; e
Etapa 2: colocar em contato com um receptor do ligante ou um fragmento do mesmo e detectar um sinal de reação.

[013] Na presente invenção, o método de detecção pode detectar anticorpos neutralizantes e/ou anticorpos totais, a Etapa 1 detecta os anticorpos totais que podem se ligar ao ligante e a Etapa 2 detecta os anticorpos neutralizantes que se ligam ao ligante.

[014] Em algumas modalidades, o ligante ou o fragmento contendo ligante pode ser acoplado a um marcador; e opcionalmente, o marcador são microesferas de látex.

[015] Em algumas modalidades, o receptor ou o fragmento do mesmo pode ser acoplado a um marcador; e, opcionalmente, o marcador são microesferas de látex.

[016] Em algumas modalidades, o ligante ou o fragmento contendo ligante é derivado de SARSr-CoV; e o ligante específico ou o fragmento contendo ligante é selecionado a partir de um ligante contendo uma região RBM de SARSCoV-2.

[017] Em algumas modalidades, o receptor ou o fragmento do mesmo é um receptor da superfície celular ou um fragmento do mesmo; e o receptor específico é ACE2 ou o fragmento do receptor é um fragmento contendo ACE2.

[018] Em algumas modalidades, uma amostra pode ser uma amostra sanguínea, uma amostra de fluido linfático, uma amostra de saliva e uma amostra de urina. Em um modo de implementação, a amostra pode ser soro.

[019] A invenção fornece ainda um conjunto para detectar um anticorpo, incluindo:

(i) um ligante ou um fragmento contendo ligante, e
(ii) um receptor ou um fragmento do mesmo ligado ao ligante de (i).

[020] Em algumas modalidades, no conjunto de detecção de anticorpo, o ligante ou o fragmento contendo ligante é acoplado a um marcador e, em algumas modalidades, o marcador são microesferas de látex.

[021] Em algumas modalidades, o receptor ou o fragmento do mesmo ligado ao ligante de (i) é acoplado a um marcador e, em algumas modalidades, o marcador são microesferas de látex.

[022] Em algumas modalidades, no conjunto de detecção de anticorpo, o ligante ou o fragmento contendo ligante é selecionado a partir de SARSr-CoV e especificamente selecionado a partir de um ligante contendo uma região RBM de SARS-CoV-2.

[023] O SARS-CoV-2 inclui o SARS-CoV-2 e suas variantes.

[024] Em algumas modalidades, no conjunto de detecção de anticorpo, o receptor ou o fragmento do mesmo é um receptor de superfície celular ou um fragmento do mesmo, e o receptor específico é ACE2 ou o fragmento do receptor é um fragmento contendo ACE2.

[025] As vantagens da invenção residem em: não apenas no fato de os anticorpos totais e os anticorpos neutralizantes poderem ser detectados simultaneamente, mas também de a conveniência ser trazida na interpretação dos dados, e um resultado de detecção poder ser corrigido pela detecção simultânea dos anticorpos totais e dos anticorpos neutralizantes, por exemplo, quando a detecção de anticorpo total é negativa, e a detecção de anticorpo neutralizante é positiva, pode ser informado que o resultado da detecção é anormal e precisa ser detectado novamente.

Breve descrição dos desenhos

[026] Desenhos da descrição para constituir uma parte da presente invenção são usados para fornecer uma melhor compreensão da invenção, e modalidades exemplificativas da invenção e suas descrições são usadas para explicar a invenção e não constituem limitação imprópria à invenção. Nos desenhos:

[027] Fig. 1 mostra uma estrutura cristalina de uma região de ligação ao receptor RBD de proteína spike de SARS-CoV-2 (núcleo + RBM) e complexo ACE2 e um diagrama de densidade de elétrons de uma interface de interação

[028] Fig. 2 mostra uma correlação entre anticorpos totais na detecção simultânea dos anticorpos totais e anticorpos neutralizantes na invenção e detecção dos anticorpos totais em uma plataforma luminescente.

[029] Fig. 3 mostra uma correlação entre anticorpos neutralizantes na detecção simultânea dos anticorpos totais e anticorpos neutralizantes na invenção e detecção dos anticorpos neutralizantes na plataforma luminescente.

[030] Fig. 4 mostra um diagrama de dispersão da distribuição da taxa de inibição de uma amostra negativa e uma amostra positiva detectada na invenção.

Descrição detalhada das modalidades

[031] Uma referência às modalidades da invenção pode ser fornecida em detalhes agora, e um ou mais exemplos das mesmas são descritos abaixo. Cada exemplo é fornecido como explicação em vez de limitação da invenção. Na verdade, é evidente para técnicos no assunto que várias modificações e mudanças poderão ser feitas na invenção sem se afastar do escopo ou do espírito da invenção. Por exemplo, as características ilustradas ou descritas como parte de uma modalidade podem ser usadas em outra modalidade para produzir uma modalidade adicional.

[032] Os exemplos da invenção podem detectar níveis de anticorpos totais e anticorpos neutralizantes em uma amostra a ser detectada e ter maior sensibilidade e/ou especificidade. O método e conjunto da invenção têm universalidade, não estão limitados a uma plataforma de imunodetecção específica e não estão limitados a uma espécie específica.

[033] Na presente invenção, um termo "receptor" se refere a uma proteína especial que existe em uma membrana celular ou dentro de uma célula, pode se ligar a uma molécula de sinal específica fora da célula para ativar uma série de reações bioquímicas dentro da célula e fazer a célula gerar um efeito correspondente para estimulação externa

[034] Na presente invenção, um termo "ligante" se refere a uma proteína ou a um fragmento de proteína que pode se ligar ao "receptor".

[035] Na presente invenção, um termo "anticorpo total" se refere a um conjunto de todos os anticorpos que podem se ligar ao "ligante", e um termo "anticorpo neutralizante" se refere a um anticorpo que pode se ligar ao "ligante" competitivamente com o "receptor".

[036] Na presente invenção, um "marcador" pode ser entendido como sendo capaz de gerar diretamente um sinal; ou estimular direta ou indiretamente uma substância específica para gerar o sinal, e o marcador pode ser direta ou indiretamente conectado a uma substância marcada. Por exemplo, os marcadores comumente usados na imunodetecção incluem partículas de metal, um marcador fluorescente, um marcador cromóforo, um marcador eletronicamente denso, um marcador quimioluminescente, um marcador eletroquimioluminescente, um marcador radioativo, um marcador de ácido nucleico, um marcador polipeptídico ou uma enzima, mas não se limitam a estes. Em algumas modalidades, o marcador pode ser ouro coloidal, uma fluoresceína, uma microesfera fluorescente, um éster de acridínio, uma peroxidase de rábano, uma fosfatase alcalina, microesferas de látex, rutênio triplo, luminóis ou um composto de quelato de Eu.

[037] Na presente invenção, um "sinal de detecção" pode ser entendido como a adoção de um modo que pode identificar uma substância de sinal para obter ou identificar a força ou nível do sinal de detecção.

[038] Na presente invenção, um termo "fragmento" se refere a um fragmento de aminoácido contendo pelo menos um segmento de ligação.

[039] Na presente invenção, "contato" pode ser entendido como permitindo que ele se ligue. O tempo de contato não é especificamente limitado e diferentes modalidades e plataformas de detecção têm tempos de contato diferentes, mas estes pertencem a uma categoria que pode ser entendida por técnicos no assunto.

[040] Na presente invenção, ACE2 não limita as espécies. As diferentes espécies de ACE2 podem ser selecionadas de acordo com uma fonte de espécie de uma amostra a ser detectada, por exemplo, um mamífero, um animal voador de sangue não frio, um morcego e pássaros. Em algumas modalidades, ACE2 humano é usado para uma detecção de anticorpo neutralizante de SARSCOV-2 de uma amostra humana.

[041] Na presente invenção, como mostrado na Fig. 1, uma região RBM é um segmento em RBD que pode se ligar ao ACE2, e o anticorpo neutralizante de RBD e o ACE2 podem se ligar competitivamente à região RBM.

[042] Na presente invenção, "SARSr-CoV" se refere a um coronavírus relacionado à síndrome respiratória aguda grave, incluindo, mas não se limitando a SARS-CoV, SARS-CoV-2 e MERS-CoV

[043] Em algumas modalidades, a invenção fornece um método para detectar um anticorpo, incluindo: Etapa 1: colocar em contato uma amostra com um ligante ou um fragmento contendo ligante, para formar um primeiro reagente e detectar um primeiro sinal de reação; e Etapa 2: colocar em contato o primeiro reagente com um receptor do ligante ou um fragmento do mesmo, para formar um segundo reagente e detectar um segundo sinal de reação.

[044] No método de detecção acima, a Etapa 1 detecta os anticorpos totais ligados ao ligante e a Etapa 2 detecta os anticorpos neutralizantes ligados ao ligante. O método de detecção fornecido de acordo com o presente pedido pode detectar os anticorpos neutralizantes e/ou os anticorpos totais.

[045] Na presente invenção, a amostra a ser detectada deve ser entendida como uma amostra que pode conter os anticorpos, e a amostra pode ser soro, plasma, sangue total, exsudato da mucosa oral, linfa, saliva, urina e não está limitada aos mesmos.

[046] Na presente invenção, a detecção do sinal de reação pode ser o uso de métodos de detecção conhecidos, tais como turbidimetria, absorbância, razão de dispersão e ressonância magnética nuclear para detectar uma mudança de um valor de sinal.

[047] Em algumas modalidades, o sinal de reação é ainda amplificado por acoplamento das microesferas de látex no receptor e/ou ligante, e os anticorpos totais e os anticorpos neutralizantes são detectados por um modo de detecção imunoturbidimétrica.

[048] Vários aspectos e modalidades da presente invenção são discutidos com referência aos desenhos e às modalidades a seguir. Outros aspectos e modalidades são evidentes aos técnicos no assunto. Embora o presente pedido já esteja descrito em combinação com as modalidades exemplificativas, muitas modificações e mudanças equivalentes são claras para técnicos no assunto enquanto o presente pedido é apresentado. Portanto, as modalidades exemplificativas do presente pedido são exemplificativas e não restritivas. Várias mudanças podem ser feitas nas modalidades sem se afastar de um propósito e escopo do presente pedido.

Exemplo 1: Detecção de anticorpo

[049] No exemplo, o requerente fornece um método e um conjunto para detectar simultaneamente anticorpos totais de SARS-CoV-2 e anticorpos neutralizantes.

1.1 Material e método

[050] ACE2 humano recombinante, um antígeno RBD recombinante, uma substância padrão de anticorpo neutralizante SARS-COV-2 (G3) e microesferas de látex são todos adquiridos pela Guangdong Feipeng Biological Co., Ltd. Instrumento: Analisador bioquímico totalmente automático.

1.2 Microesferas de látex acopladas a ACE2

[051] 1) 390 μL de solução de reticulação (HEPES 50 mM, pH 6,1), 100 μL de microesferas de látex (JSR) são adicionados, agitados e uniformemente misturados em um agitador, para formar a solução de microesferas de látex;

[052] 2) 13 μL de solução de EDAC são adicionados à solução de microesferas de látex, agitados e ativados a 37 °C por 1 hora;

[053] 3) 50 μL de ACE2 (2 mg/mL) são adicionados à solução de microesferas de látex, agitados e reticulados a 37 °C por 4 horas;

[054] 4) 50 μL de solução de TW-20 são adicionados, agitados e bloqueados a 37 °C por 1 hora;

[055] 5) o líquido de reticulação é adicionado a um tubo de centrifugação, após a centrifugação, o sobrenadante é cuidadosamente descartado com uma pipeta;

[056] 6) 2 mL de solução de limpeza (glicina 50 mM + NaN3 0,1%, pH 8,0) são adicionados, agitados em vórtice, centrifugados novamente e o sobrenadante é cuidadosamente descartado; e

[057] 7) 5 mL de suspensão de microesferas de látex (glicina 50 mM + BSA 0,1% + sacarose 10% + NaN3 0,1%, pH 8,0) são adicionados e ultrassonicamente dispersos e tratados.

1.3 Microesferas de látex acopladas a RBD

[058] 1) 390 μL de solução de reticulação (HEPES 50 mM, pH 6,1), 100 μL de microesferas de látex (JSR) são adicionados, agitados e uniformemente misturados no agitador, para formar solução de microesferas de látex;

[059] 2) 13 μL de solução de EDAC são adicionados à solução de microesferas de látex, agitados e ativados a 37 °C por 1 hora;

[060] 3) 50 μL de RBD (2 mg/mL) são adicionados à solução de microesferas de látex, agitados e reticulados a 37 °C por 4 horas;

[061] 4) 50 μL de solução de TW-20 são adicionados, agitados e bloqueados a 37 °C por 1 hora;

[062] 5) o líquido de reticulação é adicionado a um tubo de centrifugação, após a centrifugação, o sobrenadante é cuidadosamente descartado com uma pipeta;

[063] 6) 2 mL de solução de limpeza (glicina 50 mM + NaN3 0,1%, pH 8,0) são adicionados, agitados em vórtice, centrifugados novamente e o sobrenadante é cuidadosamente descartado; e

[064] 7) 5 mL de suspensão de microesferas de látex (glicina 50 mM + BSA 0,1% + sacarose 10% + NaN3 0,1%, pH 8,0) são adicionados, ultrassonicamente dispersos e tratados.

1.4 Preparação de substância padrão

[065] A substância padrão do anticorpo neutralizante G3 (adquirida pela Guangdong Feipeng Biological Co., Ltd) é diluída com soro de matriz nas seguintes concentrações diferentes: 0, 25 ng/mL, 50 ng/mL, 100 ng/mL, 200 ng/mL, 500 ng/mL, 1000 ng/mL e 2000 ng/mL.

1.5 Detecção na máquina

[066] Instrumento: analisador bioquímico totalmente automático

[067] Processo de detecção: 15 μL de uma amostra em uma placa de amostra são absorvidos e 135 μL de R1 são absorvidos, adicionados a uma cubeta, mecanicamente agitados e incubados a 37 °C por 5 minutos; 15 μL de R2 são adicionados à cubeta e agitados mecanicamente; o instrumento registra os valores de absorbância em 7 minutos e 30 segundos e 13 minutos e 30 segundos a partir do momento em que a amostra é adicionada, um valor de diferença é um grau de reação da amostra e o grau de reação é diretamente proporcional à concentração total de anticorpos na amostra. Depois de reagir continuamente por 10 minutos, 50 μL de R3 são adicionados à cubeta e agitados mecanicamente; e o instrumento registra os valores de absorbância em 15 minutos, 30 segundos e 26 minutos a partir do momento em que a amostra é adicionada, um valor de diferença é um grau de reação da amostra e o grau de reação é inversamente proporcional à concentração de anticorpo neutralizante na amostra.

[068] Razão de amostragem S: R1: R2: R3 = 15: 135: 15: 50;

[069] Comprimento de onda: 570 nm;

[070] Tempo em branco 1: 51-51;

[071] Tempo de reação 1: 90-90;

[072] Tempo em branco 2: 104-104;

[073] Tempo de reação 2: 172-172;

[074] R1: tampão Tris;

[075] R2: reagente de microesferas de látex acoplado a RBD; e

[076] R3: reagente de microesferas de látex acoplado a ACE2.

[077] Nota: Taxa de inibição = sinal de detecção de 1 amostra/sinal de detecção negativo

[078] Pode ser conhecido pela análise dos dados da Tabela 1 que a amostra de detecção é uma substância padrão do anticorpo neutralizante e 17% da taxa de inibição ainda pode ser detectada a 25 ng/mL de uma concentração padrão, em outras palavras, a sensibilidade pode atingir pelo menos 25 ng/mL se for detectada de acordo com o reagente preparado e o método da invenção.

[079] O significado do ponto de leitura na Tabela 1 acima é explicado tomando o Ponto de leitura 1 como exemplo: enquanto o analisador bioquímico totalmente automático lê o sinal, ele é calculado a partir de 0 s quando a amostra é adicionada, e lê em um certo intervalo de tempo, como ler uma vez a cada 9 s, um número correspondente 51 no Ponto de leitura 1 significa o sinal lido pela 50ª vez, e o tempo de leitura é um ponto de tempo de 450 s após a amostra ser adicionada (ou seja, 7 minutos e 30 segundos). Outros pontos de leituras são analogizados da mesma maneira

Exemplo 2: Detecção de anticorpo de amostra clínica 2.1 Preparação de reagentes: De acordo com o método na Modalidade 1, os seguintes reagentes são preparados:

[080] R1: Tampão Tris

[081] R2: reagente de microesferas de látex acoplado a RBD

[082] R3: reagente de microesfera de látex ACE2 acoplado

2.2 Coleta de 23 casos de amostras de soro após inoculação com vacina COVID-19 2.3 Detecção na máquina

[083] Instrumento: Mindray BS480

[084] Processo de detecção: 15 μL de uma amostra em uma placa de amostra são absorvidos e 135 μL de R1 são absorvidos, adicionados a uma cubeta, agitados mecanicamente e incubados a 37 ° C por 5 minutos; 15 μL de R2 são adicionados à cubeta e agitados mecanicamente; o instrumento registra os valores de absorbância em 7 minutos e 30 segundos e 13 minutos e 30 segundos a partir do momento em que a amostra é adicionada, um valor de diferença é uma absorbância de reação da amostra e a absorbância é diretamente proporcional à concentração total de anticorpos na amostra sob uma condição específica. Depois de reagir continuamente por 10 minutos, 50 μL de R3 são adicionados à cubeta e agitados mecanicamente; e o instrumento registra os valores de absorbância em 15 minutos 30 segundos e 26 minutos a partir do momento em que a amostra é adicionada, um valor de diferença é uma absorbância de reação da amostra e a absorbância é diretamente proporcional à concentração de anticorpo neutralizante na amostra sob a condição específica.

[085] Razão de amostragem S: R1: R2: R3 = 15: 135: 15: 50

[086] Comprimento de onda: 570 nm

[087] Tempo em branco 1: 51-51

[088] Tempo de reação 1: 90-90

[089] Tempo em branco 2: 104-104

[090] Tempo de reação 2: 172-172

[091] R1: Tampão Tris

[092] R2: reagente de microesferas de látex acoplado a RBD

[093] R3: reagente de microesferas de látex ACE2 acoplado

Exemplo de contraste 1: Anticorpos totais na amostra clínica detectados pela plataforma de luminescência existente

[094] 3.1 Detecção de anticorpo total por quimioluminescência: 50 μL de uma amostra são adicionados a um copo de reação, e então 50 μL de RBD revestido com esfera magnética (0,25 mg/mL) e 40 μL de solução de marcação de anticorpo IgG anti-humano marcado com éster de acridínio (0,1 μg/mL) são adicionados, reagidos a 37 °C por 15 min, e um valor de luminescência é detectado.

[095] 3.2 Detecção de anticorpo neutralizante por quimioluminescência: 50 μL de uma amostra são adicionados a um copo de reação e, em seguida, 50 μL de ACE2 revestidos com esfera magnética (0,25 mg/mL) e 40 μL de solução de marcação de RBD marcado com éster de acridínio (0,1 μg/mL) são adicionados, reagidos a 37 °C por 15 min, e um valor de luminescência é detectado.

[096] Os resultados da detecção são os seguintes:

[097] Nota: Taxa de inibição = grau de reação de 1 amostra/grau de reação PBS

[098] Análise: o reagente de detecção de anticorpo preparado pela invenção pode detectar simultaneamente os anticorpos totais e anticorpos neutralizantes na amostra e, como mostrado na Fig. 2 e Fig. 3, a correlação R² dos anticorpos totais com a detecção separada da plataforma de quimioluminescência de alta sensibilidade atinge 0,81 e a correlação R² dos anticorpos neutralizantes atinge 0,78, uma conformidade é consistente.

Exemplo 3: Detecção do reagente preparado no Exemplo 1 com 50 casos de amostras negativas e 23 casos de amostras positivas (vacinados)

[099] Os resultados são mostrados na Fig. 4. Pode ser visto na Fig. 4 que o reagente preparado e o método de detecção da invenção podem distinguir bem as amostras negativas e positivas, e a especificidade da reação é alta. Ele também tem um alto grau de discriminação para as diferentes amostras positivas, e a detecção de reação tem uma ampla faixa linear

[0100] O acima exposto indica apenas modalidades preferidas da invenção e não são usadas para limitar a invenção. Várias modificações e alterações podem ser feitas na invenção por técnicos no assunto. Quaisquer modificações, substituições equivalentes, melhorias e similares feitas dentro do espírito e princípio da invenção devem ser incluídos em um escopo de proteção da invenção.

Claims

.Método para detectar um anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende:
Etapa 1: colocar em contato uma amostra com um ligante ou um fragmento contendo ligante, para formar um primeiro reagente e detectar um primeiro sinal de reação; e
Etapa 2: colocar em contato o primeiro reagente com um receptor do ligante ou um fragmento do mesmo e detectar um segundo sinal de reação
Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método de detecção é usado para detectar anticorpos neutralizantes e/ou anticorpos totais.
Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o ligante ou o fragmento contendo ligante pode ser acoplado a um marcador; e opcionalmente, o marcador são microesferas de látex
Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o receptor ou o fragmento do mesmo pode ser acoplado a um marcador; e opcionalmente, o marcador são microesferas de látex.
Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o ligante ou o fragmento contendo ligante é derivado de um patógeno; opcionalmente, o patógeno é SARSr-CoV; opcionalmente, o ligante ou o fragmento contendo ligante é selecionado a partir de um ligante contendo uma região RBM no SARSr-CoV; e opcionalmente, o ligante ou o fragmento contendo ligante é selecionado a partir de um ligante contendo uma região RBM de SARS-CoV-2.
Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o receptor ou o fragmento do mesmo é um receptor da superfície celular; e opcionalmente, o receptor é ACE2.
Conjunto para detectar um anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende:
- (i) um ligante ou um fragmento contendo ligante, e
- (ii) um receptor ou um fragmento do mesmo ligado ao ligante de (i).
Conjunto de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que: o ligante ou o fragmento contendo ligante é acoplado a um marcador; e opcionalmente, o marcador são microesferas de látex.
Conjunto de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que: o receptor ou o fragmento do mesmo ligado ao ligante de (i) é acoplado a um marcador; e opcionalmente, o marcador são microesferas de látex.
Conjunto de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que o ligante ou o fragmento contendo ligante é derivado de um patógeno; opcionalmente, o ligante ou o fragmento contendo ligante é selecionado a partir de um ligante contendo uma região RBM em SARSr-CoV; opcionalmente, o ligante ou o fragmento contendo ligante é selecionado a partir de um ligante contendo uma região RBM de SARS-CoV-2; opcionalmente, o receptor ou o fragmento do mesmo é um receptor de superfície celular ou um fragmento do mesmo; e opcionalmente, o receptor é ACE2.
Aplicação do método definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 ou do conjunto definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizado pelo fato de ser na detecção de um anticorpo ou preparação de um reagente de detecção de anticorpo