BR102020012760A2

BR102020012760A2 - Ensaio para o diagnóstico de infecções causadas por nematodos

Info

Publication number: BR102020012760A2
Application number: BR102020012760-8A
Authority: BR
Inventors: Babett MENGE; Katja Steinhagen; Juliane Schaefer; Christian Probst; Andrea Deeberg; Mandy Unger; Claudia Messing
Original assignee: Euroimmun Medizinische Labordiagnostika Ag
Priority date: 2019-07-02
Filing date: 2020-06-22
Publication date: 2022-03-08
Also published as: US11519919B2; LT3761029T; CN112180096A; EP3761029B1; US20210003591A1; EP3761029A1

Abstract

ensaio para o diagnóstico de infecções causadas por nematodos. a presente invenção refere-se a um veículo diagnosticamente útil que compreende (a) um peptídeo que compreende a sequência de aminoácidos indicada na seq id no:1 ou uma variante da mesma, e (b) um lisato somático de larvas de toxocara canis. além disso, a presente invenção refere-se a um kit, uso, métodos, composições que compreendem o veículo diagnosticamente útil da invenção.

Description

ENSAIO PARA O DIAGNÓSTICO DE INFECÇÕES CAUSADAS POR NEMATODOS

[0001] A presente invenção refere-se a um veículo diagnosticamente útil que compreende (a) um peptídeo que compreende a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO:1 ou uma variante da mesma, e (b) um lisato somático de larvas de Toxocara canis. Além disso, a presente invenção refere-se a um kit, uso, métodos, composições que compreendem o veículo diagnosticamente útil da invenção.

[0002] A toxocaríase é a infecção dos seres humanos por helmintos que é causada pela lombriga, pela Toxocara canis ou pela Toxocara cati. Essa infecção ocorre quando os ovos embrionados que contêm larvas infectantes inteiramente desenvolvidas de Toxocara spp. são ingeridos. As larvas no intestino humano penetram na parede dos intestinos e migram através dos vasos sanguíneos para alcançar o fígado, os músculos e os pulmões, migrando até mesmo para os olhos e o cérebro.

[0003] A toxocaríase normalmente é chamada de larva migrans visceral (VLM). Os nomes alternativos ou os sintomas relacionados podem ser a larva migrans ocular (OLM), a doença de Weingarten, a síndrome de Frimodt-Moller ou a pseudoleucemia eosinofílica, a oftal-mite nematoide, a doença de toxocara, a toxocarose ou a toxocaríase oculta. Esta infecção zoonótica, helmíntica, é uma causa rara de cegueira e pode provocar sintomas reumáticos, neurológicos ou asmáticos [Schantz, PM (1994), Journal of the American Veterinary Medical Association; 204 (7): 1023-8], Os seres humanos normalmente são infectados pela ingestão de ovos embrionados (cada um contendo uma larva inteiramente desenvolvida, L2) das fontes contaminadas (solo, carne malcozida, vegetais frescos ou mal lavados).

[0004] A Toxocara canis é um nematódeo cujo ciclo de vida básico consiste em sete estágios: um ovo, quatro estágios larvais (L2, L2, L3, L4) e dois estágios adultos que compreendem machos e fêmeas separados. Os nematódeos se modificam quatro vezes durante os estágios larvais com um uma modificação que ocorre no final de cada estágio larval.

[0005] Tendo em vista que os métodos de diagnóstico e de detecção da toxocaríase são cruciais para sua prevenção e tratamento, vários PCR, western-blot e ensaios de detecção baseados em ELISA são descritos no estado da técnica. Não obstante, os ensaios de PCR requerem pessoal altamente especializado e equipamentos muito caros. Isto pode ser um fator limitante, especialmente nos países onde a soroprevalência à Toxocara é mais alta.

[0006] Desse modo, o diagnóstico baseia-se em métodos imunológicos sensíveis (tais como ELISA e western-blot) que usam antíge-nos excretores-secretores de Toxocara. No entanto, os ensaios imuno-lógicos atuais de Toxocara não apresentam alta especificidade e sensibilidade ao mesmo tempo. Os exemplos de tais ensaios são descritos por dos Santos et al. [dos Santos et al. (2019), PLoS One; 14 (3)], Jin et al. [Jin et al. (2013), Korean J Parasitol; 51 (4): 433-9], Mohamad et al. [Mohamad et al. (2009), J Clin Microbiol; 47 (6): 1712-7] and Norhaida et al. [Norhaida et al. (2008), Ann Trop Med Parasitol; 102 (2): 151-60],

[0007] Portanto, há uma necessidade de longa data da provisão de um ensaio sorológico para o diagnóstico combinado sensível e específico de infecções por Toxocara.

[0008] Os autores da presente invenção descobriram de modo surpreendente que o uso combinado de um peptídeo que compreende o aminoácido indicado na SEQ ID NO:1 e um lisato somático das larvas de Toxocara canis resultam em um ensaio imunológico (por exemplo, um ELISA) que apresenta uma razão bem equilibrada entre alta sensibilidade e alta especificidade. Esta razão bem equilibrada entre alta sensibilidade e alta especificidade pode ser observada de preferência quando o peptídeo e o lisato são misturados e co-localizados em um veículo diagnóstico.

[0009] Desse modo, em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a um veículo diagnosticamente útil que compreende (a) um peptídeo que compreende a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO:1 ou uma variante da mesma, e (b) um lisato somático de larvas de Toxocara canis.

[0010] Nas modalidades preferidas adicionais, o veículo é selecionado do grupo que compreende uma slide de vidro, um biochip, uma placa de microtítulo, um dispositivo de fluxo lateral, uma tira de teste, uma membrana, um borrão de linha, uma coluna de cromatografia e um grânulo.

[0011] Em um segundo aspecto, a presente invenção refere-se a um kit que compreende o veículo diagnosticamente útil da invenção e um anticorpo etiquetado para detectar um anticorpo humano, de Cani-dae ou de Rodentia.

[0012] Em um terceiro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para diagnosticar uma infecção por Toxocara que compreende a detecção, em uma amostra de um paciente, da presença de um anticorpo para a SEQ ID NO:1 e/ou um anticorpo a um lisato somático de larvas de Toxocara canis.

[0013] Em um quarto aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição que compreende (a) um peptídeo que compreende a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO:1 ou uma variante da mesma, e (b) um lisato somático de larvas de Toxocara canis.

[0014] Em um quinto aspecto, a invenção também refere-se à composição da invenção ou ao veículo diagnosticamente útil da invenção para uso no diagnóstico de uma infecção por Toxocara.

[0015] Em um sexto aspecto, a invenção refere-se a um método para determinar a presença de um anticorpo contra uma proteína de Toxocara canis de acordo com a SEQ ID NO:1 e/ou um anticorpo contra uma proteína de um lisato somático de larvas de Toxocara canis, o qual compreende i) a colocação de uma amostra isolada de um indivíduo que tem uma infecção por Toxocara em contato com um polipep-tídeo que compreende a SEQ ID NO:1 e/ou uma variante da mesma e com um lisato somático de larvas de Toxocara canis, em que o poli-peptídeo e/ou o lisato se ligam especificamente aos anticorpos que se ligam à SEQ ID NO:1 ou ao lisato somático; e ii) a determinação da presença de um anticorpo contra a SEQ ID NO:1 e/ou um anticorpo contra o lisato somático.

[0016] Em um sétimo aspecto, a invenção também refere-se ao uso de uma proteína de Toxocara canis de acordo com a SEQ ID NO:1 e a um lisato somático de larvas de Toxocara canis para a fabricação de um kit para detectar a infecção por Toxocara que compreende: (a) um peptídeo que compreende a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO:1 ou uma variante da mesma, e (b) um lisato somático de larvas de Toxocara canis.

[0017] Nas modalidades preferidas de vários aspectos da invenção, a infecção por Toxocara é uma infecção por Toxocara canis.

[0018] Nas modalidades preferidas de vários aspectos da invenção, a amostra consiste em sangue, soro, plasma, CSF, urina ou saliva.

[0019] Em outras modalidades preferidas de vários aspectos da invenção, a infecção por Toxocara pode ser distinta de uma infecção por Echinococcus, Strongyloides e Ascaris.

[0020] Além disso, nas modalidades preferidas de vários aspectos da invenção, o peptídeo e o lisato são combinados de modo conjunto.

[0021] Nas modalidades preferidas de vários aspectos da invenção, o anticorpo contra a SEQ ID NO:1 e/ou o anticorpo contra o lisato somático são selecionados do grupo que compreende os anticorpos da classe IgG, IgA e IgM.

[0022] Nas modalidades preferidas de vários aspectos da invenção, a detecção ou a determinação compreendem um ensaio do borrão, um imunoensaio de quimioluminiscência, um imunoensaio de dispersão de luz, um imunoensaio radiorotulado ou um ensaio de imuno-fluorescência.

[0023] A presente invenção baseia-se nos achados surpreendentes dos autores da presente invenção de que os anticorpos para a SEQ ID NO:1 e um lisato somático de larvas de Toxocara canis pode ser usado para o diagnóstico sensível e específico de uma infecção por nematódeo, a saber, uma infecção por Toxocara. Experimentalmente, é demonstrado que o uso combinado de Toxocara canis TES-30 (SEQ ID NO:1) e o lisato somático das larvas de Toxocara canis resulta em um ensaio bem equilibrado com alta especificidade e sensibilidade ao mesmo tempo. Tal ensaio supera os ensaios que usam a proteína separada, o lisato separado e um ensaio padrão que compreende os antígenos excretores-secretores de Toxocara (TES).

[0024] De acordo com a presente invenção, os (poli)peptídeos podem ser proteínas recombinantes, em que o termo “recombinante”, tal como usado no presente documento, refere-se a um polipeptídeo produzido usando abordagens de engenharia genética em qualquer estágio do processo de produção, por exemplo, mediante a fusão de um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo em um promotor forte para superexpressão nas células ou tecidos ou pela engenharia da sequência do próprio polipeptídeo. Um elemento versado no estado da técnica é familiarizado com os métodos de engenharia de ácidos nucleicos e os polipeptídeos codificados (por exemplo, descrito em Sambrook, J., Fri-tsch, E. F. e Maniatis, T. (1989), Molecular Cloning, CSH ou em Brown T. A. (1986), Gene Cloning - an introduction, Chapman & Hall) e para a produção e purificação de polipeptídeos nativos ou recombinantes (por exemplo Handbooks, “Strategies for Protein Purification”, “Antibody Purification”, publicado por GE Healthcare Life Sciences, e em Burgess, R. R., Deutscher, Μ. P. (2009): Guide to Protein Purification).

[0025] Em uma modalidade preferida, o polipeptídeo é o Toxocara canis TES-30, que tem ou compreende a SEQ ID NO:1 ou a A0A1D8MBE4 (Uniprot), com mais preferência a ID SEQ NO:1. Em todo o presente Pedido de Patente, qualquer código de base de dados usado refere-se à sequência disponível da dita base de dados na primeira data de prioridade que refere-se ao dito Pedido de Patente. Em outra modalidade, podem ser usados os polipeptídeos que são compreendidos em um lisato somático das larvas de Toxocara canis. Em outra modalidade preferida, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção e usado para as várias modalidades da presente invenção é um polipeptídeo isolado, em que o termo "isolado", tal como usado no presente documento, significa que o polipeptídeo foi enriquecido se comparado a seu estado quando da produção com o uso de uma abordagem biotecnológica ou sintética e é de preferência puro, isto é, pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 ou 99 por cento do polipeptídeo na respectiva amostra consiste no dito polipeptídeo, tal como julgado pela eletroforese em gel de poliacrilamida SDS seguida pelo tingimento com o azul de Coomassie e por determinação quantitativa usando um densitômetro auxiliado por computador. Alternativamente, o termo "isolado" pode se referir à solução enriquecida que compreende várias proteínas diferentes, visto que a solução foi essencialmente purificada de outros tipos da molécula, tais como lipídeos ou moléculas de ácido nucleico.

[0026] Em uma modalidade preferida, o termo "variante", tal como usado no presente documento, pode se referir a pelo menos um fragmento da sequência de comprimento completo indicada, por exemplo, na SEQ ID N0:1 ou na SEQ ID N0:2, com mais preferência a SEQ ID NO:1, mais especificamente um ou mais aminoácidos ou sequência de ácido nucleico que é, em relação à sequência de comprimento completa, truncada em um ou ambos os terminais por um ou mais aminoácidos. Tal fragmento compreende ou codifica um peptídeo que tem pelo menos 10, 13, 15, 25, 50, 75, 100, 150, 200 ou 230 aminoácidos sucessivos da sequência original ou uma variante d mesma. O comprimento total da variante pode ser pelo menos 13, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais aminoácidos.

[0027] Em outra modalidade preferida, o termo "variante" refere-se não somente a pelo menos um fragmento, mas também a um polipep-tídeo ou a um fragmento do mesmo que compreende as sequências de aminoácido, de preferência um fragmento que compreende pelo menos 25, com mais preferência 50, com mais preferência 100, com mais preferência 150, com mais preferência 200, com mais preferência 230 aminoácidos sucessivos, que são pelo menos 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,4, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8 ou 99,9 % idênticos à sequência de aminoácidos de referência indicada ou ao fragmento da mesma, em que os aminoácidos, com exceção daqueles essenciais para a atividade biológica, por exemplo, a capacidade de se ligar especificamente a um anticorpo de interesse, ou a dobra ou estrutura do polipeptídeo são suprimidos ou substituídos e/ou um ou mais de tais aminoácidos essenciais são substituídos de uma maneira conservadora e/ou os aminoácidos são adicionados ou suprimidos de tal modo que a atividade biológica do polipeptídeo é, pelo menos parcialmente, preservada. Os métodos conhecidos compreendem os vários métodos que podem ser usados para alinhar dois ácidos nucleicos ou sequências de aminoácidos dados e para calcular o grau de identidade. Vide, por exemplo, Arthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics, Oxford University Press, 2008, 3a edição. Em uma modalidade preferida, o software ClustalW (Larkin, M. A., Blackshields, G., Brown, N. P., Chenna, R., McGettigan, P. A., McWilliam, H., Valentin, F., Wallace, M. do I., Wilm, A., Lopez, R., Thompson, J. D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. (2007): Versão 2.0 do Clustal W e Clustal X. Bioin-formatics, 23, 2947-2948) é usado para aplicação dos ajustes padrão.

[0028] Nas modalidades preferidas, a variante é um polipeptídeo que compreende uma sequência que tem pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência para a sequência de acordo com a SEQ ID NO:1. Em uma modalidade preferida, a variante é um polipeptídeo que compreende uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade de sequência para a sequência de acordo com a SEQ ID NO:1.

[0029] As estruturas de proteínas relacionada a TES-30/SEQ ID NO:1, especificamente aquelas de outras proteínas de lectina, são bem conhecidas de um elemento versado na técnica. Tais estruturas de proteínas podem ser encontradas, por exemplo, em httpsY/modbase. Comp-bio.ucsf.edu/modbase-cgi/model_details.cgi?queryfile= 1592383498_ 9335&searchmode=default&displaymode=moddetail&referer=yes&snpfla g=&. Além disso, o elemento versado na técnica é ciente dos fragmentos de TES-30 que conferem atividade imunogênica. Ebrahimi et al. (Ebrahimi, M. et al. (2019), Int J Pept Res Ther (2019). https:// doi.org/10.1007/s10989-019-09940-1) descrevem que os fragmentos de TES-30 de resíduos de aminoácidos 52 a 102 e 172 a 207 têm uma elevada imunogenicidade. Desse modo, nas modalidades preferidas da invenção as variantes da SEQ ID NO:1 compreendem a sequência dos fragmentos 52 a 102 (de acordo com a SEQ ID NO:3) e/ou 172 a 207 (de acordo com a SEQ ID NO:4) de TES-30. Em modalidades ainda mais preferidas, as variantes da SEQ ID NO:1 compreendem ambas a SEQ ID NO:3 e a SEQ ID NO:4.

[0030] Em uma modalidade preferida, as variantes também podem compreender modificações químicas, por exemplo, etiquetas isotópi-cas ou modificações covalentes, tais como glicosilação, fosforilação, acetilação, decarboxilação, citrulinação, hidroxilação e outras. O elemento versado no estado da técnica é familiarizado com os métodos para a modificação dos polipeptídeos. Além disso, as variantes também podem ser geradas por fusão com outros polipeptídeos ou outras variantes conhecidas.

[0031] A variante do polipeptídeo tem atividade biológica. Em uma modalidade preferida, tal atividade biológica é a capacidade de se ligar, de preferência de capturar especificamente o respectivo anticorpo se a variante for uma variante de uma sequência do grupo que compreende a SEQ ID NO:1 ou a SEQ ID NO:2, de preferência a SEQ ID NO:1. Por exemplo, uma variante da SEQ ID NO:1 tem a capacidade de capturar especificamente um anticorpo para a SEQ ID NO:1 em uma amostra obtida de um indivíduo que sofre ou que é suspeito de sofrer de uma infecção por nematódeo, de preferência uma infecção por Toxocara canis. Tais variantes têm pelo menos um epítopo reconhecido pelo anticorpo a ser capturado, por exemplo, um epítopo na SEQ ID NO:1 se um anticorpo para a SEQ ID NO:1 for capturado. Uma variante da SEQ ID NO:2 tem a capacidade de capturar especificamente um anticorpo para a SEQ ID NO:2 em uma amostra de um indivíduo que sofre ou que é suspeito de sofrer de uma infecção por nematódeo, de preferência uma infecção por Toxocara canis.

[0032] O elemento versado no estado da técnica pode projetar variantes partindo da sequência SEQ ID NO:1 original, introduzindo modificações tais como mutações de ponto, truncamentos e outras e depois confirmando que a variante ainda tem atividade biológica ao testar se a dita variante se liga a um anticorpo para a SEQ ID NO:1 em uma amostra obtida de um indivíduo que sofre da doença a ser diagnosticada, de preferência uma infecção, com mais preferência uma infecção por nematódeo, com mais preferência uma infecção por Toxocara, e com mais preferência uma infecção por Toxocara canis. As variantes podem ser identificadas pela identificação dos fragmentos que ocorrem naturalmente derivados da proteína de comprimento completo ou de um precursor da mesma, por exemplo, purificando as mesmas usando um polipeptídeo que compreende a SEQ ID NO:1 ou a SEQ ID NO:2, de preferência a SEQ ID NO:1, como um ligando de afinidade seguido pelo sequenciamento de N-terminal de Edman e/ou digestão tríptica em combinação com a espectrometria de massa, e usando os mesmos para praticar a invenção. As substituições de aminoácidos conservadoras podem ser usadas para todas as variantes.

[0033] Dentro do âmbito da presente invenção está um veículo diagnosticamente útil que compreende um meio para capturar especificamente um anticorpo para um antígeno tal como a SEQ ID NO:1 ou a SEQ ID NO:2, de preferência a SEQ ID NO:1 e o lisato somático de larvas de Toxocara canis. Em uma modalidade preferida, o termo "que captura especificamente um anticorpo", tal como usado no presente documento, refere-se à capacidade de se ligar especificamente ao anticorpo de interesse, de preferência um anticorpo da classe IgA, IgM ou IgG, para o efeito de que é ligado e pode ser removido da amostra, visto que outros anticorpos, de preferência da mesma classe e/ou para um outro antígeno, essencialmente não são ligados e permanecem na amostra. O anticorpo é de preferência um anticorpo que se liga ao antígeno de interesse somente tal como o representado pela SEQ ID NO:1 ou a SEQ ID NO:2, de preferência a SEQ ID NO:1 e o lisato somático de larvas de Toxocara canis.

[0034] O veículo diagnosticamente útil de acordo com a invenção serve como uma sustentação para um ou mais meios para capturar especificamente um anticorpo, de preferência um anticorpo relevante diagnosticamente para um antígeno de Toxocara, tal como o representado pela SEQ ID NO:1 e/ou o lisato somático de larvas de Toxocara canis. O dito veículo é apropriado para realizar um método diagnóstico. Ao usar um veículo em vez de um meio livre, solúvel, para capturar especificamente um anticorpo, é mais direto isolar e separar da amostra um complexo que compreende os meios e o anticorpo e lavar o dito complexo, por exemplo, com a finalidade de remover quaisquer moléculas que se ligam de modo não específico aos meios, ao complexo ou ao veículo. Em uma modalidade preferida, o veículo diagnosticamente útil é um dispositivo diagnóstico, selecionado de preferência do grupo que compreende um grânulo, de preferência um grânulo para-magnético, uma tira de teste, uma placa de microtítulo, um microarran-jo, um borrão e uma membrana, e é de preferência um borrão de linha ou uma placa de microtítulo, com mais preferência uma placa de microtítulo. O veículo pode compreender um ou mais controles, de preferência todos do grupo que compreende um controle conjugado de IgM, que confirma que um anticorpo secundário que reconhece o IgM humano foi adicionado, um controle conjugado de IgG, que confirma que um anticorpo secundário que reconhece o IgG humano foi adicionado, um controle conjugado de IgA, que confirma que um anticorpo secundário que reconhece o IgA humano foi adicionado, um controle de soro, que confirma que o soro foi adicionado, um controle negativo, que mostra que não há nenhum sinal falso positivo, um controle positivo, que mostra que não há nenhum sinal falso negativo, e um ou mais controles calibradores, que são de preferência pontos positivos fracos que permitem uma determinação semiquantitativa. Se o veículo compreender diversos antígenos, o veículo pode compreender uma faixa da separação, que pode indicar a separação espacial das faixas, por exemplo, as faixas de controle em uma mão e as faixas de antígeno em outra. Além disso, o veículo pode compreender uma faixa de corte.

[0035] O veículo diagnosticamente útil pode ser um slide, de preferência um slide de vidro ou de plástico para a microscopia, o qual compreende uma ou mais células eucarióticas, cada uma separada espacialmente uma da outra e cada uma expressando um polipeptídeo que é um meio para capturar especificamente um anticorpo. Uma ou mais células eucarióticas podem ser células vivas, mas de preferência são células fixas. Os protocolos do estado da técnica estão disponíveis para fixação da célula, por exemplo, usando o metanol ou o formaldeí-do. A imunofluorescência indireta pode ser usada para detectar um anticorpo capturado usando tal veículo. Uma célula pode compreender o peptídeo de acordo com a SEQ ID NO:1 ou uma variante da mesma. Além disso, um lisato de larvas de Toxocara canis pode ser imobilizado no slide.

[0036] O veículo diagnosticamente útil pode ser um grânulo configurado para um imunoensaio o qual compreende um polipeptídeo que compreende a SEQ ID NO:1 ou uma variante da mesma e o lisato somático de larvas de Toxocara canis. Em uma modalidade mais preferida, o grânulo é um grânulo sólido que compreende um carboidrato, tal como a sefarose ou um polímero sintético, tal como o látex, de preferência um grânulo paramagnético, que pode ser removido de uma solução e ser concentrado, de preferência na superfície de um vaso, pela aplicação de um campo magnético. O grânulo compreende um meio para a captura de um anticorpo ligado ao grânulo por uma ligação co-valente ou não covalente. Uma mistura de grânulos, por exemplo, um que é ligado à SEQ ID NO:1 ou uma variante da mesma, e/ou um que é ligado à SEQ ID NO:2 ou uma variante da mesma, pode ser usada.

[0037] Em uma modalidade preferida, o dispositivo diagnosticamente útil é uma placa de microtítulo que compreende uma faixa de poços configurados para um imunoensaio, tal como um ensaio ELISA. De preferência, a placa de microtítulo compreende um poço revestido com meios para capturar especificamente um anticorpo para a SEQ ID No:1 e ou a SEQ ID NO:2, e de preferência a SEQ ID NO:1 e o lisato somático de larvas de Toxocara canis, o que significa que é de preferência um polipeptídeo que compreende a SEQ ID NO:1 ou uma variante da mesma e o lisato somático de larvas de Toxocara canis. Em uma modalidade preferida, o termo "placa de microtítulo" é um dispositivo diagnóstico, feito de preferência de vidro ou de plástico, com mais preferência de plástico, que compreende um ou mais, de preferência mais de um, com mais preferência pelo menos 8 poços, em que as reações no tampão líquido podem ocorrer separadamente sem contaminação cruzada. Pelo menos um dos poços é revestido com um polipeptídeo, de preferência um polipeptídeo antigênico, que pode ser usado para capturar especificamente um anticorpo diagnosticamente útil. Se mais de um meio para detectar especificamente um antígeno for usado, então cada meio é de preferência separado de outros meios em um poço. A placa de microtítulo pode ser usada para lidar com várias amostras em paralelo, de preferência de uma forma automatizada. Os poços são de preferência compatíveis com pelo menos uma técnica de detecção de rotina, tal como a colorimetria, a imunofluorescên-cia, a detecção da atividade enzimática, a quimioluminescência, a radioatividade ou outras ainda. Além disso, um poço separado pode incluir um ou mais antígenos para detectar uma outra infecção por ne-matódeo.

[0038] Nas modalidades preferidas da presente invenção, os métodos e os ensaios não compreendem uma etapa de amplificação de ácido nucleico, tal como PCR ou amplificação isotérmica mediada por laço (LAMP).

[0039] Em uma modalidades preferida, o termo "que detecta especificamente um anticorpo capturado", tal como usado no presente documento, significa que o anticorpo se liga especificamente ao meio para capturar especificamente o anticorpo, de preferência um polipeptí-deo que compreende a SEQ ID NO:1 ou a SED ID NO:2, de preferência a SEQ ID NO:1 ou uma variante da mesma ou um lisato somático de larvas de Toxocara canis, depois da captura, se liga especificamente ao meio para detectar o anticorpo, por exemplo, um anticorpo secundário. Em uma modalidade preferida, o termo "que captura especificamente um anticorpo", tal como usado no presente documento, significa que o meio para capturar especificamente um anticorpo se liga especificamente ao anticorpo e não se liga, a um nível significativo ou detectável, a qualquer outro anticorpo. Em uma modalidade preferida, o termo "se liga especificamente", tal como usado no presente documento, significa que a ligação é mais forte do que uma reação de ligação caracterizada por uma constante de dissociação de 1 x de 10-5 M, com mais preferência de 1 x 10 7 M, com maior preferência de 1 x 10-8 M, com mais preferência ainda de 1 x 10-9 M, com maior preferência ainda de 1 x 10-10 M, ainda com mais preferência de 1 x 1011 M, e com a máxima preferência de 1 x 10-12 M, tal como determinado pelo ressonância de plasmon de superfície ao usar o equipamento Biacore a 25°C no tampão de PBS a um pH 7.

[0040] Em uma modalidade preferida, o termo "detecção específica de um anticorpo", cujo anticorpo pertence a uma certa classe de anticorpos, por exemplo, anticorpos das classes IgA, IgM ou IgG, significa que o dito anticorpo é detectado em um ensaio espacialmente separado de qualquer reação de ligação que envolve a detecção de anticorpos ao mesmo antígeno associado com uma outra classe e, com mais preferência, nenhum anticorpo de outra classe contra o mesmo antígeno é detectado na mesma reação, por exemplo, um poço de ELISA. Em outras palavras, o ensaio é realizado de tal modo que a leitura permite distinguir entre as classes de anticorpos, por exemplo, anticorpos IgG ou IgM, de outras classes de anticorpos, e concluir e detectar especificamente a qual classe de anticorpo pertence o anticorpo detectado, ou detectar apenas uma classe específica de anticorpos para um antígeno de interesse, de preferência os anticorpos IgM para a SEQ ID NO:1 ou o lisato somático de larvas de Toxocara canis, ou os anticorpos IgG para a SEQ ID NO:1 ou o lisato somático de larvas de Toxocara canis. Isto não determina que os anticorpos para o mesmo antígeno, porém associados com outra classe de anticorpos, podem ser detectados em uma reação espacialmente separada simultaneamente. Por exemplo, as reações de ligação que envolvem o mesmo antígeno, tal como a SEQ ID NO:1 ou a SEQ ID NO:2 ou uma variante da mesma, podem ser realizadas em poços separados de um paca de microtítulo de ELISA, mas podem ser desenvolvidas ao usar a ligação de anticorpos secundários a classes diferentes de anticorpos, por exemplo, IgM e IgG, respectivamente.

[0041] Em uma modalidade preferida, um anticorpo da classe IgG para um peptídeo que compreende a SEQ ID NO:1 e/ou um lisato somático de larvas de Toxocara canis é detectado.

[0042] De acordo com a presente invenção, um meio para detectar especificamente um anticorpo capturado é provido ou usado para praticar a presente invenção, opcionalmente como parte de um kit. Em uma modalidade preferida, o termo "um meio para detectar especificamente um anticorpo capturado", tal como usado no presente documento, refere-se a um reagente que se liga especificamente ao anticorpo capturado, de preferência à sua região constante, de maneira tal que o anticorpo capturado ou a ser capturado permanece capaz de se ligar a seu antígeno. A sequência da região constante depende do organismo do qual a amostra é tirada e analisada, e da classe do anticorpo. De preferência, o meio se liga aos anticorpos das classes IgA, IgM ou IgG humanos. Se um anticorpo para a SEQ ID NO:1 for detectado, é preferível que o anticorpo secundário reconheça a região constante dos anticorpos da classe IgG. Se um anticorpo para o lisato somático de larvas de Toxocara canis for detectado, é preferível que o anticorpo secundário reconheça a região constante dos anticorpos da classe IgG.

[0043] Em uma modalidade mais preferida, o meio para detectar especificamente um anticorpo capturado é selecionado do grupo que compreende um anticorpo secundário, um aptâmero e uma anticalina (Skerra, A. (2008). "Alternative binding proteins: anticalins - harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities". FEBS J. 275 (11): 2677-83) e é com mais preferência um anticorpo secundário. Um anticorpo secundário pode ser um anticorpo de mamífero, com mais preferência selecionado do grupo que compreende um anticorpo de vaca, cabra, galinha, rato, murino, suíno, equino ou coelho. O meio pode compreender uma etiqueta de-tectável, de preferência do grupo que compreende uma etiqueta colorida, enzimaticamente ativa, de preferência do grupo que compreende uma etiqueta de ouro e de látex, uma etiqueta quimioluminescente e fluorescente.

[0044] Se um polipeptídeo for usado como o meio para capturar especificamente um anticorpo, o dito polipeptídeo, de preferência que compreende uma ou mais sequências selecionas do grupo que compreende a SEQ ID NO:1 e/ou um lisato somático de larvas de Toxocara canis, quando usado para a prática dos ensinamentos da presente invenção, pode ser provido em qualquer forma e a qualquer grau de purificação, de tecidos ou células que compreendem dito polipeptídeo em uma forma endógena, com mais preferência células que superex-pressam o polipeptídeo, lisatos crus ou enriquecidos de tais células, para o polipeptídeo purificado e/ou isolado que pode ser essencialmente puro. Em uma modalidade preferida, o termo "superexpressar", tal como usado no presente documento, significa que a célula, de preferência eucariótica, com mais preferência de mamífero ou inseto, com mais preferência ainda de um mamífero, com mais preferência uma célula humana, e com mais preferência ainda uma célula HEK293 ou HEK293T, foi projetada geneticamente de maneira tal que expressa mais da proteína de interesse do que o faria uma célula do tipo selvagem não projetada. Em uma modalidade preferida, o polipeptídeo é um polipeptídeo nativo, em que o termo "polipeptídeo nativo", tal como usado no presente documento, refere-se a um polipeptídeo multiplicado que compreende pelo menos 15, 30, 50, 100 150, 200, 300 ou 350 aminoácidos, de preferência mais de 30 aminoácidos, com mais preferência a um polipeptídeo multiplicado purificado de tecidos ou células, com mais preferência de célula ou tecidos de mamífero, opcionalmente de tecidos ou células não recombinantes. Em outra modalidade preferida, o polipeptídeo é um peptídeo linear que tem pelo menos 7, com mais preferência pelo menos 10 resíduos de aminoácidos. Se um polipeptídeo nativo for usado, ele é de preferência enriquecido em comparação a seu estado natural. Um polipeptídeo recombinante pode compreender uma etiqueta no terminal C ou no terminal N para a purificação por afinidade, a imobilização ou a detecção, tal como uma etiqueta His, tal como exemplificado pela SEQ ID NO:2, ou uma etiqueta de estreptavidina, de preferência uma estreptavidina cuja etiqueta pode ser de preferência removida por meio de clivagem ao usar uma protease que reconhece um sítio de clivagem de protease em um ligante polipeptídico entre a etiqueta e o terminal N ou o terminal C, respectivamente, como parte da purificação ou do método. O polipeptídeo clivado pode ser subsequentemente unido a um veículo diagnosticamente útil para resultar no veículo diagnosticamente útil de acordo com a presente invenção. Em outra modalidade preferida, o meio para capturar especificamente um anticorpo é uma célula eucariótica, de preferência uma célula humana, infectada por Toxocara. Tal célula pode ser avaliada por meio de microscopia de fluorescência. As células podem ser transiente ou estavelmente transfectadas, de preferência transientemente transfectadas, de preferência com um vetor que compreende uma sequência que codifica a SEQ ID NO:1 ou a SEQ ID NO:2, de preferência a SEQ ID NO:1, sob o controle de um promotor induzível ou constantemente induzido.

[0045] O dito meio para capturar especificamente um anticorpo, junto com o veículo insolúvel ao qual ele é unido, pode ser separado de uma amostra de um indivíduo de uma maneira direta, por exemplo, por meio de filtração, centrifugação, magnetismo ou decantação. O dito meio pode ser imobilizado de uma maneira reversível ou irreversível. Por exemplo, a imobilização é reversível se o meio interagir com o veículo através de interações iônicas que podem ser mascaradas pela adição de uma elevada concentração de sal ou se a molécula for ligada através de uma ligação covalente clivável ou uma ligação não cova-lente. Por outro lado, a imobilização é irreversível se o meio for ligado ao veículo através de uma ligação covalente que não pode ser clivada em solução aquosa. O meio pode ser imobilizado indiretamente, por exemplo, ao imobilizar um anticorpo ou uma outra entidade que tem a afinidade com o polipeptídeo, seguida pela adição do meio e a formação de um complexo do maio-anticorpo. Uma ligação não covalente pode ser feita al ligar quimicamente um ligando ao veículo, de preferência através de uma ligação covalente, e ao fundir ao meio um polipeptídeo que tem afinidade com o ligando. Em uma modalidade preferida, o ligando é selecionado do grupo que compreende a biotina, em cujo caso o polipeptídeo que tem afinidade pode ser a estreptavidina ou uma variante da mesma que se liga à biotina, glutationa (polipeptídeo que tem afinidade: glutationa-S-transferase), níquel (polipeptídeo que tem afinidade: etiqueta His), etiqueta de sinalizador (polipeptídeo que tem afinidade: anticorpo antissinalizador), carboidrato, tal como a maltose ou a celulose (polipeptídeo que tem afinidade: proteína de ligação de maltose ou celulose), e é de preferência a biotina.

[0046] De acordo com a presente invenção, é provido um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de acordo com a presente invenção tal como um polipeptídeo que compreende a SEQ ID NO:1 ou a SEQ ID NO:2, ID de preferência a SEQ NO:1 ou uma variante da mesma, opcionalmente com um promotor induzível, cujo polipeptídeo é de preferência para o uso para o diagnóstico de uma doença ou a fabricação de um kit ou reagente para tal uso. O dito ácido nucleico pode fazer parte de um vetor, de preferência para expressar o dito ácido nucleico. Uma célula eucariótica ou procariótica, de preferência uma célula eucariótica que compreende este vetor e que expressa de preferência o polipeptídeo codificado pelo vetor, também é provida. O ácido nucleico, o vetor e a célula podem ser usados para a fabricação de um kit para o uso de acordo com a presente invenção, tal como o uso de um anticorpo para a SEQ ID NO:1 ou a SEQ ID NO:2, de preferência SEQ ID NO:1. O ácido nucleico pode ser expresso, o polipeptídeo codificado purificado e usado, de preferência imobilizado em um veículo diagnosticamente útil, a fim de obter o veículo diagnosticamente útil de acordo com a presente invenção. O ácido nucleico pode ser usado para projetar e preparar um construto de ácido nucleico que codifica uma variante do polipeptídeo para a expressão e o uso da variante resultante para a preparação de um veículo diagnosticamente útil e para a detecção do respectivo anticorpo, tal como o anticorpo para a SEQ ID NO:1 ou a SEQ ID NO:2, de preferência a SEQ ID NO:1.

[0047] Os ensinamentos da invenção proveem um kit, de preferência para diagnosticar uma infecção, com mais preferência para diagnosticar uma infecção por nematódeo, e com mais preferência ainda uma infecção por Toxocara. Tal kit é um recipiente que compreende reagentes específicos requeridos para a prática do método da invenção, em particular o veículo diagnosticamente útil de acordo com a presente invenção, opcionalmente além de um ou mais reagentes e soluções requeridos para praticar o método da invenção, de preferência selecionados de ou todos do grupo que compreende o tampão de diluição de amostra, o tampão de lavagem e o meio para detectar qualquer anticorpo especificamente capturado, e opcionalmente um meio para detectar o anticorpo especificamente capturado, o qual pode ser opcionalmente unido ao anticorpo secundário, por exemplo, uma etiqueta fluorescente, enzimaticamente ativa, radioativa, quimiolumi-nescente, de preferência eletroquimioluminescente, ou uma etiqueta de spin. O kit pode compreender uma solução química para realizar uma reação de detecção, tal como a 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina, o fosfato de p-nitrofenila, o ácido 2,2'-azinobis [3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico ou o dicloridreto de o-fenilenediamina, para uma reação colo-rimétrica, e a tripropilamina para uma reação de eletroquimiolumines-cência. Além disso, pode compreender instruções que detalham como usar o kit e o veículo diagnosticamente útil da invenção para contactar o polipeptídeo da invenção com uma amostra de fluido corporal de um indivíduo, de preferência um indivíduo humano. O kit pode compreender um soro de controle negativo e/ou positivo, com mais preferência ambos.

[0048] Além disso, o kit pode compreender um controle positivo, por exemplo, um anticorpo recombinante que é conhecido por se ligar à SEQ ID NO:1 e/ou um anticorpo recombinante que é conhecido por se ligar ao lisato somático de larvas de Toxocara canis, e um controle negativo, por exemplo, uma proteína que não tem nenhuma afinidade detectável com a SEQ ID NO:1 ou o lisato somático de larvas de Toxocara canis. Finalmente, o kit pode compreender um ou mais calibradores, que consistem de preferência em uma solução que compreende uma ligação da SEQ ID NO:1 e/ou uma sequência do lisato somático das larvas de Toxocara canis, de preferência um anticorpo de ligação da SEQ ID N0:1 para preparar uma curva de calibração. Em uma modalidade mais preferida, o kit compreende mais de um, de preferência três ou mais calibradores que compreendem concentrações diferentes de um anticorpo para a SEQ ID NO:1, cujo anticorpo é de preferência reconhecido por um anticorpo secundário aos anticorpos da classe IgG humanos. Em uma modalidade mais preferida, o kit compreende pelo menos um anticorpo para o lisato somático das larvas de Toxocara canis, cujo anticorpo é de preferência reconhecido por um anticorpo secundário aos anticorpos da classe de IgG humanos. Tal calibrador pode ser ou compreende um anticorpo quimérico que compreende uma região constante humana e opcionalmente uma região variável de um mamífero, que não um ser humano. Se mais de um calibrador for usado, os dois ou mais calibradores compreendem concentrações diferentes do anticorpo, de preferência a uma faixa de concentrações que permite que o usuário ajuste uma curva de calibração.

[0049] Se os anticorpos da classe IgM que se ligam à SEQ ID NO:1 ou ao lisato somático de larvas de Toxocara canis, de preferência à SEQ ID NO:1 forem detectados, os anticorpos das classes IgM e IgA podem ser removidos ou a sua concentração pode ser diminuída antes de determinar os anticorpos da classe IgG. Isto pode ser obtido ao pré-absorver os anticorpos das classes IgM e IgA, por exemplo, ao colocar os mesmos em contato com um anticorpo anti-lgM ou anti-IgA, por exemplo, um anticorpo IgM ou IgA de mamífero, de preferência anti-humano cabra. Este anticorpo pode absorver os anticorpos que podem interferir no ensaio de detecção de IgG. Os reagentes apropriados são comercialmente disponíveis, por exemplo, EUROSORB, commercializado pela EUROIMMUN, Lubeck. Alternativamente, isto pode ser obtido ao isolar a totalidade do anticorpo da classe IgG antes de detectar um anticorpo IgG para a SEQ ID NO:1 ou a SEQ ID NO:2, de preferência a SEQ ID NO:1.

[0050] Para finalidades terapêuticas, pode ser provida uma vacina que compreende o polipeptídeo que compreende a SEQ ID NO:1 e/ou o lisato somático das larvas de Toxocara canis ou as suas variantes, que podem ser formuladas com um ou mais diluentes, um ou mais gli-dantes e/ou um ou mais agentes de carga. A preparação das formulações apropriadas é descrita no estado da técnica, por exemplo, no documento de Patente US20130022631A1. A formulação da vacina pode compreender, além do polipeptídeo purificado, um tampão farmaceuticamente aceito, tal como o tampão de fosfato ou de fosfato-citrato na faixa de pH de 6,4 a 7,5 com agentes estabilizantes adicionados que podem incluir um ou mais dos seguintes, mas sem ficar a eles limitados: albumina de soro humano, gelatina, açúcares redutores e não redutores, aminoácidos, polióis tais como o sorbitol e o manitol, sais orgânicos e inorgânicos de glicerol, polivinil pirrolidona etc. A formulação estável pode estar em uma forma líquida e é apropriada para a administração intramuscular/intradermal/subcutânea/intravenosa em um hospedeiro humano. A formulação estável pode estar em uma forma liofilizada seca e pode se reconstituída com um solvente apropriado a ntes da administração. As formulações podem ser apropriadas para a administração oral e intranasal nos seres humanos.

[0051] A invenção provê uma composição farmacêutica ou uma vacina, cuja composição ou composição imunogênica, tal como uma vacina, compreende um polipeptídeo que compreende a SEQ ID NO:1 e/ou o lisato somático de larvas de Toxocara canis ou as suas variantes. Uma composição imunogênica ou vacina podem compreender componentes para inativar um nematódeo ou bactérias e estabilizar a vacina, ajudando a preservar a vacina e impedindo que ela perca a sua potência com o passar do tempo. Adjuvantes são adicionados às vacinas para estimular a produção de anticorpos contra a vacina para torná-la mais eficaz. Um adjuvante pode ser orgânico ou inorgânico. Os adjuvantes inorgânicos mais comuns para as vacinas humanas incluem o fosfato de alumínio e o hidróxido de alumínio. Os adjuvantes orgânicos podem ser baseados no composto orgânico esqualeno e um adjuvante de óleo em água [esqualeno] pode ser usado.

[0052] Uma composição imunogênica pode compreender estabili-zantes que ajudam a vacina a manter a sua eficácia durante a armazenagem, por exemplo, MgCI2, MgS04, lactose-sorbitol, ou sorbitol-gelatina, e conservantes para impedir o crescimento bacteriano e fúngico, por exemplo, tiomersal, formaldeído ou derivados de fenol, antibióticos. A composição é de preferência apropriada para a administração a um indivíduo, de preferência um indivíduo mamífero, com mais preferência um ser humano. Tal composição farmacêutica pode compreender um veículo farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode, por exemplo, ser administrada oralmente, parente-ralmente, por spray de inalação, topicamente, por colírios, retalmente, nasalmente, bucalmente, vaginalmente ou através de um reservatório implantado, em que o termo "parenteralmente", tal como usado no presente documento, compreende a injeção subcutânea, intracutânea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intrasinovial, instraesternal, intratecal, intralesional e intracranial ou técnicas de infusão. A composição farmacêutica pode ser provida em formas de dosagens apropriadas, por exemplo, cápsulas, comprimidos e suspensões e soluções aquosas, de preferência na forma estéril. Ela pode ser usada em um método de tratamento de uma doença, cujo método compreende a administração de uma quantidade eficaz do polipeptídeo da invenção a um indivíduo.

[0053] O método da invenção para diagnosticar uma infecção por nematódeo, de preferência para distinguir uma infecção por Toxocara de uma infecção por Echinococcus, Strongyloides e Ascaris, pode compreender a etapa de detecçãio em uma primeira amostra de um indivíduo de um anticorpo da classe IgG para a SEQ ID NO:1 e de um lisato somático de larvas de Toxocara canis, e opcionalmente também compreender a detecção, na dita primeira amostra, de um anticorpo da classe IgM e/ou IgA à SEQ ID NO:1 e um lisato somático de larvas de Toxocara canis.

[0054] O método, o kit e os veículos da invenção podem ser usados para detectar uma infecção por nematódeo. Em uma modalidade preferida, o termo "infecção por nematódeo", tal como usado no presente documento, refere-se a uma infecção de uma pessoa que sofre de uma infecção por Toxocara, com mais preferência de uma infecção por Toxocara canis.

[0055] Nas modalidades preferidas, os termos "detecção em uma amostra" e/ou "determinação em uma amostra", tal como usados no presente documento, referem-se à medição qualitativa ou quantitativa de um composto ou uma molécula na dita amostra. Em muitos casos, a detecção ou a detecção da presença de um anticorpo, que significa opcionalmente a determinação se a concentração do anticorpo está além de um determinado limite, de preferência tal como ajustado pela medição ao usar ELISA, de preferência tal como descrito nos exemplos, no limite de detecção implícito por este método, frequentemente sugerido pelo limite de detecção, na amostra, é suficiente para o diagnóstico. Se o anticorpo puder ser detectado, esta vai ser uma informação instrumental para o diagnóstico de um clínico e indica uma maior probabilidade de que o paciente sofre de uma doença. Em uma modalidade preferida, a concentração relativa do anticorpo no soro, comparada ao nível que pode ser encontrado no indivíduo saudável médio, pode ser determinada. Em uma modalidade preferida, o termo "detectar a presença", tal como usado no presente documento, significa que é suficiente para verificar se um sinal suficientemente além de qualquer nível base pode ser detectado ao usar um método de detecção complexo apropriado que indica que o anticorpo de interesse está presente ou se mais anticorpos de interesse estão presentes do que no caso de um indivíduo saudável. Em uma modalidade mais preferida, isto pode envolver a determinação se a concentração é pelo menos 0,1, de preferência 0,2, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 25, 50, 100, 200, 500, 1.000, 10.000 ou 100.000 vezes maior do que a concentração do anticorpo de interesse encontrada no indivíduo saudável médio.

[0056] Em uma modalidades preferida, o termo "diagnóstico", tal como usado no presente documento, refere-se a qualquer tipo de procedimento que visa obter uma informação instrumental ao avaliar se um paciente sofre ou provavelmente ou mais provavelmente do que um indivíduo médio ou um indivíduo comparativo, em que este último tem, de preferência, sintomas similares, sofreu de uma certa doença ou distúrbio no passado, no momento do diagnóstico ou no futuro, para verificar como a doença está progredindo ou vai provavelmente progredir no futuro, ou avaliar a resposta de um paciente no que diz respeito a um determinado tratamento, por exemplo, a administração de fármacos apropriados, tais como fármacos para a dessensibilização de pacientes alérgicos. Em outras palavras, o termo "diagnóstico" compreende não somente o diagnóstico, mas também o prognóstico e/ou monitoramento do curso de uma doença ou distúrbio.

[0057] Portanto, o termo "diagnóstico" de preferência não implica que os métodos ou agentes de diagnóstico de acordo com a presente invenção serão definitivos e suficientes para finalizar o diagnóstico com base em um único teste, quanto menos um parâmetro, mas pode se referir a uma contribuição para o que é indicado como um "diagnóstico diferencial", isto é, um procedimento de diagnóstico sistemático que considera a probabilidade de uma gama de condições possíveis com base em uma faixa de parâmetros de diagnóstico. O termo "diagnóstico" também pode se referir a um método ou a um agente usado para selecionar o regime de tratamento mais promissor para um paciente. Em outras palavras, o método ou o agente podem estar relacionados à seleção de um regime de tratamento para um indivíduo.

[0058] A invenção pode ser usada para prover um diagnóstico ou um prognóstico se um indivíduo sofre de larva migrans visceral (VLM), larva migrans ocular (OLM), a doença de Weingarten, a síndrome de Frimodt-Moller ou a pseudoleucemia eosinofílica, a oftalmite nematoi-de, a doença de toxocara, a toxocarose ou a toxocaríase oculta.

[0059] Uma "infecção por Toxocara", tal como usada no presente documento, refere-se à infecção de um indivíduo por Toxocara canis, Toxocara cati, Toxocara mystax ou Toxascaris leonine.

[0060] O termo "amostra", tal como usado no presente documento, refere-se a um fluido (sangue, soro, urina, sêmen, CSF), célula intactas ou extratos das mesmas, ou amostras de tecidos. A amostra pode ser um espécime de citologia clínica (por exemplo, biopsia da mama de agulha fina ou espécime de citologia pulmonar) ou um espécime de tecido humano, por exemplo, tumores do estômago, do pulmão, da mama, do ovário, do pâncreas, da próstata ou do cérebro. O espécime do tecido pode ser fresco ou congelado. De preferência, a amostra é de sangue integral ou soro.

[0061] "Indivíduo" ou "paciente", tal como usado intercambiavel-mente no presente documento, refere-se a um ser humano ou um animal, de preferência um mamífero, com mais preferência um ser humano, Canidae, Rotendia ou Felidae e com maior preferência ainda um ser humano.

[0062] A presente invenção refere-se a um método que compreende a etapa de detecção em uma amostra de um indivíduo da presença ou ausência de um anticorpo a um polipeptídeo antigênico tal como um polipeptídeo que compreende uma SEQ ID NO:1 e um lisato somático de larvas de Toxocara canis. Este método compreende de preferência a imobilização do dito anticorpo seguida pela detecção específica do dito anticorpo, por exemplo, por meio das etapas de a) (opcionalmente) provisão de uma amostra de um indivíduo, b) colocação da amostra em contato com o veículo diagnosticamente útil de acordo com a presente invenção sob condições compatíveis com a formação de um complexo que compreende o veículo diagnosticamente útil e o anticorpo, mais especificamente o meio para capturar especificamente o anticorpo, c) o isolamento de qualquer dito complexo, por exemplo, mediante a remoção da amostra, d) opcionalmente a lavagem do dito complexo e e) opcionalmente a detecção do dito complexo. O método é de preferência um método in vitro. A detecção do complexo para o prognóstico, o diagnóstico, os métodos ou o kit de teste de acordo com a presente invenção compreende o uso de um método selecionado do grupo que compreende técnicas de imunodifusão, técnicas imunoele-troforáticas, imunoensaios com dispersão de luz, técnicas de aglutinação, imunoensaios etiquetados, tais como aqueles do grupo que compreende imunoensaio radioetiquetado, imunoensaios com enzimas tais como ensaios colorimétricos, quimioluminescência, de preferência a eletroquimioluminescência, imunoensaios e técnicas de imunofluores-cência. O elemento versado no estado da técnica é familiarizado com esses métodos, que também são descritos no estado de a técnica, por exemplo, em Zane, H. D. (2001): Immunology - Theoretical & Practical Concepts in Laboratory Medicine, W. B. Saunders Company, em particular no capítulo 14. O método também pode envolver o teste da avidez dos anticorpos para a SEQ ID NO:1 ou o lisato somático de larvas de Toxocara canis na amostra, de preferência dos anticorpos para a SEQ ID NO:1.

[0063] Em modalidades preferidas, as larvas de Toxocara canis estão no estágio larval L2. As larvas de Toxocara podem ser cultivadas e obtidas de acordo com Savigny [de Savigny (1975), J. Parasitol., 61 (1975), pp. 781-782], Resumidamente, os vermes fêmeas são coletados de filhotes de cachorro após a remoção de vermes com pipera-zina, uma droga anti-helmíntica que não mata os ovos, ou após a necropsia. Os vermes fêmeas são lavados com água da torneira e então dissecados. Os tratos genitais são submetidos a uma digestão artificial controlada em uma mistura de pepsina-HCI para remover os tecidos circunvizinhos. Os ovos coletados são distribuídos em tubos de vidro que são tampados com lã do algodão e contêm uma solução a 0,9% de NaCI suplementada com formalina a 1%. Os tubos são incubados a 37°C em um banho de água sob agitação por 2 a 3 semanas. Periodicamente, o nível de embrionação é avaliado pela inspeção microscópica. Quando a taxa é de cerca de 50%, os ovos são dissecados no moedor de Potter. Outras etapas requerem um ambiente esterile provido por uma bancada de fluxo laminar. A mistura resultante, que contém larvas vivas e mortas junto com fragmentos de casca de ovo, é diluída no meio RPMI 1640. As larvas viáveis são extraídas da mistura bruta ao usar um método similar à técnica de Baermann empregada para a recuperação de larvas de Strongyloides stercoralis das fezes. As larvas são distribuídas então em frascos lisos do tipo usado em vi-rologia para as culturas de células que são carregadas com o meio RPMI 1640 suplementado com glutamina. A concentração de larvas final é de cerca de 1.000 larvas/ml. Os vfrascos são incubados a 37°C em uma atmosfera de CO2 a 5%. Os termos "lisato somático", "lisato" e "extrato", tal como usados intercambiavelmente no presente documento, referem-se a uma solução ou suspensão aquosa que compreende proteínas e os fatores celulares produzidos pela lise de larvas de Toxocara canis. Tal lisato pode compreender macromoléculas, tais como DNA, RNA, proteínas, peptídeos, carboidratos, lipídeos e outros ainda, e/ou micromoléculas, tais como aminoácidos, açúcares, ácidos lipídicos e outros ainda, ou frações das células lisadas. Os fragmentos celulares presentes em tal lisato podem ser de estrutura lisa ou granular. De preferência, o dito meio aquoso é a água, solução de soro fisiológico, ou uma solução tampão.

[0064] O termo lisato, tal como usado no presente documento, também engloba os preparados ou as frações preparadas ou obtidas a partir dos lisatos acima mencionados. Essas frações podem ser obtidas pelos métodos conhecidos dos elementos versados na técnica, por exemplo, a cromatografia, incluindo, por exemplo, a cromatografia de afinidade, a cromatografia de troca iônica, a cromatografia de exclusão de tamanho, a cromatografia de fase reversa e a cromatografia com um outro material cromatográfico em métodos de coluna ou descontínuos, outros métodos de fracionamento, por exemplo, métodos de filtração, por exemplo, ultrafiltração, diálise, diálise e concentração com exclusão de tamanho na centrifugação, centrifugação em gradientes de densidade ou matrizes de etapas, precipitação, por exemplo, precipitações de afinidade, salinização ou dessalinização (precipitação de sulfato de amónio), precipitações alcoólicas ou outros produtos químicos de proteínas, métodos biológicos moleculares, bioquímicos, imunológicos, químicos ou físicos para separar os componentes acima dos lisatos. Em uma modalidade preferida essas frações que são mais imunogênicas do que outras são as preferidas. Os elementos versados na técnica podem escolher um método apropriado e determinar o seu potencial imunogênico ao consultar as explanações gerais acima e as explanações específicas nos exemplos no presente documento, e modificar ou alterar tais métodos de maneira apropriada, se for necessário.

[0065] O termo "combinado de modo conjunto", tal como usado no presente documento, refere-se a um veículo diagnosticamente útil que compreende pelo menos dois antígenos, ou seja, um peptídeo que compreende uma sequência indicada na SEQ ID NO:1 ou uma variante da mesma e um lisato somático de larvas de Toxocara canis. Em modalidades preferidas, os antígenos ficam localizados no veículo diagnosticamente útil de maneira tal que ambos os antígenos podem ser colocados em contato com a amostra idêntica ao mesmo tempo. Em modalidades preferidas ainda mais preferidas, o peptídeo que compreende uma sequência indicada na SEQ ID NO:1 ou uma variante da mesma e o lisato somático de larvas de Toxocara canis são misturados antes de serem unidos ao veículo diagnosticamente útil da invenção. Isto significa que se o veículo diagnosticamente útil for uma placa de microtítulo para realizar o ensaio ELISA, o peptídeo que compreende uma sequência indicada na SEQ ID NO:1 e os antígenos compreendidos no lisato somático de larvas de Toxocara canis podem ser co-localizados no mesmo poço. Se o veículo diagnosticamente útil for uma membrana, ambos os antígenos podem ser colocalizados para formar uma mancha, um ponto ou uma pista de proteína.

[0066] Em modalidades preferidas, os antígenos, ou seja, o peptídeo que compreende uma sequência indicada na SEQ ID NO:1 ou uma variante da mesma e o lisato somático de larvas de Toxocara canis, ficam em uma solução antes de serem unidos ao veículo diagnosticamente útil, ao passo que a dita solução tem uma concentração de antígeno de não mais do que 40,0 μg/ml, não mais do que 35,0 μg/ml, não mais do que 30,0 μg/ml, não mais do que 25,0 μg/ml, não mais do que 20,0 μg/ml, não mais do que 18,0 μg/ml, não mais do que 16,0 μg/ml, não mais do que 14,0 μg/ml, não mais do que 12,0 μg/ml, não mais do que 10,0 μg/ml, não mais do que 8,0 μg/ml, não mais do que 7.5 μg/ml, não mais do que 7,0 μg/ml, não mais do que 6,5 μg/ml, não mais do que 6,0 μg/ml, não mais do que 5,5 μg/ml, não mais do que 5,0 μg/ml, não mais do que 4,5 μg/ml, não mais do que 4,0 μg/ml, não mais do que 3,5 μg/ml, não mais do que 3,0 μg/ml, não mais do que 2,5 μg/ml ou não mais do que 2,0 μg/ml que compreendem um ou ambos os antígenos. Em outras modalidades preferidas, a densidade do antígeno (ou seja, o peptídeo que compreende uma sequência indicada na SEQ ID NO:1 ou uma variante da mesma e o lisato somático de larvas de Toxocara canis) para um ou ambos os antígenos na superfície do veículo diagnosticamente útil não é mais do que 2,0 μg, não mais do que 1,8 μg, não mais do que 1,6 μg, não mais do que 1,4 μg, não mais do que 1,2 μg, não mais do que 1,0 μg, não mais do que 0,9 μg, não mais do que 0,8 μg, não mais do que 0,7 μg, não mais do que 0,6 μg, não mais do que 0,5 μg, não mais do que 0,4 μg, não mais do que 0,3 μg, não mais do que 0,2 μg, não mais do que 0,1 μg ou não mais do que 0,05 por 0,32 cm2 que corresponde à área de um único poço de uma placa com 96 poços. Para outros veículos diagnosticamente úteis, tais como slides e membranas de borrão, as densidades idênticas dos antígenos podem ser usadas nas modalidades preferidas.

[0067] A presente invenção também é ilustrada pelos exemplos, sequências e figuras a seguir, dos quais podem ser tomadas características, modalidades, aspectos e vantagens adicionais da presente invenção. Todos os métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos no presente documento podem ser usados na prática ou nos testes da presente invenção, em que os métodos e materiais apropriados são descritos no presente documento. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes, e outras referências mencionadas no presente documento são incorporadas a título de referência em sua totalidade. Além disso, os materiais, os métodos e os exemplos são apenas ilustrativos e não se prestam a limitar, a menos que esteja especificado de alguma outra maneira.
SEQ ID NO:1 (Toxocara canis TES-30)
MIAAIVVLLCLHLSATNACATNNDCGIFQVCVNNVCVANNQGCNPPCVAPQVCVAPMCVAPPAATTTAAPGVTTTRPRACPPNWTPFNNNCYIASLPGRFLFNQASDWCTQTGSRVVWFDQSTVGNFGSELNFVNSFAVGRGVTRYWIGVNRQFGQWVFTNGSPVIFSNWRPSQPDGCCGSNVTCAFVNYANFLGQWDDAPCGSLFTTPQGFVCKRPL
SEQ ID NO:2 (N-terminal Etiquetado com His de Toxocara canis TES-30)
MSHHHHHHHHSMIAAIVVLLCLHLSATNACATNNDCGIFQVCVNNVCVANNQGCNPPCVAPQVCVAPMCVAPPPAATTTAAPGVTTTRPRACPPNWTPFNNNCYIASLPGRFLFNQASDWCTQTGSRWWFDQSTVGNFGSELNFVNSFAVGRGVTRYWIGVNRQFGQWVFTNGSPVIFSNWRPSQPDGCCGSNVTCAFVNYANFLGQWDDAPCGSLFTTPQGFVCKRPL
SEQ ID NO:3 (Toxocara canis TES-30 fragmento 52 a 102 aa)
VCVAPMCVAPPPAATTTAAPGVTTTRPRACPPNWTPFNNNCYIASLPGRFL
SEQ ID NO:4 (Toxocara canis TES-30 fragmento 172 a 207 aa)
RPSQPDGCCGSNVTCAFVNYANFLGQWDDAPCGSLF

[0068] A Figura 1 mostra os resultados de ensaios ELISA diferentes ao usar T canis TES-30, larvas de lisato somático de T canis antí-genos excretores-secretores de T canis (TES) e a combinação de TES-30 e do lisato somático de larvas para a detecção de anticorpos de ligação de Toxocara nas amostras dos pacientes que sofrem de uma infecção por Toxocara. Os resultados da detecção positiva significativa são mostrados estatisticamente em negrito. Os resultados vagos são sublinhados.

[0069] A Figura 2 mostra os resultados de ensaios ELISA diferentes ao usar T.canis TES-30, larvas de lisato somático de T canis, antí-genos excretores-secretores de T canis (TES) e a combinação de Tes-30 e do lisato somático das larvas para a detecção de anticorpos de ligação de Toxocara nas amostras de um grupo de controle saudável. Os resultados positivos significativos da detecção são mostrados estatística em bold(realce). Os resultados vagos são sublinhados.

[0070] A Figura 3 mostra os resultados para ensaios ELISA diferentes ao usar T. canis TES-30, larvas de lisato somático de T. canis, antígenos excretores-secretores de T. canis (TES) e a combinação de TES-30 e lisato somático das larvas para a detecção de anticorpos de ligação de Toxocara nas amostras dos pacientes de controle que sofrem de infecções por Echinococcus, Strongyloides ou Ascaris. Os resultados da detecção positiva significativa são mostrados estatisticamente em negrito. Os resultados vagos são sublinhados.

[0071] A Figura 4 mostra o resumo dos experimentos ELISA, (a) A sensibilidade derivada dos resultados de ensaios ELISA testados com as amostras dos pacientes que sofrem de uma infecção por Toxocara. (b) A especificidade derivada dos resultados de ensaios ELISA testados com as amostras do grupo de controle saudável, (c) A especificidade (parasitose) derivada dos resultados de ensaios ELISA testados com as amostras dos pacientes que sofrem das infecções por Echinococcus, Strongyloides ou Ascaris. (d) A contagem combinada incluindo os resultados de (a), (b) e (c).

Exemplos

[0072] Os experimentos a seguir foram realizados para avaliar antígenos diferentes de Toxocara em um ensaio ELISA indireto para a detecção de anticorpos específicos de IgG anti-Toxocara no soro ou no plasma humano. Os antígenos a seguir foram analisados para a) a sensibilidade, b) a especificidade para amostras de pacientes Toxocara negativos e c) a especificidade para as amostras positivas para outras parasitoses.

Descrição de antígenos de Toxocara spp. testados

[0073] Os antígenos a seguir foram analisados: 1) mTES-30 recombinante de Toxocara spp., 2) antígeno somático de larvas de Toxocara canis, 3) excretores-secretores (E/S) de larvas de Toxocara canis e 4) antígeno somático de T. canis combinado com mTES-30 recombinante.

Amostras: Painel 1 (painel da sensibilidade):

[0074] O painel da sensibilidade contém 16 amostras dos pacientes com infecção por Toxocara evidenciada. As amostras foram confirmadas serologicamente através de ELISA e/ou técnica de borrão (Figura 1).

Painel 2 (painel da especificidade):

[0075] O painel da especificidade contém 48 amostras que são originárias de indivíduos saudáveis (mulher grávida, crianças e doadores de sangue da Alemanha) (Figura 2).

Painel 3 (painel da especificidade):

[0076] O painel da especificidade contém 32 amostras dos pacientes com infecções por Ascaris, Echinococcus e Strongyloides. As amostras foram confirmadas serologicamente através de ELISA (Figura 3).

Experimentos: 1. Preparação de placas de microtítulo revestidas

[0077] Os antígenos a seguir foram usados:

- MTES-30 recombinante de Toxocara spp.
- Antígeno somático de larvas de Toxocara canis (lisato)
- Excretor-secretor (E/S) de larvas de Toxocara canis
- Antígeno somático de T canis (lisato) combinado com mTES-30 recombinante

[0078] Para o uso em ELISA de microtítulo, estes antígenos foram diluídos em um tampão de carbonato até as concentrações finais de:

- MTES-30 recombinante de Toxocara spp. 2,0 μg /ml
- Antígeno somático de larvas de Toxocara canis 0,5 μg /ml
- Excretor-secretor (E/S) de larvas de Toxocara canis 1,0 μg/ml
- Antígeno somático de T canis 0,5 μg/ml combinado com 2,0 μg/ml de mTES-30 recombinante

[0079] As placas de microtítulo de ELISA (NUNC, Roskilde, Dinamarca) foram revestidas com 100 μΙ de diluição de antígeno por poço.

2. Procedimento experimental

[0080] As amostras foram diluídas 1:101 no tampão da amostra de IgG, aplicadas às placas de microtítulo e incubadas tal como descrito para os Kits de Teste de ELISA EUROIMMUN (por exemplo, El 2311-9601 G). Em resumo: 60 minutos a 37°C; 3 etapas de lavagem ao usar o tampão da lavagem EUROIMMUN; adição de 100 μΙ do conjugato de IgG anti-humano etiquetado com peroxidase (cabra) por poço; incubação por 30 minutos a 37°C; 3 etapas de lavagem ao usar o tampão de lavagem EUROIMMUN; adição de 100 μΙ da solução de cromogê-nio/substrato (TMB/H2O2) por poço; incubação por 30 minutos à temperatura ambiente; adição de 100 μΙ de solução de parada (ácido sul-fúrico 0,5 M); medição da densidade óptica a 450 nm.

[0081] O painel 1 foi usado para a avaliação da sensibilidade dos respectivos antígenos para a detecção de anticorpos específicos de IgG anti-Toxocara. Os painéis 2 e 3 foram incubados para determinar a especificidade do sistema do teste.

3. Interpretação dos resultados 1. Sensibilidade de mTES-30 recombinante, antígeno somático de larvas de T. canis, antígeno E/S de T. canis, e a combinação de mTES-30 e antígeno somático das larvas

[0082] A comparação de mTES-30 recombinante de Toxocara spp., antígeno somático de larvas de Toxocara canis, excretor-secretor (E/S) de larvas de Toxocara canis e a combinação do antígeno somático de T canis com mTES-30 recombinante revelou sensibilidades tal como mostrado na Figura 4a.

[0083] O kit de amostra usado para a avaliação da sensibilidade deste teste consiste em amostras que são originários dos pacientes positivos para anticorpos de IgG anti-Toxocara. A combinação de mTES-30 recombinante com o antígeno somático de larvas de T canis sugere que é mais sensível para a detecção de anticorpos de IgG anti-Toxocara do que os antígenos sozinhos e revela uma sensibilidade comparável ao antígeno E/S de T canis comercialmente usado.

2. Especificidade de mTES-30 recombinante, antígeno somático de larvas de T. canis, antígeno E/S de T. canis e a combinação de mTES-30 e antígeno somático das larvas

[0084] A comparação de mTES-30 recombinante, do antígeno somático de larvas de T canis, do antígeno E/S de T canis e a combinação de mTES-30 e do antígeno somático das larvas revela a especificidade tal como mostrado na Figura 4b.

[0085] Os anticorpos anti-lgG medidos podem resultar de um contato anterior de Toxocara (predominância na Alemanha de 2 a 5%). mTES-30 recombinante, assim como o antígeno somático de larvas de T. canis, revela uma elevada especificidade. Neste estudo, a especificidade do antígeno E/S de T. canis resulta na mais baixa especificidade.

3. Especificidade versus outras parasitoses de mTES-30 recombinante, antígeno somático de larvas de T. canis, antígeno E/S de T. canis e combinação de mTES-30 e do antígeno somático das larvas

[0086] A comparação de mTES-30 recombinante, do antígeno somático de larvas de T. canis, do antígeno E/S de T. canis e a combinação de mTES-30 e do antígeno somático das larvas revelou a especificidade tal como mostrado na Figura 4c.

[0087] Os anticorpos anti-lgG medidos podem resultar de um contato anterior de Toxocara. mTES-30 recombinante, bem como o antígeno somático de larvas de T canis, revela uma elevada especificidade. Neste estudo, a especificidade do antígenoE/S de T canis resulta na mais baixa especificidade.

Conclusão

[0088] Os dados resultantes da combinação de mTES-30 recombinante e do antígeno somático de larvas de T. canis descrevem que esta combinação de antígenos permite o desenvolvimento de um sistema específico de teste comparado ao ensaio ELISA baseado no antígeno E/S a uma sensibilidade comparável (Figura 4d).

[0089] Todos os documentos citados no presente documento são incorporados no presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0090] As invenções descritas de maneira ilustrativa no presente documento podem ser apropriadamente praticadas na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limitações, não divulgados especificamente no presente documento. Desse modo, por exemplo, os termos "que compreende", "que inclui", "que contém", etc., serão lidos de maneira expansiva e sem limitação. Além disso, os termos e as expressões empregados no presente documento foram usados como termos de descrição e não de limitação, e não há nenhuma intenção no uso de tais termos e expressões de excluir quaisquer equivalentes das características mostradas e descritas ou porções das mesmas, mas é reconhecido que várias modificações são possíveis dentro do âmbito da invenção reivindicada. Desse modo, deve ser compreendido que, embora a presente invenção seja divulgada especificamente por modalidades e por características opcionais preferidas, as modificações e as variações das invenções englobadas divulgadas no presente documento podem ser recorridas pelos elementos versados na técnica, e tais modificações e variações são consideradas como enquadradas dentro do âmbito da presente invenção. A invenção foi descrita ampla e genericamente no presente documento. Cada um dentre as espécies mais estreitas e os agrupamentos subgenéricos que se enquadram dentro da descrição genérica também faz parte da invenção. Isto inclui a descrição genérica da invenção com uma condição ou limitação negativa que remove qualquer objeto do gênero, independente do fato se o material excisado é ou não recitado especificamente no presente documento. Além disso, onde as características ou os aspectos da invenção são descritos em termos de grupos de Markush, os elementos versados na técnica irão reconhecer que a invenção também está descrita desse modo em termos de qualquer membro individual ou subgrupo de membros do grupo de Markush. Outras modalidades da invenção irão tornar-se aparentes a partir das reivindicações a seguir.

Claims

Veículo diagnosticamente útil, caracterizado pelo fato de que compreende:
- a) um peptídeo que compreende a sequência de aminoá-cidos indicada na SEQ ID NO:1 ou uma variante da mesma, e
- b) um lisato somático de larvas de Toxocara canis.
Veículo diagnosticamente útil de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o peptídeo e o lisato são combinados em conjunto.
Veículo diagnosticamente útil de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o veículo é selecionado do grupo que compreende um slide de vidro, um biochip, uma placa de microtítulo, um dispositivo de fluxo lateral, uma tira de teste, uma membrana, um borrão de linha, uma coluna de cromatografia e um grânulo.
Kit, caracterizado pelo fato de que compreende o veículo diagnosticamente útil como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e um anticorpo etiquetado para detectar um anticorpo humano, de Canidae ou de Rodentia.
Método para diagnosticar a infecção por Toxocara, caracterizado pelo fato de que compreende a detecção em uma amostra de um paciente da presença de um anticorpo à SEQ ID NO:1 e/ou um anticorpo a um lisato somático de larvas de Toxocara canis.
Composição, caracterizada pelo fato de que compreende:
- a) um peptídeo que compreende a sequência de aminoá-cidos indicada na SEQ ID NO:1 ou uma variante da mesma, e
- b) um lisato somático de larvas de Toxocara canis.
Composição de acordo com a reivindicação 6 ou veículo diagnosticamente útil de acordo qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizados pelo fato de servem para o uso no diagnóstico de uma infecção por Toxocara.
Método para determinar a presença de um anticorpo contra uma proteína de Toxocara canis de acordo com a SEQ ID NO:1 e/ou um anticorpo contra uma proteína de um lisato somático de larvas de Toxocara canis, caracterizado pelo fato de que compreende:
- i) a colocação de uma amostra isolada de um indivíduo que tem uma infecção por Toxocara em contato com um polipeptídeo que compreende a SEQ ID NO:1 e/ou uma variante da mesma e com um lisato somático de larvas de Toxocara canis, em que o polipeptídeo e/ou o lisato se ligam especificamente aos anticorpos que se ligam à SEQ ID NO:1 ou ao lisato somático; e
- ii) a determinação da presença de um anticorpo contra a SEQ ID NO:1 e/ou um anticorpo contra o lisato somático.
Uso de uma proteína de Toxocara canis de acordo com a SEQ ID NO:1 e um lisato somático de larvas de Toxocara canis, caracterizado pelo fato de que serve para a manufatura de um kit para detectar a infecção por Toxocara que compreende
- a) um peptídeo que compreende a sequência de aminoá-cidos indicada na SEQ ID NO:1 ou uma variante da mesma, e
- b) um lisato somático de larvas de Toxocara canis.
Método de acordo com a reivindicação 5, composição ou veículo para uso de acordo com a reivindicação 7, método de acordo com a reivindicação 8 ou uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizados pelo fato de que a infecção por Toxocara é uma infecção por Toxocara canis.
Método de acordo com a reivindicação 5 ou 8, caracterizado pelo fato de que a amostra é de sangue, soro, plasma, urina ou saliva.
Método de acordo com a reivindicação 5, composição ou veículo para o uso de acordo com a reivindicação 7 ou uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizados pelo fato de que a infecção por Toxocara pode ser distinta de uma infecção por Echinococcus, Strongyloides e Ascaris.
Método de acordo com a reivindicação 8 ou uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizados pelo fato de que o peptí-deo e o lisato são combinados em conjunto.
Método de acordo com a reivindicação 5 ou método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo contra a SEQ ID NO:1 e/ou o anticorpo contra o lisato somático são selecionados do grupo que compreende anticorpos das classes IgG, IgA e IgM.
Método de acordo com a reivindicação 5, método de acordo com a reivindicação 8 ou uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizados pelo fato de que a detecção ou a determinação compreende um ensaio de borrão, um imunoensaio de quimioluminiscên-cia, um imunoensaio de dispersão de luz, um imunoensaio radiorotula-do ou um ensaio de imunofluorescência.