ES2764080T3 - Deshidrogenasa y toxina de Clostridium difficile como un biomarcador - Google Patents

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Abstract

Un método para medir una cantidad de C. difficile en una muestra fecal, el método que comprende: medir cuantitativamente un nivel de lactoferrina, de la glutamato deshidrogenasa (GDH) de C. difficile y de la toxina A de C. difficile o de la toxina B de C. difficile en una muestra fecal diluida de un paciente infectado con C. difficile, en donde un nivel de lactoferrina <7,25 μg/ml, de GDH de C. difficile <1000 ng/g y una ausencia de toxina indica el estado de portador, y en donde un nivel de lactoferrina > 7,25 μg/ml, de GDH de C. difficile > 1000 ng/g, y de toxina se identifica y de esta manera determina que el paciente tiene actividad en la enfermedad por C. difficile.

Description

DESCRIPCIÓN
Deshidrogenasa y toxina de Clostridium difficile como un biomarcador
Antecedentes de la invención
La infección por Clostridium difficile (CDI) involucra una variedad de presentaciones clínicas que incluyen desde diarrea leve a autolimitante, hasta colitis pseudomembranosa y megacolon potencialmente mortales. Muchas personas sanas (por ejemplo, los bebés) portan Clostridium difficile (C. difficile), y muchos pacientes se convierten en portadores asintomáticos después del ingreso al hospital. La mayoría de los casos se diagnostican en base a evaluaciones clínicas, antecedentes de uso de antibióticos y la presencia del organismo y/o las toxinas A y B (es decir, TcdA y TcdB, respectivamente) en las deposiciones. Las pruebas inmunoenzimáticas (EIA) son el formato de prueba más frecuentemente usado para medir la toxina en las muestras de deposiciones, y el cultivo de tejidos combinado con la neutralización específica es el estándar de oro para detectar la toxina de las deposiciones. Más recientemente, las pruebas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) están disponibles para determinar la presencia de los genes de las toxinas A y B (tcdA y tcdB) del C. difficile y estas se usan como pruebas independientes y en combinación con la detección de la glutamato deshidrogenasa (GDH) para descartar pacientes con C. difficile negativo. Todos estos ensayos son adecuados para detectar la presencia de C. difficile como ayuda para el diagnóstico, pero no proporcionan información sobre la gravedad de la enfermedad ni confirma que el C. difficile en realidad es responsable de los síntomas en pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal (EII), síndrome del intestino irritable (SlI), otras infecciones entéricas y agentes causantes de diarrea como laxantes y antibióticos.
La presencia y la gravedad de la enfermedad es un factor importante para recomendar un curso de tratamiento adecuado. En general, los pacientes con la enfermedad por C. difficile a menudo presentan fiebre, tienen los glóbulos blancos ligeramente elevados (leucocitosis) y experimentan dolor abdominal leve. El estado de portador incluye aquellos pacientes que están colonizados con C. difficile pero carecen de toxina en las deposiciones e inflamación intestinal que indica que algo más está causando los síntomas. Los pacientes que se determina que son portadores aún pueden ser ubicados en salas de aislamiento, pero no recibirán tratamiento para la CDI. Determinar el estado de portador es importante al decidir un curso de tratamiento, ya que los antibióticos podrían alterar la flora normal y hacer que el paciente sea susceptible a la enfermedad por C. difficile. Además, un bajo nivel de células como lo indican los bajos niveles de GDH de C. difficile puede diferenciar aún más entre pacientes que son infecciosos versus no infecciosos y, por lo tanto, permite el alta de las salas de aislamiento.
Oppenheimer y otros (informe de la conferencia Scientific Symposium on New Approaches to Clostridium difficile Testing del Simposio Satélite celebrado durante la Semana de la Gastroenterología en la Unión Europea (UEGW) de 2010, 23 de octubre de 2010) y Langhorst y otros (Gastroenterology, 138 (5) S-197, resumen S1178) describen el uso de la GDH y las toxinas A/B para identificar la enfermedad por C. difficile y la lactoferrina para investigar la inflamación intestinal.
Para los pacientes con la enfermedad, los casos leves responden bien a la suspensión del antibiótico incitante mientras que los casos de enfermedad por C. difficile moderada a grave a menudo requieren intervención antibiótica. Actualmente, ningún parámetro de laboratorio único se usa habitualmente para estratificar a los pacientes según la gravedad de la enfermedad asociada a C. difficile (CDAD) para optimizar el tratamiento médico y/o quirúrgico. La tasa de recaída es de aproximadamente el 20 % de los pacientes que ocurre dentro de días a un mes después del final del tratamiento con antibióticos.
Breve descripción de las distintas vistas de los dibujos
Los aspectos de la descripción se describen en detalle a continuación con referencia a las figuras de dibujos adjuntas, en las que:
La Figura 1A representa las características de los pacientes diagnosticados con la enfermedad por C. difficile;
La Figura 1B representa los niveles medios de lactoferrina (pg/mL ± error estándar) para los pacientes con casos clínicamente definidos de la enfermedad por C. difficile estratificada según la gravedad;
La Figura 2 representa los niveles medios de lactoferrina (pg/mL ± error estándar) para los pacientes estratificados por ARL 027 versus otro ribotipo de las infecciones por C. difficile;
La Figura 3 representa la monitorización diaria de los niveles de lactoferrina durante y después del tratamiento con antibióticos en un paciente con la enfermedad por C. difficile;
La Figura 4A muestra un resumen de los resultados de biomarcadores para pacientes con curación clínica (sin síntomas y sin C. difficile durante y/o después del tratamiento inicial);
La Figura 4B representa un resumen de los resultados de biomarcadores para pacientes con reinfección bacteriana (retorno de C. difficile en ausencia de síntomas durante y/o después del tratamiento inicial);
La Figura 4C representa un resumen de los resultados de biomarcadores para pacientes con recurrencia clínica o sin cura (retorno de síntomas y C. diffiále durante y/o después del tratamiento inicial);
La Figura 5 representa una curva estándar generada por una prueba cuantitativa ELISA para la GDH usando el antígeno GDH de C. difficile purificado;
La Figura 6 representa una curva estándar generada por una prueba cuantitativa ELISA para lactoferrina usando el antígeno de lactoferrina purificado;
La Figura 7 representa un resumen de la monitorización de un paciente curado de C. diffiále usando el tratamiento antibiótico Dificid con biomarcadores de la enfermedad por C. diffiále que incluyen el promedio de la GDH (ng/ml), la toxina (densidad óptica por ELISA ABII) y niveles de lactoferrina (pg/ml);
La Figura 8 representa un resumen de la monitorización de un paciente con infección continua de C. diffiále durante el tratamiento antibiótico con rifaximina usando biomarcadores de la enfermedad por C. diffiále que incluyen el promedio de la GDH (ng/ml), la toxina (densidad óptica por ELISA ABII) y niveles de lactoferrina (pg/ml); y
La Figura 9 representa la utilización de un panel de biomarcadores de diagnóstico que incluye GDH cuantitativa, lactoferrina cuantitativa y la toxina en las deposiciones como ayuda para diferenciar a los pacientes con la enfermedad por C. difficile de aquellos con estado de portador.
Descripción detallada de la invención
La presente invención está dirigida a los métodos de prueba para ayudar a estratificar a los pacientes según la gravedad de la enfermedad por C. difficile. Estratificar a los pacientes con la enfermedad según la gravedad usando un panel de biomarcadores es un concepto nuevo que es críticamente necesario debido al aumento de la incidencia y las frecuentes presentaciones graves y el uso excesivo de antibióticos. La aparición de la cepa del brote ribotipo ARL 027 que produce más toxinas y esporas se ha relacionado con la enfermedad por C. difficile más grave y una mayor probabilidad de recaída. Además, los medicamentos más nuevos como el antibiótico fidaxomicina (Dificid) ofrecen opciones de tratamiento adicionales para la enfermedad por C. difficile. En un estudio publicado por L. Kyne y otros 1999, los autores realizaron una caracterización detallada de los estados de la enfermedad para un brote de CDAd en Dublín, Irlanda. Este brote en particular involucró a 14 pacientes que eran positivos para las citotoxinas en las deposiciones pero eran asintomáticos. De los pacientes sintomáticos, el 25 % tenía la enfermedad leve autolimitante sin tratamiento con antibióticos, el 35 % tenía la enfermedad por C. difficile moderadamente grave que responde al tratamiento con antibióticos y el 40 % desarrolló la enfermedad grave con síntomas prolongados que duran entre once y treinta y seis días. Un total de 8 % de los pacientes con la enfermedad por C. difficile progresó a colitis grave con pseudomembranas y megacolon tóxico. Los autores señalaron que los médicos deben conocer los indicadores tempranos de la gravedad de la enfermedad para reducir la morbilidad y la mortalidad en los casos de la enfermedad por C. difficile.
Se ha evaluado una combinación de presentaciones clínicas y varios parámetros de laboratorio para estratificar a los pacientes según la actividad de la enfermedad (por ejemplo, leve, moderado y moderado a grave). El conteo de glóbulos blancos (WBC), el nivel de albúmina sérica (indicador de filtración al intestino) y el nivel de creatinina para la monitorización del fallo renal son los indicadores de laboratorio más usados para la actividad de la enfermedad por C. difficile. Los casos leves a moderados de C. difficile generalmente se presentan con un WBC < 15,000 /pL, creatinina sérica normal (<2,0 mg/dL) y niveles de albúmina (> 2,5 g/dL). Los síntomas incluyen tener menos de 10 deposiciones acuosas sin sangre por día y calambres leves que duran hasta un promedio de 4 días. Un tratamiento común para los pacientes con un episodio inicial de leve a moderado de la enfermedad por C. difficile es el tratamiento con un miembro de la clase de antibióticos nitroimidazol. Por ejemplo, la enfermedad leve a moderada por C. difficile puede tratarse con 500 mg de metronidazol, tres veces al día durante diez días. La mayoría de los casos se resuelven sin más complicaciones, pero hasta el 25 % de estos casos pueden recaer varias veces y requerir una segunda ronda de antibióticos, que históricamente ha incluido el tratamiento con un miembro de la clase de antibióticos glucopéptidos, como la vancomicina. Sin embargo, ahora tales segundas rondas de antibióticos incluyen miembros de la clase macrocíclica de antibióticos, tales como la fidaxomicina (Dificid).
Los pacientes mayores de sesenta y cinco años con múltiples comorbilidades tienen un mayor riesgo de la enfermedad por C. difficile y más a menudo sufren de una enfermedad más grave que conduce a múltiples recaídas. La enfermedad por C. difficile grave fulminante se caracteriza por tener once o más deposiciones líquidas por día durante más de diez días. Las muestras de deposiciones a menudo contienen moco y pueden ser sanguinolentas. Los parámetros de laboratorio definidos para la colitis por C. difficile fulminante son WBC > 15,000 /pL, un aumento de la creatinina sérica (aumento del 50 % y niveles > 2,0 mg/dL) que indica una función renal deficiente y niveles de albúmina que caen por debajo de 2,5 g/dL y muestran pérdida de proteína debido a la exudación de suero al intestino. Las presentaciones clínicas pueden incluir pseudomembranas en la endoscopia, dolor abdominal grave y calambres, y engrosamiento del colon observado por tomografía computarizada. El megacolon tóxico derivado del íleo puede causar náuseas, vómitos, deshidratación grave y letargo extremo. El tratamiento para casos graves y recurrentes de la enfermedad por C. difficile generalmente involucra 125 mg de vancomicina 4 veces al día durante 10 días.
Identificar la actividad de la enfermedad en pacientes con infección por C. difficile es imprescindible para un tratamiento adecuado y un mejor resultado con una disminución de la morbilidad y la mortalidad. En la presente descripción se describe un parámetro de diagnóstico para evaluar la gravedad en la enfermedad por C. difficile midiendo la lactoferrina en las deposiciones y usando la medición de la lactoferrina en las deposiciones como un indicador de inflamación intestinal causada por el C. difficile. Las modalidades de la invención están dirigidas a la medición de biomarcadores de la enfermedad en pacientes infectados con C. difficile para monitorear la efectividad del tratamiento y el potencial de recaída, como se discutirá con más detalle a continuación. La invención proporciona métodos para medir una cantidad de C. difficile en una muestra de deposiciones según la reivindicación 1 y métodos de monitorización de un paciente con la enfermedad por C. difficile según la reivindicación 5.
La enfermedad por C. difficile es una enfermedad inflamatoria que implica la infiltración de neutrófilos activados a través de la mucosa hacia la luz que causa colitis y, en casos graves, la formación de pseudomembranas. La lactoferrina humana es una glucoproteína que está presente en la mayoría de las secreciones de la mucosa y un componente primario de los gránulos de neutrófilos activados. Durante el inicio de la inflamación intestinal por C. difficile, los neutrófilos activados se infiltran en la luz intestinal y causan un aumento de la lactoferrina fecal.
Las muestras fecales se recolectan rutinariamente para la prueba del C. difficile (antígeno y toxina). En consecuencia, se pueden realizar pruebas adicionales para medir el nivel de lactoferrina fecal para determinar la cantidad de inflamación intestinal como un indicador de la gravedad de la enfermedad. Además, combinar la presencia de antígeno y los niveles de toxinas A y B con las concentraciones de lactoferrina fecal puede ayudar al médico a determinar si un paciente es portador de pacientes que tienen verdaderas infecciones leves a graves para un tratamiento médico óptimo.
Como se describe en la presente descripción, se proporciona un método para evaluar la gravedad de la enfermedad en pacientes con la enfermedad por C. difficile usando niveles de lactoferrina fecal. La toxina A es una proteína quimiotáctica fuerte que provoca la liberación de IL-8 y la infiltración de neutrófilos activados en la mucosa intestinal. De hecho, se ha demostrado que las concentraciones de toxina A de 100 veces menos que la de la toxina B estimulan la liberación de IL-8. La toxina A también estimula otras citocinas proinflamatorias, incluidas la II-1p y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a). La toxina B es una citotoxina que causa daño tisular e inflamación que contribuye, junto con la toxina A que causa la acumulación de líquido, a la enfermedad. Los efectos combinados de la toxina enterotóxica y quimiotáctica A y los efectos citotóxicos de la toxina B contribuyen en gran medida a la gravedad de la enfermedad. En un estudio de Kuehne y otros, los mutantes knockout mostraron que los mutantes A+B- y A-B+ eran citotóxicos y causaban enfermedades en el modelo de hámster. Un hallazgo interesante fue que cuando la tcdB fue inactivada por una inserción, el mutante A+B- resultante mostró una citotoxicidad aumentada de la toxina A en el cultivo celular. El aumento de la citotoxicidad no fue neutralizado completamente por el anticuerpo específico antitoxina A. La razón del aumento de la citotoxicidad después de la inactivación de tcdB no se determinó pero se pensó que se debía a una mayor expresión. El mutante de doble desactivación A-B- no causó la enfermedad en el hámster. Estos resultados confirmaron que tanto la TcdA como la TcdB en combinación e independientemente causan enfermedad. En otro estudio, el análisis de los aislados A-B+ mostró una variante de toxina B que fue significativamente más letal en un ratón que la toxina B normal. Estos estudios respaldan el papel de ambas toxinas en la enfermedad. Un método para determinar la presencia de inflamación intestinal en combinación con la presencia de toxina en las deposiciones puede ofrecer información adicional sobre el estado de la enfermedad para pacientes con infección por C. difficile.
La presente invención proporciona la determinación de la presencia de la enfermedad por C. difficile usando un panel de biomarcadores que incluye, a modo de ejemplo, el antígeno GDH de C. difficile, las toxinas A (tcdA o TcdA) y B (tcdB o TcdB) para determinar la presencia de C. difficile toxigénica. Como se entenderá, otras modalidades de la invención utilizan biomarcadores adicionales para la infección por C. difficile. Cuando un diagnóstico de la enfermedad por C. difficile ha concluido, las concentraciones de lactoferrina fecal pueden usarse para determinar la gravedad de la enfermedad. En pacientes con sospecha de infección con C. difficile, si la GDH está presente, indicando la presencia de C. difficile, luego se detectan las toxinas A y/o B (genes y/o proteínas) para mostrar la presencia del C. difficile toxigénico seguido por la medición de los niveles de lactoferrina fecal como un indicador de inflamación intestinal. Saber si el C. difficile toxigénico está presente en combinación con una concentración de lactoferrina ayudará a determinar la gravedad de la enfermedad para optimizar el tratamiento.
En las modalidades, se utilizan las mediciones en serie de los biomarcadores para las infecciones por C. difficile. Por ejemplo, los niveles de lactoferrina, GDH, toxina A y/o toxina B pueden monitorearse a intervalos regulares durante el análisis y/o tratamiento para monitorear el estado de la enfermedad y/o la efectividad del tratamiento. En las modalidades, el análisis en serie de la presencia de los biomarcadores (lactoferrina, GDH, toxinas A y/o B) proporciona un indicador de la bacteria, que puede usarse para determinar la respuesta de un paciente al tratamiento. La mayoría de los tratamientos con antibióticos se administran durante diez (10) días seguidos de una evaluación clínica para la cura. Además, después del régimen de antibióticos por 10 días, algunos pacientes siguen siendo portadores del C. difficile dejándolos en riesgo de una recaída clínica. La información sobre la efectividad del tratamiento dentro de los días posteriores al episodio inicial puede permitir un ajuste en la terapia farmacológica que resulte en un manejo médico óptimo de los pacientes. Por ejemplo, los pacientes que están infectados con la cepa del brote, el ribotipo 027 que produce más toxinas, corren un mayor riesgo de enfermedad grave que conduce a la colectomía y/o a la muerte. Estos pacientes se beneficiarían de una estrecha vigilancia de su enfermedad por C. difficile usando biomarcadores de inflamación y por la cantidad de C. difficile y sus toxinas. Al identificar a los pacientes que no responden al tratamiento antes en su régimen de 10 días, puede ofrecer la opción de cambiar la terapia para obtener mejores resultados.
El nivel de lactoferrina en muestras fecales proporciona una indicación de la gravedad del C. diffiále. Por ejemplo, la enfermedad por C. diffiále "leve" puede estar indicada en muestras con niveles de lactoferrina cercanos a 7,25 pL/ml de lactoferrina. Un diagnóstico de enfermedad por C. diffiále leve está indicada en muestras con niveles más bajos de lactoferrina combinados con indicadores clínicos para definir la enfermedad leve. Por ejemplo, los indicadores clínicos como la cantidad de deposiciones no formadas por día, la presencia de fiebre, dolor abdominal y vómitos pueden caracterizarse y/o determinarse como indicativos de un diagnóstico de enfermedad por C. diffiále leve, y puede analizarse junto con una medición baja de lactoferrina cerca o alrededor de los niveles basales (<7,25 pg/ml de lactoferrina), para determinar la gravedad de la enfermedad. En las modalidades, los indicadores clínicos para el diagnóstico de la enfermedad por C. diffiále leve incluye tener de tres a cinco deposiciones por día y un conteo de glóbulos blancos menor o igual a 15,000/mm3 En modalidades adicionales, los parámetros de laboratorio tales como la proteína C reactiva (CRP), el conteo de glóbulos blancos (WBC), la albúmina sérica y/o la creatinina, se pueden combinar con un nivel de lactoferrina, un nivel de calprotectina y/o un indicador(es) clínico(s) para determinar la gravedad de la enfermedad en pacientes con diagnóstico de C. diffiále.
En otro ejemplo, la enfermedad por C. diffiále "moderada" puede estar indicada en muestras con niveles superiores a 99,99 pg/ml de lactoferrina. Un diagnóstico de la enfermedad por C. diffiále moderada está indicada en muestras con más de 99,99 pg/ml de lactoferrina, combinada con indicadores clínicos para definir la enfermedad moderada. Por ejemplo, los indicadores clínicos tales como el número de deposiciones no formadas por día, la presencia de fiebre, dolor abdominal y vómitos pueden caracterizarse y/o determinarse como indicativos de un diagnóstico de enfermedad por C. diffiále moderada, y puede analizarse junto con una medición de más de 99,99 pg/ml de lactoferrina, para determinar la gravedad de la enfermedad. En las modalidades, los indicadores clínicos para un diagnóstico de enfermedad por C. diffiále moderada incluye tener de seis a nueve deposiciones por día, un conteo de glóbulos blancos de 15,001/mm3 hasta 20,000/mm3y dolor abdominal moderado. En modalidades adicionales, los parámetros de laboratorio tales como la proteína C reactiva (PCR), el conteo de glóbulos blancos (WBC), la albúmina sérica y/o la creatinina, pueden combinarse con un nivel de lactoferrina, un nivel de calprotectina y/o un indicador(es) clínico(s) para determinar la gravedad de la enfermedad en pacientes con diagnóstico de C. diffiále moderado.
En otro ejemplo, la enfermedad por C. difficile "moderada a grave" puede estar indicada en muestras cercanas a 500 pg/ml o más de lactoferrina. Un diagnóstico de enfermedad por C. difficile moderada a grave está indicada en muestras cercanas a 500 pg/ml o más de lactoferrina, combinadas con indicadores clínicos para definir la enfermedad de moderada a grave. Por ejemplo, los indicadores clínicos como el número de deposiciones no formadas por día, la presencia de fiebre, dolor abdominal y vómitos pueden caracterizarse y/o determinarse como indicativos de un diagnóstico de enfermedad por C. difficile moderado a grave, y puede analizarse junto con una medición cercana a 500 pg/ml o más de lactoferrina, para determinar la gravedad de la enfermedad. En las modalidades, los indicadores clínicos para un diagnóstico de C. difficile moderado a grave incluye tener diez o más deposiciones por día, un conteo de glóbulos blancos de 20,001/mm3 o mayor, y dolor abdominal grave. En modalidades adicionales, los parámetros de laboratorio tales como la proteína C reactiva (PCR), el conteo de glóbulos blancos (WBC), la albúmina sérica y/o la creatinina, se pueden combinar con un nivel de lactoferrina, un nivel de calprotectina y/o un indicador(es) clínico(s) para determinar la gravedad de la enfermedad en pacientes con diagnóstico de C. difficile moderado a grave.
Un método ilustrativo para probar la presencia del biomarcador GDH de C. difficile es utilizar la prueba C. DIFF CHEK™ - 60, que usa anticuerpos específicos para la GDH de C. difficile. LaPlaca de Microensayo contiene un anticuerpo policlonal contra el antígeno GDH inmovilizado, mientras que el Conjugado consiste en un anticuerpo monoclonal altamente específico conjugado con peróxido de rábano picante. Si el antígeno GDH está presente en la muestra, se detecta un color debido a los complejos enzima-anticuerpo-antígeno que se forman en el ensayo.
Un método ilustrativo para evaluar la presencia de la toxina A y la toxina B es usar la prueba C. DIFFICILE TOXA/ B II™ , que usa anticuerpos contra las toxinas A y B del C. difficile. La prueba utiliza un anticuerpo policlonal contra las toxinas A y B, purificado por afinidad inmovilizado, y el anticuerpo de detección consiste en una mezcla de anticuerpo monoclonal de toxina A conjugado con la peroxidasa de rábano picante y un anticuerpo policlonal de toxina B conjugado con peroxidasa de rábano picante. Si las toxinas A y B están presentes en la muestra, se detecta un color debido a los complejos enzima-anticuerpo-antígeno que se forman en el ensayo.
Un método ilustrativo para probar la presencia de GDH, de toxina A y toxina B es usar la prueba QUIK CHEK COMPLETED™, que usa anticuerpos específicos para la GDH y las toxinas A y B de C. difficile. El dispositivo contiene tres líneas verticales de anticuerpos inmovilizados, la línea de prueba del antígeno contiene anticuerpos contra la GDH de C. difficile, y la línea de control es una línea de puntos que contiene anticuerpos anti peroxidasa de rábano picante. La línea de prueba de las toxinas A y B contiene anticuerpos contra las toxinas A y B del C. difficile y el Conjugado consiste en anticuerpos contra la GDH y anticuerpos contra las toxinas A y B acopladas a la peroxidasa de rábano picante. La reacción de GDH se examina visualmente para detectar la aparición de una línea azul vertical, que indica una prueba positiva, mientras que una línea azul también indica una prueba positiva para la toxina A y la toxina B.
Un método ilustrativo para probar la presencia de la toxina de C. diffiále es la C. DIFFICILE TOX-B TEST™, que usa un formato de cultivo de tejidos para detectar la presencia de actividad citotóxica en muestras fecales y confirma la identificación de la toxina de C. diffiále usando una antitoxina específica. La prueba confirma la presencia de la toxina de C. diffiále neutralizando la actividad citotóxica con un reactivo que es una antitoxina específica. En el ensayo, si la toxina de C. diffiále está presente, las células en el pozo con PBS se volverán redondas, demostrando la presencia de la actividad citotóxica, mientras que la presencia de la toxina de C. diffiále se confirma si la actividad citotóxica se neutraliza en el pozo que contiene antitoxina.
Un método ilustrativo para tratar al C. diffiále es a través de un trasplante de flora nativa. Este proceso, también conocido como trasplante de microbiota fecal (FMT), es la restauración de la flora del colon mediante la introducción de una flora bacteriana saludable a través de la infusión de deposiciones, por ejemplo, mediante enema, obtenido de un donante humano sano. Un trasplante de flora nativa también se puede administrar como un líquido que el paciente bebe.
Los siguientes son ejemplos de procedimientos que se han utilizado para establecer los ensayos preferidos de acuerdo con la presente invención. Los siguientes ejemplos son meramente ilustrativos y no se presentan a modo de limitación.
Ejemplo 1
Los niveles de lactoferrina fecal se evaluaron en pacientes con la enfermedad clínicamente definida por C. diffiále que varía de la enfermedad leve a moderada a grave. En resumen, los pacientes con la enfermedad por C. diffiále clínicamente confirmada que presentaban un espectro de gravedad se reclutaron junto con catorce sujetos sanos de la misma edad y sexo definidos como no teniendo enfermedades intestinales. La actividad de la enfermedad se definió mediante la evaluación del médico y se basó en los síntomas, la albúmina sérica, los conteos de leucocitos y las comorbilidades. La lactoferrina fecal se midió usando un inmunoensayo enzimático cuantitativo (EIA). La glutamato deshidrogenasa (GDH) de C. diffiále y las toxinas A y B en las deposiciones se detectaron mediante el uso de un EIA basado en membrana. El cultivo toxigénico se realizó mediante enriquecimiento de esporas y se analizaron tanto los aislamientos como las muestras de deposiciones mediante un ensayo de cultivo de tejidos para determinar la citotoxicidad.
Resultados
Treinta y nueve casos clínicamente confirmados de la enfermedad por C. diffiále (quince moderados a graves, veintiuno moderados y tres leves) se evaluaron durante un período de seis meses. Las edades iban de treinta y dos a ochenta y nueve años y el cincuenta por ciento eran mujeres. Las comorbilidades predominantes fueron diabetes (31 %), cáncer (23 %) y fallo renal (23 %). Todos los pacientes eran GDH-positivos y el C. diffiále toxigénico fue aislado de todos menos de cuatro pacientes. Los niveles medios de lactoferrina (pg/mL ± error estándar) fueron 1198 ± 404 para moderado a grave, 132 ± 50 para moderado, 12 ± 5 para leve y 2 ± 0,3 para sujetos sanos. La toxina de las deposiciones se detectó mediante cultivo de tejidos en el 87 % (13/15) de moderada a grave, 71 % (15/21) de moderada y 33 % (1/3) para enfermedad leve. Dos de los pacientes de moderados a graves con los niveles más bajos de lactoferrina (< 8 pg/ml) y tres de los cuatro más bajos con niveles moderados (< 12 pg/ml) también fueron negativos para el cultivo de tejidos. De estos pacientes, tanto los pacientes graves como dos de los cuatro moderados tuvieron cultivos de deposiciones negativos. Todos estos pacientes tenían comorbilidades que contribuyeron a las evaluaciones clínicas. Nuestra conclusión es que, en un entorno clínico, las comorbilidades pueden complicar la evaluación clínica de la infección por C. diffiále. Nuestros resultados muestran que la lactoferrina fecal es útil para indicar la gravedad de la enfermedad en pacientes con infección por C. diffiále.
Por consiguiente, la Figura 1A detalla las características del paciente para casos clínicamente confirmados de la enfermedad por C. diffiále. La mayoría de los pacientes tenían >64 años, experimentaban dolor, tenían deposiciones líquidas y sufrían comorbilidades, como diabetes, cáncer, fallo renal y neumonía. La Figura 1B muestra que los niveles de lactoferrina fueron significativamente más altos entre los casos leves, moderados y moderados a graves de la enfermedad por C. diffiále y la tendencia más alta para el grupo moderado a grave.
La Figura 2 muestra los niveles medios de lactoferrina para pacientes con la enfermedad por C. diffiále clínicamente confirmada agrupados por ribotipo. Los pacientes infectados con el ARL 027 tenían niveles significativamente más altos de lactoferrina que los pacientes infectados con otros ribotipos. Los estudios han demostrado que los pacientes infectados con el ARL 027 tienden a tener toxinas en las deposiciones y se presentan con una enfermedad más grave.
Ejemplo 2
La GDH de C. diffiále fecal, las toxinas A y B, y los niveles de lactoferrina humana se midieron en varios sujetos con la enfermedad por C. diffiále durante el tratamiento con antibióticos. Ambos sujetos con la enfermedad por C. diffiále clínicamente confirmada se monitorizaron para detectar la presencia de GDH, toxinas A y B y lactoferrina fecal mediante inmunoensayo enzimático (EIA). La recolección de muestras se inició al inicio del tratamiento con antibióticos y se continuó de forma diaria o semanal cuando fue posible. Cada paciente mantuvo un registro de síntomas y todos los tratamientos se registraron durante el período de prueba. Ambos pacientes mostraron una respuesta rápida al tratamiento con antibióticos y la GDH fecal, las toxinas A y B, y la lactoferrina fecal alcanzaron el valor basal en 24 horas. El antígeno, la toxina y la lactoferrina fecal permanecieron negativos durante la terapia con antibióticos. Después del tratamiento, ambos pacientes experimentaron una recaída clínica y mostraron un rápido aumento de todos los parámetros. Después de un segundo ciclo de antibióticos, todos los parámetros volvieron al basal. Al finalizar el segundo ciclo de antibióticos, todos los parámetros aumentaron rápidamente en ausencia de síntomas clínicos. Tanto la GDH como la toxina permanecieron presentes durante 3 a 4 semanas, pero la lactoferrina fecal volvió rápidamente al basal. No se administraron antibióticos ya que no hubo síntomas clínicos y los pacientes permanecieron sanos.
Resultados
En esta evaluación, se observó que la GDH, toxina y lactoferrina fecal de C. diffiále respondieron rápidamente a la terapia con antibióticos volviendo al valor basal (negativo). Más interesante aún, tanto la GDH como la toxina estaban presentes sin síntomas clínicos y sin inflamación intestinal según lo determinado por la lactoferrina basal. Estos resultados muestran un papel para la lactoferrina fecal en combinación con mediciones de antígenos y toxinas para determinar qué casos de la enfermedad por C. diffiále puede no requerir tratamiento adicional con antibióticos. Además, nuestra invención proporciona un papel para la lactoferrina fecal en el monitoreo de la enfermedad por C. diffiále. Al determinar la cantidad de inflamación intestinal mediante el uso de lactoferrina en pacientes con la enfermedad por C. diffiále junto con evaluaciones clínicas, la identificación de los pacientes por la gravedad de la enfermedad puede resultar útil para optimizar el tratamiento y conducir a mejores resultados para el paciente.
El tratamiento para la enfermedad por C. diffiále puede optimizarse ya que los diferentes niveles de gravedad requieren diferentes recomendaciones de tratamiento. Por ejemplo, los casos leves de la enfermedad por C. diffiále a menudo no recibe tratamiento con antibióticos. Por el contrario, un caso de gravedad moderada puede requerir un antibiótico como el metronidazol, mientras que un caso de la enfermedad por C. diffiále moderado a grave puede tratarse con antibióticos como vancomicina y fidaxomicina (Dificid).
La Figura 3 ilustra los niveles diarios de lactoferrina del episodio inicial de la infección por C. diffiále, durante y después del tratamiento con antibióticos. La lactoferrina estaba elevada (^7,25 pg/ml) durante el episodio inicial y para ambos períodos de recaída. Los niveles disminuyen rápidamente una vez que se inicia el tratamiento y aumentan a medida que los síntomas regresan.
Ejemplo 3
Los pacientes (pts) con diarrea y positivos para la toxina (TcdAy TcdB) en las deposiciones y/o glutamato deshidrogenasa (GDH) fueron reclutados con consentimiento informado. Las muestras de deposiciones se recolectaron desde el ingreso (T = 0) hasta el seguimiento (T = F). La GDH, la toxina y la lactoferrina (LF: mediana pg/g) se midieron en muestras de deposiciones por inmunoensayo. El cultivo bacteriano y los conteos (mediana de CFU #/g) se realizaron con enriquecimiento con etanol y los aislamientos se ribotiparon. Un total de 18 pacientes hospitalizados fueron reclutados y seguidos durante un período medio de 21 días de T = 0 a T = F. La mediana de edad fue de 75 años y la relación hombre:mujer fue de 1:3,5. Los pacientes se estratificaron en 3 grupos (i) pacientes que fueron tratados y no mostraron recurrencia (N = 9). (ii) pacientes que fueron tratados con resolución completa de síntomas pero que tenían CDI (N = 5) y (iii) pacientes que respondieron inicialmente al tratamiento pero recayeron (N = 4).
Resultados
Los pacientes en el grupo (i) pasaron de ser muy positivos para la GDH, la toxina y un conteo de esporas de 104 en T = 0, a negativos para todos los biomarcadores en T = F. LF cayó de 406 a 4 durante este período (Tabla 1a). Cuatro de los 5 pacientes en el grupo (ii) fueron positivos para la GDH, la toxina, y tuvieron un conteo de esporas de 104 en T = 0. En T = F, 3 de los 5 pts eran negativos para la toxina, 3 pts seguían siendo positivos para la GDH y todos los pts tenían esporas (103) La LF para estos pacientes disminuyó de 85 a 2 asociada con la resolución de los síntomas (Tabla 1b). Para el grupo (iii), los 4 pacientes permanecieron sintomáticos y se mantuvieron fuertemente positivos para la GDH, la toxina, y tuvieron un conteo de esporas de 104. Los niveles de LF para este grupo fueron similares tanto en T = 0 como en T = F (362 y 315, respectivamente) (Tabla 1c). Un total de 5 (28 %) pts tuvo 027 CDI en T = 0. En el grupo (ii), 3 de 5 pts fueron reinfectados con 027 como portadores. En el grupo (iii), 1 paciente se convirtió a 027. ** Todos los aislamientos de 027 fueron resistentes a las fluoroquinolonas. En nuestro estudio, a T = F, el 50 % de los pacientes no tenía CDI, el 28 % se convirtió en portador y el 22 % permaneció enfermo. Los niveles de GDH, toxina y l F se correlacionaron con la presencia de la enfermedad clínica. El C. diffiále continúa siendo una infección compleja, y el diagnóstico preciso de la enfermedad se basa en la historia clínica utilizada junto con biomarcadores para el organismo y para la inflamación.
La Figura 4A muestra los resultados de los biomarcadores de CDI antes y después del tratamiento con antibióticos para la enfermedad por C. diffiále. Todos los pacientes en este grupo tuvieron una cura clínica, lo que significa que no hubo síntomas ni C. diffiále detectado durante y después del tratamiento antibiótico inicial.
La Figura 4B muestra los resultados de los biomarcadores de CDI antes y después del tratamiento antibiótico para la enfermedad por C. diffiále. Todos los pacientes en este grupo tuvieron una reinfección de C. diffiále lo que significa que el organismo de C. diffiále se detectó en ausencia de síntomas durante y/o después del tratamiento antibiótico inicial.
La Figura 4C muestra los resultados de los biomarcadores de CDI antes y después del tratamiento con antibióticos para la enfermedad por C. diffiále. Todos los pacientes en este grupo tuvieron una recurrencia clínica o ninguna cura, lo que significa que los síntomas y el organismo C. diffiále se mantuvo o regresó durante y/o después del tratamiento antibiótico inicial.
La Figura 5 representa una curva estándar generada por una prueba cuantitativa ELISA para la GDH usando el antígeno GDH de C. diffiále purificado mientras que la Figura 6 ilustra una curva estándar generada por una prueba cuantitativa de ELISA para lactoferrina usando el antígeno de lactoferrina purificado.
La Figura 7 representa la monitorización de un paciente curado de C. diffiále usando un tratamiento antibiótico con Dificid con biomarcadores de la enfermedad por C. diffiále que incluyen la media de la GDH (ng/ml), la toxina (densidad óptica por ELISA ABII) y los niveles de lactoferrina (pg/ml). Como se ilustra en la Figura 7, se analizaron muestras fecales del paciente y, como es evidente, los niveles de GDH disminuyeron y no se detectaron al concluir que los biomarcadores del régimen antibiótico muestran una cura en el paciente con Dificid. Además, los niveles de lactoferrina y toxina también disminuyeron notablemente. Esto es útil al identificar si una terapia de tratamiento es efectiva o no.
La Figura 8 representa la monitorización de un paciente que tiene infección continua con C. difficile durante el tratamiento con antibióticos de rifaximina usando biomarcadores de la enfermedad por C. diffiále que incluyen la media de la GDH (ng/ml), la toxina (densidad óptica por ELISA ABII) y los niveles de lactoferrina (pg/ml). En contraste a la Figura 7, la Figura 8 ilustra que las muestras fecales del individuo que aún sufre de la enfermedad por C. difficile experimentó un aumento en la GDH. Específicamente, el nivel de GDH parece disminuir, pero luego comienza a aumentar a medida que la terapia demuestra ser ineficaz.
La Figura 9 representa la utilización de un panel de biomarcadores de diagnóstico que incluye la GDH cuantitativa, lactoferrina cuantitativa y toxina en las deposiciones como ayuda para diferenciar pacientes con la enfermedad por C. diffiále de aquellos en estado de portador. Los resultados muestran los niveles de biomarcadores para diferenciar a los pacientes en estado de portador de aquellos con la enfermedad activa. Una combinación de los biomarcadores y los síntomas clínicos se usan en combinación para determinar los portadores de los pacientes con enfermedad. Por ejemplo, los pacientes con niveles de lactoferrina cercanos al valor basal (7,25 pg/g), de GDH <1000 ng/g, y con poca o ninguna toxina son sospechosos del estado de portador. En contraste, los pacientes con toxina en las deposiciones, niveles más altos de lactoferrina y GDH son sospechosos de enfermedad. Los ensayos moleculares como la PCR son altamente sensibles y muestran resultados positivos para pacientes en estado de portador y con la enfermedad. La adición de biomarcadores con evaluaciones clínicas ofrece un método para determinar qué pacientes requieren tratamiento para un resultado óptimo.
Como se describe en la presente descripción, la calprotectina fecal se puede utilizar además de la lactoferrina fecal como un marcador no invasivo para medir la inflamación intestinal. Por ejemplo, en una persona diagnosticada con la enfermedad por C. difficile, se puede medir un nivel cuantitativo de calprotectina fecal y el nivel cuantitativo se puede asociar con una gravedad de la enfermedad que incluye leve, moderada y moderada a grave. Además, la calprotectina fecal se puede medir después del tratamiento para monitorizar la respuesta de una persona al tratamiento médico o un nivel de actividad de la enfermedad.
Se describen métodos no invasivos para identificar la gravedad de la enfermedad por C. difficile en personas diagnosticadas con la enfermedad por C. difficile usando la lactoferrina. La gravedad de la enfermedad identificada se puede usar para recomendar un curso de tratamiento preferido para la persona. La divulgación se dirige además a utilizar cambios en los niveles de lactoferrina para monitorizar la actividad de la enfermedad de una persona y/o la respuesta al tratamiento.
Los inmunoensayos descritos en la presente descripción detectan la lactoferrina, una proteína estable que sirve como un indicador de inflamación intestinal, y proporciona niveles cuantitativos de lactoferrina fecal para asociar la gravedad de la enfermedad por C. difficile y para monitorizar la actividad de la enfermedad. La presente invención se ha descrito en relación con modalidades particulares que pretenden en todos los aspectos ser ilustrativas más que restrictivas. Las formas de modalidad alternativas serán evidentes para los expertos en la materia a los que pertenece la presente invención sin apartarse del alcance de las reivindicaciones.
De lo anterior, se verá que esta invención es una bien adaptada para alcanzar todos los fines y objetos expuestos en la presente descripción anteriormente junto con otras ventajas que son obvias y que son inherentes al método. Se entenderá que ciertas características y subcombinaciones son de utilidad y pueden emplearse sin referencia a otras características y subcombinaciones. Esto está contemplado por y está dentro del alcance de las reivindicaciones.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un método para medir una cantidad de C. diffiále en una muestra fecal, el método que comprende: medir cuantitativamente un nivel de lactoferrina, de la glutamato deshidrogenasa (GDH) de C. diffiále y de la toxina A de C. diffiále o de la toxina B de C. diffiále en una muestra fecal diluida de un paciente infectado con C. diffiále, en donde un nivel de lactoferrina <7,25 pg/ml, de GDH de C. diffiále <1000 ng/g y una ausencia de toxina indica el estado de portador, y en donde un nivel de lactoferrina > 7,25 pg/ml, de GDH de C. diffiále > 1000 ng/g, y de toxina se identifica y de esta manera determina que el paciente tiene actividad en la enfermedad por C. diffiále.
2. El método de la reivindicación 1, que comprende además determinar un nivel de uno o más de otros antígenos en la muestra fecal, en donde uno o más de los otros antígenos se miden cuantitativamente.
3. El método de la reivindicación 1, que comprende además poner en contacto la muestra fecal con anticuerpos policlonales o monoclonales inmovilizados para la GDH de C. diffiále para crear una muestra unida a anticuerpos, que comprende además poner en contacto la muestra unida a anticuerpos con anticuerpos policlonales o monoclonales ligados a enzimas de modo que los anticuerpos policlonales o monoclonales ligados a enzimas puedan unirse o capturarse a la GDH de C. difficile y crear una muestra unida a anticuerpos ligados a enzimas, que comprende además añadir un sustrato a la muestra unida a anticuerpos ligados a enzimas para el desarrollo del color para crear una muestra unida a anticuerpos ligados a enzimas legible.
4. El método de la reivindicación 3, que comprende además determinar una densidad óptica de dicha muestra unida a anticuerpo ligado a enzima legible mediante el uso de una longitud de onda, en donde la densidad óptica corresponde a un nivel de GDH de C. diffiále en la muestra unida a anticuerpo ligado a enzima legible.
5. Un método para monitorear a un paciente con la enfermedad por C. diffiále por la cantidad de C. diffiále, el método comprende: determinar una concentración de lactoferrina, de la glutamato deshidrogenasa (GDH) de C. diffiále y de la toxina A de C. diffiále o de la toxina B de C. diffiále en una primera muestra fecal diluida de un paciente que tiene una infección por C. diffiále por primera vez, en la que una concentración de lactoferrina <7,25 pg/ml, de GDH de C. diffiále <1000 ng/g y una ausencia de toxina indica un estado de portador, y una concentración de lactoferrina > 7,25 pg/ml, de GDH de C. diffiále > 1000 ng/g y la toxina se identifica y de esta manera indica la enfermedad activa por C. diffiále; determinar la concentración de lactoferrina, de GHD de C. diffiále y de la toxina A de C. difficile o de la toxina B de C. difficile en una segunda muestra fecal diluida del paciente por segunda vez más tarde que la primera vez; y monitorizar la actividad de la enfermedad comparando dicha primera concentración de lactoferrina, la concentración de GDH de C. diffiále y de la toxina A de C. diffiále o de la toxina B de C. diffiále a dicha segunda concentración de lactoferrina, de concentración de GDH de C. diffiále y de la toxina A de C. diffiále o de la toxina B de C. diffiále para determinar si el paciente ha tenido un aumento o disminución o ningún cambio en la cantidad de C. diffiále.
6. El método de la reivindicación 5, que comprende además: poner en contacto dicha primera muestra fecal con anticuerpos policlonales o monoclonales inmovilizados para la GDH de C. diffiále para crear una primera muestra tratada; poner en contacto dicha primera muestra tratada con anticuerpos policlonales ligados a enzimas para crear una primera muestra unida a anticuerpos ligados a enzimas; añadir un primer sustrato a la primera muestra unida a anticuerpos ligados a enzimas para crear una primera muestra legible; y determinar una densidad óptica de dicha primera muestra legible.
7. El método de la reivindicación 5, que comprende además: poner en contacto dicha segunda muestra fecal con anticuerpos policlonales o monoclonales inmovilizados para la GDH de C. diffiále para crear una segunda muestra tratada; poner en contacto dicha segunda muestra tratada con anticuerpos policlonales o monoclonales ligados a enzimas para crear una segunda muestra unida a anticuerpos ligados a enzimas; añadir un segundo sustrato a la segunda muestra unida a anticuerpos ligados a enzima para crear una segunda muestra legible; y determinar una densidad óptica de dicha segunda muestra legible.
8. El método de la reivindicación 5, que comprende además generar una curva estándar de GDH de C. diffiále purificada y determinar una porción lineal de la curva estándar.
9. El método de la reivindicación 8, que comprende además diluir dichas primera y segunda muestras fecales mediante diluciones en serie de 2 a diez veces hasta que un resultado medido indique una concentración de GDH de C. diffiále fecal que proporciona una densidad óptica mediante el uso de una longitud de onda que está dentro de la porción lineal de la curva estándar.
10. El método de la reivindicación 5, que comprende además monitorear al paciente para detectar niveles cambiantes de GDH de C. diffiále fecal como un indicador de la efectividad del tratamiento médico.
11. El método de la reivindicación 5, en donde uno o más formatos de ensayo se utilizan para determinar la cantidad de C. diffiále en la muestra fecal, en donde uno o más formatos de ensayo incluyen inmunoensayos basados en membrana de flujo lateral y pruebas moleculares de ADN y ARN.
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