JP2015167527A - 標的タンパク質の量の低減のためのポリペプチド、単離された核酸、組み換えベクター、及び形質転換体 - Google Patents
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Abstract
【課題】標的タンパク質の量を特異的に低減する技術を提供すること。
【解決手段】本発明は、標的タンパク質に特異的に結合するアミノ酸配列を含むタンパク質領域と、Hsc70に結合するアミノ酸配列と、を少なくとも含むアミノ酸配列からなるポリペプチドを提供する。前記タンパク質領域は、Tpp1領域であってもよい。前記タンパク質領域と、前記Hsc70に結合するアミノ酸配列との間にリンカー配列及び/又はスペーサー配列が介在していてもよい。
【選択図】図2
【解決手段】本発明は、標的タンパク質に特異的に結合するアミノ酸配列を含むタンパク質領域と、Hsc70に結合するアミノ酸配列と、を少なくとも含むアミノ酸配列からなるポリペプチドを提供する。前記タンパク質領域は、Tpp1領域であってもよい。前記タンパク質領域と、前記Hsc70に結合するアミノ酸配列との間にリンカー配列及び/又はスペーサー配列が介在していてもよい。
【選択図】図2
Description
本発明は、標的タンパク質の量の低減のためのポリペプチド、単離された核酸、組み換えベクター、及び形質転換体に関する。
癌等の疾患は、先天的、又は外的環境等によって後天的に導入された遺伝子の変異によって生成される変異型タンパク質が主要な病因である。癌等の疾患の治療において、変異型タンパク質の発現を人工的に抑制する技術が着目されている。
変異型タンパク質等の標的タンパク質の発現を人工的に抑制する技術としては、転写段階で遺伝子の発現を抑制するアンチジーン法、翻訳段階でタンパク質の発現を抑制するアンチセンス法等が挙げられる(非特許文献1及び2)。これらの技術はいずれも、細胞外からオリゴヌクレオチドを添加し、標的タンパク質をコードするDNAやmRNAに対して該オリゴヌクレオチドを結合させることで、オリゴヌクレオチドの結合部位よりも下流の遺伝子の転写及び翻訳を阻害し、標的タンパク質の発現を抑制する技術である。
Goodchild, J. "Therapeutic oligonucleotides" Methods Mol. Biol.(2011) 764, 1−15
Malik, R., Roy, I. "Making sense of therapeutics using antisense technology" Expert Opin. Drug Discov.(2011) 6(5), 507−526
しかし、従来の技術においては、標的遺伝子中の適切な標的配列を選択しなければ標的タンパク質の発現を抑制できないという問題、細胞外から添加したオリゴヌクレオチドが、核酸分解酵素等で分解されて標的配列に到達できないという問題、変異型タンパク質のみならず正常タンパク質の発現も同時に抑制してしまい得るという問題等があった。
本発明は、以上のような課題に鑑みてなされたものであり、標的タンパク質の量を特異的に低減する技術を提供することを目的とする。
本発明者らは、標的タンパク質に特異的に結合するタンパク質に、シャペロン介在性オートファジー作用に関与する特定の分子シャペロンの結合モチーフを付加させた融合タンパク質によれば、該融合タンパク質が標的タンパク質に特異的に結合し、該標的タンパク質をリソソーム内で分解することができるので、標的タンパク質の量を特異的に低減できる点を見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は以下のものを提供する。
(1) 標的タンパク質に特異的に結合するアミノ酸配列を含むタンパク質領域と、
Hsc70に結合するアミノ酸配列と、
を少なくとも含むアミノ酸配列からなるポリペプチド。
Hsc70に結合するアミノ酸配列と、
を少なくとも含むアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(2) 前記タンパク質領域は、Tpp1領域である、(1)に記載のポリペプチド。
(3) 前記タンパク質領域と、前記Hsc70に結合するアミノ酸配列との間にリンカー配列及び/又はスペーサー配列が介在する(1)又は(2)に記載のポリペプチド。
(4) 前記Hsc70に結合するアミノ酸配列を複数含む(1)から(3)のいずれかに記載のポリペプチド。
(5) (1)から(4)のいずれかに記載のポリペプチドをコードする単離された核酸。
(6) (5)に記載の核酸を含む組み換えベクター。
(7) (6)に記載の組み換えベクターを含み、単離された細胞又は非ヒト動物である形質転換体。
本発明によれば、標的タンパク質の量を特異的に低減する技術が提供される。
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施形態に限定されない。
<本発明のポリペプチド>
本発明は、標的タンパク質に特異的に結合するアミノ酸配列を含むタンパク質領域と、Hsc70に結合するアミノ酸配列と、を少なくとも含むアミノ酸配列からなるポリペプチドを提供する。本発明は、Hsc70に結合するアミノ酸配列と、熱ショック関連タンパク質Hsc70との結合を介した、シャペロン介在性オートファジー作用を利用して、タンパク質領域に結合した標的タンパク質をリソソームまで運搬し、該標的タンパクをプロテアーゼによって分解することで標的タンパク質の量を低減する技術である。
本発明は、標的タンパク質に特異的に結合するアミノ酸配列を含むタンパク質領域と、Hsc70に結合するアミノ酸配列と、を少なくとも含むアミノ酸配列からなるポリペプチドを提供する。本発明は、Hsc70に結合するアミノ酸配列と、熱ショック関連タンパク質Hsc70との結合を介した、シャペロン介在性オートファジー作用を利用して、タンパク質領域に結合した標的タンパク質をリソソームまで運搬し、該標的タンパクをプロテアーゼによって分解することで標的タンパク質の量を低減する技術である。
[Hsc70に結合するアミノ酸配列]
「Hsc70に結合するアミノ酸配列」とは、分子シャペロンである熱ショック関連タンパク質Hsc70に対するKFERQ様配列(「Hsc70結合モチーフ(Hsc70bm)」とも呼ばれる。)を含む配列である。以下、Hsc70に結合するアミノ酸配列を含む領域を「Hsc70bm領域」という。
「Hsc70に結合するアミノ酸配列」とは、分子シャペロンである熱ショック関連タンパク質Hsc70に対するKFERQ様配列(「Hsc70結合モチーフ(Hsc70bm)」とも呼ばれる。)を含む配列である。以下、Hsc70に結合するアミノ酸配列を含む領域を「Hsc70bm領域」という。
Hsc70に結合するアミノ酸配列としては、特に限定されないが、配列番号14(動物種:ヒト)、配列番号15(動物種:ヒト)で表されるアミノ酸配列が挙げられる。Hsc70に結合するアミノ酸配列の由来する動物種は特に限定されず、“Proc. Am. Thorac. Soc. (2010) Vol. 7, pp.29−39”や、“Autophagy (2007) 3, 295−299”等の文献において定義される結合モチーフを使用できる。
本発明においては、Hsc70に結合するアミノ酸配列のアミノ酸配列と80%以上、85%以上、90%以上、又は95%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列も使用できる。
Hsc70bm領域は、Hsc70に結合するアミノ酸配列からなる領域であってもよいが、スペーサー配列等を含んでいてもよい。Hsc70bm領域には、Hsc70に結合するアミノ酸配列が単数又は複数含まれていてもよい。Hsc70bm領域に、Hsc70に結合するアミノ酸配列が複数含まれている場合、該アミノ酸配列は、タンデムに結合されていてもよいし、スペーサー配列を介して離れていてもよい。該スペーサー配列の長さは、10〜20アミノ酸であってもよい。
Hsc70bm領域におけるHsc70に結合するアミノ酸配列の配置は特に限定されないが、Hsc70bm領域に、Hsc70に結合するアミノ酸配列が複数含まれている場合、Hsc70に結合するアミノ酸配列と、Hsc70とが結合しやすいという点から、該アミノ酸配列を、Hsc70bm領域の両末端に配置することが好ましい。
Hsc70に結合するアミノ酸配列を含むタンパク質は、Hsc70に結合するアミノ酸配列を介してHsc70に特異的に結合し、次いで、該タンパク質とHsc70との複合体は、細胞内におけるタンパク質分解の場であるリソソームまで運搬される。該複合体は、リソソームまで運搬された後、リソソームシャペロンLys−Hsc73の働きにより、リソソーム関連膜タンパク質Type−2a LAMP−2aを通過して、リソソーム内に取り込まれ、リソソーム内部のプロテアーゼにより分解される。このような、Hsc70に対する結合を介したタンパク質の分解作用を、「シャペロン介在性オートファジー作用」という。
本発明者らは、Hsc70bmとHsc70との特異的な結合に基づく、シャペロン介在性オートファジー作用を利用した標的タンパク質の分解に着目し、本発明に想到した。すなわち、任意の標的タンパク質に特異的に結合するアミノ酸配列を含むタンパク質領域にHsc70bm領域が付加された融合タンパク質(つまり、本発明におけるポリペプチド)を細胞内で発現させると、該融合タンパク質は、タンパク質領域を介して標的タンパク質に結合する。次いで、又は標的タンパク質と融合タンパク質との結合と同時に、標的タンパク質に結合した融合タンパク質は、Hsc70bm領域を介して、細胞内のHsc70に結合し、リソソームまで運搬され、上記のシャペロン介在性オートファジー作用によって、融合タンパク質とともに標的タンパク質が分解される。シャペロン介在性オートファジー作用によって分解される標的タンパク質は、Hsc70bm領域が付加されたタンパク質領域に特異的に結合するものに限られるので、本発明によれば、標的タンパク質の量を特異的に低減できる。
本発明のポリペプチドには、単数又は複数のHsc70bm領域が含まれていてもよい。本発明のポリペプチドに複数のHsc70bm領域が含まれていると、本発明のポリペプチドを、より特異的にHsc70に結合させやすくなる。複数のHsc70bm領域は、タンデムに結合されていてもよいし、タンパク質領域やその他の配列を介して離れていてもよい。
本発明のポリペプチドと、標的タンパク質とを、より特異的に結合させるために、本発明のポリペプチドには、Hsc70bm領域とともに、SUMO−interacting motif(SIM)と呼ばれるアミノ酸配列を含んでいてもよい。「SIM」とは、翻訳後修飾の1種であるSUMO化を受けたタンパク質に結合する小さなタンパク質である「SUMO」に特異的に結合する配列である。本発明のポリペプチドにSIMが含まれていると、SUMO化を受けたタンパク質のみを特異的にリソソームに運搬できる。
例えば、大腸癌の病因は、Wntシグナル経路において蓄積したβ−カテニンが転写因子であるT−cell factor−4(TCF4)と結合して形成された複合体が、標的遺伝子の上流配列に結合し、標的遺伝子の転写を活性化することによって生じる腺腫形成であることが知られている。SUMO E3リガーゼであるRanBP2は、TCF4とともに複合体を形成することでTCF4をSUMO化し、TCF4とβ−カテニンとの結合親和性を増加させる。そのため、Hsc70bm領域とともに、SIMを含む本発明のポリペプチドによれば、SUMO化修飾を受けたTCF4のみを特異的にリソソームに運搬して分解することができるので、TCF4及びβ−カテニンの複合体の核への移行量が抑制され、その結果、標的遺伝子の転写が抑制され、大腸癌細胞の成長を阻害できることが期待される。
本発明のポリペプチドによって、標的タンパク質の量が特異的に低減されたかどうかは、標的タンパク質の量や、タンパク質領域の量を公知の免疫染色等によって検出することで特定できる。標的タンパク質や、タンパク質領域の分解物が認められた場合、標的タンパク質の量が特異的に低減されたものと判断できる。
[タンパク質領域]
本発明におけるタンパク質領域は、任意の標的タンパク質に結合するアミノ酸配列を含むものであれば特に限定されない。このようなタンパク質領域として、具体的には、Tpp1領域(例えば、配列番号9で表されるアミノ酸配列、又は配列番号9と80%以上、85%以上、90%以上、又は95%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列)、抗体、酵素、レクチン、受容体、シグナル伝達タンパク質、基本転写因子、ヒストン、複数のタンパク質が集合して形成されるタンパク質複合体(リボソーム、プロテアソーム、基本転写因子、ヒストン、クロマチン・リモデリング複合体等)を構成するタンパク質等が挙げられる。
本発明におけるタンパク質領域は、任意の標的タンパク質に結合するアミノ酸配列を含むものであれば特に限定されない。このようなタンパク質領域として、具体的には、Tpp1領域(例えば、配列番号9で表されるアミノ酸配列、又は配列番号9と80%以上、85%以上、90%以上、又は95%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列)、抗体、酵素、レクチン、受容体、シグナル伝達タンパク質、基本転写因子、ヒストン、複数のタンパク質が集合して形成されるタンパク質複合体(リボソーム、プロテアソーム、基本転写因子、ヒストン、クロマチン・リモデリング複合体等)を構成するタンパク質等が挙げられる。
Tpp1領域は、Tpp1の全長配列であってもよいが、部分配列であってもよい。例えば、ヒトTpp1(全長544アミノ酸)については、87−251アミノ酸領域を含む部分配列であれば、標的タンパク質であるテロメラーゼに結合できる。同様に、マウスTpp1(全長416アミノ酸)については、1−163アミノ酸領域を含む部分配列であれば、標的タンパク質であるテロメラーゼに結合できる。ヒトTpp1の87−251アミノ酸領域のうち、E168、E169、E171、R180、L183、L212、E215がテロメラーゼとの結合に特に重要である。
上記のタンパク質領域の例示のうち、Tpp1領域とは、テロメア伸長酵素であるテロメラーゼに特異的に結合するタンパク質である。つまり、タンパク質領域がTpp1領域である場合、「標的タンパク質」はテロメラーゼである。癌細胞においては、テロメラーゼが発現することによって、正常細胞においては細胞分裂の度に短縮していくテロメアを伸長させ、細胞が永続的に分裂することが知られる。そのため、本発明のポリペプチドによって、標的タンパク質であるテロメラーゼを分解することで、癌等を治療できることが期待される。
タンパク質領域が抗体である場合、「標的タンパク質」は、該抗体に対する抗原タンパク質である。
タンパク質領域が酵素である場合、「標的タンパク質」は、該酵素の基質タンパク質である。
タンパク質領域がレクチンである場合、「標的タンパク質」は、該レクチンに対応する糖タンパク質である。
タンパク質領域が受容体である場合、「標的タンパク質」は、該受容体に対応するホルモン(ペプチド、タンパク質、糖タンパク質等)、シグナル伝達タンパク質である。
タンパク質領域がシグナル伝達タンパク質である場合、「標的タンパク質」は、該タンパク質に関連するシグナル伝達タンパク質である。
タンパク質領域が基本転写因子である場合、「標的タンパク質」は、該因子に対応するRNAポリメラーゼ及び/又は転写制御因子である。
タンパク質領域がヒストンである場合、「標的タンパク質」は、該ヒストンに関連するヒストン関連タンパク質(ヒストン修飾酵素、ヒストン脱修飾酵素、ヒストン結合タンパク質、ヒストンシャペロン)である。
タンパク質領域が、タンパク質複合体を構成するタンパク質である場合、「標的タンパク質」は、該複合体を構成する他のタンパク質である。
タンパク質領域のアミノ酸配列は、いずれの動物種に由来するものであってもよい。動物種としては、マウス、ヒト、ラット、モルモット等が挙げられる。
タンパク質領域及びHsc70bm領域の位置関係は特に限定されないが、タンパク質領域のC末端側にHsc70bm領域のN末端が配置されていてもよいし、Hsc70bm領域のC末端側にタンパク質領域のN末端が配置されていてもよい。
[その他の領域]
タンパク質領域と、Hsc70bm領域との間(タンパク質領域とHsc70に結合するアミノ酸配列との間)には、リンカー配列及び/又はスペーサー配列等のアミノ酸配列の小断片が介在していてもよい。このような配列の種類や長さを調整することにより、本発明のポリペプチドを、より効率的にHsc70や標的タンパク質に結合させることができる。
タンパク質領域と、Hsc70bm領域との間(タンパク質領域とHsc70に結合するアミノ酸配列との間)には、リンカー配列及び/又はスペーサー配列等のアミノ酸配列の小断片が介在していてもよい。このような配列の種類や長さを調整することにより、本発明のポリペプチドを、より効率的にHsc70や標的タンパク質に結合させることができる。
リンカー配列としては、制限酵素部位を有するもの、蛍光タンパク質を発現するもの等が挙げられる。リンカー配列の長さは、10〜200アミノ酸であってもよい。
スペーサー配列は、特に限定されないが、5〜30アミノ酸のものであってもよい。スペーサー配列が10〜20アミノ酸であると、本発明のポリペプチドを、より効率的にHsc70や標的タンパク質に結合させることができる傾向にある。
本発明のポリペプチドの任意の部位には、HAタグ、Mycタグ、Hisタグ等の公知のタグペプチドが付加されていてもよい。これらのタグを付加することにより、本発明のポリペプチドの発現の検出等を容易に行うことができる。
<本発明のポリペプチドの製造方法>
本発明のポリペプチドは、本発明の属する技術分野において公知の遺伝子組み換え技術によって作製できる。例えば、本発明のポリペプチドをコードする核酸をベクターに組み込み、該ベクターを細胞(ヒト腎臓由来のHEK293細胞等)、大腸菌等に導入することによって、ポリペプチドとして大量に発現させることができる。
本発明のポリペプチドは、本発明の属する技術分野において公知の遺伝子組み換え技術によって作製できる。例えば、本発明のポリペプチドをコードする核酸をベクターに組み込み、該ベクターを細胞(ヒト腎臓由来のHEK293細胞等)、大腸菌等に導入することによって、ポリペプチドとして大量に発現させることができる。
<核酸>
本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸は、本発明の属する技術分野において公知の遺伝子組み換え技術によって作製できる。例えば、アミノ酸配列情報からプライマーを作成し、PCR等によってクローニングしたタンパク質領域をコードする核酸や、Hsc70bm領域をコードする核酸を、ライゲーション反応等によってつなげることにより本発明のポリペプチドをコードする核酸を単離することができる。
本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸は、本発明の属する技術分野において公知の遺伝子組み換え技術によって作製できる。例えば、アミノ酸配列情報からプライマーを作成し、PCR等によってクローニングしたタンパク質領域をコードする核酸や、Hsc70bm領域をコードする核酸を、ライゲーション反応等によってつなげることにより本発明のポリペプチドをコードする核酸を単離することができる。
本願明細書で使用される用語「核酸」には、DNA、RNA等が含まれる。
<組み換えベクター>
本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸を含む組み換えベクターは、本発明の属する技術分野において公知の遺伝子組み換え技術によって作製できる。例えば、任意のプラスミドを、任意の制限酵素で切断し、その切断部位に、本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸を結合させることによって作製できる。
本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸を含む組み換えベクターは、本発明の属する技術分野において公知の遺伝子組み換え技術によって作製できる。例えば、任意のプラスミドを、任意の制限酵素で切断し、その切断部位に、本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸を結合させることによって作製できる。
本願明細書で使用される用語「組み換えベクター」は、組み換えDNA実験等において異種DNAの運搬に使用されるDNAを指す。本発明の組み換えベクターとしては、例えば、本発明のポリペプチドを発現するDNA断片、任意の制限酵素認識部位、任意の複製開始点等を有するクローニングベクターや、本発明のポリペプチドを発現するDNA断片、転写開始点等を有する発現ベクター等が挙げられる。
<形質転換体>
上記の組み換えベクターを含む形質転換体は、本発明の属する技術分野において公知の遺伝子組み換え技術によって作製できる。本願明細書で使用される用語「形質転換体」は、単離された細胞又は非ヒト動物である。細胞としては特に限定されず、任意の細胞株(例えば、ヒト腎臓由来のHEK293細胞等)を使用できる。また、非ヒト動物としては特に限定されず、大腸菌、哺乳類(マウス、ラット等)、モデル動物等を使用できる。
上記の組み換えベクターを含む形質転換体は、本発明の属する技術分野において公知の遺伝子組み換え技術によって作製できる。本願明細書で使用される用語「形質転換体」は、単離された細胞又は非ヒト動物である。細胞としては特に限定されず、任意の細胞株(例えば、ヒト腎臓由来のHEK293細胞等)を使用できる。また、非ヒト動物としては特に限定されず、大腸菌、哺乳類(マウス、ラット等)、モデル動物等を使用できる。
本発明の形質転換体は、例えば、単離された細胞に、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、ウイルス等によって組み換えベクターを導入することによって、単離された細胞の形質転換体が得られる。また、非ヒト動物の受精卵前核中へDNA顕微注入、ES細胞への相同組み換え、組み換えウイルスによる感染等を行うことによって非ヒト動物の形質転換体が得られる。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
<プラスミドの構築>
下記の方法にしたがい、プラスミドを作製した。使用したプライマーの塩基配列を、表1に示す。
下記の方法にしたがい、プラスミドを作製した。使用したプライマーの塩基配列を、表1に示す。
プラスミドの調製に使用したマウスのTpp1(以下、「mTpp1」という。)の全塩基配列及び全アミノ酸配列を表2に示す。
プラスミドの調製に使用したHsc70bm領域の全塩基配列及び全アミノ酸配列を表3に示す。
[pcDNA3.1/mycHisC−mTpp1プラスミドの構築]
mTpp1(マウスTpp1の1−416アミノ酸領域)をコードするDNA断片をpGADT7ベクター(Clontech)にクローニングしたプラスミドを鋳型として、QuikChange Lightning Multi enzyme blend(Agilent Technologies)、及び、表1に示した2種のプライマー(MPTOP1BASEF、MPTOP1248BASEF)を用いて、(95℃で1分間)×1サイクル、(95℃で20秒間熱変性、55℃で30秒間アニーリング、65℃で6分間伸長)×30サイクル、(65℃で5分間)×1サイクルでPCRにより増幅した。こうして、5’末端にEcoRI及びKozak配列、3’末端にNotIを含むmTpp1(1−416)遺伝子をクローニングしたプラスミドの取得を目指した。
mTpp1(マウスTpp1の1−416アミノ酸領域)をコードするDNA断片をpGADT7ベクター(Clontech)にクローニングしたプラスミドを鋳型として、QuikChange Lightning Multi enzyme blend(Agilent Technologies)、及び、表1に示した2種のプライマー(MPTOP1BASEF、MPTOP1248BASEF)を用いて、(95℃で1分間)×1サイクル、(95℃で20秒間熱変性、55℃で30秒間アニーリング、65℃で6分間伸長)×30サイクル、(65℃で5分間)×1サイクルでPCRにより増幅した。こうして、5’末端にEcoRI及びKozak配列、3’末端にNotIを含むmTpp1(1−416)遺伝子をクローニングしたプラスミドの取得を目指した。
得られた反応溶液をDpnI処理後、大腸菌XL10−Goldに導入し、複数のクローンを得た。該クローン(pGADT7−mTpp1(1−416))及びpcDNA3.1/mycHisCベクター(Invitrogen、このベクターは発現ベクターに相当する。)をEcoRIとNotIで切断し、得られたDNA断片を、Ligation high ver.2(TOYOBO)を用いてライゲーションし、大腸菌DH5αに導入し、複数のクローンを得た。該クローンを用いてプラスミドDNAを調製し、pcDNA3.1/mycHisC−mTpp1プラスミドを得た。
[Tpp1−Hsc70bm(−)HAプラスミドの構築]
表1に示したオリゴヌクレオチド(Hsc70bmF2、Hsc70bmR2)を等量ずつ混合し、90℃で5分間静置した後、一晩徐冷しHsc70bmを2個含むオリゴヌクレオチドを作製した。pcDNA3.1/mycHisC−mTpp1プラスミドをNspVとXhoIで切断した。得られたDNA断片を、Ligation high ver.2(TOYOBO)を用いて上記オリゴヌクレオチドとライゲーションし、大腸菌DH5αに導入し、複数のクローンを得た。該クローンを用いてプラスミドを調製し、Tpp1−Hsc70bm(−)HAプラスミドを得た。Tpp1−Hsc70bm(−)HAプラスミドに挿入された遺伝子の構造を図1(A)に示す。図1(A)中、「5aa」、「6aa」とは、それぞれスペーサー配列を示す。「5aa」の配列はAAARG(配列番号16)であり、「6aa」の配列はAGAAAP(配列番号17)である。
表1に示したオリゴヌクレオチド(Hsc70bmF2、Hsc70bmR2)を等量ずつ混合し、90℃で5分間静置した後、一晩徐冷しHsc70bmを2個含むオリゴヌクレオチドを作製した。pcDNA3.1/mycHisC−mTpp1プラスミドをNspVとXhoIで切断した。得られたDNA断片を、Ligation high ver.2(TOYOBO)を用いて上記オリゴヌクレオチドとライゲーションし、大腸菌DH5αに導入し、複数のクローンを得た。該クローンを用いてプラスミドを調製し、Tpp1−Hsc70bm(−)HAプラスミドを得た。Tpp1−Hsc70bm(−)HAプラスミドに挿入された遺伝子の構造を図1(A)に示す。図1(A)中、「5aa」、「6aa」とは、それぞれスペーサー配列を示す。「5aa」の配列はAAARG(配列番号16)であり、「6aa」の配列はAGAAAP(配列番号17)である。
[Tpp1−Hsc70bm(+)HAプラスミドの構築]
Tpp1−Hsc70bm(−)HAプラスミドを鋳型として、QuikChange Lightning Multi enzyme blend(Agilent Technologies)、表1に示したプライマー(mTppHAtagHsc70bmF)を用いて、(95℃で2分間)×1サイクル、(95℃で20秒間熱変性、55℃で30秒間アニーリング、65℃で4分間伸長)×30サイクル、(95℃で2分間)×1サイクルでPCRにより増幅した。こうして、mTpp1とHsc70bmの間にHA tag配列を含む遺伝子をクローニングしたプラスミドの取得を目指した。得られた反応溶液をDpnI処理後、大腸菌XL10−Goldに導入し、複数のクローンを得た。該クローンを用いてプラスミドを調製し、Tpp1−Hsc70bm(+)HAプラスミドを得た。Tpp1−Hsc70bm(+)HAプラスミドに挿入された遺伝子の構造を図1(B)に示す。図1(B)中、「12aa」、「6aa」とは、それぞれスペーサー配列を示す。「12aa」の配列はAAARGYDVPDYA(配列番号18)であり、「6aa」の配列はAGAAAPである。
Tpp1−Hsc70bm(−)HAプラスミドを鋳型として、QuikChange Lightning Multi enzyme blend(Agilent Technologies)、表1に示したプライマー(mTppHAtagHsc70bmF)を用いて、(95℃で2分間)×1サイクル、(95℃で20秒間熱変性、55℃で30秒間アニーリング、65℃で4分間伸長)×30サイクル、(95℃で2分間)×1サイクルでPCRにより増幅した。こうして、mTpp1とHsc70bmの間にHA tag配列を含む遺伝子をクローニングしたプラスミドの取得を目指した。得られた反応溶液をDpnI処理後、大腸菌XL10−Goldに導入し、複数のクローンを得た。該クローンを用いてプラスミドを調製し、Tpp1−Hsc70bm(+)HAプラスミドを得た。Tpp1−Hsc70bm(+)HAプラスミドに挿入された遺伝子の構造を図1(B)に示す。図1(B)中、「12aa」、「6aa」とは、それぞれスペーサー配列を示す。「12aa」の配列はAAARGYDVPDYA(配列番号18)であり、「6aa」の配列はAGAAAPである。
[Tpp1−Hsc70bm3プラスミドの構築]
表1に示したオリゴヌクレオチド(Hsc70bmF3、Hsc70bmR3)を等量ずつ混合し、90℃、5分間静置した後、一晩徐冷しHsc70bmを4個含むオリゴヌクレオチドを作製した。pcDNA3.1/mycHisC−mTpp1プラスミドをNspVとXhoIで切断した。得られたDNA断片を、Ligation high ver.2(TOYOBO)を用いて上記オリゴヌクレオチドとライゲーションし、大腸菌DH5αに導入し、複数のクローンを得た。該クローンを用いてプラスミドを調製し、Tpp1−Hsc70bm3プラスミドを得た。Tpp1−Hsc70bm3プラスミドに挿入された遺伝子の構造を図1(C)に示す。図1(C)中、「5aa」、「6aa」とは、それぞれスペーサー配列を示す。「5aa」の配列はAAARGであり、「6aa」の配列はAGAAAPである。
表1に示したオリゴヌクレオチド(Hsc70bmF3、Hsc70bmR3)を等量ずつ混合し、90℃、5分間静置した後、一晩徐冷しHsc70bmを4個含むオリゴヌクレオチドを作製した。pcDNA3.1/mycHisC−mTpp1プラスミドをNspVとXhoIで切断した。得られたDNA断片を、Ligation high ver.2(TOYOBO)を用いて上記オリゴヌクレオチドとライゲーションし、大腸菌DH5αに導入し、複数のクローンを得た。該クローンを用いてプラスミドを調製し、Tpp1−Hsc70bm3プラスミドを得た。Tpp1−Hsc70bm3プラスミドに挿入された遺伝子の構造を図1(C)に示す。図1(C)中、「5aa」、「6aa」とは、それぞれスペーサー配列を示す。「5aa」の配列はAAARGであり、「6aa」の配列はAGAAAPである。
<細胞培養及びトランスフェクション>
下記の方法で、上記で調製した各プラスミドを、293T細胞(ヒト胎児腎細胞)にトランスフェクションした。
下記の方法で、上記で調製した各プラスミドを、293T細胞(ヒト胎児腎細胞)にトランスフェクションした。
[細胞培養用培地の調製]
293T細胞の継代に使用した細胞培養用培地の組成は下記のとおりである。
293T細胞の継代に使用した細胞培養用培地の組成は下記のとおりである。
[トランスフェクション用培地の調製]
トランスフェクションにおいて使用したトランスフェクション用培地は、Opti−MEM(商標)I(1×)+GlutaMAX(商標)−I(Gibco)である。
トランスフェクションにおいて使用したトランスフェクション用培地は、Opti−MEM(商標)I(1×)+GlutaMAX(商標)−I(Gibco)である。
[細胞の調製方法]
液体窒素中に保存された293T細胞を常温の水浴中で5分間静置し、解凍した。細胞培養用培地9mlと細胞液1mlとを混合し、4℃、3000rpmで、2分間遠心分離を行い、上清を除去して細胞ペレットを作製した。該ペレットに細胞培養用培地10mlを加え懸濁した後、100mm×20mm細胞用ディッシュに播種し5.0%CO2、37℃で培養した。
液体窒素中に保存された293T細胞を常温の水浴中で5分間静置し、解凍した。細胞培養用培地9mlと細胞液1mlとを混合し、4℃、3000rpmで、2分間遠心分離を行い、上清を除去して細胞ペレットを作製した。該ペレットに細胞培養用培地10mlを加え懸濁した後、100mm×20mm細胞用ディッシュに播種し5.0%CO2、37℃で培養した。
[トランスフェクション]
上記で調製された80〜90%コンフルエントの細胞を、PBSバッファー 10mlで2回洗い、0.25%−Trypsin/1mM−EDTA溶液(ナカライテスク)1mlを加え、37℃、5分間保温後に細胞培養用培地10mlを加えて細胞を剥がした。得られた細胞を、血球計算板を用いて4.0×105cells/mlに調製し、6ウェルプレートに播種し、5.0%CO2、37℃で24時間培養後、細胞をPBSバッファーで2回洗い、OptiMEM I+GlutaMax(Gibco)を各ウェルに1.5ml加えた。次いで、各ウェルあたり、各プラスミド 8.0μg(トランスフェクション用培地250μl中で混合させたもの)及びLipofectamine2000 20μl(Invitorogen)の混合物(室温で20分間静置したもの)を添加し、5.0%CO2、37℃で4時間培養した。
上記で調製された80〜90%コンフルエントの細胞を、PBSバッファー 10mlで2回洗い、0.25%−Trypsin/1mM−EDTA溶液(ナカライテスク)1mlを加え、37℃、5分間保温後に細胞培養用培地10mlを加えて細胞を剥がした。得られた細胞を、血球計算板を用いて4.0×105cells/mlに調製し、6ウェルプレートに播種し、5.0%CO2、37℃で24時間培養後、細胞をPBSバッファーで2回洗い、OptiMEM I+GlutaMax(Gibco)を各ウェルに1.5ml加えた。次いで、各ウェルあたり、各プラスミド 8.0μg(トランスフェクション用培地250μl中で混合させたもの)及びLipofectamine2000 20μl(Invitorogen)の混合物(室温で20分間静置したもの)を添加し、5.0%CO2、37℃で4時間培養した。
<細胞からのタンパク質抽出>
細胞をPBSバッファーで2回洗い、M−PER(Mammalian Protein Extraction Reagent、Thermo SCIENTIFIC)200μl/well(後述するオートファジー阻害剤を添加する場合は、50μl/well)を加えて、ピペッティングにより細胞を破砕した。破砕物をチューブに入れ、小型回転培養機にて5分間反応させた後、4℃、14000g、10分間遠心分離し、ペレット以外の上清を抽出されたタンパク質として回収した。
細胞をPBSバッファーで2回洗い、M−PER(Mammalian Protein Extraction Reagent、Thermo SCIENTIFIC)200μl/well(後述するオートファジー阻害剤を添加する場合は、50μl/well)を加えて、ピペッティングにより細胞を破砕した。破砕物をチューブに入れ、小型回転培養機にて5分間反応させた後、4℃、14000g、10分間遠心分離し、ペレット以外の上清を抽出されたタンパク質として回収した。
<タンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動>
各タンパク質をサンプルバッファー中に溶かし、トリシン系緩衝液(陽極バッファー、又は陰極バッファー)中で、室温、定電流下(30mA)で泳動した。
各タンパク質をサンプルバッファー中に溶かし、トリシン系緩衝液(陽極バッファー、又は陰極バッファー)中で、室温、定電流下(30mA)で泳動した。
各バッファー及びゲルの組成は下記のとおりである。
<ウエスタンブロット及び免疫染色>
上記ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後、ゲル上のタンパク質を、ウエスタンブロット及び免疫染色によって検出した。
上記ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後、ゲル上のタンパク質を、ウエスタンブロット及び免疫染色によって検出した。
[ウエスタンブロット(セミドライ式)]
SDS−PAGE後のゲル上のタンパク質を、室温、定電流下(1.3mA/cm2)で、Immobilon−FL Membrane(MILLIPORE)へ一時間転写した。転写の際には、ブロッティングバッファーA乃至Cを使用した。転写後のメンブレンは1×PBSで洗浄し、ブロッキングバッファーに一晩浸した。ブロッキングされたメンブレンは、一次抗体溶液(一次抗体 5μl、0.1% SDS、0.1% カゼイン/1×PBS)5mlで一時間免疫染色した後、0.1% PBSTで洗浄した。さらに遮光条件下で、二次抗体溶液(二次抗体 5μl、0.1% SDS、0.1% カゼイン/1×PBS)5mlで一時間免疫染色した後、0.1% PBST、1×PBSで洗浄した。タンパク質の検出は、Infrared Imaging System Odyssey(LI−COR)を用いて700nm又は800nmで行った。
SDS−PAGE後のゲル上のタンパク質を、室温、定電流下(1.3mA/cm2)で、Immobilon−FL Membrane(MILLIPORE)へ一時間転写した。転写の際には、ブロッティングバッファーA乃至Cを使用した。転写後のメンブレンは1×PBSで洗浄し、ブロッキングバッファーに一晩浸した。ブロッキングされたメンブレンは、一次抗体溶液(一次抗体 5μl、0.1% SDS、0.1% カゼイン/1×PBS)5mlで一時間免疫染色した後、0.1% PBSTで洗浄した。さらに遮光条件下で、二次抗体溶液(二次抗体 5μl、0.1% SDS、0.1% カゼイン/1×PBS)5mlで一時間免疫染色した後、0.1% PBST、1×PBSで洗浄した。タンパク質の検出は、Infrared Imaging System Odyssey(LI−COR)を用いて700nm又は800nmで行った。
各バッファーの組成は下記のとおりである。
1次抗体及び2次抗体は下記のものを使用した。
<実施例1:mTpp1の分解効率の検討>
mTpp1領域及びHsc70bm領域を含む融合タンパク質が発現した場合、Hsc70bm領域と分子シャペロンであるHsc70とが結合し、シャペロン介在性オートファジーの作用により、該結合体がリソソームまで運搬される。その結果、該結合体はリソソーム内のプロテアーゼによって分解される。したがって、シャペロン介在性オートファジーが生じたかどうかは、mTpp1の分解物を検出することによって確認できる。そこで、本実施例においては、シャペロン介在性オートファジーが生じるかどうかを検討するために、下記の方法にしたがい、上記で調製した各プラスミドを使用して発現させたmTpp1の分解物を検出し、その分解効率を算出した。
mTpp1領域及びHsc70bm領域を含む融合タンパク質が発現した場合、Hsc70bm領域と分子シャペロンであるHsc70とが結合し、シャペロン介在性オートファジーの作用により、該結合体がリソソームまで運搬される。その結果、該結合体はリソソーム内のプロテアーゼによって分解される。したがって、シャペロン介在性オートファジーが生じたかどうかは、mTpp1の分解物を検出することによって確認できる。そこで、本実施例においては、シャペロン介在性オートファジーが生じるかどうかを検討するために、下記の方法にしたがい、上記で調製した各プラスミドを使用して発現させたmTpp1の分解物を検出し、その分解効率を算出した。
トランスフェクションから4時間後に、培地を(1)細胞培養用培地のみ、(2)細胞培養用培地及び50mM NH4Cl、(3)細胞培養用培地及び15mM NH4Cl及び100μM クロロキンのいずれかに交換した。NH4Cl及びクロロキンは、いずれもシャペロン介在性オートファジー阻害剤である。
トランスフェクションから24時間後にM−PER 200μlを用いて、上記の方法によって抽出したタンパク質をSDS−PAGEで分離し、ウエスタンブロッティング後、免疫染色でタンパク質を検出した。その結果を図2(B)に示す。なお、内部標準としてβ−アクチンを使用した。
図2(B)において、最も左端のレーンは、pcDNA3.1/mycHisC −mTpp1プラスミドを使用して発現させたmTpp1(つまり、Hsc70bmを含まないタンパク質)を使用した結果である。
図2(B)において、最も右端のレーンは、pcDNA3.1/mycHisCベクター(発現ベクター)を使用して発現させたタンパク質(つまり、mTpp1及びHsc70bmを含まないタンパク質)を使用した結果である。
図2(B)において、左側の1乃至3レーンは、Tpp1−Hsc70bm(−)HAプラスミドを使用し、かつ、上記(1)乃至(3)のいずれかの培地を使用した結果を示す。
図2(B)において、真ん中の1乃至3レーンは、Tpp1−Hsc70bm(+)HAプラスミドを使用し、かつ、上記(1)乃至(3)のいずれかの培地を使用した結果を示す。
図2(B)において、右側の1乃至3レーンは、Tpp1−Hsc70bm3プラスミドを使用し、かつ、上記(1)乃至(3)のいずれかの培地を使用した結果を示す。
図2(B)において、最も右端のレーンは、pcDNA3.1/mycHisCベクター(発現ベクター)を使用して発現させたタンパク質(つまり、mTpp1及びHsc70bmを含まないタンパク質)を使用した結果である。
図2(B)において、左側の1乃至3レーンは、Tpp1−Hsc70bm(−)HAプラスミドを使用し、かつ、上記(1)乃至(3)のいずれかの培地を使用した結果を示す。
図2(B)において、真ん中の1乃至3レーンは、Tpp1−Hsc70bm(+)HAプラスミドを使用し、かつ、上記(1)乃至(3)のいずれかの培地を使用した結果を示す。
図2(B)において、右側の1乃至3レーンは、Tpp1−Hsc70bm3プラスミドを使用し、かつ、上記(1)乃至(3)のいずれかの培地を使用した結果を示す。
mTpp1の分解効率は、図2(B)の各レーンにおける「Tpp1分解産物」のバンド強度の合計値を、バンド強度の合計値で割ることによって求めた。その結果を図2(A)に示す。
図2(A)及び(B)の各レーン1に示されるとおり、Tpp1−Hsc70bm(−)HAプラスミド、Tpp1−Hsc70bm(+)HAプラスミド及びTpp1−Hsc70bm3プラスミドのいずれのプラスミドを使用しても、mTpp1の分解効率は高かった(それぞれ、23.5%、30.5%、33.0%)。他方、オートファジー阻害剤の存在下で細胞培養して得られたタンパク質を示す図2(A)及び(B)の各レーン2及び3においては、mTpp1の分解効率が低かったことから、これらのレーンにおいては、オートファジーが阻害され、mTpp1の分解が生じなかったことがわかる。つまり、図2(A)及び(B)の各レーン1において認められたmTpp1の分解は、シャペロン介在性オートファジーによるものであることがわかる。
また、Tpp1−Hsc70bm(−)HAプラスミドを使用した結果と、Tpp1−Hsc70bm(+)HAプラスミドを使用した結果とを比較すると、mTpp1とHsc70bmの間のスペーサー配列が長い後者のプラスミドの方が高い分解効率を示した。
Tpp1−Hsc70bm(−)HAプラスミドを使用した結果と、Tpp1−Hsc70bm3プラスミドを使用した結果とを比較すると、付加されたHsc70bmの数が2個多い後者のプラスミドの方が高い分解効率を示した。
<実施例2:シャペロン介在性オートファジー作用に関する検討>
実施例1で認められたオートファジーが、シャペロン介在性オートファジーによるものかどうかを確認するため、シャペロン介在性オートファジー以外の経路のオートファジー阻害剤の存在下で実施例1同様の試験を行った。
実施例1で認められたオートファジーが、シャペロン介在性オートファジーによるものかどうかを確認するため、シャペロン介在性オートファジー以外の経路のオートファジー阻害剤の存在下で実施例1同様の試験を行った。
具体的には、トランスフェクションから4時間後に、培地を(1)細胞培養用培地のみ、(2)細胞培養用培地及び10mM又は50mMの3−MA、(3)細胞培養用培地及び5μM又は50μMのMG132のいずれかに交換した。3−MA(3−メチルアデニン)は、マクロオートファジー阻害剤である。MG132は、ユビキチン・プロテアソーム分解系阻害剤である。
トランスフェクションから24時間後にM−PER 200μlを用いて、上記の方法によって回収したタンパク質をSDS−PAGEで分離し、ウエスタンブロッティング後、免疫染色でタンパク質を検出した。その結果に基づき、実施例1同様にTpp1の分解効率を算出した結果を図3に示す。なお、図3において、「Tpp1」は、pcDNA3.1/mycHisC−mTpp1プラスミドを使用して発現させたmTpp1(つまり、Hsc70bmを含まないタンパク質)を使用した結果である。「Tpp1−Hsc70bm(+)HA」、「(+)NH4Cl」、「(+)NH4Cl,クロロキン」は、それぞれ、図2(A)の真ん中の1乃至3レーンと同一の結果である。
図3に示されるとおり、シャペロン介在性オートファジー機構以外のタンパク質分解に対する阻害剤(3−MA、及びMG132)を添加した場合には、シャペロン介在性オートファジー阻害剤(NH4Cl、及びクロロキン)を添加した時と比較して、mTpp1の分解効率が低下しなかった。つまり、実施例1で認められたmTpp1の分解は、主にシャペロン介在性オートファジー作用によって生じたものであることがわかる。
Claims (7)
- 標的タンパク質に特異的に結合するアミノ酸配列を含むタンパク質領域と、
Hsc70に結合するアミノ酸配列と、
を少なくとも含むアミノ酸配列からなるポリペプチド。 - 前記タンパク質領域は、Tpp1領域である、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記タンパク質領域と、前記Hsc70に結合するアミノ酸配列との間にリンカー配列及び/又はスペーサー配列が介在する請求項1又は2に記載のポリペプチド。
- 前記Hsc70に結合するアミノ酸配列を複数含む請求項1から3のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 請求項1から4のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸。
- 請求項5に記載の核酸を含む組み換えベクター。
- 請求項6に記載の組み換えベクターを含み、単離された細胞又は非ヒト動物である形質転換体。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2014045698A JP2015167527A (ja) | 2014-03-07 | 2014-03-07 | 標的タンパク質の量の低減のためのポリペプチド、単離された核酸、組み換えベクター、及び形質転換体 |
PCT/JP2015/056670 WO2015133611A1 (ja) | 2014-03-07 | 2015-03-06 | 標的タンパク質の量の低減のためのポリペプチド、単離された核酸、組み換えベクター、及び形質転換体 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2014045698A JP2015167527A (ja) | 2014-03-07 | 2014-03-07 | 標的タンパク質の量の低減のためのポリペプチド、単離された核酸、組み換えベクター、及び形質転換体 |
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EP1757306A4 (en) * | 2004-04-09 | 2010-05-19 | Genecare Res Inst Co Ltd | AGENT INDUCING APOPTOSIS SPECIFIC TO CARCINOMA CELLS TARGETING A GENE INVOLVED IN STABILIZING CHROMOSOMES |
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2014
- 2014-03-07 JP JP2014045698A patent/JP2015167527A/ja active Pending
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2015
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