WO2017204561A2 - 리포터 모이어티, 기질 모이어티 및 탈안정화 모이어티를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드, 그를 포함하는 숙주세포, 및 그의 용도 - Google Patents

리포터 모이어티, 기질 모이어티 및 탈안정화 모이어티를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드, 그를 포함하는 숙주세포, 및 그의 용도 Download PDF

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    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Definitions

  • Proteases are enzymes that perform proteolysis. Proteases hydrolyze peptide bonds that link amino acids together in a polypeptide chain. Proteases may include neurotoxins. Clostridium botulinum and Clostridium tetani produce very potent neurotoxins: botulinum toxin (BoNT) and tetanus toxin (TeNT). These Clostridial neurotoxins specifically bind to neuronal cells and inhibit the release of neurotransmitters. Some proteases, such as neurotoxins, have very strong toxicity and are present in very small amounts, requiring a safe and accurate method of measuring their activity.
  • One aspect is a reporter moiety; A destabilizing moiety and a substrate moiety that operably links said reporter moiety with said destabilizing moiety, wherein said substrate moiety comprises a cleavage site of protease activity.
  • a recombinant polynucleotide comprising a first polynucleotide encoding a polypeptide.
  • Another aspect provides a host cell comprising the recombinant polynucleotide described above.
  • Another aspect is a proteolytic activity of a protease polypeptide comprising a polypeptide encoded by the recombinant polynucleotide described above and a detection agent for measuring a signal emitted by a reporter moiety or internal standard reporter or product thereof. kits for determining proteolytic activity are provided.
  • Another aspect is a proteolytic activity of a protease polypeptide comprising a host cell comprising the recombinant polynucleotide described above and a detection agent for measuring a signal emitted by a reporter moiety or internal standard reporter or product thereof. kits for determining proteolytic activity are provided.
  • Another aspect includes contacting a polypeptide encoded by a recombinant polynucleotide described above with a sample suspected of containing a protease polypeptide; And measuring the signal emitted from the reporter moiety or product thereof in the product contacted, providing a method for determining the protease activity of a protease polypeptide in a sample.
  • Another aspect includes contacting said host cell with a sample suspected of containing a protease polypeptide; And measuring the signal emitted from the reporter moiety or the internal standard reporter or product thereof in the contacted product, providing a method for determining the protease activity of a protease polypeptide in a sample.
  • Another aspect includes contacting a polypeptide encoded by a recombinant polynucleotide described above with a protease polypeptide; Measuring a signal emitted from the reporter moiety or product thereof in contacted product; And determining at least one of a start point, and a duration of release of the signal from the measured signal.
  • Another aspect includes contacting said host cell with a protease polypeptide; Measuring a signal emitted from the reporter moiety, the internal standard reporter or a product thereof in contacted product; And determining at least one of a start point, and a duration of release of the signal from the measured signal.
  • a first aspect is reporter moiety; A destabilizing moiety and a substrate moiety that operably links said reporter moiety with said destabilizing moiety, wherein said substrate moiety comprises a cleavage site of protease activity.
  • a recombinant polynucleotide comprising a first polynucleotide encoding a polypeptide.
  • the reporter moiety may be a substance that emits a detectable signal or emits a substance (hereinafter also referred to as a "product") that emits a detectable signal in a reaction catalyzed by it.
  • the reporter moiety may be selected from the group consisting of fluorescent protein, ⁇ -lactamase, ⁇ -galactosidase, alkaline phosphatase, chloramphenicol acetyaltransferase, ⁇ -glucuronidase, peroxidase, and luciferase
  • the fluorescent protein is GFP, YFP, Citrine, It may be selected from the group consisting of CFP, RFP, Kaede, PA-GFP, Emerald, Venus, DsRed, mHoneydew, mBanana, mOrange, tdTomato, mTangerine, mStrawberry, mCherry, mRasberry, mPlum, ZsGreen, and ZsYellow proteins.
  • the destabilizing moiety may have a property of reducing expression of the first polynucleotide in a cell as compared to its absence.
  • the expression may be at the mRNA level or at the protein level.
  • the destabilizing moiety may be to promote degradation of mRNA or protein expressed from the first polynucleotide in the cell.
  • the destabilizing moiety may be a fusion protein of PEST, CL1 or PEST and CL1.
  • the protease may be of bacterial origin.
  • the bacterium may be of the genus Clostrium.
  • the protease may be a neurotoxin polypeptide.
  • the protease may be an endoprotease.
  • the neurotoxin polypeptide is botulinum toxin serotype A (BoNT / A), BoNT / B, BoNT / C, BoNT / D, BoNT / CD, BoNT / DC, BoNT / E, BoNT / F, BoNT / FA, BoNT / G, Tetanus neurotoxin (TeNT), or variants thereof.
  • the protease may be to cleave a cleavage site in the substrate moiety.
  • the cleavage site may be a site recognized and cleaved by the protease.
  • the amino acid sequence of each botulinum toxin serum type and the polynucleotides encoding it are known.
  • the amino acid sequence of the botulinum toxin serum type and the polynucleotide encoding it may be, for example, having the sequence set forth in SEQ ID NOs 1 to 14 of WO2004-031355.
  • the cleavage site may be a peptide substrate that can be cleaved at a particular cleavage site by a protease.
  • the cleavage site may be, for example, a cleavage site recognized and cleaved by an endogenous protease of neurotoxin.
  • the cleavage site of the neurotoxin may be naturally occurring or artificially made.
  • Neurotoxin cleavage sites may be derived from proteins that are recognized and cleaved by, for example, BoNT / A, BoNT / E protease, or variants thereof.
  • the protein may be SNAP-25, isoform, paralog, or ortholog thereof.
  • SNAP-25 may be of human, rat, mouse, bovine, danio, carassius, xenopus, torpedo, strongylocentrotus, loligo, lymnaea or aplysia.
  • SNAP-25 may be SNAP-25A or SNAP-25B.
  • the neurotoxin cleavage site may also be derived from a protein that is recognized and cleaved by, for example, BoNT / B, BoNT / D, BoNT / F, BoNT / G protease, or variants thereof.
  • the protein may be VAMP, its isoform, paralog, or ortholog.
  • the protein is VAMP, its isoform, paralog, or ortholog, for example, human or mouse VAMP-1, VAMP-2, VAMP-3 / cellubravin, bovine VAMP-2, rat VAMP-2 or VAMP- 3, chicken VAMP-1, VAMP-2 or VAMP-3, Torpedo VAMP-1, Strongylocentrotus VAMP, Drosophila sybA, synB, synC, synD, or syn, Hirudo VAMP, Xenopus VAMP-2 or VAMP-3, Danio VAMP- 1 or VAMP-2, Loligo VAMP, Lymnaea VAMP, Aplysia VAMP or Caenorhabditis SNB1-like.
  • the neurotoxin cleavage site may be derived from a protein that is recognized and cleaved by a BoNT / C protease, or variant thereof.
  • the protein may be Syntaxin or an ortholog, paralog, homolog thereof.
  • the protein may be, for example, Syntaxin 1A, Syntaxin 1B1, Syntaxin 2-1, Syntaxin 2-2, Syntaxin 2-3, Syntaxin 3A or Syntaxin 1B2, bovine or rat Syntaxin 1A, Syntaxin 1B1 or Syntaxin 1B2, rat Syntaxin 2 or Rat syntaxin 3, mouse Syntaxin 1A, Syntaxin 1B1, Syntaxin 1B2, Syntaxin 2, Syntaxin 3A, Syntaxin 3B or Syntaxin 3C, chicken Syntaxin 1A or Syntaxin 2; Xenopus Syntaxin 1A or Syntaxin 1B, Danio Syntaxin 1A, Syntaxin 1B or Syntaxin 3, Torpedo Syntaxin 1A or Syntaxin 1B, Strongylocentrotus Syntaxin 1A or Syntaxin 1B, Drosophila Syntaxin 1A or Syntaxin 1B, Hirudo Syntaxin 1A or Synoligo Syninin 1A or Syntaxin Synin 1B, Lymnaea
  • the recombinant polynucleotide may be one containing a regulatory sequence that allows the first polynucleotide to be expressed in a cell.
  • the recombinant polynucleotide may be an expressible recombinant polynucleotide.
  • the regulatory sequence may be a promoter, enhancer, terminator sequence, or a combination thereof.
  • the cell may be one capable of binding to and internalizing the protease.
  • the protease is a neurotoxin polypeptide
  • the cell may be configured to bind to, internalize, release within the cell, or a combination thereof.
  • the cell may be addicted to neurotoxin in Clostrium.
  • the neurotoxin polypeptide is botulinum toxin serotype A (BoNT / A), BoNT / B, BoNT / C, BoNT / D, BoNT / CD, BoNT / DC, BoNT / E, BoNT / F, BoNT / FA, BoNT / G, Tetanus neurotoxin (TeNT), or variants thereof.
  • the cell may be an endocrine cell or the like.
  • the cells may be primary neurons, neuroblastoma cells, or neurons differentiated from pluripotent stem cells.
  • the recombinant polynucleotide may be a vector.
  • the vector may be an expression vector.
  • the vector may be a viral vector, a plasmid vector, or a linear nucleic acid construct.
  • the recombinant polynucleotide may further comprise a bicistronic sequence linked upstream or downstream of the first polynucleotide.
  • the non-cistron sequence may be a nucleotide sequence that enables 5'-cap independently tanslate translation.
  • the non-cistron sequence may be a nucleotide sequence that allows the ribosome to synthesize two or more polypeptides from an mRNA with one 5'-cap during translation to synthesize the polypeptide from the mRNA.
  • the bicistron sequence may be an internal ribosomal entry site (IRES) or a nucleotide sequence that causes the ribosomes to skip forming peptide bonds.
  • Bicistron sequences that allow the ribosomes to skip forming peptide bonds are polynucleotide sequences that encode P2A, T2A, E2A, or F2A (eg, SEQ ID NOs: 13, 20, 22, or 24) (eg, SEQ ID NO: 5, 19, 21, or 23).
  • the recombinant polynucleotide may also further comprise a polynucleotide encoding an internal standard reporter operably linked upstream or downstream of the non-cistron sequence.
  • the internal standard reporter may be different from the reporter moiety.
  • the internal standard reporter may be a substance that emits a detectable signal or converts into a substance that emits a detectable signal in a reaction catalyzed by it.
  • the internal standard reporter may be selected from the group consisting of fluorescent protein, ⁇ -lactamase, ⁇ -galactosidase, alkaline phosphatase, chloramphenicol acetyaltransferase, ⁇ -glucuronidase, peroxidase and luciferase.
  • the fluorescent protein is GFP, YFP, Citrine, CFP, RFP, Kaede, PA-GFP, Emerald, Venus, DsRed, mHoneydew, mBanana, mOrange, tdTomato, mTangerine, mStrawberry, mCherry, mRasberry, mPlum, ZsGreen, and ZsYellow proteins It may be selected from the group consisting of.
  • FIG. 1 is a diagram showing the structure of a recombinant polynucleotide according to one aspect.
  • R, S, and D represent nucleotide sequences encoding reporter moiety, substrate moiety, and destabilization moiety, respectively.
  • I, and B represent nucleotide sequences encoding internal standard reporters, and bicistronic sequences, respectively.
  • the recombinant polynucleotides are described in the order of 5 '-> 3 from left to right.
  • the recombinant polynucleotide may have a structure of R-S-D.
  • the recombinant polynucleotide has a nucleotide sequence in which an additional -S- structure is linked between R and D, encoding two or more, for example, three, or four, substrate moieties.
  • -D structures may also include two or more, for example three, or four or more destabilizing moieties.
  • the recombinant polynucleotide has a structure of I-B-R-S-D.
  • the recombinant polynucleotide is a nucleotide sequence that encodes two or more, for example, 3, or 4 or more internal standard reporters, with the additional -IB- structure linked to the 5 'position. It may include.
  • the recombinant polynucleotide may have a structure of R-S-D-B-I.
  • this structure is exemplary, and the recombinant polynucleotide has a nucleotide sequence that encodes two or more, eg, 3, or 4, internal standard reporters, with the additional -BI- structure linked to the 3 'position. It may include.
  • FIG. 2 is a diagram showing the structure of a recombinant polynucleotide according to one aspect and the reaction of a polypeptide and a protease expressed thereby.
  • a polypeptide expressed by a recombinant polynucleotide according to one aspect is cleaved at the cleavage site of the substrate moiety in the presence of a protease, fragmented into the reporter moiety fragment and the rest.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating a case where a recombinant polynucleotide is contacted with a protease in a cell according to one aspect.
  • a polypeptide expressed by a recombinant polynucleotide according to one aspect is cleaved at the cleavage site of the substrate moiety in the presence of a protease, fragmented into the reporter moiety fragment and the rest.
  • the polypeptide having the RSD structure when the protease is transfected into the cell (top), the polypeptide having the RSD structure is cleaved at the S site, and the reporter moiety is separated from the destabilizing moiety (D), thereby destabilizing the moiety (D). ) Is more stabilized than in the case of transfection. Accordingly, the signal measured from the reporter moiety or a substance derived therefrom is stronger than when the destabilizing moiety (D) is transfected.
  • the polypeptide having the RSD structure retains the destabilizing moiety (D), and thus the level of the polypeptide having the RSD structure is determined by the destabilizing moiety (D). It is lowered, indicating that the signal measured therefrom also becomes smaller.
  • FIG. 4 is a diagram illustrating a case where a recombinant polynucleotide having a nucleotide sequence encoding an internal standard reporter according to an aspect is contacted with a protease in a cell.
  • a polypeptide expressed by a recombinant polynucleotide according to one aspect is cleaved at the cleavage site of the substrate moiety in the presence of a protease and fragmented into the reporter moiety fragment and the rest.
  • the polypeptide having the RSD structure is cleaved at the S site, and the reporter moiety is separated from the destabilizing moiety (D), thereby destabilizing the moiety (D).
  • the signal measured from the reporter moiety or a substance derived therefrom is stronger than when the destabilizing moiety (D) is transfected.
  • the lower part (B) shows that when a protease is not present in a cell, the polypeptide having the RSD structure retains the destabilizing moiety (D), and thus has the polypeptide having the RSD structure by the destabilizing moiety (D).
  • the level of is lowered and thus the signal measured therefrom is smaller.
  • the internal standard reporter protein expressed from the recombinant polynucleotide is expressed in cells with or without protease.
  • the R-S-D polypeptide is 5'-cap independent translation and synthesized by the non-cistron sequence.
  • the signal measured from the internal standard reporter can be used to standardize the conditions for expressing the recombinant polynucleotide in a host cell.
  • a second aspect provides a host cell comprising the recombinant polynucleotide described above.
  • the host cell may be one capable of translocating the protease into a cell, for example into the cytoplasm.
  • the host cell may be a cell capable of translocating a protease such as a neurotoxin polypeptide into the cell, for example into the cytoplasm.
  • the host cell may be, for example, to bind through a protease and a receptor and to displace the complex into the cell, for example, into the cytoplasm.
  • the claimed invention should not be construed as limited to any particular transposition mechanism.
  • the host cell may be a cell capable of expressing a protease, for example, a polynucleotide encoding a proteolytically active neurotoxin polypeptide in the cytoplasm.
  • the host cell may be one containing a protease, for example, a polynucleotide encoding a proteolytic active neurotoxin polypeptide.
  • Proteases For example, a polynucleotide encoding a proteolytically active neurotoxin polypeptide may be inserted into a chromosome or may be transfected outside the chromosome.
  • a polynucleotide encoding a proteolytically active neurotoxin polypeptide may be one that is transiently or permanently expressed.
  • a polynucleotide encoding a proteolytically active neurotoxin polypeptide can be in itself or in a form included in a vehicle such as a vector.
  • the polynucleotide may be introduced from outside the host cell.
  • the host cell may be a recombinant cell.
  • the host cell may be an endocrine cell.
  • the cell may be selected from the group consisting of primary neurons, neuroblastoma cells, and neurons differentiated from pluripotent stem cells.
  • the host cell may be one capable of expressing the recombinant polynucleotide.
  • the host cell comprises a reporter moiety from the recombinant polynucleotide; A destabilizing moiety and a substrate moiety that operably links said reporter moiety with said destabilizing moiety, wherein said substrate moiety comprises a cleavage site of protease activity.
  • a destabilizing moiety and a substrate moiety that operably links said reporter moiety with said destabilizing moiety, wherein said substrate moiety comprises a cleavage site of protease activity.
  • a third aspect comprises a polypeptide encoded by the recombinant polynucleotide described above, and a protease, for example a detection agent for measuring a signal emitted by a reporter moiety or internal standard reporter or product thereof.
  • a protease for example a detection agent for measuring a signal emitted by a reporter moiety or internal standard reporter or product thereof.
  • kits for determining the proteolytic activity of a neurotoxin polypeptide are provided.
  • the reporter is luciferase
  • the kit further comprises a luciferase substrate
  • the detection agent is for measuring enzymatic conversion of the luciferase substrate, for example, a photodetector.
  • the reporter is a fluorescent protein
  • the detection agent may be a device for measuring the fluorescence emitted from the fluorescent protein, for example, an apparatus for exciting the fluorescent protein using excitation light and measuring the fluorescence emitted accordingly.
  • the internal standard reporter may be different from the reporter moiety.
  • the reporter may be a luciferase or fluorescent protein different from the reporter moiety.
  • a fourth aspect comprises a host cell comprising the recombinant polynucleotide described above and a detection agent for measuring a signal emitted by a reporter moiety or internal standard reporter or product thereof, for example,
  • kits for determining the proteolytic activity of a neurotoxin polypeptide are provided.
  • the reporter is luciferase
  • the kit further comprises a luciferase substrate
  • the detection agent may be for measuring enzymatic conversion of the luciferase substrate.
  • the reporter is a fluorescent protein
  • the detection agent may be a device for measuring the fluorescence emitted from the fluorescent protein, for example, an apparatus for exciting the fluorescent protein using excitation light and measuring the fluorescence emitted accordingly.
  • the internal standard reporter may be different from the reporter moiety.
  • the reporter may be a luciferase or fluorescent protein different from the reporter moiety.
  • the fifth aspect comprises contacting a polypeptide encoded by the recombinant polynucleotide described above with a sample suspected of containing the protease polypeptide; And measuring the signal emitted from the reporter moiety or product thereof in the contacted product, providing a method for determining protease activity in a sample.
  • the sixth aspect comprises contacting a polypeptide encoded by the recombinant polynucleotide described above with a protease polypeptide; Measuring a signal emitted from the reporter moiety or product thereof in contacted product; And determining at least one of a start point, and a duration of release of the signal from the measured signal.
  • the method of the fifth and sixth aspects comprises contacting the polypeptide encoded by the recombinant polynucleotide described above with a sample or protease suspected of containing the protease polypeptide.
  • the contact may be carried out under conditions such that the cleavage site of protease activity in the polypeptide is degraded.
  • the protease may be a neurotoxin polypeptide.
  • the contact may be performed in a liquid medium.
  • the liquid medium may be one having a condition for proteolytic activity of the protease to operate.
  • the condition may be pH, temperature, cofactor, salt concentration, or a combination thereof.
  • the liquid medium may be a buffer solution such as phosphate buffered saline (PBS).
  • the method of the fifth and sixth aspects also includes measuring the signal emitted from the reporter moiety or product thereof in contacted product.
  • the reporter moiety is a polypeptide that emits a detectable signal
  • the step may be to measure the signal directly.
  • the reporter moiety is a fluorescent protein such as GFP
  • the fluorescence may be measured. Measuring the fluorescence may be to irradiate the excitation light to the contacted product, and to measure the emission light emitted from the contacted product.
  • the wavelength of the excitation light and the emission light can be appropriately selected depending on the fluorescent protein to be selected.
  • the step adds a substrate necessary for the catalytic activity of the reporter moiety in the contacted product to detect the substrate.
  • the method may further include converting the signal into a material emitting a signal.
  • the signal may be measured from a substance emitting a detectable signal.
  • the reporter moiety is luciferase
  • the contacting or measuring signal includes adding a luciferase substrate in the reaction solution, and the detection is enzymatic conversion of the luciferase substrate. It may be to measure the.
  • the luciferase substrate may be luciferin.
  • the method may further include comparing the measured signal with a signal measured from a control.
  • the control group may be measured by the same procedure except that a sample containing no protease, eg, a neurotoxin polypeptide, or a sample containing a known concentration of protease, eg, a neurotoxin polypeptide, is used.
  • the method may further comprise determining the level of protease in the sample by a correlation of the signal obtained by the comparing step to the level of protease in the sample.
  • the method of the sixth aspect includes determining at least one of a start time, and a duration of emission of the signal from the measured signal.
  • One or more of the emission start point, and duration, of the signal can be readily determined from the measured signal by one skilled in the art.
  • one of skill in the art can determine signal values indicative of protease activity over time, such as the onset and duration of release from a signal emitted.
  • the signal value indicative of protease activity over time may determine from the measured value of the signal emitted over time, the start time, and duration of release of the signal.
  • One or more of the onset, and duration, of the release of the signal may be dependent on properties such as the type of protease.
  • the reporter moiety is a polypeptide that emits a detectable signal
  • the released signal starts to increase, and when the protease activity disappears, the released signal may decrease.
  • one or more of the onset and duration of release of the signal may vary depending on the nature of the protease.
  • proteases can be distinguished from other proteases from the absolute value or range of one or more of the time of onset of release of the signal, and the duration, as well as this relative comparison.
  • the determining step may be compared to one or more of the onset of release of the signal for a known protease, and the duration or the absolute value or range of one or more of the onset of release of the signal of a known protease, and the duration of time. Determining protease properties from the.
  • the indication to be treated by the protease may vary depending on one or more of the start of the release of the signal, and the duration.
  • the method may include determining an indication to be treated in the subject by the protease based on the determined protease properties.
  • a seventh aspect comprises contacting said host cell with a sample suspected of containing a protease polypeptide; And measuring the signal emitted from the reporter moiety or the internal standard reporter or product thereof in the contacted product, providing a method for determining protease activity in a sample.
  • An eighth aspect comprises the steps of contacting said host cell with a protease polypeptide; Measuring a signal emitted from the reporter moiety, the internal standard reporter or a product thereof in contacted product; And determining at least one of a start point, and a duration of release of the signal from the measured signal.
  • the method of the seventh and eighth aspects comprises contacting said host cell with a sample suspected of containing a protease polypeptide.
  • the contact can be carried out under conditions that allow the cleavage site of protease activity to degrade.
  • the protease may be a neurotoxin polypeptide.
  • the contact may be performed in a liquid medium.
  • the liquid medium may be one having a condition for proteolytic activity of the protease to operate.
  • the condition may be pH, temperature, cofactor, salt concentration, or a combination thereof.
  • the liquid medium may be a buffer solution such as phosphate buffered saline (PBS), or a medium in which the host cell is cultured.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the host cell may be one capable of transposing the protease into the cell, for example into the cytoplasm.
  • the host cell may be a cell capable of translocating a protease such as a neurotoxin polypeptide into the cell, for example into the cytoplasm.
  • the host cell may be, for example, to bind through a protease and a receptor and to displace the complex into the cell, for example, into the cytoplasm.
  • the claimed invention should not be construed as limited to any particular transposition mechanism.
  • the host cell may be a cell capable of expressing a protease, for example, a polynucleotide encoding a proteolytically active neurotoxin polypeptide in the cytoplasm.
  • the host cell may be one containing a protease, for example, a polynucleotide encoding a proteolytic active neurotoxin polypeptide.
  • Proteases For example, polynucleotides encoding proteolytically active neurotoxin polypeptides may be embedded in chromosomes or present outside of chromosomes.
  • a polynucleotide encoding a proteolytically active neurotoxin polypeptide may be one that is transiently or stably expressed.
  • a polynucleotide encoding a proteolytically active neurotoxin polypeptide can be in itself or in a form included in a vehicle such as a vector.
  • the polynucleotide may be introduced from outside the host cell.
  • the host cell may be a recombinant cell.
  • the host cell may be an endocrine cell.
  • the host cell may be selected from the group consisting of primary neurons, neuroblastoma cells, and neurons differentiated from pluripotent stem cells.
  • the host cell may be one capable of expressing the recombinant polynucleotide.
  • the host cell comprises a reporter moiety from the recombinant polynucleotide; A destabilizing moiety and a substrate moiety that operably links said reporter moiety with said destabilizing moiety, wherein said substrate moiety comprises a cleavage site of protease activity.
  • a destabilizing moiety and a substrate moiety that operably links said reporter moiety with said destabilizing moiety, wherein said substrate moiety comprises a cleavage site of protease activity.
  • the method of the seventh and eighth aspects also includes measuring the signal emitted from the reporter moiety or internal standard reporter or product thereof in the contacted product.
  • the reporter moiety or internal standard reporter is a polypeptide that emits a detectable signal
  • the step may be to measure the signal directly.
  • the reporter moiety is a fluorescent protein such as GFP
  • the fluorescence may be measured. Measuring the fluorescence may be to irradiate the excitation light to the contacted product, and to measure the emission light emitted from the contacted product.
  • the wavelength of the excitation light and the emission light can be appropriately selected depending on the fluorescent protein to be selected.
  • the step may be performed by adding a substrate required for catalytic activity of the reporter moiety in the contacted product, The method may further comprise converting the substrate into a substance that emits a detectable signal.
  • the signal may be measured from a substance emitting a detectable signal.
  • the reporter moiety or internal standard reporter is luciferase
  • the step of contacting or measuring the signal comprises adding a luciferase substrate to the reaction solution, and the detection comprises the luciferase substrate. It may be for measuring the enzymatic conversion of.
  • the luciferase substrate may be luciferin.
  • the reporter moiety is luciferase
  • the contacting or measuring signal includes adding a luciferase substrate in the reaction solution, and the detection is enzymatic conversion of the luciferase substrate. It may be to measure the.
  • the luciferase substrate may be luciferin.
  • the reporter is a fluorescent protein
  • the measuring may include measuring fluorescence coming from the fluorescent protein.
  • the method of the seventh and eighth aspects may further comprise comparing the measured signal with a signal measured from a control.
  • the control group may be measured by the same procedure except that a sample containing no neurotoxin polypeptide or a sample containing a neurotoxin polypeptide of known concentration is used.
  • the method may further comprise determining the level of neurotoxin polypeptide in the sample by a correlation of the signal obtained by the comparing step to the level of neurotoxin polypeptide in the sample.
  • the recombinant polynucleotide is bicistronic sequence linked upstream or downstream of the first polynucleotide and internally operably linked upstream or downstream of the bicistronic sequence. It may further comprise a polynucleotide encoding a standard reporter.
  • the method may further include measuring a signal emitted from an internal standard reporter.
  • the method may also include determining a level of a signal emitted from the reporter relative to a signal emitted from an internal standard reporter.
  • the method of the eighth aspect includes determining one or more of an onset, and a duration of emission of the signal from the measured signal.
  • One or more of the emission start point, and duration, of the signal can be readily determined from the measured signal by one skilled in the art.
  • one skilled in the art can determine a signal value that indicates protease activity over time, such as the start of release and duration of the signal from the emitted signal.
  • the signal value indicative of protease activity over time may determine from the measured value of the signal emitted over time, the start time, and duration of release of the signal.
  • One or more of the onset, and duration, of the release of the signal may be dependent on properties such as the type of protease.
  • the reporter moiety is a polypeptide that emits a detectable signal
  • the released signal starts to increase, and when the protease activity disappears, the released signal may decrease.
  • one or more of the start time and duration of the release of the signal may vary.
  • proteases can be distinguished from other proteases from the absolute value or range of one or more of the time of onset of release of the signal, and the duration, as well as this relative comparison.
  • the determining step may be compared to one or more of the onset of release of the signal for a known protease, and the duration or the absolute value or range of one or more of the onset of release of the signal of a known protease, and the duration of time. Determining protease properties from the.
  • the indication to be treated by the protease may vary depending on one or more of the start of the release of the signal, and the duration.
  • the method may include determining an indication to be treated in the subject by the protease based on the determined protease properties.
  • the method of the eighth aspect may comprise determining one or more of the onset, and duration of release of the signal from the measured signal without damaging the cell, eg, without cell lysis.
  • a ninth aspect comprises introducing a polynucleotide encoding a protease polypeptide into the host cell; And culturing the host cell into which the polynucleotide has been introduced and measuring the signal emitted from the reporter moiety or the internal standard reporter or a product thereof in the culture; the host cell can express or inhibit the protease. It provides a way to measure the ability of a person.
  • the method includes introducing a polynucleotide encoding a protease polypeptide into the host cell.
  • Host cells and proteases are as described above.
  • the step of introducing may be by a method of introducing any polynucleotide into the cell, such as transformation, transfection, or transduction.
  • the host cell may be a cell capable of expressing a protease, for example, a polynucleotide encoding a proteolytically active neurotoxin polypeptide in the cytoplasm.
  • the host cell may be one containing a protease, for example, a polynucleotide encoding a proteolytic active neurotoxin polypeptide.
  • polynucleotides encoding proteolytically active neurotoxin polypeptides may be embedded in chromosomes or present outside of chromosomes.
  • a polynucleotide encoding a proteolytically active neurotoxin polypeptide may be one that is transiently or stably expressed.
  • a polynucleotide encoding a proteolytically active neurotoxin polypeptide can be in itself or in a form included in a vehicle such as a vector.
  • the polynucleotide may be introduced from outside the host cell.
  • the host cell may be a recombinant cell.
  • the host cell may be an endocrine cell.
  • the host cell may be selected from the group consisting of primary neurons, neuroblastoma cells, and neurons differentiated from pluripotent stem cells.
  • the method includes culturing the host cell into which the polynucleotide has been introduced and measuring the signal emitted from the reporter moiety or the internal standard reporter or product thereof in culture.
  • the culturing can be carried out in the presence of a test substance.
  • the test substance may be a polymer, such as a protein, polysaccharide, or a small molecule compound.
  • the test substance may be a substance that is believed to inhibit or promote protease.
  • the host cell may be a polynucleotide encoding the candidate material.
  • the method may be a method of screening for substances that modulate protease activity.
  • the method may include comparing an experimental group signal, which is a signal obtained by using a test substance, and a control signal, which is a signal obtained from a control experiment.
  • the control may be a positive control using a substance known to modulate protease activity or a negative control obtained by performing the same operation except for the candidate substance.
  • the method may comprise determining from the comparison result obtained from the comparing step whether the candidate agent modulates protease activity. For example, when the experimental group signal is greater than the negative control signal, it may be determined that the substance has an activity for promoting protease activity. In addition, when the experimental group signal is smaller than the negative control signal, it may be determined that the substance has an activity that inhibits protease activity.
  • FIG. 1 is a diagram showing the structure of a recombinant polynucleotide according to one aspect.
  • FIG. 2 is a diagram showing the structure of a recombinant polynucleotide according to one aspect and the reaction of a polypeptide and a protease expressed thereby.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating a case where a recombinant polynucleotide is contacted with a protease in a cell according to one aspect.
  • FIG. 4 is a diagram illustrating a case where a recombinant polynucleotide having a nucleotide sequence encoding an internal standard reporter according to an aspect is contacted with a protease in a cell.
  • FIG. 5 shows the results of measuring the activity of the reporter moiety after NG108-15 cells transfected with pFB vector1 were differentiated into neurons and addicted with botulinum toxin A.
  • FIG. 6 shows the results of NG108-15 cells transfected with pFB vector2 after differentiation into neurons and intoxication with botulinum toxin A, followed by fluorescence microscopy.
  • Figure 7 shows the results of measuring the activity of the reporter moiety of the cells after NG108-15 cells transfected with pFB vector3 after differentiation into neurons and addicted with botulinum toxin A.
  • FIG. 8 shows the results of measuring the activity of reporter moieties of cells after differentiating SiMa cells transfected with pFB vector 3 into neurons and then addicting with botulinum toxin A.
  • FIG. 9 shows the results of measuring the activity of the reporter moiety of the cells after NT2 cells transfected with pFB vector 3 were differentiated into neurons and addicted with botulinum toxin A.
  • FIG. 10 shows reporter moieties expressed from NG108-15 cells transiently transfecting NG108-15 cells transfected with pFB vector 6 into neurons followed by transient transfection of the pCDNA4_BLC vector expressing the light chain of botulinum toxin B. The result of confirming the signal from an internal standard reporter protein is shown.
  • FIG. 11 shows NT2 cells transfected with pFB vector2 as stabilized monoclonal-derived cell lines, differentiated into neurons, intoxicated with different concentrations of BoNT / A, and confirmed signals from expressed reporter moiety proteins. Indicates.
  • the recombinant polynucleotide produced two structures. One encodes a polypeptide having an R-S-D structure, and the other encodes a polypeptide having an I-B-R-S-D structure. Wherein I and B are the nucleotide sequence and the bicistron sequence, respectively, encoding the internal standard reporter.
  • the recombinant polynucleotide is in the form of a plasmid vector.
  • the internal standard reporter or reporter moiety used a nucleotide sequence encoding a luminescent or fluorescent protein.
  • the sequence encoding the luminescent protein comprises a nucleotide sequence (eg SEQ ID NO: 1) and a nano-luciferase protein (Nano-luciferase) encoding Firefly luciferase protein (FLuc) (eg SEQ ID NO: 9).
  • Nucleotide sequence (SEQ ID NO: 2) encoding NLuc) (SEQ ID NO: 10), and the sequence encoding the fluorescent protein encodes enhanced Green Fluorescence Protein (eGFP) (SEQ ID NO: 11)
  • eGFP enhanced Green Fluorescence Protein
  • SEQ ID NO: 4 A nucleotide sequence (SEQ ID NO: 4) encoding a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 3) or an Emery protein (mCherry) (SEQ ID NO: 12) was used.
  • the bicistron sequence was a nucleotide sequence (P2A) (SEQ ID NO: 5) encoding a self-cleaved peptide derived from porcine teschovirus-1.
  • the protease substrate moiety is the C-terminal region of human SNAP25 in the case of botulinum toxin type A and the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 14) encoding amino acid sequences 145 to 207 of the total 207 amino acid sequences. Number 6) or for botulinum toxin type B, a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 17) encoding human VAMP2 (SEQ ID NO: 18) was used.
  • the destabilization moiety used a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 8) encoding a PEST sequence (SEQ ID NO: 16) and a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 7) encoding a CL1 sequence (SEQ ID NO: 15).
  • a nucleotide (SEQ ID NO: 1) (hereinafter referred to as the 'FLuc sequence') encoding Firefly luciferase protein (SEQ ID NO: 9), pNL1.1
  • the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 2) (hereinafter referred to as the 'NLuc sequence') encoding the nano-luciferase protein (NLuc) (SEQ ID NO: 10) in the vector (Promega) is called the pEGFP-C1 vector (clontech).
  • the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 3) (hereinafter referred to as the 'eGFP sequence') encoding the enhanced Green Fluorescence Protein (eGFP) (SEQ ID NO: 11) was expressed in the mCherry vector in the pmCherry-C1 vector. ) (SEQ ID NO: 12) to obtain a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 4) (hereinafter referred to as 'mCherry sequence').
  • Nucleotide sequence number 6 (hereinafter referred to as SNAP25 sequence) encoding the amino acid sequence of positions 145 to 207 of the total 207 amino acid sequences as the C-terminal portion of human SNAP25 and the nucleotide sequence encoding human VAMP2 ( Hereinafter referred to as 'VAMP2 sequence' synthesized the nucleotide sequence via RT-PCR in the mRNA of the human-derived cell line.
  • a sequence encoding a CL1-PEST polypeptide fused with CL1 and PEST (hereinafter referred to as a 'CL1-PEST sequence'), and a nucleotide sequence encoding a self-cleaving peptide P2A derived from porcine teschovirus-1 (teschovirus-1) (Hereinafter referred to as 'P2A sequence') was obtained through gene synthesis.
  • a recombinant polynucleotide of RSD or IBRSD was prepared using a gene cloning method using a restriction enzyme as a combination of the above sequences, and linked to the BamHI / XhoI restriction site of the pCDNA4 vector (invitrogen) or the pFB vector (Agilent). To generate a recombinant vector.
  • a recombinant polynucleotide consisting of an NLuc sequence-SNAP25 sequence-CL1-PEST sequence is introduced into a BamHI / XhoI enzyme site of a pCDNA4 vector (hereinafter also referred to as "pCDNA4 vector1”) or a BamHI / XhoI enzyme site of a pFB vector.
  • pCDNA4 vector1 BamHI / XhoI enzyme site of a pB vector
  • An introduced pFB vector hereinafter also referred to as "pFB vector1" was produced.
  • pCDNA4 vector2 the BamHI / XhoI enzyme site of the pCDNA4 vector
  • pFB vector2 BamHI / XhoI enzyme site of the pFB vector
  • the FLuc sequence and the recombinant polynucleotide consisting of the P2a sequence, the NLuc sequence, the SNAP25 sequence, and the CL1-PEST sequence are introduced into the BamHI / XhoI enzyme site of the pCDNA4 vector (hereinafter pCDNA4 vector 3) or BamHI of the pFB vector.
  • pCDNA4 vector 3 A pFB vector (hereinafter also referred to as "pFB vector3”) introduced to the / XhoI enzyme site was constructed.
  • pFB vector4 a pFB vector (hereinafter referred to as "pFB vector4") into which a recombinant polynucleotide consisting of the FLuc sequence, the P2a sequence, the NLuc sequence, the VAMP2 sequence, and the CL1-PEST sequence was introduced into the BamHI / XhoI enzyme site of the pFB vector Produced.
  • the pCDNA4 vector is a vector derived from plasmid and used for transient expression of the recombinant polynucleotide in a cell.
  • the pFB vector was derived from Moloney Murine Leukemia virus (MMLV) and was used to construct engineered cell lines through transfection, ie cell lines into which the recombinant polynucleotide was introduced into the chromosome.
  • MMLV Moloney Murine Leukemia virus
  • the prepared plasmid vector and viral vector confirmed the structure of the construct through sequencing and purified and isolated plasmid vector DNA at the level for cell culture.
  • MMLV-derived viral vector that is, a pFB vector
  • Transduction method using a MMLV-derived viral vector was performed.
  • Transfection with MMLV-derived viral vectors is a widely practiced method in the art and see the references (Felts Ka et al., Mol Biotechnol. 2002 Sep; 22 (1): 25-32.).
  • FBS fetal bovine serum
  • the recombinant polynucleotide pFB vector of the present invention constructed in (1), pFB vectors 1,2,3, or 4 and pCMV-gagpol (Cell Biolabs, inc. ) And pCMV-VSV-G (Cell Biolabs, Inc.) were mixed in a 3: 2: 1 ratio.
  • the pFB vector used 7.5ug.
  • the mixture of the vectors used Lipofectamine TM 3000 (invitrogen) for transfection and the transduction method was performed according to the manufacturer's instructions. Cells were cultured under the same conditions for 48 hours after transduction. Accordingly, infectious packaged pFB vectors 1,2,3 or 4 containing viruses were produced from the HEK 293T cells.
  • Target cells were NG108-15 cells (ATCC-HB-12317), SiMa cells (DSMZ: ACC-164), and NT2 cells (ATCC-CRL-1973).
  • NG108-15 cells are hybrid cells of rat neuroblastoma and rat glioma and have been confirmed to be susceptible to botulinum toxin type A through differentiation into neurons (Whitemarsh RC et al., Biochem Biophys Res Commun.
  • SiMa cells are cell lines derived from human-derived neuroblastoma and have been confirmed to be susceptible to botulinum toxin type A through differentiation into neurons (Fernandez-Salas E et al., PLoS One.2012; 7 (11): e49516), NT2 cells are embryonic carcinoma cell lines derived from human testes, have multipotent ability and can differentiate into neurons under certain conditions and differentiate into neurons NT2 cells were confirmed to be susceptible to botulinum toxin type A (Tegenge et al., Cell Mol Neurobiol. 2012 Aug; 32 (6): 1021-9).
  • target cells were seeded at about 1 ⁇ 10 5 cells per well of a 24-well plate containing 0.5 ml of DMEM medium containing 10% FBS one day prior to infection and incubated for 1 day in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator.
  • the culture supernatant of HEK-293T cells collected above was filtered using a 0.45um syringe filter to obtain a virus solution from which cells and cell debris were removed.
  • the virus solution thus obtained was added to the cultured wells in which the target cells were removed from the medium at a concentration of 1 ml / well (24-well), and cultured for 6 hours under the same conditions to cause infection.
  • Polybrene was added at the level of 8mg / ml in order to increase the infection efficiency of the target cells. After 6 hours, the medium was replaced with DMEM medium containing 10% FBS, a medium for normal cell culture, and cultured under the same conditions for 2 days.
  • target cells infected in 24-well were transferred to 55 cm 2 culture dishes after 2 days of incubation, and 500-1000 ug / ml of geneticin (Gibco), a selective antibiotic of pFB vector, was added. Incubated daily. Appropriate antibiotic doses were treated based on titration of target cells and geneticin.
  • NT2 cells were the target cells, they were cultured in a culture dish containing 10 ml of cell culture medium in the presence of 800 ug / ml of geneticin for 5 days.
  • the target cells were transferred to 96-well wells at a concentration of 2 cells / well to form single cell clones.
  • Single cells cloned colonies were selected through cell culture microscopy and expanded in culture for 4 weeks under the same conditions in each well of a 96-well plate containing 100ul of the same medium used in 55 cm 2 culture dish culture.
  • the pre-selection process was performed by using a fluorescence microscope when the internal standard reporter protein is a fluorescent protein or through luminescence analysis when the internal standard reporter protein is a luminescent protein.
  • proteosome inhibitor MG132 (Sigma) was used for pre-selection of recombinant polynucleotides without an internal standard reporter protein or to first select the superiority of the sensitivity of each monoclonal cell line with an internal standard reporter protein.
  • light chain DNA of botulinum toxin type B when the recombinant polynucleotide comprises a VAMP2 sequence was transduced using Lipofectamine TM 3000 (invitrogen) and according to the manufacturer's instructions.
  • BoNT / A LC and BoNT / B LC were introduced into the BamHI / XhoI site of pCDA4.
  • the cells were cultured in 96-well for about 3 ⁇ 4 weeks, and the same number of cells were seeded independently on two 96-well plates for the cells identified with single clone colonies. One was used for the maintenance culture.
  • cell lines derived from monoclonal cells were each expanded culture and cryopreserved. Cryopreservation was performed by cryopreservation of normal mammalian cells. Briefly, 5x10 7 to 1x10 7 cells were diluted in 1 ml of culture medium containing 5% or 10% of DMSO and placed in a freezing vial to prepare a programmed freezing container. The temperature was lowered to -80 ° C. and then stored in the gas phase of the liquefied nitrogen tank.
  • NG108-15 cells, SiMa cells, and NT2 cells are neuroblastoma cell lines or embryonal carcinoma cell lines, which have been known to be susceptible to botulinum toxin when differentiated into neurons. Thus, these cells were differentiated into neurons according to the following procedure.
  • NG108-15 cells were maintained in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator in DMEM medium with 10 (v / v)% FBS.
  • DMEM medium with 10 (v / v)% FBS.
  • seed cells at a concentration of 2x10 4 cells / well in each well of a matrigel (BD sceince) -coated 96-well plate and incubate 50 uM of retinoic acid and purmo for approximately 5 days.
  • the neurobasal medium contained B27 (Gibco), Glutamax (Gibco) and non-essential amino acid (Gibco) in amounts of 1X, respectively.
  • SiMa cells were maintained in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator in DMEM medium supplemented with 10 (v / v)% FBS.
  • DMEM medium supplemented with 10 (v / v)% FBS.
  • seed cells at a concentration of 5 ⁇ 10 4 cells / well in each well of a matrigel (BD sceince) coated 96-well plate and add 50 uM of retinoic acid for about 5 days.
  • the MEM medium contained B27 (Gibco), N2 (Gibco), Glutamax (Gibco), HEPES (Gibco), and non-essential amino acid (Gibco) in amounts of 1X, respectively.
  • NT2 cells (hereinafter also referred to as “NTtera2 cells”) were maintained in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator in ⁇ -MEM medium (Welgene) added with 10 (v / v)% FBS.
  • ⁇ -MEM medium Welgene
  • For neural cell differentiation seed the cells at a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells / ml in each well of a petri dish and for 2 weeks under different conditions in differentiation medium with 50 uM of retinoic acid added Incubate with changing medium every day.
  • differentiation medium DMEM / F12 (Welgene) medium to which 10 (v / v)% FBS was added was used.
  • the cells thus cultured form globular bodies, and after one week of culture, the globulars are collected to transfer the globulars to a general cell culture plate of the same area, and the differentiation medium to which 50 uM of retinoic acid is added under the same conditions as adherent cells for one week.
  • the culture was carried out every 2 to 3 days while changing the medium.
  • the attached cells were then depopulated, and deattached using trypsin and the cells were counted.
  • 1 ⁇ 10 7 cells were transferred to a 175T flask (Nunc) and cultured for 10 days while changing the medium every 2 to 3 days under the same conditions in the differentiation medium to which mitotic inhibitors were added. Mitosis inhibition was AraC 1 uM, Uridine 10 uM and Fluoxuridine 10 uM. Cells differentiated into neurons were detached using trypsin and the cells obtained here were stored frozen. The cryopreservation medium used a freezing medium and the freezing method used the cell freezing method. Differentiated neurons were seeded at a matrigel-coated 96-well plate for cell culture at a level of 1 ⁇ 10 5 cells per well, incubated for about 10 days or more in the differentiation medium, and the medium was changed every 2-3 days.
  • Intoxication of botulinum toxin type A in differentiated neurons was performed as follows.
  • the poisoning of the purified toxin protein was exchanged with the culture of the nerve cells in maintenance culture in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. after diluting the purified toxin protein to an appropriate concentration in the differentiation medium. It was then incubated for 24 hours under the same conditions to induce toxin poisoning, then the medium was replaced with the differentiation medium and 72 hours were incubated under the same conditions.
  • the differentiation medium was added to a commercially available botulinum toxin medicine vial (Medotoxin, Neuronox) to suspend lyophilized toxin proteins and excipients, followed by culture of cells in maintenance culture at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator. Exchanged.
  • Toxin titer experiments on finished vials used toxin placebo vials to equalize the amount of excipients treated.
  • Toxin placebo vials only removed toxin protein from the finished toxin vial.
  • the same amount of the toxin finished vial and the toxin placebo vial was suspended in the same amount, and treated with the same amount of the total poisoning medium according to each treatment concentration.
  • Quantitative analysis of the reporter moiety or internal standard reporter protein expressed from the recombinant polynucleotide was performed as follows.
  • the luminescent protein when used as a reporter moiety or an internal standard reporter protein, the luminescent protein was quantitatively analyzed by luminescence analysis. In the case of NLuc reporter moiety, it was analyzed by Nano-luciferase assay kit (promega).
  • the reporter moiety is NLuc and the internal standard reporter protein is FLuc
  • one-glo Dual nano-luciferase assay kit (promega) was used, the test was carried out according to the supplier's manual, and luminescence was performed using SpectraMax (Molecular Device). Measured using. The NLuc value measured for normalization was used as the result value divided by the FLuc value, an internal standard reporter protein.
  • fluorescence value was quantitatively analyzed through a fluorimeter.
  • the reporter moiety is mCherry and the internal standard reporter protein is eGFP, spectraMax (Molecular Device Co., Ltd.), a fluorescence meter, was used to excite the mCherry at 610 nm wavelength and to measure emission at 507 nm wavelength.
  • eGFP excitation at 488 nm wavelength and emission value at 507 nm wavelength were measured.
  • the release value of mCherry measured for normalization was used as the result divided by the release value of eGFP, an internal standard reporter protein.
  • fluorescence values of GFP and RFP may be measured using an incucyte instrument (Essen Bioscience Co., Ltd.) to perform normalization and used as a result value.
  • eGFP is the GFP family and mCherry is the RFP family.
  • FIG. 5 shows the results of measuring the activity of the reporter moiety after NG108-15 cells transfected with pFB vector1 were differentiated into neurons and addicted with botulinum toxin A.
  • FIG. 5 the preparation of NG108-15 cells transfected with pFB vector1, differentiation into neurons, intoxication with botulinum toxin A, and measurement of the activity of the reporter moiety are described in (3), (4), and (5).
  • the activity of nano-luciferase was measured for luminescence using the Nano-luciferase kit of cells finally cultured for 72 hours.
  • the activity of the measured nano-luciferase was intoxicated with 10 nM botulinum toxin A, which showed a markedly increased relative luminescence unit compared to that otherwise.
  • FIG. 6 shows the results of NG108-15 cells transfected with pFB vector2 after differentiation into neurons and intoxication with botulinum toxin A, followed by fluorescence microscopy.
  • construction of NG108-15 cells transfected with pFB vector2 differentiation into neurons, and intoxication with botulinum toxin A are as described in (3) and (4) above.
  • control is a control group having a botulinum toxin A concentration of 0 nM
  • BoNT / A 1 nM represents an experimental group having a botulinum toxin A concentration of 1 nM.
  • red fluorescent cells in the experimental group significantly increased.
  • 5 and 6 show that when the cleavage site of SNAP25 is not cleaved by botulinum toxin A, the polypeptide of the NLuc-SNPA25 substrate moiety-CL1-PEST structure is readily degraded to lower the relative luminescence unit, while the botulinum toxin When A cleavage site of SNAP25 is cleaved by A, the polypeptide of NLuc-SNPA25 substrate moiety-CL1-PEST structure is stabilized from degradation, indicating that the relative luminescent units are high.
  • FIG. 7 shows the results of NG108-15 cells transfected with pFB vector 3 after differentiation into neurons followed by poisoning with botulinum toxin A, followed by fluorescence microscopy.
  • the production of NG108-15 cells transfected with pFB vector3, differentiation into neurons, intoxication with botulinum toxin A, and measurement of the activity of the reporter moiety are described in (3), (4), and (5).
  • the activity measurement of the half-buy luciferase (FLuc) and the nano-luciferase (NLuc) was performed by measuring the luminescence of cells finally cultured for 72 hours using a One-glo nano dual luciferase kit. It was.
  • the relative activity of the nano-luciferase relative to the measured bandifulin-luciferase (FLuc) was intoxicated with 10 nM botulinum toxin A, which was significantly increased relative to that otherwise. luminescence unit).
  • BoNT / A 0 nM is a control group having a botulinum toxin A concentration of 0 nM
  • BoNT / A 1 nM represents an experimental group having a botulinum toxin A concentration of 1 nM.
  • the activity of the measured nano-luciferase was markedly increased relative luminescence compared to that otherwise intoxicated with 10 nM botulinum toxin A.
  • FIG. 8 shows the results of the differentiation of SiMa cells transfected with pFB vector 3 into neurons followed by intoxication with botulinum toxin A, followed by fluorescence microscopy.
  • FIG. 9 shows the results of fluorescence microscopy of NT2 cells transfected with pFB vector 3 after neuronal differentiation into botulinum toxin A.
  • pCDNA4-BLC Reporter moiety and internal standard reporter protein expressed after random expression of the light chain of BoNT / B (pCDNA4-BLC) in NG108-15 cells stably expressing polypeptides by inducing transfection with pFB vector 4 Shows the result of checking the signal coming from.
  • the pCDNA4-BLC vector was transduced using Lipofectamine TM 3000 (invitrogen) and according to the manufacturer's instructions. Cells were incubated under the same conditions for 48 hours after transduction. Accordingly, pCDNA4-BLC vectors are transiently expressed in NG108-15 cells.
  • the vertical axis is the normalization value from NLuc value to Fluc.
  • the activity of the nano-luciferase measured against the bandi-luciferase was significantly increased compared to that of the introduction of the DNA of pCDNA4-BLC encoding the light chain of 10 ug botulinum toxin B. Relative luminescence was shown.
  • FIG. 11 shows the result of confirming the signal from the reporter moiety protein expressed by intoxicating the stabilized cell line NT2 cells transduced with pFB vector 3 with different concentrations of BoNT / A.
  • BoNT / A APIs represent the raw materials used to make products comprising BoNT / A as BoNT / A.
  • BoNT / A API was supplied from Medytox Co., Ltd.
  • pFB Vector3 was transduced using Lipofectamine TM 3000 (invitrogen) and according to the manufacturer's instructions. Cells were incubated under the same conditions for 48 hours after transduction. Accordingly, pFB vector3 is transiently expressed in NT2 cells.
  • RLU represents a relative luciferase unit.
  • the activity of the nano-luciferase measured against the bandi-luciferase showed a concentration-dependent relative luminescence unit of botulinum toxin A at a concentration of 1 pM to 10 nM. This indicates that by measuring the RLU, the level of botulinum toxin, eg, type A, in the sample can be measured.
  • 12 to 14 show the results of poisoning stabilized NT2 cells transduced with pFB vector3 with different concentrations of BoNT / A containing finished products and confirming signals from expressed reporter moieties and internal standard reporter proteins. 12 to 14 were measured by the same process except that instead of using the raw material used to prepare a product containing BoNT / A as BoNT / A, a product containing BoNT / A as BoNT / A was used. . Compared to the BoNT / A API, the product further contains components such as excipients. 12, 13 and 14 show the values of FLuc, NLuc and NLuc / FLuc, respectively.
  • the activity of the nano-luciferase measured against the bandi-luciferase showed a concentration dependent relative luminescence unit of botulinum toxin A at a concentration of 1U to 10U. This indicates that by measuring the RLU, the level of botulinum toxin, eg, type A, in the sample can be measured.
  • the recombinant polynucleotide according to the first aspect it can be used in a method for determining the protease activity of a neurotoxin polypeptide in a host cell and a sample including the same.
  • the host cell comprising the recombinant polynucleotide according to the second aspect, the host cell can be efficiently used in a method for determining the protease activity of a neurotoxin polypeptide in a sample.
  • kit for determining the proteolytic activity of the neurotoxin polypeptide it can be used to determine the proteolytic activity of the neurotoxin polypeptide.
  • the properties of the neurotoxin polypeptide can be efficiently determined.
  • the protease activity of the neurotoxin polypeptide in the sample can be efficiently determined.
  • the host cell can efficiently measure the ability of the host cell to express or inhibit the protease, or the test substance can modulate protease activity. Can be determined.

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Abstract

리포터 모이어티, 기질 모이어티 및 탈안정화 모이어티를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드, 그를 포함하는 숙주세포, 및 그를 이용하여 프로테아제의 수준을 측정하는 방법을 제공한다.

Description

리포터 모이어티, 기질 모이어티 및 탈안정화 모이어티를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드, 그를 포함하는 숙주세포, 및 그의 용도
리포터 모이어티, 기질 모이어티 및 탈안정화 모이어티를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드, 그를 포함하는 숙주세포, 및 그를 이용하여 프로테아제의 수준을 측정하는 방법에 관한 것이다.
프로테아제는 단백질 분해(proteolysis)를 수행하는 효소이다. 프로테아제는 폴리펩티드 사슬 중에 아미노산을 서로 연결하는 펩티드 결합을 가수분해에 의하여 분해한다. 프로테아제에는 신경독소가 포함될 수 있다. Clostridium botulinum 및 Clostridium tetani는 아주 강력한 신경독소, 즉 보툴리눔 독소(BoNT)와 테타누스 독소(TeNT)를 생산한다. 이들 클로스트리디아성 신경독소는 신경세포(neuronal cell)에 특이적으로 결합하고 신경전달물질(neurotransmitter)의 방출을 저해한다. 신경독소와 같은 일부 프로테아제는 아주 강력한 독성을 가지고 있을 뿐만 아니라 극소량으로 존재하기 때문에 그 활성을 안전하고, 정확하게 측정할 수 있는 방법이 요구되고 있다.
일 양상은 리포터 모이어티; 탈안정화 모이어티 및 상기 리포터 모이어티와 상기 탈안정화 모이어티를 작동적으로 연결하는 기질 모이어티로서, 상기 기질 모이어티는 프로테아제 활성의 절단 부위(cleavage site)를 포함하는 것인 기질 모이어티를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
다른 양상은 상기한 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포를 제공한다.
다른 양상은 상기한 재조합 폴리뉴클레오티드에 의하여 코딩되는 폴리펩티드, 및 리포터 모이어티 또는 내부 표준 리포터 또는 그의 산물에 의하여 방출되는 신호를 측정하기 위한 검출제(detection agent)를 포함하는, 프로테아제 폴리펩티드의 단백질 분해 활성(proteolytic activity)을 결정하기 위한 키트를 제공한다.
다른 양상은 상기한 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포, 및 리포터 모이어티 또는 내부 표준 리포터 또는 그 산물에 의하여 방출되는 신호를 측정하기 위한 검출제(detection agent)를 포함하는, 프로테아제 폴리펩티드의 단백질 분해 활성(proteolytic activity)을 결정하기 위한 키트를 제공한다.
다른 양상은 상기한 재조합 폴리뉴클레오티드에 의하여 코딩되는 폴리펩티드를 프로테아제 폴리펩티드를 포함할 것으로 의심되는 시료와 접촉시키는 단계; 및 접촉된 산물 중의 상기 리포터 모이어티 또는 그 산물로부터 방출되는 신호를 측정하는 단계;를 포함하는, 시료 중의 프로테아제 폴리펩티드의 프로테아제 활성을 결정하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 상기한 숙주세포를 프로테아제 폴리펩티드를 포함할 것으로 의심되는 시료와 접촉시키는 단계; 및 접촉된 산물 중의 상기 리포터 모이어티 또는 상기 내부 표준 리포터 또는 그 산물로부터 방출되는 신호를 측정하는 단계;를 포함하는, 시료 중의 프로테아제 폴리펩티드의 프로테아제 활성을 결정하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 상기한 재조합 폴리뉴클레오티드에 의하여 코딩되는 폴리펩티드를 프로테아제 폴리펩티드에 접촉시키는 단계; 접촉된 산물 중의 상기 리포터 모이어티 또는 그 산물로부터 방출되는 신호를 측정하는 단계; 및 상기 측정된 신호로부터 상기 신호의 방출 개시 시점, 및 지속시간 중 하나 이상을 결정하는 단계를 포함하는, 시료 중의 프로테아제 폴리펩티드의 특성을 결정하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 상기한 숙주세포를 프로테아제 폴리펩티드에 접촉시키는 단계; 접촉된 산물 중의 상기 리포터 모이어티, 상기 내부 표준 리포터 또는 그 산물로부터 방출되는 신호를 측정하는 단계; 및 상기 측정된 신호로부터 상기 신호의 방출 개시 시점, 및 지속시간 중 하나 이상을 결정하는 단계를 포함하는, 시료 중의 프로테아제 폴리펩티드의 특성을 결정하는 방법을 제공한다.
제1 양상은 리포터 모이어티; 탈안정화 모이어티 및 상기 리포터 모이어티와 상기 탈안정화 모이어티를 작동적으로 연결하는 기질 모이어티로서, 상기 기질 모이어티는 프로테아제 활성의 절단 부위(cleavage site)를 포함하는 것인 기질 모이어티를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 재조합 폴리뉴클레오티드에 있어서, 상기 리포터 모이어티는 검출가능한 신호를 방출하거나, 그에 의하여 촉매되는 반응에서 검출가능한 신호를 방출하는 물질(이하 "산물(product)이라고도 한다)을 방출하는 물질인 것일 수 있다. 상기 리포터 모이어티는 형광 단백질, β-lactamase, β-galactosidase, alkaline phosphatase, chloramphenicol acetyaltransferase, β-glucuronidase, peroxidase 및 luciferase로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 형광 단백질은 GFP, YFP, Citrine, CFP, RFP, Kaede, PA-GFP, Emerald, Venus, DsRed, mHoneydew, mBanana, mOrange, tdTomato, mTangerine, mStrawberry, mCherry, mRasberry, mPlum, ZsGreen, 및 ZsYellow 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 재조합 폴리뉴클레오티드에 있어서, 상기 탈안정화 모이어티는 그의 부재시에 비하여 세포 내에서 상기 제1 폴리뉴클레오티드의 발현을 감소시키는 특성을 갖는 것일 수 있다. 상기 발현은 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서의 발현인 것일 수 있다. 상기 탈안정화 모이어티는 세포 내에서 제1 폴리뉴클레오티드로부터 발현되는 mRNA 또는 단백질의 분해를 촉진하는 것일 수 있다. 상기 탈안정화 모이어티는 PEST, CL1 또는 PEST과 CL1의 융합 단백질인 것일 수 있다.
상기 프로테아제는 박테리아 유래의 것일 수 있다. 상기 박테리아는 클로스트리움 속의 것일 수 있다. 상기 프로테아제는 신경독소(neurotoxin) 폴리펩티드인 것일 수 있다. 상기 프로테아제는 엔도프로테아제인 것일 수 있다. 상기 신경독소 폴리펩티드는 보툴리눔 독소 혈청 타입 A(botulinum toxin serotype A: BoNT/A), BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/CD, BoNT/DC, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/FA, BoNT/G, 테타누스 신경독소(TeNT), 또는 이들의 변이체인 것일 수 있다. 상기 프로테아제는 상기 기질 모이어티 중의 절단 부위를 절단하는 것일 수 있다. 상기 절단 부위는 상기 프로테아제에 의하여 인식되고 절단되는 부위인 것일 수 있다. 각 보툴리눔 독소 혈청 타입의 아미노산 서열 및 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 알려져 있다. 보툴리눔 독소 혈청 타입의 아미노산 서열 및 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, WO2004-031355의 서열번호 1 내지 14에 개시된 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 절단 부위는 프로테아제에 의하여 특정 절단 부위에서 절단되어 질 수 있는 펩티드 기질일 수 있다. 상기 절단 부위는 예를 들면, 신경독소의 내생성 프로테아제에 의하여 인식되고 절단되는 절단 부위일 수 있다. 신경독소의 절단 부위는 자연적으로 발생하거나 인위적으로 만들어진 것일 수 있다. 신경독소 절단부위는 예를 들면, BoNT/A, BoNT/E 프로테아제, 또는 이들의 변이체에 의해서 인식되고 절단되는 단백질에서 유래된 것일 수 있다. 상기 단백질은 SNAP-25, 그의 이소폼, 파랄로그, 또는 오소로그일 수 있다. SNAP-25는 사람, rat, mouse, bovine, danio, carassius, xenopus, torpedo, strongylocentrotus, loligo, lymnaea 또는 aplysia 유래의 것일 수 있다. SNAP-25는 SNAP-25A 또는 SNAP-25B일 수 있다.
또한, 신경독소 절단부위는 예를 들면, BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G 프로테아제, 또는 이들의 변이체에 의해서 인식되고 절단되는 단백질에서 유래된 것일 수 있다. 상기 단백질은 VAMP, 그의 이소폼, 파랄로그, 또는 오소로그일 수 있다. 상기 단백질은 VAMP, 그의 이소폼, 파랄로그, 또는 오소로그는 예를 들면, 인간 혹은 마우스의 VAMP-1, VAMP-2, VAMP-3/cellubravin, bovine VAMP-2, rat VAMP-2 또는 VAMP-3, chicken VAMP-1, VAMP-2 또는 VAMP-3, Torpedo VAMP-1, Strongylocentrotus VAMP, Drosophila sybA, synB, synC, synD, 또는 syn, Hirudo VAMP, Xenopus VAMP-2 또는 VAMP-3, Danio VAMP-1 또는 VAMP-2, Loligo VAMP, Lymnaea VAMP, Aplysia VAMP 또는 Caenorhabditis SNB1-like일 수 있다.
또한, 신경독소 절단부위는 BoNT/C 프로테아제, 또는 그 변이체에 의해서 인식되고 절단되는 단백질에서 유래된 것일 수 있다. 상기 단백질은 Syntaxin 또는 그 오소로그, 파랄로그, 상동체일 수 있다. 상기 단백질은 예를 들면, 인간 혹은 마우스의 Syntaxin 1A, Syntaxin 1B1, Syntaxin 2-1, Syntaxin 2-2, Syntaxin 2-3, Syntaxin 3A 또는 Syntaxin 1B2, bovine 또는 rat Syntaxin 1A, Syntaxin 1B1 또는 Syntaxin 1B2, rat Syntaxin 2 또는 Rat syntaxin 3, mouse Syntaxin 1A, Syntaxin 1B1, Syntaxin 1B2, Syntaxin 2, Syntaxin 3A, Syntaxin 3B 또는 Syntaxin 3C, chicken Syntaxin 1A 또는 Syntaxin 2; Xenopus Syntaxin 1A 또는 Syntaxin 1B, Danio Syntaxin 1A, Syntaxin 1B 또는 Syntaxin 3, Torpedo Syntaxin 1A 또는 Syntaxin 1B, Strongylocentrotus Syntaxin 1A 또는 Syntaxin 1B, Drosophila Syntaxin 1A 또는 Syntaxin 1B, Hirudo Syntaxin 1A 또는 Syntaxin 1B, Loligo Syntaxin 1A 또는 Syntaxin 1B, Lymnaea Syntaxin 1A 또는 Syntaxin 1B 또는 그 오소로그, 파랄로그, 상동체일 수 있다.
상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 세포 내에서 제1 폴리뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 하는 조절 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 발현가능한 재조합 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 조절 서열은 프로모터, 인핸서, 터미네이터 서열, 또는 이들의 조합인 것일 수 있다. 상기 세포는 상기 프로테아제와 결합하고 내재화(internalization)할 수 있는 것일 수 있다.
상기 재조합 폴리뉴클레오티드에 있어서, 상기 프로테아제는 신경독소 폴리펩티드이고, 상기 세포는 상기 신경독소 폴리펩티드와 결합, 내재화, 세포 내부에서 방출 또는 이들의 조합이 일어나도록 되어 있는 것일 수 있다. 상기 세포는 클로스트리움 속의 신경독소(neurotoxin)에 중독될 수 있는 것일 수 있다. 상기 신경독소 폴리펩티드는 보툴리눔 독소 혈청 타입 A(botulinum toxin serotype A: BoNT/A), BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/CD, BoNT/DC, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/FA, BoNT/G, 테타누스 신경독소(TeNT), 또는 이들의 변이체인 것일 수 있다. 상기 세포는 내분비성 세포(endocrine cell) 등일 수 있다. 상기 세포는 일차 뉴론(primary neuron), neuroblastoma 세포, 또는 만능 줄기세포로부터 분화된 뉴론인 것일 수 있다.
상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 벡터(vector)일 수 있다. 상기 벡터는 발현 벡터인 것일 수 있다. 상기 벡터는 바이러스 벡터(viral vector), 플라스미드 벡터(plasmid vector), 또는 선형 핵산 구조체(linear nucleic acid construct)일 수 있다.
상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 제1 폴리뉴클레오티드의 상류 또는 하류에 연결된 비시스트론 서열(bicistronic sequence)을 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 비시스트론 서열은 5'-캡(cap) 비의존적으로 번역(5'-cap independently tanslate)이 될 수 있도록 하는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 상기 비시스트론 서열은 mRNA로부터 폴리펩티드를 합성하는 번역(translation) 동안 리보솜이 하나의 5'-캡을 가진 mRNA로부터 2 이상의 폴리펩티드를 합성하도록 하는 뉴클레오티드 서열인 것일 수 있다. 상기 비시스트론 서열은 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosomal entry site: IRES) 또는 리보솜이 펩티드 결합을 형성하는 것을 누락(skip)하도록 하는 것인 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 리보솜이 펩티드 결합을 형성하는 것을 누락(skip)하도록 하는 비시스트론 서열은 P2A, T2A, E2A, 또는 F2A (예, 서열번호 13, 20, 22, 또는 24)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(예, 서열번호 5, 19, 21,또는 23)일 수 있다.
상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 또한 상기 비시스트론 서열의 상류 또는 하류에 작동가능하게 연결된 내부 표준 리포터를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 내부 표준 리포터는 상기 리포터 모이어티와 다른 것일 수 있다. 상기 내부 표준 리포터는 검출가능한 신호를 방출하거나, 그에 의하여 촉매되는 반응에서 검출가능한 신호를 방출하는 물질로 전환하는 물질인 것일 수 있다. 상기 내부 표준 리포터는 형광 단백질, β-lactamase, β-galactosidase, alkaline phosphatase, chloramphenicol acetyaltransferase, β-glucuronidase, peroxidase 및 luciferase로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 형광 단백질은 GFP, YFP, Citrine, CFP, RFP, Kaede, PA-GFP, Emerald, Venus, DsRed, mHoneydew, mBanana, mOrange, tdTomato, mTangerine, mStrawberry, mCherry, mRasberry, mPlum, ZsGreen, 및 ZsYellow 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
도 1은 일 양상에 따른 재조합 폴리뉴클레오티드의 구조를 나타낸 도면이다. 도 1의 A 및 B에서, R, S, 및 D는 각각 리포터 모이어티(reporter moiety), 기질 모이어티(substrate moiety), 및 탈안정화 모이어티(destabilization moiety)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 도 1의 B에서, I, 및 B는 각각 내부 표준 리포터(internal standard reporter), 및 비시스트론 서열(bicistronic sequence)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 도 1에서, 상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 왼쪽부터 오른쪽으로 5'->3의 순서로 기재된 것이다. 도 1의 A에 나타낸 바와 같이, 상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 R-S-D의 구조를 가질 수 있다. 그러나, 이 구조는 예시적인 것이며, 상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 추가적인 -S-의 구조가 R과 D 사이에 연결되어, 2개 이상, 예를 들면, 3, 또는 4 이상의 기질 모이어티를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, -D 구조도 2개 이상, 예를 들면 3, 또는 4 이상의 탈안정화 모이어티를 포함할 수 있다. 도 1의 A에 나타낸 바와 같이, 상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 I-B-R-S-D의 구조를 갖고 있다. 그러나, 이 구조는 예시적인 것이며, 상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 추가적인 -I-B-의 구조가 5' 위치에 연결되어, 2개 이상, 예를 들면, 3, 또는 4 이상의 내부 표준 리포터를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 R-S-D-B-I의 구조를 가질 수 있다. 그러나, 이 구조는 예시적인 것이며, 상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 추가적인 -B-I-의 구조가 3' 위치에 연결되어, 2개 이상, 예를 들면, 3, 또는 4 이상의 내부 표준 리포터를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
도 2는 일 양상에 따른 재조합 폴리뉴클레오티드의 구조 및 그에 의하여 발현된 폴리펩티드와 프로테아제의 반응을 나타내는 도면이다. 도 2에서, 일 양상에 따른 재조합 폴리뉴클레오티드에 의하여 발현된 폴리펩티드는 프로테아제의 존재하에서 기질 모이어티의 절단 부위가 절단되어, 리포터 모이어티 단편과 나머지로 단편화된다.
도 3은 일 양상에 따른 재조합 폴리뉴클레오티드가 세포 내에서 프로테아제와 접촉하는 경우를 나타내는 도면이다. 도 3에서, 일 양상에 따른 재조합 폴리뉴클레오티드에 의하여 발현된 폴리펩티드는 프로테아제의 존재하에서 기질 모이어티의 절단 부위가 절단되어, 리포터 모이어티 단편과 나머지로 단편화된다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 세포 내에 프로테아제가 형질감염 경우(상단), R-S-D 구조를 갖는 폴리펩티드는 S 부위에서 절단되어 리포터 모이어티는 탈안정화 모이어티(D)로부터 분리되어, 탈안정화 모이어티(D)가 형질감염 경우에 비하여 더 안정화된다. 그에 따라서, 상기 리포터 모이어티 또는 그로부터 유래되는 물질로부터 측정되는 신호는, 탈안정화 모이어티(D)가 형질감염 경우에 비하여 더 강하다. 도 3에서 하단은 세포 내에 프로테아제가 존재하지 않는 경우, R-S-D 구조를 갖는 폴리펩티드는 탈안정화 모이어티(D)를 그대로 유지하고 있어서, 탈안정화 모이어티(D)에 의하여 R-S-D 구조를 갖는 폴리펩티드의 수준이 낮아지고, 그에 따라서 그로부터 측정되는 신호도 작아진다는 것을 나타낸다.
도 4는 일 양상에 따른 내부 표준 리포터를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 재조합 폴리뉴클레오티드가 세포 내에서 프로테아제와 접촉하는 경우를 나타내는 도면이다. 도 4에서, 일 양상에 따른 재조합 폴리뉴클레오티드에 의하여 발현된 폴리펩티드는 프로테아제의 존재하에서 기질 모이어티의 절단 부위가 절단되어, 리포터 모이어티 단편과 나머지로 단편화된다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 세포 내에 프로테아제가 형질감염 경우(A), R-S-D 구조를 갖는 폴리펩티드는 S 부위에서 절단되어 리포터 모이어티는 탈안정화 모이어티(D)로부터 분리되어, 탈안정화 모이어티(D)가 형질감염 경우에 비하여 더 안정화된다. 그에 따라서, 상기 리포터 모이어티 또는 그로부터 유래되는 물질로부터 측정되는 신호는, 탈안정화 모이어티(D)가 형질감염 경우에 비하여 더 강하다. 도 4에서 하단(B)은 세포 내에 프로테아제가 존재하지 않는 경우, R-S-D 구조를 갖는 폴리펩티드는 탈안정화 모이어티(D)를 그대로 유지하고 있어서, 탈안정화 모이어티(D)에 의하여 R-S-D 구조를 갖는 폴리펩티드의 수준이 낮아지고, 그에 따라서 그로부터 측정되는 신호도 작아진다는 것을 나타낸다. 도 4에 있어서, 상기 재조합 폴리뉴클레오티드로부터 발현되는 내부 표준 리포터 단백질은 프로테아제의 존재 유무와 관계없이 세포 내에서 발현된다. 반면, 상기 R-S-D 폴리펩티드는 상기 비시스트론 서열에 의하여 5'-캡 비의존적으로 번역되어 합성된다. 따라서, 상기 내부 표준 리포터로부터 측정되는 신호는 숙주세포에서 상기 재조합 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 조건을 표준화하는데 사용될 수 있다.
제2 양상은 상기한 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포를 제공한다. 상기 숙주세포는 상기 프로테아제를 세포 내, 예를 들면 세포질 내로 전치시킬 수 있는 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 프로테아제 예를 들면, 신경독소 폴리펩티드를 세포 내 예를 들면 세포질 중으로 전치(translocate)시킬 수 있는 세포일 수 있다. 상기 숙주세포는 예를 들면, 프로테아제와 수용체를 통하여 결합하고 그 복합체를 세포 내 예를 들면, 세포질 중으로 전치시키는 것일 수 있다. 그러나, 청구된 발명이 특정한 전치 기작에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 상기 숙주세포는 프로테아제 예를 들면, 단백질 분해 활성 신경독소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포질 내에서 발현할 수 있는 세포일 수 있다. 상기 숙주세포는 프로테아제 예를 들면, 단백질 분해 활성 신경독소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 프로테아제 예를 들면, 단백질 분해 활성 신경독소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 염색체 내에 삽입되어 있거나, 염색체 외에 형질감염 것일 수 있다. 프로테아제 예를 들면, 단백질 분해 활성 신경독소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 일시적(transient) 또는 영구적(permanently)으로 발현되는 것일 수 있다. 프로테아제 예를 들면, 단백질 분해 활성 신경독소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 그 자체 또는 벡터와 같은 비히클에 포함된 형태일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 외부로부터 도입된 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 재조합 세포일 수 있다. 상기 숙주세포는 내분비성 세포(endocrine cell)일 수 있다. 상기 세포는 일차 뉴론(primary neuron), neuroblastoma 세포, 및 만능 줄기세포로부터 분화된 뉴론으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
상기 숙주세포는 상기 재조합 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 상기 재조합 폴리뉴클레오티드로부터 리포터 모이어티; 탈안정화 모이어티 및 상기 리포터 모이어티와 상기 탈안정화 모이어티를 작동적으로 연결하는 기질 모이어티로서, 상기 기질 모이어티는 프로테아제 활성의 절단 부위(cleavage site)를 포함하는 것인 기질 모이어티를 포함하는 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드와 상기 내부 표준 리포터 단백질을 발현하는 것일 수 있다.
제3 양상은 상기한 재조합 폴리뉴클레오티드에 의하여 코딩되는 폴리펩티드, 및 리포터 모이어티 또는 내부 표준 리포터 또는 그 산물에 의하여 방출되는 신호를 측정하기 위한 검출제(detection agent)를 포함하는, 프로테아제, 예를 들면 신경독소 폴리펩티드의 단백질 분해 활성(proteolytic activity)을 결정하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트에 있어서, 상기 리포터는 루시퍼라제이고, 상기 키트는 루시퍼라제 기질을 더 포함하고, 상기 검출제는 상기 루시퍼라제 기질의 효소적 전환을 측정하기 위한 것 예를 들면, 광검출기일 수 있다. 상기 리포터는 형광 단백질이고, 상기 검출제는 상기 형광 단백질로부터 나오는 형광을 측정하기 위한 것, 예를 들면, 상기 형광 단백질을 여기 광을 이용하여 여기시키고 이에 따라 방출되는 형광을 측정하기 위한 장비일 수 있다. 상기 내부 표준 리포터는 상기 리포터 모이어티와는 다른 것일 수 있다. 상기 리포터는 상기 리포터 모이어티와는 다른 루시퍼라제 또는 형광 단백질일 수 있다.
제4 양상은 상기한 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포, 및 리포터 모이어티 또는 내부 표준 리포터 또는 그 산물에 의하여 방출되는 신호를 측정하기 위한 검출제(detection agent)를 포함하는, 프로테아제 예를 들면, 신경독소 폴리펩티드의 단백질 분해 활성(proteolytic activity)을 결정하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트에 있어서, 상기 리포터는 루시퍼라제이고, 상기 키트는 루시퍼라제 기질을 더 포함하고, 상기 검출제는 상기 루시퍼라제 기질의 효소적 전환을 측정하기 위한 것일 수 있다. 상기 리포터는 형광 단백질이고, 상기 검출제는 상기 형광 단백질로부터 나오는 형광을 측정하기 위한 것, 예를 들면, 상기 형광 단백질을 여기 광을 이용하여 여기시키고 이에 따라 방출되는 형광을 측정하기 위한 장비일 수 있다. 상기 내부 표준 리포터는 상기 리포터 모이어티와는 다른 것일 수 있다. 상기 리포터는 상기 리포터 모이어티와는 다른 루시퍼라제 또는 형광 단백질일 수 있다.
제5 양상은 상기한 재조합 폴리뉴클레오티드에 의하여 코딩되는 폴리펩티드를 프로테아제 폴리펩티드를 포함할 것으로 의심되는 시료와 접촉시키는 단계; 및 접촉된 산물 중의 상기 리포터 모이어티 또는 그 산물로부터 방출되는 신호를 측정하는 단계;를 포함하는, 시료 중의 프로테아제 활성을 결정하는 방법을 제공한다.
제6 양상은 상기한 재조합 폴리뉴클레오티드에 의하여 코딩되는 폴리펩티드를 프로테아제 폴리펩티드에 접촉시키는 단계; 접촉된 산물 중의 상기 리포터 모이어티 또는 그 산물로부터 방출되는 신호를 측정하는 단계; 및 상기 측정된 신호로부터 상기 신호의 방출 개시 시점, 및 지속시간 중 하나 이상을 결정하는 단계를 포함하는, 시료 중의 프로테아제 폴리펩티드의 특성을 결정하는 방법을 제공한다.
제5 및 제6 양상의 상기 방법은 상기한 재조합 폴리뉴클레오티드에 의하여 코딩되는 폴리펩티드를 프로테아제 폴리펩티드를 포함할 것으로 의심되는 시료 또는 프로테아제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 접촉은 상기 폴리펩티드 중의 프로테아제 활성의 절단 부위가 분해되도록 하는 조건하에서 수행될 수 있다. 상기 프로테아제는 신경독소 폴리펩티드일 수 있다.
상기 접촉은 액체 매질 중에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 액체 매질은 상기 프로테아제의 단백질 분해 활성이 작동하도록 하는 조건을 갖는 것일 수 있다. 상기 조건은 pH, 온도, 보조인자, 염 농도, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 액체 매질은 인산 완충 염수(PBS)와 같은 완충용액일 수 있다.
제5 및 제6 양상의 상기 방법은 또한 접촉된 산물 중의 상기 리포터 모이어티 또는 그 산물로부터 방출되는 신호를 측정하는 단계를 포함한다. 상기 리포터 모이어티가 검출가능한 신호를 방출하는 폴리펩티드인 경우, 상기 단계는 상기 신호를 직접적으로 측정하는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 리포터 모이어티가 GFP와 같은 형광 단백질인 경우, 그 형광을 측정하는 것일 수 있다. 형광을 측정하는 것은 상기 접촉된 산물에 여기광을 조사하고, 상기 접촉된 산물로부터 나오는 방사광을 측정하는 것일 수 있다. 여기광 및 방사광의 파장은 선택되는 형광 단백질에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 리포터 모이어티가 그에 의하여 촉매되는 반응에서 검출가능한 신호를 방출하는 물질로 전환하는 폴리펩티드인 경우, 상기 단계는 접촉된 산물 중에 상기 리포터 모이어티의 촉매 활성에 필요한 기질을 첨가하여, 기질을 검출가능한 신호를 방출하는 물질로 전환시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 다음으로, 검출가능한 신호를 방출하는 물질로부터 상기 신호를 측정하는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 리포터 모이어티는 루시퍼라제이고, 상기 접촉시키는 단계 또는 신호를 측정하는 단계는, 반응액 중에 루시퍼라제 기질을 첨가하는 단계를 포함하고, 상기 검출은 상기 루시퍼라제 기질의 효소적 전환을 측정하기 위한 것일 수 있다. 상기 루시퍼라제 기질은 루시페린일 수 있다.
제5 및 제6 양상의 상기 방법에 있어서, 상기 측정된 신호를 대조군으로부터 측정된 신호와 비교하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 대조군은 프로테아제 예를 들면, 신경독소 폴리펩티드가 없거나 알려진 농도의 프로테아제 예를 들면, 신경독소 폴리펩티드를 포함하는 시료를 사용한 것을 제외하고는 동일한 과정에 의하여 측정된 것일 수 있다. 상기 방법은 상기 비교하는 단계에 의하여 얻어진 신호 대 시료 중 프로테아제의 수준과의 상관관계에 의하여 시료 중의 프로테아제의 수준을 결정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
제6 양상의 상기 방법은 상기 측정된 신호로부터 상기 신호의 방출 개시 시점, 및 지속시간 중 하나 이상을 결정하는 단계를 포함한다. 상기 신호의 방출 개시점, 및 지속시간 중 하나 이상은 통상의 기술자에 의하여 상기 측정된 신호로부터 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들면, 통상의 기술자는 시간에 따른 프로테아제 활성을 나타내는 신호 값, 예를 들면, 방출된 신호로부터 방출 개시 시점, 및 지속시간을 결정할 수 있다. 상기 시간에 따른 프로테아제 활성을 나타내는 신호 값은 시간에 따른 방출된 신호의 측정값으로부터 상기 신호의 방출 개시 시점, 및 지속시간을 결정할 수 있다. 상기 신호의 방출 개시 시점, 및 지속시간 중 하나 이상은 프로테아제의 타입과 같은 특성에 따라 달라지는 것일 수 있다. 상기 리포터 모이어티가 검출 가능한 신호를 방출하는 폴리펩티드인 경우, 프로테아제 활성에 의해 절단 부위가 분해될 경우 방출된 신호가 증가하기 시작하여 프로테아제 활성이 사라질 경우 방출된 신호가 감소하는 것일 수 있다. 예를 들면, 동일한 조건에서 측정된 경우 프로테아제의 특성에 따라, 상기 신호의 방출 개시 시점, 및 지속시간 중 하나 이상이 달라질 수 있다. 또한, 상기 프로테아제는 이러한 상대적 비교뿐만 아니라, 상기 신호의 방출 개시 시점, 및 지속시간 중 하나 이상의 절대값 또는 그 범위로부터 다른 프로테아제와 구별될 수 있다. 따라서, 상기 결정하는 단계는 알려진 프로테아제에 대한 상기 신호의 방출 개시 시점, 및 지속시간 중 하나 이상과 비교하는 것 또는 알려진 프로테아제의 상기 신호의 방출 개시 시점, 및 지속시간 중 하나 이상의 절대값 또는 그 범위로부터 프로테아제 특성을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 상기 신호의 방출 개시 시점, 및 지속시간 중 하나 이상에 따라 그 프로테아제에 의하여 치료되어질 적응증(indication)이 달라질 수 있다. 따라서, 상기 방법은 결정된 프로테아제 특성에 근거하여, 프로테아제에 의하여 개체에서 치료되어질 적응증을 결정하는 것을 포함할 수 있다.
제7 양상은 상기한 숙주세포를 프로테아제 폴리펩티드를 포함할 것으로 의심되는 시료와 접촉시키는 단계; 및 접촉된 산물 중의 상기 리포터 모이어티 또는 상기 내부 표준 리포터 또는 그 산물로부터 방출되는 신호를 측정하는 단계;를 포함하는, 시료 중의 프로테아제 활성을 결정하는 방법을 제공한다.
제8 양상은 상기한 숙주세포를 프로테아제 폴리펩티드에 접촉시키는 단계; 접촉된 산물 중의 상기 리포터 모이어티, 상기 내부 표준 리포터 또는 그 산물로부터 방출되는 신호를 측정하는 단계; 및 상기 측정된 신호로부터 상기 신호의 방출 개시 시점, 및 지속시간 중 하나 이상을 결정하는 단계를 포함하는, 시료 중의 프로테아제 폴리펩티드의 특성을 결정하는 방법을 제공한다.
제7 및 제8 양상의 상기 방법은 상기한 숙주세포를 프로테아제 폴리펩티드를 포함할 것으로 의심되는 시료와 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 접촉은 프로테아제 활성의 절단 부위가 분해되도록 하는 조건하에서 수행될 수 있다. 상기 프로테아제는 신경독소 폴리펩티드일 수 있다. 상기 접촉은 액체 매질 중에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 액체 매질은 상기 프로테아제의 단백질 분해 활성이 작동하도록 하는 조건을 갖는 것일 수 있다. 상기 조건은 pH, 온도, 보조인자, 염 농도, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 액체 매질은 인산 완충 염수(PBS)와 같은 완충용액, 또는 숙주세포가 배양되는 배지일 수 있다.
제7 및 제8 양상의 상기 방법에 있어서, 상기 숙주세포는 상기 프로테아제를 세포 내, 예를 들면 세포질 내로 전치시킬 수 있는 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 프로테아제 예를 들면, 신경독소 폴리펩티드를 세포 내 예를 들면 세포질 중으로 전치(translocate)시킬 수 있는 세포일 수 있다. 상기 숙주세포는 예를 들면, 프로테아제와 수용체를 통하여 결합하고 그 복합체를 세포 내 예를 들면, 세포질 중으로 전치시키는 것일 수 있다. 그러나, 청구된 발명이 특정한 전치 기작에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 상기 숙주세포는 프로테아제 예를 들면, 단백질 분해 활성 신경독소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포질 내에서 발현할 수 있는 세포일 수 있다. 상기 숙주세포는 프로테아제 예를 들면, 단백질 분해 활성 신경독소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 프로테아제 예를 들면, 단백질 분해 활성 신경독소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 염색체 내에 삽입되어 있거나, 염색체 외에 존재하는 것일 수 있다. 프로테아제 예를 들면, 단백질 분해 활성 신경독소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 일시적(transient) 또는 안정적으로(stably) 발현되는 것일 수 있다. 프로테아제 예를 들면, 단백질 분해 활성 신경독소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 그 자체 또는 벡터와 같은 비히클에 포함된 형태일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 외부로부터 도입된 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 재조합 세포일 수 있다. 상기 숙주세포는 내분비성 세포(endocrine cell)일 수 있다. 상기 숙주세포는 일차 뉴론(primary neuron), neuroblastoma 세포, 및 만능 줄기세포로부터 분화된 뉴론으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 상기 재조합 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 상기 재조합 폴리뉴클레오티드로부터 리포터 모이어티; 탈안정화 모이어티 및 상기 리포터 모이어티와 상기 탈안정화 모이어티를 작동적으로 연결하는 기질 모이어티로서, 상기 기질 모이어티는 프로테아제 활성의 절단 부위(cleavage site)를 포함하는 것인 기질 모이어티를 포함하는 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드와 상기 내부 표준 리포터 단백질을 발현하는 것일 수 있다.
제7 및 제8 양상의 상기 방법은 또한 접촉된 산물 중의 상기 리포터 모이어티 또는 내부 표준 리포터 또는 그 산물로부터 방출되는 신호를 측정하는 단계를 포함한다. 상기 리포터 모이어티 또는 내부 표준 리포터가 검출가능한 신호를 방출하는 폴리펩티드인 경우, 상기 단계는 상기 신호를 직접적으로 측정하는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 리포터 모이어티가 GFP와 같은 형광 단백질인 경우, 그 형광을 측정하는 것일 수 있다. 형광을 측정하는 것은 상기 접촉된 산물에 여기광을 조사하고, 상기 접촉된 산물로부터 나오는 방사광을 측정하는 것일 수 있다. 여기광 및 방사광의 파장은 선택되는 형광 단백질에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 리포터 모이어티 또는 내부 표준 리포터가 그에 의하여 촉매되는 반응에서 검출가능한 신호를 방출하는 물질로 전환하는 폴리펩티드인 경우, 상기 단계는 접촉된 산물 중에 상기 리포터 모이어티의 촉매 활성에 필요한 기질을 첨가하여, 기질을 검출가능한 신호를 방출하는 물질로 전환시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 다음으로, 검출가능한 신호를 방출하는 물질로부터 상기 신호를 측정하는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 리포터 모이어티 또는 내부 표준 리포터는 루시퍼라제이고, 상기 접촉시키는 단계 또는 신호를 측정하는 단계는, 반응액 중에 루시퍼라제 기질을 첨가하는 단계를 포함하고, 상기 검출은 상기 루시퍼라제 기질의 효소적 전환을 측정하기 위한 것일 수 있다. 상기 루시퍼라제 기질은 루시페린일 수 있다. 예를 들면, 상기 리포터 모이어티는 루시퍼라제이고, 상기 접촉시키는 단계 또는 신호를 측정하는 단계는, 반응액 중에 루시퍼라제 기질을 첨가하는 단계를 포함하고, 상기 검출은 상기 루시퍼라제 기질의 효소적 전환을 측정하기 위한 것일 수 있다. 상기 루시퍼라제 기질은 루시페린일 수 있다.
제7 및 제8 양상의 방법에 있어서, 상기 리포터는 형광 단백질이고, 상기 측정하는 단계는 상기 형광 단백질로부터 나오는 형광을 측정하는 것을 포함하는 것일 수 있다.
제7 및 제8 양상의 방법에 있어서, 상기 측정된 신호를 대조군으로부터 측정된 신호와 비교하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 대조군은 신경독소 폴리펩티드가 없거나 알려진 농도의 신경독소 폴리펩티드를 포함하는 시료를 사용한 것을 제외하고는 동일한 과정에 의하여 측정된 것일 수 있다. 상기 방법은 상기 비교하는 단계에 의하여 얻어진 신호 대 시료 중 신경독소 폴리펩티드의 수준과의 상관관계에 의하여 시료 중의 신경독소 폴리펩티드의 수준을 결정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
제7 및 제8 양상의 방법에 있어서, 상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 제1 폴리뉴클레오티드의 상류 또는 하류에 연결된 비시스트론 서열(bicistronic sequence) 및 상기 비시스트론 서열의 상류 또는 하류에 작동가능하게 연결된 내부 표준 리포터를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것일 수 있다. 이 경우, 상기 방법은 내부 표준 리포터로부터 방출되는 신호를 측정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 방법은 또한 내부 표준 리포터로부터 방출되는 신호 대비 상기 리포터로부터 방출되는 신호의 수준을 결정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
제8 양상의 상기 방법은 상기 측정된 신호로부터 상기 신호의 방출 개시 시점, 및 지속시간 중 하나 이상을 결정하는 단계를 포함한다. 상기 신호의 방출 개시점, 및 지속시간 중 하나 이상은 통상의 기술자에 의하여 상기 측정된 신호로부터 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들면, 통상의 기술자는 시간에 따른 프로테아제 활성을 나타내는 신호 값, 예를 들면, 방출된 신호로부터 상기 신호의 방출 개시 시점, 및 지속시간을 결정할 수 있다. 상기 시간에 따른 프로테아제 활성을 나타내는 신호 값은 시간에 따른 방출된 신호의 측정값으로부터 상기 신호의 방출 개시 시점, 및 지속시간을 결정할 수 있다. 상기 신호의 방출 개시 시점, 및 지속시간 중 하나 이상은 프로테아제의 타입과 같은 특성에 따라 달라지는 것일 수 있다. 상기 리포터 모이어티가 검출 가능한 신호를 방출하는 폴리펩티드인 경우, 프로테아제 활성에 의해 절단 부위가 분해될 경우 방출된 신호가 증가하기 시작하여 프로테아제 활성이 사라질 경우 방출된 신호가 감소하는 것일 수 있다. 예를 들면, 동일한 조건에서 측정된 경우 프로테아제의 특성에 따라, 상기 신호의 방출 개시 시점과 그 지속시간 중 하나 이상이 달라질 수 있다. 또한, 상기 프로테아제는 이러한 상대적 비교뿐만 아니라, 상기 신호의 방출 개시 시점, 및 지속시간 중 하나 이상의 절대값 또는 그 범위로부터 다른 프로테아제와 구별될 수 있다. 따라서, 상기 결정하는 단계는 알려진 프로테아제에 대한 상기 신호의 방출 개시 시점, 및 지속시간 중 하나 이상과 비교하는 것 또는 알려진 프로테아제의 상기 신호의 방출 개시 시점, 및 지속시간 중 하나 이상의 절대값 또는 그 범위로부터 프로테아제 특성을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 상기 신호의 방출 개시 시점, 및 지속시간 중 하나 이상에 따라 그 프로테아제에 의하여 치료되어질 적응증(indication)이 달라질 수 있다. 따라서, 상기 방법은 결정된 프로테아제 특성에 근거하여, 프로테아제에 의하여 개체에서 치료되어질 적응증을 결정하는 것을 포함할 수 있다.
제8 양상의 상기 방법은 세포의 손상 없이 예를 들면, 세포 분쇄(lysis) 없이 상기 측정된 신호로부터 상기 신호의 방출 개시 시점, 및 지속시간 중 하나 이상을 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
제9 양상은 상기 숙주세포에 프로테아제 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 도입시키는 단계; 및 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 숙주세포를 배양하고 배양물 중의 상기 리포터 모이어티 또는 상기 내부 표준 리포터 또는 그 산물로부터 방출되는 신호를 측정하는 단계;를 포함하는, 숙주세포가 프로테아제를 발현 또는 저해할 수 있는 능력을 측정하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 상기 숙주세포에 프로테아제 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 도입시키는 단계를 포함한다. 숙주세포 및 프로테아제에 대하여는 상기한 바와 같다. 도입시키는 단계는 형질전환(transformation), 형질감염(transfection), 또는 형질도입(transduction)과 같은 임의의 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 방법에 의할 수 있다. 상기 숙주세포는 프로테아제 예를 들면, 단백질 분해 활성 신경독소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포질 내에서 발현할 수 있는 세포일 수 있다. 상기 숙주세포는 프로테아제 예를 들면, 단백질 분해 활성 신경독소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 프로테아제 예를 들면, 단백질 분해 활성 신경독소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 염색체 내에 삽입되어 있거나, 염색체 외에 존재하는 것일 수 있다. 프로테아제 예를 들면, 단백질 분해 활성 신경독소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 일시적(transient) 또는 안정적(stably)으로 발현되는 것일 수 있다. 프로테아제 예를 들면, 단백질 분해 활성 신경독소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 그 자체 또는 벡터와 같은 비히클에 포함된 형태일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 외부로부터 도입된 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 재조합 세포일 수 있다. 상기 숙주세포는 내분비 세포일 수 있다. 상기 숙주세포는 일차 뉴론(primary neuron), neuroblastoma 세포, 및 만능 줄기세포로부터 분화된 뉴론으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
상기 방법은 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 숙주세포를 배양하고 배양물 중의 상기 리포터 모이어티 또는 상기 내부 표준 리포터 또는 그 산물로부터 방출되는 신호를 측정하는 단계를 포함한다. 상기 배양은 시험 물질의 존재하에서 수행될 수 있다. 상기 시험 물질은 단백질, 다당과 같은 중합체이거나 작은 분자 화합물(small molecule compound)일 수 있다. 상기 시험 물질은 프로테아제를 저해하거나, 촉진할 것으로 여겨지는 물질일 수 있다. 상기 숙주세포는 상기 후보물질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 것일 수 있다. 따라서, 상기 방법은 프로테아제 활성을 조절하는 물질을 스크리닝하는 방법일 수 있다. 상기 스크리닝하는 방법에서, 시험 물질을 사용하여 얻어진 신호인 실험군 신호와 대조군 실험으로부터 얻어진 신호인 대조군 신호를 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 대조군은 프로테아제 활성을 조절하는 것으로 알려진 물질을 사용한 양성 대조군 또는 상기 후보 물질을 제외하고 동일하게 수행하여 얻어진 음성 대조군일 수 있다. 상기 방법은 상기 비교하는 단계로부터 얻어진 비교 결과로부터 후보 물질이 프로테아제 활성을 조절하는 물질인지를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 실험군 신호가 음성 대조군 신호 보다 큰 경우, 상기 물질은 프로테아제 활성을 촉진하는 활성을 갖는 것으로 결정할 수 있다. 또한, 상기 실험군 신호가 음성 대조군 신호 보다 작은 경우, 상기 물질은 프로테아제 활성을 저해하는 활성을 갖는 것으로 결정할 수 있다.
도 1은 일 양상에 따른 재조합 폴리뉴클레오티드의 구조를 나타낸 도면이다.
도 2는 일 양상에 따른 재조합 폴리뉴클레오티드의 구조 및 그에 의하여 발현된 폴리펩티드와 프로테아제의 반응을 나타내는 도면이다.
도 3은 일 양상에 따른 재조합 폴리뉴클레오티드가 세포 내에서 프로테아제와 접촉하는 경우를 나타내는 도면이다.
도 4은 일 양상에 따른 내부 표준 리포터를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 재조합 폴리뉴클레오티드가 세포 내에서 프로테아제와 접촉하는 경우를 나타내는 도면이다.
도 5는 pFB 벡터1로 형질감염된 NG108-15 세포를 신경세포로 분화시킨 후 보툴리눔 독소 A로 중독화시킨 후 리포터 모이어티의 활성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 6은 pFB 벡터2로 형질감염된 NG108-15 세포를 신경세포로 분화시킨 후 보툴리눔 독소 A로 중독화시킨 후 세포를 형광 현미경으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 pFB 벡터3으로 형질감염된 NG108-15 세포를 신경세포로 분화시킨 후 보툴리눔 독소 A로 중독화시킨 후 세포의 리포터 모이어티의 활성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 8은 pFB 벡터3으로 형질감염된 SiMa 세포를 신경세포로 분화시킨 후 보툴리눔 독소 A로 중독화시킨 후 세포의 리포터 모이어티의 활성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 9는 pFB 벡터3으로 형질감염된 NT2 세포를 신경세포로 분화시킨 후 보툴리눔 독소 A로 중독화시킨 후 세포의 리포터 모이어티의 활성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 10은 pFB 벡터6으로 형질감염된 NG108-15 세포를 신경세포로 분화시킨 후 보툴리눔 독소 B의 경쇄를 발현하는 pCDNA4_BLC 벡터를 일시적 형질감염(transient transfection)한 NG108-15 세포로부터 발현된 리포터 모이어티 및 내부 표준 리포터 단백질로부터 나오는 신호를 확인한 결과를 나타낸다.
도 11은 pFB 벡터2로 형질감염된 NT2 세포를 안정화된 단일클론 유래 세포주로 확립하고 신경세포로 분화시킨 후 다른 농도의 BoNT/A로 중독화하고 발현된 리포터 모이어티 단백질로부터 나오는 신호를 확인한 결과를 나타낸다.
도 12 내지 14는 pFB 벡터2로 형질감염된 NT2 세포를 안정화된 단일클론 유래 세포주로 확립하고 신경세포로 분화시킨 후 다른 농도의 BoNT/A 함유 완제품으로 중독화하고 발현된 리포터 모이어티 및 내부 표준 리포터 단백질로부터 나오는 신호를 확인한 결과를 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예1: 리포터 모이어티-기질 모이어티-탈안정화 모이어티(이하 'R-S-D'라고도 함) 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드 및 그를 포함하는 세포의 제작
(1) 리포터 모이어티-기질 모이어티-탈안정화 모이어티(이하 'R-S-D'라고도 함) 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드의 제작
상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 두 가지 구조를 제작하였다. 하나는 R-S-D 구조를 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 것이고, 다른 하나는 I-B-R-S-D 구조를 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 것이다. 여기서, I 및 B는 각각 내부 표준 리포터를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 비시스트론 서열이다. 상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 플라스미드 벡터의 형태이다.
상기 내부 표준 리포터 또는 리포터 모이어티는 발광 혹은 형광 단백질을 코딩하고 있는 뉴클레오티드 서열을 사용하였다. 구체적으로, 발광 단백질을 코딩하는 서열은 반딧불-루시퍼라제 단백질(Firefly luciferase: FLuc)(예, 서열번호 9)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(예, 서열번호 1)과 나노-루시퍼라제 단백질(Nano-luciferase: NLuc)(서열번호 10)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 2)을 사용하고, 형광단백질을 코딩하는 서열은 강화된 녹색형광단백질(enhanced Green Fluorescence Protein: eGFP)(서열번호 11)을 코딩하고 있는 뉴클레오티드 서열(서열번호 3) 또는 엠체리 단백질(mCherry)(서열번호 12)을 코딩하고 있는 뉴클레오티드 서열(서열번호 4)을 사용하였다.
상기 비시스트론 서열은 돼지 테스코비루스-1(teschovirus-1)에서 유래된 자가-절단 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(P2A)(서열번호 5)을 사용하였다.
단백질 분해효소의 기질 모이어티는 보툴리눔 독소 타입 A형의 경우 인간 SNAP25의 C-말단부위로써 전체 207개 아미노산 서열 중 145번부터 207번까지의 아미노산 서열(서열번호 14)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 6) 또는 보툴리눔 독소 타입 B형의 경우 인간 VAMP2(서열번호 18)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 17)을 사용하였다.
탈안정화 모이어티는 PEST 서열(서열번호 16)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 8) 및 CL1 서열(서열번호 15)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열번호7)을 사용하였다.
상기 재조합 폴리뉴클레오티드의 제작 과정은 다음과 같았다:
먼저, pGL4.31 벡터(Promega)에서, 반딧불-루시퍼라제 단백질(Firefly luciferase: FLuc)(서열번호 9)을 코딩하는 뉴클레오티드(서열번호 1)(이하 'FLuc 서열'이라고 함)를, pNL1.1 벡터(Promega)에서 나노-루시퍼라제 단백질(Nano-luciferase: NLuc)(서열번호 10)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 2)(이하 'NLuc 서열'이라고 함)를, pEGFP-C1 벡터(clontech)에서 강화된 녹색형광단백질(enhanced Green Fluorescence Protein: eGFP)(서열번호 11)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 3)(이하 'eGFP 서열'이라고 함)을, pmCherry-C1 벡터에서 엠체리 단백질(mCherry)(서열번호 12)을 코딩하고 있는 뉴클레오티드 서열(서열번호 4)(이하 'mCherry 서열'이라고 함)을 얻었다. 인간 SNAP25의 C-말단부위로써 전체 207개 아미노산 서열 중 145번부터 207번까지의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열서열번호 6)(이하 'SNAP25 서열'이라고 함)과 인간 VAMP2를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(이하 'VAMP2 서열'이라고 함)은 인간 유래 세포주의 mRNA에서 RT-PCR을 통해 뉴클레오티드 서열을 합성하였다. CL1과 PEST이 융합된 CL1-PEST 폴리펩티드를 코딩하는 서열(이하 'CL1-PEST 서열'이라고 함), 및 돼지 테스코비루스-1(teschovirus-1)에서 유래된 자가-절단 펩티드 P2A를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(이하 'P2A 서열'이라고 함)은 유전자 합성을 통해 얻었다.
다음으로, 상기의 서열들의 조합으로 R-S-D 혹은 I-B-R-S-D의 재조합된 폴리뉴클레오티드를 제한효소를 이용한 유전자 클로닝 법을 이용하여 제작하였으며 pCDNA4 벡터(invitrogen) 또는 pFB 벡터(Agilent)의 BamHI/XhoI 제한효소 부위에 연결하여 재조합 벡터를 제작하였다. 예로서 NLuc 서열-SNAP25 서열-CL1-PEST 서열로 구성된 재조합 폴리뉴클레오티드가 pCDNA4 벡터의 BamHI/XhoI 효소 부위에 도입된 벡터(이하 "pCDNA4 벡터1"이라고도 함) 또는 pFB 벡터의 BamHI/XhoI 효소 부위에 도입된 pFB 벡터(이하 "pFB 벡터1"이라고도 함)를 제작하였다. 또한, 상기 mCherry 서열, SNAP25 서열, 및 CL1-PEST 서열로 구성된 재조합 폴리뉴클레오티드가 pCDNA4 벡터의 BamHI/XhoI 효소 부위에 도입된 벡터(이하 pCDNA4 벡터2) 또는 pFB 벡터의 BamHI/XhoI 효소 부위에 도입된 pFB 벡터(이하 "pFB 벡터2"이라고도 함)를 제작하였다. 또한, 상기 FLuc 서열, 및 P2a 서열, NLuc 서열, SNAP25 서열, 및 CL1-PEST 서열로 구성된 재조합 폴리뉴클레오티드가 pCDNA4 벡터의 BamHI/XhoI 효소 부위에 도입된 벡터(이하 pCDNA4 벡터3) 또는 pFB 벡터의 BamHI/XhoI 효소 부위에 도입된 pFB 벡터(이하 "pFB 벡터3"이라고도 함)를 제작하였다. 또한, 상기 FLuc 서열, P2a 서열, NLuc 서열, VAMP2 서열, 및 CL1-PEST 서열로 구성된 재조합 폴리뉴클레오티드가 pFB 벡터의 BamHI/XhoI 효소 부위에 도입된 pFB 벡터(이하 "pFB 벡터4"이라고도 함)를 제작하였다.
여기서 pCDNA4 벡터는 플라스미드 유래의 벡터이며 세포에서 상기 재조합 폴리뉴클레오티드를 일시적(transient) 발현을 시키기 위하여 사용하였다. 반면, pFB 벡터는 몰로니 생쥐 백혈병 바이러스(Moloney Murine Leukemia virus: MMLV) 유래의 벡터로서 형질감염을 통한 조작된 세포주, 즉 상기 재조합 폴리뉴클레오티드가 염색체 내에 도입된 세포주를 제작하는데 사용되었다.
제작된 플라스미드 벡터 및 바이러스 벡터는 시퀀싱을 통해 작제물의 구성을 확인하였으며 세포 배양용 수준으로 플라스미드 벡터 DNA를 정제 및 분리하였다.
(2) R-S-D 또는 I-B-R-S-D 폴리펩티드를 발현하는 세포의 제작
상기 (1)에서 제작된 벡터를 안정하고 일정하게 발현하는 세포주를 구축하기 위해 MMLV 유래 바이러스 벡터, 즉 pFB 벡터를 이용한 형질도입법을 수행하였다. MMLV 유래 바이러스 벡터를 이용한 형질감염법은 당업계에서 널리 수행되는 방법이며 해당 참고 문헌을 참조하였다(Felts Ka et al., Mol Biotechnol. 2002 Sep;22(1):25-32.). 간략히 설명하면 패키징을 위한 세포인 HEK-293T(ATCC-CRL-3216) 세포를 10% fetal bovine serum(FBS)이 포함된 DMEM 배지 10ml에 1X107의 세포 개수를 55 cm2 컬쳐 디시에 씨딩하고 24시간 동안 37℃ 및 5% CO2 인큐베이터에서 배양한 후, (1)에서 제작된 본 발명의 재조합 폴리뉴클레오티드 pFB 벡터 즉 pFB 벡터 1,2,3, 또는 4와 pCMV-gagpol (Cell Biolabs,inc.)및 pCMV-VSV-G (Cell Biolabs,inc.)를 3:2:1의 비율로 혼합하였다. 이때 pFB 벡터는 7.5ug를 사용하였다. 이 벡터의 혼합물은 형질감염(transfection)을 하기 위해 LipofectamineTM 3000 (invitrogen)를 이용하였으며 형질도입방법은 제조자의 지침에 따라 수행하였다. 형질 도입 이후 48시간 동안 세포를 동일한 조건에서 배양하였다. 그에 따라, 상기 HEK 293T 세포로부터 감염성 있는 패키징된 pFB 벡터 1,2,3 또는 4 함유 비루스를 생산하였다.
다음으로, 생산된 상기 감염성 있는 패키징된 pFB 벡터 1,2,3 또는 4 함유 비루스를 목적 세포에 형질 감염시켜 안정화되고 일정하게 발현하는 세포주를 확립하였다. 목적 세포는 NG108-15 세포(ATCC-HB-12317), SiMa 세포(DSMZ: ACC-164), 및 NT2 세포(ATCC-CRL-1973)를 사용하였다. NG108-15 세포는 쥐의 신경아세포종과 랫트의 신경교종의 잡종 세포로써 신경세포로 분화를 통해 보툴리눔 독소 A형에 대한 감수성이 확인된 세포주이며(Whitemarsh RC et al., Biochem Biophys Res Commun. 2012 Oct 19;427(2):426-30), SiMa 세포는 인간 유래 신경아세포종 유래의 세포주로서 신경세포로 분화를 통해 보툴리눔 독소 A형에 대한 감수성이 확인된 세포주이며(Fernandez-Salas E et al., PLoS One. 2012;7(11):e49516), NT2 세포는 인간의 고환에서 유래한 태생기암 (embryonal carcinoma)세포주로서 다분화능을 가지고 있으며 특정 조건하에서 신경세포로 분화가 진행될 수 있으며 신경세포로 분화된 NT2 세포는 보툴리눔 독소 A형에 대한 감수성이 확인되었다 (Tegenge et al., Cell Mol Neurobiol. 2012 Aug;32(6):1021-9).
목적 폴리펩티드의 발현이 안정화된 세포주 제작의 구체적 과정은 다음과 같다.
먼저, 목적세포는 감염 하루 전에 10% FBS가 함유된 DMEM 배지 0.5ml를 함유하는 24-well 플레이트의 각 웰당 약 1x105 세포로 씨딩하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 1일 동안 배양하였다. 또한, 상기에서 수집된 HEK-293T 세포의 배양 상등액을 0.45um 시린지 필터를 이용하여 여과하여, 세포와 세포 잔해가 제거된 비루스 용액을 얻었다. 이렇게 얻어진 비루스 용액을 1ml/웰(24-웰)의 농도로 배지가 제거된 상기 목적 세포가 배양된 웰에 첨가하고, 동일한 조건에서 6시간 동안 배양하여 감염이 일어나게 했다. 감염 시 목적세포로의 감염효율을 높이기 위해 polybrene을 8mg/ml 수준으로 첨가하였다. 6시간 이후, 상기 배지를 일반 세포 배양용 배지인 10% FBS가 함유된 DMEM 배지로 교체하고 2일 동안 동일한 조건에서 배양하였다.
다음으로, 24-well에서 감염된 목적세포는 2일간 배양 후 55 cm2 컬쳐 디쉬(dish)로 이송되고 pFB 벡터의 선택적 항생제인 게네티신(geneticin, Gibco)을 500~1000ug/ml으로 첨가하여 5일간 배양하였다. 적절한 항생제의 용량은 목적세포와 geneticin의 적정시험(titration)에 근거하여 처리하였다. NT2 세포가 목적 세포인 경우 10ml의 세포배양용 배지를 함유한 컬쳐디쉬에서 5일간 800ug/ml의 게네티신 존재하에서 배양하였다.
다음으로, 단일 세포 클론을 형성하기 위해 목적세포를 2 세포/well의 농도로 96-well의 웰로 이송하였다. 55cm2 컬쳐 디쉬 배양에서 사용된 동일한 배지 100ul를 포함한 96-웰 플레이트의 각 웰에서 동일한 조건하에서 4주간 배양을 하면서 단일 세포의 클론이 형성된 콜로니를 세포배양용 현미경을 통해 선별하고 확장 배양을 하였다.
이 단계에서 제조된 재조합 폴리뉴클레오티드의 구성에 따라 전-선별과정을 수행할 수 있다. 즉, 내부 표준 리포터 단백질이 형광 단백질인 경우 형광 현미경을 이용하여, 또는 내부 표준 리포터 단백질이 발광 단백질인 경우 발광분석을 통해 전-선별과정을 수행하였다.
또한, 내부 표준 리포터 단백질이 존재하지 않는 재조합 폴리뉴클레오티드의 전-선별과정을 위해 또는 내부 표준 리포터 단백질이 존재하는 각 단일 클론 세포주의 감도 우수성을 먼저 선별하기 위해, 프로테오좀 저해제 MG132(Sigma)를 10uM 배지의 농도로 첨가하거나 또는 상기 재조합 폴리뉴클레오티드가 SNAP25 서열을 포함하는 경우에 한정해 보툴리눔 독소 타입A형의 경쇄 DNA를, 상기 재조합 폴리뉴클레오티드가 VAMP2 서열을 포함하는 경우 보툴리눔 독소 타입 B형의 경쇄 DNA를 LipofectamineTM 3000 (invitrogen)를 사용하고 제조자의 지침에 따라 형질도입 하였다. 이때 BoNT/A LC와 BoNT/B LC는 pCDA4의 BamHI/XhoI 부위에 도입되었다. 방법은 96-well에서 약 3~4주간 배양하면서 단일 클론의 콜로니가 확인된 세포에 한해 동 개수의 세포를 96-well 플레이트 2장에 독립적으로 씨딩을 하여 1장을 선별을 위한 실험에 소진하고 1장은 유지 배양용으로 이용하였다.
이러한 선별과정을 통해 단일 클론 유래의 세포주는 각각 확장 배양을 수행하고 동결보관하였다. 동결보관법은 일반적인 포유동물세포의 동결보관법으로 수행하였는데 간략히 설명하면 5x107 내지 1x107 세포를 5% 혹은 10%의 DMSO가 포함된 배양 배지 1ml에 희석하여 동결용 바이알에 담고 프로그램화된 동결 용기를 이용하여 -80℃까지 온도를 낮추고 이후 액화 질소 탱크의 가스상에 보관하였다.
그 결과, pFB 벡터 1,2,3,4, 또는 6 함유 비루스를 안정화되고 일정하게 발현하는 세포주 NG108-15 세포, SiMa 세포, 및 NT2 세포를 확립하였다.
(3) 확립된 NG108-15 세포, SiMa 세포, 및 NT2 세포의 신경세포로의 분화 및 독도 중독법
NG108-15 세포, SiMa 세포, 및 NT2 세포는 신경아세포종(Neuroblastoma) 세포주 또는 배성암(embryonal carcinoma cell) 세포주이며, 이들은 신경 세포로 분화되는 경우, 보툴리눔 독소의 감수성이 있는 것으로 알려진 바 있다. 따라서, 이들 세포를 다음 과정에 따라 신경세포로 분화시켰다.
NG108-15 세포는 10(v/v)% FBS가 첨가된 DMEM 배지 중에서 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 유지 배양하였다. 신경 세포 분화를 위하여, matrigel(BD sceince)이 코팅된 세포배양용 96-well 플레이트의 각 웰에 2x104 세포/웰의 농도로 세포를 씨딩하고 약 5일간 레티노산(retinoic acid) 50uM과 푸르모파민(purmophamine) 25uM이 첨가된 neurobasal 배지(Gibco)에서 동일한 조건에서 배양하였다. 상기 neurobasal 배지는 보충제로서 B27(Gibco), Glutamax(Gibco) 및 non-essential amino acid(Gibco)를 각각 1X의 양으로 포함하였다.
SiMa 세포는 10(v/v)% FBS가 첨가된 DMEM 배지 중에서 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 유지 배양하였다. 신경 세포 분화를 위하여, matrigel(BD sceince)이 코팅된 세포배양용 96-well 플레이트의 각 웰에 5x104 세포/웰의 농도로 세포를 씨딩하고 약 5일간 레티노산(retinoic acid) 50uM가 첨가된 무혈청 MEM 배지(Welgene)에서 동일한 조건에서 배양하였다. 상기 MEM 배지는 보충제로서 B27(Gibco), N2(Gibco), Glutamax(Gibco), HEPES(Gibco) 및 non-essential amino acid(Gibco)를 각각 1X의 양으로 포함하였다.
NT2 세포(이하 "NTtera2 세포"라고도 함)는 10(v/v)% FBS가 첨가된 α-MEM 배지(Welgene) 중에서 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 유지 배양하였다. 신경 세포 분화를 위하여, 페트리 접시(petri dish)의 각 웰에 1x105 세포/ml의 농도로 세포를 씨딩하고 1주일간 레티노산(retinoic acid) 50uM가 첨가된 분화용 배지에서 동일한 조건에서 2 내지 3일마다 배지를 교환하면서 배양하였다. 분화용 배지는 10(v/v)% FBS가 첨가된 DMEM/F12(Welgene) 배지를 사용하였다.
이렇게 배양된 세포는 구상체를 형성하며 1주일간 배양 후 구상체를 수집하여 동일 면적의 일반 세포배양 플레이트에 구상체를 이송하고 부착세포로서 1주일간 동일한 조건에서 레티노산 50uM이 첨가된 상기 분화배지를 중에서 2~3일마다 배지를 교환하면서 배양하였다. 이 후 부착된 세포를 트립신을 이용하여 탈군집화, 및 탈부착화하고 세포 개수를 세었다.
1x107 세포를 175T 플라스크(Nunc)에 이송을 하고 유사분열 저해제(mitotic inhibitor)가 첨가된 상기 분화용 배지에서 동일한 조건에서 2~3일 마다 배지를 교환하면서 열흘간 배양하였다. 유사분열 저해는 AraC 1uM, 우리딘(Uridine) 10uM 및 풀록스우리딘(Floxuridine) 10uM이었다. 신경세포로 분화된 세포는 트립신을 이용하여 탈부착화하며 여기서 수득된 세포는 동결 보관하였다. 동결 보관용 배지는 동결용 배지를 이용하며 동결법은 상기 세포 동결방법을 이용하였다. 분화된 신경세포는 matrigel이 코팅된 세포배양용 96-well 플레이트에 웰당 1x105 세포수준으로 씨딩하고 상기 분화용 배지 중에서 약 열흘 이상 배양하며 배지는 2~3일간 마다 교환하였다.
(4) 분화된 신경세포에 대한 보툴리눔 독소의 중독화
분화된 신경세포에서 보툴리눔 독소 타입 A형의 중독화는 다음과 같이 수행하였다. 정제된 독소 단백질의 중독화는 상기 분화용 배지에 정제된 독소 단백질을 적절한 농도로 희석한 후 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 유지 배양 중인 상기 신경 세포의 배양액과 교환하였다. 그 후 동일한 조건에서 24시간 동안 배양하여 독소 중독화를 유도하고, 이후 배지를 상기 분화용 배지로 교환하고 72 시간을 동일한 조건에서 배양하였다.
상기 분화용 배지를 상업적으로 판매되는 보툴리눔 독소 의약품 바이알(메디톡신주, Neuronox)에 첨가하여 동결 건조된 독소 단백질과 부형제를 현탁한 후 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 유지 배양 중인 세포의 배양액과 교환하였다. 완제품 바이알에 대한 독소 역가 실험은 부형제의 처리 양을 동일하게 하기 위해 독소 플라시보 바이알을 이용하였다. 독소 플라시보 바이알은 완제품 독소 바이알에서 독소 단백질만을 제거하였다.
즉, 독소 완제 바이알과 독소 플라시보 바이알을 동량으로 현탁한 후 각 처리 농도에 따라 총 중독시키는 배지의 양을 동일하게 처리하였다.
(5) 리포터 모이어티 또는 내부 표준 리포터의 정량 분석
상기 재조합 폴리뉴클레오티드로부터 발현된 리포터 모이어티 또는 내부 표준 리포터 단백질의 정량 분석은 다음과 같이 수행하였다.
본 발명의 상기 재조합 폴리뉴클레오티드에서 발광 단백질을 리포터 모이어티 혹은 내부 표준 리포터 단백질로 이용한 경우 발광 분석법을 통해 상기 발광 단백질을 정량 분석하였다. 리포터 모이어티가 NLuc 경우, Nano-luciferase assay kit(promega)에 의하여 분석하였다.
리포터 모이어티가 NLuc이고 내부 표준 리포터 단백질이 FLuc인 경우, one-glo Dual nano-luciferase assay kit(promega사)를 이용하고, 시험은 공급자의 매뉴얼대로 수행하였으며, 발광은 SpectraMax(Molecular Device사)를 사용하여 측정하였다. 노말라이제이션을 위해 측정된 NLuc 값은 내부 표준 리포터 단백질인 FLuc 값으로 나눈 값을 결과 값으로 이용하였다.
본 발명의 상기 재조합 폴리뉴클레오티드에서 형광 단백질을 리포터 모이어티 혹은 내부 표준 리포터 단백질로 이용한 경우, 형광 측정기를 통해 형광값을 정량 분석하였다. 리포터 모이어티가 mCherry이고 내부 표준 리포터 단백질이 eGFP인 경우 형광 측정기인 SpectraMax(Molecular Device사)를 사용하여 mCherry의 경우 610nm 파장에서 여기하고 507nm 파장에서 방출값을 측정하였다. eGFP의 경우 488 nm 파장에서 여기하고 507 nm 파장에서 방출 값을 측정하였다. 노말라이제이션을 위해 측정된 mCherry의 방출 값은 내부 표준 리포터 단백질인 eGFP의 방출 값으로 나눈 값을 결과값으로 이용하였다. 또한 incucyte 기기(Essen Bioscience사)를 이용하여 GFP와 RFP의 형광값을 측정하여 노말라이제이션을 수행해 결과 값으로 이용할 수 있다. eGFP는 GFP 계열이고 mCherry는 RFP 계열이다.
(6) 결과
도 5는 pFB 벡터1로 형질감염된 NG108-15 세포를 신경세포로 분화시킨 후 보툴리눔 독소 A로 중독화시킨 후 리포터 모이어티의 활성을 측정한 결과를 나타낸다. 도 5에서, pFB 벡터1로 형질감염된 NG108-15 세포의 제작, 신경세포로 분화, 보툴리눔 독소 A로 중독화, 및 리포터 모이어티의 활성 측정은 상기 (3), (4), 및 (5)에 기재된 바와 같다. 도 5에서, 나노-루시퍼라제의 활성 측정은, 중독화를 위하여 최종적으로 72 시간 배양된 세포를 상기의 Nano-luciferase kit를 이용하여 발광도를 측정하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 측정된 나노-루시퍼라제의 활성은 10nM 보툴리눔 독소 A로 중독화시킨 것이, 그렇지 않은 경우에 비하여 현저하게 증가된 상대적 발광 단위(relative luminescence unit)를 보였다.
도 6은 pFB 벡터2로 형질감염된 NG108-15 세포를 신경세포로 분화시킨 후 보툴리눔 독소 A로 중독화시킨 후 세포를 형광 현미경으로 확인한 결과를 나타낸다. 도 6에서, pFB 벡터2로 형질감염된 NG108-15 세포의 제작, 신경세포로 분화, 및 보툴리눔 독소 A로 중독화는 상기 (3), 및 (4)에 기재된 바와 같다. 도 6에 나타낸 결과는, Olympus FSX-100 기기 형광 현미경을 사용하여 중독화를 위하여 최종적으로 72 시간 배양된 세포를 형광관찰 하였다.
도 6에서 control은 보툴리눔 독소 A 농도가 0nM인 대조군이고, BoNT/A 1nM은 보툴리눔 독소 A 농도가 1nM인 실험군을 나타낸다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 실험군에서 적색 형광을 띠는 세포가 현저하게 증가하였다.
도 5 및 도 6의 결과는 보툴리눔 독소 A에 의하여 SNAP25의 절단 부위가 절단되지 않는 경우, NLuc-SNPA25 기질 모이어티-CL1-PEST 구조의 폴리펩티드가 용이하게 분해되어 상대적 발광 단위가 낮은 반면, 보툴리눔 독소 A에 의하여 SNAP25의 절단 부위가 절단되는 경우, NLuc-SNPA25 기질 모이어티-CL1-PEST 구조의 폴리펩티드가 분해로부터 안정화되어 상대적 발광 단위가 높다는 것을 나타낸다.
도 7은 pFB 벡터3으로 형질감염된 NG108-15 세포를 신경세포로 분화시킨 후 보툴리눔 독소 A로 중독화시킨 후 세포를 형광 현미경으로 확인한 결과를 나타낸다. 도 7에서, pFB 벡터3으로 형질감염된 NG108-15 세포의 제작, 신경세포로 분화, 보툴리눔 독소 A로 중독화, 및 리포터 모이어티의 활성 측정은 상기 (3), (4), 및 (5)에 기재된 바와 같다. 도 7에서, 반디불이-루시퍼라제(FLuc) 및 나노-루시퍼라제(NLuc)의 활성 측정은, 중독화를 위하여 최종적으로 72 시간 배양된 세포를 One-glo nano dual luciferase kit를 이용하여 발광도를 측정하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 측정된 반디불이-루시퍼라제(FLuc)에 대한 나노-루시퍼라제의 상대적 활성은 10nM 보툴리눔 독소 A로 중독화시킨 것이, 그렇지 않은 경우에 비하여 현저하게 증가된 상대적 발광 단위(relative luminescence unit)를 보였다. 도 7에서 BoNT/A 0nM은 보툴리눔 독소 A 농도가 0nM인 대조군이고, BoNT/A 1nM은 보툴리눔 독소 A 농도가 1nM인 실험군을 나타낸다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 측정된 나노-루시퍼라제의 활성은 10nM 보툴리눔 독소 A로 중독화시킨 것이, 그렇지 않은 경우에 비하여 현저하게 증가된 상대적 발광 (relative luminescence)을 보였다.
도 8은 pFB 벡터3으로 형질감염된 SiMa 세포를 신경세포로 분화시킨 후 보툴리눔 독소 A로 중독화시킨 후 세포를 형광 현미경으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 pFB 벡터3으로 형질감염된 NT2 세포를 신경세포로 분화시킨 후 보툴리눔 독소 A로 중독화시킨 후 세포를 형광 현미경으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 8 및 도 9는 세포를 NG108-15를 사용한 대신, SiMa 세포 및 NT2 세포를 각각 사용한 것을 제외하고는 도 7의 과정과 동일한 과정에 의하여 측정된 것이다. 도 8 및 도 9에 나타낸 바와 같이, 측정된 나노-루시퍼라제의 활성은 10nM 보툴리눔 독소 A로 중독화시킨 것이, 그렇지 않은 경우에 비하여 현저하게 증가된 상대적 발광(relative luminescence)을 보였다.
도 10은 pFB 벡터 4를 이용하여 형질감염을 유도하여 안정하게 폴리펩티드를 발현하는 NG108-15 세포에서 BoNT/B의 경쇄를 임의 발현한 후 (pCDNA4-BLC) 발현된 리포터 모이어티 및 내부 표준 리포터 단백질로부터 나오는 신호를 확인한 결과를 나타낸다. 여기서, pCDNA4-BLC 벡터는 LipofectamineTM 3000 (invitrogen)를 사용하고 제조자의 지침에 따라 형질도입하였다. 형질도입 이후 48시간 동안 세포를 동일한 조건에서 배양하였다. 그에 따라서, pCDNA4-BLC 벡터는 NG108-15 세포에서 일시적(transiently)으로 발현된다. 도 10에서, 세로축은 NLuc 값을 Fluc 으로 노말라이제이션 값이다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 반디불이-루시퍼라제에 대하여 측정된 나노-루시퍼라제의 활성은 10ug 보툴리눔 독소 B의 경쇄를 코딩하는 pCDNA4-BLC의 DNA를 도입시킨 것이, 그렇지 않은 경우에 비하여 현저하게 증가된 상대적 발광(relative luminescence)을 보였다.
도 11은 pFB 벡터3가 형질도입된 안정화된 세포주 NT2 세포를 다른 농도의 BoNT/A로 중독화하고 발현된 리포터 모이어티 단백질로부터 나오는 신호를 확인한 결과를 나타낸다. 도 11에서, BoNT/A API는 BoNT/A로서 BoNT/A를 포함하는 제품을 제조하는데 사용되는 원료를 나타낸다. BoNT/A API는(주)메디톡스로부터 공급되었다. pFB 벡터3은 LipofectamineTM 3000(invitrogen)을 사용하고 제조자의 지침에 따라 형질도입하였다. 형질도입 이후 48시간 동안 세포를 동일한 조건에서 배양하였다. 그에 따라서, pFB 벡터3은 NT2 세포에서 일시적(transiently)으로 발현된다. 도 11에서, RLU는 상대적 루시퍼라제 단위(relative luciferase unit)를 나타낸다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 반디불이-루시퍼라제에 대하여 측정된 나노-루시퍼라제의 활성은 1pM 내지 10nM의 농도에서 보툴리눔 독소 A의 농도 의존적으로 상대적 발광 단위(relative luminescence unit)을 보였다. 이는 RLU를 측정함으로써, 시료 중의 보툴리눔 독소, 예를 들면 타입 A의 수준을 측정할 수 있다는 것을 나타낸다.
도 12 내지 14는 pFB 벡터3이 형질도입된 안정화된 NT2 세포를 다른 농도의 BoNT/A 함유 완제품으로 중독화하고 발현된 리포터 모이어티 및 내부 표준 리포터 단백질로부터 나오는 신호를 확인한 결과를 나타낸다. 도 12 내지 도 14는 BoNT/A로서 BoNT/A를 포함하는 제품을 제조하는데 사용되는 원료를 사용한 대신, BoNT/A로서 BoNT/A를 포함하는 제품을 사용한 것을 제외하고는 동일한 과정에 의하여 측정하였다. BoNT/A API에 비하여 상기 제품은 부형제 등의 성분을 더 포함한다. 도 12, 도 13 및 14는 각각 FLuc, NLuc 및 NLuc/FLuc의 값으로 나타낸 것이다.
도 14에 나타낸 바와 같이, 반디불이-루시퍼라제에 대하여 측정된 나노-루시퍼라제의 활성은 1U 내지 10U의 농도에서 보툴리눔 독소 A의 농도 의존적으로 상대적 발광 단위(relative luminescence unit)을 보였다. 이는 RLU를 측정함으로써, 시료 중의 보툴리눔 독소, 예를 들면 타입 A의 수준을 측정할 수 있다는 것을 나타낸다.
제1 양상에 따른 재조합 폴리뉴클레오티드에 따르면, 그를 포함한 숙주세포 및 시료 중의 신경독소 폴리펩티드의 프로테아제 활성을 결정하는 방법에 사용될 수 있다.
제2 양상에 따른 상기한 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포에 의하면, 시료 중의 신경독소 폴리펩티드의 프로테아제 활성을 결정하는 방법에 효율적으로 사용될 수 있다.
제3 및 제4 양상에 따른 신경독소 폴리펩티드의 단백질 분해 활성(proteolytic activity)을 결정하기 위한 키트에 의하면, 신경독소 폴리펩티드의 단백질 분해 활성(proteolytic activity)을 결정하는데 사용될 수 있다.
제5 및 제7 양상에 따른 시료 중의 신경독소 폴리펩티드의 특성을 결정하는 방법에 따르면, 신경독소 폴리펩티드의 특성을 효율적으로 결정할 수 있다.
제6 및 제8 양상에 따른 시료 중의 신경독소 폴리펩티드의 프로테아제 활성을 결정하는 방법에 의하면, 시료 중의 신경독소 폴리펩티드의 프로테아제 활성을 효율적으로 결정할 수 있다.
제9 양상에 따른 숙주세포가 프로테아제를 발현 또는 저해할 수 있는 능력을 측정하는 방법에 의하면, 숙주세포가 프로테아제를 발현 또는 저해할 수 있는 능력을 효율적으로 측정하거나, 시험 물질이 프로테아제 활성을 조절할 수 있는지를 결정할 수 있다.

Claims (14)

  1. 리포터 모이어티; 탈안정화 모이어티 및 N 말단에 상기 리포터 모이어티와 C 말단에 상기 탈안정화 모이어티를 작동적으로 연결하는 기질 모이어티로서, 상기 기질 모이어티는 프로테아제 활성의 절단 부위(cleavage site)를 포함하는 것인 기질 모이어티를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 프로테아제는 신경독소(neurotoxin) 폴리펩티드이고, 상기 신경독소 폴리펩티드는 보툴리눔 독소 혈청 타입 A(botulinum toxin serotype A: BoNT/A), BoNT/B, BoNT/C, BoNT/CD, BoNT/D, BoNT/DC, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/FA, BoNT/G, 또는 테타누스 신경독소(TeNT)인 것인 재조합 폴리뉴클레오티드.
  3. 청구항 1에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드의 상류 또는 하류에 연결된 비시스트론 서열(bicistronic sequence) 및 상기 비시스트론 서열의 상류 또는 하류에 작동가능하게 연결된 내부 표준 리포터를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것인 재조합 폴리뉴클레오티드.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 비시스트론 서열은 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosomal entry site: IRES) 또는 리보솜이 펩티드 결합을 형성하는 것을 누락(skip)하도록 하는 것인 재조합 폴리뉴클레오티드.
  5. 청구항 1의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 숙주세포는 신경독소 폴리펩티드를 세포질 중으로 전치(translocate)시킬 수 있는 세포인 것인 숙주세포.
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 숙주세포는 NT2, SiMa, 또는 NG108-15 세포인 것인 숙주세포.
  8. 청구항 5에 있어서, 프로테아제 예를 들면, 단백질 분해 활성 신경독소 폴리펩티드를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 숙주세포.
  9. 청구항 5의 숙주세포를 단백질 분해 활성(proteolytically active) 신경독소 폴리펩티드를 포함할 것으로 의심되는 시료와 접촉시키는 단계; 및
    접촉된 산물 중의 상기 리포터로부터 방출되는 신호를 측정하는 단계;를 포함하는, 시료 중의 신경독소 폴리펩티드의 프로테아제 활성을 결정하는 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 제1 폴리뉴클레오티드의 상류 또는 하류에 연결된 비시스트론 서열(bicistronic sequence) 및 상기 비시스트론 서열의 상류 또는 하류에 작동가능하게 연결된 내부 표준 리포터를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것인 방법.
  11. 청구항 9에 있어서, 접촉시키는 단계 전에 상기 숙주세포를 배지 중에서 배양하여 신경세포로 분화시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 숙주세포는 NT2, SiMa, 또는 NG108-15 세포인 것인 방법.
  13. 청구항 5의 숙주세포에 프로테아제 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 도입시키는 단계; 및 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 숙주세포를 배양하고 배양물 중의 상기 리포터 모이어티 또는 상기 내부 표준 리포터 또는 그 산물로부터 방출되는 신호를 측정하는 단계;를 포함하는, 숙주세포가 프로테아제를 발현 또는 저해할 수 있는 능력을 측정하는 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 배양은 시험 물질의 존재하에서 수행되는 것인 방법.
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