JP2019516379A - レポーターモイエティ、基質モイエティ及び脱安定化モイエティを含むポリペプチドをコーディングする組み換えポリヌクレオチド、それを含む宿主細胞、並びにその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
第6様相は、前記組み換えポリヌクレオチドによってコーディングされるポリペプチドを、プロテアーゼポリペプチドに接触させる段階と、接触された産物中の前記レポーターモイエティまたはその産物から放出される信号を測定する段階と、前記測定された信号から、前記信号の放出開始時点及び持続時間のうち1以上を決定する段階と、を含む、試料中のプロテアーゼポリペプチドの特性を決定する方法を提供する。
(1)レポーターモイエティ・基質モイエティ・脱安定化モイエティ(以下、「R−S−D」ともいう)ポリペプチドをコーディングする組み換えポリヌクレオチドの作製
前記組み換えポリヌクレオチドは、2つの構造を作製した。一つは、R−S−D構造を有するポリペプチドをコーディングするものであり、他の一つは、I−B−R−S−D構造を有するポリペプチドをコーディングするものである。ここで、I及びBは、それぞれ内部標準レポーターをコーディングするヌクレオチド配列及びバイシストロン配列である。前記組み換えポリヌクレオチドは、プラスミドベクターの形態である。
前記(1)で作製されたベクターを、安定して一定に発現する細胞株を構築するために、MMLV由来ウイルスベクター、すなわち、pFBベクターを利用した形質導入法を遂行した。MMLV由来ウイルスベクターを利用した形質感染法は、当業界で広く遂行される方法であり、当該参照文献を参照した(Felts Ka et al., Mol Biotechnol. 2002 Sep; 22 (1): 25-32)。簡略に説明すれば、パッケージングのための細胞であるHEK−293T(ATCC−CRL−3216)細胞を、10% FBS(fetal bovine serum)が含まれたDMEM培地10mlに、1X107の細胞個数を、55cm2カルチャディッシュにシーディングし、24時間、37℃及び5% CO2インキュベータで培養した後、(1)で作製された本発明の組み換えポリヌクレオチドpFBベクター、すなわち、pFBベクター1,2,3または4、pCMV−gagpol(Cell Biolabs,inc.)、及びpCMV−VSV−G(Cell Biolabs,inc.)を、3:2:1の比率で混合した。このとき、pFBベクターは、7.5μgを使用した。このベクターの混合物は、形質感染を行うために、LipofectamineTM 3000(invitrogen)を利用し、形質導入方法は、製造者の指針によって遂行した。形質導入後の48時間、細胞を同一条件で培養した。それにより、前記HEK293T細胞から、感染性あるパッケージングされたpFBベクター1,2,3または4含有ウイルスを生産した。
NG108−15細胞、SiMa細胞及びNT2細胞は、神経芽細胞腫細胞株または胚性癌(embryonal carcinoma cell)細胞株であり、それらは、神経細胞に分化される場合、ボツリヌス毒素の感受性があると知られている。従って、それら細胞を、次の過程によって神経細胞に分化させた。
分化された神経細胞において、ボツリヌス毒素タイプA型の中毒化は、次のように行った。精製された毒素タンパク質の中毒化は、前記分化用培地に精製された毒素タンパク質を適切な濃度に希釈した後、37℃、5% CO2インキュベータにおいて維持培養中の前記神経細胞の培養液と交換した。その後、同一条件で24時間培養し、毒素中毒化を誘導し、その後、培地を前記分化用培地に交換し、72時間同一条件で培養した。
前記組み換えポリヌクレオチドから発現されたレポーターモイエティまたは内部標準レポータータンパク質の定量分析は、次のように行った。
図5は、pFBベクター1に形質感染されたNG108−15細胞を、神経細胞に分化させた後、ボツリヌス毒素Aで中毒化させた後、レポーターモイエティの活性を測定した結果を示す。図5において、pFBベクター1に形質感染されたNG108−15細胞の作製、神経細胞への分化、ボツリヌス毒素Aによる中毒化、及びレポーターモイエティの活性測定は、前記(3)、(4)及び(5)に記載された通りである。図5において、ナノ・ルシフェラーゼの活性測定は、中毒化のために、最終的に、72時間培養された細胞を、前述のnano−luciferase kitを利用して発光度を測定した。図5に図示されているように、測定されたナノ・ルシフェラーゼの活性は、10nMボツリヌス毒素Aで中毒化させたものが、そうではない場合に比べ、著しく増大した相対的発光単位(relative luminescence unit)を示した。
Claims (14)
- レポーターモイエティ、脱安定化モイエティ、及びN末端に、前記レポーターモイエティと、C末端に、前記脱安定化モイエティを作動的に連結する基質モイエティであって、前記基質モイエティは、プロテアーゼ活性の切断部位を含むものである基質モイエティを含むポリペプチドをコーディングする第1ポリヌクレオチドを含む組み換えポリヌクレオチド。
- 前記プロテアーゼは、神経毒素ポリペプチドであり、前記神経毒素ポリペプチドは、ボツリヌス毒素血清タイプA(BoNT/A)、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/CD、BoNT/D、BoNT/DC、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/FA、BoNT/G、またはテタヌス神経毒素(TeNT)であるものである求項1に記載の組み換えポリヌクレオチド。
- 第1ポリヌクレオチドの上流または下流に連結されたバイシストロン配列、及び前記バイシストロン配列の上流または下流に作動可能に連結された内部標準レポーターをコーディングするポリヌクレオチドをさらに含むものである請求項1に記載の組み換えポリヌクレオチド。
- 前記バイシストロン配列は、内部リボゾーム進入部位(IRES)であるか、あるいはリボゾームがペプチド結合形成を抜かさせるものである請求項3に記載の組み換えポリヌクレオチド。
- 請求項1に記載の組み換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
- 前記宿主細胞は、神経毒素ポリペプチドを、細胞質中に転置させる細胞であるものである請求項5に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞は、NT2,SiMaまたはNG108−15細胞であるものである請求項5に記載の宿主細胞。
- プロテアーゼ、例えば、タンパク質分解活性神経毒素ポリペプチドをコーディングする外来ポリヌクレオチドを含むものである請求項5に記載の宿主細胞。
- 請求項5に記載の宿主細胞をタンパク質分解活性神経毒素ポリペプチドを含むと疑われる試料と接触させる段階と、
接触された産物中の前記レポーターから放出される信号を測定する段階と、を含む試料中の神経毒素ポリペプチドのプロテアーゼ活性を決定する方法。 - 前記組み換えポリヌクレオチドは、第1ポリヌクレオチドの上流または下流に連結されたバイシストロン配列、及び前記バイシストロン配列の上流または下流に作動可能に連結された内部標準レポーターをコーディングするポリヌクレオチドをさらに含むことである請求項9に記載の方法。
- 接触させる段階前に、前記宿主細胞を培地中で培養し、神経細胞に分化させる段階をさらに含むことである請求項9に記載の方法。
- 前記宿主細胞は、NT2,SiMaまたはNG108−15細胞であることである請求項11に記載の方法。
- 請求項5に記載の宿主細胞に、プロテアーゼポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドを導入させる段階と、前記ポリヌクレオチドが導入された宿主細胞を培養し、培養物中の前記レポーターモイエティ、前記内部標準レポーターまたはその産物から放出される信号を測定する段階と、を含む宿主細胞がプロテアーゼを発現または阻害することができる能力を測定する方法。
- 前記培養は、試験物質の存在下で行われることである請求項13に記載の方法。
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