JPWO2008114544A1

JPWO2008114544A1 - 細胞周期可視化プローブ

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Publication number: JPWO2008114544A1
Application number: JP2009505097A
Authority: JP
Inventors: 宮脇　敦史; 敦史宮脇; 朝子沢野; 久雄正井
Original assignee: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research; RIKEN
Current assignee: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research; RIKEN
Priority date: 2007-03-16
Filing date: 2008-02-06
Publication date: 2010-07-01
Anticipated expiration: 2028-02-06
Also published as: US8182987B2; EP2138577B1; US20100100977A1; EP2138577A1; WO2008114544A1; EP2138577A4; JP5370890B2

Abstract

本発明は細胞周期の増殖期と休止期とを簡単にリアルタイムで識別することができる方法を提供することを目的とし、細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する１以上の遺伝子発現産物をマーカーとして可視化・検出することにより細胞周期の増殖期と休止期とを識別する、細胞周期の検出方法を提供することにより解決する。

Description

本発明は、細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する遺伝子発現産物をマーカーにより可視化して細胞周期を検出する方法、並びに上記方法で使用するための遺伝子構築物に関する。

細胞周期は、細胞分裂で生じた細胞が、再び細胞分裂を行って新しい細胞になるまでの過程である。細胞周期において。有糸分裂の時期はM期と称され、通常、Ｍ期は約１時間で終了する。M期と、次のM期との間を間期と称され、細胞の成長、物質の生合成や代謝はこの時期に行われる。間期はさらに、G1期、S期、G2期に分類される。S期ではDNA複製が行われる。M期とS期との間の期間がG1期であり、S期とM期との間がG2期である。

細胞周期（G1期、S期、G2期、M期）の一部を調べる方法としては、BrdUラベルによる方法が知られている。具体的には、細胞内に一定の期間BrdUを取り込ませ、その後、抗BrdU抗体を使って免疫組織を行う方法であるが、リアルタイムでの観察は不可能である。また、細胞同調と生化学的手法による方法もあるが、リアルタイムでの観察は不可能である。

細胞周期の一部を可視化する方法としては、The G２M cell cycle phase marker (G"MCCPM) (Amersham Bioscience社)を用いる方法がある。この方法は、cyclinのプロモータ活性を利用しており、遺伝子導入によって形質転換を起こす際に、染色体への組み込まれ方で大きく影響されるという問題があった。また、G1期は可視化されていないので、細胞周期の追跡が困難であり、またコントラストが不明瞭であった。

本発明は、細胞周期の増殖期と休止期とを簡単にリアルタイムで識別することができる細胞周期の検出方法を提供することを解決すべき課題とした。さらに本発明は、上記した本発明の細胞周期の検出方法で用いるために遺伝子構築物を提供することを解決すべき課題とした。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する少なくとも１以上の遺伝子発現産物をマーカーにより可視化して、前記マーカーを検出することによって細胞周期の増殖期と休止期とを識別できることを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する少なくとも１以上の遺伝子発現産物をマーカーにより可視化して、前記マーカーを検出することによって細胞周期の増殖期と休止期とを識別することを特徴とする、細胞周期の検出方法。
（２）細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する少なくとも１以上の遺伝子発現産物として、細胞周期依存的な存在量の変化が異なるパターンを示す少なくとも２以上の遺伝子発現産物を使用する、（１）に記載の方法。

（３）細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する少なくとも１以上の遺伝子発現産物として、Ｇ１期と、Ｓ／Ｇ２／Ｍ期において存在量が変化する発現産物を使用する、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する少なくとも１以上の遺伝子発現産物として、Ｇ１期で存在量が増加し、Ｓ／Ｇ２／Ｍ期で存在量が減少する第一の発現産物と、Ｇ１期で存在量が減少し、Ｓ／Ｇ２／Ｍ期で存在量が増加する第二の発現産物とを使用し、上記第一の発現産物と第二の発現産物とをそれぞれ異なるマーカーで標識して可視化する、（１）から（３）の何れかに記載の方法。

（５）第一の発現産物がCdt1又はその部分断片であり、第二の発現産物がGeminin又はその部分断片である、（４）に記載の方法。
（６）第一の発現産物が、Cdt1からGeminin結合部位を除いた部分断片である、（５）に記載の方法。
（７）第一の発現産物が、Cdt1の３０から１２０番目のアミノ酸からなる部分断片である、（５）又は（６）に記載の方法。

（８）第二の発現産物が、GemininからCdt1結合部位を除いた部分断片である、（５）から（７）の何れかに記載の方法。
（９）第二の発現産物が、Gemininの１から１１０番目のアミノ酸からなる部分断片である、（５）から（８）の何れかに記載の方法。
（１０）マーカーが蛍光タンパク質又は発光タンパク質である、（１）から（９）の何れかに記載の方法。

（１１）細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する発現産物の遺伝子又はその部分断片と、マーカーをコードする遺伝子とを含む、遺伝子構築物。
（１２）細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する発現産物の遺伝子が、Cdt1遺伝子又はGeminin遺伝子である、（１１）に記載の遺伝子構築物。
（１３）細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する発現産物の遺伝子の部分断片が、Cdt1からGeminin結合部位を除いた部分断片をコードする遺伝子、又はGemininからCdt1結合部位を除いた部分断片をコードする遺伝子である、（１１）又は（１２）に記載の遺伝子構築物。

（１４）細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する発現産物の遺伝子の部分断片が、Cdt1の３０から１２０番目のアミノ酸からなる部分断片をコードする遺伝子断片、又はGemininの１から１１０番目のアミノ酸からなる部分断片をコードする遺伝子断片である、（１３）に記載の遺伝子構築物。
（１５）マーカーをコードする遺伝子が、蛍光タンパク質又は発光タンパク質をコードする遺伝子である、（１１）から（１４）の何れかに記載の遺伝子構築物。

（１６）（１１）から（１５）の何れかに記載の遺伝子構築物を有する、形質転換体。
（１７）（１１）から（１５）の何れかに記載の遺伝子構築物を有する、遺伝子導入非ヒト動物。
（１８）（１１）から（１５）の何れかに記載の遺伝子構築物の少なくとも１種類以上を細胞に導入し、細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する発現産物の遺伝子又はその部分断片とマーカーとを発現させ、前記マーカーを検出することによって細胞周期の増殖期と休止期とを識別することを特徴とする、細胞周期の検出方法。
（１９）細胞周期阻害剤、又は細胞周期が関与する疾患用の薬剤の候補物質の存在下において細胞を培養し、該細胞について（１）から（１０）又は（１８）に記載の細胞周期の検出方法を行うことによって細胞周期に影響を及ぼす候補物質を選択することを特徴とする、細胞周期阻害剤、又は細胞周期が関与する疾患用の薬剤のスクリーニング方法。
（２０）細胞周期阻害剤、または細胞周期が関与する疾患用の薬剤の候補物質、あるいは特定の遺伝子発現を抑制する試薬を、（１７）に記載の遺伝子導入非ヒト動物に投与し、それらの、腫瘍の増殖、免疫系、血球系などの細胞の細胞周期、生存などに影響を及ぼす候補物質を選択することを特徴とする、疾患治療薬のスクリーニング方法あるいは化合物、薬剤、試薬の効能、作用機序について検定する方法。

本発明によれば、細胞周期の増殖期と休止期とを簡単にリアルタイムで識別することができる。本発明によれば、細胞周期の制御を考える上で最も重要な、G1期からS期への移行（G1/S transition）を赤色から緑色への色の変化（最も高いコントラストを達成できる）として読み取ることができるプローブが提供される。特に、本発明の方法においては、細胞周期依存的な遺伝子転写（プロモータ）は使用しないので、恒常的プロモーターを使用することができ、形質転換生物の作製が容易である。また、本発明においては、細胞周期に関するシグナルは核に局在するので、細胞質で働く様々な蛍光機能プローブと同時に発現させることができる。本発明によれば、細胞周期と様々な細胞機能との関連を調べることができる。

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明による細胞周期の検出方法は、細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する少なくとも１以上の遺伝子発現産物をマーカーにより可視化して、前記マーカーを検出することによって細胞周期の増殖期と休止期とを識別することを特徴とする方法である。

本明細書において、Ｇ１期とは複製前休止期（明細書では単に「休止期」）のことを言い、Ｓ期／Ｇ２期／Ｍ期とは、ＤＮＡ合成／細胞分裂期（明細書では単に「増殖期」）のことを言う。

本発明では、細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する少なくとも１以上の遺伝子発現産物として、細胞周期依存的な存在量の変化が異なるパターンを示す少なくとも２以上の遺伝子発現産物を使用することが好ましく、Ｇ１期と、Ｓ／Ｇ２／Ｍ期において存在量が変化する発現産物を使用することが特に好ましい。具体的には、細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する少なくとも１以上の遺伝子発現産物として、Ｇ１期で存在量が増加し、Ｓ／Ｇ２／Ｍ期で存在量が減少する第一の発現産物と、Ｇ１期で存在量が減少し、Ｓ／Ｇ２／Ｍ期で存在量が増加する第二の発現産物とを使用することができる。

Ｇ１期で存在量が増加し、Ｓ／Ｇ２／Ｍ期で存在量が減少する第一の発現産物の具体例としては、p27、p57、p21、p130、Cyclin A、Cyclin D、Cyclin E、CDK9、MYC、E2F1、ORC1、CDT1、B-MYB、RAG2、SMAD4、FOXO1、UBP43、Viral E7、Notch1、Notch 4、JUN、Presenilin 1/2、SREBP 1/2、β−catenin、IκBα／β／ε、p105 / p100、Cdc25 A/B、Wee1A、EMI 1/2、Viral Vpu、ATF4、DIG1、INFα-R、PRL-R、Snail、PER 1/2、Claspinなどを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。上記の中でも好ましくは、Cdt1又はその部分断片を用いることができる。Cdt1の部分断片としては、Cdt1からGeminin結合部位を除いた部分断片を用いることができる。

Ｇ１期で存在量が減少し、Ｓ／Ｇ２／Ｍ期で存在量が増加する発現産物の具体例としては、Cyclin A、Cyclin B、CDC20、PLK1、Aurora A / B、NEK2A、mE2-C、Geminin、CDC6、SKP2、SNON、RRR2、TK1、TPX2、CDH1、Securin、KIP、Survivin、Dbf 4、Hsl 1、Sgo 1、Sororin、R2、UBCH10 / E2-C / Vihar、Cks 1、Ase 1 / Prc 1、Cin 8、Anillinなどを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。上記の中でも好ましくは、Geminin又はその断片を用いることができる。Gemininの部分断片としては、GemininからCdt1結合部位を除いた部分断片を用いることができる。

上記した発現産物は、マーカーで標識することにより可視化される。２種類以上の発現産物を用いる場合は、２種類以上の発現産物をそれぞれ異なるマーカーで標識して可視化する。本発明で用いるマーカーとしては、蛍光タンパク質又は発光タンパク質が好ましい。本発明で用いる蛍光タンパク質又は発光タンパク質としては、蛍光活性又は発光活性を迅速に獲得し、かつ融合相手の蛋白質の分解に伴ってマーカー自身も分解され、蛍光活性又は発光活性を迅速に失うものを使用することが好ましい。

蛍光タンパク質は、刺胞動物・ヒドロ虫類・Aequorea victoria由来のAequoreaGFP(Green Fluorescent Protein)を始めとし、それ以外の動物：花虫類（サンゴ、イソギンチャク）、Aequorea victoria以外のヒドロ虫類、節足動物・甲殻類などから多数の蛍光タンパク質がクローニングされており、さらにそれらに変異を導入した改変体も報告されている。

本発明では、例えば、刺胞動物の緑色蛍光蛋白質(GFP)及びその変異体を使用することができる。変異体としては、シアン蛍光蛋白質（CFP）、黄色蛍光蛋白質（YFP）、赤色蛍光蛋白質（RFP）または青色蛍光蛋白質 (BFP) などが挙げられる。これらの蛍光蛋白質は、Pacific Northwest jellyfish、Aequorea victoria、the sea pansy、Renilla reniformis、及びPhialidium gregariumなどから得られる（Ward, W. W., 他, Photochem. Photobiol., 35:803-808 (1982); and Levine, L. D., 他, Comp. Biochem. Physiol., 72B:77-85 (1982)）。有用な励起及び放射スペクトルを有する各種クラゲ由来蛍光蛋白質は、オワンクラゲ由来の天然GFPのアミノ酸配列を改変することによって作製されている（Prasher, D. C., 他、Gene, 111:229-233 (1992); Heim, R., 他, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:12501-04 (1994); 米国特許出願番号08/337,915;国際出願PCT/US95/14692;及び米国特許出願番号No. 08/706,408）。また、変異誘発により励起又は発光波長がシフトしたGFP変異体が作製されている（Heim, R. & Tsien, R. Y. Current Biol. 6:178-182 (1996)）。蛍光タンパク質のクローニングは多数報告されており、例えば、Prasher，D.C．ら(1992)，"Primary structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein"，Gene 111：229−233、Roger Y.Tsin, Annu.Rev.Biochem.1998. 67:509-44、並びにその引用文献などに記載されている。

以下に本発明で使用できる蛍光タンパク質及び発光タンパク質の具体例を示すが、これらに限定されるものではない。

本発明によれば、細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する発現産物の遺伝子又はその部分断片と、マーカーをコードする遺伝子とを含む、遺伝子構築物が提供される。本発明の遺伝子構築物は、細胞周期依存的に起こる蛋白質分解を利用したプローブとして使用できる。本発明の遺伝子構築物は、細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する発現産物の遺伝子又はその部分断片と、マーカーをコードする遺伝子とをそれぞれ通常の遺伝子組み換え技術により取得た後に両者を連結することによって、構築することができる。

例えば、蛍光タンパク質をコードする遺伝子は、蛍光タンパク質のＤＮＡ配列に基づいたプライマーを用いて蛍光タンパク質のcDNAを含む鋳型ＤＮＡを用いてPCRを行うことによって取得することができる。細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する発現産物の遺伝子又はその部分断片も同様に、当該遺伝子のＤＮＡ配列に基づいたプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより取得することができる。ＰＣＲで各遺伝子断片を増幅する際に用いるプライマーに制限酵素部位を導入しておくことによって、ＰＣＲで得られた増幅産物を、適当なベクター内の制限酵素部位に挿入することができる。細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する発現産物の遺伝子又はその部分断片と、マーカーをコードする遺伝子とを、同一のベクター内に隣接して挿入することによって、細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する発現産物の遺伝子又はその部分断片と、マーカーをコードする遺伝子とを含む、遺伝子構築物を作製することができる。

本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明の遺伝子は、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されている。プロモーターは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。

本発明においては、上記のようにして得られた、細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する発現産物の遺伝子又はその部分断片と、マーカーをコードする遺伝子とを含む遺伝子構築物を、細胞に導入し、細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する発現産物の遺伝子又はその部分断片とマーカーとを発現させ、前記マーカーを検出することによって細胞周期の増殖期と休止期とを識別することによって、細胞周期を検出することができる。

発現ベクターの構築、及び細胞への導入（トランスフェクション）は、当業者に公知の手法に従って行うことができる。これらの詳細は、Sambrook 他, Molecular Cloning--A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1989) 、並びにCurrent Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel 他, eds., (Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., most recent Supplement)に記載されている。

例えば、トランスフェクションは、リン酸カルシウム共沈殿法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム又はウイルスベクターに封入したプラスミドの挿入などのＤＮＡトランスフェクション法を使用して行うことができる。

本発明による細胞周期の検出方法は、例えば、薬剤（細胞周期阻害剤、又は細胞周期が関与する疾患用の薬剤など）のスクリーニング方法に応用することができる。具体的には、薬剤の候補物質の存在下において細胞を培養し、該細胞について本発明による細胞周期の検出方法を行うことによって細胞周期に影響を及ぼす候補物質を選択することができ、これにより、細胞周期阻害剤、又は細胞周期が関与する疾患用の薬剤などをスクリーニングすることができる。

さらに本発明によれば、上記した遺伝子構築物を有する形質転換体が提供される。本発明の遺伝子構築物は、適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。宿主細胞の種類は、特に限定されないが、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレプトマイセス等のグラム陽性菌又は大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられる。哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法も公知であり、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevis1ae)またはサッカロマイセス・クルイベリ(Ｓaccharomyces kluyveri)等が挙げられる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。

さらに本発明によれば、上記した遺伝子構築物を有する、遺伝子導入非ヒト動物が提供される。
本発明の遺伝子導入非ヒト動物の作製方法は特に限定されないが、例えば、本発明の遺伝子構築物を受精卵などに導入することにより作製することができる。遺伝子導入非ヒト動物の作製のために導入遺伝子として用いる本発明の遺伝子構築物としては、細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する発現産物の遺伝子又はその部分断片と、マーカーをコードする遺伝子とを、適当な哺乳動物用プロモーターの下流に連結した組換え遺伝子を使用することが好ましい。本発明の遺伝子導入非ヒト動物は、例えば、非ヒト動物の受精卵に、本発明の遺伝子構築物を導入し、当該受精卵を偽妊娠雌性非ヒト動物に移植し、当該非ヒト動物から本発明の遺伝子構築物が導入された非ヒト動物を分娩させることにより作製することができる。非ヒト動物としては、例えば、マウス、ハムスター、モルモット、ラット、ウサギ等のげっ歯類の他、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ、サル、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ等を使用することができるが、作製、育成及び使用の簡便さなどの観点から見て、マウス、ハムスター、モルモット、ラット、ウサギ等のげっ歯類が好ましく、そのなかでもマウスが最も好ましい。

本発明の遺伝子導入動物は、交配により本発明の遺伝子構築物を安定に保持することを確認した後、当該遺伝子保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することができる。導入遺伝子を相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該遺伝子を過剰に有するように繁殖継代することができる。細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する発現産物の遺伝子又はその部分断片と、マーカーをコードする遺伝子の発現部位を同定するためには、当該遺伝子の発現を個体、臓器、組織、細胞の各レベルで観察することができる。

以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

実施例１：プラスミドの構築
（１）mKO2-Cdt1の構築
（ａ）蛍光蛋白質単量体Kusabira-Orange(mKO)の早期蛍光発光能獲得変異体の開発
細胞周期をはじめ、細胞内の生理的なシグナルを検出する際に、蛍光タンパク質をレポーターとして使用する場合は、その蛍光タンパク質が翻訳されてから素早く蛍光を発することが必要とされる。細胞内の可視化したい事象と蛍光タンパク質の蛍光発光能を獲得するまでの時間に大きな開きがある場合には、その検出系自体が意味を持たないことになりかねない。そのため、レポーターとして使用する蛍光タンパク質において、翻訳後に素早く成熟して蛍光発光能を獲得できる変異体（早期蛍光発光能獲得変異体）の作製を行なった。材料としてイシサンゴ類のクサビライシより単離された蛍光蛋白質Kusabira-Orange（KO）の単量体変異体であるｍKOを使用した。mKOは(株)医学生物学研究所、Amalgaam(有)より製品名ｍKO1として市販されている。

（ｂ）点変異導入による早期蛍光発光能獲得変異体の作製
mKOの一次構造配列から構造を予測し、早期蛍光発光能を獲得できそうな部位（点）をいくつか選択し、なおかつ蛍光特性を保持するようｍKO遺伝子にアミノ酸置換点変異を導入した。ｍKO遺伝子を挿入した大腸菌発現ベクタープラスミド（pRSET B Invitrogen）を鋳型にアミノ酸置換点変異導入プライマーをもちいてアミノ酸置換点変異導入を行なった。サーマルサイクリングにより、鋳型DNAの解離、プライマーの会合、プライマーの伸長を繰り返し、アミノ酸置換点変異導入されたDNAを増幅した。増幅に用いたプライマーは5'側のリン酸化を行った。

a）プライマーの5'リン酸化
100μM primer 2μl
10× T4 polynucleotide kinase buffer 5μl
100μM ATP 0.5μl
滅菌水 41.5μl
T4 polynucleotide kinase (10 U/μl) 1μl
37℃で30分間インキュベートした。

b）点変異導入PCR
5'リン酸化プライマーミックス final 4μl
template(mKO−pRSET B) 100ng
10× polymerase buffer 2.5μl
10× DNA ligase buffer 2.5μl
2.5mM dNTPs 1μl
polymerase（pfu）2.5U/μl 1μl
Taq DNA ligase 40U/μl 0.5μl
滅菌水で計50μlとする。

プログラム
サーマルサイクラーはGeneAmp PCR system 9700を使用した。
反応条件
65℃ 5min (ライゲーション)
95℃ 2min (変性)
95℃ 20sec (変性)
52℃ 20sec (プライマーの鋳型へのアニーリング)
65℃ 8min (プライマー伸長及びライゲーション)
上記3ステップを25サイクル行った。
75℃ 7min (最後の伸長)
4℃ 保存

使用したプライマー
5'- cgcgtcacaatggccgasggcgggccaatgcct -3'（配列番号１）
5'- cgcgtcacaatggccragggcgggccaatgcct -3' （配列番号２）
5'- tacggccacagavtntttactaaatatcca -3' （配列番号３）
5'- aatcacaaatgccaannsaagactacttacaag -3' （配列番号４）
5'- cttaaaatgccaggagancattacatcagccat -3' （配列番号５）
5'- aacattactgagvwsgtagaagatgcagta -3' （配列番号６）
5'- tacaaggcggcaraaragattcttraaatgccagga -3' （配列番号７）
5'- gaccattacatcrrscatcgcctcgtcagg -3' （配列番号８）
混合塩基表記 w=a/t, r=a/g, s=g/c, v= a/g/c,n=a/t/g/c

c） DpnI処理
PCR後のサンプルにDpnIを1μl加えて37℃に1時間インキュベートして鋳型発現ベクタープラスミドを切断した。

d) 大腸菌への形質転換
DpnI処理後のサンプルを大腸菌JM109（DE3）に形質転換して形質転換体を得た。蛍光タンパク質を発現している形質転換体の蛍光強度を比較し、候補クローンをピックアップした。ピックアップしたクローンの発現ベクタープラスミドをWizard Plus SV Minipreps DNA Purification System（Promega）で精製し、その発現ベクタープラスミドを鋳型にアミノ酸置換点変異導入を繰り返し、mKOを進化させた。発現ベクタープラスミドの精製はキットのプロトコールに準じた。

e) mKO変異体の塩基配列決定
最終的に選択した形質転換体クローンを培養して発現ベクタープラスミドをWizard Plus SV Minipreps DNA Purification System（Promega）で精製した。発現ベクタープラスミドの精製はキットのプロトコールに準じた。精製した発現ベクタープラスミド内のmKO変異体の塩基配列を解析し、アミノ酸配列を決定した。塩基配列解析にはBigDye Terminator ver.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)を使用し、方法はキットのプロトコールに準じた。その結果、49番目のリジン（K）をグルタミン酸（E）に、70番目のプロリン（P）をバリン（V）に、176番目のフェニルアラニン（F）をメチオニン（M）に、185番目のリジン（K）をグルタミン酸（E）に、188番目のリジン（K）をグルタミン酸（E）に、192番目のセリン（S）をアスパラギン酸（D）に、196番目のセリン（S）をグリシン（G）に、210番目のロイシン（L）をグルタミン（Q）に置換されていた。この変異体をmKO2とした。蛍光タンパク質mKO2の塩基配列を配列番号２０に示し、アミノ酸配列を配列番号２１に示す。

f) 蛍光特性の解析
大腸菌を用いてｍKO2にHis-Tagを付加したリコンビナント蛋白質を発現させNi-NTA Agarose(QIAGEN)を用いて精製した。精製方法はキットのプロトコールに準じた。20uM蛍光タンパク質、150mM KCl、50mM HEPES-KOH pH7.4溶液の吸収スペクトルを分光高度計（U-3310 HITACHI）にて測定し、吸収スペクトルのピークの値よりモル吸光係数を算出した。500nmの吸収値が0.005となるようにmKO、mKO2を150mM KCl、50mM HEPES-KOH pH7.4溶液で調整して、蛍光分光光度計（F-2500 HITACHI）にて500nmの光で励起した際の蛍光スペクトルを取得し、その面積を算出した。mKOの蛍光の量子収率を0.6としてその面積比からmKO2の蛍光の量子収率を算出した。mKO2のpH感受性（pKa）に関しては100mM緩衝液100μｌに２μｌのmKO2タンパク質溶液（19.1mg/ml）を加えての吸収スペクトルを測定し、算出した。

各pHの緩衝液は次の通り、
pH4、5 ：酢酸緩衝液
pH6 ：リン酸緩衝液
pH7、8 ：HEPES緩衝液
pH9、10 ：グリシン緩衝液
mKOとmKO2の蛍光特性の比較を表６に記載する。
“モル吸光係数×量子収率＝蛍光タンパク質分子としての絶対的な明るさ”より、
mKO=51600×0.6＝30.9k
mKO2=63800×0.57＝36.3k
となり、蛍光タンパク質分子として約1.2倍明るくなった。

g) 培養細胞での発現によるmKO2の評価
蛍光タンパク質発現ベクタープラスミドpmKO1-MN1（（株）医学生物学研究所）より、制限酵素NotI、XbaIでmKO(mKO1)遺伝子部分を切り出し、５’側にNotIサイト、３’側にXbaIサイトを付加したmKO2遺伝子を替わりに挿入した。制限酵素配列の付加はPCRで行なった。サーマルサイクラーはGeneAmp PCR system 9700を使用した。

PCR反応液組成
テンプレート（mKO2-pRSET B） 1ul
X10 pfu バッファー 5ul
2.5mM dNTPs 3ul
20uM フォワードプライマー 1ul
20uM リバースプライマー 1ul
DMSO 5ul
ミリQ 33ul
pfu polymerase(2.5U/ul) 1ul

PCR反応条件
94℃ 1min(PAD)
94℃ 30sec (変性)
52℃ 30sec (プライマーの鋳型へのアニーリング)
72℃ 1min (プライマー伸長)
上記3ステップを30サイクル行った。
72℃ 7min (最後の伸長)
4℃ 保存

フォワードプライマー
5'- ataagaatgcggccgcggggaccatggtgagtgtgattaaaccagag -3' （配列番号９）
リバースプライマー
5'-cgctctagattaggaatgagctactgcatcttctacca-3' （配列番号１０）

1％アガロースゲルの電気泳動で、増幅された約700bpのバンドを切り出し、精製してNotI、XbaIで処理したpmKO1-MN1にサブクローニングし、pmKO2-MN1を作製した。pmKO1-MN1と構築した発現ベクタープラスミドpmKO2-MN1を用いて、HeLa細胞でのmKO（mKO1）とmKO2の蛍光発光能の比較を行なった。

35mmガラスボトムデッシュにHeLa細胞を40％コンフルエントになるように用意して、遺伝子導入試薬polyfect（QIAGEN）を用いてHeLa細胞にpmKO1-MN1とpmKO2-MN1を導入して蛍光タンパク質を発現させた。細胞培養条件および遺伝子導入はpolyfectのプロトコールに準じた。35mmガラスボトムデッシュあたり１μｇの発現ベクタープラスミドを使用した。

時間を追って、蛍光画像を取得し、蛍光輝度の比較を行なった。蛍光画像は、励起フィルター 25BP520-540HQ、蛍光フィルター 25BA555-600HQ、ダイクロイックミラーDM545HQを使用し、画像取得した。励起光はキセノン光源を用い、70％をカット（30％透過）して0.5秒間露光した。顕微鏡は倒立型顕微鏡IX-71（オリンパス）を、レンズは20倍Uapo/340 N.A. 0.75（オリンパス）を使用した。画像取得及び画像解析にはMetaMolph（日本ローパー）を使用して、ビニング２で画像取得を行なった。冷却CCDカメラORCA-ER（浜松ホトニクス）を用いて蛍光像を取得した。

発現ベクタープラスミド導入後、６、８、１０時間で蛍光画像を取得し、細胞あたりの平均輝度を計算して、その値を蛍光輝度としてプロットした（図１）。発現制御のできる系ではないことから、発現ベクターを取り込んでから蛍光タンパク質を発現するまでの時間にばらつきはあるものの、明らかにmKO2の方が、早い時間で蛍光発光能を有し、2倍以上明るいという結果が得られた。早期蛍光発光能獲得変異体mKO2を以後の実験に使用した。

（ｃ）mKO2-Cdt1の構築
以下に示すプライマー１及び２を用いて蛍光タンパク質mKO2をPCRで増幅し、pcDNA3 vector のEcoRI - EcoRVサイトに導入した。その後、以下に示すプライマー３とプライマー４の組み合わせ（Cdt1の３０〜１００番目のアミノ酸からなる断片を増幅する）、又はプライマー３とプライマー５（Cdt1の３０〜１２０番目のアミノ酸からなる断片を増幅する）の組み合わせを用いて、Cdt1（Genbank Accession No.; NM＿030928）の断片をPCRで増幅し、Xho I- XbaI サイトに導入した。また、レンチウイルスベクター（CSII-EF-MCS）へは、上記EcoRI - XbaIサイトを用いて移し変えた。なお、上記PCRは以下の条件で行った。

反応液：
テンプレートDNA; 1〜10 ng / 1μl
10× polymerase buffer 10μl
2.5mM dNTP mix; 8μl
forward primer (20 μM); 1μl
reverse primer (20 μM); 1μl
DMSO; 5μl
Pfu porymerase 2.5U/μl 1μl
Mili Q 73μl

サーマルサイクラーはGeneAmp PCR system 9700を使用した。
反応条件：
94℃ ２分
94℃ 1分
50℃ 30秒
72℃ 1.5分
上記3つの反応を28サイクル
その後、72℃ 7分
４℃ 保存

（２）mAG-Gemininの構築
蛍光タンパク質ｍAGはイシサンゴ類のアザミサンゴより単離されたAzami Green（AG）の単量体変異体で、(株)医学生物学研究所、Amalgaam(有)より製品名ｍAG1として市販されている。

以下に示すプライマー６及び７を用いてmAGをPCRで増幅し、pcDNA3 vector のEcoRI - EcoRVサイトに導入した。その後、以下に示すプライマー８及びプライマー９（Gemininの１〜１１０番目のアミノ酸からなる断片を増幅する）を用いて、Geminin（Genbank Accession No.; NM＿015895）の断片をPCRで増幅し、Xho I- XbaI サイトに導入した。また、レンチウイルスベクター（CSII-EF-MCS）へは、上記EcoRI - XbaIサイトを用いて移し変えた。なお、上記PCRは以下の条件で行った。

プライマー１：mKO2 forward primer (M12-EcoN-F) : 5'- ggg gaa ttc gcc acc atg gtg agt gtg att aaa cca gag（配列番号１１）
プライマー２：mKO2 reverse primer (m11-AGCter-EcoV-R) : 5'- atg gat atc cgc cct ggg aag gca aca ttg agt aat gag cta ctg cat ctt cta c（配列番号１２）

プライマー３：XhoI-Hu.Cdt(30)(F): 5'- gcc ctc gag ccc agc ccc gcc agg ccc gca（配列番号１３）
プライマー４：Hu.Cdt(100)ter.XbaI(R): 5'- gca tct aga tta ttt ctt tat ctt ctg gcc cgg aga（配列番号１４）
プライマー５：Hu.Cdt(120)ter.XbaI(R): 5'- gca tct aga tta gat ggt gtc ctg gtc ctg cgc（配列番号１５）

プライマー６：mAG forward primer (hM12-EcoN-F) : 5'- ggg gaa ttc gcc acc atg gtg agc gtg atc aag ccc ga （配列番号１６）
プライマー７：mAG reverse primer (hM12-EcoV-R) : 5'- atg gat atc cct tgg cct ggc tgg gca gca t （配列番号１７）

プライマー８：XhoI-Hu.geminin(1)(F): 5'- gcc ctc gag atg aat ccc agt atg aag cag aaa c （配列番号１８）
プライマー９：Hu.geminin(110)ter.XbaI(R): 5'- gca tct aga tta cag cgc ctt tct ccg ttt ttc tgc （配列番号１９）

実施例２：トランスフェクション及びイメージング
細胞培養法
ＨｅＬａ細胞およびCOS7細胞を、10%ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを追加したＤＭＥＭで培養した。マウスNMuMG乳腺上皮細胞を、10%ウシ胎児血清、ペニシリン／ストレプトマイシン及び10 μg/mlインシュリン(シグマ)を追加したＤＭＥＭ（高グルコース)で培養した。ＥＧＦとＴＧＦβ１をＲ＆Ｄから購入した。

トランスフェクション
Lipofectin 法を用いて、HeLa 細胞へ、実施例１で作製した遺伝子構築物をトランスフェクションを行った。具体的には、以下の通りである。細胞を10%ウシ胎児血清(FBS)を含むフェノールレッド無添加ダルベッコ修飾イーグル培地を加えた35mmガラス底ディッシュ上で培養した。Ａ液（プラスミド１μg、Opti-MEM 100 μl）とB液（lipofectin 4 μl、Opti-MEM 100μl）をそれぞれ作成し、混合後、室温で１５分静置した。ガラスボトムディッシュにあらかじめ準備しておいた細胞の培養上清を Opti-MEMに置き換える。Ａ液とＢ液の混合液を細胞の培養液上に加えた。４時間後に培養上清を新しい培養液に置き換えた。

１から２日後に、インキュベータ顕微鏡（オリンパス社、LCV100）にて２４〜６０時間くらいイメージングを行い、細胞周期特異的に核に蛍光シグナルが現れるものをスクリーニングした。Wavelength1; LED620nmによりDICイメージを取得。Wavelength2; mKO2蛍光シグナルを取得（ex; BP520-540HQ. em; BA555-600HQ）。Wavelength3; mAGシグナルを取得（ex; 470DF35. em; 510WB40 ）。

また、トランスフェクション後、500μg/ml G418を加えた培地を用いて培養を行い、クローンとして増殖できるかどうかで細胞毒性の判定を行った。

上記の結果、Cdt1の３０から１２０番目のアミノ酸からなる部分断片（以下、mKO2-Cdt1#10とも称する）、及びGemininの１〜１１０番目のアミノ酸からなる断片（以下、mAG-Geminin#2とも称する）を用いたトランスフェクションをした場合、細胞周期特異的な核質蛍光パターンが獲得され、かつ細胞毒性を持たないことが確認された。

なお、作製されたmKO2-Cdt1#10 およびmAG-Geminin#2 の塩基配列は、それぞれAB370332及びAB370333としてDDBJ databaseに登録されている。

実施例３：レンチウイルスの作成、及び細胞のトランスダクション
HEK293細胞を用いて、mKO2-Cdt1#10、mAG-Geminin#2それぞれのレンチウイルスを作成し、様々な細胞へのトランスダクションを行った。具体的には、以下の通りである。

レンチウイルスの作成
レンチウイルス作成の手順については、理化学研究所ＢＲＣ生体情報統合技術開発チーム細胞運命情報解析技術開発サブチームの三好先生の方法を改変して行った。すなわち；
A液；
pCAG-HIVgp plasmid 10 μg
pCMV-VSV-G-RSV-Rev plasmid 10 μg
CSII-EF-MCS-mKO-Cdt1#10 or CSII-EF-MCS-mAG-Geminin#2 17 μg
Opti-MEM 1.5 ml
B液；
Lipofectamine 2000 36 μl
Opti-MEM 1.5 ml

A液とB液を準備し、混合した後、室温にて20分静置する。HEK２９３Ｔ細胞をトリプシン処理して剥がし、細胞数をカウントする。6ｘ１０⁶ cells / 5 ml になるよう調整する。１０ｃｍディッシュを用意し、５ml の培養液を入れる。その上に、A液とB液の混合液を加える。最後に、HEK２９３Ｔ細胞を５ml 加える。37℃、５％CO2インキュベータにて培養する。２４時間後に、培養液を交換する。２日後に、培養上清を回収する。これがウイルス液となる。３０００回転で５分間の遠心を行い、上清を回収、分注して-80℃にて保存する。細胞には新たに培養液を加えておく。同様に３日後にも培養上清を回収し、ウイルス液としてストックする。

細胞のトランスダクション
任意の細胞を準備する。プラスチックディッシュに張り付いている細胞、または浮遊している細胞の培養上清に、ウイルス液を加える。３０〜３００ μl / 3.5 cm dish 位がおおまかな目安になる。２から３日後に蛍光顕微鏡にて観察すると、トランスダクション（ウイルスが感染して、遺伝子がゲノムにインテグレート）された細胞が蛍光を発するのが観察できる。２種類のウイルス mKO-Cdt1#10 と mAG-Geminin#2 を同時にトランスダクションし、１週間後からシングルセルクローニングを始める。４週間くらいかけて、シングルから細胞が成長し、２色の蛍光を発するコロニーを回収し、インディケータ発現細胞とする。HeLa＿LV＿mKO2-Cdt1#10 & mAG-Geminin#2 におけるクローンの蛍光顕微鏡観察の結果を図２に示す。

上記方法により、HeLa（ヒト子宮頸部ガンの培養細胞）,HEK293（ヒトの胎児腎臓由来培養細胞）、PC12（ラット褐色腫由来の培養細胞）, COS（サルの培養細胞）, CHO（ハムスターの培養細胞）、NMuMG（マウス培養細胞）,ラット神経細胞の初代培養、マウス骨髄由来細胞の初代培養などの細胞を２種類のウイルス（mKO2-Cdt1#10、mAG-Geminin#2）で同時にトランスダクションし、両遺伝子が導入された細胞をイメージングした。上記の細胞全てにおいて、細胞周期依存性に、休止期（G1期）には、mKOの蛍光が核に局在し、増殖期（S,G2,M期）にはmAGの蛍光が核局在するのが観察された。PC12、COS、NMuMG について、それぞれ両インディケータが発現する細胞をシングルセルクローニングし、数ラインを得ている。

具体例として、HeLa細胞を２種類のレンチウイルス（mKO2-Cdt1#10、mAG-Geminin#2）で同時にトランスダクションし、両遺伝子が導入された細胞をイメージングした結果を図２に示した。細胞周期の期間は、細胞密度及び血清濃度の差により推測上可変である。緑色蛍光がＭ期の終了間際に急速に消失し、赤色蛍光がＧ₁期初期で検知できるようになったので、蛍光中の小さなギャップは新しく生成した娘細胞を示す。対照的に、赤色から緑色への変換中において、赤色及び緑色蛍光がオーバーラップし、黄色の核を示した。色変換のタイミングがＳ期の開始と関連するかどうか調べるために、形質転換体を５分間ＢｒｄＵでパルス標識し、ＢｒｄＵに対して直ちに免疫染色した。Ｇ１／Ｓ転移、及びＧ₁、Ｓ、Ｇ₂及びＭ期における細胞の典型的な共焦点イメージを図3Ｃに示す。黄色の核を示す細胞のすべてがＢｒｄＵ取り込みを示したことから、緑色蛍光の出現はＳ期の開始を示す。同様の結果が、ＰＣＮＡに対して免疫染色した別個の実験から得られ、純粋な緑色蛍光発色核を示す細胞を観察した。これらの細胞はＳ又はＧ₂期のどちらかにあり、核性ＢｒｄＵ又はＰＣＮＡ免疫染色によって識別可能だった。これらの結果は、mKO2-Cdt1#10がＧ₁期に蓄積し、その一方でmAG-Geminin#2はＳ／Ｇ₂／Ｍ期に蓄積することを示す。この蛍光性ユビキチン化に基づいた細胞周期指示薬（fluorescent, ubiquitination-based cell cycle indicator）を「Ｆｕｃｃｉ」と名付けた。フローサイトメトリーによるＤＮＡ内容物の分析から、Ｆｕｃｃｉ発現ＨｅＬａ細胞と親ＨｅＬａ細胞とは同じ分布を示すことを明らかにした（図3Ｄ、左）。Ｆｕｃｃｉ発現細胞を、赤色、黄色、緑色を発する集団に分割し、（それぞれ、ｍＫＯ２（＋）ｍＡＧ（−）、ｍＫＯ２（＋）ｍＡＧ（＋）、ｍＫＯ２（−）ｍＡＧ（＋））（図3Ｄ、真中）、及びそれらのＤＮＡ内容物をヘキスト３３３４２で染色し、その後分析した。緑色及び黄色の細胞は、それぞれＤＮＡの完全及び部分的に複製量を有していた（図3Ｄ、右）。したがって、Ｇ₁及びＳ／Ｇ₂／Ｍ期の細胞の分化プロファイリングは赤色、黄色又は緑色にある細胞の集団をソーティングすること、並びに遺伝子発現及び抗原表面発現などの様々な細胞性機能を検討することにより達成される場合がある。

実施例４：免疫細胞化学的細胞周期分析
分析方法
カバーグラス上で培養したFucci発現ＨｅＬａ細胞を、37℃で5分間BrdU(シグマ)で処理した。PBS(-)で洗浄した後に、細胞を、4℃で１０分間４％ＰＦＡで固定した後、室温で5分間0.1%TritonX-100/PBS(-)で処理した。
使用した抗体は次の通りである：アレクサ・フルーアー633(モレキュラープローブ)とコンジュゲートしたヤギ抗マウスIgG、マウス抗BrdU mAb(イムロジカルダイレクト)、及びマウス抗PCNA mAb(ダコ)。イメージの入手を488nm(Ａｒ)、543nm(Ｈｅ/Ne)および633nm(Ｈｅ/Ne)のレーザー線を装備したFV500(オリンパス)共焦点顕微鏡システムを用いて実施した。

フローサイトメトリー
ヘキスト33342溶液(１ｍｇ／ｍｌストックの56μｌ)(ドージンドー)を、親又はFucci発現ＨｅＬａ細胞を含む10cmディッシュに加えた。30分間のインキュベーション後、細胞を集め、及びBDＴＭＬＳＲ（ベクトンデッキンソン）を用いて分析した。mKO2及びmAGを488nmのレーザー線(Ａｒ)で励起し、ヘキスト33342を325nmのレーザー線(HeCd)で励起した。蛍光信号は、mAGに対して530 nm (530/28 BP)(FL1)、mKO2に対して575 nm (575/26 BP)(FL2)、ヘキスト３３３４２に対して400 nm (380 LP) (FL5)で集めた。データはFlowJoソフトウェア(ツリースター)を用いて分析した。

培養細胞の構造及び行動変化及び細胞周期力学のモニタリング結果
上皮間充織転移（ＥＭＴ）は、胚発生、創傷治癒及び多細胞性組織における腫瘍進行において、間葉細胞が上皮から形成される基本的な形態形成プロセスである。ｉｎｖｉｔｒｏで、ＥＭＴは細胞−細胞間結合の分解、細胞骨格の転位、及び培養細胞の運動性の増加によって特徴付けられる。細胞周期の特定のステージがプロセスに含まれる可能性がある。確かに、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）は、Ｇ₁／Ｓ期で同期されたＡＭＬ−１２肝細胞においてＥＭＴを効率的に誘導するが、Ｇ₂／Ｍ期で同期された細胞においてはその活性はない。さらに、ＮＭｕＭＧ細胞は、ＴＧＦβに応じてＥＭＴを受ける。ＥＭＴ中の細胞周期進行を調査するために、Ｆｕｃｃｉを発現し、安定して形質転換されたＮＭｕＭＧ細胞を検査した。

細胞をカバーグラス上にまいた後、細胞は近隣の細胞と細胞−細胞接着を維持するクラスターとして増殖した（図４Ａ、１ｈ）。これらの細胞の高い増殖能を、緑色核の細胞が優位である増殖像より証拠づけた（図４Ａ，２５−４９ｈ）．しかしながら、集合単層に達すると、緑色の核の細胞は観られなくなり、赤色の核の細胞のみに置換され（図４Ａ，７３ｈ）、細胞がＧ₁期に留まったことを示す。集合単層（図４Ｃ、１ｈ）に傷を入れた場合、傷の端にある細胞は緑になり（図４Ｃ、１３ｈ、矢印）、傷の導入がＮＭｕＭＧ細胞の増殖を要求したことを示している。緑色の核が傷誘導後９−１３時間に顕著に現われた。そのような８時間を超える時間の遅れは、他の同様の創傷治癒実験中で再現性よく観察され、増殖刺激の開始後に静止（Ｇ₀）の状態から細胞周期に再び入るために、ＮＩＨ３Ｔ３細胞にとって必要な８時間を思い起こさせる。したがって、集合単層になったＮＭｕＭＧ細胞がＧ₀期に留まっていた可能性が考えられる（図４Ａ、８５ｈ）。次に、１ｎｇ／ｍｌＴＧＦβの存在下で同じ実験を行なった。ＴＧＦβ処理後１日以内に、緑の核をもつ細胞の数は増加し、このリガンドがＧ₁／Ｓ転移を誘導することを示す（図４Ｂ、１−４９ｈ）。続いて、細胞は軸形で、繊維芽細胞状の形態及び高い運動性を示し始めた（図４Ｂ、４９ｈ）。２日間のＴＧＦ処理の後、緑色の核をもつ細胞の数が減少し、ＴＧＦβのＧ₁停止効果を反映している（図４Ｂ、４９−８５ｈ）。したがって、ＴＧＦβ処理の細胞は、集合単層中で密集した未処理のＮＭｕＭＧ細胞と対照的に、増殖なしで広がる。さらに、傷の導入は増殖に帰着せず、むしろ細胞の一層の延長に帰着した（図４Ｄ）。

実施例５：トランスジェニック動物の作成
mKO-Cdt1#10 及び mAG-Geminin#2をそれぞれpCAGGS ベクターに組み込んだプラスミドの名前をpCAGGS＿mKO-Cdt1#10 、pCAGGS＿mAG-Geminin#2 とする。それらプラスミドから、マウス卵細胞にインジェクションするためのフラグメントを生成した。
pCAGGS＿mKO-Cdt1#10 or pCAGGS＿mAG-Geminin#2 20μg / 40 μl
10x H buffer 10 μl
H2O 50 μl
制限酵素 Sal I、Pst I、Pvu I

上記反応液を混合し、３７℃で２時間インキュベートする。電気泳動により、バンドを分離し、mKO-Cdt1#10については３．２Kb のバンドを、mAG-Geminin#2については 3.3 Kbのバンドを精製した。理化学研究所、脳科学総合研究センター、ＲＲＣの支援業務に委託し、トランスジェニックマウスの作成を行った。ジェノタイピングの結果、mKO-Cdt1#10の遺伝子を持つトランスジェニックマウスを１６系統、及びmAG-Geminin#2の遺伝子を持つトランスジェニックマウスを８系統、取得した。

実施例６：生マウス中の腫瘍細胞の細胞周期進行
マウスの全身イメージング方法
ホフマンおよびヤングらの文献（Nat. Protocol, (2006), 3, 1429-1438）に記載され
ている通りに、培養細胞の皮下及び静脈注射、並びにOV100(オリンパス)を備えた全身
イメージングを実施した。血管を視覚化するために、アンジオセンス−IVM750(ヴィス
エンメディカル)を投入し、又は、内皮細胞を抗CD31 mAb(ケミコン)を用いて染色した
。

ＣＡＧプロモーターを使用して、mKO2-Cdt1#10を発現するトランスジェニックマウス系統を作製した。赤色蛍光を発する１６マウス系統から、＃５９６をさらなる特性解析のために選択した。さらに、８種の緑色蛍光性mAG-Geminin#2マウス系統を作製し、＃５０４をさらなる特性解析のために選択した。これらのマウス系統は、細胞周期の調整と発生を研究する先例のないモデル系を提供する。増殖パターンに関する生体内の情報を提供するので、＃５０４は特に有用である。哺乳類の大脳皮質の初期発生中に、脳室面（ＶＺ）での神経前駆細胞は増殖を続ける。mAG-Geminin#2の緑色蛍光が神経前駆細胞によって生み出されるかどうか判断するために、胎齢（Ｅ）１４日の＃５０４トランスジェニック胎期マウスの終脳部について免疫組織化学を行なった。緑色の核をもつ終脳の細胞がＭＡＰ２ではなくネスチンに対して免疫陽性であったので、これらの細胞は神経前駆細胞である可能性がある。

次に、＃５９６及び＃５０４トランスジェニックのマウスをクロス交配させ、Ｆｕｃｃ
ｉ産生マウス系統を生成し、すべての体細胞核は赤色又は緑色の何れかの蛍光を示した
。

E13 Fucci(#596/#504)胎児を、停色剤(4%PFA)で経心的に注入し、2時間氷冷停色剤でおき、20%スクロースを含むPBSで抗凍結処理し、及びＯＣＴ複合物へ埋め込んだ。冠状頭部切片(15μmの厚さ)を、2つのレーザーダイオード(473nm及び559nm)を装備したFV1000を用いてイメージ化した。イメージは、広視野写真を作成するために統合された。E14#504胎児からの脳部を固定化し、マウス抗MAP2 mAb(ケミコン)又はマウス抗ネスチンmAb(ファーミンゲン)でインキュベートし、AlexaFluor 546X(モレキュラープローブ)でコンジュゲートされたヤギ抗マウスIgGでインキュベートした。

培養脳スライスのイメージング方法
脳スライスを、E13でFucci発現マウス(#596/#504)で準備し、及びミヤタらの文献（J.
Neurosci. Res. (2002), 69, 861-868）に記載されている通りに、コラーゲンゲルで
培養した。スライスを5%CO₂及び40%O₂に暴露した。3DイメージングはFV1000多重位置ス
テージシステムを用いて、xyz-tモードで行なった。記録間隔を10分とした。各時間ポ
イントでは、Z軸(2μmステップ)に沿った20の焦点を共有するイメージが得られた。緑
および赤信号のクロス検知を回避するために、イメージは488nm(Ａｒ)および543nm(Ｈ
ｅ/Ne)で連続して得られた。緑及び赤のイメージは個々の焦点を共有するイメージのた
めに統合された。2レーザー線及び検知チャンネルを備えたFV1000の正確なイメージ登
録及び適切な整列は、二重に標識された蛍光性ビーズ(テトラスペック蛍光マイクロス
フェアスタンダード、直径0.5μｍ、モレキュラープローブ)を用いて確認された。デー
タ分析は、Volocityソフトウェア(インプロヴィジョン)及びMETAMORPFソフトウェア(ユ
ニバーサルイメージング、メディア、PA)を用いて行なわれた。

生マウス中の腫瘍細胞の細胞周期進行分析結果
蛍光性タンパク質で遺伝学的標識した培養腫瘍細胞を注入したマウスの全身及び生存中の細胞のイメージングは、腫瘍発生を調査するための強力な技術である。ヌードマウスの乳腺皮下へＦｕｃｃｉ発現ＮＭｕＭＧ細胞を皮下注射することにより、腫瘍発生をモニターするためにＦｕｃｃｉを使用した（図５Ａ）。接種１日後に、緑色及び赤色の細胞が観察された（図５Ｂ）。しかしながら、１６日後には、赤色を示す細胞だけが見られ（図５Ｃ）、ＮＭｕＭＧ細胞が増殖を停止したことを示した。次に、Ｆｕｃｃｉ発現ＨｅＬａ細胞を、同様の方法でヌードマウスに注入した（図５Ｄ）。注入細胞は徐々に増殖し、常に緑色及び赤色蛍光を発し、腫瘍進行を示唆した（図５Ｅ及び５Ｆ）。拡大像は、接種２７日後に顕微鏡（オリンパス、IV100、10X、UplanFL N N.A.=0.30）下で皮膚を通して観察された（図５Ｇ）。非常に発達した腫瘍容積が遠赤外の蛍光を放射するアンジオセンス７５０をロードすることにより視覚化された。３色のライブイメージは、Ｇ₁及びＳ／Ｇ₂期にあるＨｅＬａ細胞を識別するが、容積と関連のあるそれらの位置は低い空間分解能により明らかではなかった。腫瘍を固定及び分離し、ＣＤ３１に対する抗体で染色した。Ｆｕｃｃｉの赤色及び緑色蛍光は、４％ＰＦＡにおける固定を含む従来の免疫染色手順後に留まった。血管のまわりのＨｅＬａ細胞の細胞周期パターンは、明白に視覚化された（図５Ｈ）。パターンは、容積の成熟及び周囲の組織中の壊死の程度を含むいくつかの要因に依存するように見えた。

次に、腫瘍細胞の細胞周期進行を、内皮細胞への接着及び浸潤・転移などの古典的な転移カスケードの第一段階中に検査した。ゲル中のＦｕｃｃｉ発現ＨｅＬａ細胞を、皮膚静脈に接種した。さらに、生存細胞のイメージングを行なった。興味深いことには、初期段階では、静脈の内壁に固着した細胞のほぼすべては、Ｇ₁期にあった（図５Ｉ及び５Ｊ）。浸潤・転移プロセスで細胞のイメージを捕らえた（図５Ｋ、５Ｌ及び５Ｍ）。静脈壁を横切ったＨｅＬａ細胞のクラスター内では、黄色の断片化した核を示す長方形の細胞が壁を通過することを観察した。接種４日後、ＨｅＬａ細胞が、組織に侵入し増殖することを観察し（図５Ｎ及び５Ｏ）、これは浸潤・転移の多数の発生を示唆する。

これまでに、マウスに注入された別個に標識された細胞質及び核をもつ培養細胞が、癌細胞の輸送、生マウスにおける細胞死、変形、浸潤・転移、及び有糸分裂をモニターするために、核−細胞質力学を想像することに使用することができる場合があることが知られている。これらの細胞質標識技術と組み合わせて、生きている動物に注入された、安定して形質変換されたＦｕｃｃｉ発現細胞の蛍光イメージングは、腫物の成長及び転移の振る舞いとして信頼できる薬力学的な読み出しを供給するだろう。

Ｆｕｃｃｉトランスジェニックマウスにおける神経組織発生の細胞周期分析結果
遺伝学的にコード化されたプローブの主な１つの利点は、転写調節に依存する必要がないということである；その転写は構成的恒常的なプロモーターを使用して動くことを可能とする。したがって、容易に細胞周期分析用の遺伝子組み換え生物を生成作製できる。ＦｕｃｃｉトランスジェニックE13胎期マウスを固定化し、脳の冠状断切片を用意した。赤色及びまたは緑色蛍光は共焦点走査顕微鏡を用いて、すべての部分において検査された。３つの代表的な部分の蛍光イメージを図６Ａ、６Ｅ及び６Ｉの中で示した。赤色及び緑色シグナルは、胚形成期でよく平衡に保たれるように見える。しかし、マウスが成長するとともに、赤色に対する緑色シグナルの全体比率は減少する。

発生中の大脳皮質（図６Ｂ、６Ｆ、６Ｇ及び６Ｊ）では、赤色のmKO2-Cdt1#10蛍光を発する核は、２つの主な細胞集団で区別された：脳膜面（ＣＰ）中の異なる層に住みうる、有系分裂後のニューロン及びＶＺ中の有系分裂の神経前駆細胞。有系分裂後のニューロンは、恐らく細胞周期逸脱後のmKO2-Cdt1#10の蓄積により、はるかに明るい赤色蛍光を示した。さらに、血管の明るい赤色の核は、ＶＺにおいて視覚化された（図６Ｂ及び６Ｆ）。間脳では、Ｇ₁期の細胞の縞があり、zona limitans intrathalamica(zli)に相当する。視床上部は下部の視床より多くの緑色の核を含んでおり（図６Ｉ及び６Ｊ）、下部領域の細胞が、上部領域のものに先立つ分化のために、細胞周期からの逸脱が早いことを支持する。

有系分裂及び有系分裂後の細胞の間の赤色蛍光の分化強度はまた、嗅覚及び鋤鼻系（それぞれ図６Ｃ及び６Ｄ）、並びに網膜（図６Ｈ）の神経上皮の発生中に観察された。高及び低強度の蛍光性の核のランダムな分布は、嗅覚及び鋤鼻上皮の構造がＥ１３でまだ確立されていないことを示唆する。対照的に、明るい赤色の核は、発生途中の網膜の中央の頂点領域（図６Ｈ）で観察された。その発生途中の網膜の神経節細胞は、遠心分離を受ける。レンズ上皮細胞もこの段階で細胞周期を出た。明るい赤色蛍光を持った他の神経外の組織は三叉神経節（図６Ｋ）及び脳下垂体（図６Ｌ）を含む。

GemininとCdt1は、初期のマウス神経新生中に神経前駆細胞によって十分に発現されることがこれまでに知られていたが、遅い発生段階で転写を下流制御する。Ｆｕｃｃｉシグナルはトランスジェニックマウス中の転写調節によって影響されない。

発生途中の大脳皮質において、いくつかの神経前駆細胞は、細胞周期を出て、及びそれらがニューロン又は後期段階で膠細胞に分化する、ＶＺを越えて移転する。神経前駆細胞はまた、ＶＺ内の典型的な移動パターンを受ける；それらの核は、インターカイネティック核動作として知られている特有の動作を受ける。Ｓ期の核が脳室面に向かって移動し、Ｍ期の核は脳室面に局在化する。神経前駆細胞の増殖、分化及び移動の空間及び時間制御を観察するために、Ｅ１３のＦｕｃｃｉトランスジェニック胎期マウスから用意された背面終脳のスライスを用いて、タイムラプスイメージング実験を行なった（図７Ａ）。皮質スライスを使用したタイムラプスイメージング実験は、３時間以上の間隔で通常得られる。そのような長期の間隔では、核の動作や細胞周期進行を充分にモニターすることができない。しかしながら、明るいＦｕｃｃｉ蛍光は、ＦＶ１０００多重位置ステージシステムを使用して、xyz-tモードで１０分間隔をもつ３Ｄタイムラプスイメージングを可能にする。各時間ポイントにおいては、Ｚ軸（２μｍステップ）に沿った２０の共焦点イメージが得られた。さらに、スライスの４０％酸素への暴露（通常の２０％に代えて）が、イメージング実験中に細胞増殖、分化及び移動を著しく改善した。これまでに述べたように、細胞分裂直後の神経前駆細胞の赤色の核は、神経分化した赤色の核よりも格段に蛍光が弱かった。ＶＺ内の細胞周期中の核の移動を視覚化するために、赤色蛍光用の光電子増倍管（ＰＭＴ）感度を増加させた。ＣＰの中の核は飽和した赤色蛍光を示したが、ＶＺの中の核は等価なレベルの緑色又は赤色蛍光を示した（図７Ｂ）。これらの条件の下では、明白に細胞周期進行中の緑色と赤色の変化及び細胞の移動を明白に追跡し得た。

インターカイネティック核動作に対応する神経前駆細胞の核の軌道を追跡した。脳室下帯（ＩＺ）付近のＳ期の細胞が、Ｇ₂期を経て、脳室面（ＶＺ）へ移動しＭ期に突入し細胞分裂後２つのＧ₁細胞になる１連の動きを追跡したものが図７Ｃ（左）で示される。分裂後の２つのＧ₁細胞は赤色を呈し、脳室面から離れて移動し始めた。また別の細胞はいわゆるエレベーター運動を示し（図７Ｃ，真中）、Ｇ₁期では脳室下帯に向かって上昇し、Ｇ₁／Ｓのタイミングで脳室下帯でヘアピンカーブを切るように方向転換をしＳ期になって脳室面へと移動した。さらに多くの細胞が脳室面で分裂期を迎えるのに対して、数％の細胞は脳室下帯でも分裂期を迎える事が知られており、その細胞を捕らえる事もできた（図７Ｃ，右）。最後に脳室下帯を横切るように赤色の核が非常に早く移動する現象も捉えた。これらの核は皮質のＧＡＢＡ（γ-amino-butyric-acid）ニューロンに属する細胞と思われる。サブパリアル（subpallial）な旧人類の終脳中で生れて、それらの最終移動場所に到着するために接線方向に移動する事がしられている。

Ｆｕｃｃｉの核の局在性は次の観点において有利である：ｍＣｈｅｒｒｙ及びｍＫｅｉｍａなどの、ｍＡＧ及びｍＫＯ２の両方とスペクトル的に異なるさらなる遠赤外の蛍光性タンパク質は、細胞タイプを同定し、かつ細胞形態学を観察するために、それらに核輸出シグナル（ＮＥＳ）で札付けすることにより細胞質中で発現し、識別されうる。第三の色の蛍光シグナルも化学染料によって提供され得る。図７に示される実験では、脳軟膜を連結している前駆細胞に希薄に標識するために脳のスライスの軟膜の表面に澄んだＤｉＤ結晶でラベルした。動作を追跡した（データは示していない）緑色の核を示す前駆細胞の二極化した形態を同定することができる例である。

カメレオン及びRaichu-Rasを代表とするＦＲＥＴ型インディケータを細胞質に発現させることで、細胞周期と同時に細胞内現象を理解する事が可能である。（データは示していない。）例えば、Ｆｕｃｃｉ発現ＣＯＳ７細胞へRaichu-Rasをトランスフェクトすると、Ｒａｓの活性化は上皮増殖因子（ＥＧＦ）シグナルに応じてＳ／Ｇ₂期よりもＧ₁期においてより活発である事が証明された。したがって、多数の細胞内の出来事の細胞周期依存性は細胞周期同期技術を使用せずに解明されうる。これらの蛍光プローブとタンパク質とを結合する多重カラーイメージングは、さらにＦｕｃｃｉ技術の適用を拡張し得る。

Ｆｕｃｃｉ技術は２つの色のイメージ化を可能とし、Ｇ₁及びＳ／Ｇ₂／Ｍ期の中の実際の細胞を区別できる。この技術は、２つの色（赤と緑）の間の蛍光の明るさ及び高コントラストによる、細胞周期力学の空間及び時間のパターンのｉｎｖｉｖｏでの分析を可能にする。ＦｕｃｃｉはmKO2-Cdt1#10及びmAG-Geminin#2からなるが、どちらか一方のトランスフェクションは細胞周期指示薬機能を与える際に十分である；例えば、トランスジェニックマウス系統＃５０４はmAG-Geminin#2を生産するが、しかしながら増殖パターンに関するｉｎｖｉｖｏの情報を提供する。それが黄色のシグナルをもつＧ₁／Ｓ転移を強調し、及び細胞周期中の細胞又は核の移動を連続的に追跡することを可能にするので、両方の構築物の共発現は、実質的に相当により有用である。この点では、２つの構成物の化学量論をコントロールする、信頼できる遺伝子導入技術は必要である。

さらに、（１）ｍＫＯ２とｍＡＧの組み合わせとは異なる進化したＦｕｃｃｉの作製を目指し（図８、９）、（２）Ｇ₁／Ｓ移行とは異なるフェーズの可視化を可能とするプローブの開発を目指し、及び（３）哺乳類以外の個体で機能するＦｕｃｃｉ誘導体を開発することを含む。そのような研究は、細胞周期進行及びユビキチン媒介型タンパク質分解の両方の基礎となる分子メカニズムの調査が有益である。上記について、Cdt1とGemininの一次構造が種によって変わることは注目されるべきである。ｍＫＯ２又はｍＡＧをこれらの２つのタンパク質のより低い真核生物の相同性のある領域に札付けすることによって、魚と昆虫の細胞の中で機能するＦｕｃｃｉの派生体を開発した。さらに、原腸胚形成や変成などの主な形態形成イベント中、及び陥入、退縮及び分岐などの基礎的な形態形成プロセス中に細胞周期進行の空間及び時間制御を調査するために哺乳類以外のＦｕｃｃｉを発現するトランスジェニックのゼブラフィッシュ及びショウジョウバエ系統を生成した。

実施例７：Ｆｕｃｃｉプローブを用いた抗がん剤のスクリーニング
Ｆｕｃｃｉを恒常的に発現する良性腫瘍細胞（ＮＭｕＭＧ細胞）および、Ｆｕｃｃｉを恒常的に発現する悪性腫瘍細胞（ＨｅＬａ細胞）を用い、抗がん剤などに対する反応を観察した（図１０）。コントロールとしたＤＭＳＯ処理の細胞からのデータは、赤色と緑色が混在し、通常の増殖を示した。CDK4 inhibitor(G1期阻害剤)は、良性腫瘍細胞のNMuMG細胞には十分に作用するが、悪性腫瘍細胞のHeLa細胞には効果がなかった。etoposide(topoisomerase 2 の阻害剤)は、悪性腫瘍細胞には十分作用し、S/G2 期での細胞周期停止が起きるが、NMuMG細胞では効果が強く、apotosisが誘導された。Nocodazole(M期阻害剤)は、いずれの細胞もＭ期で丸くなった状態で停止した。

（材料供給元）
mKO2-Cdt1#10およびmAG-Geminin#2などのDNA構築物、それらの安定した形質転換体細胞系統、およびこの明細書中で記載されたトランスジェニックマウス系統は、ＭＢＬインターナショナル(Amalgaam) (http://www.mblintl.com/mbli/index.asp).からのmKO2又はmAGに対するcDNAの付随購入で供給されうる。

図１は、mKOとmKO2の蛍光輝度を比較した結果を示す。図２は、Ｆｕｃｃｉを恒常的に発現するＨｅＬａ細胞のイメージング画像で、細胞周期進行に対応した核の蛍光パターンを示す。図３は、Ｆｕｃｃｉプローブのメカニズム及び性能評価実験について示す。図４は、Ｆｕｃｃｉを恒常的に発現する細胞の行動変化及び、細胞周期力学のモニタリング結果を示す。図５は、生マウス中の腫瘍細胞の細胞周期進行をＦｕｃｃｉプローブでモニタリングした結果を示す。図６は、Ｆｕｃｃｉトランスジェニックマウスにおける神経組織発生の細胞周期分析結果を示す。図７は、Ｆｕｃｃｉトランスジェニックマウス胎児期Ｅ１３におけるマウスの脳原基のスライスを用いたタイムラプスイメージング実験結果を示す。図８は、次世代Ｆｕｃｃｉを恒常的に発現するＰＣ１２細胞のイメージング画像を示す。（mCherry-Cdt1#10 及び mVenus-Geminin#2) 図９は、次世代Ｆｕｃｃｉを恒常的に発現するHeLa細胞のイメージング画像を示す。（mCherry-Cdt1#10 及び mCGFP-Geminin#2）図１０は、Ｆｕｃｃｉプローブを用いた抗がん剤のスクリーニング結果を示す。

Claims

細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する少なくとも１以上の遺伝子発現産物をマーカーにより可視化して、前記マーカーを検出することによって細胞周期の増殖期と休止期とを識別することを特徴とする、細胞周期の検出方法。
細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する少なくとも１以上の遺伝子発現産物として、細胞周期依存的な存在量の変化が異なるパターンを示す少なくとも２以上の遺伝子発現産物を使用する、請求項１に記載の方法。
細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する少なくとも１以上の遺伝子発現産物として、Ｇ１期と、Ｓ／Ｇ２／Ｍ期において存在量が変化する発現産物を使用する、請求項１又は２に記載の方法。
細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する少なくとも１以上の遺伝子発現産物として、Ｇ１期で存在量が増加し、Ｓ／Ｇ２／Ｍ期で存在量が減少する第一の発現産物と、Ｇ１期で存在量が減少し、Ｓ／Ｇ２／Ｍ期で存在量が増加する第二の発現産物とを使用し、上記第一の発現産物と第二の発現産物とをそれぞれ異なるマーカーで標識して可視化する、請求項１から３の何れかに記載の方法。
第一の発現産物がCdt1又はその部分断片であり、第二の発現産物がGeminin又はその部分断片である、請求項４に記載の方法。
第一の発現産物が、Cdt1からGeminin結合部位を除いた部分断片である、請求項５に記載の方法。
第一の発現産物が、Cdt1の３０から１２０番目のアミノ酸からなる部分断片である、請求項５又は６に記載の方法。
第二の発現産物が、GemininからCdt1結合部位を除いた部分断片である、請求項５から７の何れかに記載の方法。
第二の発現産物が、Gemininの１から１１０番目のアミノ酸からなる部分断片である、請求項５から８の何れかに記載の方法。
マーカーが蛍光タンパク質又は発光タンパク質である、請求項１から９の何れかに記載の方法。
細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する発現産物の遺伝子又はその部分断片と、マーカーをコードする遺伝子とを含む、遺伝子構築物。
細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する発現産物の遺伝子が、Cdt1遺伝子又はGeminin遺伝子である、請求項１１に記載の遺伝子構築物。
細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する発現産物の遺伝子の部分断片が、Cdt1からGeminin結合部位を除いた部分断片をコードする遺伝子、又はGemininからCdt1結合部位を除いた部分断片をコードする遺伝子である、請求項１１又は１２に記載の遺伝子構築物。
細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する発現産物の遺伝子の部分断片が、Cdt1の３０から１２０番目のアミノ酸からなる部分断片をコードする遺伝子断片、又はGemininの１から１１０番目のアミノ酸からなる部分断片をコードする遺伝子断片である、請求項１３に記載の遺伝子構築物。
マーカーをコードする遺伝子が、蛍光タンパク質又は発光タンパク質をコードする遺伝子である、請求項１１から１４の何れかに記載の遺伝子構築物。
請求項１１から１５の何れかに記載の遺伝子構築物を有する、形質転換体。
請求項１１から１５の何れかに記載の遺伝子構築物を有する、遺伝子導入非ヒト動物。
請求項１１から１５の何れかに記載の遺伝子構築物の少なくとも１種類以上を細胞に導入し、細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する発現産物の遺伝子又はその部分断片とマーカーとを発現させ、前記マーカーを検出することによって細胞周期の増殖期と休止期とを識別することを特徴とする、細胞周期の検出方法。
細胞周期阻害剤、又は細胞周期が関与する疾患用の薬剤の候補物質、あるいは特定の遺伝子発現を抑制する試薬の存在下において細胞を培養し、該細胞について請求項１から１０又は１８に記載の細胞周期の検出方法を行うことによって細胞周期および／又は細胞死に影響を及ぼす候補物質を選択することを特徴とする、細胞周期阻害剤、又は細胞周期が関与する疾患用の薬剤のスクリーニング方法あるいは化合物、薬剤、試薬の効能、作用機序について検定する方法。
細胞周期阻害剤、または細胞周期が関与する疾患用の薬剤の候補物質、あるいは特定の遺伝子発現を抑制する試薬を、請求項１７に記載の遺伝子導入非ヒト動物に投与し、それらの、腫瘍の増殖、免疫系、血球系などの細胞の細胞周期、生存などに影響を及ぼす候補物質を選択することを特徴とする、疾患治療薬のスクリーニング方法あるいは化合物、薬剤、試薬の効能、作用機序について検定する方法。