WO2002014372A1

WO2002014372A1 - Proteine de surveillance d'activite pour proteine de faible poids moleculaire se liant a la guanosine triphosphate (gtp)

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Publication number: WO2002014372A1
Application number: PCT/JP2001/004421
Authority: WO
Inventors: Michiyuki Matsuda
Original assignee: Michiyuki Matsuda
Priority date: 2000-08-14
Filing date: 2001-05-25
Publication date: 2002-02-21
Also published as: JP3842729B2; AU2001260625A1; JPWO2002014373A1

Description

明細書低分子量 GTP結合タンパク質の活性モニタータンパク質技術分野

本発明は、低分子量 GTP結合タンパク質の活性モニタ一タンパク質、該タンパク質をコ一ドする遺伝子、該遺伝子を含む発現べクタ一、該発現べクタ一を保持する形質転換された細胞およびトランスジヱニック動物、前記タンパク質を用レ、る低分子量 G T P結合タンパク質の活性化を測定する方法、ならびに低分子量 GTP結合タンパク質の活性調節物質のスクリーニング方法に関する。背景技術

細胞内情報伝達分子には非常に多くの種類が知られており、低分子量 GTP結合タンパク質（以下、 GTP結合ダンパク質という場合がある）はその中でも種類が多いこと、重要な分子スィツチとして働いていることから非常に詳しく解析されてきている。低分子量 GTP結合タンパク質群は R a sファミリー、 Rho ファミリ一、 Rabファミリー、 Ranフアミリーなどからなる（文献 1 ) 。これらの低分子量 GTP結合タンパク質は、細^増殖、細胞骨格、細胞内輸送、核輸送など細胞内での多様な情報伝達を制御する重要な分子スィツチである。低分子量 GTP結合タンパク質は、 GDPに結合している不活性化型と G T Pに結合している活性化型との間をサイクルしている（第 1図）。 GTP結合型はそれぞれの GTP結合タンパク質に特異的な標的タンパク質に結合し、該標的タンパク質を活性化する。 GDP結合型を GTP結合型にする反応を触媒するタンパク質はグァニンヌクレオチド交換因子であり、 G T P結合型を G D P結合型に戻す反応を触媒するタンパク質は GTP水解促進酵素（ G T Pァ一ゼ活性化因子）である。該 GTP水解促進酵素は、結合した G TPの加水分解を促進し、無機リン酸を遊離させて GDPを生じさせるように働く。

最近、多くの低分子量 GTP結合タンパク質およびその活性化因子と不活性化因子が単離されるにおよび、これら低分子量 G T P結合タンパク質が細胞内および個体内でどのような機能的差異があるのかに注目が集まっている。その機能的差異を明らかにするためには、細胞内および個体内での低分子量 G TP結合タンパク質の活性化状態をモニターする必要がある。

細胞内での低分子量 G T P結合タンパク質の活性化の程度を調べるには、細胞内での低分子量 G T P結合タンパク質の G T P結合型と G D P結合型の量比を知る必要がある。現在、細胞内での低分子量 GTP結合タンパク質の GTP結合型, と GDP結合型の量比を調べる方法としては次の二つがよく用いられている。

(1) ラジオアイソトープ³² P iによる標識を利用する方法：細胞を³² P iで標識したのち低分子量 GTP結合タンパク質を精製し、結合している GTPおよび GDPを薄層クロマトグラフィーにて分離し定量する（文献 2)。

( 2 ) プルダウン法：低分子量 GTP結合夕ンパク質に結合する標的タンパク質を固層に結合させておき、可溶化した細胞抽出液と混合する。 GTP結合型のものは標的タンパク質に高いァフィ二ティーで結合するので、 GTP結合型のみを選択的に回収することができる。これを、 SDS— PAGEゲルにて分離した後に、ィムノブロッテイングにて定量する（文献 3)。しかしながら、いずれの方法も細胞を一旦可溶化する必要があり、生細胞で直接、低分子量 GTP結合夕ンパク質の活性化を調べる方法はこれまでなかつた。

細胞内には、細胞膜、細胞質以外にも多くの細胞内小器官が存在するだけでなく、細胞質の中でも異なる場所では異なる生化学的現象が起きていることが近年明らかにされている。また、個体レベルでも低分子量 GTP結合タンパク質が高次神経機能や器官形成に非常に重要であるということがわかっている。したがつて、低分子量 GTP結合夕ンパク質の活性化状態を細胞内あるいは個体内で非侵襲的に知ることは、生命現象の理解のみならず、薬剤開発などにおいても必須である。しかし、これまでの生化学的方法では細胞を可溶化してしまうため、細胞内のどの場所で低分子量 G T P結合タンパク質が活性化されているのか、また、どの細胞で低分子量 GT P結合タンパク質が活性化されているのかを知ることはできなかった。

一方、生細胞においてタンパク質を可視化する技術としては GFP (green fl uorescent protein ) を用いる方法が知られている（文献 4)。 GFPは発光クラゲなどより単離されるタンパク質群で、主に緑色の蛍光を発するタンパク質である。現在、細胞内でのタンパク質の局在を調べるのに広く用いられている。 G FPとしては CFP (cyan-emitting mutant of GFP)、 YFP (yellow-emitt ing mutant of GFP)などがあり、また、それらを改良したタンパク質として E GFP (enhanced green fluorescent protein)、 ECFP (enhanced CFP)、 E YFP (enhanced YFP)、 EBFP (enhanced blue-emitting mutant of GFP ) など（本明細書において、これらをまとめて GFP関連タンパク質という）がある。これらは、それぞれ異なる波長の光で励起され、異なる波長の蛍光を放出する。

さらに GF Pを応用した技術として FRET (fluorescent resonance energy transfer ) を用いるものがある（文献 5)。 F R E Tとは以下の現象を指す。蛍光物質 Aおよび Bという物質がそれぞれ； laexおよび； Ibexで励起され、 iae mおよび； Ibemの光をそれぞれ発光するとする。この時、 Aおよび Bがごく近傍に存在し、 Aaemが ; bexに充分に近い時、 Aおよび Bの混合物に Aaexの光を照射すると、物質 Aのエネルギーが Bに吸収され； Ibemの発光が観察される。これを FRETという。この方法を利用して、 2分子間の距離を推定することもできる。この時、蛍光物質 Aをドナ一、蛍光物質 Bをァクセプ夕一という。

さらにこの技術の応用として、二つの蛍光物質を一^ 3の夕ンパク質内に標識することにより、タンパク質の構造変化を検出することが可能である。 EBFPおよび EGFP、 ECFPおよび EYFPの 2セットの G F P関連タンパク質は、至適な F R E Tのためのドナーとァクセプ夕一の組み合わせを作ることが知られている。たとえば、 EBFPと EGFPとの二つのタンパク質とカルシウム結合タンパク質カルモジュリンとの融合タンパク質で、この FRET技術を応用してカルシウムの濃度を測りうることが知られている（文献 6) 。しかしながら、 G F Pタンパク質と F R ET技術とを応用した 1分子モニタ一による測定法は、前記カルシウム測定ならびにサイクリック AMP依存性リ酸化酵素の活性測定以外には、現時点では成功していない。発明の開示

本発明は、非侵襲的な低分子量 G TP結合タンパク質の活性化の測定を可能にする低分子量 GTP結合タンパク質の活性モニタ一タンパク質；該タンパク質をコードする遺伝子；該遺伝子を含む発現ベクター；前記タンパク質を発現し、非侵襲的な低分子量 GTP結合タンパク質の活性化の測定に有用な前記発現べクタ ―を保持する形質転換された細胞およびトランスジニック動物；前記タンパク質を用いる低分子量 G T P結合タンパク質の活性化を測定する方法、より詳しくは生細胞においても使用可能な、低分子量 GTP結合タンパク質の GTP結合型と GDP結合型の量比を測定する方法；ならびに低分子量 GTP結合タンパク質の活性調節物質のスクリ一ニング方法を提供することを目的とする。

すなわち、本発明の要旨は、

〔1〕低分子量 GTP結合タンパク質の全部または一部、該低分子量 GTP結合タンパク質の標的タンパク質の全部または一部、 GFPァクセプ夕一タンパク質の全部または一部、及び GFPドナ一タンパク質の全部または一部が、各タンパク質の機能を発揮し得る状態で直接または間接的に連結されてなる融合タンパク質からなる低分子量 GTP結合タンパク質の活性モニタータンパク質、

〔2〕前記〔1〕記載の低分子量 GTP結合タンパク質の活性モニタ一タンパク質をコードする遺伝子、〔 3〕前記〔 2〕記載の遺伝子を含む発現べクタ一、

〔4〕前記〔3〕記載の発現ベクターを保持してなる形質転換された細胞、

〔5〕前記〔3〕記載の発現ベクターを保持してなるトランスジエニック動物

〔6〕前記〔1〕記載の低分子量 GTP結合タンパク質の活性モニタータンパク質における F R E Tを検出する工程を含む低分子量 GT P結合夕ンパク質の活性化を測定する方法、

〔7〕前記〔4〕記載の細胞または前記〔5〕記載のトランスジエニック動物における F R E Tを検出する工程を含む低分子量 G T P結合夕ンパク質の活性化を測定する方法、ならびに

〔8〕（a)前記〔4〕記載の細胞と被検物質とを接触させる工程、および

( b ) 低分子量 G T P結合タンパク質の活性の変化を検出する工程、

を含む、低分子量 GTP結合タンパク質の活性調節物質のスクリーニング方法、に関する。図面の簡単な説明

第 1図は、低分子量 GTP結合タンパク質の活性制御機構を示す。本図では、低分子量 GTP結合タンパク質として R a sを例にとり、低分子量 GTP結合夕ンパク質の活性制御機構を模式的に示してある。低分子量 GTP結合タンパク質は G D Pに結合していると不活性化型であり、ここにグァニンヌクレオチド交換因子（GEF)が作用すると GDPが GTPに置換され、活性化型となる。活性化された G T P結合夕ンパク質は構造変化を起こし、その特異的な標的夕ンパク質と結合し、それを活性化できるようになる。活性化型の低分子量 G TP結合夕ンパク質は G TP水解促進酵素（GAP)存在下に GTPが GDPに水解され、無機リン酸（P i)を遊離し、もとの不活性化型に戻る。

第 2図は、 F R E Tを利用した低分子量 GT P結合夕ンパク質の活性化測定法の原理を示す。この図では低分子量 GTP結合タンパク質として Ra sを、標的タンパク質として Ra fを例にとっている。 GFPドナ一タンパク質として例示する CF P(cyan-emitting mutant of GFP) は 433 nmの光で励起され、 47 5 nmを極大とする光を放射する。一方、 GFPァクセプタータンパク質として例示する YF P (yellow-emitting mutant of GFP) は 505 nmの光で励起され 530 nmを極大とする光を放射する。なお、本発明においては、 GFPァクセプタ一タンパク質およびまたは GFPドナータンパク質として、これらを用いることもできる。第 2図中の下図に示すように、 Ra sの活性化前には、モニタ —タンパク質において、ァミノ末端側に存在する YFPとカルボキシル末端側に存在する C F Pとが離れているので C F Pから YF Pへのエネルギーの移行はあまり起きない。ところが、何らかの刺激を受けて〔たとえば、上皮細胞増殖因子 (EGF)の添加〕 Ra sが活性化型になると、標的タンパク質 R a fの R a s 結合領域（RBD) に結合するので、 YFPと CFPが近傍に来て、その結果、 CFPから YFPへのエネルギーの移行、それに伴う YFPからの 530 nmの蛍光が観察されるようになる。従って、刺激前後（すなわち、 Ra sの活性化前後）における FRET効率を測定することにより、 Ra sの活性化を測定することができる。

第 3図は、プラスミド pRa f r a s 1722の構造を示す。発現べクタ一はすでに報告されている PCAGGSを用いた。図中の CAGプロ乇一夕一の下流に EYFP_Ra s— Ra f RBD (Ra s結合領域）一 ECFPの順となる融合夕ンパク質をコ一ドする c DNAを結合した。

第 4図は、プラスミド pRa f r a s 1722の翻訳領域の塩基配列および予測されるアミノ酸配列を示す。

第 5図は、プラスミド pRa f r a s 1722の翻訳領域の塩基配列および予測されるアミノ酸配列（つづき）を示す。

第 6図は、プラスミド pRa f r a s 1722の翻訳領域の塩基配列および予測されるアミノ酸配列（つづき）を示す。

第 7図は、発現夕ンパク質 R a f r a s 1722の蛍光プロフィールを示す。 HEK 293丁細胞に 1¾& f r a s 1 722とグァニンヌクレオチド交換因子 So s発現べクタ一（pCAGGS— mSo s) あるいは GT P水解促進酵素 G a p 1 m発現ベクター（pEF— Bo s— Gap lm) をリン酸カルシウム法にてトランスフクトし、 48時間培養後に細胞を可溶化し、遠心分離後、上清を得た。該上清について励起波長 433 nmにて、波長 450ηπ！〜 550nmにおける蛍光強度を蛍光分光光度計にて測定した。第 7図に示すグラフの右囲みにおける S 0 sは pRa i r a s l 722と pCAGGS— mS o sを共にトランスフェクトした場合における R a f r a s 1722の蛍光プロフィールであることを、 Gap lmは pRa f r a s 1722と pEF— Bo s— Gap 1 mを共にトランスフエクトした場合における Ra f r a s 1722の蛍光プロフィールであることを示す。

第 8図は、発現タンパク質 R a f r a s 1722の GTP結合タンパク質上の GTPと GDPの比〔GTPZ (GDP + GTP) (%) 〕に対する励起波長 4 33 nmでの波長 475 nmと波長 530 nmの蛍光強度比（波長 530/47 5) を示す。 HEK 293 T細胞に pRa f r a s 1722と様々な量のグァニンヌクレオチド交換因子 So s発現べクタ一（pCAGGS— mSo s) あるいは GTP水解促進酵素 Gap lm発現べクタ一（pEF_Bo s— Gap 1 m) をトランスフエクトした。 48時間培養後に³² P i標識し、 Ra f r a s 1 72 2を抗 GFP抗体で免疫沈降した後に、 Ra f r a s 1 722に結合している G TPおよび GDPを薄層クロマトグラフィーで分離、定量した。一方、同様に処理した細胞可溶化液について蛍光プロフィールを測定し、励起波長 433 nmでの波長 475 nmと波長 530 nmの蛍光強度比を測定した。 Ra f r a s 1 7 22上の GTPの量に依存して蛍光強度比が増強されることが分かる。

第 9図は、発現タンパク質 R a f r a s 1722を発現する細胞株が得られたことを示す。 N I H3T3細胞に pRa f r a s 1722をトランスフエクトし、細胞株 3T3—Ra f r a sを樹立した。細胞を可溶化し、抗 GFP抗体を用いてィムノブロッティングにて R a f r a s 1722の発現について解析した。第 9図に示すィムノブロッテイングの左には分子量マ一力一を示す。

第 10図は、 3T3—Ra f r a s細胞を用いた R a s活性化の解析を示す。 3T3-Ra f r a s細胞を EGF (1 zg/ml)で刺激し、その前後で 43

3 nmの波長で励起した蛍光プロフィール（波長 450 ηπ！〜 550 nm)を測疋し。

第 1 1図は、プラスミド pRa i— c hu 31 1の構造を示す。バックボーンとなるベクターの構造は第 3図と同一である。

第 12図は、プラスミド pRa i— chu 31 1の翻訳領域における塩基配列および予測されるァミノ酸配列を示す。

第 13図は、プラスミ FpRa i— chu31 1の翻訳領域における塩基配列および予測されるアミノ酸配列（つづき）を示す。

第 14図は、プラスミド pRa i— chu 31 1の翻訳領域における塩基配列および予測されるァミノ酸配列（つづき）を示す。

第 15図は、発現タンパク質 R a i— chu 31 1の蛍光プロフィールを示す。 HEK 293 T細胞に pRa i - c hu 31 1とグァニンヌクレオチド交換因子 C3G発現べクタ一（pCAGGS— C3G；文献 9に記載）あるいは GTP 水解促進酵素 r ap 1 GAP I I発現べクタ一（pCAGGS— r ap l GAP I I ；文献 9に記載）とをリン酸カルシウム法にてトランスフヱクトし、 48時間培養後に細胞を可溶化し、遠心分離後、上清を得た。該上清について励起波長

433 nmにて、波長 450 nm〜 550 nmにおける蛍光強度を蛍光分光光度計にて測定した。第 15図に示すグラフの右囲みにおける C 3 Gは pR a i— c hu 31 1と pCAGGS— C3Gを共にトランスフエクトした場合における R a i - c h u 31 1の蛍光プロフィールであることを、 r ap l GAP I Iは p Ra i - c hu 31 1と pCAGGS— r ap l GAP I Iを共にトランスフエクトした場合における R a i - c hu 31 1の蛍光プロフィールであることを示す。

第 16図は、プラスミド pRa i— chu 158の構造を示す。バックボーンとなるベクタ一の構造は第 3図と同一である。

第 17図は、プラスミド pRa i— chu 158の翻訳領域における塩基配列および予測されるァミノ酸配列を示す。

第 18図は、プラスミド pRa i— c hu 158の翻訳領域における塩基配列および予測されるアミノ酸配列（つづき）を示す。

第 19図は、プラスミド pRa i _chu 158の翻訳領域における塩基配列および予測されるアミノ酸配列（つづき）を示す。

第 20図は、発現タンパク質 R a i— chu 158の蛍光プロフィールを示す HEK 293 T細胞に pRa i— chu 158とグァニンヌクレオチド交換因子 Ca l DAG— GEF I I I発現べクタ一（pCAGGS— Ca l DAG— G EF I I I ；文献 10に記載）あるいは GTP水解促進酵素 Gap lm発現べク夕一（pEF— Bos— Gap lm)をリン酸カルシウム法にてトランスフエクトし、 48時間培養後に細胞を可溶化し、遠心分離後、上清を得た。該上清について励起波長 433 nmにて、波長 450 nm〜 550 nmにおける蛍光強度を蛍光分光光度計にて測定した。第 20図に示すグラフの右囲みにおける Gap 1 mは pRa i - c hu 158と pEF— Bo s— Gap lmを共にトランスフエクトした場合における Ra i -chu 158の蛍光プロフィールであることを、 Ca 1 DAG-GEF I I Iは pRa i— chu l 58と pCAGGS— Ca l DAG-GEF I I Iを共にトランスフエクトした場合における R a i— chu 158の蛍光プロフィールであることを示す。

第 21図は、プラスミド pRa i— c hu 1 19の翻訳領域における塩基配列および予測されるァミノ酸配列を示す。第 22図は、プラスミド pRa i— c hu 1 19の翻訳領域における塩基配列および予測されるアミノ酸配列（つづき）を示す。

第 23図は、プラスミド pRa i— c hu 1 19の翻訳領域における塩基配列および予測されるアミノ酸配列（つづき）を示す。

第 24図は、発現タンパク質 R a i— c hu 1 19の蛍光プロフィールを示す HEK 293丁細胞に 1¾& i - c hu 1 19または pRa f r a s 1722 とグァニンヌクレオチド交換因子 So s発現ベクター（pCAGGS— mSo s ) とをリン酸カルシウム法にてトランスフエクトし、 24時間培養後に 33でおよび 40°Cに移し、さらに 24時間培養を加えた後、細胞を可溶化し、遠心分離して上清を得た。該上清について励起波長 433 nmにて、波長 450 nm〜5 50 nmにおける蛍光強度を蛍光分光光度計にて測定した。第 21図に示すグラフの右囲みにおける対照は pR a f r a s 1722と p CAGGS— mS o sを共にトランスフヱクトした場合における Ra i -chu 1 19の蛍光プロフィ一ルであることを、変異ありは pR a i - c hu 1 1 9と pCAGGS— mSo s を共にトランスフエクトした場合における Ra i -chu 1 19の蛍光プロフィ —ルであることを示す。 Ra i— c hu 1 19では野生型（Ra f r a s 172 2) より、グァニンヌクレオチド交換因子に対する反応性が増加していた。

第 25図は、上皮細胞増殖因子（EGF)添加による細胞内における ECFP および EYF Pの蛍光強度の経時的変化の結果を示す。実施例 1に記載の蛍光顕微鏡システムを用いて、波長 430 nmの励起光を照射して蛍光波長 475 nm および 530 nmでの画像を経時的に取得し、当該画像から E C F Pおよび E Y FPの蛍光強度を求めた。

第 26図は、種々のグァニンヌクレオチド交換因子および GTP水解促進酵素による発現タンパク質 Rafrasl722における ECFPと EYFPの蛍光強度比の変化を示すグラフである。 HEK293T細胞に pRafrasl722とグァニンヌクレオチド交換因子発現ベクタ一あるいは GTP水解促進酵素発現べクタ一とをリン酸カルシウム法にてトランスフエクトし、 2 4時間以上培養後に細胞を可溶化し、遠心分離して上清を得た。該上清について励起波長 4 3 3 n mにて、波長 4 7 5 n mおよび 5 3 0 n mにおける蛍光強度を蛍光分光光度計にて測定した。後者の前者に対する比（蛍光強度比）をグラフに示してある。

第 2 7図は、種々のグァニンヌクレオチド交換因子および GTP水解促進酵素による発現タンパク質 Rai- chu404における ECFPと EYFPの蛍光強度比の変化を示すグラフである。 HEK293T細胞に p Rai-chu404とグァニンヌクレオチド交換因子発現ベクターあるいは GTP水解促進酵素発現ベクターとをリン酸カルシウム法にてトランスフクトし、 2 4時間以上培養後に細胞を可溶化し、遠心分離して上清を得た。該上清について励起波長 4 3 3 n mにて、波長 4 7 5 n mおよび 5 3 0 η mにおける蛍光強度を蛍光分光光度計にて測定した。後者の前者に対する比（蛍光強度比）をグラフに示してある。

第 2 8図は、 EGF添加による pRai-chulOIXまたは pRai- chu404Xをトランスフエクトした C0S1細胞内における EYFPの ECFPに対する蛍光強度比の経時的変化ならびに、細胞内分布を示す写真である。 C0S1細胞に pRai-chulOIXあるいは pRai-chu40 4Xをトランスフヱクトし、 2 4時間以上培養後に、培地をフエノールレッドおよび血清を含まない培地に交換した。ついで、キセノン光源を有する倒立型蛍光顕微鏡（Carl Zeiss, Axiovert 100) に回転式蛍光励起フィルタ一および回転式蛍光発光フィルター装置（LUDL electronic社）を備え、高感度冷却 CCD カメラ（P hotometrix社、 Micromax450)を備え、日本ローパー社製 Metamorph画像解析ソフトにて制御ならびに解析できるシステムを用いて画像を取得した。細胞に 430 nm の励起光を照射し、 475 醒の ECFPドナーの蛍光波長での画像を CCD カメラにより撮影し、ついで、 530 腹の BYFPァクセプターの蛍光波長での画像を撮影した。これを 3 0秒間隔で行った。データ取得後、デジタル画像上の各ピクセルについて、 EYFPZECFPの蛍光強度比を 8段階に分け、青から赤までの色を割り当てた。一方、 ECFPの蛍光強度を明度として割り当てることによりビデオ画像が作成できる。本図ではこのうちの図に示す時間の画像を示してある。 Rai-chulOIX発現細胞に EGFを添加すると、 FRET効率を反映する蛍光強度比が細胞の辺縁部から徐々に中央部に向かって上昇していく過程が見える。一方、 Rai-chu 4 0 4 X を発現する細胞においては、中央部から辺縁部に向かって活性が上昇するのがわかる。このように、本発明の活性モニタ一タンパク質は、 Ras ファミリー G タンパク質の活性化に関する時間情報と、細胞内の空間情報の双方を同時に得ることを可能とする。

第 2 9図は、 EGF添加による pRai-chulOIXをトランスフヱクトしたサブコンフルェントな状態の C0S1細胞内における EYFPの ECFPに対する蛍光強度比の経時的変化ならびに、細胞内分布を示す写真である。サブコンフルェントな状態の C0S1細胞を用いた以外は第 2 8図の説明に記載したのと同様の方法により実験を行った。 Rai-chulOIX発現細胞に EGF を添加すると、 FRET効率を反映する蛍光強度比が他の細胞には接着していない辺縁部から上昇していく過程が見える。一方、隣の細胞と接着している部位ではこの FRET効率の上昇が抑制されているのがわかる。第 3 0図は、神経成長因子添加による pRai-chulOIXまたは pRai-chu404Xをトランスフクトした PC 1 2細胞内における EYFPの ECFPに対する蛍光強度比の経時的変化ならびに、細胞内分布を示す写真である。 PC 1 2細胞に pRai-chulOIXあるいは pRai-chu404Xをトランスフヱクトし、 2 4時間以上培養後に、培地をフエノ一ルレッドおよび血清を含まない培地に交換し、さらに神経成長因子を加え、第 2 8図の説明に記載したのと同様の方法により観察した。本図ではこの連続する画像のうち、図に示す時間の画像のみを示してある。 Rai-chulOIX発現細胞に神経成長因子を添加すると、 FRET効率を反映する蛍光強度比が細胞の辺縁部から徐々に中央部に向かって上昇していく過程が見える。そして、神経様突起の進展が明らかな 1 8 0分以後においては、 FRET効率の上昇はこの神経様突起に主に限局していることがわかる。一方、 Rai-chu 4 0 4 X を発現する細胞においては、逆に中央部から辺縁部に向かつて活性が上昇し、分化した神経様突起ではこの FRET効率が抑制されているのがわかる。このことは、分化誘導の過程において Ras が細胞辺縁部より、 Raplが細胞の中心部より活性化され、分化が完成した後は、 Ras は神経様突起において高い活性が持続していることを示している。このことは、 Ras フアミリー G タンパク質が細胞内の異なる部位では異なる活性化状態にあることを明らかにするもので、本発明の活性モニタ一タンパク質群が Ras ファミリ — G タンパク質活性化に関する時間的、空間的情報を得るのに至適な分子プロ一ブであることを示すものである。発明を実施するための最良の形態

本発明の低分子量 GT P結合タンパク質の活性モニタータンパク質（以下、モ二タータンパク質という）は、 G T P結合型の低分子量 GT P結合タンパク質が特異的にその標的タンパク質のみに結合するという性質を利用したものであり、非侵襲的な低分子量 GT P結合夕ンパク質の活性化の測定に非常に有用な夕ンパク質である。本発明のモニタータンパク質は、低分子量 G T P結合タンパク質、該低分子量 G T P結合夕ンパク質の標的タンパク質、 G F Pァクセプタ一タンパク質、および G F Pドナ一タンパク質からなる融合タンパク質であり、各タンパク質が適切に、すなわち個々に本来のコンフォメーションを形成して各夕ンパク質が有する機能を完全な程度に発揮し得るような状態で、前記各夕ンパク質が直接または間接的に連結されてなる。従って、かかる融合タンパク質のアミノ酸配列は、前記各タンパク質のァミノ酸配列部分が直接または間接的に連結されてなる構造を有する。なお、本発明のモニタータンパク質を構成する各タンパク質は、当該タンパク質が有する機能を完全な程度に発揮し得るようであれば当該タンパク質の一部であってもよい。

本明細書においては、モニタータンパク質内に含まれる各タンパク質をいう場合、例えば、標的タンパク質を例にあげると、標的タンパク質そのものと区別し、標的タンパク質部分というべきところ、かかる区別なく、簡易に標的タンパク質と表現する。

本発明のモニタータンパク質では、低分子量 GTP結合タンパク質の GTPとの結合による活性化（GDP結合型の、グァニンヌクレオチド交換因子による G T P結合型への変換による低分子量 G T P結合タンパク質の活性化を含む）に伴いモニタータンパク質内で低分子量 GT P結合タンパク質とその標的タンパク質とが結合し、その結果、 GFPドナータンパク質から GFPァクセプタ一タンパク質への FRET効率に変化が生ずることになる。第 2図に、本発明のモニタ一タンパク質の一例を模式的に示し、該モニタータンパク質を用いる、 FRETを利用した低分子量 G T P結合タンパク質の活性化を測定する方法の原理を示す。なお、本明細書において FRET効率とは、 GFPドナータンパク質に対する励起光を本発明のモニタ一夕ンパク質に照射した場合の、 GF Pドナ一タンパク質の蛍光波長における蛍光強度と G F Pァクセプ夕一タンパク質の蛍光波長における蛍光強度との比（蛍光強度比）をいう。詳しくは後述する。

FRETを実現するためには、 i) GFPドナーの発光スペクトラムと GFP ァクセプ夕一の吸光スペクトラムとの重なり、 ii) ドナーとァクセプタ一間の距離、 iii) ドナーの発光モーメントとァクセプ夕一の吸光モーメントの配向の 3 因子を考慮しなければならない。また、 GFPを他のタンパク質と融合する場合、他のタンパク質と融合することがストレスとなって GFPのミスフォールディングが生じ、その結果、発色団形成の効率が低下し、無蛍光の GFPとなる可能性をも考慮しなければならない。このように、 GFPドナーと GFPァクセプ夕一を利用して両者間に FRETの良好な発現を生じさせるには厳格な条件が存在し、未だ両者間の配置等に一定の規則も見出されておらず、 FRETの実現は一般に困難である。すなわち、 FRETの実現は公知の技術常識に基づき容易になし得るものではなく、期待し得る程度を超える試行錯誤や複雑高度の実験等を要するものである。本発明のモニタ一タンパク質は、前記タンパク質を、本発明の所望の効果が得られ得るように適切に組み合わせたものであり、 G T P結合型の低分子量 GT P結合タンパク質が特異的にその標的夕ンパク質のみに結合するという性質を利用し、 G T Pの低分子量 G T P結合夕ンパク質への結合に応じて変化し得る GFPドナ一タンパク質と GFPァクセプタータンパク質との間で生ずる F R E Tを実現させたもので、その技術的価値は非常に大きレ、。

本発明のモニタ一タンパク質における各構成タンパク質の結合の順序は、低分子量 GTP結合タンパク質の活性化前後における FRET効率の差（以下、単に FRET効率の差という）の増大を考慮して適宜選択され得る。低分子量 GTP 結合タンパク質の活性化前後における FRET効率の差が大きい程、当該タンパク質の活性化状態をより的確に捉えることができ、従って、低分子量 GTP結合夕ンパク質の活性化の測定精度を向上させることができるので好ましい。該モニ夕一タンパク質における低分子量 GTP結合タンパク質と該低分子量 GTP結合夕ンパク質の標的タンパク質との結合の好ましい態様としては、ァミノ末端側に存在する低分子量 GTP結合タンパク質の標的タンパク質結合部位のカルボキシル末端が、カルボキシル末端側に存在する標的夕ンパク質のァミノ末端に直接または間接的に結合される態様（1)、ァミノ末端側に存在する標的タンパク質のカルボキシル末端が、カルボキシル末端側に存在する低分子量 GTP結合タンパク質の標的タンパク質結合部位のァミノ末端に直接または間接的に結合される態様（2)が挙げられ、態様（1)がより好ましい。 GFPァクセプタータンパク質および GFPドナータンパク質は各々、それらのァミノ末端またはカルボキシル末端が低分子量 GTP結合タンパク質と標的タンパク質とが連結されたもの（連結物）のァミノ末端またはカルボキシル末端に直接または間接的に連結されて連結される。中でも、前記連結物のアミノ末端に GFPァクセプタータンパク質のカルボキシル末端が、カルボキシル末端に GFPドナータンパク質のアミノ末端が直接または間接的に連結されてなるモニタータンパク質が好ましい。従って、本発明のモニタ一タンパク質としては、該モニタ一タンパク質において、アミノ末端側より、 GFPァクセプタータンパク質、低分子量 GTP結合タンパク質、該低分子量 GTP結合タンパク質の標的タンパク質、 GFPドナ一タンパク質となるようにそれぞれ直接または間接的に連結されてなるものが特に好ましい。なお、「間接的に連結」とは、各タンパク質間の連結を、たとえば、後述するスぺ一サ一としてのペプチド等を介して行う態様をいう。

本発明のモニタ一タンバク質の構成要素である低分子量 G T P結合夕ンパク質としては、当該夕ンパク質として知られるものであれば特に限定されるものではないが、有用性の観点から R a sスーパ一ファミリーに属するものが好ましく、中でも Ra sファミリーに属するものがより好ましい。より詳しくは、 H— Ra s、 K— Ra s、 N— Ra s、 R - Ra s、 Rap 1 A. Rap l B、 R a p 2 A、および R ap 2 Bからなる群より選ばれる 1種が好ましい。

一方、前記低分子量 GTP結合タンパク質の標的タンパク質は、前記例示するような各低分子量 G T P結合タンパク質が G T P結合型となった際に特異的に結合するものであれば特に限定されるものではない。有用性の観点から、好ましくは Ra f または Ra 1 GDSである。

さらに、前記低分子量 GT P結合夕ンパク質と前記標的夕ンパク質の組み合わせとしては、有用性ならびに特異性の観点から、低分子量 GTP結合タンパク質が H— Rasであり、標的タンパク質が R a fである組み合わせ、または低分子量 GTP結合タンパク質が Rap 1 Aであり、標的タンパク質が R a 1 GDSである組み合わせが特に好ましい。

また、 GFPァクセプタータンパク質としては前記例示した GFP関連タンパク質のいずれを使用することもできるが、機能的観点から、好ましくは EGFP または EYFPである。一方の GFPドナ一タンパク質も同様に前記例示した G FP関連タンパク質のいずれを使用することもできるが、機能的観点から、好ましくは ECFPまたは EBFPである。

前記した本発明のモニタ一タンパク質の構成要素それぞれの特に好ましい組み合わせとしては、有効性、特異性および感度の観点から、低分子量 GTP結合夕ンパク質が H— Ra sであり、標的タンパク質が R a fであり、 GFPドナ一夕ンパク質が EC FPであり、 GFPァクセプタ一タンパク質が EYFPであるか、または、低分子量 GTP結合タンパク質が Rap 1 Aであり、標的タンパク質が Ra l GDSであり、 GFPドナータンパク質が ECFPであり、 GFPァクセプ夕一タンパク質が EYFPである。

また、低分子量 GTP結合タンパク質、標的タンパク質、 GFPドナ一タンパク質、および GFPァクセプタ一タンパク質の結合の順序は、 FRET効率の差の増大の観点から、本発明のモニタータンパク質において、好ましくはァミノ末端側より EYFP— H- Ra s -Ra f — E C F Pまたは E Y F P— R a p 1 A — Ra 1 GDS— ECFPが挙げられる。また、これらにおいて E YF Pと E C FPとが互いに交換されてなるものも好適に使用できる。

低分子量 GT P結合夕ンパク質は、その標的夕ンパク質に結合することができれぱ該タンパク質の一部でもよく、必ずしも、その全部（全長）である必要はない。ここで、低分子量 GTP結合タンパク質の一部とは、たとえば、公知の方法に従って当該夕ンパク質分子を大腸菌で生産し、試験管内で GTPと結合せしめるという方法により、標的タンパク質との結合が検出され得るタンパク質部分をいう。なお、検出は、たとえば、標的タンパク質に対する抗体で免疫沈澱させ、 G T P結合タンパク質の一部が共沈するかをィムノブロッテイングで調べる方法により行うことができる。たとえば、 H— Ra sおよび Rap 1 Aであれば、好ましくは 1〜1 80位、より好ましくは 1〜172位に相当するアミノ酸配列部分からなるタンパク質部分を、 R— Ra sであれば、好ましくは 1〜204位、より好ましくは 28〜204位に相当するアミノ酸配列部分からなるタンパク質部分を挙げることができる。

一方、低分子量 GTP結合タンパク質の全部よりはむしろ、そのアミノ酸配列のァミノ末端あるいはカルボキシル末端を一部削ることでしばしば F R E T効率の差の増大が生ずる。それゆえ、当該タンパク質の一部としては、そのアミノ酸配列のァミノ末端領域およびまたはカルボキシル末端領域に、好ましくは少なくとも 1個、より好ましくは 1〜28個、さらに好ましくは 1 7〜28個のァミノ酸の欠損を有してなるものも含まれる。なお、かかる領域におけるアミノ酸の欠損部位には特に限定はない。たとえば、 H— Ra sの場合、 C末端を 1 72位まで削ったものが 1 80位まで削ったものより FRET効率の差を増大させた。すなわち、その了ミノ酸配列のカルボキシル末端領域において好ましくは少なくとも 1個、より好ましくは 9〜20個、さらに好ましくは 1 7個のアミノ酸の欠損を有してなるものが好ましい。また、 R— Ra sの場合、ァミノ末端から 28 個のアミノ酸を削つたものが削らないものよりも FRE T効率の差を増大させた。すなわち、そのアミノ酸配列のァミノ末端領域において好ましくは少なくとも 1個、より好ましくは 1〜28個、さらに好ましくは 28個のアミノ酸の欠損を有してなるものが好ましい。

なお、前記アミノ末端領域またはカルボキシル末端領域とは、低分子量 GTP 結合タンパク質のアミノ酸配列において、そのアミノ末端またはカルボキシル末端から、アミノ酸の個数で好ましくは 30個までの領域をいう。

また、標的タンパク質も、対応する低分子量 GTP結合タンパク質に結合することができれぱ該タンパク質の一部でもよく、必ずしも、その全部（全長）である必要はない。ここで、標的タンパク質の一部とは、前記低分子量 GTP結合夕ンパク質と同様の方法において、その対応する低分子量 GTP結合タンパク質との結合が検出され得るタンパク質部分をいう。たとえば、 Ra f (GenBank/EMBL ァクセッション番号： X03484) であれば、好ましくは Ra s結合領域（RBD) 、詳しくは、好ましくは 5 1〜204位、より好ましくは 5 1〜1 3 1位に相当するァミノ酸配列部分からなるタンパク質部分を、 Ra 1 GDS (GenBank/EMBL了クセッシヨン番号： U14417) であれば、好ましくは 202〜 309位、より好ましくは 2 1 1〜297位に相当するアミノ酸配列部分からなるタンパク質部分を挙げることができる。一方、 GFPドナータンパク質およびまたは GFPァクセプ夕一タンパク質も、 FRETのペア一となる機能が保たれていればそれらタンパク質の一部でもよく、必ずしも全部（全長）である必要はない。しばしば、それらのアミノ酸配列のカルボキシル末端を短くすることにより、 FRE T効率の差の増大が生ずる。たとえば、 GFPァクセプタ一タンパク質およびまたは GFPドナ一タンパク質の一部としては、それらのアミノ酸配列のカルボキシル末端領域に好ましくは少なくとも 1個、より好ましくは 1〜1 1個の欠損を有してなるものを挙げることができる。なお、かかる領域におけるアミノ酸の欠損部位には特に限定はない。たとえば、 EYFPの場合、そのアミノ酸配列のカルボキシル末端領域において好ましくは少なくとも 1個、より好ましくは 1〜1 1個、さらに好ましくは 1 1個のアミノ酸の欠損を有してなるものが好ましい。また、 ECFPの場合、そのァミノ酸配列のカルボキシル末端領域において好ましくは少なくとも 1個、より好ましくは 1~1 1個、さらに好ましくは 1 1個のアミノ酸の欠損を有してなるものが好ましい。ここで、カルボキシル末端領域とは、本発明に使用する G FP関連タンパク質のアミノ酸配列において、そのカルボキシル末端から、アミノ酸の個数で好ましくは 1〜20個までの、より好ましくは 1 1個までの領域をいう。なお、 FRETのペア一となる機能が保たれているか否かは、たとえば、公知の方法に従い F R E Tのペアを形成すると想定される 1対のタンパク質分子を共に大腸菌で生産し、当該 1対のタンパク質を含む細胞抽出液において、当該タンパク質それぞれの想定される励起波長での蛍光強度を観察するという方法により評価することができる。

さらに、 GFPァクセプ夕一タンパク質およびまたは GFPドナ一タンパク質は変異を有していてもかまわない。かかる変異の導入は、 FRETのペア一となる機能が保たれている限り、 GFPァクセプタータンパク質および/または G F Pドナ一タンパク質のァミノ酸配列における任意の部位に対し行うことができる。たとえば、変異の態様としては複数のアミノ酸の置換が挙げられ、かかるァミノ酸置換の具体的態様としては、たとえば、 Phe 64Leu、 Va l 68L e u、 S e r 72 A 1 a、 I 1 e 167 T h rなどが挙げられる。このような変異を導入することで発色団形成効率の上昇や、 F R E T効率の上昇などの効果が得られるので好ましい。変異の導入は、公知の制限酵素を用いる方法や、 PCR (ポリメラ一ゼ連鎖反応）を用いる方法により行うことができる。

また、低分子量 GTP結合タンパク質および/またはその標的タンパク質に変異を導入したものも本発明において好適に使用することができる。例えば点突然変異を導入することにより、グァニンヌクレオチド交換因子や G T Pァ一ゼ活性化因子に対する感受性を向上させたものを得ることができる。かかる変異の導入は、互いに結合する機能が保たれている限り、低分子量 GTP結合タンパク質および/またはその標的タンパク質のアミノ酸配列における任意の部位に対し行うことができる。たとえば、変異の態様としてはアミノ酸の置換、挿入、欠失などが挙げられ、具体的には、たとえば、 H— Ra sのアミノ酸配列において I 1 e 36を L e uに変化させる態様が挙げられる。かかる H— Ra sにおける変異により、当該 H— Ra sは、多数の変異の中でも GTPァ一ゼ活性化因子に対し最も高い感受性を示すようになる。その結果、モニタータンパク質のダイナミックレンジを変化させることができる。かる変異を有する H— R a sは、本発明のモニタ一タンパク質において好適に使用することができる。なお、変異の導入は

、公知の制限酵素を用いる方法や、 PCRを用いる方法により行うことができる本発明のモニタ一タンパク質においては、構成要素である各タンパク質の空間的な配置は、その機能発現に関連する因子である。かかる配置を変化させることにより FRET効率の差を非常に増大させることができる。たとえば、モニタ一タンパク質における各構成タンパク質間にスぺーサ一となるペプチド配列を入れ、 FRET効率の差を調節することができる。かかるスぺーサ一は、 FRET効率の差を増大させる観点から、低分子量 GTP結合タンパク質と標的タンパク質との間に挿入することが好ましい。スぺ一サ一となるペプチド配列としては、好ましくは 1〜30個、より好ましくは 1〜10個の連続した任意のアミノ酸からなるぺプチドを挙げることができる。かかるべプチドを低分子量 G T P結合タンパク質と標的夕ンパク質との間に挿入した場合、 F R E T効率の差が増大すること、 G F P関連夕ンパク質自身の折りたたみの効率が上昇することなどが期待できる。また、各構成タンパク質が、本発明のモニタータンパク質内において適切なコンフオメーシヨンをとり得る観点から、好ましくはグリシンを主とする低分子で二次構造を形成しにくいという性質を有するアミノ酸からなるペプチドをスぺ一サ一として用いることが好ましい。

また、本発明のモニタータンパク質のアミノ酸配列のァミノ末端および/またはカルボキシル末端に他の夕ンパク質あるいはべプチドを融合することも好ましい態様の 1つである。特に、該モニタータンパク質に、細胞内局在シグナル、たとえば、公知の小胞体（ER)移行シグナル、細胞膜局在シグナルなどを付加することにより、細胞内の局所での G T P結合タンパク質の活性化を直接測定することが可能となり好ましい。また、後述するように、細胞内の局所での GTP結合タンパク質の GTP結合型と GDP結合型の量比（GTPZGDP比）（モル比）を直接測定することも可能となり好ましい。

本発明のモニタ一タンパク質では、 GTPが結合し低分子量 GTP結合タンパク質が活性化された場合、該モニタ一タンパク質内で低分子量 GTP結合タンパク質と標的夕ンパク質との結合が誘導され全体のコンフォメ一ションが変化することになり、 GFPァクセプタ一タンパク質と GFPドナ一タンパク質との距離と方向とが変化する。次いで、特定の波長の光を照射すると、かかるァクセプ夕 —タンパク質とドナ一タンパク質との間で FRET効率の増加が検出されるようになる（第 2図）。このような FRET効率の変化には、前記モニタータンパク質のコンフオメ一シヨン変化後における GFPァクセプタータンパク質と GFP ドナータンパク質の配置が影響する。たとえば、 GFPドナ一タンパク質と GF Pァクセプ夕一タンパク質との距離が短くなると F R E T効率は増加し、距離が長くなると FRET効率は減少する。 FRET効率の変化の幅、すなわち、 FR ET効率の差の増減は、たとえば、用いる各構成タンパク質の性質により、スぺ —サ一べプチド等の挿入により、所望により適宜調節することができる。

なお、上述する本発明のモニタ一タンパク質が本発明の所望の効果を発現し得るか否かについての評価は、たとえば、後述の実施例 1に記載の方法に準じて評価することができる。

本発明はまた、本発明のモニタ一タンパク質をコ一ドする遺伝子を提供する。かかる遺伝子は、該タンパク質の前記各構成夕ンパク質の遺伝子情報を G enB ank等から入手し、公知の PCRを用いた方法により、あるいは制限酵素とリガーゼとを用いた方法により常法に従って作製することができる。

本発明のモニタ一タンパク質の構成タンパク質として好適に用いられる各タンパク質の G e n B a n k / E M B Lにおけるァクセッション番号を以下に示す。なお、ァクセッション番号は各タンパク質名の後の括弧内に示す。

(1)低分子量 GTP結合タンパク質

H-Ra s (V00574)、 K-Ra s (L00045〜L00049)、 N— Ra s (L00040〜 L00043)、 R-Ra s (M14948.M14949)、 Ra 1 A (X12533)、 Rap 1 B (X08004)、 Rap 2A (X12534)、 Rap 2B (X52987)

(2)標的タンパク質

Ra f (X03484)、 Ra 1 GDS (U14417)

(3) GFPドナータンパク質と GFPァクセプタータンパク質

EGFP (U76561)、 EYFP (AVU73901 1)、 ECFP (AB041904)

なお、 EBFP (GFPに以下の 3つの変異を有するものである： Ph e 64 Leu, Ty r 66Hi s、 Ty r 145 Ph e) については文献 6に記載されている。

本発明はさらに、前記遺伝子を含む発現べクタ一を提供する。かかるベクターは、公知の方法に従い、本発明のモニタータンパク質をコードする遺伝子を公知の原核細胞発現べクタ一、例えば pGEX— 2T (アマシャムーフアルマシアバイオテック社製）、真核細胞発現べクタ一、例えば pCAGGS (文献 7) に、あるいはウィルスベクター、例えば p Shu t t 1 e (CLONTECH社製 ) に挿入することにより得ることができる。発現べクタ一としては発現プラスミドが好ましい。

本発明はさらに、前記発現べクタ一を保持する形質転換された細胞およびトランスジニック動物を提供する。かかる細胞は、前記発現べクタ一を対象とする細胞に導入することにより得られる。細胞への導入法としては公知のトランスフェクシヨン法やウィルス感染法が使用でき特に制限はないが、たとえばリン酸カルシゥム法、リボフヱクシヨン法、あるいはエレクト口ポレージョン法等が使用できる。該細胞としては真核細胞あるいは原核細胞を用いることができ、特に制限はない。たとえば、真核細胞としては、ヒト胎児腎臓由来 HEK 293 T細胞、サル腎臓由来 COS細胞、ヒト臍帯由来 HUVEC細胞、酵母など、原核細胞としては、大腸菌など、培養細胞や、その他、各種細胞を使用できる。一方、前記発現ベクターを公知の方法、たとえば、マウス受精卵の核内にプラスミド DN Aをマイクロインジェクションする方法などにより、マウス等の個体に直接導入することでトランスジニック動物を得ることができる。

本発明においてはさらに、本発明のモニタ一タンパク質を用いる低分子量 GT P結合タンパク質の活性化を測定する方法を提供する。かかる方法によれば、本発明のモニタ一タンパク質における FRETを検出することで低分子量 GTP結合タンパク質の活性化を測定することができる。また、前記する本発明の形質転換された細胞またはトランスジエニック動物において FRETを検出し、当該細胞または動物における低分子量 G T P結合タンパク質の活性化を直接測定することもできる。かかる場合、別途、 GTPの結合した低分子量 GTP結合タンパク質と GTPからの無機リン酸の遊離によって生じる GDPの結合した低分子量 G TP結合タンパク質とを測定して GTPZGDP比〔または GTPZ (GDP + GTP)比〕（いずれもモル比）を算出し、さらに対応する FRET効率を測定して予め検量線を作成しておけば、当該細胞または動物における FRET効率に基づいて、 GTPZGDP比を算出することができる。

たとえば、具体的には以下のような方法が例示される。

( 1 ) 分光光度計を用いた測定法

モニタ一タンパク質を発現し得る本発明の形質転換細胞を、当該タンパク質の発現が可能な条件下に培養する。次いで、当該細胞を可溶化する。細胞の可溶化の方法に特に制限はないが、界面活性剤 TritonXlOOを含む溶液を用いて可溶化する方法が好ましい。可溶化した溶液に、 GFPドナ一タンパク質に対する励起光 (たとえば、波長 433 nm)を照射し、たとえば、波長 450 nmから 550 nmの範囲で蛍光プロフィールを公知の蛍光分光光度計を用いて測定する。得られた蛍光プロフィールのデータを基に、たとえば、波長 475 nmにおける GF Pドナータンパク質の蛍光強度と波長 530 nmにおける GFPァクセプ夕一夕ンパク質の蛍光強度との比（（波長 530 nmにおける蛍光強度） / (波長 47 5 nmにおける蛍光強度）〕を算出し、それを GFPドナ一タンパク質から GF Pァクセブタ一タンパク質への FRET効率とする。 GTPの低分子量 GTP結合タンパク質への結合前に比べ、結合後（すなわち、低分子量 GTP結合タンパク質の活性化後）に FRET効率が上昇するため、それを指標として低分子量 G TP結合タンパク質の活性化を測定する。なお、低分子量 GTP結合タンパク質の活性化と不活性化は、たとえば、前者については、グァニンヌクレオチド交換因子 So s発現ベクター（pCAGGS— mSos ；文献 9に記載）を本発明のモニタ一タンパク質を発現し得る細胞にトランスフヱクトすることにより、また

、上皮細胞増殖因子（EGF) による当該細胞の刺激により行うことが、後者については、たとえば、 GTP水解促進酵素 Gap lm発現べクタ一（pEF— B o s— Gap lm ;文献 9に記載）を当該細胞にトランスフエクトすることにより行うことができる。一方、 1¾£で効率は0?？ドナ一タンパク質と GFPァクセプタータンパク質との距離および方向の変化により生ずるため、 FRET効率の変化によりモニタータンパク質の構造変化をも検出することができる。 (2)顕微鏡を用いた測定法

モニター夕ンパク質を発現した本発明の形質転換細胞またはトランスジヱニック動物を蛍光顕微鏡で観察し、低分子量 GTP結合タンパク質の活性化前後に生ずる FRET効率の変化を直接的に検出する。なお、低分子量 GTP結合タンパク質の活性化と不活性化は前記（1)分光光度計を用いた測定法の場合と同様にして行うことができる。

用いる蛍光顕微鏡には特に制限はないが、公知のキセノン光源を有する倒立型蛍光顕微鏡（Carl Zeiss, Axiovert 100) に回転式蛍光励起フィルターおよび回転式蛍光発光フィルターを備え、高感度冷却 C C Dカメラを備えたものが好ましレ、。さらにフィルターおよびカメラ画像は、日本ローパー社製 Metamorph画像解析ソフトにて制御ならびに解析できるシステムが望ましい。

前記細胞または動物に GFPドナータンパク質の励起光を照射し、 GFPドナ —タンパク質の蛍光波長での画像を CCDカメラにより撮影し、その後、 GFP ァクセプタータンパク質の蛍光波長での画像を撮影する。両画像の蛍光強度の比を測定することにより各測定点での FRET効率を算出できる。また、たとえば、グァニンヌクレオチド交換因子 So s発現べクタ一をモニタータンパク質を発現し得る細胞または動物に種々の量で導入して低分子量 GTP結合タンパク質の種々の活性化状態（すなわち、活性化の程度が異なる状態）を構築する。次いで、各状態における細胞または動物を蛍光顕微鏡で観察し、前記と同様にして FR ET効率を求める。また、各状態における細胞（当該動物から得られた、 FRE T効率を求めた部位に由来する細胞を含む）を可溶化し、別途、 GTPの結合した低分子量 G T P結合タンパク質と G D Pの結合した低分子量 G T P結合タンパク質とを測定して GTPZGDP比を算出する。詳しくは、公知の方法（文献 2 ) により低分子量 GTP結合タンパク質への GTP結合量および GDP結合量を測定して GTP/GDP比を求める。次いで、得られた GTP/GDP比を、予め求めておいた FRET効率と関連付ける。すなわち、各状態での測定時点における FRET効率と GTPZGDP比を測定し、それらを基に検量線を作成する。このようにして別途、検量線を作成しておけば、モニタータンパク質を発現した細胞または動物における F R E T効率を蛍光顕微鏡を用いて直接測定するだけで、各測定時点での F R E T効率から GTPZGDP比を求めることが可能となる。従って、非侵襲的に細胞内または個体内における低分子量 GTP結合タンパク質の活性化状態を容易に把握することができ、しかも、かかる状態における G TP/GDP比を具体的に得ることができる。なお、かかる検量線を用いる方法は、前記（1)の方法においても同様に使用することができる。

本発明によれば、非侵襲的な低分子量 GTP結合タンパク質の活性化の測定を可能にする低分子量 GTP結合タンパク質の活性モニタ一タンパク質、その遺伝子等が提供される。また、かかるモニタータンパク質を発現し、非侵襲的な低分子量 G T P結合タンパク質の活性化の測定に有用な前記発現べクタ一を保持する形質転換された細胞およびトランスジエニック動物、ならびに前記夕ンパク質を用いる低分子量 G T P結合タンパク質の活性化を測定する方法が提供される。従つて、低分子量 G T P結合タンパク質の活性化状態を細胞内または個体で非侵襲的に知ることが可能となり、生命現象の理解のみならず、薬剤開発（たとえば、癌、自己免疫疾患、アレルギー性疾患等の治療剤または予防剤）において多大な利益をもたらし得る。

さらに本発明の別の態様として、低分子量 GTP結合夕ンパク質の活性調節物質のスクリーニング方法を提供する。すなわち、

(a)低分子量 GTP結合タンパク質の活性モニタ一タンパク質を発現する、当該夕ンパク質の遺伝子を含む発現べクターを保持する形質転換された細胞と被検物質とを接触させる工程、ならびに ( b )低分子量 G T P結合タンパク質の活性の変化を検出する工程、

を含む、低分子量 GTP結合タンパク質の活性調節物質のスクリ一ユング方法を提供する。

本発明のスクリーニング方法によれば、本発明の低分子量 GTP結合タンパク質の活性モニタ一タンパク質を発現する細胞を構築し、バイオアツセィ系を用いることによって、低分子量 GTP結合タンパク質の活性を変化させる物質またはその塩（すなわち、低分子量 GTP結合タンパク質の活性調節物質）を効率よくスクリーニングすることができる。当該方法における被検物質としては特に限定されるものではないが、たとえば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性物質、合成物質、発酵生産物等を挙げることができる。

本発明のスクリーニング方法は、（i)低分子量 GTP結合タンパク質活性化物質の存在下、あるいは（i i)当該活性化物質の非存在下において行うことができる。なお、低分子量 G TP結合タンパク質活性化物質とは、低分子量 GTP 結合タンパク質を活性化する物質であり、たとえば、上皮細胞増殖因子等の細胞増殖因子、インタ一ロイキン等のサイト力イン類を挙げることができ、またこれらに限定されない。低分子量 GTP結合タンパク質の活性調節物質は、（i) の場合、低分子量 G T P結合タンパク質の活性を増強あるいは減少させる物質として、（i i) の場合、低分子量 GTP結合タンパク質の活性を増強させる物質としてスクリーユングすることができる。

具体的には、本発明のスクリーニング方法は、前記活性化物質の存在下または非存在下に、工程（a) において、本発明の低分子量 GTP結合タンパク質の活性モニタ一タンパク質を発現する細胞と被検物質とを接触させる（態様 1)。接触させる方法は特に限定されるものではなく、たとえば、被検物質の存在下に当該細胞を培養することにより行うことができる。また、平行して、対照として、同条件下、本発明の低分子量 G TP結合タンパク質の活性モニタ一タンパク質を発現する細胞と被検物質とを接触させない場合（態様 2)を行う。次いで、工程 (b) において、それぞれの場合における低分子量 GTP結合タンパク質の活性を測定し、態様 2と比較した態様 1における低分子量 GTP結合タンパク質の活性の変化を検出することにより低分子量 G T P結合タンパク質の活性調節物質のスクリーニングを行う。なお、当該活性の測定は、各々の場合における FRET 効率を測定することにより行なうことができる。

すなわち、前記（i) の場合に、低分子量 GTP結合タンパク質の活性をより増強する物質は、低分子量 GTP結合タンパク質の活性を増強し得る活性調節物質であり、逆に当該活性を減少する物質は、低分子量 GTP結合タンパク質の活性を減少し得る活性調節物質である。また、前記（i i) の場合に、低分子量 G TP結合タンパク質の活性を増強する物質は、低分子量 GTP結合タンパク質の活性を増強し得る活性調節物質である。

以上の方法により、簡便かつ迅速に低分子量 G T P結合タンパク質の活性調節物質を得ることができる参照文献

以下に、本明細書において記載する参照文献を列挙する。かかる参照文献は参照により、その全教示が本明細書中に取り込まれる。なお、本明細書中では〔文献（数字）〕として参照する各文献の文献番号を示す。

1. Bos, J. L. 1997. 「Ra s様 GTPァ一ゼ（Ras-like GTPases. ) J Bioc him. Biophys. Acta 1333:M19-M31.

2. Satoh, T. and Y. Kaziro. 1995. 「刺激された造血細胞における R a s結合グァニンヌクレオチドの測定 (Measurement of Ras-bound guanine nucleotid e in stimulated hematopoietic cells. ) J Method. Enzymol. 255:149-155.

3. Franke, B.， J. W. N. Akkerman, and J. L. Bos. 1997. Γヒト血小板における迅速な R a ρ 1の C a ²⁺媒介活性化 ( Rapid Ca2+- mediated activation of Rapl in human platelets. ) J EMBO J. 15:252-259. 4. Tsien, R. Y. and A. iyawaki. 1998. 「生細胞の機構を見る（ Seeing th e machinery of live cells.) J Science 280:1954-1955.

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6. Miyawaki, ， J. Llopis, R. Heim, J. M. McCaffery, J. A. Adams, M. Ikura, and R. Y. Tsien. 1997. 「グリーンフルオレセントプロテインとカルモジュリンに基づく C a ²⁺の蛍光インディケ一夕一（Fluorescent indicators for

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7. Niwa, H.， K. Yamamura, and J. iyazaki. 1991. 「新規真核細胞べクタ一による高発現形質転換体の効率的な選抜 ( Efficient selection for high-expr ession transfectants with a novel eukaryotic vector. ) J Gene 108:193-20 0，

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11. T. Got oh, S. Hattori, S. Nakamura, H. Kitayama, M. Noda, Y. Takai, K. Kaibuchi, H. Matsui, 0. Hatase, H. Takahashi, T. Kurata, and M. Matsu da. 「C r k SH3ドメインバインディンググァニンヌグレオチドリリーシングファクタ一、 C3Gの夕一ゲッ卜としての Rap 1の同定（Identification o f Rapl as a target for Crk SH3 domain-binding guanine nucleotide-releasi ng factor, C3G) 」 Mol. Cell. Biol. 15:6746-6753, 1995. 実施例

以下、本発明を実施例により説明するが、本発明の範面はかかる実施例のみに限定されるものではない。なお、以下においては、ヒト H— Ra sを Ra sと、ヒト c一 Ra f 1を Ra f と、ヒト Rap l Aを Ra p 1 Aと、ヒト Ra 1 GD Sを Ra l GDSと、ヒト R— R a sを R— R a sという。実施例 1 Ra f r a s l 722による Ra s活性化の測定

(1) R a と Ra f をコードするキメラ遺伝子の作成

, (i) Ra s遺伝子の増幅

R a sの c DN A (Genbank/EMBL了クセシヨン番号： V00574) を銹型として、センスプライマ一 h R a s X h (5* -CTCGAGATGACGGAATATAAGCTGGTGGTG-3' ) (配列番号： 1) およびアンチセンスプライマー Ra s 172Ra f (5' -AGTGTTGCTTGTC TTAGAAGGGGTACCACCTCCGGAGCCGTTCAGCTTCCGCAGCTTGTG-3' ) (配列番号： 2 ) と、耐熱性 DNA複製酵素 P f X (Gibco-BRL, Bethesda, U.S.A.) とを用い、 PC R (ポリメラ一ゼ連鎖反応）法により R a sの 1位から 172位のアミソ酸配列に对応する c DN A部分を増幅した。センスプライマ一 hRa s Xhは、 5，末端の下線で示した制限酵素 X h o I の切断部位の塩基配列と R a sの 1位から 8位のァミノ酸配列に対応する c DN A部分の塩基配列とからなる。一方、アンチセンスプライマー Ra s 172Ra f は、 5'末端より、 Ra f の Ra s結合領域のアミノ酸配列のァミノ末端領域（ 61位から 67位まで）に対応する cDN A部分の相補鎖の塩基配列、スぺーサ —配列（下線部）、 R a sの 1 66位から 1 72位のァミノ酸配列に対応する c DNA部分の相補鎖の塩基配列とからなる。

(ii) Ra ί遺伝子の増幅

R a ίの c DN A (Genbank/EMBL了クセション番号： X03484) を鐯型として、センスプライマー R a f RBD-F 1 (5' -GGTACCCCTTCTAAGACAAGCAACACT-3' ) (配列番号： 3) およびアンチセンスプライマ一 Ra f RBDn 2 (5' -GCGGCCGCCCA GGAAATCTACTTGAAGTTC-3' ) (配列番号： 4) と前記 P f xとを用い、 P C R法により Ra f の 51位から 1 31位のアミノ酸配列に対応する cDNA部分を増幅し。

センスプライマ一 Ra f RBD— F 1は、 5' 末端の下線で示した制限酵素 K p n Iの切断部位の塩基配列と R a f の 51位から 57位の了ミノ酸配列に対応する cDNA部分の塩基配列とからなる。一方、アンチセンスプライマー Ra f RBDn 2は、 5' 末端の下線で示した制限酵素 No ΐ Iの切断部位の塩基配列と R a f の R a s結合領域のアミノ酸配列のカルボキシル末端領域（125位カヽら 131位まで）に対応する cDNA部分の相補鎖の塩基配列とからなる。

(iii) Ra sと Ra f をコードするキメラ遺伝子の増幅

前記（i) および（ii) で増幅された遺伝子を混合したものを铸型として、センスプライマー hRa sXhおよびアンチセンスプライマー Ra f RBDn 2と前記 P f xとを用レ、、 PCR法により Ra sと Ra fをコードするキメラ遺伝子からなる cDNAを増幅した。次いで、得られた DNA断片を pCR— b 1 un t I I -TOPO (Invitrogen¾：) にライゲ一シヨンし、得られたプラスミド構築物で大腸菌を形質転換した。かかる大腸菌を培養後、公知のアルカリ SDS法によりプラスミドを精製した。

(2) £¥??ぉょぴ£0??を発現するべグター？ e t 2の構築

(i) じ八003-？ 7の構築

pB l u e s c r i p t -SK I I (+) (Stratagene社）のマルティブルクローニングサイトをプライマ一 P 7 (5' -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3' ) (配列番号： 5) とプライマ一 P 8 (5' -AGCGGATAACAATTTCACACAGGAAAC-3' ) (配列番号： 6) とを用い、前記と同様にして PCR法により増幅し、 DNA断片を得た。一方、哺乳類細胞発現べクタ一 pCAGGS (文献 7) を E c oR Iで切断し、 K 1 e n ow酵素で平滑末端化処理した。次いで、前記 DNA断片と前記処理後の p C AGGSとを T 4 DNAリガーゼで結合した。得られたベクタ一を p C AGGS— P 7と呼ぶ。

(ii) EYFP遺伝子の増幅

本実施例においては、公知の EGFP (Genbank/E BL了クセ》/シヨン番号： U76561) に対し、 PCR法を用いる公知の方法により 6つのアミノ酸置換（Leu65Phe;Thr 66Gly;Val69Leu;Gln70Lys;Ser73Ala;Thr204Tyr) を導入したものを E YF Pとして用いた。この EYFPの cDNAを铸型として、センスプライマー GFP— N 2 (5' -GGATCCGGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3' ) (配列番号： 7 ) およびアンチセンスプライマー GFP— N3 (5' -GGATCCGGTACCTCGAGCTTGTACAGCTCGTCCATG-3' ) (配列番号： 8) と前記 P f Xとを用い、 PCR法により EYFPの全長アミノ酸配列に対応する c DNAを増幅した。

センスプライマ一 GFP— N2は、 5' 末端の下線で示した制限酵素 B a mH Iの切断部位の塩基配列と 3塩基のスぺーサーと E Y F Pの 1位から 7位のアミノ酸配列に対応する cDN A部分の塩基配列とからなる。一方、アンチセンスプライマ— GFP— N3は、 5' 末端の下線で示した制限酵素 B a mH I、 Kpn Iおよび X h ο Iの各々の切断部位の塩基配列と後述の ECFPのァミノ酸配列の力ルポキシル末端領域（233位から 239位まで）に対応する cDNA部分の相補鎖の塩基配列とからなる。

(iii) ECFP遺伝子の増幅

本実施例においては、 EGFP (Genbank/E BL了クセッション番号： U76561) に対し、 PCR¾を用いる公知の方法により 4つのアミノ酸置換（Tyr67Trp; Asnl47Il e; Metl54Thr; Vall64Ala)を導入したものを E C F Pとして用いた。この ECF Pの cDNAを鎮型として、センスプライマ一 XFPNo t 2 (5' -GCGGCCGCATG GTGAGCAAGGGCGAGGAGC -3' ) (配列番号： 9)およびアンチセンスプライマ一 X FP-Bg 1 (5' -AGATCTACAGCTCGTCCATGCCGAGAG-3' ) (配列番号： 10) と前記 P f Xとを用レ、、 PCR法により ECFPの全長アミノ酸配列に対応する cD NAを増幅した。

センスプライマ一 XFPNo t 2は、 5' 末端の下線で示した制限酵素 No t Iの切断部位の塩基配列と E C F Pの 1位から 8位のァミノ酸配列に対応する c

DNA部分の塩基配列とからなる。一方、アンチセンスプライマ一 XFP— Bg Πま、 5' 末端の下線で示した制限酵素 Bg 1 I Iの切断部位の塩基配列と EC

FPのアミノ酸配列のカルボキシル末端領域（231位から 237位まで）に対応する c DNA部分の相補鎖の塩基配列とからなる。

(iv) p F r e t 2の構築

前記（i)で得られた pCAGGS— P 7を制限酵素 Xho Iで切断し、 dT TPと dCTPの存在下に K 1 enow酵素で処理した。また、前記（ii)で得られた EYFPの DNA断片を BamH Iで切断し、次いで dGTPと dATP の存在下に K 1 e n ow酵素で処理した。得られた二つの遺伝子断片を T 4 DN Aリガーゼで結合し、プラスミドを得た。該プラスミドを No t Iと Bg 1 I I で切断し、次いで、 No t Iと Bg 1 I Iで予め切断しておいた前記（iii)で得られた ECFPの DNA断片と、 T 4 DNAリガーゼを用いて結合した。得られたプラスミドを pFr e t 2と命名した。 (3) Ra s活性モニタ一タンパク質遺伝子の発現プラスミドである pRa f r a s 1722の構築

前記（2) - (iv)で得られた pFr e t 2を Xho Iと No t Iで切断し、次いで、 Xho Iと No t Iで予め切断しておいた前記（1) — (iii)で得られたキメラ遺伝子と、 T 4 DNAリガーゼを用いて結合した。得られたプラスミドを pRa f r a s l 722と呼ぶ。 pRa f r a s l 722の構造、その翻訳領域の塩基配列（配列番号： 1 1)および予測されるアミノ酸配列（配列番号： 1 2) を第 3図と第 4図〜第 6図にそれぞれ示す。

かかる塩基配列および予測されるァミノ酸配列を説明する：

nt 1 - 717 ォワンクラゲ（Aequorea) の EYFP

nt 718 - 723 リンカー

nt 724一 1239 R a s

nt 1240一 125 リンカー

nt 1258一 1500 R a f

nt 1501 - 1509 リンカー

nt 1510一 2220 ォワンクラゲの ECFP

(4)哺乳類細胞での R a s活性モニタータンパク質（Ra f r a s l 722) の発現と分光光度法による解析

ヒト胎児腎臓由来 HE K 293 T細胞は 10 %ゥシ胎仔血清を含む D MEM培地（日本製薬社製）で培養した。該 HEK 293 T細胞に前記（3)で得られた PR a f r a s 1722とグァニンヌクレオチド交換因子 S o s発現べクタ一（ pCAGGS-mSo s) または GT P水解促進酵素 G a p lm発現べクタ一（ pEF-Bos-Gap lm)をリン酸カルシウム法にてトランスフエクトした。トランスフヱクト後の HE K 293 T細胞を 10%ゥシ胎仔血清を含む DM E M培地（日水製薬社製）で培養し、 Ra s活性モニタ一タンパク質を発現させた。 48時間培養後に、細胞をリン酸緩衝生理食塩水にて洗浄し、溶解液（20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 0.1% Triton X-100) にて溶解した。得られた細胞溶解液を 10, 000 xgで遠心分離後、上清を回収した。該上清を蛍光分光光度計（日本分光社製、 FP- 750) の 1 m 1キュべットに入れ、励起波長 433 nmにて、 450 nmから 550 nmまでの蛍光強度を測定した。得られた蛍光プロフィールを第 7図に示す。

なお、前記トランスフヱクト後の HEK 293 T細胞を³² P i無機リン酸で標識した後に該細胞の溶解液を得、抗 GFP抗体を用い、発現させた Ra s活性モ二夕—タンパク質を免疫沈降し、結合している GTPおよび GDPを薄層クロマトグラフィ一にて分離することにより、 Ra s活性モニタ一夕ンパク質について得られた蛍光プロフィールのデータから得られる FRET効率〔波長 433 nm で励起したときの、（波長 530 nmにおける蛍光強度）を（波長 475 nmにおける蛍光強度）で割った値〕と実際の GTP結合の程度とを対応付けることが可能である（第 8図）。なお、第 8図中、 FRET効率は「蛍光強度比（波長 5

30/475 ) 」と、 GTP結合の程度は「GTPZ (GDP + GTP) (%) J として示した。

( 5 ) 哺乳類細胞での R a s活性モニタ一タンパク質の発現とタイムラブス蛍光顕微鏡による解析

サル腎臓由来 COS 7細胞は 1 0%ゥシ胎仔血清を含むフエノールレツド不含 MEM培地（日本製薬社製）で培養した。該 COS 7細胞に前記 (3)で得られた pRa f r a s l 722をリン酸カルシウム法にてトランスフエクトした。トランスフヱクト後の COS 7細胞を 1 0%ゥシ胎仔血清を含むフヱノールレツド不含 MEM培地（日水製薬社製）で培養し、 R a s活性モニタータンパク質を発現させた。トランスフヱクシヨンの 48時間後に、培養細胞をタイムラブス蛍光顕微鏡による観察に供した。

かかる顕微鏡は、回転式蛍光励起フィルター装置および回転式蛍光発光フィル夕一装置（LUDL electronic社製）を備え、さらに高感度冷却 C C Dカメラ（Ph otometrix社製、 Micromax450 ) を備えた、キセノン光源を有する倒立型蛍光顕微鏡（Carl Zeiss社製、 Axiovert 100)であり、観察の際は、該顕微鏡の制御ならぴに観察結果の解析を日本口一パー社製メタモルフ（Metamorph ) 画像解析ソフトにより行うシステムを用いた。蛍光励起フィルター、蛍光発光フィルター、ダイクロイツクミラーはオメガ社より購入した。

前記培養細胞に 433 nmの励起光を照射し、 475 nmの ECFPドナーの蛍光波長での画像を CCDカメラにより撮影し、次いで、 53011111の£¥ ？ァクセプターの蛍光波長での画像を撮影した。両画像デ一夕をもとに両者の蛍光強度の比を求めることにより各測定点での F R E T効率を計算した。実施例 2 R a s活性を簡便に測定するための培養細胞株の取得

マウス線維芽細胞 N I H 3 T 3細胞は 10 %ゥシ胎仔血清を含む DM E IV [培地 (日水製薬社製）で培養した。かかる NIH3T3細胞に、実施例 1で得られた pRa f r as l 722と G418耐性遺伝子を含むベクター p S V 2 n e o ( Genbank/EMBL: U02434) とを、 FuGene 6 (日本ロッシュ社製）を用いて共トランスフクトした。該細胞を前記培地にて培養し、 48時間培養後に 1 ： 1 0の希釈率で播きなおし、 G418 (Gibco 一 BRL社製）を 0. 5mg/mlになるように培地中に添加した。培地は 3日に一度交換した。培養 2週間後、よく分離したコロニーをクロ一ニングし、 3T3— Ra f r a s細胞と命名した。かかる 3T3—Ra f r a s細胞を 10%ゥシ胎仔血清と 0. 5mgZmlの G418とを含む DMEM培地（日水製薬社製）で培養し、 R a s活性モニタータンパク質を発現させた。次いで、かかるタンパク質の発現を抗 R a s抗体（Tr ansduction Lab社）を用いた通常のィムノブロッテイング法にて解析した。その結果、約 80 kD aのタンパク質の発現が認められた（第 9図）。

さらに、かかる細胞を上皮細胞増殖因子（EGF) (S i gma社製）で刺激し、実施例 1の（4) に記載の方法により FRET効率を求め、 EGF刺激前後で比較した。 EGF添加前後における蛍光プロフィールを集 1 0.図に示す。実施例 3 R a i - c h u 3 1 1による R a p 1 A活性化の測定

(1) Rap 1 Aと Ra 1 GD Sをコードするキメラ遺伝子の作成

( i ) Ra 1 A遺伝子の増幅

R a p 1 Aの c DNA (Genbank/EMBL了クセッション番号： X12533) を鐯型として、センスプライマ一 hRap 1 Xh (5' -GGCTCGAGATGCGTGAGTACAAGCTAGTGG-3' ) ( 配列番号： 1 3) およびアンチセンスプライマ一 Ra p 1 72Ra 1 GDS (5' -GCGGATGATACAGCAGTCGCCACCTCCGGATCCGCCGGTACCTCCACCACCGGTTCCACCTCCGGAGCCAT TGATCTTTGACTTTGCAGAAG-3' ) (配列番号： 1 4 ) と、前記 P f xとを用い、 P C R法により Rap 1 Aの 1位から 1 72位のアミノ酸配列に対応する c DN A部分を増幅した。

センスプライマー hRap 1 Xhは、 5' 末端の下線で示した制限酵素 X h o Iの切断部位の塩基配列と R a p 1 Aの 1位から 8位のアミノ酸配列に対応する cDNA部分の塩基配列とからなる。一方、アンチセンスプライマ一 Rap 1 7 2 R a 1 GD Sは、 5 ' 末端より、 R a 1 GD S (Genbank/EMBL了クセッション番号： U14417) の Rap 1 A結合領域のアミノ酸配列のアミ/末端領域（2 1 1位から 2 1 7位まで）に対応する cDNA部分の相補鎖の塩基配列、スぺ一サー配列（下線部）、 Rap 1 Aの 1 6 6位から 1 72位のアミノ酸配列に対応する c DN A部分の相補鎖の塩基配列とからなる。

(ii) Ra 1 GDS遺伝子の増幅

Ra l GDSの cDNA (Genbank/EMBL了クセ' yシヨン番号： U14417) を鐯型として、センスプライマー Ra l GDS— F (5' -GGCGACTGCTGTATCATCCGC-3' ) (配列番号： 1 5) およびアンチセンスプライマー Ra 1 GDSR (5' -CGCGGCCGCCCCG CTTCTTGAGGACAAAGTC-3' ) (配列番号： 1 6) と前記 P f xとを用い、 PCR法により Ra 1 GDSの c DNAを増幅した。 . センスプライマ一 R a 1 GDS— Fは、 Ra 1 GDSのcDNAのRap 1 A 結合領域のアミノ酸配列のァミノ末端領域（21 1位から 217位まで）に対応する cDNA部分の塩基配列を有する。一方、アンチセンスプライマー R a 1 G DSRは、 5' 末端の下線で示した制限酵素 No t Iの切断位の塩基配列と R a 1 GDSの Rap 1 A結合領域のアミノ酸配列のカルボキシル末端領域（29 1位から 297位まで）に対応する cDN A部分の塩基配列の相補鎖の塩基配列とからなる。

(iii) Rap 1 Aと Ra 1 GDSをコードするキメラ遺伝子の増幅

前記（i) および（ii)で増幅された遺伝子を混合したものを铸型として、センスプライマー hRap 1 Xhおよびアンチセンスプライマー Ra 1 GDSRと Pf Xとを用い、 PCR法により Rap 1 Aと Ra ί GD Sをコードするキメラ遺伝子からなる cDNAを増幅した。次いで、得られた DNA断片を pCR— b 1 un t I I— TOP 0にライゲージヨンし、得られたプラスミド構築物で大腸菌を形質転換した。かかる大腸菌を培養後、公知のアルカリ SDS法によりブラスミドを精製した。

(2) Rap 1 A活性モニタータンパク質遺伝子の発現プラスミドである pRa i - c hu 31 1の構築

実施例 1の（2) の（ii) において、アンチセンスプライマー GFP— N3に換えてアンチセンスプライマ一 GFP— d MR (5' -GGATCCGGTACCTCGAGGGCGGC GGTCACGAACTCCAGCAG-3' ) (配列番号 : 17)を用い同様の操作を行い、 ECF Pと、そのアミノ酸配列のカルボキシル末端めアミノ酸が 1 1個欠損した EYF Pとをコードする c DNAを含むベクタ一を作成した。かかるベクターを X h 0

Iと No t Iで切断した。次いで、該ベクタ一と、 Xh o Iと No t Iで予め切断しておいた前記（1)で得られたキメラ遺伝子とを T 4 DNAリガーゼで結合した。得られたプラスミドを pR a i - c hu 31 1と命名した。得られたブラスミドの構造ならびに、その翻訳領域の塩基配列（配列番号： 18) および予測されるアミノ酸配列（配列番号： 1 9) を第 1 1図と第 1 2図〜第 1 4図にそれぞれ示す。

かかる塩基配列および予測されるアミノ酸配列を説明する：

nt 1 - 684 ォワンクラゲの EYFP

nt 685 - 690 リンカ一

nt 691 - 1206 R a ρ 1 A

nt 1207 - 1257 リンカ一

nt 1258 - 1515 Ra 1 GDS

nt 1516 - 1521 リンカ一

nt 1522 - 2235 ォワンクラゲの ECFP

(3) 哺乳類細胞での R a p 1 A活性モニタ一タンパク質（Ra i— c hu 3 1 1) の発現と分光光度法による解析

実施例 1の（4) に記載の方法により解析を行った。得られた蛍光ブロフィールを第 1 5図に示す。実施例 4 R a i - c h u 1 5 8による R— Ra s活性化の測定

( 1 ) pRa i - c hu 1 58の構築

( i) R— Ra s遺伝子の増幅

R— Ra sの cDNA (Genbank/EMBLアクセ^ヨン番号： M14948, M14949) を铸型として、センスプライマ一 RRa s 28 F (5' -CCCCTCGAGACACACAAGCTGGTGGTC-3 ' ) (配列番号： 20) およびアンチセンスプライマ一 RRa s 204 R (5'-G CCGGTACCGCCACTGGGAGGGCTCGGTGGGAG-3* ) (配列番号： 2 1 ) と、前記 P f xとを用い、 PCR法により R— Ra sの 28位から 204位のアミノ酸配列に対応する cDNA部分を増幅した。

センスプライマー RRa s 28 Fは、 5' 末端の下線で示した制限酵素 X h o Iの切断部位の塩基配列と R— Ra sの 28位から 33位のアミノ酸配列に対応する cDNA部分の塩基配列とからなる。一方、アンチセンスプライマー RR a s 204 Rは、 5' 末端より、 Kpn I切断部位を含むスぺーサー配列（下線部 )、 R-Ra sの 198位から 204位のアミノ酸配列に対応する c DN A部分の相補鎖の塩基配列とからなる。

(ii)制限酵素断片の作製

前記（i)で得られた PCR産物を Xho Iと Kpn Iとで切断した。

(iii) R— Ra s活性モニタータンパク質遺伝子の発現プラスミドである p Ra i -chu 158の構築

実施例 1で得られた PR a f r a s l 722を Xho Iで完全消化したのち、 Kpn Iで部分消化し、 R a s部分を除去した DN A断片を得た。該 DNA断片と前記（ii)で得られた DNA断片とを T 4 DNAリガーゼで結合した。得られたプラスミドを pRa i -c hu 158と命名した。該プラスミドの構造ならびに、その翻訳領域における塩基配列（配列番号： 22) および予測されるァミノ酸配列（配列番号： 23)を第 16図と第 17図〜第 19図にそれぞれ示す。かかる塩基配列および予測されるァミノ酸配列を説明する：

nt 1 - 717 ：ォワンクラゲの EYFP

nt 718 - 723 ：リンカ一

nt 724 - 1251 ： R-Ra s

nt 1252 - 1257: リンカー

nt 1258一 1500： R a f

nt 1501― 1509：リンカ一

nt 1510一 2220：ォワンクラゲの ECFP

(2)哺乳類細胞での R— Ra s活性モニタータンパク質（Ra i— chu 15 8) の発現と分光光度法による解析

実施例 1の（4) に記載の方法により解析を行った。得られた蛍光プロフィ一ルを第 20図に示す。実施例 5 Ra sの標的タンパク質結合ドメインに温度感受性変異を有するモニタ—タンパク質をコードする遺伝子の構築

(1) p R a i - c h u 1 19の構築

( i ) 変異を有する R a s遺伝子の増幅

実施例 1にて用いた Ra sの cDNAを铸型として、センスプライマ一 hRa sXh (実施例 1にて使用）とアンチセンスプライマー R a s I 36 LR (5' - G GAATCCTCTAGAGTGGGGTCG-3' ) (配列番号 : 24) と前記 P f xとを用い、 PCR 法により Rasの 1位から 39位のアミノ酸配列に対応する c DN A部分を増幅した。

アンチセンスプライマ一 Ra s I 36 LRは、 Ra sの 35位から 42位のァミノ酸配列に対応する cDNA部分の配列を有し、下線で示した部分に I 1 eの L e uへの点突然変異を有している。この変異は R a sの活性を温度感受性にすることが知られている（文献 8)。

同様に、 Ra sの cDNAを铸型として、センスプライマ一 Ra s I 36 LF (5' -CGACCCCACTCTAGAGGATTCC-3' ) (配列番号： 25) とアンチセンスプライマ — R a s 172 R a f (実施例 1にて使用）と前記 P f xとを用い、 PC R法により R a sのァミノ酸配列の 32位から 172位に対応する c DN A部分を増幅した。

得られた 2つの DN A断片を混合し、センスブライマー hR a sXhとアンチセンスプライマー Ra s 172Ra f とを用い、前記と同様にして P C Rを行い、 R a sのアミノ酸配列の 1位から 172位に対応し、かつ I 1 e 36の L e u への点突然変異を含む D N Aを増幅した。

(ii)制限酵素断片の作製

上記 PCR産物を Xho Iと Kpn Iとで切断した。

(iii)実施例 1で得られた pR a f r as l 722を Xho Iで完全消化したのち、 Kpn Iで部分消化し、 Ra sの部分を除去した DNA断片を得た。該 DNA断片と前記（ii)で得られた DNA断片とを T 4 DNAリガーゼで結合した。得られたプラスミドを pRa i-chu 119と命名した。該プラスミドの翻訳領域における塩基配列（配列番号： 26)および予測されるアミノ酸配列（配列番号： 27)を第 21図〜第 23図にそれぞれ示す。

(2)哺乳類細胞でのモニタータンパク質（Ra i _ c hu 1 19)の発現と分光光度法による解析

ヒト胎児腎臓由来 HE K 293 T細胞を 10%ゥシ胎仔血清を含む DMEM培地（日水製薬社製）で培養した。該 HEK 293 T細胞に、実施例 1において作成した pRa f r a s 1722または pRa i— chu l 19と、グァニンヌクレオチド交換因子 S 0 s発現べクタ一（pCAGGS— mSo s) とをリン酸力ルシゥム法にてトランスフヱクトした。前記同培地にて 24時間培養後に 33°C および 40°Cのインキュベータに移し、さらに 24時間、培養した。該細胞をリン酸緩衝生理食塩水にて洗浄した後、溶解液（20 m Tris-HCl, pH 7.5, 150mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 0.1% Triton X-100 ) にて溶解した。得られた細胞溶解液を

10, 000 xgで遠心分離し上清を回収した。

該上清を蛍光分光光度計（日本分光社製、 FP-750)の 1 m 1キュべットに入れ、励起波長 433 nmにて、 450 nmから 550 nmまでの蛍光強度を測定した。得られた蛍光プロフィールを第 24図に示す。実施例 6 Ra f r a s 1722を発現するトランスジエニックマウスの作成およびこのマウスの心筋培養細胞における R a s活性化の測定

(1)実施例 1で得られた pR a f r a s 1722を制限酵素 Sp e Iおよび B amHIで切断し、これをァガロース電気泳動にかけ、約 4. 5kbのプロモー夕一、イントロン、コーディング配列、ポリ A付加シグナルを含む領域の DN A 断片を得た。該 DNAは電気溶出法にてゲルより取り出した後、 Qiagen20チップ (キアゲン社）を用いて精製した。この DNAを定法に従い、マウス受精卵（DB Fl、日本エスエルシー社）の前核に注入し、偽妊娠させた I CRマウス（日本ェスエルシ一社）の卵管内に移植した。得られたマウスの離乳後、尾を 1 cm切断し、プロティナ一ゼ Kを含む DNA抽出液（ABI 社）中で 37 °Cにて一晩維持し、ここから、フヱノールおよびフエノールクロ口ホルムにてタンパク質を除いた後に、等量のイソプロパノールを加えて、析出した DNAを回収した。回収した DNAを水にいれ、 37°Cで溶解させた。

(2) このマウス DNAを鎳型にして、センスプライマー Ra f RBDx (5' - C TCGAGCCTTCTAAGACAAGCAACACT-3' ) (配列番号： 28) とアンチセンスプライマ — XFPNs e q (5' -CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3' ) (配列番号： 29 ) とを用レ、、 PCR法にて DNAを増幅した。このプライマ一により、 Ra f r a s 1 7 22遺伝子のうちの R a f遺伝子と EC FP遺伝子の連結領域に相当する DNA が増幅できる。予期される 3 1 4 b pのバンドが現れるものを、 Ra f r a s 1 722の DNAの組み込みがあると判定した。 35匹の仔マウスのうち 7匹にこのバンドが確認できた。

(3) つぎに、この F 1マウスを C 57/B 1 a c kマウス（日本エスエルシ一社）と交配させた。 F 2のマウス新生児（0日齢）より、心室をとり、眼科用ハサミで細切した。ここに、 0. 05%トリプシンと 0. 5mM EDTAとを含む PBSを加え、 37°Cで細胞を 1 0分間処理し、剝離してきた心筋細胞を回収した。この操作を 6回繰り返し、心筋細胞を集めた。ここに、 1 0%ゥシ胎仔血清を含む DMEM培地を加え、低速遠心にて心筋細胞を沈殿させ、上清を捨てた。回収した心筋細胞を 1 0%ゥシ胎仔血清を含む DMEMで培養した。

(4) 得られた心筋細胞をガラス底の培養皿 φ 35mm) に移して底面に付着させ、無血清培地（日本製薬製）中で 6時間培養を行った。次いで、当該心筋培養細胞に EGFを 1 O O ngZm l添加し、実施例 1の（5) に記載の蛍光顕微鏡システムで観察した。 £0?添加にょる細胞内にぉける£じ？ぉょび£丫 Pの蛍光強度の経時的変化の結果を第 2 5図に示す。トランスジニックマウス由来の初代培養細胞でも E G F依存的に R a sの活性化が測定できることを確認した。実施例 7 Raf rasl722のグァニンヌクレオチド交換因子およぴ GTP水解促進酵素に対する特異性

実施例 1の (4) の実験において、グァニンヌクレオチド交換因子および GTP水解促進酵素を多数の種類を用いて Rafrasl722の特異性を検討した。 GTP水解促進酵素およびグァニンヌクレオチド交換因子としては、（文献 9 ) に記載の GAPlm 、 R - RasGAPゝ raplGAPI I 、 mSosl 、 RasGRF、 CalDAG-GEFI、 C3G、 PDZ 一 GEF1、 KIAA0351の発現べクタ一を用いた。第 2 6図に示す如く、 Ras に対する GTP 水解促進酵素である GAPlm により FRET効率の低下が認められるが、 R-Ras や Raplに対する GTP水解促進酵素である R- RasGAPや raplGAPI I によっては FRET効率は低下しない。また、 mSosl 、 RasGRFゝ CalDAG-GEFI Iといった Ras に対するグァニンヌクレオチド交換因子により FRET効率は上昇するが、 CalDAG-GEFI、 C3G、 PDZ-GEF1 、 KIAA0351といった他の Ras ファミリー G タンパク質を基質とするグァニンヌクレオチド交換因子によっては FRET効率は上昇しなかった。これは、 Rafrasl722が Ras と同じグァニンヌクレオチド交換因子および GTP水解促進酵素によってその FRET効率が特異的に制御されていることを示している。実施例 8 Rap 1モニターである Rai-chu404の作成とそのグァニンヌクレオチド交換因子および GTP水解促進酵素に対する特異性

( 1 ) RaplAと Raf をコードするキメラ遺伝子 Rai-chu404の作成

公知の EGFP (Genbank /EMBL ァクセッション番号： U76561) に対し、 PCR 法を用いる公知の方法により 7つのアミノ酸置換 (Thr66Gly; Val69Leu; Ser73A la; Metl54Thr; Val腿 la; Serl76Gly; Thr204Tyr) をいれたものを、実施例 3 に記載の pRai- chu311 の EYFPと制限酵素 EcoRI と Xholとを用いる切断およびライゲ一シヨンによる方法で置換した。次に、 Rafrasl722の Raf 領域を含む Kpnl/Not I 断片を、この pRai-chu311 由来のプラスミドの RalGDS領域を含む Kpnl/Not l 断片と置換した。このべクタ一を pRai-chu404 と命名した。その翻訳領域の塩基配列を配列番号： 3 0として、また当該塩基配列から予測されるアミノ酸配列を配列番号： 3 1として示す。

( 2 ) 実施例 7と同様に Rai-chu404の FRET効率に及ぼすグァニンヌクレオチド交換因子の影響を調べた。 Raplに対するグァニンヌクレオチド交換因子としては PDZ-GBFK C3G、 CalDAG-GBFI、 CalDAG-GBFI I I を用いた。また、対照として Ra s に対するグァニンヌクレオチド交換因子である CalDAG-GEFI I、 mSosl、 RasGRF および Ral に対するグァニンヌクレオチド交換 H子である KIAA0351を用いた。これらのグァニンヌクレオチド交換因子は（文献 9 ) に記載がある。実験の結果を第 2 7図に示すように、 Raplに対するグァニンヌクレオチド交換因子のみが Rai- chu404の FRET効率を上昇せしめることがわかった。実施例 9 Ki-Rasタンパク質の CAAXボックスを有する活性モニタ一タンパク質 Ra i-chul01 と Rai-chu404X の作成

実施例 1においてアンチセンスプライマ一 XFP-B g 1のかわりに制限酵素 Xbal の認識部位を含むプライマー（配列番号： 3 2 ) を用いて ECFPを増幅し、（文献 1 1 ) に記載の方法で、 ECFPのカルボキシル末端に Ki—Ras タンパク質の CAAXポックスを融合せしめた。これを Rafrasl722および Rai - chu404の ECFPと制限酵素と T4リガ一ゼを用いる方法で置換した。得られたベクターをそれぞれ pRai-chulOIX および pRai-chu404Xと命名した。それぞれの翻訳領域の塩基配列を配列番号： 3 3および配列番号： 3 5として、また当該塩基配列から予測されるアミノ酸配列を配列番号： 3 4および配列番号： 3 6として示す。実施例 1 0 Rai- chulOIXおよび Rai- chu404Xを発現する C0S1細胞における Ras 活性化の可視化

C0S1細胞をガラス底の培養皿に巻きなおす。実施例 9で得られた Rai-chulOIX および Rai-chu404Xを COS 1細胞に、定法に従いトランスフヱクトした。 24時間後に、実施例 1の（5 ) に記載の蛍光顕微鏡システムで観察した。 EGF添加による細胞内における ECFPおよび EYFPの蛍光強度比（EYFP/ECFP ) の経時的変化の結果を第 2 8図に示す。本図では蛍光比の高いところを赤で、低いところを青色で表し、 ECFPの蛍光強度を明度として表わす IMD モードを用いて図を提示している。すなわち、原図においては赤いところが Ras あるいは Raplの活性化が高い部位を示している。第 2 8図では細胞増殖因子による刺激で Ras が細胞の周辺部より活性化され、 Raplは核周囲から活性化される様子が画像化できた。同様の実験を、細胞がやや密集した状態で行うと、第 2 9図に示すように、細胞が接触した部位においては Ras の活性化が起きず、細胞が接触していないところにおいて辺縁部より Ras が活性化されることが明らかとなった。このように、本発明の活性モ二夕—タンパク質を用いることにより、細胞内で R _a sプアミリー Gタンパク質の活性に関する時間的、空間的情報を取得することができる。実施例 1 1 Rai-chulOIXおよび Rai-chu404Xを発現する PC12細胞における Ras 活性化の可視化

ガラス底の培養皿に増殖している PC12細胞に、実施例 9 で得られた Rai- chulOl Xおよび Rai- chu404Xを定法に従いトランスフエクトし、実施例 1の（5 ) に記載の蛍光顕微鏡システムで観察した。神経成長因子にて添加による細胞内における ECFPおよび EYFPの蛍光強度比（EYFP/ECFP ) の経時的変化の結果を第 3 0図に示す。原図では蛍光比の高いところを赤で、低いところを青色で表し、 ECFPの蛍光強度を明度として表わす IMD モードを用いて図を提示している。すなわち、原図においては赤いところが Ras あるいは Raplの活性化が高い部位を示している。 PC12細胞の神経様分化においては、分化の誘導期には Ras は細胞体で辺縁部から活性化されるのに対し、分化が完成した時期においては、細胞の生存に必要な Ra s の活性は神経突起においてのみ維持されていることがわかった。すなわち、 Ra s の活性化が細胞の分化の段階により、細胞内の異なる部位で起きていることが明らかとなった。 Ras とは全く対照的に Raplは神経成長因子の添加により核周囲ぶより活性化され、分化した神経突起においてはその活性は低く抑えられていることが明らかとなった。これは Ras ファミリー G タンパク質の活性が細胞内の異なる場所では異なる制御を受けていることを示すものである。配列表フリーテキスト

配列番号： 1は、制限酵素 X h 0 Iの切断部位の塩基配列とヒト H— R a sの塩基配列を基にデザインしたプライマ一の塩基配列である。

配列番号： 2は、ヒト c— R a f 1の塩基配列とヒト H _ R a sの塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。

配列番号： 3は、制限酵素 K p n Iの切断部位の塩基配列とヒト c一 R a f 1 の塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。

配列番号： 4は、制限酵素 N 0 t Iの切断部位の塩基配列とヒト c— R a f 1 の塩基配列を基にデザインしたプライマ一の塩基配列である。

配列番号： 5は、 p B 1 u e s c r i p t— S K I I (+) のマルティブルクローニングサイトの 5 ' 側の塩基配列を基にデザインしたプライマ一の塩基配列め。

配列番号： 6は、 p B 1 u e s c r i p t— S K I I ( +) のマルティブルクローニングサイトの 3 ' 側の塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列であ。

配列番号： 7は、制限酵素 B a mH Iの切断部位の塩基配列と E Y F Pの塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。配列番号： 8は、制限酵素 BamHI、 Kpn Iおよび X ho Iの各々の切断部位の塩基配列と E C F Pの塩基配列を基にデザィンしたプライマ一の塩基配列である。

配列番号： 9は、制限酵素 No t Iの切断部位の塩基配列と E C F Pの塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。

配列番号： 10は、制限酵素 Bg l I Iの切断部位の塩基配列と EC FPの塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。

配列番号： 1 1は、ヒト H— Ra s、ヒト c— Ra f 1、 EYFPおよび EC F Pの各塩基配列を基にデザィンしたプラスミドの塩基配列である。

配列番号： 12は、配列番号： 1 1のプラスミドの塩基配列から予測されるァミノ酸配列である。

配列番号： 13は、制限酵素 X h 0 Iの切断部位の塩基配列とヒト R a p 1 A の塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。

配列番号： 14は、ヒト Ra 1 GDSの塩基配列とヒト Ra p 1 Aの塩基配列を基にデザインしたプライマ一の塩基配列である。

配列番号： 15は、ヒト R a 1 GDSの塩基配列を基にデザインしたプライマ一の塩基配列である。

配列番号： 16は、制限酵素 N 0 t Iの切断部位の塩基配列とヒト R a 1 G D Sの塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。

配列番号： 17は、制限酵素 BamHI、 Kpn Iおよび X ho Iの各々の切断部位の塩基配列と E C F Pの塩基配列を基にデザィンしたプライマ一の塩基配列である。

配列番号： 18は、ヒト Ra p 1 A、ヒト Ra 1 GDS、 EYFPおよび EC F Pの各塩基配列を基にデザィンしたプラスミドの塩基配列である。

配列番号： 19は、配列番号： 18のプラスミドの塩基配列から予測されるァミノ酸配列である。配列番号： 20は、制限酵素 X h 0 Iの切断部位の塩基配列とヒト R— R a s の塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。

配列番号： 21は、制限酵素 K p n Iの切断部位の塩基配列とヒト R— R a s の塩基配列を基にデザインしたプライマ一の塩基配列である。

配列番号： 22は、ヒト R— Ra s、ヒト c一 Ra i l、 EYFPおよび EC F Pの各塩基配列を基にデザィンしたプラスミドの塩基配列である。

配列番号： 23は、配列番号： 22のプラスミドの塩基配列から予測されるァミノ酸配列である。

配列番号： 24は、ヒト H— R a sの塩基配列を基にデザインしたプライマ一の塩基配列である。

配列番号： 25は、ヒト H— Ra sの塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。

配列番号： 26は、ヒト H-Ras、ヒト c— Ra f l、 EYFPおよび EC F Pの各塩基配列を基にデザィンしたプラスミドの塩基配列である。

配列番号： 27は、配列番号： 26のプラスミドの塩基配列から予測されるァミノ酸配列である。

配列番号： 28は、ヒト c— Ra f 1のヒト H— R a s結合領域の塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。

配列番号： 29は、 ECFPの塩基配列を基にデザインしたプライマ一の塩基配列である。

配列番号： 30は、ヒト Ra p 1 A、ヒト c -Ra f 1、 EYFPおよび EC F Pの各塩基配列を基にデザィンしたプラスミドの塩基配列である。

配列番号： 31は、配列番号： 30のプラスミドの塩基配列から予測されるァミノ酸配列である。

配列番号： 32は、 ECFPの塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。配列番号： 33は、ヒト H— Ra s、ヒト c— Ra f l、 EYFP、 ECFP およびヒト K— Ra sの各塩基配列を基にデザインしたプラスミドの塩基配列でめる o

配列番号： 34は、配列番号： 33のプラスミドの塩基配列から予測されるァミノ酸配列である。

配列番号： 35は、ヒト Rap 1 A、ヒト c— Ra f 1、 EYFP、 ECFP およびヒト K一 Ra sの各塩基配列を基にデザインしたプラスミドの塩基配列である。

配列番号： 36は、配列番号： 35のプラスミドの塩基配列から予測されるァミノ酸配列である。産業上の利用可能性

本発明によれば、非侵襲的な低分子量 G TP結合タンパク質の活性化の測定を可能にする低分子量 GT P結合夕ンパク質の活性モニタータンパク質、該夕ンパク質を発現し、非侵襲的な低分子量 GTP結合タンパク質の活性化の測定に有用な細胞およびトランスジエニック動物、前記タンパク質を用いる低分子量 GTP 結合タンパク質の活性化を測定する方法、より詳しくは生細胞においても使用可能な、低分子量 G T P結合タンパク質の G T P結合型と G D P結合型の量比を測定する方法、ならびに低分子量 GTP結合タンパク質の活性調節物質のスクリーユング方法が提供される。

Claims

請求の範囲

1. 低分子量 GTP結合タンパク質の全部または一部、該低分子量 GTP結合タンパク質の標的タンパク質の全部または一部、 GFPTクセプタータンパク質の全部または一部、及び GFPドナ一タンパク質の全部または一部が、各タンパク質の機能を発揮し得る状態で直接または間接的に連結されてなる融合タンパク質からなる低分子量 GTP結合タンパク質の活性モニタータンパク質。

2. さらに、細胞内局在シグナルを付加してなる請求項 1記載の低分子量 GT P結合夕ンパク質の活性モニタータンパク質。

3. さらに、低分子量 GTP結合タンパク質と標的タンパク質との間にスぺーサ一となるペプチドを有してなる請求項 1または 2記載の低分子量 G T P結合夕ンパク質の活性モニタ一タンパク質。

4. 低分子量 GTP結合タンパク質が R a sスーパーファミリーに属するものである請求項 1〜 3いずれか記載の低分子量 GT P結合夕ンパク質の活性モニタ —タンパク質。

5. 低分子量 G TP結合タンパク質が R a sフアミリーに属するものである請求項 1〜4いずれか記載の低分子量 G TP結合夕ンパク質の活性モニタータンパク質。

6. 低分子量 GTP結合タンパク質が H— Ra s、 K一 Ra s、 N— Ra s、 R— R a s、 R a p 1 A、 R a p 1 B、 R a p 2 A、および R a p 2 Bからなる群より選ばれる 1種である請求項 1〜 5いずれか記載の低分子量 GT P結合夕ンパク質の活性モニタ一タンパク質。

7. 標的タンパク質が R a f または Ra 1 GD Sである請求項 1〜 6いずれか記載の低分子量 GTP結合タンパク質の活性モニタ一タンパク質。

8. GFPァクセプタータンパク質が EGFPまたは EYFPである請求項 1 〜 7いずれか記載の低分子量 G T P結合タンパク質の活性モニタータンパク質。

9. GFPドナ一タンパク質が ECFPまたは EBFPである請求項 1〜8いずれか記載の低分子量 G T P結合タンパク質の活性モニタータンパク質。

1 0. 低分子量 GTP結合タンパク質および/または標的タンパク質が変異を有するものである請求項 1〜 9いずれか記載の低分子量 G TP結合タンパク質の活性モニタータンパク質。

1 1. 低分子量 GTP結合タンパク質のアミノ酸配列のァミノ末端領域およびまたはカルボキシル末端領域に少なくとも 1個のアミノ酸の欠損を有してなる請求項 1〜 1 0いずれか記載の低分子量 G TP結合夕ンパク質の活性モニター夕ンパク質。

12. GFPァクセプ夕一タンパク質および/または GFPドナータンパク質のァミノ酸配列のカルボキシル末端領域に少なくとも 1個のァミノ酸の欠損を有してなる請求項 1〜 1 1いずれか記載の低分子量 G TP結合夕ンパク質の活性モ二タータンパク質。

13. 低分子量 GTP結合タンパク質が H— Ra sであり、標的タンパク質が Ra fである請求項 1〜12いずれか記載の低分子量 GTP結合タンパク質の活性モニタ一タンパク質。

14. 低分子量 GTP結合タンパク質が Rap 1 Aであり、標的タンパク質が Ra 1 GDSである請求項 1〜12いずれか記載の低分子量 GT P結合タンパク質の活性モニタ一タンパク質。

1 5. 低分子量 GTP結合タンパク質が H— Ra sであり、標的タンパク質が Ra fであり、 GFPドナ一タンパク質が ECFPであり、 GFPァクセプター夕ンパク質が E YF Pである請求項 1〜 12いずれか記載の低分子量 G T P結合夕ンパク質の活性モニター夕ンパク質。

1 6. ァミノ末端側より、 EYFP、 H— Ra s、 Ra f, ECFPの順で直接または間接的に連結されてなる請求項 15記載の低分子量 G TP結合タンパク質の活性モニタータンパク質。

17. 低分子量 GTP結合タンパク質が Rap 1 Aであり、標的タンパク質が Ra l GDSであり、 GFPドナ一タンパク質が ECFPであり、 GFPァクセプ夕一夕ンパク質が E Y F Pである請求項 1〜 12いずれか記載の低分子量 G T P結合タンパク質の活性モニタ一タンパク質。

1 8. ァミノ末端側より、 EYFP、 Rap lA、 Ra 1 GDS, ECFPの順で直接または間接的に連結されてなる請求項 1 7記載の低分子量 G T P結合夕ンパク質の活性モニタータンパク質。

1 9. 請求項 1〜 18いずれか記載の低分子量 G TP結合夕ンパク質の活性モ二夕一タンパク質をコ一ドする遺伝子。

20. 請求項 1 9記載の遺伝子を含む発現べクタ一。

21. 発現プラスミドである請求項 20記載の発現ベクター。

22. 請求項 20または 21記載の発現べクタ一を保持してなる形質転換された細胞。

23. 請求項 20または 21記載の発現べクタ一を保持してなるトランスジェニック動物。

24. 請求項 1〜18いずれか記載の低分子量 G TP結合タンパク質の活性モ二夕一タンパク質における FRETを検出する工程を含む低分子量 GTP結合夕ンパク質の活性化を測定する方法。

25. 請求項 22記載の細胞または請求項 23記載のトランスジヱニック動物における F R E Tを検出する工程を含む低分子量 G T P結合タンパク質の活性化を測定する方法。

26. GTPの結合した低分子量 GTP結合タンパク質と、 GTPからの無機リン酸の遊離によって生じる GDPの結合した低分子量 G T P結合夕ンパク質とを測定して GTPZGDP比（モル比）を算出する工程をさらに含む請求項 25 記載の低分子量 G T P結合タンパク質の活性化を測定する方法。

27. (a)請求項 22記載の細胞と被検物質とを接触させる工程、ならび (： ( b ) 低分子量 G T P結合タンパク質の活性の変化を検出する工程、

を含む、低分子量 GTP結合タンパク質の活性調節物質のスクリーニング方法。