KR101105189B1 - 중증급성호흡기증후군 바이러스의 뉴클레오캡시드와 세포막단백질간의 상호작용 측정방법 및 항-사스 바이러스활성을 갖는 물질의 검색방법 - Google Patents

중증급성호흡기증후군 바이러스의 뉴클레오캡시드와 세포막단백질간의 상호작용 측정방법 및 항-사스 바이러스활성을 갖는 물질의 검색방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 중증급성호흡기증후군(SARS, Severe Acute Respiratory Syndrome, 사스) 바이러스의 뉴클레오캡시드(Nucleocapsid) 단독 또는 이것과 세포막(Membrane) 단백질간의 상호작용 측정방법과 항-사스 바이러스 활성을 갖는 물질의 검색방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 사스 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자 또는 뉴클레오캡시드 단백질 및 세포막 단백질을 코딩하는 유전자에 조각난 노랑형광단백질을 코딩하는 유전자를 삽입하고, 상기 유전자를 발현시켜 사스 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질간의 자가정렬(Self-assembly)을 측정하는 방법 또는 사스 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질과 세포막 단백질의 상호작용을 측정하는 방법, 및 상기 방법을 이용한 항-사스 바이러스 활성을 갖는 물질의 검색방법에 관한 것이다. 본 발명은 사스 바이러스 생성과 증식에 필요한 바이러스 단백질들간의 상호작용을 세포 수준에서 검색할 수 있는 방법을 제시함으로써, 사스 바이러스의 증식을 효과적으로 억제할 수 있는 신약 후보 물질들을 세포 수준에서 간편하게 검색할 수 있다.
사스, 저해제, 형광 현미경, 단백질 상호작용, 검색방법

Description

중증급성호흡기증후군 바이러스의 뉴클레오캡시드와 세포막 단백질간의 상호작용 측정방법 및 항-사스 바이러스 활성을 갖는 물질의 검색방법{The Determination of the Interaction between SARS Nucleocapsid and Membrane Protein, and the Screening Method for anti-SARS Drugs}
본 발명은 본 발명은 중증급성호흡기증후군(SARS, Severe Acute Respiratory Syndrome, 사스) 바이러스의 뉴클레오캡시드(Nucleocapsid) 단독 또는 이것과 세포막(Membrane) 단백질간의 상호작용 측정방법과 항-사스 바이러스 활성을 갖는 물질의 검색방법에 관한 것이다.
중증급성호흡기증후군(重症急性呼吸器症候群)은 2001년 11월경에 중국 광동지역에서 첫 환자가 발생하였으며, 그 이후로 전 세계로 확산되었다. 이 전염병은 코로나 바이러스의 변종으로 알려진 사스(SARS, Severe Acute Respiratory Syndrome) 바이러스에 의해서 발병이 되며, 고열, 기침, 호흡곤란 등의 호흡기 증상을 보인다(Lo AW et al., J Pathol. 208, 142-151, 2006; Lai MM et al., Adv Virus Res. 48, 1-100, 1997).
사스 뉴클레오캡시드 단백질은 422개의 아미노산으로 이루어져있으며, 바이러스의 구조적 구성물들 중에서 가장 중요한 단백질로서, 바이러스의 게놈을 둘러싸서 바이러스 구조를 형성하는데 중요한 역할을 하며, 인체의 다양한 단백질과 상호작용하여 다양한 세포 작용을 방해하여 바이러스 증식과 복제에 유리하게끔 작용한다고 알려져 있다. 사스 뉴클레오캡시드 단백질의 N-말단은 DNA 및 RNA와 결합할 수 있으며(Huang Q et al., Biochemistry. 43, 6059-6063, 2004), 중간 부위는 인체의 다양한 단백질들과 상호작용을 통해 여러 세포내 반응에 관여하며(Surjit M et al., J Virol. 79, 11476-11486, 2005; Fan Z et al., J Med Virol. 78, 1365-1373, 2006), 뉴클레오캡시드 단백질의 자가정렬에도 매우 중요한 역할을 한다(Luo H et al., Biochemistry,. 44, 15351-15358, 2005). C-말단 부위는 뉴클레오캡시드 단백질의 자가정렬(Yu IM et al., J Biol Chem. 280, 23280-23286, 2005; Luo H et al., Biochemistry. 45, 11827-11835, 2006)과 사스 세포막 단백질의 C-말단 부위와의 상호결합작용에 중요한 역할을 한다(Fang X et al., J Biochem Mol Biol. 38, 381-385, 2005; Luo H et al., Int J Biochem Cell Biol. 38, 589-599, 2006). 사스 뉴클레오캡시드는 사스 단백질들 중에서 유일하게 인산화되는 단백질로서 인산화는 DNA의 결합에 영향을 미치며, 세포내 여러 단백질과의 상호작용에도 영향을 미치지만 인산화 부위와 정확한 조절기작은 알려져 있지 않다(Surjit M et al., J Virol. 79, 11476-11486, 2005).
사스 세포막(Membrane) 단백질은 221개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 3 개의 세포막 투과 지역을 가지고 있다. C-말단 부위는 사스 뉴클레오캡시드 단백질과 상호결합작용을 함으로써 사스 바이러스의 구조를 형성하는 요소로서 중요한 역할을 한다(Fang X et al., J Biochem Mol Biol. 38, 381-385, 2005; Luo H et al., Int J Biochem Cell Biol. 38, 589-599, 2006; He R et al., Virus Res. 105, 121-125, 2004). 사스 세포막 단백질의 발현은 세포의 NF-kappaB를 활성화하며, 세포사멸을 유도한다(Fang X et al., J Med Virol. 79, 1431-1439, 2007).
사스 바이러스에 대한 신약 개발의 연구가 활발히 진행되고 있다. 방대한 항체 목록으로부터 사스 뉴클레오캡시드 단백질을 인지하는 항체 스크리닝에 관한 연구를 통해 항-사스 바이러스 항체를 찾아내는 연구가 진행되고 있으며, 강력한 살균력을 갖고 있는 천연 물질과 나노 크기 입자로 합성된 복합 나노 물질에 관한 연구가 진행되고 있다. 리노바이러스 치료제로 알려진 Ruprintrivir는 바이러스 3C프로테아제(3C Protease)의 활성을 차단하여 바이러스의 증식을 억제한다고 보고되어 있으며, 만성 C형 간염 환자 치료에 사용되고 있는 인터페론 알파콘1(Interferon alfacon1)도 사스 바이러스에 대해 증식 저해 효과를 보인다고 보고되고 있다(Paragas J et al., Antiviral Res. 66, 99-102, 2005). 그러나, 이러한 치료제들은 사스 바이러스 증식을 효과적으로 차단하지 못하고 있다. 이러한 사스 바이러스에 대한 많은 연구에도 불구하고, 현재까지 사스 바이러스에 대한 근본적인 예방책과 효과적인 치료방법이 개발되지 않은 상태이다.
신약 개발에서 동물 세포를 대상으로 화합물의 생리활성을 측정하는 방법은 정제된 단백질의 활성을 측정하는 방법보다 화합물의 활성, 화합물의 세포 투과성, 독성을 동시에 검증할 수 있는 장점이 있어 보다 효과적인 검색방법으로 인식되고 있다. 사스 바이러스의 신약 개발에 있어서 뉴클레오캡시드와 세포막 단백질은 바이러스 구조 형성에 중요한 단백질로서 신약 개발의 좋은 후보물로 여겨지고 있다.
이에, 본 발명자들은 사스 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 자가정렬과 세포막 단백질과의 상호작용을 동물 세포에서 측정할 수 있는 방법을 개발하고, 세포에서 발현된 뉴클레오캡시드와 세포막 단백질들은 인산화, DNA 결합 등의 고유의 성질을 가지고 있기 때문에, 다양한 화합물 라이브러리로부터 효과적인 항-사스 바이러스의 효력을 갖는 신약 물질 스크리닝에 매우 유용하게 이용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 동물 세포에서 사스 바이러스의 뉴클레오캡시드와 세포막 단백질을 발현함으로써, 세포 수준에서 사스 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 자가정렬과 세포막 단백질과 뉴클레오캡시드 단백질의 상호결합작용을 측정할 수 있는 방법을 개발하여, 다양한 화합물 라이브러리로부터 효과적으로 사스 바이러스의 복제와 증식을 저해할 수 있는 물질을 탐색하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ⅰ) 사스(SARS, Severe Acute Respiratory Syndrome, 중증급성호흡기증후군) 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자에 노랑형광단백질(Yellow Fluorescence Protein, YFP) N-말단 부위를 코딩하는 유전자를 삽입하고, 또 다른 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자에 노랑형광단백질 C-말단 부위를 코딩하는 유전자를 삽입하는 단계; ⅱ) 상기 유전자를 이용하여 동물세포를 형질전환시키는 단계; ⅲ) 상기 형질전환된 동물세포에서 상기 유전자를 발현시키는 단계; 및 ⅳ) 상기 발현된 뉴클레오캡시드 단백질을 형광현미경 또는 형광분석법을 통해 형광 단백질의 분포 및 형광 세기를 측정하는 단계;를 포함하는 사스 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 자가정렬 측정방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 ⅰ) 사스 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자에 노랑형광단백질 N-말단 부위를 코딩하는 유전자를 삽입하고, 또 다른 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자에 노랑형광단백질 C-말단 부위를 코딩하는 유전자를 삽입하는 단계; ⅱ) 상기 유전자를 이용하여 동물세포를 형질전환시키는 단계; ⅲ) 상기 형질전환된 동물세포에서 상기 유전자를 발현시키고, 상기 형질전환된 동물세포에 항-사스 바이러스 활성을 가질 수 있는 시험물질을 처리하는 단계; 및 ⅳ) 형광현미경 또는 형광분석법을 통해 형광 단백질의 분포 및 형광 세기를 측정하는 단계;를 포함하는 상기 방법을 이용한 항-사스 바이러스 활성을 갖는 물질의 검색방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 ⅰ) 사스 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자에 노랑형광단백질 N-말단 부위 및 사스 바이러스의 세포막 단백질을 코딩하는 유전자에 노랑형광단백질 C-말단 부위를 코딩하는 유전자를 삽입하거나 사스 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자에 노랑형광단백질 C-말단 부위 및 사스 바이러스의 세포막 단백질을 코딩하는 유전자에 노랑형광단백질 N-말단 부위를 코딩하는 유전자를 삽입하는 단계; ⅱ) 상기 유전자를 이용하여 동물세포를 형질전환시키는 단계; ⅲ) 상기 형질전환된 동물세포에서 상기 유전자를 발현시키는 단계; 및 ⅳ) 형광현미경 또는 형광분석법을 통해 측정하는 형광 단백질의 분포 및 형광 세기를 측정하는 단계;를 포함하는 사스 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질과 세포막 단백질의 상호작용 측정방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 ⅰ) 사스 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자에 노랑형광단백질 N-말단 부위 및 사스 바이러스의 세포막 단백질을 코딩하는 유전자에 노랑형광단백질 C-말단 부위를 코딩하는 유전자를 삽입하거나 사스 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자에 노랑형광단백질 C-말단 부위 및 사스 바이러스의 세포막 단백질을 코딩하는 유전자에 노랑형광단백질 N-말단 부위를 코딩하는 유전자를 삽입하는 단계; ⅱ) 상기 유전자를 이용하여 동물세포를 형질전환시키는 단계; ⅲ) 상기 형질전환된 동물세포에서 상기 유전자를 발현시키고, 상기 형질전환된 동물세포에 항-사스 바이러스 활성을 가질 수 있는 시험물질을 처리하는 단계; 및 ⅳ) 형광현미경 또는 형광분석법을 통해 형광 단백질의 분포 및 형광 세기를 측정하는 단계;를 포함하는 상기 방법을 이용한 항-사스 바이러스 활성을 갖는 물질의 검색방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 기재되는 군중에서 선택된 전체 사스 뉴클레오캡시드(1-422 아미노산 서열)와 노랑형광단백질의 N-말단 또는 C-말단 부위를 포함하는 융합단백질, 사스 세포막 단백질과 노랑형광단백질의 N-말단 또는 C-말단 부위, 및 사스 뉴클레오캡시드의 C-말단(168-422 아미노산 서열) 부위와 노랑형광단백질의 N-말단 또는 C-말단 부위를 포함하는 융합단백질을 코딩하는 유전자 및 상기 유전자로부터 코딩되는 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 11 및 서열번호 12로 기재되는 군중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 융합단백질을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
ⅰ) 사스(SARS, Severe Acute Respiratory Syndrome, 중증급성호흡기증후군) 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자에 노랑형광단백질(Yellow Fluorescence Protein, YFP) N-말단 부위를 코딩하는 유전자를 삽입하고, 또 다른 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자에 노랑형광단백질 C-말단 부위를 코딩하는 유전자를 삽입하는 단계; ⅱ) 상기 유전자를 이용하여 동물세포를 형질전환시키는 단계; ⅲ) 상기 형질전환된 동물세포에서 상기 유전자를 발현시키는 단계; 및 ⅳ) 상기 발현된 뉴클레오캡시드 단백질을 형광현미경 또는 형광분석법을 통해 형광 단백질의 분포 및 형광 세기를 측정하는 단계;를 포함하는 사스 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 자가정렬 측정방법을 제공한다.
본 발명의 사스 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 자가정렬 측정방법에 있어서, 상기 ⅰ) 단계의 유전자는 플라스미드를 이용하는 것이 바람직하고, 이때 상기 플라스미드는 pDONR221, pFPIA-YN 및/또는 pFPIA-YC 벡터인 것이 보다 바람직하고, 상기 ⅰ) 단계의 유전자는 서열번호 13과 14 또는 서열번호 15와 14로 기재되는 프라이머를 이용하여 DNA 중합연쇄 반응법(PCR)으로 증폭되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 사스 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 자가정렬 측정방법에 있어서, 상기 뉴클레오캡시드 단백질은 단백질 전체(1-422) 또는 C-말단 부위(168-422 아미노산 서열)인 것이 바람직하고, 상기 ⅱ) 단계의 동물세포는 HEK293T 세포인 것이 바람직하며, 상기 ⅳ) 단계의 형광현미경 또는 형광분석법은 500 ㎚에서 여기 및 535 ㎚에서 방출파장을 이용하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 ⅰ) 사스 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자에 노랑형광단백질 N-말단 부위를 코딩하는 유전자를 삽입하고, 또 다른 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자에 노랑형광단백질 C-말단 부위를 코딩하는 유전자를 삽입하는 단계; ⅱ) 상기 유전자를 이용하여 동물세포를 형질전환시키는 단계; ⅲ) 상기 형질전환된 동물세포에서 상기 유전자를 발현시키고, 상기 형질전환된 동물세포에 항-사스 바이러스 활성을 가질 수 있는 시험물질을 처리하는 단계; 및 ⅳ) 형광현미경 또는 형광분석법을 통해 형광 단백질의 분포 및 형광 세기를 측정하는 단계;를 포함하는 상기 방법을 이용한 항-사스 바이러스 활성을 갖는 물질의 검색방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 ⅰ) 사스 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자에 노랑형광단백질 N-말단 부위 및 사스 바이러스의 세포막 단백질을 코딩하는 유전자에 노랑형광단백질 C-말단 부위를 코딩하는 유전자를 삽입하거나 사스 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자에 노랑형광단백질 C-말단 부위 및 사스 바이러스의 세포막 단백질을 코딩하는 유전자에 노랑형광단백질 N-말단 부위를 코딩하는 유전자를 삽입하는 단계; ⅱ) 상기 유전자를 이용하여 동물세포를 형질전환시키는 단계; ⅲ) 상기 형질전환된 동물세포에서 상기 유전자를 발현시키는 단계; 및 ⅳ) 형광현미경 또는 형광분석법을 통해 측정하는 형광 단백질의 분포 및 형광 세기를 측정하는 단계;를 포함하는 사스 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질과 세포막 단백질의 상호작용 측정방법을 제공한다.
본 발명의 사스 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질과 세포막 단백질의 상호작용 측정방법에 있어서, 상기 사스 뉴클레오캡시드 세포막 단백질은 C-말단 꼬리 부위(96-221)인 것이 바람직하고, 상기 ⅰ) 단계의 사스 뉴클레오캡시드 세포막 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 16과 서열번호 17로 기재되는 프라이머를 이용하여 DNA 중합연쇄 반응법(PCR)으로 증폭되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 ⅰ) 사스 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자에 노랑형광단백질 N-말단 부위 및 사스 바이러스의 세포막 단백질을 코딩하는 유전자에 노랑형광단백질 C-말단 부위를 코딩하는 유전자를 삽입하거나 사스 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자에 노랑형광단백질 C-말단 부위 및 사스 바이러스의 세포막 단백질을 코딩하는 유전자에 노랑형광단백질 N-말단 부위를 코딩하는 유전자를 삽입하는 단계; ⅱ) 상기 유전자를 이용하여 동물세포를 형질전환시키는 단계; ⅲ) 상기 형질전환된 동물세포에서 상기 유전자를 발현시키고, 상기 형질전환된 동물세포에 항-사스 바이러스 활성을 가질 수 있는 시험물질을 처리하는 단계; 및 ⅳ) 형광현미경 또는 형광분석법을 통해 형광 단백질의 분포 및 형광 세기를 측정하는 단계;를 포함하는 상기 방법을 이용한 항-사스 바이러스 활성을 갖는 물질의 검색방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 기재되는 군중에서 선택된 전체 사스 뉴클레오캡시드(1-422 아미노산 서열)와 노랑형광단백질의 N-말단 또는 C-말단 부위를 포함하는 융합단백질, 사스 세포막 단백질과 노랑형광단백질의 N-말단 또는 C-말단 부위, 및 사스 뉴클레오캡시드의 C-말단(168-422 아미노산 서열) 부위와 노랑형광단백질의 N-말단 또는 C-말단 부위를 포함하는 융합단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자로부터 코딩되는 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 11 및 서열번호 12로 기재되는 군중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 융합단백질을 제공한다.
본 발명은 중증급성호흡기증후군(重症急性呼吸器症候群, Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS)을 유발하는 바이러스의 뉴클레오캡시드의 자가정렬(self-assembly)과 세포막 단백질과의 상호결합작용을 형광현미경으로 측정하며, 형광분석법을 이용하여 정량화함으로서 다양한 화합물 라이브러리로부터 사스 바이러스의 증식과 복제를 억제하는 항-사스 바이러스 약물을 편리하고 빠르게 검색할 수 있는 시스템을 제시한다. 구체적으로, 본 발명은 N-말단과 C-말단 부위를 포함하도록 각각 절편화된 노랑형광단백질(Yellow Fluorescence Protein, YFP)의 N-말단 부분에 뉴클레오캡시드 단백질의 전체(1-422) 혹은 C-말단(168-422) 부위를 삽입한 재조합단백질과, 혹은 사스 세포막 단백질의 C-말단(96-221) 부위를 절편화된 노랑형광단백질의 N-말단에 삽입하여 만들어진 재조합단백질을 인간 동물세포(HEK293T)에서 발현시킨 후, 세포 내에서 발현된 재조합 단백질들의 상호 작용에 의해 절편화된 노랑형광단백질이 재결합하여 원래의 활성화 상태의 노랑형광단백질로 3차원 구조가 재조합 되었을 때 발생하는 형광을 형광현미경과 형광분석법을 이용하여 결정한다.
사스 바이러스가 감염된 세포에서 사스 뉴클레오캡시드 단백질은 사스 캡시드를 구성하는 중요한 단백질로서 자가정렬을 통해서 밀집된 캡시드를 형성한다. 또한 뉴클레오캡시드의 C-말단 부위는 사스 세포막 단백질의 C-말단과 선택적인 결합을 형성하여 완성된 사스 바이러스 입자를 만들어 낸다. 따라서 사스 뉴클레오캡시드 단백질간의 자가정렬과, 뉴클레오캡시드와 세포막 단백질 간의 특이적 결합을 세포 수준에서 측정할 수 있다면 이들 단백질의 상호 작용을 억제하는 화합물들 을 효과적으로 검색할 수 있을 것이다. 이러한 검색방법을 통해 검색된 화합물들은 사스 바이러스의 복제와 증식을 효과적으로 억제할 수 있는 기능을 가질 것이며, 사스 바이러스에 의해서 유발되는 중증급성호흡기증후군의 치료제로서 개발될 수 있다.
전체 사스 뉴클레오캡시드(1-422 아미노산 서열)와 노랑형광단백질의 N-혹은 C-말단 부위를 포함하는 융합단백질은 서열번호 1과 2로 기재되는 염기서열에 의해 코딩되는 서열번호 3과 4의 아미노산 서열을 갖는다. 사스 세포막 단백질과 노랑형광단백질의 N-혹은 C-말단 부위를 포함하는 융합단백질은 서열번호 5와 6으로 기재되는 염기서열에 의해 코딩되는 서열번호 7과 8의 아미노산 서열을 갖는다. C-말단 사스 뉴클레오캡시드(168-422 아미노산 서열)와 노랑형광단백질의 N-혹은 C-말단 부위를 포함하는 융합단백질은 서열번호 9와 10으로 기재되는 염기서열에 의해 코딩되는 서열번호 11과 12의 아미노산 서열을 갖는다.
상기의 융합단백질을 코딩하는 DNA를 pFPIA-YN 혹은 pFPIA-YC 벡터에 삽입하여 뉴클레오캡시드와 세포막 단백질을 동시에 동물세포에서 발현될 수 있는 발현 벡터들을 제조하였다. 구체적으로, NCL-YN는 노랑형광단백질(YFP)의 N-말단의 부위의 서열을 포함하는 절편화된 노랑형광단백질(YFP-N)의 N-말단에 사스 뉴클레오캡시드의 전체 서열(1~422)이 삽입되어있고, YFP-N의 C-말단에 FLAG 꼬리가 삽입된 형태이다(도 1 참조). NCL-Yc는 노랑형광단백질의 C-말단 부위의 서열을 포함하는 절편화된 노랑형광단백질(YFP-C)의 N-말단에 뉴클레오캡시드 전체 서열(1~422)이 삽입되어 있고, YFP-C의 C-말단에 HA 꼬리가 삽입된 형태이다(도 1 참조). 또한, 뉴클레오캡시드의 C-말단 부위(168-422)는 단백질의 자가정렬에 매우 중요한 부위이므로 이 부분만 발현되는 재조합단백질을 제조하였다. 구체적으로, YFP-N 혹은 YFP-C의 N-말단에 168-422 부위의 뉴클레오캡시드(NCC)를 삽입하여 NCC-YN 혹은 NCC-YC의 재조합 단백질을 제조하였다(도 1 참조). 또한, 사스 세포막 단백질의 96-221의 C-말단을 포함하는 부위(M)를 각각 YFP-N 혹은 YFP-C의 N-말단에 삽입함으로써 M-YN 혹은 M-YC의 재조합 단백질을 제조하였다(도 1 참조).
상기 발현벡터에 의해 동물세포에서 발현되는 재조합 융합단백질들이 세포내에서 상호작용을 통해서 결합하게 되면 N-말단과 C-말단으로 서로 조각난 노랑형광단백질 부위가 서로 근접하게 되어 원형의 노랑형광단백질 형태를 갖추게 되면 각각 조각난 노랑형광단백질은 형광을 내지 않지만(도 2 (가) 참조) 재결합된 노랑형광단백질은 형광을 띄게 된다(도 2 (나) 참조). 이때, 사스 뉴클레오캡시드 자가정렬이나, 뉴클레오캡시드와 세포막 단백질간의 상호 작용을 억제하는 화합물이 처리되면 조각난 노랑형광단백질들이 상호 결합을 못하게 되어 형광을 띄지 못하게 된다(도 2 (다) 참조).
조각난 노랑형광단백질이 융합된 사스 뉴클레오캡시드 전체(1-422 아미노산 서열) 혹은 C-말단 부위(168-422 아미노산 서열)를 발현하는 재조합 벡터가 동물세포에 형질 전환되어 발현되었을 때, 뉴클레오캡시드 단백질의 자가정렬에 의한 상호작용으로 인해 조각난 노랑형광단백질이 원형을 갖춤으로서 형광을 발산하는 결과를 형광 현미경을 통해 분석되었다(도 3 (가) 및 (나) 참조). 뉴클레오캡시드와 세포막 단백질 간의 상호 작용도 형광 현미경을 통해 분석되었다(도 4 (가) 및 (나) 참조).
재조합 벡터가 발현된 세포를 용해하여 형광 측정기에서 형광 세기를 측정하면 세포막 단백질간은 상호작용을 하지 않아 형광을 띄지 않았으며, 뉴클레오캡시드 단백질은 형광을 띄었다. 또한, 세포막 단백질은 전체 혹은 C-말단 부위 뉴클레오캡시드 모두에서 형광을 나타내었다(도 5 참조).
본 발명의 사스 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질의 자가정렬의 측정방법은 가) 사스 뉴클레오캡시드+노랑형광단백질 발현 재조합 발현 벡터를 동물세포 (HEK293T)에 형질전환하는 단계; 나) 형광현미경과 형광분석법을 이용하여 세포내 형광 단백질의 분포 및 형광 세기를 측정하는 단계로 구성된다.
본 발명의 사스 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질과 세포막 단백질간의 특이적 상호결합작용의 측정 방법은 가) 사스 뉴클레오캡시드+노랑형광단백질 혹은 세포막단백질+노랑형광단백질 발현 재조합 발현 벡터를 동물세포(HEK293T)에 형질전환하는 단계; 나) 형광 현미경과 형광 분석법을 이용하여 세포내 형광 단백질의 분포 및 형광 세기를 측정하는 단계로 구성된다.
본 발명은 사스 뉴클레오캡시드의 자가정렬과 뉴클레오캡시드와 세포막 단백질 간의 상호작용을 형광분석법을 이용하여 측정함으로써 사스 바이러스 증식 억제 물질의 검색에 이용될 수 있으며, 정제된 단백질을 이용한 상호작용 측정법과는 달리 세포에서 단백질 합성 후 발생하는 다양한 변형이 보존된 원형 그대로의 형태로 단백질 활성을 측정할 수 있는 장점이 있다. 또한, 본 발명의 검색방법이 96-웰 플레이트 등을 이용하여 수행되면 다수 화합물의 활성을 동시에 측정할 수 있으므로 사스 바이러스의 증식 억제활성 물질을 검색하는 방법으로 활용할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 치환 및 균등한 타 실시예로 변경할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 명백할 것이다.
<실시예 1> 발현벡터 제조
<1-1> 사스 뉴클레오캡시드 발현 유전자의 제조
사스 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자는 연세대학교 생명공학과 오종원 교수로부터 제공 받았다. 사스 단백질을 동물세포에서 발현시키는 플라스미드인 pFPIA-YN와 pFPIA-YC, 그리고 Entry vector로 사용된 pDONR221(Invitrogen Inc, USA) 벡터는 연세대학교 의과대학 허만욱 교수로부터 제공 받았다. 사스 뉴클레오캡시드 단백질 전체(1-422) 혹은 C-말단 부위(168-422 아미노산 서열)에 대 한 유전자를 주형으로 하고, 서열번호 13과 14 혹은 서열번호 15와 14로 기재되는 프라이머를 이용하여 DNA 중합연쇄 반응법(PCR)으로 95℃, 30초; 56℃, 30초; 72℃, 1분의 주기로 30회 반복하여 합성한 후, 아가로스겔에서 원하는 밴드를 분리 정제하였다. 정제된 PCR 산물은 BP 클로나제(BP clonase)에 의해 25℃에서 12시간 반응하여 pDONR221 벡터로 삽입되어 pDONR N1-1266 혹은 pDONR502-1266의 벡터를 제조하였다. 상기 정제된 벡터를 pFPIA-YN 혹은 pFPIA-YC 벡터와 섞은 후, LR 클로나제(LR clonase)로 25℃에서 12시간 반응하여 각각 pFPIA-YN-N1-1266, pFPIA-YC-N1-1266, pFPIA-YN-N502-1266, pFPIA-YC-N502-1266의 벡터를 제조하였다. 상기 제조된 벡터들은 정제된 후, 염기서열분석기를 통해 서열을 확인하였다(도 1).
사스 뉴클레오캡시드 단백질 유전자의 전체(1-1266 유전자 서열) 혹은 C-말단(502-1266 유전자 서열)의 유전자 서열이 entry vector로 사용된 pDONR221 벡터에 삽입된 형태인 pDONR N1-1266 혹은 pDONR502-1266은 pDONR221(Invitrogen Inc.) 벡터 내부의 attP1와 attP2의 사이에 재조합을 통해 각각 삽입되어있다. 사스 뉴클레오캡시드 유전자의 전체(1-1266 유전자 서열) 혹은 C-말단 502-1266 유전자 서열)의 유전자 서열은 동물세포 발현 벡터로 사용된 pFPIA-YN 혹은 pFPIA-YC 벡터에 삽입되어 pFPIA-YN-N1-1266(도 1 NCL-YN, 서열번호 1), pFPIA-YC-N1-1266(도 1 NCL-YC, 서열번호 2), pFPIA-YN-N502-1266(도 1 NCC-YN, 서열번호 9), pFPIA-YC-N502-1266(도 1 NCC-YC, 서열번호 10)의 형태로 제조되었다. pFPIA-YN-N1-1266(도 1 NCL-YN)은 사스 뉴클레오캡시드 전체 서열과 그것의 C-말단에 노랑형광단백질 N-말 단(1-154 아미노산 서열)과 Flag 태그가 삽입되어 있으며, pFPIA-YC-N1-1266(도 1 NCL-YC)은 사스 뉴클레오캡시드 전체 서열과 그것의 C-말단에 노랑형광단백질 C-말단(155-238 아미노산 서열)과 HA 태그가 삽입되어 있는 형태이다. pFPIA-YN-N502-1266(도 1 NCC-YN)은 사스 뉴클레오캡시드 C-말단 서열과 그것의 C-말단에 노랑형광단백질 N-말단(1-154 아미노산 서열)과 Flag 태그가 삽입되어 있으며, pFPIA-YC-N502-1266(도 1 NCC-YC) 사스 뉴클레오캡시드 C-말단 서열과 그것의 C-말단에 노랑형광단백질 C-말단(155-238 아미노산 서열)과 HA 태그가 삽입되어 있다.
<1-2> 사스 세포막 발현 유전자의 제조
사스 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자는 연세대학교 생명공학과 오종원 교수로부터 제공 받았다. 사스 세포막 단백질의 C-말단 꼬리 부위(96-221)의 유전자를 주형으로 하고, 서열번호 16과 서열번호 17로 기재되는 프라이머를 이용하여 DNA 중합연쇄 반응법(PCR)으로 95℃, 30초; 56℃, 30초; 72℃, 1분의 주기로 30회 반복하여 합성한 후 아가로스겔에서 원하는 밴드를 분리 정제하였다. 정제된 PCR 산물은 BP 클로나제(BP clonase)에 의해 25℃에서 12시간 반응하여 pDONR221 벡터로 삽입되어 pDONR M96-221의 벡터를 제조하였다. 정제된 벡터를 pFPIA-YN 혹은 pFPIA-YC 벡터와 섞은 후, LR 클로나제(LR clonase)로 25℃에서 12시간 반응하여 각각 pFPIA-YN-M96-221, pFPIA-YC-N96-221의 벡터를 제조하였다. 상기 제조된 벡터들은 정제된 후, 염기서열분석기를 통해 서열을 확인하였다(도 1).
사스 세포막 유전자의 C-말단(96-221 유전자 서열)의 유전자 서열이 entry vector로 사용된 pDONR221 벡터에 삽입된 형태인 pDONR M96-221은 pDONR221 (Invitrogen Inc.) 벡터 내부의 attP1와 attP2의 사이에 재조합을 통해 각각 삽입되어 있다. 사스 세포막 단백질 유전자의 C-말단(96-221 유전자 서열)의 유전자 서열은 동물세포 발현 벡터로 사용된 pFPIA-YN 혹은 pFPIA-YC 벡터에 삽입되어 pFPIA-YN-M96-221(도 1 M-YN, 서열번호 5)과 pFPIA-YC-M96-221(도 1 M-YC, 서열번호 6)의 형태로 제조되었다. pFPIA-YN-M96-221(도 1 M-YN)은 사스 세포막 단백질의 C-말단 서열과 그것의 C-말단에 노랑형광단백질 N-말단(1-154 아미노산 서열)과 Flag 태그가 삽입되어 있으며, pFPIA-YC-M96-221(도 1 M-YC)은 사스 뉴클레오캡시드 전체 서열과 그것의 C-말단에 노랑형광단백질 C-말단(155-238 아미노산 서열)과 HA 태그가 삽입되어 있는 형태이다.
<실시예 2> 동물세포에서의 형질전환
<2-1> 동물세포의 배양
HEK293T(Human Embryonic Kidney) 동물세포는 ATCC로 구입되었다. 인간동물 세포인 HEK293T 세포는 5% CO2와 37℃ 조건하에서 10% FBS(우태아 혈청, fetal bovine serum)이 포함된 Dulbecco's modified Eagle's medium(Gibco)에서 배양하였다. 세포는 90%의 밀도에서 25%가 되도록 나누어 주면서 계대배양을 유지하면서형질전환을 위하여 준비하였다.
<2-2> 동물세포의 형질전환
상기 실시예 2-1에서 배양된 HEK293T 세포를 형질전환 하루 전날 6-웰 플레이트에 90% 밀도조건이 되도록 배양하였다. 사스 뉴클레오캡시드 단백질의 자가정렬을 측정하기 위하여, Lipofectamine 2000(Invitrogen)을 이용하여 상기 실시예 1-1에서 제조한 pFPIA-YN-N1-1266과 pFPIA-YC-N1-1266을 1:1(1.6 ㎍: 1.6 ㎍)의 비율로 그리고, pFPIA-YC-N502-1266과 pFPIA-YC-N502-1266을 1:1(1.6 ㎍: 1.6 ㎍)의 비율로 섞어서 상기 HEK293T 세포에 감염시켰다.
사스 뉴클레오캡시드와 세포막 단백질간의 상호작용을 측정하기 위하여 실시예 1-2에서 제조한 pFPIA-YC-M96-221을 각각 pFPIA-YN-N1-1266 혹은 pFPIA-YN-N502-1266과 1:1(1.6 ㎍: 1.6 ㎍)의 비율로 섞어준 후 상기 HEK293T 세포에 감염시켰다. 이렇게 형질 전환된 세포를 5% CO2와 37℃ 조건하에서 48시간 동안 배양하였다.
<실시예 3> 형광현미경을 이용한 세포영상 측정
상기 실시예 2-2에서 형질전환된 HEK293T 세포가 자라는 플레이트를 실온의 인산완충용액으로 2회 세척한 후 노랑형광단백질 형광을 관찰할 수 있는 파장(excitation=500 ㎚, emission=535 ㎚)의 필터가 장착된 형광현미경을 이용하여 세포를 관찰하였다.
형질전환된 HEK293T 세포가 형광을 나타낸 것은 사스 바이러스의 뉴클레오캡시드 자가정렬 측정과, 뉴클레오캡시드와 세포막 단백질의 상호결합작용의 측정 방법에 관한 원리를 도 2에 기재된 모식도와 같이 나타낼 수 있다. 그 결과, 조각난 노랑형광단백질이 융합된 사스 뉴클레오캡시드 전체(1-422 아미노산 서열) 혹은 C-말단 부위(168-422 아미노산 서열)를 발현하는 재조합 벡터가 동물세포에 형질전환되어 발현되었을 때, 뉴클레오캡시드 단백질의 자가정렬에 의한 상호작용으로 인해 조각난 노랑형광단백질이 원형을 갖춤으로서 형광을 발산하는 결과를 형광 현미경을 통해 분석되었다(도 3 (가) 및 (나)). 사스 뉴클레오캡시드 전체 서열과 그것의 C-말단에 노랑형광단백질의 N-말단 혹은 C-말단이 결합된 형태의 재조합 단백질인 NCL-YN 과 NCL-YC가 동물세포에서 동시에 발현되었을 때, 사스 뉴클레오캡시드는 서로 강한 결합 작용을 통해 조각난 노랑형광단백질이 서로 인접하게 됨으로서 상호 결합을 통해 완전한 노랑형광단백질의 모습을 갖춤으로서 세포 영상에서 형광을 나타내었다(도 3 (가)). 사스 뉴클레오캡시드 C-말단 서열과 그것의 C-말단에 노랑형광단백질의 N-말단 혹은 C-말단이 결합된 형태의 재조합 단백질인 NCC-YN 과 NCC-YC가 동물세포에서 동시에 발현되었을 때, 사스 뉴클레오캡시드 C-말단은 서로 강한 결합 작용을 통해 조각난 노랑형광단백질이 서로 인접하게 됨으로서 상호 결합을 통해 완전한 노랑형광단백질의 모습을 갖춤으로서 세포 영상에서 형광을 나타내었다(도 3 (나)). 노랑형광단백질의 N-말단과 C-말단을 포함하는 뉴클레오캡시드와 세포막 단백질 간의 상호 작용도 형광 현미경을 통해 분석되었다(도 4 (가) 및 (나)). 사스 뉴클레오캡시드 전체 서열과 그것의 C-말단에 노랑형광단백질의 N-말단이 결합된 형태의 재조합 단백질인 NCL-YN과 사스 세포막 단백질의 C-말단과 그것의 C-말단에 노랑형광단백질의 C-말단이 삽입된 형태의 재조합 단백질인 M-YC가 동물세포에서 동시에 발현되었을 때, 사스 뉴클레오캡시드와 세포막 단백질은 서로 강한 결합 작용을 통해 조각난 노랑형광단백질이 서로 인접하게 됨으로서 상호 결합을 통해 완전한 노랑형광단백질의 모습을 갖춤으로서 세포 영상에서 형광을 나타내었다(도 4 (가)). 사스 뉴클레오캡시드 C-말단 서열과 그것의 C-말단에 노랑형광단백질의 C-말단이 결합된 형태의 재조합 단백질인 NCS-YC과 사스 세포막 단백질의 C-말단과 그것의 C-말단에 노랑형광단백질의 N-말단이 삽입된 형태의 재조합 단백질인 M-YN가 동물세포에서 동시에 발현되었을 때, 사스 뉴클레오캡시드와 세포막 단백질은 서로 강한 결합 작용을 통해 조각난 노랑형광단백질이 서로 인접하게 됨으로서 상호 결합을 통해 완전한 노랑형광단백질의 모습을 갖춤으로서 세포 영상에서 형광을 나타내었다(도 4 (나)).
<실시예 4> 형광분석법을 이용한 형광 세기 측정
상기 실시예 2-2에서 형질전환된 HEK293T 세포가 자라는 플레이트를 실온의 인산완충용액으로 2회 세척한 후, 각각의 웰에 1% NP-40가 포함된 인산완충액에 4ㅀC에서 1시간 동안 세포를 분해시킨 후, 용액을 모아 13,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액을 분리하였다. 분리된 상층액을 96-웰 플레이트에 넣어, 형광 분석기를 통해 500 ㎚ excitation, 535 ㎚ emission으로 형광의 세기를 측정하였다.
이와 같이, 상기 형질전환된 HEK293T 세포에서 사스 뉴클레오캡시드 재조합 융합단백질의 자가정렬과, 뉴클레오캡시드와 세포막 재조합 융합단백질간의 상호결합작용을 형광분석법으로 측정할 수 있었다. 그 결과, 재조합 벡터가 발현된 세포를 용해하여 형광 측정기에서 형광 세기를 측정하면 세포막 단백질간은 상호작용을 하지 않아 형광을 띄지 않았으며, 뉴클레오캡시드 단백질은 형광을 띄었다. 또한, 세포막 단백질은 전체 혹은 C-말단 부위 뉴클레오캡시드 모두에서 형광을 나타내었다(도 5). 대조 실험으로 사용된 Jun과 Fos는 연세대학교 의과대학 허만욱 교수로부터 제공받았다. Jun 과 Fos는 상호작용을 통해 형광을 나타낸다고 알려져 있으며, 형광 측정시 50,000 정도의 형광 세기를 나타내었다(도 5, 첫 번째 막대). 사스 뉴클레오캡시드의 전체 서열 단백질(NL+NL)은 서로 강한 상호 작용을 통해 20,000 정도의 형광 세기를 나타내었다(도 5, 두 번째 막대). 사스 뉴클레오캡시드의 C-말단 서열 단백질들(NS+NS)은 서로 강한 상호 작용을 통해 18,000 정도의 형광 세기를 나타내었다(도 5, 세 번째 막대). 세포막 단백질은 사스 뉴클레오캡시드 전체(도 5, 네 번째 막대), 혹은 C-말단(도 5, 다섯 번째 막대) 단백질과 상호 작용을 통해 각각 22,000 혹은 23,000 정도의 형광 세기를 나타내었다. 반면, 세포막 단백질 간에는 상호 작용을 하지 않았고, 형광의 세기를 전혀 나타내지 않았다(도 5, 여섯 번째 막대).
도 1은 절편화된 노랑형광단백질의 N-말단에 사스 바이러스 뉴클레오캡시드와 세포막 단백질의 아미노산 서열이 연결되어 만들어지는 재조합 융합단백질의 구조를 나타낸 모식도이다.
도 2는 사스 바이러스의 뉴클레오캡시드 자가정렬 측정과, 뉴클레오캡시드와 세포막 단백질의 상호결합작용의 측정 방법에 관한 원리를 나타낸 모식도이다.
도 3은 동물세포에서 발현된 사스 뉴클레오캡시드 재조합 융합단백질의 자가정렬을 형광 현미경으로 측정한 결과이다.
도 4는 동물세포에서 발현된 사스 뉴클레오캡시드와 세포막 재조합 융합단백질의 상호결합작용을 형광 현미경으로 측정한 결과이다.
도 5는 사스 뉴클레오캡시드 재조합 융합단백질의 자가정렬과, 뉴클레오캡시드와 세포막 재조합 융합단백질간의 상호결합작용을 형광분석법으로 측정한 결과이다
<110> Kookmin University Industry Academy Cooperation Foundation <120> The Determination of the Interaction between SARS Nucleocapsid and Membrane Protein, and the Screening Method for anti-SARS Drugs <130> DPP08-0467 <140> 10-2008-0053761 <141> 2008-06-09 <160> 17 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1887 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gene Coding SARS Nucleocapsid and Yellow Fluorescence Protein N-terminus <400> 1 atggtacttg cggccgcgaa ttcatcgatc acaagtttgt acaaaaaagc aggcttcatg 60 tctgataatg gaccccaatc aaaccaacgt agtgcccccc gcattacatt tggtggaccc 120 acagattcaa ctgacaataa ccagaatgga ggacgcaatg gggcaaggcc aaaacagcgc 180 cgaccccaag gtttacccaa taatactgcg tcttggttca cagctctcac tcagcatggc 240 aaggaggaac ttagattccc tcgaggccag ggcgttccaa tcaacaccaa tagtggtcca 300 gatgaccaaa ttggctacta ccgaagagct acccgacgag ttcgtggtgg tgacggcaaa 360 atgaaagagc tcagccccag atggtacttc tattacctag gaactggccc agaagcttca 420 cttccctacg gcgctaacaa agaaggcatc gtatgggttg caactgaggg agccttgaat 480 acacccaaag accacattgg cacccgcaat cctaataaca atgctgccac cgtgctacaa 540 cttcctcaag gaacaacatt gccaaaaggc ttctacgcag agggaagcag aggcggcagt 600 caagcctctt ctcgctcctc atcacgtagt cgcggtaatt caagaaattc aactcctggc 660 agcagtaggg gaaattctcc tgctcgaatg gctagcggag gtggtgaaac tgccctcgcg 720 ctattgctgc tagacagatt gaaccagctt gagagcaaag tttctggtaa aggccaacaa 780 caacaaggcc aaactgtcac taagaaatct gctgctgagg catctaaaaa gcctcgccaa 840 aaacgtactg ccacaaaaca gtacaacgtc actcaagcat ttgggagacg tggtccagaa 900 caaacccaag gaaatttcgg ggaccaagac ctaatcagac aaggaactga ttacaaacat 960 tggccgcaaa ttgcacaatt tgctccaagt gcctctgcat tctttggaat gtcacgcatt 1020 ggcatggaag tcacaccttc gggaacatgg ctgacttatc atggagccat taaattggat 1080 gacaaagatc cacaattcaa agacaacgtc atactgctga acaagcacat tgacgcatac 1140 aaaacattcc caccaacaga gcctaaaaag gacaaaaaga aaaagactga tgaagctcag 1200 cctttgccgc agagacaaaa gaagcagccc actgtgactc ttcttcctgc ggctgacatg 1260 gatgatttct ccagacaact tcaaaattcc atgagtggag cttctgctga ttcaactcag 1320 gcacacccag ctttcttgta caaagtggtg atatcggtac cagtcgactc tagaggatcc 1380 agatccatcg ccaccatggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc 1440 ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag 1500 ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc 1560 gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccttc ggctacggcc tgaagtgctt cgcccgctac 1620 cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag 1680 gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc 1740 gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc 1800 aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc 1860 gactacaaag acgatgacga caagtga 1887 <210> 2 <211> 1704 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gene Coding SARS Nucleocapsid and Yellow Fluorescence Protein C-termins <400> 2 atggccatgg aggcccgaat tatcacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt catgtctgat 60 aatggacccc aatcaaacca acgtagtgcc ccccgcatta catttggtgg acccacagat 120 tcaactgaca ataaccagaa tggaggacgc aatggggcaa ggccaaaaca gcgccgaccc 180 caaggtttac ccaataatac tgcgtcttgg ttcacagctc tcactcagca tggcaaggag 240 gaacttagat tccctcgagg ccagggcgtt ccaatcaaca ccaatagtgg tccagatgac 300 caaattggct actaccgaag agctacccga cgagttcgtg gtggtgacgg caaaatgaaa 360 gagctcagcc ccagatggta cttctattac ctaggaactg gcccagaagc ttcacttccc 420 tacggcgcta acaaagaagg catcgtatgg gttgcaactg agggagcctt gaatacaccc 480 aaagaccaca ttggcacccg caatcctaat aacaatgctg ccaccgtgct acaacttcct 540 caaggaacaa cattgccaaa aggcttctac gcagagggaa gcagaggcgg cagtcaagcc 600 tcttctcgct cctcatcacg tagtcgcggt aattcaagaa attcaactcc tggcagcagt 660 aggggaaatt ctcctgctcg aatggctagc ggaggtggtg aaactgccct cgcgctattg 720 ctgctagaca gattgaacca gcttgagagc aaagtttctg gtaaaggcca acaacaacaa 780 ggccaaactg tcactaagaa atctgctgct gaggcatcta aaaagcctcg ccaaaaacgt 840 actgccacaa aacagtacaa cgtcactcaa gcatttggga gacgtggtcc agaacaaacc 900 caaggaaatt tcggggacca agacctaatc agacaaggaa ctgattacaa acattggccg 960 caaattgcac aatttgctcc aagtgcctct gcattctttg gaatgtcacg cattggcatg 1020 gaagtcacac cttcgggaac atggctgact tatcatggag ccattaaatt ggatgacaaa 1080 gatccacaat tcaaagacaa cgtcatactg ctgaacaagc acattgacgc atacaaaaca 1140 ttcccaccaa cagagcctaa aaaggacaaa aagaaaaaga ctgatgaagc tcagcctttg 1200 ccgcagagac aaaagaagca gcccactgtg actcttcttc ctgcggctga catggatgat 1260 ttctccagac aacttcaaaa ttccatgagt ggagcttctg ctgattcaac tcaggcacac 1320 ccagctttct tgtacaaagt ggtgatgatc tctcgaggta ccgcggccgc acgtccggcg 1380 tgcaaaatcc cgaacgacct gaaacagaaa gtcatgaacc acgacaagca gaagaacggc 1440 atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac 1500 cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac 1560 ctgagctacc agtccaagct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg 1620 ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caagtaccca 1680 tacgatgttc cagattacgc ttga 1704 <210> 3 <211> 628 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS Nucleocapsid and Yellow Fluorescence Protein N-terminus <400> 3 Met Val Leu Ala Ala Ala Asn Ser Ser Ile Thr Ser Leu Tyr Lys Lys 1 5 10 15 Ala Gly Phe Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Ser Asn Gln Arg Ser Ala 20 25 30 Pro Arg Ile Thr Phe Gly Gly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln 35 40 45 Asn Gly Gly Arg Asn Gly Ala Arg Pro Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly 50 55 60 Leu Pro Asn Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly 65 70 75 80 Lys Glu Glu Leu Arg Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr 85 90 95 Asn Ser Gly Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg 100 105 110 Arg Val Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Glu Leu Ser Pro Arg Trp 115 120 125 Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Ser Leu Pro Tyr Gly 130 135 140 Ala Asn Lys Glu Gly Ile Val Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn 145 150 155 160 Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Asn Asn Asn Ala Ala 165 170 175 Thr Val Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr 180 185 190 Ala Glu Gly Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser 195 200 205 Arg Ser Arg Gly Asn Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser 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Artificial Sequence <220> <223> SARS Nucleocapsid and Yellow Fluorescence Protein C-terminus <400> 4 Met Ala Met Glu Ala Arg Ile Ile Thr Ser Leu Tyr Lys Lys Ala Gly 1 5 10 15 Phe Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Ser Asn Gln Arg Ser Ala Pro Arg 20 25 30 Ile Thr Phe Gly Gly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn Gly 35 40 45 Gly Arg Asn Gly Ala Arg Pro Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro 50 55 60 Asn Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu 65 70 75 80 Glu Leu Arg Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser 85 90 95 Gly Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Val 100 105 110 Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Glu Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe 115 120 125 Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Ser Leu Pro Tyr Gly Ala Asn 130 135 140 Lys Glu Gly Ile Val Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro 145 150 155 160 Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Asn Asn Asn Ala Ala Thr Val 165 170 175 Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu 180 185 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400 Pro Gln Arg Gln Lys Lys Gln Pro Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala 405 410 415 Asp Met Asp Asp Phe Ser Arg Gln Leu Gln Asn Ser Met Ser Gly Ala 420 425 430 Ser Ala Asp Ser Thr Gln Ala His Pro Ala Phe Leu Tyr Lys Val Val 435 440 445 Met Ile Ser Arg Gly Thr Ala Ala Ala Arg Pro Ala Cys Lys Ile Pro 450 455 460 Asn Asp Leu Lys Gln Lys Val Met Asn His Asp Lys Gln Lys Asn Gly 465 470 475 480 Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val 485 490 495 Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro 500 505 510 Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser Lys Leu Ser 515 520 525 Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val 530 535 540 Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Tyr Pro 545 550 555 560 Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 565 <210> 5 <211> 996 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gene coding SARS Membrane Protein and Yellow Fluorescence Protein N-terminus <400> 5 atggtacttg cggccgcgaa ttcatcgatc acaagtttgt acaaaaaagc aggcttcgtt 60 gcttccttca ggctgtttgc tcgtacccgc tcaatgtggt cattcaaccc agaaacaaac 120 attcttctca atgtgcctct ccgggggaca attgtgacca gaccgctcat ggaaagtgaa 180 cttgtcattg gtgctgtgat cattcgtggt cacttgcgaa tggccggaca ccccctaggg 240 cgctgtgaca ttaaggacct gccaaaagag atcactgtgg ctacatcacg aacgctttct 300 tattacaaat taggagcgtc gcagcgtgta ggcactgatt caggttttgc tgcatacaac 360 cgctaccgta ttggaaacta taaattaaat acagaccacg ccggtagcaa cgacaatatt 420 gctttgctag tacagcaccc agctttcttg tacaaagtgg tgatatcggt accagtcgac 480 tctagaggat ccagatccat cgccaccatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg 540 gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc 600 ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc 660 ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccacct tcggctacgg cctgaagtgc 720 ttcgcccgct accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa 780 ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc 840 gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc 900 aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc 960 tatatcatgg ccgactacaa agacgatgac gacaag 996 <210> 6 <211> 816 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gene coding SARS Membrane Protein and Yellow Fluorescence Protein C-terminus <400> 6 atggccatgg aggcccgaat tatcacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cgttgcttcc 60 ttcaggctgt ttgctcgtac ccgctcaatg tggtcattca acccagaaac aaacattctt 120 ctcaatgtgc ctctccgggg gacaattgtg accagaccgc tcatggaaag tgaacttgtc 180 attggtgctg tgatcattcg tggtcacttg cgaatggccg gacaccccct agggcgctgt 240 gacattaagg acctgccaaa agagatcact gtggctacat cacgaacgct ttcttattac 300 aaattaggag cgtcgcagcg tgtaggcact gattcaggtt ttgctgcata caaccgctac 360 cgtattggaa actataaatt aaatacagac cacgccggta gcaacgacaa tattgctttg 420 ctagtacagc acccagcttt cttgtacaaa gtggtgatga tctctcgagg taccgcggcc 480 gcacgtccgg cgtgcaaaat cccgaacgac ctgaaacaga aagtcatgaa ccacgacaag 540 cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg 600 cagctcgccg accactacca gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc 660 gacaaccact acctgagcta ccagtccaag ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat 720 cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg 780 tacaagtacc catacgatgt tccagattac gcttga 816 <210> 7 <211> 332 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS Membrane Protein and Yellow Fluorescence Protein N-terminus <400> 7 Met Val Leu Ala Ala Ala Asn Ser Ser Ile Thr Ser Leu Tyr Lys Lys 1 5 10 15 Ala Gly Phe Val Ala Ser Phe Arg Leu Phe Ala Arg Thr Arg Ser Met 20 25 30 Trp Ser Phe Asn Pro Glu Thr Asn Ile Leu Leu Asn Val Pro Leu Arg 35 40 45 Gly Thr Ile Val Thr Arg Pro Leu Met Glu Ser Glu Leu Val Ile Gly 50 55 60 Ala Val Ile Ile Arg Gly His Leu Arg Met Ala Gly His Pro Leu Gly 65 70 75 80 Arg Cys Asp Ile Lys Asp Leu Pro Lys Glu Ile Thr Val Ala Thr Ser 85 90 95 Arg Thr Leu Ser Tyr Tyr Lys Leu Gly Ala Ser Gln Arg Val Gly Thr 100 105 110 Asp Ser Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Arg Tyr Arg Ile Gly Asn Tyr Lys 115 120 125 Leu Asn Thr Asp His Ala Gly Ser Asn Asp Asn 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aaatttcggg 420 gaccaagacc taatcagaca aggaactgat tacaaacatt ggccgcaaat tgcacaattt 480 gctccaagtg cctctgcatt ctttggaatg tcacgcattg gcatggaagt cacaccttcg 540 ggaacatggc tgacttatca tggagccatt aaattggatg acaaagatcc acaattcaaa 600 gacaacgtca tactgctgaa caagcacatt gacgcataca aaacattccc accaacagag 660 cctaaaaagg acaaaaagaa aaagactgat gaagctcagc ctttgccgca gagacaaaag 720 aagcagccca ctgtgactct tcttcctgcg gctgacatgg atgatttctc cagacaactt 780 caaaattcca tgagtggagc ttctgctgat tcaactcagg cacacccagc tttcttgtac 840 aaagtggtga tatcggtacc agtcgactct agaggatcca gatccatcgc caccatggtg 900 agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac 960 gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag 1020 ctgaccctga agttcatctg caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg 1080 accaccttcg gctacggcct gaagtgcttc gcccgctacc ccgaccacat gaagcagcac 1140 gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag 1200 gacgacggca actacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac 1260 cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca acatcctggg gcacaagctg 1320 gagtacaact acaacagcca caacgtctat atcatggccg actacaaaga cgatgacgac 1380 aag 1383 <210> 10 <211> 1203 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gene Coding SARS Nucleocapsid C-terminus and Yellow Fluorescence Protein C-terminus <400> 10 atggccatgg aggcccgaat tatcacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cttgccaaaa 60 ggcttctacg cagagggaag cagaggcggc agtcaagcct cttctcgctc ctcatcacgt 120 agtcgcggta attcaagaaa ttcaactcct ggcagcagta ggggaaattc tcctgctcga 180 atggctagcg gaggtggtga aactgccctc gcgctattgc tgctagacag attgaaccag 240 cttgagagca aagtttctgg taaaggccaa caacaacaag gccaaactgt cactaagaaa 300 tctgctgctg aggcatctaa aaagcctcgc caaaaacgta ctgccacaaa acagtacaac 360 gtcactcaag catttgggag acgtggtcca gaacaaaccc aaggaaattt cggggaccaa 420 gacctaatca gacaaggaac tgattacaaa cattggccgc aaattgcaca atttgctcca 480 agtgcctctg cattctttgg aatgtcacgc attggcatgg aagtcacacc ttcgggaaca 540 tggctgactt atcatggagc cattaaattg gatgacaaag atccacaatt 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Ser Arg Gly Gly 20 25 30 Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Gly Asn Ser Arg 35 40 45 Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Asn Ser Pro Ala Arg Met Ala 50 55 60 Ser Gly Gly Gly Glu Thr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu 65 70 75 80 Asn Gln Leu Glu Ser Lys Val Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly 85 90 95 Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg 100 105 110 Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Gln Tyr Asn Val Thr Gln Ala Phe Gly 115 120 125 Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Asp Leu 130 135 140 Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe 145 150 155 160 Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu 165 170 175 Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr His Gly Ala Ile Lys Leu 180 185 190 Asp Asp Lys Asp Pro Gln Phe Lys Asp Asn Val Ile Leu Leu Asn Lys 195 200 205 His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys Lys Asp 210 215 220 Lys Lys Lys Lys Thr Asp Glu Ala Gln Pro Leu Pro Gln Arg Gln Lys 225 230 235 240 Lys Gln Pro Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Met Asp Asp Phe 245 250 255 Ser Arg Gln Leu Gln Asn Ser Met Ser Gly Ala Ser Ala Asp Ser Thr 260 265 270 Gln Ala His Pro Ala Phe Leu Tyr Lys Val Val Ile Ser Val Pro Val 275 280 285 Asp Ser Arg Gly Ser Arg Ser Ile Ala Thr Met Val Ser Lys Gly Glu 290 295 300 Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp 305 310 315 320 Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala 325 330 335 Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu 340 345 350 Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe Gly Tyr Gly Leu Lys 355 360 365 Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys 370 375 380 Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys 385 390 395 400 Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp 405 410 415 Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp 420 425 430 Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn 435 440 445 Val Tyr Ile Met Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 450 455 460 <210> 12 <211> 400 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gene Coding SARS Nucleocapsid C-terminus and Yellow Fluorescence Protein C-terminus <400> 12 Met Ala Met Glu Ala Arg Ile Ile Thr Ser Leu Tyr Lys Lys Ala Gly 1 5 10 15 Phe Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser Arg Gly Gly Ser Gln 20 25 30 Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Gly Asn Ser Arg Asn Ser 35 40 45 Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Asn Ser Pro Ala Arg Met Ala Ser Gly 50 55 60 Gly Gly Glu Thr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln 65 70 75 80 Leu Glu Ser Lys Val Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr 85 90 95 Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg Gln Lys 100 105 110 Arg Thr Ala Thr Lys Gln Tyr Asn Val Thr Gln Ala Phe Gly Arg Arg 115 120 125 Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Asp Leu Ile Arg 130 135 140 Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe Ala Pro 145 150 155 160 Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr 165 170 175 Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr His Gly Ala Ile Lys Leu Asp Asp 180 185 190 Lys Asp Pro Gln Phe Lys Asp Asn Val Ile Leu Leu Asn Lys His Ile 195 200 205 Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys Lys Asp Lys Lys 210 215 220 Lys Lys Thr Asp Glu Ala Gln Pro Leu Pro Gln Arg Gln Lys Lys Gln 225 230 235 240 Pro Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Met Asp Asp Phe Ser Arg 245 250 255 Gln Leu Gln Asn Ser Met Ser Gly Ala Ser Ala Asp Ser Thr Gln Ala 260 265 270 His Pro Ala Phe Leu Tyr Lys Val Val Met Ile Ser Arg Gly Thr Ala 275 280 285 Ala Ala Arg Pro Ala Cys Lys Ile Pro Asn Asp Leu Lys Gln Lys Val 290 295 300 Met Asn His Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile 305 310 315 320 Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln 325 330 335 Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His 340 345 350 Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser Lys Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg 355 360 365 Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu 370 375 380 Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 385 390 395 400 <210> 13 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt catgtctgat aatggacccc aatcaaacc 59 <210> 14 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtg tgcctgagtt gaatcagcag aagctc 56 <210> 15 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cttgccaaaa ggcttctacg cagag 55 <210> 16 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cgttgcttcc ttcaggctgt ttgctc 56 <210> 17 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtg ctgtactagc aaagcaatat tgtcgttgct 60 60

Claims (14)

  1. ⅰ) 사스(SARS, Severe Acute Respiratory Syndrome, 중증급성호흡기증후군) 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 1-422 아미노산 서열을 갖는 단백질 전체 또는 168-422 아미노산 서열을 갖는 C-말단 부위를 코딩하는 유전자에 노랑형광단백질(Yellow Fluorescence Protein, YFP) N-말단 부위를 코딩하는 유전자를 pDONR221, pFPIA-YN 또는 pFPIA-YC 벡터에 삽입하고, 또 다른 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자에 노랑형광단백질 C-말단 부위를 코딩하는 유전자를 삽입하는 단계;
    ⅱ) 상기 유전자를 이용하여 HEK293T 동물세포를 형질전환시키는 단계;
    ⅲ) 상기 형질전환된 동물세포에서 상기 유전자를 발현시키는 단계; 및
    ⅳ) 상기 발현된 뉴클레오캡시드 단백질을 500 ㎚에서 여기 및 535 ㎚에서 방출파장을 이용한 형광현미경 또는 형광분석법을 통해 형광 단백질의 분포 및 형광 세기를 측정하는 단계;를 포함하는 사스 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 자가정렬 측정방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서, 상기 ⅰ) 단계의 유전자는 서열번호 13과 14 또는 서열번호 15와 14로 기재되는 프라이머를 이용하여 DNA 중합연쇄 반응법(PCR)으로 증폭되는 것을 특징으로 하는 사스 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 자가정렬 측정방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. ⅰ) 사스 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자에 노랑형광단백질 N-말단 부위를 코딩하는 유전자를 삽입하고, 또 다른 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자에 노랑형광단백질 C-말단 부위를 코딩하는 유전자를 삽입하는 단계;
    ⅱ) 상기 유전자를 이용하여 동물세포를 형질전환시키는 단계;
    ⅲ) 상기 형질전환된 동물세포에서 상기 유전자를 발현시키고, 상기 형질전환된 동물세포에 항-사스 바이러스 활성을 가질 수 있는 시험물질을 처리하는 단계; 및
    ⅳ) 형광현미경 또는 형광분석법을 통해 형광 단백질의 분포 및 형광 세기를 측정하는 단계;를 포함하는 제1항의 방법을 이용한 항-사스 바이러스 활성을 갖는 물질의 검색방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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The Journal of Molecular Biology*
논문2;Biochem Biophys Res Commun*
논문3;The International Journal of Biochemistry Cell Biology*

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