KR101492696B1

KR101492696B1 - 심근 트로포닌 ⅰ과 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101492696B1
Application number: KR20120142847A
Authority: KR
Inventors: 김인산; 소인섭; 손혜남; 차기원
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2011-12-09
Filing date: 2012-12-10
Publication date: 2015-02-12
Also published as: WO2013085367A1; KR20130065627A

Abstract

본 발명은 심근 트로포닌 I을 특이적으로 표적하는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 17 또는 서열번호 24로 표시되는 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI)) 표적 특이 펩타이드와 이를 유효성분으로 포함하는 진단용 조성물 및 진단용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 심근 트로포닌 I을 특이적으로 표적하는 펩타이드는 목적 펩타이드와 결합 친화력 및 결합 특이성을 증강시키는 단백질 골격모듈을 포함하고 있어 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI)) 관련 증상/질환에 특이적인 폴리펩타이드 또는 단백질을 검출하는데 효과적이므로 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI)) 관련 증상/질환의 진단 및 치료에 이용할 수 있다.

Description

심근 트로포닌 Ⅰ과 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 및 이의 용도{Polypeptide binding cardiac troponin I specifically and use thereof}

본 출원은 2011년 12월 9일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2011-0131973호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체를 본 출원의 참고문헌이다.

본 발명은 심근 트로포닌 I에 특이적인 폴리펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 하기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI))에 특이적인 폴리펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

[일반식 1]

Arg-X₁-X₂-X₃-Arg-X₄-X₅

상기 일반식에서, 상기 X₁은 Cys 또는 Ala 이고, 상기 X₂ 또는X₃은 Ala 또는 Ser 이며, 상기 X₄는 Arg 또는 Leu이고, 상기 X₅는 Ser 또는 Trp 이다.

단백질의 아미노산 서열과 2차, 3차 구조를 분석하면 많은 단백질들이 독립적인 도메인 (domain, 또는 module)으로 구성되어 있다. 도메인은 구조적 기능적 독립적인 단위이다. 동일한 도메인은 여러 단백질에 하나 이상으로 분포될 수 있으며, 하나의 단백질은 여러 도메인으로 구성될 수 있다. 도메인의 구체적인 정보는 Prosite (Hulo N 등, Nucleic Acids Res, 36:D245-249, 2008; Website: http://kr.expasy.org/prosite/), SMART(Letunic I 등, Nucleic Acids Res, 34:D257-D260, 2006; Website: http://smart.embl-heidelberg.de/)등의 생물정보학 웹사이트에서 탐색할 수 있다.

단백질, 펩티드, RNA 등 생체고분자물질들은 생체내의 표적물질과의 결합에 의해 그 기능이 나타낸다. 특히 이들 결합의 기본 단위는 단백질 결합에 의해 매개되므로 특정 단백질에 결합하는 또 다른 단백질들을 파악하는 것은 이들 단백질들의 기능적 연관성을 나타내는 지표로 사용된다. 따라서 특정 단백질과 결합하는 미지의 결합단백질(들)을 확인하는 것은 세포 신호전달 기작 연구 뿐 아니라 신약 타겟을 결정할 수 있는 직접적인 기회를 제공함과 동시에 특정 신호전달 체계 내에서의 신약후보물질 발굴을 위한 기반 기술을 제공할 수 있다.

생체분자간 상호작용 (예, 단백질-단백질, 단백질-핵산, 등)은 세포의 생장, 분화, 발달, 세포간/내에서의 신호 전달, 물질이동 등 다양한 생명현상을 일으키는 중요한 기능을 한다. 기존에 표적분자에 특이적으로 결합하여 생물학적 활성을 조절하는 분자로서, 항체 (전체 또는 절편)가 주도적으로 개발되어져 왔다. 하지만, 항체의 문제점은 발현 양이 적고, 용해도가 낮으며, 동물세포 발현 세포주을 써야하고, 정제비용이 비싸고, 환원적 세포내 환경에서 안정성이 떨어지는 여러 문제 등이 있다. 따라서, 항체의 문제점을 극복하면서 항체처럼 표적분자 (targeted molecules)에 특이적으로 결합하는 특성을 지닌 항체외 단백질 개발이 시급한 실정이다.

암이나 동맥경화의 진단 및 치료에 사용하기 위하여 페이지 디스플레이등의 방법으로 발굴된 펩타이드는 낮은 결합력, 비안정성, 고면역성 등의 한계가 있다. 이러한 문제점을 극복하고 활성 펩타이드를 인체내에서 결합력과 안정성을 높이면서 면역성을 낮출 수 있는 새로운 기술의 개발이 필요하다.

목적 펩타이드에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 스크리닝하는 방법으로 T7 phage library가 효과적으로 사용되고 있다. 그러나 이렇게 스크리닝된 펩타이드는 합성 펩타이드 자체만으로 목적 펩타이드에 결합시킬 경우 친화도가 현저히 떨어지는 단점이 있다. 이러한 약한 펩타이드-단백질 간의 결합을 보완하기 위하여 단백질-단백질 결합을 모방하여 펩타이드를 특정한 단백질 골격에 삽입하여 친화도를 상승시키는 연구들이 이루어져왔다. 그러나 이 경우 특정한 단백질 골격에 삽입된 펩타이드가 항상 친화도가 상승되는 결과를 보여주지는 않는데 이것은 T7 phage library에 분포하는 펩타이드의 구조나 이 아미노산 서열로부터 합성한 자유로운 펩타이드 자체의 구조가 특정한 단백질 골격에 삽입된 펩타이드의 3차 구조와 다를 것으로 추측되고 있다.

심근 경색증(MIF)은 여전히 의학적으로 위험하며, 세계적으로 사망과 심장혈관계 이환의 주원인이 되고 있다. 모든 경우에서, 도입된 치료는 비가역성 괴사로부터 심근 조직을 보호하는데 있다. 오늘날 혈전용해성 또는 제 1 선 혈관 성형술과 같은 새로운 치료방법으로 관상 순환을 급속히 회복시켜서 경색된 부위의 크기를 제한하고, 사망률 및 이환율을 감소시킬 수 있다.

임상 증상발현이 개시된 후 사용되는 상기 치료 수단은 빠를수록 더 효과적이다. 상기 병리에 직면한 임상의들은 더욱 효과적인 진단 기구를 가질 수 있어야 한다.

최근까지 심장질환이 있는 환자를 진단하는 생화학적 표지자(Biochemical Marker)로서, 트로포닌 I(TnI), 트로포닌T(TnT), 젖산 탈수소분해효소(LDH), 크레아틴키나제(CK), 크레아틴 키나제 동질효소(CK-MB), 그리고 미오글로빈(Myoglobin)등을 사용하여 왔다.

상기 젖산 탈수소분해효소는 인체의 모든 근육에 존재하며, 심근 경색 후기에 상승하게 되므로, 특이성 및 예민도가 낮아 진단에 크게 도움이 되지 않는다.

크레아틴 키나제는 모든 근육에서 발견되기 때문에 심장근육에 대하여 특이성이 없고, 근육손상, 외상, 뇌손상 등 여러가지 요인에 의해서 상승한다.

미오글로빈은 다른 근육 손상 시에도 그 농도가 상승하여, 심장 근육에 대한 특이성이 매우 낮다.

크레아틴 키나제 동질효소는 심근 경색의 생화학적 표지자로서 현재까지 가장 보편적으로 사용되고 있으나, 경색의 급성기에 매우 빨리 그 농도가 변하기 때문에 수회 측정하여야 하고, 측정된 CK-MB 양을 복잡한 수학적 공식을 통해 얻어야 하며, 경색 24시간 경과한 후에 내원한 경우 경색의 크기와의 상관성이 떨어지고, 재관류(reperfusion) 여부에 따라 매우 다른 양상을 나타낸다는 단점이 있다.

상기한 심장질환의 생화학적 표지자들은 공통적으로 질환에 따른 측정치의 변이가 심하고, 심근 손상 정도와의 상관관계가 낮으며, 경색이 아닌 고 위험군의 불안정성 협심증과 같은 미세 심근 손상의 경우에는 예민도가 낮아 진단적 가치가 낮다.

한편, 최근에는 심장질환의 생화학적 표지자로서 트로포닌 I 또는 T를 각각 이용하는 경우가 있다. 특히 트로포닌 I은 일반골격근에서는 발견이 되지 않고, 성인의 심근에만 존재하므로 심근 손상 이외에 크레아틴 키나제 동질효소(CK-MB)가 증가되어 있을 수 있는 상황에서는 혈중에서 검출되지 않아 심근 손상에 매우 특이하며, 심근 경색 크기와도 연관성을 나타낸다.

또한, 급성심근경색이 아닌 비전형 협심증의 경우에도 트로포닌이 심근세포로부터 유출되기 때문에, 비전형 협심증의 예후판정 지표로도 유용하다.

혈중 트로포닌 측정은 재관류(reperfusion) 요법의 치료효과를 평가하는 데도 도움이 된다. 혈전용해술을 시작한 후 트로포닌의 급격한 상승을 관찰할 수 있는데 이는 재관류에 의해 세포질 분획의 washout이 일어나기 때문이다.

이상과 같이, 트로포닌은 심근 특이적이며 심근 손상 시 혈중 농도 상승이 오래 지속되고, 정상인과 비심장질환에서는 나타나지 않기 때문에 경미한 정도의 심근 손상 여부도 알 수 있어 허혈성심질환과 급성심근경색 진단, 그리고 예후 판정에 매우 유용한 지표이다.

이에 본 발명자들은 스크리닝 단계부터 특정한 단백질 골격에 펩타이드가 삽입된 형태로 발현하여 진행하는 것이 단백질 골격에 삽입된 펩타이드의 목적 펩타이드에 대한 높은 친화도를 유지시키는 데 유리할 것이라 판단하여 T7 phage에 활성 펩타이드의 결합 친화력 및 특이성을 증강시키는 단백질 골격을 삽입시킨 펩타이드 라이브러리를 구축하고, 이를 이용하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 하기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI))에 특이적인 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.

[일반식 1]

Arg-X₁-X₂-X₃-Arg-X₄-X₅

상기 일반식에서, 상기 X₁은 Cys 또는 Ala 이고, 상기 X₂또는X₃은 Ala 또는 Ser 이며, 상기 X₄는 Arg 또는 Leu이고, 상기 X₅는 Ser 또는 Trp 이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 17 또는 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 벡터 및 형질 전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI)) 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리펩타이드는 바이오틴(biotin), 발색효소, 방사성동위원소, 크로모포어(chromophore), 발광물질, 형광물질(fluorescer), 상자성입자(super paramagnetic particles) 및 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles)로 이루어진 군에서 선택되는 하나로 표지된 것을 특징으로 하는 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI)) 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI)) 관련 증상/질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI)) 관련 증상/질환의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 단백질-단백질 상호작용의 검출에 의해서 심근 트로포닌 I를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI))에 특이적인 폴리펩타이드를 제공한다.

[일반식 1]

Arg-X₁-X₂-X₃-Arg-X₄-X₅

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 17 또는 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 벡터 및 형질 전환체를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI)) 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 폴리펩타이드는 바이오틴(biotin), 발색효소, 방사성동위원소, 크로모포어(chromophore), 발광물질, 형광물질(fluorescer), 상자성입자(super paramagnetic particles) 및 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles)로 이루어진 군에서 선택되는 하나로 표지된 것을 특징으로 하는 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI)) 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI)) 관련 증상/질환 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI)) 관련 증상/질환의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 단백질-단백질 상호작용의 검출에 의해서 심근 트로포닌 I를 검출하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI))에 특이적인 폴리펩타이드를 제공한다.

[일반식 1]

Arg-X₁-X₂-X₃-Arg-X₄-X₅

상기 폴리펩타이드는 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI))에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일실시예에서 plaque assay를 실시하여 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 phage가 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI))에 결합 능력이 우수하며, 심장마비를 진단하는 다른 지표물질에 결합하지 않는 것을 확인하였다. 또한 다른 실시예에서는 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 phage 클론을 ELISA를 통하여 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI))에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.

한편 본 발명은 서열번호 17 또는 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 제공한다.

본 발명의 폴리펩타이드 단편은 모든 종류의 펩타이드, 단백질, 펩타이드 모조물, 화합물 및 생물제제를 포함하며, 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI))에 특이적으로 결합할 수 있는 활성을 갖는 것을 말한다. 본 발명의 폴리펩타이드는 천연으로부터 유래될 수도 있으며, 공지의 펩타이드 합성 방법을 이용하여 합성될 수 있다.

또한, 본 발명의 폴리펩타이드는 천연형 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명의 펩타이드의 변이체란 서열번호 17 또는 서열번호 24로 이루어진 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환, 아미노산유사체의 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 펩타이드를 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).

경우에 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.

아울러 본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 결과적으로 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화할 수 있는 어떤 조합의 염기서열도 가능하다.

아울러 본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 벡터는 통상의 클로닝 벡터 또는 발현벡터일 수 있으며, 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(촉진유전자) 같은 발현 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한 상기 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 벡터인 경우 복제기원을 포함한다.

상기 벡터로 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 미세사출법(microprojectile bombardment), 전기충격유전자전달법(electroporation), 인산 칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection) 및 리포좀 매개법(liposome-mediated method)를 이용할 수 있으며, 상기 형질전환체는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacteriumtumefaciens)일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명자들은 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI))과 특이적으로 결합하는 선별된 폴리펩타이드의 기능을 확인하고자 실험을 수행한 결과, 본 발명의 폴리펩타이드가 BSA 혹은 CKB 단백질 대비 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI))에 강한 결합특이성을 보인다는 사실을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 폴리펩타이드를 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI)) 검출용 조성물로 이용할 수 있음을 알 수 있었으며, 더 나아가 혈액이나 요 내에서 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI))을 검출하는 진단용 조성물로서 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명의 일실시예에서는 상용의 펩타이드 라이브러리를 사용하여 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI))과 특이적으로 결합하는 파지를 스크리닝하였다. 그 결과, 총 5 라운드의 스크리닝을 통해 상기 세포와 특이적으로 결합하는 파지를 각각 선별할 수 있었으며, 이의 서열을 분석한 결과 서열번호 15로 표시되는 PAAAMRV, 서열번호 16로 표시되는 SSRTGSQ, 서열번호 17로 표시되는 RASSRLW, 서열번호 24로 표시되는 RCAARRS의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드가 주로 선별됨을 알 수 있었다.

본 발명의 일실시예에서는 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI))에 대한 본 발명의 선별된 폴리펩타이드가 특이적으로 결합하는지 여부를 확인하였다. 그 결과 본 발명의 선별된 서열번호 17으로 표시되는 RASSRLW의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드가 BSA 혹은 CKB 단백질 대비 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI))에 강하게 결합함을 알 수 있었다.

결론적으로, 본 발명의 폴리펩타이드가 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI))과 특이적으로 결합할 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명 폴리펩타이드는 5% BSA, 0.05% tween, pH 7.4 인산화용액 조건에서 cTnI의 검출이 가능했다. 이는 정상인의 혈액 알부민 농도 3.4~5.4 g/dl(~5%)에 부합하는 조건으로 실험 증명 자료는 없으나, 충분히 혈액 cTnI의 검출이 가능하다는 것을 보여준다. Urine에서 cTnI의 검출은 MI환자에서 큰 의미가 없는 것으로 보고 되고 있으나, 신부전 MI환자에서는 Urine sample에서 검출이 된다는 점에서 요에서의 검출도 의미가 있다. 참고로 최근 신장기능 정상인 MI환자의 요에서는 cTnI 검출이 되지 않는다는 보고가 있다. 이 역시 실제 실험 자료는 없으나, 정상인 요의 pH 범위는 pH 4.6~8.0로 주로 pH 7.0인 점을 고려할 때, 충분히 검출 가능하다는 것을 추측할 수 있다[Nephrol Dial Transplant (2008) 23: 231-238].

본 발명은 상기의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI)) 검출용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 폴리펩타이드는 바이오틴(biotin), 발색효소, 방사성동위원소, 크로모포어(chromophore), 발광물질, 형광물질(fluorescer), 상자성입자(super paramagnetic particles) 및 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles)로 이루어진 군에서 선택되는 하나로 표지된 것을 특징으로 하는 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI)) 검출용 조성물을 제공한다.

상기 폴리펩타이드는 본 발명에 의해 선별된 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI))에 특이적인 폴리펩타이드를 의미하며, 시료는 예를 들어 혈액이나 요(尿)일 수 있다. 본 발명의 조성물과 시료의 혼합 과정을 통해 시료에 존재하는 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI))을 검출할 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드의 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI)) 결합 여부의 확인, 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여, 본 발명의 폴리펩타이드는 표지된 상태로 제공될 수 있다. 즉, 검출가능한 표지에 링크(예: 공유 결합 또는 가교)되어 제공될 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 발색효소(예: 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제), 방사성 동위원소(예:18F,124I,125I,32P,35S), 크로모포어(chromophore), 발광물질 또는 형광물질(예: FITC, RITC, 형광단백질(GFP(Green Fluorescent Protein); EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein), RFP(Red Fluorescent Protein); DsRed(Discosoma sp. red fluorescent protein); CFP(Cyan Fluorescent Protein), CGFP(Cyan Green Fluorescent Protein), YFP(Yellow Fluorescent Protein), Cy3, Cy5 및 Cy7.5), 상자성입자(superparamagnetic particles) 또는 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles)일 수 있다.

표지에 따른 검출 방법은 당 업계에 널리 알려져 있으나, 예를 들어 다음과 같은 방법에 의해 수행될 수 있다. 검출가능한 표지로 형광물질을 이용하는 경우에는 면역형광염색법을 이용할 수 있다. 예컨대, 형광물질로 표지된 본 발명의 펩타이드를 시료와 반응시키고 미결합 또는 비특이적인 결합 산물을 제거한 다음 형광 현미경 하에서 펩타이드에 의한 형광을 관찰할 수 있다. 또한 검출가능한 표지로 효소를 이용하는 경우에는 효소반응을 통한 기질의 발색반응에 의해 흡광도를 측정하고, 방사선 물질인 경우에는 방사선 방출량을 측정함으로써 수행할 수 있다.

한편, 본 발명의 폴리펩타이드가 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI))과 특이적으로 결합하는 특성을 이용하여, 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI)) 관련 증상/질환의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 단백질-단백질 상호작용의 검출에 의해서 심근 트로포닌 I를 검출하는 방법을 제공한다.

상기 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI)) 관련 증상/질환은 심근경색, 협심증, 고혈압(hypertension), 감염성 질환(infection), 패혈증(sepsis), 부정맥(arrhythmias), 폐색전증(pulmonary embolism), 뇌압상승(increased intracranial pressure), 신부전(renal insufficiency), 상부위장관 출혈(UGI bleeding), 급성 호흡곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome), 말기 신질환(End stage renal disease), 유전분증(amyloidosis), 당뇨병(diabetes) 및 심장독성[Clin Chem. 2009 Dec;55(12):2098-112, Am Heart J 2011;162:64-73]으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 증상/질환일 수 있으며, 바람직하게는 심근경색 또는 협심증으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 증상/질환일 수 있다.

체내의 심근과 골격근의 근조직이 손상되거나 근세포가 괴사 되었을 때, 심근표지자의 하나인 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI))이 혈중으로 유출되고 요(尿)중에도 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI)) 형태로 배설된다. 요(尿)의 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI)) 농도는 근육에서 방출되는 양, 혈중 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI)) 농도, GFR(glomerular filtration rate, 사구체 여과율), 소변량의 영향을 받는다. 따라서 근조직 손상을 수반하는 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI)) 관련 증상/질환의 진단용으로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드를 유효성분으로 함유하는 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI)) 관련 증상/질환의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 단백질-단백질 상호작용의 검출에 의해서 심근 트로포닌 I를 검출하는 방법을 제공한다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 심근 트로포닌 I에 특이적인 폴리펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 17 또는 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI))에 특이적인 폴리펩타이드와 이를 유효성분으로 포함하는 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI)) 검출용 조성물 및 진단용 조성물을 제공한다. 본 발명의 심근 트로포닌 I에 특이적인 펩타이드는 목적 펩타이드와 결합 친화력 및 결합 특이성을 증강시키는 단백질 골격모듈을 포함하고 있어 심근질환에 특이적인 폴리펩타이드 또는 단백질을 검출하는데 효과적이므로 심근 질환의 진단에 효과적이다.

도 1은 T7 phage 10B Capsid에 DMID를 인코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하는 cassette의 구조를 나타낸 그림이다.(DMID : 본 발명자가 기 출원(10-2011-0035613)한 단백질 골격 모듈)
도 2는 T7 phage 10B Capsid에 DMID를 인코딩하는 뉴클레오타이드와 펩타이드 라이브러리를 인코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하는 구조를 나타낸 그림이다.(DMID : 본 발명자가 기 출원(10-2011-0035613)한 단백질 골격 모듈)
도 3은 본 발명의 펩타이드 라이브러리를 인코딩하는 다양한 뉴클레오타이드 염기서열을 나타낸 것이다.
도 4는 Cardiac troponin I (cTnI) 표적 phage 라이브러리를 대상으로 총 5라운드의 탐색을 시행한 결과를 나타낸 그림이다.
도 5A는 발굴된 후보 phage 클론의 Cardiac troponin I (cTnI) 결합능력을 plaque assay를 통해 나타낸 그림이다.
도 5B는 발굴된 후보 phage 클론의 Cardiac troponin I (cTnI) 결합능력을 ELISA를 통해 나타낸 그림이다.
도 6은 5R19 클론(RASSRLW)의 부유 cTnI의 검출 능력을 확인한 결과를 나타낸 그림이다. (5R19 : 본 발명에서 탐색 된 phage 클론 중 가장 반복성(Frequency)이 높은 후보 클론)
도 7A는 RASSRLW 아미노산 서열을 탑재한 DMID 재조합 단백질의 플레이트에 부착된 cTnI의 검출 능력을 확인한 결과를 나타낸 그림이다. (cTnI 특이적 결합)
도 7B는 RASSRLW 아미노산 서열을 탑재한 DMID 재조합 단백질의 부유 cTnI의 검출 능력을 확인한 결과를 나타낸 그림이다. (cTnI 특이적 결합 및 검출)
도 7C는 RASSRLW 아미노산 서열을 탑재한 DMID 재조합 단백질의 부유 CKB의 검출 능력을 확인한 결과를 나타낸 그림이다. (cTnI 특이적 결합 및 검출)
도 8는 발굴된 후보 5R19 phage 클론 및 4R5 phage 클론의 Cardiac troponin I (cTnI) 결합능력을 ELISA를 통해 나타낸 그림이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

T7 phage DMID(Designed Modular Immunodiagnostics)-(X7)펩타이드 라이브러리 구축

본 실험에서는 T7 phage의 10B capsid에 DMID(Designed Modular Immunodiagnostics) 단백질 골격 모듈을 융합시키고, 이 단백질 골격 모듈에 펩타이드 라이브러리를 구축하였다. 이를 위해서 T7 phage-DMID cassette를 제조하고 여기에 다양한 펩타이드 라이브러리를 발현하는 T7 phage DMID-(X7) 펩타이드 라이브러리를 제조하였다.

<1-1> T7 phage-DMID cassette 제조

T7 phage DMID cassette의 제조를 위해서 먼저 DMID의 T1-L86번째 아미노산에 해당하는 DNA 절편(EGF의 T1470-L1556 번째 아미노산에 해당하는 DNA 절편)을 PCR을 이용해 증폭시킨 후, 벡터 pET-32a(+)(Novagen; Madison, WI)의 BamHI 및 XhoI 위치에 클로닝하여 pET-32a(+)-DMID-BX 벡터를 제조하였다.

이로부터 펩타이드 라이브러리를 인코딩하는 뉴클레오타이드를 삽입하기 위한 제한효소 자리를 만들기 위하여 R21/T22 사이와 R26/R27 사이에 각각 SacI, SalI 제한효소자리를 PCR을 이용하여 삽입하고 pET-32a(+)의 EcoRI 및 HindIII 위치에 클로닝 하였다. 이때 pET-32a(+)-DMID-BX를 주형으로 DMIDEFwd와 DMIDSSRvs primer 쌍과 DMIDSSFwd와 DMIDHRvs primer 쌍으로 각각 1차 PCR을 하고, 각각의 1차 PCR 산물을 섞어서 주형으로 사용하여 DMIDEFwd와 DMIDHRvs primer를 이용하여 2차 PCR 하여, DMID의 R21/T22 사이와 R26/R27 사이에 각각 SacI, SalI 제한효소자리가 삽입된 재조합 DNA를 얻고 이를 EcoRI 및 HindIII 제한효소를 처리하여 같은 제한 효소로 처리한 pET-32a(+) 벡터로 클로닝하였다. 이를 pET-32a(+)-DMID-ESSH로 명명하였다.

pET-32a(+)-DMID-ESSH를 제한효소 EcoRI 와 HindIII를 처리하고 아가로즈젤 전기영동을 통해 DMID-ESSH cassette DNA를 분리하였다. 이렇게 분리한 DMID-ESSH cassette DNA를 T7select10-3b (Novagen)의 T7 vector arm에 ligase를 사용하여 연결하였다. 이것을 T7select10-3b의 packaging extract와 섞어서 in vitro packaging 하여 재조합 T7 phage-DMID-ESSH cassette 바이러스를 완성하고 도 1에 나타내었다. T7 phage의 packaging 방법은 Novagen 사가 제공하는 실험방법을 따랐다.

<1-2> T7 phage DMID-(X7) 펩타이드 라이브러리 제조

T7 phage-DMID-ESSH cassette 바이러스로부터 T7 phage-DMID-ESSH cassette DNA를 분리하고 SacI 및 SalI 제한효소를 처리하였다. 펩타이드 라이브러리를 인코딩하는 뉴클레오타이드는 SacI 및 SalI 제한효소 자리를 가지고 있는 forward 올리고뉴클레오타이드인 gatcgagctcNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKgtcgaccatcatcaccaccatcac (N=any nucleotide, K=G or T)(서열번호 5)와 이와 3' 부위에 상보적인 reverse 올리고뉴클레오타이드인 gtgatggtggtgatgatggtcgac(서열번호 6)를 사용하였으며, 두 가지 올리고뉴클레오타이드를 같은 몰 비율로 섞은 후 섭씨 95에서 5분간 가열한 후 상온으로 식혀서 상보적인 수소결합을 시킨 후 DNA 중합효소인 Klenow fragment로 forward 올리고뉴클레오타이드인 gatcgagctcNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKgtcgaccatcatcaccaccatcac에 상보적인 DNA를 합성하여 완전한 이중가닥의 라이브러리 DNA를 만들었다.

이 라이브러리 DNA에 SacI 및 SalI를 처리하였다. 제한효소로 처리한 펩타이드 라이브러리를 인코딩하는 뉴클레오타이드를 같은 제한효소로 처리한 T7 phage-DMID-ESSH cassette DNA와 ligase를 사용하여 연결하였다. 이것을 T7select10-3b의 packaging extract와 섞어서 in vitro packaging 하여 재조합 T7 phage-DMID-(X7) 펩타이드 라이브러리 바이러스를 완성하고 도 2에 나타내었다.

재조합 T7 phage-DMID-(X7) 펩타이드 라이브러리 바이러스의 검증을 위하여 염기서열 분석을 하였다. 먼저 T7 phage-DMID-(X7) 펩타이드 라이브러리 바이러스의 capsid DNA의 EcoRI 부위로부터 107 bp 상류에 존재하는 염기서열에 결합하는 프라이머인 T7 UP FWD -100 프라이머 : agcgcgctcgccgtgctaac(서열번호 22)와 HindIII 부위로부터 108 bp 하류에 존재하는 염기서열에 결합하는 프라이머인 T7 Down Rvs -100 프라이머 : ctgataactcagcggcagtc(서열번호 23)를 이용하여 펩타이드 라이브러리가 삽입된 부위를 PCR 방법으로 증폭하였다. 이렇게 증폭된 PCR 산물을 DNA 정제 칼럼을 이용하여 정제한 후 상기 T7 UP FWD -100 프라이머와 T7 Down Rvs -100을 이용하여 펩타이드 라이브러리 부위의 염기서열을 분석하였다. 염기서열을 분석은 일반적으로 사용되는 Sanger 방법을 이용하였으며, Genotech 사에 의뢰하였다. 이로부터 펩타이드 라이브러리를 인코딩하는 다양한 뉴클레오타이드의 염기서열을 확인하였으며 그 중 일부의 염기서열을 정렬하여 도 3에 나타내었다. 염기서열 정렬에서 검은색으로 나타난 서열의 동일성을 보이는 서열보존지역의 서열 중 tctgccaaggctgactgtaagagagagctc는 라이브러리가 삽입된 DMID의 아미노 말단 부위와 SacI 삽입부위에 의해 인코딩되는 SAKADCKRGS를 발현하고, gtcgaccgagtgtgcacgtgcaaagcaggctac는 라이브러리가 삽입된 SalI 삽입부위와 DMID의 카복시 말단 부위에 의해 인코딩되는 LERVCTCKAGY를 발현한다. 한편 염기서열 정렬에서 정렬되지 않은 검은색과 붉은색으로 나타난 서열의 이질성을 보이는 서열다양성지역의 서열들은 SacI과 SalI 부위 사이에 삽입된 NNKNNKNNKNNKNNKNNKNNK (N=any nucleotide, K=G or T)로부터 유래하였으며, 실재로 다양한 뉴클레오타이드의 집합을 보여준다. 이러한 다양한 뉴클레오타이드의 집합들로부터 다양한 펩타이드들이 만들어짐을 알 수 있다. -로 표시된 부분은 각각의 라이브러리가 서로 정렬되지 않아서 공백으로 표시된 부분으로 실제 염기서열상에서의 결손을 의미하지는 않는다.

이렇게 확인된 재조합 T7 phage-DMID-(X7) 펩타이드 라이브러리 바이러스를 대량으로 증폭하여 목적 펩타이드에 대한 바이오패닝(biopanning)을 위해 사용하였다. 바이러스를 대량으로 증폭하기 위하여, 대장균 균주인 BLT5403을 100 ug/ml 농도의 Ampicillin이 든 LB media에서 하룻밤 종배양을 한 후 다음날 새로운 LB/Amp (100 ug/ml) media에 1/100 부피로 희석하여 600nm에서 흡광도가 0.5~1.0 (OD600=0.5~1.0) 될 때까지 배양하였다. MOI(multiplicity of infection)가 0.001-0.01 사이가 되도록 T7 phage-DMID-(X7) 펩타이드 라이브러리 바이러스를 대장균 균주인 BLT5403에 감염시키고 세포가 용해되어 투명해질 때까지 섭씨 37도에서 2-3 시간 교반 배양하여 바이러스를 증폭하였다. 증폭된 T7 phage-DMID-(X7) 펩타이드 라이브러리 바이러스는 Plaque assay를 통하여 titration을 확인하였으며 8.67x10¹⁰ pfu/ml의 역가를 가진 97 ml의 T7 phage-DMID-(X7) 펩타이드 라이브러리 바이러스를 제조하였다.

<실시예 2>

Cardiac troponin I(cTnI)에 대한 특이 표적 phage 클론 탐색 및 선별

<2-1> 질병 목표 재조합 단백질의 클로닝 및 발현

Human Cardiac Troponin I 재조합 단백질의 제조를 위해서 human Troponin I의 전체 ORF에 해당되는 DNA 절편을 TroB5Fwd와 TroN3Rvrs primer를 사용하여 PCR을 이용해 증폭시킨 후, 벡터 pET-29a(+)(Novagen; Madison, WI)의 BamHI 및 NotI 위치에 클로닝하여 재조합 human Troponin I 발현 벡터를 제조하였으며 이를 pET29a-hTroponin I로 명명하였다. 이 발현 벡터는 human Troponin I의 전체 아미노산 서열 1번부터 210번까지를 포함하고 있으며, human Troponin I의 아미노 말단에는 벡터 유래의 MKETAAAKFERQHMDSPDLGTLVPRGSMADIGS, 카복시 말단에는 벡터 유래의 AAALEHHHHHH 아미노산이 융합되어있다.

상기 각각의 벡터들은 대장균 세포주(E. coliBL21)로 형질전환시켜, 50 ㎍/㎖ 카나마이신(kanamycin)을 포함한 37℃ LB 배양액에서 배양되었고, 595 ㎚ 흡광도가 0.5~0.6이 되었을 때, 1 mM IPTG(isopropyl-β-D-(-)-thiogalactopyranoside)를 처리하여 20℃에서 24시간 동안 재조합 단백질의 발현을 유도하였다. 배양된 대장균은 용해 완충용액(50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 0.5 mM DTT)에 재부유시키고 초음파로 분쇄한 후, Ni-NTA 수지(resin, Qiagen)를 이용하여 정제하였다. 상기 발현 정제된 재조합 단백질은 SDS-PAGE를 통해 단백질의 순도를 확인한 후, 실험에 이용하였다.

<2-2> Phage plaque assay

M9LB 배양액에 숙주세포 BLT5403 대장균을 OD600=1.0 될 때 까지 배양한 후, 10 ml 튜브에 250 μl 분주하여 4℃ 보관한다. 농도를 확인하고자 하는 phage는 다양한 희석배율로 준비하고 사용 전까지 4℃ 보관한다. Top aga는 100℃에서 녹여서 37℃로 유지시켜 놓는다. 준비된 숙주 BLT5403 대장균 250 μl에 phage 용액 100 μl를 주입하여 섞은 다음, 마지막으로 녹인 Top age 4 ml을 주입하여 다시 섞고 aga plate로 옮겨 부어 굳힌다. 굳은 aga plate는 37℃에서 3-4시간 배양시킨 후, 생긴 plaque 수를 확인한다.

<2-3> cTnI 표적 phage 라이브러리 탐색

T7 phage DMID-(X7) 펩타이드 라이브러리를 이용하여 cTnI에 특이적으로 붙는 phage 클론을 탐색 하였다. cTnI(Abcam, Cambridge, UK)와 BSA(Gibco, Auckland, New Zealand)는 10 μg/ml 농도로 준비한 후, 96well plate에 100 μl씩 주입하여 4℃에서 16시간 코팅시킨다. 코팅된 plate의 각 well은 200 μl의 5% skim milk로 블로킹하고, 두 차례 PBS 세척하여 사용 전까지 4℃에 보관한다.

phage 라이브러리는 1×10¹⁰ pfu/ml 농도로 준비하는데, 이때 버퍼는 5% BSA, 0.1 mg/ml DMID 단백질을 포함한 인산완충용액(pH 7.4)을 사용한다. 준비된 phage를 BSA 코팅된 well에 1×10⁹ pfu 씩 주입하고 상온에서 10분간 결합시킨다. 비결합 phage는 새로운 BSA 코팅 well로 이동시켜 10분간 재차 결합시킨다. 이 과정을 3번 반복하여 비특이적으로 결합하는 phage 클론들을 제거한다. 3차례동안 BSA 코팅 well에 결합하지 않은 phage 클론은 cTnI 코팅 well로 이동시켜 상온에서 30분간 더 결합시킨다. 이 후, 0.05% Tween을 포함한 PBS로 3차례 세척을 통해 비특이적 결합 phage 클론들을 제거한다. 각 세척은 5분간 진행된다.

cTnI 코팅 well에 결합된 phage 클론은 1% SDS 100μl로 20분간의 반응으로 떼 내어 회수하고, phage plaque assay를 통해 cTnI에 결합된 phage 수를 확인한다. 또한 회수한 phage는 BLT5403 대장균 배양액에 넣고 감염시켜 증폭시킨다. 증폭된 phage 클론은 다음 라운드 탐색에 사용되고, 총 5라운드의 탐색을 더 반복 진행한다.

그 결과 도 4에서 나타낸 바와 같이 각 라운드 진행시 2~3배씩 파지 농도가 증가하는 양상을 확인하였고, 1 라운드에 대비하여 최종 5라운드는 약 25배정도 파지 농도가 증가하는 것을 확인하였다. 이에 반해, BSA에 결합하는 파지 및 임의삽입 아미노산이 없는 T7 phage-DMID-(-) 파지의 수적 증가는 관찰되지 않았다.

<2-4> phage 염기 서열 판독 및 후보 phage 클론 선정

5라운드에서 탐색된 phage 클론 중, 21개의 클론을 선정하고 각각 PCR을 통해 클론 내 삽입된 염기서열을 판독한다. PCR에 사용된 프라이머 염기는 upstream 프라이머 5-AGCGGACCAGATTATCGCTA-3' 와 downstream 프라이머 5-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3' 이며, 94℃에서 50초, 50℃에서 1분, 72℃에서 1분씩 총 35 사이클을 수행한다. 염기서열 판독 후, 각 클론에 삽입된 아미노산은 ClustalX 프로그램을 이용하여 서열정리하고, 반복되는 모티프 및 클론을 후보군으로 선정하였다. 후보군은 표 1에 나타내었다.

No.	Phage clone	Sequence	Frequency
1	5R1	PAAAMRV	4/21
2	5R5	SSRTGSQ	1/21
3	5R19	RASSRLW	9/21

그 결과 표 1에서 보는 바와 같이 RASSRLW는 21개 중 9번 확인되었고, PAAAMRV 역시 4차례 확인되었다. 특히, RASSRLW에서 SSR 모티프는 5R5 클론에서도 재차 확인되어 cTnI에 대한 후보군으로 선정하였다.

<2-5> Plaque assay 를 통해 발굴된 후보 phage 클론의 cTnI 결합능력 확인

cTnI(Abcam, Cambridge, UK), BSA 및 CKB 단백질은 10 μg/ml 농도로 준비한 후, 96well plate에 100 μl씩 주입하여 4℃에서 16시간 코팅시킨다. 코팅된 plate의 각 well은 200 μl의 5% skim milk로 블록킹하고, 두 차례 인산완충용액으로 세척하여 사용 전까지 4℃에 보관한다. 선정된 후보군 phage 클론은 1×10¹⁰pfu/ml 농도로 준비하고, 이때 버퍼는 5% BSA, 0.1 mg/ml DMID 단백질을 포함한 인산완충용액(pH 7.4)을 사용한다. 준비된 농도의 각 phage는 단백질이 코팅된 각well에 1×10⁹ pfu씩 주입하고 상온에서 1시간 결합시킨다. 이 후, 0.05% Tween을 포함한 인산완충용액으로 3차례 세척을 통해 비특이적 결합 phage들을 제거한다. 각 세척은 5분간 진행된다. cTnI 및 각각의 단백질 코팅 well에 결합된 phage 클론은 1% SDS 100μl로 20분간의 반응으로 떼 내어 회수하고, phage plaque assay를 통해 각각의 단백질에 결합된 phage 수를 확인한다. 그 결과는 도 5A에 나타내었다.

plaque assay를 통해 cTnI에 결합하는 phage수를 확인 해 본 결과, 도 5A에 나타낸 바와 같이, 5R-19 클론(RASSRLW)의 cTnI에 대한 결합 능력이 우수한 것을 알 수 있었다. 5R-19 클론은 BSA 혹은 심장마비 진단의 또 다른 지표물질인 CKB 단백질에 결합하지 않으면서 cTnI에 선택적으로 결합함을 확인했다. 하지만, 다른 후보군인 5R-1(PAAAMRV)와 5R-5(SSRTGSQ) 클론에서는 cTnI에 대한 특이성을 관찰할 수 없었다.

<2-6> 발굴된 후보 phage 클론의 cTnI 결합능력을 ELISA 를 통해 확인 cTnI(Abcam, Cambridge, UK), BSA 및 대장균에서 정제한 cTnI(실시예 2-1)와 CKB 단백질은 10 μg/ml 농도로 준비한 후, 96well plate에 100 μl씩 주입하여 4℃에서 16시간 코팅시킨다. 코팅된 plate의 각 well은 200 μl의 5% skim milk로 블록킹하고, 두 차례 인산완충용액으로 세척하여 사용 전까지 4℃에 보관한다.

선정된 후보군 phage 클론은 1×10¹⁰ pfu/ml 농도로 준비하고, 이때 버퍼는 5% BSA, 0.1 mg/ml DMID 단백질을 포함한 인산완충용액(pH 7.4)을 사용한다. 준비된 농도의 각 phage는 단백질이 코팅된 각well에 1×10⁹ pfu씩 주입하고 상온에서 1시간 결합시킨다. 이 후, 0.05% Tween을 포함한 인산완충용액으로 3차례 세척을 통해 비특이적 결합 phage들을 제거한다. 각 세척은 5분간 진행된다.

cTnI 및 각각의 단백질이 코팅된 well에 결합된 phage 클론은 T7 phage tail fiber 항체 (Merck KGaA, Darmstadt, Germany)로 검출하고 TMB 기질(Koma biotech inc., Seoul, Korea) 발색 반응을 시킨다. TMB 발색 반응은 2N H₂SO₄ 100 μl의 주입으로 종결시키고, 450nm 파장에서 흡광도를 측정하여 각 그룹의 후보군 phage의 결합 정도를 비교 확인한다. 그 결과는 도 5B에 나타내었다.

<2-7> 5 R19 클론( RASSRLW )의 부유된 cTnI 의 검출 능력 확인

대장균에서 정제한 cTnI는 10 μg/ml 농도로 준비한 후, 96well plate에 100 μl씩 주입하여 4℃에서 16시간 코팅시킨다. 코팅된 plate의 각 well은 200 μl의 5% skim milk로 블록킹하고, 두 차례 인산완충용액으로 세척하여 사용 전까지 4℃에 보관한다. 검출에 사용할 cTnI는 10 μg/ml, 5 μg/ml, 2.5 μg/ml, 1.25 μg/ml, 0.625 μg/ml, 0.3125 μg/ml 농도로 5% BSA와 0.1 mg/ml 농도의 DMID 단백질을 포함하는 버퍼에 부유시켜 준비한다. 준비한 각 농도의 cTnI 50 μl 샘플에 발굴된 후보군 5R19 phage clone(RASSRLW) 1×10⁸ pfu(50 μl)를 각각 주입 및 혼합한 후, 상온에서 30분간 반응시킨다. 이 때, 반응 혼합액은 다시 cTnI를 코팅시킨 well로 옮겨 상온에서 30분간 더 결합 반응시킴으로써, 부유 cTnI와 결합체를 이루지 않은 자유형 phage가 cTnI가 코팅된 well에 결합하도록 한다. 이후, 0.05% Tween을 포함한 인산완충용액으로 3차례 세척을 통해 부유상태의 cTnI와 결합체를 이룬 phage들을 제거한다. 각 세척은 5분간 진행된다.

cTnI 코팅된 well에 결합되어 남은 phage 클론은 T7 phage tail fiber 항체 (Merck KGaA, Darmstadt, Germany)로 검출하고 TMB 기질(Koma biotech inc., Seoul, Korea) 발색 반응을 시킨다. TMB 발색 반응은 2N H₂SO₄ 100 μl의 주입으로 종결시키고, 450nm 파장에서 흡광도를 측정하여 cTnI 부유농도에 따른 후보군 5R19 phage의 검출 정도 및 양상을 비교 확인한다. 그 결과는 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 5R-19 (RASSRLW) 클론이 부유된 cTnI를 검출 할 수 있는지, 있다면 어느 농도 범위까지 검출 가능한지를 확인한 결과, 선정된 5R-19 클론은 부유된 cTnI를 농도 의존적으로 검출했으며, 현재 확인된 최저 검출 농도는 cTnI 312 ng/ml(절대검출량 15.5 ng/50 μl)이다.

<2-8> RASSRLW 를 탑재한 DMID 단백질 ( RASSRLW - DMID )의 부유된 cTnI 의 검출 능력 확인

RASSRLW의 탑재 DMID 재조합 단백질의 제조를 위해서 cTnI에 특이적으로 결합하는 5R-19 phage 클론을 주형으로 T7 super UP 프라이머(5'-AGCGGACCAGATTATCGCTA-3')와 T7 super DOWN 프라이머 (5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3')를 사용하여 PCR을 이용해 증폭시킨 후, 벡터 pET-29b(+)(Novagen; Madison, WI)의 BamHI 및 XhoI 위치에 클로닝하여 RASSRLW 탑재 DMID 단백질 발현 벡터를 제조하였으며, 이를 RASSRLW-DMID로 명명하였다. 이 발현 벡터는 human stabilin-2의 전체 아미노산 서열 1470번부터 1555번까지를 포함하고 있으며, 아미노산 서열 1490번과 1496번 사이에 제한효소 SalI과 SacI 인식 서열이 삽입되어 있고, 그 사이에 RASSRLW 서열이 배열된 형태를 가진다. 아미노 말단에는 벡터 유래의 MKETAAAKFERQHMDSPDLGTLVPRGSMAISDPNS, 카복시 말단에는 LEHHHHHH 아미노산이 융합되어있다. 상기 벡터는 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 대장균 세포주에 형질전환하고 배양하여 재조합 단백질을 제조 하였다.

BSA 및 대장균에서 정제한 cTnI와 CKB 단백질은 10 μg/ml, 5 μg/ml, 2.5 μg/ml 농도로 각각 준비한 후, 96well plate에 100 μl씩 주입하여 4℃에서 16시간 코팅시킨다. 코팅된 plate의 각 well은 200 μl의 5% skim milk로 블록킹하고, 두 차례 인산완충용액으로 세척하여 사용 전까지 4℃에 보관한다.

대장균에서 정제한 RASSRLW-DMID 단백질은 아미노기에 HRP (Dojindo, Tokyo, Japan)를 결합시켜 10 μg/ml 농도로 준비한다. 이때 버퍼는 5% BSA, 0.05% tween 20, 0.1 mg/ml DMID 단백질을 포함한 인산완충용액(pH 7.4)을 사용한다. 준비된 농도의 RASSRLW-DMID-HRP 단백질은 코팅된 각 well에 100 μl씩 주입하고 상온에서 1시간 결합시킨다. 이 후, 0.05% Tween을 포함한 인산완충용액으로 3차례 세척을 통해 비특이적 결합을 제거한다. 각 세척은 5분간 진행된다.

cTnI 및 각각의 단백질이 코팅된 well에 결합된 RASSRLW-DMID-HRP 단백질은 TMB 기질(Koma biotech inc., Seoul, Korea) 발색 반응을 시켜 단백질의 결합 정도를 비교 분석한다. TMB 기질 발색 반응은 2N H₂SO₄ 100 μl의 주입으로 종결시키고 450nm 파장에서 흡광도를 측정한다. 그 결과는 도 7A에 나타내었다.

대장균에서 정제한 cTnI는 10 μg/ml 농도로 준비한 후, 96well plate에 100 μl씩 주입하여 4℃에서 16시간 코팅시킨다. 코팅된 plate의 각 well은 200 μl의 5% skim milk로 블록킹하고, 두 차례 인산완충용액으로 세척하여 사용 전까지 4℃에 보관한다. 검출에 사용할 cTnI 및 CKB 단백질은 10 μg/ml, 5 μg/ml, 2.5 μg/ml, 1.25 μg/ml, 0.625 μg/ml, 0.312 μg/ml, 0.156 μg/ml, 0.078 μg/ml, 0 μg/ml 농도로 5% BSA와 0.1 mg/ml 농도의 DMID 단백질을 포함하는 버퍼에 부유시켜 준비한다. 준비한 각 농도의 cTnI 및 CKB 단백질 50 μl 샘플에 RASSRLW-DMID-HRP 0.5 μg (50 μl)를 각각 주입 및 혼합한 후, 상온에서 30분간 반응시킨다. 이 때, 반응 혼합액은 다시 cTnI를 코팅시킨 well로 옮겨 상온에서 30분간 더 결합 반응시킴으로써, 부유 cTnI와 결합체를 이루지 않은 자유형 RASSRLW-DMID-HRP가 cTnI-코팅 well에 결합하도록 한다. 이후, 0.05% Tween을 포함한 인산완충용액으로 3차례 세척을 통해 부유 cTnI 혹은 CKB와 결합체를 이룬 RASSRLW-DMID-HRP를 제거한다. 각 세척은 5분간 진행된다.

cTnI 및 각각의 단백질이 코팅된 well에 결합된 RASSRLW-DMID-HRP 단백질은 TMB 기질(Koma biotech inc., Seoul, Korea) 발색 반응을 시켜 단백질의 결합 정도를 비교 분석한다. TMB 기질 발색 반응은 2N H₂SO₄ 100 μl의 주입으로 종결시키고 450nm 파장에서 흡광도를 측정한다. 그 결과는 도 7B와 C에 나타내었다.

도 7의 결과와 같이, RASSRLW 아미노산 서열을 탑재한 DMID단백질은 phage 상태에서 보인 특성 그대로, cTnI에 특이적으로 결합함을 알 수 있다. 부유 cTnI 검출 능력은 cTnI에 특이적이며, 이때 검출 한계 농도는 약 78 ng/ml (절대검출량 3.9 ng/50 μl)이다.

<2-9> 새로운 후보 phage 클론 선정 및 ELISA 를 이용한 cTnI 결합능력 확인

상기 실시예 1 내지 실시예 2-3과 동일한 방법으로 스크리닝하여 얻은 phage클론 중, 4라운드에서 탐색된 phage 클론 20개를 임의 선정하고, 각각 PCR을 통해 클론 내 삽입된 염기서열을 판독한다. PCR에 사용된 프라이머 상기 실시예 <2-4>의 프라이머와 동일하며 동일한 PCR 조건으로 수행한다. 염기서열 판독 후, 각 클론에 삽입된 아미노산은 ClustalX 프로그램을 이용하여 서열정리하고, 2회 이상 반복되는 모티프 및 클론을 후보군으로 선정하였다. 후보군은 표 2에 나타내었다.

No.	Phage clone	Sequence	Frequency
1	4R5	RCAARRS	9/20

표 2에서 보는 바와 같이, 4R5(RCAARRS, 서열번호 24)는 총 20개 클론 중 9회 반복 확인되었다. 특히 4R5는 상기 실시예 2-4와 유사한 아미노산 서열을 보이고 있어, cTnI의 특이 결합이 예상되어 새로운 후보군으로 선정하였다.

표 1의 5R19 phage 클론 및 상기 4R5 phage 클론을 상기 실시예<2-5>와 동일한 방법으로 ELISA를 실시하여 흡광도로 phage의 결합정도를 비교한 결과, 5R19 phage 클론 및 4R5 phage 클론은 cTnI에 대해 선택적 표적성을 보였으며, 다른 BSA 및 CKB 단백질에서는 결합력이 현저히 저하됨을 확인하였다. 그러나 도 8에서 보듯이 자연발생형 인간 cTnI뿐만 아니라 대장균에서 추출한 인간 cTnI에서는 새롭게 발굴된 4R5 후보군이 5R19보다 결합 특이성이 탁월하게 높은 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 심근 트로포닌 I을 특이적으로 표적하는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 17 또는 서열번호 24로 표시되는 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI)) 표적 특이 펩타이드와 이를 유효성분으로 포함하는 진단용 조성물 및 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 심근 트로포닌 I을 특이적으로 표적하는 펩타이드는 목적 펩타이드와 결합 친화력 및 결합 특이성을 증강시키는 단백질 골격모듈을 포함하고 있어 심근질환에 특이적인 폴리펩타이드 또는 단백질을 검출하는데 효과적이므로 심근 질환의 진단에 이용할 수 있다.

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Polypeptide binding cardiac troponin I specifically and use thereof <130> NP12-0106 <160> 26 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DMIDEFwd <400> 1 gatcgaattc tacagcaatc aatgcctgt 29 <210> 2 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DMIDSSRvs <400> 2 gtcgaccctt cctggggtgg tgagctctct cttacagtca gcctt 45 <210> 3 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DMIDSSFwd <400> 3 gagctcacca ccccaggaag ggtcgaccga gtgtgcacgt gcaaa 45 <210> 4 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DMIDHRvs <400> 4 gatcaagctt ttagtgatgg tggtgatgat ggagtgtgca gacctttcc 49 <210> 5 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for library construction <400> 5 gatcgagctc nnknnknnkn nknnknnknn kgtcgaccat catcaccacc atcac 55 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for library construction <400> 6 gtgatggtgg tgatgatggt cgac 24 <210> 7 <211> 273 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DMIDnucleotide <400> 7 ggatccacag caatcaatgc ctgtgagatc agcaatggag gttgctctgc caaggctgac 60 tgtaagagaa ccaccccagg aaggcgagtg tgcacgtgca aagcaggcta cacgggtgat 120 ggcattgtgt gcctggaaat caacccgtgt ttggagaacc atggtggctg tgacaagaat 180 gcggagtgca cacagacagg acccaaccag gctgcctgta actgtttgcc agcatacact 240 ggagatggaa aggtctgcac actctaactc gag 273 <210> 8 <211> 304 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DMID-ESSH cassette nucleotide <400> 8 gaattctaca gcaatcaatg cctgtgagat cagcaatgga ggttgctctg ccaaggctga 60 ctgtaagaga gagctcacca ccccaggaag ggtcgaccga gtgtgcacgt gcaaagcagg 120 ctacacgggt gatggcattg tgtgcctgga aatcaacccg tgtttggaga accatggtgg 180 ctgtgacaag aatgcggagt gcacacagac aggacccaac caggctgcct gtaactgttt 240 gccagcatac actggagatg gaaaggtctg cacactccat catcaccacc atcactaaaa 300 gctt 304 <210> 9 <211> 310 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DMID-(X7) nucleotide <400> 9 gaattctaca gcaatcaatg cctgtgagat cagcaatgga ggttgctctg ccaaggctga 60 ctgtaagaga gagctcnnkn nknnknnknn knnknnkgtc gaccgagtgt gcacgtgcaa 120 agcaggctac acgggtgatg gcattgtgtg cctggaaatc aacccgtgtt tggagaacca 180 tggtggctgt gacaagaatg cggagtgcac acagacagga cccaaccagg ctgcctgtaa 240 ctgtttgcca gcatacactg gagatggaaa ggtctgcaca ctccatcatc accaccatca 300 ctaaaagctt 310 <210> 10 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DMID amino acid <400> 10 Thr Ala Ile Asn Ala Cys Glu Ile Ser Asn Gly Gly Cys Ser Ala Lys 1 5 10 15 Ala Asp Cys Lys Arg Thr Thr Pro Gly Arg Arg Val Cys Thr Cys Lys 20 25 30 Ala Gly Tyr Thr Gly Asp Gly Ile Val Cys Leu Glu Ile Asn Pro Cys 35 40 45 Leu Glu Asn His Gly Gly Cys Asp Lys Asn Ala Glu Cys Thr Gln Thr 50 55 60 Gly Pro Asn Gln Ala Ala Cys Asn Cys Leu Pro Ala Tyr Thr Gly Asp 65 70 75 80 Gly Lys Val Cys Thr Leu 85 <210> 11 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DMID-ESSH cassette amino acid <400> 11 Thr Ala Ile Asn Ala Cys Glu Ile Ser Asn Gly Gly Cys Ser Ala Lys 1 5 10 15 Ala Asp Cys Lys Arg Glu Leu Thr Thr Pro Gly Arg Val Asp Arg Val 20 25 30 Cys Thr Cys Lys Ala Gly Tyr Thr Gly Asp Gly Ile Val Cys Leu Glu 35 40 45 Ile Asn Pro Cys Leu Glu Asn His Gly Gly Cys Asp Lys Asn Ala Glu 50 55 60 Cys Thr Gln Thr Gly Pro Asn Gln Ala Ala Cys Asn Cys Leu Pro Ala 65 70 75 80 Tyr Thr Gly Asp Gly Lys Val Cys Thr Leu His His His His His His 85 90 95 <210> 12 <211> 92 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DMID-(X7) amino acid <400> 12 Thr Ala Ile Asn Ala Cys Glu Ile Ser Asn Gly Gly Cys Ser Ala Lys 1 5 10 15 Ala Asp Cys Lys Arg Glu Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Asp 20 25 30 Arg Val Cys Thr Cys Lys Ala Gly Tyr Thr Gly Asp Gly Ile Val Cys 35 40 45 Leu Glu Ile Asn Pro Cys Leu Glu Asn His Gly Gly Cys Asp Lys Asn 50 55 60 Ala Glu Cys Thr Gln Thr Gly Pro Asn Gln Ala Ala Cys Asn Cys Leu 65 70 75 80 Pro Ala Tyr Thr Gly Asp Gly Lys Val Cys Thr Leu 85 90 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> upstream primer <400> 13 agcggaccag attatcgcta 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> downstream primer <400> 14 aacccctcaa gacccgttta 20 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5R1 Phage clone <400> 15 Pro Ala Ala Ala Met Arg Val 1 5 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5R5 Phage clone <400> 16 Ser Ser Arg Thr Gly Ser Gln 1 5 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5R19 Phage clone <400> 17 Arg Ala Ser Ser Arg Leu Trp 1 5 <210> 18 <211> 633 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human Troponin I nucleotide <400> 18 atggcggatg ggagcagcga tgcggctagg gaacctcgcc ctgcaccagc cccaatcaga 60 cgccgctcct ccaactaccg cgcttatgcc acggagccgc acgccaagaa aaaatctaag 120 atctccgcct cgagaaaatt gcagctgaag actctgctgc tgcagattgc aaagcaagag 180 ctggagcgag aggcggagga gcggcgcgga gagaaggggc gcgctctgag cacccgctgc 240 cagccgctgg agttggccgg gctgggcttc gcggagctgc aggacttgtg ccgacagctc 300 cacgcccgtg tggacaaggt ggatgaagag agatacgaca tagaggcaaa agtcaccaag 360 aacatcacgg agattgcaga tctgactcag aagatctttg accttcgagg caagtttaag 420 cggcccaccc tgcggagagt gaggatctct gcagatgcca cgatgcaggc gctgctgggg 480 gcccgggcta aggagtccct ggacctgcgg gcccacctca agcaggtgaa gaaggaggac 540 accgagaagg aaaaccggga ggtgggagac tggcgcaaga acatcgatgc actgagtgga 600 atggagggcc gcaagaaaaa gtttgagagc tga 633 <210> 19 <211> 765 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Re human Troponin I nucleotide <400> 19 atgaaagaaa ccgctgctgc taaattcgaa cgccagcaca tggacagccc agatctgggt 60 accctggtgc cacgcggttc catggctgat atcggatcca tggcggatgg gagcagcgat 120 gcggctaggg aacctcgccc tgcaccagcc ccaatcagac gccgctcctc caactaccgc 180 gcttatgcca cggagccgca cgccaagaaa aaatctaaga tctccgcctc gagaaaattg 240 cagctgaaga ctctgctgct gcagattgca aagcaagagc tggagcgaga ggcggaggag 300 cggcgcggag agaaggggcg cgctctgagc acccgctgcc agccgctgga gttggccggg 360 ctgggcttcg cggagctgca ggacttgtgc cgacagctcc acgcccgtgt ggacaaggtg 420 gatgaagaga gatacgacat agaggcaaaa gtcaccaaga acatcacgga gattgcagat 480 ctgactcaga agatctttga ccttcgaggc aagtttaagc ggcccaccct gcggagagtg 540 aggatctctg cagatgccac gatgcaggcg ctgctggggg cccgggctaa ggagtccctg 600 gacctgcggg cccacctcaa gcaggtgaag aaggaggaca ccgagaagga aaaccgggag 660 gtgggagact ggcgcaagaa catcgatgca ctgagtggaa tggagggccg caagaaaaag 720 tttgagagcg cggccgcact cgagcaccac caccaccacc actga 765 <210> 20 <211> 210 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human Troponin I amino acid <400> 20 Met Ala Asp Gly Ser Ser Asp Ala Ala Arg Glu Pro Arg Pro Ala Pro 1 5 10 15 Ala Pro Ile Arg Arg Arg Ser Ser Asn Tyr Arg Ala Tyr Ala Thr Glu 20 25 30 Pro His Ala Lys Lys Lys Ser Lys Ile Ser Ala Ser Arg Lys Leu Gln 35 40 45 Leu Lys Thr Leu Leu Leu Gln Ile Ala Lys Gln Glu Leu Glu Arg Glu 50 55 60 Ala Glu Glu Arg Arg Gly Glu Lys Gly Arg Ala Leu Ser Thr Arg Cys 65 70 75 80 Gln Pro Leu Glu Leu Ala Gly Leu Gly Phe Ala Glu Leu Gln Asp Leu 85 90 95 Cys Arg Gln Leu His Ala Arg Val Asp Lys Val Asp Glu Glu Arg Tyr 100 105 110 Asp Ile Glu Ala Lys Val Thr Lys Asn Ile Thr Glu Ile Ala Asp Leu 115 120 125 Thr Gln Lys Ile Phe Asp Leu Arg Gly Lys Phe Lys Arg Pro Thr Leu 130 135 140 Arg Arg Val Arg Ile Ser Ala Asp Ala Thr Met Gln Ala Leu Leu Gly 145 150 155 160 Ala Arg Ala Lys Glu Ser Leu Asp Leu Arg Ala His Leu Lys Gln Val 165 170 175 Lys Lys Glu Asp Thr Glu Lys Glu Asn Arg Glu Val Gly Asp Trp Arg 180 185 190 Lys Asn Ile Asp Ala Leu Ser Gly Met Glu Gly Arg Lys Lys Lys Phe 195 200 205 Glu Ser 210 <210> 21 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Re human Troponin I amino acid <400> 21 Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser 1 5 10 15 Pro Asp Leu Gly Thr Leu Val Pro Arg Gly Ser Met Ala Asp Ile Gly 20 25 30 Ser Met Ala Asp Gly Ser Ser Asp Ala Ala Arg Glu Pro Arg Pro Ala 35 40 45 Pro Ala Pro Ile Arg Arg Arg Ser Ser Asn Tyr Arg Ala Tyr Ala Thr 50 55 60 Glu Pro His Ala Lys Lys Lys Ser Lys Ile Ser Ala Ser Arg Lys Leu 65 70 75 80 Gln Leu Lys Thr Leu Leu Leu Gln Ile Ala Lys Gln Glu Leu Glu Arg 85 90 95 Glu Ala Glu Glu Arg Arg Gly Glu Lys Gly Arg Ala Leu Ser Thr Arg 100 105 110 Cys Gln Pro Leu Glu Leu Ala Gly Leu Gly Phe Ala Glu Leu Gln Asp 115 120 125 Leu Cys Arg Gln Leu His Ala Arg Val Asp Lys Val Asp Glu Glu Arg 130 135 140 Tyr Asp Ile Glu Ala Lys Val Thr Lys Asn Ile Thr Glu Ile Ala Asp 145 150 155 160 Leu Thr Gln Lys Ile Phe Asp Leu Arg Gly Lys Phe Lys Arg Pro Thr 165 170 175 Leu Arg Arg Val Arg Ile Ser Ala Asp Ala Thr Met Gln Ala Leu Leu 180 185 190 Gly Ala Arg Ala Lys Glu Ser Leu Asp Leu Arg Ala His Leu Lys Gln 195 200 205 Val Lys Lys Glu Asp Thr Glu Lys Glu Asn Arg Glu Val Gly Asp Trp 210 215 220 Arg Lys Asn Ile Asp Ala Leu Ser Gly Met Glu Gly Arg Lys Lys Lys 225 230 235 240 Phe Glu Ser Ala Ala Ala Leu Glu His His His His His His 245 250 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7 UP FWD -100 : Forward primer for library sequencing <400> 22 agcgcgctcg ccgtgctaac 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7 Down Rvs -100 : Reverse primer for library sequencing <400> 23 ctgataactc agcggcagtc 20 <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4R5 Phage clone <400> 24 Arg Cys Ala Ala Arg Arg Ser 1 5 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5R19 polynucleotide <400> 25 cgtgcgtcgt cgcgtctttg g 21 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4R5 polynucleotide <400> 26 aggtgtgctg cgaggcggtc g 21

Claims

서열번호 17 또는 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI))에 특이적인 폴리펩타이드.
삭제
제1항의 폴리펩타이드를 암호화하는 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드.
제3항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
제4항의 벡터로 형질전환된 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphyloccoccus), 아그로박테리움 투메파이엔스(Agrobacterium tumefaciens)로 이루어진 군에서 선택된 형질전환 미생물.
제1항의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI)) 검출용 조성물.
제6항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 바이오틴(biotin), 발색효소, 방사성동위원소, 크로모포어(chromophore), 발광물질, 형광물질(fluorescer), 상자성입자(super paramagnetic particles) 및 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles)로 이루어진 군에서 선택되는 하나로 표지된 것을 특징으로 하는 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI)) 검출용 조성물.
제1항의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 심근경색, 협심증, 고혈압(hypertension), 감염성 질환(infection), 패혈증(sepsis), 부정맥(arrhythmias), 폐색전증(pulmonary embolism), 뇌압상승(increased intracranial pressure), 신부전(renal insufficiency), 상부위장관 출혈(UGI bleeding), 급성 호흡곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome), 말기 신질환(End stage renal disease), 유전분증(amyloidosis), 당뇨병(diabetes) 및 심장독성으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 증상/질환인 것을 특징으로 하는 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin(cTnI)) 관련 증상/질환 진단용 조성물.
삭제
심근경색, 협심증, 고혈압(hypertension), 감염성 질환(infection), 패혈증(sepsis), 부정맥(arrhythmias), 폐색전증(pulmonary embolism), 뇌압상승(increased intracranial pressure), 신부전(renal insufficiency), 상부위장관 출혈(UGI bleeding), 급성 호흡곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome), 말기 신질환(End stage renal disease), 유전분증(amyloidosis), 당뇨병(diabetes) 및 심장독성으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI)) 관련 증상/질환의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 제1항의 폴리펩타이드와 요 또는 혈액 내 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI))의 결합여부를 확인하여 심근 트로포닌 I(Cardiac troponin I(cTnI))를 검출하는 방법.