SK7602001A3 - Hbv core antigen particles with multiple immunogenic components attached via peptide ligands - Google Patents

Hbv core antigen particles with multiple immunogenic components attached via peptide ligands Download PDF

Info

Publication number
SK7602001A3
SK7602001A3 SK760-2001A SK7602001A SK7602001A3 SK 7602001 A3 SK7602001 A3 SK 7602001A3 SK 7602001 A SK7602001 A SK 7602001A SK 7602001 A3 SK7602001 A3 SK 7602001A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
hbv
core antigen
capsid
virus
immunogenic
Prior art date
Application number
SK760-2001A
Other languages
English (en)
Inventor
Kenneth Murray
Original Assignee
Biogen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biogen Inc filed Critical Biogen Inc
Publication of SK7602001A3 publication Critical patent/SK7602001A3/sk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • A61K39/292—Serum hepatitis virus, hepatitis B virus, e.g. Australia antigen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6075—Viral proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • A61K2039/627—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier characterised by the linker
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/64—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the architecture of the carrier-antigen complex, e.g. repetition of carrier-antigen units
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10123—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G01N2333/02—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier

Description

Predkladaný vynález sa týka antigénnych častíc jadra vírusu hepatitídy B (HBV), ktoré sú charakterizované viacnásobnou imunogénnou špecifitou. Konkrétne sa vynález týka častíc jadrového antigénu HBV, ktoré obsahujú imunogény, epitopy a ďalšie príbuzné štruktúry, viazané zosieťovaním prostredníctvom ligandov, čo sú peptidy viažuce sa na kapsid HBV, ktoré selektívne viažu aj jadrový proteín HBV. Také častice sa môžu využiť ako prenosový systém na celé spektrum rôznych imunogénnych epitopov, vrátane peptidov viažucich sa na kapsid HBV, ktoré tiež výhodne inhibujú a narúšajú zloženie vírusu HBV tým, že blokujú interakciu medzi jadrovým proteínom HBV a povrchovým proteínom HBV. Zmesi rôznych imunogénov, ligandov peptidov viažucich sa na kapsid HBV alebo obidvoch môžu byť zosieťovaním viazané na tú istú časticu jadra HBV. Výsledné viaczložkové (multikomponentné) alebo multivalentné častice jadra HBV sa môžu výhodne použiť v terapeutických aj profylaktických vakcínach a kompozíciách a tiež v diagnostických kompozíciách.
Doterajší stav techniky
Prvá línia klinických imunoterapeutických režimov zahŕňa imunizáciu pacientov proti infekčným patogénom a ďalším agensom ohrozujúcim zdravie. Aj napriek značnému množstvu imunizačných agensov, očkovanie poskytuje prinajlepšom len čiastočnú imunitu a je potrebná častá reimunizácia. To je prípad bežných monovalentných alebo polyvalentných vakcín. A dokonca aj medzi týmito vakcínami je počet očkovacích látok schopných samostatne vyvolať imunitu proti rôznym imunogénom veľmi obmedzený. Okrem toho antigénna variabilita patogénov obmedzuje účinnosť konvenčných vakcín.
Vzhľadom na tieto problémy sa venovalo značné úsilie nájdeniu spôsobov, ako zosilniť reakciu imunitného systému na daný imunogén. S týmto cieľom boli napr. pripravené imunogénne konjugáty naviazaním imunogénov na časticu jadra vírusu hepatitídy B (HBV) (označovaná aj ako nukleokapsid alebo nukleokapsidový obal), aby sa zvýšila imunogenicita naviazaného imunogénu prostredníctvom determinantov antigénu jadra HBV, a to tak závislých ako aj nezávislých na T-lymfocytoch. Pozri napr. Patent USA č. 4 818 527 a R. Ulrich et al., Core Particles of Hepatitis B Virus as Carrier for Foreign Epitopes, Adv. Virus Res. 50, 141-182, 1998). Zosilnenie imunogenicity požadovaných epitopov bolo tiež dosiahnuté pomocou hybridných proteinov tvoriacich vírusové častice, obsahujúcich aspoň časť prirodzene sa vyskytujúceho proteínu, ktorý tvorí vírusové častice, napr. povrchového antigénu HBV a jeden alebo viac požadovaných epitopov, pozri Patent USA č. 5 965 140. Ako je zrejmé z týchto pokusov, proteíny HBV beli použité ako platforma na prezentáciu požadovaných imunogénov imunitného systému.
Vírus hepatitídy B je krvou prenášaný virus, obsahujúci malý genóm z čiastočne dvojreťazcovej DNA nesúci štyri značne sa prekrývajúce čítacie rámce a pozostáva z vnútorného nukleokapsidu obsahujúceho jadrový proteín HBV (HbcAg), vírusovú polymerázu a vírusovú DNA, ktorý je obklopený obalovou membránou obsahujúcou povrchový antigén HBV (HbsAg). Vírusový obal obsahuje tri rôzne, ale príbuzné proteíny povrchových antigénov, tzv. dlhý (L) , stredný (M) a krátky (S) , ktoré majú spoločný karboxykoncový úsek, ale majú odlišné aminokoncové úseky, čo je dôsledok variabilného použitia iniciačného tripletu v rôznych miestach súvislého otvoreného čítacieho rámca.
Dlhý polypeptid (L polypeptid) obsahuje úseky pre-Sl, preS2 a S. Je produktom celého čítacieho rámca a obsahuje na svojom aminokonci doménu pre-Sl obsahujúcu 108 aminokyselín (alebo 199, v závislosti na subtype vírusu), potom nasleduje doména pre-S2 z 55 aminokyselín a potom úsek krátkeho polypeptidu (S polypeptid) z 226 aminokyselín. Stredne dlhý polypeptid (M polypeptid) obsahuje na svojom aminokonci doménu pre-S2, po ktorej nasleduje S úsek, zatiaľ čo S polypeptid, ktorý je najčastejšou formou, obsah je len úsek S. Úseky pre-S hrajú dôležitú úlohu tak pri poskladaní vírusu ako aj pri jeho prichytení na hostiteľskú bunku. S forma je vo víruse častejšia ako M a L formy HbsAg a vyskytuje sa tak v glykozylovanej ako aj v neglykozylovanej podobe (V. Bruss a D. Ganem, The Role of Envelope Protein in Hepatitis B Virus Assembly, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 105963, 1991, V. Bruss et al., Post-translational Alteration in
Transmembrane Topology of Hepatitis B Virus Large Envelope Protein, EMBO J. 13, 2273-79, 1994, A. R. Neurath et al., Identification and Chemical Synthesis of a Host Celí Receptor Binding Site on Hepatitis B Virus, Celí 46, 429-36, 1986, K. Ueda et al., Three Envelope Proteins of Hepatitis B Virus: Large S, Middle S and Major S Proteins Needed for the Formation of Dane Particles, J. Virol. 65, 3521-29, 1991.) Špecifické interakcie medzi vonkajším povrchom vírusového jadra a vnútorným povrchom vírusového obalu pravdepodobne vedú k správnemu poskladaniu vírusu a stabilizujú vzniknutú vírusovú časticu.
Proteíny jadra HBV môžu byť účinne exprimované v E. coli (M. Pasek et al., Hepatitis B Virus Genes and Their Expression in E. coli, Náture 282, 575-79, 1979), kde vytvárajú obaly v tvare ikosaédra (dvadsaťstenu) v dvoch veľkostiach, ktoré obsahujú buď 280 (T=3) alebo 240 (T=4) podjednotiek (R. A. Crcwther et al., Three-Dimensional Structure of Hepatitis B Virus Core Particles Determined by Electron Microscopy, Celí 77, 943-50, 1994). Podjednotky sú zoskupené ako diméry a každý dimér vytvára hrot, ktorý vyčnieva z povrchu obalu. Použitím elektrónovej kryomikroskopie a spracovaním obrazu bola pripravená mapa obalu T=4 s rozlíšením 7,4 Ä pri použití viac ako 6 000 snímok jednotlivých častíc (pozri B. Bóttcher et al., Determination of the Fold of the Core Protein of Hepatitis B Vírus by Electron Cryomicroscopy, Náture 386, 88-91, 1997). Tak bolo odhalené priestorové poskladanie polypeptidového reťazca, ktorý je zväčša vo forme α-závitnice a značne sa nepodobá už opísanému vírusovému kapsidu. Každý dimérny hrot je tvorený párom závitnicových vlásenkových štruktúr, po jednej z každého monoméru tvoriaceho dimér (Bóttcher et al., 1997, J. F. Conway et al., Visualisation of a 4-Helix Bundle in the Hepatitis B Vírus Capsid by Cryoelectron Microscopy, Náture 386, 91-94, 1997). Schéma číslovania, ktorá navrstvila sekvenciu aminokyselín na hélix (Bóttcher et al., 1997) umiestnila hlavný imunodominantný úsek HBV jadra okolo aminokyselín 78 až 82 (J. Salfeld et al., Antigenic Determinants and Functional Domains in Core Antigén and E Antigén from Hepatitis B Virus, J. Virol. 63, 798-808, 1989, M. Sällberg et al., Characterisation of a Lír.ear Binding Site for a Monoclonal Antibody to Hepatitis B Core Antigén, J. Med. Virol. 33, 248-52, 1991) na vrchole hrotu.
K činidlám, ktoré inhibujú poskladanie vírusu HBV, patria také činidlá, ktoré sa viažu na antigén jadra HBV a tým blokujú interakciu medzi proteínom jadra HBV a povrchovým proteínom. Také peptidy viažuce sa na kapsid HBV boli opísané v PCT patentovej prihláške WO98/18818 a v publikácii M. R. Dysor. a K. Murray, Selection of Peptide Inhibitors of Interactions Ir.vclved in Complex Protein Assemblies: Association of the Core and Surface Antigens of Hepatitis B Virus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 2194-98, 1995. Jeden taký peptid viažuci sa na kapsid, a to MRRSLLGRMKGA, bol zosieťcvaním naviazaný na antigén jadra HBV (Bóttcher et al., Peptides that Block Hepatitis B Vírus
Assembly: Analysis by Cryomicroscopy Mutagenesis and
Transfection, EMBO J. 17, 6839-95, 1998).
Ako bude zjavné z ďalšieho opisu, peptidy viažuce sa na kapsid HBV môžu byť výhodne po -.žité ako ligandy na konštrukciu
častíc HBV jadrového antigénu, zosilnenú imunitnú reakciu na imunogény. ktoré majú schopnosť vyvolať
jednoduché alebo viacnásobné
Podstata vynálezu
Predkladaný vynález rieši už uvedené problémy tým, že
poskytuje častice jadrového antigénu HBV, ktoré majú schopnosť vyvolať zosilnenú imunitnú reakciu na jeden alebo niekoľko imunogénov. Takéto viaczložkové alebo multivalentné častice jadrového antigénu HBV obsahujú imunogény, epitopy alebo iné príbuzné štruktúry, ktoré sú na častice naviazané zosieťovanim pomocou ligandov, čo sú peptidy selektívne sa viažuce na častice jadrového antigénu HBV, okrem imunogénnych domén alebo epitopov naviazaných alebo vložených do polypeptidu jadrového antigénu HBV metódami génového inžinierstva, t. j. modifikáciou kódujúcej sekvencie alebo syntézou polypeptidu. Takéto častice sa môžu využiť ako prenosový systém pre celé spektrum rôznych imunogénnych epitopov vrátane peptidov viažucich sa na kapsid HBV, ktoré výhodne navyše inhibujú a narúšajú poskladanie vírusu HBV tým, že blokujú interakciu medzi jadrovým proteinom HBV a povrchovým proteinom HBV. Zmesi rôznych imunogénov, ligandov peptidov viažucich sa na kapsid HBV alebo oboje môžu byť zosieťovanim naviazané na tú istú časticu jadra HBV. Výsledné viaczložkové (multikomponentné) alebo multivalentné častice jadra HBV sa môžu výhodne použiť v terapeutických aj profylaktických vakcínach a kompozíciách a tiež v diagnostických kompozíciách.
Predkladaný vynález výhodne umožňuje naviazať zosiefovanim zmes rôznych imunogénov, peptidových ligandov viažucich sa na kapsid HBV alebo zmes oboch zlúčenín na tú istú časticu jadrového antigénu HBV. Výsledkom je častica účinne stimulujúca T-lymfocyty, ktorá je imunologický multivalentná. Teda jediná bunka prezentujúca antigén môže stimulovať proliferáciu niekoľkých klonov B-lymfocytov s rôznou špecifitou.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1 znázorňuje štruktúru častice jadrového antigénu HBV obsahujúcu rôzne imunogény viažuce sa na kapsid HBV. Imunogén viažuci sa na kapsid obsahuje aspoň jednu peptidc-ú zložku viažucu sa na kapsid HBV a aspoň jednu imunogénnu zložku. Každý imunogén viažuci sa na kapsid je naviazaný na časticu jadrového antigénu HBV prostredníctvom peptidu viažuceho sa na kapsid HBV.
Obr. 2 je tabuľka prehľadne zhrňujúca rôzne fúzne proteíny jadrového antigénu HBV, ktoré môžu byť použité ako častice jadrového antigénu HBV, na ktoré môžu byť naviazané rôzne imunogény prostredníctvom peptidov viažucich sa na kapsid HBV.
Podrobný opis vynálezu
Podľa jedného výhodného uskutočnenia vynálezu môžu byť zmesi viac ako jedného typu imunogénu a viac ako jedného typu peptidového ligandu, viažuceho sa na kapsid HBV zosiefovanim, naviazané na tú istú časticu jadrového antigénu HBV. Alternatívne sa viac kópií toho istého imunogénu naviaže na jeden typ peptidu viažuceho sa na kapsid HBV a potom sa zosiefovanim naviaže na rôzne miesta jednej častice jadrového antigénu HBV. Takéto viaczložkové alebo multivalentné častice jadrového antigénu HBV sú užitočné na indukciu protilátok proti všetkým zúčastneným imunogénnym zložkám.
- r -
Použitie peptidov viažucich sa na kapsid HBV na naviazanie imunogénov na časticu jadrového antigénu HBV umožňuje zosilniť prezentáciu imunogénov bez toho, aby sa poškodila imunogenicita alebo stabilita imunogénu denaturáciou, porušením konformácie alebo iným destabilizujúcim účinkom. Tak napr. spojovacie peptidy viažuce sa na kapsid HBV znižujú riziko, že jednotlivé imunogény budú navzájom interferovať a že by dochádzalo ku stratám funkčného materiálu. Výsledkom teda je, že častice jadrového antigénu HBV podľa predkladaného vynálezu vyvolávajú zosilnenú imunitnú reakciu na každú svoju imunogénnu zložku. Takže je možné dosiahnuť požadovaný terapeutický alebo profylaktický účinok s menším počtom očkovaní a/alebo menším množstvom očkovacej látky ako ktoré je potrebné, keď je každý imunogén podávaný ako samostatný agens.
Naviazanie imunogénov na častici jadrového antigénu HBV prostredníctvom peptidov viažucich sa na kapsid HBV tiež umožňuje prezentáciu imunogénov, ktoré sa líšia veľkosťou, konformáciou a povahou. Teda predkladaný vynález umožňuje do jednej vakcíny alebo kompozície vložiť kombináciu imunogénov užitočnú na vyvolanie širckospektrálnej imunity alebo liečby.
Imunogény
K imunogénom, kroré mcžu byť naviazané na peptidy viažuce sa na kapsid HBV a teda vložené do častice jadrového antigénu HBV, patria akékoľvek molekuly obsahujúce jeden alebo viac imunologických, imunogénnych alebo antigénnych epitopov. Také epitopy sú svojou povahou lineárne, konformačné, jednoduché alebo zmiešané.
Konkrétne imunogény môžu byť vybraté zo všetkých činidiel, ktoré sú schopné vyvolať imunitnú reakciu. Bez toho, aby bolo vymenovanie obmedzujúce, k takýmto činidlám patria antigény, antigénne determinanty, proteiny, glykoproteíny, protilátky, fragmenty protilátok, peptidy, peptidomimetiká, ktoré napodobňujú antigén alebo antigénny determinant, polypeptidy, glykopeptidy, sacharidy, oligosacharidy, polysacharidy, oligonukleotidy a polynukleotidy. Imunogénmi sú aj alergény, toxíny alebo endotoxíny.
K týmto činidlám patria aj činidlá zamerané na alebo odvodené od rôznych patogénnych agensov, ako sú napr. vírusy, parazity, baktérie, huby, fágy, prvoky a rastliny. Z vírusov sú to napr. retrovírusy, vrátane vírusu humánnej imunodeficiencie typu 1 a typu 2 a vírusu T-lymfocytárnej leukémie, herpetické vírusy ako vírus Herpex simplex typu 1 a typu 2, vírus Varicella zoster, cytomegalovírus a Epstein-Barrov vírus, ortomyxovirusy ako je vírus chrípky A, B a C, paramyxovírusy ako je respiračný synciciálny vírus, osýpkam podobný vírus, vírus mumpsu a vírusy parainfluenzy, hepadnavírusy ako je vírus hepatitídy B, flavivírusy ako je vírus hepatitídy C, hepatitídy A a hepatitídy E, vírus žltej horúčky, vírus Dengue a vírus kliešťovej encefalitídy, pikornavírusy ako sú napr. enterovírusy, rinovírusy, vírusy krívačky a slintačky a vírus poliomyelitídy, togavírusy ako je vírus rubeoly, rabdovírusy ako je vírus besnoty, adenovírusy, ebolavirusy, bakulovírusy, hantavírusy, papovírusy ako je napr. papilomavírus, parvovírusy, DNA vírusy, RNA vírusy, RNA nádorové vírusy ako sú onkovírusy, poxvirusy ako je vírus vakcínie. Okrem toho môžu byť imunogény zamerané na alebo pochádzajúce z agensov ako sú bacily, enterobaktérie, klostrídie, listérie, mykobaktérie, pseudomonády, stafylokoky, eubaktérie, mykoplazmy, chlamýdie, spirochéty, neiserie alebo salmonely. Imunogény môžu byť tiež vybraté z nasledujúcich epitopcv vírusu humánnej imunodeficiencie: GELDRWEKI(gag), ELDKWAS (gp40), IGPGRAFYTTKN (slučka V3), ELDKWA (gp41) a DRFYKTLRA (gp41).
Ku glykoproteínom, ktoré môžu byť naviazané na peptidy viažuce sa na kapsid HBV a takto inkorporované do častice jadrového antigénu HBV, patria napr. protilátky, glykopeptidy z povrchu živočíšnych buniek, baktérií alebo vírusov, napr.
vyvolávajúcich meningitídu, alebo podobné týmto povrchovým štruktúram glykopeptidov, alebo fragmenty takýchto štrukcur.
Odborníkovi je zrejmé, že veľkosť imunogénu by mala byť taká, aby jeho funkčné skupiny neinterferovali so spojovacím peptidom viažucim sa na kapsid HBV.
Proteín jadrového antigénu HBV
Vzhľadom na svoju zvláštnu povahu predstavuje proteín jadrového antigénu HBV výhodnú platformu na prezentáciu niekoľkých imunogénov, podobného alebo odlišného typu, imunitnému systému. Podľa predkladaného vynálezu je táto výhoda ešte zosilnená použitím peptidov viažucich sa na kapsid HBV ako ligandov na naviazanie požadovaných imunogénov na časticu jadrového antigénu HBV. Také častice obsahujú buď 90 alebo 120 väzbových miest pre ligand, a to hrotov kapsidu, keď každý nrot je tvorený dimérom jadrcvéno antigénu HBV (pozri obr. 1) . Takže viac antigénov môže pyť fyzicky naviazaných na časticu jadrového antigénu HBV pomocou peptidov viažucich sa na kapsid HBV ako ligandov. Výsledná častica je potom schopná vyvolať imunitnú reakciu na všetky imunogénne zložky v nej obsiahnuté.
Častice jadrového antigénu HBV môžu byť pripravené expresiou rekombinancnej kódujúcej sekvencie pre polypeptid jadrového antigénu HBV vo vhodnom mikrobiálnom, živočíšnom alebo rastlinnom systéme, pozri napr. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratorv Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York·, 1989. Polypeptid, ktorý sa exprimuje, obsahuje úplnú sekvenciu jadrového antigénu HBV alebo jeho mutovanú, skrátenú alebo derivovania fojľmu alebo jej časť, ktorá si uchováva schopnosť vytvoriť časticovú formu v bunkách použitého expresného systému. Rekombinantné metódy vhodné na prípravu takýchto častíc jadrového antigénu HBV sú odborníkom známe, pozri napr. US patent č. 4 710 463.
Alternatívne sa na získanie polypeptidu jadrového antigénu HBV môžu použiť metódy chemickej syntézy. Na základe sekvencie jadrového antigénu HBV je možné uskutočniť syntézu na pevnej fáze (R. B. Merrifield, Fed. Proced. 21, 412, 1964, R. B. Merrifield, Biochemistry 3, 1385-90, 1964 a D. R. Milich et al., J. Immunol. 139, 1223-31, 1987).
Odborníkovi je zrejmé, že aj keď mutanty alebo varianty sekvencie jadrového antigénu HBV môžu ovplyvniť reakcie s väzbovými peptidmi alebo ligandmi, predkladaný vynález sa týka tak prirodzených variantov ako aj mutácii vnesených do kódujúcej sekvencie rekombinantnými metódami alebo aj iným spôsobom, v podjednotkách jadrového antigénu HBV alebo zodpovedajúcich väzbových peptidoch alebo ligandoch.
Mutácie zvyškov jadrového proteínu dôležitých pre väzbu peptidov
Metódy použité na stanovenie priestorového usporiadania (poskladania) jadrového proteínu sa uplatnili na kryomikroskopickú lokalizáciu väzbového miesta jadrového proteínu SLLGRMKGA, peptidu viažuceho sa na kapsid HBV, ktorý inhibuje väzbu L-HbsAg. Pomocou tejto metódy bolo ukázané, že peptid je naviazaný na vrcholy hrotov, a to tak pri obaloch typu T=3 ako aj T=4 (B. Bóttcher et al., Peptides that Block Hepatitis B Virus Assembly: Analysis by cryomicroscopy, Mutagenesis and Transfection, EMBO J. 17, 6839-45, 1998). Obrazová analýza ukázala, že väzbové miesto pre peptid leží na vrchole hrotov, čo zodpovedá podlá predpokladanej schémy zoradenia aminokyselín a priestorového poskladania polypeptidu (Bóttcher et al., 1997) aminokyselinovým zvyškom 78 až 82. V blízkosti vrcholu jadrového proteínu sú dva kysl.é zvyšky (glu77 a asp78) a zvolený väzbový peptid obsahoval dva zachované bázické zvyšky. Dôležitosť týchto zvyškov s opačným nábojom pre väzbovú reakciu bola potvrdená tým, že mutácia ktoréhokolvek z týchto dvoch kyslých zvyškov v prcteíne na alanín výrazne redukovala afinitu peptidu k zmenenému obalu jadra. Zmena kyseliny asparágovej v polohe 78 na alanin znížila afinitu 160x a zmena. kyseliny glutámovej v polohe 77 na alanin znížila afinitu lOOOx. To vedie k predpokladu, že jeden z týchto kyslých zvyškov alebo obidva zvyšky v proteíne jadrového antigénu HBV vytvárajú aspoň časť väzbového miesta pre peptidy viažuce sa na kapsid HBV.
Tieto výsledky tiež dokumentujú dôležitosť aminokyselinovej sekvencie jadrového antigénu HBV v úseku vrcholu hrotu pre väzbu ligandu. Odborníkovi je jasné, že jadrový antigén HBV z niektorých kmeňov HBV môže vyžadovať mutáciu, aby sa dosiahla účinná väzba konkrétneho ligandu a imunogénneho peptidu, alebo selekciu a adaptáciu variantov ligandu pre účinnú väzbu na špecifický variant jadrového antigénu HBV.
Fúzne proteíny jadrového antigénu HBV
Podľa jedného uskutočnenia predkladaného vynálezu časticami jadrového antigénu HBV, ku ktorým sa môžu naviazať imunogény prostredníctvom peptidov viažucich sa na kapsid HBV, môžu byť častice prezentujúce jeden alebo viac imunogénov ako výsledok metód génovej fúzie. Pri jednej takejto metóde sa relevantná kódujúca sekvencia vloží vo vhodnej pozícii do plazmidu alebo iného vektoru nesúceho gén pre polypeptid jadrového antigénu HBV.
Fúzia s génom β-galaktozidázy z E. coli, použitá na zvýšenie expresie polypeptidu jadrového antigénu HBV, ukázala, že nahradenie prvých dvoch aminokyselín antigénu sekvenciou jedenástich aminokyselín (osem z aminokonca β-galaktozidázy a tri ďalšie vzniknuté transláciou spojovacej sekvencie použitej na fúziu génov) nemalo negatívny účinok na získanie, antigenicitu alebo morfológiu výsledného produktu (S. Stahl et al., Hepatitis B Virus Core Antigén. Synthesis in Escherichia coli and Applicaticn in Diagnosis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 1606
10, 1982, B. J. Cohen and J. E. Richmond, Electron Microscopy of Hepatitis B Core Antigén Synthesized in E. coli, Náture 296, 677-78, 1982).
Fúzne proteíny jadrového antigénu HBV užitočné podľa predkladaného vynálezu môžu byť pripravené napr. spôsobom opísaným v S. J. Stahl and K. Murray, Immunogenicity of Peptide Fusions to Hepatitis B Vírus Core Antigén, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6283-87, 1989. Alternatívne fúzie sekvencii polypeptidov k hlavnému segmentu jadrového antigénu HBV s cieľom získať vysoko imunogénne častice sú ilustrované množstvom príkladov použitia vírusových kódujúcich sekvencii, ako je vymenované v tabuľke na obr. 2. Patri sem aj produkt vytvárajúci častice s vysokou imunogenicitou získaný expresiou peptídu VPI (aminokyselinové zvyšky 142 až 160) fúzovaného vo vektore vírusu vakcínie prostredníctvom sekvencie heptapeptidového lir.kera k šiestim aminokyselinám pre-jadrovej sekvencie bezprostredne predchádzajúcej aminokoniec polypeptidu jadrového antigénu HBV (B. E. Čiarke et al., Improved Immunogenicity of a Peptide Epitope after Fusion to Hepatitis B Core Proteín, Náture 330, 381-84, 1987). Ďalšie užitočné fúzne proteíny jadrového antigénu HBV pozri tiež Ulrich et al., 1998.
Séria ďalších fúznych proteínov je charakterizovaná nahradením úseku bohatého na arginín na karboxykonci polypeptidu jadrového antigénu HBV inou alternatívnou kódujucou sekvenciou. Peptidy obsahujúce imunodominantný úsek povrchového antigénu HBV (aminokyselinové zvyšky 111 až 165), epitopy pre-Sl a pre-S2 a rôzne segmenty obalového proteínu vírusu humánnej imunodeficiencie (HIV) boli naviazané na aminokyselinový zvyšok 144 polypeptidu jadrového antigénu HBV. Všetky boli účinne exprimované v E. coli a poskytli produkt vc forme častice, ktorá má v podstate rovnaké morfologické vlastnosti ako samotný jadrový antigén HBV (Stahl a Murray, 1989). Produkty vykazujú antigénnu reaktivitu jadrového antigénu HBV a ako preparáty polypeptidu jadrového antigénu HBV skráteného v mieste zvyšku 144 testované vzorky vykazovali reaktivitu s antigénom HBV, zatiaľ čo jadrové antigény HBV úplnej dĺžky mali túto aktivitu len veľmi malú. Fúzne proteíny nesúce aminokyselinové zvyšky 111 až 156 alebo 111 až 165 z povrchového antigénu HBV neprejavujú žiadnu významnú reaktivitu povrchového antigénu HBV, čo je výsledok, ktorý je konzistentný s konformačnou závislosťou tohto hlavného epitopu alebo pravdepodobnosťou, že sekvencia je ponorená dovnútra častice. Imunogénne reakcie na fúzne proteíny avšak odrážajú epitopy ich rôznych zložiek.
Imunitná reakcia na povrchový antigén HBV je zložitá, lebo navyše okrem epitopov v úsekoch pre-Sl a pre-S2 úsekov L-HbsAg a hlavnom imunodominantnom úseku a, je tu množstvo determinantov variabilných subtypov v ďalších úsekoch S polypeptidu povrchového antigénu HBV (G. L. Le Bouvier, The Heterogeneity of Austrália Antigén, J. Infect. Dis. 123, 671-75, 1971, W. H. Bancroft et al., Detection of Additional Antigenic Determinants of Hepatitis B Antigén, J. Immunol. 109, 842-48, 1972, A.-M. Couroucé-Pauty a P. V. Holland, Summary of Workshop A2: HbsAg and its Subtypes, in Viral Hepatitis. G. N. Vyas, S. N. Cohen a R. Schmid, eds., Philadelphia, USA: Franklin Inštitúte Press, 649-54, 1978). Kódujúce sekvencie povrchového antigénu HBV stanovené z HBV DNA klonovanej zo séra rôznych subtypov vykazujú rozdiely v zodpovedajúcich proteínových sekvenciách. Avšak jediná špecifická mutácia zjavne kritického aminokyselinového zvyšku neovplyvňuje zmenu z jedného sérologického subtypu (y) na iný (d), ale jedna ďalšia mutácia indukuje postupnú zmenu, keď tá istá molekula potom vykazuje tak y ako aj d reaktivitu a imunogenicitu (. G. Ashton-Rickardt a K. Murray, Mutations that Change the Immunological Subtype of Hepatitis B Vírus Surface Antigén and Distrnguish Between Antigenic and Immunogenic Determination, J. Med. Virol. 29, 204-14, 1989). Mutácie boli vytvorené priamo vo vnútri alebo blízko konformačne senzitívneho imunodominantného úseku a a boli všetky v segmente jadrového antigénu HBV použitého vo fúziách jadrového antigénu HBV už opísaných.
Dopad mutácií na subtypovú špecifitu indukovaných protilátok viedol k návrhu, že fúzne proteíny by tiež mohli poskytnúť prostriedok na zmenu špecifity reakcie na požadované epitopy, hlavne pokiaľ sú závislé na konformácii. Mutácie glycinu 145 na arginín, napodobňujúce prirodzeného únikového mutanta a na ďalšie pozitívne alebo negatívne nabité aminokyseliny (lyzín alebo kyselina glutámová) boli pripravené v HBcSni-156 na porovnávacie štúdiá humorálnej a bunkovej imunitnej reakcie (A. L. Shiau a K. Murray, Mutated Epitopes of Hepatitis B Surface Antigén Fused to the Core Antigén of the Virus Induce Antibodies That React with the Náture Surface Antigén, J. Med. Virol. 51, 159-66, 1997). Všetky boli účinne exprimované v E.
coli a poskytli podľa očakávaní časticové produkty vykazujúce silnú antigenicitu HBV jadra a indukovali u králikov vysoký titer protilátok proti jadrovému antigénu HBV.
Rovnako tak východiskový proteín HBcSni-i56, ako aj tri mutanty vo zvyšku 145 prejavovali minimálnu interakciu s protilátkami proti povrchovému antigénu HBV v rádioimunoteste na pevnej fáze AUSRIA (Abbott Laboratories) alebo v teste precipitácie protilátok v roztoku. Avšak všetky vykazujú silnú reakciu so sérom s králičími protilátkami proti povrchu HBV v imunoblotovacích experimentoch po elektroforeze v akrylamidovom géli pri denaturujúcich podmienkach (A. L. Shiau, Immunological Aspects of Hepatitis B Virus Core Antigén and its Derivatives, PhD Thesis, University of Edinburgh, UK, 1993). Pri vysokej koncentrácii pôvodné aj mutované proteíny tiež dávajú slabú pozitívnu reakciu s protilátkou proti povrchovému antigénu HBV pri zachytení na pevnom povrchu potiahnutom protilátkou proti povrchovému antigénu HBV, pravdepodobne v dôsledku nejakého r· r poškodenia častíc, ktorý dovoľuje prístup anti-HbsAg molekúl (Shiau a Murray, 1997).
Imunizované králiky boli použité na vyšetrenie reakcie Tlymfocytov na fúzne proteíny a tiež na produkciu protilátok. Mononukleárne bunky periférnej krvi (PBMC) odoberané v rôznych časoch po imunizácii boli použité v proliferačnom bunkovom teste založenom na inkorporácii [3H]-tymidínu v reakcii na expozíciu jadrovému antigénu HBV alebo .fúznemu proteínu použitému na imunizáciu. Vo všetkých prípadoch bola zistená silná reakcia, pričom podľa očakávaní fúzne proteíny vykazovali vyšší index stimulácie ako jadrový antigén HBV a povrchový antigén HBV pôsobil ako najhorší stimulant. Imunoprecipitačný test s dvojitou protilátkou (C. J. Burrell et al., Rapid Detection of Hepatitis B Surface Antigén by Double Antibody Radioimmunoassay, J. Med. Virol. 3, 1926, 1978) s povrchovým antigénom [125I]-HBV bol použitý na stanovenie anti-HBs vo vzorkách séra a ukázal očakávanú pozitívnu reakciu na HBcSui-i56· Arginínový mutant dával tiež pozitívnu reakciu, aj keď tak trochu slabšiu ako pôvodná molekula, slabá reakcia bola získaná pri mutante s kyselinou glutámovou, ale žiadna reakcia pri lyzínovom mutante.
Takže výsledky ukázali, že fúzny protein (označený HBcS-.^r) nesúci mutáciu v arginíne 145 pôsobil ako silný stiir.ulant Tlymfocytov a indukoval protilátky so širokou reakčnou špecifitou.
Ďalšia skupina fúzií rôznych častí polypeptidu povrchového antigénu HBV, obsahujúcich mutant v aminokyselinovom zvyšku 145, s polypeptidom jadrového antigénu HBV bola pripravená na vysvetlenie účinku celkovej veľkosti, počtu a pozícii rôznych ďalších zložiek na imunogenicitu produktu (Shiau, 1993). Tieto konštrukty sú tiež uvedené na obr. 2 a spoločne ešte s ďalšími fúziami poskytujú produkt vo forme častice, ktorá má morfológiu častice jadrového antigénu HBV, hoci fúzie s fragmentom HBsm-156 na aminokonci jadrového antigénu HBV boli menej vhodné, pretože tento produkt tvoril nerozpustné agregáty.
Táto skupina produktov, podobne ako predchádzajúca so segmentami HBcS111_156, prejavovala malú alebo žiadnu reaktivitu s protilátkou proti povrchovému antigénu HBV v pevnej fáze alebo v roztoku, avšak pri vychytávaní protilátkou proti jadrovému antigénu HBV na pevnej fáze prejavovali podobnú reaktivitu s protilátkou proti povrchovému antigénu HBV a tá bola o niečo vyššia (približne dvakrát), s fúziou obsahujúcou segmenty pre-Sl a pre-S2 navyše k HBcSiii-i56. Stimulácia inhibície proliferácie Tlymfocytov bola opäť silná u všetkých fúznych proteínov a tie, ktoré obsahovali segmenty pre-S a tiež natívne alebo mutované sekvencie HBcSm-156 poskytovali najsilnejšiu reakciu. Vloženie sekvencií pre-Sl a pre-S2 medzi sekvencie HBci44 a HBcSm-156 (buď mutované alebo divokého typu) viedlo k vyššej hladine protilátok v imunoprecipitačnom teste s dvojitou protilátkou v porovnaní s fúziami, ktoré nemajú pre-S segmenty, ale vloženie druhej sekvencie HBcSm-156, medzi HBci44 a pre-S sekvenciu už neviedlo k ďalšiemu zvýšeniu v žiadnej sekvencií naviazaných prolíne 144, a to negatívny účinok na zo sledovaných reakcií. Najdlhšia zo na polypeptid jadrového antigénu
165 aminokyselín, nemala zjavne výťažok alebo funkčné vlastnosti
HBV na žiadny fúzneho proteínu.
Jadrový proteín (HCc) vírusu hepatitídy C (HCV) bol tiež fúzovaný ako čiastočný peptid alebo ako viacnásobné úplné kópie s polypeptidom jadrového antigénu HBV skráteným v polohe valínu 149 (A. Yoshikawa et al., Chimeric Hepatitis B Vírus Core
Particles with Parts of Copies of the Hepatitis C Virus Core Proteín, J. Virol. 67, 6064-70, 1993). Fúzie nesúce HCc aminokyselinové zvyšky 39 až 75 prejavovali zanedbateľnú antigenicitu HCc, avšak zvyšky 1 až 91 alebo celá sekvencia 180 aminokyselín viedla k pozitívnej reakcii a antigenicita sa zvyšovala takmer aritmeticky s rastúcim počtom kópií (až do 4) sekvencie 1 až 180 pospájaných krátkymi spojkami (linkermi). Elektronmikroskopia ukázala, že fúzia nesúca jednu kópiu úseku 1 až 91 HCc vytvárala častice morfologicky zhodné s polypeptidom jadrového antigénu HBV, avšak tri kópie HCc úplnej dĺžky výrazne poškodili štruktúru a produkt bol veľmi citlivý na proteolýzu, avšak napriek tomu si tento materiál udržal antigenicitu jadra HBV. Zatiaľ čo najdlhší fúzny proteín niesol viac ako 720 ďalších aminokyselín, limit na vytvorenie častice typu jadrového antigénu HBV je zrejme podstatne nižší.
Sekvencia PrcS bola použitá v iných štúdiách, keď sa skúmal vplyv pozície fúzie k HbcAg na imunogenicitu. Borisova e: al. (1989) pripravila fúzie so segmentami pre-Sl (zvyšky 20 až 68, 20 až 69 a 69 až 106) alebo celým pre-S2 naviazaným na jadrový antigén HBV skrátený v prolíne 144 alebo s inzerciou v tejto polohe do sekvencie celého jadrového antigénu HBV. V týchto a ďalších ar.· logických konštruktoch so zvyškami 56 až 103 obalového proteínu vírusu bovinnej leukémie (BLV) alebo zvyškami 78 až 129 transmembránového proteínu (gp41) HIV, sa predpokladalo, že sekvencie fúzované s jadrovým antigénom HBV boli exponované na povrchu častice a boli všetky opísané ako antigénne aj imunogénne a C-koncová doména bohatá na arginín mala zjavne len malý negatívny účinok.
F. Schodel et al. (The Position of Heterologous Epitopes Inserted in hepatitis B Virus Core Particles Determines Their Immunogenicity, J. Virol. 6, 106-14, 1992) skúmali účinok polohy fúzie na antigenicitu a imunitnú reakciu u inbredných myší, keď boli segmenty pre-Sl alebo pre-S2 naviazané na aminokoniec jadrového antigénu HBV úplnej dĺžky (buď priamo alebo prostredníctvom pre-jadrovej sekvencie) alebo na karboxylový koniec skráteného jadrového antigénu HBV a ďalšie konštrukty obsahovali pre-Sl segment medzi zvyškami 75 až 83 jadrového antigénu HBV a tiež pre-S2 fragment na skrátenom karboxylovom konci (prolín 156).
Úplná analýza ukázala, že sekvencia pre-Sl fúzovaná s aminokoncom jadrového antigénu HBV prostredníctvom krátkej pre-jadrovej sekvencie bola antigénna, avšak fúzovaná priamo k aminokoncu nie a aj keď obidve mali rovnakú imunogenicitu jadrového antigénu HBV, fúzia obsahujúca pre-jadrovú sekvenciu stimulovala oveľa silnejšiu anti-pre-Sl reakciu. Sekvencia preS2 na konci skráteného jadrového antigénu HBV bola antigénna a imunogénna v podobnej miere v obidvoch kontextoch, ale sekvencia pre-Sl, fúzovaná vnútorne tak, že nahradila aminokyselinové zvyšky 76 až 82 (ktoré zahŕňajú hlavný epitop jadrového antigénu HBV), bola podstatne viac antigénna a dramaticky viac imunogénna ako keď bola fúzovaná na A-koniec. Ako sa dalo očakávať, antigenicita a imunogenicita jadrového antigénu HBV bola silne redukovaná vo vnútorných fúznych proteinoch. Nahradenie vnútornej sekvencie jadrového antigénu HBV (zvyšky 78 až 82) fragmentom povrchového antigénu HBV obsahujúci imunodominantný epitop a viedlo k produktu, ktorý tiež vykazoval pozitívnu antigenicitu a imunogenicictu jadrového antigénu HBV (G. Borisova et al., Hybrid Hepatitis B Vírus Nucleocapsid Bearing an Immunodominant Región from Hepatitis B Surface Antigén, J. Virol. 67, 3696-3701, 1993).
Ako ďalšia alternatíva alebo navyše k fúznym prcteinom opísaným vyššie, imunogénne zložky môžu byť naviazané na jadrový antigén HBV metódami chemického zosieťovania.
Prekrývanie aminokyselinovéj sekvencie jadrového antigénu HBV s fyzickou štruktúrou navrhnutou Bóttcherom et al. (1997) pomáha vysvetliť nízku antigenicitu sekvencii fúzovaných ku karboxykoncu jadrového antigénu HBV alebo v jeho blízkosti, zatiaľ čo fúzie na N-konci môžu využiť výhody flexibilných spojovacích sekvencii, ktoré umožnia umiestniť imunogén ďalej od relatívne uzavretého priestoru pri päte hrotov. Lokalizácia imunodominantného epitopu jadrového antigénu HBV (aminokyselinové zvyšky 78 až 82, Salfeld et al., 1989) na e r r r “· r « vrchole hrotov ukazuje atraktívnosť tejto lokalizácie na vkladanie alebo naväzovanie peptidových imunogénov viažucich sa na kapsid. V princípe všetky tieto pozície môžu byť využité súčasne na zvýšenie počtu a/alebo diverzity epitopov prezentovaných danou časticou jadrového antigénu HBV.
Peptidy viažuce sa na kapsid HBV použité na ligáciu imunogénov na častice jadrového antigénu HBV
Ako už bolo uvedené, požadované imunogény môžu byť naviazané na častice jadrového antigénu HBV pomocou ligandov, ktorým je peptid viažuci sa na kapsid HBV. Také peptidy viažuce sa na kapsid HBV sú izolované purifikované peptidy. Tieto peptidy viažuce sa na kapsid HBV výhodne inhibujú a narúšajú poskladanie vírusovej častice HBV tým, že blokujú interakciu medzi jadrovým proteínom HBV a povrchovým proteinom HBV.
Výhodne k peptidom viažucim sa na kapsid HBV patria peptidy a ich fragmenty, analógy a homológy, ktoré sú dlhé asi 2 až 20 aminokyselín. Výhodnejšie sú peptidy dlhé 3 až 15 aminokyselín. K týmto peptidom patria tie, ktoré sú uvedené v nasledujúcej tabuľke a tiež ich fragmenty a analógy.
Termín „fragment podľa predkladaného vynálezu označuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je kratšia ako peptid, z ktorého pochádza, pričom si uchováva biologickú aktivitu v podstate podobnú pôvodnému peptidu. Taký fragment obsahuje aspoň 2 aminokyseliny.
Termín „analóg aminokyselinovej líšiace sa od podľa sekvencie peptidov, pôvodného peptidu vynálezu čo označuje sú hlavne jednej až variácie
K ďalším príkladom analógov patria analógy štyroch peptidy aminokyselinách.
s malými zmenami v aminokyselinovej sekvencii oproti peptidom tu uvedeným ako príklady. Analógy tvoria hlavne peptidy obsahujúce konzervatívne zámeny aminokyselín, t. j. zámeny odohrávajúce sa v rámci rodiny aminokyselín príbuzných svojimi vedľajšími reťazcami.
Geneticky kódované aminokyseliny môžu byť rozdelené do štyroch skupín: 1) kyslé: kyselina asparágová a kyselina glutámová, 2) bázické: lyzín, arginín, histidín, 3) nepoláme: alanín, valín, leucín, izoleucín, prolín, fenylalanín, metionin, tryptofán, a 4) nenabité polárne: glycin, asparagín, glutamin, cysteín, serín, treonín, tyrozin. Fenylalanín, tryptofán a tyrozin sa niekedy spoločne označujú ako aromatické aminokyseliny. Pokiaľ ide o peptidy viažuce sa na kapsid HBV, je výhodné zameniť jednu alebo viac aminokyselín. Odborník ľahko zhodnotí význam takej zámeny.
Termín „homológ podľa vynálezu označuje peptidové fragmenty, ktoré zdieľajú aspoň 60% identitu na úrcvni aminokyselinovej sekvencie, výhodne 75% identitu a v podstate majú rovnakú biologickú aktivitu ako pôvodný peptid. Táto výhodná percentuálna identita odráža malú veľkosť peptidov.
K užitočným peptidom viažucim sa na kapsid HBV patria také, ktoré sú založené na peptidoch opísaných v publikácii Dyson a Murray (1995). Tieto peptidy boli získané syntézou po náhodnej mutagenéze zvyškov obklopujúcich peptid LLGRMK fúzovaný do fága BI reselekciou proti jadrovému antigénu HBV bioskríningcm na vyhľadanie derivátov, ktoré sa viažu na antigén so zvýšenou afinitou. Elektrónová kryomikroskopia s vysokým rozlíšením ukázala, že peptidy viažuce sa na kapsid HBV sa viažu na vrcholy hrotov obalu tvoreného jadrovým proteinom HBV. Inhibujúci účinok peptidov na interakciu medzi proteíncm jadrového antigénu HBV a proteinom povrchového antigénu HBV v infikovaných bunkách bol skúmaný pomocou transfekcie permeabilizovaných hepatómcvých buniek Hep G2 replikačne kompetetným plazmidom nesúcim dimér typu „hlava ku chvostu HBV genómu v prítomnosti alebo neprítomnosti peptidu. Pozri tiež Bottcher et al. (1998).
Peptidy viažuce sa na kapsid HBV nesúce sekvenciu LLGRMK znižujú výťažok HBV pri transfekovaných hepatómových bunkových kultúrach, a to spôsobom závislým na dávke a s relatívnou účinnosťou odrážajúcou hodnoty IC5o peptidov v inhibícii reakcie medzi jadrovým antigénom HBV a povrchovým antigénom L-HBV v roztoku.
Peptidy viažuce sa na kapsid HBV majú výhodne polovičnú maximálnu koncentráciu (IC50) nižšiu ako 10, výhodnejšie nižšiu ako 5, ešte výhodnejšie nižšiu ako 2 a najvýhodnejšie nižší ako 0,5 μΜ. K výhodným peptidom patria (avšak vymenovanie nie je obmedzujúce): SLLGRMKG(β-Α)C, RSLLGRMKGA, HRSLLGRMKGA a RSLLGRMKGA(β-Α)C alebo z nich odvodené peptidy. Alternatívne to môžu byť peptidy ako ALLGRMKG, ktorý inhibuje interakciu medzi dlhým povrchovým antigénom HBV (L HbsAg) a HbcAg s polovičnou maximálnou koncentráciou (IC50) približne 10,0 μΜ.
Príklady peptidov viažucich sa na kapsid HBV sú uvedené v nasledujúcom zozname, kde KD rel (nM) je relatívna disociačná konštanta reakcií medzi jadrovým antigénom HBV a fd fúznym fágom nesúcim peptidovú sekvenciu v aminokoncovom úseku gpIII proteínu (pozri Dyson a Murray, 1995).
Sekvencia KD rel (nM)
ADGALLGRMKGA 152 ± 5
ADGALLGRMKPA 7 67 ± 8
ADGSLLGRMKPA
ADGALLGRMKRA
ADGTLLGRMKLA
ADGSLLGRMKGA
322 ± 50
181 ± 12 ± 2
1,7 ± 0,3
ADRSLLGRMKGA
1,09 ± 0,02 r r
ADGSRSSLLGRMKGA 1,96 ± 0,32
ADGAHSSLLGRMKGA 1,72 ± 0,17
ADGHRSSLLGRMKGA 1,40 ± 0,13
ADGPRSSLLGRMKGA 0,84 ± 0,07
ADGAHRSLLGRMKGA 0,94 ± 0,12
ADGYQRSLLGRMKGA 0,88 ± 0,08
ADGTQRSLLGRMKGA 0,84 ± 0,06
ADGMHRSLLGRMKGA 0,55 ± 0,03
Tieto peptidy, ktoré napodobňujú cytoplazmatický úsek L HbsAg, boli identifikované selekciou z knižnice náhodných hexapeptidov exprimovaných na vláknitých fágoch (fágový aisplej) a ich afinity k jadrovému antigénu HBV v roztoku boli stanovené vo forme asociovanej s fágom. Ďalšie uvedené peptidy (zoznam uvedený ďalej) sú tiež príkladmi peptidov viažucich sa na kapsid HBV a v tabulke uvedené hcdnoty IC50 (μΜ) predstavujú koncentráciu peptidu potrebnú na 50% inhibíciu väzby L HbsAg na jadrový antigén HBV, údaj N/D označuje, že nebola pozorovateľná žiadna inhibícia a β-Α predstavuje β-alanin (pozri Dyson a Murray, 1995):
Sekvencia IC50 (μΜ)
ALLGRMKG 11,0 ± 0,8
LLGRMKG 46,2 ± 7,4
LGRMKG 980 ± 157
GRMKG N/D
LLGRM N/D
' *f f
CLLGRMKC 652 ± 74
ALLPRMKG N/D
SLLGRMKG 6,4 ± 0,7
SLLGRMK 40,7 ± 4,8
SLLGRMKGA 2,4 ± 0,2
GSLLGRMKGA 0,79 ± 0,23
DGSLLGRMKGAA 3,0 ± 0,4
ADGSLLGRMKGAAG 4,5 ± 0,8
ACSLLGRMKG 26,2 ± 5,0
SLLGRMKG(β-A)C 1,8 ± 0,4
RSLLGRMKGA 0,29 ± 0,02
HRSLLGRMKGA 0,50 ± 0,04
MHRSLLGRMKGA 0,80 ± 0,10
RSLLGRMKGA(β-Α)C 0,29 ± 0,03
MHRSLLGRMKGAG(β-Α)GC 3,80 ± 0,69
Peptidy viažuce sa na kapsid HBV, ich fragmenty, analógy
a homológy, ktoré slúžia ako ligandy na naviazanie imunogénov na
častice jadrového antigénu HBV, sú výhodne syntetizované zvyčajnými metódami syntézy peptidov, napr. chemickými metódami.
Alternatívne odborník môže syntetizovať ktorýkoľvek z uvedených peptidov pomocou automatického syntetizátora peptidov, napr. metódou s t-BOC (pozri napr. L. A. Carpino, J. Am. Chem. Soc. 79, 4427, 1957). Peptidy môžu byť tiež pripravené chemickým štiepením proteinov alebo inými metódami. Peptidy sa izolujú tak, aby boli v podstate bez chemických prekurzorov a ďalších prísad, pokiaľ sa pripravujú chemickou syntézou alebo chemickým štiepením proteínov.
Alternatívne sa peptidy viažuce sa na kapsid HBV pripravujú štandardnými metódami génového inžinierstva,
t. jtechnikami rekombinantných DNA, v hostiteľskej bunke transformované sekvenciou nukleovej kyseliny kódujúcej peptid, klonovaním a expresiou DNA fragmentu nesúceho kódujúcu sekvenciu vybratého peptidu v hostiteľskom mikroorganizme alebo bunke. Keď sa peptidy pripravujú rekombinantnou technológiou vo vhodne transformovaných bunkách, peptidy sa purifikujú od kultivačného média a/alebo hostiteľských buniek štandardnými postupmi. Rekombinantné peptidy sa izolujú, takže sú v podstate bez bunkového materiálu alebo kultivačného média, keď sú pripravené technikou rekombinantných DNA. Kódujúca sekvencia pre peptid môže byť pripravená synteticky alebo známym spôsobom odvodená z vírusovej RNA alebo z dostupných plazmidov obsahujúcich cDNA.
Na použitie v spôsoboch podľa predkladaného vynálezu uvedené peptidy sa môžu vložiť do známych alebo alternatívnych konštruktov na zvýšenie produkcie peptidu alebo jeho väzby na jadrový antigén HBV. Tak napr. peptidy môžu byť prípadne fúzované s iným peptidovým alebo proteínovým partnerom. Odborník ľahko skonštruuje peptid asociovaný s vybratým fúznym partnerom, ako je napr. ir.ý peptid alebo iné peptidy či proteíny, ktoré fúziou prinesú požadované vlastnosti.
Systémy vhodné na kloncvanie a expresiu peptidov viažucich sa na kapsid HBV v rôznych mikroorganizmoch a bunkách, ku ktorým napr. patria E. Coli, Bacillus, Streptomyces, Saccharomyces, ďalej cicavčie, kvasinkové a hmyzie bunky a tiež rastlinné bunky, vrátane vhodných vektorov, sú odborníkom známe a sú dostupné z rôznych verejných laboratórií a zbierok a tiež od komerčných dodávateľov.
Peptidy viažuce sa na kapsid rekombinantnou technológiou alebo purifikujú konvenčnými purifikačnými urči požadovaný stupeň čistoty ktorej majú byť peptidy použité.
na
HBV, či chemickou metódami.
požadovanú už pripravené syntézou, sa
Odborník ľahko aplikáciu, pri
Je potrebné chápať, že výber peptidu viažuceho sa na kapsid HBV závisí do určitej miery od povahy konkrétneho polypeptidu jadrového antigénu HBV vytvárajúceho časticu jadrového antigénu HBV. Tak napr. častice jadrového antigénu HBV z rôznych kmeňov vírusu budú vyžadovať iné ligandy peptidu viažuceho sa na kapsid HBV, pretože obsahujú odlišné aminokyselinové sekvencie vo väzbovom mieste ligandu alebo v jeho blízkosti v danom polypeptide jadrového antigénu HBV.
Naviazanie peptidov, viažucich sa na kapsid HBV, na imunogény
Na vytvorenie imunogénov viažucich sa na kapsid HBV môžu byť peptidy viažuce sa na kapsid HBV naviazané na požadované imunogény prostredníctvom peptidovej väzby. Keď je samotný imunogé.n peptidom, je toto možné zvyčajne dosiahnuť v jedinom syntetickom kroku alebo expresiou v transformovaných bunkách zodpovedajúcej kódujúcej sekvencie peptidu, ktorý obsahuje sekvenciu peptidu viažuceho sa na kapsid HBV naviazanú na sekvenciu imunogénu, zvyčajne a výhodne prostredníctvom troch až piatich (typicky troch) glycínových zvyškov, aby sa dosiahla dostatočná flexibilita spojenia medzi obidvoma zložkami tohto dlhého peptidu. Alternatívne sa peptid naviaže na imunogén zosieťovanim.
Orientácia väzby medzi zložkami, t. j. medzi peptidom a imunogénom, môže ovplyvniť účinnosť konečného procesu zosieťovania imunogénu viažuceho sa na kapsid HBV na časticu jadrového antigénu HBV. Alternatívne z množstva imunogénov viažucich sa na kapsid HBV, ktoré majú byť zosieťované na častici jadrového antigénu HBV, daný imunogén môže byť f f r r ** f - rt 'r ’ -cer, < í ;
umiestnený na aminokonci peptidu, ku ktorému je naviazaný, zatiaľ čo iný imunogén môže byť umiestnený na karboxykonci peptidu, ku ktorému je naviazaný. V niektorých prípadoch môže byť výhodné umiestniť rovnaké alebo rôzne imunogény na každý z koncov peptidu viažuceho sa na kapsid HBV. Také variácie v organizácii komplexov „peptid viažuci sa na kapsid HBV imunogén, ktoré sa zosieťujú na častici jadrového antigénu HBV, výhodne poskytujú vysoko multikomponentné alebo multivalentné častice jadrového antigénu HBV (pozri obr. 1).
Takže orientácia imunogénu viažuceho sa na kapsid HBV, ktorý sa má zosieťovať na časticu jadrového antigénu HBV, je dôležitá pre výslednú imunogenicitu alebo multivalentnosť výslednej častice. Vyššiu imunogenicitu alebo multivalentnosť je možné očakávať, keď je imunogén orientovaný k aminokoncu peptidu viažuceho sa na kapsid HBV. Taká orientácia, ktorá umožňuje väčšiu flexibilitu, je tiež výhodná pri imunogénoch väčších veľkostí.
Naviazanie imunogénov viažucich sa na kapsid na časticu jadrového antigénu HBV
Imunogény viažuce sa na kapsid HBV môžu byť zosieťované na časticu jadrového antigénu HBV použitím zvyčajného zosieťujúceho činidla. K takým zosieťujúcim činidlám patria napr. multifunkčné zosieťujúce činidlá, ako je napr. glutaraldehyd, oktandialdehyd a glyoxol. Ďalšie zosieťujúce činidlá sú uvedené v publikácii Pierce Catalog and Handbock, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois, 1997. K ďalším zosieťujúcim činidlám patria napr. hydrochlorid l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl) karbodiimidu (EDC) a N-hydroxysulfosukcínimid (sulfo-NHS), ktoré spájajú susediace primárne aminoskupiny a karboxylové skupiny do formy amidovej väzby. Keď sú pridané do zmesi imunogénu viažuceho sa na kapsid HBV a častíc jadrového antigér.j HBV, tieto činidlá kovalentne zosieťujú dostupné lyzinové zložky peptidu k susediacemu aspartátu alebo glutamátu z jadrového antigénu HBV.
Je potrebné chápať, že pomer rôznych imunogénov naviazaných na danú časticu jadrového antigénu HBV sa mení v závislosti od relatívneho zastúpenia imunogénov v zmesi použitej na zosieťovanie imunogénov viažucich sa na kapsid HBV na častice jadrového antigénu HBV.
Terapeutické kompozície podľa predkladaného vynálezu
Predkladaný vynález tiež poskytuje profylaxiu alebo liečbu viaczložkovými predkladaného a akýkoľvek iný liečení pomocou kompozície podľa častíc časticami vynálezu. cicavec častíc účinné alebo pacientov jadrového Akýkoľvek a tiež alebo podľa človek kompozície vhodné na multivalentnýiri antigénu HBV jedinec, tzn.
akýkoľvek živočích môžu byť jadrového antigénu HBV. Terapeutické obsahujú farmaceutický účinné množstvo množstvo, ktoré je viacerým ochoreniam ochorení u pacienta, do určitého časového vynálezu antigénu HBV, t.j. také imunizácii proti jednej alebo liečbe jednej alebo viacerých terapeutická kompozícia podávaná Profylaktická účinné množstvo častíc jadrového pri pri ktorému je intervalu.
množstvo, ktoré je účinné ochorení u jedinca, časového intervalu.
kompozícia obsahuje jadrového antigénu HBV, pri profylaxii jednej alebo ktorému je kompozícia podávaná do profylaktický , t. j . také viacerých určitého
V prípadoch, keď častice viac imunogénov rôznych typov, obsahujú, reakcie u a vakcíny, zosilnenej zloženého obsahujú ktoré ich imunitnej
V prípade, imunogénov obsahujú, reakcie imunogénu.
viac ktoré ich imunitnej kompozície jadrového antigénu HBV kompozície môžu byť využité na vyvolanie jedinca na každú zo zložiek keď častice jadrového antigénu HBV obsahujú rovnakého typu, kompozície a vakcíny, môžu byť využité na vyvolanie zosilnenej u jedinca na spoločný imunogén. Tieto a vakcíny sú charakterizované zosilnenou monovalentnosťou a silou v porovnaní s konvenčnou monoterapiou.
Kompozície obsahujúce multikomponentné alebo multivalentné častice jadrového samotné alebo ako prípravkov, buď s formulácie antigénu HBV podľa zložky farmaceutických alebo adjuvans alebo bez adjuvans a s riadeným uvoľňovaním. Prípravky vynálezu sú podávané profylaktických môžu ďalej to byť aj obsahujú farmaceutický prijateľné nosiče a riedidlá, vhodné na na liečenie podávanie infekcií.
fyziologicky inertné
Vhodné farmaceutický prijateľné a/alebo netoxické. Odborníkovi nosiče sú sú známe mnohé také nosiče vhodné sa vyberú podľa požadovanej aplikácie.
K príkladom vymenovanie patria, bez toho, aby bolo toto sterilný fyziologický roztok, laktóza, sacharóza, obmedzujúce, kalciumfosfát, želatína, dextrín, liadok, oxid hlinitý, hydroxid hlinitý, peptín, arašidový olej, olivový olej, sezamový olej a voda. Okrem toho nosiče alebo riedidlá môžu ako je glycerolmonostearát samotné alebo v kombinácii s voskami.
obsahovať „oneskorujúce činidlá, alebo glyceroldistearát,
Okrem toho môžu byť použité konvenčné polymérové prípravky s pomalým uvoľňovaním obsahujúce napr. rozpustné sklá.
Kompozície obsahujúce viaczložkové alebo multivalentné častice jadrového antigénu HBV môžu obsahovať aj ďalšie terapeutické alebo profylaktické činidlá. Tak napr. kompozícia môže obsahovať „koktail viacerých činidiel vhodných na liečbu alebo prevenciu infekcií. Taký koktail obsahuje interferóny, analógy nukleozidov a/alebo W-acetylcysteín.
Pripadne môže kompozícia obsahujúca častice jadrového antigénu HBV ďalej obsahovať modifikátory imunitného systému, ako sú adjuvans alebo cytckíny, ktoré sú užitočné na ďalšiu indukciu protilátok a reakcie T-lymfocytov u pacientov. K takým modifikátorom patria zvyčajné adjuvans založené na liadku, muramyldipeptidy, konzervačné látky, chemické stabilizátory alebo ďalšie antigénne proteíny. Typicky stabilizátory, adjuvans a konzervačné látky sú optimalizované tak, aby z hľadiska účinnosti poskytli najlepšiu formuláciu pre danú aplikáciu. K vhodným konzervačným látkam patria chlorylbutynol, sorbát sodný, kyselina sorbová, oxid siričitý, propylgalát, parabény, glycerín a fenol.
Vhodné množstvo týchto kompozícií požadovanej hladiny reakcie. Všeobecne sa stanoví na základe kompozície obsahujúce častice jadrového antigénu
HBV obsahujú zvyčajne 5 μg až 200 μg častíc. Tieto kompozície série niekoľkých očkovaní, mesiacov. Vhodná dávka sa podávajú vo forme jedného alebo napr. 3 očkovania v intervale 2 až 6 sa stanoví na základe posúdenia vezme do úvahy také faktory, ako je tiež zvyčajné hmotnosť, vek a keď sú podávané stavu pacienta samostatne v alebo pri je možné v obsahujúcej ošetrujúceho lekára, ktorý napr. zdravotný stav pacienta, dávky jednotlivých imunogénov, monoterapii. Po zlepšení pravdepodobnosti zvýšenej expozície danému patogénu prípade nutnosti podať udržovaciu dávku kompozície častice jadrového antigénu HBV. Potom môžu byť dávky alebo frekvencie podávania kompozície alebo oboje znížené na úroveň, keď je udržovaný požadovaný účinok. V tomto bode sa môže liečba zastaviť alebo prerušiť alebo ukončiť. Avšak pacienti môžu vyžadovať intermitentnú liečbu dlhodobo, pokiaľ sa objaví nežiaduci stav.
Kompozície obsahujúce multikomponentné alebo multivalentné častice jadrového antigénu HBV sa môžu podávať akýmkoľvek vhodným spôsobom, napr. parenterálnym, hlavne intramuskulárnym alebo subkutánnym spôsobom a tiež perorálne. Je možné použiť aj iný spôsob podávania, napr. spôsob pulmonálny, nazálny, aurálny, análny, dermálny, okulárny, intravenózny, intraarteriálny, intraperitoneálny, mukozálny, sublinguálny, subkutánny a intrakraniálny.
Imunogénne častice jadrového antigénu HBV podlá predkladaného vynálezu sa môžu použiť na aktívnu liečbu pacientov infikovaných HBV, aby sa inhibovala, znížila alebo spomalila proliferácia vírusu v tele. Terapeutické kompozície obsahujú imunogénne častice jadrového antigénu HBV schopné znemožniť, inhibovať alebo brániť zostavovaciemu mechanizmu vírusu. Terapeutické kompozície sú formulované s nosičmi a riedidlami a jednou alebo viacerými imunogénnymi časticami jadrového antigénu HBV podľa vynálezu. O takých nosičoch a riedidlách bolo už diskutované v spojení s niektorými kompozíciami a sú odborníkovi dobre známe.
Výroba kompozícií alebo vakcín, obsahujúcich ako účinnú látku imunogénnu časticu jadrového antigénu HBV, sa uskutočňuje formuláciou do injikovateľných kompozícií alebo vakcín, buď vo forme tekutého roztoku alebo suspenzie. Môžu byť tiež pripravené tuhé formy vhodné na vytvorenie roztoku alebo suspenzie v tekutine pred injikovaním. Prípravky môžu byť v niektorých prípadoch tiež emulgované alebo enkapsulované do lipozómov alebo do tekutých skiel na vytvorenie liekových foriem s kontinuálnym a/alebo predĺženým uvoľňovaním liečiva. Alternatívne sú prípravky vo forme aerosólu alebo spreja. Môžu byť tiež súčasťou transdermálnych náplastí. Účinná zložka môže byť zmiešaná s množstvom rôznych vehikúl, ktoré sú farmaceutický prijateľné a kompatibilné s účinnou zložkou. K takým vehikulám patria napr. Freundovo neúplné adjuvans, bakteriálne lipopolysacharidy, iónomeniče, oxid hlinitý, stearát hlinitý, muramyldipeptid, lecitin, pufrujúce látky, látky založené na celulóze a polyetylénglykol.
Výhodne vakcínami obsahujúcimi častice jadrového antigénu HBV podľa vynálezu sú kombinované vakcíny, obsahujúce niekoľko rôznych imunogénov. K takým vakcínam patria napr. kombinované vakcíny obsahujúce imunogény proti dvom alebo viacerým patogénnym agensom z nasledovných: záškrt, tetanus, čierny kašeľ, Haemophillus influenza, detská obrna, osýpky, mumps, rubeola, ovčie kiahne, hepatitída typu B a typu A a pneumokoková pneumónia. K ďalším výhodným vakcínam patria vakcíny na vakcináciu pred cestami, napr. obsahujúce imunogény proti dvom alebo viacerým patogénnym agensom z nasledujúcich: žltá horúčka, hepatitída B, hepatitída A, týfusová horúčka, meningokoková encefalitída a cholera.
Kompozície obsahujúce častice jadrového antigénu HBV podľa vynálezu sa môžu použiť tiež v imunoterapeutických režimoch na desenzibilizáciu u pacientov na jeden alebo viac alergénov, ako sú napr. alergény zvierat, hmyzu, rastlín alebo atmosférické alebo inhalované alergény.
Podľa alternatívneho uskutočnenia predkladaného vynálezu sa častice jadrového antigénu HBV môžu použiť na vyvolanie protilátok proti požadovaným imunogénom pri imunoterapii alebo na diagnostické účely. Tak napr. protilátky vytvorené v pacientovi po očkovaní časticami jadrového antigénu HBV sa môžu izolovať a potom použiť v čistej forme. Alternatívne sa také protilátky alebo zodpovedajúce B-lymfocyty izolované z pacientov môžu použiť na prípravu monoklonálnych protilátok s využitím štandardných metód.
Detekčné metódy podľa vynálezu
Častice jadrového antigénu HBV podľa predkladaného vynálezu sa môžu použiť v celom rade konvenčných testov, hlavne v testoch formátu imunotestu na diagnostiku infekcií alebo expozíciu infekčným agensom. Také využitie sa realizuje tak, že zložky konštruktu podľa vynálezu predstavujúce peptid viažuci sa na kapsid HBV sú asociované s diagnostickou značkou, ako je napr. chemický marker, toxín alebo iný proteín alebo peptid. Tak napr. peptidy viažuce sa na kapsid HBV sa môžu asociovať so zvyčajnými značkami, ktoré sú schopné, buď samé alebo v kombinácii s inou zlúčeninou alebo prípravkom, poskytnúť detegovateľný signál, ktorý je indikátorom prítomnosti hľadaného analytu vo vzorke, po expozícii imunogénom naviazaným na daný peptid viažuci sa na jadrový antigén HBV. Detegovateľné značky sa vyberú z mnohých zlúčenín a kompozícií, ktoré sú odborníkom na tento účel diagnostických testov známe.
Vynález preto nie je obmedzený žiadnym konkrétnym formátom testu a zahŕňa v podstate všetky formáty testov, ktoré sú odborníkom známe. Kvôli pohodliu používateľa všetky reagencie potrebné na uskutočnenie testu môžu byť poskytnuté vo forme diagnostickej súpravy (kitu). Taká súprava potom obsahuje mikrotitračnú doštičku, na ktorú boli preadsorbované častice jadrového antigénu HBV podľa vynálezu, rôzne riedidlá a pufre, značené konjugáty na detekciu špecificky naviazaných peptidových imunogénov viažucich sa na kapsid HBV a tiež ďalšie reagencie generujúce signál, ako sú enzýmové substráty, kofaktory a chromogény. Ďalšie zložky súpravy môžu byť odborníkom ľahko určené.
Alternatívne sa častice jadrového antigénu HBV podľa vynálezu môžu použiť v imunologických diagnostických testoch teraz bežne dostupných na detekciu patogénov, ako je rádioimunotest alebo ELISA (test s enzýmom viazaným na imunosorbent).
V jednom uskutočnení predkladaného vynálezu sa vzorka, v ktorej sa má testovať prítomnosť prctilátok k rôznym imunogénom, privedie do kontaktu s časticami jadrového antigénu HBV obsahujúcimi detegovateľne označené imunogény viažuce sa na kapsid HBV, ktoré majú rôzne imunogénne zložky, a to v čase dostačujúcom na to, aby akákoľvek protilátka zo vzorky vytvorila komplex s jedným alebo viacerými imunogénmi viažucimi sa na kapsid HBV. Potom sa detegujú komplexy vytvorené medzi imunogénom (imunogénmi) viažucim sa na kapsid HBV a danou protilátkou v skúmanej vzorke. Pri rovnakej vzorke sa uskutočni druhý test (screen) založený na každom imunogéne z komplexného imunogénu, aby sa identifikovala špecificita protilátok vo vzorke.
V alternatívnom uskutočnení predkladaného vynálezu sa vzorka, ktorá sa má testovať na prítomnosť protilátok ku špecifickému imunogénu, privedie do kontaktu s časticami jadrového antigénu HBV obsahujúcimi detegovateľne označené imunogény viažuce sa na kapsid HBV, ktoré majú tento špecifický imunogén ako imunogénnu zložku, a to v čase dostačujúcom na to, aby akákoľvek protilátka zo vzorky vytvorila komplex s jedným alebo viacerými imunogénmi viažucimi sa na kapsid HBV. Vďaka vysokej valencii špecifického imunogénu prezentovaného časticami jadrového antigénu HBV sa takto uskutočnený test vyznačuje vyššou citlivosťou ako štandardné testy.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Aby bol vynález podrobnejšie vysvetlený, sú uvedené nasledujúce príklady. Tieto príklady slúžia na ilustráciu výhodných uskutočnení vynálezu a žiadnym spôsobom predkladaný vynález neobmedzujú.
Príklad 1
Príprava jadrového antigénu HBV
Expresia buď celého jadrového antigénu HBV (aa3 - aal83) alebo jadrového antigénu HBV skráteného na C-konci (aa3 - aal48) v E. coli a následná purifikácia boli uskutočnené, ako bolo publikované v Dyson a Murray (1995). Proteínové preparáty boli uložené pri 4 °C ako frakcia sacharózového gradientu v pufri obsahujúcom TBS, sacharózu (20%) a NaN3 (0,028%). Preparáty boli stabilné v tejto podobe aspoň počas 6 mesiacov.
r 9 r r *
Chemické zosieťovanie peptidov viažucich sa na kapsid HBV na jadrový antigén HBV
Peptid MHRSLLGRMKGA viažuci sa na kapsid HBV (Albachem, University of Edinburgh) bol zosiefovaný na častice jadrového antigénu HBV pomocou hydrochloridu l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimidu (EDC) a N-hydroxysulfo-sukcínimidu (sulfoNHS) (obidve zlúčeniny od Pierce Európe B.V.). Tieto činidlá spájajú susediace primárne aminoskupiny a karboxylové skupiny amidovou väzbou (Staros et al., Enhancement by NHydroxysulphosuccinimide of Water-Soluble Carbondiimide-Mediated Coupling Reaction, Analytical Biochem. 156, 220-22, 1986). Keď sa pridajú ku zmesi peptidu viažuceho sa na kapsid HEV a jadrového antigénu HBV, mali by vytvoriť kovalentné väzby lyzin z peptidu s aspartátom alebo glutamátom z jadrového antigénu
HBV, čim sa zvýši molekulová hmotnosť.
Konkrétne teda bol skrátený jadrový antigén HBV (15 pg,’ inkubovaný pri izbovej teplote v pufri (30 μΐ) obsahujúcom fosforečnan draselný (25 mM, pH 7), NaCl (150 mM) , EDC (1,8 mM) a sulfo-NHS (1,8 mM) buď s peptidom MHRSLLGRMKGA (1 mM) alebo bez neho.
Po 18 hodinách bola reakcia analyzovaná na SDS/PAGE (15%) podľa Sambrook et al. (1989). Pridanie EDC a sulfo-NHS ku komplexom peptid-častica jadrového antigénu HBV viedlo k posunu frakcie jadrového antigénu HBV na géli o 1 kDA. Aj napriek uskutočneniu reakcie v rôznych podmienkach nebol dosiahnutý vyšší výťažok pásu posunutého proteínu ako 50%. To je v súlade s predstavou, že jeden peptid sa viaže na dimér jadrového antigénu HBV v blízkosti lokálnej osi dvojitého stočenia a tak stéricky blokuje väzbu ďalšieho peptidu v mieste príbuznom dvojitému stočeniu.
Príklad 2
Príprava jadrového antigénu HBV
Okrem dvoch vzoriek jadrového antigénu HBV pripravených v príklade 1 boli pripravené vzorky jadrového antigénu HBV so sekvenciou 1-36 HBV pre-Sl alebo so sekvenciou 111-156 alebo 111-165 povrchového antigénu HBV naviazanou na skrátený polypeptid jadrového antigénu HBV (skrátený v mieste zvyšku 144) prostredníctvom krátkeho spojovacieho peptidu, a to ako bolo opísané v Stahl a Murray (1989).
Chemické zosieťovanie peptidov viažucich sa na kapsid HBV na jadrový antigén HBV
Nasledujúce imunogény viažuce sa na kapsid HBV, pripravené syntézou na pevnej fáze, boli získané od firmy Albachem, University of Edinburgh:
AS-151 GSLLGRMKGA GGG LDPAFRG
AS-152 GSLLGRMKGA GGG EQKLISEEDL
AS-163 LDPAFR GG GSLLGRMKGA
AS-164 EQKLISEEDL GG GSLLGRMKGA
Sekvencia GSLLGRMKGA predstavuje peptid viažuci sa na kapsid HBV, sekvencia LDPAFR predstavuje epitop alebo imunogén pre-Sl HBV a sekvencia EQKLISEEDL je epitop alebo imunogén onkogénu myc. Tieto peptidy a základný peptid viažuci sa na kapsid HBV GSLLGRMKGA boli naviazané na častice jadrového antigénu HBV buď separátne alebo v kombináciách pri rôznych koncentráciách a zosieťované pôsobením EDC alebo sulfo-NHS, ako bolo opísané v príklade 1.
Vlastnosti pripravených častíc jadrového antigénu HBV
Produkty boli analyzované elektroforézou na polyakrylamidovom géli v prítomnosti SDS (SDS-PAGE) a potom zafarbené s Coomassie modrou a potom analyzované Western blotom s monoklonálnymi protilátkami a polyklonálnym králičím sérom proti časticiam jadrového antigénu HBV alebo denaturovaným časticiam povrchového antigénu HBV. Monoklonálne protilátky ku každému z HBV pre-Sl epitopu a epitopu onkogénu myc sú dostupné. Sú to monoklonálna protilátka 18/7 (K. H. Heermann et al., J. Virol. 52, 396-402, 1984) a monoklonálna protilátka 9E10 (Invitrogen, katalóg, č. R950-25).
Tieto experimenty ukázali, že produkty zo všetkých zosieťovacích reakcií vykazovali pozitívne reakcie s protilátkami proti každej epitopovej zložke v reakcii spojených zložiek. Pozitívne reakcie boli získané s imunogénom naviazaným prostredníctvom aminokonca alebo karboxykonca na peptidový ligand.
Ako je podrobnejšie uvedené ďalej, preparáty purifikovaných častíc jadrového antigénu HBV z reakcií zahrnujúcich zosieťovanie s jedným alebo viacerými rôznymi imunogénmi použitím spoločného peptidového ligandu viažuceho sa na kapsid HBV, reagovali s protilátkami ku všetkým imunogénnym zložkám. Okrem toho častice jadrového antigénu HBV precipitovali s protilátkou špecifickou k jednému z imunogénov a vykazovali skríženú reaktivitu s protilátkami k iným peptidom zúčastneným v procese zosieťovania ligandu.
Produkty ligácie boli podrobené centrifugácii v sacharózovom gradiente. Boli precipitované jednou z protilátok, a to protilátkou anti-myc a potom analyzované SDS-PAGE a Western blotom.
Materiál precipitovaný jednou z protilátok, napr.
protilátkou anti-myc, vykazoval silnú skríženú reaktivitu tak s anti-myc ako aj s anti-pre-Sl protilátkami pri analýze Western blotom. Produkty precipitované inou protilátkou, a to anti-preS1 protilátkou, vykazovali rovnaké vlastnosti.
V reakciách, kde peptidy viažuce sa na kapsid HBV nesúci rôzne imunogény boli zmiešané v rôznych pomeroch a naviazané a zosieťované na častice jadrového antigénu, SDS-PAGE a Western blot analýza ukázali, že relatívne intenzity zafarbenia dvoma monoklonálnymi protilátkami odrážali pomery dvoch imunogénov v zmesi použitej pri zosieťovani.
Tieto experimenty ukázali, že aspoň niektoré z častíc jadrového antigénu HBV pripravené v týchto reakciách mali na sebe kovalentne naviazané obidva imunogény. Pretože sa peptidové ligandy viažu na hroty častíc jadrového antigénu HBV (nukleokapsidy), také preparáty vykazujú vysokú imunogenicitu pre obidve zložky a je možné očakávať, že vyvolajú vysoké titre protilátok u pacienta, ktorému sa podávajú.
V prihláške boli uvedené len príklady výhodných uskutočnení vynálezu, pričom odborníkovi je jasné, že základné uskutočnenie vynálezu je možné do istej miery modifikovať a vytvoriť tak ďalšie uskutočnenie predkladaného vynálezu. Uvedené uskutočnenia teda predstavujú len možné ilustratívne príklady a vynález je definovaný pripojenými patentovými nárokmi.
Zoznam sekvencii
<140> PCT/US99/28755 <141> 1999-12-03
<150> 60/110,911
<151> 1998-12-04
<160> 47
<170> Patentln Ver. 2.1
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> Vírus HIV
<400> 1
Gly Glu Leu Asp Arg Trp Glu Lys íle
1 5
<210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> vírus HIV <400> 2 Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser
1 5
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> vírus HIV
<400> 3
íle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys Asn
1 5 10
<210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> vírus Ηιν <400> 4
Glu Leu Asp Lys Trp Ala
5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Vírus HIV <400> 5
Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala
5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> Umelá sekvencia
<220> <223> Opis umelej sekvencie: peptid viažuci sa na kapsid HBV
<400> 6
Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala
5 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: peptid viažuci sa na kapsid HBV <400> 7
Leu Leu Gly Arg Met Lys
5 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<221> MOD_RES <222> (9) <223> bAla <220>
<223> Opis umelej sekvencie: peptid viažuci sa na kapsid HBV <400> 8
Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Xaa Cys 15 10 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> umeiá sekvencia <220>
<221> MOD_RES <222> (11) <223> bAla <220>
<223> Opis ume^ej sekvencie: peptid viažuci sa na kapsid HBV <400> 9
Arg Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala 15 10 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <223> Opis umelej sekvencie: peptid viažuci sa na kapsid HBV <400> 10
His Arg Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala
10 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: peptid viažuci sa na kapsid HBV <220>
<221> MOD_RES <222> (11) <223> bAla <400> 11
Arg Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala Xaa Cys 15 10 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> °P1S umeleJ sekvencie: peptid viažuci sa na kapsid HBV <400> 12
Ala Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly
5 <210> 13 <211> 12 <212> PRT <213> Urae^-á sekvencia <220>
<223>
Opis umelej sekvencie: peptid viažuci sa na kapsid HBV <400> 13
Ala Asp Gly Ala Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala
10 <210> 14 <211> 12 <212> PRT <213 > umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: peptid viažuci sa na kapsid HBV <400> 14
Ala Asp Gly Ala Leu Leu Gly Arg Met Lys Pro Ala 15 10 <210> 15 <211> 12 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223>
Opis umelej sekvencie: peptid viažuci sa na kapsid HBV <400> 15
Ala Asp Gly Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Pro Ala 15 10 <210> 16 <211> 12 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
23>Opis umele] sekvencie: peptid viažuci sa na kapsid HBV <400> 16
Ala Asp Gly Ala Leu Leu Gly Arg Met Lys Arg Ala 15 10 <210> 17 • r - * <211> 12 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223>
Opis umelej sekvencie: peptid viažuci sa na kapsíd HBV <400> 17
Ala Asp Gly Thr Leu Leu Gly Arg Met Lys Leu Ala
10 <210> 18 <211> 12 <212> PRT <213> umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: peptid viažuci sa na kapsid HBV <400> 18
Ala Asp Gly Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala 15 10
<210> 19
<211> 12
<212> PRT
<213> Umelá sekvencia
<220> <223> Opis umelej sekvencie: peptic viažuci sa na kapsíd HBV
<400> 19
Ala Asp Arg Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala
10 <210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
c223> opis umelej sekvencie: peptic viažuci sa na kapsíd HBV • c* f ŕ <400> 20
Ala Asp Gly Ser Arg Ser Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala
10 15 <210> 21 <211> 15 <212> PRT <213> umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: peptid viažuci sa na kapsid HBV <400> 21
Ala Asp Gly Ala His Ser Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala
10 15 <210> 22 <211> 15 <212> PRT <213> umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: peptid viažuci sa na kapsid HBV <400> 22
Ala Asp Gly His Arg Ser Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala 15 10 15 <210> 23 <211> 15 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> opj_s umelej sekvencie: peptid viažuci sa na kapsid HBV <400> 23
Ala Asp Gly Pro Arg Ser Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala 15 10 15
<210> 24
<211> 15
<212> PRT
<213> Umelá sekvencia
<220> <223> Opis umelej sekvencie: peptid viažuci sa na kapsid HBV
<400> 24
Ala Asp Gly Ala His Arg Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala
1 5 10 15
<210> 25
<211> 15
<212> PRT
<213> Umelá sekvencia
<220> <223> Opis umelej sekvencie: peptid viažuci sa na kapsid HBV
<400> 25
Ala Asp Gly Tyr Gin Arg Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala
1 5 10 15
<210> 26
<211> 15
<212> PRT
<213> Umelá sekvencia
<220> <223> Opis umelej sekvencie: peptid viažuci sa na kapsid HBV
<400> 26
Ala Asp Gly Thr Gin Arg Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala
1 5 10 15
<210> 27
<211> <212> 15 PRT
<213> Umelá sekvencia
<220> <223 > Opis umelej sekvencie: peptid viažuci sa na kapsid HBV
<400> 27
Ala Asp Gly Met His Arg Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala
1 5 10 15
<210> 28
<211> 7
<212> PRT
<213> Umelá sekvencia <220>
<223> Qpis umelej sekvencie: peptid viažuci sa na kapsid HBV <400> 28
Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly
1 5
<210> 29
<211> 6
<212> PRT
<213> Umelá sekvencia
<220>
<223> Opis umelej sekvencie: peptid viažuci sa na kapsid HBV
<400> 29
Leu Gly Arg Met Lys Gly
1 5
<210> 30
<211> 5
<212> PRT
<213> Umelá sekvencia
<220> <223> Opis umelej sekvencie: peptic viažuci sa na kapsid HBV
<400> 30
Gly Arg Met Lys Gly
<210> 31
<211> 5
<212> PRT
<213> Umelá sekvencia
<220>
<223>Qp^s ujjjgigj sekvencie: peptid viažuci sa na kapsid HBV <400> 31
Leu Leu Gly Arg Met
1 5
<210> 32
<211> 8
<212> PRT Umelá sekvencia
<213>
<220> <223> Opis umelej sekvencie: peptid viažuci sa na kapsid HBV
<400> 32
Cys Leu Leu Gly Arg Met Lys Cys
1 5
<210> 33
<211> 8
<212> PRT
<213> Umelá sekvencia
<220> <223> Opis umelej sekvencie: peptid viažuci sa na kapsid HBV
<400> 33
Ala Leu Leu Pro Arg Met Lys Gly
1 5
<210> 34
<211> 8
<212> PRT
<213> Umelá sekvencia <220>
<223>
Opis umelej sekvencie: peptid viažuci sa na kapsid HBV <400> 34
Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly
5 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: peptid viažuci sa na kapsid HBV <400> 35
Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys
5 <210> 36 <211> 10 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: peptid viažuci sa na kapsid HBV <400> 36
Gly Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala 15 10 <210> 37 <211> 12 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
< * Opis umele; sekver.tie: peptid viažuci sa na kapsid HBV <400> 37
Asp Gly Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala Ala 15 10 <210> 38 <211> 14 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223>
Opis umelej sekvencie: peptid viažuci sa na kapsid HBV <400> 38
Ala Asp Gly Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala Ala Gly 15 10 <210> 39 <211> 10 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223 >
Opis umelej sekvencie: peptid viažuci sa na kapsid HBV <400> 39
Ala Cys Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly 15 10 <210> 40 <211> 12 <212> PRT
Uirelá sekvencia <213 >
<220>
<223> Opis umelej sekvencie: peptid viažuci sa na kapsid HBV <400> 40
Met His Arg Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala 15 10 <210> 41 <211> 16 <212> PRT <213> Ume2-á sekvencia <220>
<221> MOD_RES <222> (14) <223> b Ala <220>
<223> Opis umelej sekvencie: peptid viažuci sa na kapsid HBV <400> 41
Met His Arg Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala Gly Xaa Gly Cys 15 10 15 <210> 42 <211> 20 <212> PRT <223> Umelá sekvencia <220>
<223> opis umelej sekvencie: peptid viažuci sa na kapsid HBV <400> 42
Gly Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala Gly Gly Gly Leu Asp Pro 15 10 15
Ala Phe Arg Gly <210> 43 <211> 23 <212> PRT <213>Umelá sekvencia <220>
<223>
Opis umelej sekvencie: peptid viažuci sa na kapsid HBV <400> 43
Gly Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala Gly Gly Gly Glu Gin Lys 15 10 15 e r r t *“ e ŕ r
Leu íle Ser Glu Glu Asp Leu
20
<210> 44
<211> 18
<212> PRT
<213> Umelá sekvencia
<220> <223> Qpis umelej sekvencie: peptid viažuci sa na kapsid HBV
<400> 44
Leu Asp Pro Ala Phe Arg Gly Gly Gly Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys 15 10 15
Gly Ala <210> 45 <211> 22 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Qpis umelej sekvencie: epitop alebo imunogén onkogénu myc <400> 45
Glu Gin Lys Leu íle Ser Glu Glu Asp Leu Gly Gly Gly Ser Leu Leu 15 10 15
Gly Arg Met Lys Gly Ala <210> 46 <211> 6 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Qpis umelej sekvencie: epitop alebo imunogén pre-Sl <400> 46
Leu Asp Pro Ala Phe Arg
5 <210> 47 <211> 10 <212> PRT
Umelá sekvencia <213>
<220>
<223 > Opis umelej sekvencie: epitop alebo imunogén onkogénu myc <400> 47
Glu Gin Lys Leu íle Ser Glu Glu Asp Leu 15 10

Claims (3)

1. Častica jadrového antigénu HBV, ktorá má viacnásobné imunogénne špecifity, a ktorá obsahuje aspoň jeden imunogén viažuci sa na kapsid, pričom tento imunogén viažuci sa na kapsid obsahuje aspoň jednu peptidovú zložku viažucu sa na kapsid HBV a aspoň jednu imunogénnu zložku.
2/3
Obr. 2
Charakteristiky rôznych fúznych proteínov HbcAg
Peptidová Sekvencia a Pozícia b Dĺžka c Vlastnosti d Lit. odkaz β-galaktozidáza (1-8) N (3) 192 M, A, I Stahl et al., 1982 FMDV VPI (142160) N(prej adrový) 215 A, I Čiarke et al., 1987 HBV preSl C(144) 187, 198 M, A, I Stahl a Murray, 1989 HBV preSl C (144) , 144/145 193-233 A, I Borisova et al., 1989 HBV preSl N,N (prejadrový) 210, 244 A, I, T SchOdel et al., 1992 HBV preS2 C(144) 191 A, I Stahl a Murray, 1989 HBV preS2 C(144), 144/145 199, 236 A, I Borisova er al., 1989 HBV preS2 C(156) 167 A, I, T Schódel et al., 1992 HBV preSl + preS2 75/83, C(156) 187 A, I, T Schôdel et al., 1992 HBV preSl + preS2 C (144) 218 M, A, I, T Shiau 1993 HBV Sih-156/165 C(144) 211, 218 A, I Stahl a Murray, 1989 HBV Sin-156/165 (145 mutácia) C(144) 211 M, A, I, T Shiau a Murray, 1997
TF %0-2ΌΌ1 r · r r e - r> t f r r 9 ľ ·· r r r r r ·. *
2. Častica jadrového antigénu HBV, ktorá má viacnásobné imunogénne špecifity podlá nároku 1, kde imunogén viažuci sa na kapsid je na častici orientovaný tak, že umožňuje imunogénnej zložke, aby vyvolala imunitnú reakciu, keď sa častica podá jedincovi.
3. Častica jadrového antigénu HBV, ktorá má viacnásobné imunogénne špecifity podlá nároku 1, kde imunogén viažuci sa na kapsid je naviazaný na časticu prostredníctvom akéhokoľvek aminokyselinového zvyšku peptidovej zložky viažucej sa na kapsid HBV.
4. Častica jadrového antigénu HBV, ktorá má viacnásobné imunogénne špecifity podľa nároku 1, kde imunogén viažuci sa na kapsid je naviazaný na časticu prostredníctvom akéhokoľvek aminokyselinového zvyšku alebo iného zvyšku imunogénnej zložky.
5. Častica jadrového antigénu HBV, ktorá má viacnásobné imunogénne špecifity podľa nároku 4, kde iným zvyškom imunogénnej zložky je uhľohydrát.
6. Častica jadrového antigénu HBV, ktorá má viacnásobné imunogénne špecifity podľa nároku 1, kde imunogén viažuci sa na kapsid je naviazaný na časticu prostredníctvom aminokonca peptidovej zložky viažucej sa na kapsid HBV.
7. Častica jadrového antigénu HBV, ktorá má viacnásobné imunogénne špecifity podľa nároku 1, kde imunogén viažuci sa na kapsid je naviazaný na časticu prostredníctvom karboxykonca peptidovej zložky viažucej sa na kapsid HBV.
8. Častica jadrového antigénu imunogénne špecifity podľa nároku kapsid je naviazaný na časticu zosieťujúceho činidla.
HBV, ktorá má viacnásobné , kde imunogén viažuci sa na zosieťovaním prostredníctvom
9. Častica jadrového antigénu HBV, ktorá má viacnásobné imunogénne špecifity podľa nároku 1, kde imunogénna zložka je naviazaná na peptidovú zložku viažucu sa na kapsid HBV priamo alebo prostredníctvom spojovacej sekvencie.
10. Častica jadrového antigénu HBV, ktorá má viacnásobné imunogénne špecifity podľa nároku 1, kde imunogénna zložka je naviazaná na aminokoniec peptidovej zložky viažucej sa na kapsid HBV priamo alebo prostredníctvom spojovacej sekvencie.
11. Častica jadrového antigénu HBV, ktorá má viacnásobné imunogénne špecifity podľa nároku 1, kde imunogénna zložka je naviazaná na karboxykoniec peptidovej zložky viažucej sa na kapsid HBV priamo alebo prostredníctvom spojovacej sekvencie.
12. Častica jadrového antigénu HBV, ktorá má viacnásobné imunogénne špecifity podľa akéhokoľvek z nárokov 9 až 11, kde imunogénna zložka je naviazaná na peptidovú zložku viažucu sa na kapsid HBV prostredníctvom zosieťujúceho činidla.
r ** • * r ·
13. Častica jadrového antigénu HBV, ktorá má viacnásobné imunogénne špecifity podľa nároku 8, kde zosieťujúcim činidlom je multifunkčné zosieťujúce činidlo.
14. Častica jadrového antigénu HBV, ktorá má viacnásobné imunogénne špecifity podľa nároku 12,.kde zosieťujúcim činidlom je multifunkčné zosieťujúce činidlo.
15. Častica jadrového antigénu HBV, ktorá má viacnásobné imunogénne špecifity podľa nároku 14, kde multifunkčné zosieťujúce činidlo je vybraté zo skupiny obsahujúcej hydrochlorid l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimidu a Nhydroxysulfosukcinimid.
16. Častica jadrového antigénu HBV, imunogénne špecifity podľa nároku 1, obsahuje jeden alebo obsahujúcej imunologické epitopy.
ktorá má viacnásobné viac epitopov imunogénne epitopy kde imunogénna zložka vybratých epitopy, zo skupiny a antigénne
17. Častica jadrového imunogénne špecifity skupiny obsahujúcej jednoduché epitopy a
HBV, ktorá má antigénu podľa nároku lineárne epitopy, konformačné zmiešané epitopy.
16, kde epitopy sú viacnásobné vybraté zo epitopy,
18. Častica jadrového antigénu HBV, ktorá má viacnásobné imunogénne špecifity podľa nároku 1, kde imunogénna zložka je vybratá zo skupiny obsahujúcej antigény, alergény, antigénne determinanty, proteiny, glykoproteiny, protilátky, protilátkové fragmenty, peptidy, peptidové mimotopy napodobňujúce antigén alebo antigénny determinant, polypeptidy, glykopeptidy, uhľohydráty, oligosacharidy, polysacharidy, oligonukleotidy a polynukleotidy.
19. Častica jadrového antigénu HBV, ktorá má viacnásobné imunogénne špecifity podľa nároku 1, kde imunogénna zložka je namierená na alebo je získaná z patogénnych agensov vybratých zo skupiny obsahujúcej vírusy, parazity, mykobaktérie, baktérie, bacily, huby, prvoky, rastliny, fágy, živočíšne bunky a rastlinné bunky.
20. Častica jadrového antigénu HBV, ktorá má viacnásobné imunogénne špecifity podľa nároku 19, kde vírus je vybratý zo skupiny obsahujúcej retrovírusy, herpetické vírusy, ortomyxovírusy, paramyxovírusy, hepadnavírusy, flavivirusy, pikornavírusy, papovírusy, adenovírusy, bakulovírusy, hantavírusy, parvovírusy, enterovírusy, rinovírusy, nádorové vírusy, DNA vírusy, RNA vírusy, togavírusy, rabdovírusy a poxvírusy.
21. Častica jadrového antigénu HBV, ktorá má viacnásobné imunogénne špecifity podľa nároku 20, kde vírus je vybratý zo skupiny obsahujúcej vírusy humánnej imunodeficiencie typu 1 a humánnej imunodeficiencie typu 2, vírus T-lymfocytárnej leukémie, vírusy Herpex simplex typu 1 a Herpex simplex typu 2, vírus Varicella zoster, cytomegalovírus, vírus Epstein-Barrcvej, vírusy chrípky A, B a C, respiračný svnciciálny vírus, osýpkam podobný vírus, vírus mumpsu, vírus parainfluenzy, vírus hepatitídy B, hepatitídy C, hepatitídy A a hepatitídy E, vírus žltej horúčky, malárie, vírus Dengue a vírus kliešťovej er.cefalitídy, onkovirusy, vírus poliomyelitídy, papilomavírus, vírus rubeoly, vírus besnoty a vírus vakcinie.
r r Γ r
57 '
22. Častica jadrového antigénu HBV, ktorá má viacnásobné imunogénne špecifity podľa nároku 19, kde imunogénna zložka je namierená na alebo je získaná z bacilov, enterobaktérií, klostridií, listérii, mykobaktérii, pseudomonád, stafylokokov, eubaktérii, mykoplaziem, chlamýdii, spirochét, neiserii alebo salmonel.
23. Častica jadrového antigénu HBV, ktorá má viacnásobné imunogénne špecifity podľa nároku 19, kde imunogénna zložka je namierená na pôvodcu záškrtu, tetanu a čierneho kašľa, na Haemophilus influenzae, vírus poliomyelitídy, vírus osýpok, mumpsu, rubeoly, vírus varicelly, vírusy hepatitídy B a A, pneumokokovej pneumónie, žltej horúčky, malárie, týfusovej horúčky, meningokokovej encefalitídy a cholery.
24. Častica jadrového antigénu HBV, ktorá má viacnásobné imunogénne špecifity podľa nároku 18, kde imunogénna zložka je vybratá zo skupiny obsahujúcej alergény zvierat, hmyzu a rastlín, atmosférické alergény a inhalované alergény.
25. Častica jadrového antigénu HBV, ktorá má viacnásobné imunogénne špecifity podľa nároku 1, kde jadrový antigén HBV je fúzny proteín jadrového antigénu HBV.
26. Častica jadrového antigénu HBV, ktorá má viacnásobné imunogénne špecifity podľa nároku 25, kde fúzny proteín jadrového antigénu HBV obsahuje imunologický epitop, imunogénny epitop alebo antigénny epitop.
27. Častica jadrového antigénu HBV, ktorá má viacnásobné imunogénne špecifity podľa nároku 26, kde fúzny proteín jadrového antigénu HBV obsahuje imunologický epitop, imunogénny epitop alebo antigénny epitop fúzovaný s jadrovým antigénom HBV prostredníctvom spojovacej sekvencie.
28. Častica jadrového antigénu HBV, ktorá má viacnásobné imunogénne špecifity podľa nároku 26, kde fúzny proteín jadrového antigénu HBV obsahuje imunologický epitop, imunogénny epitop alebo antigénny epitop fúzovaný s karboxykoncom jadrového antigénu HBV buď priamo alebo prostredníctvom spojovacej sekvencie.
29. Častica jadrového antigénu HBV, ktorá má viacnásobné imunogénne špecifity podľa nároku 26, kde fúzny proteín jadrového antigénu HBV obsahuje imunologický epitop, imunogénny epitop alebo antigénny epitop fúzovaný s aminokoncom jadrového antigénu HBV buď priamo alebo prostredníctvom spojovacej sekvencie.
30. Častica jadrového antigénu HBV, ktorá má viacnásobné imunogénne špecifity podľa nároku 25, kde fúzny proteín jadrového antigénu HBV obsahuje skrátený jadrový antigén HBV.
31. Častica jadrového antigénu HBV, ktorá má viacnásobné imunogénne špecifity podľa nároku 25, kde fúzny proteín jadrového antigénu HBV obsahuje povrchový antigén HBV alebo jeho časť.
32. Častica jadrového antigénu HBV, ktorá má viacnásobné imunogénne špecifity podľa nároku 31, kde fúzny proteín jadrového antigénu HBV obsahuje sekvenciu vybratú zo skupiny obsahujúcej úsek pre-Sl povrchového antigénu HBV, úsek pre-S2 povrchového antigénu HBV, imunodominantný úsek a povrchového antigénu HBV alebo jeho časti.
e *
33. Častica jadrového antigénu HBV, ktorá má viacnásobné imunogénne špecifity podlá nároku 1, kde jadrový antigén HBV je polypeptid jadrového antigénu HBV úplnej dĺžky alebo sú to časti, skrátenia, mutácie alebo deriváty tohto polypeptidu, schopné usporiadania do časticovej formy.
34. Častica jadrového antigénu HBV, ktorá má viacnásobné imunogénne špecifity podľa nároku 1, kde peptidová zložka viažuca sa na kapsid HBV je vybratá zo skupiny obsahujúcej: SLLGRMKGA, GSLLGRMKGA, DGSLLGRMKGAA, ADGSLLGRMKGAAG, SLLGRMKG(pA)C, RSLLGRMKGA, HRSLLGRMKGA, ALLGRMKG, MHRSLLGRMKGA, RSLLGRMKGA(β-Α)C, MHRSLLGRMKGAG(β-Α)GC.
35. Vakcína, vyznačujúca sa tým, ž e obsahuje profylaktický účinné množstvo častice jadrového antigénu HBV, ktorá má viacnásobné imunogénne špecifity podľa nároku 1.
36. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje terapeuticky účinné množstvo častice jadrového antigénu HBV, ktorá má viacnásobné imunogénne špecifity podľa nároku 1.
37. Spôsob vyvolania imunitnej reakcie u jedinca vyznačujúci sa tým, že obsahuje krok podania častice jadrového antigénu HBV, ktorá má viacnásobné imunogénne špecifity podľa nároku 1 pacientovi v množstve, ktoré je účinné na vyvolanie imunitnej reakcie.
38. Spôsob podľa nároku 37, vyznačujúci sa tým, ž e častica jadrového antigénu HBV je podávaná jedincovi parenterálne.
39. Spôsob zvýšenia imunogenicity imunogénu vyznačujúci sa t ý m, že sa imunogén naviaže na časticu jadrového antigénu HBV prostredníctvom peptidu viažuceho sa na kapsid HBV.
40. Častica jadrového antigénu HBV, ktorá má viacnásobné imunogénne špecifity podľa nároku 1, kde imunogén viažuci sa na kapsid obsahuje diagnostickú značku alebo chemický marker.
41. Spôscb detekcie prítomnosti protilátok k imunogénu vo vzorke vyznačujúci sa tým, že obsahuje kroky: a) vzorka sa privedie do kontaktu s časticou jadrového antigénu HBV, ktorá má viacnásobné imunogénne špecifity podľa nároku 40, a to v čase dostatočnom na to, aby všetky protilátky vo vzorke mohli vytvoriť komplex s imunogénom viažucim sa na kapsid, b) detekčné prostriedky sa použijú na detekciu komplexu vytvoreného medzi imunogénom viažucim sa na kapsid a protilátkami vo vzorke.
42. Peptidový imunogén viažuci sa na kapsid HBV, ktorý obsahuje aspoň jednu peptidovú zložku viažucu sa na kapsid a aspoň jednu imunogénnu zložku.
43. Peptidový imunogén viažuci sa na kapsid HBV podľa nároku 42, kde imunogénna zložka je naviazaná na peptid viažuci sa na kapsid HBV priamo alebo prostredníctvom spojovacej sekvencie.
44. Peptidový imunogén viažuci sa na kapsid HBV podľa nároku 42, kde imunogénna zlcžka je naviazaná na aminokoniec peptidovej zložky viažucej sa na kapsid HBV priamo alebo prostredníctvom spojovacej sekvencie.
45. Peptidový imunogén viažuci sa na kapsid HBV podľa nároku 42, kde imunogénna zložka je naviazaná na karboxykoniec peptidovej zložky viažucej sa na kapsid HBV priamo alebo prostredníctvom spojovacej sekvencie.
46. Peptidový imunogén viažuci sa na kapsid HBV podlá ktoréhokoľvek z nárokov 42 až 44, kde imunogénna zložka je zosieťovaním naviazaná na peptidovú zložku viažucu sa na kapsid pomocou zosieťujúceho činidla.
47. Peptidový imunogén viažuci sa na kapsid HBV podľa nároku 46, kde zosieťujúcim činidlom je multifunkčné zosieťujúce činidlo. 48. Peptidový imunogén viažuci sa na kapsid HBV podľa nároku
47, kde multifunkčné zosieťujúce činidlo je vybraté zo skupiny obsahujúcej hydrochlorid l-etyl-3-(3-dimetylamincpropyl) karbodiimidu a N-hydroxysulfosukcínimid.
49. Peptidový imunogén viažuci sa na kapsid HBV podľa nároku 42, kde imunogénna zložka obsahuje jeden alebo viac epitopov vybratých zo skupiny obsahujúcej imunologické epitopy, imunogénne epitopy a antigénne epitopy.
50. Peptidový imunogén viažuci sa na kapsid HBV podľa nároku 49, kde epitopy sú vybraté zo skupiny obsahujúcej lineárne epitopy, konformačné epitopy, jednoduché epitopy a zmiešané epitopy.
51. Peptidový imunogén viažuci
42, kde imunogénna zložka je antigény, alergény, antigénne glykoproteíny, protilátky, protiláckové peptidové mimotopy napodobňujúce antigén obsahujúcej proteíny, , peptidy, antigénny sa na kapsid HBV podľa nároku vybratá zo skupiny <
determinanty, fragmenty, alebo determinant, polypeptidy, glykopeptidy, uhľohydráty, oligosacharidy, polysacharidy, oligonukleotidy a polynukleotidy.
52. Peptidový imunogén viažuci sa na kapsid HBV podľa nároku 42, kde imunogénna zložka je namierená na alebo je získaná z patogénneho agensa vybratého zo skupiny obsahujúcej vírusy, parazity, mykobaktérie, baktérie, bacily, huby, prvoky, rastliny, fágy, živočíšne bunky a rastlinné bunky.
53. Peptidový imunogén viažuci sa na kapsid HBV podľa nároku 52, kde vírus je vybratý zo skupiny obsahujúcej retrovírusy, herpetické vírusy, ortomyxovírusy, paramyxovírusy, hepadnavírusy, flavivírusy, pikornavírusy, papovírusy, adenovírusy, bakulovírusy, hantavírusy, parvovirusy, enterovírusy, rinovírusy, nádorové vírusy, DNA vírusy, RNA vírusy, togavírusy, rabdovirusy a poxvírusy.
54. Peptidový imunogén viažuci sa na kapsid HBV podľa nároku 53, kde vírus je vybratý zo skupiny obsahujúcej vírusy humánnej imunodeficiencie typu 1 a humánnej imunodeficiencie typu 2, vírus T-lymfocytárnej leukémie, vírusy Herpex simplex typu 1 a Herpex simplex typu 2, vírus Varicella zoster, cytomegalovírus, vírus Epstein-Barrovej, vírusy chrípky A, B a C, respiračný synciciálny vírus, osýpkam podobný vírus, vírus mumpsu, vírus parainfluenzy, vírus hepatitídy B, hepatitídy C, hepatitídy A a hepatitídy E, vírus žltej horúčky, malárie, vírus Dengue a vírus kliešťovej encefalitídy, onkovírusy, vírus poliomyelitídy, papilomavirus, vírus rubeoly, vírus besnoty a vírus vakcínie.
55. Peptidový imunogén viažuci sa na kapsid HBV podľa nároku
42, imunogénna zložka je získaná z alebo namierená na bacily, ·· r r e e f enterobaktérie, klostrídie, listérie, monády, stafylokoky, eubaktérie, spirochéty, neiserie alebo salmonely.
mykobaktérie, pseudomykoplazmy, chlamýdie,
56. Peptidový imunogén viažuci
42, kde imunogénna zložka je tetanu a čierneho kašla, na kapsid HBV podlá nároku namierená na pôvodcu záškrtu, sa na
Haemophilus influenzae, vírus poliomyelitídy, vírus vírusy hepatitídy B a malárie, týfusovej a cholery.
osýpok, mumpsu, rubeoly, A, pneumokokovej pneumónie, horúčky, vírus varicelly, žltej horúčky, meningokokovej encefalitídy
57. Peptidový imunogén viažuci sa na kapsid HBV podlá nároku 42, kde imunogénna zložka je vybratá zo skupiny obsahujúcej alergény zvierat, hmyzu a rastlín, atmosférické alergény a inhalované alergény.
58. Peptidový imunogén viažuci sa na kapsid HBV podlá nároku 42, kde peptidová zložka viažuca sa na kapsid HBV je vybratá zo skupiny obsahujúcej: SLLGRMKGA, GSLLGRMKGA, DGSLLGRMKGAA, ADGSLLGRMKGAAG, SLLGRMKG(β-Α)C, RSLLGRMKGA, HRSLLGRMKGA, ALLGRMKG, MHRSLLGRMKGA, RSLLGRMKGA (β-Α) C, MHRSLLGRMKGAG (β—A) GC.
59. Peptidový imunogén viažuci sa na kapsid HBV podlá nároku
42, kde peptidová zložka viažuca sa na kapsid HBV je fragment alebo analóg SLLGRMKGA, GSLLGRMKGA, DGSLLGRMKGAA,
ADGSLLGRMKGAAG, SLLGRMKG(β-Α)C, RSLLGRMKGA, HRSLLGRMKGA, ALLGRMKG, MHRSLLGRMKGA, RSLLGRMKGA (β-Α) C, MHRSLLGRMKGAG (β—A) GC.
60. Častica jadrového antigénu HBV podlá nároku 1, kde zložka viažuca sa na kapsid HBV je fragment alebo analóg SLLGRMKGA, GSLLGRMKGA, DGSLLGRMKGAA, ADGSLLGRMKGAAG, SLLGRMKG(β-Α)C,
RSLLGRMKGA, HRSLLGRMKGA, ALLGRMKG, MHRSLLGRMKGA,
-A)C, MHRSLLGRMKGAG(β-Α)GC.
RSLLGRMKGA(βf f 7^0 - 2_OOy • f r r · ’* ·· ^f ·I imunogén peptia viažuci sa na kapsid HBV imunogén
TF % C-ZOO f
3/3
Obr. 2
Charakteristiky rôznych fúznych proteinov HbcAg
Peptidová Sekvencia a Pozícia Dĺžka c Vlastnosti d Lit. odkaz HBV Sm-149 78/82-144 180 A, I Borisova et al., 1989 HBV preSl + preS2 + Sm_i56 C(144) 266 M, A, I, T Shiau 1993 HBV Sin-156 + preSl + preS2 + Slll-1566 C(144), N, C(144) 318, 314 M, Am, I, T Shiau 1993 HIV env (728-751) C{144) 178 I Stahl a Muray, 1989 HIV gp41 (78-129) C(144) , 144/145 196, 235 A Borisova et al., 1993 BLV gp51 (56-103) C(144) 192 A Borisova et al., 1993 HCV HCc (rôzne) C(14 9) 186-881 M, A Yoshikawa et al., 1993
a Pôvod peptidov fúzovaných s HbcAG. Čísla v zátvorkách odkazujú na aminokyselinovú sekvenciu. Niekoľko autorov použilo rôzne fragmenty preSl a preS2.
b Pozícia fúzie HbcAG, N je N-koniec, C je C-koniec, prípadne skrátený vo zvyšku v zátvorke. Vnútorná fúzia je označená zlomovou čiarou medzi dvomi číslami.
c Celkový počet aminokyselín vo fúznom proteíne.
d M je morfológia (elektrónová mikroskopia), A je antigenicita,
I je produkcia protilátok, T je proliferácia T lymfocytov.
e Niektoré kombinácie zahŕňajú ďalší segment S 111-156 v uvedenom poradí, ale v iných bol umiestnený na N-koniec sekvencie HBcAG.
SK760-2001A 1998-12-04 1999-12-03 Hbv core antigen particles with multiple immunogenic components attached via peptide ligands SK7602001A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11091198P 1998-12-04 1998-12-04
PCT/US1999/028755 WO2000032625A1 (en) 1998-12-04 1999-12-03 Hbv core antigen particles with multiple immunogenic components attached via peptide ligands

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK7602001A3 true SK7602001A3 (en) 2002-03-05

Family

ID=22335607

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK760-2001A SK7602001A3 (en) 1998-12-04 1999-12-03 Hbv core antigen particles with multiple immunogenic components attached via peptide ligands

Country Status (23)

Country Link
US (5) US6627202B2 (sk)
EP (3) EP2360174B1 (sk)
JP (2) JP2002532387A (sk)
KR (1) KR100715954B1 (sk)
CN (1) CN1179973C (sk)
AT (1) ATE525388T1 (sk)
AU (1) AU770225B2 (sk)
BR (1) BR9915942A (sk)
CA (1) CA2352738A1 (sk)
CZ (1) CZ20011907A3 (sk)
DK (1) DK1135408T3 (sk)
EA (1) EA004497B1 (sk)
EE (1) EE200100292A (sk)
HK (3) HK1041272B (sk)
HU (1) HU229222B1 (sk)
IL (1) IL143475A0 (sk)
IS (1) IS5957A (sk)
NO (1) NO20012760L (sk)
NZ (1) NZ512056A (sk)
PL (1) PL348766A1 (sk)
SK (1) SK7602001A3 (sk)
TR (1) TR200102423T2 (sk)
WO (1) WO2000032625A1 (sk)

Families Citing this family (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2245163C2 (ru) * 1998-11-30 2005-01-27 Сайтос Байотекнолэджи АГ Композиция (варианты), способ получения не природной упорядоченной и содержащей повторы антигенной матрицы, способ терапевтического лечения и способ иммунизации
WO2000032625A1 (en) * 1998-12-04 2000-06-08 Biogen, Inc. Hbv core antigen particles with multiple immunogenic components attached via peptide ligands
US6942866B2 (en) 2000-08-16 2005-09-13 Apovia, Inc. Malaria immunogen and vaccine
US7264810B2 (en) * 2001-01-19 2007-09-04 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen array
US7128911B2 (en) * 2001-01-19 2006-10-31 Cytos Biotechnology Ag Antigen arrays for treatment of bone disease
US7094409B2 (en) * 2001-01-19 2006-08-22 Cytos Biotechnology Ag Antigen arrays for treatment of allergic eosinophilic diseases
US7361352B2 (en) 2001-08-15 2008-04-22 Acambis, Inc. Influenza immunogen and vaccine
US7115266B2 (en) 2001-10-05 2006-10-03 Cytos Biotechnology Ag Angiotensin peptide-carrier conjugates and uses thereof
US20030219459A1 (en) * 2002-01-18 2003-11-27 Cytos Biotechnology Ag Prion protein carrier-conjugates
US8101189B2 (en) 2002-07-05 2012-01-24 Folia Biotech Inc. Vaccines and immunopotentiating compositions and methods for making and using them
ES2431963T3 (es) * 2002-07-05 2013-11-28 Folia Biotech Inc. Partícula viral adyuvante
RU2324704C2 (ru) * 2002-07-17 2008-05-20 Цитос Байотекнолоджи Аг Молекулярные массивы антигенов
JP5084103B2 (ja) * 2002-07-18 2012-11-28 サイトス バイオテクノロジー アーゲー ハプテン担体抱合体およびその用法
EP2338510A1 (en) * 2002-07-19 2011-06-29 Novartis Pharma AG Vaccine compositions containing amyloid beta1-6 antigen arrays
CN100381463C (zh) * 2002-09-18 2008-04-16 中国人民解放军免疫学研究所 用于生产治疗用乙型肝炎疫苗或药物的免疫原及其制备方法和用途
EP1605973B1 (en) 2003-03-26 2012-09-26 Cytos Biotechnology AG Packaging of immunostimulatory oligonucleotides into virus-like particles: methods of preparation and uses
US7537767B2 (en) * 2003-03-26 2009-05-26 Cytis Biotechnology Ag Melan-A- carrier conjugates
US20060210588A1 (en) * 2003-03-26 2006-09-21 Cytos Biotechnology Ag Hiv-peptide-carrier-conjugates
BRPI0416270A (pt) * 2003-11-07 2007-01-09 Hepgenics Pty Ltd método para detectar um analito em uma amostra, e, método e kit para detectar um anticorpo especìfico de uma amostra
AU2005205181A1 (en) * 2004-01-20 2005-07-28 Cytos Biotechnology Ag Particle-induced ghrelin immune response
US7964196B2 (en) * 2004-05-25 2011-06-21 Chimeros, Inc. Self-assembling nanoparticle drug delivery system
KR100746991B1 (ko) 2004-08-06 2007-08-08 한국과학기술연구원 Ｈｂｖ 코아 단백질과 표면 단백질 간 상호작용의 측정을이용한 ｈｂｖ의 증식 억제물질의 검색방법
JP2008509902A (ja) * 2004-08-13 2008-04-03 ミジェニックス インコーポレイテッド Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ感染を処置または防止するための組成物および方法
US7572451B2 (en) * 2004-10-25 2009-08-11 Cytos Biotechnology Ag Gastric inhibitory polypeptide (GIP) antigen arrays and uses thereof
US9603921B2 (en) 2004-10-27 2017-03-28 Janssen Vaccines Ag Virosome particles comprising antigens from influenza virus and hepatitis b virus
GB0424563D0 (en) * 2004-11-05 2004-12-08 Novartis Ag Organic compounds
DE102005008765B4 (de) * 2005-02-25 2016-06-16 Siemens Healthcare Gmbh Kontrastmittel auf der Basis von Bakteriophagen, diese enthaltende Zusammensetzung, deren Verwendung und Verfahren zu deren Herstellung
CA2648581A1 (en) * 2006-04-07 2008-09-12 Chimeros, Inc. Compositions and methods for treating b- cell malignancies
DK2069503T3 (da) * 2006-11-15 2016-02-15 Folia Biotech Inc Papayamosaikvirus-baserede vacciner mod influenza
EP2078086A4 (en) 2006-11-15 2010-06-30 Folia Biotech Inc PAPAYAMOSAIC VIRUS-BASED IMMUNOGENE AFFINITY-CONJUGATED ANTIGENSYSTEMS AND THEIR USES
WO2008089569A1 (en) * 2007-01-26 2008-07-31 Folia Biotech Inc. Papaya mosaic virus-based vaccines against salmonella typhi and other enterobacterial pathogens
JP5428017B2 (ja) * 2007-03-23 2014-02-26 国立大学法人 熊本大学 ワクチン剤
US20090226525A1 (en) * 2007-04-09 2009-09-10 Chimeros Inc. Self-assembling nanoparticle drug delivery system
AU2008291604B2 (en) 2007-08-30 2013-12-05 Akshaya Bio Inc. Antigenic compositions and use of same in the targeted delivery of nucleic acids
KR100949310B1 (ko) * 2007-11-21 2010-03-23 한국과학기술연구원 세포 영상 기법을 이용한 ｈｂｖ 캡시드 단백질과 표면단백질 간 상호작용 측정 방법과 이를 이용한 ｈｂｖ 증식억제물질의 검색방법
CN102083979B (zh) * 2008-05-09 2015-01-07 新加坡科技研究局 Hbv表位反应性外源t细胞受体(tcr)及其用途
WO2010042743A2 (en) * 2008-10-08 2010-04-15 Chimeros Inc. Chimeric multiplexes, compositions, and methods for using same
CN101503461B (zh) * 2009-02-12 2011-09-07 北京大学人民医院 一种具有诱导肝癌细胞凋亡功能的多肽
WO2010120874A2 (en) 2009-04-14 2010-10-21 Chimeros, Inc. Chimeric therapeutics, compositions, and methods for using same
KR20120052352A (ko) 2009-08-07 2012-05-23 트랜스진 에스.에이. Ｈｂｖ 감염을 치료하는 조성물
US10076570B2 (en) 2009-08-07 2018-09-18 Transgene S.A. Composition for treating HBV infection
WO2011136506A2 (ko) * 2010-04-30 2011-11-03 중앙대학교 산학협력단 로타바이러스 나노입자를 이용한 재조합 복합 항원의 제조방법
US8865188B2 (en) 2011-09-09 2014-10-21 Biomed Realty, L.P. Methods and compositions for controlling assembly of viral proteins
CA2936092A1 (en) 2013-01-23 2014-07-31 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Stabilized hepatitis b core polypeptide
GB201402890D0 (en) * 2014-02-18 2014-04-02 Iqur Ltd Vaccines based on hepatitis B Core antigens
WO2015133467A1 (ja) * 2014-03-06 2015-09-11 株式会社シノテスト Ｃ型肝炎ウイルスのワクチン及び診断に用いるためのＨＢｃ／ＨＣＶ Ｅ２ペプチドキメラタンパク質
CA2955287A1 (en) * 2014-07-18 2016-01-21 The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Vaccine containing virus-like particles
KR20200000497A (ko) 2015-09-04 2020-01-02 인벤트프라이즈 엘엘씨 Vlp 안정화된 백신 조성물
AU2016348675B2 (en) * 2015-11-04 2022-11-17 Hookipa Biotech Gmbh Vaccines against Hepatitis B virus
JP6904959B2 (ja) * 2016-01-04 2021-07-21 クール ファーマシューティカルズ ディベロップメント カンパニー インコーポレイテッド 結合エピトープを含有する融合タンパク質を封入する粒子
CN107056947B (zh) * 2016-12-23 2021-04-20 中国人民解放军第四军医大学 抗hbv复制的靶向融合蛋白及其构建方法
WO2018208547A1 (en) * 2017-05-10 2018-11-15 University Of Massachusetts Bivalent dengue/hepatitis b vaccines
AU2018285412B2 (en) 2017-06-14 2022-06-23 Universität Zürich Cyclic peptides for protection against respiratory syncytial virus
MY202196A (en) 2017-06-23 2024-04-16 Verimmune Inc Chimeric virus-like particles and uses thereof as antigen-specific redirectors of immune responses
WO2020071869A1 (ko) * 2018-10-05 2020-04-09 알엔에이진 주식회사 표적 세포 특이적으로 결합하여 다중 면역기능이 강화된 키메라항원 및 이의용도
CA3121724A1 (en) 2018-12-20 2020-06-25 Virometix Ag Lipopeptide building blocks and synthetic virus-like particles
WO2020139978A1 (en) 2018-12-27 2020-07-02 Verimmune Llc Conjugated virus-like particles and uses thereof as anti-tumor immune redirectors
EP4216992A1 (en) 2020-09-28 2023-08-02 DBV Technologies Particle comprising an rsv-f protein for use in rsv vaccination
AU2021364548A1 (en) 2020-10-19 2023-06-08 Verimmune Inc. Virus-inspired compositions and methods of redirecting preexisting immune responses using the same for treatment of cancer

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES8105035A1 (es) 1978-12-22 1981-05-16 Biogen Nv Un metodo para producir al menos un polipeptido que muestra antigenicidad de hbv
US5204096A (en) 1984-03-07 1993-04-20 New York Blood Center, Inc. Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipid vesicle carriers
US4722840A (en) 1984-09-12 1988-02-02 Chiron Corporation Hybrid particle immunogens
US5296572A (en) 1986-04-30 1994-03-22 James Sparrow Large pore polyamide resin and method of preparation thereof
DE3788902T3 (de) 1986-06-17 2004-11-25 Chiron Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware), Emeryville Hepatitis-Delta-Diagnostika und Impfstoffe, ihre Herstellung und Verwendung.
US5143726A (en) * 1986-12-09 1992-09-01 The Scripps Research Institute T cell epitopes of the hepatitis B virus nucleocapsid protein
US4882145A (en) * 1986-12-09 1989-11-21 Scripps Clinic And Research Foundation T cell epitopes of the hepatitis B virus nucleocapsid protein
US4818527A (en) 1986-12-09 1989-04-04 Scripps Clinic And Research Foundation T cell epitopes of the hepatitis B virus nucleocapsid protein
GB8903313D0 (en) 1989-02-14 1989-04-05 Wellcome Found Conjugates
JPH02273700A (ja) 1989-04-14 1990-11-08 Olympus Optical Co Ltd ペプチド
US5547669A (en) 1989-11-03 1996-08-20 Immulogic Pharma Corp Recombinant peptides comprising T cell epitopes of the cat allergen, Fel d I
KR940000755B1 (ko) 1990-02-16 1994-01-29 유나이티드 바이오메디칼 인코오포레이티드 Hcv에 대한 항체 검출, hcv 감염의 진단 및 백신으로서의 그 예방에 특히 적합한 합성 펩티드
US5556744A (en) 1992-05-29 1996-09-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and compositions for diagnosing and treating certain HIV infected patients
US5531990A (en) 1993-12-15 1996-07-02 Health Research, Inc. Method of raising an immune response with an anti-idiotypic antibody having correspondence with human hepatitis B surface antigen
US5856459A (en) 1995-06-06 1999-01-05 Hybridon, Inc. Oligonucleotides specific for hepatitis B virus
US6207157B1 (en) * 1996-04-23 2001-03-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Conjugate vaccine for nontypeable Haemophilus influenzae
JP4091663B2 (ja) * 1996-10-31 2008-05-28 バイオジェン アイデック マサチューセッツ インコーポレイテッド Ｂ型肝炎インヒビター
WO2000032625A1 (en) * 1998-12-04 2000-06-08 Biogen, Inc. Hbv core antigen particles with multiple immunogenic components attached via peptide ligands

Also Published As

Publication number Publication date
EE200100292A (et) 2002-08-15
US6827937B2 (en) 2004-12-07
ATE525388T1 (de) 2011-10-15
NZ512056A (en) 2004-01-30
CN1179973C (zh) 2004-12-15
US20020064533A1 (en) 2002-05-30
EP1135408B1 (en) 2011-09-21
IL143475A0 (en) 2002-04-21
EP2351768B1 (en) 2014-06-18
EP2360174B1 (en) 2014-04-09
DK1135408T3 (da) 2012-01-23
US20030198649A1 (en) 2003-10-23
TR200102423T2 (tr) 2002-02-21
JP2008074867A (ja) 2008-04-03
NO20012760D0 (no) 2001-06-05
EA200100619A1 (ru) 2001-12-24
AU1841700A (en) 2000-06-19
BR9915942A (pt) 2001-08-21
HK1160652A1 (en) 2012-08-10
US20070280962A1 (en) 2007-12-06
HU229222B1 (en) 2013-09-30
US8168190B2 (en) 2012-05-01
KR100715954B1 (ko) 2007-05-09
CZ20011907A3 (cs) 2002-01-16
JP2002532387A (ja) 2002-10-02
NO20012760L (no) 2001-08-06
EA004497B1 (ru) 2004-04-29
HK1041272B (zh) 2012-08-03
US6627202B2 (en) 2003-09-30
US7226603B2 (en) 2007-06-05
EP2351768A1 (en) 2011-08-03
PL348766A1 (en) 2002-06-03
CN1332749A (zh) 2002-01-23
HK1041272A1 (en) 2002-07-05
HK1161606A1 (en) 2012-07-27
IS5957A (is) 2001-05-31
HUP0104946A3 (en) 2004-10-28
WO2000032625A1 (en) 2000-06-08
EP1135408A1 (en) 2001-09-26
EP2360174A1 (en) 2011-08-24
US20040234554A1 (en) 2004-11-25
HUP0104946A2 (hu) 2002-04-29
AU770225B2 (en) 2004-02-19
KR20010081068A (ko) 2001-08-25
US20120321659A1 (en) 2012-12-20
CA2352738A1 (en) 2000-06-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK7602001A3 (en) Hbv core antigen particles with multiple immunogenic components attached via peptide ligands
Bremer et al. N-terminal myristoylation-dependent masking of neutralizing epitopes in the preS1 attachment site of hepatitis B virus
US5039522A (en) Immunogens containing peptides with an attached hydrophobic tail for adsorption to hepatitis B virus surface antigen
JP2003529319A (ja) ＨＩＶ−１ｇｐ４１を標的化する広範に中和する抗体を誘発する方法
AU2022246465A1 (en) Stabilized group 2 influenza hemagglutinin stem region trimers and uses thereof
JP2009067810A (ja) 合成ペプチドとそれを含むワクチン
Koletzki et al. Puumala (PUU) hantavirus strain differences and insertion positions in the hepatitis B virus core antigen influence B-cell immunogenicity and protective potential of core-derived particles
JP2818755B2 (ja) 非ａ非ｂ型肝炎の診断及び検出に有効な新規分枝ハイブリッド及びクラスターペプチド
Joisson et al. Antigenic analysis of bean pod mottle virus using linear and cyclized synthetic peptides
AU5860198A (en) Annexin v-binding polypeptides derived from hbsag and their uses
MXPA01005613A (es) Particulas de antigeno del nucleo del hbv con multiples componentes inmunogenicos unidos mediante ligandos de peptido
EP1390397A1 (en) Pre-s protein of hepatitis b virus (hbv) as an adjuvant and a component of hbv vaccine
US20030224011A1 (en) Hepatitis c virus conjugates
Yang et al. Expression and characterization of hepatitis C virus core protein fused to hepatitis B virus core antigen
AU8142201A (en) Annexin V-binding polypeptides derived from HBsAg and their uses

Legal Events

Date Code Title Description
FB9A Suspension of patent application procedure