ES2321382T3 - Matriz de antigeno molecular que presenta un amiloide beta. - Google Patents

Matriz de antigeno molecular que presenta un amiloide beta. Download PDF

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ES2321382T3 ES02716207T ES02716207T ES2321382T3 ES 2321382 T3 ES2321382 T3 ES 2321382T3 ES 02716207 T ES02716207 T ES 02716207T ES 02716207 T ES02716207 T ES 02716207T ES 2321382 T3 ES2321382 T3 ES 2321382T3
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seq
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Wolfgang A. Renner
Martin Bachmann
Alain Tissot
Patrick Maurer
Franziska Lechner
Peter Sebbel
Christine Piossek
Rainer Ortmann
Rainer Luond
Matthias Staufenbiel
Peter Frey
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Novartis Pharma AG
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Cytos Biotechnology AG
Novartis Pharma AG
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Abstract

Una composición que comprende: (a) un armazón molecular no natural que comprende: (i) una partícula núcleo, donde dicha partícula núcleo es una partícula de tipo virus de un fago con ARN; (ii) un organizador que comprende al menos un primer sitio de anclaje, donde dicho organizador está conectado a dicha partícula núcleo por al menos un enlace covalente; (b) un antígeno o determinante antigénico con al menos un segundo sitio de anclaje, donde dicho antígeno o determinante antigénico es el péptido beta amiloide (Abeta1-42) o uno de sus fragmentos, y donde dicho segundo sitio de anclaje se selecciona del grupo que consiste en: (i) un sitio de anclaje de origen no natural con dicho antígeno o determinante antigénico; y (ii) un sitio de anclaje de origen natural con dicho antígeno o determinante antigénico, donde dicho segundo sitio de anclaje susceptible de asociación por medio de al menos un enlace no peptídico a dicho primer sitio de anclaje; y donde dicho antígeno o determinante antigénico y dicho armazón interaccionan por medio de dicha asociación para formar una matriz de antígeno ordenada y repetitiva.

Description

Matriz de antígeno molecular que presenta un amiloide beta.
Antecedentes de la invención Campo de la invención
La presente invención hace referencia a los campos de la biología molecular, la virología, la inmunología y la medicina. La invención proporciona una composición que comprende una matriz de antígenos o determinantes antigénicos ordenada y repetitiva. La invención está relacionada con un procedimiento para producir un antígeno o determinante antigénico en una matriz ordenada y repetitiva. El antígeno o determinante antigénico ordenado y repetitivo es útil en la producción de vacunas para el tratamiento de enfermedades infecciosas, el tratamiento de alergias y como fármaco para prevenir o curar el cáncer y para inducir eficazmente respuestas inmunitarias autoespecíficas, en particular respuestas de anticuerpos.
Técnica anterior
En la publicación WO 00/3227 se describen composiciones y procedimientos para la producción de matrices de antígenos o determinantes antigénicos ordenadas y repetitivas. Las composiciones son útiles para la producción de vacunas para la prevención de enfermedades infecciosas, el tratamiento de alergias y el tratamiento de cánceres. Las composiciones comprenden una partícula núcleo, tal como un virus o partícula de tipo virus, a la cual se asocia al menos un antígeno o un determinante antigénico, por medio de al menos un enlace no peptídico lo que conduce a una matriz de antígeno ordenada y repetitiva.
Las partículas de tipo virus (VLP) están siendo explotadas en el área de la producción de vacunas debido tanto a sus propiedades estructurales como a su naturaleza no infecciosa. Las VLP son estructuras supermoleculares construidas de manera simétrica a partir de muchas moléculas de proteína de uno o más tipos. Carecen de genoma viral y, por lo tanto, no son infecciosas. Las VLP pueden ser producidas a menudo en grandes cantidades mediante expresión heteróloga y pueden ser fácilmente purificadas.
Los ejemplos de VLP incluyen las proteínas de la cápside del virus de la Hepatitis B (Ulrich, et al., Virus Res. 50:141-182 (1998)), el virus del sarampión (Warnes, et al., Gene 160:173-178 (1995)), el virus Sindbis, rotavirus (Patente de los Estados Unidos 5.071.651 y Patente de los Estados Unidos 5.374.426), el virus de la Fiebre Aftosa (Twomey, et al., Vaccine 13:1603-1610, (1995)), el virus de Norwalk (Jiang, X., et al., Science 250:1580-1583 (1990); Matsui, S.M., et al., J. Clin. Invest. 87:1456-1461 (1991)), la proteína GAG retroviral (Solicitud de Patente Internacional WO 96/30523), la proteína p1 del retrotransposon Ty, la proteína de la superficie del virus de la Hepatitis B (Solicitud de Patente Internacional WO 92/11291) y el virus del papiloma humano (Solicitud de Patente WO 98/15631).
Generalmente es difícil inducir respuestas inmunitarias frente a auto-moléculas debido a la tolerancia inmunológica. Específicamente, los linfocitos con especificidad por las auto-moléculas son normalmente hipo-sensibles o incluso no-sensibles si son movilizados mediante estrategias de vacunación convencionales.
El péptido amiloide B (A\beta_{1-42}) tiene un papel central en la neuropatología de la enfermedad de Alzheimer. La acumulación extracelular del péptido A\beta, específica de una región está acompañada de microgliosis, cambios citoesqueléticos, neuritis distrófica y pérdida sináptica. Se piensa que estas alteraciones patológicas están relacionadas con el descenso congnitivo que define la enfermedad.
En un modelo de ratón de enfermedad de Alzheimer, los animales transgénicos diseñados para producir A\beta_{1-42} (ratones PDAPP), desarrollan placas y lesión neuronal en sus cerebros. Trabajos recientes han demostrado la inmunización de ratones PDAPP jóvenes, utilizando A\beta_{1-42}, que da como resultado la inhibición de la formación de la placa y la neuritis distrófica asociada (Schenk, D. et al., Nature 400:173-77 (1999)).
Además la inmunización de ratones PDAPP de más edad que ya habían desarrollado neuropatologías de tipo AD, reducía el grado y el progreso de las neuropatologías. El protocolo de inmunización para estos estudios fue el siguiente: se disolvió el péptido en tampón acuoso y se mezcló 1:1 con coadyuvante completo de Freund (para la dosis principal) para dar una concentración de péptido de 100 \mug/dosis. En los refuerzos posteriores se utilizó coadyuvante incompleto de Freund. Los ratones recibieron 11 inmunizaciones a lo largo de un período de 11 meses. Se lograron títulos de anticuerpo mayores de 1:10.000 y se mantuvieron. Por tanto, la inmunización puede ser una acción profiláctica y terapéutica eficaz contra la enfermedad de Alzheimer.
En otro estudio, los anticuerpos administrados periféricamente originados contra A\beta_{1-42}, fueron capaces de cruzar la barrera hematoencefálica, unirse al péptido A\beta, e inducir el aclaramiento del amiloide pre-existente (Bard, F. et al., Nature Medicine 6:916-19 (2000)). En este estudio se utilizaron anticuerpos policlonales originados contra A\beta_{1-42}, o anticuerpos monoclonales originados contra fragmentos sintéticos derivados de diferentes regiones de A\beta. Esta inducción de anticuerpos puede ser considerada como un tratamiento terapéutico potencial para la enfermedad de Alzheimer.
Es bien sabido que la administración de proteínas purificadas solas normalmente no es suficiente para lograr una respuesta inmunitaria fuerte; generalmente se debe administrar el antígeno aislado junto con sustancias auxiliares denominadas coadyuvantes. En estos coadyuvantes, el antígeno administrado es protegido de la rápida degradación, y el coadyuvante proporciona una liberación prolongada de un nivel de antígeno bajo.
Como se ha indicado, uno de los eventos clave en la Enfermedad de Alzheimer (AD) es el depósito de amiloide en forma de masas fibrosas insolubles (amiloidogénesis) dando como resultado placas neuríticas extracelulares y depósitos en torno a las paredes de los vasos sanguíneos cerebrales (para una revisión véase Selkoe, D. J. (1999) Nature. 399, A23-31). El principal constituyente de las placas neuríticas y la angiopatía congofílica es el amiloide B (AB), aunque estos depósitos también contienen otras proteínas tales como glucosaminoglicanos y apolipoproteínas. A\beta es escindido proteolíticamente de una glucoproteína mucho más grande conocida como Proteína Precursora del Amiloide (APP), que comprenden isoformas de 695-770 aminoácidos con una única región transmembrana hidrófoba. A\beta forma un grupo de péptidos de hasta 43 aminoácidos de longitud que muestran una heterogeneidad amino y carboxi terminal considerable (truncamiento) así como modificaciones (Roher, A. E., Palmer, K. C., Chau, V., & Ball, M. J. (1988) J. Cell Biol. 107, 2703-2716. Roher, A. E. Palmer, K. C., Yurewicz, E. C., Ball, M. J., & Greenberg, B. D. (1993) J. Neurochem. 61, 1916-1926). Las isoformas prominentes son A\cdot 1-40 y 1-42. Estas tienen una elevada propensión a formar láminas \beta que se agregan en fibrillas, que conducen por último al amiloide. Estudios recientes han demostrado que una reducción inducida por vacunación de los depósitos amiloides del cerebro da como resultado mejoras cognitivas (Schenk, D., Barbour, R., Dunn, W., Gordon, G., Grajeda, H., Guido, T., Hu, K., Huang, J., Johnson-Wood, K., Khan, K., et al. (1999) Nature. 400, 173-177).
Los autores de la presente invención han descubierto sorprendentemente que las auto-moléculas o los auto-antígenos presentados en una matriz altamente ordenada y repetitiva eran capaces de inducir eficazmente respuestas inmunitarias auto-específicas, en particular respuestas de anticuerpos. Por otra parte, tales respuestas podrían ser inducidas incluso en ausencia de coadyuvantes que de otro modo activarían de manera no específica las células presentadoras de antígenos y otras células inmunitarias.
Breve resumen de la invención
La presente invención proporciona las composiciones definidas en las reivindicaciones, que comprenden matrices de antígenos o determinantes antigénicos altamente ordenadas y repetitivas, así como los procedimientos para su producción y sus usos. De este modo, las composiciones de la invención son útiles para la producción de vacunas para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
En un primer aspecto, la presente invención proporciona una nueva composición que comprende, o alternativamente consiste en, (A) un armazón molecular no natural y (B) un antígeno o determinante antigénico. El armazón molecular no natural comprende, o alternativamente consiste en, (i) una partícula núcleo que es una partícula de tipo virus de un fago con ARN; y (ii) un organizador que comprende al menos un primer sitio de anclaje, donde dicho organizador está conectado a dicha partícula núcleo al menos por medio de un enlace covalente. El antígeno o determinante antigénico es un péptido amiloide beta (A\beta_{1-42}) o un fragmento del mismo y tiene al menos un segundo sitio de anclaje que se selecciona del grupo que consiste en (i) un sitio de anclaje de origen no natural con dicho antígeno o determinante antigénico; y (ii) un sitio de anclaje de origen natural con dicho antígeno o determinante antigénico. La invención proporciona una matriz de auto-antígeno ordenada y repetitiva por medio de una asociación del segundo sitio de anclaje al primer sitio de anclaje mediante al menos un enlace no peptídico. De este modo, el auto-antígeno o auto-determinante antigénico y el armazón molecular no natural se reúnen por medio de esta asociación del primer y el segundo sitio de anclaje para formar una matriz de antígeno ordenada y repetitiva.
En un segundo aspecto, el presente documento describe una composición que comprende, o alternativamente consiste en, (A) un armazón molecular no natural y (B) un antígeno o determinante antigénico. El armazón molecular no natural comprende o alternativamente consiste en, (i) una partícula núcleo y (ii) un organizador que comprende al menos un primer sitio de anclaje, donde dicha partícula núcleo es una partícula de tipo virus que comprende proteínas recombinantes, o fragmentos de las mismas, de un bacteriófago, y donde dicho organizador está conectado a dicha partícula núcleo por medio de un enlace covalente como mínimo. El antígeno o determinante antigénico tiene al menos un segundo sitio de anclaje que se selecciona del grupo que consiste en (i) un sitio de anclaje de origen no natural a dicho antígeno o determinante antigénico; y (ii) un sitio de anclaje de origen natural a dicho antígeno o determinante antigénico. El documento proporciona una matriz ordenada y repetitiva por medio de una asociación del segundo sitio de anclaje al primer sitio de anclaje mediante al menos un enlace no peptídico.
En un tercer aspecto, el presente documento describe una composición que comprende, o alternativamente consiste en, (A) un armazón molecular no natural y (B) un antígeno o determinante antigénico. El armazón molecular no natural comprende, o alternativamente consiste en, (i) una partícula núcleo seleccionada del grupo que consiste en (1) una partícula núcleo de origen no natural y (2) una partícula núcleo de origen natural; y (ii) un organizador que comprende al menos un primer sitio de anclaje, donde dicho organizador está conectado a dicha partícula núcleo por al menos un enlace covalente. El antígeno o determinante antigénico es un péptido beta amiloide (A\beta_{1-42}) o uno de sus fragmentos, y tiene al menos un segundo sitio de anclaje que se selecciona del grupo que consiste en (i) un sitio de anclaje de origen no natural a dicho antígeno o determinante antigénico; y (ii) un sitio de anclaje de origen natural a dicho antígeno o determinante antigénico.
En un cuarto aspecto, el presente documento describe una composición que comprende, o alternativamente consiste en, (A) un armazón molecular no natural y (B) un antígeno o determinante antigénico. El armazón molecular no natural comprende, o alternativamente consiste en, (i) una partícula núcleo seleccionada del grupo que consiste en (1) una partícula núcleo de origen no natural y (2) una partícula núcleo de origen natural; y (ii) un organizador que comprende al menos un primer sitio de anclaje, donde dicho organizador está conectado a dicha partícula núcleo por al menos un enlace covalente. El antígeno o determinante antigénico es un anticuerpo anti-idiotípico o un fragmento de anticuerpo anti-idiotípico y tiene al menos un segundo sitio de anclaje que se selecciona del grupo que consiste en (i) un sitio de anclaje de origen no natural a dicho antígeno o determinante antigénico; y (ii) un sitio de anclaje de origen natural a dicho antígeno o determinante antigénico.
Los aspectos adicionales así como las realizaciones preferidas de la presente invención se harán evidentes a continuación así como, en particular, a la luz de la siguiente descripción detallada, los ejemplos y las reivindicaciones adjuntas.
En una realización preferida de la presente invención, la partícula núcleo es una partícula de tipo virus que comprende proteínas recombinantes de un fago con ARN, seleccionado preferiblemente del grupo que consiste en a) el bacteriófago Q\beta; b) el bacteriófago R17; c) el bacteriófago fr; d) el bacteriófago GA; e) el bacteriófago SP; f) el bacteriófago MS2; g) el bacteriófago M11; h) el bacteriófago MX1; i) el bacteriófago NL95; k) el bacteriófago f2; y 1) el bacteriófago PP7. Son muy preferidos el bacteriófago Q\beta y el bacteriófago fr.
En otra realización preferida de la invención, las proteínas recombinantes de los fagos con ARN comprenden proteínas de la envoltura de tipo salvaje.
En una realización adicional de la invención, las proteínas recombinantes de los fagos con ARN comprenden proteínas de la envoltura mutantes.
También se describen partículas núcleo que comprenden, o alternativamente consisten en, una o más proteínas núcleo (cápside) de la Hepatitis diferentes (HBcAg). Uno o más restos cisteína de estos HBcAg pueden ser suprimidos o sustituidos por otro resto aminoácido (p. ej., un resto serina). En una descripción específica, los restos cisteína del HBcAg utilizado para preparar las composiciones que corresponden a los restos aminoácido 48 y 107 del SEQ ID NO: 134 son o bien suprimidos o bien sustituidos por otro resto aminoácido (p. ej., un resto serina).
Adicionalmente, las variantes de HBcAg utilizadas para preparar las composiciones serán generalmente variantes que conserven la capacidad para asociarse con otros HBcAg para formar estructuras diméricas o multiméricas que presentan matrices de antígenos o determinantes antigénicos ordenadas y repetitivas.
Asimismo se describe el armazón molecular no natural que comprende, o alternativamente consiste en, pili o estructuras de tipo pilus que han sido producidas a partir de proteínas de pilina o cosechadas de bacterias. Cuando se utilizan pili o estructuras de tipo pilus para preparar composiciones, estos pueden estar formados a partir de productos de genes de pilina que están residiendo naturalmente en las células bacterianas pero que han sido modificados mediante ingeniería genética (p. ej., mediante recombinación homóloga) o genes de pilina que han sido introducidos en estas células.
La partícula núcleo anterior puede comprender, o alternativamente consistir en, pili o estructuras de tipo pilus que han sido preparados a partir de proteínas de pilina o cosechados de bacterias. Estas partículas núcleo pueden estar formadas a partir de productos de genes de pilina naturalmente residentes en las células bacterianas.
En una realización concreta, el organizador puede comprender al menos un primer sitio de anclaje. El primer y el segundo sitios de anclaje son elementos particularmente importantes de la invención. En diversas realizaciones de la invención, el primer y/o el segundo sitio de anclaje pueden ser un antígeno y un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo para este; biotina y avidina; estreptavidina y biotina; un receptor y su ligando; una proteína de unión al ligando y su ligando; polipéptidos interaccionantes de la cremallera de leucina; un grupo amino y un grupo químico reactivo con este; un grupo carboxilo y un grupo químico reactivo con este; un grupo sulfhidrilo y un grupo químico reactivo con este; o una de sus combinaciones.
En una realización preferida adicional, la composición comprende adicionalmente un conector aminoacídico. Preferiblemente el conector aminoacídico comprende, o alternativamente consiste en, el segundo sitio de anclaje. El segundo sitio de anclaje media una asociación y una unión dirigida y ordenada, respectivamente, del antígeno a la partícula núcleo. Una función importante del conector aminoacídico consiste en asegurar adicionalmente la presentación y accesibilidad apropiadas del segundo sitio de anclaje, y de este modo facilitar la unión del antígeno a la partícula núcleo, en particular por medio de un entrecruzamiento químico. Otra importante propiedad del conector aminoacídico es la de asegurar adicionalmente una accesibilidad óptima y, en particular, una reactividad del segundo sitio de anclaje. Estas propiedades del conector aminoacídico tienen incluso más importancia para los antígenos proteicos.
En otra realización preferida, el conector aminoacídico se selecciona del grupo que consiste en (a) CGG; (b) conector gamma-1 N-terminal; (c) conector gamma-3 N-terminal; (d) regiones bisagra de Ig; (e) conectores de glicina N-terminal; (f) (G)_{k}C (G)_{n} con n=0-12 y k=0-5; (g) conectores de glicina-serina N-terminales; (h) (G)_{k}C(G)_{m}(S)_{l}(GGGCS)_{n} con n=0-3, k=0-5, m=0-10, l=0-2; (i) GGC; (k) GGC-NH2; (l) conector gamma-1 C-terminal; (m) conector gamma-3 C-terminal, (n) conectores de glicina C-terminal; (o) (G)_{n}C(G)_{k} con n=0-12 y k=0-5; (p) conectores de glicina-serina C-terminales; (q) (G)_{m}(S)_{l}(GGGGS)_{n}(G)_{o}C(G)_{k} con n=0-3, k=0-5, m=0-10, l=0-2, y o=0-8.
Una importante propiedad de los conectores de glicina y glicina-serina es su flexibilidad, en particular su flexibilidad estructural, que permite una amplia gama de conformaciones y desfavorece el plegamiento en las estructuras que imposibilitan la accesibilidad del segundo sitio de anclaje. Como los conectores de glicina y glicina-serina no contienen o contienen una cantidad limitada de restos de las cadenas laterales, tienen una tendencia limitada a engancharse en interacciones extensas con el antígeno, asegurando de este modo adicionalmente la accesibilidad del segundo sitio de anclaje. Los restos serina de los conectores de glicina-serina confieren propiedades de solubilidad mejorada a estos conectores. Por consiguiente, la inserción de uno o dos aminoácidos ya sea en tándem o aislados, y en particular de restos aminoácido polares o cargados, en el conector aminoacídico de glicina o glicina-serina, también está incluida en las enseñanzas de la invención.
En una realización preferida adicional, el conector aminoacídico es GGC-NH2, GGC-NMe, GGC-N(Me)2, GGC-NHET o GGC-N(Et)2, en el que el extremo C del resto cisteína de GGC está amidado. Estos conectores aminoacídicos son preferidos en particular para antígenos peptídicos, y en particular para realizaciones, en las que el antígeno o el determinante antigénico con dicho segundo sitio de anclaje comprenden péptidos A\beta o sus fragmentos. Es particularmente preferido GGC-NH2. En otra realización, el conector aminoacídico es una región bisagra de una Inmunoglobulina (Ig). Los fragmentos de las regiones bisagra de Ig también están dentro del alcance de la invención, así como las regiones bisagra de Ig modificadas con restos glicina. Preferiblemente, las regiones bisagra de Ig contienen solamente un resto cisteína. Se debe entender, que el único resto cisteína del conector aminoacídico de la región bisagra de Ig puede estar localizado en diversas posiciones de la secuencia del conector, y un experto en la técnica sabría cómo seleccionarlas con las pautas de las enseñanzas de esta invención.
En la presente memoria también se describe el acoplamiento de casi cualquier antígeno de elección a la superficie de un virus, pilus bacteriano, estructura formada a partir de pilina bacteriana, bacteriófago, partícula de tipo virus o partícula de la cápside viral. Introduciendo un antígeno en una estructura "de tipo virus" casi cristalina, la invención explota la fuerte producción inmunitaria antiviral de un anfitrión para la producción de una respuesta inmunitaria altamente eficaz, esto es, una vacunación, contra el antígeno presentado. Para esto, el antígeno puede ser seleccionado del grupo que consiste en: (1) una proteína adaptada para inducir una respuesta inmunitaria contra células cancerosas; (2) una proteína adaptada para inducir una respuesta inmunitaria contra enfermedades infecciosas; (3) una proteína adaptada para inducir una respuesta inmunitaria contra alergenos; (4) una proteína adaptada para inducir una respuesta mejorada contra auto-antígenos; y (5) una proteína adaptada para inducir una respuesta inmunitaria en animales de granja o mascotas. En otra realización, el primer sitio de anclaje y/o el segundo sitio de anclaje se seleccionan del grupo que comprende: (1) un resto lisina diseñado genéticamente y (2) un resto cisteína diseñado genéticamente, dos restos que pueden ser unidos químicamente entre sí.
En una realización adicionalmente más preferida, el primer sitio de anclaje comprende o es un grupo amino y dicho segundo sitio de anclaje comprende o es un grupo sulfhidrilo. Preferiblemente, el primer sitio de anclaje comprende o es un resto lisina y dicho segundo sitio de anclaje comprende o es un resto cisteína.
La invención también incluye realizaciones en las que la partícula organizadora tiene solamente un único sitio de anclaje y el antígeno o determinante antigénico tiene solamente un segundo sitio de anclaje. De este modo, cuando se prepara una matriz de antígeno ordenada y repetitiva utilizando tales realizaciones, cada organizador se unirá a un único antígeno o determinante antigénico.
El documento describe adicionalmente composiciones que comprenden, o alternativamente consisten en, (a) un armazón molecular no natural que comprende (i) una partícula núcleo seleccionada del grupo que consiste en una partícula núcleo de origen no natural y una partícula núcleo de origen natural, y (ii) un organizador que comprende al menos un primer sitio de anclaje, donde la partícula núcleo comprende, o alternativamente consiste en, una partícula de tipo virus, un pilus bacteriano, una estructura de tipo pilus, o un HBcAg modificado, o uno de sus fragmentos, y donde el organizador está conectado a la partícula núcleo por al menos un enlace covalente, y (b) un antígeno o determinante antigénico con al menos un segundo sitio de anclaje, estando seleccionado el segundo sitio de anclaje del grupo que consiste en (i) un sitio de anclaje de origen no natural al antígeno o determinante antigénico y (ii) un sitio de anclaje de origen natural al antígeno o determinante antigénico, donde el segundo sitio de anclaje es capaz de asociarse por medio de al menos un enlace no peptídico al primer sitio de anclaje, y donde el antígeno o determinante antigénico y el armazón interaccionan a través de la asociación para formar una matriz de antígeno ordenada y repetitiva.
Otras realizaciones de la invención incluyen procedimientos para la producción de composiciones de la invención y métodos de tratamiento médico utilizando composiciones de vacuna descritas en la presente memoria.
Se debe entender que tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada son solamente ilustrativas y explicativas y están destinadas a proporcionar una explicación adicional de la invención reivindicada.
El documento describe adicionalmente una composición que comprende una proteína de la envoltura del bacteriófago Q\beta anclada por medio de un enlace covalente a una proteína fosfolipasa A_{2}, o uno de sus fragmentos. En una realización preferida, la proteína fosfolipasa A_{2}, o uno de sus fragmentos, y la proteína de la envoltura del bacteriófago Q\beta interaccionan por medio de un enlace covalente para formar una matriz de antígeno ordenada y repetitiva. En otra realización preferida, el enlace covalente no es un enlace peptídico. En otra realización preferida, la proteína fosfolipasa A_{2} incluye un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 168, la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 169, la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 170, la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 171, la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 172, la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 173, la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 174, y la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 175.
El documento también proporciona un método para elaborar la composición que comprende combinar la proteína de la envoltura del bacteriófago Q\beta y la proteína fosfolipasa A_{2}, donde la proteína de la envoltura del bacteriófago Q\beta y la proteína fosfolipasa A_{2} interaccionan para formar una matriz de antígeno.
En otro aspecto, el presente documento también proporciona una composición que comprende un armazón molecular no natural que comprende una proteína de la envoltura del bacteriófago Q\beta, y un organizador que comprende al menos un primer sitio de anclaje, donde el organizador está conectado con la proteína de la envoltura del bacteriófago Q\beta por al menos un enlace covalente; y la proteína fosfolipasa A_{2}, o uno de sus fragmentos, o una de sus variantes con al menos un segundo sitio de anclaje, seleccionándose el segundo sitio de anclaje del grupo que consiste en: un sitio de anclaje de origen no natural con una proteína fosfolipasa A_{2}, o uno de sus fragmentos; y sitio de anclaje de origen natural con la proteína fosfolipasa A_{2}, o uno de sus fragmentos, donde el segundo sitio de anclaje se asocia a través de al menos un enlace no peptídico al primer sitio de anclaje, y donde el antígeno o determinante antigénico y el armazón interaccionan por medio de la asociación para formar una matriz de antígeno ordenada y repetitiva. La proteína fosfolipasa A_{2} puede incluir un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 168, la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 169, la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 170, la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 171, la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 172, la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 173, la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 174, y la secuencia de aminoácidos del SEQ ED NO: 175.
El presente documento también proporciona un método para elaborar la composición que comprende combinar la proteína de la envoltura del bacteriófago Q\beta y la proteína fosfolipasa A_{2}, donde la proteína de la envoltura del bacteriófago Q\beta y la proteína fosfolipasa A_{2} interaccionan para formar una matriz de antígeno. La matriz de antígeno puede ser ordenada y/o repetitiva.
El presente documento también proporciona una composición farmacéutica que comprende una proteína fosfolipasa A_{2}, y un portador farmacéuticamente aceptable y una composición de vacuna que comprende una proteína fosfolipasa A_{2}, que comprende opcionalmente adicionalmente al menos un coadyuvante.
El presente documento también proporciona un método de tratamiento de una alergia al veneno de la abeja, que comprende administrar la composición farmacéutica o la composición de vacuna a un sujeto. Como resultado de semejante administración el sujeto muestra un descenso en la respuesta inmunitaria al veneno.
El documento también describe una vacuna para la prevención de enfermedades mediadas por priones mediante la inducción de anticuerpos anti-linfotoxina \beta, anti-linfotoxina \alpha o anti-receptor de linfotoxina \beta. La vacuna contiene proteínas portadoras foráneas para el animal inmunizado o animal acoplado a linfotoxina \beta o uno de sus fragmentos, linfotoxina \alpha o uno de sus fragmentos o el receptor de linfotoxina \beta o uno de sus fragmentos. La vacuna es inyectada en seres humanos o animales con el fin de inducir anticuerpos específicos para la linfotoxina \beta, la linfotoxina \alpha o el receptor de linfotoxina \beta endógenos. Estos anticuerpos anti-linfotoxina \beta, linfotoxina \alpha o anti-receptor de linfotoxina \beta inducidos reducen o eliminan la reserva de células dendríticas foliculares presente en los órganos linfoides. Puesto que la replicación de priones en órganos linfoides y el transporte al sistema nervioso central están deteriorados en ausencia de células dendríticas foliculares, este tratamiento inhibe el progreso de la enfermedad mediada por priones. Además, el bloqueo de las linfotoxinas es beneficioso para pacientes con enfermedades autoinmunitarias tales como la diabetes de tipo I.
Breve descripción de las figuras
Fig. 1A-1C
Vectores modulares de expresión eucariótica para la expresión de los antígenos de acuerdo con la invención;
Fig. 2A-2C
Clonación, expresión y acoplamiento de resistina a la proteína de la cápside de Q\beta;
Fig. 3A-3B
Clonación y expresión de constructos de linfotoxina-\beta para el acoplamiento a partículas de tipo virus y pili.
Fig. 4A-4B
Clonación, expresión y acoplamiento de constructos de MIF a la proteína de la cápside de Q\beta.
Fig. 4C
Análisis ELISA de anticuerpos IgG específicos para MIF en sueros de ratones inmunizados contra proteínas MIF acopladas a la proteína de la cápside de Q\beta.
Fig. 5
Acoplamiento de constructos de MIF a la proteína de la cápside de fr y a la proteína de la cápside HBcAg-lys-2cys-Mut analizada mediante SDS-Page.
Fig. 6
Clonación y expresión C-RANKL humano.
Fig. 7
Clonación y expresión de proteína priónica.
Fig. 8A
Análisis ELISA de anticuerpos IgG específicos para "Angio I" en sueros de ratones inmunizados contra péptidos de angiotensina acoplados a la proteína de la cápside de Q\beta.
Fig. 8B
Análisis ELISA de anticuerpos IgG específicos para "Angio II" en sueros de ratones inmunizados contra péptidos de angiotensina acoplados a la proteína de la cápside de Q\beta.
Fig. 8C
Análisis ELISA de anticuerpos IgG específicos para "Angio III" en sueros de ratones inmunizados contra péptidos de angiotensina acoplados a la proteína de la cápside de Q\beta.
Fig. 8D
Análisis ELISA de anticuerpos IgG específicos para "Angio IV" en sueros de ratones inmunizados contra péptidos de angiotensina acoplados a la proteína de la cápside de Q\beta.
Fig. 9A
Análisis ELISA de anticuerpos IgG específicos para "Der p I p52" en sueros de ratones inmunizados contra péptidos Der p I acoplados a la proteína de la cápside de Q\beta.
Fig. 9B
Análisis ELISA de anticuerpos IgG específicos para "Der p I p117" en sueros de ratones inmunizados contra péptidos Der p I acoplados a la proteína de la cápside de Q\beta.
Fig. 10A
Análisis ELISA de anticuerpos IgG específicos para el péptido VEGFR II humano en sueros de ratones inmunizados contra el péptido VEGFR II humano y el dominio extracelular de VEGFR II humano acoplados ambos a la proteína de los pili de Tipo 1.
Fig. 10B
Análisis ELISA de anticuerpos IgG específicos para el dominio extracelular de VEGFR II humano en sueros de ratones inmunizados contra el péptido VEGFR II humano y el dominio extracelular de VEGFR II humano acoplados ambos a la proteína de los pili de Tipo 1.
Fig. 11
Análisis ELISA de anticuerpos IgG específicos para la proteína anti-TNF\alpha en sueros de ratones inmunizados contra HBc-TNF completo.
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Fig. 12
Análisis ELISA de anticuerpos IgG específicos para la proteína anti-TNF\alpha en sueros de ratones inmunizados contra 2cysLys-mut HBcAg1-149 acoplado al péptido 3'TNF II.
Fig. 13A
Análisis SDS-PAGE de acoplamiento de "A\beta1-15" a la proteína de la cápside de Q\beta utilizando el entrecruzador SMPH.
Fig. 13B
Análisis SDS-PAGE de acoplamiento de "and33-42" a la proteína de la cápside de Q\beta utilizando el entrecruzador SMPH.
Fig. 13C
Análisis SDS-PAGE del acoplamiento de "A\beta1-27" a la proteína de la cápside de Q\beta utilizando el entrecruzador SMPH.
Fig. 13D
Análisis SDS-PAGE del acoplamiento de "A\beta1-15" a la proteína de la cápside de Q\beta utilizando el entrecruzador Sulfo-GMBS.
Fig. 13E
Análisis SDS-PAGE del acoplamiento de "A\beta1-15" a la proteína de la cápside de Q\beta utilizando el entrecruzador Sulfo-MBS.
Fig. 14A
Análisis ELISA de anticuerpos IgG específicos para "A\beta1-15" en sueros de ratones inmunizados contra "A\beta1-15" acoplado a la proteína de la cápside de Q\beta.
Fig. 14B
Análisis ELISA de anticuerpos IgG específicos para "A\beta1-27" en sueros de ratones inmunizados contra "A\beta1-27" acoplado a la proteína de la cápside de Q\beta.
Fig. 14C
Análisis ELISA de anticuerpos IgG específicos para "A\beta33-42" en sueros de ratones inmunizados contra "A\beta33-42" acoplado a la proteína de la cápside de Q\beta.
Fig. 15A
Análisis SDS-PAGE del acoplamiento de pCC2 a la proteína de la cápside de Q\beta.
Fig. 15B
Análisis SDS-PAGE del acoplamiento de pCA2 a la proteína de la cápside de Q\beta.
Fig. 15C
Análisis SDS-PAGE del acoplamiento de pCB2 a la proteína de la cápside de Q\beta.
Fig. 16
Acoplamiento de péptidos priónicos a la proteína de la cápside de Q\beta; análisis SDS-Page.
Fig. 17A
Análisis SDS-PAGE de la expresión de IL-5 en bacterias.
Fig. 17B
Análisis de Transferencia Western de la expresión de IL-5 e IL-13 en células eucarióticas
Fig. 18A
Análisis SDS-PAGE del acoplamiento del péptido VEGFR-2 murino a Pili.
Fig. 18B
Análisis SDS-PAGE del acoplamiento del péptido VEGFR-2 murino a la proteína de la cápside de Q\beta.
Fig. 18C
Análisis SDS-PAGE del acoplamiento del péptido VEGFR-2 murino a HBcAg-lys-2cys-Mut.
Fig 18D
Análisis ELISA de anticuerpos IgG específicos para el péptido VEGFR-2 murino en sueros de ratones inmunizados contra el péptido VEGFR-2 murino acoplado a Pili.
Fig 18E
Análisis ELISA de anticuerpos IgG específicos para el péptido VEGFR-2 murino en sueros de ratones inmunizados contra el péptido VEGFR-2 murino acoplado a la proteína de la cápside de Q\beta.
Fig 18F
Análisis ELISA de anticuerpos IgG específicos para el péptido VEGFR-2 murino en sueros de ratones inmunizados contra el péptido VEGFR-2 murino acoplado a HBcAg-lys-2cys-Mut.
Fig. 19A
Análisis SDS-PAGE del acoplamiento del péptido A\beta 1-15 a HBcAg-lys-2cys-Mut y proteína de la cápside de fr.
Fig. 19B
Análisis ELISA de anticuerpos IgG específicos para el péptido A\beta 1-15 en sueros de ratones inmunizados contra el péptido A\beta 1-15 acoplado a HBcAg-lys-2cys-Mut o a la proteína de la cápside de fr.
Fig. 20
Análisis ELISA de anticuerpos IgG específicos para A\beta humano en sueros de ratones APP23 transgénicos inmunizados con péptidos A\beta humanos acoplados a la proteína de la cápside de Q\beta.
Fig. 21
Análisis SDS-PAGE del acoplamiento de un fragmento de anticuerpo Fab a la proteína de la cápside de Q\beta.
Fig. 22A
Análisis SDS-PAGE del acoplamiento del péptido flag acoplado a la proteína de la cápside de Q\beta mutante con el entrecruzador sulfo GMBS.
Fig. 22B
Análisis SDS-PAGE del acoplamiento del péptido flag acoplado a la proteína de la cápside de Q\beta mutante con el entrecruzador sulfo MBS.
Fig. 22C
Análisis SDS-PAGE del acoplamiento del péptido flag acoplado a la proteína de la cápside de Q\beta mutante con el entrecruzador SMPH.
Fig. 22D
Análisis SDS-PAGE del acoplamiento de la proteína PLA_{2}-cys acoplada a la proteína de la cápside de Q\beta mutante con el entrecruzador SMPH
\newpage
Fig. 23
Análisis ELISA de inmunización con el péptido M2 acoplado a la proteína de la cápside de Q\beta mutante y de la cápside de fr.
Fig. 24
Análisis SDS-PAGE del acoplamiento del péptido DER p1,2 acoplado a la proteína de la cápside de Q\beta mutante.
Fig. 25A
Desensibilización de ratones alérgicos con PLA2 acoplado a la proteína de la cápside de Q\beta: mediciones de temperatura.
Fig. 25B
Desensibilización de ratones alérgicos con PLA2-cys acoplado a la proteína de la cápside de Q\beta: títulos de IgG 2A e Ig E.
Fig. 26
Análisis SDS-PAGE y análisis de Transferencia Western del acoplamiento de PLA_{2}-cys a la proteína de la cápside de Q\beta
Fig. 27A
Análisis ELISA de anticuerpos IgG específicos para el péptido M2 en sueros de ratones inmunizados contra el péptido M2 acoplado a HBcAg-lys-2cys-Mut, proteína de la cápside de Q\beta, proteína de la cápside de fr, HBcAg-lys-1-183 y péptido M2 fusionado a HBcAg 1-183.
Fig. 28A
Análisis SDS-PAGE del acoplamiento del mimocuerpo VAE051 de IgE anti-idiotípico a la proteína de la cápside de Q\beta.
Fig. 28B
Análisis ELISA de anticuerpos IgG específicos para el anticuerpo VAE051 anti-idiotípico e IgE Humana en sueros de ratones inmunizados contra VAE051 acoplado a la proteína de la cápside de Q\beta.
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Descripción detallada de la invención 1. Definiciones
Alfavirus: Según se utiliza en la presente memoria, el término "alfavirus" hace referencia a cualquiera de los virus con ARN incluidos en el género Alphavirus. La descripción de los miembros de este género está contenida en Strauss y Strauss, Microbiol. Rev., 58:491-562 (1994). Los ejemplos de los alfavirus incluyen el virus Aura, el virus Bebaru, el virus Cabassou, el virus Chikungunya, el virus de la encefalomielitis equina Oriental, el virus Fort morgan, el virus Getah, el virus Kyzylagach, el virus Mayoaro, el virus Middleburg, el virus Mucambo, el virus Ndumu, el virus Pixuna, el virus Tonate, el virus Triniti, el virus Una, el virus de la encefalomielitis equina Occidental, el virus Whataroa, el virus Sindbis (SIN), el virus Semliki Forest (SFV), el virus de la encefalomielitis equina Venezolana (VEE), y el virus Ross River.
Antígeno: Según se utiliza en la presente memoria, el término "antígeno" es una molécula capaz de unirse a un anticuerpo. Un antígeno es adicionalmente capaz de inducir una respuesta inmunitaria humoral y/o una respuesta inmunitaria celular que conduce a la producción de linfocitos B y/o T. Un antígeno puede tener uno o más epítopos (epítopos B y T). La reacción específica a la que se hace referencia antes pretende indicar que el antígeno reaccionará, de una manera altamente selectiva, con su correspondiente anticuerpo y no con la multitud de anticuerpos distintos que pueden ser evocados por otros antígenos.
Determinante antigénico: Según se utiliza en la presente memoria, el término "determinante antigénico" pretende hacer referencia a la porción de un antígeno que es específicamente reconocida por los linfocitos B o T. Los linfocitos B responden a determinantes antigénicos foráneos por medio de la producción de anticuerpos, mientras los linfocitos T son los mediadores de la inmunidad celular. De este modo, los determinantes antigénicos o epítopos son aquellas porciones de un antígeno que son reconocidas por los anticuerpos, o en el contexto de un MHC, por los receptores de las células T.
Asociación: Según se utiliza en la presente memoria, el término "asociación" que se aplica al primer y segundo sitios de anclaje, hace referencia a al menos un enlace no peptídico. La naturaleza de la asociación puede ser covalente, iónica, hidrófoba, polar o cualquiera de sus combinaciones.
Sitio de Anclaje, Primero: Según se utiliza en la presente memoria, la frase "primer sitio de anclaje" hace referencia a un elemento del "organizador", unido como tal a la partícula núcleo de una manera no al azar, al cual se puede asociar el segundo sitio de anclaje localizado en el antígeno o determinante antigénico. El primer sitio de anclaje puede ser una proteína, un polipéptido, un aminoácido, un péptido, un azúcar, un polinucleótido, un polímero natural o sintético, un metabolito o compuesto secundario (biotina, fluoresceína, retinol, digoxigenina, iones metálicos, fluoruro de fenilmetilsulfonilo), o una de sus combinaciones, o uno de sus grupos químicamente reactivos. En la superficie del armazón molecular no natural se encuentran presentes múltiples primeros sitios de anclaje en una configuración repetitiva.
Sitio de Anclaje, Segundo: Según se utiliza en la presente memoria, la frase "segundo sitio de anclaje" hace referencia a un elemento asociado con el antígeno o determinante antigénico al cual se puede asociar el primer sitio de anclaje del "organizador" localizado en la superficie del armazón molecular no natural. El segundo sitio de anclaje del antígeno o determinante antigénico puede ser una proteína, un polipéptido, un péptido, un azúcar, un polinucleótido, un polímero natural o sintético, un metabolito o compuesto secundario (biotina, fluoresceína, retinol, digoxigenina, iones metálicos, fluoruro de fenilmetilsulfonilo), o una de sus combinaciones, o uno de sus grupos químicamente reactivos. En el antígeno o determinante antigénico está presente al menos un segundo sitio de anclaje. El término "antígeno o determinante antigénico con al menos un segundo sitio de anclaje" hace referencia, por lo tanto, a un antígeno o constructo antigénico que comprende al menos el antígeno o determinante antigénico y el segundo sitio de anclaje. No obstante, en particular para el segundo sitio de anclaje, que no es de origen natural en el antígeno o determinante antigénico, estos antígenos o constructos antigénicos comprende un "conector aminoacídico". Semejante conector aminoacídico, o también denominado solo "conector" en esta memoria, asocia el antígeno o determinante antigénico con el segundo sitio de anclaje, o más preferiblemente, ya comprende o contiene el segundo sitio de anclaje, típicamente - pero no necesariamente - en forma de un resto aminoácido, preferiblemente en forma de un resto cisteína. El término "conector aminoacídico" según se utiliza en la presente memoria, sin embargo, no pretende implicar que semejante conector aminoacídico consiste exclusivamente en restos aminoácido, incluso si un conector aminoacídico que consiste en restos aminoácido es una realización preferida de la presente invención. Los restos aminoácido del conector aminoacídico están compuestos, preferiblemente, por aminoácidos de origen natural o aminoácidos no naturales conocidos en la técnica, todo L o todo D o sus mezclas. Sin embargo, un conector aminoacídico que comprende una molécula con un grupo sulfihidrilo o un resto cisteína también está incluido en la invención. Semejante molécula comprende preferiblemente un radical alquilo C_{1}-C_{6}, cicloalquilo (C_{5}-C_{6}), arilo o heteroarilo. La asociación entre el antígeno o determinante antigénico u opcionalmente el segundo sitio de anclaje y el conector aminoacídico es preferiblemente por medio de al menos un enlace covalente, más preferiblemente por medio de al menos un enlace peptídico.
Unido: Según se utiliza en la presente memoria, el término "unido" hace referencia a una unión o anclaje que puede ser covalente, p. ej., mediante acoplamiento químico, o no covalente, p. ej., interacciones iónicas, interacciones hidrofóbicas, enlaces de hidrógeno, etc. Los enlaces covalentes pueden ser, por ejemplo, enlaces éster, éter, fosfoéster, amida, peptídico, imida, carbono-azufre, carbono-fósforo y similares. El término "unido" es más amplio e incluye los términos tales como "acoplado", "fusionado" y "anclado".
Partícula núcleo: Según se utiliza en la presente memoria, el término "partícula núcleo" hace referencia a una estructura rígida con una organización repetitiva inherente que proporciona un apoyo para el anclaje de un "organizador". Una partícula núcleo según se utiliza en la presente memoria puede ser el producto de un procedimiento sintético o el producto de un procedimiento biológico.
Proteína o proteínas de la envoltura: Según se utiliza en la presente memoria, el término "proteína o proteínas de la envoltura" hace referencia a la proteína o las proteínas de un bacteriófago o un fago con ARN susceptibles de ser incorporadas al ensamblaje de la cápside del bacteriófago o del fago con ARN. Sin embargo, cuando se hace referencia al producto génico específico del gen de la proteína de la envoltura de los fagos con ARN se utiliza el término "CP". Por ejemplo, el producto génico específico del gen de la proteína de la envoltura del fago con ARN Q\beta es referido como "Q\beta CP", mientras las "proteínas de la envoltura" del bacteriófago Qb comprenden la "Q\beta CP" así como también la proteína A1.
Que actúa en cis: Según se utiliza en la presente memoria, la frase "que actúa en cis" hace referencia a secuencias de ácido nucleico a las cuales se une la replicasa para catalizar la replicación de las moléculas de ARN dependientes de ARN. Estos eventos de replicación dan como resultado la replicación de las moléculas de ARN completas y parciales y, de este modo, el promotor subgenómico de alfavirus es también una secuencia "que actúa en cis". Las secuencias que actúan en cis pueden estar localizadas en o cerca del extremo 5', el extremo 3', o ambos extremos de una molécula de ácido nucleico, así como internamente.
Fusión: Según se utiliza en la presente memoria, el término "fusión" hace referencia a la combinación de secuencias de aminoácido de diferente origen en una cadena polipeptídica mediante la combinación en marco de sus secuencias de nucleótidos codificantes. El término "fusión" abarca explícitamente fusiones internas, esto es, la inserción de secuencias de diferente origen en una cadena polipeptídica, además de la fusión a uno de sus extremos.
Secuencia heteróloga: Según se utiliza en la presente memoria, el término "secuencia heteróloga" hace referencia a una segunda secuencia de nucleótidos presente en un vector de la invención. El término "secuencia heteróloga" también hace referencia a cualquier secuencia de aminoácidos o ARN codificada por una secuencia de ADN heteróloga contenida en un vector de la invención. Las secuencias de nucleótidos heterólogas pueden codificar proteínas o moléculas de ARN expresadas normalmente en el tipo de célula en el que están presentes o moléculas que no son expresadas normalmente allí (p. ej., proteínas estructurales de Sindbis).
Aislado: Según se utiliza en la presente memoria, cuando se utiliza el término "aislado" en referencia a una molécula, el término significa que la molécula ha sido separada de su entorno natural. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido naturalmente presente en un animal vivo no está "aislado", pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes en su estado natural está "aislado". Adicionalmente, las moléculas de ADN recombinante contenidas en un vector se consideran aisladas para los fines de la presente invención. Las moléculas de ARN aisladas incluyen los productos de la replicación del ARN in vivo o in vitro de moléculas de ADN y ARN. Las moléculas de ácido nucleico aisladas incluyen adicionalmente las moléculas producidas sintéticamente. Adicionalmente, las moléculas vectoras contenidas en las células anfitrionas recombinantes también están aisladas. De este modo, no todas las moléculas "aisladas" necesitan ser purificadas.
"Inmunoterapéutico": Según se utiliza en la presente memoria, el término "inmunoterapéutico" es una composición para el tratamiento de enfermedades o trastornos. Más específicamente, el término se utiliza para hacer referencia a un método de tratamiento para alergias o un método de tratamiento para el cáncer.
Individuo: Según se utiliza en la presente memoria, el término "individuo" hace referencia a organismos pluricelulares e incluye tanto plantas como animales. Los organismos pluricelulares preferidos son los animales, son más preferidos los vertebrados, son aún más preferidos los mamíferos, y son muy preferidos los seres humanos.
"Baja o no detectable": Según se utiliza en la presente memoria, la frase "baja o no detectable", cuando se utiliza en referencia al nivel de expresión génica, hace referencia a un nivel de expresión que es significativamente inferior al observado cuando el gen es inducido al máximo (p. ej., al menos cinco veces inferior) o no es fácilmente detectable mediante los métodos utilizados en la siguientes sección de ejemplos.
Lectina: Según se utiliza en la presente memoria, proteínas obtenidas concretamente a partir de semillas de plantas leguminosas, pero también de muchas otras fuentes vegetales y animales, que tienen sitios de unión para mono- u oligosacáridos específicos. Los ejemplos incluyen la concanavalina A y la glutinina de germen de trigo, que son ampliamente utilizadas como agentes analíticos y preparativos en el estudio de las glucoproteínas.
Mimotopo: Según se utiliza en la presente memoria, el término "mimotopo" hace referencia a una sustancia que induce una respuesta inmunitaria a un antígeno o determinante antigénico. Generalmente, el término mimotopo se utilizará en referencia a un antígeno concreto. Por ejemplo, un péptido que logra la producción de anticuerpos para una fosfolipasa A_{2} (PLA_{2}) es un mimotopo del determinante antigénico al cual se unen los anticuerpos. Un mimotopo puede tener o no similitud estructural sustancial o compartir propiedades estructurales con un antígeno o determinante antigénico para el cual induce una respuesta inmunitaria. Los métodos para generar e identificar mimotopos que inducen respuestas inmunitarias a antígenos o determinantes antigénicos concretos son conocidos en la técnica y se describen en otro sitio en la presente memoria.
Origen natural: Según se utiliza en la presente memoria, el término "origen natural" significa que la totalidad o partes del mismo no son sintéticas y existen o son producidas en la naturaleza.
No natural: Según se utiliza en la presente memoria, el término significa generalmente que no es de la naturaleza, más específicamente, el término significa con intervención del hombre.
Origen no natural: Según se utiliza en la presente memoria, el término "origen no natural" significa generalmente sintético o que no es de la naturaleza; más específicamente, el término significa con intervención del hombre.
Armazón molecular no natural: Según se utiliza en la presente memoria, la frase "armazón molecular no natural" hace referencia a cualquier producto elaborado por la mano del hombre que puede servir para proporcionar una matriz rígida y repetitiva de primeros sitios de anclaje. Idealmente pero no necesariamente, estos primeros sitios de anclaje están en un orden geométrico. El armazón molecular no natural puede ser orgánico o no orgánico y puede ser sintetizado químicamente o por medio de procedimientos biológicos, en parte o en su totalidad. El armazón molecular no natural está formado por: (a) una partícula núcleo, ya sea de origen natural o no natural; y (b) un organizador, que a su vez comprende al menos un primer sitio de anclaje y está conectado a una partícula núcleo por al menos un enlace covalente. En una realización concreta, el armazón molecular no natural puede ser un virus, una partícula de tipo virus, un pilus bacteriano, una partícula de la cápside del virus, un fago, una de sus formas recombinantes, o una partícula sintética.
Matriz de antígeno o determinante antigénico ordenada y repetitiva: Según se utiliza en la presente memoria, el término "matriz de antígeno o determinante antigénico ordenada y repetitiva" hace referencia generalmente a un patrón de repetición de antígeno o determinante antigénico, caracterizado por una disposición espacial uniforme de los antígenos o determinantes antigénicos con respecto al armazón molecular no natural. En una realización de la invención, el patrón de repetición puede ser un patrón geométrico. Los ejemplos de las matrices de antígeno o determinante antigénico ordenadas y repetitivas adecuadas son aquellos que poseen órdenes paracristalinos estrictamente repetitivos de antígenos o determinantes antigénicos con espaciamientos de 5 a 15 nanometros.
Organizador: Según se utiliza en la presente memoria, el término "organizador" se utiliza para hacer referencia a un elemento unido a una partícula núcleo de una manera no al azar que proporciona un sitio de nucleación para crear una matriz de antígeno ordenada y repetitiva. Un organizador es cualquier elemento que comprende al menos un primer sitio de anclaje que está unido a una partícula núcleo por al menos un enlace covalente. Un organizador puede ser una proteína, un polipéptido, un péptido, un aminoácido (esto es, un resto de una proteína, un polipéptido o un péptido), un azúcar, un polinucleótido, un polímero natural o sintético, un metabolito o un compuesto secundario (biotina, fluoresceína, retinol, digoxigenina, iones metálicos, fluoruro de fenilmetilsulfonilo), o una de sus combinaciones, o uno de sus grupos químicamente reactivos. Por lo tanto, el organizador asegura adicionalmente la formación de una matriz de antígeno ordenada y repetitiva de acuerdo con la presente invención. En las realizaciones típicas de la invención, la partícula núcleo es modificada, p. ej., por medio de ingeniería genética o reacción química, con el fin de generar un armazón molecular no natural que comprende la partícula núcleo y el organizador, estando conectado el último a la partícula núcleo por al menos un enlace covalente. En ciertas realizaciones de la invención, no obstante, se selecciona el organizador para que sea parte de la partícula núcleo. Por lo tanto, para aquellas realizaciones la modificación de la partícula núcleo no es forzosamente necesaria para generar un armazón molecular no natural que comprende la partícula núcleo y el organizador para asegurar la formación de una matriz de antígeno ordenada y repetitiva.
Temperatura permisiva: Según se utiliza en la presente memoria, la frase "temperatura permisiva" hace referencia a las temperaturas a las cuales una enzima tiene niveles relativamente elevados de actividad catalítica.
Pili: Según se utiliza en la presente memoria, el término "pili" (siendo el singular "pilus") hace referencia a estructuras extracelulares de las células bacterianas compuestas por monómeros de proteína (p. ej., monómeros de pilina) que están organizados en patrones ordenados y repetitivos. Adicionalmente, los pili son estructuras que están implicadas en procedimientos tales como el anclaje de células bacterianas a receptores de la superficie de la célula anfitriona, intercambios genéticos intercelulares, y reconocimiento célula a célula. Los ejemplos de los pili incluyen los pili de Tipo 1, los pili P, los pili F1C, los pili S, y los pili 987P. Más abajo se exponen ejemplos adicionales de pili.
Estructura de tipo pilus: Según se utiliza en la presente memoria, la frase "estructura de tipo pilus" hace referencia a estructuras que tienen características similares a las de los pili y compuestas por monómeros de proteína. Un ejemplo de una "estructura de tipo pilus" es una estructura formada por una célula bacteriana que expresa proteínas de pilina modificadas que no forman matrices ordenadas y repetitivas que son esencialmente idénticas a las de los pili
naturales.
Polipéptido: Según se utiliza en la presente memoria el término "polipéptido" hace referencia a un polímero compuesto por restos aminoácido, generalmente restos aminoácido naturales, unidos entre sí a través de enlaces peptídicos. Aunque el polipéptido puede no tener necesariamente un tamaño limitado, el término polipéptido se utiliza a menudo junto con un péptido de un tamaño de aproximadamente diez a aproximadamente 50 aminoácidos.
Proteína: Según se utiliza en la presente memoria, el término proteína hace referencia a un polipéptido generalmente de un tamaño de más de 20, más concretamente más de 50 restos aminoácido. Las proteínas tienen generalmente una estructura tridimensional definida aunque no lo necesitan forzosamente, y son a menudo referidas como plegadas, en oposición a los péptidos y polipéptidos que a menudo no poseen una estructura tridimensional definida, pero en lugar de ello pueden adoptar un gran número de conformaciones diferentes, y son referidos como no plegados. Las estructuras tridimensionales definidas de las proteínas son especialmente importantes para la asociación entre la partícula núcleo y el antígeno, mediada por el segundo sitio de anclaje, y en particular por medio de un entrecruzamiento químico entre el primer y el segundo sitio de anclaje utilizando un entrecruzador químico. El conector aminoacídico también está íntimamente relacionado con las propiedades estructurales de las proteínas en algunos aspectos de la invención.
Purificado: Según se utiliza en la presente memoria, cuando se utiliza el término "purificado" en referencia a una molécula, significa que la concentración de la molécula que está siendo purificada ha aumentado con respecto a las moléculas asociadas con ella en su entorno natural. Las moléculas naturalmente asociadas incluyen proteínas, ácidos nucleicos, lípidos y azúcares pero generalmente no incluyen agua, tampones, y reactivos añadidos para mantener la integridad o facilitar la purificación de la molécula que está siendo purificada. Por ejemplo, incluso si el ARNm está diluido con un disolvente acuoso durante la cromatografía en columna con oligo dT, las moléculas de ARNm son purificadas por medio de esta cromatografía si los ácidos nucleicos y otras moléculas biológicas naturalmente asociadas no se unen a la columna y son separadas de las moléculas de ARNm sujeto.
Receptor: Según se utiliza en la presente memoria, el término "receptor" hace referencia a proteínas u oligoproteínas o sus fragmentos capaces de interaccionar con otra molécula, denominada ligando. El ligando puede pertenecer a cualquier clase de compuesto bioquímico o químico. El receptor no necesita forzosamente ser una proteína unida a la membrana. Las proteínas solubles, como p. ej., la proteína de unión a maltosa o la proteína de unión a retinol también son receptores.
Resto: Según se utiliza en la presente memoria, se pretende que el término "resto" represente un aminoácido específico de una cadena principal o una cadena lateral polipeptídica.
Célula anfitriona recombinante: Según se utiliza en la presente memoria, el término "célula anfitriona recombinante" hace referencia a una célula anfitriona en la cual se han introducido una o más moléculas de ácido nucleico de la invención.
Virus recombinante: Según se utiliza en la presente memoria, la frase "virus recombinante" hace referencia a un virus que está modificado genéticamente por la mano del hombre. La frase abarca cualquier virus conocido en la técnica. Más específicamente, la frase hace referencia a un alfavirus modificado genéticamente por la mano del hombre,
y más específicamente, la frase hace referencia a un virus Sinbis modificado genéticamente por la mano del hombre.
Temperatura restrictiva: Según se utiliza en la presente memoria, la frase "temperatura restrictiva" hace referencia a las temperaturas a las cuales una enzima tiene niveles de actividad catalítica bajos o no detectables. Se conocen mutantes sensibles tanto al "calor" como al "frío" y, de este modo, una temperatura restrictiva puede ser superior o inferior a la temperatura permisiva.
Evento de replicación de ARN dependiente de ARN: Según se utiliza en la presente memoria, la frase "evento de replicación de ARN dependiente de ARN" hace referencia a un procedimiento que da como resultado la formación de una molécula de ARN utilizando una molécula de ARN como molde.
ARN polimerasa dependiente de ARN: Según se utiliza en la presente memoria, la frase "ARN polimerasa dependiente de ARN" hace referencia a una polimerasa que cataliza la producción de una molécula de ARN a partir de otra molécula de ARN. Este término se utiliza en la presente memoria como sinónimo del término "replicasa".
Fago con ARN: Según se utiliza en la presente memoria, el término "Fago con ARN" hace referencia a los virus con ARN que infectan bacterias, preferiblemente a virus con ARN de sentido positivo de hebra sencilla que infectan bacterias.
Auto-antígeno: Según se utiliza en la presente memoria, el término "auto-antígeno" hace referencia a las proteínas codificadas por el ADN del anfitrión y los productos generados por las proteínas o el ARN codificado por el ADN del anfitrión son denominados auto. Además, las proteínas que resultan de una combinación de dos o varias auto-moléculas o que representan una fracción de una auto-molécula y las proteínas que tienen una elevada homología con las auto-moléculas definidas antes (>95%) también pueden ser consideradas auto.
Sensible a la temperatura: Según se utiliza en la presente memoria, la frase "sensible a la temperatura" hace referencia a una enzima que cataliza fácilmente una reacción a una temperatura pero cataliza la misma reacción lentamente o no lo hace en absoluto a otra temperatura. Un ejemplo de una enzima sensible a la temperatura es la proteína replicasa codificada por el vector pCYTts, que tiene una actividad replicasa fácilmente detectable a temperaturas por debajo de 34ºC y tiene una actividad baja o no detectable a 37ºC.
Transcripción: Según se utiliza en la presente memoria, el término "transcripción" hace referencia a la producción de moléculas de ARN a partir de moldes de ADN catalizada por la ARN polimerasa.
ARN no traducido: Según se utiliza en la presente memoria, la frase "ARN no traducido" hace referencia a una secuencia o molécula de ARN que no codifica un marco de lectura abierto o codifica un marco de lectura abierto, o una de sus porciones, pero en un formato en el que no se producirá una secuencia de aminoácidos (p. ej., no está presente el codón de iniciación). Los ejemplos de tales moléculas son las moléculas de ARNt, las moléculas de ARNr, y las ribozimas.
Vector: Según se utiliza en la presente memoria, el término "vector" hace referencia a un agente (p. ej., un plásmido o virus) utilizado para transmitir material genético a una célula anfitriona. Un vector puede estar compuesto por ADN o ARN.
Partícula de tipo virus: Según se utiliza en la presente memoria, el término "partícula de tipo virus" hace referencia a una estructura que se asemeja a una partícula de virus. Por otra parte, una partícula de tipo virus de acuerdo con la invención no es replicativa ni infecciosa puesto que carece de todo o de parte del genoma viral, en particular de los componentes replicativos e infecciosos del genoma viral. Una partícula de tipo virus de acuerdo con la invención puede contener un ácido nucleico distinto de su genoma.
Partícula de tipo virus de un bacteriófago: Según se utiliza en la presente memoria, el término "partícula de tipo virus de un bacteriófago" hace referencia a una partícula de tipo virus que se asemeja a la estructura de un bacteriófago, que no es replicativa ni infecciosa, y que carece de al menos el gen o los genes que codifican la maquinaria replicativa del bacteriófago, y típicamente también carecen del gen o los genes que codifican la proteína o las proteínas responsables del anclaje viral y de la entrada en el anfitrión. Esta definición también debe abarcar, sin embargo, las partículas de tipo virus de bacteriófagos, en las cuales el gen o los genes anteriormente mencionados todavía están presentes pero son inactivos, y, por lo tanto, también conducen a partículas de tipo virus no replicativas ni infecciosas de bacteriófagos.
Partícula de virus: El término "partícula de virus" según se utiliza en la presente memoria hace referencia a la forma morfológica de un virus. En algunos tipos de virus comprende un genoma rodeado por una cápside de proteína; otros tienen estructuras adicionales (p. ej., envolturas, colas, etc.).
Uno, una o un: Cuando se utilizan los términos "uno", "una" o "un" en esta descripción, se quiere significar "al menos uno" o "uno o más", a menos que se indique de otro modo.
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2. Composiciones de Matrices de Antígeno y Determinante Antigénico Ordenadas y Repetitivas y Métodos su Elaboración
La invención descrita proporciona composiciones como se define en las reivindicaciones que comprende una matriz de antígeno o determinante antigénico ordenada y repetitiva. Además, la invención permite convenientemente al práctico construir matrices de antígeno o determinante antigénico ordenadas y repetitivas para el tratamiento.
Las composiciones de la invención comprenden esencialmente, o alternativamente consisten en, dos elementos: (1) un armazón molecular no natural; y (2) un antígeno o determinante antigénico con al menos un segundo sitio de anclaje capaz de asociarse a través de al menos un enlace no peptídico a dicho primer sitio de anclaje.
El armazón molecular no natural comprende, o alternativamente consiste en: (a) una partícula núcleo, y (b) un organizador que comprende al menos un primer sitio de anclaje, donde dicho organizador está conectado a dicha partícula núcleo por al menos un enlace covalente.
Las composiciones de la invención también comprenden, o alternativamente consisten en, partículas núcleo a las cuales se unen directamente antígenos o determinantes antigénicos.
El antígeno o determinante antigénico según se define en las reivindicaciones tiene al menos un segundo sitio de anclaje que se selecciona del grupo que consiste en (a) un sitio de anclaje de origen no natural con dicho antígeno o determinante antigénico; y (b) un sitio de anclaje de origen natural con dicho antígeno o determinante antigénico.
La invención proporciona una matriz de antígeno ordenada y repetitiva por medio de una asociación del segundo sitio de anclaje al primer sitio de anclaje mediante al menos un enlace no peptídico. De este modo, el antígeno o determinante antigénico y el armazón molecular no natural se sitúan juntos por medio de esta asociación del primer y el segundo sitios de anclaje para formar una matriz de antígeno ordenada y repetitiva.
El práctico puede diseñar específicamente el antígeno o determinante antigénico y el segundo sitio de anclaje de manera que la disposición de todos los antígenos o determinantes antigénicos unidos al armazón molecular no natural o, en ciertas realizaciones, la partícula núcleo sea uniforme. Por ejemplo, se puede colocar un único segundo sitio de anclaje en el antígeno o determinante antigénico en el extremo carboxilo o amino, asegurando de ese modo por medio del diseño que todas las moléculas de antígeno o determinante antigénico que están ancladas al armazón molecular no natural estén situadas de una manera uniforme. De este modo, la invención proporciona un medio conveniente para colocar el antígeno o determinante antigénico sobre un armazón molecular no natural en un orden definido y de una manera que forma un patrón repetitivo.
Como quedará claro para los expertos en la técnica, ciertas realizaciones de la invención implican el uso de tecnologías de ácidos nucleicos recombinantes tales como la clonación, la reacción en cadena de la polimerasa, la purificación de ADN y ARN, la expresión de proteínas recombinantes en células procarióticas y eucarióticas, etc. Tales metodologías son bien conocidas por los expertos en la técnica y pueden ser encontradas convenientemente en manuales de métodos de laboratorio publicados (p. ej., Sambrook, J. et al., eds., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel, F. et al., eds., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John H. Wiley & Sons, Inc. (1997)). Las técnicas de laboratorio fundamentales para trabajar con líneas celulares para el cultivo de tejidos (Celis, J., ed., CELL BIOLOGY, Academic Press, 2^{a} edición, (1998)) y las tecnologías basadas en anticuerpos (Harlow, E. y Calle, D., "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988); Deutscher, M.P., "Guide to Protein Purification", Meth. Enzymol. 128, Academic Press San Diego (1990); Scopes, R.K., "Protein Purification Principles and Practice", 3ª ed., Springer-Verlag, New York (1994)) también están adecuadamente descritas en la literatura.
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A. Partículas Núcleo y Armazones Moleculares No Naturales
Un elemento de las composiciones de la invención es un armazón molecular no natural que comprende, o alternativamente consiste en, una partícula núcleo y un organizador. Según se utiliza en la presente memoria, la frase "armazón molecular no natural" hace referencia a cualquier producto elaborado por la mano del hombre que puede servir para proporcionar una matriz rígida y repetitiva de primeros sitios de anclaje. Más específicamente, el armazón molecular no natural comprende, o alternativamente consiste en, (a) una partícula núcleo que es una partícula de tipo virus de un fago con ARN; y (b) un organizador que comprende al menos un primer sitio de anclaje, donde dicho organizador está conectado a dicha partícula núcleo por medio de al menos un enlace covalente.
Como resultará fácilmente evidente para los expertos en la técnica, la partícula núcleo del armazón molecular no natural de la invención puede ser sintetizada químicamente o por medio de procedimientos biológicos. También se describen las partículas núcleo no naturales.
Una partícula núcleo no natural puede ser un polímero sintético, una micela lipídica o un metal. Semejantes partículas núcleo son bien conocidas en la técnica, proporcionando una base a partir de la cual construir el armazón molecular no natural. A modo de ejemplo, los polímeros sintéticos o las partículas núcleo metálicas se describen en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.770.380, que describe el uso de un armazón orgánico de calixareno al cual están anclados una pluralidad de bucles peptídicos en la creación de un "mimético de anticuerpo", y la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.334.394 describe partículas nanocristalinas utilizadas como señuelo viral que están compuestas por una amplia variedad de materiales inorgánicos, incluyendo metales o cerámicas. Los metales adecuados incluyen cromo, rubidio, hierro, cinc, selenio, níquel, oro, plata, platino. Los materiales cerámicos adecuados de esta realización incluyen dióxido de silicio, dióxido de titanio, óxido de aluminio, óxido de rutenio y óxido de estaño. Estas partículas núcleo pueden estar confeccionadas de materiales orgánicos incluyendo carbono (diamante). Los polímeros adecuados incluyen poliestireno, nailon y nitrocelulosa. Para este tipo de partícula nanocristalina, también se pueden utilizar partículas confeccionadas de óxido de estaño, óxido de titanio o carbono (diamante). Se puede preparar una micela lipídica por medio de cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo se pueden preparar micelas de acuerdo con el procedimiento de Baiselle y Millar (Biophys. Chem. 4:355-361 (1975)) o Corti et al. (Chem. Phys. Lipids 38:197-214 (1981)) o Lopez et al. (FEBS Lett. 426:314-318 (1998)) o Topchieva y Karezin (J. Colloid Interface Sci. 213:29-35 (1999)) o Morein et al., (Nature 308:457-460 (1984)), que se incorporan todos en la presente memoria como referencia.
La partícula núcleo descrita también puede ser producida por medio de un procedimiento biológico, que puede ser natural o no natural. A modo de ejemplo, este tipo de realización puede incluir una partícula núcleo que comprende, o alternativamente consiste en, un virus, una partícula de tipo virus, un pilus bacteriano, un fago, una partícula de la cápside viral o una de sus formas recombinantes. La partícula núcleo puede comprender, o alternativamente consistir en, proteínas recombinantes de Rotavirus, proteínas recombinantes del virus de Norwalk, proteínas recombinantes de Alfavirus, proteínas recombinantes que forman pili bacterianos o estructuras de tipo pilus, proteínas recombinantes del virus de la Fiebre Aftosa, proteínas recombinantes de Retrovirus, proteínas recombinantes del virus de la Hepatitis B (p. ej., a HBcAg), proteínas recombinantes del virus del mosaico del Tabaco, proteínas recombinantes del virus Flock House, y proteínas recombinantes del virus del Papiloma humano. La partícula núcleo puede comprender adicionalmente, o alternativamente consistir en, uno o más fragmentos de tales proteínas, así como variantes de tales proteínas que conservan la capacidad de asociarse entre sí para formar matrices de antígeno o determinante antigénico ordenadas y repetitivas.
Como se explica más abajo, las variantes de las proteínas que conservan la capacidad de asociarse entre sí para formar matrices de antígeno o determinante antigénico ordenadas y repetitivas pueden compartir, por ejemplo, una identidad de al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 99% a nivel de aminoácidos con sus contrapartes de tipo salvaje. Utilizando el HBcAg que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO:89 como ilustración, la invención incluye composiciones de vacuna que comprenden polipéptidos HBcAg que comprenden, o alternativamente consisten en, secuencias de aminoácidos que son idénticas al menos en un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 99% a la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO:89, y formas de esta proteína que han sido procesadas, cuando sea apropiado, para separar la secuencia líder N-terminal. Estas variantes generalmente serán capaces de de asociarse para formar estructuras diméricas o multiméricas. Los métodos que se pueden utilizar para determinar si las proteínas forman tales estructuras comprenden la filtración en gel, la electroforesis en gel de agarosa, la centrifugación en gradiente de sacarosa y la microscopía electrónica (p. ej., Koschel, M. et al., J. Virol 73: 2153-2160 (1999)).
Los fragmentos de proteínas que conservan la capacidad para asociarse entre sí para formar matrices de antígeno o determinante antigénico ordenadas y repetitivas pueden comprender, o alternativamente consistir en, polipéptidos que tienen 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, o 200 aminoácidos de longitud. Los ejemplos de tales fragmentos de proteínas incluyen, fragmentos de proteínas comentados en la presente memoria que son adecuados para la preparación de partículas núcleo y/o armazones moleculares no naturales.
La partícula núcleo de la invención tendrá generalmente un organizador que está anclado a la partícula núcleo por al menos un enlace covalente. El organizador es un elemento unido a una partícula núcleo de una manera no al azar que proporciona un sitio de nucleación para crear una matriz de antígeno ordenada y repetitiva. Idealmente, pero no necesariamente, el organizador está asociado con la partícula núcleo en un orden geométrico. Como mínimo, el organizador comprende un primer sitio de anclaje.
En algunas realizaciones de la invención, la matriz ordenada y repetitiva está formada por asociación entre (1) cualquiera de las partículas núcleo o armazones moleculares no naturales y (2) o bien (a) un antígeno o determinante antigénico o bien (b) uno o más antígenos o determinantes antigénicos. De este modo, en muchos casos, será posible formar matrices ordenadas de antígenos o determinantes antigénicos uniendo estas estructuras constitutivas o bien directamente o bien a través de un organizador.
Como se ha establecido previamente, el organizador es cualquier elemento que comprende al menos un primer sitio de anclaje que está unido a una partícula núcleo por al menos un enlace covalente. Un organizador puede ser una proteína, un polipéptido, un péptido, un aminoácido (esto es, un resto de una proteína, un polipéptido o un péptido), un azúcar, un polinucleótido, un polímero natural o sintético, un metabolito o compuesto secundario (biotina, fluoresceína, retinol, digoxigenina, iones metálicos, fluoruro de fenilmetilsulfonilo), o una de sus combinaciones, o uno de sus grupos químicamente reactivos. En una realización más específica, el organizador puede comprender un primer sitio de anclaje que comprende un antígeno, un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo, biotina, avidina, estreptavidina, un receptor, un ligando del receptor, un ligando, una proteína de unión al ligando, un polipéptido de la cremallera de leucina interaccionante, un grupo amino, un grupo químico reactivo con un grupo amino; un grupo carboxilo, un grupo químico reactivo con un grupo carboxilo, un grupo sulfhidrilo, un grupo químico reactivo con un grupo sulfhidrilo, o una de sus combinaciones.
En una realización, la partícula núcleo del armazón molecular no natural es una partícula de tipo virus de un fago con ARN o una de sus formas recombinantes. Se puede seleccionar cualquiera de tales virus conocidos en la técnica que tenga una estructura de envoltura y/o proteína núcleo ordenada y repetitiva como armazón molecular no natural de la invención; los ejemplos de los virus adecuados incluyen el bacteriófago Q\beta, el bacteriófago R17, el bacteriófago M11, el bacteriófago MX1, el bacteriófago NL95, el bacteriófago fr, el bacteriófago GA, el bacteriófago SP, el bacteriófago MS2, el bacteriófagos f2, el bacteriófago PP7 (por ejemplo, véase la Tabla 1 en Bachman, M.F. y Zinkernagel, R.M., Immunol. Today 17:553-558 (1996)).
En una realización, la invención utiliza la ingeniería genética de un virus para crear una fusión entre una proteína de la envoltura viral ordenada y repetitiva y un organizador que comprende una proteína heteróloga, péptido, determinante antigénico o un resto aminoácido reactivo de elección. Se pueden incluir otras manipulaciones genéticas conocidas por los expertos en la técnica para la construcción del armazón molecular no natural; por ejemplo, puede ser deseable restringir la capacidad de replicación del virus recombinante a través de la mutación genética. La proteína viral seleccionada para la fusión con la proteína organizadora (esto es, el primer sitio de anclaje) debe tener una estructura ordenada y repetitiva. Semejante estructura ordenada y repetitiva incluye organizaciones paracristalinas con un espaciamiento de 5-15 nm sobre la superficie del virus. La creación de este tipo de proteína de fusión dará como resultado múltiples organizadores ordenados y repetitivos sobre la superficie del virus. De este modo, la organización ordenada y repetitiva de los primeros sitios de anclaje resultantes de allí reflejará la organización normal de la proteína viral nativa.
Como se discutirá con más detalle en la presente memoria, también se describen otros armazones moleculares no naturales tales como un alfavirus recombinante, y más específicamente, un virus Sinbis recombinante. Los alfavirus son virus con ARN de hebra positiva que replican su ARN genómico completamente en el citoplasma de la célula infectada y sin un ADN intermedio (Strauss, J. y Strauss, E., Microbiol. Rev. 58:491-562 (1994)). Varios miembros de la familia de los alfavirus, Sindbis (Xiong, C. et al., Science 243:1188-1191 (1989); Schlesinger, S., Trends Biotechnol. 11:18-22 (1993)), Virus Semliki Forest (SFV) (Liljeström, P. & Garoff, H., Bio/Technology 9:1356-1361 (1991)) y otros (Davis, N.L. et al., Virology 171:189-204 (1989)), han recibido una atención considerable para su uso como vectores de expresión basados en virus para una variedad de proteínas diferentes (Lundstrom, K., Curr. Opin. Biotechnol. 8:578-582 (1997); Liljeström, P., Curr. Opin. Biotechnol. 5:495-500 (1994)) y como candidatos para el desarrollo de vacunas. Recientemente, se han presentado numerosas patentes dirigidas al uso de alfavirus para la expresión de proteínas heterólogas y para el desarrollo de vacunas (véanse las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.766.602; 5.792.462; 5.739.026; 5.789.245 y 5.814.482). La construcción del armazón alfaviral de la invención se puede realizar por medios generalmente conocidos en los mecanismos de la tecnología recombinante, como se describe en los artículos anteriormente mencionados.
Se pueden utilizar una variedad de células anfitrionas recombinantes diferentes para producir una partícula núcleo basada en virus para el anclaje del antígeno o el determinante antigénico. Por ejemplo, se sabe que los Alfavirus tienen una amplia gama de anfitriones; el virus Sindbis infecta células de mamíferos, reptiles, y anfibios cultivadas, así como algunas células de insecto (Clark, H., J. Natl. Cancer Inst. 51:645 (1973); Leake, C., J. Gen. Virol. 35:335 (1977); Stollar, V. en THE TOGA VIRUSES, R.W. Schlesinger, Ed., Academic Press, (1980), págs. 583-621). De este modo, se pueden utilizar numerosas células anfitrionas recombinantes en la práctica de la invención. Las células BHK, COS, Vero, HeLa y CHO son particularmente adecuadas para la producción de proteínas heterólogas ya que tienen el potencial de glucosilar las proteínas heterólogas de una manera similar a las células humanas (Watson, E. et al., Glycobiology 4:227, (1994)) y pueden ser seleccionadas (Zang, M. et al., Bio/Technology 13:389 (1995)) o diseñadas genéticamente (Renner W. et al., Biotech. Bioeng. 4:476 (1995); Lee K. et al. Biotech. Bioeng. 50:336 (1996)) para crecer en medio sin suero, así como en suspensión.
La introducción de los vectores polinucleotídicos en las células anfitrionas se puede efectuar mediante los métodos descritos en los manuales de laboratorio convencionales (véase, p. ej., Sambrook, J. et al., eds., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Capítulo 9; Ausubel, F. et al., eds., CURRENT PROTOCOL IN MOLECULAR BIOLOGY, John H. Wiley & Sons, Inc. (1997), Capítulo 16), incluyendo métodos tales como la electroporación, la transfección mediada por DEAE-dextrano, la transfección, la microinyección, la transfección catiónica mediada por lípidos, la transducción, la carga de colorante en surco ("scrape loading"), la introducción balística, y la infección. Los métodos para la introducción de secuencias de ADN exógenas en células anfitrionas son comentados por Felgner, P. et al., Patente de los Estados unidos Núm. 5.580.859.
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Las secuencias de ARN empaquetadas también se pueden utilizar para infectar células anfitrionas. Estas secuencias de ARN empaquetadas pueden ser introducidas en las células anfitrionas añadiéndolas al medio de cultivo. Por ejemplo, la preparación, de partículas alfa-virales no infectivas la describen numerosas fuentes, incluyendo "Sindbis Expresión System", Versión C (Invitrogen Núm. de Catálogo K750-1).
Cuando se utilizan células de mamífero como células anfitrionas recombinantes para la producción de partículas núcleo basadas en virus, estas células se harán crecer generalmente en cultivos de tejidos. Los métodos para hacer crecer las células son bien conocidos en la técnica (véase, p. ej., Celis, J., ed., CELL BIOLOGY, Academic Press, 2ª edición, (1998); Sambrook, J. et al., eds., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel, F. et al., eds., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John H. Wiley & Sons, Inc. (1997); Freshney, R., CULTURE OF ANIMAL CELLS, Alan R. Liss, Inc. (1983)).
Como comprenderán los expertos en la técnica, el primer sitio de anclaje puede ser o es una parte de cualquier proteína, polipéptido, azúcar, polinucleótido, péptido (aminoácido), polímero natural o sintético adecuado, un metabolito secundario o una de sus combinaciones que pueden servir para anclar específicamente el antígeno o determinante antigénico de elección al armazón molecular no natural. En una realización, el sitio de anclaje es una proteína o péptido que se puede seleccionar entre los conocidos en la técnica. Por ejemplo, el primer sitio de anclaje se puede seleccionar del siguiente grupo: un ligando, un receptor, una lectina, avidina, estreptavidina, biotina, un epítopo tal como una etiqueta HA o T7, Myc, Max, dominios de inmunoglobulina y cualquier otra secuencia de aminoácidos conocida en la técnica que resulte útil como primer sitio de anclaje. Los expertos en la técnica deben entender adicionalmente que en otra realización de la invención, el primer sitio de anclaje puede ser creado secundariamente al organizador (esto es, proteína o polipéptido) utilizado en la construcción de la fusión en marco a la proteína de la cápside. Por ejemplo, se puede utilizar una proteína para la fusión a la proteína de la envoltura con una secuencia de aminoácidos que se sabe que está glucosilada de una manera específica, y el radical azúcar añadido como resultado puede servir después como primer sitio de anclaje del armazón viral por medio de la unión a una lectina que sirve como sitio de anclaje secundario de un antígeno. Alternativamente, la secuencia organizadora puede ser biotinilada in vivo y el radical biotina puede servir como primer sitio de anclaje de la invención, o se puede someter una secuencia organizadora a modificación química de distintos restos aminoácido in vitro, sirviendo la modificación como primer sitio de anclaje.
En otra realización de la invención, el primer sitio de anclaje se selecciona para que sea el dominio de la proteína de la cremallera de leucina JUN-FOS que está fusionada en marco con la proteína de la cápside (núcleo) de la Hepatitis B (HBcAg). Sin embargo, quedará claro para todos los expertos en la técnica que se pueden utilizar otras proteínas de cápsides virales en el constructo de la proteína de fusión para localizar el primer sitio de anclaje en el armazón molecular no natural de la invención.
En otra realización de la invención, el primer sitio de anclaje se selecciona para que sea un resto lisina o cisteína que está fusionado en marco con HBcAg. No obstante, estará claro para todos los expertos en la técnica que se pueden utilizar otras partículas de la cápside viral o de tipo virus en los constructos de la proteína de fusión para localizar el primer anclaje del armazón molecular no natural de la invención.
La secuencia de aminoácidos JUN utilizada para el primer sitio de anclaje es la siguiente:
CGGRIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMNHVGC
(SEQ ID NO:59)
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En este caso, el segundo sitio de anclaje previsto en el antígeno sería el dominio proteico de la cremallera de leucina FOS y la secuencia de aminoácidos sería la siguiente:
CGGLTDTLQAETDQVEDEKSALQTEIANLLKEKLEFILAAHGGC
(SEQ ID NO:60)
Estas secuencias derivan de los factores de transcripción JUN y FOS, cada uno flanqueado por una secuencia corta que contiene un resto cisteína en ambos lados. Se sabe que estas secuencias interaccionan entre sí. La estructura hipotética original propuesta para el dímero JUN-FOS suponía que las cadenas laterales hidrófobas de un monómero se entrelazan con las respectivas cadenas laterales del otro monómero de una manera similar a una cremallera (Landschulz et al., Science 240:1759-1764 (1988)). Sin embargo, se demostró que esta hipótesis era errónea, y se sabe que estas proteínas forman una bobina enrollada en hélice \alpha (O'Shea et al., Science 243:538-542 (1989); O'Shea et al., Cell 68:699-708 (1992); Cohen & Parry, Trends Biochem. Sci. 11:245-248 (1986)). De este modo, el término "cremallera de leucina" se utiliza frecuentemente para hacer referencia a estos dominios de proteína por razones más históricas que estructurales. En toda esta patente, el término "cremallera de leucina" se utiliza para hacer referencia a las secuencias representadas antes o a secuencias esencialmente similares a las representadas antes. Los términos JUN y FOS se utilizan para los respectivos dominios de la cremallera de leucina en lugar de para las proteínas JUN y FOS completas.
Como se ha establecido previamente, la invención incluye partículas núcleo basadas en virus que comprenden, o alternativamente consisten en partículas de tipo virus, de un fago con ARN o una de sus formas recombinantes. Los expertos en la técnica tienen el conocimiento para producir tales partículas núcleo y anclar los organizadores a estas. La producción de partículas de tipo virus de la Hepatitis B y de partículas de la cápside viral del sarampión como partículas núcleo se describe en los Ejemplos 17 a 22 del documento WO 00/32227. En tales realizaciones, el dominio proteico de la cremallera de leucina JUN o el dominio proteico de la cremallera de leucina FOS se pueden utilizar como organizador, y por tanto como primer sitio de anclaje, para el armazón molecular no natural de la invención.
Los Ejemplos 23-29 proporcionan detalles de la producción de las partículas núcleo de la Hepatitis B que portan un péptido fusionado en marco con un resto lisina reactivo y antígenos que portan un resto cisteína fusionado genéticamente, como primer y segundo sitio de anclaje, respectivamente.
Asimismo se describen partículas núcleo compuestas por una proteína de la cápside (núcleo) de la Hepatitis B (HBcAg), un fragmento de HBcAg, u otra proteína o péptido que puede formar matrices ordenadas, que han sido modificadas para eliminar o reducir el número de restos cisteína libres. Zhou et al. (J. Virol. 66:5393-5398 (1992)) demostraron que los HBcAgs que han sido modificados para separar los restos cisteína residentes naturalmente conservan la capacidad para asociarse y formar estructuras multiméricas. De este modo, las partículas núcleo incluyen aquellas que comprende HBcAgs modificados o sus fragmentos, en los cuales uno o más de los restos cisteína residentes naturalmente han sido suprimidos o sustituidos por otro resto aminoácido (p. ej., un resto serina).
El HBcAg es una proteína generada por el procesamiento de una proteína precursora del antígeno núcleo de la Hepatitis B. Se han identificado numerosos isotipos de HBcAg. Por ejemplo, la proteína HBcAg que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO:132 tiene 183 aminoácidos de longitud y es generada por el procesamiento de una proteína precursora del antígeno del núcleo de la Hepatitis B de 212 aminoácidos. Este procesamiento da como resultado la separación de 29 aminoácidos del extremo N de la proteína precursora del antígeno del núcleo de la Hepatitis B. De un modo similar, la proteína HBcAg que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 134 tiene 185 aminoácidos de longitud y es generada por el procesamiento de la proteína precursora del antígeno del núcleo de la Hepatitis B de 214 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 134, en comparación con la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 132, contiene un inserto de dos aminoácidos en las posiciones 152 y 153 del SEQ ID NO: 134.
Las composiciones de vacuna podrían ser preparadas utilizando la forma procesada de un HBcAg (esto es, un HBcAg del cual se ha separado la secuencia líder N-terminal (p. ej., los primeros 29 restos aminoácidos mostrados en el SEQ ID NO: 134) de la proteína precursora del antígeno del núcleo de la Hepatitis B).
Además, cuando se producen HBcAg en condiciones en las que no se producirá el procesamiento, los HBcAg serán expresados generalmente en la forma "procesada". Por ejemplo, los sistemas bacterianos, tales como E. coli, generalmente no separan las secuencias líder, también referidas como "péptidos señal", de las proteínas que son expresadas normalmente en las células eucarióticas. De este modo, cuando se utiliza un sistema de expresión de E. coli para producir los HBcAg, estas proteínas serán expresadas generalmente de manera que la secuencia líder N-terminal de la proteína precursora del antígeno del núcleo de la Hepatitis B no esté presente.
Se puede utilizar un HBcAg modificado que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 134, o una de sus subporciones, para preparar armazones moleculares no naturales. En particular, los HBcAg modificados incluyen proteínas en las cuales uno o más de los restos cisteína de las posiciones correspondientes a las posiciones 48, 61, 107 y 185 de una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 134 han sido suprimidos o sustituidos por otros restos aminoácido (p. ej., un resto serina). Como reconocerá un experto en la técnica, también se podrían suprimir o sustituir con otros aminoácidos los restos cisteína en localizaciones similares de las variantes de HBcAg que tienen secuencias de aminoácidos que difieren de la mostrada en el SEQ ID NO: 134. Las variantes de HBcAg modificadas pueden ser utilizadas después para preparar composiciones de vacuna.
La presente descripción también incluye variantes de HBcAg que han sido modificadas para suprimir o sustituir uno o más restos cisteína adicionales que no se encuentran en los polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 134. Los ejemplos de tales variantes de HBcAg tienen las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NO: 90 y 132. Estas variantes contienen restos cisteína en una posición correspondiente al resto aminoácido 147 del SEQ ID NO: 134. De este modo, las composiciones de vacuna incluyen composiciones que comprenden HBcAg en los que los restos cisteína no presentes en la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 134 han sido suprimidos.
En ciertas circunstancias (p. ej., cuando se utiliza un reactivo de entrecruzamiento heterobifuncional para anclar antígenos o determinantes antigénicos al armazón molecular no natural), se cree que la presencia de restos cisteína libres en el HBcAg conduce al acoplamiento covalente de componentes tóxicos a las partículas núcleo, así como al entrecruzamiento de monómeros para formar especies no definidas.
Adicionalmente, en muchos casos, estos componentes tóxicos pueden no ser detectables con los análisis realizados a las composiciones del documento. Esto es así porque el acoplamiento de componentes tóxicos al armazón molecular no natural daría como resultado la formación de una población de diversas especies en las cuales los componentes tóxicos están conectados a diferentes restos cisteína, o en algunos casos a restos no cisteína, de los HBcAg. En otras palabras, cada resto cisteína libre de cada HBcAg no se unirá covalentemente a componentes tóxicos. Adicionalmente, en muchos casos, ninguno de los restos cisteína de los HBcAg concretos se unirá a componentes tóxicos. De este modo, la presencia de estos componentes tóxicos puede ser difícil de detectar debido a que estarían presentes en una población mixta de moléculas. La administración a un individuo de una especie de HBcAg que contiene componentes tóxicos, no obstante, podría conducir a una reacción adversa potencialmente grave.
Es bien sabido en la técnica que los restos cisteína libres pueden estar implicados en numerosas reacciones químicas secundarias. Estas reacciones secundarias incluyen intercambios disulfuro, reacciones con sustancias químicas o metabolitos que son, por ejemplo inyectados o formados en una terapia combinada con otras sustancias, o la oxidación directa y la reacción con nucleótidos tras la exposición a la luz UV. De este modo se podrían generar aductos tóxicos, considerando especialmente el hecho de que los HBcAg tienen una fuerte tendencia a unirse a los ácidos nucleicos. La detección de tales productos tóxicos en productos conjugados de antígeno-cápside sería difícil utilizando cápsides preparadas utilizando HBcAg que contienen cisteínas libres y entrecruzadores heterobifuncionales, puesto que se generaría una distribución de productos con una amplia gama de pesos moleculares. Los aductos tóxicos serían distribuidos de este modo entre una multiplicidad de especies, que individualmente pueden estar presentes cada una a una baja concentración, pero alcanzan niveles tóxicos cuando están juntas.
A la vista de lo anterior, una ventaja del uso de los HBcAg en las composiciones de vacuna que han sido modificadas para separar los restos cisteína naturalmente residentes es que los sitios a los cuales se pueden unir especies tóxicas cuando los antígenos o determinantes antigénicos están anclados al armazón molecular no natural se reducirían en número o se eliminarían todos juntos. Adicionalmente, se puede utilizar una elevada concentración de entrecruzador para producir partículas altamente decoradas sin la desventaja de generar una pluralidad de especies entrecruzadas indefinidas de monómeros de HBcAg (esto es, una mezcla variada de HbcAg monoméricos entrecruzados).
Se han identificado numerosas variantes de HBcAg de origen natural. Yuan et al., (J. Virol. 73:10122-10128 (1999)), por ejemplo, describen variantes en las que el resto isoleucina de la posición correspondiente a la posición 97 del SEQ ID NO: 134 es remplazado por un resto leucina o un resto fenilalanina. Las secuencias de aminoácidos de numerosas variantes de HBcAg, así como diversas variantes del precursor del antígeno núcleo de la Hepatitis B, se describen en los informes de GenBank AAF121240 (SEQ ID NO:89), AF121239 (SEQ ID NO:90),
X85297 (SEQ ID NO:91), X02496 (SEQ ID NO:92), X85305 (SEQ ID NO:93), X85303 (SEQ ID NO:94),
AF151735 (SEQ ID NO:95), X85259 (SEQ ID NO:96), X85286 (SEQ ID NO:97), X85260 (SEQ ID NO:98),
X85317 (SEQ ID NO:99), X85298 (SEQ ID NO:100), AF043593 (SEQ ID NO:101), M20706 (SEQ ID NO:102), X85295 (SEQ ID NO:103), X80925 (SEQ ID NO:104), X85284 (SEQ ID NO:105), X85275 (SEQ ID NO:106), X72702 (SEQ ID NO:107), X85291 (SEQ ID NO:108), X65258 (SEQ ID NO:109), X85302 (SEQ ID NO:110), M32138 (SEQ ID NO:111), X85293 (SEQ ID NO:112), X85315 (SEQ ID NO:113), U95551 (SEQ ID NO:114), X85256 (SEQ ID NO:115), X85316 (SEQ ID NO:116), X85296 (SEQ ID NO:117), AB033559 (SEQ ID NO:118), X59795 (SEQ ID NO:119), X85299 (SEQ ID NO:120), X85307 (SEQ ID NO:121), X65257 (SEQ ID NO:122), X85311 (SEQ ID NO: 123), X85301 (SEQ ID NO:124), X85314 (SEQ ID NO:125), X85287 (SEQ ID NO:126), X85272 (SEQ ID NO:127), X85319 (SEQ ID NO:128), AB010289 (SEQ ID NO:129), X85285 (SEQ ID NO:130), AB010289 (SEQ ID NO:131), AF121242 (SEQ ID NO:132), M90520 (SEQ ID NO:135), P03153 (SEQ ID NO:136), AF110999 (SEQ ID NO:137), y M95589 (SEQ ID NO:138). Estas variantes de HBcAg difieren en la secuencia de aminoácidos en numerosas posiciones, incluyendo los restos aminoácido que corresponden a los restos aminoácido localizados en las posiciones 12, 13, 21, 22, 24, 29, 32, 33, 35, 38, 40, 42, 44, 45, 49, 51, 57, 58, 59, 64, 66, 67, 69, 74, 77, 80, 81, 87, 92, 93, 97, 98, 100, 103, 105, 106, 109, 113, 116, 121, 126, 130, 133, 135, 141, 147, 149, 157, 176, 178, 182 y 183 en el SEQ ID NO: 134.
Los HBcAg pueden derivar de cualquier organismo con tal de que sean capaces de asociarse para formar una matriz de antígeno ordenada y repetitiva.
Como se ha observado antes, generalmente se podrían utilizar los HBcAg procesados (esto es, aquellos que carecen de secuencias líder) en las composiciones para vacunas. De este modo, cuando se puedan utilizar los HBcAg que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en los SEQ ID NO: 136, 137, o 138 para preparar composiciones para vacunas, generalmente se omitirán los restos aminoácido 30, 35-43, o 35-43 del extremo N, respectivamente de cada una de estas proteínas.
La presente descripción incluye composiciones para vacunas, así como los métodos para utilizar estas composiciones, que emplean los HBcAg variantes descritos anteriormente para la preparación de armazones moleculares no naturales.
Adicionalmente se describen las variantes de HBcAg adicionales que son capaces de asociarse para formar estructuras diméricas o multiméricas. De este modo, la descripción incluye adicionalmente composiciones para vacuna que comprenden polipéptidos HBcAg que comprenden, o alternativamente consiste en, secuencias de aminoácidos que son idénticas al menos en un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 99% a cualquiera de las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NO: 89-132 y 134-138, y formas de estas proteínas que han sido procesadas, cuando sea apropiado, para separar la secuencia líder N-terminal.
Se puede determinar convencionalmente si la secuencia de aminoácidos de un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos en un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 99% a una de las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NO: 89-132 y 134-138, o una de sus subporciones, utilizando programas de ordenador conocidos tales como el programa Bestfit. Cuando se utiliza Bestfit o cualquier otro programa de alineamiento de secuencia para determinar si una secuencia concreta es, por ejemplo, idéntica en el 95% a una secuencia de aminoácidos de referencia de acuerdo con la presente invención, los parámetros se ajustan de manera que se calcula el porcentaje de identidad a lo largo de una longitud completa de la secuencia de aminoácidos de referencia y que se permitan espacios en una homología de hasta 5% del número total de restos aminoácido de la secuencia de referencia.
Las variantes de HBcAg y los precursores que tiene las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NO: 89-132 y 134-136 son relativamente similares entre sí. De este modo, la referencia a un resto aminoácido de una variante de HBcAg localizada en una posición que corresponde a una posición concreta en el SEQ ID NO: 134, hace referencia al resto aminoácido que está presente en esa posición en la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 134. La homología entre estas variantes de HBcAg es para la mayor parte suficientemente alta entre los virus de la Hepatitis B que infectan mamíferos de manera que un experto en la técnica tendría poca dificultad al revisar tanto la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 134 como la de una variante de HBcAg concreta e identificar los restos aminoácido "correspondientes". Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de HBcAg mostrada en el SEQ ID NO: 135, que muestra la secuencia de aminoácidos de un HBcAg derivado de un virus que infecta las marmotas, tiene suficiente homología con el HBcAg que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 134 que es bien evidente que se encuentra presente un inserto de tres restos aminoácido en el SEQ ID NO: 135 entre los restos aminoácido 155 y 156 del SEQ ID NO: 134.
Los HBcAg de los virus de la Hepatitis B que infectan los gansos nivales y patos difieren lo suficiente de las secuencias de aminoácidos de los HBcAg de los virus de la Hepatitis B que infectan mamíferos ya que el alineamiento de estas formas de esta proteína con la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 134 es difícil. Sin embargo, las composiciones para vacuna podrían comprender variantes de HBcAg de los virus de la Hepatitis B que infectan aves, así como las composiciones para vacuna que comprenden fragmentos de estas variantes de HBcAg. Los fragmentos de HBcAg adecuados para su uso en la preparación de composiciones para vacuna incluyen composiciones que contienen fragmentos polipeptídicos que comprenden, o alternativamente consisten en, los restos aminoácido seleccionados del grupo que consiste en 36-240, 36-269, 44-240, 44-269, 36-305, y 44-305 del SEQ ID NO: 137 o 36-240, 36-269, 44-240, 44-269, 36-305, y 44-305 del SEQ ID NO: 138. Como reconocería un experto en la técnica, se podrían sustituir uno, dos, tres o más de los restos cisteína naturalmente presentes en estos polipéptidos (p. ej., los restos cisteína de la posición 153 del SEQ ID NO:137 o las posiciones 34, 43, y 196 del SEQ ID NO: 138) por otro resto aminoácido o se podrían suprimir antes de su inclusión en las composiciones para vacunas.
En una realización, los restos cisteína de las posiciones 48 y 107 de una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 134 son suprimidos o sustituidos por otro resto aminoácido pero la cisteína de la posición 61 se deja en su sitio. Adicionalmente, el polipéptido modificado se utiliza después para preparar composiciones para vacunas.
Como se muestra más abajo en el Ejemplo 31, los restos cisteína de las posiciones 48 y 107, que son accesibles al disolvente, se pueden separar, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio. Adicionalmente, los autores de la presente invención han descubierto que el HBcAg doble mutante Cys-48-Ser, Cys-107-Ser construido como se describe en el Ejemplo 31 puede ser expresado en E. coli.
Como se ha comentado antes, la eliminación de los restos cisteína libres reduce el número de sitios en los que se pueden unir componentes tóxicos al HBcAg, y también elimina sitios en los que se puede producir el entrecruzamiento de los restos lisina y cisteína de la misma molécula o de moléculas vecinas de HBcAg. La cisteína de la posición 61, que está implicada en la formación de dímeros y forma un puente disulfuro con la cisteína de la posición 61 de otro HBcAg, se dejará normalment intacta para la estabilización de los dímeros y multímeros de HBcAg de la invención.
Como se muestra en el Ejemplo 32, los experimentos de entrecruzamiento realizados con (1) los HBcAg que contienen resto cisteínas libres y (2) los HBcAg cuyos restos cisteína libres se han vuelto no reactivos con yodoacetamida, indican que los restos cisteína libres del HBcAg son responsables del entrecruzamiento entre los HBcAg por medio de reacciones entre las cadenas laterales de la lisina derivatizadas con el entrecruzador heterobifuncional, y los restos cisteína libres. El Ejemplo 32 también indica que el entrecruzamiento de las subunidades de HBcAg conduce a la formación de especies de elevado peso molecular de un tamaño indefinido que no pueden ser resueltas mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida.
Cuando se conecta un antígeno o determinante antigénico al armazón molecular no natural por medio de un resto lisina, puede ser ventajoso sustituir o suprimir uno o ambos restos lisina naturalmente residentes localizados en las posiciones correspondientes a las posiciones 7 y 96 del SEQ ID NO: 134, así como otros restos lisina presentes en las variantes de HBcAg. La eliminación de estos restos lisina da como resultado la separación de los sitios de unión para los antígenos o determinantes antigénicos que podrían desorganizar la matriz ordenada y deberían mejorar la calidad y la uniformidad de la composición de vacuna final.
En muchos casos, cuando ambos restos lisina naturalmente residentes en las posiciones correspondientes a las posiciones 7 y 96 del SEQ ID NO: 134 se eliminan, se introducirá otra lisina en el HBcAg como sitio de anclaje para un antígeno o determinante antigénico. Los métodos para insertar semejante resto lisina se exponen, por ejemplo, en el Ejemplo 23 de más abajo. A menudo será ventajoso introducir un resto lisina en el HBcAg cuando, por ejemplo, ambos restos lisina naturalmente residentes en las posiciones correspondientes a las posiciones 7 y 96 del SEQ ID NO: 134 sean alteradas y se busque anclar el antígeno o determinante antigénico al armazón molecular no natural utilizando un agente de entrecruzamiento heterobifuncional.
Se ha demostrado que el extremo C del HBcAg dirige la localización nuclear de esta proteína. (Eckhardt et al., J. Virol. 65:575-582 (1991).) Adicionalmente, también se cree que esta región de la proteína confiere al HBcAg la capacidad de unirse a ácidos nucleicos.
En algunos casos, las composiciones para vacunas contendrán HBcAg que tienen actividad de unión a ácidos nucleicos (p. ej., que contienen un dominio de unión al ácido nucleico de HBcAg naturalmente residente). Los HBcAg que contienen uno o más dominios de unión a ácido nucleico son útiles para preparar composiciones para vacunas que muestran un aumento de la actividad estimuladora de las células T. De este modo, las composiciones para vacuna pueden incluir composiciones que contienen HBcAg que tienen actividad de unión a ácidos nucleicos. Adicionalmente se describen composiciones para vacunas, así como el uso de tales composiciones en los protocolos de vacunación, donde los HBcAg están unidos a ácidos nucleicos. Estos HBcAg se pueden unir a los ácidos nucleicos antes de la administración a un individuo o se pueden unir a los ácidos nucleicos después de la administración.
En otros casos, las composiciones para vacunas contendrán HBcAg cuya región C-terminal (p. ej., restos aminoácido 145-185 o 150-185 del SEQ ID NO: 134) ha sido separada y no se unen a ácidos nucleicos. De este modo, los HBcAg modificados adicionales adecuados para su uso en la práctica de la presente invención incluyen los mutantes por truncamiento C-terminal. Los mutantes por truncamiento adecuados incluyen los HBcAg en los que se han separado los aminoácidos 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 34, 35, 36, 37, 38, 39 40, 41, 42 o 48 del extremo C.
Los HBcAg adecuados para su uso también incluyen los mutantes por truncamiento N-terminal. Los mutantes por truncamiento adecuados incluyen los HBcAg modificados en los que se han separado los aminoácidos 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15, o 17 del extremo N.
Los HBcAg adecuados adicionales para su uso incluyen los mutantes por truncamiento N- y C-terminal. Los mutantes por truncamiento adecuados incluyen los HBcAg en los que se han separado los aminoácidos 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15, y 17 del extremo N y los aminoácidos 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 34, 35, 36, 37, 38, 39 40, 41, 42 o 48 del extremo C.
Adicionalmente las composiciones para vacunas comprenden polipéptidos HBcAg que comprenden, o alternativamente consisten en, secuencias de aminoácidos que son idénticas al menos en un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 99% a los mutantes por truncamiento descritos antes.
Como se ha comentado antes, en ciertos casos, se introduce un resto lisina como primer sitio de anclaje en un polipéptido que forma el armazón molecular no natural. Las composiciones para vacunas se pueden preparar utilizando un HBcAg que comprende, o alternativamente consiste en, los aminoácidos 1-144 o los aminoácidos 1-149 del SEQ ID NO: 134 que está modificado de manera que los aminoácidos correspondientes a las posiciones 79 y 80 son remplazados por un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos Gly-Gly-Lys-Gly-Gly (SEQ ID NO: 158) y los restos cisteína de las posiciones 48 y 107 son suprimidos o sustituidos por otro resto aminoácido, mientras la cisteína de la posición 61 se deja en su sitio. Adicionalmente las composiciones para vacunas comprenden los correspondientes fragmentos de polipéptidos que tienen las secuencias de aminoácidos mostradas en cualquiera de los SEQ ID NO: 89-132 y 135-136 que también tienen las alteraciones de aminoácidos mostradas antes.
Las composiciones para vacunas adicionales comprenden fragmentos de un HBcAg que comprende, o alternativamente consiste en, una secuencia de aminoácidos distinta de la mostrada en el SEQ ID NO: 134 de la cual se ha suprimido un resto cisteína no presente en la correspondiente localización del SEQ ID NO: 134. Un ejemplo de semejante fragmento sería un polipéptido que comprende, o alternativamente consiste en, los aminoácidos 1-149 del SEQ ID NO: 132 donde el resto cisteína de la posición 147 ha sido sustituido por otro resto aminoácido o suprimido.
Las composiciones para vacuna adicionales comprenden polipéptidos HBcAg que comprenden, o alternativamente consisten en, secuencias de aminoácidos que son idénticas al menos en un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 99% a los aminoácidos 1-144 o 1-149 del SEQ ID NO: 134 y las correspondientes subporciones de un polipéptido que comprenden una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NO: 89-132 o 134-136, así como los aminoácidos 1-147 o 1-152 del SEQ ID NO: 158.
La descripción también incluye composiciones para vacuna que comprenden polipéptidos HBcAg que comprenden, o alternativamente consisten en, secuencias de aminoácidos que son idénticas al menos en un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 99% a los aminoácidos 36-240, 36-269, 44-240, 44-269, 36-305, y 44-305 del SEQ ID NO:137 o 36-240, 36-269, 44-240, 44-269, 36-305, y 44-305 del SEQ ID NO: 138.
Las composiciones para vacuna pueden comprender mezclas de diferentes HBcAg. De este modo, estas composiciones para vacuna pueden estar compuestas por HBcAg que difieren en la secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, se podrían preparar composiciones para vacuna que comprendan un HBcAg de "tipo salvaje" y un HBcAg modificado en el que uno o más restos aminoácido ha sido alterado (p. ej., suprimido, insertado o sustituido). En la mayoría de las aplicaciones, sin embargo, solamente se utilizará un tipo de HBcAg, o al menos HBcAg que tienen primeros sitios de anclaje esencialmente equivalentes, debido a que las vacunas preparadas utilizando tales HBcAg presentarán matrices de antígenos o determinantes antigénicos altamente ordenadas y repetitivas. Las composiciones para vacuna adicionales son aquellas que presentan matrices de antígeno altamente ordenadas y repetitivas.
Las composiciones para vacuna adicionales son aquellas en las que el armazón molecular no natural se prepara utilizando un HBcAg fusionado a otra proteína. Como se ha comentado antes, un ejemplo de semejante proteína de fusión es una fusión HBcAg/FOS. Otros ejemplos de proteínas de fusión de HBcAg adecuadas para su uso en composiciones para vacuna incluyen proteínas de fusión en las que se ha añadido una secuencia de aminoácidos que ayuda a la formación y/o estabilización de dímeros y multímeros de HBcAg. Esta secuencia de aminoácidos adicional puede ser fusionada al extremo N o C del HBcAg. Un ejemplo, de semejante proteína de fusión es una fusión de un HBcAg con la región de la hélice GCN4 de Saccharomyces cerevisiae (Núm. de Acceso GenBank P03069 (SEQ ID NO: 154)).
El dominio de la hélice de la proteína GCN4 forma homodímeros por medio de interacciones no covalentes que se pueden utilizar para preparar y estabilizar dímeros y multímeros de HBcAg.
Las composiciones para vacuna se pueden preparar utilizando proteínas de fusión de HBcAg que comprenden un HBcAg, o uno de sus fragmentos, con un polipéptido GCN4 que tiene la secuencia de restos aminoácido 227 a 276 del SEQ ID NO: 154 fusionada al extremo C. Este polipéptido GCN4 también puede ser fusionado al extremo N del HbcAg.
También se podrían utilizar proteínas de fusión HBcAg/dominio de homología 3 de src (SH3), para preparar composiciones para vacuna. Los dominios SH3 son dominios relativamente pequeños encontrados en numerosas proteínas que confieren la capacidad de interaccionar con secuencias ricas en prolina específicas en los compañeros de unión proteicos (véase McPherson, Cell Signal 11:229-238 (1999). Las proteínas de fusión HBcAg/SH3 se podrían utilizar de diversas maneras. Primero, el dominio SH3 podría formar un primer sitio de anclaje que interacciona con un segundo sitio de anclaje del antígeno o determinante antigénico. De un modo similar, se podría añadir una secuencia de aminoácidos rica en prolina al HBcAg y utilizarla como primer sitio de anclaje para un segundo sitio de anclaje del dominio SH3 de un antígeno o determinante antigénico. Segundo, se podría asociar el dominio SH3 con regiones ricas en prolina introducidas en HBcAg. De este modo, los dominios SH3 y los sitios de interacción con SH3 ricos en prolina podrían ser insertados en los mismos o diferentes HBcAg y utilizados para formar dímeros y multímeros estabilizados.
En otros casos, se utiliza una pilina bacteriana, una subporción de una pilina bacteriana, o una proteína de fusión que contiene una pilina bacteriana o una subporción de la misma para preparar composiciones para vacuna. Los ejemplos de las proteínas pilina incluyen pilinas producidas por Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Caulobacter crescentus, Pseudomonas stutzeri, y Pseudomonas aeruginosa. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas pilina adecuadas para su uso en la presente invención incluyen aquellas mostradas en los informes de GenBank AJ000636 (SEQ YID NO: 139), AJ132364 (SEQ ID NO: 140), AF229646 (SEQ ID NO: 141), AF051814 (SEQ ID NO: 142), AF051815 (SEQ ID NO: 143), y X00981 (SEQ ID NO: 155).
Las proteínas pilinas bacterianas son generalmente procesadas para separar las secuencias líder N-terminales antes de exportar las proteínas al periplasma bacteriano. Adicionalmente, como reconocerá un experto en la técnica, las proteínas pilinas bacterianas utilizadas para preparar composiciones para vacuna no tendrán la secuencia líder presente naturalmente.
Un ejemplo específico de una proteína pilina adecuada para su uso es la pilina P de E. coli (informe GenBank AF237482 (SEQ ID NO: 144)). Un ejemplo de pilina de E. coli de Tipo-1 adecuado para su uso es una pilina que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en el informe de GenBank P04128 (SEQ ID NO: 146), que es codificada por el ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en el informe de GenBank M27603 (SEQ ID NO: 145). Las descripciones completas de estos informes de GenBank se incorporan en la presente memoria como referencia. De nuevo, se utilizaría generalmente la forma madura de la proteína referida antes para preparar composiciones para vacuna.
Las pilinas bacterianas o subporciones de pilina adecuadas para su uso en la práctica de la presente invención serán generalmente capaces de asociarse para formar armazones moleculares no naturales.
Los métodos para preparar pili y estructuras de tipo pilus in vitro son conocidos en la técnica. Bullitt et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 93:12890-12895 (1996), por ejemplo, describen la reconstitución in vitro de subunidades de pili P de E. coli. Adicionalmente, Eshdat et al., J. Bacteriol. 148:308-314 (1981) describen métodos adecuados para disociar pili de Tipo 1 de E. coli y para la reconstitución de pili. En resumen, estos métodos son los siguientes: los pili son disociados mediante incubación a 37ºC en hidrocloruro de guanidina saturado. Las proteínas pilinas se purifican después mediante cromatografía, después de lo cual se forman dímeros de pilina mediante diálisis frente a hidrocloruro de tris(hidroximetil)aminometano 5 mM (pH 8,0). Eshdat et al. también encontraron que los dímeros de pilina se vuelven a ensamblar para formar pili tras la diálisis frente a tris(hidroximetil)aminometano 5 mM (pH 8,0) que contiene MgCl_{2} 5 mM.
Adicionalmente, utilizando, por ejemplo, métodos de ingeniería genética y modificación de proteínas convencionales, se pueden modificar proteínas pilinas para que contengan un primer sitio de anclaje al cual está conectado un antígeno o determinante antigénico por medio de un segundo sitio de anclaje. Alternativamente, los antígenos o determinantes antigénicos se pueden conectar directamente a través de un segundo sitio de anclaje a restos aminoácido que son naturalmente residentes en estas proteínas. Estas proteínas pilinas modificadas se pueden utilizar después en composiciones para vacuna.
Las proteínas pilinas bacterianas utilizadas para preparar composiciones de vacuna pueden ser modificadas de una manera similar a la descrita en la presente memoria para HBcAg. Por ejemplo, los restos cisteína y lisina pueden ser suprimidos o sustituidos por otros restos aminoácido y se pueden añadir a estas proteínas primeros sitios de anclaje. Adicionalmente, las proteínas pilinas pueden ser expresadas en forma modificada o pueden ser modificadas químicamente después de la expresión. De un modo similar, se pueden recoger pili intactos de bacterias y después modificarlos químicamente.
En otro caso, se recogen pili o estructuras de tipo pilus de bacterias (p. ej., E. coli) y se utilizan para formar composiciones para vacuna. Un ejemplo de pili adecuados para preparar composiciones para vacuna es el pilus de Tipo 1 de E. coli, que se forma a partir de monómeros de pilina que tienen la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 146.
Se conocen numerosos métodos en la técnica para cosechar pili bacterianos. Bullitt y Makowski (Biophys. J. 74:623-632 (1998)), por ejemplo, describen un método de purificación de pilus para cosechar pili P a partir de E. coli. De acuerdo con este método, los pili se someten a cizalla a partir de E. coli hiperpiliada que contiene un plásmido de pilus P y se purifica mediante ciclos de solubilización y precipitación con MgCl_{2} (1,0 M). Se expone un método de purificación similar más abajo en el Ejemplo 33.
Una vez recogidos, los pili o las estructuras de tipo pilus se pueden modificar de diversas maneras. Por ejemplo, se puede añadir un primer sitio de anclaje a los pili a los cuales se pueden anclar antígenos o determinantes antigénicos por medio de un segundo sitio de anclaje. En otras palabras, se pueden recoger pili bacterianos o estructuras de tipo pilus y modificarlos para formar armazones moleculares no naturales.
Los pili o estructuras de tipo pilus también pueden ser modificados por el anclaje a antígenos o determinantes antigénicos en ausencia de un organizador no natural. Por ejemplo, los antígenos o determinantes antigénicos se podrían conectar a restos cisteína o restos lisina de origen natural. En tales casos, el mayor orden y repetitividad de un resto aminoácido de origen natural guiará el acoplamiento de los antígenos o determinantes antigénicos a los pili o estructuras de tipo pilus. Por ejemplo los pili o estructuras de tipo pilus se podrían conectar a los segundos sitios de anclaje de los antígenos o determinantes antigénicos utilizando un agente de entrecruzamiento heterobifuncional.
Cuando se utilizan estructuras que son sintetizadas naturalmente por los organismos (p. ej., pili) para preparar composiciones para vacuna, a menudo será ventajoso diseñar genéticamente estos organismos de manera que produzcan estructuras con características deseables. Por ejemplo, cuando se utilizan pili de Tipo 1 de E. coli, se pueden modificar las E. coli de las cuales se recogen estos pili para que produzcan estructuras con características específicas. Los ejemplos de las posibles modificaciones de las proteínas pilinas incluyen la inserción de uno o más restos lisina, la deleción o sustitución de uno o más de los restos lisina naturalmente residentes, y la deleción o sustitución de uno o más de los restos cisteína naturalmente residentes (p. ej., los restos cisteína de las posiciones 44 y 84 del SEQ ID NO: 146).
Además, se pueden realizar modificaciones adicionales en los genes de pilina que dan como resultado productos de expresión que contienen un primer sitio de anclaje distinto de un resto lisina (p. ej., un dominio FOS o JUN). Por supuesto, los primeros sitios de anclaje adecuados estarán limitados generalmente a aquellos que no evitan que las proteínas pilinas formen pili o estructuras de tipo pilus adecuadas para su uso en las composiciones para vacuna.
Los genes de pilina que residen naturalmente en las células bacterianas pueden ser modificados in vivo (p. ej., mediante recombinación homóloga) o se pueden insertar genes de pilina con características concretas en estas células. Por ejemplo, se podrían introducir genes de pilina en células bacterianas como componente de un vector de clonación replicable o un vector que se inserta en el cromosoma bacteriano. Los genes de pilina insertados también pueden ser conectados a secuencias para el control regulador de la expresión (p. ej., un promotor lac).
En la mayoría de los casos, los pili o las estructuras de tipo pilus utilizados en las composiciones para vacuna estarán compuestos por un solo tipo de subunidad de pilina. Generalmente se utilizarán pili o estructuras de tipo pilus compuestos por subunidades idénticas debido a que se espera que formen estructuras que presenten matrices de antígeno altamente ordenadas y repetitivas.
No obstante, las composiciones también pueden incluir vacunas que comprenden pili o estructuras de tipo pilus formadas a partir de subunidades heterogéneas de pilina. Las subunidades de pilina que forman estos pili o estructuras de tipo pilus pueden ser expresadas a partir de genes naturalmente residentes en la célula bacteriana o pueden ser introducidos en las células. Cuando un gen de pilina naturalmente residente y un gen introducido son expresados ambos en una célula que forma pili o estructuras de tipo pilus, el resultado serán generalmente estructuras formadas a partir de una mezcla de estas proteínas pilinas. Adicionalmente, cuando se expresan dos o más genes de pilina en una célula bacteriana, la expresión relativa de cada gen de pilina será típicamente el factor que determine la proporción de las diferentes subunidades de pilina en los pili o estructuras de tipo pilus.
Cuando se desean pili o estructuras de tipo pilus que tienen una composición concreta de subunidades de pilina mezcladas, la expresión de al menos uno de los genes de pilina puede ser reglada por un promotor inducible, heterólogo. Tales promotores, así como otros elementos genéticos, pueden ser utilizados para regular las cantidades relativas de diferentes subunidades de pilina producidas en la célula bacteriana y, de ese modo, la composición de los pili o estructuras de tipo pilus.
Además, mientras en la mayoría de los casos el antígeno o determinante antigénico estará conectado a pili bacterianos o estructuras de tipo pilus por un enlace que no es un enlace peptídico, las células bacterianas que producirán pili o estructuras de tipo pilus utilizadas en las composiciones de la invención pueden ser diseñadas genéticamente para generar proteínas pilinas que se fusionan a un antígeno o determinante antigénico. Tales proteínas de fusión que forman pili o estructuras de tipo pilus son adecuadas para su uso en las composiciones para vacuna.
Como ya se ha comentado, se pueden utilizar cápsides virales para (1) la presentación de antígenos o determinantes antigénicos y (2) la preparación de composiciones para vacuna de la invención. Concretamente, son útiles en la práctica de la invención las proteínas de la cápside viral, también referidas en la presente memoria como "proteínas de la envoltura", que tras la expresión forman cápsides o estructuras de tipo cápside. De este modo, estas proteínas de la cápside pueden formar partículas núcleo y armazones moleculares no naturales. Generalmente, estas cápsides o estructuras de tipo cápside forman matrices ordenadas y repetitivas que pueden ser utilizadas para la presentación de antígenos o determinantes antigénicos y la preparación de composiciones para vacuna de la invención.
Se pueden anclar uno o más (p. ej., uno, dos, tres, cuatro, cinco, etc.) antígenos o determinantes antigénicos por medio de cualquiera de los numerosos métodos a una o más (p. ej., una, dos, tres, cuatro, cinco, etc.) proteínas que forman cápsides virales o estructuras de tipo cápside (p. ej., proteínas de la envoltura de los bacteriófagos), así como otras proteínas. Por ejemplo, se pueden anclar antígenos o determinante antigénicos a partículas núcleo utilizando un primer y un segundo sitios de anclaje. Adicionalmente, se pueden utilizar uno o más (p. ej., uno, dos, tres, cuatro, cinco, etc.) entrecruzadores heterobifuncionales para anclar antígenos o determinantes antigénicos a una o más proteínas que forman cápsides virales o estructuras de tipo cápside.
Se pueden utilizar proteínas de la cápside viral, o sus fragmentos, por ejemplo, para preparar partículas núcleo y composiciones para vacuna de la invención. Las proteínas de la envoltura del bacteriófago Q\beta, por ejemplo, pueden ser expresadas recombinantemente en E. coli. Adicionalmente, después de semejante expresión, estas proteínas forman espontáneamente las cápsides. Adicionalmente, estas cápsides forman matrices de antígeno o determinante antigénico ordenadas y repetitivas que se pueden utilizar para la presentación de antígenos y la preparación de composiciones para vacuna. Como se describe más abajo en el Ejemplo 38, las proteínas de la envoltura del bacteriófago Q\beta se pueden utilizar para preparar composiciones para vacuna que logren respuestas inmunológicas a determinantes antigénicos.
Los ejemplos específicos de las proteínas de la envoltura de los bacteriófagos que se pueden utilizar para preparar las composiciones de la invención incluyen las proteínas de la envoltura de los bacteriófagos con ARN tales como el bacteriófago Q\beta (SEQ ID NO: 159; Base de datos PIR, Núm. de Acceso VCBPQ\beta referente a Q\beta CP y SEQ ID NO: 217; Núm. de Acceso AAA16663 referente a la proteína A1 de Q\beta), bacteriófago R17 (SEQ ID NO: 160.; PIR Núm. de Acceso VCBPR7), bacteriófago fr (SEQ ID NO: 161; PIR Núm. de Acceso VCBPFR), bacteriófago GA (SEQ ID NO: 162; GenBank Núm. de Acceso NP-040754), bacteriófago SP (SEQ ID NO:163; GenBank Núm. de Acceso CAA30374 referente a SP CP y SEQ ID NO: 254; Núm. de Acceso referente a la proteína A1 de SP), bacteriófago MS2 (SEQ ID NO: 164; PIR Núm. de Acceso VCBPM2), bacteriófago M11 (SEQ ID NO: 165; GenBank Núm. de Acceso AAC06250), bacteriófago MX1 (SEQ ID NO: 166; GenBank Núm. de Acceso AAC14699), bacteriófago NL95 (SEQ ID NO: 167; GenBank Núm. de Acceso AAC14704), bacteriófago f2 (SEQ m NO: 215; GenBank Núm. de Acceso P03611), bacteriófago PP7 (SEQ ID NO: 253). Como reconocerá un experto en la técnica, se puede utilizar cualquier proteína que forme cápsides o estructuras de tipo cápside para la preparación de las composiciones para vacuna de la invención. Además, la proteína A1 del bacteriófago Q\beta o las formas truncadas C-terminales que pierden 100, 150 o 180 aminoácidos de su extremo C pueden ser incorporadas al ensamblaje en la cápside de las proteínas de la envoltura de Q\beta. La proteína A1 también puede ser fusionada a un organizador y por tanto a un primer sitio de anclaje, para el anclaje de Antígenos que contienen un segundo sitio de anclaje. Generalmente, el porcentaje de proteína A1 con respecto a la CP de Q\beta en el ensamblaje de la cápside estará limitado, con el fin de asegurar la formación de la cápside. Núm. de Acceso de la proteína A1 AAA16663 (SEQ ID NO: 217).
También se ha encontrado que la proteína de la envoltura de Q\beta se auto-ensambla en cápsides cuando es expresada en E. coli (Kozlovska TM. et al., GENE 137: 133-137 (1993)). Las cápsides o partículas de tipo virus obtenidas mostraron una estructura de la cápside de tipo fago icosahédrico con un diámetro de 25 nm y T=3 casi simétrica. Adicionalmente, la estructura cristalina del fago Q\beta ha sido resuelta. La cápside contiene 180 copias de la proteína de la envoltura, que están conectadas en pentámeros y hexámeros covalentes por puentes disulfuro (Golmohammadi, R. et al., Structure 4: 543-5554 (1996)). También se ha demostrado que otras proteínas de la envoltura de fagos con ARN se auto-ensamblan tras la expresión en un anfitrión bacteriano (Kastelein, RA. et al., Gene 23: 245-254 (1983), Kozlovskaya, TM. et al., Dokl. Akad Nauk SSSR 287: 452-455 (1986), Adhin, MR. et al., Virology 170: 238-242 (1989), Ni, CZ., et al., Protein Sci. 5: 2485-2493 (1996), Priano, C. et al., J. Mol. Biol. 249: 283-297 (1995)). La cápside del fago Q\beta contiene, además de la proteína de la envoltura, la denominada proteína de lectura directa A1 y la proteína de maduración A2. A1 es generada por supresión del codón de terminación UGA y tiene una longitud de 329 aa. La cápside de proteína de la envoltura recombinante del fago Q\beta utilizada en la invención está desprovista de la proteína de lisis A2, y contiene ARN del anfitrión. La proteína de la envoltura de los fagos con ARN es una proteína de unión a ARN, e interacciona con el bucle del sitio de unión ribosómico del gen de la replicasa que actúa como represor traduccional durante el ciclo de vida del virus. La secuencia y los elementos estructurales de la interacción son conocidos (Witherell, GW. & Uhlenbeck, OC. Biochemistry 28: 71-76 (1989); Lim F. et al., J. Biol. Chem. 271: 31839-31845 (1996)). Se sabe que el bucle y el ARN en general están implicados en el ensamblaje del virus (Golmohammadi, R. et al., Structure 4: 543-5554 (1996))
Las proteínas o dominios de proteínas pueden afectar a la estructura y ensamblaje de la partícula incluso más que un péptido corto. Como ejemplo, el plegamiento apropiado de los antígenos que comprenden puentes disulfuro generalmente no será posible en el citoplasma de E. coli, donde son expresadas las partículas de Q\beta. Del mismo modo, no es posible generalmente la glucosilación en sistemas de expresión procarióticos. Por lo tanto es una ventaja de la invención contemplada descrita aquí anclar el antígeno a la partícula partiendo de la partícula ya ensamblada y del antígeno aislado. Esto permite la expresión de la partícula y el antígeno en un anfitrión de expresión garantizando el plegamiento apropiado del antígeno, y el plegamiento y ensamblaje apropiado de la partícula.
Un descubrimiento de esta invención es que se pueden anclar una o varias moléculas de antígeno a una subunidad de la cápside de proteínas de la envoltura de los fagos con ARN. Una característica específica de la cápside de la proteína de la envoltura de los fagos con ARN y en particular de la cápside de Q\beta es por lo tanto la posibilidad de acoplar varios antígenos por subunidad. Esto permite la generación de una matriz de antígeno densa. Otras cápsides virales utilizadas para el anclaje covalente de antígenos por medio de entrecruzamiento químico, tal como por ejemplo un HBcAg modificado con un resto lisina en su región inmunodominante principal (MIR; documento WO 00/32227), muestran una densidad de acoplamiento de 0,5 antígenos por subunidad como máximo. La distancia entre las espinas (correspondientes a las MIR) del HBcAg es de 50 \ring{A} (Wynne, SA. et al., Mol. Cell 3: 771-780 (1999)), y por lo tanto no se puede generar una matriz de antígeno con distancias menores de 50 \ring{A}.
Las cápsides de proteína de la envoltura de Q\beta presentan un número definido de restos lisina en su superficie, con una topología definida con tres restos lisina que apuntan hacia el interior de la cápside y que interaccionan con el ARN, y otros cuatro restos lisina expuestos al exterior de la cápside. Estas propiedades definidas favorecen el anclaje de antígenos al exterior de la partícula, y no al interior donde los restos lisina interaccionan con el ARN. Las cápsides de otras proteína de la envoltura de los fagos con ARN tienen un número definido de restos lisina en su superficie y una topología definida de estos restos lisina. Otra ventaja de las cápsides derivadas de los fagos con ARN es su elevado rendimiento de expresión en bacterias, que permite producir grandes cantidades de material a un coste
permisible.
Otro rasgo de la cápside de la proteína de la envoltura de Q\beta es su estabilidad. Las subunidades de Q\beta están unidas por medio de puentes disulfuro entre sí, conectando covalentemente las subunidades. La proteína de la cápside de Q\beta también muestra una resistencia inusual a los disolventes orgánicos y agentes desnaturalizantes. Sorprendentemente, los autores de la presente invención han observado que se podían utilizar concentraciones de DMSO y acetonitrilo tan elevadas como el 30%, y concentraciones de guanidinio tan elevadas como 1 M sin afectar a la estabilidad o la capacidad para formar matrices de antígeno de la cápside. De este modo, estos disolventes orgánicos pueden ser utilizados para acoplar péptidos hidrófobos. La elevada estabilidad de la cápside de proteína de la envoltura de Q\beta es un importante rasgo que tiene que ver con su uso para la inmunización y vacunación de mamíferos y seres humanos en concreto. La resistencia de la cápside al disolvente orgánico permite el acoplamiento de antígenos no solubles en tampones acuosos.
La inserción de un resto cisteína en la horquilla \beta N-terminal de la proteína de la envoltura del fago con ARN MS-2 ha sido descrita en la solicitud de patente US/5.698.424. Los autores de la presente invención observan sin embargo, que la presencia de un resto cisteína libre expuesto en la cápside puede conducir a la oligomerización de cápsides por medio de la formación de puentes disulfuro. Otros anclajes contemplados en la solicitud de patente US/5.698.424 implican la formación de puentes disulfuro entre el antígeno y la partícula de Q\beta. Tales anclajes son lábiles para las moléculas que contienen radicales sulfhidrilo.
La reacción entre un puente disulfuro inicial formado con un resto cys en Q\beta, y el antígeno que contiene un resto sulfhidrilo libre libera especies que contienen sulfhidrilo distintas del antígeno. Estas especies que contienen sulfhidrilo recién formadas pueden reaccionar de nuevo con otros puentes disulfuro presentes en la partícula, estableciendo de este modo un equilibrio. Tras la reacción con el puente disulfuro formado en la partícula, el antígeno puede formar un puente disulfuro con el resto cys de la partícula, o con el resto cys de la molécula del grupo saliente que estaba formando el puente disulfuro inicial en la partícula. Por otra parte, el otro método de anclaje descrito, utilizando un entrecruzador heterobifuncional que reacciona con una cisteína de la partícula de Q\beta por un lado, y con el resto lisina del antígeno por otro lado, conduce a una orientación al azar de los antígenos sobre la partícula.
Los autores de la presente invención observan adicionalmente que, en contraste con la cápside de las proteína de la envoltura de Q\beta y Fr, el MS-2 recombinante descrito en la solicitud de patente US/5.698.424 está esencialmente libre de ácidos nucleicos, mientras el ARN está empaquetado dentro de las dos cápsides mencionadas antes.
Los autores de la presente invención describen composiciones que permiten la formación de matrices de antígeno robustas con una densidad de antígeno variable. Los autores de la presente invención demuestran que se puede lograr una densidad de epítopo mucho mayor que la obtenida normalmente con otras VLP. Los autores de la invención también describen composiciones con presentación simultánea de varios antígenos con un espaciamiento apropiado, y composiciones donde la adición de moléculas accesorias, potencia la solubilidad o modificación de la cápside de un modo adecuado y deseado.
La preparación de composiciones de cápsides de proteínas de la envoltura de fagos con ARN con una elevada densidad de epítopos se describe en esta solicitud. Como sabrá el experto en la técnica, las condiciones para el ensamblaje de la matriz de antígeno ordenada y repetitiva dependen en buena parte del antígeno y de la selección de un segundo sitio de anclaje en el antígeno. En caso de ausencia de un segundo sitio de anclaje útil, semejante segundo anclaje tiene que ser diseñado para el antígeno.
Un prerrequisito en el diseño de un segundo sitio de anclaje, es la elección de la posición en la cual se debe fusionar, insertar o diseñar en general. Un experto en la técnica sabrá cómo encontrar pautas en la selección de la posición del segundo sitio de anclaje. Una estructura cristalina del antígeno puede proporcionar información sobre la disponibilidad de los extremos C o N de la molécula (determinados por ejemplo a partir de su accesibilidad al disolvente), o sobre la exposición al disolvente de restos adecuados para su uso como segundos sitios de anclaje, tales como los restos cisteína. Los puentes disulfuro expuestos, como es el caso de los fragmentos Fab, también pueden ser una fuente para un segundo sitio de anclaje, puesto que se pueden convertir generalmente en restos cisteína individuales por medio de una reducción suave. En general, en el caso en el que la inmunización con un auto-antígeno pretende inhibir la interacción de este auto-antígeno con sus ligandos naturales, se añadirá el segundo sitio de anclaje de manera que permita la generación de anticuerpos contra el sitio de interacción con los ligandos naturales. De este modo, se seleccionará la localización del segundo sitio de anclaje de manera que se evite el impedimento estérico del segundo sitio de anclaje o cualquier conector aminoacídico que lo contenga. En realizaciones adicionales, se desea una respuesta de anticuerpo dirigida a un sitio distinto del sitio de interacción del auto-antígeno con su ligando natural. En tales realizaciones, se puede seleccionar el segundo sitio de anclaje de manera que evite la generación de anticuerpos contra el sitio de interacción del auto-antígeno con sus ligandos naturales.
Otros criterios en la selección de la posición del segundo sitio de anclaje incluyen el estado de oligomerización del antígeno, el sitio de oligomerización, la presencia de un cofactor, y la disponibilidad de evidencia experimental que describe los sitios de la estructura y la secuencia del antígeno en los que la modificación del antígeno es compatible con la función del auto-antígeno, o con la generación de anticuerpos que reconocen el auto-antígeno.
En algunas realizaciones, el diseño de un segundo sitio de anclaje sobre el antígeno requiere la fusión de un conector aminoacídico que contiene un aminoácido adecuado como segundo sitio de anclaje de acuerdo con las descripciones de esta invención. En una realización preferida, el aminoácido es la cisteína. La selección del conector aminoacídico dependerá de la naturaleza del auto-antígeno, de sus propiedades bioquímicas, tales como el pI, la distribución de la carga, la glucosilación. En general, se prefieren conectores aminoacídicos flexibles. Los ejemplos de los conectores aminoacídicos son la región bisagra de las Inmunoglobulinas, los conectores de glicina-serina (GGGGS)_{n}, y los conectores de glicina (G)_{n} que contienen todos adicionalmente un resto cisteína como segundo sitio de anclaje y opcionalmente adicionalmente restos glicina. (Los siguientes son ejemplos de dichos conectores aminoacídicos:
gamma1 N-terminal: CGDKTHTSPP
gamma 1 C-terminal: DKTHTSPPCG
gamma 3 N-terminal: CGGPKPSTPPGSSGGAP
gamma 3 C-terminal: PKPSTPPGSSGGAPGGCG
conector glicina N-terminal: GCGGGG
conector glicina C-terminal: GGGGCG)
Para los péptidos, se ha demostrado que son útiles los conectores de GGCG en el extremo C del péptido, o CGG en su extremo N. En general, los restos glicina se insertarán entre los aminoácidos voluminosos y la cisteína se utilizará como segundo sitio de anclaje.
Un método de anclaje de antígenos a VLP particularmente preferido, y en particular a cápsides de proteína de la envoltura de fagos con ARN es la unión de un resto lisina de la superficie de la cápside de proteínas de la envoltura de fagos con ARN con un resto cisteína del antígeno. Para que sea eficaz como segundo sitio de anclaje, debe estar disponible para el acoplamiento un grupo sulfhidrilo. De este modo, el resto cisteína tiene que estar en su estado reducido, esto es tiene que estar disponible una cisteína libre o un resto cisteína con un grupo sulfhidrilo libre. En el instante en el que el resto cisteína que va a funcionar como segundo sitio de anclaje está en forma oxidada, por ejemplo si está formando un puente disulfuro, se requiere la reducción de este puente disulfuro por ejemplo con DTT, TCEP o \beta-mercaptoetanol.
Un descubrimiento de esta solicitud es que la densidad de epítopos de la cápside de proteínas de la envoltura del fago con ARN se puede modular mediante la elección del entrecruzador y otras condiciones de reacción. Por ejemplo, los entrecruzadores Sulfo-GMBS y SMPH permiten alcanzar una mayor densidad de epítopos que el entrecruzador Sulfo-MBS en las mismas condiciones de reacción. La derivatización está influida positivamente por la elevada concentración de reaccionantes, y se puede utilizar la manipulación de las condiciones de reacción para controlar el número de antígenos acoplados a las proteínas de la cápside el fago con ARN, y en particular a la proteína de la cápside de Q\beta.
A partir del cálculo teórico, el máximo número alcanzable de antígenos de proteínas globulares de un tamaño de 17 kDa no excede de 0,5. De este modo, algunos de los restos lisina de la cápside de proteína de la envoltura de Q\beta serán derivatizados con una molécula de entrecruzador, todavía desprovista de antígeno. Esto conduce a la desaparición de una carga positiva, que puede ser perjudicial para la solubilidad y la estabilidad del producto conjugado. Remplazando algunos de los restos lisina por argininas, tal es el caso del mutante de la proteína de la cubierta de Q\beta descrito, los autores de la presente invención evitan la desaparición excesiva de cargas positivas puesto que los restos arginina no reaccionan con el entrecruzador.
En realizaciones adicionales, los autores de la presente invención describen una proteína de la envoltura mutante de Q\beta con restos lisina adicionales, adecuados para obtener matrices de antígenos de elevada densidad.
La estructura cristalina de varios bacteriófagos con ARN ha sido determinada (Golmohammadi, R. et al., Structure 4:543-554 (1996)). Utilizando semejante información, un experto en la técnica podría identificar fácilmente los restos expuestos de la superficie y modificar las proteínas de la envoltura del bacteriófago de manera que se puedan insertar uno o más restos aminoácido reactivos. De este modo, un experto en la técnica podría generar e identificar fácilmente las formas modificadas de las proteínas de la envoltura del bacteriófago que se pueden usar en la práctica de la invención. Así, también se pueden utilizar las variantes de las proteínas que forman cápsides o estructuras de tipo cápside (p. ej., proteínas de la envoltura del bacteriófago Q\beta, bacteriófago R17, bacteriófago fr, bacteriófago GA, bacteriófago SP, y bacteriófago MS2) para preparar las composiciones para vacuna de la invención.
Aunque la secuencia de las proteínas variantes mencionadas antes diferirá de sus contrapartes de tipo salvaje, estas proteínas variantes conservarán generalmente la capacidad de formar cápsides o estructuras de tipo cápside. De este modo, la descripción incluye adicionalmente composiciones para vacuna que contienen variantes de proteínas que forman cápsides o estructuras de tipo cápside, así como los métodos para preparar tales composiciones para vacuna, las subunidades de proteína individuales utilizadas para preparar tales composiciones para vacuna, y las moléculas de ácido nucleico que codifican estas subunidades de proteína. De este modo, están incluidas dentro del alcance de la invención las formas variantes de las proteínas de tipo salvaje que forman matrices de antígeno ordenadas y repetitivas (p. ej., variantes de proteínas que forman cápsides o estructuras de tipo cápside) y conservan la capacidad para asociarse y formar cápsides o estructuras de tipo cápside.
Las composiciones para vacuna adicionales comprenden proteínas que comprenden, o alternativamente consisten en, secuencias de aminoácidos que son idénticas al menos en un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 99% a las proteínas de tipo salvaje que forman las matrices ordenadas. En muchos casos, estas proteínas serán procesadas para separar los péptidos señal (p. ej., péptidos señal heterólogos).
Adicionalmente se describen moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas utilizadas para preparar las composiciones para vacuna de la invención.
Las composiciones para vacuna adicionales comprenden proteínas que comprenden, o alternativamente consisten en, secuencias de aminoácidos que son idénticas al menos en un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 99% a cualquiera de las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NO: 159-167, y formas de estas proteínas que han sido procesadas, cuando es apropiado, para separar la secuencia líder N-terminal.
Las proteínas adecuadas para su uso en la práctica también incluyen mutantes por truncamiento C-terminal de las proteínas que forman cápsides o estructuras de tipo cápside, así como otras matrices ordenadas. Los ejemplos específicos de tales mutantes por truncamiento incluyen proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NO: 159-167 donde 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15, o 17 aminoácidos han sido separados del extremo C. Normalmente, los mutantes por truncamiento C-terminal conservarán la capacidad para formar cápsides o estructuras de tipo cápside.
Las proteínas adecuadas adicionales para su uso en la práctica también incluyen mutantes por truncamiento N-terminal de proteínas que forman cápsides o estructuras de tipo cápside. Los ejemplos específicos de tales mutantes por truncamiento incluyen proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NO: 159-167 donde 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15, o 17 aminoácidos han sido separados del extremo N. Normalmente, los mutantes por truncamiento N-terminal utilizados en la práctica de la invención conservarán la capacidad para formar cápsides o estructuras de tipo cápside.
Las proteínas adecuadas adicionales para su uso en la práctica incluyen mutantes por truncamiento N- y C-terminal que forman cápsides o estructuras de tipo cápside. Los mutantes por truncamiento adecuados incluyen proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NO: 159-167 donde 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15, o 17 aminoácidos han sido separados del extremo N y 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15, o 17 aminoácidos han sido separados del extremo C. Normalmente, los mutantes por truncamiento N-terminal y C-terminal utilizados en la práctica conservarán la capacidad para formar cápsides o estructuras de tipo cápside.
Las composiciones para vacuna adicionales comprenden proteínas que comprenden, o alternativamente consisten en, secuencias de aminoácidos que son idénticas al menos en un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 99% a los mutantes por truncamiento descritos antes.
La invención incluye de este modo composiciones para vacuna preparadas a partir de proteínas que forman matrices ordenadas, métodos para preparar composiciones para vacuna a partir de subunidades de proteína individuales, métodos para preparar estas subunidades de proteína individuales, moléculas de ácido nucleico que codifican estas subunidades, y métodos para vacunar y/o lograr respuestas inmunológicas en individuos utilizando las composiciones para vacuna de la invención.
B. Construcción de un Antígeno o Determinante Antigénico con un Segundo Sitio de Anclaje
El segundo elemento en las composiciones de la invención es un antígeno o determinante antigénico que posee al menos un segundo sitio de anclaje capaz de asociarse por medio de al menos un enlace no peptídico al primer sitio de anclaje del armazón molecular no natural. La descripción proporciona composiciones que varían de acuerdo con el antígeno o determinante antigénico seleccionado considerando el efecto terapéutico deseado. Se proporcionan otras composiciones variando la molécula seleccionada para el segundo sitio de anclaje.
Sin embargo, cuando se utilizan pili bacterianos, estructuras de tipo pilus, o proteínas pilinas para preparar composiciones para vacuna, se pueden anclar antígenos o determinantes antigénicos a las proteínas pilinas mediante la expresión de proteínas de fusión de pilina/antígeno. De un modo similar, cuando se utilizan proteínas distintas de las proteínas pilinas (p. ej., proteínas de la cápside viral) para preparar composiciones para vacuna, se pueden anclar los antígenos o determinantes antigénicos a estas proteínas distintas de pilina mediante la expresión de proteínas de fusión de proteínas distintas de pilina/antígeno. Los antígenos o determinantes antigénicos también se pueden anclar a pili bacterianos, estructuras de tipo pilus, proteínas pilinas, y otras proteínas que forman matrices ordenadas por medio de enlaces no peptídicos.
Los antígenos de la invención son péptidos beta amiloides. No obstante, se describen antígenos seleccionados del grupo que consiste en los siguientes: (a) proteínas adaptadas para inducir una respuesta inmunitaria frente a células cancerosas; (b) proteínas adaptadas para inducir una respuesta inmunitaria frente a enfermedades infecciosas; (c) proteínas adaptadas para inducir una respuesta inmunitaria frente a alergenos, (d) proteínas adaptadas para inducir una respuestas inmunitaria en animales de granja, y (e) fragmentos (p. ej., un dominio) de cualquiera de las proteínas mostradas en los apartados (a)-(d).
El antígeno o determinante antigénico es aquél que es útil para la prevención de enfermedades infecciosas. Semejante tratamiento será útil para tratar una amplia variedad de enfermedades infecciosas que afectan a una amplia gama de anfitriones, p. ej., seres humanos, vacas, ovejas, cerdos, perros, gatos, otras especies de mamíferos, y también especies de no mamíferos. Las infecciones tratables son bien conocidas por los expertos en la técnica, los ejemplos incluyen infecciones de etiología viral tales como VIH, influenza, Herpes, hepatitis viral, Epstein Bar, polio, encefalitis viral, sarampión, viruela de los pollos, etc.; o infecciones de etiología bacteriana tales como pneumonía, tuberculosis, sífilis, etc.; o infecciones de etiología parasítica tales como malaria, tripanosomiasis, leishmaniasis, tricomoniasis, amebiasis, etc. De este modo, los antígenos o determinantes antigénicos seleccionados para las composiciones de la invención serán bien conocidos por los expertos en las técnicas médicas; los ejemplos de los antígenos o determinantes antigénicos incluyen los siguientes: los antígenos gp140 y gp160 de VIH; los antígenos hemaglutinina, proteína M2 y neuraminidasa de la influenza, el antígeno de la superficie de la Hepatitis B, la proteína de circunsporozoito de la malaria.
Las composiciones para vacuna pueden ser adecuadas para su uso en los métodos para prevenir y/o atenuar enfermedades o condiciones que están causadas o exacerbadas por productos "auto" génicos (p. ej., factores de necrosis tumoral). De este modo, las composiciones para vacuna incluyen composiciones que conducen a la producción de anticuerpos que evitan y/o atenúan enfermedades o condiciones causadas o exacerbadas por productos "auto" génicos. Los ejemplos de tales enfermedades o condiciones incluyen la enfermedad de injerto versus anfitrión, las reacciones alérgicas mediadas por IgE, la anafilaxis, el síndrome de la fatiga respiratoria en adultos, la enfermedad de Crohn, el asma alérgica, la leucemia linfoblástica aguda (ALL), el linfoma no Hodgkin (NHL), la enfermedad de Graves, el lupus eritematoso generalizado (SLE), las enfermedades autoinmunitarias inflamatorias, la miastenia grave, la linfadenopatía por enfermedad inmunoproliferativa (LEI), linfadenopatía angioinmunoproliferativa (LAI), linfadenopatía inmunoblástica (LIB), artritis reumatoide, diabetes, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer y osteoporosis.
Las composiciones pueden ser un agente inmunoterapéutico que se puede utilizar para el tratamiento de alergias o cáncer.
La selección de antígenos o determinantes antigénicos para la preparación de composiciones y para su uso en los métodos de tratamiento de alergias serían conocidas por los expertos en las técnicas médicas de tratamiento de tales trastornos. Los ejemplos representativos de tales antígenos o determinantes antigénicos incluyen los siguientes: fosfolipasa A_{2} de veneno de abeja, Bet v I (alergeno del polen de abedul), 5 Dol m V (alergeno de veneno de avispa de cara blanca), Melitina y Der p I (alergeno de ácaro del polvo doméstico), así como fragmentos de cada uno que se pueden utilizar para lograr respuestas inmunológicas.
Como se ha indicado, un antígeno o determinante antigénico es Der p I. Der p I es una proteasa de 25 kD encontrada en partículas fecales del ácaro del polvo doméstico. Der p I representa la principal molécula alérgica del ácaro del polvo doméstico. Por consiguiente, el 80% de los pacientes alérgicos a los ácaros tienen anticuerpos IgE anti-Der p I. En particular, los péptidos p52-72 y p117-133, entre otros, son conocidos por comprender epítopos, que son reconocidos por los anticuerpos específicos para Der p I nativo. Los anticuerpos IgE originados en una respuesta policlonal al antígeno completo se unen con una elevada afinidad a la región peptídica 59-94 (L. Pierson-Mullany et al. (2000) Molecular Immunology). Otras regiones también se unen a IgE con elevada afinidad. El péptido p117-133 contiene una cisteína libre en su extremo N, representando preferiblemente el segundo sitio de anclaje. El modelo 3D asigna los péptidos p52-72 y p117-133 a la superficie de la proteína completa. Sin embargo, otros fragmentos de la proteína Der p I pueden comprender epítopos de células B.
La selección de antígenos o determinantes antigénicos para las composiciones y métodos de tratamiento para el cáncer serían conocidos por los expertos en las técnicas médicas de tratamiento de tales trastornos. Los ejemplos representativos de tales tipos de antígenos o determinantes antigénicos incluyen los siguientes: Her2 (cáncer de mama), GD2 (neuroblastoma), EGF-R (glioblastoma maligno), CEA (cáncer medular tiroideo), y CD52 (leucemia), proteína de melanoma humano gp100, proteína de melanoma humano melan-A/MART-1, tirosinasa, proteína NA17-A nt, proteína MAGE-3, proteína p53, proteína HPV16 E7, así como fragmentos de cada una que pueden ser utilizados para lograr respuestas inmunológicas. Los determinantes antigénicos preferidos adicionales útiles para las composiciones y métodos de tratamiento para el cáncer son las moléculas y determinantes antigénicos implicados en la angiogénesis. La angiogénesis, la formación de nuevos vasos sanguíneos, juega un papel esencial en los procesos fisiológicos y patofisiológicos tales como la curación de heridas y el crecimiento de tumores sólidos, respectivamente (Folkman, J. (1995) Nat. medicine 1, 27-31; Folkman, J., y Klagsbrun, M. (1987) Science 235, 442-446; Martiny-Baron, G., y Marmé, D. (1995) Curr. Opin. Biotechnol. 6, 675-680; Risau, W. (1997) Nature 386, 671-674). Los tumores de crecimiento rápido se inician y dependen de la formación de vasos sanguíneos para proporcionar el suministro de sangre necesario. De este modo, los agentes antiangiogénicos podrían ser eficaces como terapia
anticancerosa.
Entre los numerosos supuestos factores angiogénicos que se han identificado hasta ahora el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) es un potente mitógeno específico de las células endoteliales y un estimulante principal de la vascularización de muchos tumores sólidos. Aunque recientes descubrimientos implican que un grupo de factores angiogénicos debe estar perfectamente orquestado para formar vasos funcionales, parece que el bloqueo de incluso un solo factor de crecimiento podría limitar el crecimiento vascular inducido por enfermedad. De este modo, el bloqueo de VEGF puede ser una diana muy demandada para la intervención en la angiogénesis inducida por tumores. El redireccionamiento al endotelio en lugar de al propio tumor ha emergido recientemente como estrategia novedosa para luchar contra los tumores (Millauer, B., Shawver, L. K., Plate, K. H., Risau, W., y Ulrich, A. (1994) Nature 367, 576-579; Kim, J., Li, B., Winer, J., Armanini, M., Gillett, N., Phillip, H. S., Ferrara, N. (1993) Nature 362, 841-844). En contraste con los tumores, que mutan fácilmente las estructuras diana reconocidas por el sistema inmunitario, las células endoteliales no escapan normalmente al sistema inmunitario u otros regímenes terapéu-
ticos.
Se han descrito un anticuerpo anti-VEGFR-II (IMC-1C11) y un anticuerpo anti-VEGF (Lu, D., Kussie, P., Pytowski, B., Persaud, K., Bohlen, P., Witte, L., Zhu, Z. (2000) J. Biol. Chem. 275, 14321-14330; Presta, L.G, Chen, H., O'Connor, SJ., Chisholm, V., Meng, YG., Krummen, L., Winkler, M., Ferrara N. (1997) Cancer Res. 47, 4593-4599). El primer anticuerpo anti-VEGFR-2 monoclonal neutralizante reconoce un epítopo que ha sido identificado como supuesto sitio de unión VEGF/VEGFR-II (Piossek, C., Schneider-Mergener, J., Schirner, M., Vakalopoulou, E., Germeroth, L., Thierauch, K.H. (1999) J Biol Chem. 274, 5612-5619).
De este modo, otro antígeno o determinante antigénico es un péptido derivado del sitio de contacto de VEGFR-II. Este proporciona una composición y una composición para vacuna, que pueden tener propiedades antiangiogénicas útiles para el tratamiento del cáncer. Se ha demostrado la inhibición del crecimiento tumoral en ratones utilizando sueros específicos para VEGFR-2 (Wei, YQ., Wang, QR., Zhao, X., Yang, L., Tian, L., Lu, Y., Kang, B., Lu, CJ., Huang, MJ., Lou, YY., Xiao, F., He, QM., Shu, JM., Xie, XJ., Mao, YQ., Lei, S., Luo, F., Zhou, LQ., Liu, CE., Zhou, H., Jiang, Y., Peng, F., Yuan, LP., Li, Q., Wu, Y., Liu, JY. (2000) Nature Medicine 6, 1160-1165). Por lo tanto, los determinantes antigénicos adicionales adecuados para composiciones y composiciones para vacunas antiangiogénicas comprenden el péptido derivado de VEGFR-II humano con la secuencia CTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKK, y/o el péptido derivado de VEGFR-II murino que tiene la secuencia CTARTELNVGLDFTWHSPPSKSHHKK, y/o los dominios globulares extracelulares relevantes 1-3 del VEGFR-II.
Por lo tanto, la composición para vacuna puede comprender una partícula núcleo seleccionada entre una partícula de tipo virus o un pilus bacteriano y un péptido derivado de VEGFR-II o uno de sus fragmentos como antígeno o determinante antigénico.
La selección de antígenos o determinantes antigénicos para las composiciones y métodos de tratamiento para otras enfermedades o condiciones asociadas con auto-antígenos también sería conocida por los expertos en las técnicas médicas de tratamiento de tales trastornos. Los ejemplos representativos de tales antígenos o determinantes antigénicos son, por ejemplo, linfotoxina (p. ej. Linfotoxina a (LT a), Linfotoxina \beta (LT \beta)), y receptores de linfotoxina, Ligando Receptor del factor nuclear kB (RANKL), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF-R), Interleuquina-5, Interleuquina-17, Interleuquina-13, CCL21, CXCL12, SDF-1, MCP-1, Endoglina, Resistina, GHRH, LHRH, TRH, MIF, Eotaxina, Bradiquinina, BLC, Factor de Necrosis Tumoral \alpha y péptido beta amiloide (A\beta_{1-42}) (SEQ ID NO: 220), así como fragmentos de cada uno que se pueden utilizar para lograr respuestas inmunológicas. El sujeto de la presente invención es la composición, donde el antígeno o determinante antigénico es el péptido beta amiloide (A\beta_{1-42}) (DAEFRHDSGYEVHHQKL VFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: 220), o uno de sus fragmentos. La proteína beta amiloide es el SEQ ID NO: 218. La proteína precursora del beta amiloide es el SEQ ID NO: 219.
Asimismo se describe un antígeno o determinante antigénico que es un péptido de angiotensina o uno de sus fragmentos. El término "péptido de angiotensina" según se utiliza en la presente memoria, abarcará cualquier péptido que comprenda la secuencia, o sus fragmentos, del angiotensinógeno, la angiotensina I o la angiotensina II. Las secuencias son las siguientes: Angiotensinógeno: DRVYIHPFHLVIHN; Angiotensina I: DRVYIHPFHL; Angiotensina II: DRVYIHPF. Típicamente, se añaden uno o más aminoácidos adicionales en el extremo C o en el N de las secuencias del péptido de angiotensina. La secuencia de los péptidos de angiotensina corresponde a la secuencia humana, que es idéntica a la secuencia murina. Por lo tanto, la inmunización de un ser humano o un ratón con las vacunas o composiciones, respectivamente, que comprenden tales péptidos de angiotensina como determinante antigénico, es una vacunación contra un auto-antígeno. Esos aminoácidos adicionales son, en particular, valiosos para una asociación orientada y ordenada a la partícula núcleo.
El péptido de angiotensina puede tener una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en a) la secuencia de aminoácidos CGGDRVYIHPF; b) la secuencia de aminoácidos CGGDRVYIHPFHL; c) la secuencia de aminoácidos DRVYIHPFHLGGC; y d) la secuencia de aminoácidos CDRVYIHPFH. La angiotensina I es escindida del angiotensinógeno (14aa) por la enzima de riñón Renina. La angiotensina I es un péptido biológicamente inactivo de 10 aa. Adicionalmente es escindida en el extremo N por la enzima conversora de angiotensina (ACE) en angiotensina II de 8aa biológicamente activa. Este péptido se une a los receptores de angiotensina AT1I y AT2 lo que conduce a la vasoconstricción y a la liberación de aldosterona.
Se puede utilizar una vacuna que comprende al menos un péptido de angiotensina para el tratamiento de la hipertensión.
El antígeno o determinante antigénico puede ser seleccionado del grupo que consiste en: (a) una proteína recombinante de VIH, (b) una proteína recombinante del virus de la Influenza (p. ej., una proteína M2 del virus de la Influenza o uno de sus fragmentos), (c) una proteína recombinante del virus de la Hepatitis C, (d) una proteína recombinante de Toxoplasma, (e) una proteína recombinante de Plasmodium falciparum, (f) una proteína recombinante de Plasmodium vivax, (g) una proteína recombinante de Plasmodium ovale, (h) una proteína recombinante de Plasmodium malariae, (i) una proteína recombinante de células de cáncer de mama, (j) una proteína recombinante células de cáncer de riñón, (k) una proteína recombinante de células de cáncer de próstata, (l) una proteína recombinante de células de cáncer de piel, (m) una proteína recombinante de células de cáncer de cerebro, (n) una proteína recombinante de células de leucemia, (o) un perfil recombinante, (p) una proteína recombinante de alergia a la picadura de abeja, (q) proteínas recombinantes de alergia a nueces, (r) proteínas recombinantes de alergias alimentarias, (s) proteínas recombinantes de asma, (t) una proteína recombinante de Chlamydia, y (u) un fragmento de cualquiera de las proteínas mostradas en los apartados (a)-(t).
Una vez que se ha elegido el antígeno o determinante antigénico de la composición, se puede añadir al menos un segundo sitio de anclaje a la molécula en preparación para construir la matriz organizada y repetitiva asociada con el armazón molecular no natural de la invención. Los expertos en la técnica estarán al tanto del conocimiento de qué constituirá un segundo sitio de anclaje apropiado. Los ejemplos representativos de los segundos sitios de anclaje incluyen, pero no están limitados a, los siguientes: un antígeno, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, biotina, avidina, estreptavidina, un receptor, un ligando de receptor, un ligando, una proteína de unión a un ligando, un polipéptido de una cremallera de leucina interaccionante, un grupo amino, un grupo químico reactivo con un grupo amino; un grupo carboxilo, un grupo químico reactivo con un grupo carboxilo, un grupo sulfhidrilo, un grupo químico reactivo con un grupo sulfhidrilo, o una de sus combinaciones.
La asociación entre el primer y el segundo sitios de anclaje se determinará por las características de las respectivas moléculas seleccionadas pero comprenderá al menos un enlace no peptídico. Dependiendo de la combinación del primer y el segundo sitios de anclaje, la naturaleza de la asociación puede ser covalente, iónica, hidrófoba, polar, o una de sus combinaciones.
En una realización de la invención, el segundo sitio de anclaje puede ser el dominio proteico de la cremallera de leucina FOS o el dominio proteico de la cremallera de leucina JUN.
En una realización más preferida de la invención, el segundo sitio de anclaje seleccionado es el dominio proteico de la cremallera de leucina FOS, que se asocia específicamente con el dominio proteico de la cremallera de leucina JUN del armazón molecular no natural de la invención. La asociación de los dominios proteicos de la cremallera de leucina JUN y FOS proporciona una base para la formación de una matriz de antígeno o determinante antigénico ordenada y repetitiva en la superficie del armazón. El dominio proteico de la cremallera de leucina FOS puede ser fusionado en marco al antígeno o determinante antigénico de elección en el extremo amino, el extremo carboxilo o localizado internamente en la proteína si se desea.
Se proporcionan diversos constructos de fusión con FOS con fines ilustrativos. Hormona del crecimiento humana (Ejemplo 4), fosfolipasa A_{2} de veneno de abeja (PLA_{2}) (Ejemplo 9), ovoalbúmina (Ejemplo 10) y gp140 de VIH (Ejemplo 12).
Con el fin de simplificar la generación de constructos de fusión con FOS, se describen numerosos vectores que proporcionan opciones para el diseño y la construcción de antígenos o determinantes antigénicos (véase el Ejemplo 6). Los vectores pAV1-4 fueron diseñados para la expresión de la fusión con FOS en E. coli; los vectores pAV5 y pAV6 fueron diseñados para la expresión de proteínas de fusión con FOS en células eucarióticas. Las propiedades de estos vectores se describen brevemente:
1.
pAV1: Este vector fue diseñado para la secreción de proteínas de fusión con FOS en el extremo C en el espacio periplásmico de E. coli. El gen de interés (g.o.i.) puede ser ligado en los sitios StuI/NotI del vector.
2.
pAV2: Este vector fue diseñado para la secreción de proteínas de fusión con FOS en el extremo N en el espacio periplásmico de E. coli. El gen de interés (g.o.i.) se ligó en los sitios NotI/EcoRV (o NotI/HindIII) del vector.
3.
pAV3: Este vector fue diseñado para la producción citplásmica de proteínas de fusión con FOS en el extremo C en E. coli. El gen de interés (g.o.i.) puede ser ligado en los sitios EcoRV/NotI del vector.
4.
pAV4: Este vector es diseñado para la producción citoplásmica de proteínas de fusión con FOS en el extremo N en E. coli. El gen de interés (g.o.i.) puede ser ligado en los sitios NotI/EcoRV (o NotI/HindIII) del vector. El resto metionina N-terminal es separado proteolíticamente tras la síntesis de proteínas (Hirel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8247-8251 (1989)).
5.
pAV5: Este vector fue diseñado para la producción eucariótica de proteínas de fusión con FOS en el extremo C. El gen de interés (g.o.i.) puede ser insertado entre las secuencias que codifican la secuencia señal de hGH y el dominio FOS mediante ligación en los sitios Eco47III/NotI del vector. Alternativamente, se puede fusionar un gen que contiene su propia secuencia señal a la región codificante de FOS mediante ligación en los sitios StuI/NotI.
6.
pAV6: Este vector fue diseñado para la producción eucariótica de proteínas de fusión con FOS en el extremo N. El gen de interés (g.o.i.) puede ser ligado en los sitios NotI/StuI (o NotI/HindIII) del vector.
Como comprenderán los expertos en la técnica, la construcción de una proteína de fusión de FOS-antígeno o determinante antigénico puede incluir la adición de ciertos elementos genéticos para facilitar la producción de la proteína recombinante. El Ejemplo 4 proporciona las pautas para la adición de ciertos elementos reguladores de E. coli para la traducción, y el Ejemplo 7 proporciona las pautas para la adición de una secuencia señal eucariótica. Se pueden seleccionar otros elementos genéticos, dependiendo de las necesidades específicas del práctico.
También se prevé que la invención incluya la producción de la proteína de fusión FOS-antígeno o FOS-determinante antigénico en células bacterianas (Ejemplo 5) o eucarióticas (Ejemplo 8). La elección a cerca de en qué tipo de célula expresar la proteína de fusión está en el conocimiento del experto en la técnica, dependiendo de factores tales como si las modificaciones post-traduccionales constituyen una importante consideración en el diseño de la composición.
Como se ha observado previamente, la invención describe varios métodos para la construcción de una proteína de fusión FOS-antígeno o FOS-determinante antigénico por medio del uso de los vectores pAV. Además de permitir al práctico la expresión procariótica y eucariótica, estos vectores permiten al práctico elegir entre la adición N- y C-terminal al antígeno del dominio proteico de la cremallera de leucina FOS. Se proporcionan ejemplos específicos en los que se elaboran fusiones de FOS N- y C-terminales con PLA_{2} (Ejemplo 9) y ovalbúmina (Ejemplo 10). El Ejemplo 11 demuestra la purificación de las proteínas de fusión de FOS con PLA_{2} y ovalbúmina.
Asimismo se describe un antígeno o determinante antigénico codificado por el genoma del VIH. Más específicamente, el antígeno o determinante antigénico del VIH es gp140. Como se proporciona en los Ejemplos 11-15, la gp140 de VIH puede ser creada con un dominio proteico de la cremallera de leucina FOS y la proteína de fusión sintetizada y purificada para el anclaje al armazón molecular no natural de la invención. Como sabría un experto en la técnica, se pueden utilizar otros antígenos o determinantes antigénicos del VIH en la creación de la composición.
Las composiciones para vacuna adicionales comprenden al menos un antígeno o determinante antigénico codificado por un ácido nucleico viral de Influenza, y el uso de tales composiciones para vacuna para lograr respuestas inmunitarias. En una realización aún más específica, el antígeno o determinante antigénico de la Influenza puede ser una proteína M2 (p. ej., una proteína M2 que tiene los aminoácidos mostrados en el SEQ ID NO: 213, Núm. de Acceso GenBank P06821, o en el SEQ ID NO: 212, Núm. de Acceso PIR MFIV62, o uno de sus fragmentos (p. ej., aminoácidos aproximadamente 2 a aproximadamente 24 del SEQ ID NO: 213, la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 212). Adicionalmente, se pueden acoplar antígenos o determinantes antigénicos de influenza a armazones moleculares no naturales o partículas núcleo por medio de enlaces peptídicos o no peptídicos. Cuando se acoplan antígenos o determinante antigénicos de Influenza a armazones moleculares no naturales o partículas núcleo por medio de enlaces peptídicos, las moléculas que forman matrices ordenadas y repetitivas se prepararán generalmente como productos de expresión de proteínas de fusión. Sin embargo la realización más preferida es una composición, donde el péptido M2 es acoplado mediante entrecruzamiento químico, a una proteína de la cápside de Q\beta, una proteína de la cápside de HBcAg o a Pili.
Las porciones de una proteína M2 (p. ej., una proteína M2 que tiene la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 213), así como otras proteínas contra las cuales se busca una respuesta inmunológica, adecuadas para su uso pueden comprender, o alternativamente consistir en, péptidos de cualquier número de aminoácidos de longitud pero generalmente tendrán al menos 6 aminoácidos de longitud (p. ej., péptidos de 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, o 97 aminoácidos de longitud).
En otra realización específica de la invención, el segundo sitio de anclaje seleccionado es un resto cisteína, que se asocia específicamente con un resto lisina del armazón molecular no natural o partícula núcleo de la invención, o el segundo sitio de anclaje seleccionado es un resto lisina, que se asocia específicamente con un resto cisteína del armazón molecular no natural o partícula núcleo de la invención. La conexión química del resto lisina (Lys) y el resto cisteína (Cys) proporciona una base para la formación de una matriz de antígeno o determinante antigénico organizada y repetitiva sobre la superficie del armazón o partícula núcleo. El resto cisteína o lisina puede ser diseñado en marco con el antígeno o determinante antigénico de elección en el extremo amino, el extremo carboxilo o localizado internamente en la proteína si se desea. A modo de ejemplo, se proporcionan PLA_{2} y gp140 de VIH con un resto cisteína para la unión a un resto lisina primer sitio de anclaje.
Se describen composiciones para vacuna adecuadas para su uso en los métodos para prevenir y/o atenuar las reacciones alérgicas, tales como las reacciones alérgicas que conducen a anafilaxis. De este modo, las composiciones para vacuna incluyen composiciones que conducen a la producción de anticuerpos que evitan y/o atenúan las reacciones alérgicas. De este modo, en ciertas realizaciones, las composiciones para vacuna incluyen composiciones que logran una respuesta inmunológica contra un alergeno. Los ejemplos de tales alergenos incluyen fosfolipasas tales como las proteínas fosfolipasa A_{2} (PLA_{2}) de Apis mellifera (SEQ ID NO: 168, Núm. de Acceso GenBank 443189; SEQ ID NO: 169, Núm. de Acceso GenBank 229378), Apis dorsata (SEQ ID NO: 170, Núm. de Acceso GenBank B59055), Apis cerana (SEQ ID NO:171, Núm. de Acceso GenBank A59055), Bombus pennsylvanicus (SEQ ID NO:172 Núm. de Acceso GenBank B56338), y Heloderma suspectum (SEQ ID NO: 173, Núm. de Acceso GenBank P80003; SEQ ID NO: 174, Núm. de Acceso S GenBank 14764; SEQ ID NO: 175, Núm. de Acceso GenBank 226711).
Utilizando la secuencia de aminoácidos de una proteína PLA_{2} de Apis mellifera (SEQ ID NO: 168) como ilustración, también se pueden utilizar péptidos de al menos aproximadamente 60 aminoácidos de longitud, que representan cualquier porción de la secuencia de PLA_{2} completa, en composiciones para prevenir y/o atenuar las reacciones alérgicas. Los ejemplos de tales péptidos incluyen péptidos que comprenden los aminoácidos 1-60 del SEQ ID NO: 168, los aminoácidos 1-70 del SEQ ID NO: 168, los aminoácidos 10-70 del SEQ ID NO: 168, los aminoácidos 20-80 del SEQ ID NO: 168, los aminoácidos 30-90 del SEQ ID NO: 168, los aminoácidos 40-100 del SEQ ID NO: 168, los aminoácidos 47-99 del SEQ ID NO: 168, los aminoácidos 50-110 del SEQ ID NO: 168, los aminoácidos 60-120 del SEQ ID NO: 168, los aminoácidos 70-130 del SEQ ID NO: 168, o los aminoácidos 90-134 del SEQ ID NO: 168, así como las correspondientes porciones de otras proteínas PLA_{2} (p. ej., las proteínas PLA_{2} descritas antes). Los ejemplos adicionales de tales péptidos incluyen péptidos que comprenden los aminoácidos 1-10 del SEQ ID NO: 168, los aminoácidos 5-15 del SEQ ID NO: 168, los aminoácidos 10-20 del SEQ ID NO: 168, los aminoácidos 20-30 del SEQ ID NO: 168, los aminoácidos 30-40 del SEQ ID NO: 168, los aminoácidos 40-50 del SEQ ID NO: 168, los aminoácidos 50-60 del SEQ ID NO: 168, los aminoácidos 60-70 del SEQ ID NO: 168, los aminoácidos 70-80 del SEQ ID NO: 168, los aminoácidos 80-90 del SEQ ID NO:168, los aminoácidos 90-100 del SEQ ID NO: 168, los aminoácidos 100-110 del SEQ ID NO: 168, los aminoácidos 110-120 del SEQ ID NO: 168, o los aminoácidos 120-130 del SEQ ID NO: 168, así como las correspondientes porciones de otras proteínas PLA_{2} (p. ej., las proteínas PLA_{2} descritas
antes).
Las porciones de PLA_{2}, así como las porciones de otras proteínas contra las cuales se busca una respuesta inmunológica, adecuadas para su uso pueden comprender, o alternativamente consisten en, péptidos que tienen generalmente al menos 6 aminoácidos de longitud (p. ej., péptidos de 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, o 100 aminoácidos de longitud).
Los péptidos PLA_{2} (p. ej., las proteínas PLA_{2} completas mencionadas antes, así como las subporciones de cada una) también pueden ser acoplados a cualquier sustancia (p. ej., una proteína de la cápside de Q\beta o uno de sus fragmentos) que permita la formación de matrices de antígeno ordenadas y repetitivas.
En otro aspecto, la descripción proporciona composiciones que son particularmente adecuadas para tratar y/o prevenir las afecciones causadas o exacerbadas por productos "auto"-génicos.
El determinante antigénico puede ser RANKL (activador del Receptor del Ligando NFkB). RANKL también es conocido como TRANCE (citoquina inductora de la activación relacionada con el TNF), ODF (Factor de Diferenciación de Osteoclastos) u OPGL (ligando de Osteoprotegerina). La secuencia de aminoácidos de la parte extracelular de RANKL humano se muestra en el SEQ ID NO: 221 (RANKL_humano: TrEMBL:O14788), mientras la secuencia de aminoácidos de una isoforma humana se muestra en el SEQ ID NO: 222. Las secuencias para la parte extracelular de RANKL murino y una isoforma se muestran en el SEQ ID NO: 223 (RANKL_ratón: TrEMBL:O35235), y en el SEQ ID No. 224 (RANKL_ratón formas de empalme: TrEMBL:Q9JJK8 y TrEMBL:Q9JJK9), respectivamente.
Se ha demostrado que RANKL es un factor esencial en la osteoclastogénesis. La inhibición de la interacción de RANKL con su RANK receptor puede conducir a la supresión de la osteoclastogénesis y proporcionar de este modo un medio para detener la resorción ósea excesiva como se observa en la osteoporosis y otras afecciones. La interacción RANKL/RANK fue inhibida por una proteína de fusión RANK-Fc o por el receptor señuelo soluble de RANKL, denominado osteoprotegerina OPG.
En el sistema inmunitario RANKL es expresado en células T mientras RANK se encuentra en células presentadoras de antígenos. Se demostró que la interacción RANKL-RANK era crítica para la activación de los células T coadyuvantes independientes de CD40L (Bachmann et al., J. Exp. Med 7: 1025 (1999)) y para aumentar la longevidad y las propiedades coadyuvantes de las células dendríticas (Josien et al., J Exp Med. 191: 495 (2000)).
En hueso RANKL es expresado en células estromáticas u osteoblastos, mientras RANK es expresado en el precursor de osteoclastos. La interacción de RANK y RANKL es crucial para el desarrollo de precursores de osteoclastos a osteoclastos maduros. La interacción puede ser bloqueada por la osteoprotegerina.
Los ratones deficientes en OPG desarrollan osteoporosis que puede ser recuperada mediante inyección de protegerina recombinante. Esto significa que la OPG es capaz de revertir la osteoporosis. De este modo, la inhibición de la interacción RANK-RANKL por medio de la inyección de la misma puede revertir la osteoporosis.
Además, se observó calcificación arterial en ratones con el gen OPG inactivado que pudo ser revertida mediante inyección de OPG (Min et al., J. Exp. Med. 4: 463 (2000)). En un modelo de artritis inducida por coadyuvante la inyección de OPG era capaz de evitar la pérdida ósea y la destrucción de cartílago, pero no la inflamación (hinchazón de la pata). Se supone que las células T activadas conducen a un incremento de la osteoclastogénesis y a una pérdida ósea mediadas por RANKL. La OPG inhibe la osteoclastogénesis inducida por el cáncer de próstata y evita el crecimiento del tumor de próstata en hueso de ratones. La OPG disminuye el dolor del cáncer de hueso avanzado en
ratones.
RANKL es una proteína transmembrana de 245 aa que pertenece a la superfamilia del TNF. Parte de la región extracelular (178 aa) puede ser desprendida por una proteasa de tipo TACE (Lum et al., J Biol Chem. 274:13613 (1999)). Además se han descrito variantes de empalme que carecen de dominio transmembrana (Ikeda et al., Endocrinology 142: 1419 (2001)). La parte desprendida contiene el dominio altamente homólogo al TNF-\alpha soluble. Este dominio extracelular de RANKL forma homotrímeros como se ha observado para TNF-\alpha. El extremo C parece estar implicado en el sitio de contacto del trímero. Una cisteína se encuentra presente en esta región de la secuencia.
Los autores de la presente invención han construido un modelo para la estructura tridimensional de la correspondiente región de RANKL y han encontrado que la cisteína presente naturalmente puede no ser accesible en la estructura plegada para la interacción con un primer sitio de anclaje del portador.
Se prefiere el extremo N para el anclaje a un segundo sitio de anclaje que comprende un conector aminoacídico con un resto cisteína adicional. Un constructo de RANKL humano con un conector aminoacídico N-terminal que contiene un resto cisteína fusionado a la porción extracelular de RANKL es descrito como un conector aminoacídico que contiene un resto cisteína como segundo sitio de anclaje y que está fusionado al extremo C de la secuencia RANKL o a la porción extracelular de RANKL.
Los constructos de RANKL humano, tales como el identificado en el SEQ ID NO: 320, son generados de acuerdo con las enseñanzas descritas en el Ejemplo 6, y el experto en la técnica es capaz de comparar las secuencias de RANKL murina y humana en un alineamiento de la secuencia de proteínas para identificar la porción de la secuencia de RANKL humano que se va a clonar en los vectores descritos en el Ejemplo 6. Los fragmentos que contienen los aminoácidos 138-317 y que corresponden a la región C-terminal del dominio extracelular de RANKL humano pueden ser modificados para el acoplamiento a VLP y Pili según sea necesario.
No obstante, también se pueden utilizar otros vectores adecuados para la expresión en el anfitrión adecuado descrito más abajo. Se describen los constructos de RANKL humano adicionales, y en particular, los que comprenden la porción de la región extracelular (178 aa), - o sus fragmentos - que pueden ser desprendidos por una proteasa de tipo TACE (Lum et al., J Biol Chem. 274:13613 (1999)), o que comprenden la secuencia correspondiente a las variantes de empalme alternativas que carecen del dominio transmembrana, así como sus fragmentos conservativos, como también los fragmentos C-terminales humanos que comprenden los aminoácidos 165-317 y los fragmentos que abarcan la región extracelular completa (aminoácidos 71-317) y pueden ser modificados para el acoplamiento a VLP y Pili según sea necesario.
RANKL ha sido expresado en diferentes sistemas (E. coli, células de insecto, células de mamífero) y se ha demostrado que es activo, y por lo tanto se pueden utilizar diversos sistemas de expresión para la producción del antígeno de la composición. En el caso en el que la expresión de proteínas está dirigida al periplasma de E. coli, el péptido señal de RANKL, o de los constructos de RANKL que consisten en la porción extracelular de la proteína, y posiblemente ambos modificados para comprender un segundo sitio de anclaje de acuerdo con la invención, es remplazado por un péptido señal bacteriano. Para la expresión de la proteína en el citoplasma de E. coli, los constructos de RANKL son desprovistos del péptido señal.
El determinante antigénico puede ser MIF o uno de sus fragmentos. MIF es una citoquina que ha sido descrita por primera vez en 1966 por su función como inhibidor de la migración de macrófagos. También es conocida como una proteína de respuesta temprana retardada 6 (DER6), factor de inhibición de la glucosilación o fenilpiruvato tautomerasa. El último nombre tiene su origen en la actividad enzimática de MIF, no obstante el sustrato endógeno no ha sido identificado.
Se ha demostrado que MIF está implicada en una amplia variedad de afecciones. MIF (ARNm y proteína) está reglada al alza en la reacción de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) inducida por la tuberculina, y el anticuerpo anti-MIF inhibe esta reacción DTH. MIF también está regulada al alza en el rechazo del aloinjerto renal. En un modelo de enfermedad autoinmunitaria ocular, la uveoretinitis autoinmunitaria experimental (EAU), el tratamiento anti-MIF ocasionó un retraso en el desarrollo de la EAU. En pacientes, existe un incremento en suero de MIF, que es también el caso de los pacientes con enfermedad de Behcet y de los pacientes que padecen iridociclitis. La inmunización frente a MIF puede proporcionar un modo de tratamiento contra la artritis reumatoide.
Se ha encontrado una elevada concentración de MIF en suero en pacientes con dermatitis atópica. En las lesiones de la piel, MIF es difusamente expresada en lugar de encontrarse en la capa de células basales en los controles. La concentración de MIF es descendente tras el tratamiento con esteroides, lo que coincide con el papel de MIF en la inflamación. También se ha encontrado que MIF contribuye al establecimiento de la glomerulonefritis. Los animales tratados con anticuerpo anti-MIF muestran una glomerulomefritis significativamente reducida. La MIF deriva de la pituitaria, secretada p. ej. tras la estimulación con LPS, y potencia la endotoxemia. Por consiguiente, el mAb anti-MIF inhibe la endotoxemia y el choque séptico, mientras la MIF recombinante aumenta notablemente la letalidad de la peritonitis. MIF también es un modulador inducido por glucocorticoides de la producción de citoquinas, y promueve la inflamación.
MIF es producida por las células T (Th2), apoya la proliferación de células T, y el tratamiento anti-MIF reduce la proliferación de las células T y los niveles de IgG. Existe un aumento de concentración de MIF en el fluido cerebroespinal de pacientes con esclerosis múltiple y enfermedad de neuro-Behcet. También se encontraron elevados niveles de MIF en sueros de pacientes con psoriasis extendida. Se encuentran niveles elevados de MIF en sueros de pacientes con colitis ulcerativa pero no en pacientes con enfermedad de Crohn.
Se han encontrado niveles elevados de MIF en sueros de pacientes con asma bronquial. Asimismo la MIF esta regulada al alza en fluido sinovial de pacientes con artritis reumatoide. El tratamiento anti-MIF fue eficaz en la disminución de la artritis reumatoide en modelos de ratón y rata (Mikulowska et al., J. Immunol. 158:5514-7(1997); Leech et al., Arthritis Rheum. 41:910-7 (1998), Leech et al. Arthritis Rheum. 43:827-33 (2000), Santos et al., Clin. Exp. Immunol. 123:309-14 (2001)). De este modo, el tratamiento dirigido a inhibir la actividad de MIF utilizando una composición que comprende MIF como determinante antigénico puede ser beneficioso para las afecciones mencionadas antes.
La MIF de ratón, rata y ser humano consiste en 114 aminoácidos y contiene tres restos cisteína conservados, como se muestra en el SEQ ID NO: 225 (MIF_rata: SwissProt), en el SEQ ID NO: 226 (MIF_ratón: SwissProt) y en el SEQ ID NO: 227 (MIF_humana: SwissProt). Tres subunidades forman un homotrímero que no está estabilizado por puentes disulfuro. Se ha resuelto la estructura de rayos x y muestra tres cisteínas libres (Sun et al., PNAS 93: 5191-96 (1996)), mientras algunos datos de la literatura reivindican la presencia de un enlace disulfuro. Sin embargo, ninguna de las cisteínas está suficientemente expuesta para una interacción óptima con un posible primer sitio de anclaje presente en el portador. De este modo, como el extremo C de la proteína está expuesto en la estructura trimérica, se añade, preferiblemente, un conector aminoacídico que contiene un resto cisteína libre, al extremo C de la proteína, para la generación del segundo sitio de anclaje, como se describe ilustrativamente en el Ejemplo 4 para MIF de rata.
Solamente existe un cambio de aminoácido entre MIF de ratón y de rata, y de un modo similar existe una homología de secuencia muy elevada (aproximadamente una identidad de secuencia del 90%) entre MIF de ser humano y de rata o MIF de ser humano y de ratón. Los constructos de MIF de humano y ratón de acuerdo con la invención se describen y se pueden generar como se describe en el Ejemplo 4. Con el fin de demostrar la elevada potencia para inducir una respuesta inmunitaria auto-específica de la proteína MIF, o uno de sus fragmentos, asociada con una partícula núcleo, se inyectaron en ratones constructos de MIF de rata acoplados a la proteína de la cápside de Q\beta. Los elevados títulos de anticuerpo obtenidos inmunizando los ratones con MIF de rata demuestran que la tolerancia a la inmunización con auto-antígenos era superada por la inmunización con constructos de MIF acoplados a partículas de tipo virus, y en particular a la proteína de la cápside de Q\beta (Ejemplo 4). Por lo tanto, las composiciones pueden comprender proteína MIF humana asociada a una partícula núcleo, preferiblemente a pili o una partícula de tipo virus, y más preferiblemente a una partícula de tipo virus de un fago con ARN, e incluso más preferiblemente a un fago con ARN Q\beta o fr.
No obstante, se puede añadir un conector aminoacídico que contiene una cisteína libre al extremo N de la secuencia de MIF.
Se ha expresado MIF en E. coli, se ha purificado y se ha demostrado que es completamente funcional (Bemhagen et al., Biochemistry 33: 14144-155 (1994). Así, se puede expresar MIF preferiblemente en E. coli para generar la composición.
La actividad tautomerasa de MIF es inhibida, si la metionina de partida no es escindida del constructo. Los constructos de MIF expresados en E. coli y descritos en el Ejemplo 4 muestran actividad tautomerasa. Los mutantes de MIF en los que la metionina de partida es escindida y en los que el resto prolina inmediatamente posterior a la metionina de partida en la secuencia se ha mutado a alanina tampoco muestran actividad tautomerasa.
Se prevé la inmunización con mutantes MIF desprovistos de actividad tautomerasa.
El determinante antigénico puede ser la Interleuquina-17 (IL-17). La IL-17 humana es una proteína homodimérica, unida por puentes disulfuro, de 32 kDa con glucosilación variable (Yao, Z. et al., J. Immunol. 155: 5483-5486 (1995); Fossiez, F. et al., J. Exp. Med. 183: 2593-2603 (1996)). La proteína comprende 155 aminoácidos e incluye una secuencia señal de secreción N-terminal de 19-23 restos. La secuencia de aminoácidos del la IL-17 es similar solamente a una proteína de Herpesvirus (HSV13) y no es similar a otras citoquinas o proteínas conocidas. La secuencia de aminoácidos de la IL-17 humana se muestra en el SEQ ID NO: 228 (NÚM. de ACCESO: AAC50341). La secuencia de la proteína se muestra en el SEQ ID NO: 229 (NÚM. de ACCESO: AAA37490). Del gran número de tejidos y líneas celulares evaluados, el transcrito de ARNm que codifica la IL-17 ha sido detectado solamente en células T activadas y células mononucleares de sangre periférica estimuladas con forbol 12-miristato 13-acetato/ionomicina (Yao, Z. et al., J. Immunol. 155: 5483-5486 (1995); Fossiez, F. et al., J. Exp. Med. 183: 2593-2603 (1996)). Las secuencias tanto de humano como de ratón contienen 6 restos cisteína.
El receptor para IL-17 es ampliamente expresado en muchos tipos de tejidos y células (Yao, Z. et al., Cytokine 9: 794-800 (1997)). Aunque la secuencia de aminoácidos del receptor de IL-17 humano (866 aa) pronostica una proteína con un único dominio transmembrana y un largo dominio intracelular de 525 aa, la secuencia del receptor es única y no es similar a la de ninguno de los receptores de la familia de receptores de citoquinas/factores de crecimiento. Esto unido a la carencia de similitud de la propia IL-17 con otras proteínas conocidas indica que IL-17 y su receptor pueden ser parte de una familia novedosa de proteínas de señalización y receptores. Los estudios clínicos indican que IL-17 puede estar implicada en muchas enfermedades inflamatorias. La IL-17 es secretada por las células T sinoviales de pacientes con artritis reumatoide y estimula la producción de mediadores inflamatorios (Chabaud, M. et al., J. Immunol. 161: 409-414 (1998); Chabaud, M. et al., Arthritis Rheum. 42: 963-970 (1999)). Se ha informado de elevados niveles de IL-17 en pacientes con artritis reumatoide (Ziolkowska M. et al., J Immunol. 164:2832-8 (2000)).
Se ha demostrado que la Interleuquina 17 tiene un efecto sobre la degradación de proteoglicanos en las articulaciones de la rodilla de múridos (Dudler J. et al., Ann Rheum Dis. 59: 529-32 (2000)) y contribuye a la destrucción de la matriz sinovial (Chabaud M. et al., Cytokine. 12:1092-9 (2000)). Existen modelos relevantes de artritis en animales para someter a ensayo el efecto de una inmunización contra MIF (Chabaud M. et al, Cytokine. 12:1092-9 (2000)). Se han encontrado niveles elevados de ARNm de IL-17 en células mononucleares de pacientes con esclerosis múltiple (Matusevicius, D. et al., Mult. Scler. 5: 101-104 (1999)). Se han observado niveles elevados de IL-17 en suero en pacientes que padecen Lupus Eritematoso Generalizado (Wong C.K. et al., Lupus 9: 589-93 (2000)). Además, hay niveles incrementados de ARNm de IL-17 en células T aisladas de piel con lesiones psoriásicas (Teunissen, M. B. et al., J. Invest. Dermatol. 111: 645-649 (1998)).
La implicación de la IL-17 en el rechazo del injerto de riñón también ha sido demostrada (Fossiez F. et al., Int. Rev. Immunol.16:541-51 (1998)). Asimismo Antonysamy et al. (J. Immunol. 162:577-84 (1999)) han presentado una evidencia del papel de la IL-17 en el rechazo de aloinjertos de órganos, que demostraron que la IL-17 promueve la diferenciación funcional de progenitores de células dendríticas. Sus descubrimientos sugieren un papel para la IL-17 en la proliferación de células T alogénicas que puede estar mediada en parte por el efecto inductor de la maduración sobre las DC. Además el mismo grupo refiere (Tang J.L. et al., Transplantation 72:348-50 (2001)) un papel para la IL-17 en la inmunopatogénesis del rechazo vascular agudo donde el antagonismo de la Interleuquina-17 inhibe el rechazo vascular agudo pero no crónico. La IL-17 parece tener potencial como diana novedosa para la intervención terapéutica en el rechazo de aloinjertos.
Los descubrimientos anteriores sugieren que la IL-17 juega un papel fundamental en el inicio o mantenimiento de una respuesta inflamatoria (Jovanovic, D. V. et al., J. Immunol. 160: 3513-3521 (1998)).
El anticuerpo monoclonal anti-IL-17 mAb5 (Schering-Plough Research Institute) fue capaz de inhibir completamente la producción de IL-6 en sobrenadantes de sinovium de artritis reumatoide (AR) tras la inducción por medio de 50 ng/ml de IL-17. Un Mab irrelevante MXI no tuvo efecto en este análisis. mAb5 es una IgG1 de ratón obtenida tras la inmunización con rIL-17 humana (r = recombinante). Una concentración de 1 \mug/ml de mAb5 fue capaz de inhibir completamente la producción de IL-6 en el sistema de análisis (Chabaud, M. et al., J. Immunol. 161: 409-414 (1998)). De este modo, la inmunización contra IL-17 proporciona un modo de tratamiento para las diversas afecciones descritas antes.
La composición puede comprender un conector que contiene un segundo sitio de anclaje y que está fusionado al extremo C de la IL-17 recombinante. Se puede fusionar un conector aminoacídico que contiene una cisteína libre al extremo N de la secuencia correspondiente a la secuencia de la proteína procesada, o se puede insertar en el extremo N de la secuencia de la forma madura de la proteína, en posición C-terminal con respecto al péptido señal. Para los sistemas de expresión eucarióticos, el péptido señal del gen IL-17, como es el caso para otros auto-antígenos indicados en la presente memoria, puede ser remplazado por otro péptido señal si fuera necesario. Para la expresión en bacterias, el péptido señal es remplazado por un péptido señal bacteriano para la expresión soluble en el periplasma, o suprimido para la expresión en el citoplasma. Los constructos de IL-17 humana desprovistos del péptido señal comprenderá preferiblemente los restos 24-155, 22-155, 21-155 o 20-155. Los constructos de IL-17 de ratón desprovistos del péptido señal comprenderán preferiblemente los restos 26-158, 25-158, 24-158 o 27-155. La IL-17 humana puede ser expresada en células CV1/EBNA; se ha demostrado que la hIL-17 recombinante es secretada tanto en forma glucosilada como no glucosilada (Yao, Z. et al., J. Immunol. 155: 5483-5486 (1995)). La IL-17 también puede ser expresada como proteína de fusión hIL-17/Fc, con la posterior escisión de la proteína IL-17 de la proteína de fusión. La IL-17 también puede ser expresada en la levadura Pichia pastoris (Murphy K.P. et. al., Protein Expr Purif. 12: 208-14 (1998)). La IL-17 humana también puede ser expresada en E. coli. Cuando la expresión de la IL-17 en E. coli está dirigida al periplasma, el péptido señal de IL-17 es remplazado por un péptido señal bacteriano. Para la expresión de la proteína en el citoplasma de E. coli, los constructos de IL-17 son desprovistos del péptido señal.
El determinante antigénico puede ser la Interleuquina-13 (IL-13). La IL-13 es una citoquina que es secretada por los linfocitos T activados y principalmente impacta en monocitos, macrófagos, y células B. La secuencia de aminoácidos de la IL-13 humana precursora se muestra en el SEQ ID NO: 230 y la secuencia de aminoácidos de la IL-13 humana procesada se muestra en el SEQ ID NO: 231. Los primeros 20 aminoácidos de la proteína precursora corresponden al péptido señal, y están ausentes en la proteína procesada. También se ha descrito la secuencia de ratón, y la secuencia de aminoácidos procesada se muestra en el SEQ ID NO: 232 (Brown K.D. et al., J. Immunol. 142:679-687 (1989)). Dependiendo del anfitrión de expresión, el constructo de Il-13 comprenderá la secuencia de la proteína precursora, p. ej., para la expresión y secreción en anfitriones eucarióticos, o consistirá en la proteína madura, p. ej., para la expresión citoplásmica en E. coli. Para la expresión en el periplasma de E. coli, el péptido señal de IL-13 es remplazado por un péptido señal bacteriano.
La IL-13 es una citoquina derivada de células T coadyuvantes 2 (como IL-4, IL-5) que ha sido implicada recientemente en las respuestas de las vías respiratorias alérgicas (asma). Se ha encontrado una regulación al alza de IL-13 y del receptor de IL-13 en muchos tipos de tumores (p. ej. linfoma Hodgkin). La Interleuquina 13 es secretada por y estimula el crecimiento de las células Hodgkin y Reed-Sternberg (Kapp U et al., J Exp Med 189:1939-46 (1999)). De este modo, la inmunización contra IL-13 proporciona un modo de tratar entre otras las afecciones descritas antes, tales como el asma y el Linfoma Hodgkin.
La composición puede comprender un conector aminoacídico que contiene un resto cisteína libre y que está fusionado al extremo N o C de la secuencia de la IL-13 madura para introducir un segundo sitio de anclaje en la proteína. Se puede añadir un conector de un aminoácido que contiene una cisteína libre al extremo N de la forma madura de la IL-13, puesto que es accesible libremente de acuerdo con la estructura de RMN de la IL-13 (Eisenmesser, E. Z. et al., J. Mol. Biol. 310: 231 (2001)). El conector aminoacídico que contiene una cisteína libre puede ser fusionado al extremo N de la secuencia correspondiente a la secuencia de la proteína procesada, o insertado en el extremo N de la secuencia de la forma madura de la proteína, en posición C-terminal con respecto al péptido señal. Aún se puede añadir un conector aminoacídico adicional que contiene un resto cisteína libre al extremo C de la proteína.
La IL-13 puede ser expresada en E. coli (Eisenmesser E.Z. et al., Protein Expr. Purif. 20:186-95 (2000)), o en células NS-0 (línea de células eucarióticas) (Cannon-Carlson S. et al., Protein Expr. Purif.12:239-48 (1998)). El Ejemplo 9 describe los constructos y la expresión de los constructos de IL-13 murina, fusionada a un conector aminoacídico que contiene un resto cisteína, en anfitriones bacterianos y eucarióticos. Se pueden generar constructos de IL-13 humana de acuerdo con las enseñanzas del Ejemplo 9 y la producción de las proteínas C-IL-13-F humana (SEQ ID NO: 330) y C-IL-13-S humana (SEQ ID NO: 331) tras la expresión de las proteínas de fusión y la escisión con el Factor Xa, y la enteroquinasa respectivamente. Las proteínas así generadas pueden ser acopladas a VLP y Pili.
El determinante antigénico puede ser la Interleuquina-5 (IL-5). La IL-5 es una citoquina de linaje específico para eosinofilopoyesis y juega un papel importante en las enfermedades asociadas con el incremento del número de eosinófilos, tales como el asma. La secuencia de la IL-5 precursora y procesada se proporciona en el SEQ ID NO: 233 y en el SEQ ID NO: 234, respectivamente, y la secuencia de aminoácidos de ratón procesada se muestra en el SEQ ID NO: 235.
La función biológica de la IL-5 ha sido demostrada en diversos estudios (Coffman R.L. et al., Science 245: 308-10 (1989); Kopf et al., Immunity 4:15-24 (1996)), lo que apunta a un efecto beneficioso de la inhibición de la función de IL-5 en las enfermedades mediadas por eosinófilos. La inhibición de la acción de IL-5 proporciona así un modo de tratamiento contra el asma y otras enfermedades asociadas con eosinófilos.
IL-5 forma un dímero, unido covalentemente por un puente disulfuro. Se ha informado sobre un constructo de cadena sencilla (sc) en el que dos monómeros de IL-5 están unidos por un conector peptídico.
Se puede añadir un conector peptídico que contiene una cisteína libre al extremo N de la secuencia de la forma procesada de IL-5. Asimismo se prevé la adición de un conector que contiene una cisteína libre, preferiblemente, al extremo N de la secuencia de la forma procesada de una scIL-5. El conector aminoacídico que contiene una cisteína libre puede ser fusionado al extremo N de la secuencia que corresponde a la secuencia de la proteína procesada, o insertado en el extremo N de la secuencia de la forma madura de la proteína, en posición C-terminal con respecto al péptido señal.
En otros casos adicionales se fusiona un conector que contiene una cisteína libre al extremo C de la secuencia de IL-5, o al extremo C de la secuencia de scIL-5.
Se han descrito numerosos sistemas de expresión para IL-5 y se pueden utilizar en la preparación de composiciones. Proudfoot et al., (Biochem J. 270:357-61 (1990)) han descrito un sistema de expresión bacteriana que utiliza E. coli. En el caso en el que la IL-5 es expresada en el citoplasma de E. coli, el constructo de IL-5 es desprovisto del péptido señal. También se pueden utilizar células de insecto para producir constructos de IL-5 para elaborar las composiciones de la invención (Pierrot C. et al., Biochem: Biophys. Res. Commun. 253:756-60 (1998)). Del mismo modo, también se pueden utilizar sistemas de expresión de Baculovirus (células sf9; Ingley E. et al., Eur. J. Biochem. 196:623-9 (1991) y Brown P.M. et al., Protein Expr. Purif. 6: 63-71 (1995)). Finalmente, también se ha informado de sistemas de expresión de mamíferos (células CHO) y se pueden utilizar en la preparación de estas composiciones de la invención (Kodama S et al., J. Biochem. (Tokyo) 110:693-701 (1991)).
También se han descrito sistemas de expresión de Baculovirus (Mitchell et al., Biochem. Soc. Trans. 21:332S (1993); Kunimoto DY et al., Cytokine 3:224-30 (1991)) y un sistema de expresión en células de mamífero utilizando células CHO (Kodama S et al., Glycobiology 2:419-27 (1992)) para IL-5 de ratón.
En el Ejemplo 10 se describe la expresión de constructos de IL-5 murina en la que la secuencia de IL-5 es fusionada en su extremo N a conectores aminoacídicos que contienen un resto cisteína para el acoplamiento a VLP y Pili. Se han generado constructos humanos de acuerdo con las enseñanzas del Ejemplo 10 y se han producido las proteínas C-IL-5-E humana (SEQ ID NO: 335), C-IL-5-F humana (SEQ ID NO: 336) y C-IL-5-S: humana (SEQ ID NO: 337) adecuadas para el acoplamiento a VLP y Pili.
El determinante antigénico puede ser CCL-21. La CCL-21 es una quimioquina de la subfamilia CC que también es conocida como citoquina A21 inducible pequeña, como exodus-2, como SLD (citoquina de linfocitos secundarios), como TCA4 (agente quimiotáctico derivado de timo 4) o 6Cquina.
La CCL21 inhibe la hematopoyesis y estimula la quiotaxis para los timocitos, las células T activadas y las células dendríticas, pero no las células B, los macrófagos o los neutrófilos. Esta demuestra una actividad preferente hacia las células T no sometidas a tratamiento previo. Asimismo es un potente quimioatrayente de las células mesangiales. La CCL21 se une a los receptores de quimioquinas CCR7 y a CXCR3 (dependiendo de las especies). Puede desencadenar una rápida detención dependiente de integrinas del contacto inicial de los linfocitos en condiciones de cizalla fisiológica y es altamente expresada por vénulas de endotelio alto.
La CCL21 murina inhibió el crecimiento tumoral y la angiogénesis en un modelo de ratón SCID de cáncer de pulmón humano (Arenberg et al., Cancer Immunol. Immunother. 49: 587-92 (2001)) y un modelo tumoral de carcinoma de colon en ratones (Vicari et al., J. Immunol. 165: 1992-2000 (2001)). La actividad angiostática de CCL21 murina también fue detectada en un análisis "micropocket" de córnea de rata (Soto et al., Proc. Natl. Acad Sci. U S A 95: 8205-10 (1998).
Se ha demostrado que los receptores que quimioquinas CCR7 y CXCR4 están regulados al alza en células de cáncer de mama y que CCL21 y CXCL12, los respectivos ligandos, están altamente expresados en órganos que representan los primeros destinos de las metástasis del cáncer de mama (Müller et al. (Nature 410: 50-6 (2001)). La quimiotaxis mediada por CCL21 in vitro pudo ser bloqueada por anticuerpos anti-CCL21 neutralizadores al igual que la quimiotaxis mediada por CXCR4 por los respectivos anticuerpos. De este modo, la inmunización contra CCL21 proporciona un modo de tratamiento contra la diseminación de metástasis en el cáncer, más específicamente en el cáncer de mama.
La CCL21 secretada consiste en 110 o 111 aa en ratones y seres humanos, respectivamente. Las respectivas secuencias se muestran en el SEQ ID NO: 236 (Swissprot: SY21_humano) y en el SEQ ID NO: 237 (Swissprot: SY21_ratón). En contraste con otras citoquinas CC, CCL21 contiene dos cisteínas más en una región ampliada en el extremo C. Se supone que todas las cisteínas están comprometidas en enlaces disulfuro.
A continuación, se describen los constructos y sistemas de expresión para elaborar composiciones que comprenden el determinante antigénico CCL21. En la estructura de RMN de la proteína homóloga oetaxina, ambos extremos N y C están expuestos al disolvente. En algunas realizaciones específicas, se añade un conector aminoacídico que contiene un resto cisteína libre como segundo sitio de anclaje en el extremo C de la proteína. Se ha expresado una proteína de fusión con fosfatasa alcalina (en el extremo C de CCL21) y se ha demostrado que es funcional, demostrando que las fusiones en el extremo C de CCL21 son compatibles con la unión al receptor. En otros casos, el conector aminoacídico que contiene una cisteína libre es fusionado al extremo N de la secuencia correspondiente a la secuencia de la proteína procesada, o insertado en el extremo N de la secuencia de la forma madura de la proteína, en posición C-terminal con respecto al péptido señal.
Se han descrito numerosos sistemas de expresión para la producción de CCL21 (p. ej. Hedrick et al., J Immunol. 159: 1589-93 (1997)). Por ejemplo, puede ser expresada en un sistema de baculovirus (Nagira et al., J. Biol. Chem. 272: 19518-24 (1997)).
El determinante antigénico puede ser el factor 1 derivado del estroma (SDF-1), ahora denominado CXCL12. CXCL12 es una quimioquina producida por células estromáticas de médula ósea y fue identificada originalmente como factor estimulador para las células pre-B.
Como ya se ha establecido antes, se ha demostrado que los receptores de quimioquinas CCR7 y CXCR4 están regulados al alza en células de cáncer de mama y que CCL21 y SDF-1, los respectivos ligandos, son altamente expresados en órganos que representan los primeros destinos de las metástasis del cáncer de mama (Müller et al. (Nature 410: 50-6 (2001)). La quimiotaxis mediada por SDF-1/CXCR4 in vitro pudo se inhibida por anticuerpos anti-SDF-1 y anti-CXCR4 neutralizadores.
En un modelo de metástasis de cáncer de mama en ratones SCID utilizando la línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231 humana, se observó un significativo descenso de las metástasis en pulmón cuando los ratones eran tratados con anticuerpos anti-CXCR4. En el drenaje de los nódulos linfáticos se observó una reducción de las metástasis de los nódulos linfáticos inguinales y axilares (38% en lugar de 100% de metástasis en los controles). De este modo, la inmunización frente a CXCL12 proporciona un modo de tratamiento contra las metástasis de los cánceres, más específicamente de los cánceres de mama.
Se ha demostrado que el par quimioquina-receptor SDF-1/CXCR4 incrementa la eficacia de la búsqueda dirigida de células progenitoras hematopoyéticas más primitivas para que sean médula ósea. Además, se supone que CXCR4 y SDF-1 influyen en la distribución de células en la leucemia linfocítica crónica. Estas células infiltran invariablemente la médula ósea de pacientes y se demostró que su migración en la médula ósea era dependiente de CXCR4. Las células de leucemia linfocítica crónica experimentan apoptosis a menos que sean cultivadas simultáneamente con células estromáticas. Los anticuerpos bloqueadores de SDF-1 podían inhibir este efecto protector de las células estromáticas (Burger et al., Blood 96: 2655-63 (2000)). La inmunización frente a CXCL12 proporciona así un modo de tratamiento contra la leucemia linfocítica crónica.
Se ha demostrado que CXCR4 es un co-receptor para la entrada del VIH a las células T. SDF-1 inhibe la infección de las células CD4+ por las cepas X4 de HIV (dependiente de CXCR4) (Oberlin et al., Nature 382:833-5 (1996); Bleul et al., Nature 382:829-33 (1996), Rusconi et al., Antivir. Ther. 5:199-204 (2000)). Se ha demostrado que los análogos peptídicos sintéticos de SDF-1 inhiben eficazmente la entrada del VIH-1 y la infección por medio del receptor CXCR4 (publicación WO059928A1). De este modo, la inmunización contra CXCL12 proporciona un modo de bloquear la entrada del VIH en las células T, y por lo tanto un modo de tratar el SIDA.
También se informó de que las interacciones SDF-1-CXCR4 jugaban un papel central en la acumulación de células T CD4+ en sinovium en la artritis reumatoide (Nanki et al., 2000). La inmunización contra SDF-1 proporciona así un modo de tratamiento contra la artritis reumatoide.
Se sabe que el SDF-1 humano y murino se originan de dos formas, SDF-1\alpha y SDF-1\beta, por un empalme diferencial a partir de un único gen. Difieren en cuatro aminoácidos C-terminales que están presentes en el SDF-1\beta (74 aa) y ausentes en el SDF-1\alpha (70 aa). La secuencia humana se muestra en el SEQ ID NO: 238 (Swissprot: SDF1_humano) y la secuencia del SDF-1 de ratón se muestra en el SEQ ID NO: 239 (Swissprot: SDF1_ratón). El SDF-1 contiene cuatro cisteínas conservadas que forman dos enlaces disulfuro intra-moleculares. La estructura cristalina del SDF muestra un dímero unido no covalentemente (Dealwis et al., PNAS 95: 6941-46 (1998)). La estructura del SDF-1 también muestra una larga prolongación N-terminal.
Se utilizó la mutagénesis de barrido con alanina para identificar (parte de) el sitio de unión al receptor de SDF-1 (Ohnishi et al., J. Interferon Cytokine Res. 20: 691-700 (2000)) y Elisseeva et al. (J. Biol. Chem. 275:26799-805 (2000)) y Heveker et al. (Curr. Biol. 8:369-76 (1998)) describieron los péptidos derivados de SDF-1 que inhiben la unión al receptor (y la entrada del VIH).
A continuación, se describen los constructos y sistemas de expresión adecuados para la generación de las composiciones relacionadas con SDF-1. Los extremos N y C de SDF-1 están expuestos al disolvente. De este modo un conector aminoacídico que contiene una cisteína como segundo sitio de anclaje puede ser fusionada al extremo C de la secuencia de la proteína, mientras en otros casos se fusiona al extremo N de la secuencia de la proteína un conector aminoacídico que contiene cisteína como segundo sitio de anclaje. El conector aminoacídico que contiene una cisteína libre se fusiona al extremo N de la secuencia correspondiente a la secuencia de la proteína procesada, o se inserta en el extremo N de la secuencia de la forma madura de la proteína, en posición C-terminal con respecto al péptido señal. Los genes que codifican estos constructos específicos pueden ser clonados en un vector de expresión
adecuado.
Se ha descrito la expresión de SDF-1 en un sistema de virus sendai en fibroblastos embrionarios de pollo (Moriya et al., FEBS Lett. 425:105-11 (1998)) así como la expresión en E. coli (Holmes et al., Prot. Expr. Purif. 21: 367-77 (2001)) y la síntesis química de SDF-1 (Dealwis et al., PNAS 95: 6941-46 (2001)).
El determinante antigénico puede ser el BLC. El quimioatrayente de linfocitos B (BLC, CXCL13) es expresado en el bazo, las placas de Peyer y los nódulos linfáticos (Gunn et al., 1998). Su expresión más fuerte es en los centros germinales, donde las células B experimentan mutación somática y maduración de la afinidad. Pertenece a la familia de quimioquinas CXC, y su homólogo más próximo es GRO\alpha (Gunn et al., Nature 391:799-803 (1998)). El BLC humano es homólogo en un 64% al BLC murino. Su receptor es CXCR5. BLC también comparte homología con IL-8. BLC recluta células B para los folículos de los órganos linfoides secundarios tales como el bazo y las placas de Peyer. El BLC también es requerido para el reclutamiento de células B hacia el compartimiento de los nódulos linfáticos ricos en células Dendríticas foliculares (FDC) (Ansel et al., Nature 406:309-314 (2000)). El BLC también induce un aumento de la expresión de la Linfotoxina \alpha1\beta2 (LT?\alpha1\beta2) en las células B reclutadas. Esto proporciona un bucle de retroalimentación positivo, puesto que LT?\alpha1\beta2 promueve la expresión de BLC (Ansel et al., Nature 406:309-314 (2000)). También se ha demostrado que BLC es capaz de inducir la neogénesis linfoide (Luther et al., Immunity 12:471-481 (2000)). Parece que las FDC también expresan el BLC. De este modo la inmunización contra BLC puede proporcionar un modo de tratamiento contra enfermedades autoinmunitarias en las que está implicada la neogénesis linfoide, tales como la Sinovitis reumatoide, y la Artritis reumatoide o la diabetes de Tipo I. Se ha descrito un constructo de BLC que porta una etiqueta his C-terminal, y es funcional (Ansel, K.M. et al., J. Exp. Med 190: 1123-1134 (1999)).
De este modo, la composición puede comprende un conector que contiene un resto cisteína como segundo sitio de anclaje y que está fusionado al extremo C de la secuencia de BLC.
En IL-8, que es homóloga a BLC, ambos extremos N y C están libres. Se puede realizar la adición de un conector aminoacídico que contiene un resto cisteína como segundo sitio de anclaje, por lo tanto, en el extremo N de BLC para la generación de esta composición específica de la invención.
La composición puede comprender un conector aminoacídico que contiene una cisteína libre y que es fusionado al extremo N de la secuencia correspondiente a la secuencia de la proteína procesada, o insertado en el extremo N de la secuencia de la forma madura de la proteína, en posición C-terminal con respecto al péptido señal. Los genes que codifican estos constructos específicos pueden ser clonados en un vector de expresión adecuado y por consiguiente expresados. La secuencia del BLC humano se muestra en el SEQ ID NO: 240 (Acceso: NP_006410). Los aminoácidos 1-22 de la secuencia son el péptido señal. La secuencia de ratón se muestra en el SEQ ID NO: 241 (Acceso NP_061354). Los aminoácidos 1-21 son el péptido señal. Las composiciones con BLC como determinante antigénico, preferiblemente, utilizan la forma madura de la proteína para generar las composiciones.
El determinante antigénico puede ser Eotaxina. La eotaxina es una quimioquina específica para el receptor 3 de Quimioquinas, presente en los eosinófilos, basófilos y células Th2. No obstante la eotaxina parece ser altamente específica para los Eosinófilos (Zimmerman et al., J. Immunol. 165: 5839-46 (2000)). La emigración de eosinófilos es reducida en un 70% en ratones con el gen de la eotaxina-1 inactivado, que sin embargo todavía pueden desarrollar eosinofilia (Rothenberg et al., J. Exp. Med 185: 785-90 (1997)). IL-5 parece ser responsable de la migración de eosinófilos desde la médula ósea a la sangre, y la Eotaxina de la migración local en el tejido (Humbles et al., J. Exp. Med. 186: 601-12 (1997)).
El genoma humano contiene 3 genes de eotaxina, eotaxinas 1-3. Estos comparten una homología del 30% entre sí. Hasta ahora se conocen dos genes en ratón: eotaxina 1 y eotaxina 2 (Zimmerman et al., J. Immunol. 165: 5839-46 (2000)). Estos comparten una homología del 38%. La eotaxina-2 murina comparte una homología del 59% con la eotaxina-2 humana. En el ratón, la eotaxina-1 parece ser expresada ubícuamente en el tracto gastro-intestinal, mientras la eotaxina-2 parece ser expresada predominantemente en el yeyuno (Zimmerman et al., J. Immunol. 165: 5839-46 (2000)). La eotaxina-I está presente en el fluido bronco-alveolar (Teixeira et al., J. Clin. Invest. 100: 1657-66 (1997)). La secuencia de la eotaxina-1 humana se muestra en el SEQ ID NO: 242 (aa 1-23 corresponden al péptido señal), la secuencia de la eotaxina-2 humana se muestra en el SEQ ID NO: 243 (aa 1-26 corresponden al péptido señal), la secuencia de la eotaxina-3 humana se muestra en el SEQ ID NO: 244 (aa 1-23 corresponden al péptido señal), la secuencia de la eotaxina-1 de ratón se muestra en el SEQ ID NO: 245 (aa 1-23 corresponden al péptido señal), y la secuencia de la eotaxina-2 de ratón se muestra en el SEQ ID NO: 246 (aa 1-23 corresponden al péptido señal).
La eotaxina tiene un PM de 8,3 kDa. Está en equilibrio entre monómeros y dímeros a lo largo de una amplia gama de condiciones, con una Kd estimada de 1,3 mM a 37ºC (Crump et al., J. Biol. Chem. 273: 22471-9 (1998)). La forma monomérica sin embargo es predominante. La estructura de la Eotaxina ha sido averiguada mediante espectroscopía de RMN. El sitio de unión a su receptor CCR3 está en el extremo N, y la región precedente a la primera cisteína es crucial (Crump et al., J. Biol. Chem. 273: 22471-9 (1998)). Los péptidos de receptores de quimioquinas unidos a la Eotaxina confirmaron este descubrimiento. La Eotaxina tiene cuatro cisteínas que forman dos puentes disulfuro. Por lo tanto, la composición puede comprender un conector aminoacídico que contiene un resto cisteína como segundo sitio de anclaje y que está, preferiblemente, fusionado al extremo C de la secuencia de la Eotaxina. Se puede fusionar un conector aminoacídico que contiene una cisteína libre al extremo N de la secuencia correspondiente a la secuencia de la proteína procesada, o insertar en el extremo N de la secuencia de la forma madura de la proteína, en posición C terminal con respecto al péptido señal. Los genes que codifican estos constructos específicos son clonados en un vector de expresión adecuado.
La Eotaxina puede ser sintetizada químicamente (Clark-Lewis et al., Biochemistry 30:3128-3135 (1991)). También se ha descrito la expresión en E. coli para la Eotaxina-1, en el citoplasma (Crump et al., J. Biol. Chem. 273: 22471-9 (1998)). Se han descrito la expresión en E. coli en forma de cuerpos de inclusión con el subsiguiente replegamiento (Mayer et al., Biochemistry 39: 8382-95 (2000)), y la expresión en células de Insecto (Forssmann et al., J. Exp. Med 185: 2171-6 (1997)) para la Eotaxina-2, y pueden ser, por otra parte, utilizadas.
El determinante antigénico puede ser un factor estimulador de la colonias de Macrófagos (M-CSF o CSF-1). El M-CSF o CSF-1 es un regulador de la proliferación, diferenciación y supervivencia de los macrófagos y sus progenitores en la médula ósea. El receptor para M-CSF es un receptor tirosina quinasa de la superficie celular, codificado por el protooncogen cfms. Se ha asociado una expresión elevada de M-CSF y su receptor con una escasa prognosis en diversos cánceres epiteliales tales como el cáncer de mama, útero y ovario. Se ha estudiado el progreso tumoral en una cepa de ratón resultante del cruce de un ratón transgénico susceptible al cáncer de mama (PyMT) con un ratón que contiene una mutación nula recesiva en el gen csf-1. Estos ratones muestran un carcinoma invasivo de fase tardía invasiva atenuada y metástasis pulmonar en comparación con el ratón PyMT (Lin et al., J. Exp. Med. 193:727-739 (2001)). La causa parece ser la ausencia del reclutamiento de macrófagos hacia los tejidos neoplásicos. El crecimiento subcutáneo del cáncer de pulmón de Lewis también resulta deterioriado en ratones con el gen csf.1 anulado. Se postula que el mecanismo de potenciación por macrófagos del crecimiento tumoral sería a través de factores angiogénicos, factores de crecimiento y proteasas producidos por los macrófagos.
Los datos estructurales de la forma soluble de M-CSF se encuentran disponibles (estructura cristalina: Pandit et al., Science 258:1358-62 (1992)), y demuestran que los extremos tanto N como C de la proteína son accesibles. Sin embargo, el extremo N está cerca del sitio de interacción con el receptor. Además, el M-CSF está presente tanto en forma soluble como en la superficie celular, donde la región transmembrana está en su extremo C. Por lo tanto, la composición puede comprender un conector aminoacídico que contiene una cisteína que se añade, preferiblemente, al extremo C de M-CSF o sus fragmentos, o preferiblemente al extremo C de la forma soluble de M-CSF. El conector aminoacídico que contiene una cisteína libre puede ser fusionado al extremo N de la secuencia correspondiente a la secuencia de la proteína procesada o de la forma soluble de la proteína, o insertado en el extremo N de la secuencia de la forma madura de la proteína o de la forma soluble de la proteína, en posición C-terminal con respecto al péptido señal. El M-CSF es un dímero, en el que dos monómeros están unidos por un puente disulfuro intercatenario.
Se ha descrito un sistema de expresión en E. coli para un fragmento de 149 aminoácidos N-terminal (funcional) de M-CSF (Koths et al., Mol. Reprod. Dev. 46:31-37 (1997)). Este fragmento de M-CSF, preferiblemente modificado como se ha esbozado antes, representa un determinante antigénico.
La secuencia humana se muestra en el SEQ ID NO: 247 (Acceso: NP_000748). Los determinantes antigénicos adicionales comprenden el fragmento N-terminal de los restos 33-181 o 33-185 del SEQ ID NO: 247, correspondiente a la forma soluble del receptor.
La secuencia de ratón (Acceso. NP_031804) se muestra en el ID de secuencia NO: 248. La secuencia madura empieza en el aminoácido 33. De este modo, un determinante antigénico comprende los aminoácidos 33-181 o 33-185.
El determinante antigénico puede ser Resistina (Res). Se realizaron estudios de inmunización pasiva con anticuerpos policlonales de conejo generados contra una proteína de fusión de Resistina de conejo (mRes) fusionada con GST, expresada en bacterias. Esta inmunización pasiva condujo a una mejora de la absorción de glucosa en un modelo animal de obesidad/diabetes de Tipo II (Steppan et al., Nature 409: 307-12 (2001)).
La resistina (Res) es una hormona peptídica de 114 aa de aproximadamente 12 KD. Contiene 11 cisteínas de las cuales se demostró que la más N-terminal era responsable de la dimerización de la proteína y las otras 10 se cree que están implicadas en enlaces disulfuro intramoleculares (Banerjee y Lazar, J. Biol. Chem. 276: 25970-3 (2001)). La mutación de la primera cisteína por alanina anula la dimerización de mRes.
Se demostró, que mRes con una etiqueta FLAG en su extremo C sigue siendo activa en un modelo animal (Steppan et al., Nature 409: 307-12 (2001)), de un modo similar se demostró que la versión de resistina con una etiqueta HA C-terminal (etiqueta de Hemaglutinina) era activa en un análisis de cultivo de tejidos (Kim et al., J. Biol. Chem. 276: 11252-6 (2001)), sugiriendo que el extremo C no era muy sensible a las modificaciones introducidas. De este modo, la composición puede comprender un conector aminoacídico que contiene un resto cisteína como segundo sitio de anclaje y que está fusionado al extremo C de la secuencia de la resistina. El conector aminoacídico que contiene una cisteína libre puede ser fusionado al extremo N de la secuencia correspondiente a la secuencia de la proteína procesada, o insertado en el extremo N de la secuencia de la forma madura de la proteína, en posición C-terminal con respecto al péptido señal.
También se pueden expresar MRes o huRes como moléculas de fusión con Fc con un sitio de escisión de proteasa insertado entre la Resistina y la porción Fc del constructo, preferiblemente en posición C-terminal con respecto a uno o más restos cisteína de la región bisagra de la porción Fc de la proteína de fusión en un sistema de expresión eucariótico, o más preferiblemente de acuerdo con las descripciones y revelaciones del Ejemplo 2. La escisión de la proteína de fusión libera una Resistina que comprende adicionalmente un conector aminoacídico que contiene un resto cisteína como se describe en el Ejemplo 2, o parte o toda la región bisagra de la porción Fc de la proteína de fusión que comprende un resto cisteína en su extremo C, que es adecuado para el acoplamiento a VLP o Pili. La secuencia de la Resistina humana se muestra en el SEQ ID NO: 249 (Acceso AF323081). La secuencia de ratón se muestra en el SEQ ID NO: 250 (Acceso AF323080). La proteína resistina humana puede ser fusionada en su extremo C a un conector aminoacídico que contiene un resto cisteína. El constructo de resistina humana puede ser generado de acuerdo con las enseñanzas descritas en el Ejemplo 2, y comparando las secuencias de Resistina murina y humana en un alineamiento de secuencias de proteínas para identificar la porción de la secuencia de la Resistina humana que se va a clonar en los vectores descritos en el Ejemplo 1 y el Ejemplo 2 de acuerdo con las enseñanzas del Ejemplo 2, o en otros vectores de expresión adecuados. Los ejemplos de los constructos de resistina humana adecuada para generar las composiciones de la invención son la resistina humana-C-Xa: (SEQ ID NO: 325), resistina humana-C-EK: (SEQ ID NO: 326) y resistina humana-C: (SEQ ID NO: 327).
La vacunación contra la Resistina utilizando las composiciones anteriormente mencionadas puede proporcionar así un modo de tratamiento de la Diabetes de Tipo II y la obesidad.
El determinante antigénico puede ser la Linfotoxina-\beta. La inmunización contra la linfotoxina-\beta puede ser útil en el tratamiento de las enfermedades mediadas por priones. Se cree que el agente de replicación del Scrapie (una enfermedad mediada por priones) tiene lugar principalmente en tejidos linfoides y se demostró que dependía de una proteína priónica que expresaba células dendríticas foliculares (FDC) (Brown et al., Nature Med. 11: 1308-1312 (1999)). Con posterioridad se demostró que los ratones que carecen de células dendríticas foliculares funcionales muestran una replicación de priones deteriorada en bazos y un retraso (pequeño) en la neuroinvasión (Montrasio et al., Science 288: 1257-1259 (2000)). Esto se logró inyectando en ratones una proteína de fusión de receptor de linfotoxina-\beta-Fc soluble (LT\betaR-Fc). Este constructo de receptor soluble inhibe el desarrollo de FDC interfiriendo en la interacción crucial de la linfotoxina-\beta de las células T, B o NK con el receptor de linfotoxina-\beta de las células precursoras de FDC. Así, la vacunación contra la linfotoxina-\beta (también denominada TNF\gamma) puede proporcionar una vacuna para el tratamiento o la prevención de la enfermedad de Creutzfeld-Jakob (forma variante) u otras enfermedades mediadas por priones y prevenir de este modo la replicación y neuroinvasión de priones.
La inmunización contra la Linfotoxina-\beta también puede proporcionar un modo de tratamiento de la diabetes. La expresión transgénica de la proteína de fusión LT\betaR-Fc soluble en ratones diabéticos no obesos NOD bloqueó el desarrollo de la diabetes pero no la insulitis (Ettinger et al., J. Exp. Med. 193: 1333-40 K (2001)). Wu et al. (J. Exp. Med. 193: 1327-32 (2001)) también utilizaron ratones NOD para estudiar la implicación de la linfotoxina-\beta, pero en lugar de animales transgénicos inyectaron la proteína de fusión LT\betaR-Fc. Observaron una fuerte inhibición del desarrollo de la diabetes y la inhibición de la insulitis. Muy interesantemente, pudieron incluso revertir la insulitis pre-existente mediante el tratamiento con la proteína de fusión. En el páncreas la formación de estructuras foliculares linfoides pudo ser revertida de este modo. La vacunación contra la linfotoxina-\beta puede proporcionar así un modo de tratamiento contra la diabetes de tipo I.
La secuencia del dominio extracelular de la linfotoxina-\beta humana se muestra en el SEQ ID NO: 250 (TNFC_huma-
na) y la secuencia del dominio extracelular de la linfotoxina-\beta murina se muestra en el SEQ ID NO: 251 (TNFC_ratón).
La composición puede comprender un conector aminoacídico que contiene una cisteína libre y que es añadida en extremo N de la secuencia correspondiente a la forma procesada de la linfotoxina-\beta, o insertada entre el extremo N de la secuencia correspondiente a la forma madura de la proteína, y el péptido señal, en posición C-terminal con respecto al péptido señal. La porción extracelular de la linfotoxina-\beta puede ser expresada como una proteína de fusión con Glutationa-S-transferasa, fusionada N-terminalmente a la linfotoxina-\beta, o con una etiqueta de 6 histidinas seguido de una etiqueta myc, fusionada de nuevo N-terminalmente a la porción extracelular de la linfotoxina-\beta. Se fusionan un espaciador de aminoácido que contiene un sito de escisión de proteasa así como una secuencia conectora que contiene una cisteína libre como sitio de anclaje, en posición C-terminal con respecto al sitio de escisión de la proteasa, al extremo N de la secuencia de la porción extracelular de la linfotoxina-\beta. Preferiblemente, la porción extracelular de la linfotoxina-\beta consiste en fragmentos que corresponden a los aminoácidos 49-306 o 126-306 de la linfotoxina-\beta. Estas composiciones específicas se pueden clonar y expresar en el vector eucariótico pCEP-Pu. Las composiciones pueden comprender un conector aminoacídico que contiene un resto cisteína libre adecuado como segundo sitio de anclaje, y que está fusionado al extremo C de la linfotoxina-\beta o fragmentos de la linfotoxina-\beta. En particular, la secuencia de aminoácidos LACGG, que comprende el conector aminoacídico ACGG que contiene a su vez un resto cisteína para el acoplamiento a VLP y Pili puede ser fusionada al extremo N de la porción extracelular de la linfotoxina-\beta: o de un fragmento de la porción extracelular de la linfotoxina-\beta, produciendo las proteínas C-LT\bullet _{49-306} humana (SEQ ID NO: 346) y C-LT\bullet _{126-306} humana (SEQ ID NO: 347) después de la escisión con la enteroquinasa de las correspondientes proteínas de fusión expresadas en el vector pCEP-SP-GST-EK o el vector pCP-SP-his-myc-EK como se describe en el Ejemplo 3.
El antígeno o determinante antigénico puede ser una proteína priónica, sus fragmentos y en particular péptidos de la proteína priónica. La proteína priónica puede ser la proteína priónica humana. Las pautas sobre cómo modificar la proteína priónica humana para su asociación con la partícula cpre se proporcionan en toda la solicitud y en particular en el Ejemplo 7. Se han descrito constructos de la proteína priónica de ratón, y también se pueden generar constructos de proteína priónica humana y tienen, por ejemplo, la secuencia del SEQ ID NO: 348. Los constructos adicionales comprenden la secuencia de la proteína priónica humana completa, y otros fragmentos de la proteína priónica humana, que son adicionalmente la composición. La inmunización contra la proteína priónica puede proporcionar un modo de tratamiento o prevención de la enfermedad de Creutzfeld-Jakob (forma variante) u otras enfermedades mediadas por priones. La inmunización utilizando las composiciones que comprenden la proteína priónica puede proporcionar un modo de tratamiento de las enfermedades mediadas por priones en otros animales, y las correspondientes secuencias de constructos de proteínas priónicas bovinas y de oveja se dan en el SEQ ID NO: 349 y el SEQ ID NO: 350, respectivamente. Los péptidos de la proteína priónica humana correspondientes a los péptidos murinos descritos en el Ejemplo 8, y con la secuencia de aminoácidos CSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHR ("cprplong humano") y CGSDYBDRYYRENMHR ("cprpshort humano") conducen a las composiciones. Estos péptidos comprenden un resto cisteína N-terminal añadido para el acoplamiento a VLP y Pili. Los correspondientes péptidos bovinos y de oveja son CSAMSRPLIHFGNDYEDRYYRENMHR ("cprplong bovino") y CONDYEDRYYRENMHR ("cprpshort bovino") CSAMSRPLIHFFGNDYEDRYYRENMYR ("cprplong de oveja") y CGNDYEDRYYRENMYR ("cprpshort de oveja").
El determinante antigénico puede ser el factor de necrosis tumoral \alpha (TNF-\alpha), sus fragmento o péptidos de TNF-\alpha. En particular, se pueden utilizar péptidos o fragmentos de TNF-\alpha para inducir una respuesta auto-inmunitaria específica dirigida a la proteína total inmunizando a un ser humano o un animal con vacunas y composiciones, respectivamente, que comprenden tales péptidos o fragmentos. Preferiblemente, se utilizan VLP, bacteriófagos o pili bacterianos como partícula núcleo, a la cual se anclan TNF-\alpha, péptidos o sus fragmentos.
Los siguientes péptidos murinos son los homólogos murinos de los péptidos humanos que se ha demostrado que son unidos por los anticuerpos que neutralizan la actividad del TNF-\alpha (Yone et al. J. Biol. Chem.270: 19509-19515) y fueron modificados con restos cisteína para el acoplamiento a VLP, bacteriófagos o pili bacterianos.
Péptido MuTNFa: se añadió la secuencia CGG al extremo N del epítopo que consiste en los restos aminoácido 22-32 del TNF-\alpha murino maduro: CGGVEEQLEWLSQR.
Péptido 3'TNF II: se fusionó la secuencia GGC al extremo C del epítopo que consiste en los restos aminoácido 4-22 del TNF-\alpha murino maduro y la glutamina 21 se mutó a glicina. La secuencia del péptido resultante es: SSQNSSDKPVAHWANHGVGGC.
Péptido 5'TNF II: se fusionó una cisteína al extremo N del epítopo que consistía en los restos aminoácido 4-22 del TNF-\alpha murino maduro y se mutó la glutamina 21 a glicina. La secuencia del péptido resultante es: CSSQNSSDKPVAHVVANHGV.
La secuencia humana correspondiente del epítopo 4-22 es SSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQ. Como para la secuencia murina, se fusiona preferiblemente una cisteína al extremo N del epítopo, o se fusiona la secuencia GGC al extremo C del epítopo para el acoplamiento covalente a VLP, bacteriófagos o pili bacterianos de acuerdo con la invención.
Se pueden fusionar otras secuencias que contienen cisteína a los extremos N o C de los epítopos. En general, se insertan preferiblemente uno o dos restos glicina entre el resto cisteína añadido y la secuencia del epítopo. Sin embargo, también se pueden insertar otros aminoácidos en lugar de restos glicina, y estos restos aminoácido serán preferiblemente aminoácidos pequeños tales como serina.
La secuencia humana correspondiente a los restos aminoácido 22-32 es QLQWLNRRANA. Preferiblemente, la secuencia CGG es fusionada al extremo N del epítopo para el acoplamiento covalente a VLP o pili bacterianos. Otros epítopos de TNF-\alpha han sido descritos y son revelados por ejemplo por Yone et al. (J. Biol. Chem.270: 19509-
19515).
La descripción incluye adicionalmente composiciones que contienen mimotopos de los antígenos o determinantes antigénicos descritos en la presente memoria.
La composición puede comprender un anticuerpo o preferiblemente un fragmento de anticuerpo presentado en una partícula de tipo virus o pilus para la inducción de una respuesta inmunitaria contra dicho anticuerpo. Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que son producidos por las células de linfoma, pueden ser seleccionados para el anclaje a la partícula de tipo virus y la inmunización, con el fin de inducir una respuesta inmunitaria protectora contra el linfoma.
Se puede anclar a la partícula un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que imita a un antígeno. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo imitador puede ser generado mediante inmunización y posterior aislamiento del anticuerpo o fragmento de anticuerpo imitador mediante cualquier método conocido en la técnica tal como p. ej. la tecnología de los hibridomas (Gherardi, E. et al., J. Immunol. Methods 126: 61-68 (1990)), la presentación en fagos (Harrison et al., Methods Enzymol. 267: 83-109 (1996)), la presentación en ribosomas (Hanes, J. et al., Nat. Biotechnol. 18: 1287-1292 (2000), el doble híbrido de levadura (Visintin, M. et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 96: 11723-11728 (1999)), la presentación en la superficie de levadura (Boder, ET. & Wittrup, KD. Methods. Enzym. 328: 430-444 (2000)), presentación en la superficie bacteriana (Daugherty, PS. et al., Protein Eng. 12: 613-621 (1999)). El anticuerpo imitador también puede ser aislado de una genoteca de anticuerpos o una genoteca de anticuerpos no sometidos a tratamiento previo utilizando los métodos conocidos en la técnica tales como los métodos mencionados antes, por ejemplo.
Se puede utilizar un anticuerpo que reconoce el sitio de combinación de otro anticuerpo, esto es un anticuerpo anti-idiotípico, adicionalmente denominado anticuerpo inmunizador. El anticuerpo reconocido por el anticuerpo anti-idiotípico será referido adicionalmente como anticuerpo neutralizador. De este modo, mediante la inmunización contra el anticuerpo anti-idiotípico, se generan moléculas con la especificidad del anticuerpo neutralizador in situ; los autores de la presente invención se refieren a estos anticuerpos generados como anticuerpos inducidos. El anticuerpo inmunizador se puede seleccionar para que interaccione con una molécula de ligando de la molécula diana contra la cual se pretende la inmunización. La molécula de ligando puede ser cualquier molécula que interaccione con la molécula diana, pero preferentemente interaccionará con el sitio de la molécula diana contra la cual se deben generar los anticuerpos para la inhibición de su función. La molécula de ligando puede ser un ligando natural de la molécula diana, o puede ser cualquier ligando construido mediante ingeniería genética, diseñado o aislado que tenga propiedades de unión adecuadas.
Los anticuerpos inmunizantes pueden ser de origen humano, tales como los aislados de genotecas de anticuerpos humanos no sometidos a tratamiento o inmunitarios, o pueden haber sido aislados de una genoteca generada a partir de otra fuente animal, por ejemplo de origen murino.
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El acoplamiento del anticuerpo o fragmento de anticuerpo a la VLP o al pilus se logra mediante la reducción limitada de los puentes disulfuro expuestos (por ejemplo del puente disulfuro intercatenario entre CH1 y C\kappa o C\lambda en un fragmento Fab) o mediante la fusión de un conector que contiene un resto cisteína libre en el extremo C del anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En una realización adicional, se fusiona un conector que contiene un resto cisteína libre con el extremo N del anticuerpo o fragmento de anticuerpo para el anclaje a una VLP o una proteína de pilus.
Numerosas composiciones para vacuna que emplean mimotopos son conocidas en la técnica, como lo son los métodos para generar e identificar mimotopos de epítopos concretos. Por ejemplo, Arnon et al., Immunology 101:555-562 (2000) describen vacunas basadas en péptidos de mimotopos contra Schistosoma mansoni. Los mimotopos utilizados en estas vacunas fueron obtenidos escrutando una genoteca de péptidos al azar de 8 unidades en fase sólida para identificar los mimotopos de un epítopo reconocido por un anticuerpo monoclonal protector contra Schistosoma mansoni. De un modo similar, Olszewska et al., Virology 272:98-105 (2000) describen la identificación de péptidos sintéticos que imitan un epítopo de la proteína de fusión con el virus del sarampión y el uso de estos péptidos para la inmunización de ratones. Además, Zuercher et al., Eur. J. Immunol. 30:128-135 (2000) describen composiciones y métodos para la inmunización oral anti-IgE utilizando un fago de presentación del epítopo. En particular, se emplean bacteriófagos M13 de presentación de epítopos como portadores para una vacuna oral anti-IgE. Las composiciones para vacuna sometidas a ensayo contienen mimotopos y epítopos del anticuerpo monoclonal anti-IgE
BSW17.
La descripción incluye de este modo composiciones para vacuna que contienen mimotopos que logran respuestas inmunológicas contra antígenos concretos, así como productos conjugados de mimotopo individual/partícula núcleo y productos conjugados de mimotopo individual/armazón molecular no natural que constituyen estas vacunas, y el uso de estas composiciones para vacuna para lograr respuestas inmunológicas contra antígenos o determinantes antigénicos específicos. Los mimotopos también pueden ser polipéptidos, tales como anticuerpos anti-idiotípicos. Por lo tanto, el antígeno o determinante antigénico puede ser un anticuerpo anti-idiotípico o un fragmento de anticuerpo anti-idiotípico.
La descripción incluye adicionalmente composiciones que contienen mimotopos de los antígenos o determinantes antigénicos descritos en la presente memoria.
Los mimotopos de los antígenos concretos pueden ser generados e identificados mediante cualquiera de numerosos métodos incluyendo el escrutinio de genotecas de presentación en fagos de péptidos al azar (véase, p. ej., la Publicación PCT Núm. WO 97/31948).
El escrutinio de tales genotecas se realizará a menudo para identificar péptidos que se unen a uno o más anticuerpos que tienen especificidad para un antígeno concreto.
Los mimotopos adecuados para su uso en composiciones para vacuna pueden ser péptidos lineales o circulares. Los mimotopos que son péptidos lineales o circulares pueden ser conectados a armazones moleculares no naturales o partículas núcleo por un enlace que no es un enlace peptídico.
Como se ha sugerido antes, se han identificado numerosos mimotopos y epítopos de IgE humana que logran respuestas inmunológicas contra las moléculas de IgE humana. (Véase, p. ej., Publicación PCT Núm. WO 97/31948). De este modo, en ciertos casos las composiciones para vacuna incluyen composiciones que logran una respuesta inmunológica contra moléculas de inmunoglobulina (p. ej., moléculas de IgE).
Los péptidos que se pueden utilizar para lograr tales respuestas inmunológicas incluyen proteínas, subunidades de proteínas, dominios de moléculas de IgE, y mimotopos que son capaces de lograr la producción de anticuerpos que tienen especificidad para las moléculas de IgE. Generalmente, las porciones de moléculas de IgE utilizadas para preparar composiciones para vacuna derivarán de moléculas de IgE de las especies de las cuales se va a administrar la composición. Por ejemplo, una composición para vacuna destinada a la administración a seres humanos contendrá a menudo una o más porciones de la molécula de IgE humana, y/o uno o más mimotopos que son capaces de lograr respuestas inmunológicas contra las moléculas de IgE humanas.
En realizaciones específicas, las composiciones para vacuna destinadas a la administración a seres humanos contendrán al menos una porción de la región constante de la cadena pesada de la IgE mostrada en el SEQ ID NO: 176; Núm. de Acceso AAB59424 (SEQ ID NO: 176). En realizaciones más específicas, los péptidos de IgE utilizados para preparar las composiciones para vacuna comprenden, o alternativamente consisten en, péptidos que tienen las siguientes secuencias de aminoácidos: CGGVNLTWSRASG (SEQ ID NO:178).
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Las composiciones para vacuna pueden contener al menos un mimotopo que es capaz de lograr una respuesta inmunitaria que da como resultado la producción de anticuerpos que tienen especificidad para un antígeno concreto. Los ejemplos de los mimotopos de IgE adecuados para su uso en la preparación de composiciones para vacuna incluyen péptidos que tienen las siguientes secuencias de aminoácidos:
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C. Preparación de las Partículas para Vacuna Alfa
La descripción proporciona composiciones y métodos novedosos para la construcción de matrices de antígenos ordenadas y repetitivas. Como sabrá un experto en la técnica, las condiciones para el ensamblaje de la matriz de antígeno ordenada y repetitiva dependen en gran parte de la elección específica del primer sitio de anclaje del armazón molecular no natural y de la elección específica del segundo sitio de anclaje del antígeno o determinante antigénico. De este modo, la elección por el práctico del diseño de la composición (esto es, la selección del primer y segundo sitios de anclaje, del antígeno y del armazón molecular no natural) determinará las condiciones específicas para el ensamblaje de la partícula para Vacuna Alfa (la matriz de antígeno ordenada y repetitiva y el armazón molecular no natural combinados). La información referente al ensamblaje de la partícula de Vacuna Alfa está dentro del conocimiento de trabajo del práctico, y existen numerosas referencias para ayudar al práctico (p. ej., Sambrook, J. et al., eds., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel, F. et al., eds., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John H. Wiley & Sons, Inc. (1997); Celis, J., ed., CELL BIOLGY, Academic Press, 2ª edición, (1998); Harlow, E. y Calle, D., "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988), todas las cuales se incorporan en la presente memoria como referencia.
Los dominios proteicos de la cremallera de leucina JUN y FOS pueden ser utilizados para el primer y segundo sitios de anclaje de la invención, respectivamente. En la preparación de las partículas de Vacuna Alfa, el antígeno debe ser producido y purificado en condiciones que promuevan el ensamblaje de la matriz de antígeno ordenada y repetitiva sobre el armazón molecular no natural. En la realización concreta de los dominios de la proteína de leucina JUN/FOS, el antígeno FOS o el determinante antigénico FOS deben ser tratados con un agente reductor (p. ej., Ditiotreitol (DTT)) para reducir o eliminar la incidencia de formación de enlaces disulfuro (Ejemplo 15).
Para la preparación del armazón molecular no natural (esto es, el virus Sinbis recombinante) de la realización del dominio proteico de la cremallera de leucina JUN/FOS, las partículas virales E2-JUN recombinantes deben ser concentradas, neutralizadas y tratadas con agente reductor (véase el Ejemplo 16).
El ensamblaje de la matriz de antígeno ordenada y repetitiva en la realización de JUN/FOS se realiza en presencia de una transferencia rédox. Las partículas virales E2-JUN se combinan con un exceso molar de 240 veces de antígeno FOS o determinante antigénico FOS durante 10 horas a 4ºC. Con posterioridad, la partícula de Vacuna Alfa se concentra y se purifica mediante cromatografía (Ejemplo 16).
El acoplamiento del armazón molecular no natural al antígeno o determinante antigénico se puede completar mediante entrecruzamiento químico. El agente químico puede ser un agente de entrecruzamiento heterobifuncional tal como éster N-hidroxisuccinimídico de ácido \varepsilon-maleimidocaproico (Tanimori et al., J. Pharm. Dyn. 4:812 (1981); Fujiwara et al., J. Immunol Meth. 45:195 (1981)), que contiene (1) un grupo succinimido reactivo con grupos amino y (2) un grupo maleimido reactivo con grupos SH. Una proteína o un polipéptido heterólogo del primer sitio de anclaje pueden ser diseñados para que contenga uno o más restos lisina que servirán como radical reactivo para la porción succinimida del agente de entrecruzamiento heterobifuncional. Una vez acoplado químicamente a los restos lisina de la proteína heteróloga, el grupo maleimida del agente de entrecruzamiento heterobifuncional estará disponible para reaccionar con el grupo SH de un resto cisteína del antígeno o determinante antigénico. La preparación de antígeno o determinante antigénico en este caso puede requerir el diseño de un resto cisteína en la proteína o polipéptido seleccionado como segundo sitio de anclaje de manera que pueda reaccionar con la funcionalidad maleimida libre del agente de entrecruzamiento unido a los primeros sitios de anclaje del armazón molecular no natural. De este modo, en tal caso, el agente de entrecruzamiento heterobifuncional se une a un primer sitio de anclaje del armazón molecular no natural y conecta el armazón a un segundo sitio de unión del antígeno o determinante antigénico.
3. Composiciones, Vacunas, y su Administración, y Métodos de Tratamiento
La invención proporciona composiciones para vacuna que se pueden utilizar para prevenir y/o atenuar enfermedades o afecciones como las definidas en las reivindicaciones. La invención proporciona adicionalmente métodos de vacunación para prevenir y/o atenuar enfermedades o afecciones en individuos como las definidas en las reivindicaciones.
Se describen vacunas para la prevención de enfermedades infecciosas en una amplia gama de especies, concretamente especies de mamíferos tales como seres humanos, monos, vacas, perros, gatos, cerdos, etc. Las vacunas pueden ser diseñadas para tratar infecciones de etiología viral tales como VIH, influenza, Herpes, hepatitis viral, Epstein Bar, polio, encefalitis viral, sarampión, viruela de los pollos, etc.; o infecciones de etiología bacteriana tales como neumonía, tuberculosis, sífilis, etc.; o infecciones de etiología parasítica tales como malaria, tripanosomiasis, leishmaniasis, tricomoniasis, amebiasis, etc.
Asimismo se describen vacunas para la prevención del cáncer en una amplia gama de especies, concretamente especies de mamíferos tales como seres humanos, monos, vacas, perros, gatos, caballos, cerdos, etc. Se pueden diseñar vacunas para tratar todos los tipos de cánceres: linfomas, carcinomas, sarcomas, melanomas, etc.
Las composiciones se pueden utilizar en el diseño de vacunas para el tratamiento de las alergias. Los anticuerpos del isotipo IgE son componentes importantes en las reacciones alérgicas. Los mastocitos se unen a los anticuerpos IgE en su superficie y liberan histaminas y otros mediadores de la respuesta alérgica tras la unión del antígeno específico a las moléculas de IgE unidas a la superficie del mastocito. La inhibición de la producción de anticuerpos IgE, por lo tanto, es una diana prometedora para proteger frente a las alergias. Esto debe ser posible alcanzando una respuesta de las células T coadyuvantes deseada. Las respuestas de las células T coadyuvantes se pueden dividir en respuestas de las células T coadyuvantes de tipo 1 (T_{H}1) y de tipo 2 (T_{H}2) (Romagnani, Immunol. Today 18:263-266 (1997)). Las células T_{H}1 secretan interferón-gama y otras citoquinas que desencadenan la producción de anticuerpos IgG1-3 por las células B. En contraste, una citoquina crítica producida por las células T_{H}2 es la IL-4, que conducía a las células B a producir IgG4 e IgE. En muchos sistemas experimentales, el desarrollo de respuestas T_{H}1 y T_{H}2 es mutuamente excluyente puesto que las células T_{H}1 suprimen la inducción de las células T_{H}2 y viceversa. De este modo, los antígenos que desencadenan una fuerte respuesta T_{H}1 suprimen simultáneamente el desarrollo de respuestas T_{H}2 y por lo tanto la producción de anticuerpos IgE. Interesantemente, virtualmente todos los virus inducen una respuesta T_{H}1 en el anfitrión y fracasan al desencadenar la producción de anticuerpos IgE (Coutelier et al., J. Exp. Med. 165:64-69 (1987)). Este patrón de isotipo no está restringido a los virus vivos si no que también se puede observar para partículas virales inactivadas o recombinantes (Lo-Man et al., Eur. J. Immunol. 28:1401-1407 (1998)). De este modo, utilizando los procedimientos descritos (p. ej., Tecnología de Vacuna Alfa), se pueden decorar las partículas virales con diversos alergenos y utilizarlas para la inmunización. Debido a la "estructura viral" resultante del alergeno, se puede lograr una respuesta T_{H}1, se producirán anticuerpos IgG1-3 "protectores", y se evitarán la producción de anticuerpos IgE que ocasionan las reacciones alérgicas. Puesto que el alergeno es presentado por las partículas virales que son reconocidas por un grupo diferente de células T coadyuvantes que el propio alergeno, es probable que los anticuerpos IgG1-3 específicos del alergeno sean inducidos incluso en individuos alérgicos que albergan células T_{H}2 pre-existentes específicas para el alergeno. La presencia de elevadas concentraciones de anticuerpos IgG puede evitar la unión de los alergenos al mastocito unido a IgE, inhibiendo de ese modo la liberación de histamina. Así, la presencia de anticuerpos IgG puede proteger de las reacciones alérgicas mediadas por IgE. Las sustancias típicas que causan alergias incluyen: los pólenes de gramíneas, ambrosía, abedul o cedro de montaña, polvo doméstico, ácaros, caspas animales, moho, veneno de insectos o fármacos (p. ej., penicilina). De este modo, la inmunización de los individuos con partículas virales decoradas con alergenos debe ser beneficiosa no solamente antes sino también después del comienzo de las alergias.
Se describen métodos para evitar y/o atenuar enfermedades o afecciones que están causadas o son exacerbadas por productos "auto"génicos (p. ej., factores de necrosis tumoral), esto es "autoantígenos" según se utiliza en la presente memoria, así como métodos para inducir respuestas inmunológicas en individuos que conducen a la producción de anticuerpos que evitan y/o atenúan enfermedades o afecciones causadas o exacerbadas por los productos "auto"génicos. Los ejemplos de tales enfermedades o afecciones incluyen la enfermedad injerto contra anfitrión, las reacciones alérgicas mediadas por IgE, la anafilaxis, el síndrome de la fatiga respiratoria en adultos, la enfermedad de Crohn, el asma alérgica, la leucemia linfoblástica aguda (LLA), el linfoma no Hodgkin (LNH), la enfermedad de Graves, las enfermedades autoinmunitarias inflamatorias, la miastenia gravis, el lupus eritematoso generalizado (LEG), linfadenopatía por enfermedad inmunoproliferativa (LEI), linfadenopatía angioinmunoproliferativa (LAI), linfadenopatía inmunoblástica (LIB), artritis reumatoide, diabetes, esclerosis múltiple, osteoporosis y enfermedad de Alzheimer.
Como comprenderá un experto en la técnica, cuando se administran las composiciones de la invención a un individuo, éstas pueden estar en una composición que contiene sales, tampones, coadyuvantes u otras sustancias que son deseables para mejorar la eficacia de la composición. Los ejemplos de los materiales adecuados para su uso en la preparación de composiciones farmacéuticas se proporcionan en numerosas fuentes incluyendo REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Osol, A, ed, Mack Publishing Co., (1990)).
Se dice que las composiciones de la invención son "farmacéuticamente aceptables" si su administración puede ser tolerada por un individuo receptor. Adicionalmente, las composiciones de la invención se administrarán en una "cantidad terapéuticamente eficaz" (esto es, en una cantidad que produce un efecto fisiológico deseado).
Las composiciones de la presente invención se pueden administrar mediante diversos métodos conocidos en la técnica, pero normalmente se administrarán mediante inyección, infusión intravenosa, inhalación, administración oral, u otros métodos físicos adecuados. Las composiciones se pueden administrar alternativamente intramuscularmente, intravenosamente, o subcutáneamente. Los componentes de las composiciones para la administración incluyen soluciones y suspensiones acuosas (p. ej., solución salina fisiológica) o no acuosas estériles. Los ejemplos de los disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Se pueden utilizar portadores o apósitos oclusivos para incrementar la permeabilidad de la piel y potenciar la absorción del antígeno.
Las enfermedades mediadas por priones representan una amenaza creciente para la sociedad. Específicamente, la EEB inducida por priones en el ganado representa una enfermedad que ha sido menospreciada durante mucho tiempo y puede afectar a un gran número de animales en toda Europa. Por otra parte, una forma variante de la ECJ es atribuida a la infección de humanos tras el consumo de carne de ganado infectado con priones. Aunque el número de personas afectadas ha sido relativamente bajo, parece posible que la enfermedad se convierta en epidémica. Sin embargo, la prognosis a largo plazo para el desarrollo de la ECJv puede ser particularmente difícil, puesto que los tiempos de incubación entre la infección y la evidencia de la enfermedad son muy largos (una estimación de 10 años).
Los priones son proteínas celulares que existen en la mayoría de las especies de mamíferos. Las proteínas priónicas existen en dos formas, una forma plegada normalmente que usualmente está presente en individuos sanos (PrP^{c}) y una forma plegada erróneamente que causa la enfermedad (Prp^{Sc}). La hipótesis actual sobre los priones postula que la forma priónica plegada erróneamente Prp^{Sc} puede catalizar el replegamiento del prión sano PrP^{c} a la forma causante de la enfermedad Prp^{Sc} (A. Aguzzi, Haematologica 85, 3-10 (2000)). En algunos casos raros, esta transición también puede ocurrir espontáneamente, causando la ECJ clásica en seres humanos. Algunas mutaciones en PrP^{c} están asociadas con un incremento de esta transición espontánea, causando las diversas formas de ECJ familiar. Sin embargo, Prp^{Sc} también puede ser infecciosa y puede ser transmitida mediante transfusión sanguínea o por medio de la cadena alimentaria. La última forma de enfermedad mediada por priones es conocida como Kuru Kuru y suele aparecer en caníbales humanos. No obstante, puesto que las especies que se alimentan de sus propios individuos no son abundantes, esta forma de enfermedad transmitida oralmente es demasiado rara para estar documentada para otras especies.
La alimentación masiva de vacas con productos cárnicos en toda Europa ha cambiado ahora la situación y el número de vacas infectadas con una forma transmisible de Prp^{Sc} causante de EEB, ha aumentado espectacularmente en los últimos años, afectando a cientos de miles de vacas. Esta aparición repentina de un número masivo de vacas infectadas con EEB ha causado el gran temor en la población humana de que una enfermedad similar pueda ser inducida en seres humanos. De hecho, 1996, se informó sobre el primer caso de una forma variante de la ECJ que pudo ser atribuida al consumo de carne de ternera infectada con Prp^{Sc}. Hasta ahora, este temor ha aumentado más, puesto que el número de seres humanos infectados ha aumentado constantemente durante los últimos años y no hay una perspectiva de curación. Por otra parte, puesto que las ovejas sucumben a una enfermedad mediada por priones denominada prurito lumbar y puesto que otras especies de mamíferos pueden ser infectadas por Prp^{Sc}.
Experimentalmente, es posible que se puedan producir enfermedades de tipo EEB en otras especies. El mecanismo de transmisión de priones ha sido estudiado con gran detalle. Ahora está claro que los priones primero se replican en los órganos linfoides de ratones infectados y con posterioridad se transportan al sistema nervioso central. Las células dendríticas foliculares (FDC), una población de células raras en los órganos linfoides, parecen ser esenciales tanto para la replicación de las proteínas priónicas en los órganos linfoides como para el transporte al sistema nervioso central (S. Brandner, M. A. Klein, A. Aguzzi, Transfus Clin Biol 6, 17-23 (1999); F. Montrasio, et al., Science 288, 1257-9 (2000)). Las FDC son un tipo de células poco estudiadas pero no está claro que dependan de la producción de linfotoxina y/o TNF por las células B para su desarrollo (F. Mackay, J. L. Browning, Nature 395, 26-27 (1998)). De hecho, los ratones carentes de linfotoxina no muestran FDC (M. S. Matsumoto, et al., Science 264, 703-707 (1996)). Por otra parte, no logran ser infectados productivamente con priones y no sucumben a la enfermedad. Además de las FDC, los anticuerpos también pueden jugar un papel en el progreso de la enfermedad (S. Brandner, M. A. Klein, A. Aguzzi, Transfus Clin Biol 6, 17-23 (1999)).
Recientemente, se demostró que el bloqueo de la ruta de LTb utilizando una molécula de fusión del receptor de Ltb con Fc no solamente elimina las FDC en ratones sino que también bloquea la infección con PrP^{Sc} (F. Montrasio, et al., Science 288, 1257-9 (2000), De este modo, una vacuna que induzca anticuerpos específicos para LTb o su receptor puede ser capaz de bloquear la transmisión de PrP^{Sc} de un individuo a otro o de la periferia al sistema nervioso central.
No obstante, normalmente es difícil, si no imposible, inducir respuestas de anticuerpos a auto-moléculas mediante vacunación convencional. Un modo de mejorar la eficacia de la vacunación consiste en incrementar el grado de repetitividad del antígeno aplicado: a diferencia de las proteínas aisladas, los virus inducen respuestas inmunitarias rápidas y eficaces en ausencia de cualquier coadyuvante tanto con como sin ayuda de las células T (Bachmann & Zinkemagel, Ann. Rev. Immunol: 15:235-270 (1991)). Aunque los virus a menudo consisten en pocas proteínas, son capaces de desencadenar respuestas inmunitarias mucho más fuertes que sus componentes aislados. Para las respuestas de las células B, se sabe que un factor crucial para la inmunogenicidad de los virus es la repetitividad y el orden de los epítopos de superficie. Muchos virus muestran una superficie casi cristalina que presenta una matriz de epítopos regular que se entrecruza eficazmente con inmunoglobulinas específicas del epítopo sobre las células B (Bachmann & Zinkernagel, Immunol. Today 17:553-558 (1996)). Este entrecruzamiento de las inmunoglobulinas de la superficie de las células T es una señal de activación fuerte que induce directamente el progreso del ciclo celular y la producción de anticuerpos IgM. Adicionalmente, tales células B movilizadas son capaces de activar las células T coadyuvantes, que a su vez inducen un cambio de producción de anticuerpos IgM a IgG en las células B y la generación de la memoria de las células B de vida larga - objetivo de cualquier vacunación (Bachmann & Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol. 15:235-270 (1997)). La estructura viral está unida incluso a la generación de anti-anticuerpos en las enfermedades autoinmunitarias y como parte de la respuesta natural a patógenos (véase Fehr, T., et al., J Exp. Med. 185:1785-1792 (1997)). De este modo, los anticuerpos presentados por una superficie viral altamente organizada son capaces de inducir respuestas anti-anticuerpos fuertes.
Normalmente el sistema inmunitario no logra producir anticuerpos contra las estructuras auto-derivadas. Para los antígenos solubles presentes a bajas concentraciones, esto es debido a la tolerancia a nivel de las células Th. En estas condiciones, el acoplamiento del auto-antígeno a un portador que puede liberar la ayuda T puede romper la tolerancia. Para las proteínas solubles presentes a elevadas concentraciones o las proteínas de membrana a una baja concentración, las células B y Th pueden ser tolerantes. Sin embargo, la tolerancia de las células B puede ser reversible (anergia) y se puede romper mediante la administración del antígeno de una manera altamente organizada acoplada a un portador foráneo (Bachmann & Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol. 15:235-270 (1997). De este modo, LTb, LTa o el receptor LTb tan altamente organizadas como un virus, una partícula de tipo virus o un pilus bacteriano pueden ser capaces de romper la tolerancia de las células B e inducir anticuerpos específicos para estas moléculas.
En la presente memoria se describe un método que facilita la inducción de anticuerpos específicos para la linfotoxina (LT)b, LTa o receptor de LTb endógenos, un procedimiento para producir un antígeno o determinante antigénico que es capaz de lograr anticuerpos específicos para LTb, LTa o receptor de LTb que es útil para la prevención y la terapia de las enfermedades mediadas por priones tales como la enfermedad de Creutzfeld-Jacob variante (ECJv) o la encefalopatía espongiforme bovina (EEB) y la eliminación de estructuras de tipo órgano linfoide en los tejidos con enfermedad autoinmunitaria, y una vacuna que es capaz de inducir anticuerpos específicos para LTb, LTa o receptor eliminando de ese modo las FDC de los órganos linfoides. Este tratamiento puede prevenir la infección con PrP^{Sc} o la diseminación de PrP^{Sc} desde el sistema nervioso periférico al central. Además, este tratamiento bloquea la generación de estructuras de tipo órganos linfoides en órganos elegidos como diana por la enfermedad autoinmunitaria y puede incluso disolver tales estructuras existentes, aliviando los síntomas de la enfermedad.
La LTb, LTa o receptor de LTb o sus fragmentos se acoplan a un portador de proteína que es foráneo para el anfitrión. La LTb, la LTa o el receptor de LTb o sus fragmentos pueden ser acoplados a una estructura altamente organizada con el fin de volver estas moléculas altamente repetitivas y organizadas. La estructura altamente organizada puede ser un pilus bacteriano, una partícula de tipo virus (VLP) generada por proteínas recombinantes del bacteriófago Q\beta, proteínas recombinantes de Rotavirus, proteínas recombinantes de virus de Norwalk, proteínas recombinantes de Alfavirus, proteínas recombinantes del virus de la Fiebre Aftosa, proteínas recombinantes de Retrovirus, proteínas recombinantes del virus de la Hepatitis B, proteínas recombinantes el virus del mosaico del Tabaco, proteínas recombinantes del Virus Flock House, y proteínas recombinantes del virus del Papiloma humano. Con el fin de optimizar la disposición tridimensional de LTb, LTa o receptor de LTb o sus fragmentos en la estructura altamente organizada, se introduce un sitio de anclaje, tal como un aminoácido químicamente reactivo, en la estructura altamente organizada (a menos que se encuentre allí naturalmente) y se introduce un sitio de unión, tal como un aminoácido químicamente reactivo, en LTb, LTa o receptor de LTb o sus fragmentos (a menos que se encuentre allí naturalmente). La presencia de un sitio de anclaje en la estructura altamente organizada y un sitio de unión en LTb, LTa o receptor de LTb o sus fragmentos permitirá acoplar estas moléculas a esta estructura repetitiva de una manera orientada y ordenada que es esencial para la inducción de respuestas eficientes de las células B.
En una realización igualmente preferida, el sitio de anclaje introducido en la estructura repetitiva es biotina que se une específicamente a estreptavidina. La biotina puede ser introducida mediante modificación química. La LTb, la LTa o el receptor de LTb o sus fragmentos pueden ser fusionados o conectados a extreptavidina y unidos a la estructura repetitiva biotinilada.
Otras realizaciones de la invención incluyen procedimientos para la producción de las composiciones de la invención y métodos de tratamiento médico que utilizan dichas composiciones. Se debe entender que tanto la descripción general como la siguiente descripción detallada son ilustrativas y explicativas solamente y se pretende que proporcionen una explicación adicional de la invención reivindicada.
Además de las tecnologías para vacunas, otras realizaciones de la invención aprovechan los métodos de tratamiento médico de la enfermedad de Alzheimer.
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Ejemplo
Las enzimas y reactivos utilizados en los siguientes experimentos incluyeron: ADN ligasa de T4 obtenida de New England Biolabs; ADN Polimerasa Taq, QIAprep Spin Plasmid Kit, QIAGEN Plasmid Midi Kit, QiaExII Gel Extraction Kit, QIAquick PCR Purification Kit obtenidos de QIAGEN; QuickPrep Micro mRNA Purification Kit obtenido de Pharmacia; SuperScript One-step RT PCR Kit, suero de ternera fetal (FCS), bacto-triptona y extracto de levadura obtenidos de Gibco BRL; Oligonucleótidos obtenidos de Microsynth (Suiza); endonucleasas de restricción obtenidas de Boehringer Manhheim, New England Biolabs o MBI Fermentas; polimerasa Pwo y dNTP obtenidos de Boehringer Mannheim. El medio HP-1 se obtuvo de Cell Culture Technologies (Glattbrugg, Suiza). Todos los productos químicos normalizados se obtuvieron de Fluka-Sigma-Aldrich, y todos los materiales de cultivo celular se obtuvieron de TPP.
Las manipulaciones del ADN se llevaron a cabo utilizando técnicas normalizadas. El ADN se preparó de acuerdo con las instrucciones del fabricante o bien a partir de un cultivo bacteriano de 2 ml utilizando QIAprep Spin Plasmid Kit o bien a partir de un cultivo de 50 ml utilizando QIAGEN Plasmid Midi Kit. Para la enzima de restricción, el ADN se incubó al menos 2 horas con la enzima de restricción apropiada a una concentración de 5-10 unidades (U) de enzima por mg de ADN en las condiciones recomendadas por el fabricante (tampón y temperatura). Los productos digeridos con más de una enzima se elaboraron simultáneamente si las condiciones de reacción fueron apropiadas para todas las enzimas, si no consecutivamente. Los fragmentos de ADN aislados para las manipulaciones adicionales se separaron mediante electroforesis en un gel de agarosa del 0,7 al 1,5%, se separaron por corte del gen y se purificaron con QiaExII Gel Extraction Kit de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Para la ligación de los fragmentos de ADN, se incubaron de 100 a 200 pg de ADN vector purificado durante la noche con un exceso molar de tres veces el fragmento de inserto a 16ºC en presencia de 1 U de ADN ligasa de T4 en el tampón proporcionado por el fabricante (volumen total: 10-20 \mul). Se utilizó una alícuota (0,1 a 0,5 \mul) de la reacción de ligación para la transformación de E. coli XL1-Blue (Stratagene). La transformación se realizó mediante electroporación utilizando un Gene Pulser (BioRAD) y Cubetas para Gene Pulser de 0,1 cm (BioRAD) a 200 Ohm, 25 \muF, 1,7 kV. Después de la electroporación, las células se incubaron con sacudimiento durante 1 h en 1 ml de medio S.O.B. (Miller, 1972) antes de cultivar en placa sobre agar S.O.B. selectivo.
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Ejemplo 1
Sistema de expresión eucariótico modular para el acoplamiento de antígenos a VLP
Este sistema se generó con el fin de añadir diversas secuencias conectoras de aminoácidos que contenían restos cisteína a antígenos para el acoplamiento químico a VLP.
A. Construcción de un sistema de expresión derivado de EBNA que codifica un conector aminoacídico que contiene cisteína y Fc-Tag escindible
Se digirió pCep-Pu (Wuttke et al. J. Biol. Chem. 276: 36839-4.8 (2001)) con Kpn I y Bam HI y se introdujo un nuevo sitio de clonación múltiple con los oligonucleótidos hibridados PH37 (SEQ ID NO:270) y PH38 (SEQ ID NO:271) que condujeron a pCep-MCS.
Se generó un sistema modular que contenía una cisteína libre flanqueada por numerosas glicinas, un sitio de escisión para proteasa y la región constante de la IgG1 humana como sigue. Se digirió pSec2/Hygro B (Invitrogen Cat. No. V910-20) con Bsp120I y Hind III y se ligó con los oligonucleótidos hibridados SU7 (SEQ ID NO:278) y SU8 (SEQ ID NO:279) que condujeron al constructo pSec-B-MCS. Después se digirió pSec-B-MCS con Nhe I y Hind III y se ligó con los oligonucleótidos hibridados PH29 (SEQ m NO:264) y PH30 (SEQ ID NO:265) que condujeron al constructo pSec 29/30. El constructo pSec-FL-EK-Fc* se generó mediante la ligación de tres fragmentos de los siguientes fragmentos; primero se digirió pSec 29/30 con Eco RI y Hind III, los oligonucleótidos hibridados PH31 (SEQ ID NO:266) y PH32 (SEQ ID NO. 267) y el fragmento Bgl I/EcoRI de un plásmido (pSP-Fc*-Cl) que contenía una versión modificada de la región constante de la IgG1 humana (para los detalles de la secuencia de la IgG1 hu véase la secuencia del constructo final pCep-Xa-Fc* véase la Fig. 1A-1C). La secuencia completa de pCep-Xa-Fc* se proporciona en el SEQ ID NO: 283. El constructo resultante se denominó pSec-FL-EK-Fc*. A partir de este plásmido se separó por corte la región conectora y la porción Fc de la IgG1 humana mediante digestión con Nhe I, Pme I y se clonó en pCep-MCS digerido con Nhe I y Pme I que condujeron al constructo pCep-FL-EK-Fc*. De este modo se creó un vector modular en el que la secuencia conectora y el sitio de escisión de la proteasa, que están localizados entre los sitios Nhe I y Hind III, pueden ser fácilmente intercambiados por oligonucleótidos hibridados. Para la generación de los vectores de la proteína de fusión escindible se digirió pCep-FL-EK-Fc* con Nhe I y Hind III y se introdujo el sitio de escisión Factor Xa flanqueado N-terminalmente por los oligonucleótidos hibridados GGGGCG PH35 (SEQ ID NO:268) y PH36 (SEQ ID NO:269) y se introdujo el sitio de la enteroquinasa flanqueado N-terminalmente por GGGGCG con los oligonucleótidos hibridados PH39 (SEQ ID NO:272) y PH40 (SEQ ID NO:273) que condujeron a los constructos pCep-Xa-Fc* (véase la Fig. 1A) y pCep-EK-Fc* (véase Fig. 1B) respectivamente. El constructo pCep-SP-EK-Fc* (véase Fig. 1C) que contiene además un péptido señal eucariótico fue generado mediante ligación de tres fragmentos eucarióticos de pCep-EK-Fc* digerido con Kpn I/Bam HI, los oligos PH41 (SEQ ID NO: 274) y PH42 (SEQ ID NO: 275) hibridados y los oligos PH43 (SEQ ID NO: 276) y PH44 (SEQ ID NO: 277) hibridados.
B. Producción a Gran Escala de proteínas de fusión
Para la producción a gran escala de las diferentes proteínas de fusión, se transfectaron células 293-EBNA (Invitrogen) con los diferentes plásmidos de expresión pCep con reactivo Lipofectamine 2000 (Life Technologies) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. A las 24-36 h de la transfección las células fueron divididas a una razón 1 a 3 bajo selección con puromicina (1 \mug/ml) en DMEM con un suplemento de FCS al 10%. Las células resistentes se expandieron en medio selectivo. Para la recolección de las proteínas de fusión se hicieron pasar las poblaciones de células resistentes por placas recubiertas con poli-L-lisina. Una vez que las células hubieron alcanzado la confluencia, se lavaron dos veces con PBS y se añadió medio sin suero (DMEM) a las placas. El sobrenadante del cultivo de tejidos se recogió cada 2 a 4 días y se remplazó por medio DMEM de nueva aportación durante un período de hasta un mes. Los sobrenadantes cosechados se mantuvieron a 4ºC.
C. Purificación de las proteínas de fusión
Las proteínas de fusión con Fc recombinantes se purificaron mediante cromatografía de afinidad utilizando proteína A Sefarosa CL-4B (Amersham Pharmacia Biotech AG). En resumen las columnas para la cromatografía se cargaron con 1-3 ml de resina con proteína A y los sobrenadantes del cultivo de tejidos que contenían las proteínas recombinantes se aplicaron a la columna con una bomba peristáltica a una velocidad de flujo de 0,5 - 1,5 ml/min. La columna se lavó después con 20-50 ml de PBS. Dependiendo de la proteína de fusión se realizó la escisión con la proteasa sobre la columna o se hizo eluir la proteína como se describe más abajo. Las proteínas de fusión recombinantes se hicieron eluir con un tampón citrato/fosfato (pH 3,8) con un suplemento de NaCl 150 mM y las fracciones que contenían la proteína se reunieron y se concentraron con filtros de centrífuga Ultrafree (Millipore).
D. Escisión con proteasa de las proteínas de fusión recombinantes (Factor Xa, enteroquinasa)
Las proteínas de fusión recombinantes eluidas que contenían el sitio de escisión de la enteroquinasa (EK) se escindieron utilizando el sistema EKmax (Invitrogen) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La porción Fc escindida de la proteína de fusión fue separada mediante incubación con proteína A. La enteroquinasa se separó después con el sistema EK-Away (Invitrogen) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. De un modo similar las proteínas de fusión que contenían en sitio de escisión para el factor Xa (Xa) fueron escindidas utilizando la escisión con la proteasa de restricción factor Xa y el kit de separación (Roche) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La porción Fc escindida fue separada mediante incubación con la proteína A y la proteasa se separó con la resina con estreptavidina proporcionada con el kit.
Las diferentes proteínas de fusión se concentraron con filtros de centrífuga Ultrafree (Millipore), se cuantificaron mediante espectrometría y se utilizaron para las subsiguientes reacciones de acoplamiento.
La Fig. 1A-1C muestra secuencias parciales de los diferentes vectores de expresión eucarióticos utilizados. Solamente se muestran las secuencias modificadas.
La Fig 1A: pCep-Xa-Fc*: se muestra la secuencia desde el sitio Bam HI hacia adelante y e muestran las diferentes características encima de la secuencia traducida. La flecha indica el sitio de escisión de la proteasa factor Xa.
La Fig 1B: pCep-EK-Fc*: se muestra la secuencia desde el sitio Bam HI hacia adelante y se muestran las diferentes características encima de la secuencia traducida. La flecha indica el sitio de escisión de la enteroquinasa. La secuencia aguas abajo del sitio Hind III es idéntica a la mostrada en la Fig 1A.
La Fig. 1C: pCep-SP-EK-Fc*: se muestra la secuencia desde el principio del péptido señal hacia adelante y se muestran las diferentes características encima de la secuencia traducida. La secuencia del péptido señal que es escindido por la peptidasa señal se muestra en negrita. La flecha indica el sitio de escisión de la enteroquinasa. La secuencia aguas abajo del sitio Hind III es idéntica a la mostrada en la Fig 1A.
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Ejemplo 2
Expresión eucariótica y acoplamiento de resistina de ratón a VLP y Pili A. Clonación de Resistina de ratón
Se aisló el ARN total de 60 mg de tejido adiposo de ratón utilizando un kit Qiagen RNeasy de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El ARN se hizo eluir en 40 \mul de H_{2}O. Este ARN total se utilizó después para la transcripción inversa con un cebador oligo dT utilizando el ThermoScript® RT-PCR System (Life Technologies) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La muestra se incubó a 50ºC durante 1 hora, se calentó a 85ºC durante 5 minutos y se trató durante 20 minutos a 37ºC con ARNasa H.
Se utilizaron 2 \mul de la reacción RT para la amplificación mediante PCR de resistina de ratón. La PCR se realizó utilizando Platinium TAQ (Life Technologies) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante utilizando los cebadores PH19 (SEQ ID NO: 260) y PH20 (SEQ ID NO: 261). El cebador PH19 (SEQ ID NO: 260) corresponde a las posiciones 58-77 y el cebador PH20 (SEQ ID NO: 261) a las posiciones 454-435 de la secuencia de Resistina de ratón. La mezcla de PCR se desnaturalizó primero a 94ºC durante 2 minutos y después se realizaron 35 ciclos como sigue: 30 segundos 94ºC, 30 segundos 56ºC y 1 minuto 72ºC, al final las muestras se dejaron durante 10 minutos a 72ºC. El fragmento de la PCR se purificó y se subclonó mediante clonación de TA en el vector pGEMTeasy (Invitrogen) que condujo a pGEMT-mRes. Con el fin de añadir los sitios de restricción apropiados se realizó una segunda PCR sobre pGEMT-mRes con los cebadores PH21 (SEQ ID NO: 262) y PH22 (SEQ ID NO: 263) utilizando el mismo programa de ciclación descrito antes. El cebador directo (PH21 (SEQ ID NO: 262)) contiene un sitio Bam HI y los nucleótidos 81-102 de la secuencia de Resistina de ratón. El cebador inverso (PH22 (SEQ ID NO: 263)) contiene un sitio Xba I y los nucleótidos 426-406 de la secuencia de Resistina de ratón. Las posiciones indicadas hacen referencia a la secuencia de resistina de ratón Núm. de Acceso Gene AF323080. El producto de la PCR se purificó y se digirió con Bam HI y Xba I y se subclonó en pcmv-Fc*-C1 digerido con Bam HI y Xba I conduciendo al constructo pcmv-mRes-Fc*.
Se separó por corte el marco de lectura abierto de la Resistina de pcmv-Res-Fc* mediante digestión con Bam HI/Xba I y se clonó en pCep-Xa-Fc* y pCep-EK-Fc* (véase el Ejemplo 1, sección B) digerido con Bam HI y Nhe I conduciendo a los constructos pCep-mRes-Xa-Fc* y pCep-mRes-EK-Fc* respectivamente.
B. Producción, purificación y escisión de Resistina
Después se utilizaron los constructos pCep-mRes-Xa-Fc* y pCep-mRes-EK-Fc* para transfectar células 293-EBNA para la producción de proteínas recombinantes como se describe en el Ejemplo 1, sección B. Los sobrenadantes del cultivo de tejidos se purificaron como se describe en el Ejemplo 1, sección C. Las proteínas purificadas se escindieron después como se describe en el Ejemplo 1, sección D. Las proteínas recombinantes resultantes se denominaron "resistina-C-Xa" o "Res-C-Xa" y "resistina-C-EK" o "Res-C-EK" de acuerdo con el vector utilizado (véase Fig. 2A y Fig. 2B).
La Fig. 2A y Fig. 2B muestran la secuencia de proteínas de Resistina de ratón recombinantes utilizadas para la expresión y el acoplamiento adicional. Res-C-Xa (Fig. 2A) y Res-C-EK (Fig. 2B) se muestran como secuencias de ADN traducidas. La secuencia señal de resistina que es escindida tras la secreción de la proteína por la peptidasa señal se muestra en cursiva. Las secuencias de aminoácidos que resultan de la escisión con la peptidasa señal y la proteasa específica (factor Xa o enteroquinasa) se muestran en negrita. Las secuencias en negrita corresponden a la secuencia de proteínas real que se utilizó para el acoplamiento, esto es el SEQ ID NO: 280, el SEQ ID NO: 281, el SEQ ID NO: 282 corresponden a un constructo de proteína resistina alternativo, que se puede utilizar para el acoplamiento a partículas de tipo virus y pili de acuerdo con la invención.
C. Acoplamiento de resistina-C-Xa y resistina-C-EK a la proteína de la cápside de Q\beta
Una solución de 0,2 ml de 2 mg/ml de proteína de la cápside de Q\beta en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,4 se hizo reaccionar durante 30 minutos con 5,6 \mul de una solución de SMPH 100 mM (Pierce) en DMSO a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se sometió a diálisis con posterioridad dos veces durante 2 horas frente a 1 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a 4ºC. Después se hicieron reaccionar 8 \mul de la mezcla de reacción de Q\beta sometida a diálisis con 32 \mul de solución de resistina-C-Xa (dando como resultado una concentración final de resistina de 0,39 mg/ml) y 13 \mul de la mezcla de reacción de Q\beta se hicieron reaccionar con 27 \mul de solución de resistina-C-EK (dando como resultado una concentración final de resistina de 0,67 mg/ml) durante cuatro horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. Los productos del acoplamiento se analizaron mediante SDS-PAGE (véase la Fig. 2C). Se encuentra presente una banda adicional de 24 kDa en la reacción de acoplamiento, pero no en la de Q\beta derivatizada y resistina, respectivamente. El tamaño de 24 kDa corresponde al tamaño esperado de 24 kDa para el producto acoplado (14 kDa para Q\beta más 10 kDa para la resistina-C-Xa y la resistina-C-EK, respectivamente).
La Fig. 2C muestra los resultados del acoplamiento de resistina-C-Xa y resistina-C-EK a Q\beta. Los productos del acoplamiento se analizaron en geles de SDS-PAGE al 16% en condiciones reductoras. Calle 1: Marcador de peso molecular. Calle 2: resistina-C-EK antes del acoplamiento. Calle 3: resistina-C-EK- Q\beta después del acoplamiento. Calle 4: Q\beta derivatizada. Calle 5: resistina-C-Xa antes del acoplamiento. Calle 6: resistina-C-Xa- Q\beta después del acoplamiento. Los pesos moleculares de las proteínas marcadoras se proporcionan en el margen izquierdo. La banda acoplada se indica por medio de una flecha.
D. Acoplamiento de resistina-C-Xa y resistina-C-EK la proteína de la cápside de fr
Una solución de 0,2 ml de 2 mg/ml de proteína de la cápside de fr en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,4 se hace reaccionar durante 30 minutos con 5,6 \mul de una solución de SMPH 100 mM (Pierce) en DMSO a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se somete con posterioridad a diálisis dos veces durante 2 horas frente a 1 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a 4ºC. Después se hacen reaccionar 8 \mul de la mezcla de reacción de la proteína de la cápside de fr sometida a diálisis con 32 \mul de solución de resistina-C-Xa (dando como resultado una concentración final de resistina de 0,39 mg/ml) y se hacen reaccionar 13 \mul de la mezcla de reacción de proteína de la cápside de fr con 27 \mul de solución de resistina-C-EK (dando como resultado una concentración final de resistina de 0,67 mg/ml) durante cuatro horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. Los productos del acoplamiento se analizan mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras.
E. Acoplamiento de resistina-C-Xa y resistina-C-EK a HBcAg-Lys-2cys-Mut
Se hace reaccionar una solución de 0,2 ml de 2 mg/ml de HBcAg-Lys-2cys-Mut en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,2 durante 30 minutos con 5,6 \mul de una solución de SMPH 100 mM (Pierce) en DMSO a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se somete e diálisis con posterioridad dos veces durante 2 horas frente a 1 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. Después se hacen reaccionar 8 \mul de la mezcla de reacción de HBcAg-Lys-2cys-Mut sometida a diálisis con 32 \mul de solución de resistina-C-Xa y se hacen reaccionar 13 \mul de la mezcla de reacción de HBcAg-Lys-2cys-Mut con 27 \mul de solución de resistina-C-EK durante cuatro horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. Los productos del acoplamiento se analizan mediante SDS-PAGE.
F. Acoplamiento de resistina-C-Xa y resistina-C-EK a Pili
Una solución de 400 \mul de 2,5 mg/ml de pili de Tipo 1 de E. coli en Hepes 20 mM, pH 7,4, se hace reaccionar durante 60 minutos con un exceso molar de 50-veces de entrecruzador SMPH diluido a partir de una solución de partida en DMSO (Pierce) a la RT en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La mezcla de reacción se somete después a eliminación de las sales en una columna PD-10 (Amersham-Pharmacia Biotech). Las fracciones que contienen la proteína que eluyen de la columna se reúnen, y se hacen reaccionar 8 \mul de la proteína de pili derivatizada de la que se han eliminado las sales con 32 \mul de solución de resistina-C-Xa y se hacen reaccionar 13 \mul de la proteína de pili derivatizada de la que se han eliminado las sales con 27 \mul de solución de resistina-C-EK durante cuatro horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. Los productos del acoplamiento se analizan mediante SDS-PAGE.
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Ejemplo 3
A. Introducción de conectores que contienen cys, expresión y purificación de linfotoxina-\beta de ratón
La porción extracelular de la linfotoxina de ratón-\bullet (LT-\bullet) se expresó recombinantemente con un conector aminoacídico CGG en su extremo N. El conector contenía una cisteína para el acoplamiento a VLP. Se fusionaron una versión larga (aa 49-306) y una corta (aa 126-306) de la proteína en su extremo N a glutationa-S-transferasa (GST) o a una etiqueta histidina-myc para la purificación. Se insertó un sitio de escisión de enteroquinasa (EK) para la escisión de la etiqueta.
Construcción de C-LT\bullet 49-306 y C-LT\bullet 126-306
Se amplificó LT\bullet 49-306 de ratón mediante PCR con los oligos 5'LT\bullet y 3'LT\bullet a partir de una genoteca de ADNc de bazo de ratón insertada en pFB-LIB. Para la reacción de PCR, se utilizaron 0,5 \mug de cada cebador y 200 ng del ADN molde en la mezcla de reacción 50 \bullet I (1 unidad de polimerasa PFX Platinum, dNTP 0,3 mM y MgSO_{4} 2 mM). Los ciclos de temperatura fueron los siguientes: 94ºC durante 2 minutos, seguido de 25 ciclos de 94ºC (15 segundos), 68ºC (30 segundos), 68ºC (1 minuto) y seguido de 68ºC durante 10 minutos. El producto de la PCR se fosforiló con Quinasa de T4 y se ligó en pEntrylA (Life technologies) que había sido cortado con EcoRV y había sido desfosforilado. El plásmido resultante se denominó pEntry1A-LT\bullet 49-306.
Se realizó una segunda reacción de PCR con los oligos 5'LT\bullet long-NheI y 3'LT\bullet stop-NotI resp. 5'LT\bullet short-NheI y 3'LT\bullet stop-NotI utilizando pEntry1A-LT\bullet 49-306 como molde. Los oligos 5'LT\bullet long-NheI y 5'LT\bullet short-NheI tenían un sitio NheI interno y contenían codones para un conector Cys-Gly-Gly y 3'LT\bullet stop-NotI tenía un sitio NotI interno y contenía un codón de parada. Para la segunda reacción de PCR, se utilizaron 0,5 \mug de cada cebador y se utilizaron 150 ng del ADN molde en la mezcla de reacción 50 \bullet I (1 unidad de polimerasa PFX Platinum, dNTP 0,3 mM y MgSO_{4} 2 mM).
Los ciclos de temperatura fueron los siguientes: 94ºC durante 2 minutos, seguido de 5 ciclos de 94ºC (15 segundos), 50ºC (30 segundos), 68ºC (1 minuto), seguido de 20 ciclos de 94ºC (15 segundos), 64ºC (30 segundos), 68ºC (1 minuto) y seguido de 68ºC durante 10 minutos.
Los productos de la PCR se digirieron con NheI y NotI y se insertaron en pCEP-SP-GST-EK o pCEP-SP-his-myc-EK (Wuttke et al. J. Biol. Chem. 276: 36839-48 (2001)). Los plásmidos resultantes se denominaron pCEP-SP-GST-EK-C-LT\bullet 49-306, pCEP-SP-GST-EK-C-LT\bullet 126-306, pCEP-SP-his-myc-EK-C-LT\bullet 49-306, pCEP-SP-his-myc-EK-C-LT\bullet 126-306, respectivamente. GST representa la glutationa-S-transferasa, EK la enteroquinasa, his la etiqueta de hexahistidina y myc el epítopo anti c-myc. La C indica el conector CGG que contiene la cisteína adicional.
Todos las demás etapas se realizaron mediante protocolos de la biología molecular normalizados.
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Secuencias de los oligonucleótidos
5'LT\bullet:
5'-CTT GGT GCC GCA GGA TCA G-3' (SEQ ID NO:284)
3'LT\bullet:
5'-CAG ATG GCT GTC ACC CCA C-3' (SEQ ID NO:285)
5'LT\bullet long-NheI:
5'-GCC CGC TAG CCT GCG GTG GTC AGG ATC AGG GAC GTC G-3' (SEQ ID NO:286)
5'LT\bullet short-NheI:
5'-GCC CGC TAG CCT GCG GTG GTT CTC CAG CTG CGG ATT C-3' (SEQ ID NO:287)
3'LT\bullet stop-NotI
5'-CAA TGA CTG CGG CCG CTT ACC CCA CCA TCA CCG-3' (SEQ ID NO:288) 
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Expresión y producción de GST-EK-C-LT\bullet_{49-306}, GST-EK-C-LT\bullet_{126-306}, his-myc-EK-C-LT\bullet_{49-306} y his-myc-EK-C-LT\bullet_{126-306}
Los plásmidos pCEP-SP-GST-EK-C-LT\bullet 49-306, pCEP-SP-GST-EK-C-LT\bullet 126-306, pCEP-SP-his-myc-EK-C-LT\bullet 49-306 y pCEP-SP-his-myc-EK-C-LT\bullet 126-306 fueron transfectados a células 293-EBNA (Invitrogen) para la producción de proteínas como se describe en el Ejemplo 1. Las proteínas resultantes se denominaron GST-EK-C-
LT\bullet _{49-306}, GST-EK-C-LT\bullet _{126-306}, his-myc-EK-C-LT\bullet _{49-306} y his-myc-EK-C-LT\bullet _{126-306}.
Las secuencias de proteínas de las proteínas de fusión LT\bullet proteína de fusión se tradujeron a partir de las secuencias de ADNc:
GST-EK-C-LT\bullet _{49-306}:
SEQ ID NO:289
GST-EK-C-LT\bullet _{126-306}:
SEQ ID NO:290
his-myc-EK-C-LT\bullet _{49-306}:
SEQ ID NO:291
his-myc-EK-C-LT\bullet _{126-306}:
SEQ ID NO:292
Las proteínas de fusión se analizaron sobre geles de SDS-PAGE al 12% en condiciones reductoras. Los geles se transfirieron a membranas de celulosa. Las membranas se bloquearon, se incubaron con un anticuerpo monoclonal anti-myc de ratón o con un anticuerpo anti-GST. Las transferencias se incubaron con posterioridad con IgG anti-ratón de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante o IgG anti-cabra de conejo conjugada con peroxidasa de rábano picante. Los resultados se muestran en la Fig. 3. Se pudieron detectar GST-EK-C-LT\bullet _{49-306} y GST-EK-C-LT\bullet _{126-306} con el anticuerpo anti-GST a un peso molecular de 62 kDa y 48 kDa, respectivamente. Se pudieron detectar his-myc-EK-C-LT\bullet _{49-306} e his-myc-EK-C-LT\bullet _{126-306} con el anticuerpo anti-myc a 40-56 kDa y 33-39 kDa, respectivamente.
La Fig. 3A y la Fig. 3B muestran el resultado de la expresión de las proteínas de fusión de LT\bullet. Las proteínas de fusión de LT\bullet fueron analizadas sobre geles de SDS-PAGE al 12% en condiciones reductoras. Los geles se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon, se incubaron o bien con un anticuerpo monoclonal anti-myc de ratón (dilución 1:2000) (Fig. 3A) o bien con un anticuerpo anti-GST (dilución 1:2000) (Fig. 3B). Las transferencias se incubaron con IgG anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (diluciones 1:4000) (Fig. 3A) o IgG anti-cabra de conejo conjugada con peroxidasa de rábano picante (diluciones 1:4000) (Fig. 3B). A: Calle 1 y 2: his-myc-EK-C-LT\bullet _{126-306}. Calle 3 y 4: his-myc-EK-C-LT\bullet _{49-306}. B: Calle 1 y 2: GST-EK-C-LT\bullet _{126-306}. Calle 3 y 4: GST-EK-C-LT\bullet _{49-306}. Los pesos moleculares de las proteínas marcadoras se dan en el margen
izquierdo.
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B. Purificación de GST-EK-C-LT- _{49-306}, GST-EK-C-LT\bullet _{126-306}, his-myc-EK-C-LT\bullet _{49-306} y his-myc-EK-C-LT\bullet _{126-306}
Se purifican GST-EK-C-LT\bullet _{49-306} y GST-EK-C-LT\bullet _{126-306} sobre una columna de glutationa-sefarosa his-myc-EK-C-LT\bullet _{49-306} y se purifican his-myc-EK-C-LT\bullet _{126-306} sobre una columna de Ni-NTA sefarosa utilizando protocolos de purificación convencionales. Las proteínas purificadas se escinden con enteroquinasa y se analizan sobre un gel de SDS-PAGE al 16% en condiciones reductoras.
C. Acoplamiento de C-LT\bullet _{49-306} y C-LT\bullet _{126-306} a la proteína de la cápside de Q\beta
Una solución de la proteína de la cápside de Q\beta 120 \muM en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,2 se hace reaccionar durante 30 minutos con un exceso molar de 25 veces de SMPH (Pierce), diluido a partir de una solución de partida en DMSO, a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se somete con posterioridad a diálisis dos veces durante 2 horas frente a 1 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. La mezcla de reacción de Q\beta sometida a diálisis se hace reaccionar después con la solución de C-LT\bullet _{49-306} y
C-LT\bullet _{126-306} solución (concentraciones finales: Q\beta 60 \muM, C-LT\bullet _{49-306} y C-LT\bullet _{126-306} 60 \muM) durante cuatro horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. Los productos del acoplamiento se analizan mediante
SDS-PAGE.
D. Acoplamiento de C-LT\bullet _{49-306} y C-LT\bullet _{126-306} a la proteína de la cápside de fr
Una solución de cápside de fr 120 \muM en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,2 se hace reaccionar durante 30 minutos con un exceso molar de 25 veces de SMPH (Pierce), diluido a partir de una solución de partida en DMSO, a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se somete con posterioridad a diálisis dos veces durante 2 horas frente a 1 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. La mezcla de reacción de la proteína de la cápside de fr sometida a diálisis se hace reaccionar después con la solución de C-LT\bullet _{49-306} y C-LT\bullet _{126-306} (concentraciones finales: fr 60 \muM, C-LT\bullet _{49-306} y C-LT\bullet _{126-306} 60 \muM) durante cuatro horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. Los productos de acoplamiento se analizan mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras.
E. Acoplamiento de C-LT\bullet _{49-306} y C-LT\bullet _{126-306} a HBcAg-Lys-2cys-Mut
Una solución de cápside HBcAg-Lys-2cys-Mut 120 \muM en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,2 se hace reaccionar durante 30 minutos con un exceso molar de 25 veces de SMPH (Pierce), diluido a partir de una solución de partida en DMSO, a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se somete con posterioridad a diálisis dos veces durante 2 horas frente a 1 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. La mezcla de reacción de HBcAg-Lys-2cys-Mut sometida a diálisis se hace reaccionar después con la solución de C-LT\bullet _{49-306} y C-LT\bullet _{126-306} (concentraciones finales: HBcAg-Lys-2cys-Mut 60 \muM, C-LT\bullet _{49-306} y C-LT\bullet _{126-306} 60 \muM) durante cuatro horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. Los productos del acoplamiento se analizan mediante SDS-PAGE.
F. Acoplamiento de C-LT\bullet _{49-306} y C-LT\bullet _{126-306} a Pili
Una solución de pili de Tipo 1 125 \muM de E. coli en Hepes 20 mM, pH 7,4, se hace reaccionar durante 60 minutos con un exceso molar de 50 veces de entrecruzador SMPH, diluido a partir de una solución de partida en DMSO (Pierce), a la RT en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La mezcla de reacción se somete a eliminación de las sales en una columna PD-10 (Amersham-Pharmacia Biotech). Las fracciones que contienen proteína que eluye de la columna se reúnen, y la proteína de los pili derivatizada se hace reaccionar con la solución de C-LT\bullet _{49-306} y C-LT\bullet _{126-306} (concentraciones finales: pili 60 \muM, C-LT\bullet _{49-306} y C-LT\bullet _{126-306} 60 \muM) durante cuatro horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. Los productos del acoplamiento se analizan mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras.
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Ejemplo 4
A. Introducción de conectores que contienen cys, expresión, purificación y acoplamiento de factor inhibidor de la migración de macrófagos de rata MIF a Q\beta
Se expresó recombinantemente factor inhibidor de la migración de macrófagos de rata (rMIF) con tres conectores aminoacídicos diferentes C1, C2 y C3 fusionados a su extremo C. Cada uno de los conectores contenía una cisteína para el acoplamiento a VLP.
Construcción de rMIF-C1, rMIF-C2, y rMIF-C3
El MCS de pET22b(+) (Novagen, Inc.) se cambió a GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGATCCGGC
TAGCGCTCGAGGGTTTAAACGGCGGCCGCATGCACC remplazando la secuencia original del sitio NdeI a un sitio XhoI con los oligos hibridados primerMCS-1F y primerMCS-1R (hibridación en tampón TrisHCl 15 mM pH 8). El plásmido resultante se denominó pMod00, que tenía los sitios de restricción NdeI, BamHI, NheI, XhoI, PmeI y NotI en su MCS. El par de oligos hibridados Bamhis6-EK-Nhe-F y Bamhis6-EKNhe-R y el par de oligo1F-C-glicina-conector y oligo1R-C-glicina-conector hibridado se ligaron entre sí en el plásmido pMod00 digerido con BamHI-NotI para obtener pModEC1, que tenía una etiqueta de hexahistidina N-terminal, un sitio de escisión de enteroquinasa y un conector aminoacídico de glicina C-terminal que contenía un resto cisteína. El par de oligos hibridados Bamhis6-EK-Nhe-F y Bamhi6-EKNhe R junto con el par hibridado de oligo1F-C-gamma1-conector y oligo1R-C-gamma1-conector se ligaron en pMod00 digerido con BamHI-NotI para obtener pModEC2, que tenía una etiqueta de hexahistidina N terminal, un sitio de escisión para enteroquinasa y un conector C-terminal\bullet 1, derivado de la región bisagra de las inmunoglobulinas humanas \gammal; que contiene un resto cisteína. El par de oligos Bamhis6-EK-Nhe-F y Bamhis6-EK-Nhe-R hibridado, el par de oligo1FA-C-gamma3-conector y oligo1RA-C-gamma3-conector hibridado, y el par de oligo1F C-gamma3-conector y oligo1RB-C-gamma3-conector hibridado se ligaron entre sí en pMod00 digerido con BamHI-NotI para obtener pModEC3, que tenía una etiqueta de histidina N-terminal, un sitio de escisión para enteroquinasa y un conector 3 C terminal, que contenía un resto cisteína, derivado de la región bisagra de la inmunoglobulina 3 de ratón.
pBS-rMIF, que contiene el ADNc de MIF de rata, fue amplificado mediante PCR con los oligos rMIF-F y rMIF-Xho-R. rMIF-F tenía un sitio NdeI interno y rMIF-Xho-R tenía un sitio XhoI interno. El producto de la PCR fue digerido con NdeI y XhoI y ligado en pModEC1, pModEC2 y pModEC3 digeridos con las mismas enzimas. Los plásmidos resultantes se denominaron pMod-rMIF-C1, pMod-rMEF-C2 y pMod-rMIF-C3, respectivamente.
Para la reacción de PCR, se utilizaron 15 pmoles de cada oligo y 1 ng del ADN molde en la mezcla de reacción 50 \bullet 1 (2 unidades de polimerasa PFX, dNTP 0,3 mM y MgSO_{4} 2 mM). Los ciclos de temperatura fueron los siguientes: 94ºC durante 2 minutos, seguido de 30 ciclos de 94ºC (30 segundos), 60ºC (30 segundos), 68ºC (30 segundos) y seguido de 68ºC durante 2 minutos.
Todas las demás etapas se realizaron mediante protocolos de la biología molecular convencionales.
Secuencias de los oligonucleótidos
2
3
3000
4
Expresión y Purificación de rMIF-Cs
Se transformaron células de E. coli BL21 (DE3) competentes con los plásmidos pMod-rMIF-C1, pMod-rMIF-C2 y pMod-rMIF-C3. Las colonias individuales de las placas de agar que contenían ampicilina (Amp) se expandieron en cultivo líquido (SB con MOPS 150 mM, pH 7,0, Amp 200 \mug/ml, glucosa al 0,5%) y se incubaron a 30ºC con sacudimiento a 220 rpm durante la noche. Después se inoculó 1 l de SB (MOPS 150 mM, pH 7,0, Amp 200 \mug/ml) 1:50 v/v con el cultivo realizado durante la noche y se hizo crecer a una DO600=2,5 a 30ºC. La expresión fue inducida con IPTG 2 mM. Las células se cosecharon después del cultivo durante la noche y se centrifugaron a 6000 rpm. El sedimento celular se suspendió en tampón de lisis (Na_{2}HPO_{4} 10 mM, NaCl 30 mM, EDTA 10 mM y Tween-20 al 0,25%) con 0,8 mg/ml de lisozima, se sometió a sonicación y se trató con benzonasa. Después se hicieron pasar 2 ml del producto lisado a través de una columna Q XL de 20 ml y una columna SP XL de 20 ml. Las proteínas rMIF-C1, rMIF-C2 y rMIF-C3 estuvieron en el flujo directo.
Las secuencias de proteínas de los rMIP-C fueron traducidas a partir de las secuencias del ADNc.
rMIF-C1: SEQ ID NO: 307
rMIF-C2: SEQ ID NO: 308
rMIF-C3: SEQ ID NO: 309
Acoplamiento de rMIF-C1 la proteína de la cápside de Q
Una solución de 1,48 ml de 6 mg/ml de proteína de la cápside de Q\bullet en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,2 se hizo reaccionar durante 30 minutos con 14,8 \mul de un SMPH (Pierce) (a partir de una solución de partida 100 mM disuelto en DMSO) a 25ºC. La solución de reacción se sometió a diálisis con posterioridad dos veces durante 3 horas frente a 2 l de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0 a 4ºC. Se hizo reaccionar una solución de 1,3 ml de proteína rMIF-C1 de 3,6 mg/ml en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,2 durante 1 hora con 9,6 \mul de TCEP (Pierce) (a partir de una solución de partida 36 mM disuelta en H_{2}O) a 25ºC. Después se hicieron reaccionar 130 \mul de Q\bullet derivatizada y sometida a diálisis con 129 \mul de rMIF-C1 reducida en 241 \mul de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0 durante la noche a 25ºC.
Acoplamiento de rMIF-C2 a la proteína de la cápside de Q\bullet
Una solución de 0,9 ml de proteína de la cápside de Q\bullet 5,5 mg/ml en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,2 se hizo reaccionar durante 30 minutos con 9 \mul de SMPH (Pierce) (a partir de una solución de partida 100 mM disuelta en DMSO) a 25ºC. La solución de reacción se sometió a diálisis con posterioridad dos veces durante 2 horas frente a 2 l de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. Se hizo reaccionar una solución de 850 \mul de 5,80 mg/ml de proteína rMIF-C2 en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,2 durante 1 hora con 8,5 \mul de TCEP (Pierce) (a partir de una solución de partida 36 mM disuelta en H_{2}O) a RT. Después se hicieron reaccionar 80 \mul de Q\bullet derivatizada y sometida a diálisis con 85 \mul de rMIF-C2 reducida en 335 \mul de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 durante la noche la 25ºC.
Acoplamiento de rMIF-C3 a la proteína de la cápside de Q\bullet
Una solución de 1,48 ml de proteína de la cápside de Q\bullet 6 mg/ml en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,2 se hizo reaccionar durante 30 minutos con 14,8 \mul de SMPH (Pierce) (a partir de una solución de partida 100 mM disuelta en DMSO) a 25ºC. La solución de reacción se sometió a diálisis con posterioridad dos veces durante 3 horas frente a 2 l de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0 a 4ºC. Una solución de 720 \mul de proteína rMIF-C3 5,98 mg/ml en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,2 se hizo reaccionar durante 1 hora con 9,5 \mul de TCEP (Pierce) (a partir de una solución de partida 36 mM disuelta en H_{2}O) a 25ºC. Después se hicieron reaccionar 130 \mul de Q\bullet derivatizada y sometida a diálisis con 80 \mul de rMIE-C3 reducida en 290 \mul de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0 a lo largo de la noche a 25ºC.
Los tres productos acoplados se analizaron sobre geles de SDS-PAGE al 16% en condiciones reductoras. Los geles fueron teñidos con Azul Brillante de Coomassie o transferidos a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon, se incubaron con un antisuero anti-Qb de conejo policlonal (dilución 1:2000) o un anticuerpo anti-MIF de conejo purificado (Torrey Pines Biolabs, Inc.) (dilución 1:2000). Las transferencias se incubaron con posterioridad con IgG anti-conejo de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante (diluciones 1:2000). Los resultados se muestran en la Fig 4A y en la Fig. 4B. Los productos acoplados pudieron ser detectados en geles teñidos con Coomassie (Fig. 4A) y tanto mediante antisuero \bullet anti-Q\beta\bullet como anticuerpo anti-MIF (Fig. 4B) se demostró claramente el acoplamiento covalente de todas las variantes de rMIF a la proteína de la cápside de Q\beta\bullet.
La Fig 4A muestra el acoplamiento de los constructos de MIF a Q\beta. Los productos de acoplamiento se analizaron sobre geles de SDS-PAGE al 16% en condiciones reductoras. El gel se tiñó con Azul Brillante de Coomassie. Los pesos moleculares de las proteínas marcadoras se dan en el margen izquierdo.
La Fig. 4B muestra el acoplamiento de MIF-C1 a Q\beta. Los productos del acoplamiento se analizaron sobre geles de SDS-PAGE al 16% en condiciones reductoras. Calle 1: MIF-C1 antes del acoplamiento Calle 2: Q\beta derivatizada antes de acoplamiento. Calle 3-5: Q\beta-MIF-C1 Las calles 1-3 fueron teñidos con Azul Brillante de Coomassie. Las calles 4 y 5 representan las transferencias western de la reacción de acoplamiento desarrollada con un antisuero anti-MIF y un antisuero anti-Q\beta, respectivamente. Los pesos moleculares de las proteínas marcadoras se dan en el margen izquierdo.
B. Inmunización de ratones con MIF-C1 acoplada a la proteína de la cápside de Q\beta
Se vacunaron ratones Balb/c hembra con MIF-C1 acoplada a la proteína de la cápside de Q\beta sin la adición de coadyuvantes. Se diluyeron 25 \mug de proteína total de cada muestra en PBS a 200 \mul y se inyectaron subcutáneamente (100 ml en dos lados ventrales) el día 0 y el día 14. Se obtuvo sangre por punción retrorbital de los ratones el día 31 y su suero se analizó utilizando un ELISA específico para MIF.
C. ELISA
Las placas de ELISA fueron recubiertas con MIF-C1 a una concentración de 5 \mug/ml. Las placas se bloquearon y después se incubaron con suero de ratón diluido seriadamente. Los anticuerpos unidos se detectaron con anticuerpo IgG anti-ratón marcado enzimáticamente. Como control, también se sometió a ensayo suero pre-inmune de los mismos ratones. Los resultados se muestran en la Fig. 4C. Hubo una clara reactividad del suero de ratón originado contra MIF-C1 acoplado a la proteína de la cápside de Q\beta, mientras el suero preinmune no reaccionó con MIF (Fig. 4C y datos no mostrados). A partir de la serie de dilución con el antisuero frente a MIF-C1 acoplada a la proteína de la cápside de Q\beta, se alcanzó un título semi-máximo a 1:84000.
En la Fig. 4C se muestran las señales del ELISA obtenidas con los sueros de los ratones vacunados con MIF-C1 acoplada a la proteína de la cápside de Q\beta. Se vacunaron ratones Balb/c hembra subcutáneamente con 25 \mug de vacuna en PBS el día 0 y el día 14. Se midió la IgG frente a MIF-C1 en suero el día 31. Como control, se analizaron los sueros pre-inmunes de uno de los ratones. Los resultados para las diluciones de suero indicadas se muestran como la densidad óptica a 450 nm. Todos los ratones vacunados elaboraron elevados títulos de anticuerpo IgG. No se detectaron anticuerpos específicos de NBF en el control (ratón pre-inmune).
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Ejemplo 5
Acoplamiento de rMIF-C1 a la proteína de la cápside de fr y a la proteína de la cápside de HBcAg-lys-2cys-Mut Acoplamiento de rMIF-C1 a la proteína de la cápside de fr
Se hizo reaccionar una solución de 100 \mul de proteína de la cápside de fr de 3,1 mg/ml en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,2 durante 30 minutos con 3 \mul de una solución de partida de SMPH 100 mM (Pierce) disuelto en DMSO a 25ºC. En una reacción paralela, la proteína de la cápside de fr se alquiló primero utilizando yodoacetamida y después se hizo reaccionar con SMPH utilizando las mismas condiciones de reacción descritas antes. Las soluciones de reacción fueron sometidas a diálisis con posterioridad dos veces durante 2 horas frente a 2 l de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. Una solución de 80 \mul de proteína rMIF-C1 de 5,7 mg/ml en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,2, se hizo reaccionar durante 1 hora con 1 \mul de una solución de partida de TCEP (Pierce) 36 mM disuelto en H_{2}O, a 25ºC. Después se hicieron reaccionar 50 \mul de la proteína de la cápside de fr derivatizada y sometida a diálisis y 50 \mul de la proteína de la cápside de fr derivatizada, alquilada y sometida a diálisis con 17 \mul de rMIF-C1 reducida durante dos horas a 25ºC.
Los productos del acoplamiento se analizaron sobre geles de SDS-PAGE al 16% (Fig. 5). Se puede detectar una banda adicional del tamaño esperado de 27 kDa (rMIF-C1: PM aparente 13 kDa, PM aparente de la proteína de la cápside de fr 14 kDa) y 29 kDa (rMIF-C1: PM aparente 13 kDa, HBcAg-lys-2cys-Mut: PM aparente 15 kDa) en la reacción de acoplamiento pero no en las soluciones de proteína de la cápside de fr y rMIF-C1, demostrando claramente el acoplamiento.
Acoplamiento de rMIF-C1 la proteína de la cápside de HBcAg-lys-2cys-Mut de hepatitis
Una solución de 100 \mul de proteína de la cápside de HBcAg-lys-2cys-Mut de 1,2 mg/ml en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM pH 7.2 se hizo reaccionar durante 30 minutos con 1,4 \mul de SMPH (Pierce) (a partir de una solución de partida 100 mM disuelta en DMSO) a 25ºC. La solución de reacción se sometió a diálisis con posterioridad dos veces durante 2 horas frente a 2 l de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. Se hizo reaccionar una solución de 80 \mul de proteína rMIF-C1 de 5,7 mg/ml en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 durante 1 hora con 1 \mul de TCEP (Pierce) (a partir de una solución de partida 36 mM disuelta en H_{2}O) a 25ºC. Después se hicieron reaccionar 60 \mul de la proteína de cápside de HBcAg-lys-2cys-Mut derivatizada y sometida a diálisis con 20 \mul de rMIF-C1 reducida durante dos horas a 25ºC.
Los productos del acoplamiento se analizaron sobre geles de SDS-PAGE al 16% (Fig. 5) en condiciones reductoras. Se puede detectar una banda adicional del tamaño esperado de aproximadamente 28 kDa (rMIF-C1: PM aparente 13 kDa, HBcAg-lys-2cys-Mut: PM aparente 15 kDa) en la reacción de acoplamiento pero no en HBcAg-lys-2cys-Mut derivatizado o rMIF-C1, demostrando claramente el acoplamiento.
Las muestras cargadas en el gel de la Fig. 5 fueron las siguientes:
Calle 1: Marcador de peso molecular. Calle 2: rMIF-Cl antes de acoplamiento. Calle 3: proteína de la cápside de rMIF-C1-fr después del acoplamiento. Calle 4: proteína de la cápside de fr derivatizada. Calle 5: rMIF-C1-fr después del acoplamiento a la proteína de la cápside de fr alquilada. Calle 6: proteína de la cápside de fr alquilada y derivatizada. Calle 7: rMIF-HBcAg-lys-2cys-Mut después del acoplamiento. Calle 8 y 9: HBcAg-lys-2cys-Mut derivatizada. El gel se tiñó con Azul Brillante de Coomassie. Los pesos moleculares de las proteínas marcadoras se dan en el margen izquierdo.
Ejemplo 6
A. Introducción de conectores aminoácidos que contienen un resto cisteína, expresión y purificación de RANKL de ratón
Se expresó recombinantemente un fragmento del ligando del receptor activador del factor nuclear kappa b
(RANKL), que también ha sido denominado factor de diferenciación de osteoclastos, ligando de osteoprotegerina y citoquina inducida por la activación relacionada con el factor de necrosis tumoral con un conector N-terminal que contenía una cisteína para el acoplamiento a VLP.
Construcción del plásmido de expresión
La región codificadora C-terminal del gen RANKL se amplificó mediante PCR con los oligos RANKL-UP y RANKL-DOWN. RANKL-UP tenía un sitio ApaI interno y RANKL-DOWN tenía un sitio XhoI interno. El producto de la PCR fue digerido con ApaI y XhoI y ligado en pGEX-6pl (Amersham Pharmacia). El plásmido resultante fue denominado pGEX-RANKL. Todas las etapas se realizaron mediante protocolos de la biología molecular convencionales y la secuencia fue verificada. El plásmido pGEX-RANKL codifica una proteína de fusión de glutationa-S-transferasa-sitio de escisión Prescission-conector aminoacídico que contiene cisteína-RANKL (GST-PS-C-RANKL). El conector aminoacídico que contiene cisteína tiene la secuencia GCGGG. El constructo también contiene una etiqueta de hexa-histidina entre el conector aminoacídico que contiene cisteína y la secuencia de RANKL.
Oligos
5
6
Expresión y Purificación de C-RANKL
Se transformaron células de E. coli BL21 (DE3) Gold pLys competentes con el plásmido pGEX-RANKL. Las colonias individuales de las placas de agar que contenían kanamicina y cloramfenicol se expandieron en medio de cultivo líquido (medio LB, kanamicina 30 \mug/ml, cloramfenicol 50 \mug/ml) y se incubaron a 30ºC con sacudimiento a 220 rpm durante la noche. Después se inoculó 1 l de LB (con kanamicina 30 \mug/ml) 1:100 v/v con el cultivo realizado durante la noche y se hizo crecer a una DO600=1 a 24ºC. La expresión fue inducida con IPTG 0,4 mM. Las células se cosecharon después de 16 h y se centrifugaron a 5000 rpm. El sedimento celular se suspendió en tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM, pH=8; sacarosa el 25%; EDTA 1 mM, NaN_{3} al 1%, DTT 10 mM; MgCl_{2} 5 mM; Lisozima de 1 mg/ml; DNAsa de 0,4 u/ml) durante 30 min. Después se añadieron 2,5 volúmenes de tampón A (Tris-HCl 50 mM, pH=8,0; Triton X100 al 1%; NaCl 100 mM; NaN_{3} al 0,1%; DTT 10 mM; PMSF 1 mM) y se incubaron a 37ºC durante 15 min. Las células se sometieron a sonicación y se sedimentaron a 9000 rpm durante 15 min. El sobrenadante se utilizó inmediatamente para la cromatografía de afinidad GST.
Se equilibró una columna GST-Trap FF de 5 ml (Amersham Pharmacia) en PBS, pH 7,3 (NaCl 140 mM, KCI 2,7 mM, Na_{2}HPO_{4} 10 mM, KH_{2}PO_{4} 1,8 mM). El sobrenadante se cargó en la columna GST-Trap FF de 5 ml y con posterioridad la columna se enjuagó con 5 veces el volumen de la columna de PBS. La proteína GST-PS-C-RANKL se hizo eluir con Tris-HCl 50 mM, pH=8,0 que contenía GSH 10 mM.
La proteína GST-PS-C-RANKL purificada se digirió utilizando la proteasa PreScission (Amersham Pharmacia). La digestión se realizó a 37ºC durante 1 hora utilizando una razón molar de 500/1 de GST-PS-C-RANKL con respecto a PreScission.
Además, se cambió el tampón de la reacción de la digestión con la proteasa utilizando una columna para la eliminación de las sales HiPrep 26/10 (Amersham Pharmacia), las fracciones que contenían las proteínas se reunieron y se utilizaron inmediatamente para otra etapa de cromatografía de afinidad para GST utilizando las mismas condiciones referidas antes. La purificación de C-RANKL se analizó sobre un gel de SDS-PAGE en condiciones reductoras, mostrado en la Fig.6. Los pesos moleculares de las proteínas marcadoras se dan en el margen izquierdo del gel en la figura. El gel se tiñó con Azul Brillante de Coomassie. El C-RANKL está presente en el flujo continuo (fracción no unida) mientras GST-PS-C-RANKL no escindida, la GST-PS y PreScission permanecen unidos a la columna. La proteína C-RANKL del tamaño esperado de 22 kDa se obtuvo con una pureza elevada.
Las muestras cargadas en el gel de la Fig. 6 fueron las siguientes:
Calle 1: Marcador de bajo peso molecular. Calles 2 y 3: sobrenadante de los productos lisados celulares de las células BL21/DE3 transformadas con los vectores pGEX6p1 y pGEX-RANKL vacíos respectivamente, después de dieciséis horas de inducción con IPTG 0,4 mM. Calle 4: proteína GST-PS-C-RANKL purificada después de la columna GST-Trap FF. Calle 5: fracción no unida a la columna GST-Trap FF. Calle 6: proteína GST-PS-C-RANKL purificada después de la escisión con la proteasa PreScission. Calle 7: fracción no unida de la columna GST-Trap FF cargada con la digestión de GST-RANKL, que contiene C-RANKL purificada. Calle 8: fracción unida de la columna GST-Trap FF cargada con la digestión de GST-PS-C-RANKL y eluida con GSH.
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B. Acoplamiento de C-RANKL a la proteína de la cápside de Q\beta
Una solución de cápside de Q\beta 120 \muM en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,2 se hace reaccionar durante 30 minutos con un exceso molar de 25 veces de SMPH (Pierce), diluido a partir de una solución de partida en DMSO, a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se somete a diálisis con posterioridad dos veces durante 2 horas frente a 1 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. La mezcla de reacción de QP sometida a diálisis se hace reaccionar después con la solución de C-RANKL (concentraciones finales: Q\beta 60 \muM, C-RANKL 60 \muM) durante cuatro horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. Los productos del acoplamiento se analizan mediante SDS-PAGE.
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C. Acoplamiento de C-RANKL a la proteína de la cápside de fr
Una solución de cápside de fr 120 \muM en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,2 se hace reaccionar durante 30 minutos con un exceso molar de 25 veces de SMPH (Pierce), diluido a partir de una solución de partida en DMSO, a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción es sometida a diálisis con posterioridad dos veces durante 2 horas frente a 1 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. La mezcla de reacción de la proteína de la cápside de fr sometida a diálisis se hace reaccionar después con la solución de C-RANKL (concentraciones finales: proteína de la cápside de fr 60 \muM, C-RANKL 60 \muM) durante cuatro horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. Los productos del acoplamiento se analizan mediante SDS-PAGE.
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D. Acoplamiento de C-RANKL a HBcAg-Lys-2cys-Mut
Una solución de cápside de HBcAg-Lys-2cys-Mut 120 \muM en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,2 se hace reaccionar durante 30 minutos con un exceso molar de 25 veces de SMPH (Pierce), diluido a partir de una solución de partida en DMSO, a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se somete a diálisis con posterioridad dos veces durante 2 horas frente a 1 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. La mezcla de reacción de HBcAg-Lys-2cys-Mut sometida a diálisis se hace reaccionar después con la solución de C-RANKL (concentraciones finales: HBcAg-Lys-2cys-Mut 60 \muM, C-RANKL 60 \muM) durante cuatro horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. Los productos del acoplamiento se analizan mediante SDS-PAGE.
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E. Acoplamiento de C-RANKL a Pili
Una solución de pili de Tipo-1 de E. coli 125 \muM en Hepes 20 mM, pH 7,4, se hace reaccionar durante 60 minutos con un exceso molar de 50 veces de entrecruzador SMPH, diluido a partir de una solución de partida en DMSO, a RT en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La mezcla de reacción se somete a eliminación de las sales en una columna PD-10 (Amersham-Pharmacia Biotech). Las fracciones que contienen la proteína que eluyen de la columna se recogen, y la proteína de los pili derivatizada sometida a eliminación de las sales se hace reaccionar con la solución de C-RANKL (concentraciones finales: pili 60 \muM, C-RANKL 60 \muM) durante cuatro horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. Los productos del acoplamiento se analizan mediante SDS-PAGE.
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Ejemplo 7
A. Introducción de un conector aminoacídico que contiene un resto cisteína, expresión y purificación de una forma truncada de la proteína priónica de ratón
Una forma truncada (aa 121-230) de la proteína priónica de ratón (denominada mPrP_{t}) se expresó recombinantemente con un conector aminoacídico GGGGCG fusionado en su extremo C para el acoplamiento a VLP y Pili. La proteína se fusionó al extremo N de un fragmento humano para la purificación. Se introdujo un sitio de escisión de enteroquinasa (EK) detrás del sitio de escisión EK para escindir la porción Fc de la proteína de fusión después de la purificación.
Construcción de mPrP_{t}-EK-Fc*
Se amplificó PrP_{t} de ratón mediante PCR con el cebador 5'PrP-BamHI y 3'PrP-NheI utilizando el plásmido pBp^{CMV}PrP-Fc como molde. pBp^{CMV}PrP-Fc contenía la secuencia de tipo salvaje de la proteína priónica de ratón. 5'PrP-BamHI tenía un sitio BamHI interno y contenía un ATG y 3'PrP-NheI tenía un sitio NheI interno.
Para la reacción mediante PCR, se utilizaron 0,5 \mug de cada cebador y 200 ng del ADN molde en la mezcla de reacción 50 \bullet 1 (1 unidad de polimerasa PFX Platinum, dNTP 0,3 mM y MgSO_{4} 2 mM). Los ciclos de temperatura fueron los siguientes: 94ºC durante 2 minutos, seguido de 5 ciclos de 94ºC (15 segundos), 50ºC (30 segundos), 68ºC (45 segundos), seguido de 20 ciclos de 94ºC (15 segundos), 64ºC (30 segundos), 68ºC (45 segundos) y seguido de 68ºC durante 10 minutos.
El producto de la PCR se digirió con BamHI y NheI y se insertó en pCEP-SP-EK-Fc* que contenía la secuencia conectora GGGGCG en el extremo 5' de la secuencia de escisión de EK. El plásmido resultante se denominó pCEP-SP-mPrP_{t}-EK-Fc*.
Todas las demás etapas se realizaron mediante protocolos de la biología molecular convencionales.
Oligos
7
Expresión y Purificación de mPrP_{t}-EK-Fc*
Se transfectó el plásmido pCEP-SP-mPrP_{t}-EK-Fc* en células 293-EBNA (Invitrogen) y se purificó sobre una columna de Proteína A-sefarosa como se describe en el Ejemplo 1.
La secuencia de proteínas de mPrP_{t}-EK-Fc* se identifica en el SEQ ID NO: 323.
Después de la escisión mPrP_{t} tiene la secuencia identificada en el SEQ ID NO: 324 con el conector GGGGCG en su extremo C.
La proteína de fusión purificada mPrP_{t}-EK-Fc* se escindió con enteroquinasa, y se analizó en un gel de SDS-PAGE al 16% gel en condiciones reductoras antes y después de la escisión con enteroquinasa. El gel se tiñó con Azul Brillante de Coomassie. El resultado se muestra en la Fig. 7. Los pesos moleculares de las proteínas marcadoras se dan en el margen izquierdo del gel en la figura. La proteína de fusión mPrP_{t}EK-Fc* se pudo detectar como una banda de 50 kDa. La proteína mPrP_{t} escindida que contenía el conector aminoacídicos GGGGCG fusionado a su extremo C pudo ser detectada como una banda ancha entre 18 y 25 kDa. La identidad de mPrP_{t} se confirmó mediante transferencia western (datos no mostrados). De este modo, mPrPt con un conector aminoacídico C-terminal que contenía un resto cisteína, pudo ser expresado y purificado para utilizarlo para el acoplamiento a VLP y Pili.
Las muestras cargadas en el gel de la Fig. 7 fueron las siguientes.
Calle 1: Marcador de peso molecular. Calle 2: mPrP_{t}-EK-Fc* antes de la escisión. Calle 3: mPrP_{t} después de la escisión.
B. Acoplamiento de mPrP_{t} a la cápside de Q\beta
Una solución de cápside de Q\beta 120 \muM en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,2 se hace reaccionar durante 30 minutos con un exceso molar de 25 veces de SMPH (Pierce), diluido a partir de una solución de partida en DMSO, a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se somete a diálisis con posterioridad dos veces durante 2 horas frente a 1 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. La mezcla de reacción de Q\beta sometida a diálisis se hace reaccionar después con la solución de mPrP_{t} (concentraciones finales: Q\beta 60 \muM, mPrP_{t} 60 \muM) durante cuatro horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. Los productos del acoplamiento se analizan mediante SDS-PAGE.
C. Acoplamiento de mPrP_{t} a la proteína de la cápside de fr
Una solución de proteína de la cápside de fr 120 \muM en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,2 se hace reaccionar durante 30 minutos con un exceso molar de 25 veces de SMPH (Pierce), diluido a partir de una solución de partida en DMSO, a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se somete a diálisis con posterioridad dos veces durante 2 horas frente a 1 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. La mezcla de reacción de fr sometida a diálisis se hace reaccionar después con la solución de mPrP_{t} (concentraciones finales: fr 60 \muM, mPrP_{t} 60 \muM) durante cuatro horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. Los productos del acoplamiento se analizan mediante SDS-PAGE.
D. Acoplamiento de mPrP_{t} a HBcAg-Lys-2cys-Mut
Una solución de cápside de HBcAg-Lys-2cys-Mut 120 \muM en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,2 se hace reaccionar durante 30 minutos con un exceso molar de 25 veces de SMPH (Pierce), diluido a partir de una solución de partida en DMSO, a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se somete a diálisis con posterioridad dos veces durante 2 horas frente a 1 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. La mezcla de reacción de HBcAg-Lys-2cys-Mut sometida a diálisis se hace reaccionar después con la solución de mPrP_{t} (concentraciones finales: HBcAg-Lys-2cys-Mut 60 \muM, mPrP_{t} 60 \muM) durante cuatro horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. Los productos del acoplamiento se analizan mediante SDS-PAGE.
E. Acoplamiento de mPrP_{t} a Pili
Una solución de pili de Tipo-1 de E. coli 125 \muM en Hepes 20 mM, pH 7,4, se hace reaccionar durante 60 minutos con un exceso molar de 50 veces de entrecruzador SMPH (Pierce), diluido a partir de una solución de partida en DMSO, a RT en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. la mezcla de reacción se somete a eliminación de las sales en una columna PD-10 (Amersham-Pharmacia Biotech). Las fracciones que contienen la proteína que eluyen de la columna se reúnen, y la proteína de los pili derivatizada y sometida a eliminación de las sales se hace reaccionar con la solución de mPrP_{t} (concentraciones finales: pili 60 \muM, mPrP_{t} 60 \muM) durante cuatro horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. Los productos del acoplamiento se analizan mediante SDS-PAGE.
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Ejemplo 8
A. Acoplamiento de péptidos priónicos a la proteína de la cápside de Q\beta: vacunas de péptidos priónicos
Se sintetizaron químicamente los siguientes péptidos priónicos: CSAMSRPMIHFGNDWEDRYYRENMYR ("cprplong") y CGNDWEDRYYRENMYR ("cprpshort"), que comprenden un resto cisteína N-terminal añadido para el acoplamiento a VLP y Pili, y se utilizaron para el acoplamiento químico a Q\beta como se describe a continuación.
Una solución de 5 ml de proteína de la cápside de Q\beta 140 \muM en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,4 se hizo reaccionar durante 30 minutos con 108 \mul de una solución 65 mM de SMPH (Pierce) en H_{2}O a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se sometió a diálisis con posterioridad dos veces durante 2 horas frente a 5 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a 4ºC. Después se hicieron reaccionar 100 \mul de la mezcla de reacción sometida a diálisis se hizo reaccionar después con 1,35 \mul de una solución de partida 2 mM (en DMSO) del péptido cprpshort (razón de péptido/proteína de la cápside de Q\beta 1:2) o con 2,7 \mul de la misma solución de partida (razón péptido/Q\beta 1:1). Se hizo reaccionar 1 \mul de una solución de partida 10 mM (en DMSO) del péptido cprplong con 100 \mul de la mezcla de reacción sometida a diálisis. Las reacciones de acoplamiento se realizaron durante la noche a 15ºC en un baño de agua. Las mezclas de reacción se sometieron a diálisis con posterioridad 24 h frente a 2 x 5 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a 4ºC.
Los productos acoplados se centrifugaron y los sobrenadantes y los sedimentos se analizaron sobre geles de SDS-PAGE al 16% en condiciones reductoras. Los geles se tiñeron con Azul Brillante de Coomassie. Los resultados se muestran en la Fig. 16. Los pesos moleculares de las proteínas marcadoras se dan en el margen izquierdo del gel en la figura. Las bandas a un peso molecular entre 16,5 y 25 kDa demostraron claramente el acoplamiento covalente de los péptidos cprpshort y cprplong a la proteína de la cápside de Q\bullet.
Las muestras cargadas en el gel de la Fig. 16 A fueron las siguientes:
Calle 1: proteína de la cápside de Q\bullet purificada. Calle 2: proteína de la cápside de Q\beta derivatizada antes de acoplamiento. Calles 3-6: acoplamientos proteína de la cápside de Q\beta-cprpshort con una razón péptido/Q\cdot 1:2 (calles 3 y 4) y razón péptido/Q\cdot 1:1 (calles 5 y 6). Se muestran las fracciones solubles (calles 3 y 5) y las fracciones insolubles (calles 4 y 6).
Las muestras cargadas en el gel de la Fig. 16 B fueron las siguientes:
Calle 1: Marcador de peso molecular. Calle 2: proteína de la cápside de Q\beta derivatizada antes del acoplamiento. Calle 3 y 4: reacciones de acoplamiento de la proteína de la cápside de Q\beta-cprplong. Se muestran la fracción soluble (calle 3) y la fracción insoluble (calle 4).
B. Acoplamiento de péptidos priónicos a la proteína de la cápside de fr
Una solución de proteína de la cápside de fr 120 \muM en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,2 se hace reaccionar durante 30 minutos con un exceso molar de 10 veces de SMPH (Pierce)), diluido a partir de una solución de partida en DMSO, a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se somete a diálisis con posterioridad dos veces durante 2 horas frente a 1 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. La mezcla de reacción de fr sometida a diálisis se hace reaccionar después con una concentración equimolar de péptido cprpshort o una razón de cprplong/fr 1:2 a lo largo de la noche a 16ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. Los productos del acoplamiento se analizan mediante SDS-PAGE.
C. Acoplamiento de péptidos priónicos a HBcAg-Lys-2cys-Mut
Una solución de HBcAg-Lys-2cys-Mut 120 \muM en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,2 se hace reaccionar durante 30 minutos con un exceso molar de 10 veces de SMPH (Pierce)), diluido a partir de una solución de partida en DMSO, a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio: La solución de reacción se somete a diálisis con posterioridad dos veces durante 2 horas frente a 1 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. La mezcla de reacción de HBcAg-Lys-2cys-Mut sometida a diálisis se hace reaccionar después con una concentración equimolar de péptido cprpshort o una razón cprplong/HBcAg-Lys-2cys-Mut 1:2 durante la noche a 16ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. Los productos del acoplamiento se analizan mediante SDS-PAGE.
D. Acoplamiento de péptidos priónicos a Pili
Una solución de pili de Tipo-1 de E. coli 125 \muM en Hepes 20 mM, pH 7,4, se hace reaccionar durante 60 minutos con un exceso molar de 50 veces de entrecruzador SMPH (Pierce), diluido a partir de una solución de partida en DMSO, a RT en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La mezcla de reacción se somete a eliminación de las sales en una columna PD-10 (Amersham-Pharmacia Biotech). Las fracciones que contienen la proteína que eluyen de la columna se reúnen, y la proteína de los pili derivatizada y sometida a eliminación de las sales se hace reaccionar con los péptidos priónicos a una razón equimolar o una razón péptido a pili de 1:2 durante la noche a 16ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. Los productos del acoplamiento se analizan mediante SDS-PAGE.
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Ejemplo 9
Clonación, expresión y purificación de IL-13 a VLP y Pili A. Clonación y expresión de Interleuquina 13 (IL-13) con un conector aminoacídico N-terminal que contiene un resto cisteína para el acoplamiento a VLP y Pili a) Clonación de IL-13 de ratón (HEK-293T) para la expresión en células de mamífero como proteína de fusión con Fc
Se aisló el ADN para la clonación de IL-13 mediante RT-PCR a partir de esplenocitos activados in vitro, que fueron obtenidos como sigue: se aislaron células T CD4+ de células de bazo de ratón y se incubaron 3 días en IMDM (+FCS al 5% + IL4 de 10 ng/ml) en placas de 6 pocillos que habían sido recubiertas previamente con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28. El ARN de estas células se utilizó para amplificar la IL13 mediante RT-PCR de una etapa (kit para PCR de una etapa de Qiagen). Se utilizó el cebador XhoIL13-R para la transcripción inversa del ARN y se utilizaron los cebadores NheIL13-F (SEQ ID NO: 338) y XhoIL13-R (SEQ ID NO: 339) para la amplificación mediante PCR del ADNc de IL13. El ADNc de Il13 amplificado se ligó en un vector pMOD utilizando los sitios de restricción NheI/XhoI (proporcionando el vector pMODB1-IL13). pMODB1-Il13 fue digerido con BamHI/XhoI y el fragmento que contenía IL13 se ligó en el vector pCEP-SP-XA-Fc*(\Deltaxho), un análogo de pCEP-SP-XA-Fc* en el que se había eliminado un sitio XhoI en el extremo de la secuencia de Fc, que había sido digerido previamente con BamHI/XhoI. El plásmido resultante de esta ligación (pCEP-SP-IL13-Fc) fue secuenciado y utilizado para transfectar células HEK-293T. El constructo de IL 13 resultante codificado por este plásmido tenía la secuencia de aminoácidos ADPGCGGGGGLA fusionada al extremo N de la secuencia de IL-13 madura. Esta secuencia comprende la secuencia del conector aminoacídico GCGGGGG flanqueada por aminoácidos adicionales introducidos durante el procedimiento de clonación. IL13-Fc pudo ser purificado con resina con Proteína-A del sobrenadante de las células transfectadas con pCEP-SP-IL13-Fc. El resultado de la expresión se muestra en la Fig. 17 B (véase el Ejemplo 10 para la descripción de las muestras). La Il-13 madura fusionada en su extremo N con la secuencia de aminoácidos anteriormente mencionada se libera tras la escisión de la proteína de fusión con Factor-Xa, conduciendo a una proteína denominada más adelante en la presente memoria " C-IL-13-F de ratón" y que tiene la secuencia del SEQ ID NO: 328. El resultado de la Fig. 17 B demuestra claramente la expresión del constructo IL-13.
b) Clonación de Il-13 de ratón (HEK-293T) para la expresión en células de mamífero con GST (Glutationa-S-transferasa) fusionada en su extremo N
El ADNc se utilizó para clonar IL-13 con una GST N-terminal originada a partir del ADNc de células T activadas con TH2 como se ha descrito antes (a.). IL-13 fue amplificado a partir de este ADNc utilizando los cebadores Nhelink1IL13-F y IL13StopXhoNot-R. El producto de la PCR se digirió con NheI y XhoI y se ligó en el vector pCEP-SP-GST-EK digerido previamente con NheI/XhoI. El plásmido que se pudo aislar de la ligación (pCEP-SP-GST-IL13) se utilizó para transfectar células HEK-293T. El constructo de IL 13 resultante codificado por este plásmido tenía la secuencia de aminoácidos LACGGGGG fusionada al extremo N de la secuencia madura de IL-13. Esta secuencia comprende la secuencia del conector aminoacídico ACGGGGG flanqueada por un aminoácido adicional introducido durante el procedimiento de clonación. El sobrenadante de cultivo de las células transfectadas con pCEP-SP-GST-IL13 contenía la proteína de fusión GST-IL13 que pudo ser purificada mediante cromatografía de afinidad con Glutationa de acuerdo con los protocolos convencionales. IL-13 madura fusionada en su extremo N con la secuencia de aminoácidos anteriormente mencionada es liberada tras la escisión de la proteína de fusión con enteroquinasa, conduciendo a una proteína denominada en adelante en la presente memoria "C-IL-13-S de ratón" y que tiene la secuencia del SEQ ID NO: 329.
B. Acoplamiento de C-IL-13-F de ratón, C-IL-13-S de ratón a la proteína de la cápside de Q\beta
Una solución de cápside de Q\beta 120 \muM en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,2 se hace reaccionar durante 30 minutos con un exceso molar de 25 veces de SMPH (Pierce), diluido a partir de una solución de partida en DMSO, a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se somete con posterioridad a diálisis dos veces durante 2 horas frente a 1 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. La mezcla de reacción de Q\beta sometida a diálisis se hace reaccionar después con la solución de C-IL-13-F de ratón o C-IL-13-S de ratón (concentraciones finales: proteína de la cápside de Q\beta 60 \muM, C-IL-13-F de ratón o C-IL-13-S de ratón 60 \muM) durante cuatro horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. Los productos del acoplamiento se analizan mediante SDS-PAGE.
C. Acoplamiento de C-IL-13-F de ratón, C-IL-13-S de ratón a proteína de la cápside de fr
Una solución de proteína de la cápside de fr 120 \muM en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,2 se hace reaccionar durante 30 minutos con un exceso molar de 25 veces de SMPH (Pierce), diluido a partir de una solución de partida en DMSO, a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se somete con posterioridad a diálisis dos veces durante 2 horas frente 1 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. La mezcla de reacción de fr sometida a diálisis se hace reaccionar después con solución C-IL-13-F de ratón o C-IL-13-S de ratón (concentraciones finales: proteína de la cápside de fr 60 \muM, C-IL-13-F de ratón o C-IL-13-S de ratón 60 \muM) durante cuatro horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. Los productos del acoplamiento se analizan mediante SDS-PAGE.
D. Acoplamiento de la solución de C-IL-13-F de ratón o C-IL-13-S de ratón a HBcAg-Lys-2cys-Mut
Una solución de cápside HBcAg-Lys-2cys-Mut 120 \muM en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,2 se hace reaccionar durante 30 minutos con un exceso molar de 25 veces de SMPH (Pierce), diluido a partir de una solución de partida en DMSO, a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se somete con posterioridad a diálisis dos veces durante 2 horas frente a 1 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. La mezcla de reacción de HBcAg-Lys-2cys-Mut sometida a diálisis se hace reaccionar después con la solución de C-IL-13-F de ratón o C-IL-13-S de ratón (concentraciones finales: HBcAg-Lys-2cys-Mut 60 \muM, C-IL-13-F de ratón o C-IL-13-S de ratón 60 \muM) durante cuatro horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. Los productos del acoplamiento se analizan mediante SDS-PAGE.
E. Acoplamiento de solución de C-IL-13-F de ratón o C-IL-13-S de ratón a Pili
Una solución de pili de Tipo 1 de E. coli 125 \muM en Hepes 20 mM, pH 7,4, se hace reaccionar durante 60 minutos con un exceso molar de 50 veces de entrecruzador SMPH, diluido a partir de una solución de partida en DMSO, a RT en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La mezcla de reacción se somete a eliminación de las sales en una columna PD-10 (Amersham-Pharmacia Biotech). Las fracciones que contienen la proteína que eluyen de la columna se reúnen, y la proteína de los pili derivatizados sometidos a eliminación de las sales se hace reaccionar con la solución de C-IL-13-F de ratón o C-IL-13-S de ratón (concentraciones finales: pili 60 \muM, C-IL-13-F de ratón o C-IL-13-S de ratón 60 \muM) durante cuatro horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. Los productos del acoplamiento se analizan mediante SDS-PAGE.
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Ejemplo 10
Clonación y expresión de Interleuquina 5 (IL-5) con un conector aminoacídico N-terminal que contiene un resto cisteína para el acoplamiento a VLP y Pili A. Clonación de IL-5 para la expresión como cuerpos de Inclusión en E. coli
Se amplificó IL-5 a partir del clon de ATCC (pmIL5-4G; número ATCC: 37562) mediante PCR utilizando los siguientes dos cebadores: Spelinker3-F1 (SEQ ID NO: 340) y Il5StopXho-R (SEQ ID NO: 342). El producto de esta PCR se utilizó como molde para una segunda PCR con los cebadores SpeNlinker3-F2 (SEQ ID NO: 341) y Il5StopXho-R. El inserto se digirió con SpeI y NotI. Este inserto se ligó en un derivado del vector pET (vector pMODEC3-8), previamente digerido con NheI y NotI (no desfosforilado), y se transformó en células de E. coli TG1. El constructo IL5 generado mediante clonación en el vector pMODEC3-8 contiene en su extremo N una etiqueta de hexa-histidina, seguida de un sitio de enteroquinasa, un conector aminoacídico gamma 3 N-terminal que contiene un resto cisteína, flanqueado C-terminalmente por la secuencia AS y N-terminalmente por la secuencia ALV, y la forma madura del gen IL 5. La proteína liberada mediante escisión con enteroquinasa se denomina "C-IL-5-E de ratón" (SEQ ID NO: 332). El ADN plasmídico del clon pMODC6-IL5.2 resultante (también denominado pMODC6-IL5), cuya secuencia había sido confirmada mediante secuenciación del ADN, se transformó en la cepa BL21 de E. coli.
Se hizo crecer el clon pMODC6-IL5/BL21 durante la noche en 5 ml de LB que contenía 1 mg/L de Ampicilina. Se diluyeron 2 ml de este cultivo en 100 ml de caldo Terrific (TB) que contenía 1 mg/L de Ampicilina. El cultivo se indujo añadiendo 0,1 ml de una solución 1 M de Isopropil-\beta-D-Tiogalactopiranósido (IPTG) cuando el cultivo alcanzó una densidad óptica DO600=0,7. Cada 2 horas se tomaron muestras de 10 ml. Las muestras se centrifugaron 10 min a 4000 x g. El sedimento se resuspendió en 0,5 ml de tampón de lisis que contenía Tris-HCl 50 mM, EDTA 2 mM, triton X-100 al 0,1% (pH 8). Después de haber añadido 20 \mul de Lisozima (40 mg/ml) y haber incubado el tubo 30 min a 4ºC, las células se sometieron a sonicación durante 2 min. Se añadieron 100 \mul de una solución de MgCl_{2} 50 mM y 1 ml de benzonasa. Las células se incubaron después 30 minutos a la temperatura ambiente y se centrifugaron 15 min a 13000 x g.
El sobrenadante se descartó y el sedimento se hirvió 5 minutos a 98ºC en 100 \mul de tampón de carga SDS. Se analizaron 10 \mul de las muestras en el tampón de carga mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras (Fig. 17 A). El gel de la Fig. 17 A demuestra claramente la expresión del constructo IL-5. Las muestras cargadas en el gel de la Fig. 17 A fueron las siguientes:
Calle M: Marcador (NEB, Marcador pre-teñido de gama amplia). Calle 1: extracto celular de 1 ml de cultivo antes de la inducción. Calle 2: extracto celular de 1 ml de cultivo 4 h después de la inducción.
B. Clonación de IL-5 para la expresión en células de mamífero (HEK-293T) a) IL-5 fusionado en su extremo N a un conector aminoacídico que contiene un resto cisteína y fusionado en su extremo C al fragmento Fc
El molde descrito en el apartado (A) (clon ATCC 37562) se utilizó para la clonación del siguiente constructo. El plásmido pMODB1-IL5 (un derivado de pET) fue digerido con BamHI/XhoI para proporcionar un fragmento pequeño que codifica IL5 fusionado a un conector aminoacídico N-terminal que contiene una cisteína. Este fragmento fue ligado en el vector pCEP-SP-XA-Fc*(\DeltaXho) que había sido digerido previamente con BamHI y XhoI. La ligación se sometió a electroporación en la cepa TG1 de E. coli y se utilizó el ADN plasmídico del clon resultante pCEP-SP-IL5-Fc.2, cuya secuencia había sido confirmada mediante secuenciación del ADN, para transfectar células HEK-293T. El constructo de Il-5 resultante codificado por este plásmido tenía la secuencia de aminoácidos ADPGCGGGGGLA fusionada al extremo N de la secuencia de IL-5 madura. Esta secuencia comprende a secuencia del conector aminoacídico GCGGGGG que contiene una cisteína y está flanqueada por aminoácidos adicionales introducidos durante el procedimiento de clonación. La proteína IL-5 liberada por escisión de la proteína de fusión con el Factor-Xa se denomina en adelante en la presente memoria "C-IL-5-F de ratón" (SEQ ID NO: 333).
Tras la transfección y la selección sobre Puromicina se analizó el sobrenadante de cultivo mediante Transferencia Western (Fig. 17 B) utilizando un anticuerpo anti-His (ratón) y anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante. El anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante también detecta las proteínas de fusión con Fc. La purificación de la proteína se realizó mediante cromatografía de afinidad sobre una resina de Proteína A. El resultado de la Fig. 17 B demuestra claramente la expresión del constructo de IL-5.
Las muestras cargadas en la Transferencia Western de la Fig. 17 B fueron las siguientes:
Calle 1: sobrenadante del cultivo de HEK que expresa IL5-Fc (20 \mul). La SDS-PAGE se realizó en condiciones reductoras. Calle 2: sobrenadante del cultivo de HEK que expresa IL13-Fc (20 \mul). La SDS-PAGE se realizó en condiciones no reductoras. Calle 3: sobrenadante del cultivo de HEK que expresa IL5-Fc (20 \mul). La SDS-PAGE se realizó en condiciones no reductoras.
b) IL-5 clonada con GST (Glutationa-S-transferasa) y un conector aminoacídico que contiene un resto cisteína fusionada en su extremo N
Se amplificó IL-5 (ATCC 37562) con los cebadores Nhe-link1-IL13-F y IL5StopXho-R. Tras la digestión con NheI y XhoI se ligó el inserto en pCEP-SP-GST-EK que había sido digerido previamente con NheI y XhoI. El plásmido resultante pCEP-SP-GST-IL5 se secuenció y se utilizó para la transfección de las células HEK-293T. El constructo IL-5 resultante codificado por este plásmido tenía la secuencia de aminoácidos LACGGGGG fusionada al extremo N de la secuencia de Il-5 madura. Esta secuencia comprende la secuencia del conector aminoacídico ACGGGGG que contiene un resto cisteína y está flanqueada por aminoácidos adicionales introducidos durante el procedimiento de clonación. La proteína liberada por escisión con enteroquinasa es denominada más adelante en la presente memoria "C-IL-5-S de ratón" (SEQ ID NO: 334). La purificación de la proteína resultante se realizó mediante cromatografía de afinidad sobre resina de afinidad con Glutationa.
C. Acoplamiento de C-IL-5-F de ratón o C-IL-5-S de ratón a proteína de la cápside de Q\beta
Una solución de proteína de la cápside de Q\beta 120 \muM en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,2 se hace reaccionar durante 30 minutos con un exceso molar de 25 veces de SMPH (Pierce), diluido a partir de una solución de partida en DMSO, a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se somete con posterioridad a diálisis dos veces durante 2 horas frente a 1 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. La mezcla de reacción de Q\beta sometida a diálisis se hace reaccionar después con la solución de C-IL-5-F de ratón o C-IL-5-S de ratón (concentraciones finales: proteína de la cápside de Q\beta 60 \muM, C-IL-5-F de ratón o C-IL-5-S de ratón 60 \muM) durante cuatro horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. Los productos del acoplamiento se analizan mediante SDS-PAGE.
D. Acoplamiento de C-IL-5-F de ratón o C-IL-5-S de ratón a proteína de la cápside de fr
Una solución de proteína de la cápside de fr 120 \muM en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,2 se hace reaccionar durante 30 minutos con un exceso molar de 25 veces de SMPH (Pierce), diluido a partir de una solución de partida en DMSO, a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se somete con posterioridad a diálisis dos veces durante 2 horas frente a 1 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. La mezcla de reacción de fr sometida a diálisis se hace reaccionar después con la solución de C-IL-5-F de ratón o C-IL-5-S de ratón (concentraciones finales: proteína de la cápside de fr 60 \muM, C-IL-5-F de ratón o C-IL-5-S de ratón 60 \muM) durante cuatro horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. Los productos del acoplamiento se analizan mediante SDS-PAGE.
E. Acoplamiento de la solución de C-IL-5-F de ratón o C-IL-5-S de ratón a HBcAg-Lys-2cys-Mut
Una solución de cápside de HBcAg-Lys-2cys-Mut 120 \muM en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,2 se hace reaccionar durante 30 minutos con un exceso molar de 25 veces de SMPH (Pierce), diluido a partir de una solución de partida en DMSO, a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se somete con posterioridad a diálisis dos veces durante 2 horas frente a 1 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. La mezcla de reacción de HBcAg-Lys-2cys-Mut sometida a diálisis se hace reaccionar después con la solución de C-IL-5-F de ratón o C-IL-5-S de ratón (concentraciones finales: HBcAg-Lys-2cys-Mut 60 \muM, C-IL-5-F de ratón o C-IL-5-S de ratón 60 \muM) durante cuatro horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. Los productos del acoplamiento se analizan mediante SDS-PAGE.
F. Acoplamiento de la solución de C-IL-5-F de ratón o C-IL-5-S de ratón a Pili
Una solución de pili de Tipo 1 125 \muM de E. coli en Hepes 20 mM, pH 7,4, se hace reaccionar durante 60 minutos con un exceso molar de 50 veces de entrecruzador SMPH, diluido a partir de una solución de partida en DMSO, a RT en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La mezcla de reacción se somete a eliminación de las sales en una columna PD-10 (Amersham-Pharmacia Biotech). Las fracciones que contienen proteína que eluyen de la columna se reúnen, y la proteína de los pili derivatizada sometida a eliminación de las sales se hace reaccionar con C-IL-5-F de ratón o C-IL-5-S de ratón (concentraciones finales: pili 60 \muM, C-IL-5-F de ratón o C-IL-5-S de ratón 60 \muM) durante cuatro horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. Los productos del acoplamiento se analizan mediante SDS-PAGE.
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Ejemplo 11
Introducción de un conector aminoacídico que contiene un resto cisteína, expresión, purificación y acoplamiento de un fragmento del factor de crecimiento endotelial vascular-2 murino (mVEGFR-2, FLK1)
Se expresó recombinantemente un constructo del factor de crecimiento endotelial vascular-2 murino (mVEGFR-2, FLK-1) que comprendía su segundo y su tercer dominios extracelulares en forma de una proteína de fusión con Fc con un conector aminoacídico que contenía un resto cisteína en su extremo C para el acoplamiento a VLP y Pili. La secuencia de proteína del mVEGFR-2(2-3) fue traducida a partir de las secuencias del ADNc de FLK-1 de ratón ((Matthews et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9026-9030 (1991)): Núm. de Acceso: X59397; dominio 2 de tipo C2 similar a Ig: aminoácido 143-209; dominio 3 de tipo C2 similar a Ig: aminoácido 241-306). El constructo mVEGFR-2 (2-3) comprende la secuencia del VEGFR-2 desde el aminoácido prolina126 a lisina329 (en la numeración de la proteína precursora). El constructo también comprende, además de lo dominios 2 y 3 de tipo C2 similar a Inmunoglobulina, regiones limítrofes que preceden el dominio 2 y siguientes al dominio 3 en la secuencia de mVEGFR-2, para añadir radicales espaciadores de aminoácidos. Se fusionó un conector aminoacídico que contenía un resto cisteína al extremo C de la secuencia de mVEGFR-2 a través de la clonación en el vector pCEP-SP-EK-Fc* (Ejemplo 1). El fragmento de mVEGFR-2 clonado en el vector pCEP-SP-EK-Fc* codificó la siguiente secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 345):
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Expresión de mVEGFR-2(2-3) recombinante en células eucarióticas
Se expresó el mVEGFR-2(2-3) recombinante en células EBNA 293 utilizando el vector pCEP-SP-EK-Fc*. El vector pCEP-SP-EK-Fc* tiene un sitio BamHI y un sitio Nhel, codifica un conector aminoacídico que contiene un resto cisteína, un sitio de escisión de enteroquinasa, y una región Fc humana en posición C-terminal. El mVEGFR-2(2-3) se amplificó mediante PCR con el par de cebadores BamH1-FLK1-F y Nhe1-FLK1-B de un ADNc de embrión de 7 días de ratón (Marathon-Ready cDNA, Clontech). Para la reacción de PCR, se utilizaron 10 pmoles de cada oligo y 0,5 ng del ADNc (ADNc de embrión de 7 días de ratón Marathon-Ready cDNA, Clontech) en la mezcla de reacción 50 \bullet 1 (1 \bullet I de mezcla de polimerasa Advantage 2 (50x), dNTP 0,2 mM y 5 \bullet 1 10x tampón para reacción de PCR de ADNc). Los ciclos de temperatura fueron los siguientes: 5 ciclos a 94ºC durante 1 minuto, 94ºC durante 30 segundos, 54ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 1 minuto seguido de 5 ciclos de 94ºC (30 segundos), 54ºC (30 segundos), 70ºC (1 minuto) y seguido de 30 ciclos 94ºC (20 segundos), 54ºC (30 segundos) y 68ºC (1 minuto). El producto de la PCR se digirió con BamH1 y Nhe1 y se insertó en el vector pCEP-SP-EK-Fc* digerido con las mismas enzimas. El plásmido resultante se denominó mVEGFR-2(2-3)-pCep-EK-Fc. Todas las demás etapas se realizaron mediante protocolos de la biología molecular convencionales.
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Oligos
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Transfección y expresión de mVEGFR-2(2-3) recombinante. Se transfectaron células EBNA 293 con el constructo mVEGFR-2(2-3)-pCep-Ek-Fc descrito antes y se recogió el sobrenadante sin suero de las células para la purificación como se describe en el Ejemplo 1.
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Purificación de mVEGFR-2(2-3) recombinante
Se realizó la purificación en Proteína A de las proteínas Fc-EK-mVEGFR-2(2-3) expresadas como se describe en el Ejemplo 1. Con posterioridad, después de la unión de la proteína de fusión a la Proteína A, se escindió mVEGFR-2(2-3) de la porción Fc unida a la proteína A utilizando enteroquinasa (EnterokinaseMax, Invitrogen). La digestión se realizó durante la noche a 37ºC (2,5 unidades de enteroquinasa/100 \mul de cuentas de Proteína A con proteína de fusión unida). El VEGFR-2(2-3) liberado se separó de la porción Fc todavía unida a las cuentas de proteína A mediante una centrifugación corta en columnas de cromatografía (Micro Bio Spin, Biorad). Con el fin de separar la enteroquinasa se trató el flujo continuo con enteroquinasa (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
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Ejemplo 12
Acoplamiento del péptido VEGFR-2 murino a la proteína de la cápside de Q\beta, HbcAg-lys-2cys-Mut y Pili e inmunización de ratones con vacunas de VLP-péptido y Pili-péptido A. Acoplamiento de péptidos VEGFR-2 murinos a VLP y pili
Se sintetizaron químicamente los siguientes péptidos (por Eurogentec, Belgica): péptido VEGFR-2 murino CTARTELNVGLDFTWHSPPSKSHHKK y se utilizaron para el acoplamiento químico a Pili como se describe más abajo.
Acoplamiento del péptidos VEGFR-2 murinos a pili: Una solución de 1400 \mul de proteína de pili de 1 mg/ml en Hepes 20 mM, pH 7,4, se hizo reaccionar durante 60 minutos con 85 \mul de una solución de Sulfo-MBS 100 mM (Pierce) en (H_{2}O) a RT en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La mezcla de reacción se sometió a eliminación de las sales en una columna PD-10 (Amersham-Pharmacia Biotech). Las fracciones que contenían proteína que eluían de la columna se reunieron (conteniendo aproximadamente 1,4 mg de proteína) y se hicieron reaccionar con un exceso molar de 2,5 veces (volumen final) de péptido VEGFR-2 murino respectivamente. Por ejemplo, a 200 \mul de producto eluido que contenía aproximadamente 0,2 mg de pili derivatizados, se añadieron 2,4 \mul de una solución de péptido 10 mM (en DMSO). La mezcla se incubó durante cuatro horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio y con posterioridad se sometió a diálisis frente a 2 litros de Hepes 20 mM, pH 7,2 durante la noche a 4ºC. Los resultados del acoplamiento se analizaron mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras y se muestran en la Fig. 18 A. Se cargaron el sobrenadante (S) y el sedimento (P) de cada muestra en el gel, así como los pili y los pili derivatizados con entrecruzador Sulfo-MBS (Pierce). Las muestras cargadas en el gel de la Fig. 18 A fueron las siguientes:
Calle 1: Proteínas marcadoras; calle 2-5: muestras acopladas (Pili murinos: Pili acoplados a péptido murino; Pili humanos: Pili acoplados a péptidos humanos); calle 6: pili derivatizados con entrecruzador Sulfo-MBS; calle 7-9: tres fracciones del producto eluido de la columna PD-10. La fracción 2 es la fracción pico, las fracciones 1 y 3 son las fracciones tomadas en el borde del pico. Las bandas del acoplamiento fueron claramente visibles en el gel, demostrando el acoplamiento exitoso de VEGFR-2 murino a los pili.
Acoplamiento del péptido VEGFR-2 murino a la proteína de la cápside de Q\beta: Una solución de 1 ml de proteína de la cápside de Q\beta de 1 mg/ml en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,4 se hizo reaccionar durante 45 minutos con 20 \mul de solución de Sulfo-MBS (Pierce) 100 mM en (H_{2}O) a RT en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se sometió a diálisis con posterioridad dos veces durante 2 horas frente a 2 L de Hepes 20 mM, pH 7,4 a 4ºC. Después se hicieron reaccionar 1000 \mul de la mezcla de reacción sometida a diálisis con 12 \mul de una solución de péptido 10 mM (en DMSO) durante cuatro horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La mezcla de reacción se sometió a diálisis con posterioridad 2x2 horas frente a 2 litros de Hepes 20 mM, pH 7,4 a 4ºC. Los resultados del acoplamiento se analizaron mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras y se muestran en la Fig. 18 B. El sobrenadante (S) de cada muestra se cargó en el gel, así como la proteína de la cápside de Q\beta y la proteína de la cápside de Q\beta derivatizada con entrecruzador Sulfo-MBS. El acoplamiento se realizó por duplicado. Se cargaron en el gel las siguientes muestras:
Calle 1: Proteínas marcadoras; calle 2, 5: proteína de la cápside de Q\beta; calle 3, 6 proteína de la cápside de Q\beta derivatizada con Sulfo-MBS; calle 4, 7: proteína de la cápside de Q\beta acoplada al péptido VEGFR-2 murino. Las bandas de acoplamiento fueron claramente visibles en el gel, demostrando el acoplamiento exitoso del VEGFR-2 murino a la proteína de la cápside de Q\beta.
Acoplamiento del péptido VEGFR-2 murino a HbcAg-lys-2cys-Mut: Una solución de 3 ml de proteína de la cápside de HbcAg sin cisteína de 0,9 mg/ml (Ejemplo 31) en PBS, pH 7,4 se hizo reaccionar durante 45 minutos con 37,5 \mul de una solución de Sulfo-MBS (Pierce) 100 mM en (H_{2}O) a RT en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se sometió a diálisis con posterioridad durante la noche frente a 2 L de Hepes 20 mM, pH 7,4. Después de cambiar el tampón la solución de reacción se sometió a diálisis durante otras 2 horas frente al mismo tampón. La mezcla de reacción sometida a diálisis se hizo reaccionar después con 3 \mul de una solución de péptido 10 mM (en DMSO) durante 4 horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La mezcla de reacción se sometió a diálisis con posterioridad frente a 2 litros de Hepes 20 mM, pH 7,4 durante la noche a 4ºC seguido de cambio del tampón y otras 2 horas de diálisis frente al mismo tampón. Los resultados del acoplamiento se analizaron mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras y se muestran en la Fig. 18 C. El sobrenadante (S) de cada muestra se cargó en el gel, así como la proteína HbcAg-lys-2cys-Mut proteína y la proteína HbcAg-lys-2cys-Mut derivatizada con entrecruzador Sulfo-MBS. El acoplamiento se realizó por duplicado. Las reacciones de acoplamiento se condujeron en un exceso molar de 2,5 veces y 10 veces de péptido. Se cargaron las siguientes muestras en el gel:
Calle 1: Proteínas marcadoras; calle 2, 4, 6, 8: Sobrenadante (S) y sedimento (P) de las reacciones de acoplamiento realizadas con un exceso molar de 10 veces de péptido; calle 3, 5, 7, 9: Sobrenadante (S) y sedimento (P) de las reacciones de acoplamiento realizadas con un exceso molar de 2,5 veces de péptido; calle 10: HbcAg-lys-2cys-Mut derivatizado con Sulfo-MBS; calle 11: HbcAg-lys-2cys-Mut.
Las bandas de acoplamiento fueron claramente visibles en el gel, demostrando el acoplamiento exitoso del VEGFR-2 murino a la proteína HbcAg-lys-2cys-Mut.
B. Inmunización de ratones Vacuna de Pili-péptido
Se vacunaron ratones C3H-Hej hembra (carentes del receptor 4 de tipo Toll) y C3H-HeN (tipo salvaje) con el péptido VEGFR-2 murino acoplado a la proteína de los sin la adición de coadyuvantes. Se diluyeron aproximadamente 100 \mug de proteína total de cada muestra en PBS a 200 \mul y se inyectaron subcutáneamente el día 0, el día 14 y el día 28. Se tomaron muestras de los ratones por punción retroorbital el día 14, 28 y el día 42 y se analizó el suero el día 42 utilizando un ELISA específico para VEGFR-2 humano.
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Vacuna de proteína de la cápside de QB-péptido
Se vacunaron ratones Black 6 hembra con el péptido VEGFR-2 murino acoplado a la proteína de la cápside de Q\beta con y sin la adición de coadyuvante (Hidróxido de aluminio). Se diluyeron aproximadamente 100 \mug de proteína total de cada muestra en PBS a 200 \mul y se inyectaron subcutáneamente el día 0, el día 14 y el día 28. Se tomaron muestras de sangre de los ratones mediante punción retroorbital el día 14, 28 y el día 42 y se analizó el suero el día 42 utilizando un ELISA específico para VEGFR-2 humano.
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Vacunas de HbcAg-lys-2cys-Mut
Se vacunaron ratones Black 6 hembra con el péptido VEGFR-2 murino acoplado a la proteína HbcAg-lys-2cys-Mut con y sin la adición de coadyuvante (Hidróxido de aluminio). Se diluyeron aproximadamente 100 \mug de proteína total de cada muestra en PBS a 200 \mul y se inyectaron subcutáneamente en día 0, el día 14 y el día 28. Se tomaron muestras de sangre de los ratones mediante punción retroorbital el día 14, 28 y el día 42 y se analizó el suero el día 42 utilizando un ELISA específico para VEGFR-2 humano.
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C. ELISA
Se sometieron a ensayo los sueros de los ratones inmunizados en un ELISA con péptido VEGFR-2 murino inmovilizado. Se acopló el péptido VEGFR-2 murino a ARNasa bovina utilizando el entrecruzador químico Sulfo-SPDP. Las placas de ELISA se recubrieron con ARNasa A acoplada a una concentración de 10 \mug/ml. Las placas se bloquearon y después se incubaron con sueros de ratón diluido seriadamente. Los anticuerpos unidos se detectaron con anticuerpo IgG anti-ratón marcado enzimáticamente. Como control, también se sometieron a ensayo sueros preinmunes de los mismos ratones. Los experimentos de ELISA de control utilizando sueros de ratones inmunizados con portador no acoplado mostraron que los anticuerpos detectados eran específicos para los respectivos péptidos. Los resultados se muestran en la Figura 4-6.
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Vacuna de pili-péptido
El resultado del ELISA se muestra en la Fig. 18 D. Los resultados para las diluciones de suero indicadas se muestran como la densidad óptica a 450 nm. Se muestran las medias de tres ratones (incluyendo las desviaciones típicas). Todos los ratones vacunados elaboraron títulos de anticuerpo IgG frente al péptido VEGFR-2 murino. No se observaron diferencias entre los ratones carentes el receptor 4 de tipo Toll y los ratones de tipo salvaje, demostrando la inmunogenicidad del péptido VEGFR-2 murino auto-antígeno, cuando se acoplaba a los pili, en ratones. Las vacunas inyectadas en los ratones están designando los correspondientes sueros analizados.
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Vacuna de proteína de la cápside de Q\beta-péptido
Los resultados para las diluciones de suero indicadas se muestran en la Fig. 18 E como la densidad óptica a 450 nm. Se muestran las medias de dos ratones (incluyendo las desviaciones típicas). Todos los ratones vacunados elaboraron títulos de anticuerpo IgG frente al péptido VEGFR-2 murino, demostrando la inmunogenicidad del péptido VEGFR-2 murino auto-antígeno, cuando se acoplaba a la proteína de la cápside de Q\beta, en ratones. Las vacunas inyectadas en los ratones están designando los correspondientes sueros analizados.
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Vacuna de HbcAg-lys-2cys-Mut
Los resultados para las diluciones de suero indicadas se muestran en la Fig. 18 F como la densidad óptica a 450 nm. Se muestran las medias de tres ratones (incluyendo las desviaciones típicas). Todos los ratones vacunados elaboraron títulos de anticuerpo IgG frente al péptido VEGFR-2 murino, demostrando la inmunogenicidad del péptido VEGFR-2 murino auto-antígeno, cuando se acoplaba a la proteína de la cápside de Q\beta, en ratones. Las vacunas inyectadas en los ratones están designando los correspondientes sueros analizados.
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Ejemplo 13
Acoplamiento péptidos A\beta 1-15 a proteína de la cápside de HBc-Ag-lys-2cys-Mut y fr
Se sintetizó químicamente el siguiente péptido A\beta (DAEFRHDSGYEVHHQGGC), un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos desde el resto 1-15 de A\beta humano, fusionado en su extremo C a la secuencia GGC para el acoplamiento a VLP y Pili.
A.
a.) Acoplamiento del péptido A\beta 1-15 a HBc-Ag-lys-2cys-Mut utilizando el entrecruzador SMPH
Una solución de 833,3 \mul de proteína HBc-Ag-lys-2cys-Mut de 1,2 mg/ml en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,4 se hizo reaccionar durante 30 minutos con 17 \mul de una solución de SMPH 65 mM (Pierce) en H_{2}O, a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se sometió a diálisis con posterioridad dos veces durante 2 horas frente a 1 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a 4ºC en un tubo de diálisis con un corte de Peso Molecular de 10000 Da. Después se hicieron reaccionar 833,3 \mul de la mezcla de reacción sometida a diálisis con 7,1 \mul de una solución de partida de péptido 50 mM (solución de partida de péptido en DMSO) durante dos horas a 15ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La mezcla de reacción se sometió a diálisis con posterioridad durante la noche frente a 1 litro de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a 4ºC. Después la muestra se congeló en alícuotas en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80ºC hasta la inmunización de los ratones.
b) Acoplamiento del péptido A\beta 1-15 a proteína de la cápside de fr utilizando el entrecruzador SMPH
Una solución de 500 \mul de proteína de la cápside de fr de 2 mg/ml en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,4 se hizo reaccionar durante 30 minutos con 23 \mul de una solución de SMPH 65 mM (Pierce) en H_{2}O, a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se sometió a diálisis con posterioridad dos veces durante 2 horas frente a 1 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a 4ºC en un tubo de diálisis con un corte de Peso Molecular de 10000 Da. Después se hicieron reaccionar 500 \mul de la mezcla de reacción sometida a diálisis con 5,7 \mul de una solución de partida de péptido 50 mM (solución de partida de péptido en DMSO) durante dos horas a 15ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La mezcla de reacción se sometió a diálisis con posterioridad durante la noche frente a 1 litro de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a 4ºC. La muestra se congeló después en alícuotas e nitrógeno líquido y se almacenó a -80ºC hasta la inmunización de los ratones. Las muestras de la reacción de acoplamiento se analizaron mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras.
Los resultados de los experimentos de acoplamiento se analizaron mediante SDS-PAGE, y se muestran en la Fig. 19 A. Fueron visibles en el gel claras bandas de acoplamiento correspondientes al acoplamiento de A\beta 1-15 a proteína de la cápside de fr o a HBc-Ag-lys-2cys-Mut, y están indicadas por flechas en la figura, demostrando el acoplamiento exitoso de A\beta 1-15 a la proteína de la cápside de fr y a proteína de la cápside de HBc-Ag-lys-2cys-Mut. Fueron visibles múltiples bandas de acoplamiento para el acoplamiento a la proteína de la cápside de fr, mientras fue visible principalmente una banda de acoplamiento para HBc-Ag-lys-2cys-Mut.
Se cargaron las siguientes muestras en el gel de la Fig. 19 A.
1:
Marcador de Proteína (kDa Marker 7708S BioLabs. bandas marcadoras del peso molecular desde la parte superior del gel: 175, 83, 62, 47,5, 32,5, 25, 16,5, 6,5 kDa). 2: HBc-Ag-lys-2cys-Mut derivatizado. 3: HBc-Ag-lys-2cys-Mut acoplado con A\beta1-15, sobrenadante de la muestra tomada al final de la reacción de acoplamiento, y centrifugada. 4: HBc-Ag-lys-2cys-Mut acoplado con A\beta1-15, sedimento de la muestra tomada al final de la reacción de acoplamiento, y centrifugada. 5: proteína de la cápside de fr derivatizada. 6: proteína de la cápside de fr acoplada con A\beta1-15, sobrenadante de la muestra tomada al final de la reacción de acoplamiento, y centrifugada. 4: proteína de la cápside de fr acoplada con A\beta1-15, sedimento de la muestra tomada al final de la reacción de acoplamiento, y centrifugada.
B. Inmunización de ratones Balb/c
Se vacunaron ratones Balb/c hembra dos veces el día 0 y el día 14 subcutáneamente con 10 \mug de proteína de la cápside de fr acoplada a A\beta 1-15 (Fr-AB 1-15) o 10 \mug de HBc-Ag-lys-2cys-Mut acoplado a A\beta 1-15 (HBc-A\beta1-15) diluido en PBS estéril. Se tomaron muestras de sangre de los ratones mediante punción retroorbital el día 22 y se analizaron los sueros en un ELISA específico para A\beta-1-15.
C. ELISA
Se acopló el péptido A\beta 1-15 a ARNasa bovina utilizando el entrecruzador químico sulfo-SPDP. Las placas de ELISA se recubrieron con producto conjugado de A\beta 1-15-ARNasa a una concentración de 10 \mug/ml. Las placas se bloquearon y después se incubaron con muestras de suero diluidas seriadamente. Los anticuerpos unidos se detectaron con IgG anti-ratón marcada enzimáticamente. Como control, también se sometió a ensayo suero de un ratón no sometido a tratamiento previo.
En la Fig. 19 B se muestran las señales de ELISA obtenidas el día 22 con los sueros de los ratones inmunizados con las vacunas de Fr-A\beta 1-15, y HBc-A\beta1-15 respectivamente. También se incluyó un suero de control de un ratón no sometido a tratamiento previo (suero preinmune). Los resultados de las diferentes diluciones de suero se muestran como la densidad óptica a 450 nm. Se muestran los resultados medios de tres ratones vacunados. Todos los ratones vacunados tenían anticuerpos IgG específicos para A\beta 1-15 en su suero.
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Ejemplo 14
Acoplamiento de los péptidos A\beta 1-15, A\beta 1-27 y A\beta 33-42 a Pili de Tipo 1 Acoplamiento péptidos A\beta 1-15, A\beta 1-27 y A\beta 33-42 a Pili utilizando el entrecruzador SMPH
Se sintetizaron químicamente los siguientes péptidos A\beta:
DAEFRHDSGYEVHHQGGC ("A\beta 1-15"), un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos del resto 1-15 de A\beta humano, fusionado en su extremo C a la secuencia GGC para el acoplamiento a Pili y VLP,
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNGGC ("A\beta 1-27") un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos del resto 1-27 A\beta humano, fusionado en su extremo C a la secuencia GGC para el acoplamiento a Pili y VLP, y
CGHGNKSGLMVGGVVIA ("A\beta 33-42") un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos del resto 33-42 de A\beta, fusionado en su extremo N a la secuencia CGHGNKS para el acoplamiento a Pili y VLP. Los tres péptidos fueron fusionados para el acoplamiento químico a Pili como se describe a continuación.
Una solución de 2 ml de Pili de 2 mg/ml en Hepes 20 mM NaCl 150 mM pH 7,4 se hizo reaccionar durante 45 minutos con 468 \mul de una solución de SMPH 33,3 mM (Pierce) en H_{2}O, a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se cargó en una columna PD10 (Pharmacia) y se hizo eluir con 6 X 500 \mul de Hepes 20 mM NaCl 150 mM pH 7,4. Las fracciones se analizaron mediante aplicación de microgotas sobre Nitrocelulosa (Schleicher & Schuell) y se tiñeron con Amidoblack. Se reunieron las fracciones 3-6. Las muestras se congelaron después en alícuotas en Nitrógeno líquido y se almacenaron a -80ºC hasta el acoplamiento.
Después se mezclaron 200 \mul de la mezcla de reacción sometida a eliminación de las sales descongelada con 200 \mul de DMSO y 2,5 \mul de cada uno de las correspondientes soluciones de partida de péptido 50 mM en DMSO, durante 3,5 horas a RT en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. Se sometieron a diálisis con posterioridad 400 \mul de la mezcla de reacción tres veces durante una hora frente a 1 litro de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a 4ºC en un tubo de diálisis con un cote de Peso Molecular de 10000 Da. Luego se congelaron las muestras en alícuotas en Nitrógeno líquido y se almacenaron a -80ºC.
La preparación de la muestra para la SDS-Page se realizó como sigue: se incubaron 100 \mul de la mezcla de reacción de acoplamiento sometida a diálisis durante 10 minutos en TCA al 10% sobre hielo, con posterioridad se centrifugaron. El sedimento se resuspendió en 50 \mul de solución de Guanidina-HCl 8,5 M y se incubó durante 15 minutos a 70ºC. Las muestras se precipitaron después con etanol, y después de una segunda etapa de centrifugación, el sedimento se resuspendió en tampón de muestra.
Los resultados de los experimentos de acoplamiento se analizaron mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras. Fueron visibles claras bandas de acoplamiento para los tres péptidos, demostrando el acoplamiento de los péptidos A\beta a Pili.
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Ejemplo 15
Vacunación de ratones APP23 con péptidos A\beta acoplados a proteína de la cápside de Q\beta A. Inmunización de ratones APP23
Se acoplaron tres péptidos A\beta diferentes (A\beta1-27-Gly-Gly-Cys-NH2; H-Cys-Gly-His-Gly-Asn-Lys-Ser-A\beta 33-42; A\beta 1-15-Gly-Gly-Cys-NH2) a la proteína de la cápside de Q\beta. Las vacunas resultantes se denominaron "Qb-Ab 1-15", "Qb-Ab 1-27" y "Qb-Ab 33-42". Para la vacunación se utilizaron ratones APP23 hembra de ocho meses de edad que portaban un transgén APP humano (Sturchler-Pierrat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 13287-13292 (1997)). Los ratones fueron inyectados subcutáneamente con 25 \mug de vacuna diluida en PBS estéril y 14 días más tarde recibieron un refuerzo con la misma cantidad de vacuna. Se tomaron muestras de sangre de la vena de la cola de los ratones antes del inicio de la inmunización y 7 días después de la inyección de refuerzo. Los sueros se analizaron mediante ELISA.
B. ELISA
Se elaboraron soluciones de partida del péptido A\beta 1-40 y A\beta 1-42 en DMSO y se diluyeron en tampón de recubrimiento antes del uso. Las placas de ELISA se recubrieron con 0,1 \mug/pocillo de péptido A\beta 1-40 o A\beta 1-42. Las placas se bloquearon y después se incubaron con suero de ratón diluido seriadamente. Se detectaron anticuerpos unidos con anticuerpo IgG anti-ratón marcado enzimáticamente. Como control, también se incluyeron sueros obtenidos antes de la vacunación. Se calculó la dilución en suero que mostraba tres desviaciones típicas de la media por encima de la línea base y se definió como "título de ELISA". Las tres vacunas sometidas a ensayo fueron inmunogénicas en ratones APP23 e indujeron elevados títulos de anticuerpo frente a los péptidos A\beta 1-40 y/o A\beta 1-42. Los resultados se muestran en la Fig. 20. No se detectaron anticuerpos específicos en los sueros preinmunes de los mismos ratones (no mostrado).
En la Fig. 20 se muestran las señales de ELISA obtenidas el día 22 con los sueros de los ratones inmunizados con las vacunas Pr-A\beta 1-15, y HBc-A\beta1-15 respectivamente. También se incluyó un suero de control de un ratón no sometido a tratamiento previo (suero preinmune). Los resultados de las diferentes diluciones de suero se muestran como la densidad óptica a 450 nm. Se muestran los resultados medio de los tres ratones vacunados.
Los ratones A21-A30 recibieron la vacuna Qb-Ab 1-15, los ratones A31-A40 recibieron Qb-Ab 1-27 y los ratones A41-49 recibieron Qb-Ab 33-42. Para cada ratón, se determinaron los títulos de anticuerpos en suero específicos para los péptidos A\beta 1-40 y A\beta 1-42 el día 21 mediante ELISA. Los títulos de ELISA definidos como la dilución de suero que muestra tres desviaciones típicas de la media por encima de la línea base se muestran para los ratones individuales. Los ratones vacunados con Qb-Ab 1-15 o Qb-Ab 1-27 elaboraron elevados títulos de anticuerpo frente a A\beta 1-40 y A\beta 1-42 mientras los ratones vacunados con Qb-Ab 33-42 tuvieron solamente elevados títulos de anticuerpos frente al péptido A\beta 1-42.
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Ejemplo 16
Acoplamiento de fragmentos de anticuerpo Fab a la proteína de la cápside de Q\beta
Una solución de proteína de la cápside de Q\beta de 4,0 mg/ml en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,2 se hizo reaccionar durante 30 minutos con SMPH 2,8 mM (Pierce) (a partir de una solución de partida disuelta en DMSO) a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se sometió a diálisis con posterioridad dos veces durante 2 horas frente a 2 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC.
El fragmento Fab de la IgG humana, producido mediante digestión con papaína de IgG humana, se adquirió de Jackson Immunolab. Esta solución (11,1 mg/ml) se diluyó a una concentración de 2,5 mg/ml en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,2 y se dejó reaccionar con diferentes concentraciones (0-1000 \muM) de ditiotreitol (DTT) o tricarboxietilfosfona (TCEP) durante 30 minutos a 25ºC.
El acoplamiento fue inducido mezclando la solución de proteína de la cápside de Q\beta derivatizada y sometida a diálisis con solución de Fab no reducida o reducida (concentraciones finales: 1,14 mg/ml de Q\beta y 1,78 mg/ml de Fab) y continuó durante la noche a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio.
Los productos de la reacción se analizaron sobre geles de SDS-PAGE al 16% en condiciones reductoras. Los geles se tiñeron con Azul Brillante de Coomassie. Los resultados se muestran en la Fig. 21.
Se pudo detectar un producto de acoplamiento de aproximadamente 40 kDa en las muestras en las que Fab había sido reducido antes del acoplamiento por TCEP 25-1000 \muM y DTT 25 - 100 \muM (Fig. 21, flecha), pero no con TCEP 10 \muM, DTT 10 \muM o DTT 1000 \muM. La banda acoplada también reaccionó con un antisuero anti-Q\beta (datos no mostrados) demostró claramente el acoplamiento covalente del fragmento Fab a la proteína de la cápside de Q\beta. Las muestras cargadas en el gel de la Fig. 21 fueron las siguientes:
Calle 1: Marcador de peso molecular. Calle 2 y 3: proteína de la cápside de Q\beta antes del acoplamiento. Calle 4-13: reacciones de acoplamiento Q\beta-Fab después de la reducción de Fab con 4: reacciones de acoplamiento Q\beta-Pab después de la reducción de Fab con TCEP 10 \muM. 5: reacciones de acoplamiento Q\beta-Fab después de la reducción de Fab con TCEP 25 \muM. 6: reacciones de acoplamiento Q\beta-Fab después de la reducción de Fab con TCEP 50 \muM, 7: reacciones de acoplamiento Q\beta-Fab después de la reducción de Fab con TCEP 100 \muM. 8: reacciones de acoplamiento Q\beta-Fab después de la reducción de Fab con TCEP 1000 \muM. 9: reacciones de acoplamiento Q\beta-Fab después de la reducción de Fab con DTT 10 \muM. 10: reacciones de acoplamiento Q\beta-Fab después de la reducción de Fab con DTT 25 \muM. 11: reacciones de acoplamiento Q\beta-Fab después de la reducción de Fab con DTT 50 \muM. 12: reacciones de acoplamiento Q\beta-Fab después de la reducción de Fab con DTT 100 \muM. 13: reacciones de acoplamiento Q\beta-Fab después de la reducción de Fab con DTT 1000 \muM. Calle 14: Fab antes del acoplamiento. El se tiñó con Azul Brillante de Coomassie. Los pesos moleculares de las proteínas marcadoras se dan en el margen izquierdo. La flecha indica la banda acoplada.
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Ejemplo 17
Vacunación de ratones APP23 con péptidos A\beta acoplados a la proteína de la cápside de Q\beta A. Inmunización de ratones APP23
Se acoplaron tres péptidos A\beta diferentes (A\beta 1-27-Gly-Gly-Cys-NH2; H-Cys-Gly-His-Gly-Asn-Lys-Ser-A\beta 33-42; A\beta 1-15-Gly-Gly-Cys-NH2) a la proteína de la cápside de Q\beta. Las vacunas resultantes se denominaron "Qb-Ab 1-15", "Qb-Ab 1-27" y "Qb-Ab 33-42". Para la vacunación se utilizaron ratones APP23 hembra de 8 meses de edad que portan un transgen APP humano (Sturchler-Pierrat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 13287-13292 (1997)). Los ratones se inyectaron subcutáneamente con 25 \mug de vacuna diluidos en PBS estéril y 14 días mas tarde recibieron un refuerzo con la misma cantidad de vacuna. Se tomaron muestras de sangre de la vena de la cola de los ratones antes del inicio de la inmunización y 7 días después de la inyección de refuerzo. Los sueros se analizaron mediante ELISA.
B. ELISA
Se elaboraron soluciones de partida de péptido A\beta 1-40 y A\beta 1-42 en DMSO y se diluyeron en tampón de recubrimiento antes de su uso. Se recubrieron las placas de ELISA con 0,1 \mug/pocillo de péptido A\beta 1-40 o A\beta 1-42 péptido. Las placas se bloquearon y después se incubaron con suero de ratón diluido seriadamente. Se detectaron los anticuerpos unidos con anticuerpo IgG anti-ratón marcado enzimáticamente. Como control, también se incluyeron los sueros obtenidos antes de la vacunación. Se calculó la dilución de suero que mostraba tres desviaciones típicas de la media por encima de la línea base y se definió como "título de ELISA". Las tres vacunas sometidas a ensayo fueron inmunogénicas en ratones APP23 e indujeron elevados títulos de anticuerpo frente a los péptidos A\beta 1-40 y/o A\beta 1-42. Los resultados se muestran en la Fig. 20. No se detectaron anticuerpos específicos en los sueros preinmunes de los mismos ratones (no mostrado).
En la Fig. 20 se muestran las señales de ELISA obtenidas el día 22 con los sueros de los ratones inmunizados con vacunas Qb-Ab 1-15, Qb-Ab 1-27 y Qb-Ab 33-42, respectivamente. Los ratones A21-A30 recibieron la vacuna Qb-Ab 1-15, los ratones A31-A40 recibieron Qb-Ab 1-27 y los ratones A41-49 recibieron Qb-Ab 33-42. Para cada ratón, se determinaron los títulos de anticuerpo en suero específicos para los péptidos A\beta 1-40 y A\beta 1-42 el día 21 mediante ELISA. Los títulos del ELISA definidos como dilución de suero que muestra tres desviaciones típicas de la media por encima de la línea base se muestran para los ratones individuales. Los ratones vacunados con Qb-Ab 1-15 o Qb-Ab 1-27 elaboraron elevados títulos de anticuerpos frente a A\beta 1-40 y A\beta 1-42 mientras los ratones vacunados con Qb-Ab 33-42 tenían solamente elevados títulos de anticuerpo frente al péptido A\beta 1-42. Las respuestas inmunitarias muy fuertes obtenidas con los péptidos A\beta humanos en los ratones transgénicos que expresan el transgén A\beta humano, demuestran que se puede superar la tolerancia hacia el auto-antígeno mediante acoplamiento de péptidos A\beta a la proteína de la cápside de Q\beta.
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Ejemplo 18
Construcción, expresión y purificación de proteínas de la envoltura de Q\beta mutantes. Construcción de pQ\beta-240
Se utilizó el plásmido pQ\beta10 (Kozlovska, TM, et al., Gene 137:133-137) como plásmido inicial para la construcción de pQ\beta-240. Se creó la mutación Lys13\rightarrowArg mediante PCR inversa. Los cebadores inversos se diseñaron en direcciones cola-con-cola invertidas:
5'-GGTAACATCGGTCGAGATGGAAAACAAACTCTGGTCC-3' y
5'-GGACCAGAGTTTGTTTTCCATCTCGACCGATGTTACC-3'.
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Los productos de la primera PCR se utilizaron como moldes para la segunda reacción de PCR, en la que se utilizaron un cebador aguas arriba
5'-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3' y un cebador aguas abajo
5'-CGATGCATITCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3'.
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El producto de la segunda PCR fue digerido con XbaI y Mph11031 y clonado en el vector de expresión pQ\beta10, que fue escindido por las mismas enzimas de restricción. Las reacciones de PCR se realizaron con los reactivos del kit para PCR y de acuerdo con el protocolo del productor (MBI Fermentas, Vilnius, Lituania).
La secuenciación utilizando el método de incorporación de la marca directa verificó las mutaciones deseadas. Las células de E. coli que albergaban pQ\beta-240 apoyaban una síntesis eficaz de la proteína de 14-kD que migraba simultáneamente después de PAGE con la proteína de la envoltura de Q\beta de control aislada de las partículas del fago Q\beta.
La secuencia de aminoácidos resultante: (SEQ ID NO: 255)
10
Construcción de pQ\beta-243
El plásmido pQ\beta10 se utilizó como plásmido inicial para la construcción de pQ\beta-243. La mutación Asn10\rightarrowLys fue creada mediante PCR inversa. Los cebadores inversos fueron diseñados en direcciones cola-con-cola invertidas:
5'-GGCAAAATTAGAGACTGTTACTTTAGGTAAGATCGG -3' y
5'-CCGATCTTACCTAAAGTAACAGTCTCTAATTTTGCC -3'.
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Los productos de la primera PCR se utilizaron como moldes para la segunda reacción de PCR, en la que se utilizaron el cebador aguas arriba
5'-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3' y el cebador aguas abajo
5'-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3'.
El producto de la segunda PCR fue digerido con XbaI y Mph11031 y clonado en el vector de expresión pQ\beta10, que fue escindido por las mismas enzimas de restricción. Las reacciones de PCR se realizaron con los reactivos del kit para PCR y de acuerdo con el protocolo del productor (MBI Fermentas, Vilnius, Lituania).
La secuenciación utilizando el método de incorporación de la marca directa verificó las mutaciones deseadas. Las células de E. coli que albergaban pQ\beta-243 apoyaron la síntesis eficaz de la proteína de 14-kD que migraba simultáneamente después de PAGE con la proteína de la envoltura de Q\beta de control aislada de las partículas del fago Q\beta.
Secuencia de aminoácidos resultante: (SEQ ID NO: 256)
11
Construcción de pQ\beta-250
Se utilizó el plásmido pQ\beta-240 como plásmido inicial para la construcción inicial de pQ\beta-250. La mutación Lys2\rightarrowArg se creó mediante mutagénesis dirigida al sitio. Se utilizaron un cebador aguas arriba
5'-GGCCATGGCACGACTCGAGACTGTTACTTTAGG-3' y un cebador aguas abajo
5'-GATTTAGGTGACACTATAG-3' para la síntesis del fragmento de PCR mutante, que se introdujo en el vector de expresión pQ\beta-185 en los únicos sitios de restricción NcoI y HindIII. Las reacciones de PCR se realizaron con los reactivos del kit para PCR y de acuerdo con el protocolo del productor (MBI Fermentas, Vilnius, Lituania).
La secuenciación utilizando el método de incorporación de la marca directa verificó las mutaciones deseadas. Las células de E. coli que albergan pQ\beta-250 apoyaban una síntesis eficaz de la proteína de 14-kD que migraba simultáneamente después de PAGE con la proteína de la envoltura de Q\beta de control aislada de las partículas del fago Q\beta.
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Secuencia de aminoácidos resultante: (SEQ ID NO: 257)
12
Construcción de pQ\beta-251
Se utilizó el plásmido pQ\beta10 como plásmido inicial para la construcción de pQ\beta-251. La mutación Lys16\rightarrowArg fue creada mediante PCR inversa. Los cebadores inversos fueron diseñados en direcciones cola-con-cola invertidas:
5'-GATGGACGTCAAACTCTGGTCCTCAATCCGCGTGGGG -3' y
5'-CCCCACGCGGATTGAGGACCAGAGTTTGACGTCCATC -3'.
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Los productos de la primera PCR se utilizaron como moldes para la segunda reacción de PCR, en la que se utilizaron un cebador aguas arriba
5'-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3' y un cebador aguas abajo
5'-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3'.
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El producto de la segunda PCR fue digerido con XbaI y Mph11031 y clonado en el vector de expresión pQ\beta10, que había sido escindido por las mismas enzimas de restricción. Las reacciones de PCR se realizaron con los reactivos del kit para PCR y de acuerdo con el protocolo del productor (MBI Fermentas, Vilnius, Lituania).
La secuenciación utilizando el método de incorporación de la marca directa verificó las mutaciones deseadas. Las células de E. coli que albergaban pQ\beta-251 apoyaron eficazmente la síntesis de la proteína de 14-kD que migraba simultáneamente después de PAGE con la proteína de la envoltura de Q\beta aislada de partículas del fago Q\beta. La secuencia de aminoácidos resultante codificada por este constructo se muestra en el SEQ ID NO: 259.
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Construcción de pQ\beta-259
Se utilizó el plásmido pQ\beta-251 como plásmido inicial para la construcción de pQ\beta-259. La mutación Lys2\rightarrowArg se creó mediante mutagénesis dirigida al sitio. Se utilizaron un cebador aguas arriba
5'-GGCCATGGCACGACTCGAGACTGTTACTTTAGG-3' y un cebador aguas abajo
5'-GATTTAGGTGACACTATAG-3' pata la síntesis del fragmento de PCR mutante, que se introdujo en el vector de expresión pQ\beta-185 en los sitios de restricción únicos NcoI y HindIII. Las reacciones de PCR se realizaron con los reactivos del kit para PCR y de acuerdo con el protocolo del productor (MBI Fermentas, Vilnius, Lituania).
La secuenciación utilizando el método de incorporación de la marca directa verificó las mutaciones deseadas. Las células de E. coli que albergaban pQ\beta-259 apoyaban eficazmente la síntesis de la proteína de 14-kD que migraba simultáneamente después de PAGE con la proteína de la envoltura de Q\beta de control aislada de partículas del fago Q\beta.
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Secuencia de aminoácidos resultante: (SEQ ID NO: 258)
13 
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Procedimientos generales para la Expresión y purificación de Q\beta y mutantes de Q\beta Expresión
Transformar E. coli JM109 con los plásmidos de expresión de Q-beta. Inocular 5 ml de medio líquido con 20 \bullet g/ml de ampicilina con clones transformados con plásmidos de expresión de Q-beta. Incubar a 37ºC durante 16-24 h sin sacudimiento.
Inocular 100-300 ml de medio LB, que contiene 20 \bullet g/ml, 1:100 con el inóculo preparado. Incubar a 37ºC durante la noche sin sacudimiento. Inocular M9 + Casaminoácidos al 1% + medio de glucosa al 0,2% en matraces con el inóculo preparado 1:50, incubar a 37ºC durante la noche con sacudimiento.
\newpage
Purificación
Soluciones y tampones para el procedimiento de purificación:
1.
Tampón de lisis LB 50 mM Tris-HCl pH 8,0 con EDTA 5 mM, triton X100 al 0,1% y PMSF recién preparado hasta 5 microgramos por ml. Sin lisozima y ADNasa.
2.
SAS
Sulfato de amonio saturado en agua
3.
Tampón NET.
Tris-HCl 20 mM, pH 7,8 con EDTA 5 mM y NaCl 150 mM.
4.
PEG
polietilenglicol 6000 al 40% (p/v) en NET
Desorganización y lisis
Se resuspendieron células congeladas en LB a 2 ml/g de células. La mezcla se sometió a sonicación con 22 kH cinco veces durante 15 segundos, con intervalos de 1 min para enfriar la solución sobre hielo. El producto lisado se centrifugó después a 14.000 rpm, durante 1 hora utilizando un rotor Janecki K 60. Las etapas de centrifugación descritas más abajo se realizan todas utilizando el mismo rotor, excepto cuando se establezca de otro modo. El sobrenadante se almacenó a 4ºC, mientras el desecho celular se lavó dos veces con LB. Tras la centrifugación, los sobrenadantes del producto lisado y las fracciones lavadas se reunieron.
Fraccionamiento
Se añadió gota a gota una solución saturada de sulfato de amonio con agitación al producto lisado reunido anterior. El volumen de SAS se ajustó para que fuera un quinto del volumen total, para obtener un 20% de saturación. La solución se dejó estar durante la noche, y se centrifugó al día siguiente a 14.000 rpm, durante 20 min. El sedimento se lavó con una pequeña cantidad de sulfato de amonio al 20%, y se centrifugó de nuevo. Los sobrenadantes obtenidos se reunieron, y se añadió SAS gota a gota para obtener un 40% de saturación. La solución se dejó estar durante la noche, y se centrifugó al día siguiente a 14.000 rpm, durante 20 min. El sedimento obtenido se solubilizó en tampón NET.
Cromatografía
La proteína de la cápside resolubilizada en tampón NET se cargó en una columna de Sefarosa CL-4B. Eluyeron tres picos durante la cromatografía. El primero contenía principalmente membranas y fragmentos de membranas, y no se recogió. Las cápsides estaban contenidas en el segundo pico, mientras el tercero contenía otras proteínas de E. coli.
Las fracciones de los picos se reunieron, y la concentración de NaCl se ajustó a una concentración final de 0,65 M. Se añadió gota a gota un volumen de solución de PEG correspondiente a la mitad de la fracción del pico recogida con agitación. La solución se dejó estar durante la noche sin agitación. La proteína de la cápside se sedimentó mediante centrifugación a 14.000 rpm durante 20 min. Después se solubilizó en un volumen mínimo de NET y se cargó de nuevo en una columna de Sefarosa CL-4B. Las fracciones de los picos se reunieron, y precipitaron con sulfato de amonio a un 60% de saturación (p/v). Tras la centrifugación y la resolubilización en tampón NET, se cargó la proteína de la cápside en una columna de Sefarosa CL-6B para la una nueva cromatografía.
Diálisis y secado
Las fracciones de los picos obtenidas antes se reunieron y se sometieron a diálisis extensamente frente a agua estéril, y se liofilizaron para su almacenamiento.
Expresión y purificación de Q\beta-240
Las células se resuspendieron (E. coli JM 109, transformadas con el plásmido pQ\beta-240) en LB, se sometieron a sonicación durante 15 segundos (camisa de agua helada) y se centrifugaron a 13.000 rpm durante una hora. El sobrenadante se almacenó a 4ºC hasta un tratamiento adicional, mientras los restos se lavaron 2 veces con 9 ml de LB, y finalmente con 99 ml de urea 0,7 M en LB. Todos los sobrenadantes se reunieron, y e cargaron en la columna de Sefarosa CL-4B. Las fracciones de los picos reunidas se precipitaron con sulfato de amonio y se centrifugaron. La proteína solubilizada de nuevo se purificó después adicionalmente en una columna de Sefarosa 2B y finalmente en una columna de Sefarosa 6B. Finalmente el pico de la cápside se sometió extensamente a diálisis frente agua y se liofilizó como se la descrito antes. El ensamblaje de la proteína de la envoltura en una cápside se confirmó mediante microscopía electrónica.
Expresión y purificación de Q\beta-243
Las células (E. coli RR1) se resuspendieron en LB y se trataron como se describe en el procedimiento general. La proteína se purificó mediante dos etapas de filtración en gel sucesivas sobre una columna de sefarosa CL-4B y finalmente en una columna de sefarosa CL-2B. Las fracciones de los picos se reunieron y se liofilizaron como se ha descrito antes. El ensamblaje de la proteína de la envoltura en una cápside se confirmó mediante microscopía electrónica.
Expresión y purificación de Q\beta-250
Las células (E. coli JM 109, transformadas con pQ\beta-250) se suspendieron en LB y se trataron como se ha descrito antes. La proteína se purificó mediante filtración en gel en una columna de Sefarosa CL-4B y finalmente en una columna de Sefarosa CL-2B, y se liofilizó como se ha descrito antes. El ensamblaje de la proteína de la envoltura en una cápside se confirmó mediante microscopía electrónica.
Expresión y purificación de Q\beta-259
Las células (E. coli JM 109, transformadas con pQ\beta-259) se resuspendieron en LB y se sometieron a sonicación. Los restos se lavaron una vez con 10 ml de LB y una segunda vez con 10 ml de urea 0,7 M en LB. La proteína se purificó mediante dos etapas de cromatografía de filtración en gel, en una columna de Sefarosa CL-4 B. La proteína se sometió a diálisis y se liofilizó, como se ha descrito antes. El ensamblaje de la proteína de la envoltura en una cápside se confirmó mediante microscopía electrónica.
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Ejemplo 19
Desensibilización de ratones alérgicos con PLA2 acoplado a la proteína de la cápside de Q\beta A. Desensibilización de ratones alérgicos mediante vacunación
Se sensibilizaron ratones CBA/J hembra (8 semanas de edad) con PLA2: Por ratón, se adsorbieron 0,1 \mug de PLA2 de Latoxan (Francia) sobre 1 mg de Alúmina (Imject, Pierce) en un volumen total de 66 \mul sometiendo a vórtice durante 30 minutos y después se inyectaron subcutáneamente. Este procedimiento se repitió cada 14 días durante un total de cuatro veces. Este tratamiento condujo al desarrollo de IgE en suero específica de PLA2 pro no a anticuerpos Ig2a. Un mes después de la última sensibilización, los ratones fueron inyectados subcutáneamente con 10 \mug de vacuna que consistía en PLA2 recombinante acoplado a la proteína de la cápside de Q\beta. Una y dos semanas más tarde fueron tratados de nuevo con la misma cantidad de vacuna. Una semana después del último tratamiento, se tomaron muestras de sangre de los ratones y después se sensibilizaron intraperitonealmente con 25 \mug de PLA2 (Latoxan) y se midió la temperatura rectal durante 60 minutos utilizando un termómetro digital calibrado. Como control se utilizaron ratones sensibilizados que no habían sido tratados con proteína de la cápside de Q\beta-PLA2. Mientras todos los ratones de control experimentaron una respuesta anafiláctica reflejada en una caída espectacular de la temperatura rectal después de la sensibilización con PLA2, los ratones vacunados estuvieron totalmente o al menos parcialmente protegidos. Los resultados se muestran en la Fig 25 A.
B. ELISA
Se recubrieron placas de ELISA (Maxisorp, Nunc) con PLA2 (Latoxan) a 5 \mug/ml. Las placas se bloquearon y después se incubaron con suero diluido seriadamente. Para la detección de los anticuerpos IgE, se pre-trato el suero con cuentas de proteína G (Pharmacia) durante 60 min en un aparato de sacudimiento a la temperatura ambiente. Las cuentas se separaron mediante centrifugación y el sobrenadante se utilizó para el ELISA. Los anticuerpos unidos a PLA2 se detectaron con anticuerpos IgG2a o IgE anti-ratón marcados enzimáticamente. Los títulos de ELISA se determinaron a una densidad óptica semimáxima (DO50%) y se expresaron como - log5 de los sueros prediluidos 100 veces para IgG2a y como -log5 de los sueros prediluidos 10 veces para IgE. Para todos los ratones, se determinaron la IgG2a e IgE específicas de PLA2 en suero antes y al final del tratamiento con la vacuna. La vacunación condujo a un aumento espectacular de la IgG2a específica de PLA2 mientras no se observaron cambios consistentes en los títulos de IgE. Estos resultados indican que la vacunación condujo a una inducción de la respuesta inmunitaria de tipo Th1 (reflejada por la producción de IgG2a). Los resultados se muestran en la Fig. 25 B.
La respuesta anafiláctica en los ratones vacunados y no vacunados se muestra en la Fig. 25A.
Los ratones fueron sensibilizados a PLA2 y después tratados 3x subcutáneamente con 10 \mug de vacuna que consistía en PLA2 acoplado a proteína de la cápside de Q\beta. Los ratones de control fueron sensibilizados pero no vacunados. Una semana después de la última vacunación todos los ratones se sometieron a ensayo intraperitonealmente con 25 \mug de PLA2 y se controló la respuesta anafiláctica midiendo la temperatura rectal durante 60 min. Mientras todos los ratones de control mostraron una caída espectacular de la temperatura corporal, los ratones vacunados estuvieron totalmente o al menos parcialmente protegidos de la reacción anafiláctica.
La inducción de IgG2a específica de PLA2 mediante vacunación se muestra en la Fig. 25 B.
Los ratones fueron sensibilizados a PLA2 y después tratados 3x con 10 \mug de vacuna que consistía en PLA2 acoplado a proteína de la cápside de Q\beta. Los ratones e control fueron sensibilizados pero no vacunados. Se tomó suero de los ratones sensibilizados antes del inicio del tratamiento y una vez completado el tratamiento, antes del ensayo. En los ratones vacunados (izquierda del panel) se observó un incremento espectacular de IgG2a específica PLA2.
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Ejemplo 20
Expresión, replegado, purificación y acoplamiento de Pla_{2}-Cys (también denominada proteína de fusión PLA_{2}) A. Expresión y preparación de cuerpos de inclusión
Se transformó el plásmido pET11a que contenía el gen PLA_{2}-Cys del ejemplo xxx en E. coli BL21DE3Ri11 (Stratagene). Se hizo crecer un cultivo realizado durante la noche en medio dYT que contenía 100 \mug/ml de Ampicilina y 15 \mug/ml de Cloramfenicol. El cultivo se diluyó en medio dYT de nueva aportación que contenía Ampicilina y Cloramfenicol, y se hizo crecer a 37ºC hasta alcanzar una DO _{600 \ nm}= 1. El cultivo fue inducido con IPTG 1 mM, y se hizo crecer durante otras 4 horas. Las células se recogieron por centrifugación, y se resuspendieron en tampón PBS que contenía Lisozima de 0,5 mg/ml. Tras la incubación sobre hielo, las células se sometieron a sonicación sobe hielo, y se añadió MgCl_{2} a una concentración de 10 mM. Se añadieron 6 \mul de Benzonasa (Merck) al producto lisado celular, y el producto lisado se incubó 30 minutos a RT. Se añadió Triton a una concentración final de 1%, y el producto lisado se incubó adicionalmente durante 30 minutos sobe hielo. Se recogió el sedimento de los cuerpos de inclusión (IB) mediante centrifugación durante 10 minutos a 13.000 g. El sedimento de cuerpos de inclusión se lavó en tampón de lavado que contenía Tris 20 mM, sacarosa al 23%, EDTA 1 mM, pH 8,0. Los IB se solubilizaron en Guanidinio-HCl 6 M, Tris 20 mM, pH 8,0, que contenía DTT 200 mM. Los IB solubilizados se centrifugaron a 50.000 g y el sobrenadante se sometió a diálisis frente a Guanidinio-HCl 6 M, Tris 20 mM, pH 8,0 y con posterioridad frente al mismo tampón que contenía DTT 0,1 mM. Se añadió glutationa oxidada a una concentración final de 50 mM, y los IB solubilizados se incubaron durante 1 h. a RT. Los IB solubilizados se sometieron a diálisis frente a Guanidinio-HCL 6 M, Tris 20 mM, pH 8,0. La concentración de la solución de IB se estimó mediante análisis Bradford y SDS-PAGE.
B. Replegamiento y purificación
La solución de IB se añadió lentamente en tres porciones, cada 24 horas, a una concentración final de 3 \muM, al tampón de replegamiento que contenía EDTA 2 mM, Benzamidina 0,2 mM, ácido 6-aminocaproico 0,2 mM, Guanidinio-HCl 0,2 mM, L-Arginina 0,4 M, pH 6,8, a lo que se añadieron Glutationa reducida 5 mM y Glutationa oxidada 0,5 M antes del inicio del replegamiento a 4ºC. La solución de replegamiento se concentró a la mitad de su volumen mediante Ultrafiltración utilizando una membrana YM10 (Millipore) y se sometió a diálisis frente a PBS, pH 7,2, que contenía DTT 0,1 mM. La proteína se concentró adicionalmente mediante ultrafiltración y se cargó en una columna Superdex G-75 (Pharmacia) equilibrada en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, DTT 0,1 mM, 4ºC para su purificación. El pH del tampón de equilibrado se ajustó a 7,2 a RT. Las fracciones monoméricas se reunieron.
C. Acoplamiento
Una solución de 1,5 mg de Q\beta en 0,75 mL de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 se hizo reaccionar con 0,06 mL de Sulfo-SMPB (Pierce; Solución de partida 31 mM en H_{2}O) durante 45 min. a RT. La mezcla de reacción se sometió a diálisis durante la noche frente a Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 y se mezclaron 0,75 mL de esta solución con 1,5 mL de solución de PLA_{2}-Cys en DTT 0,1 mM (62 \muM) y 0,43 mL de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, DTT 137 \muM, pH 7,4 ajustado a RT. La reacción de acoplamiento se dejó continuar durante 4 h. a RT, y la mezcla de reacción se sometió a diálisis durante la noche frente a Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 utilizando tubos de diálisis Spectra Por, corte de PM 300.000 Da (Spectrum). La reacción de acoplamiento se analizó mediante SDS-PAGE y tinción con Coomassie, y transferencia Western, utilizando antisuero anti-veneno de abeja de conejo (diluido 1:10000), desarrollado con producto conjugado con fosfatasa alcalina anti-conejo de cabra (diluida 1:10000), o un antisuero anti-Q\beta de conejo (1:5000), desarrollado con un producto conjugado con fosfatasa alcalina anti-conejo de cabra (diluida 1:10000). Las muestras se hicieron circular en ambos casos en condiciones reductoras.
El resultado de la reacción de acoplamiento se muestra en la Fig. 26. Las bandas correspondientes al producto de acoplamiento de la proteína de la cápside de Q\beta a PLA_{2}-Cys son claramente visibles en el SDS-PAGE teñido con Coomassie (panel izquierdo), la Transferencia Western anti-Q\beta (panel central) y la Transferencia Western anti-PLA2 (panel derecho) de las reacciones de acoplamiento entre la proteína de la cápside de Q\beta y PLA_{2}-Cys, y están indicadas por una flecha en la figura. Se cargaron 15 \mul de las reacciones de acoplamiento y 50 \mul de las reacciones de acoplamiento sometidas a diálisis en el gel.
Calle 1: Marcador de proteína. 2: Reacción de acoplamiento sometida a diálisis 1. 3: Reacción de acoplamiento 1. 4: Reacción de acoplamiento 2. 5: Reacción de acoplamiento 2. 6: Reacción de acoplamiento 1. 7: Reacción de acoplamiento 1 sometida a diálisis. 8: Marcador de proteína. 9: Reacción de acoplamiento 2. 10: Reacción de acoplamiento 1. 11: Reacción de acoplamiento 1 sometida a diálisis. 12: Marcador de proteína.
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Ejemplo 21
Acoplamiento de mimocuerpo de IgE anti-idiotípico VAE051 a Q\beta, inmunización de ratones y ensayo de antisueros
Una solución de proteína de la cápside de Q\beta de 4,0 mg/ml en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,2 se hizo reaccionar durante 30 minutos con un exceso molar de diez veces de SMPH (Pierce) (a partir de una solución de partida 100 mM disuelta en DMSO) a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se sometió a diálisis con posterioridad dos veces durante 2 horas frente a 2 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. La solución de VAE051 (2,4 mg/ml) se redujo con una concentración equimolar de TCEP durante 60 min a 25ºC.
Después se hicieron reaccionar 46 \mul de la mezcla de reacción de Q\beta sometida a diálisis con 340 \mul de la solución de VAE051 tratada con TCEP (2,4 mg/ml) en un volumen total de 680 \mul tampón acetato de sodio 50 mM a 16ºC durante 2 h en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio.
Los productos de reacción se analizaron sobre geles de SDS-PAGE al 16% en condiciones reductoras. Los geles fueron teñidos con Azul Brillante de Coomassie. Las dos bandas adicionales de las reacciones de acoplamiento (que están ausentes en las soluciones de VAE o Q\beta) representan la cadena pesada y la cadena ligera de VAE051 acoplado a Q\beta (Fig. 28 A). La identidad de las bandas se confirmó mediante transferencia Western con anticuerpos específicos para las cadenas pesada y ligera, respectivamente.
Inmunización de ratones
La solución de acoplamiento de Q\beta-VAE051 se sometió a diálisis frente a Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 utilizando una membrana de corte a 300000 Da. Se inyectaron 50 \mug de Q\beta-VAE051 intraperitonealmente en dos ratones Balb/c hembra el día 0 y el día 14. Se tomaron muestras de sangre de los ratones mediante punción retroorbital el día 28 y se analizó su suero utilizando ELISA específicos para IgE y VAE051.
ELISA
Se recubrieron las placas de ELISA con IgE humana a una concentración de 0,8 \mug/ml o con 10 \mug/ml de VAE051. Las placas se bloquearon y después se incubaron con sueros de ratón diluidos seriadamente. Los anticuerpos unidos se detectaron con anticuerpo IgG anti-ratón marcado enzimáticamente (Fig. 28 B).
Ambos ratones mostraron una elevada reactividad a VAE051 así como a IgE humana. Los sueros preinmunes de los mismos ratones no mostraron reactividad alguna frente a VAE051 e IgE (Fig. 28 B). Esto demuestra que se han producido anticuerpos contra el mimocuerpo de IgE anti-idiotípico VAE051 que también reconocen la molécula IgE "de origen".
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Ejemplo 22
Acoplamiento de alta ocupación del péptido DerpI a la proteína de la cápside de Q\beta wt utilizando el entrecruzador SMPH
El péptido Derp 1.2, al cual se había añadido una cisteína N-terminalmente para el acoplamiento, se sintetizó químicamente y tenía la siguiente secuencia: H2N-CQIYPPNANKIREALAQTHSA-COOH. Este péptido se utilizó para el acoplamiento químico a la proteína de la cápside de Q\beta wt y se describe a continuación.
A. Acoplamiento del péptido Flag a la proteína de la cápside de Q\beta
Se hizo reaccionar proteína de la cápside de Q\beta en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2, a una concentración de 2 mg/ml, con un exceso de 5 o 20 veces molar del entrecruzador SMPH (Pierce) durante 30 min. a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se sometió a diálisis con posterioridad dos veces durante 2 horas frente a 2 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. La mezcla de reacción sometida a diálisis se hizo reaccionar después con un exceso de 5 veces de péptido Derp 1,2 durante dos horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio.
El resultado de la reacción de acoplamiento se puede observar en la Fig. 24. Las bandas de acoplamiento correspondientes a 1,2 y 3 péptidos por subunidad, respectivamente, son claramente visibles sobre el gel, y están indicadas por flechas. Se presentaron una media de dos péptidos por subunidad sobre la cápside.
Las muestras cargadas sobre el gel de la Fig. 24 fueron las siguientes:
Calle 1: Marcador de proteína. 2: proteína de la cápside de Q\beta derivatizada con un exceso de 5 veces de SMPH. 3: proteína de la cápside de Q\beta derivatizada con un exceso de 20 veces de SMPH. 4: Reacción de acoplamiento de la proteína de la cápside de Q\beta derivatizada 5 veces. 5: Reacción de acoplamiento de la proteína de la cápside de Q\beta derivatizada 20 veces.
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Ejemplo 23
Inserción de un péptido que contiene un resto Lisina en el epítopo c/e1 de HBcAg(1-149)
El epítopo c/e1 (restos 72 a 88) de HBcAg está localizado en la región del ápice sobre la superficie de la cápside del virus de la Hepatitis B (HBcAg). Una parte de esta región (Prolina 79 y Alanina 80) fue remplazada genéticamente por el péptido Gly-Gly-Lys-Gly-Gly (constructo HBcAg-Lys). El resto Lisina introducido contiene un grupo amino reactivo en su cadena lateral que puede ser utilizado para el entrecruzamiento intermolecular de las partículas de HBcAg con cualquier antígeno que contenga un grupo cisteína libre.
El ADN de HBcAg-Lys, que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 158, se generó mediante PCR: Los dos fragmentos que codificaban los fragmentos de HBcAg (restos aminoácido 1 a 78 y 81 a 149) se amplificaron por separado mediante PCR. Los cebadores utilizados para estas PCR también introdujeron una secuencia de ADN que codificaba el péptido Gly-Gly-Lys-Gly-Gly. El fragmento de HBcAg (1 a 78) fue amplificado a partir de pEco63 utilizando los cebadores EcoRIHBcAg(s) y Lys-HBcAg(as). El fragmento de HBcAg (81 a 149) fue amplificado a partir de pEco63 utilizando los cebadores Lys-HBcAg(s) y HBcAg(1-149)Hind(as). Los cebadores Lys-HBcAg(as) y Lys-HBcAg(s) introdujeron secuencias de ADN complementario en los extremos de los dos productos de la PCR permitiendo la fusión de los dos productos de la PCR en una PCR de ensamblaje posterior. Los fragmentos ensamblados fueron amplificados mediante PCR utilizando los cebadores EcoRIHBcAg(s) y HbcAg(1-149)Hind(as).
Para las PCR, se utilizaron 100 pmoles de cada oligo y 50 ng de los ADN molde en las mezclas de reacción de 50 ml con 2 unidades de polimerasa Pwo, dNTP 0,1 mM y MgSO4 2 mM. Para ambas reacciones, el ciclo de temperatura se llevó a cabo como sigue: 94ºC durante 2 minutos; 30 ciclos de 94ºC (1 minuto), 50ºC (1 minuto), 72ºC (2 minutos).
Secuencias de los cebadores
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Para la fusión de los dos fragmentos de PCR mediante PCR se utilizaron 100 pmoles de cebadores
EcoRIHBcAg(s) y HBcAg(1-149)Hind(as) con 100 ng de los dos fragmentos de PCR purificados en una mezcla de reacción de 50 ml que contenía 2 unidades de polimerasa Pwo, dNTPs 0,1 mM y MgSO_{4} 2 mM. Las condiciones del ciclo de la PCR fueron: 94ºC durante 2 minutos; 30 ciclos de 94ºC (1 minuto), 50ºC (1 minuto), 72ºC (2 minutos). El producto de la PCR ensamblado se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa, se purificaron y se digirieron durante 19 horas en un tampón apropiado con las enzimas de restricción EcoRI y HindIII. El fragmento de ADN digerido se ligó en el vector pKK digerido con EcoRI/HindIII para generar el vector de expresión pKK-HBcAg-Lys. La inserción del producto de la PCR en el vector se analizó mediante análisis de restricción con EcoRI/HindIII y secuenciación del ADN del inserto.
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Ejemplo 24
Expresión y purificación parcial de HBcAg-Lys
Se transformó la cepa XL-1 blue de E. coli con pKK-HBcAg-Lys. Se utilizó 1 ml de un cultivo durante la noche de bacteria para inocular 100 ml de medio LB que contenía 100 \mug/ml de ampicilina. Este cultivo se hizo crecer durante 4 horas a 37ºC hasta que se alcanzó una DO a 600 nm de aproximadamente 0,8. La inducción de la síntesis de HBcAg-Lys se realizó mediante adición de IPTG a una concentración final de 1 mM. Tras la inducción, las bacterias se sacudieron adicionalmente a 37ºC durante 16 horas. Las bacterias se recogieron mediante centrifugación a 5000 x g durante 15 minutos. El sedimento se congeló a -20ºC. El sedimento se descongeló y se resuspendió en tampón de lisis (Na_{2}HPO_{4} 10 mM, pH 7,0, NaCl 30 mM, Tween-20 al 0,25%, EDTA 10 mM, DTT 10 mM) con un suplemento de 200 \mug/ml de lisozima y 10 \mul de Benzonasa (Merck). Las células se incubaron durante 30 minutos a la temperatura ambiente y se desorganizaron utilizando una celda de presión French. Se añadió Triton X-100 al producto lisado a una concentración final de 0,2%, y el producto lisado se incubó durante 30 minutos sobre hielo y se sacudió ocasionalmente. Las células de E. coli que albergaban el plásmido de expresión pKK-HBcAg-Lys o un plásmido de control se utilizaron pata la inducción de la expresión de HBcAg-Lys con IPTG. Antes de la adición de IPTG, se separó una muestra del cultivo de bacterias que portaba el plásmido pKK-HBcAg-Lys y de un cultivo que portaba el plásmido de control. Dieciséis horas después de la adición de IPTG, las muestras se separaron de nuevo del cultivo que contenía pKK-HBcAg-Lys y del cultivo de control. La expresión de la proteína se controló mediante SDS-PAGE seguido de tinción de Coomassie.
El producto lisado se centrifugó durante 30 minutos a 12.000 x g con el fin de separar los restos celulares insolubles. El sobrenadante y el sedimento se analizaron mediante transferencia Western utilizando un anticuerpo monoclonal frente a HBcAg (YVS1841, adquirido de Accurate Chemical and Scientific Corp., Westbury, NY, USA), indicando que una cantidad significativa de proteína HBcAg-Lys era soluble. En resumen, los productos lisados de las células de E. coli que expresaban HBcAg-Lys y de las células de control fueron centrifugados a 14.000 x g durante 30 minutos. El sobrenadante (= fracción soluble) y el sedimento (= fracción insoluble) se separaron y se diluyeron con tampón de muestra de SDS a volúmenes iguales. Las muestras se analizaron mediante SDS-PAGE seguido de transferencia Western con anticuerpo monoclonal anti-HBcAg YVS 1841.
El producto lisado celular se utilizó para la centrifugación en gradiente por etapas utilizando un gradiente por etapas de sacarosa que consistía en 4 ml de una solución de sacarosa al 65% superpuesta sobre 3 ml de solución de sacarosa al 15% seguido de 4 ml de producto lisado bacteriano. La muestra se centrifugó durante 3 horas con 100.000 x g a 4ºC. Después de la centrifugación, se recogieron fracciones de 1 ml de la parte superior del gradiente y se analizaron mediante SDS-PAGE seguido de tinción de Coomassie. La proteína HBcAg-Lys fue detectada mediante tinción de Coomassie.
En la interfaz entre la sacarosa al 15% y al 65% se produjo un enriquecimiento de proteína HBcAg-Lys indicando que se había formado una partícula de la cápside. La mayoría de las proteínas bacterianas permaneció en la capa superior sin sacarosa del gradiente, por lo tanto la centrifugación en gradiente por etapas de las partículas de HBcAg-Lys condujo al enriquecimiento y a una purificación parcial de las partículas.
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Ejemplo 25
Acoplamiento químico del péptido FLAG a HbcAg-Lys utilizando el entrecruzador heterobifuncional SPDP
Se acopló químicamente el péptido sintético FLAG con un resto Cisteína en su extremo amino (secuencia de aminoácidos CGGDYKDDDDK (SEQ ID NO:147)) a partículas de HBcAg-Lys purificadas con el fin de lograr una respuesta inmunitaria frente al péptido FLAG. Se incubaron 600 ml de una solución pura en un 95% de partículas de HBcAg-Lys (2 mg/ml) durante 30 minutos a la temperatura ambiente con el entrecruzador heterobifuncional 3-(2-Piridilditio)propionato de N-Succinimidilo (SPDP) (0,5 mM). Una vez completada la reacción, la mezcla se sometió a diálisis durante la noche frente a 1 litro Tampón fosfato 50 mM (pH 7,2) con NaCl 150 mM para separar el SPDP libre. Después se mezclaron 500 ml de cápside de HBcAg-Lys derivatizada (2 mg/ml) con 0,1 mM de péptido FLAG (que contenía una cisteína amino terminal) en presencia de EDTA 10 mM para evitar la oxidación de sulfhidrilo catalizada con metal. La reacción se controló por medio del incremento de la densidad óptica de la solución a 343 nm debido a la liberación de piridina-2-tiona del SPDP tras la reacción con la cisteína libre del péptido. La reacción de los restos Lys derivatizados con el péptido fue completa después de aproximadamente 30 minutos.
Las partículas decoradas con FLAG se inyectaron en ratones.
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Ejemplo 26
Construcción de pMPSV-gp140cys
Se amplificó el gen gp140 mediante PCR a partir de pCytTSgp140FOS utilizando los oligos gp140CysEcoRI y SalIgp140. Para las PCR, se utilizaron 100 pmoles de cada oligo y 50 ng de los molde en las mezclas de reacción de 50 ml con 2 unidades de polimerasa Pwo, dNTP 0,1 mM y MgSO4 2 mM. Para ambas reacciones, el ciclo de temperatura se llevó a cabo como sigue: 94ºC durante 2 minutos; 30 ciclos de 94ºC (0,5 minutos), 55ºC (0,5 minutos), 72ºC (2 minutos).
El producto de la PCR se purificó utilizando el kit QiaEXII, se digirió con SalI/EcoRI y se ligó en el vector pMPSVHE escindido con las mismas enzimas.
Secuencias de los oligos
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Ejemplo 27
Expresión de pMPSVgp140Cys
Se linealizó pMPSVgp140Cys (20 \mug) mediante digestión con enzimas de restricción. La reacción se detuvo mediante extracción con fenol/cloroformo, seguido de precipitación con isopropanol del ADN linealizado. La digestión con enzimas de restricción se evaluó mediante electroforesis en gel de agarosa. Para la transfección, se mezclaron 5,4 \mug de pMPSVgp140-Cys linealizado con 0,6 \mug de pSV2Neo linealizado en 30 \mul de H_{2}O y se añadieron 30 \mul de solución de CaCl_{2} 1 M. Tras la adición de 60 \mul de tampón fosfato (HEPES 50 mM, NaCl 280 mM, Na_{2}HPO_{4} 1,5 mM, pH 7,05), la solución se sometió a vórtice durante 5 segundos, seguido de una incubación a la temperatura ambiente durante 25 segundos. La solución se añadió inmediatamente a 2 ml de medio HP-1 que contenía FCS al 2% (medio FCS al 2%). El medio de un cultivo de células BHK21 confluente al 80% (placas de 6 pocillos) se remplazó después por el medio que contenía ADN. Después de una incubación durante 5 horas a 37ºC en una incubadora con CO_{2}, el medio que contenía ADN se separó y se remplazó por 2 ml de glicerol al 15% en medio FCS al 2%. El medio que contenía glicerol se separó después de una fase de incubación de 30 segundos, y las células se lavaron enjuagando con 5 ml de medio HP-1 que contenía FCS al 10%. Finalmente se añadieron 2 ml de medio HP-1 fresco que contenía FCS al 10%.
Las células transfectadas establemente se seleccionaron y se hicieron crecer en medio de selección (medio HP-1 con suplemento de G418) a 37ºC en una incubadora con CO_{2}. Cuando la población mixta se hizo crecer hasta la confluencia, el cultivo se dividió en dos placas, seguido de un período de crecimiento de 12 horas a 37ºC. Una placa de las células se llevó a 30ºC para inducir la expresión de GP140-FOS soluble. La otra placa se mantuvo a 37ºC.
La expresión de GP140-Cys soluble se determinó mediante análisis de transferencia Western. El medio de cultivo (0,5 ml) se precipitó con metanol/cloroformo, y el sedimento se resuspendió en tampón de muestra para SDS-PAGE. Las muestras se calentaron durante 5 minutos a 95ºC antes de ser aplicadas a un gel de acrilamida al 15%. Después de SDS-PAGE, las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa Protan (Schleicher & Schuell, Alemania) como describen Bass y Yang, en Creighton, T.E., ed., Protein Function: A Practical Approach, 2ª Edn., IRL Press, Oxford (1997), págs. 29-55. La membrana se bloqueó con albúmina bovina al 1% (Sigma) en TBS (10xTBS por litro: 87,7 g de NaCl, 66,1 g de hidrocloruro Trizma (Sigma) y 9,7 g de base Trizma (Sigma), pH 7,4) durante 1 hora a la temperatura ambiente, seguido de incubación con un anticuerpo anti-GP140 o GP-160 durante 1 hora. La transferencia se lavó 3 veces durante 10 minutos con TBS-T (TBS con Tween20 al 0,015%), y se incubó durante 1 hora con producto conjugado de fosfatasa alcalina-IgG anti-ratón/conejo/mono/humano. Después de lavar 2 veces durante 10 minutos con TBS-T y 2 veces durante 10 minutos con TBS, se llevó a cabo la reacción de desarrollo utilizando reactivos de detección de fosfatasa alcalina (10 ml de tampón AP (Tris/HCl 100 mM, NaCl 100 mM, pH 9,5) con 50 \mul de solución NBT (Nitro Azul de Tetrazolio al 7,7% (Sigma) en dimetilformamida al 70%) y 37 \mul de solución de X-Fosfato (5% de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo en dimetilformamida).
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Ejemplo 28
Purificación de gp140Cys
Un anticuerpo anti-gp120 se acopló covalentemente a dextrano activado con NHS/EDC y se empaquetó en una columna de cromatografía. El sobrenadante, que contenía GP140Cys se cargó en la columna y después de un lavado suficiente, se hizo eluir el GP140Cys utilizando HCl 0,1 M. El producto eluido se neutralizó directamente durante la recolección utilizando Tris 1 M pH 7,2 en tubos de recolección.
Durante la purificación se podría producir la formación de enlaces disulfuro, por lo tanto la muestra recogida se trata con DTT 10 mM en Tris 10 mM pH 7,5 durante 2 horas a 25ºC.
El DTT se separa mediante posterior diálisis frente a Mes 10 mM; NaCl 80 mM pH 6,0. Finalmente se mezcla GP140Cys con partículas de alfavirus que contienen el resto JUN en E2 como se describe en el Ejemplo 16.
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Ejemplo 29
Construcción de PLA_{2}-Cys
El gen PLA_{2} se amplificó mediante PCR a partir de pAV3PLAfos utilizando los oligos EcoRIPLA y PLA-Cys-hind. Para las PCR, se utilizaron 100 pmoles de cada oligo y 50 ng de los ADN molde en las mezclas de reacción de 50 ml con 2 unidades de polimerasa Pwo, dNTP 0,1 mM y MgSO_{4} 2 mM. Para la reacción, el ciclo de temperaturas se llevó a cabo como sigue: 94ºC durante 2 minutos; 30 ciclos de 94ºC (0,5 minutos), 55ºC (0,5 minutos), 72ºC (2 minutos).
El producto de la PCR se purificó utilizando el kit QiaEXII, digerido con EcoRI/HindIII y ligado en el vector pAV3 escindido con las mismas enzimas.
Oligos
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Ejemplo 30
Expresión y Purificación de PLA_{2}-Cys
Para la producción citoplásmica de proteínas etiquetadas con Cys, se transformó la cepa XL-1-Blue de E. coli con los vectores pAV3::PLA y pPLA-Cys. El cultivo se incubó en medio rico en presencia de ampicilina a 37ºC con sacudimiento. A una densidad óptica (550 nm) de IPTG 1 mM, se añadió y se continuó la incubación durante otras cinco horas. Las células se recogieron mediante centrifugación, se resuspendieron en un tampón apropiado (p. ej., Tris-HCl, pH 7,2, NaCl 150 mM) que contenía ADNasa, ARNasa y lisozima, y se desorganizaron por medio de una celda de prensa French. Tras la centrifugación (Sorvall RC-5C, rotor SS34, 15000 rpm, 10 min, 4ºC), el sedimento se resuspendió en 25 ml de tampón de lavado de cuerpos de inclusión (tris-HCl 20 mM, sacarosa al 23%, Triton X-100 al 0,5%, EDTA 1 mM, pH 8) a 4ºC y se volvió a centrifugar como se ha descrito antes. Este procedimiento se repitió hasta que el sobrenadante después de la centrifugación estuvo esencialmente claro. Los cuerpos de inclusión fueron resuspendidos en 20 ml de tampón de solubilización (hidrocloruro de guanidinio 5,5 M, tris-HCl 25 mM, pH 7,5) a la temperatura ambiente y el material insoluble se separó mediante centrifugación y posterior paso del sobrenadante a través de un filtro estéril (0,45 \mum). La solución de proteína se mantuvo a 4ºC durante al menos 10 horas en presencia de EDTA 10 mM y DTT 100 mM y después se sometió a diálisis tres veces frente a 10 volúmenes de hidrocloruro de guanidinio 5,5 M, tris-HCl 25 mM, EDTA 10 mM, pH 6. La solución se sometió a diálisis dos veces frente a 5 L de urea 2 M, EDTA 4 mM, NH_{4}Cl 0,1 M, borato de sodio 20 mM (pH 8,3) en presencia de una transferencia rédox apropiada (glutationa oxidada/glutationa reducida; cistina/cisteína). La proteína replegada se aplicó después a una cromatografía de intercambio iónico. La proteína se almacenó en un tampón apropiado en un pH por encima de 7 en presencia de DTT 2-10 mM para mantener los restos cisteína en una forma reducida. Antes del acoplamiento de la proteína con las partículas de alfavirus, se separó el DTT haciendo pasar la solución de proteína a través de una columna de filtración en gel Sephadex G-25.
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Ejemplo 31
Construcción de HBcAg desprovisto de restos cisteína libres y que contiene un resto lisina insertado
Se construyó un Antígeno núcleo de la Hepatitis (HBcAg), referido en la presente memoria como HBcAg-lys-2cys-Mut, desprovisto de restos cisteína en las posiciones correspondientes a 48 y 107 del SEQ ID NO: 134 y que contenía un resto lisina insertado utilizando los siguientes métodos.
Las dos mutaciones se introdujeron amplificando por separado primero tres fragmentos del gen HBcAg-Lys como se ha descrito antes en el Ejemplo 23 con las siguientes combinaciones de cebadores para PCR. Se utilizaron los métodos de PCR descritos esencialmente en el Ejemplo 1 y las técnicas de clonación convencionales para preparar el gen HBcAg-lys-2cys-Mut.
En resumen, se utilizaron los siguientes cebadores para preparar el fragmento 1:
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Se utilizaron los siguientes cebadores para preparar el fragmento 2:
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Se utilizaron los siguientes cebadores para preparar el fragmento 3:
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Después se combinaron los fragmentos 1 y 2 con los cebadores de la PCR EcoRIHBcAg(s) y 107as para dar el fragmento 4. El fragmento 4 y el fragmento 3 se combinaron después con los cebadores EcoRIHBcAg(s) y HBcAg149hind-as para producir el gen completo. El gen completo se digirió después con las enzimas EcoRI (GAATTC) y HindIII (AAGCTT) y se clonó en el vector pKK (Pharmacia) cortado en los mismos sitios de restricción.
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Ejemplo 32
Bloqueo de los restos cisteína libres de un HBcAg seguido de entrecruzamiento
Se bloquearon los restos cisteína libres del HBcAg-Lys preparado como se ha descrito en el Ejemplo 23 anterior utilizando Yodoacetamida. El HBcAg-Lys bloqueado se entrecruzó con el péptido FLAG con el entrecruzador heterobifuncional éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (Sulfo-MBS).
Los métodos utilizados para bloquear los restos cisteína libres y entrecruzar el HBcAg-Lys son los siguientes. Se hizo reaccionar HBcAg-Lys (550 \mug/ml) durante 15 minutos a la temperatura ambiente con Yodoacetamida (Fluka Chemie, Brugg, Suiza) a una concentración de solución salina tamponada con fosfato 50 mM (PBS) (fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 150 mM), pH 7,2, en un volumen total de 1 ml. El HBcAg-Lys así modificado se hizo reaccionar inmediatamente con Sulfo-MBS (Pierce) a una concentración de 330 \muM directamente en la mezcla de reacción de la etapa 1 durante 1 hora a la temperatura ambiente. La mezcla de reacción se enfrió después sobre hielo, y se sometió a diálisis frente a 1000 volúmenes de PBS pH 7,2. La mezcla de reacción sometida a diálisis se hizo reaccionar finalmente con 300 \muM del péptido FLAG péptido (CGGDYKDDDDK (SEQ ID NO: 147)) que contenía un resto cisteína N-terminal libre para el acoplamiento al HBcAg-Lys activado, y se cargó sobre SDS-PAGE para el análisis.
Los patrones de bandas resultantes sobre el gel de SDS-PAGE mostraron una clara banda adicional que migraba más despacio que el HBcAg-Lys de control derivatizado con el entrecruzador, pero no reaccionó con el péptido FLAG. Las reacciones realizadas en las mismas condiciones sin derivatización previa de las cisteínas con Yodoacetamida condujeron al entrecruzamiento completo de monómeros del HBcAg-Lys a especies de peso molecular superior.
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Ejemplo 33
Aislamiento y acoplamiento químico del péptido FLAG a pili de Tipo 1 de Escherichia coli utilizando un entrecruzador heterobifuncional A. Introducción
Los pili bacterianos o fimbrias son orgánulos superficiales filamentosos producidos por una amplia gama de bacterias. Estos orgánulos median el anclaje de las bacterias a los receptores superficiales de las células anfitrionas y son necesarios para el establecimiento de muchas infecciones bacterianas como la cistitis, la pielonefritis, la meningitis del recién nacido y la diarrea.
Los pili se pueden dividir en clases diferentes con respecto a su especificidad de receptor (la aglutinación de células sanguíneas de especies diferentes), su ruta de ensamblaje (nucleación extracelular, secreción general, chaperona/acomodadora, chaperona alternativa) y sus propiedades morfológicas (pili gruesos, rígidos; pili finos, flexibles; estructuras atípicas incluyendo cápsula; rizado; etc.). Los ejemplos de pili gruesos, rígidos que forman una hélice dextrógira que están ensamblados por medio de la denominada ruta de las chaperonas/acomodadoras y median la adherencia a las glucoproteínas anfitrionas incluyen los pili de Tipo 1, los pili P, los pili S, los pili F1C, y los pili 987P). Los miembros más prominentes y mejor caracterizados de esta clase de pili son los pili P y los pili de Tipo 1 (para revisiones de las estructuras adhesivas, su ensamblaje y las enfermedades asociadas véanse Soto, G. E. & Hultgren, S. J., J. Bacteriol. 181:1059-1071 (1999); Bullitt & Makowski, Biophys. J. 74:623-632 (1998); Hung, D. L. & Hultgren, S. J., J. Struct, Biol. 124:201-220 (1998)).
Los pili de Tipo 1 son estructuras proteicas poliméricas filamentosas, largas sobre la superficie de E. coli. Poseen propiedades adherentes que permiten la unión a receptores que contienen manosa presentes en la superficie de ciertos tejidos del anfitrión. Los pili de Tipo 1 pueden ser expresados por un 70-80% de todas los productos aislados E. coli y una única célula de E. coli puede portar hasta 500 pili. Los pili de Tipo 1 alcanzan típicamente una longitud de 0,2 a 2 \mum con un número medio de 1.000 subunidades de proteína que se asocian a una hélice dextrógira con 3.125 subunidades por vuelta con un diámetro de 6 a 7 nm y un hueco central de 2,0 a 2,5 nm.
El componente principal del pilus de Tipo 1, FimA, que representan un 98% de la proteína total del pilus, es una proteína de 15,8 kDa. Los componentes minoritarios del pilus FimF, FimG y FimH se incorporan en la punta y a distancias regulares a lo largo del eje del pilus (Klemm, P. & Krogfelt, K. A., "Type I fimbriae of Escherichia coli", en: Fimbriae. Klemm, P. (ed.), CRC Press Inc., (1994) págs. 9-26). Se demostró que FimH, una proteína de 29,1 kDa, era la adhesina de unión a manosa de los pili de Tipo 1 (Krogfelt, K. A., et al., Infect. Immun. 58:1995-1998 (1990); Klemm, P., et al., Mol. Microbiol. 4:553-560 (1990); Hanson, M. S. & Brinton, C. C. J., Nature 17:265-268 (1988)), y su incorporación es facilitada probablemente por FimG y FimF (Klemm, P. & Christiansen, G., Mol. Gen. Genetics 208:439-44.5 (1987); Russell, P. W. & Orndorff, P. E., J. Bacteriol. 174:5923-5935 (1992)). Recientemente, se ha demostrado que FimH también podría formar un fibrilo de punta fina en el extremo de los pili (Jones, C. H., et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 92:2081-2085 (1995)). El orden de los componentes mayoritarios y minoritarios de los pili maduros individuales es muy similar, indicando un procedimiento de ensamblaje altamente ordenado (Soto, G. E. & Hultgren, S. J., J. Bacteriol. 181:1059-1071 (1999)).
Los pili P de E. coli son e arquitectura muy similar, tienen un diámetro de 6,8 nm, un hueco axial de 1,5 nm y 3,28 subunidades por vuelta (Bullitt & Makowski, Biophys. J. 74:623-632 (1998)). La PapA de 16,6 kDa es el principal componente de este tipo de pilus y muestra una identidad de secuencia del 36% y una similitud del 59% con FimA (véase la Tabla 1). Como en los pili de Tipo 1 la adhesina del pilus P de 36,0 kDa PapG y las proteínas adaptadoras especializadas forman solamente una fracción diminuta de la proteína total del pilus. La diferencia más obvia con los pili de Tipo 1 es la ausencia de adhesina como parte integrante de la varilla del pilus, y su localización exclusiva en el fibrilo de la punta que está conectado con la varilla del pilis por medio de proteínas adaptadoras especializadas de las que carecen los pili de Tipo 1 (Hultgren, S. J., et al., Cell 73:887-901 (1993)).
TABLA 1 Similitud e identidad entre las diversas proteínas estructurales del pilus entre pili de Tipo 1 y P (en tanto por ciento). Se omitieron las adhesinas
20
Los pili de Tipo 1 son complejos hetero-oligoméricos extraordinariamente estables. Ni el tratamiento con SDS ni las digestiones con proteasas, la ebullición o la adición de agentes desnaturalizantes pueden disociar los pili de Tipo 1 en sus componentes proteicos individuales. Se encontró inicialmente que la combinación de diferentes métodos como la incubación a 100ºC a pH 1,8 permite la despolimerización y separación de los componentes (Eshdat, Y., et al., J. Bacteriol. 148:308-314 (1981); Brinton C.C.J., Trans, N.Y. Acad. Sci. 27:1003-1054 (1965); Hanson, A.S., et al., J. Bacteriol., 170:3350-3358 (1988); Klemm, P. y Krogfelt, K.A., "Type I fimbriae of Escherichia coli", en: Fimbriae. Klemm, P. (ed.), CRC Press Inc., (1994) págs. 9-26). Interesantemente, los pili de Tipo 1 muestran una tendencia a romperse en las posiciones en las que se incorpora FimH tras la agitación mecánica, dando como resultado fragmentos que presentan una adhesina FimH en sus puntas. Esto fue interpretado como un mecanismo de la bacteria para acortar los pili hasta una longitud eficaz bajo estrés mecánico (Klemm, P. y Krogfelt, K.A., "Type I fimbriae of Escherichia coli", en: Fimbriae. Klemm, P. (ed.), CRC Press Inc., (1994) págs. 9-26). A pesar de su extraordinaria estabilidad, se ha demostrado que los pili de Tipo 1 se desenmarañan parcialmente en presencia de glicerol del 50%; pierden su estructura helicoidal y forman una cadena proteica de 2 nm de ancho, prolongada y flexible (Abraham, S. N., et al., J. Bacteriol 174:5145-5148 (1992)).
Los pili P y los pili de Tipo 1 están codificados por agrupaciones de genes individuales en el cromosoma de E. coli de aproximadamente 10 kb (Klemm, P. & Krogfelt, K. A., "Type I fimbriae of Escherichia coli", en: Fimbriae. Klemm, P. (ed.), CRC Press Inc., (1994) págs. 9-26; Orndorff, P. E. & Fallow, S., J. Bacteriol. 160:61-66 (1984)). Se han encontrado un total de nueve genes en el agrupamiento génico de pilus de Tipo 1, y 11 genes en el agrupamiento de pilus P (Hultgren, S. J., et al., Adv. Prot. Chem. 44:99-123 (1993)). Ambas agrupaciones se organizan bastante similarmente.
Los dos primeros genes fim, fimB y fimE, codifican las recombinasas implicadas en la regulación de la expresión del pilus (McClain, M. S., et al., J. Bacteriol. 173:5308-5314 (1991)). La estructura principal de la proteína del pilus está codificada por el siguiente gen del agrupamiento, fimA (Klemm, P., Euro. J. Biochem. 143:395-400 (1984); Orndorff, P. E. & Falkow, S., J. Bacteriol. 160:61-66 (1984); Orndorff, P. E. & Falkow, S., J. Bacterial. 162:454-457 (1985)). El papel exacto de fimI no está claro. Se ha informado que también se incorpora al pilus (Klemm, P. & Krogfelt, K. A., "Type I fimbriae of Escherichia coli", en: Fimbriae. Klemm, P. (ed.), CRC Press Inc., (1994) págs. 9-26). El fimC adyacente codifica no un componente estructural del pilus maduro, sino una denominada chaperona del pilus que es esencial para en ensamblaje del pilus (Klemm, P., Res. Microbiol. 143:831-838 (1992); Jones, C. H., et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:8397-8401 (1993)).
La plataforma de ensamblaje en la membrana bacteriana externa a la que se ancla el pilus maduro es codificada por fimD (Klemm, P. & Christiansen, G., Mol. Gen, Genetics 220:334-338 (1990)). Los tres componentes minoritarios de los pili de Tipo 1, FimF, FimG y FimH son codificados por los tres últimos genes del agrupamiento (Klemm, P. & Christiansen, G., Mol. Gen. Genetics 208:439-445 (1987)). Aparte de fimB y fimE, todos los genes codifican proteínas precursoras para la secreción al periplasma a través de la ruta sec.
Las similitudes entre diferentes pili que siguen la ruta chaperona/acomodador están restringidas a sus propiedades morfológicas. Sus genes también están dispuestos de una manera muy similar. Generalmente el gen de la subunidad estructural principal se encuentra directamente aguas abajo de los elementos reguladores al principio del agrupamiento génico, seguido de un gen para la subunidad estructural adicional (fimI en el caso de los pili de Tipo 1 y papH en el caso de los pili P). Se mostró PapH y se supone que FimI termina el ensamblaje del pilus (Hultgren, S. J., et al., Cell 73:887-901 (1993)). Las dos proteínas que guían el procedimiento de formación del pilus, es decir la chaperona del pilus especializada y la plataforma de ensamblaje de la membrana externa, están localizadas adyacentemente aguas abajo. Al final de los agrupamientos se codifica un número variable de componentes minoritarios del pilus incluyendo las adhesinas. Las similitudes en la estructura morfológica, la secuencia (véase la Tabla 1), la organización y regulación genéticas indican una relación evolutiva íntima y un procedimiento de ensamblaje similar para estos orgánulos celulares.
Las bacterias que producen pili de Tipo 1 muestran una denominada variación de fase. Las bacterias están completamente piliadas o desnudas. Esto se logra mediante una inversión de un fragmento de ADN genómico de 314 pb que contiene el promotor fimA, induciendo de ese modo una expresión "totalmente activo" o "totalmente inactivo" de los genes del pilus (McClain, M. S., et al., J. Bacteriol. 173:5308-5314 (1991)). El acoplamiento de la expresión de los otros genes estructurales del pilus a la expresión de fimA se logra mediante un mecanismo todavía desconocido. No obstante, un amplio abanico de estudios dilucidaron el mecanismo que influye en el cambio entre los dos fenotipos.
Los dos primeros genes del agrupamiento de pilus de Tipo 1, fimB y fimE codifican recombinasas que reconocen segmentos de ADN de 9 pb con simetría de díada que flanquean el promotor fimA invertible. Mientras que FimB cambia la pilación "activada", FimE pone el promotor en orientación "desactivada". Por lo tanto, la regulación al alza o a la baja de la expresión de fimB o de fimE controla la posición del denominado "conmutador fim" (McClain, M. S., et al., J. Bacteriol. 173:5308-5314 (1991); Blomfield, I. C., et al., J. Bacterial. 173:5298-5307 (1991)).
Las dos proteínas reguladoras fimB y fimE son transcritas a partir de dos promotores diferentes y se demostró que su transcripción estaba influida por una amplia gama de factores diferentes incluyendo el factor de integración del anfitrión (IHF) (Blomfield, I. C., et al., Mol. Microbiol. 23:705-717 (1997)) y la proteína reguladora sensible a la leucina (LRP) (Blomfield, I. C., et al., J. Bacterial. 175:27-36 (1993); Gally, D. L., et al., J. Bacteriol. 175:6186-6193 (1993); Gally, D. L., et al., Microbiol. 21:725-738 (1996); Roesch, R. L. & Blomfield, I. C., Mol. Microbiol, 27:751-761 (1998)). Las mutaciones en el primero bloquean la bacteria en la fase "activada" o "desactivada", mientras que los mutantes LRP cambian con una frecuencia reducida. Además, se ha demostrado un efecto de leuX sobre la biogénesis del pilus. Este gen está localizado en la proximidad de los genes fim en el cromosoma y codifica el codón UUG en las especies con ARNt para leucina minoritarios. Mientras fimB contiene cinco codones UUG, fimE contiene sólo dos, y el aumento de la transcripción de leuX podría favorecer la expresión de FimB sobre FimE (Burghoff, R. L., et al., Infect. Immun. 61:1293-1300 (1993); Newman, J. V., et al., FEMS Microbial. Lett. 122:281-287 (1994); Ritter, A., et al., Mol. Microbial, 25:871-882 (1997)).
Además, la temperatura, se demostró que la composición del medio y otros factores medioambientales influyen en la actividad de FimB y FimE. Finalmente, se ha informado de un cambio estadístico, espontáneo, del promotor fimA. La frecuencia de este cambio espontáneo es de aproximadamente 10^{-3} por generación (Eisenstein, B. I., Science 214:337-339 (1981); Abraham, S. M., et al., Proc. Nat. Acad. Sci, USA 82:5724-5727 (1985)), pero está acusadamente influido por los factores anteriormente mencionados.
Los genes fimI y fimC también son transcritos a partir del promotor fimA, pero directamente aguas abajo de fimA se identificó un segmento de ADN con una fuerte tendencia a formar estructura secundaria lo que probablemente representa un terminador de la transcripción parcial (Klemm, P., Euro. J. Biochem. 143:395-400 (1984)); y por lo tanto se supone que reduce severamente la transcripción de fimI y fimC. En el extremo 3' de fimC un promotor adicional controla la transcripción de fimD; en el extremo 3' de fimD se localiza el último promotor fim conocido que regula los niveles de FimF, FimG, y FimH. Así, todas las proteínas de los pili de Tipo 1 secundarias son transcritas como un ARNm sencillo (Klemm, P. & Krogfelt, K. A., "Type I fimbriae of Escherichia coli", en: Fimbriae. Klemm, P. (ed.), CRC Press Inc., (1994) págs. 9-26). Esto asegura una estequiometría 1:1:1 en el nivel del ARNm, que probablemente se mantiene en el nivel de la proteína.
En el caso de los pili P se encontraron mecanismos reguladores adicionales cuando se determinó la vida media del ARNm para diferentes genes de pilus P. El ARNm para papA tenía una vida extraordinariamente larga, mientras que el ARNm para papB, una proteína del pilus reguladora, era codificada por un ARNm de vida corta (Naureckiene, S. & Uhlin. B. E., Mol. Microbiol. 21:55-68 (1996); Nilsson, P., et al., J. Bacterial. 178:683-690 (1996)).
En el caso de los pili de Tipo 1, el gen para la chaperona del pilus de Tipo 1 FimC comienza con GTG en lugar de con un codón ATG, conduciendo a una reducción de la eficacia de la traducción. Finalmente, el análisis del gen fimH reveló una tendencia del ARNm de fimH a formar un bucle, lo que podría impedir gravemente la traducción. En resumen, la biogénesis del pilus bacteriano es regulada por una amplia gama de mecanismos diferentes que actúan sobre todos los niveles de la biosíntesis de proteínas.
Las proteínas periplásmicas del pilus se sintetizan generalmente en forma de precursores, que contienen una secuencia señal N-terminal que permite la translocación a través de la membrana interna a través del aparato Sec. Después de la translocación los precursores son escindidos normalmente por la peptidasa señal de tipo I. Las subunidades estructurales del pilus de Tipo 1 contienen normalmente enlaces disulfuro, su formación está catalizada por los productos génicos DsbA y posiblemente DsbC y DsbG.
La chaperona del pilus de Tipo 1 FimC carece de restos cisteína. En contraste, la chaperona de los pili P, PapD, es el único miembros de la familia de chaperonas del pilus que contiene un enlace disulfuro, y se ha demostrado explícitamente la dependencia de los pili P de DsbA (Jacob-Dubuisson, F., et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:11552-11556 (1994)). PapD no se acumula en el periplasma de la cepa \DeltadsbA, indicando que la perturbación de la maquinaria de ensamblaje del pilus P está ocasionada por la ausencia de la chaperona (Jacob-Dubuisson, F., et al., Proc. Nat. Acad Sci. USA 91:11552-11556 (1994)). Esto está de acuerdo con el descubrimiento de que los pili de Tipo 1 todavía se ensamblan en una cepa \DeltadsbA, aunque a nivel reducido (Hultgren, S. J., et al., "Bacterial Adhesion and Their Assembly", en: Escherichia coli and Salmonella, Neidhardt, F. C. (ed.) ASM Press, (1996) págs. 2730-2756).
Los pili de Tipo 1 así como los pili P están constituidos hasta 98% de una subunidad estructural sencilla o principal denominada FimA y PapA, respectivamente. Ambas proteínas tienen un tamaño de \sim15,5 kDa. Los componentes secundarios adicionales codificados en los agrupamientos génicos del pilus son muy similares (véase la Tabla 1). Las similitudes de secuencia y tamaño de las subunidades con la excepción de las adhesinas sugiere que todas comparten un motivo de plegamiento idéntico, y difieren únicamente con respecto a su afinidad entre sí. Especialmente las regiones N- y C-terminales de estas proteínas están bien conservadas y se supone que juegan un papel importante en las interacciones chaperona/subunidad así como en las interacciones subunidad/subunidad dentro del pilus (Soto, G. E. & Hultgren, S. J., J. Bacteriol. 181:1059-1071 (1999)). Interesantemente, el segmento N-terminal conservado se puede encontrar en el centro de las adhesinas del pilus, indicando una organización de dos dominios de las adhesinas cuando el dominio C-terminal propuesto, partiendo del motivo conservado, corresponde a una subunidad de pilus estructural mientras que se ha demostrado que el dominio N-terminal es responsable del reconocimiento de los receptores celulares del anfitrión (Hultgren, S. J., et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:4357-4361 (1989); Haslam, D. B., et al., Mol. Microbiol. 14:399-409 (1994); Soto, G. E., et al., EMBO J. 17:6155-6167 (1998)). También se demostró que las diferentes subunidades influyen en las propiedades morfológicas de los pili. Se informó que la eliminación de algunos genes reducía el número de pili de Tipo 1 o P o aumentaba su longitud, (fimH, papG, papK, fimF, fimG) (Russell, P. W. & Orndorff, P. E., J. Bacteriol. 174:5923-5935 (1992); Jacob-Dubuisson, R., et al., EMBO J. 12:837-847 (1993); Soto, G. E. & Hultgren, S. J., J. Bacteriol. 181:1059-1071 (1999)); la combinación de las deleciones de genes amplificó estos efectos o condujo a una pérdida total de piliación (Jacob-Dubuisson, R., et al., EMBO J. 12:837-847
(1993)).
En orgánulos celulares adherentes no fimbriales también ensamblados a través de sistemas de chaperonas/acomo-
dador tales como fimbrias Myf y pili CS3, la región C-terminal conservada es diferente. Esto prueba indirectamente la importancia de estos segmentos de la subunidad C-terminal para las interacciones cuaternarias (Hultgren, S. J., et al., "Bacterial Adhesion and Their Assembly", en: Escherichia coli y Salmonella, Neidhardt, F. C. (ed.) ASM Press, (1996) págs. 2730-2756).
Los estudios de deleción de genes demostraron que la eliminación de las chaperonas del pilus conduce a una pérdida total de piliación en pili P y pili de Tipo 1 (Lindberg, F., et al., J. Bacteriol. 171:6052-6058 (1989); Klemm, P., Res. Microbiol. 143:831-838 (1992); Jones, C. H., et al., Proc. Nat. Acad Sci. USA 90:8397-8401 (1993)). Los extractos periplásmicos de una cepa \DeltafimC demostraron la acumulación de FimA de la subunidad principal, pero no se pudieron detectar pili (Klemm, P., Res. Microbiol. 143:831-838 (1992)). Los intentos de expresar en exceso las subunidades de pilus P individuales fracasaron y sólo pudieron ser detectadas formas degradadas proteolíticamente en ausencia de PapD; además, la adhesina del pilus P se purificó con la fracción de la membrana interna en ausencia de la chaperona (Lindberg, F., et al., J. Bacteriol. 171:6052-6058 (1989)). No obstante, la co-expresión de las proteínas del pilus estructurales y su chaperona permitieron la detección de complejos de chaperona/subunidad del periplasma en el caso del complejo FimC/FimH así como en el caso de diferentes proteínas Pap incluyendo la adhesina PapG y la subunidad principal PapA (Tewari, R., et. al., J. Biol. Chem. 268:3009-3015 (1993); Lindberg, F., et al., J. Bacteriol. 171:6052-6058 (1989)). También se ha investigado in vitro la afinidad de los complejos de chaperona/subunidad hacia su plataforma de ensamblaje y se encontró que diferían acusadamente (Dodson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3670-3674 (1993)). A partir de estos resultados se sugirieron las siguientes funcionales para las chaperonas del pilus.
Se supone que reconocen las subunidades del pilus no plegadas, evitan su agregación y proporcionan un "molde de plegamiento" que guía la formación de una estructura nativa.
Luego se espera que las subunidades plegadas, que después del plegamiento presentan superficies que permiten las interacciones subunidad/subunidad, se protejan de la interacción con otras subunidades, y se mantengan en un estado monomérico, competente para el ensamblaje.
Finalmente, se supone que las chaperonas del pilus permitan una liberación desencadenada de las subunidades en la localización de ensamblaje de la membrana interna, y, haciendo esto con diferente eficacia, influyen en la composición y el orden de los pili maduros (véase también la sección separada de más abajo).
Después de la liberación de la subunidad en la membrana externa, la chaperona queda libre para otra ronda de unión al sustrato, ayuda al plegamiento, o transporte de la subunidad a través del periplasma y liberación específica al sito de ensamblaje. Puesto que el periplasma carece de fuentes de energía, como el ATP, el proceso de ensamblaje del pilus completo se debe conducir termodinámicamente (Jacob-Dubuisson, F., et al., Proc. Nat. Acad Sci. USA 91:11552-11556 (1994)). El amplio abanico de funciones diferentes atribuidas a las chaperonas del pilus podría implicar una cascada de etapas con una regulación extremadamente fina.
Varios descubrimientos, no obstante, no se explican fácilmente con el modelo de la función de la chaperona del pilus esbozada anteriormente. Un ejemplo es la existencia de complejos de chaperona/subunidad multiméricos (Striker, R. T., et al., J. Biol. Chem. 269:12233-12239 (1994)), donde una chaperona une dímeros o trímeros de subunidades. Es difícil imaginar un molde de plegamiento que pueda ser de "doble-marco". Los estudios de los detalles moleculares de la interacción chaperona/subunidad (véase más abajo) apoyaron parcialmente las funciones resumidas antes, pero también originaron nuevas cuestiones.
Las 31 chaperonas periplásmicas identificadas hasta ahora mediante estudios genéticos o análisis de secuencias son proteínas de aproximadamente 25 kDa con valores de pI visiblemente altos de alrededor de 10. Diez de estas chaperonas ayudan al ensamblaje de pili de tipo varilla, cuatro están implicadas en la formación de pili finos, diez son importantes para la biogénesis de estructuras atípicamente finas (incluyendo estructuras de tipo cápsula) y dos estructuras adherentes no se han determinado hasta ahora (Holmgren, A., et al., EMBO J. 11:1617-1622 (1992); Bonci, A., et al., J. Mol. Evolution 44:299-309 (1997); Smyth, C. J., et al., FEMS Immun. Med Microbiol. 16:127-139 (1996); Hung, D. L. & Hultgren, S. J., J. Struct, Biol. 124:201-220 (1998)). La identidad de secuencia por pares entre estas chaperonas y PapD oscila de 25 a 56%, indicando un plegamiento global idéntico (Hung, D. L., et al., EMBO J. 15:3792-3805 (1996)).
Los primeros estudios sobre el mecanismo de reconocimiento chaperona/sustrato estuvieron basados en la observación de que los extremos C de todas la chaperonas de pilus conocidas son extremadamente similares. Se demostró que péptidos sintéticos correspondientes a los extremos C de las proteínas del pilus P se unen a PapD en análisis ELISA (Kuehn, M. J., et al., Science 262:1234-12A1 (1993)). Muy importantemente, se resolvieron las estructuras de rayos X de dos complejos en los que PapD era cristalizada simultáneamente con péptidos de 19 restos correspondientes al extremo C de la adhesina PapG o del componente secundario del pilus PapK (Kuehn, M. J., et al., Science 262:1234-1241 (1993); Soto, G. E., et al., EMBO J. 17:6155-6167 (1998)). Ambos péptidos se unen en una conformación prolongada a una hebra \beta en el dominio N-terminal de la chaperona que está orientado hacia la hendidura inter-dominio, prolongando de ese modo una lámina \beta mediante una hebra adicional. Los grupos carboxilato C-terminales de los péptidos se anclaron a través de enlaces de hidrógeno a Arg8 y Lys112, estos dos restos son invariables en la familia de chaperonas del pilus. Los estudios de mutagénesis confirmaron su importancia puesto que su cambio a alanina produjo la acumulación de chaperonas de pilus no funcionales en el periplasma (Slonim, L. N., et al., EMBO J. 11:4747-4756 (1992)). La estructura cristalina de PapD indica que ni Arg8 ni Lys112 están implicadas en la estabilización de la chaperona, pero están completamente expuestas al disolvente (Holmgren, A. & Branden, C. I., Nature 342:248-251 (1989)). En el lado del sustrato se informó que el cambio de restos PapA C-terminales anula la formación de pilus P, y experimentos similares sobre el segmento C-terminal conservado de la adhesina del pilus P PapG evita su incorporación al pilus P (Hultgren, S. J., et al., "Bacterial Adhesion and Their Assembly", en: Escherichia coli and Salmonella, Neidhardt, F. C. (ed.) ASM Press, (1996) págs. 2730-2756). Todas las evidencias indicaron por lo tanto el reconocimiento de la subunidad del pilus a través de los segmentos C-terminales de las subunidades.
Un estudio más reciente de los cambios del aminoácido C-terminal de la adhesina del pilus P PapG proporciona una descripción más detallada. Se toleró un abanico de sustituciones de aminoácidos en las posiciones -2, -4, -6, y -8 con respecto al extremo C, pero cambió la estabilidad del pilus (Soto, G. E., et al., EMBO J. 17:6155-6167 (1998)).
Sin embargo, aparecen algunos problemas cuando se examina este modelo más atentamente. Las estructuras bacterianas adherentes no se ensamblan a pili de tipo varilla, rígidos que carecen de segmentos C-terminales conservados (Hultgren, S. J., et al., "Bacterial Adhesion y Their Assembly", en: Escherichia coli y Salmonella, Neidhardt, F.C. (ed.) ASM Press, (1996) págs. 2730-2756), incluso aunque dependan también de la presencia de chaperonas del pilus relacionadas. Esto indica un papel general diferente para los segmentos C-terminales de las subunidades del pilus, es decir la mediación de interacciones cuaternarias en el pilus maduro. Por otra parte, el intento de resolver la estructura de un péptido C-terminal que forma complejo con la chaperona mediante RMN resulto fuertemente impedido por la débil unión del péptido a la chaperona (Walse, B., et al., FEBS Lett. 412:115-120 (1997)); mientras que una contribución esencial de los segmentos C-terminales para el reconocimiento de la chaperona implica interacciones de afinidad relativamente alta.
Aparece un problema adicional si se tiene en cuenta la variabilidad entre las diferentes subunidades. Incluso aunque se conserven los segmentos C-terminales, se encuentra un amplio intervalo de sustituciones conservativas. Por ejemplo, 15 de los 19 restos aminoácido difieren entre los dos péptidos cristalizados simultáneamente con PapD (Soto, G. E., et al., EMBO J. 17:6155-6167 (1998)). Esto ha sido explicado por la clase de interacción entre la chaperona y el sustrato, que ocurre principalmente a través de las interacciones de la cadena principal y no específicamente a través de interacciones de la cadena secundaria. Y además, la especificidad de la chaperona para algunos sustratos no se explica fácilmente. En contraposición al primer argumento, los restos conservados se han tomado como prueba de la especificidad (Hultgren, S. J., et al., "Bacterial Adhesion and Their Assembly", en: Escherichia coli y Salmonella, Neidhardt, F. C. (ed.) ASM Press, (1996) págs. 2730-2756).
La plataforma de ensamblaje de la membrana externa, también denominada "acomodador" en las publicaciones, está formada de homo-oligómeros de FimD o PapC, en el caso de los pili de Tipo 1 y P, respectivamente (Klemm, P. & Christiansen, G., Mol. Gen, Genetics 220:334-338 (1990); Thanassi, D. G., et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 95:3146-3151 (1998)). Los estudios sobre la elongación de las fimbrias de Tipo 1 mediante microscopía electrónica demostraron una elongación del pilus desde la base (Lowe, M. A., et al., J. Bacteriol. 169:157-163 (1987)). En contraste con la secreción de subunidades no plegadas en el espacio periplásmico, las proteínas completamente plegadas tienen que ser translocadas a través de la membrana externa, posiblemente en una forma oligomérica (Thanassi, D. G., et al., Proc. Nat. Acad Sei. USA 95:3146-3151 (1998)). Esto requiere primero un poro de membrana suficientemente ancho para permitir el paso y segundo un mecanismo de transporte que sea guiado termodinámicamente (Jacob-Dubuisson, F., et al., J. Biol. Chem. 269:12447-12455 (1994)).
Se demostró que la sola expresión de FimD tenía un efecto perjudicial sobre el crecimiento bacteriano, la expresión simultánea de las subunidades del pilus podría restaurar el comportamiento de crecimiento normal (Klemm, P. & Christiansen, G., Mol. Gen, Genetics 220:334-338 (1990)). Basándose en esto se puede concluir que los acomodadores probablemente forman poros que están completamente rellenos de pilus. La microscopía electrónica sobre las vesículas de la membrana en las que se ha incorporado PapC confirmó una estructura que forma poros con un diámetro interno de 2 nm (Thanassi, D. G., et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:3146-3151 (1998)). Puesto que el diámetro interno del poro es demasiado pequeño para el paso de una varilla de pilus, se ha sugerido que la disposición helicoidal del pilus maduro se forma en el exterior de la superficie bacteriana. El descubrimiento de que el glicerol conduce al desenmarañamiento de los pili que después forman una cadena proteica de aproximadamente 2 nm está en buena armonía con esta hipótesis, puesto que se podría formar una cadena prolongada de subunidades en el poro como una primera etapa (Abraham, S. N., et al., J. Bacteriol. 174:5145-5148 (1992); Thanassi, D. G., et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 95:3146-3151 (1998)). La formación de la varilla de pilus helicoidal en el exterior de la membrana bacteriana podría ser la fuerza impulsora responsable de la translocación del pilus en crecimiento a través de la membrana.
También se ha demostrado que las proteínas acomodadoras de pili de Tipo 1 y P forman complejos ternarios con complejos de chaperona/subunidad con diferentes afinidades (Dodson, K. W., et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:3670-3674 (1993); Saulino, E. T., et al., EMBO J. 17:2177-2185 (1998)). Esto se interpretó como "reparto cinético" que permite un orden definido de proteínas del pilus en el pilus. Por otra parte, se ha sugerido que las proteínas estructurales podrían presentar una superficie de unión sólo compatible con el otro tipo de proteína del pilus; esto podría ser otro mecanismo para lograr un orden altamente definido de subunidades en el pilus maduro (Saulino, E. T., et al., EMBO J. 17:2177-2185 (1998)).
B. Producción de pili de Tipo 1 de Escherichia coli
La cepa W3110 de E. coli se esparció en placas LB (10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura, 5 g/L de NaCl, pH 7,5, agar al 1% (p/v)) y se incubó a 37ºC durante la noche. Después se utilizó una sola colonia para inocular 5 ml de cultivo iniciador LB (10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura, 5 g/L de NaCl, pH 7,5). Después de la incubación durante 24 horas en condiciones que favorecen la bacteria que produce pili de Tipo 1 (37ºC, sin agitación) 5 matraces con agitador que contenían 1 litro de LB se inocularon con un mililitro del cultivo iniciador. Los cultivos bacterianos se incubaron después durante 48 a 72 horas adicionales a 37ºC sin agitación. Las bacterias se cosecharon después mediante centrifugación (5000 rpm, 4ºC, 10 minutos) y el sedimento resultante se volvió a resuspender en 250 mililitros de Tris/HCl 10 mM, pH 7,5. Los pili se separaron de bacteria mediante 5 minutos de agitación en una mezcladora convencional a 17.000 rpm. Después de la centrifugación durante 10 minutos a 10.000 rpm a 4ºC se recogió el sobrenadante que contenía los pili y se añadió MgCl_{2} 1 M a una concentración final 100 mM. La solución se mantuvo a 4ºC durante 1 hora, y los pili precipitados se sedimentaron mediante centrifugación (10.000 rpm, 20 minutos, 4ºC). El sedimento se resuspendió después en HEPES 10 mM, pH 7,5, y luego se aclaro la solución de pilus mediante una etapa de centrifugación final para eliminar los restos celulares residuales.
C. Acoplamiento de FLAG a pili de Tipo 1 de E. coli utilizando éster de m-Maleimidonbenzoil-N-hidroxi-sulfosuccinimida (sulfo-MBS)
Se incubaron 600 \mul de una solución con una pureza de 95% de pili de Tipo 1 bacteriano (2 mg/ml) durante 30 minutos a temperatura ambiente con el entrecruzador heterobifuncional sulfo-MBS (0,5 mM). Después de eso, la mezcla se sometió a diálisis durante la noche frente a 1 litro de tampón fosfato 50 mM (pH 7,2) con NaCl 150 mM para eliminar el sulfo-MBS libre. Después, 500 \mul de los pili derivatizados (2 mg/ml) se mezclaron con 0,5 mM de péptido FLAG (que contenía una Cisteína amino-terminal) en presencia de EDTA 10 mM para evitar la sufhidriloxidación catalizada por metal. El péptido no acoplado se eliminó mediante cromatografía de exclusión por tamaños.
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Ejemplo 34
Construcción de un plásmido de expresión para la expresión de pili de Tipo 1 de Escherichia coli
La secuencia de ADN descrita en GenBank Núm. de Acceso U14003, cuya descripción completa se incorpora en la presente memoria como referencia, contiene todos los genes de Escherichia coli necesarios para la producción de pili de tipo 1 del nucleótido número 233947 al nucleótido número 240543 (el agrupamiento génico fim). Esta parte de las secuencias contiene las secuencias para los fimA, fimI, fimC, fimD, fimF, fimG, y fimH. Se emplearon tres PCR diferentes para la amplificación de esta parte del genoma de E. coli y la posterior clonación en pUC19 (Núms. Acceso GenBank L09137 y X02514) como se describe a continuación.
El molde de la PCR se preparó mezclando 10 ml de una provisión en glicerol de la cepa W3110 de E. coli con 90 ml de agua e hirviendo la mezcla durante 10 minutos a 95ºC, centrifugando durante 10 minutos a 14.000 rpm en una centrífuga de sobremesa y recogiendo el sobrenadante. Después se mezclaron 10 ml del sobrenadante con 50 pmoles de un primer cebador para PCR y 50 pmoles de un segundo cebador para PCR como se define más abajo. Después, se añadieron 5 ml de un tampón 10X PCR, 0,5 ml de ADN-Polimerasa Taq y agua hasta un total de 50 ml. Todas las PCR se llevaron a cabo de acuerdo con el siguiente esquema: 94ºC durante 2 minutos, después 30 ciclos de 20 segundos a 94ºC, 30 segundos a 55ºC, y 2 minutos a 72ºC. Los productos de la PCR se purificaron después mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%.
Se utilizaron los oligonucleótidos con las siguientes secuencias para amplificar la secuencia del nucleótido número 233947 al nucleótido número 235863, que comprende los genes fimA, fimI, y fimC:
21
Estos dos oligonucleótidos también contenían las secuencias limítrofes que permitían la clonación del producto de amplificación en puc19 a través de los sitios de restricción HindIII y SalI. El plásmido resultante se denominó pFIMAIC (SEQ ID NO:198).
Los oligonucleótidos con las siguientes secuencias se utilizaron para amplificar la secuencia del nucleótido número 235654 al nucleótido número 238666, que comprende el gen fimD:
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23
Estos dos oligonucleótidos también contenían las secuencias limítrofes que permitían la clonación del producto de amplificación en puc19 a través de los sitios de restricción HindIII y XbaI, el plásmido resultante se denominó pFIMD (SEQ ID NO:201).
Los oligonucleótidos con las siguientes secuencias se utilizaron para amplificar la secuencia del nucleótido número 238575 al nucleótido número 240543, que comprende el gen fimF, fimG, y fimH:
24
Estos dos oligonucleótidos también contenían las secuencias limítrofes que permitían la clonación del producto de amplificación en puc19 a través de los sitios de restricción HindIII y XbaI; el plásmido resultante se denominó pFIMFGH. (SEQ ID NO:204).
Los siguientes procedimientos de clonación se llevaron a cabo con posterioridad para generar un plásmido que contenía todos los genes fim anteriormente mencionados:
pFIMAIC fue digerido con EcoRI y HindIII (2237-3982), pFIMD fue digerido con EcoRI y SstII (2267-5276), pFIMFGH fue digerido con SstII y HindIII (2327-2231). Los fragmentos se ligaron después y el plásmido resultante, que contenía todos los genes fim necesarios para la formación del pilus, se denominó pFIMAICDFGH (SEQ ID NO:205).
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Ejemplo 35
Construcción de un plásmido de expresión para pili de tipo 1 de Escherichia coli que carece de FimH para la adherencia
El plásmido pFIMAICDFGH (SEQ ID NO:205) fue digerido con KpnI, después de lo cual se aisló un fragmento que consistía en los números de nucleótidos 8895-8509 mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,7% y se circularizó mediante autoligación. El plásmido resultante se denominó pFIMAICDFG (SEQ ID NO: 206), carece de del gen fimH y se puede utilizar para la producción de pili de tipo 1 sin FIMH.
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Ejemplo 36
Expresión de pili de tipo 1 utilizando el plásmido pFIMAICDFGH
La cepa W3110 de E. coli se transformó con pFIMAICDFGH (SEQ ID NO:205) y se esparció sobre una placa LB (10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura, 5 g/L de NaCl, pH 7,5, agar al 1% (p/v)) que contenía 100 \mug/ml de ampicilina y se incubó a 37ºC durante la noche. Después se utilizó una sola colonia para inocular 50 ml de cultivo de inicio de LB-glucosa (10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura, glucosa al 1% (p/v), 5 g/L de NaCl, pH 7,5, 100 mg/ml de ampicilina). Después de la incubación durante 12-16 horas a 37ºC a 150 rpm, se inocularon matraces de 5 litros con agitador que contenían 2 litros de LB-glucosa con 20 mililitros del cultivo de inicio. Los cultivos bacterianos se incubaron después durante 24 h adicionales at 37ºC con agitación (150 rpm). Las bacterias se cosecharon después mediante centrifugación (5000 rpm, 4ºC, 10 minutos) y el sedimento resultante se resuspendió en 250 mililitros de Tris/HCl 10 mM, pH 8. Los pili se separaron de las bacterias mediante agitación en una mezcladora convencional a 17.000 rpm durante 5 minutos. Después de la centrifugación durante 10 minutos a 10.000 rpm, 1 hora,ºC se recogió el sobrenadante que contenía los pili y se añadió MgCl_{2} 1 M hasta una concentración final 100 mM. La solución se mantuvo a 4ºC durante 1 hora, y los pili precipitados se sedimentaron mediante centrifugación (10.000 rpm, 20 minutos, 4ºC). El sedimento se resuspendió después en HEPES 10 mM, EDTA 30 mM, pH 7,5, durante 30 minutos a temperatura ambiente, y la solución de pilus se aclaró después mediante una etapa de centrifugación final para eliminar los restos celulares residuales. La preparación se sometió después a diálisis frente a Hepes 20 mM, pH 7,4.
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Ejemplo 37
Acoplamiento de epítopos y mimotopos de IgE a pili de Tipo 1 de Escherichia coli
Una alícuota de 66 \mul de una solución 100 \muM del entrecruzador heterobifuncional sulfo-MBS se añadió a 400 \mul de una solución con una pureza del 95% de pili bacteriano de Tipo 1 (2,5 mg/ml, HEPES 20 mM, pH 7,4) y con posterioridad se incubó durante 45 minutos a temperatura ambiente agitando. Después de eso, el exceso de sulfa-MBS se separó mediante cromatografía de exclusión por tamaño utilizando una columna PD-10, Alternativamente, el entrecruzador se puede eliminar mediante diálisis. Después se añadieron 1,3 \mul de una solución que contenía 1,1 mg/ml de péptido Ce3epi (CGGVNLTWSRA SG (SEQ ID NO:207)), o péptido Ce3Mim (CGGVNLPWSFGLE (SEQ ID NO:208) a alícuotas de 1 ml de los pili derivatizados (1-1,25 mg/ml, HEPES 20 mM, pH 7,4). Las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 4 h y el péptido no acoplado se eliminó mediante diálisis frente a 2 veces 2 l de un tampón que contenía HEPES 20 mM (pH 7,4). Alternativamente, el péptido no acoplado se puede eliminar mediante cromatografía de exclusión por tamaño.
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Ejemplo 38
Inmunización de ratones con una proteína de fusión de fosfolipasa A_{2} (PLA_{2}) de veneno de abeja acoplada a una proteína de la cápside de Q\beta A. Preparación de un vector alternativo para la expresión citoplásmica de la variante catalíticamente inactiva del gen PLA_{2} fusionada a la secuencia de aminoácidos AAASGGCGG (SEQ ID NO: 209)
El constructo génico PLA_{2} del ejemplo 9 se amplificó mediante PCR a partir de pAV3PLAfos utilizando oligos ecori_Ndel_pla (siguiente secuencia) y PLA-Cys-hind (Ejemplo 29). Para la reacción, se utilizaron 100 pmoles de cada oligo, y aproximadamente 1 \mug de ADN PAV3PLAfos en las mezclas de reacción de 50 \mul con 1,2 unidades de ADN polimerasa Pfx (Gibco), MgSO_{4} 1 mM, dNTPS 200 \muM y solución de potenciador Pfx (Gibco) diluida diez veces. Para la reacción, el ciclo de temperatura se llevó a cabo como sigue: 94ºC durante 2 minutos, 5 ciclos de 92ºC (0,5 minutos), 58ºC (0,5 minutos), 68ºC (1 minuto); 25 ciclos de 92ºC (0,5 minutos), 63ºC (0,5 minutos), 68ºC (1 minuto). El producto de la PCR se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa y posterior aislamiento del the fragmento utilizando el Kit Qiaquick de Qiagen, se digirió con las enzimas Ndel y HindIII, y se clonó en el vector PET11a (Novagen) digerido con las mismas enzimas.
25
El vector codificó una proteína de fusión que tenía la secuencia de aminoácidos
2500
Acoplamiento de la proteína de fusión PLA_{2} a la proteína de la cápside de Q\beta
Una solución de 600 \mul de la proteína de la cápside de Q\beta (2 mg/ml en Hepes 20 mM, pH 7,4) se hizo reaccionar con 176 \mul de Sulfo-MBS (13 mg/ml en H_{2}O) durante 60 minutos a temperatura ambiente, y se sometió a diálisis frente a 1 L de Hepes 20 mM, pH 7,4 O/N a 4ºC. El día siguiente, se eliminaron las sales de 500 \mul de una solución de PLA2 (2,5 mg/ml) que contenía DTT 0,1 mM en una columna Hi-Trap de 5 ml (Pharmacia). PLA_{2} reducida y con las sales eliminadas (60 \mul, de una solución de aprox. 0,5 mg/ml) se mezcló con la cápside de Q\beta sometida a diálisis y activada (25 \mul de una solución de 1,5 mg/ml) y se hizo reaccionar durante cuatro horas a temperatura ambiente.
Las cápsides de 25-30 nm de diámetro son claramente visibles en las imágenes de microscopía electrónica de la proteína de la cápside de Q\beta tomadas antes y después del acoplamiento a PLA_{2}.
C. Inmunización de ratones con PLA_{2} acoplada a la proteína de la cápside de Q\beta
Se inmunizaron intravenosamente ratones Balb/c hembra el día 0 con 50 \mug de cápside de Q\beta acoplada a PLA_{2}, y se reforzaron el día 14 con la misma cantidad de antígeno. Se tomaron muestras de sangre de los ratones el día 20 y los sueros se analizaron en un ELISA. Se obtuvo un título de 1:5000 frente a PLA_{2}.
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Ejemplo 39
Acoplamiento de mimotopos y epítopos a la proteína de la cápside de Q\beta
Los epítopos de IgE humana que tenían la siguiente secuencia de aminoácidos se acoplaron a la proteína de la cápside de Q\beta utilizando el resto cisteína N-terminal:
Ce3epítopo: CGGVNLTWSRASG (SEQ ID NO:207)
Ce3mimotopo: CGGVNLPWSFGLE (SEQ ID NO:208)
La reacción de acoplamiento se realizó utilizando la proteína de la cápside de Q\beta activada con Sulfo-MBS y con posterioridad se sometió a diálisis para eliminar el entecruzador en exceso. El respectivo epítopo o mimotopo se diluyó en la mezcla de reacción que contenía la cápside de Q\beta activada, y se dejó reaccionando durante 4 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se sometió finalmente a diálisis durante 4 horas frente a PBS, y se inyecto a los ratones.
El siguiente mimotopo circular se acopló también a la proteína de la cápside de Q\beta: Ce4mimotopo:
GEFCINHRGYWVCGDPA (SEQ ID NO:211).
El mimotopo se hizo reaccionar primero con el grupo químico N-succinimidil-S-acetiltioacetato (SATA), con el fin de introducir un grupo sulfhidrilo protegido en el mimotopo. El grupo protector se separó con posterioridad mediante tratamiento con hidroxilamina, y se hizo reaccionar inmediatamente proteína de la cápside de Q\beta activada, durante 4 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se sometió finalmente a diálisis durante 4 horas, y se inyecto a los ratones.
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Ejemplo 40
Inmunización de ratones con HBcAg-Lys acoplada al péptido M2 A. Acoplamiento del péptido M2 a la proteína de la cápside HBcAg-Lys
El péptido sintético M2, correspondiente a un fragmento N-terminal de la proteína M2 de la Influenza con un resto cisteína residuo en su extremo C (SLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSDGGGC (SEQ ID NO:212)) se acopló químicamente a partículas de HBcAg-Lys purificadas con el fin de lograr un respuesta inmunitaria contra el péptido M2. El Sulfo-MBS (232 \mul, 3 mM) se hizo reaccionar con una solución de 1,4 ml de HBcAg-Lys (1,6 mg/ml) en PBS. La mezcla sometió a diálisis durante la noche frente a solución salina tamponada con fosfato (PBS). El péptido M2 se diluyó hasta una concentración de 24 mg/ml en DMSO; se diluyeron 5 \mul de esta solución en 300 \mul de PBS, 188 \mul de los cuales se añadieron a 312 \mul de la solución de HBcAg-Lys activada sometida a diálisis. También se añadió EDTA (10 \mul de una solución 1 M) a la mezcla de reacción, después de lo cual se dejó que la reacción prosiguiera durante 4 horas a temperatura ambiente.
Inmunización de ratones con HBcAg-Lys acoplada un péptido M2
Se inmunizaron intravenosamente ratones Balb/c hembra el día 0 con 50 \mug de HBcAg-Lys-M2 o péptido M2 solo y se reforzaron 10 días después con la misma cantidad de antígeno. Al cabo de otros 10 días, los ratones se infectaron intranasalmente con virus de la Influenza (50 ufp, PR/8) y se verificó la supervivencia de los ratones infectados. Además, se determinaron los títulos virales en el pulmón. Los ratones cebados con M2-HBcAg-Lys se protegieron completamente y el día 7 habían eliminado el virus.
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Ejemplo 41
Acoplamiento del péptido M2 a los pili, proteína de la cápside de Q\beta y HbcAg sin cys y comparación del título de anticuerpo obtenido mediante inmunización de ratones con estos pili y cápsides acoplados con el título obtenido inmunizando ratones con una proteína de fusión N-terminal del péptido M2 a HbcAg-183 A. Acoplamiento del péptido M2 a pili, proteína de la cápside de Q\beta y HbcAg sin cys
Q\beta: Una solución de 1 ml de 1 mg/ml de proteína de la cápside de Q\beta en Hepes 20 mM. Se hizo reaccionar NaCl 150 mM, pH 7,2 durante 30 minutos con 93 \mul de una solución de 13 mg/ml de Sulfo-MBS (Pierce) en H_{2}O a RT en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se sometió con posterioridad a diálisis durante la noche frente a 2 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2. La mezcla de reacción sometida a diálisis se hizo reaccionar después con 58,8 \mul de una solución de partida 25 mM del péptido M2 (SEQ ID NO:212) en DMSO durante cuatro horas a RT en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La mezcla de reacción se sometió con posterioridad a diálisis frente a 2 litros de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 durante la noche a 4ºC.
HbcAg sin cys: Una solución de 1,25 ml de 0,8 mg/ml de proteína de la cápside HbcAg sin cys (ejemplo 31) en PBS, pH 7,2 se hizo reaccionar durante 30 minutos con 93 \mul de una solución de 13 mg/ml de Sulfo-MBS (Pierce) en H_{2}O a RT en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se sometió con posterioridad a diálisis durante la noche frente a 2 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2. La mezcla de reacción sometida a diálisis se hizo reaccionar después con 58,8 \mul de una solución de partida 25 mM de péptido M2 (SEQ ID NO:212) en DMSO durante cuatro horas a RT en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La mezcla de reacción se sometió con posterioridad a diálisis frente a 2 litros de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, ph 7,2 durante la noche a 4ºC.
Pili: Una solución de 400 \mul de 2,5 mg/ml de proteína de pili en Hepes 20 mM, pH 7,4, se hizo reaccionar durante 45 minutos con 60 \mul de una solución 100 mM de Sulfo-MBS (Pierce) en (H_{2}O) a RT en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. Se eliminaron las sales de la mezcla de reacción en una columna PD-10 (Amersham-Pharmacia Biotech), y la segunda fracción de 500 \mul de proteína que eluyó de la columna (que contenía aproximadamente 1 g de proteína) se hizo reaccionar con 58,8 \mul de una solución de partida 25 mM de péptido M2 (SEQ ID NO:212) en DMSO durante cuatro horas a RT en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La mezcla de reacción se sometió con posterioridad a diálisis frente a 2 litros de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 durante la noche a 4ºC.
Fusión genética de péptido M2 a HbcAg1-183
M2 genéticamente fusionado a Hbc: M2 se clonó en el extremo N Hbc como publicó Neirynck et. al. Nature Medicine 5: 1157 (1999). MD-HBc se expresó en E. coli y se purificó mediante cromatografía en gel. La presencia del péptido M2 en el extremo N de M2-HBc se confirmó mediante secuenciación de Edman.
Inmunización de ratones
Los ratones Balb/c hembra se vacunaron con péptido M2 acoplado a pili, proteína Q\beta y HbcAg sin cys y con péptido M2 genéticamente fusionado al inmunógeno Hbc sin la adición de coadyuvantes. Se inyectaron 35 \mug de proteína de cada muestra intraperitonealmente el día 0 y el día 14. Se tomaron muestras de sangre de los ratones el día 27 y su suero se analizó utilizando un ELISA específico del péptido M2.
ELISA
Se aplicaron como recubrimiento 10 \mug/ml del péptido M2 acoplado a ARNasa sobre una placa de ELISA. La placa se bloqueó, después se incubó con suero de ratón diluido seriadamente. Los anticuerpos unidos se detectaron con anticuerpo anti-IgG de ratón marcado enzimáticamente. Como control, también se sometieron a ensayo sueros preinmunes. Los experimentos ELISA de control utilizando sueros de los ratones inmunizados con péptidos no relacionados entrecruzados con Hbc u otros portadores mostraron que los anticuerpos detectados eran específicos para el péptido M2. Los resultados se muestran en la Fig. 27 A y B.
Ejemplo 42
Acoplamiento de péptidos angiotensina I y angiotensina II a Q\beta e inmunización de ratones con vacunas de péptido Q\beta - angiotensina A. Acoplamiento de péptidos angiotensina I y angiotensina II a proteína de la cápside de Q\beta
Se sintetizaron químicamente los siguientes péptidos de angiotensina: CGGDRVYIHPF ("Angio I"), CGGDRV
YIHPFHL ("Angio II"), DRVYIHPFHLGGC ("Angio III"), CDRVYIHPFHL ("Angio IV") y se utilizaron el acoplamiento químico a Q\beta como se describe a continuación.
Una solución de 5 ml de 2 mg/ml de proteína de la cápside de Q\beta en Hepes 20 mM. Se hizo reaccionar NaCl 150 mM, pH 7,4 durante 30 minutos con 507 \mul de una solución de 13 mg/ml de Sulfo-MBS (Pierce) en H_{2}O a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se sometió con posterioridad a diálisis dos veces durante 2 horas frente a 2 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a 4ºC. Después se hicieron reaccionar 665 ml de la mezcla de reacción sometida a diálisis con 2,8 ml de cada una de las correspondientes soluciones de partida de péptido 100 mM (en DMSO) durante dos horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La mezcla de reacción se sometió con posterioridad a diálisis 2 x 2 horas frente a 2 litros de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a 4ºC.
Inmunización de ratones
Los ratones Balb/c hembra se vacunaron con uno de los cuatro péptidos de angiotensina acoplados a la proteína de la cápside de Q\beta sin la adición de coadyuvantes. Se diluyeron 50 \mug de proteína total de cada muestra en PBS hasta 200 ml y se inyectaron subcutáneamente (100 ml en dos caras ventrales) el día 0 y día 14. Se tomaron muestras de sangre de los ratones mediante punción retroorbital el día 21 y su suero se analizó utilizando un ELISA específico de angiotensina.
ELISA
Los cuatro péptidos de Angiotensina se acoplaron individualmente a ARNasa A bovina utilizando el entrecruzador químico sulfo-SPDP. Las placas de ELISA se recubrieron con preparaciones de ARNasa a una concentración de 10 mg/ml. Las placas se bloquearon y después se incubaron con sueros de ratón diluidos seriadamente. Los anticuerpos unidos se detectaron con anticuerpo anti-IgG de ratón marcado enzimáticamente. Como control, también se sometieron a ensayo los sueros preinmunes de los mismos ratones. Los experimentos ELISA de control utilizando los sueros de los ratones inmunizados con péptidos no relacionados entrecruzados con Q\beta u otros portadores mostraron que los anticuerpos detectados fueron específicos para el péptido respectivo. Los resultados se muestran en la Fig. 8A-8D.
Las Figs. 8A, 8B, 8C y 8D, respectivamente, muestran análisis ELISA de anticuerpos IgG específicos para "Angio I", "Angio II", "Angio III", y "Angio IV", respectivamente, en sueros de ratones inmunizados contra una Angio I-IV acoplada a proteína de la cápside de Q\beta. Q\beta-Angio I, Q\beta-Angio II, Q\beta-Angio III y Q\beta-Angio IV, según se utilizan en las figuras, representan la vacuna inyectada en los ratones, de los cuales derivan los sueros de acuerdo con la anterior definición de los péptidos de angiotensina.
Los ratones Balb/c hembra se vacunaron subcutáneamente con 50 mg de vacuna en PBS el día 0 y día 14, los anticuerpos IgG en sueros de ratones vacunados con Q\beta3-Angio I, Q\beta-Angio II, Q\beta-Angio III y Q\beta-Angio IV se midieron el día 21 frente a los cuatro péptidos (acoplados a ARNasa A), es decir, frente a "Angio I" (Fig. 8A), "Angio II" (Fig. 8B), "Angio III" (Fig. 8C), y "Angio IV" (Fig. 8D). Como control, se analizaron los sueros pre-inmunes de los mismos ratones. Los resultados para las diluciones de suero indicadas se muestran como la densidad óptica a 450 nm. Se muestra el promedio de cada uno de tres ratones (incluyendo las desviaciones típicas). Todos los ratones vacunados formaron altos títulos de anticuerpos frente a los cuatro péptidos sometidos a ensayo. No se detectaron anticuerpos específicos de angiotensina en los controles (ratones pre-inmunizados).
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Ejemplo 43
Acoplamiento de péptidos de angiotensina I y angiotensina II a HBcAg-149-lys-2cys-Mut, es decir, HBcAg sin Cys.
Los siguientes péptidos de angiotensina se sintetizaron químicamente: CGGDRVYIHPF ("Angio I"), CGGDRV
YIHPFHL ("Angio II"), DRVYIHPFHLGGC ("Angio III"), CDRVYIHPFHL ("Angio IV") y se utilizaron para el acoplamiento químico a HBcAg-149-lys-2cys-Mut, es decir, HBcAg sin cys.
Una solución de 1,25 ml de 0,8 mg/ml de proteína de la cápside HBcAg-149-lys-2cys-Mut (véase el Ejemplo 31) en PBS, pH 7,4 se hace reaccionar durante 30 minutos con 93 \mul de una solución de 13 mg/ml de Sulfo-MBS (Pierce) en H_{2}O a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se somete con posterioridad a diálisis durante la noche frente a 2 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4. Después de cambio del tampón la solución de reacción se somete a diálisis durante otras 2 horas. La mezcla de reacción sometida a diálisis se hace reaccionar después con 1,8 \mul de una solución de partida de péptido 100 mM (en DMSO) durante 2 horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La mezcla de reacción se somete con posterioridad a diálisis frente a 2 litros de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, ph 7,4 durante la noche a 4ºC seguido de cambio de tampón y otras 2 horas de diálisis.
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Ejemplo 44
Acoplamiento de péptidos de angiotensina I y Angiotensina II a pili de Tipo 1 de E. coli
Los siguientes péptidos de angiotensina se sintetizaron químicamente: CGGDRVYIHPF ("Angio I"), CGGDRVYIHPFHL ("Angio II"), DRVYIHPFHLGGC ("Angio III"), CDRVYIHPFHL ("Angio IV") y se utilizaron para el acoplamiento químico a pili de Tipo 1 de E. coli.
Una solución de 400 \mul de 2,5 mg/ml a pili de Tipo 1 de E. coli en Hepes 20 mM, pH 7,4, se hace reaccionar durante 60 minutos con 60 \mul de una solución 100 mM de Sulfo-MBS (Pierce) en (H_{2}O) a RT en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. Se eliminan las sales de la mezcla de reacción en una columna PD-10 (Amersham-Pharmacia Biotech). Las fracciones que contienen proteína que eluyen de la columna se reúnen (conteniendo aproximadamente 1 mg proteína, es decir, los pili derivatizados) y se hacen reaccionar con un exceso tres veces molar del péptido. Por ejemplo, a 500 \mul de producto eluido que contenía aproximadamente 1 mg los pili derivatizados, se les añaden 2,34 \mul de una solución de partida de péptido 100 mM (en DMSO). La mezcla se incuba durante cuatro horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio y con posterioridad se somete a diálisis frente a 2 litros de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 durante la noche a 4ºC.
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Ejemplo 45
Acoplamiento de péptidos Der p I a Q\beta e inmunización de ratones con vacunas Q\beta - Der p I Acoplamiento de péptidos Der p I a proteína de la cápside de Q\beta
Los siguientes péptidos derivados del alergeno del ácaro del polvo doméstico Der p I se sintetizaron químicamente: CGNQSLDLAEQELVDCASQHGCH ("Der p I p52"; aa 52-72, con un conector de cisteína-glicina adicional en el extremo N), CQIYPPNANKIREALAQTHSA ("Der p 1 p117"; aa 117-137). Estos péptidos se utilizaron para el acoplamiento químico a Q\beta como se describe a continuación.
Se hizo reaccionar 1 ml de una solución que consistía en 2 mg/ml de proteína de la cápside de Q\beta en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 durante 30 minutos con 102 \mul de una solución de 13 mg/ml de Sulfo-MBS (Pierce) en H_{2}O a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se sometió con posterioridad a diálisis dos veces durante 2 horas frente a 2 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a 4ºC. Después se hicieron reaccionar 440 \mul de la mezcla de reacción sometida a diálisis con 1,9 \mul de una solución de partida de péptido 100 mM (en DMSO) durante dos horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La mezcla de reacción se sometió con posterioridad a diálisis 2x 2 horas frente a 2 litros de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a 4ºC.
Inmunización de los ratones
Los ratones Balb/c hembra se vacunaron con uno de los dos péptidos Der p I acoplados a la proteína de la cápside de Q\beta sin la adición de coadyuvantes. Se utilizaron dos ratones para cada vacuna. Se diluyeron 30 \mug de proteína total de cada muestra en PBS hasta 200 \mul y se inyectaron subcutáneamente el día 0 y día 14. Se tomaron muestras de sangre de los ratones mediante punción retroorbital el día 21 y su suero se analizó utilizando un ELISA específico para el péptido Der p I.
ELISA
Los péptidos Der p I "Der p I p52" y "Der p I p117" se acoplaron individualmente a ARNasa A bovina utilizando el entrecruzador químico sulfo-SPDP. Las placas de ELISA se recubrieron con preparaciones de ARNasa acopladas a una concentración de 10 mg/ml. Las placas se bloquearon y después se incubaron con sueros de ratón diluidos seriadamente. Los anticuerpos unidos se detectaron con anticuerpo anti-IgG de ratón marcado enzimáticamente. Como control, también se sometieron a ensayo los sueros preinmunes de los mismos ratones. Los experimentos ELISA de control utilizando los sueros de los ratones inmunizados con péptidos no relacionados entrecruzados con Q\beta u otros portadores mostraron que los anticuerpos detectados eran específicos para el péptido respectivo. Los resultados se muestran en la Figs. 9A y 9B.
La Fig. 9A y la Fig. 9B muestran análisis ELISA de anticuerpos IgG específicos para "Der p I p52" (Fig. 9A) y específicos para "Der p I p117" (Fig. 9B) en sueros de ratones inmunizados frente a los péptidos Der p I acoplados a la proteína de la cápside de Q\beta. "p52" y "p117", según se utilizan en las Figs. 9A y 9B, representan la vacuna inyectada a los ratones, de la cual derivan los sueros.
Como control, se analizaron los sueros pre-inmunes de los mismos ratones (día 0). Los resultados para las diluciones de suero indicadas se muestran como la densidad óptica a 450 nm. El día 21, todos los ratones vacunados formaron anticuerpos específicos IgG contra el péptido Der p I con el que fueron vacunados con pero no contra el otro péptido Der p I. No se detectaron anticuerpos específicos para el péptido Der p I antes de la vacunación (día 0).
Ambas vacunas de péptido Der p I fueron altamente inmunogénicas en ausencia de coadyuvantes. Todos los ratones vacunados elaboraron buenas respuestas específicas de anticuerpos para el péptido en la preparación de la vacuna.
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Ejemplo 46
Acoplamiento de péptidos Der p 1 a HBcAg-149-lys-2cys-Mut, es decir, HBcAg sin cys
Los siguientes péptidos derivados del alergeno del ácaro del polvo doméstico Der p 1 se sintetizaron químicamente: Der p I p52 (aa 52-72, con un conector cisteína-glicina adicional en el extremo N): CGNQSLDLAEQELVDCASQHGCH, Der p I p117 (aa 117-137): CQIYPPNANKIREALAQTHSA. Estos péptidos se utilizaron para el acoplamiento químico a HBcAg-149-lys-2cys-Mut, es decir, HBcAg sin cys.
Una solución de 1,25 ml de 0,8 mg/ml de proteína de la cápside HBcAg-149-lys-2cys-Mut (Ejemplo 31) en PBS, pH 7,4 se hace reaccionar durante 30 minutos con 93 \mul de una solución de 13 mg/ml de Sulfo-MBS (Pierce) en H_{2}O a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se somete con posterioridad a diálisis durante la noche frente a 2 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4. Después de cambio del tampón la solución de reacción se somete a diálisis durante otras 2 horas. La mezcla de reacción sometida a diálisis se hace reaccionar después con 1,8 \mul de una solución de partida de péptido 100 mM (en DMSO) durante 2 horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La mezcla de reacción se somete con posterioridad a diálisis frente a 2 litros de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, ph 7,4 durante la noche a 4ºC seguido de cambio de tampón y otras 2 horas de diálisis.
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Ejemplo 47
Acoplamiento de péptidos Der pI a pili de Tipo 1 de E. coli
Los siguientes péptidos derivados del alergeno del ácaro del polvo doméstico Der p I se sintetizaron químicamente: Der p I p52 (aa 52-72, con un conector cisteína-glicina adicional en el extremo N) y CGNQSLDLAEQELVDCASQHGCH, Der. I p117 (aa 117-137): CQIYPPNANKIREALAQTHSA. Estos péptidos se utilizaron para el acoplamiento químico a pili de Tipo 1 de E. coli.
Una solución de 400 \mul de 2,5 mg/ml de pili de Tipo 1 de E. coli en Hepes 20 mM, pH 7,4, se hace reaccionar durante 60 minutos con 60 \mul de una solución 100 mM de Sulfo-MBS (Pierce) en (H_{2}O) a RT en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. Se eliminan las sales de la mezcla de reacción en una columna PD-10 (Amersham-Pharmacia Biotech). Las fracciones que contienen proteína que eluyen de la columna se reúnen (conteniendo aproximadamente 1 mg proteína, es decir, los pili derivatizados) y se hacen reaccionar con un exceso de péptido tres veces molar. Por ejemplo, a 500 \mul de producto eluido que contenía aproximadamente 1 mg los pili derivatizados, se les añaden 2,34 \mul de una solución de partida de péptido 100 mM (en DMSO). La mezcla se incuba durante cuatro horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio y con posterioridad se somete a diálisis frente a 2 litros de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 durante la noche a 4ºC.
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Ejemplo 48
Acoplamiento de Péptido VEGFR-II Humano a pili de Tipo 1 de E. coli e Inmunización de Los ratones con Vacunas que Comprenden Matrices de pili de Tipo 1-Péptido VEGFR-II Humano Acoplamiento de péptido VEGFR-II humano a pili de Tipo 1 de E. coli
El péptido VEGFR II humano con la secuencia CTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKK se sintetizó químicamente y se utilizó para el acoplamiento químico a pili de Tipo 1 de E. coli.
Una solución de 1400 \mul de 1 mg/ml de proteína de pili en Hepes 20 mM, pH 7,4, se hizo reaccionar durante 60 minutos con 85 \mul de una solución 100 mM de Sulfo-MBS (Pierce) en (H_{2}O) a RT en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. Se eliminaron las sales de la mezcla de reacción en una columna PD-10 (Amersham-Pharmacia Biotech). Las fracciones que contenían la proteína que eluyeron de la columna se reunieron (conteniendo aproximadamente 1,4 mg proteína) y se hicieron reaccionar con un exceso 2,5 veces molar (volumen final) de péptido VEGFR II humano. Por ejemplo, a 200 \mul de producto eluido que contenía aproximadamente 0,2 mg de los pili derivatizados, se les añadieron 2,4 \mul de una solución 10 mM de péptido (en DMSO). La mezcla se incubó durante cuatro horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio y con posterioridad se sometió a diálisis frente a 2 litros de Hepes 20 mM, pH 7,2 durante la noche a 4ºC.
Inmunización de los ratones
Se vacunaron ratones C3H-HeJ hembra (carentes de receptor 4 de tipo Toll, ratones que no responden a LPS) y C3H-HeN (tipo salvaje) con el péptido VEGFR-II humano acoplado a proteína de pili de Tipo 1 sin la adición de coadyuvantes. Se diluyeron aproximadamente 100 \mug de proteína total de cada muestra en PBS hasta 200 \mul y se inyectaron subcutáneamente el día 0, día 14 y día 28. Se tomaron muestras de sangre de los ratones mediante punción retroorbital el día 14, 28 y día 42 y se analizó el suero del día 42 utilizando un ELISA específico de VEGFR II humano.
ELISA
Los sueros de los ratones inmunizados se sometieron a ensayo en ELISA con péptido el VEGFR II humano inmovilizado y el dominio extracelular del VEGFR II humano (R&D Systems GmbH, Wiesbaden).
El péptido VEGFR-II humano se acopló a ARNasa A bovina utilizando el entrecruzador químico sulfo-SPDP. Las placas de ELISA se recubrieron con ARNasa A acoplada a una concentración de 10 \mug/ml. El dominio extracelular humano de VEGFR-II se adsorbió a las placas a una concentración de 2 \mug/ml. Las placas se bloquearon y después se incubaron con sueros de ratón diluidos seriadamente. Los anticuerpos unidos se detectaron con anticuerpo anti-IgG de ratón marcado enzimáticamente. Como control, también se sometieron a ensayo los sueros preinmunes de los mismos ratones. Los experimentos ELISA de control utilizando los sueros de los ratones inmunizados con portador no acoplado mostraron que los anticuerpos detectados eran específicos para el péptido respectivo. Los resultados para el péptido VEGFR II humano acoplado a pili de Tipo 1 se muestran en la Figura 10. En particular, la Fig. 10A. y la Fig. 10B muestran el análisis ELISA de anticuerpos IgG específicos para el péptido VEGFR II humano y el dominio extracelular de VEGFR II humano, respectivamente, en sueros de ratones inmunizados frente al péptido VEGFR II humano y al dominio extracelular de VEGFR II humano acoplados cada uno a una proteína de pili de
Tipo 1.
Los ratones C3H-HeJ hembra (carentes de receptor 4 de tipo Toll, sin respuesta a LPS) y C3H-HeN (tipo salvaje) se vacunaron subcutáneamente con 100 \mug de vacuna en PBS el día 0, 14 y 28. La IgG del suero contra el péptido (acoplado a ARNasa A) y el dominio extracelular de VEGFR II humano se midieron el día 42, Como control, se analizaron los sueros preinmunes de los mismos ratones. Los resultados para las diluciones de suero indicadas se muestran como la densidad óptica a 450 nm. Se muestra el promedio de cada uno de tres ratones (incluyendo las desviaciones típicas). Todos los ratones vacunados formaron altos títulos de anticuerpos contra el péptido VEGFR II humano así como contra el dominio extracelular de VEGFR II humano (KDR) y no se observó ninguna diferencia entre los ratones carentes del receptor 4 de tipo Toll y de tipo salvaje. Lo último es notable puesto que demuestra que la formación de altos títulos de anticuerpo IgG contra el péptido VEGFR II humano así como contra el dominio extracelular de VEGFR II humano es independiente de las contaminaciones con endotoxina.
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Ejemplo 49
Acoplamiento del Péptido VEGFR-II Humano a la Proteína de la cápside de Q\beta e Inmunización de los Ratones con Vacunas que Comprenden Matrices de Proteína de la cápside de Q\beta - Péptido VEGFR-II Humano Acoplamiento del Péptido VEGFR-II Humano a Proteína de la cápside de Q\beta
El péptido VEGFR II humano con la secuencia CTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKK se sintetizó químicamente y se utilizó para el acoplamiento químico a la proteína de la cápside de Q\beta.
Una solución de 1 ml de 1 mg/ml de proteína de la cápside de Q\beta en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 se hizo reaccionar durante 45 minutos con 20 \mul de una solución 100 mM de Sulfo-MBS (Pierce) en (H_{2}O) a RT en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se sometió con posterioridad a diálisis dos veces durante 2 horas en 2 L de Hepes 20 mM, pH 7,4 a 4ºC. Después se hicieron reaccionar 1000 \mul de la mezcla de reacción sometida a diálisis con 12 \mul de una solución 10 mM de péptido VEGFR II humano (en DMSO) durante cuatro horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La mezcla de reacción se sometió con posterioridad a diálisis 2x2 horas frente a 2 litros de Hepes 20 mM, pH 7,4 a 4ºC.
Se hizo reaccionar 1 ml de una solución que consistía en 2 mg/ml proteína de la cápside de Q\beta en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 durante 30 minutos con 102 \mul de una solución de 13 mg/ml de Sulfo-MBS (Pierce) en H_{2}O a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se sometió con posterioridad a diálisis dos veces durante 2 horas frente a 2 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a 4ºC. Después se hicieron reaccionar 440 \mul de la mezcla de reacción sometida a diálisis con 1,9 \mul de una solución de partida de péptido 100 mM (en DMSO) durante dos horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La mezcla de reacción se sometió con posterioridad a diálisis 2x 2 horas frente a 2 litros de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a 4ºC.
Inmunización de los ratones
Se vacunan ratones C57BL/6 con el péptido VEGFR II humano acoplado a proteína Q\beta sin la adición de coadyuvantes. Se diluyen aproximadamente 50 \mug de proteína total de cada muestra en PBS hasta 200 \mul y se inyectan subcutáneamente el día 0, día 14 y día 28. Se extrae sangre de los ratones mediante punción retroorbital el día 14, 28 y día 42 y el suero del día 42 se analiza utilizando un ELISA específico para VEGFR II humano.
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Ejemplo 50
Acoplamiento del Péptido VEGFR-II Humano a la Proteína de la cápside HBcAg-149-lys-2cys-Mut, es decir, HBcAg sin cys, e Inmunización de los ratones con Vacunas que Comprenden Matrices de Proteína de la cápside HBcAg-149-lys-2cys-Mut - Péptido VEGFR-II humano Acoplamiento del Péptido VEGFR-II Humano a la Proteína de la cápside HBcAg-149-lys-2cys-Mut
El péptido VEGFR II humano con la secuencia CTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKK se sintetizó químicamente y se utilizó para el acoplamiento químico a la proteína de la cápside HBcAg-149-lys-2cys-Mut.
Una solución de 3 ml de 0,9 mg/ml de proteína de la cápside HbcAg sin cys (véase Ejemplo 31) en PBS, pH 7,4 se hace reaccionar durante 45 minutos con 37,5 \mul de una solución 100 mM de Sulfo-MBS (Pierce) en (H_{2}O) a RT en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se sometió con posterioridad a diálisis durante la noche frente a 2 L de Hepes 20 mM, pH 7,4. Después de cambio del tampón la solución de reacción se somete a diálisis durante otras 2 horas. La mezcla de reacción sometida a diálisis se hace reaccionar después con 3 \mul de una solución 10 mM de péptido VEGFR II humano (en DMSO) durante 4 horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La mezcla de reacción se somete con posterioridad a diálisis frente a 2 litros de Hepes 20 mM, pH 7,4 durante la noche a 4ºC seguido de cambio de tampón y otras 2 horas de diálisis.
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Ejemplo 51
Construcción de HBcAg1-183Lys
El antígeno núcleo de la hepatitis (HBcAg) 1-183 se modificó como se ha descrito en el Ejemplo 23. Una parte de la región (Prolina 79 y Alanina 80) del epítopo c/e1 (residuos 72 a 88) se remplazó genéticamente por el péptido Gly-Gly-Lys-Gly-Gly (constructo HBcAgl-183Lys). El resto Lisina introducido contiene un grupo amino reactivo en su cadena lateral que se puede utilizar para el entrecruzamiento químico intermolecular de partículas HBcAg con cualquier antígeno que contenga un grupo cisteína libre. Se utilizaron métodos PCR esencialmente como se ha descrito en el Ejemplo 1 y técnicas de clonación convencionales para preparar el gen HBcAg1-183Lys.
La secuencia Gly-Gly-Lys-Gly-Gly se insertó amplificando dos fragmentos separados del gen HBcAg de pEco63, como se ha descrito antes en Ejemplo 23 y fusionando con posterioridad los dos fragmentos mediante PCR para ensamblar el gen completo. Se utilizaron las siguientes combinaciones de cebadores de PCR:
fragmento 1:
Cebador 1:
EcoRIHBcAg(s) (véase el Ejemplo 23)
Cebador 2:
Lys-HBcAg(as) (véase el Ejemplo 23)
\newpage
fragmento 2:
Cebador 3:
Lys-HBcAg(s) (véase el Ejemplo 23)
Cebador 4:
HBcAgwtHindIII
\quad
CGCGTCCCAAGCTTCTAACATTGAGATTCCCGAGATTG
Ensamblaje:
Cebador 1:
EcoRIHBcAg(s) (véase el Ejemplo 23)
Cebador 2:
HBcAgwtHindIIII
El gen completo ensamblado se digirió después con las enzimas EcoRI (GAATTC) y HindIII (AAGCTT) y se clonó en el vector pKK (Pharmacia) cortado en los mismos sitios de restricción.
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Ejemplo 52
Acoplamiento del Péptido muTNFa a HBcAg1-183Lys e Inmunización de los ratones con Vacunas que Comprenden Matrices de HBcAg1-183Lys - Péptido muTNFa A. Acoplamiento del Péptido muTNFa a HBcAg1-183Lys
HBcAg1-183Lys a una concentración de 0,6 mg/ml (29 \muM) se trató con yodoacetamida como se ha descrito en el Ejemplo 32, HBcAg1-183Lys se hizo reaccionar después con un exceso de cincuenta veces del entecruzador Sulfo-MBS, como se ha descrito en el Ejemplo 32, y se sometió a diálisis durante la noche frente a Hepes 20 mM, pH 7,2, a 4ºC. HBcAg1-183Lys activada (derivatizada) se hizo reaccionar con un exceso cinco veces molar del péptido muTNFa (secuencia: CGGVEEQLEWLSQR, diluido directamente en la solución de HBcAg1-183Ly en una solución de partida 100 mM en DMSO) a RT durante 4 horas. La reacción de acoplamiento (aproximadamente 1 ml de solución) se sometió a diálisis frente a 2x 2 litros de HEPES 20 mM, pH 7,2, a 4ºC, durante 4 horas. La reacción de acoplamiento sometida a diálisis se congeló en alícuotas en nitrógeno líquido y se almacenó a -80ºC hasta la inmunización de los ratones.
Inmunización
Dos ratones (Balb/c hembra) se inmunizaron intravenosamente el día 0 y el 14 con 100 \mug de HBcAg1-183Lys acoplado al péptido muTNFa, por animal, sin coadyuvante. Los anticuerpos específicos para el péptido muTNFa (recubierto en forma de producto conjugado con Ribonucleasa A) y para la proteína TNF\alpha nativa (Sigma) en el suero se determinaron el día 21 mediante ELISA.
ELISA
La proteína TNF\alpha murina (Sigma) se recubrió a una concentración de 2 \mug/ml. Como control, se sometieron a ensayo los sueros preinmunes de los mismos ratones utilizados para la inmunización. La Fig. 14 muestra el resultado del experimento ELISA, demostrando que la inmunización con HBcAg1-183Lys acoplada al péptido muTNFa (HBc-TNF completo) generó una respuesta inmunitaria específica para la proteína TNF\alpha murina. Los sueros de los ratones a los que se extrajo sangre el día 0 (preinmune) y 21 se sometieron a ensayo a tres diluciones diferentes. Cada barra es el promedio de la señal obtenida con sueros de dos ratones. Así, la vacunación con HBcAg1-183Lys acoplada al péptido muTNFa indujo una respuesta inmunitaria contra un autoantígeno, puesto que la secuencia de aminoácidos del péptido muTNFa está derivada de la secuencia de la proteína TNF\alpha de ratón.
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Ejemplo 53
Acoplamiento del Péptido 3'TNF II a 2cysLys-mut HBcAg1-149 e Inmunización de los ratones con Vacunas que Comprenden Matrices de 2cysLys-mut HBcAg1-149 - Péptido 3'TNF II Acoplamiento del Péptido 3'TNF II a 2cysLys-mut HBcAg1-149
2cysLys-mut HBcAg1-149 se hizo reaccionar a una concentración de 2 mg/ml durante 30 min. a RT con un exceso de cincuenta veces de un entecruzador en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2. El entecruzador en exceso se eliminó mediante diálisis durante la noche, y la proteína de la cápside 2cysLys-mut HBcAg1-149 activada (derivatizada) se hizo reaccionar con un exceso de diez veces del péptido 3'TNF II (SEQ: SSQNSSDKPVAHVVANHGVGGC, diluido en una solución de partida 100 mM en DMSO) durante 4 horas a RT. La mezcla de reacción se sometió después a diálisis durante la noche en tubos para diálisis con un corte de peso molecular de 50000 Da, se congeló en nitrógeno líquido y se almacenó a -80ºC hasta la inmunización de los ratones.
Inmunización de los ratones
Tres ratones C3H/HeN hembra, 8 semanas de edad se vacunaron con el péptido 3'TNF II acoplado a 2cysLys-mut HBcAg1-149 sin la adición de coadyuvantes. Se diluyeron 50 \mug de proteína total en PBS hasta 200 \mul y se inyectaron subcutáneamente (100 \mul en las dos caras inguinales) el día 0 y día 14. Se tomaron muestras de sangre de los ratones mediante punción retroorbital el día 0 y 21, y sus sueros se analizaron en un ELISA específico para la proteína TNF\alpha murina.
ELISA
La proteína TNF\alpha murina (Sigma) se recubrió a una concentración de 2 \mug/ml. Como control, los sueros preinmunes de los mismos ratones utilizados para la inmunización se sometieron a ensayo. La Fig. 15 muestra el resultado del ELISA, demostrando que la inmunización con 2cysLys-mut HBcAg1-149 acoplada al péptido 3'TNF II generaba una respuesta inmunitaria específica de la proteína TNF\alpha murina. Los sueros de los ratones de los que se extrajo sangre el día 0 (preinmune) y 21 se sometieron a ensayo a tres diluciones diferentes. Cada barra es el promedio de la señal obtenida con los sueros de 3 ratones. De este modo, la vacunación con 2cysLys-mut HBcAg1-149 acoplada al péptido 3'TNF II indujo una respuesta inmunitaria específica para un autoantígeno, puesto que la secuencia de aminoácidos del péptido 3'TNF II deriva de la secuencia de la proteína TNF\alpha murina.
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Ejemplo 54
Acoplamiento de los péptidos A\beta 1-15, A\beta 1-27 y A\beta 33-42 a Q\beta e inmunización de los ratones con vacunas que comprenden matrices de péptido Q\beta - A\beta A. Acoplamiento de los péptidos A\beta 1-15 y A\beta 33-42 a la proteína de la cápside de Q\beta utilizando el entecruzador SMPH
Los siguientes péptidos A\beta se sintetizaron químicamente: DAEFRHDSGYEVHHQGGC (abreviado como "A\beta 1-15"), un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los restos 1-15 de A\beta humano, fusionada en su extremo C a la secuencia GGC para el acoplamiento a la proteína de la cápside de Q\beta y CGHGNKSGLWGGVVIA (abreviado como "A\beta 33-42") un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los restos 33-42 de A\beta, fusionada en su extremo N a la secuencia CGHGNKS para el acoplamiento a proteína de la cápside de Q\beta. Ambos péptidos se utilizaron para el acoplamiento químico a Q\beta como se describe a continuación.
Una solución de 1,5 ml de 2 mg/ml de proteína de la cápside de Q\beta en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 se hizo reaccionar durante 30 minutos con 16,6 \mul de una solución de SMPH 65 mM (Pierce) en H_{2}O, a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se sometió con posterioridad a diálisis dos veces durante 2 horas frente a 2 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a 4ºC en tubos para diálisis con un corte de peso molecular de 10000 Da. Después se hicieron reaccionar 450 \mul de la mezcla de reacción sometida a diálisis, que contenía Q\beta activada (derivatizada), con 6,5 \mul de cada una de las correspondientes soluciones de partida de péptido 50 mM (en DMSO) durante dos horas a 15ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. Con posterioridad, 200 \mul de la mezcla de reacción se sometieron a diálisis durante la noche frente a 2 litros de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a 4ºC, y la mañana siguiente durante otras dos horas después del cambio de tampón. La mezcla de reacción se congeló después en alícuotas en Nitrógeno líquido y se almacenó a -80ºC hasta la inmunización de los ratones.
Los resultados de los experimentos de acoplamiento se analizaron mediante SDS-PAGE, y se muestran en la Fig.13A y Fig.13B. Las flechas apuntan a la banda que corresponde a uno, respectivamente dos péptidos acoplados a una subunidad de Q\beta (Fig.13A), o un péptido acoplado a una subunidad de Q\beta (Fig.13B). Los pesos moleculares de las proteínas marcadoras se proporcionan en el margen izquierdo de la Fig. 13A y la Fig.13B.
Las muestras cargadas en el gel de la Fig. 13A son las siguientes:
1: Q\beta derivatizada; 2: Q\beta acoplada a "A\beta1-15", sobrenadante de la muestra tomada al final de la reacción de acoplamiento, y centrifugada; 3: Q\beta acoplada a "A\beta1-15", sedimento de la muestra tomada al final de la reacción de acoplamiento, y centrifugada. 4: Q\beta acoplada a "A\beta1-15", sobrenadante de una muestra dejada en reposo durante 24 horas a 4ºC, sometida a diálisis y centrifugada. 5: Q\beta acoplada a "A\beta1-15", sedimento de una muestra dejada en reposo durante 24 horas a 4ºC, sometida a diálisis y centrifugada. 6: Q\beta acoplada a "A\beta1-15", sobrenadante de la muestra tomada después de la diálisis de la reacción de acoplamiento, y centrifugada.
Las muestras cargadas en el gel de la Fig. 13B son las siguientes:
1: Q\beta derivatizada. 2: Q\beta acoplada a "A\beta33-42", sobrenadante de la muestra tomada al final de la reacción de acoplamiento, y centrifugada. 3: Q\beta acoplada a "A\beta33-42", sedimento de la muestra tomada al final de la reacción de acoplamiento, y centrifugada. 4: Q\beta acoplada a "A\beta33-42", sobrenadante de una muestra dejada en reposo durante 24 horas a 4ºC, sometida a diálisis y centrifugada. 5: Q\beta acoplada a "A\beta33-42", sedimento de una muestra dejada en reposo durante 24 horas a 4ºC, sometida a diálisis y centrifugada. 6: Q\beta acoplada a "A\beta33-42", sobrenadante de la muestra tomada después de la diálisis de la reacción de acoplamiento, y centrifugada.
B. Acoplamiento del péptido "A\beta1-27" a proteína de la cápside de Q\beta utilizando el entecruzador SMPH
El siguiente péptido A\beta ("A\beta1-27") se sintetizó químicamente DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNGGC. Este péptido comprende la secuencia de aminoácidos de los restos 1-27 de A\beta humano, fusionado en su extremo C a la secuencia GGC para el acoplamiento a la proteína de la cápside de Q\beta.
Un primer lote de "A\beta1-27" acoplado a la proteína de la cápside Q\beta, en lo sucesivo abreviado como "lote 1 de Q\beta-A\beta1-27" se preparó a continuación:
Una solución de 1,5 ml de 2 mg/ml proteína de la cápside DE Q\beta en Hepes 20 Mm, NaCl 150 mM, pH 7,4 se hizo reaccionar durante 30 minutos con 16,6 \mul de una solución de SMPH 65 mM (Pierce) en H_{2}O, a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se sometió con posterioridad a diálisis dos veces durante 2 horas frente a 2 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a 4ºC en tubos para diálisis con un corte de peso molecular de 10000 Da. Se hicieron reaccionar 450 \mul de la mezcla de reacción sometida a diálisis después con 6,5 \mul de una solución de partida de péptido 50 mM (en DMSO) durante dos horas a 15ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. Después se tomaron alícuotas de 200 \mul de la muestra, se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80ºC hasta la inmunización de los ratones.
Un segundo lote de "A\beta 1-27" acoplado a la proteína de la cápside de Q\beta, en lo sucesivo abreviado como "lote 2 de Q\beta-A\beta1-27" se preparó a continuación:
Se hicieron reaccionar 500 \mul de proteína de la cápside de Q\beta en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 durante 30 minutos con 11,3 \mul de una solución de SMPH 32,5 mM (Pierce) en H_{2}O, a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se sometió con posterioridad a diálisis dos veces durante 2 horas frente a 2 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a 4ºC en tubos para diálisis con un corte de peso molecular de 3500 Da (SnakeSkin, Pierce). La mezcla de reacción sometida a diálisis se hizo reaccionar después con 3,6 \mul de una solución de partida de péptido 50 mM (en DMSO) durante dos horas a 15ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La mezcla de reacción se sometió después a diálisis 2X frente a 1 l Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 durante 1 hora y durante la noche después de un último cambio de tampón, utilizando una membrana de diálisis con un corte de 50000 Da (Spectrapor, spectrum). La mezcla de reacción se congeló después en alícuotas en nitrógeno líquido y se almacenó a -80ºC hasta la inmunización de los ratones. El "lote 1 de Q\beta-A\beta 1-27" se utilizó para la primera inmunización, mientras que "el lote 2 de Q\beta-A\beta 1-27 lote 2" se utilizó para el refuerzo.
El resultado del experimento de acoplamiento se analizó mediante SDS-PAGE, y se muestra en la Fig. 13C. Las flechas apuntan a la banda que corresponde a un péptido acoplado a una subunidad de Q\beta.
Las muestras cargadas en el gel de la Fig.13C son las siguientes:
M: marcador de proteína. 1: Q\beta proteína de la cápside 2: Q\beta derivatizada, sobrenadante de la muestra tomada al final de la reacción de derivatización, y centrifugada. 3: Q\beta derivatizada, sedimento de la muestra tomada al final de la reacción de derivatización, y centrifugada. 4: Q\beta acoplada a "A\beta1-27", sobrenadante de la muestra tomada al final de la reacción de acoplamiento, y centrifugada. 5: Q\beta acoplada a "A\beta1-27", sedimento de la muestra tomada al final de la reacción de acoplamiento, y centrifugada. 6: Q\beta acoplada a "A\beta1-27", sobrenadante de la muestra tomada después de la diálisis de la reacción de acoplamiento, y centrifugada. 7: Q\beta acoplada a "A\beta1-27", sedimento de la muestra tomada después de la diálisis de la reacción de acoplamiento, y centrifugada.
C. Acoplamiento del péptido "A\beta 1-15" a la proteína de la cápside de Q\beta utilizando el entecruzador Sulfo-GMBS
Una solución de 500 \mul de 2 mg/ml de proteína de la cápside Q\beta en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 se hizo reaccionar durante 30 minutos con 5,5 \mul de una solución de SMPH 65 mM (Pierce) en H_{2}O, a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se sometió con posterioridad a diálisis dos veces durante 2 horas frente a 2 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a 4ºC en tubos para diálisis con un corte de peso molecular de 10000 Da. Después, se hicieron reaccionar 500 \mul de la mezcla de reacción sometida a diálisis con 6,5 \mul de la solución de partida del péptido 50 mM (en DMSO) durante dos horas a 15ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. Con posterioridad se sometieron a diálisis 200 \mul de la mezcla de reacción durante la noche frente a 2 litros de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a 4ºC, y la mañana siguiente durante otras dos horas después del cambio de tampón. La mezcla de reacción se congeló después en alícuotas en nitrógeno líquido y se almacenó a -80ºC hasta la inmunización de los ratones.
El resultado del experimento de acoplamiento se analizó mediante SDS-PAGE, y se muestra en la Fig. 13D. Las flechas apuntan a las bandas que corresponden a uno, dos y tres péptidos, respectivamente, acoplados a una subunidad de Q\beta.
Las muestras cargadas en el gel de la Fig. 13D son las siguientes:
M: marcador de proteína. 1: Q\beta derivatizada. 2: Q\beta acoplada a "A\beta1-15", sobrenadante de la muestra tomada al final de la reacción de acoplamiento, y centrifugada. 3: Q\beta acoplada a "A\beta1-15", sedimento de la muestra tomada al final de la reacción de acoplamiento, y centrifugada. 4: Q\beta acoplada a "A\beta1-15", sobrenadante de una muestra dejada en reposo durante 24 horas a 4ºC, sometida a diálisis y centrifugada. 5: Q\beta acoplada a "A\beta1-15", sedimento de una muestra dejada en reposo durante 24 horas a 4ºC, sometida a diálisis y centrifugada. 6: Q\beta acoplada a "A\beta1-15", sobrenadante de la muestra tomada después de la diálisis de la reacción de acoplamiento, y centrifugada.
D. Acoplamiento de "A\beta 1-15" a la proteína de la cápside de Q\beta utilizando el entecruzador Sulfo-MBS
Se hicieron reaccionar 500 \mul de proteína de la cápside de Q\beta en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 durante 30 minutos con 14,7 \mul de una solución 100 mM de Sulfo-MBS (Pierce) en H_{2}O, a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se sometió con posterioridad a diálisis dos veces durante 2 horas frente a 2 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a 4ºC en tubos para diálisis (SnakeSkin, Pierce) con un corte de peso molecular de 3500 Da. La mezcla de reacción sometida a diálisis se hizo reaccionar después con 7,2 \mul de una solución de partida de péptido 50 mM (en DMSO) durante dos horas a 15ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La mezcla de reacción se sometió después a diálisis 3 X a lo largo de 4 horas frente a Hepes 2120 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 utilizando una membrana de diálisis con un corte de 50000 Da (Spectrapor, spectrum). La mezcla de reacción se congeló después en alícuotas en nitrógeno líquido y se almacenó a -80ºC hasta la inmunización de los ratones.
El resultado del experimento de acoplamiento se analizó mediante SDS-PAGE, y se muestra en la Fig. 13E. Las flechas apuntan hacia la banda que corresponde a un péptido acoplado a una subunidad de Q\beta.
Las muestras cargadas en el gel de la Fig. 13E son las siguientes: 1: proteína de la cápside de Q\beta. 2: Q\beta derivatizada, sobrenadante de la muestra tomada al final de la reacción de derivatización, y centrifugada. 3: Q\beta derivatizada, sedimento de la muestra tomada al final de la reacción de derivatización, y centrifugada. 4: Q\beta derivatizada, sobrenadante de la muestra tomada al final de the diálisis de la reacción de derivatización, y centrifugada. 5: Q\beta derivatizada, sedimento de la muestra tomada al final de the diálisis de la reacción de derivatización, y centrifugada. 6: Q\beta acoplada a "A\beta1-15", sobrenadante de la muestra tomada al final de la reacción de acoplamiento, y centrifugada. 7: Q\beta acoplada a "A\beta1-15", sedimento de la muestra tomada al final de la reacción de acoplamiento, y centrifugada. 8: Q\beta acoplada a "A\beta1-15", sobrenadante de la muestra tomada después de la diálisis de la reacción de acoplamiento, y centrifugada.
E. Inmunización de los ratones
Cinco grupos de ratones C57BL/6 hembra, tres ratones por grupo, 8 semanas de edad se vacunaron cada uno con uno de los cinco productos conjugados de péptido A\beta- proteína de la cápside de Q\beta sin la adición de coadyuvante. Se diluyeron 25 \mug de proteína total de cada muestra en PBS hasta 200 \mul y se inyectaron subcutáneamente el día 0 y día 14. Se tomaron muestras de sangre de los ratones mediante punción retroorbital el día 0 (preinmune) y 21 y su suero se analizó en un ELISA. El péptido "A\beta1-15" se acopló a Q\beta con tres entrecruzadores diferentes, dando como resultado tres preparaciones de vacuna diferentes ("Qb-A\beta1-15 SMPH", "Q\beta-Ab1-15 SMBS", "Qb-A\beta1-15 SGMBS"; véase la sección de ELISA para los resultados).
F. ELISA
Los tres péptidos A\beta se acoplaron individualmente a ARNasa A bovina utilizando el entrecruzador químico SPDP como sigue: una solución de 10 mg de ARNasa A en 2 mL de PBS (tampón Fosfato 50 mM, NaCl 150 mM pH 7,2) se hizo reaccionar con 100 \mul de una solución 20 mM de SPDP en DMSO, a 25ºC durante 60 min. en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. El entecruzador en exceso se separó de la ARNasa A activada (derivatizada) mediante filtración en gel utilizando una columna PD 10 (Pharmacia). Las fracciones que contenían la proteína se reunieron y se concentraron hasta un volumen de 2 ml utilizando filtros de centrífuga (CDPM 5000). Una muestra de 333 \mul de la solución de ARNasa A derivatizada se hizo reaccionar con 2 \mul de la solución de partida del péptido (50 mM en DMSO). La reacción de acoplamiento se siguió espectrofotométricamente.
Las placas de ELISA se recubrieron con ARNasa A acoplada un péptido a una concentración de 10 \mug/ml. Las placas se bloquearon y después se incubaron con sueros de ratón diluidos seriadamente. Los anticuerpos unidos se detectaron con anticuerpo anti-IgG de ratón marcado enzimáticamente. Los sueros preinmunes o los sueros de control de los ratones inmunizados con los péptidos no relacionados conjugados a Q\beta, mostraron que los anticuerpos detectados eran específicos para el péptido respectivo. La Fig. 14A, la Fig. 14B y la Fig. 14C, respectivamente, muestran análisis ELISA de anticuerpos IgG específicos para "A\beta 1-15", "A\beta 1-27" y "A\beta 33-42", respectivamente, en sueros de ratones inmunizados frente a "A\beta 1-15", "A\beta 1-27" y "A\beta 33-42", respectivamente, acoplados a la proteína de la cápside de Q\beta. Las denominaciones sobre la abscisa representan la vacuna inyectada a los ratones de la que derivan los sueros, y describen el péptido y el entecruzador utilizados para elaborar la vacuna respectiva. Todos los sueros se midieron frente a los tres péptidos acoplados a ARNasa A, y los resultados muestran que mientras que hay reactividad cruzada entre los anticuerpos originados contra un péptido 1-15 y 1-27, no se observa tal reactividad cruzada contra un péptido 33-42, demostrando la especificidad de la respuesta inmunitaria. Asimismo, los títulos de ELISA obtenidos, expresados en forma de la dilución del suero que produce una señal de ELISA tres desviaciones típicas por encima del fondo, fueron muy altos, y oscilaron de 60.000 a 600.000. No se detectaron anticuerpos específicos para el péptido A\beta en los controles (ratones pre-inmunizados).
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Ejemplo 55
Introducción de conectores que contienen cys, expresión, y purificación de mimocuerpos de IgE anti-idiotípicos y su acoplamiento a la proteína de la cápside de Q\beta A. Construcción de plásmidos para la expresión de mimocuerpos para el acoplamiento a la proteína de la cápside de Q\beta
Los plásmidos estuvieron basados en el plásmido de expresión VAE051-pASK116. Este plásmido contiene las regiones codificantes de la cadena pesada y de la cadena ligera del mimocuerpo. Los siguientes cebadores se utilizaron para introducir conectores que contienen cys en el extremo C de la cadena pesada:
26
A.1. Construcción de pCA2
Los cebadores CA2F y CA1R se utilizaron para amplificar un fragmento de 741 pb que codifica parte de la cadena pesada con una extensión que codifica la secuencia conectora que contiene cys. VAE-pASK116 sirvió como molde para la polimerasa Pfx (Roche) en un ciclador de PCR (Robo) a (desnaturalización inicial a 92ºC, ciclo: 92ºC, 30 s; 48ºC, 30 s; 68ºC, 60s) durante 5 ciclos seguido de 30 ciclos con 92ºC, 30 s; 58ºC, 30 s; 68ºC, 1 min. El producto de la PCR del tamaño apropiado se purificó utilizando el kit de purificación de PCR de Qiagen y se digirió con XhoI y NcoI de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Gibco). El producto se purificó en un gel de agarosa con el kit de extracción en gel de Qiagen. El plásmido VAE-pASK116 se escindió en paralelo con XhoI y NcoI y se purificó una banda de 3,7 kb en geles de agarosa. Las alícuotas apropiadas del producto digerido con XhoI-NcoI de la PCR y el plásmido se ligaron durante la noche a 16ºC utilizando la ADN ligasa de T4 de acuerdo con el protocolo del fabricante (Gibco). El producto de ligación se transformó en células de E. coli XL-1 competentes que se cultivaron en placa en placas de agarosa que contenían cloranfenicol. Las colonias individuales se expandieron en medio LB/cloranfenicol, se preparó el plásmido (kit de miniplásmidos de Qiagen) y se sometió a ensayo en busca de la presencia del tamaño de inserto XhoI-NcoI después de la digestión con las enzimas correspondientes. Un plásmido correspondientemente positivo denominado pCA2 se envió para la secuenciación en ambas hebras lo que confirmó la identidad del plásmido incluyendo el conector que contiene cys.
A.2. Construcción de pCB2
Los Cebadores CA2F y CB1R se utilizaron para introducir el conector 2 en el extremo 5' de la secuencia codificante de la cadena pesada y las mismas condiciones que se han descrito en la sección A1. El producto resultante de la PCR tuvo 750 pb y se clonó en VAE051-pASK116 como se ha descrito en la sección A.1.
A.3. Construcción de pCC2
El plásmido pCC2 se construyó en un procedimiento de dos etapas: Un primer producto de la PCR de 754 pb se amplificó utilizando los cebadores CA2F y CC1R. Un segundo producto de la PCR de 560 pb se produjo utilizando los cebadores CC1F y CC2R. Para ambas PCR VAE051-pASK116 se utilizó como molde y las condiciones fueron las descritas en la sección A1. Ambos productos de la PCR se aislaron en geles de agarosa, se mezclaron con los cebadores CA2F y CC2R y se realizó una tercera PCR que dio como resultado un fragmento de 1298 pb. Este fragmento se aisló y se digirió con XhoI y NcoI. El fragmento de 780 pb resultante se clonó en VAE-pASK100 como se ha descrito en la sección A.1.
B. Expresión de mimocuerpos
Las células de E. coli W3110 competentes se transformaron con los plásmidos pCA2, pCB2 y pCC2. Las colonias individuales de las placas de agarosa con cloranfenicol se expandieron en cultivo líquido (LB +15 \mug/ml de cloranfenicol) durante la noche a 37ºC. Después se inoculó 1 l de medio TB 1:50 v/v con el cultivo realizado durante la noche y se hizo crecer hasta DO600=3 a 28ºC. La expresión se indujo con 1 mg/l de anhidrotetraciclina. Las células se cosecharon después del cultivo realizado durante la noche y se centrifugaron a 6000 rpm. El periplasma se aisló de los sedimentos celulares mediante incubación en tampón de lisis con un suplemento de sulfato de polimixina B durante 2 h a 4ºC. Los esferoblastos se separaron mediante centrifugación a 6000 rpm. El sobrenadante resultante contuvo el mimocuerpo y se sometió a diálisis frente a Tris 20 mM, pH 8,0.
C. Purificación de mimocuerpos
La etiqueta his6 introducida permitió la purificación de los mimocuerpos pCA2 y pCB2 mediante cromatografía Ni-NTA Fast Flow (Qiagen) según las recomendaciones del fabricante. Cuando fue necesario, siguió una etapa de purificación en una columna Fast Flow con proteína G (Amersham Pharmacia Biotech). Los mimocuerpos eluyeron con glicina 0,1 M, pH 2,7, se neutralizaron inmediatamente mediante la adición de NaOH se sometieron a diálisis frente a Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2.
pCC2 se purificó mediante cromatografía de afinidad sobre proteína G solamente. La pureza se analizó mediante SDS-PAGE.
Las secuencias de proteínas de los mimocuerpos se tradujeron de las secuencias de ADNc. Las secuencias N-terminales se confirmaron mediante secuenciación de Edman de pCA2 y pCB2.
La secuencia de las cadenas ligeras de pCA2, pCB2 y pCC2 es la misma y es la siguiente:
1000
La secuencia de la cadena pesada de pCA2 es:
1001
La secuencia de la cadena pesada de pCB2 es:
1002
La secuencia de la cadena pesada de pCC2 es:
1003
D. Acoplamiento de mimocuerpos a la proteína de la cápside de Q\beta D.1. Acoplamiento del mimocuerpo pCC2 a la proteína de la cápside de Q\beta
Una solución de 1,25 ml de 4,5 mg/ml de proteína de la cápside de Q\beta en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 se hizo reaccionar durante 30 minutos con 40 \mul de una solución de SMPH (Pierce) (de una solución de partida 100 mM disuelta en DMSO) a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se sometió con posterioridad a diálisis dos veces durante 2 horas frente a 2 l de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. Después se hicieron reaccionar 6 \mul de la mezcla de reacción sometida a diálisis con 30 \mul de la solución de pCC2 (2,88 mg/ml) durante la noche a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio.
Los productos de reacción se analizaron en geles de SDS-PAGE al 16% en condiciones reductoras. Los geles se tiñeron con Azul Brillante de Coomassie o se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon, se incubaron con un antisuero anti-Qb de conejo policlonal (dilución 1:2000) o un anticuerpo monoclonal anti-Fab monoclonal de ratón (Jackson ImmunoResearch) (dilución 1:2000). Las transferencias se incubaron con posterioridad con IgG anti-conejo de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante o IgG anti-ratón de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante (diluciones 1:7000), respectivamente.
Los resultados se muestran en la Fig 13A. Los productos y eductos de acoplamiento se analizaron en geles de SDS-PAGE al 16% en condiciones reductoras. En la Fig. 13A "pCC2" corresponde al mimocuerpo antes del acoplamiento. "Q\beta deriv" representa Q\beta derivatizada antes del acoplamiento, "Q\beta-pCC2" el producto de la reacción de acoplamiento. Los geles se tiñeron con Azul Brillante de Coomassie o se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon, se incubaron con un antisuero anti-Q\beta de conejo policlonal (dilución 1:2000) o un anticuerpo monoclonal anti-Fab monoclonal de ratón (Jackson ImmunoResearch) (dilución 1:2000). Las transferencias se incubaron con posterioridad con IgG anti-conejo de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante o IgG anti-ratón de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante (diluciones 1:7000), respectivamente. El aumento de quimioluminiscencia (kit ELC de Amersham Pharmacia) se utilizó para visualizar las bandas inmunorreactivas. Los pesos moleculares de las proteínas marcadoras se proporcionan en el margen izquierdo.
Se podría detectar un producto de acoplamiento de aproximadamente 40 kDa (Fig. 13A, flechas). Su reactividad con el antisuero anti-Q\beta y el anticuerpo anti-Fab que reconoce el mimocuerpo demostró claramente el acoplamiento covalente del mimocuerpo a Q\beta.
D.2. Acoplamiento de los mimocuerpos pCA2 y pCB2 a la proteína de la cápside de Q\beta
Una solución de 1,25 ml de 4,5 mg/ml de proteína de la cápside de Q\beta en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 se hizo reaccionar durante 30 minutos con 40 \mul de SMPH (Pierce) (de una solución de partida 100 mM disuelta en DMSO) a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se sometió con posterioridad a diálisis dos veces durante 2 horas frente a 2 l de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. pCA2 (1,2 mg/ml) se redujo con TCEP 20 mM durante 30 min a 25ºC, pCB2 (4,2 mg/ml) con mercaptoetilamina 50 mM a 37ºC. Ambos mimocuerpos se sometieron después a diálisis dos veces frente a Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. El acoplamiento se realizó añadiendo 6 \mul de Q\beta derivatizada a 30 \mul de mimocuerpo a 25ºC durante la noche en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio.
Los productos de reacción se analizaron en geles de SDS-PAGE al 16% en condiciones reductoras. Los geles se tiñeron con Azul Brillante de Coomassie o se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon, se incubaron con un antisuero anti-Qb de conejo policlonal (Cytos, dilución 1:2000) o un anti-his6-mAb monoclonal de ratón (Qiagen) (dilución 1:5000). Las transferencias se incubaron con posterioridad con IgG anti-conejo de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante o IgG anti-ratón de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante (diluciones 1:5000), respectivamente.
Los resultados se muestran en la Fig. 13B y Fig. 13C. Los productos y eductos de acoplamiento se analizaron en geles de SDS-PAGE al 16% en condiciones reductoras. En Fig. 15A y la Fig. 15B "pCA2" y "pCB2" corresponden a los mimocuerpos antes del acoplamiento. "Qb deriv" representa Q\beta derivatizada antes del acoplamiento y "Q\beta-pCA2" y "Q\beta-pCA2" los productos de la reacción de acoplamiento. Los geles se tiñeron con Azul Brillante de Coomassie o se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon, se incubaron con un antisuero anti-Qb de conejo policlonal (dilución 1:2000) o un anti-his6-mAb monoclonal de ratón (Qiagen) (dilución 1:5000). Las transferencias se incubaron con posterioridad con IgG anti-conejo de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante o IgG anti-ratón de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante (diluciones 1:5000), respectivamente. El aumento de quimioluminiscencia (kit ELC de Amersham Pharmacia) se utilizó para visualizar las bandas inmunorreactivas. Los pesos moleculares de las proteínas marcadoras se proporcionan en el margen izquierdo.
Se podrían detectar productos de acoplamiento de aproximadamente 40 kDa tanto para el acoplamiento de pCA2 como de pCB2 (Fig. 15A y Fig. 15B, flechas). Su reactividad con el antisuero anti-Q\beta y el anticuerpo anti-his6 que reconoce la cadena pesada del mimocuerpo demostró claramente el acoplamiento covalente del mimocuerpo a Q\beta.
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Ejemplo 56
Acoplamiento de péptidos Flag a la proteína de la cápside de Q\beta wt y mutante utilizando el entrecruzador Sulfo-GMBS
El péptido Flag, al que se añadió una secuencia CGG N-terminalmente para el acoplamiento, se sintetizó químicamente y tenía secuencia siguiente: CGGDYKDDDDK. Este péptido se utilizó para el acoplamiento químico a la proteína de la cápside de Q\beta wt y proteína de la cápside de Q\beta mutante como se describe a continuación.
A. Acoplamiento del péptido Flag a la proteína de la cápside de Q\beta
Una solución de 100 \mul de 2 mg/ml proteína de la cápside de Q\beta en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 se hizo reaccionar durante 60 minutos con 7 \mul de una solución 65 mM de de Sulfo-GMBS (Pierce) en H_{2}O a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se sometió con posterioridad a diálisis dos veces durante 2 horas frente a 2 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. Después se hicieron reaccionar 100 \mul de la mezcla de reacción sometida a diálisis con 0,58 \mul de solución de partida de péptido Flag 100 mM (en H_{2}O) durante dos horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La mezcla de reacción se sometió con posterioridad a diálisis 2x 2 horas frente a 2 litros de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4
a 4ºC.
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B. Acoplamiento del péptido Flag a la proteína de la cápside de Q\beta-240
Una solución de 100 \mul de 2 mg/ml de proteína de la cápside de Q\beta-240 en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 se hizo reaccionar durante 60 minutos con 7 \mul de una solución 65 mM de de Sulfo-GMBS (Pierce) en H_{2}O a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se sometió con posterioridad a diálisis dos veces durante 2 horas frente a 2 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. Después se hicieron reaccionar 100 \mul de la mezcla de reacción sometida a diálisis con 0,58 \mul de solución de partida de péptido Flag 100 mM (en H_{2}O) durante dos horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La mezcla de reacción se sometió con posterioridad a diálisis 2x 2 horas frente a 2 litros de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC.
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C. Acoplamiento de péptidos Flag a proteína de la cápside de Q\beta-250
Una solución de 100 \mul de 2 mg/ml de proteína de la cápside de Q\beta-250 en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 se hizo reaccionar durante 60 minutos con 7 \mul de una solución 65 mM de Sulfo-GMBS (Pierce) en H_{2}O a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se sometió con posterioridad a diálisis dos veces durante 2 horas frente a 2 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. Después se hicieron reaccionar 100 \mul de la mezcla de reacción sometida a diálisis con 0,58 \mul de solución de partida de péptido Flag 100 mM (en H_{2}O) durante dos horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La mezcla de reacción se sometió con posterioridad a diálisis 2x 2 horas frente a 2 litros de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC.
D. Acoplamiento de péptidos Flag a proteína de la cápside de Q\beta-259
Una solución de 100 \mul de 2 mg/ml de proteína de la cápside de Q\beta-259 en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 se hizo reaccionar durante 60 minutos con 7 \mul de una solución 65 mM de Sulfo-GMBS (Pierce) en H_{2}O a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se sometió con posterioridad a diálisis dos veces durante 2 horas frente a 2 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a 4ºC. Después se hicieron reaccionar 100 \mul de la mezcla de reacción sometida a diálisis con 0,58 \mul de solución de partida de péptido Flag 100 mM (en H_{2}O) durante dos horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La mezcla de reacción se sometió con posterioridad a diálisis 2x 2 horas frente a 2 litros de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a 4ºC.
Los resultados de las reacciones de acoplamientos de los mutantes de Q\beta 240, 250 y 259 al péptido Flag analizados mediante SDS-PAGE se muestran en la Fig. 22 A. El patrón de carga fue el siguiente:
1. Q\beta-240 derivatizada 2. Q\beta-240 acoplada al péptido Flag 3. Q\beta-250 derivatizada 4. Q\beta-250 acoplada al péptido Flag 5. Q\beta-259 derivatizada 6. Q\beta-259 acoplada al péptido Flag 7. Q\beta wt derivatizada 8. Q\beta wt acoplada al péptido Flag 9. Marcador de proteína.
La comparación de la reacción derivatizada con las reacciones de acoplamiento muestra que para todos los mutantes y wt, son visibles las bandas de acoplamiento correspondientes a los péptidos 1 y 2 por subunidad. La banda correspondiente a la subunidad de Q\beta no acoplada es muy débil, indicando que casi todas las subunidades han reaccionado con al menos un péptido Flag. Para el mutante Q\beta-250 y Q\beta wt, es visible una banda correspondiente a tres péptidos por subunidad. La razón de las intensidades de la banda correspondiente a dos péptidos por subunidad y la banda correspondiente a 1 péptido por subunidad es más fuerte para wt, con una razón de 1:1, está razón es aún más alta para el mutante Q\beta-250, mientras que es significativamente más débil para el mutante Q\beta-240 mutante y la más débil es para el mutante Q\beta-259.
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Ejemplo 57
Acoplamiento del péptido Flag a la proteína de la cápside de Q\beta utilizando el entrecruzador Sulfo-MBS
El péptido Flag, al que se añadió una secuencia CGG N-terminalmente para el acoplamiento, se sintetizó químicamente y tenía secuencia siguiente: CGGDYKDDDDK. Este péptido se utilizó para el acoplamiento químico a la proteína de la cápside de Q\beta wt y la otra proteína de la cápside de Q\beta mutante como se describe a continuación.
A. Acoplamiento de péptidos Flag a la proteína de la cápside de Q\beta
Una solución de 100 \mul de 2 mg/ml de proteína de la cápside de Q\beta en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 se hizo reaccionar durante 60 minutos con 7 \mul de una solución 65 mM de Sulfo-MBS (Pierce) en H_{2}O a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se sometió con posterioridad a diálisis dos veces durante 2 horas frente a 2 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. Después se hicieron reaccionar 100 \mul de la mezcla de reacción sometida a diálisis con 0,58 \mul de solución de partida de péptido Flag 100 mM (en H_{2}O) durante dos horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La mezcla de reacción se sometió con posterioridad a diálisis 2x 2 horas frente a 2 litros de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a
4ºC.
B. Acoplamiento del péptido Flag a la proteína de la cápside de Q\beta-240
Una solución de 100 \mul de 2 mg/ml de proteína de la cápside de Q\beta-240 en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 se hizo reaccionar durante 60 minutos con 7 \mul de una solución 65 mM de Sulfo-MBS (Pierce) en H_{2}O a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se sometió con posterioridad a diálisis dos veces durante 2 horas frente a 2 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. Después se hicieron reaccionar 100 \mul de la mezcla de reacción sometida a diálisis con 0,58 \mul de solución de partida de péptido Flag 100 mM (en H_{2}O) durante dos horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La mezcla de reacción se sometió con posterioridad a diálisis 2x 2 horas frente a 2 litros de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a
4ºC.
C. Acoplamiento del péptido Flag a la proteína de la cápside de Q\beta-250
Una solución de 100 \mul de 2 mg/ml de proteína de la cápside de Q\beta-250 en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 se hizo reaccionar durante 60 minutos con 7 \mul de una solución 65 mM de Sulfo-MBS (Pierce) en H_{2}O a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se sometió con posterioridad a diálisis dos veces durante 2 horas frente a 2 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. Después se hicieron reaccionar 100 \mul de la mezcla de reacción sometida a diálisis con 0,58 \mul de solución de partida de péptido Flag 100 mM (en H_{2}O) durante dos horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La mezcla de reacción se sometió con posterioridad a diálisis 2x 2 horas frente a 2 litros de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC.
D. Acoplamiento de péptidos Flag a la proteína de la cápside de Q\beta-259
Una solución de 100 \mul de 2 mg/ml de proteína de la cápside de Q\beta-259 en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 se hizo reaccionar durante 60 minutos con 7 \mul de una solución 65 mM de Sulfo-MBS (Pierce) en H_{2}O a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se sometió con posterioridad a diálisis dos veces durante 2 horas frente a 2 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. Después se hicieron reaccionar 100 \mul de la mezcla de reacción sometida a diálisis con 0,58 \mul de solución de partida de péptido Flag 100 mM (en H_{2}O) durante dos horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La mezcla de reacción se sometió con posterioridad a diálisis 2x 2 horas frente a 2 litros de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC.
Los resultados de las reacciones de acoplamiento de los mutantes de Q\beta 240, 250 y 259 al péptido Flag analizados mediante SDS-PAGE se muestran en la Figura 1. El patrón de carga fue el siguiente:
1. Marcador de Proteína 2. Q\beta-240 Derivatizada 3. Q\beta-240 acoplada al péptido Flag 4. Q\beta-250 Derivatizada 5. Q\beta-250 acoplada al péptido Flag 6. Q\beta-259 Derivatizada 7. Q\beta-259 acoplada al péptido Flag 8. Q\beta wt Derivatizada 9. Q\beta wt acoplada al péptido Flag.
La comparación de la reacción derivatizada con las reacciones de acoplamiento muestra que para todos los mutantes y wt, es visible una banda de acoplamiento correspondiente a 1 péptido por subunidad. También son visibles las bandas correspondientes a 2 péptidos por subunidad para Q\beta-250 mutante y Q\beta wt. La razón de las intensidades de la banda correspondiente a 1 péptido por subunidad y a la subunidad no acoplada, respectivamente, es mayor para el mutante Q\beta-250 y Q\beta wt. Es visible una banda correspondiente a dos péptidos por subunidad para Q\beta-240 mutante.
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Ejemplo 58
Acoplamiento de péptidos Flag a mutantes de Q\beta utilizando el entrecruzador SMPH
El péptido Flag, al que se añadió una secuencia CGG N-terminalmente para el acoplamiento, se sintetizó químicamente y tenía secuencia siguiente: CGGDYKDDDDK. Este péptido se utilizó para el acoplamiento químico a los mutantes de Q\beta como se describe a continuación.
A. Acoplamiento de péptidos Flag a proteína de la cápside de Q\beta-240
Una solución de 100 \mul de 2 mg/ml de proteína de la cápside de Q\beta-240 en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 se hizo reaccionar durante 30 minutos con 2,94 \mul de una solución 100 mM de SMPH (Pierce) en DMSO a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se sometió con posterioridad a diálisis dos veces durante 2 horas frente a 2 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a 4ºC. Después se hicieron reaccionar 90 \mul de la mezcla de reacción sometida a diálisis con 1,3 \mul de solución de partida de péptido Flag 50 mM (en DMSO) durante dos horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La mezcla de reacción se sometió con posterioridad a diálisis 2x 2 horas frente a 2 litros de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a 4ºC.
B. Acoplamiento del péptido Flag a la proteína de la cápside de Q\beta-250
Una solución de 100 \mul de 2 mg/ml de proteína de la cápside de Q\beta-250 en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 se hizo reaccionar durante 30 minutos con 2,94 \mul de una solución 100 mM de SMPH (Pierce) en DMSO a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se sometió con posterioridad a diálisis dos veces durante 2 horas frente a 2 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a 4ºC. Después se hicieron reaccionar 90 \mul de la mezcla de reacción sometida a diálisis con 1,3 \mul de la solución de partida de péptido Flag 50 mM (en DMSO) durante dos horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La mezcla de reacción se sometió con posterioridad a diálisis 2x 2 horas frente a 2 litros de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a 4ºC.
C. Acoplamiento del péptido Flag a la proteína de la cápside de Q\beta-259
Una solución de 100 \mul de 2 mg/ml de proteína de la cápside de Q\beta-259 en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 se hizo reaccionar durante 30 minutos con 2,94 \mul de una solución 100 mM de SMPH (Pierce) en DMSO a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se sometió con posterioridad a diálisis dos veces durante 2 horas frente a 2 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a 4ºC. Después se hicieron reaccionar 90 \mul de la mezcla de reacción sometida a diálisis con 1,3 \mul de la solución de partida de péptido Flag 50 mM (en DMSO) durante dos horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La mezcla de reacción se sometió con posterioridad a diálisis 2x 2 horas frente a 2 litros de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a 4ºC.
Los resultados de la reacción de acoplamiento de los mutantes de Q\beta 240, 250 y 259 al péptido Flag analizados mediante SDS-PAGE se muestran en la Figura 1. El patrón de carga fue el siguiente. 1. Marcador de Proteína 2. Q\beta-240 acoplada a Flag, sedimento de la reacción de acoplamiento 3. Q\beta-240 acoplada a Flag, sobrenadante de la reacción de acoplamiento 4. Q\beta-240 derivatizada con SMPH 5. Q\beta-250 acoplada a Flag, sedimento de la reacción de acoplamiento 6. Q\beta-250 acoplada a Flag, sobrenadante de la reacción de acoplamiento 7. Q\beta-250 derivatizada con SMPH 8. Q\beta-259 acoplada a Flag, sedimento de la reacción de acoplamiento 9. Q\beta-259 acoplada a Flag, sobrenadante de la reacción de acoplamiento 10. Q\beta-259 derivatizada con SMPH.
La comparación de la reacción derivatizada con las reacciones de acoplamiento muestra que para todos los mutantes, son visibles bandas de acoplamiento correspondientes a 1, respectivamente 2 péptidos por subunidad. También son visibles bandas correspondientes a tres, respectivamente cuatro péptidos por subunidad para Q\beta-250 mutante.
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Ejemplo 59
Acoplamiento de la proteína PLA_{2-}Cys a proteínas de la cápside de Q\beta mutantes
Las proteínas de la cápside de Q\beta mutantes liofilizadas se empaparon durante la noche en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4.
A. Acoplamiento de la proteína PLA_{2}-Cys a la proteína de la cápside de Q\beta-240
Una solución de 100 \mul de 2 mg/ml de proteína de la cápside de Q\beta-240 en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 se hizo reaccionar durante 30 minutos con 2,94 \mul de una solución 100 mM de SMPH (Pierce) en DMSO a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se sometió con posterioridad a diálisis dos veces durante 2 horas frente a 2 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a 4ºC. Se mezclaron 90 \mul de la mezcla de reacción sometida a diálisis con 146 \mul de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 y se hicieron reaccionar con 85,7 \mul de 2,1 mg/ml de solución de partida de PLA_{2}-Cys durante cuatro horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La mezcla de reacción se sometió con posterioridad a diálisis 2x 2 horas frente a 2 litros de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a 4ºC.
B. Acoplamiento de la proteína PLA_{2}-Cys a la proteína de la cápside de Q\beta-250
Una solución de 100 \mul de 2 mg/ml de proteína de la cápside de Q\beta-250 en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 se hizo reaccionar durante 30 minutos con 2,94 \mul de una solución 100 mM de SMPH (Pierce) en DMSO a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se sometió con posterioridad a diálisis dos veces durante 2 horas frente a 2 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a 4ºC. Se mezclaron 90 \mul de la mezcla de reacción sometida a diálisis con 146 \mul de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 y se hicieron reaccionar con 85,7 \mul de 2,1 mg/ml de solución de partida de PLA_{2}-Cys durante cuatro horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La mezcla de reacción se sometió con posterioridad a diálisis 2x 2 horas frente a 2 litros de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a 4ºC.
C. Acoplamiento de la proteína PLA_{2}-Cys a la proteína de la cápside de Q\beta-259
Una solución de 100 \mul de 2 mg/ml de proteína de la cápside de Q\beta-259 en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 se hizo reaccionar durante 30 minutos con 2,94 \mul de una solución 100 mM de SMPH (Pierce) en DMSO a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La solución de reacción se sometió con posterioridad a diálisis dos veces durante 2 horas frente a 2 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a 4ºC. Se mezclaron 90 \mul de la mezcla de reacción sometida a diálisis con 146 \mul Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 y se hicieron reaccionar con 85,7 \mul de 2,1 mg/ml de solución de partida de PLA_{2}-Cys durante cuatro horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento con movimiento oscilatorio. La mezcla de reacción se sometió con posterioridad a diálisis 2x 2 horas frente a 2 litros de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a 4ºC.
Los resultados del experimento de acoplamiento analizados mediante SDS-PAGE se muestran en la Figura 1. El patrón de carga fue el siguiente: 1. Marcador de Proteína 2. Q\beta-240 derivatizada 3. Q\beta-240 acoplada a Pla2Cys, sobrenadante de la reacción de acoplamiento 4. Q\beta-240 acoplada a PLA_{2}-Cys, sedimento de la reacción de acoplamiento 5. Q\beta-250 derivatizada 6. Q\beta-250 acoplada a PLA_{2}-Cys, sobrenadante de la reacción de acoplamiento 7. Q\beta-250 acoplada a PLA_{2}-Cys, sedimento de la reacción de acoplamiento 8. Q\beta-259 derivatizada 9. Q\beta-259 acoplada a PLA_{2}-Cys, sobrenadante de la reacción de acoplamiento 10. Q\beta-259 acoplada a PLA_{2}-Cys, sedimento de la reacción de acoplamiento 11. PLA_{2}-Cys.
Las bandas de acoplamiento (indicadas mediante la flecha en la figura) fueron visibles para todos los mutantes, mostrando que la proteína PLA_{2}-Cys podría acoplarse a todas las proteínas de la cápside de Q\beta mutantes.
<110> Cytos Biotechnology
\hskip1cm
Novartis Pharma AG 
\hskip1cm
Renner, Wolfgang A. 
\hskip1cm
Bachmann, Martin 
\hskip1cm
Tissot, Alain 
\hskip1cm
Maurer, Patrick 
\hskip1cm
Lechner, Franziska 
\hskip1cm
Sebbel, Peter 
\hskip1cm
Piossek, Christine 
\hskip1cm
Ortmann, Rainer 
\hskip1cm
Luond, Rainer 
\hskip1cm
Staufenbiel, Matthias 
\hskip1cm
Frey, Peter 
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Matrices de Antígenos Moleculares
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 1700.019PC05
\vskip0.400000\baselineskip
<140> (Por asignar)
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 2002-01-18
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/262.379
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2001-01-19
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/288.549
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2001-05-04
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/326.998
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2001-10-05
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/331.045
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2001-11-07
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 350
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggacgcgt gcagcaggta accaccgtta aagaaggcac c 
\hfill
41 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cggtggttac ctgctgcacg cgttgcttaa gcgacatgta gcgg 
\hfill
44 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccatgaggcc tacgataccc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggcactcacg gcgcgcttta caggc 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccttctttaa cggtggttac ctgctggcaa ccaacgtggt tcatgac 
\hfill
47 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aagcatgctg cacgcgtgtg cggtggtcgg atcgcccggc 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
29 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
30 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cccgaattcc tagaagccac agctgccctc c 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cctgcggtgg tctgaccgac accc 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccgcggaaga gccaccgcaa ccaccgtgtg ccgccaggat g 
\hfill
41 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctatcatcta gaatgaatag aggattcttt aac 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sitio de unión al ribosoma modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aggaggtaaa aaacg 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido señal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: constructo Fos modificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: conector peptídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
33 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: conector peptídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
34 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 256
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: constructo de fusión Fos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
35 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: constructo de fusión Fos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
36 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 261
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: constructo de fusión Fos
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (22)..(240)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
37 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: constructo de fusión Fos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
38 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 196
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: constructo de fusión Fos
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (34)..(189)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
39 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: constructo de fusión Fos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
40 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 204
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: constructo de fusión Fos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
41 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: constructo de fusión Fos
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\hskip1cm
42 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\hskip1cm
43 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 262
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: constructo de fusión Fos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\hskip1cm
44 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: constructo de fusión Fos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\hskip1cm
45 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 261
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: constructo de fusión Fos
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)..(240)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\hskip1cm
46 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: constructo de fusión Fos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\hskip1cm
47 
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<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cctgggtggg ggcggccgct tctggtggtt gcggtggtct gacc 
\hfill
44 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggtgggaatt caggaggtaa aaagatatcg ggtgtggggc ggcc 
\hfill
44 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggtgggaatt caggaggtaa aaaacgatgg cttgcggtgg tctgacc 
\hfill
47 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcttgcggtg gtctgacc 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador
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<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccaccaagct tagcaaccac cgtgtgc 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\hskip1cm
300 
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccaccaagct taggcctccc acacccagcg gc 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggtgggaatt caggaggtaa aaaacgatg 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggtgggaatt caggcctatg gctacaggct cc 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggtgggaatt catggctaca ggctccc 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\hskip1cm
301 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\hskip1cm
302 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 402
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Fosfolipasa A2 de veneno de abeja modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(402)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\hskip1cm
48 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 134
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Fosfolipasa A2 de veneno de abeja modificada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\hskip1cm
49 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccatcatcta cccaggtac 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cccacaccca gcggccgcgt atttgcgcag gtcg 
\hfill
34 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cggtggttct gcggccgcta tcatctaccc aggtac 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttagtatttg cgcaggtcg 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccggctccat cggtgcag 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
accaccagaa gcggccgcag gggaaacaca tctgcc 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cggtggttct gcggccgctg gctccatcgg tgcag 
\hfill
35 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttaaggggaa acacatctgc c 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
actagtctag aatgagagtg aaggagaaat atc 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tagcatgcta gcaccgaatt tatctaattc caataattct tg 
\hfill
42 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\hskip1cm
303 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caaagctcct attcccactg ccagtttctc gagctgggta gctttcag 
\hfill
48 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttcggtgcta gcggtggctg cggtggtctg accgac 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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gatgctgggc ccttaaccgc aaccaccgtg tgccgcc 
\hfill
37 
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<210> 59
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<211> 46
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia de aminoácidos JUN
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<400> 59
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\hskip1cm
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<210> 60
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<211> 46
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia de aminoácidos FOS
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<400> 60
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\hskip1cm
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<210> 61
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
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ccggaattca tgtgcggtgg tcggatcgcc cgg 
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
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gtcgctaccc gcggctccgc aaccaacgtg gttcatgac 
\hfill
39 
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
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gttggttgcg gagccgcggg tagcgacatt gacccttata aagaatttgg 
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
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cgcgtcccaa gcttctacgg aagcgttgat aggatagg 
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
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\hfill
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
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cgcgtcccaa gcttttagca accaacgtgg ttcatgac 
\hfill
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
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ccggaattca tggacattga cccttataaa g 
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
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ccgaccaccg caacccgcgg ctagcggaag cgttgatagg atagg 
\hfill
45 
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
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\hfill
47 
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
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<400> 70
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gtcgctaccc gcggctccgc aaccaacgtg gttcatgac 
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<211> 31
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
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ccggaattca tggacattga cccttataaa g 
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
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ccgaccaccg cagcccccac cggatccatt agtacccacc caggtagc 
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
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gttggttgcg gagccgcggg tagcgaccta gtagtcagtt atgtc 
\hfill
45 
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
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cgcgtcccaa gcttctacgg aagcgttgat aggatagg 
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
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ctagccgcgg gttgcggtgg tcggatcgcc cgg 
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
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cgcgtcccaa gcttttagca accaacgtgg ttcatgac 
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
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ccggaattca tggacattga cccttataaa g 
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
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\hskip1cm
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
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\hfill
48 
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgcgtcccaa gcttctaaac aacagtagtc tccggaag 
\hfill
38 
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<211> 36
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
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gccgaattcc tagcagctag caccgaattt atctaa 
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36 
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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taaccgaatt caggaggtaa aaagatatgg 
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
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gaagtaaagc ttttaaccac cgcaaccacc agaag 
\hfill
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 87
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\hskip-.1em\dddseqskip
tcgaatgggc cctcatcttc gtgtgctagt cag 
\hfill
33 
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<210> 88
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<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: constructo de fusión Fos
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<400> 88
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<213> Virus de la hepatitis B
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: constructo sintético de la Hepatitis B humana
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<213> Virus de la hepatitis B
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<213> Virus de la hepatitis B
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> POCO SEGURO
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<222> (28)
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<223> Puede ser cualquier aminoácido.
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
113 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 132
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 183
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 132
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
114 
\hskip1cm
115 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 133
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3221
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la hepatitis B
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1901)..(2458)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 133
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
116 
\hskip1cm
117 
\hskip1cm
118 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 134
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 185
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 134
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
119 
\hskip1cm
120 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 135
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 188
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la hepatitis B Woodchuck
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 135
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
121 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 136
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 217
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la hepatitis de la ardilla moruna
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 136
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
122 
\hskip1cm
123 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 137
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 262
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis B del ganso nival
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 137
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
124 
\hskip1cm
125 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 138
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 305
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la hepatitis B de los patos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 138
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
126 
\hskip1cm
127 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 139
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haemophilus influenzae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 139
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
128 
\hskip1cm
129 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 140
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 139
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pseudomonas stutzeri 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 140
\hskip1cm
130 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 141
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Caulobacter crescentus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 141
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
131 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 142
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 173
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 142
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
132 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 143
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 173
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 143
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
133 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 144
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 172
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 144
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
134 
\hskip1cm
135 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 145
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 853
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (281)..(829)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 145
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
136 
\hskip1cm
137 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 146
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 182
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 146
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
138 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 147
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: FLAG péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 147
\hskip1cm
139 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 148
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 148
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccggaattca tggacattga cccttataaa g 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 149
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 149
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtgcagtatg gtgaggtgag gaatgctcag gagactc 
\hfill
37 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 150
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 150
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gsgtctcctg agcattcctc acctcaccat actgcac 
\hfill
37 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 151
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 151
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cttccaaaag tgagggaaga aatgtgaaac cac 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 152
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 152
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgcgtcccaa gcttctaaac aacagtagtc tccggaagcg ttgatag 
\hfill
47 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 153
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 153
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtggtttcac atttcttccc tcacttttgg aag 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 154
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 281
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 154
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
140 
\hskip1cm
141 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 155
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 181
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 155
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
142 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 156
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 447
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hepatitis B
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(447)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 156
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
143 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 157
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 149
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 157
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
144 
\hskip1cm
145 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 158
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 152
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 158
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
146 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 159
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 132
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago Q Beta
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 159
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
147 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 160
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 129
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago R 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 160
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
148 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 161
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 130
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago fr
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 161
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
149 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 162
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 130
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago GA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 162
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
150 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 163
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 132
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago SP
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 163
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
151 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 164
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 130
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago MS2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 164
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
152 
\hskip1cm
153 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 165
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 133
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago M11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 165
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
154 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 166
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 133
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago MX1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 166
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
155 
\hskip1cm
156 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 167
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 330
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago NL95
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 167
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
157 
\hskip1cm
158 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 168
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 134
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Apis mellifera 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 168
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
159 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 169
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 129
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Apis mellifera 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 169
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
160 
\hskip1cm
161 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 170
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 134
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Apis dorsata 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 170
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
162 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 171
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 134
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Apis cerana 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 171
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
163 
\hskip1cm
164 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 172
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 136
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bombus pennsylvanicus 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 172
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
165 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 173
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 142
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Heloderma suspectum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 173
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
166 
\hskip1cm
167 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 174
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 143
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Heloderma suspectum 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 174
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
168 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 175
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 142
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Heloderma suspectum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 175
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
169 
\hskip1cm
170 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 176
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 574
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cadena pesada IgE
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 176
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
171 
\hskip1cm
172 
\hskip1cm
173 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 177
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 177
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
000 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 178
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptidos IgE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 178
\hskip1cm
174 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 179
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mimotipo IgE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 179
\hskip1cm
175 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 180
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mimotipo IgE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 180
\hskip1cm
176 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 181
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mimotipo IgE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 181
\hskip1cm
177 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 182
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mimotipo IgE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 182
\hskip1cm
178 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 183
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mimotipo IgE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 183
\hskip1cm
179 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 184
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mimotipo IgE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 184
\hskip1cm
180 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 185
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mimotipo IgE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 185
\hskip1cm
181 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 186
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mimotipo IgE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 186
\hskip1cm
182 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 187
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mimotipo IgE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 187
\hskip1cm
183 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 188
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mimotipo IgE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 188
\hskip1cm
184 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 189
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mimotipo IgE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 189
\hskip1cm
185 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 190
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mimotipo IgE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 190
\hskip1cm
186 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 191
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mimotipo IgE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 191
\hskip1cm
187 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 192
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mimotipo IgE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 192
\hskip1cm
188 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 193
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mimotipo IgE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 193
\hskip1cm
189 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 194
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mimotipo IgE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 194
\hskip1cm
190 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 195
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mimotipo IgE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 195
\hskip1cm
191 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 196
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador Oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 196
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
305 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 197
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador Oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 197
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtcaaaggcc ttgtcgacgt tattccatta cgcccgtcat tttgg 
\hfill
45 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 198
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4623
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> pFIMAIC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 198
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
192 
\hskip1cm
193 
\hskip1cm
194 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 199
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador Oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 199
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aagatcttaa gctaagcttg aattctctga cgctgattaa cc 
\hfill
42 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 200
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador Oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 200
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acgtaaagca tttctagacc gcggatagta atcgtgctat c 
\hfill
41 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 201
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5681
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> pFIMD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 201
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
195 
\hskip1cm
196 
\hskip1cm
197 
\hskip1cm
198 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 202
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador Oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 202
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aattacgtga gcaagcttat gagaaacaaa cctttttatc 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 203
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador Oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 203
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gactaaggcc tttctagatt attgataaac aaaagtcacg c 
\hfill
41 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 204
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4637
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> pFIMFGH
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 204
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
199 
\hskip1cm
200 
\hskip1cm
201 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 205
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9299
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> pFIMAICDFGH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 205
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
202 
\hskip1cm
203 
\hskip1cm
204 
\hskip1cm
205 
\hskip1cm
206 
\hskip1cm
207 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 206
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8464
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> pFIMAICDFG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 206
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
208 
\hskip1cm
209 
\hskip1cm
210 
\hskip1cm
211 
\hskip1cm
212 
\hskip1cm
213 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 207
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Epítopo Ce3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 207
\hskip1cm
214 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 208
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mimotopo Ce3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 208
\hskip1cm
215 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 209
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Vector clonación de fosfolipasa A2 de veneno de abeja
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 209
\hskip1cm
216 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 210
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 145
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Proteína de fusión PLA_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 210
\hskip1cm
217 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 211
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mimotopo Ce4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 211
\hskip1cm
218 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido M2 sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 212
\hskip1cm
219 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 213
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Proteína M2 de la matriz
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 213
\hskip1cm
220 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 214
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 214
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
taaccgaatt caggaggtaa aaacatatgg ctatcatcta cc 
\hfill
42 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 215
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 129
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago f2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 215
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
221 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 216
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mimotopo circular
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 216
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
222 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 217
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 329
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Bacteriófago Q-beta
\newpage
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<400> 217
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
223 
\hskip1cm
224 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 218
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 770
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Proteína Amiloide-Beta (Homo Sapiens)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 218
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
225 
\hskip1cm
226 
\hskip1cm
227 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 219
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Precursor del Péptido Beta-Amiloide (Homo Sapiens)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 219
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
228 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 220
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Péptido Beta Amiloide
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 220
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
229 
\hskip1cm
230 
\hskip1cm
231 
\hskip1cm
232 
\hskip1cm
233 
\hskip1cm
234 
\hskip1cm
235 
\hskip1cm
236 
\hskip1cm
237 
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238 
\hskip1cm
239 
\hskip1cm
240 
\hskip1cm
241 
\hskip1cm
242 
\hskip1cm
243 
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244 
\hskip1cm
245 
\hskip1cm
246 
\hskip1cm
247 
\hskip1cm
248

Claims (36)

1. Una composición que comprende:
(a)
un armazón molecular no natural que comprende:
(i)
una partícula núcleo, donde dicha partícula núcleo es una partícula de tipo virus de un fago con ARN;
(ii)
un organizador que comprende al menos un primer sitio de anclaje, donde dicho organizador está conectado a dicha partícula núcleo por al menos un enlace covalente;
(b)
un antígeno o determinante antigénico con al menos un segundo sitio de anclaje, donde dicho antígeno o determinante antigénico es el péptido beta amiloide (A\beta_{1-42}) o uno de sus fragmentos, y donde dicho segundo sitio de anclaje se selecciona del grupo que consiste en:
(i)
un sitio de anclaje de origen no natural con dicho antígeno o determinante antigénico; y
(ii)
un sitio de anclaje de origen natural con dicho antígeno o determinante antigénico,
donde dicho segundo sitio de anclaje susceptible de asociación por medio de al menos un enlace no peptídico a dicho primer sitio de anclaje; y donde dicho antígeno o determinante antigénico y dicho armazón interaccionan por medio de dicha asociación para formar una matriz de antígeno ordenada y repetitiva.
2. La composición de la reivindicación 1, donde dicha asociación es por medio de al menos un enlace covalente no peptídico.
3. La composición de la reivindicación 1, donde dicha partícula de tipo virus es una partícula de tipo virus recombinante.
4. La composición de la reivindicación 1, donde dicho organizador es un polipéptido, un péptido o un aminoácido y dicho segundo sitio de anclaje es un polipéptido, un péptido o un aminoácido.
5. La composición de la reivindicación 1, donde dicha partícula de tipo virus comprende, o alternativamente consiste esencialmente en, proteínas recombinantes de un fago con ARN.
6. La composición de la reivindicación 5, donde dicho fago con ARN se selecciona del grupo que consiste en:
a)
bacteriófago Q\beta;
b)
bacteriófago R17;
c)
bacteriófago fr;
d)
bacteriófago GA;
e)
bacteriófago SP;
f)
bacteriófago MS2;
g)
bacteriófago M11;
h)
bacteriófago MX1;
i)
bacteriófago NL95;
j)
bacteriófago f2; y
k)
bacteriófago PP7.
7. La composición de la reivindicación 6, donde dicha partícula de tipo virus del bacteriófago Q\beta comprende o alternativamente consiste esencialmente en proteínas de la cubierta que tiene la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 159.
8. La composición de la reivindicación 5 o 6, donde dicho segundo sitio de anclaje no existe naturalmente en dicho antígeno o determinante antigénico.
9. La composición de la reivindicación 8, donde dicha composición comprende un conector aminoacídico.
10. La composición de la reivindicación 9, donde dicho conector aminoacídico está unido a dicho antígeno o dicho determinante antigénico por medio de al menos un enlace covalente.
11. La composición de la reivindicación 10, donde dicho enlace covalente es un enlace peptídico.
12. La composición de la reivindicación 9, donde dicho conector aminoacídico comprende, o alternativamente consiste en, dicho segundo sitio de anclaje.
13. La composición de la reivindicación 12, donde dicho conector aminoacídico comprende un grupo sulfhidrilo.
14. La composición de la reivindicación 12, donde dicho conector aminoacídico comprende un resto cisteína.
15. La composición de la reivindicación 12, donde dicho conector aminoacídico se selecciona del grupo que consiste en:
(a)
CGG;
(b)
conector gamma-1 N-terminal;
(c)
conector gamma-3 N-terminal;
(d)
regiones bisagra de Ig;
(e)
conectores de glicina N-terminales;
(f)
(G)_{k}C (G)_{n} con n=0-12 y k=0-5;
(g)
conectores de glicina-serina N-terminales;
(h)
(G)_{k}C(G)_{m}(S)_{l}(GGGCS)_{n} con n=0-3, k=0-5, m=0-10, 1=0-2;
(i)
GGC;
(j)
GGC-NH2;
(k)
conector gamma-1 C-terminal;
(l)
conector gamma-3 C-terminal,
(m)
conectores de glicina C-terminales;
(n)
(G)_{n}C(G)_{k} con n=0-12 y k=0-5;
(o)
conectores de glicina-serina C-terminales;
(p)
(G)_{m}(S)_{l}(GGGGS)_{n}(G)_{o}C(G)_{k} con n=0-3, k=0-5. m=0-10, 1=0-2, y o=0-8.
16. La composición de la reivindicación 1, donde dicho primer sitio de anclaje comprende o es un grupo amino y dicho segundo sitio de anclaje comprende o es un grupo sulfhidrilo.
17. La composición de la reivindicación 1, donde dicho primer sitio de anclaje comprende o es un resto lisina y dicho segundo sitio de anclaje comprende o es a resto cisteína.
18. La composición de la reivindicación 1, donde dicho péptido beta amiloide (A\beta_{1-42}) o uno de sus fragmentos se selecciona del grupo que consiste en:
a)
A\beta 1-15;
b)
A\beta 1-27;
c)
A\beta 1-40;
d)
A\beta 1-42;
e)
A\beta 33-40; y
f)
A\beta 33-42.
19. La composición de la reivindicación 1 o 18 que comprende adicionalmente un entrecruzador heterobifuncional.
20. La composición de la reivindicación 19, donde dicho entrecruzador heterobifuncional se selecciona del grupo que consiste en:
a)
SMPH;
b)
Sulfo-MBS; y
c)
Sulfo-GMBS.
21. La composición de la reivindicación 1, donde dicho péptido beta amiloide (A\beta_{1-42}) o uno de sus fragmentos con dicho segundo sitio de anclaje tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:
a)
la secuencia de aminoácidos de DAEFRHDSGYEVHHQGGC;
b)
la secuencia de aminoácidos de CGHGNKSGLMVGGVVIA; y
c)
la secuencia de aminoácidos de DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNGGC.
22. La composición de la reivindicación 18, donde dicho primer sitio de anclaje comprende o es un grupo amino y dicho segundo sitio de anclaje comprende o es un grupo sulfhidrilo.
23. La composición de la reivindicación 18, donde dicho primer sitio de anclaje comprende o es un resto lisina y dicho segundo sitio de anclaje comprende o es a resto cisteína.
24. La composición de la reivindicación 18, donde dicho segundo sitio de anclaje no existe naturalmente en dicho antígeno o determinante antigénico.
25. La composición de la reivindicación 24, donde dicha composición comprende un conector aminoacídico.
26. La composición de la reivindicación 25, donde dicho conector aminoacídico está unido a dicho antígeno o dicho determinante antigénico por medio de al menos un enlace covalente.
27. La composición de la reivindicación 26, donde dicho enlace covalente es un enlace peptídico.
28. La composición de la reivindicación 25, donde dicho conector aminoacídico comprende, o alternativamente consiste en, dicho segundo sitio de anclaje.
29. La composición de la reivindicación 28, donde dicho conector aminoacídico comprende un grupo sulfhidrilo.
30. La composición de la reivindicación 28, donde dicho conector aminoacídico comprende a resto cisteína.
31. La composición de la reivindicación 18 o 28, donde dicho conector aminoacídico se selecciona del grupo que consiste en:
(a)
CGG;
(b)
conector gamma 1 N-terminal;
(c)
conector gamma 3 N-terminal;
(d)
regiones bisagra de Ig;
(e)
conectores de glicina N-terminales;
(f)
(G)_{k}C(G)_{n} con n=0-12 y k=0-5;
(g)
conectores de glicina-serina N-terminales;
(h)
(G)_{k}C(G)_{m}(S)_{l}(GGGGS)_{n} con n=0-3, k=0-5, m=0-10, 1=0-2;
(i)
GGC;
(j)
GGC-NH2, GGC-NMe, GGC-N(Me)2, GGC-NHET o GGC-N(Et)2;
(k)
conector gamma 1 C-terminal;
(l)
conector gamma 3 C-terminal;
(m)
conectores de glicina C-terminales;
(n)
(G)_{n}C(G)_{k} con n=0-12 y k=0-5;
(o)
conectores de glicina-serina C-terminales; y
(p)
(G)_{m}(S)_{l}(GGGGS)_{n}(G)_{o}C(G)_{k} con n=0-3, k=0-5, m=0-10,1=0-2, y o=0-8.
32. La composición de la reivindicación 18, donde dicho conector aminoacídico se selecciona del grupo que consiste en:
(a)
CGG;
(b)
CGKR;
(c)
CGHGNKS;
(d)
GGC; y
(e)
GGC-NH2.
33. Una composición farmacéutica que comprende:
a)
la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-32; y
b)
un portador farmacéuticamente aceptable.
34. El uso de la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-32 para la fabricación de un medicamento para tratar la enfermedad de Alzheimer.
35. Una composición de vacuna que comprende la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-32.
36. Un procedimiento ara producir una matriz de antígeno de origen no natural ordenada y repetitiva que comprende:
a)
proporcionar un armazón molecular no natural que comprende:
(i)
una partícula núcleo, donde dicha partícula núcleo es una partícula de tipo virus de un fago con ARN;
(ii)
un organizador que comprende al menos un primer sitio de anclaje, donde dicho organizador está conectado a dicha partícula núcleo por al menos un enlace covalente; y
b)
proporcionar un antígeno o determinante antigénico con al menos un segundo sitio de anclaje, donde dicho antígeno o determinante antigénico es el péptido beta amiloide (A\beta_{1-42}) o uno de sus fragmentos, y donde dicho segundo sitio de anclaje se selecciona del grupo que consiste en:
(i)
un sitio de anclaje de origen no natural con dicho antígeno o determinante antigénico; y
(ii)
un sitio de anclaje de origen natural con dicho antígeno o determinante antigénico, donde dicho segundo sitio de anclaje es susceptible de asociación por medio de al menos un enlace no peptídico a dicho primer sitio de anclaje; y
c)
combinar dicho armazón molecular no natural y dicho antígeno o determinante antigénico, donde dicho antígeno o determinante antigénico y dicho armazón interaccionan por medio de dicha asociación para formar una matriz de antígeno ordenada y repetitiva.
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Families Citing this family (135)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8022270B2 (en) * 2000-07-31 2011-09-20 Biolex Therapeutics, Inc. Expression of biologically active polypeptides in duckweed
US7632983B2 (en) 2000-07-31 2009-12-15 Biolex Therapeutics, Inc. Expression of monoclonal antibodies in duckweed
US7128911B2 (en) * 2001-01-19 2006-10-31 Cytos Biotechnology Ag Antigen arrays for treatment of bone disease
US7094409B2 (en) * 2001-01-19 2006-08-22 Cytos Biotechnology Ag Antigen arrays for treatment of allergic eosinophilic diseases
US7320793B2 (en) * 2001-01-19 2008-01-22 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen array
US7629309B2 (en) 2002-05-29 2009-12-08 Zystor Therapeutics, Inc. Targeted therapeutic proteins
EP1974752B1 (en) 2001-04-30 2012-09-26 BioMarin Pharmaceutical Inc. Subcellular targeting of therapeutic proteins
US7560424B2 (en) 2001-04-30 2009-07-14 Zystor Therapeutics, Inc. Targeted therapeutic proteins
DE60234375D1 (de) 2001-09-14 2009-12-24 Cytos Biotechnology Ag VERPACKUNG VON IMMUNSTIMULIERENDEM CpG IN VIRUSÄHNLICHEN PARTIKELN: HERSTELLUNGSVERFAHREN UND VERWENDUNG
CA2492823A1 (en) * 2001-09-14 2003-03-27 Martin F. Bachmann In vivo activation of antigen presenting cells for enhancement of immune responses induced by virus like particles
MXPA04002644A (es) 2001-10-05 2004-07-08 Cytos Biotechnology Ag Conjugados que portan un peptido de angiotensina y usos de los mismos.
US7115266B2 (en) 2001-10-05 2006-10-03 Cytos Biotechnology Ag Angiotensin peptide-carrier conjugates and uses thereof
US20030072761A1 (en) 2001-10-16 2003-04-17 Lebowitz Jonathan Methods and compositions for targeting proteins across the blood brain barrier
AU2003225957A1 (en) * 2002-03-25 2003-10-13 Mercia Pharma, Llc Treatment methods for eotaxin mediated inflammatory conditions
EP1532167B1 (en) * 2002-07-17 2012-01-25 Cytos Biotechnology AG Molecular antigen arrays using a virus like particle derived from the ap205 coat protein
KR101228376B1 (ko) 2002-07-18 2013-01-31 사이토스 바이오테크놀로지 아게 합텐-캐리어 컨쥬게이트 및 그의 용도
RU2450827C2 (ru) * 2002-07-19 2012-05-20 Цитос Биотехнологи Аг Композиции вакцин, содержащие наборы антигенов в виде амилоида бета 1-6
US20040076645A1 (en) * 2002-07-19 2004-04-22 Bachmann Martin F. Ghrelin-carrier conjugates
AU2003263212A1 (en) * 2002-08-14 2004-03-03 Avidis Sa Heteropolymeric compound comprising a scaffold, an adjuvant and an antigen, and its use
DK2261249T3 (en) 2002-09-12 2015-02-16 Oncotherapy Science Inc KDR peptides and vaccines comprising the same
BR0314619A (pt) * 2002-09-18 2005-08-02 Univ Montreal Ct Hospitalier Chum Análogos de ghrh
CA2504129A1 (en) * 2002-11-01 2004-05-21 Promega Corporation Cell lysis compositions, methods of use, apparatus, and kit
EP1419786A1 (en) * 2002-11-13 2004-05-19 Bracco Imaging S.p.A. Method for the selective and quantitative functionalization of immunoglobulin fab fragments, conjugate compounds obtained with the same and compositions thereof
WO2004047728A2 (en) * 2002-11-26 2004-06-10 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
EP1608316A4 (en) * 2003-03-24 2007-08-15 Mercia Pharma Inc METHOD AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT AND PREVENTION OF INFLAMMATORY CONDITIONS
RU2351362C2 (ru) 2003-03-26 2009-04-10 Цитос Байотекнолоджи Аг КОНЪЮГАТЫ ПЕПТИДА Melan-A, АНАЛОГА ВИРУСОПОДОБНОЙ ЧАСТИЦЫ
US7537767B2 (en) 2003-03-26 2009-05-26 Cytis Biotechnology Ag Melan-A- carrier conjugates
DE602004031017D1 (de) * 2003-07-10 2011-02-24 Cytos Biotechnology Ag Zusammensetzung verpackte virusartige teilchen umfassend zur verstärkung einer immunantwort
BRPI0415204A (pt) * 2003-10-10 2006-12-05 Powderject Vaccines Inc construção de ácido nucleico, métodos de obtenção da expressão em células de mamìferos de um polipeptìdeo de interesse, e de imunização com ácido nucleico, partìculas revestidas, receptáculo de dosagem para um dispositivo de liberação mediada por partìculas, dispositivo de liberação mediada por partìculas, e, sequência de promotor quimérico isolada purificada
US7923109B2 (en) * 2004-01-05 2011-04-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Inorganic nanowires
WO2005068639A2 (en) * 2004-01-20 2005-07-28 Cytos Biotechnology Ag Particle-induced ghrelin immune response
US20050244400A1 (en) 2004-02-10 2005-11-03 Zystor Therapeutics, Inc. Acid alpha-glucosidase and fragments thereof
KR101013999B1 (ko) * 2004-03-19 2011-02-14 재단법인서울대학교산학협력재단 표면에 골조직 형성 증진 펩타이드가 고정된 차폐막 및임플란트
CN1960752A (zh) * 2004-06-02 2007-05-09 赛托斯生物技术公司 非人类tnf－肽的载体偶联物的医药用途
US20080019991A1 (en) * 2004-06-02 2008-01-24 Cytos Biotechnology Ag Carrier Conjugates Of Tnf-Peptides
JP2008513035A (ja) * 2004-09-21 2008-05-01 サイトス バイオテクノロジー アーゲー Ａｐ２０５のコートタンパク質と抗原性ポリペプチドとの融合タンパク質を含んでなるウイルス粒子
CN101052411B (zh) * 2004-10-05 2011-04-06 赛托斯生物技术公司 Vlp-抗原偶联物及其作为疫苗的用途
JP2008517975A (ja) * 2004-10-25 2008-05-29 サイトス バイオテクノロジー アーゲー 胃酸分泌抑制ポリペプチド（ｇｉｐ）抗原アッセイ及びその使用
EP1804829A1 (en) * 2004-10-29 2007-07-11 Cytos Biotechnology AG T-cadherin antigen arrays and uses thereof
GB0424563D0 (en) 2004-11-05 2004-12-08 Novartis Ag Organic compounds
AU2011253800B2 (en) * 2004-11-05 2013-08-22 Novartis Ag Composition comprising VLP and amyloid-beta peptide
ATE492563T1 (de) 2004-11-17 2011-01-15 Amgen Inc Vollständige humane monoklonale antikörper gegen il-13
US7767212B2 (en) 2005-03-18 2010-08-03 Cytos Biotechnology Ag CAT allergen conjugates and uses thereof
EP1746165A1 (en) 2005-07-21 2007-01-24 Cytos Biotechnology AG Scalable fermentation process
WO2006125821A2 (en) * 2005-05-26 2006-11-30 Cytos Biotechnology Ag Scalable fermentation process
EP1736538A1 (en) 2005-06-21 2006-12-27 Cytos Biotechnology AG Process for the preparative purification of virus-like-particles (VLPs)
CN103230590A (zh) 2005-09-28 2013-08-07 赛托斯生物技术公司 白介素-1偶联物及其用途
US8497072B2 (en) 2005-11-30 2013-07-30 Abbott Laboratories Amyloid-beta globulomer antibodies
PL2289909T3 (pl) 2005-11-30 2015-04-30 Abbvie Inc Sposób przeszukiwania, proces oczyszczania niedyfundujących oligomerów Abeta, selektywne przeciwciała przeciw niedyfundującym oligomerom Abeta i sposób wytwarzania tych przeciwciał
EP1973608A1 (en) 2005-12-14 2008-10-01 Cytos Biotechnology AG Immunostimulatory nucleic acid packaged particles for the treatment of hypersensitivity
AT503690A1 (de) * 2006-06-09 2007-12-15 Biomay Ag Hypoallergene moleküle
WO2007144150A1 (en) 2006-06-12 2007-12-21 Cytos Biotechnology Ag Processes for packaging oligonucleotides into virus-like particles of rna bacteriophages
CA2655933C (en) * 2006-06-23 2014-09-09 Alethia Biotherapeutics Inc. Polynucleotides and polypeptide sequences involved in cancer
EP2043681B1 (en) 2006-07-14 2015-10-07 Sanofi Pasteur Biologics, LLC Construction of recombinant virus vaccines by direct transposon-mediated insertion of foreign immunologic determinants into vector virus proteins
BRPI0603490B1 (pt) * 2006-07-21 2018-04-24 Universidade Federal De Minas Gerais Vacina recombinante contra a leishmaniose visceral canina
JP2010504760A (ja) 2006-09-29 2010-02-18 サノフィ パスツール バイオロジクス カンパニー 組換え型ライノウイルスベクター
US8455626B2 (en) 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
WO2008104386A2 (en) * 2007-02-27 2008-09-04 Abbott Gmbh & Co. Kg Method for the treatment of amyloidoses
ES2337113B1 (es) 2007-04-17 2011-01-24 Centre De Recerca En Sanitat Animal (Cresa) Empleo de la hemaglutinina del virus de la peste porcina africana como adyuvante.
EP2012122A1 (en) * 2007-07-06 2009-01-07 Medigene AG Mutated parvovirus structural proteins as vaccines
ES2331271B1 (es) 2007-06-29 2010-10-14 Universidad Del Pais Vasco Metodo para la internalizacion de bacterias no invasivas en celulas eucariotas.
AU2008288283B2 (en) * 2007-08-15 2013-01-31 Circassia Limited Peptides for desensibilization against allergens
TWI436775B (zh) 2007-08-24 2014-05-11 Oncotherapy Science Inc 以抗原胜肽合併化療藥劑治療胰臟癌
ES2327375B1 (es) 2007-11-14 2010-08-05 Universidad Del Pais Vasco Empleo de microparticulas para su uso como vacunas y la liberacion de moleculas biologicamente activas.
US20110207673A1 (en) * 2007-11-20 2011-08-25 Ashutosh Chilkoti Methods and compositions for modulating drug-polymer architecture, pharmacokinetics and biodistribution
AU2009244148B2 (en) 2008-05-07 2014-10-09 Biomarin Pharmaceutical Inc. Lysosomal targeting peptides and uses thereof
WO2010042743A2 (en) * 2008-10-08 2010-04-15 Chimeros Inc. Chimeric multiplexes, compositions, and methods for using same
WO2010060186A1 (en) 2008-11-03 2010-06-03 Alethia Biotherapeutics Inc. Antibodies that specifically block the biological activity of a tumor antigen
CN102245198B (zh) 2008-12-09 2016-08-17 辉瑞疫苗有限责任公司 IgE CH3肽疫苗
WO2010122164A1 (en) 2009-04-23 2010-10-28 Cytos Biotechnology Ag VIRUS-LIKE PARTICLES OF BACTERIOPHAGE φCB5
NZ596058A (en) * 2009-04-30 2013-08-30 Cytos Biotechnology Ag Influenza hemagglutinin compositions and uses thereof
WO2010129578A1 (en) * 2009-05-06 2010-11-11 Cornell Research Foundation, Inc. E. coli lpfa antigen for prevention and treatment of infectious diseases
TW201109029A (en) 2009-06-11 2011-03-16 Oncotherapy Science Inc Vaccine therapy for choroidal neovascularization
US8993715B2 (en) * 2009-07-06 2015-03-31 Canon Kabushiki Kaisha Labeled protein and method for obtaining the same
RU2518291C2 (ru) * 2009-07-30 2014-06-10 Пфайзер Вэксинс ЭлЭлСи Антигенные tau-пептиды и их применения
SG178447A1 (en) * 2009-09-03 2012-03-29 Pfizer Vaccines Llc Pcsk9 vaccine
JP2013504539A (ja) 2009-09-10 2013-02-07 サイトス バイオテクノロジー アーゲー 糖尿病治療におけるインターロイキン１βムテイン・コンジュゲートの使用
US9301997B2 (en) 2009-09-21 2016-04-05 Peptinov Sas Method of vaccination for limiting articular inflammation in rheumatoid arthritis and multiple sclerosis by administering IL-23 peptides
US8987419B2 (en) 2010-04-15 2015-03-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Amyloid-beta binding proteins
EP2942061A3 (en) 2010-06-07 2016-01-13 Pfizer Vaccines LLC Ige ch3 peptide vaccine
CA2808187A1 (en) 2010-08-14 2012-02-23 Abbvie Inc. Amyloid-beta binding proteins
WO2012131504A1 (en) 2011-03-02 2012-10-04 Pfizer Inc. Pcsk9 vaccine
DK3173427T3 (da) 2011-03-31 2019-08-05 Adc Therapeutics Sa Antistoffer mod nyre-associeret antigen 1 og antigen-bindende fragmenter deraf
EA201490381A1 (ru) 2011-07-29 2014-06-30 Селекта Байосайенсиз, Инк. Синтетические наноносители, которые стимулируют формирование гуморального иммунного ответа и иммунного ответа, опосредованного цитотоксическими т-лимфоцитами (ctl)
AR089440A1 (es) 2011-12-21 2014-08-20 Apse Llc Procesos que emplean particulas similares a virus (psv) con capsides resistentes a hidrolasas
RS58918B1 (sr) 2012-01-09 2019-08-30 Adc Therapeutics Sa Agensi za tretman trostruko negativnog raka dojke
AU2013207962B2 (en) * 2012-01-12 2017-07-20 Unm Rainforest Innovations Immunogenic HPV L2-containing VLPs and related compositions and methods
ES2428405B1 (es) 2012-03-29 2014-06-02 Universidad De Valladolid Vehiculización de moléculas antigénicas en polímeros recombinantes similares a elastina
US20160000901A1 (en) * 2013-03-05 2016-01-07 Shifa Biomedical Compositions and Methods for the Production of Virus-Like Particles
US10392611B2 (en) 2013-05-30 2019-08-27 Duke University Polymer conjugates having reduced antigenicity and methods of using the same
US10364451B2 (en) 2013-05-30 2019-07-30 Duke University Polymer conjugates having reduced antigenicity and methods of using the same
US9822361B2 (en) 2013-06-19 2017-11-21 Apse, Inc. Compositions and methods using capsids resistant to hydrolases
WO2015017280A1 (en) 2013-07-28 2015-02-05 Qantu Therapeutics, Inc. Vaccine formulations that induce a th2 immune response
US9017698B2 (en) * 2013-09-25 2015-04-28 Sequoia Sciences, Inc. Compositions of vaccines and adjuvants and methods for the treatment of urinary tract infections
WO2015101666A1 (en) 2014-01-03 2015-07-09 Fundación Biofísica Bizkaia VLPs, METHODS FOR THEIR OBTENTION AND APPLICATIONS THEREOF
EP3104877B1 (en) 2014-02-11 2020-01-22 The USA, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Pcsk9 vaccine and methods of using the same
WO2015171395A2 (en) * 2014-05-05 2015-11-12 Purdue Research Foundation Degradation resistant peptide based biosensors
EP3191131A4 (en) * 2014-08-21 2018-09-05 The General Hospital Corporation Tumor necrosis factor superfamily and tnf-like ligand muteins and methods of preparing and using the same
US10385115B2 (en) 2015-03-26 2019-08-20 Duke University Fibronectin type III domain-based fusion proteins
BR112017022205A2 (pt) * 2015-04-14 2018-08-28 Academia Sinica anticorpo anti-vegfr2 humano para terapia de câncer antiangiogênica e objetivada
BR112018002342A2 (pt) 2015-08-04 2018-12-11 Univ Duke polímeros furtivos intrinsecamente desordenados e geneticamente modificados para entrega e métodos para uso dos mesmos
WO2017042212A1 (en) 2015-09-08 2017-03-16 Universität Zürich Treatment of insect bite hypersensitivity
US11752213B2 (en) 2015-12-21 2023-09-12 Duke University Surfaces having reduced non-specific binding and antigenicity
WO2017123652A1 (en) 2016-01-11 2017-07-20 Verndari, Inc. Microneedle compositions and methods of using same
WO2017179025A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Alk-Abelló A/S Epitope polypeptides of ragweed pollen allergens
FR3051192B1 (fr) 2016-05-13 2020-12-25 Univ De Lorraine Methode de purification de proteines recombinantes par affinite basee sur l'activite lectinique du domaine crd d'une galectine
WO2017210476A1 (en) 2016-06-01 2017-12-07 Duke University Nonfouling biosensors
US11053301B2 (en) 2016-07-18 2021-07-06 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions relating to covalently circularized nanodiscs
CN109890833A (zh) 2016-09-14 2019-06-14 杜克大学 用于递送亲水性药物的基于三嵌段多肽的纳米粒子
CN110023326A (zh) 2016-09-23 2019-07-16 杜克大学 具有lcst行为的非结构化无重复多肽
WO2018132732A1 (en) 2017-01-12 2018-07-19 Duke University Genetically encoded lipid-polypeptide hybrid biomaterials that exhibit temperature triggered hierarchical self-assembly
CN110662548B (zh) * 2017-02-17 2024-07-16 卡姆瑞斯国际公司 通用抗毒液素
WO2018162577A1 (en) 2017-03-07 2018-09-13 Universität Zürich Treatment of pruritus in horses
US20220009987A9 (en) * 2017-04-14 2022-01-13 The Regents Of The University Of California Human resistin compositions and methods of treating tlr4-mediated disease and infection
WO2018213320A1 (en) 2017-05-15 2018-11-22 Duke University Recombinant production of hybrid lipid-biopolymer materials that self-assemble and encapsulate agents
WO2019006374A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Duke University ORDER AND DISORDER AS A DESIGN PRINCIPLE FOR STIMULI-SENSITIVE BIOPOLYMER NETWORKS
CN107703294B (zh) * 2017-10-12 2019-06-04 华派生物工程集团有限公司 一种用于检测鸡血清中cLHRH抗体效价的ELISA方法
US11633471B2 (en) 2018-03-06 2023-04-25 Unm Rainforest Innovations Compositions and methods for reducing serum triglycerides
KR102529094B1 (ko) 2018-04-05 2023-05-08 엘지전자 주식회사 냉장고
EP3781689A1 (en) 2018-04-19 2021-02-24 Checkmate Pharmaceuticals, Inc. Synthetic rig-i-like receptor agonists
WO2019228990A1 (en) 2018-05-28 2019-12-05 Evax Ag Treatment of urticaria
WO2020028806A1 (en) 2018-08-02 2020-02-06 Duke University Dual agonist fusion proteins
AU2020246504B2 (en) * 2019-03-25 2024-02-15 Immunwork Inc. Composite polypeptide having a metal binding motif and molecular construct comprising the same
US11512314B2 (en) 2019-07-12 2022-11-29 Duke University Amphiphilic polynucleotides
JP2022554175A (ja) 2019-10-23 2022-12-28 チェックメイト ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 合成ｒｉｇ－ｉ様受容体アゴニスト
WO2021083766A1 (en) 2019-10-29 2021-05-06 Evax Ag Treatment of pruritus in horses
US20230063876A1 (en) * 2020-03-02 2023-03-02 Unm Rainforest Innovations Virus-Like Particle Vaccines for Opioid Drugs
CA3185429A1 (en) 2020-06-12 2021-12-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Bacterial immunization using nanoparticle vaccine
MX2023003009A (es) * 2020-09-17 2023-04-10 Othair Prothena Ltd Vacuna de beta-amiloide para el tratamiento de la enfermedad de alzheimer.
US12121574B2 (en) 2021-09-28 2024-10-22 Unm Rainforest Innovations Malaria immunogen and methods for using same
WO2023111826A1 (en) 2021-12-14 2023-06-22 Glaxosmithkline Biologicals Sa Bacterial immunization using qbeta hairpin nanoparticle constructs
WO2023133509A2 (en) * 2022-01-08 2023-07-13 Carogen Corporation Multi-antigen therapeutic vaccines to treat or prevent chronic hepatitis b virus infection
WO2023139103A1 (en) 2022-01-19 2023-07-27 Universität Bern Compositions of virus-like particles and microcrystalline tyrosine
WO2024047091A2 (en) 2022-08-30 2024-03-07 Saiba Animal Health Ag Veterinary compositions of modified virus-like particles of cmv and ngf antigens

Family Cites Families (107)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US522013A (en) * 1894-06-26 Wardrobe-bedstead
US4722840A (en) 1984-09-12 1988-02-02 Chiron Corporation Hybrid particle immunogens
JPS61250560A (ja) * 1985-04-30 1986-11-07 Toshiba Corp 免疫分析方法
US4666829A (en) * 1985-05-15 1987-05-19 University Of California Polypeptide marker for Alzheimer's disease and its use for diagnosis
US5374426A (en) * 1986-09-03 1994-12-20 University Of Saskatchewan Rotavirus nucleocapsid protein VP6 in vaccine compositions
CA1319101C (en) 1986-09-03 1993-06-15 Marta Iris Sabara Rotavirus nucleocapsid protein with or without binding peptides as immunologic carriers for macromolecules
ATE108067T1 (de) 1986-09-22 1994-07-15 Univ Emory Impfstoff und verfahren zur herstellung.
US5220013A (en) 1986-11-17 1993-06-15 Scios Nova Inc. DNA sequence useful for the detection of Alzheimer's disease
US5187153A (en) * 1986-11-17 1993-02-16 Scios Nova Inc. Methods of treatment using Alzheimer's amyloid polypeptide derivatives
US5223482A (en) 1986-11-17 1993-06-29 Scios Nova Inc. Recombinant Alzheimer's protease inhibitory amyloid protein and method of use
WO1988003951A1 (en) 1986-11-17 1988-06-02 California Biotechnology, Inc. Recombinant alzheimer's amyloid protein
US5143726A (en) * 1986-12-09 1992-09-01 The Scripps Research Institute T cell epitopes of the hepatitis B virus nucleocapsid protein
GB8903313D0 (en) 1989-02-14 1989-04-05 Wellcome Found Conjugates
US5703055A (en) * 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
GB8913737D0 (en) * 1989-06-15 1989-08-02 Univ Birmingham A novel anti-allergy treatment
DE69018926T2 (de) 1989-09-04 1995-08-24 Wellcome Found Vakzine gegen Bordetella.
DE69126304T2 (de) 1990-04-27 1997-09-04 Mcmichael, John, Delanson, N.Y. Verfahren und zusammensetzung zur behandlung von erkrankungen des zns hervorgerufen durch abnormales beta-amyloid-protein
US5753624A (en) 1990-04-27 1998-05-19 Milkhaus Laboratory, Inc. Materials and methods for treatment of plaquing disease
US6174916B1 (en) * 1990-04-27 2001-01-16 Milkhaus Laboratory, Ltd. Methods for treating herpes virus infections
US5178882A (en) 1990-06-22 1993-01-12 The Regents Of The University Of California Viral decoy vaccine
US5334394A (en) 1990-06-22 1994-08-02 The Regents Of The University Of California Human immunodeficiency virus decoy
SE9003978D0 (sv) 1990-12-13 1990-12-13 Henrik Garoff Dna expressionssystem baserade paa ett virus replikon
FR2670800B1 (fr) 1990-12-19 1994-05-20 Gaches Chimie Sa Procede de traitement de peaux ou cuirs, agents de tannage et procede de fabrication.
WO1992011291A1 (en) 1990-12-20 1992-07-09 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Vaccines based on hepatitis b surface antigen
GB9114003D0 (en) * 1991-06-28 1991-08-14 Mastico Robert A Chimaeric protein
ZA934199B (en) 1992-06-18 1994-01-10 Akzo Nv Carrier system against gnrh
GB9213601D0 (en) * 1992-06-26 1992-08-12 Mastico Robert A Protein based delivery system
FR2695563B1 (fr) 1992-09-11 1994-12-02 Pasteur Institut Microparticules portant des antigènes et leur utilisation pour l'induction de réponses humorales ou cellulaires.
US6004763A (en) * 1992-09-11 1999-12-21 Institut Pasteur Antigen-carrying microparticles and their use in the induction of humoral or cellular responses
GB2271826B (en) 1992-10-26 1996-06-05 British Gas Plc Apparatus for bending plastic tube
JPH08505625A (ja) 1993-01-11 1996-06-18 ダナ−ファーバー キャンサー インスティチュート 細胞毒性ｔリンパ球応答の誘導
WO1994017813A1 (en) 1993-02-08 1994-08-18 Paravax, Inc. Defective sindbis virus vectors that express toxoplasma gondii p30 antigens
US6015686A (en) 1993-09-15 2000-01-18 Chiron Viagene, Inc. Eukaryotic layered vector initiation systems
US5602301A (en) * 1993-11-16 1997-02-11 Indiana University Foundation Non-human mammal having a graft and methods of delivering protein to myocardial tissue
US5652223A (en) * 1994-03-14 1997-07-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services DNA encoding CAI resistance proteins and uses thereof
US6727230B1 (en) * 1994-03-25 2004-04-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
AU686818B2 (en) 1994-05-25 1998-02-12 John Mcmichael Materials and methods for treatment of plaquing diseases
US6239116B1 (en) * 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6207646B1 (en) * 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6429199B1 (en) * 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
AT402898B (de) 1994-08-08 1997-09-25 Int Centre Genetic Eng & Bio Molekulares präsentiersystem
US5589154A (en) * 1994-11-22 1996-12-31 Rutgers, The State University Of New Jersey Methods for the prevention or treatment of vascular hemorrhaging and Alzheimer's disease
US5935821A (en) 1995-01-17 1999-08-10 Board Of Trustees Of The University Of Kentucky Polynucleotides related to monoclonal antibody 1A7 and use for the treatment of melanoma and small cell carcinoma
US6319498B1 (en) * 1995-03-14 2001-11-20 Praecis Pharmaceuticals Incorporated Modulators of amyloid aggregation
US6303567B1 (en) * 1995-03-14 2001-10-16 Praecis Pharmaceuticals, Inc . Modulators of β-amyloid peptide aggregation comprising D-amino acids
US5817626A (en) * 1995-03-14 1998-10-06 Praecis Pharmaceuticals Incorporated Modulators of beta-amyloid peptide aggregation
US5854215A (en) * 1995-03-14 1998-12-29 Praecis Pharmaceuticals Incorporated Modulators of β-amyloid peptide aggregation
WO1996030523A2 (en) 1995-03-31 1996-10-03 Hans Wolf Antigen presentation system based on retrovirus-like particles
US5792462A (en) 1995-05-23 1998-08-11 University Of North Carolina At Chapel Hill Alphavirus RNA replicon systems
US5835821A (en) * 1995-09-28 1998-11-10 Canon Kabushiki Kaisha Image forming apparatus
US5985242A (en) * 1995-10-27 1999-11-16 Praecis Pharmaceuticals, Inc. Modulators of β-amyloid peptide aggregation comprising D-amino acids
US6277826B1 (en) * 1996-08-27 2001-08-21 Praecis Pharmaceuticals, Inc. Modulators of β-amyloid peptide aggregation comprising D-amino acids
IL125590A (en) 1996-03-01 2001-08-26 Novartis Ag Peptide immunogens, process for their preparation and use thereof as vaccines against allergies
US6117992A (en) 1996-08-26 2000-09-12 Hybridon, Inc. Reagents and process for synthesis of oligonucleotides containing phosphorodithioate internucleoside linkages
US5770380A (en) * 1996-09-13 1998-06-23 University Of Pittsburgh Synthetic antibody mimics--multiple peptide loops attached to a molecular scaffold
GB9621091D0 (en) 1996-10-09 1996-11-27 Fondation Pour Le Perfectionem Attenuated microorganisms strains and their uses
US6084668A (en) 1997-07-10 2000-07-04 American Air Liquide Inc. In-line cell for absorption spectroscopy
DK0996717T3 (da) 1997-08-05 2006-04-10 Vlaams Interuniv Inst Biotech Immunbeskyttende influenzaantigen og anvendelse deraf til vaccination
US6169175B1 (en) 1997-08-06 2001-01-02 Centers For Disease Control And Prevention Preparation and use of recombinant influenza A virus M2 construct vaccines
US6054312A (en) * 1997-08-29 2000-04-25 Selective Genetics, Inc. Receptor-mediated gene delivery using bacteriophage vectors
US6703015B1 (en) * 1999-09-03 2004-03-09 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Filamentous bacteriophage displaying an β-amyloid epitope
TWI239847B (en) 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
WO1999027949A1 (en) 1997-12-03 1999-06-10 Brigham And Women's Hospital METHOD OF SUPPRESSING β-AMYLOID-RELATED CHANGES IN ALZHEIMER'S DISEASE
US6231864B1 (en) 1998-02-12 2001-05-15 Immune Complex Corporation Strategically modified hepatitis B core proteins and their derivatives
DE69927249T2 (de) 1998-03-27 2006-06-29 Cytos Biotechnology Ag Induzierendes alphavirengen- expressionssystem
US5990085A (en) 1998-05-04 1999-11-23 Michigan State University Inhibin-HBc fusion protein
TWI227241B (en) 1998-06-20 2005-02-01 United Biomedical Inc IgE-CH3 domain antigen peptide, peptide conjugate containing the same, and pharmaceutical composition for treating allergies containing the peptide conjugate
US6927278B1 (en) * 1998-09-01 2005-08-09 Trustees Of The University Of Pennsylvania Peptide scaffolds for transfer of molecules into eukaryotic cells
CA2347411C (en) * 1998-10-21 2012-04-03 The Government Of The United States Of America Virus-like particles for the induction of autoantibodies
US6548651B1 (en) * 1998-11-11 2003-04-15 Pantheco A/S Modified peptide nucleic acid (PNA) molecules
US6380364B1 (en) * 1998-11-23 2002-04-30 Loyola University Of Chicago Chimeric biotin-binding papillomavirus protein
EP1135162B1 (en) 1998-11-30 2008-10-29 Cytos Biotechnology AG Ordered molecular presentation of allergens, method of preparation and use
KR100715954B1 (ko) * 1998-12-04 2007-05-09 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 펩티드 리간드에 의하여 부착된 다중 면역원성 성분을보유한 ｈｂｖ 코어 항원 입자
CN1520423A (zh) 1999-02-25 2004-08-11 ʷ��˿�������ȳ�ķ���޹�˾ 来源于IgE的Cε3或Cε4区的抗原决定基或拟表位,其拮抗物,及其治疗用途
EP1173467A4 (en) 1999-04-07 2005-12-28 Univ Jefferson CHEMOKIN DERIVED SYNTHETIC PEPTIDES
US20020052311A1 (en) * 1999-09-03 2002-05-02 Beka Solomon Methods and compostions for the treatment and/or diagnosis of neurological diseases and disorders
ES2344189T3 (es) 1999-09-03 2010-08-20 RAMOT UNIVERSITY AUTHORITY FOR APPLIED RESEARCH &amp; INDUSTRIAL DEVELOPMENT LTD. Agentes, composiciones y metodos que los utilizan utiles en el tratamiento o la prevencion de la enfermedad de alzheimer.
KR100879810B1 (ko) * 2000-02-21 2009-01-22 하. 룬드벡 아크티에셀스카브 아밀로이드의 하향-조절을 위한 신규한 방법
JP5025871B2 (ja) 2000-02-21 2012-09-12 エイチ．リュンドベック エイ／エス アミロイドの新規なダウン−レギュレート方法
CA2407897A1 (en) 2000-05-05 2001-11-15 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen arrays and vaccines
US7018638B2 (en) * 2000-12-19 2006-03-28 Wyeth Mycoplasma hyopneumoniae bacterin vaccine
US7320793B2 (en) * 2001-01-19 2008-01-22 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen array
US7094409B2 (en) * 2001-01-19 2006-08-22 Cytos Biotechnology Ag Antigen arrays for treatment of allergic eosinophilic diseases
US7128911B2 (en) * 2001-01-19 2006-10-31 Cytos Biotechnology Ag Antigen arrays for treatment of bone disease
US7097837B2 (en) * 2001-02-19 2006-08-29 Pharmexa A/S Synthetic vaccine agents
MY144532A (en) 2001-08-20 2011-09-30 Lundbeck & Co As H Novel method for down-regulation of amyloid
DE60234375D1 (de) * 2001-09-14 2009-12-24 Cytos Biotechnology Ag VERPACKUNG VON IMMUNSTIMULIERENDEM CpG IN VIRUSÄHNLICHEN PARTIKELN: HERSTELLUNGSVERFAHREN UND VERWENDUNG
US7115266B2 (en) * 2001-10-05 2006-10-03 Cytos Biotechnology Ag Angiotensin peptide-carrier conjugates and uses thereof
ES2321491T3 (es) * 2001-10-05 2009-06-08 Cytos Biotechnology Ag Conjugados que llevan peptido angiotensina y uso de los mismos.
WO2003039225A2 (en) * 2001-11-07 2003-05-15 Cytos Biotechnology Ag Antigen arrays comprising rankl for treatment of bone disease
BR0213950A (pt) * 2001-11-07 2004-08-24 Cytos Biotechnology Ag Arranjos de antìgenos para o tratamento de doenças eosinofólicas alérgicas
EP1487875A2 (en) 2002-03-20 2004-12-22 Health Protection Agency Antibody that binds to a dimer of a prion protein for the treatment of tse infection
DE10228059B4 (de) * 2002-06-19 2005-12-29 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Verwendung von amphiphilen Nucleosid-Phosphonoameisensäure-Derivaten zur Behandlung von viralen Infektionskrankheiten
EP1532167B1 (en) * 2002-07-17 2012-01-25 Cytos Biotechnology AG Molecular antigen arrays using a virus like particle derived from the ap205 coat protein
KR101228376B1 (ko) * 2002-07-18 2013-01-31 사이토스 바이오테크놀로지 아게 합텐-캐리어 컨쥬게이트 및 그의 용도
RU2450827C2 (ru) * 2002-07-19 2012-05-20 Цитос Биотехнологи Аг Композиции вакцин, содержащие наборы антигенов в виде амилоида бета 1-6
US20040076645A1 (en) * 2002-07-19 2004-04-22 Bachmann Martin F. Ghrelin-carrier conjugates
US7537767B2 (en) * 2003-03-26 2009-05-26 Cytis Biotechnology Ag Melan-A- carrier conjugates
RU2351362C2 (ru) * 2003-03-26 2009-04-10 Цитос Байотекнолоджи Аг КОНЪЮГАТЫ ПЕПТИДА Melan-A, АНАЛОГА ВИРУСОПОДОБНОЙ ЧАСТИЦЫ
US6946769B2 (en) * 2003-05-08 2005-09-20 Asmo Co., Ltd. Insulator and manufacturing method thereof, and stator for electric rotating machine
KR101147064B1 (ko) 2003-07-24 2012-05-22 더 퀸스 메디컬 센터 알킬화제의 제조 및 용도
JP2008513035A (ja) * 2004-09-21 2008-05-01 サイトス バイオテクノロジー アーゲー Ａｐ２０５のコートタンパク質と抗原性ポリペプチドとの融合タンパク質を含んでなるウイルス粒子
CN101052411B (zh) * 2004-10-05 2011-04-06 赛托斯生物技术公司 Vlp-抗原偶联物及其作为疫苗的用途
JP2008517975A (ja) * 2004-10-25 2008-05-29 サイトス バイオテクノロジー アーゲー 胃酸分泌抑制ポリペプチド（ｇｉｐ）抗原アッセイ及びその使用
NZ555590A (en) * 2004-12-13 2009-07-31 Cytos Biotechnology Ag Compositions comprising a VLP and IL-15 protein
US7767212B2 (en) * 2005-03-18 2010-08-03 Cytos Biotechnology Ag CAT allergen conjugates and uses thereof
EP1982729A1 (en) * 2007-04-20 2008-10-22 Cytos Biotechnology AG Vaccination Regimen for B-Cell Vaccines

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