ES2316628T3 - Disposicion ordenada de antigenos que comprende rankl para el tratamiento de enfermedades oseas. - Google Patents

Disposicion ordenada de antigenos que comprende rankl para el tratamiento de enfermedades oseas. Download PDF

Info

Publication number
ES2316628T3
ES2316628T3 ES02779538T ES02779538T ES2316628T3 ES 2316628 T3 ES2316628 T3 ES 2316628T3 ES 02779538 T ES02779538 T ES 02779538T ES 02779538 T ES02779538 T ES 02779538T ES 2316628 T3 ES2316628 T3 ES 2316628T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
baselineskip
rankl
seq
antigen
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES02779538T
Other languages
English (en)
Inventor
Martin Bachmann
Patrik Maurer
Gunther Spohn
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cytos Biotechnology AG
Original Assignee
Cytos Biotechnology AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US10/050,902 external-priority patent/US7264810B2/en
Application filed by Cytos Biotechnology AG filed Critical Cytos Biotechnology AG
Application granted granted Critical
Publication of ES2316628T3 publication Critical patent/ES2316628T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/35—Allergens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0007—Nervous system antigens; Prions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/521—Chemokines
    • C07K14/523—Beta-chemokines, e.g. RANTES, I-309/TCA-3, MIP-1alpha, MIP-1beta/ACT-2/LD78/SCIF, MCP-1/MCAF, MCP-2, MCP-3, LDCF-1, LDCF-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5409—IL-5
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5437—IL-13
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • C07K16/082—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig
    • C07K16/4291—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig against IgE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6075—Viral proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • A61K2039/627—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier characterised by the linker
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Una composición que comprende: (a) una partícular similar a virus de un fago de ARN; y (b) por lo menos un antígeno o determinante antigénico, en donde dicho antígeno o dicho determinante antigénico es una proteína RANKL, un fragmento RANKL o un péptido RANKL, y en donde dicho por lo menos un antígeno o determinante antigénico está unido a dicha partícula similar a virus por al menos un enlace covalente no peptídico.

Description

Disposición ordenada de antígenos que comprende RANKL para el tratamiento de enfermedades óseas.
Campo de la invención
La presente invención está relacionada con los campos de biología molecular, virología, inmunología y medicina. La invención proporciona una composición que comprende:
(a) una partícula similar a virus de un fago de ARN; y
(b) por lo menos un antígeno o determinante antigénico, en donde el antígeno o determinante antigénico es una proteína RANKL, un fragmento RANKL o un péptido RANKL, y
en donde por lo menos un antígeno o determinante antigénico está unido a una partícula similar a virus por al menos un enlace covalente no peptídico.
La invención proporciona también un proceso para producir la composición. Las composiciones de la invención son útiles en la producción de vacunas para el tratamiento de enfermedades óseas y como una vacuna farmacéutica para prevenir o curar enfermedades óseas y para inducir eficientemente respuestas inmunes, en particular respuestas de anticuerpos. Más aún, las composiciones de la invención son particularmente útiles para inducir eficientemente respuestas inmunes auto-específicas en el contexto indicado.
Técnica relacionada
El hueso vivo es permanentemente renovado por procesos de remodelación balanceados y coordinados. Principalmente dos tipos de células contribuyen a esta remodelación: los osteoblastos son esenciales para la formación de hueso mientras que los osteoclastos promueven la disolución de la matriz ósea y la solubilización de la hidroxiapatita. En individuos jóvenes con huesos en crecimiento, la velocidad de formación de huesos excede la velocidad de resorción de hueso, mientras que en individuos más mayores la velocidad de resorción puede exceder la de formación y dar como resultado una pérdida neta de la densidad mineral ósea y/o masa ósea. En este último caso, la resistencia de los huesos es debilitada y lleva a un riesgo incrementado de fracturas así como a una reparación lenta o incompleta de los huesos rotos. Se sabe que varias condiciones en humanos están asociadas con un desequilibrio en la remodelación ósea.
Recientemente se han descrito tres proteínas que están implicadas crucialmente en la formación de osteoclastos a partir de células precursoras hematopoyéticas y la regulación de la remodelación ósea. RANKL (Activador Receptor de Ligando NFkB) el cual se conoce también como TNFSF11 (miembro 11 de la superfamilia de factor de necrosis tumoral), TRANCE (citocina inducida por activación relacionada con FNT), ODF (Factor de diferenciación de osteoclastos) u OPGL (ligando de osteoprotegerina) es una proteína de transmembrana de 245 aminoácidos que forma homotrímeros. Parte de la región extracelular de RANKL puede ser esparcida por una proteasa tipo TACE. Además, se han descrito variantes de empalme que carecen de la región de transmembrana. La parte esparcida de RANKL contiene el dominio que es altamente homólogo al FNT-\alpha (Lum, L. y otros, J. Biol. Chem. 274:13613-13618 (2000)).
Los procesos acerca de cómo producir proteína RANKL y fragmentos RANKL han sido descritos en los documentos WO 98/46751, US 5.843.678, WO 98/259958, US 6.242.586, WO 98/28426, US 6.242.213, WO 99/29865, JP 2000102390 y WO 00/15807.
RANKL interactúa con una molécula de transmembrana en osteoclastos, llamada RANK (activador receptor de NFkB). Esta interacción lleva a la activación del precursor de osteoclastos y concluye la formación de osteoclastos de resorción de hueso activos. In vivo, un receptor señuelo soluble llamado osteoprotegerina, está implicado en la regulación de la osteoclastogénesis por su capacidad para unirse a RANKL e inhibir la interacción de RANKL con su RANK receptor. Esta inhibición lleva una supresión de la osteoclastogénesis y de esta manera proporciona un medio para detener una resorción ósea excesiva. La interacción de RANKL con su RANK receptor puede ser suprimida por osteoprotegerina recombinante y por una proteína de fusión RANK-Fc soluble. De acuerdo con estos descubrimientos, ratones deficientes en RANKL y RANK desarrollan osteopetrosis mientras que los ratones transgénicos que sobreexpresan RANKL así como los ratones deficientes en osteoprotegerina desarrollan osteoporosis (Kong, YY. y otros, Nature 397:315-322 (1999); Kim, N. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci USA 97:10905-10910 (2000); Dougall, B. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci USA 97:1566-1571 (1999); Bucay, N. y otros, Genes Dev. 12: 1260-1268 (1998)).
La importancia del sistema de RANKL-RANK-osteoprotegerina se confirma más en un modelo de roedor para osteoporosis inducida por deficiencia de estrógenos. La osteoprotegerina recombinante abolió completamente la pérdida ósea inducida por ovariectomía (Simonet, W. S. y otros, Cell 89:309-319 (1997)).
En un modelo de artritis inducida por adyuvantes la inyección de osteoprotegerina fue capaz de prevenir la pérdida ósea y la destrucción de los cartílagos, pero no la inflamación (hinchazón de las patas). Aparte de su expresión en células estromales, RANKL también es expresado en células T, y RANK se encuentra sobre células presentadoras de antígenos. Se asume que durante una reacción artrítica las células T activadas con expresión de RANKL incrementada median un incremento en osteoclastogénesis y pérdida ósea subsecuente. La interacción de RANKL con RANK también incrementa la longevidad y propiedades adyuvantes de las células dendríticas (Kong Y. Y. y otros, Nature 402:304-309 (1999)).
La destrucción ósea alveolar y la subsecuente pérdida de dientes se observa en infecciones periodontales. La inhibición in vivo de la función de RANKL con osteoprotegerina disminuyó la destrucción ósea alveolar y redujo el número de osteoclastos periodontales después del ataque microbiano (Teng, Y. T. A. y otros, J. Clin. Invest. 106:R59-R67 (2000)).
Los tumores óseos y ciertas metástasis tumorales se caracterizan por resorción ósea incrementada debido a una osteoclastogénesis incrementada (Hofbauer, L. C. y Heufelder A. E., J. Clin Endocrin. Met. 85:2355-2363 (2000)). La osteoprotegerina mostró inhibir osteoclastogénesis inducida por cáncer de próstata y prevenir el crecimiento de tumores de próstata en huesos de ratones (Zhang Y. y otros, J. Clin. Invest. 107:1219-1220 (2001)). También disminuyó el dolor de cáncer óseo avanzado en ratones (Luger N. M. y otros, Cancer Res. 61:4038-4047 (2001)). El mieloma múltiple es una malignidad de células B caracterizada por la acumulación de células de plasma en la médula ósea y el desarrollo de enfermedad ósea osteolítica. En modelos de ratón para mieloma múltiple, la inyección de osteoprotegerina o proteína de fusión RANK-Fc previno el desarrollo de lesiones óseas líticas e interfirió con la progresión del mieloma (Pearse RN. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci USA 98:11581-11586 (2001)).
Central para la etiología de una pérdida séptica de implantes prostéticos es la osteólisis periprostética en la interfaz de hueso-implante, la cual es causada por inflamación inducida por restos de desgaste. Los sinoviocitos tipo fibroblasto, transfectados con osteoprotegerina, fueron capaces de prevenir la osteoclastogénesis inducida por restos de desgaste en un modelo de ratón (Gouter J. J. y otros, J. Orthop. Res. 202:169-173 (2002)).
La calcificación vascular se encuentra con alta incidencia clínica en la población de pacientes osteoporósicos. Una implicación del sistema de RANKL-RANK-osteoprotegerina se demuestra por el descubrimiento de que ratones deficientes en osteoprotegerina mostraban calcificación arterial que podía ser revertida por osteoprotegerina recombinante (Min, H. y otros, J. Exp. Med. 192:463-474 (2000)).
Todos estos descubrimientos apuntan a una importancia crucial del sistema de RANKL-RANK-osteoprotegerina en la regulación de la resorción ósea en una variedad de condiciones patológicas. Hasta el momento, la inhibición de la pérdida ósea ha sido demostrada principalmente por la inyección de osteoprotegerina recombinante o de una proteína de fusión RANK-Fc. En forma conceptual, la inmunización de un animal con RANKL debería permitir la producción de anticuerpos específicos para RANKL los cuales, al unirse al sitio de fijación de RANK o inhibición estérica, deberían interferir con la osteoclastogénesis.
Sin embargo, hasta el momento no se ha informado de ninguna vacuna con una proteína o péptido RANKL. Más aún, no ha habido evidencia alguna de que las vacunas pudieran ser efectivas para la protección contra enfermedades óseas en particular, ya que normalmente es difícil inducir respuestas de anticuerpos a auto-moléculas mediante vacunación convencional.
Una forma de mejorar la eficiencia de la vacunación es la de incrementar el grado de carácter repetitivo del antígeno aplicado. A diferencia de las proteínas aisladas, los virus inducen respuestas inmunes rápidas y eficientes en ausencia de cualquier adyuvante tanto con como sin ayuda de células T (Bachmann y Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol.: 15:235-270 (1991)). Aunque los virus consisten comúnmente en pocas proteínas, son capaces de activar respuestas inmunes mucho más fuertes que sus componentes aislados. Para respuestas de células B, se sabe que un factor crucial para la inmunogenicidad de los virus es el carácter repetitivo y orden de epítopes de superficie. Muchos virus exhiben una superficie casi cristalina que despliega una disposición regular de epítopes que entrelaza eficientemente inmunoglobulinas específicas para epítopes sobre células B (Bachmann y Zinkernagel, Immunol. Today 17:553-558 (1996)). Este entrelazamiento de inmunoglobulinas de superficie sobre células B es una fuerte señal de activación que induce directamente la progresión del ciclo celular y la producción de anticuerpos de IgM. Más aún, estas células B activadas son capaces de activar células T auxiliares, las cuales a su vez inducen un cambio de IgM a IgG en la producción de anticuerpos en células B y la generación de una memoria de células B de larga vida: la meta de cualquier vacuna (Bachmann y Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol. 15:235-270 (1997)). La estructura viral está incluso relacionada con la generación de anticuerpos en enfermedades autoinmunes y como una parte de la respuesta natural a patógenos (véase Fehr, T. y otros, J Exp. Med. 185:1785-1792 (1997)). De esta manera, los anticuerpos presentados por una superficie viral altamente organizada son capaces de inducir fuertes respuestas de anti-anticuerpos.
Sin embargo, como se indicó, el sistema inmune normalmente no puede producir anticuerpos contra estructuras auto-derivadas. Para antígenos solubles presentes a bajas concentraciones, esto es debido a la tolerancia al nivel de células Th. Bajo estas condiciones, el acoplamiento del auto-antígeno a un vehículo que pueda suministrar ayuda T podría romper la tolerancia. Para proteínas solubles presentes a altas concentraciones o proteínas de membrana a baja concentración, las células B y Th pueden ser tolerantes. Sin embargo, la tolerancia de las células B puede ser reversible (anergia) y puede ser rota por la administración del antígeno de una manera altamente organizada acoplado a un vehículo extraño (Bachmann y Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol. 15:235-270 (1997)).
En el documento WO 00/23955 se indujeron auto-anticuerpos contra CCR5 y FNT-\alpha acoplados a partículas tipo virus del virus del papiloma.
Breve sumario de la invención
Se ha encontrado ahora que proteínas RANKL, fragmentos RANKL o péptidos RANKL que están unidos a partículas tipo virus (VLP) y subunidades de VLP de fagos de ARN, respectivamente, llevando a conjugados altamente ordenados y repetitivos, representan potentes inmunógenos para la inducción de anticuerpos específicos para RANKL. Los anticuerpos son capaces de bloquear y neutralizar, respectivamente, la interacción de RANKL con su RANK receptor. Por lo tanto, la presente invención proporciona un medio terapéutico para el tratamiento de enfermedades óseas. Este producto terapéutico es capaz de inducir altas concentraciones de anticuerpos anti-RANKL en un animal vacunado.
La presente invención proporciona entonces una composición que comprende:
(a) una partícula similar a virus de un fago de ARN; y
(b) por lo menos un antígeno o determinante antigénico, en donde el antígeno o determinante antigénico es una proteína RANKL, un fragmento RANKL o un péptido RANKL, y
en donde por lo menos un antígeno o determinante antigénico está unido a una partícula similar a virus por al menos un enlace covalente no peptídico.
En la presente invención, una proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL es unido a una VLP de fago de ARN, típicamente de una manera orientada, produciendo una disposición de antígenos de proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL ordenada y repetitiva. Más aún, la estructura altamente repetitiva y organizada de las partículas de núcleo y VLP, respectivamente, media el despliegue de la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL de una manera altamente ordenada y repetitiva llevando a una disposición de antígenos altamente organizada y repetitiva. Además, la unión de la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL a la partícula de núcleo y VLP, respectivamente, proporciona epítopes de células T auxiliares, toda vez que la partícula de núcleo y VLP es extraña para el huésped inmunizado con la disposición de partícula de núcleo-proteína RANKL, -fragmento RANKL o -péptido RANKL y la disposición de VLP-proteína RANKL, -fragmento RANKL o -péptido RANKL, respectivamente. Esas disposiciones son diferentes de los conjugados de la técnica anterior en su estructura altamente organizada, dimensiones y en el carácter repetitivo del antígeno sobre la superficie de la disposición.
En un aspecto de la invención, la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL es expresado en un huésped de expresión adecuado compatible con el doblez adecuado de la proteína RANKL o fragmento RANKL, o sintetizado, mientras que la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente, son expresados y purificados a partir de un huésped de expresión adecuado para el doblez y ensamblaje de la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente. La proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL también puede ser químicamente sintetizado. La disposición de proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL es después ensamblada al unir la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL a la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende (a) una partícula tipo virus de un fago de ARN y (b) al menos un antígeno o determinante antigénico, en donde el antígeno o determinante antigénico es una proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL, y en donde el por lo menos un antígeno o determinante antigénico está unido a la partícula tipo virus.
En un aspecto más, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende (a) la composición de la reivindicación 1 y (b) un vehículo farmacéutico aceptable.
En un aspecto más, la presente invención proporciona una composición de vacuna que comprende una composición, en donde la composición comprende (a) una partícula tipo virus de un fago de ARN y (b) al menos un antígeno o determinante antigénico, en donde el antígeno o determinante antigénico es una proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL, y en donde el por lo menos un antígeno o determinante antigénico está unido a la partícula tipo virus.
En otro aspecto más, la presente invención proporciona un proceso para producir una composición de la reivindicación 1 que comprende (a) proporcionar una partícula tipo virus; (b) proporcionar al menos un antígeno o determinante antigénico, en donde el antígeno o determinante antigénico es una proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL; y (c) combinar la partícula tipo virus y el por lo menos un antígeno o determinante antigénico de tal manera que el por lo menos un antígeno o determinante antigénico sea unido a la partícula tipo virus.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de inmunización que comprende administrar la composición de la reivindicación 1 a un animal o un humano.
En un aspecto más, la presente invención proporciona el uso de la composición de la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades óseas.
En otro aspecto más, la presente invención proporciona el uso de una composición de la reivindicación 1 en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o profiláctico de enfermedades óseas, de preferencia de encefalopatías de mamíferos. Más aún, en un aspecto más, la presente invención proporciona el uso de la composición de la reivindicación 1 o la reivindicación 22, ya sea en aislamiento o en combinación con otros agentes, en la fabricación de una composición, vacuna, fármaco o medicamento para la terapia o profilaxis de enfermedades óseas, en particular encefalopatías de mamíferos, y/o para estimular el sistema inmune del mamífero.
Por lo tanto, la invención proporciona, en particular, composiciones de vacuna que son adecuadas para prevenir y/o atenuar enfermedades óseas o condiciones relacionadas con las mismas. La invención proporciona además métodos de inmunización y vacunación, respectivamente, para prevenir y/o atenuar enfermedades óseas o condiciones relacionadas con las mismas, en animales, y en particular en vacas, borregos y ganado así como en humanos. Las composiciones de la invención se pueden usar profiláctica o terapéuticamente.
Como se entendería por cualquiera de capacidad normal en la técnica, cuando las composiciones de la invención se administran a un animal o humano, pueden estar en una composición que contenga sales, reguladores de pH, adyuvantes u otras sustancias que sean deseables para mejorar la eficacia de la composición. Ejemplos de materiales adecuados para usarse en la preparación de composiciones farmacéuticas se proporcionan en numerosas fuentes que incluyen Remington's Pharmaceutical Sciences (Osol, A., ed., Mack Publishing Co. (1990)).
Se dice que las composiciones de la invención son "farmacológicamente aceptables" si su administración puede ser tolerada por un individuo receptor. Además, las composiciones de la invención se administrarán en una "cantidad terapéuticamente efectiva" (es decir, una cantidad que produzca un efecto fisiológico deseado).
Las composiciones de la presente invención se pueden administrar mediante varios métodos conocidos en la técnica, pero normalmente serán administradas mediante inyección, infusión, inhalación, administración oral u otros métodos físicos adecuados. Como alternativa, las composiciones pueden administrarse intramuscular, intravenosa o subcutáneamente. Los componentes de las composiciones para administración incluyen soluciones y suspensiones estériles acuosas (por ejemplo, solución salina fisiológica) o no acuosas. Ejemplos de solventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de olivo, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Pueden usarse vehículos o vendajes oclusivos para incrementar la permeabilidad de la piel e incrementar la absorción de los antígenos.
Otras realizaciones de la presente invención serán evidentes para una persona de capacidad normal en vista de lo que se conoce en la técnica, las siguientes figuras y descripción de la invención, y las reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra la expresión y purificación de C-RANKL.
La purificación de C-RANKL se analizó en un gel SDS bajo condiciones reductoras. El gel fue teñido con azul brillante de Coomassie. Los pesos moleculares de las proteínas marcadoras se dan en el margen izquierdo. Línea 1: marcador de bajo peso molecular. Líneas 2 y 3: el sobrenadante de lisados de células de las células BL21/DE3 transformadas con el vector vacío pGEX6p1 y PGEX-RANKL, respectivamente, después de dieciséis horas de inducción con IPTG 0,4 mM. Línea 4: la proteína GST-PS-C-RANKL purificada después de columna GST-Trap FF. Línea 5: la fracción no unida de la columna GST-Trap FF. Línea 6: la proteína GST-PS-C-RANKL purificada después del corte con la proteasa PreScission. Línea 7: la fracción no unida de la columna GST-Trap FF cargada con la digestión GST-RANKL, la cual contiene la C-RANKL purificada. Línea 8: la fracción unida de la columna GST-Trap FF cargada con la digestión GST-PS-C-RANKL y eluída con GSH.
La figura 2 muestra la expresión y purificación de RANKL-C.
La figura 2A muestra la purificación de GST-EK-RANKL-C. Muestras de proteínas se analizaron en un SDS-PAGE bajo condiciones reductoras. El gel fue teñido con azul brillante de Coomassie. Los pesos moleculares de las proteínas marcadoras se dan en el margen izquierdo. Línea 1: marcador de proteína preteñido, intervalo amplio (New England Biolabs). Línea 2: lisado de células clarificadas de células BL21/DE3 transformadas con el plásmido pMod-GST-EK-mRANKL-C1 después de la inducción nocturna con IPTG 0,1 mM. Línea 3: flujo a través de la columna GST-Trap FF cargada con el lisado clarificado de la línea 2. Línea 4: primer lavado de la columna GST-Trap FF. Línea 5: segundo lavado de la columna GST-Trap FF. Línea 6: tercer lavado de la columna GST-Trap FF. Líneas 7-15: fracciones de elución 1 a 9 de la columna GST-Trap FF que contienen la proteína de fusión GST-EK-RANKL-C purificada y una cantidad menor de proteína GST-EK.
La figura 2B muestra el corte de GST-EK-RANKL-C con EnterokinaseMax®.
La digestión de GST-EK-RANKL-C se analizó en SDS-PAGE bajo condiciones reductoras. El gel fue teñido con azul brillante de Coomassie. Los pesos moleculares de las proteínas marcadoras se dan en el margen izquierdo. Línea 1: marcador de proteína preteñido, intervalo amplio (New England Biolabs). Línea 2: proteína de fusión GST-EK-RANKL-C purificada. Línea 3: productos de corte después de una incubación de 16 horas a 4ºC con EnterokinaseMax®.
La figura 2C muestra la purificación de RANKL-C.
La purificación de RANKL-C después de la remoción de GST-EK por cromatografía de afinidad en glutationa sefarosa fue analizada en SDS-PAGE bajo condiciones reductoras. El gel fue teñido con azul brillante de Coomassie. Los pesos moleculares de las proteínas marcadoras se dan en el margen izquierdo. Línea 1: marcador de proteína preteñido, intervalo amplio (New England Biolabs). Líneas 2 y 3: productos de corte GST-EK y RANKL-C después de 16 horas de incubación de GST-EK-RANKL-C a 4ºC con EnterokinaseMax®. Líneas 4 y 5: cantidades diferentes de la fracción no unida de la comuna GST-Trap FF, la cual contiene la proteína RANKL-C en alta pureza.
La figura 3 muestra el acoplamiento de C-RANKL a proteína de cápside Q\beta.
La figura 3A muestra el análisis SDS-PAGE de productos de acoplamiento: Las proteínas fueron analizadas en geles SDS al 16% bajo condiciones reductoras. El gel fue teñido con azul brillante de Coomassie. Los pesos moleculares de las proteínas marcadoras se dan en el margen izquierdo. La identidad de las bandas de proteínas se indica en el margen derecho. Línea 1: marcador de proteína preteñido, intervalo amplio (New England Biolabs). Línea 2: proteína de cápside Q\beta derivada. Línea 3: proteína C-RANKL purificada. Línea 4: reacción de acoplamiento C-RANKL/Q\beta.
Figuras 3B y 3C: análisis Western Blot de productos de acoplamiento.
Las proteínas fueron extendidas sobre geles SDS al 16% bajo condiciones reductoras, absorbidas a membranas de nitrocelulosa y detectadas con antisuero anti-Q\beta (figura 3B) o anticuerpo anti-RANKL (figura 3C). Los pesos moleculares de las proteínas marcadoras se dan en el margen izquierdo. La identidad de las bandas de proteínas se indica en el margen derecho. Línea 1: marcador de proteína preteñido, intervalo amplio (New England Biolabs). Línea 2: proteína de cápside Q\beta derivada. Línea 3: proteína C-RANKL purificada. Línea 4: reacción de acoplamiento C-RANKL/Q\beta.
La figura 4 muestra ELISA para IgG específica de RANKL en ratones inmunizados con C-RANKL acoplada a Q\beta.
Ratones Balb/c hembra fueron vacunados subcutáneamente con 25 \mug de C-RANKL acoplada a Q\beta en PBS el día 0, día 16 y día 64 con y sin la adición de alumbre. Los sueros de los días 0, 16, 23, 64 y 78 se analizaron para anticuerpos específicos para RANKL. Las concentraciones de ELISA se expresan como el promedio de las diluciones en suero que llevaron a una OD420 máxima media en el ensayo ELISA.
La figura 5 muestra la actividad neutralizadora de anticuerpos inducidos en ratones inmunizados con C-RANKL acoplada a Q\beta.
La figura 5A muestra el ensayo de unión de C-RANKL y su ligando cognado RANK. Unas placas de ELISA se recubrieron con 10 \mug/ml de C-RANKL y se incubaron con diluciones seriales de proteína de fusión RANK-Fc o una proteína de fusión a Fc no relacionada. La detección de RANK unida se llevó a cabo con anticuerpos anti-Fc conjugados a HRP.
La figura 5B muestra la inhibición de la unión de C-RANKL/RANK-Fc por anticuerpos de suero de ratones vacunados con C-RANKL acoplada a Q\beta. Unas placas de ELISA fueron recubiertas con 10 \mug/ml de C-RANKL y co-incubadas con diluciones seriales de sueros de ratón del día 78 y 1 nM de proteína de fusión RANK-Fc. La unión de la proteína de fusión a C-RANKL se detectó con anticuerpo anti-Fc conjugado a peroxidasa de rábano.
Las figuras 6A-6C ilustran la purificación de proteínas AP205 para usarse en VLP, según se analiza por SDS PAGE y realización de Western Blot.
Las figuras 7A-7C ilustran micrografías electrónicas que comparan partículas de fago AP205 con partículas tipo virus AP205 ensambladas espontáneamente a partir de proteína recombinante expresada en E. coli y purificada.
Descripción detallada de la invención
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen los mismos significados que los entendidos comúnmente por un experto en la técnica a la cual esta invención pertenece. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente se puede usar en la práctica o pruebas de la presente invención, los métodos y materiales que se prefieren se describen a continuación.
1. Definiciones
Enlazador de aminoácidos: un "enlazador de aminoácidos", o sólo llamado "enlazador" en esta memoria descriptiva, según se usa en la presente, o bien asocia el antígeno o determinante antigénico con el segundo sitio de fijación o bien, más preferiblemente, ya comprende o contiene el segundo sitio de fijación, típicamente -pero no necesariamente- como un residuo de aminoácido, de preferencia como un residuo de cisteína. El término "enlazador de aminoácidos" según se usa en la presente, sin embargo, no está destinado a implicar que este enlazador de aminoácidos consista exclusivamente en residuos de aminoácido, incluso si un enlazador de aminoácidos que consista en residuos de aminoácido sea una realización preferida de la presente invención. Los residuos de aminoácido del enlazador de aminoácidos están, de preferencia, compuestos de aminoácidos que ocurren naturalmente o de aminoácidos no naturales conocidos en la técnica, todas las mezclas L o D de los mismos. Sin embargo, un enlazador de aminoácidos que comprenda una molécula con un grupo sulfhidrilo o residuo de cisteína también es abarcado dentro de la invención. Esta molécula comprende de preferencia una porción alquilo de C1-C6, cicloalquilo (C5, C6), arilo o heteroarilo. Sin embargo, además de un enlazador de aminoácidos, también deberá ser abarcado dentro del alcance de la invención un enlazador que comprende de preferencia una porción alquilo de C1-C6, cicloalquilo (C5, C6), arilo o heteroarilo y desprovisto de cualquier aminoácido. La asociación entre el antígeno o determinante antigénico u opcionalmente el segundo sitio de fijación y el enlazador de aminoácidos es de preferencia por medio de al menos un enlace covalente, muy preferiblemente por medio de al menos un enlace peptídico.
Animal: según se usa en la presente, el término "animal" intenta incluir, por ejemplo, humanos, borregos, alces, venados, cariacús, visones, mamíferos, monos, caballos, ganado, cerdos, cabras, perros, gatos, ratas, ratones, pájaros, pollos, reptiles, peces, insectos y arácnidos.
Anticuerpo: según se usa en la presente, el término "anticuerpo" se refiere a moléculas que son capaces de unirse a un epítope o determinante antigénico. El término intenta incluir anticuerpos enteros y fragmentos de unión a antígenos de los mismos, incluyendo anticuerpos de una sola cadena. Más preferiblemente, los anticuerpos son fragmentos de anticuerpo de unión a antígenos humanos e incluyen, pero no están limitados a, Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, Fvs de cadena individual (scFv), anticuerpos de cadena individual, Fvs enlazados por disulfuro (sdFv) y fragmentos que comprenden ya sea un dominio V_{L} o V_{H}. Los anticuerpos pueden ser de cualquier origen animal incluyendo pájaros y mamíferos. De preferencia, los anticuerpos son humanos, murinos, de conejo, cabra, conejillo de indias, camello, caballo o pollo. Según se usa en la presente, los anticuerpos "humanos" incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulina humana o de animales transgénicos para una o más inmunoblobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulinas endógenas, como se describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 5.939.598 por Kucherlapati y otros.
Antígeno: según se usa en la presente, el término "antígeno" se refiere a una molécula capaz de ser unida por un anticuerpo o un receptor de células T (TCR) si es presentado por moléculas MHC. El término "antígeno", según se usa en la presente, abarca también epítopes de células T. Un antígeno es capaz además de ser reconocido por el sistema inmunológico y/o es capaz de inducir una respuesta inmune humoral y/o respuesta inmune celular que lleve a la activación de linfocitos B y/o T. Sin embargo, esto podría requerir que, al menos en ciertos casos, el antígeno contenga o esté enlazado a un epítope de célula Th y sea dado en adyuvante. Un antígeno puede tener uno o más epítopes (epítopes B y T). La reacción específica mencionada anteriormente intenta indicar que el antígeno de preferencia reaccionará, típicamente en una forma altamente selectiva, con su anticuerpo o TCR correspondiente y no con la multitud de otros anticuerpos o TCRs que pudieran ser evocados por otros antígenos. Los antígenos según se usa en la presente también pueden ser mezclas de varios antígenos individuales.
Determinante antigénico: según se usa en la presente, el término "determinante antigénico" intenta referirse a la porción de un antígeno que es reconocida específicamente ya sea por linfocitos B o T. Los linfocitos B que responden a determinantes antigénicos producen anticuerpos, mientras que los linfocitos T responden a determinantes antigénicos por proliferación y establecimiento de funciones efectoras críticas para la mediación de la inmunidad celular y/o humoral.
Asociación: según se usa en la presente, el término "asociación" aplicado al primero y segundo sitios de fijación, se refiere a la unión del primero y segundo sitios de fijación que es de preferencia por medio de al menos un enlace no peptídico. La naturaleza de la asociación puede ser covalente, iónica, hidrofóbica, polar o cualquier combinación de las mismas, de preferencia la naturaleza de la asociación es covalente.
Sitio de fijación, primero: según se usa en la presente, la frase "primer sitio de fijación" se refiere a un elemento de origen no natural o natural, al cual el segundo sitio de fijación localizado sobre el antígeno o determinante antigénico pueden asociarse. El primer sitio de fijación puede ser una proteína, un polipéptido, un aminoácido, un péptido, un azúcar, un polinucleótido, un polímero natural o sintético, un metabolito o compuesto secundario (biotina, fluoresceína, retinol, digoxigenina, iones metálicos, fluoruro de fenilmetilsulfonilo), o una combinación de los mismos, o un grupo químicamente reactivo de los mismos. El primer sitio de fijación se localiza, típicamente y de preferencia sobre la superficie de la partícula de núcleo tal como, de preferencia, la partícula tipo virus. Varios primeros sitios de fijación están presentes sobre la superficie de la partícula de núcleo y tipo virus, respectivamente, típicamente en una configuración repetitiva.
Sitio de fijación, segundo: según se usa en la presente, la frase "segundo sitio de fijación" se refiere a un elemento asociado con el antígeno o determinante antigénico al cual el primer sitio de fijación localizado sobre la superficie de la partícula de núcleo y partícula tipo virus, respectivamente, se puede asociar. El segundo sitio de fijación del antígeno o determinante antigénico puede ser una proteína, un polipéptido, un péptido, un azúcar, un polinucleótido, un polímero natural o sintético, un metabolito o compuesto secundario (biotina, fluoresceína, retinol, digoxigenina, iones metálicos, fluoruro de fenilmetilsulfonilo), o una combinación de los mismos, o un grupo químicamente reactivo de los mismos. Al menos un segundo sitio de fijación está presente sobre el antígeno o determinante antigénico. El término "antígeno o determinante antigénico con al menos un segundo sitio de fijación" se refiere, por lo tanto, a una construcción de antígeno o antigénica que comprende al menos el antígeno o determinante antigénico y el segundo sitio de fijación. Sin embargo, en particular para un segundo sitio de fijación, el cual es de origen no natural, es decir que no ocurre naturalmente dentro del antígeno o determinante antigénico, estas construcciones de antígenos o antigénicas comprenden un "enlazador de aminoácidos".
Enfermedades óseas: El término "enfermedades óseas", según se usa en la presente, abarca, en particular, condiciones caracterizadas por resorción ósea incrementada. El término "enfermedades óseas" incluye, pero no está limitado a, osteoporosis en sus diferentes formas tales como osteoporosis primaria (tal como osteoporosis idiopática, postmenopáusica, involutiva o senil) y osteoporosis secundaria. Esta última incluye osteoporosis causada por exceso de glucocorticoides, hiperparatiroidismo, hipertiroidismo, hipergonadismo, hiperprolactinemia, diabetes mellitus, osteoporosis inducida por fármacos tal como la causada por glucocorticosteroides, etanol, dilantina, tabaco, barbituratos o heparina), osteoporosis inducida por desuso y condiciones misceláneas asociadas con resorción ósea incrementada tales como insuficiencia renal crónica, enfermedades hepáticas, síndromes de malabsorción, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, sarcoidosis. Las condiciones adicionales con resorción ósea incrementada incluyen enfermedad de Paget, osteólisis expansiva familiar, osteólisis espontánea, pérdida ósea asociada con artritis reumatoide, resorción ósea y pérdida de dientes durante enfermedades periodontales, osteomielitis, hipercalcemia de malignidad, tumores óseos, cánceres asociados por metástasis óseas y pérdida de hueso causada por ingravidez como la que se encuentra en vuelos espaciales. Los expertos en la técnica pueden reconocer condiciones adicionales caracterizadas por resorción ósea incrementada.
Enlace: según se usa en la presente, el término "enlace" se refiere a la unión o fijación que puede ser covalente, por ejemplo mediante acoplamiento químico, o no covalente, por ejemplo interacciones iónicas, interacciones hidrofóbicas, enlaces de hidrógeno, etc. Los enlaces covalentes pueden ser, por ejemplo, enlaces de éster, éter, fosfoéster, amida, péptido, imida, carbono-azufre, enlaces carbono-fósforo y similares. El término "enlace" es más amplio e incluye términos tales como "acoplado", "fusionado" y "fijado".
Proteínas de cápside: según se usa en la presente, el término "proteína o proteínas de cápside" se refiere a las proteínas de un bacteriófago o de un fago de ARN capaces de ser incorporadas en el ensamblaje de cápside del bacteriófago o el fago de ARN. Sin embargo, cuando se hace referencia al producto génico específico del gen de proteína de cápside de fagos de ARN, se usa el término "CP". Por ejemplo, el producto génico específico del gen de proteína de cápside de fago de ARN Q\beta es denominado "Q\beta CP", mientras que las "proteínas de cápside" del bacteriófago Q\beta comprenden el "Q\beta CP" así como la proteína A1. La cápside del bacteriófago Q\beta está compuesta principalmente del Q\beta CP, con un contenido menor de la proteína A1. Asimismo, la proteína de cápside Q\beta de la VLP contiene principalmente Q\beta CP, con un contenido menor de proteína A1.
Partícula de núcleo: según se usa en la presente, el término "partícula de núcleo" se refiere a una estructura rígida con una organización repetitiva inherente. Una partícula de núcleo según se usa en la presente puede ser el producto de un proceso sintético o el producto de un proceso biológico.
Acoplado: el término "acoplado", según se usa en la presente, se refiere a la fijación por enlaces covalentes o por fuertes interacciones no covalentes, típicamente y de preferencia a la unión por enlaces covalentes. Cualquier método usado normalmente por los expertos en la técnica para el acoplamiento de materiales biológicamente activos puede usarse en la presente invención.
Cantidad efectiva: según se usa en la presente, el término "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad necesaria o suficiente para lograr un efecto biológico deseado. Una cantidad efectiva de la composición podría ser la cantidad que logre este resultado deseado, y esta cantidad podría ser determinada como un asunto de rutina por una persona experta en la técnica. Por ejemplo, una cantidad efectiva para tratar una deficiencia del sistema inmunológico podría ser aquella cantidad necesaria para causar la actividad del sistema inmunológico, dando como resultado el desarrollo de una respuesta inmune específica de antígenos después de la exposición al antígeno. El término es también sinónimo de "cantidad suficiente".
La cantidad efectiva para cualquier aplicación particular puede variar dependiendo de factores tales como la enfermedad o condición que se esté tratando, la composición particular que se esté administrando, el tamaño del sujeto y/o la severidad de la enfermedad o condición. Una persona de capacidad ordinaria en la técnica puede determinar empíricamente la cantidad efectiva de una composición particular de la presente invención sin requerir de experimentación innecesaria.
Epítope: según se usa en la presente, el término "epítope" se refiere a porciones continuas o discontinuas de un polipéptido que tienen actividad antigénica o inmunógena en un animal, de preferencia un mamífero, y muy preferiblemente en un humano. Un epítope es reconocido por un anticuerpo o una célula T a través de su receptor de células T en el contexto de una molécula MHC. Un "epítope inmunogénico", según se usa en la presente, es definido como una porción de un polipéptido que desarrolla una respuesta de anticuerpos o induce una respuesta de células T en un animal, como se determina por cualquier método conocido en la técnica (véase, por ejemplo, Geysen y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002 (1983)). El término "epítope antigénico", según se usa en la presente, se define como una porción de una proteína a la cual un anticuerpo puede unir inmunoespecíficamente su antígeno como se determina por un método bien conocido en la técnica. La unión inmunoespecífica excluye la unión no específica pero no necesariamente excluye la reactividad cruzada con otros antígenos. Los epítopes antigénicos no necesariamente tienen que ser inmunogénicos. Los epítopes antigénicos también pueden ser epítopes de células T, en cuyo caso pueden unirse inmunoespecíficamente por un receptor de células T en el contexto de una molécula
MHC.
\newpage
Un epítope puede comprender tres aminoácidos en una conformación espacial que sea única para el epítope. Generalmente, un epítope consiste en al menos aproximadamente 5 de estos aminoácidos, y más usualmente, consiste en al menos 8-10 de estos aminoácidos. Si el epítope es una molécula orgánica, puede ser tan pequeño como nitrofenilo.
Fusión: según se usa en la presente, el término "fusión" se refiere a la combinación de secuencias de aminoácidos de origen diferente en una cadena de polipéptido mediante la combinación en cuadro de sus secuencias de nucleótidos de codificación. El término "fusión" abarca explícitamente fusiones internas, es decir, inserción de secuencias de origen diferente dentro de una cadena de polipéptido, además de la fusión a uno de sus términos.
Respuesta inmune: según se usa en la presente, el término "respuesta inmune" se refiere a una respuesta inmune humoral y/o respuesta inmune celular que lleva a la activación o proliferación de linfocitos B y/o T, y/o células presentadoras de antígenos. Sin embargo, en algunos casos las respuestas inmunes pueden ser de baja intensidad y hacerse detectables sólo cuando se use al menos una sustancia de acuerdo con la invención. "Inmunogénico" se refiere a un agente usado para estimular el sistema inmune de un organismo vivo, de tal manera que una o más funciones del sistema inmune sean incrementadas y dirigidas hacia el agente inmunogénico. Un "polipéptido inmunogénico" es un polipéptido que desarrolla una respuesta inmune celular y/o humoral, ya sea solo o enlazado a un vehículo en presencia o ausencia de un adyuvante. De preferencia, una célula presentadora de antígenos puede ser activada.
Una sustancia que "incrementa" una respuesta inmune se refiere a una sustancia en la cual se observa una respuesta inmune que es más grande o intensificada o desviada en cualquier forma con la adición de la sustancia cuando se le compara con la misma respuesta inmune medida sin la adición de la sustancia. Por ejemplo, la actividad lítica de células T citotóxicas puede ser medida, por ejemplo, usando un ensayo de liberación de ^{51}Cr, en muestras obtenidas con y sin el uso de la sustancia durante la inmunización. La cantidad de la sustancia a la cual la actividad lítica de CTL es incrementada en comparación con la actividad lítica de CTL sin la sustancia, se dice que es una cantidad suficiente para incrementar la respuesta inmune del animal al antígeno. En una realización preferida, la respuesta inmune es incrementada por un factor de al menos aproximadamente 2, muy preferiblemente por un factor de alrededor de 3 o más. La cantidad o tipo de citocinas secretadas también puede ser alterada. Como alternativa, la cantidad de anticuerpos inducidos o sus subclases puede ser alterada.
Inmunización: según se usa en la presente, los términos "inmunizar" o "inmunización" o términos relacionados se refieren a conferir la capacidad de montar una respuesta inmune sustancial (que comprenda anticuerpos y/o inmunidad celular tales como CTL efectora) contra un antígeno o epítope objetivo. Estos términos no requieren que se cree una inmunidad completa, sino más bien que se produzca una respuesta inmune que sea sustancialmente mayor que la de la línea de base. Por ejemplo, un mamífero puede considerarse inmunizado contra un antígeno objetivo si la respuesta inmune celular y/o humoral al antígeno objetivo ocurre después de la aplicación de los métodos de la invención.
Origen natural: según se usa en la presente, el término "origen natural" significa que todo o partes del mismo no son sintéticos y existen o son producidos en la naturaleza.
No natural: según se usa en la presente, el término significa generalmente que no proviene de la naturaleza, más específicamente, el término significa de la mano del hombre.
Origen no natural: según se usa en la presente, el término "origen no natural" significa generalmente sintético o que no es de la naturaleza; más específicamente, el término significa de la mano del hombre.
Disposición de antígenos o determinantes antigénicos ordenada y repetitiva: según se usa en la presente, el término "disposición de antígenos o determinantes antigénicos ordenada y repetitiva" se refiere generalmente a un patrón repetitivo de antígenos o determinantes antigénicos, caracterizado por una disposición espacial típica y preferiblemente uniforme de los antígenos y determinantes antigénicos con respecto a la partícula de núcleo y partícula tipo virus, respectivamente. En una realización de la invención, el patrón de repetición puede ser un patrón geométrico. Ejemplos típicos y preferidos de disposiciones de antígenos o determinantes antigénicos ordenadas y repetitivas son aquellas que poseen órdenes paracristalinos de antígenos o determinantes antigénicos estrictamente repetitivos, de preferencia con separaciones de 1 a 30 nanómetros, preferiblemente 5 a 15 nanómetros.
Pelos: según se usa en la presente, el término "pelos" (el singular es "pelo") se refiere a estructuras extracelulares de células bacterianas compuestas de monómeros proteínicos (por ejemplo, monómeros de pilina) las cuales están organizadas en patrones ordenados y repetitivos. Además, los pelos son estructuras que están implicadas en procesos tales como la fijación de células bacterianas a receptores de superficie de células huésped, intercambios genéticos intercelulares y reconocimiento entre células. Ejemplos de pelos incluyen pelos Tipo I, pelos P, pelos F1C, pelos S y pelos 987P. Ejemplos adicionales de pelos se establecen más adelante.
Estructura tipo pelo: según se usa en la presente, la frase "estructura tipo pelo" se refiere a estructuras que tienen características similares a las de los pelos y están compuestos de monómeros proteínicos. Un ejemplo de una "estructura tipo pelo" es una estructura formada por una célula bacteriana que expresa proteínas de pilina modificadas que no forman disposiciones ordenadas y repetitivas que son idénticas a las de los pelos naturales.
Polipéptido: según se usa en la presente, el término "polipéptido" se refiere a una molécula compuesta de monómeros (aminoácidos) enlazados linealmente por enlaces de amida (también conocidos como enlaces peptídicos). Indica una cadena molecular de aminoácidos y no se refiere a una longitud específica del producto. De esta manera, los péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos y proteínas están incluidos dentro de la definición de polipéptido. Este término también está destinado a referirse a modificaciones post-expresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares. Un polipéptido recombinante o derivado no necesariamente es traducido de una secuencia de ácido nucleico designada. También se puede generar en cualquier forma, incluyendo síntesis química.
Proteína RANKL: el término "proteína RANKL" según se usa en la presente se refiere a una proteína codificada por un gen RANKL. Diferentes variantes de la proteína RANKL se pueden causar por mutaciones por puntos de nucleótidos y polimorfismos, respectivamente, así como por inserciones, supresiones y/o sustituciones de uno o más nucleótidos, y deben ser abarcadas explícitamente dentro del alcance de la presente invención. Variabilidad adicional puede causarse mediante modificaciones post-traduccionales, tales como formas diferencialmente glicosiladas de RANKL así como formas proteolíticamente cortadas de RANKL (Lum, L. y otros, J. Biol. Chem. 274:13616-13618 (2000)). Existe un número de variantes de empalme conocidas actualmente del gen RANKL humano y el gen RANKL de otras especies que, con las variantes posibles mencionadas anteriormente, también están dentro del alcance de la invención. Por lo tanto, el término "proteína RANKL", según se usa en la presente, también deberá abarcar las variantes de proteína RANKL, incluyendo pero no limitadas a los ejemplos preferidos indicados anteriormente.
Según se usa en la presente, el término "fragmento RANKL" se define ampliamente como cualquier polipéptido de al menos 50 aminoácidos de largo que represente parte de una proteína RANKL, muy preferiblemente de una parte doblada de RANKL y más preferiblemente de la parte extracelular de RANKL, aún más preferiblemente de la región homóloga al FNT-\alpha. El término fragmento RANKL también abarca proteínas y polipéptidos producidos en forma recombinante, respectivamente, que corresponden a isoformas de empalme y formas proteolíticamente cortadas de RANKL, y todas las variantes, como las descritas anteriormente, de las mismas.
Según se usa en la presente, el término "péptido RANKL" se define ampliamente como cualquier péptido que represente una fracción de una proteína RANKL o un fragmento RANKL y que contenga al menos dos, de preferencia al menos tres, muy preferiblemente por lo menos cuatro, más preferiblemente por lo menos cinco, aún más preferiblemente por lo menos seis aminoácidos consecutivos de la proteína RANKL o fragmento RANKL original, muy preferiblemente de la parte extracelular de RANKL. Además, el término "péptido RANKL" debe abarcar de preferencia cualquier fracción del péptido RANKL, en donde la fracción puede ser, de preferencia, derivada mediante la supresión de uno o más aminoácidos en el término N y/o C. El péptido RANKL puede obtenerse mediante expresión recombinante en sistemas de expresión eucarióticos o procarióticos como péptido RANKL solo o como una fusión con otros aminoácidos o proteínas, por ejemplo, para facilitar el doblez, expresión o solubilidad del péptido RANKL o para facilitar la purificación del péptido RANKL. Para hacer posible el acoplamiento de péptidos RANKL y proteínas de subunidad de VLP o cápsides, al menos un segundo sitio de fijación puede añadirse al péptido RANKL. Como alternativa, los péptidos RANKL pueden ser sintetizados usando métodos conocidos en la técnica. El término "péptido RANKL" según se usa en la presente también deberá abarcar de preferencia un péptido que simule la estructura de superficie tridimensional de RANKL. Este péptido RANKL no necesariamente es derivado de una secuencia de aminoácidos continua de RANKL, sino que puede formarse por residuos de aminoácido discontinuos de RANKL. Estos péptidos pueden contener incluso aminoácidos que no estén presentes en la proteína RANKL correspondiente.
Residuo: según se usa en la presente, el término "residuo" intenta significar un aminoácido específico en una estructura de base o cadena lateral de polipéptido.
Auto-antígeno: según se usa en la presente, el término "auto-antígeno" se refiere a proteínas codificadas por el ADN del huésped, y los productos generados por proteínas o ARN codificados por el ADN del huésped se definen como auto. Además, las proteínas que resultan de una combinación de dos o varias auto-moléculas o que representan una fracción de una auto-molécula y proteínas que tienen una alta homología por dos auto-moléculas como las definidas anteriormente (>95%, de preferencia >97%, muy preferiblemente >99%) también pueden considerarse auto.
Tratamiento: según se usa en la presente, los términos "tratamiento", "tratar", "tratado" o "tratando" se refieren a profilaxis y/o terapia. Cuando se usa con respecto a una enfermedad infecciosa, por ejemplo, el término se refiere a un tratamiento profiláctico que incrementa la resistencia de un sujeto a una infección por un patógeno o, en otras palabras, disminuye la probabilidad de que el sujeto sea infectado con el patógeno o muestre signos de enfermedad atribuibles a la infección, así como a un tratamiento después de que el sujeto haya sido infectado para combatir la infección, por ejemplo reducir o eliminar la infección o prevenir que ésta empeore. Cuando se usa con respecto a enfermedades óseas, el término "tratamiento" se refiere a un tratamiento profiláctico o terapéutico que inhibe o reduce la resorción ósea incrementada que está asociada con enfermedades óseas.
Vacuna: según se usa en la presente, el término "vacuna" se refiere a una formulación que contiene la composición de la presente invención y la cual está en un forma que es capaz de ser administrada a un animal. Típicamente, la vacuna comprende una solución salina o medio de solución acuosa regulada en pH convencionales en el cual la composición de la presente invención es suspendida o disuelta. En esta forma, la composición de la presente invención se puede usar convenientemente para prevenir, disminuir o de otra manera tratar una condición. Después de su introducción en un huésped, la vacuna es capaz de provocar una respuesta inmune que incluye, pero no está limitada a, la producción de anticuerpos y/o citocinas y/o la activación de células T citotóxicas, células presentadoras de antígenos, células T auxiliares, células dendríticas y/u otras respuestas celulares.
Opcionalmente, la vacuna de la presente invención incluye además un adyuvante que puede estar presente ya sea en una proporción menor o mayor en relación al compuesto de la presente invención. El término "adyuvante" según se usa en la presente se refiere a estimuladores no específicos de la respuesta inmune o a sustancias que permiten la generación de un depósito en el huésped las cuales cuando son combinadas con la vacuna de la presente invención proporcionan una respuesta inmune todavía más incrementada. Se puede usar una variedad de adyuvantes. Ejemplos incluyen adyuvante de Freund completo e incompleto, hidróxido de aluminio y dipéptido de muramilo modificado.
Partícula tipo virus (VLP): según se usa en la presente, el término "partícula tipo virus" se refiere a una estructura que simula una partícula de virus. Más aún, una partícula tipo virus de acuerdo con la invención es no replicativa y no infecciosa toda vez que carece de todo o parte del genoma viral, en particular de los componentes replicativos e infecciosos del genoma viral. Una partícula tipo virus de acuerdo con la invención puede contener ácido nucleico diferente al de su genoma. Una realización típica y preferida de una partícula tipo virus de acuerdo con la presente invención es una cápside viral tal como la cápside viral del virus, bacteriófago o fago de ARN correspondiente. Los términos "cápside viral" o "cápside", según se usan de manera intercambiable en la presente, se refieren a un ensamblaje macromolecular compuesto de subunidades de proteínas virales. Típicamente y de preferencia, las subunidades de proteínas virales se ensamblan en una cápside viral y cápside, respectivamente, que tiene una estructura con una organización repetitiva inherente, en donde la estructura es, típicamente, esférica o tubular. Por ejemplo, las cápsides de fagos de ARN o HBcAg's tienen una forma esférica de simetría icosaédrica. El término "estructura tipo cápside" según se usa en la presente, se refiere a un ensamblaje macromolecular compuesto de subunidades de proteínas virales que simulan la morfología de la cápside en el sentido definido anteriormente pero que se desvían del ensamblaje simétrico típico mientras conservan un grado suficiente de orden y carácter repetitivo.
Partícula tipo virus de un bacteriófago: según se usa en la presente, el término "partícula tipo virus de un bacteriófago" se refiere a una partícula tipo virus que simula la estructura de un bacteriófago, que es no replicativa y no infecciosa, y que carece de al menos el gen o genes que codifican la maquinaria de replicación del bacteriófago, y que típicamente carecen también del gen o genes que codifican la proteína o proteínas responsables de la fijación viral a, o de la entrada en el huésped. Sin embargo, esta definición debe abarcar también partículas tipo virus de bacteriófagos, en las cuales el gen o genes mencionados anteriormente aún estén presentes pero sean inactivos y, por lo tanto, lleven también a partículas tipo virus no replicativas y no infecciosas de un bacteriófago.
VLP de proteína de cápside de fago de ARN: la estructura de cápside formada del auto-ensamblaje de 180 subunidades de proteína de cápside de fago de ARN y que contiene opcionalmente ARN huésped se denomina "VLP de proteína de cápside de fago de ARN". Un ejemplo específico es la VLP de proteína de cápside Q\beta. En este caso particular, la VLP de proteína de cápside Q\beta puede ser ensamblada exclusivamente a partir de subunidades Q\beta CP (generadas por la expresión de un gen Q\beta CP que contenga, por ejemplo, un codón de detención TAA que evite cualquier expresión de la proteína A1 más larga a través de la supresión (véase Kozlovska, T. M. y otros, Intervirology 39:9-15 (1996)), o contener adicionalmente subunidades de proteína A1 en el ensamblaje de cápside.
Partícula de virus: el término "partícula de virus" según se usa en la presente se refiere a la forma morfológica de un virus. En algunos tipos de virus comprende un genoma rodeado por una cápside de proteína; otras tienen estructuras adicionales (por ejemplo, envolturas, colas, etc.).
Como estará claro para los expertos en la técnica, ciertas realizaciones de la invención incluyen el uso de tecnologías de ácido nucleico recombinante tales como clonación, reacción en cadena de polimerasa, la purificación de ADN y ARN, la expresión de proteínas recombinantes en células procarióticas y eucarióticas, etc. Estas metodologías se conocen bien por los expertos en la técnica y se pueden encontrar convenientemente en manuales de métodos de laboratorio publicados (por ejemplo, Sambrook, J. y otros, eds., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a. edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel, F. y otros, eds., Current Protocols in Molecular Biology, John H. Wiley & Sons, Inc. (1997)). Las técnicas de laboratorio fundamentales para trabajar con líneas de células de cultivo de tejidos (Celis, J., ed., Cell Biology, Academic Press, 2da. edición (1998)) y tecnologías a base de anticuerpos (Harlow, E. y Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988); Deutscher, M. P., "Guide to Protein Purification", Meth. Enzymol. 128, Academic Press San Diego (1990); Scopes, R. K., Protein Purification Principles and Practice, 3a. ed., Springer-Verlag, Nueva York (1994)) también se describen adecuadamente en la literatura, todas las cuales están incorporadas en la presente a manera de referencia.
2. Composiciones y métodos para incrementar una respuesta inmune
Las composiciones de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, una partícula tipo virus de un fago de ARN y al menos un antígeno o determinante antigénico, en donde el antígeno o determinante antigénico es una proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL, y en donde el por lo menos un antígeno o determinante antigénico está unido a la partícula tipo virus para formar así una disposición antígeno-VLP ordenada y repetitiva. Además, la invención hace posible en forma conveniente que el practicante construya esta composición, entre otros, para el tratamiento y/o prevención profiláctica de enfermedades óseas caracterizadas por resorción ósea incrementada.
En una realización más, la invención utiliza la manipulación genética de un virus para crear una fusión entre una proteína de cápside viral ordenada y repetitiva y un primer sitio de fijación que comprenda una proteína heteróloga, péptido, determinante antigénico o un residuo de aminoácido reactivo de elección. Otras manipulaciones genéticas conocidas por los expertos en la técnica pueden incluirse en la construcción de las composiciones de la invención; por ejemplo, puede ser deseable restringir la capacidad de replicación del virus recombinante a través de mutación genética. Además, el virus usado para la presente invención es de replicación incompetente debido a inactivación química o física o, como se indica, debido a la falta de un genoma de replicación competente. La proteína viral seleccionada para la fusión al primer sitio de fijación debe tener una estructura organizada y repetitiva. Esta estructura organizada y repetitiva incluye organizaciones paracristalinas con una separación de 5-30 nm, de preferencia 5-15 nm, sobre la superficie del virus. La creación de este tipo de proteína de fusión dará como resultado varios primeros sitios de fijación ordenados y repetitivos sobre la superficie del virus y reflejará la organización normal de la proteína viral nativa. Como se entenderá por los expertos en la técnica, el primer sitio de fijación puede ser o formar parte de cualquier proteína, polipéptido, azúcar, polinucleótido, péptido (aminoácido), polímero natural o sintético, un metabolito secundario adecuados o combinaciones de los mismos que puedan servir para unir específicamente el antígeno o determinante antigénico, llevando a una disposición de antígenos ordenada y repetitiva.
Se puede utilizar una variedad de células huésped recombinantes diferentes para producir una partícula de núcleo a base viral para la fijación al antígeno o determinante antigénico. Por ejemplo, se sabe que los alfavirus tienen una amplia gama de huéspedes; el virus de Sindbis infecta células de mamífero, reptil y anfibio cultivadas, así como algunas células de insecto (Clark, H., J. Natl. Cancer Inst. 51:645 (1973); Leake, C., J. Gen. Virol. 35:335 (1977); Stollar, V. en THE TOGAVIRUSES, R. W. Schlesinger, ed., Academic Press (1980), págs. 583-621). De esta manera, en la práctica de la invención se pueden usar numerosas células huésped recombinantes. Las células BHK, COS, Vero, HeLa y CHO son particularmente adecuadas para la producción de proteínas heterólogas porque tienen el potencial de glicosilar proteínas hteterólogas de una manera similar a la de las células humanas (Watson, E. y otros, Glycobiology 4:227 (1994)) y pueden seleccionarse (Zang, M. y otros, Bio/Technology 13:389 (1995)) o manipularse genéticamente (Renner W. y otros, Biotech. Bioeng. 4:476 (1995); Lee K. y otros, Biotech. Bioeng. 50:336 (1996)) para crecer en medio libre de suero, así como en suspensión.
La introducción de los vectores de polinucleótidos en células huésped se puede llevar a cabo mediante métodos descritos en manuales de laboratorio estándares (véase, por ejemplo, Sambrook, J. y otros, eds., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2da. edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Capítulo 9; Ausubel, F. y otros, eds., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John H. Wiley & Sons, Inc. (1997), capítulo 16), incluyendo métodos tales como electroporación, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección, microinyección, transfección mediada por lípidos catiónicos, transducción, carga de raspado, introducción balística e infección. Los métodos para la introducción de secuencias de ADN exógenas en células huésped se describen en Felgner, P. y otros, patente de EE.UU. nº 5.580.859.
Secuencias de ARN empacadas también pueden usarse para infectar células huésped. Estas secuencias de ARN empacadas pueden introducirse en células huésped al añadirlas al medio de cultivo. Por ejemplo, la preparación de partículas alfavirales no infecciosas se describe en un número de fuentes, incluyendo "Sindbis Expression System", Versión C (Invitrogen catálogo nº K750-1).
Cuando se usan células de mamífero como células huésped recombinantes para la producción de partículas de núcleo a base viral, estas células generalmente serán cultivadas en tejido de cultivo. Los métodos para hacer crecer células en cultivo se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Celis, J., ed., CELL BIOLOGY, Academic Press, 2da. edición (1998); Sambrook, J. y otros, eds., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2da. edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel, F. y otros, eds., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John H. Wiley & Sons, Inc. (1997); Freshney, R., CULTURE OF ANIMAL CELLS, Alan R. Liss, Inc. (1983)).
Las partículas tipo virus en el contexto de la presente solicitud se refieren a estructuras que simulan una partícula de virus pero las cuales son no patógenas. En general, las partículas tipo virus carecen del genoma viral y, por lo tanto, son no infecciosas. Asimismo, las partículas tipo virus pueden ser producidas en grandes cantidades mediante expresión heteróloga y se pueden purificar fácilmente.
En una realización preferida, la partícula tipo virus es una partícula tipo virus recombinante. El experto en la técnica puede producir VLP usando tecnología de ADN recombinante y secuencias de codificación de virus que están disponibles fácilmente para el público. Por ejemplo, la secuencia de codificación de una proteína de cápside o núcleo de virus puede ser manipulada para su expresión en un vector de expresión de baculovirus usando un vector de baculovirus disponible comercialmente, bajo el control regulador de un promotor de virus, con modificaciones adecuadas de la secuencia para permitir el enlace funcional de la secuencia de codificación a la secuencia reguladora. La secuencia de codificación de una proteína de cápside o de núcleo de virus también puede ser manipulada para su expresión en un vector de expresión bacteriano, por ejemplo.
La partícula tipo virus comprende, consiste esencialmente en, o alternativamente consiste en, proteínas recombinantes, o fragmentos de las mismas, de un fago de ARN. De preferencia, el fago de ARN se selecciona del grupo que consiste en a) bacteriófago Q\beta; b) bacteriófago R17; c) bacteriófago fr; d) bacteriófago GA; e) bacteriófago SP; f) bacteriófago MS2; g) bacteriófago M11; h) bacteriófago MX1; i) bacteriófago NL95; k) bacteriófago F2; y l) bacteriófago PP7.
\newpage
En otra realización preferida de la presente invención, la partícula tipo virus comprende, o alternativamente consiste esencialmente en, o alternativamente consiste en, proteínas recombinantes, o fragmentos de las mismas, del bacteriófago de ARN Q\beta o del bacteriófago de ARN fr.
En una realización preferida más de la presente invención, las proteínas recombinantes comprenden, o alternativamente consisten esencialmente en, o alternativamente consisten en, proteínas de cápside de fagos de ARN.
Las proteínas de cápside de fago de ARN que forman cápsides o VLP, o fragmentos de las proteínas de cápside de bacteriófagos compatibles con el auto-ensamblaje en una cápside o una VLP, son por lo tanto, realizaciones preferidas adicionales de la presente invención. Las proteínas de cápside Q\beta de bacteriófagos, por ejemplo, pueden ser expresadas en forma recombinante en E. coli. Además, después de tal expresión, estas proteínas forman espontáneamente cápsides. Adicionalmente, estas cápsides forman una estructura con una organización repetitiva inherente.
Ejemplos preferidos específicos de proteínas de cápside de bacteriófagos que pueden usarse para preparar las composiciones de la invención incluyen las proteínas de cápside de bacteriófagos de ARN tales como bacteriófago Q\beta (SEQ ID NO: 10; Base de datos PIR, nº de acceso VCBPQ\beta que se refiere a Q\beta CP y SEQ ID NO: 11; nº de acceso AAA16663 que se refiere a proteína A1 de Q\beta), bacteriófago R17 (SEQ ID NO: 12; PIR nº de acceso VCBPR7), bacterióago fr (SEQ ID NO: 13; PIR nº de acceso VCBPFR), bacteriófago GA (SEQ ID NO: 14; GenBank nº de acceso NP-040754), bacteriófago SP (SEQ ID NO: 15; GenBank nº de acceso CAA30374 que se refiere a SP CP y SEQ ID NO: 16; nº de acceso que se refiere a proteína A1 de SP), bacteriófago MS2 (SEQ ID NO: 17; PIR nº de acceso VCBPM2), bacteriófago M11 (SEQ ID NO: 18; GenBank nº de acceso AAC06250), bacteriófago MX1 (SEQ ID NO: 19; GenBank nº de acceso AAC14699), bacteriófago NL95 (SEQ ID NO: 20; GenBank nº de acceso AAC14704), bacteriófago f2 (SEQ ID NO: 21; GenBank nº de acceso P03611), bacteriófago PP7 (SEQ ID NO: 22). Más aún, la proteína A1 de bacteriófago Q\beta o formas truncadas C-terminales que carecen de tanto como 100, 150 ó 180 aminoácidos desde de su término C se pueden incorporar en un ensamblaje de cápside de proteínas de cápside Q\beta. Generalmente, el porcentaje de proteína A1 de Q\beta en relación a Q\beta CP en el ensamblaje de cápside será limitado, con el fin de asegurar la formación de la cápside.
También se ha encontrado que la proteína de cápside Q\beta se auto-ensambla en cápsides cuando es expresada en E. coli (Kozlovska T. M. y otros, GENE 137:133-137 (1993)). Las cápsides o partículas tipo virus obtenidas mostraron una estructura de cápside tipo fago icosaédrica con un diámetro de 25 nm y simetría casi T=3. Además, la estructura cristalina del fago Q\beta ha sido resuelta. La cápside contiene 180 copias de la proteína de cápside, las cuales son enlazadas en pentámeros y hexámeros covalentes por puentes de disulfuro (Golmohammadi, R. y otros, Structure 4:543-5554 (1996)) llevando a una notable estabilidad de la cápside de la proteína de cápside Q\beta. Las cápsides o VLP hechas a partir de proteína de cápside Q\beta recombinante pueden contener, sin embargo, subunidades no enlazadas por medio de enlaces de disulfuro a otras subunidades dentro de la cápside, o enlazadas incompletamente. De esta manera, después de cargar una cápside Q\beta recombinante en SDS-PAGE no reductora, son visibles las bandas que corresponden a la proteína de cápside Q\beta monomérica así como las bandas que corresponden al hexámero o pentámero de la proteína de cápside Q\beta. Las subunidades enlazadas por disulfuro incompletamente podrían aparecer como banda de dímeros, trímeros o incluso tetrámeros en SDS-PAGE no reductora. La proteína de cápside Q\beta muestra también resistencia inusual a solventes orgánicos y agentes de desnaturalización. De manera sorprendente, se ha observado que concentraciones de DMSO y acetonitrilo tan altas como de 30% y concentraciones de guanidinio tan altas como de 1 M no afectan la estabilidad de la cápside. La alta estabilidad de la cápside de la proteína de cápside Q\beta es una característica adecuada, en particular, para su uso en inmunización y vacunación de mamíferos y humanos de acuerdo con la presente invención.
Después de la expresión en E. coli, la metionina N-terminal de la proteína de cápside Q\beta es normalmente removida, como se observa por la secuenciación de Edman N-terminal como se describe en Stoll, E. y otros, J. Biol. Chem. 252:990-993 (1977). VLP compuesta de proteínas de cápside Q\beta en donde la metionina N-terminal no ha sido removida, o VLP que comprenden una mezcla de proteínas de cápside Q\beta en donde la metionina N-terminal es cortada o está presente, también están dentro del alcance de la presente invención.
Las proteínas de cápside de fago de ARN adicionales también han mostrado auto-ensamblarse después de su expresión en un huésped bacteriano (Kastelein, R. A. y otros, Gene 23:245-254 (1983); Kozlovskaya, T. M. y otros, Dokl. Akad. Nauk SSSR 287:452-455 (1986), Adhin, M. R. y otros, Virology 170:238-242 (1989), Ni, C. Z. y otros, Protein Sci. 5:2485-2493 (1996), Priano, C. y otros, J. Mol. Biol. 249:283-297 (1995)). La cápside del fago Q\beta contiene, además de la proteína de cápside, la llamada proteína de lectura A1 y la proteína de maduración A2. A1 se genera mediante la supresión del codón de detención UGA y tiene una longitud de 329 aminoácidos. La cápside de la proteína de cápside recombinante Q\beta de fago usada en la invención está desprovista de la proteína de lisis A2, y contiene ARN del huésped. La proteína de cápside de fagos de ARN es una proteína de unión a ARN, e interactúa con el tallo de espira del sitio de unión a ribosomas del gen de replicasa que actúa como un represor de traducción durante el ciclo de vida del virus. La secuencia y elementos estructurales de la interacción se conocen (Witherell, G. W. & Whlenbeck, O. C. Biochemistry 28:71-76 (1989); Lim F. y otros, J. Biol. Chem. 271:31839-31845 (1996)). Se sabe que el tallo de espira y el ARN en general están implicados en el ensamblaje del virus (Golmohammadi, R. y otros, Structure 4:543-5554 (1996)).
En una realización preferida más de la presente invención, la partícula tipo virus comprende, o alternativamente consiste esencialmente en, o alternativamente consiste en, proteínas recombinantes, o fragmentos de las mismas, de un fago de ARN, en donde las proteínas recombinantes comprenden, consisten esencialmente en o consisten alternativamente en proteínas de cápside mutantes de un fago de ARN, de preferencia de proteínas de cápside mutantes de los fagos de ARN mencionados anteriormente. En otra realización preferida, las proteínas de cápside mutantes del fago de ARN han sido modificadas mediante la remoción de por lo menos un residuo de lisina por medio de sustitución, o por la adición de al menos un residuo de lisina por medio de sustitución; como alternativa, las proteínas de cápside mutantes del fago de ARN han sido modificadas mediante la supresión de al menos un residuo de lisina, o por la adición de al menos un residuo de lisina por medio de inserción.
En otra realización preferida, la partícula tipo virus comprende, o como alternativa consiste esencialmente en, o consiste alternativamente en, proteínas recombinantes, o fragmentos de las mismas, del bacteriófago de ARN Q\beta, en donde las proteínas recombinantes comprenden, o alternativamente consisten esencialmente en, o alternativamente consisten en, proteínas de cápside que tienen una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, o una mezcla de proteínas de cápside que tienen secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y de SEQ ID NO: 11 o mutantes de SEQ ID NO: 11, y en donde la metionina N-terminal es de preferencia cortada.
En una realización preferida más de la presente invención, la partícula tipo virus comprende, consiste esencialmente en o alternativamente consiste en, proteínas recombinantes de Q\beta, o fragmentos de la misma, en donde las proteínas recombinantes comprenden, o alternativamente consisten esencialmente en, o alternativamente consisten en, proteínas de cápside Q\beta mutantes. En otra realización preferida, estas proteínas de cápside mutantes han sido modificadas mediante la remoción de al menos un residuo de lisina por medio de sustitución, o por la adición de al menos un residuo de lisina por medio de sustitución. Como alternativa, estas proteínas de cápside mutantes han sido modificadas mediante la supresión de al menos un residuo de lisina, o por la adición de al menos un residuo de lisina por medio de inserción.
Cuatro residuos de lisina están expuestos sobre la superficie de la cápside de la proteína de cápside Q\beta. Los mutantes Q\beta, para los cuales los residuos de lisina expuestos son reemplazados por argininas, también se pueden usar en la presente invención. Los siguientes mutantes de proteína de cápside Q\beta y VLP de Q\beta mutantes pueden, de esta manera, usarse en la práctica de la invención: "Q\beta-240" (Lys13-Arg; SEQ ID NO: 23), "Q\beta-243" (Asn 10-Lys; SEQ ID NO: 24), "Q\beta-250" (Lys 2-Arg, Lys13-Arg; SEQ ID NO: 25), "Q\beta-251" (SEQ ID NO: 26) y "Q\beta-259" (Lys 2-Arg, Lys16-Arg; SEQ ID NO: 27). De esta manera, en una realización preferida más de la presente invención, la partícula tipo virus comprende, consiste esencialmente en o consiste alternativamente en, proteínas recombinantes de proteínas de cápside Q\beta mutantes, las cuales comprenden proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; b) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; c) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; d) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; y e) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27.
En una realización preferida más de la presente invención, la partícula tipo virus comprende, o alternativamente consiste esencialmente en, o alternativamente consiste en, proteínas recombinantes de Q\beta, o fragmentos de las mismas, en donde las proteínas recombinantes comprenden, consisten esencialmente en o alternativamente consisten en, una mezcla de cualquiera de los mutantes de Q\beta anteriores y la proteína A1 correspondiente.
En una realización preferida más de la presente invención, la partícula tipo virus comprende, o alternativamente consiste esencialmente en, o alternativamente consiste en, proteínas recombinantes, o fragmentos de las mismas, de fago de ARN AP205.
El genoma de AP205 consiste en una proteína de maduración, una proteína de cápside, una replicasa y dos marcos de lectura abiertos no presentes en los fagos relacionados; un gen de lisis y un marco de lectura abierto juegan un papel en la traducción del gen de maduración (Klovins, J. y otros, J. Gen. Virol. 83: 1523-33 (2002)). La proteína de cápside AP205 puede ser expresada del plásmido pAP283-58 (SEQ ID NO: 111), el cual es un derivado de pQb10 (Kozlovska, T. M. y otros, Gene 137:133-37 (1993)), y el cual contiene un sitio de unión a ribosomas AP205. Como alternativa, la proteína de cápside AP205 puede ser clonada en pQb185, aguas abajo del sitio de unión a ribosomas presente en el vector. Ambos enfoques llevan a la expresión de la proteína y a la formación de cápsides como se describe en la solicitud provisional de patente de EE.UU. en tramitación conjunta con el título "Molecular Antigen Arrays" y que ha sido presentada por el presente cesionario el 16 de julio de 2002, la cual se incorpora a manera de referencia en su totalidad. Los vectores pQb10 y pQb185 son vectores derivados del vector pGEM, y la expresión de los genes clonados en esos vectores se controla por el promotor trp (Kozlovska, T. M. y otros, Gene 137:133-37 (1993)). El plásmido pAP283-58 (SEQ ID NO: 111) comprende un sitio de unión a ribosomas AP205 putativo en la siguiente secuencia, la cual está aguas abajo del sitio XbaI, e inmediatamente aguas arriba del codón de inicio ATG de la proteína de cápside AP205: tctagaATTTTCTGCGCACCCATCCCGGGTGGCGCCCAAAGTGAGGAAAATCACatg. El vector pQb185 comprende una secuencia de Shine Delagarno aguas abajo del sitio XbaI y aguas arriba del codón de inicio (tctagaTTAACCCAACGCGTAGGAGTCAGGCCatg, secuencia de Shine Delagarno subrayada).
En otra realización preferida de la presente invención, la partícula tipo virus comprende, o alternativamente consiste esencialmente en, o alternativamente consiste en, proteínas de cápside recombinantes, o fragmentos de las mismas, del fago de ARN AP205.
Esta realización preferida de la presente invención comprende entonces proteínas de cápside AP205 que forman cápsides. Estas proteínas se expresan en forma recombinante, o se preparan a partir de fuentes naturales. Las proteínas de cápside AP205 producidas en bacterias forman espontáneamente cápsides, como se evidencia por Microscopia Electrónica (EM) e inmunodifusión. Las propiedades estructurales de la cápside formada por la proteína de cápside AP205 (SEQ ID NO: 112) y de aquellas formadas por la proteína de cápside del fago de ARN AP205 son casi indistinguibles cuando se les observa en EM. Las VLP AP205 son altamente inmunogénicas, y pueden ser enlazadas con antígenos y/o determinantes antigénicos para generar construcciones de vacunas que desplieguen los antígenos y/o determinantes antigénicos orientados de una manera repetitiva. Altas concentraciones se obtienen contra los antígenos desplegados de esta manera mostrando que los antígenos y/o determinantes antigénicos unidos son accesibles para interactuar con moléculas de anticuerpos y son inmunogénicos.
En una realización preferida más de la presente invención, la partícula tipo virus comprende, o alternativamente consiste esencialmente en, o alternativamente consiste en, proteínas de cápside mutantes recombinantes, o fragmentos de las mismas, del fago de ARN AP205.
Las formas mutantes competentes en ensamblaje de VLP AP205, incluyendo proteína de cápside AP205 con la sustitución de prolina en el aminoácido 5 por treonina (SEQ ID NO: 113), también se pueden usar en la práctica de la invención y llevan a una realización preferida más de la invención. Estas VLP, VLP AP205 derivadas de fuentes naturales, o partículas virales AP205, pueden ser unidas a antígenos para producir disposiciones repetitivas ordenadas de los antígenos de acuerdo con la presente invención.
La proteína de cápside mutante P5-T de AP205 puede ser expresada del plásmido pAP281-32 (SEQ ID NO: 114), el cual se deriva directamente de pQb185, y el cual contiene el gen de proteína de cápside mutante AP205 en lugar del gen de proteína de cápside Q\beta. Los vectores para la expresión de la proteína de cápside AP205 son transfectados en E. coli para la expresión de la proteína de cápside AP205.
Los métodos para la expresión de la proteína de cápside y la proteína de cápside mutante, respectivamente, que llevan al auto-ensamblaje en VLP, se describen en la solicitud provisional de patente de EE.UU. en tramitación conjunta con el título "Molecular Antigen Arrays" y que fue presentada por el presente cesionario el 17 de julio de 2002, la cual está incorporada a manera de referencia en su totalidad. Las cepas de E. coli adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, E. coli K802, JM 109, RR1. Los vectores y cepas adecuados y combinaciones de los mismos pueden identificarse probando la expresión de la proteína de cápside y proteína de cápside mutante, respectivamente, por SDS-PAGE y la formación y el ensamblaje de la cápside opcionalmente al purificar primero las cápsides mediante filtración en gel y posteriormente probándolas en un ensayo de inmunodifusión (prueba de Outchterlony) o Microscopia Electrónica (Kozlovska, T. M. y otros, Gene 137:133-37 (1993)).
Las proteínas de cápside AP205 expresadas de los vectores pAP283-58 y pAP281-32 pueden estar desprovistas del aminoácido metionina inicial, debido al procesamiento en el citoplasma de E. coli. Las formas cortadas y no cortadas de VLP AP205, o mezclas de los mismos son realizaciones preferidas adicionales de la invención.
En una realización preferida más de la presente invención, la partícula tipo virus comprende, o alternativamente consiste esencialmente en, o alternativamente consiste en una mezcla de proteínas de cápside recombinantes, o fragmentos de las mismas, del fago de ARN AP205 y de proteínas de cápside mutantes recombinantes, o fragmentos de las mismas, del fago de ARN AP205.
En una realización preferida más de la presente invención, la partícula tipo virus comprende, o alternativamente consiste esencialmente en, o alternativamente consiste en fragmentos de proteínas de cápside recombinantes o proteínas de cápside mutantes recombinantes del fago de ARN AP205.
Los fragmentos de proteína de cápside AP205 recombinante capaces de ensamblarse en una VLP y una cápside, respectivamente también son útiles en la práctica de la invención. Estos fragmentos pueden generarse mediante supresión, ya sea internamente o en los términos de la proteína de cápside y la proteína de cápside mutante, respectivamente. Las inserciones en la secuencia de la proteína de cápside y la proteína de cápside mutante o las fusiones de las secuencias de antígenos a la secuencia de la proteína de cápside y la proteína de cápside mutante, y compatibles con el ensamblaje en una VLP, son realizaciones adicionales de la invención y llevan a proteínas de cápside AP205 quiméricas, y partículas, respectivamente. El resultado de las inserciones, supresiones y fusiones a la secuencia de la proteína de cápside y si es compatible con el ensamblaje en una VLP puede determinarse mediante microscopia electrónica.
Las partículas formadas por la proteína de cápside AP205, fragmentos de proteínas de cápside y proteínas de cápside quiméricas descritas anteriormente, se pueden aislar en forma pura mediante una combinación de etapas de fraccionamiento por precipitación y de etapas de purificación por filtración en gel usando por ejemplo columnas Sepharose CL-4B, Sepharose CL-2B, Sepharose CL-6B y combinaciones de las mismas como se describe en la solicitud de patente provisional de EE.UU. en tramitación conjunta con el título "Molecular Antigen Arrays" y que fue presentada por el presente cesionario el 17 de julio de 2002, la cual se incorpora a manera de referencia en su totalidad. Otros métodos para aislar partículas tipo virus se conocen en la técnica, y se pueden usar para aislar partículas tipo virus (VLP) del bacteriófago AP205. Por ejemplo, el uso de ultracentrifugación para aislar VLP del retrotransposón de levadura Ty se describe en la patente de EE.UU. nº 4.918.166, la cual se incorpora a manera de referencia en la presente en su totalidad.
Se ha determinado la estructura cristalina de varios bacteriófagos de ARN (Golmohammadi, R. y otros, Structure 4:543-554 (1996)). Usando esta información, los residuos expuestos en la superficie pueden identificarse y, de esta manera, proteínas de cápside de fagos de ARN pueden ser modificadas de tal manera que uno o más residuos de aminoácido reactivos puedan ser insertados por medio de inserción o sustitución. Como consecuencia, las formas modificadas de las proteínas de cápside de bacteriófagos también pueden usarse para la presente invención. De esta manera, variantes de proteínas que formen cápsides o estructuras tipo cápside (por ejemplo, proteínas de cápside de bacteriófago Q\beta, bacteriófago R17, bacteriófago fr, bacteriófago GA, bacteriófago SP y bacteriófago MS2) también se pueden usar para preparar composiciones de la presente invención.
Aunque la secuencia de las proteínas variantes descritas anteriormente serán diferentes de sus contrapartes tipo silvestre, estas proteínas variantes generalmente conservarán la capacidad para formar cápsides o estructuras tipo cápside. De esta manera, la invención incluye además composiciones y composiciones de vacuna, respectivamente, que incluyen además variantes de proteínas que forman cápsides o estructuras tipo cápside, así como métodos para preparar estas composiciones y composiciones de vacuna, respectivamente, subunidades de proteína individuales usadas para preparar estas composiciones y moléculas de ácido nucleico que codifican estas subunidades de proteína. De esta manera, dentro del alcance de la invención están incluidas las formas variantes de proteínas tipo silvestre que forman cápsides o estructuras tipo cápside y conservan la capacidad de asociarse y formar cápsides o estructuras tipo
cápside.
Como resultado, la invención incluye además composiciones y composiciones de vacuna, respectivamente, que comprenden proteínas, las cuales comprenden, o alternativamente consisten esencialmente en, o alternativamente consisten en secuencias de aminoácidos que son al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% idénticas a las proteínas tipo silvestre que forman disposiciones ordenadas y que tienen una estructura repetitiva inherente, respectivamente.
Se incluyen además dentro del alcance de la invención moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas usadas para preparar composiciones de la presente invención.
En otras realizaciones, la invención incluye además composiciones que comprenden proteínas, las cuales comprenden, o alternativamente consisten esencialmente en, o alternativamente consisten en secuencias de aminoácidos que son al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% idénticas a cualquiera de las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NO: 10-27.
Las proteínas adecuadas para usarse en la presente invención también incluyen mutantes de truncamiento C-terminal de proteínas que forman cápsides o estructuras tipo cápside, o VLP. Ejemplos específicos de estos mutantes de truncamiento incluyen proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO: 10-27 en donde 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15 ó 17 aminoácidos han sido removidos del término C. Típicamente, estos mutantes de truncamiento C-terminal conservarán la capacidad de formar cápsides o estructuras tipo cápside.
Proteínas adicionales adecuadas para usarse en la presente invención incluyen también mutantes de truncamiento N-terminal de proteínas que forman cápsides o estructuras tipo cápside. Ejemplos específicos de estos mutantes de truncamiento incluyen proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO: 10-27 en donde 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15 ó 17 aminoácidos han sido removidos del término N. Típicamente, estos mutantes de truncamiento N-terminal conservarán la capacidad de formar cápsides o estructuras tipo cápside.
Las proteínas adicionales adecuadas para usarse en la presente invención incluyen mutantes de truncamiento N-terminal y C-terminal que forman cápsides o estructuras tipo cápside. Los mutantes de truncamiento adecuados incluyen proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO: 10-27 en donde 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15 ó 17 aminoácidos han sido removidos del término N y 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15 ó 17 aminoácidos han sido removidos del término C. Típicamente, estos mutantes de truncamiento N-terminal y C-terminal conservarán la capacidad de formar cápsides o estructuras tipo cápside.
La invención incluye además composiciones que comprenden proteínas que comprenden, o alternativamente consisten esencialmente en, o alternativamente consisten en, secuencias de aminoácidos que son al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% idénticas a los mutantes de truncamiento descritos anteriormente.
En una realización preferida adicional de la presente invención, la por lo menos una proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL está unido a la partícula tipo virus de fago de ARN, respectivamente, por al menos un enlace covalente no peptídico. De preferencia, la por lo menos una proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL está unido a la partícula de núcleo y partícula tipo virus, respectivamente, por al menos un enlace covalente, el enlace covalente siendo un enlace no péptídico que lleve a una disposición ordenada y repetitiva de partículas de núcleo-RANKL y a una disposición o conjugado de RANKL-VLP, respectivamente. Esta disposición y conjugado de RANKL-VLP, respectivamente, tiene típicamente y de preferencia una estructura repetitiva y ordenada toda vez que la por lo menos una, pero normalmente más de una, proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL está unida a la VLP de una manera orientada. De preferencia, más de 10, 20, 40, 80, 120 proteínas RANKL, fragmentos RANKL o péptidos RANKL están unidos a la VLP. La formación de una disposición y conjugado de RANKL-VLP repetitiva y ordenada, respectivamente, es asegurada por una unión y fijación orientada y dirigida, así como definida, respectivamente, de la por lo menos una proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL a la VLP como se pondrá de manifiesto a continuación. Más aún, la estructura altamente repetitiva y organizada inherente típica de las VLP contribuye adecuadamente al despliegue de la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL de una manera altamente ordenada y repetitiva llevando a una disposición y conjugado de RANKL-VLP altamente organizada y repetitiva, respectivamente.
Por lo tanto, los conjugados y disposiciones de la invención que se prefieren, respectivamente, difieren de los conjugados de la técnica anterior en su estructura altamente organizada, dimensiones y en el carácter repetitivo del antígeno sobre la superficie de la disposición. La realización preferida de esta invención, además, permite la expresión tanto de la partícula como del antígeno en un huésped de expresión que garantice un doblez adecuado del antígeno, es decir, la por lo menos una proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL, y el doblez y ensamblaje adecuados de la VLP.
La presente invención describe métodos de unión de proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL a partículas de núcleo y VLP, respectivamente. Como se indica, en un aspecto de la invención, la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL es unido a la partícula de núcleo y VLP, respectivamente, por medio de un entrelazamiento químico, típicamente y de preferencia mediante el uso de un entrelazador heterobifuncional. Se conocen en la técnica varios enlazadores heterobifuncionales. En realizaciones preferidas, el enlazador heterobifuncional contiene un grupo funcional que puede reaccionar con primeros sitios de fijación preferidos, es decir, con el grupo amino de cadena lateral de residuos de lisina de la partícula de núcleo y la VLP o al menos una subunidad de VLP, respectivamente, y un grupo funcional adicional que puede reaccionar con un segundo sitio de fijación preferido, es decir, un residuo de cisteína naturalmente presente, puesto a disposición para reacción mediante reducción, o manipulado en la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL, y opcionalmente también puesto a disposición para su reacción por reducción. La primera etapa del procedimiento, típicamente llamada la derivación, es la reacción de la partícula de núcleo o la VLP con el entrelazador. El producto de esta reacción es una partícula de núcleo activada o VLP activada, también llamada vehículo activado. En la segunda etapa, el entrelazador no reaccionado se remueve usando métodos normales tales como filtración en gel o diálisis. En la tercera etapa, la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL se hace reaccionar con el vehículo activado, y esta etapa es llamada típicamente la etapa de acoplamiento. La proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL no reaccionado puede ser removido opcionalmente en una cuarta etapa, por ejemplo mediante diálisis. Varios entrelazadores heterobifuncionales se conocen en la técnica. Éstos incluyen los entrelazadores preferidos SMPH (Pierce), Sulfo-MBS, Sulfo-EMCS, Sulfo-GMBS, Sulfo-SIAB, Sulfo-SMPB, Sulfo-SMCC, SVSB, SIA y otros entrelazadores disponibles por ejemplo de Pierce Chemical Company (Rockford, IL, EE.UU.), y que tienen un grupo funcional reactivo hacia grupos amino y un grupo funcional reactivo hacia residuos de cisteína. Los entrelazadores mencionados anteriormente llevan todos a la formación de un enlace de tioéter. Otra clase de entrelazadores adecuados en la práctica de la invención se caracteriza por la introducción de un enlace de disulfuro entre la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL y la partícula de núcleo o VLP después del acoplamiento. Los entrelazadores preferidos que pertenecen a esta clase incluyen por ejemplo SPDP y Sulfo-LC-SPDP (Pierce). El grado de derivación de la partícula de núcleo y VLP, respectivamente, con el entrelazador, puede ser influenciado al variar las condiciones experimentales tales como la concentración de cada uno de los socios de reacción, el exceso de un reactivo sobre el otro, el pH, la temperatura y la fuerza iónica. El grado de acoplamiento, es decir, la cantidad de proteína RANKL, fragmento RANKL o péptidos RANKL por subunidades de la partícula de núcleo y VLP, respectivamente, se puede ajustar al variar las condiciones experimentales descritas anteriormente para que coincidan con los requerimientos de la vacuna. La solubilidad de la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL puede imponer una limitación en la cantidad de proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL que puede ser acoplada en cada subunidad, y en aquellos casos en los que la vacuna obtenida pudiera ser insoluble, reducir la cantidad de proteína RANKL, fragmento RANKL o péptidos RANKL por subunidad es benéfico.
Un método particularmente adecuado de unión de proteína RANKL, fragmento RANKL o péptidos RANKL a la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente, es el enlace de un residuo de lisina sobre la superficie de la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente, con un residuo de cisteína sobre la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL. De esta manera, en una realización preferida de la presente invención, el primer sitio de fijación es un residuo de lisina y el segundo sitio de fijación es un residuo de cisteína. En algunas realizaciones podría requerirse la manipulación de un enlazador de aminoácidos que contenga un residuo de cisteína, como un segundo sitio de fijación o como una parte del mismo, a la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL para su acoplamiento a la partícula de núcleo y VLP, respectivamente. Como alternativa, una cisteína puede ser introducida ya sea mediante inserción o mutación en la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL. Como alternativa, el residuo de cisteína o un grupo tiol puede ser introducido mediante acoplamiento químico.
La selección del enlazador de aminoácidos dependerá de la naturaleza del antígeno y auto-antígeno, respectivamente, es decir, de la naturaleza de la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL, en sus propiedades bioquímicas, tales como pI, distribución de carga y glicosilación. En general, se favorecen los enlazadores de aminoácidos flexibles. Las realizaciones preferidas del enlazador de aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste en: (a) CGG; (b) enlazador gamma 1 N-terminal; (c) enlazador gamma 3 N-terminal; (d) regiones de pivoteo de Ig; (e) enlazadores de glicina N-terminales; (f) (G)_{k}C(G)_{n} con n=0-12 y k=0-5; (g) enlazadores de glicina-serina N-terminales; (h) (G)_{k}C(G)_{m}(S)_{l}(GGGGS)_{n} con n=0-3, k=0-5, m=0-10, l=0-2; (i) GGC; (k) GGC-NH2; (l) enlazador gamma 1 C-terminal; (m) enlazador gamma 3 C-terminal; (n) enlazadores de glicina C-terminales; (o) (G)_{n}C(G)_{k} con n=0-12 y k=0-5; (p) enlazadores de glicina-serina C-terminales; (q) (G)_{m}(S)_{l}(GGGGS)_{n}(G)_{o}C(G)_{k} con n=0-3, k=0-5, m=0-10, l=0-2 y o=0-8.
Ejemplos preferidos adicionales de los enlazadores de aminoácidos son la región de pivoteo de inmunoglobulinas, enlazadores de glicina-serina (GGGGS)_{n} y enlazadores de glicina (G)_{n} todos conteniendo además un residuo de cisteína como segundo sitio de fijación y opcionalmente además residuos de glicina. Ejemplos típicamente preferidos de estos enlazadores de aminoácidos son gamma 1 N-terminal: CGDKTHTSPP; gamma 1 C-terminal: DKTHTSPPCG; gamma 3 N-terminal: CGGPKPSTPPGSSGGAP; gamma 3 C-terminal: PKPSTPPGSSGGAPGGCG; enlazador de glicina N-terminal: GCGGGG; enlazador de glicina C-terminal: GGGGCG; enlazador de glicina-lisina C-terminal: GGKKGC; enlazador de glicina-lisina N-terminal: CGKKGG.
En una realización preferida más de la presente invención, y en particular si el antígeno es un péptido RANKL, los enlazadores GGCG, GGC o GGC-NH2 ("NH2" indica amidación) en el término C del péptido o CGG en su término N se prefieren como enlazadores de aminoácidos. En general, los residuos de glicina serán insertados entre aminoácidos voluminosos y la cisteína que se usará como un segundo sitio de fijación, para evitar el impedimento estérico potencial del aminoácido más voluminoso en la reacción de acoplamiento.
El residuo de cisteína presente en la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL tiene que estar en su estado reducido para reaccionar con el enlazador heterobifuncional sobre la VLP activada, es decir un residuo de cisteína libre o de cisteína con un grupo sulfhidrilo libre tiene que estar disponible. En el caso en el que el residuo de cisteína que funcione como sitio de fijación esté en una forma oxidada, por ejemplo si está formando un puente de disulfuro, se requiere la reducción de este puente de disulfuro con, por ejemplo, DTT, TCEP o \beta-mercaptoetanol.
La unión de la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL a la partícula de núcleo y VLP, respectivamente, mediante el uso de un entrelazador heterobifuncional de acuerdo con los métodos preferidos descritos anteriormente, permite el acoplamiento de la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL a la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente, de una manera orientada. Otros métodos para unir la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL a la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente, incluyen métodos en los que la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL es entrelazado a la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente, usando la EDC carbodiimida y NHS. La proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL también puede ser tiolada primero a través de la reacción, por ejemplo con SATA, SATP o iminotiolano. La proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL, después de la desprotección si se requiere, puede ser acoplado después a la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente, como sigue. Después de la separación del reactivo de tiolación en exceso, la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL se hace reaccionar con la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente, activada anteriormente con un entrelazador heterobifuncional que comprenda una porción reactiva con cisteína, y por lo tanto desplegando al menos uno o varios grupos funcionales reactivos hacia residuos de cisteína, a los cuales la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL tiolado puede reaccionar, tal como se describió anteriormente. Opcionalmente, cantidades bajas de un agente reductor se incluyen en la mezcla de reacción. En métodos adicionales, la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL es unido a la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente, usando un entrelazador homobifuncional tal como glutaraldehído, DSG, BM[PEO]_{4}, BS^{3} (Pierce Chemical Company, Rockford, IL, EE.UU.) u otros entrelazadores homobifuncionales conocidos con grupos funcionales reactivos hacia grupos amina o grupos carboxilo de la partícula de núcleo y la VLP,
respectivamente.
En una realización más, la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL es unido a la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente, a través de la modificación de las porciones de carbohidrato presentes en la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL glicosilado y la reacción subsecuente con la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente. En una realización, la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL glicosilado se hace reaccionar con periodato de sodio en una reacción de oxidación leve de la porción de carbohidrato, para producir una proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL activado con uno o más grupos funcionales aldehído. La proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL activado de esta manera se separa de periodato de sodio en exceso y se hace reaccionar más con la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente, en donde los residuos de lisina de la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente, o de al menos una subunidad de VLP que reaccionan con el grupo funcional aldehído formado anteriormente en la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL, por ejemplo como se describe por Hermanson, G. T. en Bioconjugate Techniques, Academic Press Inc., San Diego, CA, EE.UU.. La autopolimerización de la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL activado se puede controlar al ajustar el pH como se describe en la publicación mencionada anteriormente. La base de Schiff formada es de preferencia reducida más con cianoborohidruro de sodio, el cual es posteriormente removido mediante filtración en gel o diálisis. Como alternativa, la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente, pueden ser hechas reaccionar con EDC en grupos carboxilo de la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente, o al menos una subunidad de VLP y una dihidrazida, tal como dihidrazida de ácido adípico, para producir una porción de hidrazida disponible para su reacción con uno o más grupos funcionales aldehído presentes en la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL activado. La hidrazona formada de esta manera se puede reducir más con cianoborohidruro de sodio. Como alternativa, la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL activado con uno o más grupos funcionales aldehído se hace reaccionar con cisteamina, dando como resultado la introducción de un grupo de cisteína en la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL. Métodos de entrelazamiento y entrelazadores adicionales, adecuados para unir una proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL a una partícula de núcleo y una VLP, respectivamente, así como una guía para llevar a cabo las reacciones de acoplamiento y acerca del uso de los entrelazadores químicos y procedimientos de entrelazamiento químico pueden encontrarse en Hermanson, G. T. en Bioconjugate Techniques, Academic Press Inc., San Diego, CA, EE.UU..
Otros métodos para unir la VLP a una proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL incluyen métodos en los que la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente, es biotilinada, y la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL es expresado como una proteína de fusión a estreptavidina, o métodos en los que tanto la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptidos RANKL como la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente, son biotilinados, por ejemplo como se describe en el documento WO 00/23955. En este caso, la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL pueden ser unidos primero a estreptavidina o avidina al ajustar la relación de proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL a estreptavidina de tal manera que los sitios de unión libres estén aún disponibles para la unión de la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente, la cual se añade en la siguiente etapa. Como alternativa, todos los componentes se pueden mezclar en una reacción de "un recipiente". Otros pares ligando-receptor, en donde una forma soluble del receptor y del ligando esté disponible, y sean capaces de ser entrelazados a la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente, o a la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL, se pueden usar como agentes de unión para unir la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL a la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente. Como alternativa, ya sea el ligando o el receptor se puede fusionar a la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL, y de esta manera mediar la unión a la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente, unida químicamente o fusionada de otra manera al receptor, o al ligando respectivamente. La fusión también se puede efectuar mediante inserción o sustitución.
Como ya se indicó, en la presente invención, la VLP es la VLP de un fago de ARN, y en una realización más preferida, la VLP es la VLP de una proteína de cápside Q\beta de fago de ARN.
Una o varias moléculas de antígeno, es decir, una proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL, se pueden unir a una subunidad de la cápside o VLP de proteínas de cápside de fagos de ARN, de preferencia a través de los residuos de lisina expuestos de la VLP de fagos de ARN, si es estéricamente permisible. Una característica específica de la VLP de la proteína de cápside de fagos de ARN y en particular de la VLP de la proteína de cápside Q\beta, es de esta manera la posibilidad de acoplar varios antígenos por subunidad. Esto permite la generación de una densa disposición de antígenos.
En una realización preferida de la invención, la unión y fijación, respectivamente, de la por lo menos una proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL a la partícula de núcleo y la partícula tipo virus, respectivamente es por medio de interacción y asociación, respectivamente, entre al menos un primer sitio de fijación de la partícula tipo virus y al menos un segundo sitio de fijación del antígeno o determinante antigénico.
Los VLP o cápsides de la proteína de cápside Q\beta despliegan un número definido de residuos de lisina sobre su superficie, con una topología definida con tres residuos de lisina apuntando hacia el interior de la cápside e interactuando con el ARN, y otros cuatro residuos de lisina expuestos al exterior de la cápside. Estas propiedades definidas favorecen la fijación de antígenos al exterior de la partícula, en lugar que al interior de la partícula en donde los residuos de lisina interactúan con ARN. Las VLP de otras proteínas de cápside de fago de ARN también tienen un número definido de residuos de lisina sobre su superficie y una topología definida de estos residuos de lisina.
En realizaciones preferidas adicionales de la presente invención, el primer sitio de fijación es un residuo de lisina y/o el segundo sitio de fijación comprende un grupo sulfhidrilo o un residuo de cisteína. En una realización muy preferida de la presente invención, el primer sitio de fijación es un residuo de lisina y el segundo sitio de fijación es un residuo de cisteína.
En realizaciones muy preferidas de la invención, la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL está unido por medio de un residuo de cisteína, ya sea presente naturalmente en la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL o manipulado, a residuos de lisina de la VLP de la proteína de cápside de fago de ARN, y en particular a la VLP de la proteína de cápside Q\beta.
Otra ventaja de las VLP derivadas de fagos de ARN es su alto rendimiento de expresión en bacterias que permite la producción de grandes cantidades de material a un costo alcanzable.
Como se indicó, los conjugados y disposiciones de la invención, respectivamente, difieren de los conjugados de la técnica anterior en su estructura altamente organizada, dimensiones y en el carácter repetitivo del antígeno sobre la superficie de la disposición. Más aún, el uso de las VLP como vehículos permite la formación de disposiciones y conjugados de antígenos robustas, respectivamente, con densidad de antígenos variable. En particular, el uso de VLP de fagos de ARN, y por ello en particular el uso de la VLP de la proteína de cápside Q\beta de fago de ARN permite lograr una densidad de epítopes muy alta. La preparación de composiciones de VLP de proteínas de cápside de fago de ARN con una alta densidad de epítopes se puede llevar a cabo usando la enseñanza de esta solicitud.
El segundo sitio de fijación, como se define en la presente, puede estar presente naturalmente o no naturalmente con el antígeno o el determinante antigénico. En caso de ausencia de un segundo sitio de fijación adecuado que ocurra naturalmente en el antígeno o determinante antigénico, entonces un segundo sitio de fijación, no natural, tiene que ser manipulado al antígeno.
Como se describió anteriormente, cuatros residuos de lisina están expuestos sobre la superficie de la VLP de la proteína de la proteína de cápside Q\beta. Típicamente, estos residuos son derivados después de la reacción con una molécula entrelazadora. En caso de que no todos los residuos de lisina expuestos puedan ser acoplados a un antígeno, los residuos de lisina que hayan reaccionado con el entrelazador se dejan con una molécula entrelazadora unida al grupo \varepsilon-amino después de la etapa de derivación. Esto lleva a la desaparición de una o varias cargas positivas, lo cual puede ser dañino para la solubilidad y estabilidad de la VLP. Al reemplazar algunos de los residuos de lisina con argininas, como en los mutantes de proteína de cápside Q\beta descritos más adelante, se evita la desaparición excesiva de cargas positivas toda vez que los residuos de arginina no reaccionan con el entrelazador. Más aún, el reemplazo de los residuos de lisina por argininas podría llevar a disposiciones de antígenos más definidas, ya que están disponibles menos sitios para la reacción al antígeno.
En consecuencia, los residuos de lisina expuestos fueron reemplazados por argininas en los siguientes mutantes de proteína de cápside Q\beta y VLP de Q\beta mutantes descritos en esta solicitud: Q\beta-240 (Lys13-Arg; SEQ ID NO: 23), Q\beta-250 (Lys 2-Arg, Lys13-Arg; SEQ ID NO: 25) y Q\beta-259 (Lys 2-Arg, Lys16-Arg; SEQ ID NO: 27). Las construcciones fueron clonadas, las proteínas expresadas, las VLP purificadas y usadas para el acoplamiento a antígenos de péptidos y proteínas. Q\beta-251 (SEQ ID NO: 26) se construyó también, y una guía acerca de cómo expresar, purificar y acoplar la VLP de proteína de cápside Q\beta-251 se puede encontrar a lo largo de la solicitud.
En una realización más, se describe una proteína de cápside mutante Q\beta con un residuo de lisina adicional, adecuada para obtener disposiciones de antígenos de densidad todavía más alta. Esta proteína de cápside Q\beta mutante, Q\beta-243 (Asn 10-Lys; SEQ ID NO: 24), fue clonada, la proteína expresada y la cápside o VLP aislada y purificada, mostrando que la introducción del residuo de lisina adicional es compatible con el auto-ensamblaje de las subunidades a una cápside o VLP. De esta manera, las disposiciones y conjugados de proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL, respectivamente, se pueden preparar usando VLP de mutantes de proteína de cápside Q\beta. Un método de fijación de antígenos VLP que se prefiere particularmente, y en particular a VLP de proteínas de cápside de fago de ARN es el enlace de un residuo de lisina presente sobre la superficie de la VLP de proteínas de cápside de fago de ARN con un residuo de cisteína presente naturalmente o manipulado sobre el antígeno, es decir, la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL. Para que un residuo de cisteína sea efectivo como un segundo sitio de fijación, debe estar disponible un grupo sulfhidrilo para el acoplamiento. De esta manera, un residuo de cisteína tiene que estar en su estado reducido, es decir, una cisteína libre o un residuo de cisteína con un grupo sulfhidrilo libre tiene que estar disponible. En caso de que el residuo de cisteína que funcione como segundo sitio de fijación esté en una forma oxidada, por ejemplo si está formando un puente de disulfuro, se requiere la reducción de este puente de disulfuro con, por ejemplo, DTT, TCEP o \beta-mercaptoetanol. La concentración de reductor y el exceso molar del reductor sobre el antígeno se tienen que ajustar para cada antígeno. Se prueba una escala de concentración, que se inicia a partir de concentraciones tan bajas como 10 \muM o menos, hasta 10 a 20 mM o más altas, de reductor si se requiere, y se determina el acoplamiento del antígeno al vehículo. Aunque bajas concentraciones de reductor son compatibles con la reacción de acoplamiento, concentraciones más altas inhiben la reacción de acoplamiento, como un experto en la técnica sabrá, en cuyo caso el reductor tiene que ser removido mediante diálisis o filtración en gel. De manera adecuada, el pH de la diálisis o regulador de pH de equilibrio es de menos de 7, de preferencia 6. La compatibilidad del regulador de pH de bajo pH con la actividad o estabilidad del antígeno tiene que ser probada.
La densidad de epítopes en la VLP de proteínas de cápside de fago de ARN puede modularse por la elección del entrelazador y otras condiciones de reacción. Por ejemplo, los entrelazadores Sulfo-GMBS y SMPH típicamente permiten alcanzar una densidad de epítopes alta. La derivación es influenciada positivamente por la alta concentración de reactivos, y la manipulación de las condiciones de reacción se puede usar para controlar el número de antígenos acoplados a VLP de proteínas de cápside de fago de ARN, y en particular a VLP de proteína de cápside Q\beta.
Antes del diseño de un segundo sitio de fijación no natural, tiene que seleccionarse la posición en la cual debe ser fusionado, insertado o manipulado generalmente. La selección de la posición del segundo sitio de fijación puede, a manera de ejemplo, basarse en una estructura cristalina del antígeno. Esta estructura cristalina del antígeno puede proporcionar información acerca de la disponibilidad de los términos C o N de la molécula (determinada por ejemplo a partir de su accesibilidad a solventes), o sobre la exposición a solvente de residuos adecuados para usarse como segundos sitios de fijación, tales como residuos de cisteína. Los puentes de disulfuro expuestos, como es el caso para fragmentos Fab, también pueden ser una fuente de un segundo sitio de fijación, ya que se pueden convertir generalmente en residuos de cisteína individuales a través de reducción leve. Se seleccionan condiciones de reducción leves que no afecten la inmunogenicidad de la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL. En general, en caso de que la inmunización con un auto-antígeno apunte a inhibir la interacción de este auto-antígeno con sus ligandos naturales, el segundo sitio de fijación será añadido de tal manera que permita la generación de anticuerpos contra el sitio de interacción con los ligandos naturales. De esta manera, la localización del segundo sitio de fijación se seleccionará de tal manera que se evite el impedimento estérico del segundo sitio de fijación o cualquier otro enlazador de aminoácidos que contenga el mismo. En realizaciones adicionales, se desea una respuesta de anticuerpos dirigida a un sitio distinto del sitio de interacción del auto-antígeno con su ligando natural. En tales realizaciones, el segundo sitio de fijación se puede seleccionar de tal manera que evite la generación de anticuerpos contra el sitio de interacción del auto-antígeno con sus ligandos naturales.
Otros criterios para seleccionar la posición del segundo sitio de fijación incluyen el estado de oligomerización del antígeno, el sitio de oligomerización, la presencia de un cofactor y la disponibilidad de evidencia experimental que describa sitios en la estructura y secuencia del antígeno en donde la modificación del antígeno sea compatible con la función del auto-antígeno, o con la generación de anticuerpos que reconozcan el auto-antígeno.
\newpage
En las realizaciones más preferidas, la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL comprende un solo segundo sitio de fijación o un solo sitio de fijación reactivo capaz de asociarse con el primero sitio de fijación sobre la partícula de núcleo y las VLP o subunidades de VLP, respectivamente. Esto asegura una unión y asociación definida y uniforme, respectivamente, del por lo menos uno, pero típicamente más de uno, de preferencia más de 10, 20, 40, 80, 120 antígenos, a la partícula de núcleo y VLP, respectivamente. La provisión de un solo segundo sitio de fijación o de un solo sitio de fijación reactivo sobre el antígeno, de esta manera, asegura un solo y uniforme tipo de unión y asociación, llevando respectivamente a una disposición muy altamente ordenada y repetitiva. Por ejemplo, si la unión y asociación, respectivamente, se lleva a cabo por medio de una interacción con lisina (como el primer sitio de fijación) y cisteína (como un segundo sitio de fijación), se asegura, de acuerdo con esta realización preferida de la invención, que sólo un residuo de cisteína por antígeno, independientemente de si este residuo de cisteína está presente natural o no naturalmente sobre el antígeno, es capaz de unirse y asociarse, respectivamente, con la VLP y el primer sitio de fijación de la partícula de núcleo, respectivamente.
En algunas realizaciones, la manipulación de un segundo sitio de fijación sobre el antígeno requiere la fusión de un enlazador de aminoácido que contenga un aminoácido adecuado como segundo sitio de fijación de acuerdo con las descripciones de esta invención. Por lo tanto, en una realización preferida de la presente invención, un enlazador de aminoácidos es unido al antígeno o al determinante antigénico por medio de al menos un enlace covalente. De preferencia, el enlazador de aminoácidos comprende, o consiste alternativamente en, el segundo sitio de fijación. En una realización preferida más, el enlazador de aminoácidos comprende un grupo sulfhidrilo o un residuo de cisteína. En otra realización preferida, el enlazador de aminoácido es cisteína. Ya se han mencionado anteriormente algunos criterios de selección del enlazador de aminoácidos así como realizaciones más preferidas del enlazador de aminoácidos de acuerdo con la invención.
En una realización preferida más de la invención, la VLP es una VLP de un fago de ARN. Las principales proteínas de cápside de fagos de ARN se ensamblan espontáneamente en VLP después de su expresión en bacterias, y en particular en E. coli. Ejemplos específicos de proteínas de cápside de bacteriófagos que pueden usarse para preparar las composiciones de la invención incluyen las proteínas de cápside de bacteriófagos de ARN tales como bacteriófago Q\beta (SEQ ID NO: 10; base de datos PIR, nº de acceso VCBPQ\beta que se refiere a Q\beta CP y SEQ ID NO: 11; nº de acceso AAA16663 que se refiere a proteína A1 de Q\beta) y bacteriófago fr (SEQ ID NO: 4; PIR nº de acceso VCBPFR).
Las construcciones de proteínas de fusión en las que los epítopes han sido fusionados al término C de una forma truncada de la proteína A1 de Q\beta, o insertadas en la proteína A1 han sido descritas (Kozlovska, T. M. y otros, Intervirology, 39:9-15 (1996)). La proteína A1 se genera mediante la supresión en el codón de detención UGA y tiene una longitud de 329 aminoácidos, o 328 aminoácidos, si el corte de la metionina N-terminal se toma en cuenta. El corte de la metionina N-terminal antes de una alanina (el segundo aminoácido codificado por el gen Q\beta CP) normalmente tiene lugar en E. coli, y este es el caso para los términos N de las proteínas de cápside Q\beta de CP. La parte del gen A1, 3' del codón ámbar UGA codifica la extensión de CP, la cual tiene una longitud de 195 aminoácidos. Por ejemplo, Kozlovska y otros (Intervirology, 39:9-15 (1996)) describen fusiones de proteínas A1 de Q\beta en donde el epítope es fusionado en el término C de la extensión de Q\beta CP truncada en la posición 19.
La producción de partículas de mosaico se puede llevar a cabo de un cierto número de maneras. Kozlovska y otros, Intervirology, 39:9-15 (1996), describen dos métodos, ambos de los cuales pueden usarse en la práctica de la invención. En el primer enfoque, el despliegue eficiente del epítope fusionado sobre las VLP es mediado por la expresión del plásmido que codifica la fusión de la proteína A1 de Q\beta que tiene un codón de detención UGA entre CP y extensión de CP en una cepa de E. coli que porta un plásmido que codifica un ARNt supresor de UGA clonado que lleva a la traducción del codón UGA en Trp (plásmido pISM3001 (Smiley B. K. y otros, Gene 134:33-40 (1993))). En otro enfoque, el codón de detención del gen CP es modificado en UAA, y un segundo plásmido que expresa la fusión de proteína A1-proteína RANKL, -fragmento RANKL o -péptido RANKL es cotransformado. El segundo plásmido codifica una diferente resistencia a antibiótico y el origen de replicación es compatible con el primer plásmido (Kozlovska, T. M. y otros, Intervirology 39:9-15 (1996)). En un tercer enfoque, CP y la fusión de proteína A1-proteína RANKL, -fragmento RANKL o -péptido RANKL son codificadas de una manera bicistrónica, ligadas operativamente a un promotor tal como el promotor Trp, como se describe en la figura 1 de Kozlovska y otros, Intervirology, 39:9-15 (1996).
La fusión de epítopes en la horquilla \beta protuberante N-terminal de la proteína de cápside del fago de ARN MS-2 y la presentación subsiguiente del epítope fusionado sobre la VLP auto-ensamblada del fago de ARN MS-2 también se ha descrito (documento WO 92/13081).
En una realización muy preferida adicional de la invención, el antígeno o determinante antigénico es una proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL humano.
En una realización muy preferida más de la invención, el antígeno o determinante antigénico comprende, o alternativamente consiste esencialmente en, o alternativamente consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 79; b) la secuencia de aminoácidos de cualquier fragmento de SEQ ID NO: 79.
En una realización preferida más de la invención, el antígeno o determinante antigénico es una variante de proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL, por ejemplo, que contiene en particular sustituciones de aminoácido o inserciones de péptidos o polimorfismos. Como ya se indicó, las composiciones y composiciones de vacuna, respectivamente, que comprenden variantes de proteína RANKL, fragmento FRANKL o péptido RANKL están incluidas dentro del alcance de la presente invención.
En una realización preferida más de la invención, el antígeno o determinante antigénico es un fragmento RANKL. De preferencia, el antígeno o determinante antigénico es un fragmento RANKL humano seleccionado del grupo de a) la región extracelular de RANKL humana, b) la isoforma de empalme 1 de RANKL humana, c) la isoforma de empalme 2 que resulta en una RANKL humana secretada, d) la región soluble, proteolíticamente producida, de RANKL humana, y e) la región homóloga a FNT-\alpha.
En una realización muy preferida adicional de la invención, el antígeno o determinante antigénico comprende, o alternativamente consiste esencialmente en, o alternativamente consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 79; b) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 80; c) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 81; d) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 82; e) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83; f) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 84; g) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 100; h) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 101; i) la secuencia de aminoácidos de cualquier fragmento de cualquiera de SEQ ID NO: 79-84, 100, 101.
La proteína RANKL y fragmentos RANKL se pueden producir mediante la expresión del ADNc de RANKL en sistemas de expresión procarióticos o eucarióticos. Se han descrito hasta la fecha varios ejemplos en la literatura y pueden usarse, posiblemente después de modificaciones, para expresar cualquier proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL de cualquier especie deseada. La proteína RANKL y fragmentos RANKL han sido expresados en células de mamífero (Anderson, D. M. y otros, Nature 390: 175-179 (1997); Lacey, D. L. y otros, Cell 93: 165-176 (1998); Wong, B. R. y otros, J. Biol. Chem. 272:25190-25194 (1997); Lum, L. y otros, J. Biol. Chem., 274:13613-13618 (2000)), en células de insecto (Willard, D. y otros, Prot. Express. Purif. 20:48-57 (2000)) y en células procarióticas (Xu, J. y otros, J. Bone Mineral Res. 15:2178-86 (2000); Yasuda y otros, Proc. Natl. Acad. Sci USA 95:3597-3602 (1998)). Las descripciones de cómo producir proteínas y fragmentos RANKL también se dan en los documentos WO 98/46751, US 5.843.678, WO 98/259958, US 6.242.586, WO 98/28426, US 6.242.213, WO 99/29865, JP 2000102390 y WO 00/15807.
En una realización preferida más de la invención, el antígeno o determinante antigénico es un péptido RANKL. Estos péptidos RANKL o fragmentos del mismo se pueden producir usando tecnologías de biología molecular estándares en donde la secuencia de nucleótidos que codifique el fragmento de interés sea amplificada mediante PCR y sea clonada como una fusión a un marcador de polipéptidos, tal como el marcador de histidina, el marcador Flag, marcador myc o la región constante de un anticuerpo (región Fc). Al introducir un sitio de corte de proteasa entre el fragmento RANKL y el marcador, el fragmento RANKL puede ser separado del marcador después de la purificación mediante digestión con proteasa correspondiente. En otro enfoque el fragmento RANKL puede ser sintetizado in vitro usando síntesis y reacciones de péptidos estándares conocidas por una persona capacitada en la técnica. En un enfoque más, los péptidos RANKL o fragmentos RANKL pueden producirse mediante digestión con proteasa o corte químico de la proteína RANKL o fragmentos RANKL de longitud completa, ambos métodos que son bien conocidos por las personas entrenadas en la técnica.
En una realización preferida más de la presente invención, el antígeno o determinante antigénico comprenden además al menos un segundo sitio de fijación que se selecciona del grupo que consiste en: (i) un sitio de fijación que no ocurre naturalmente con el antígeno o determinante antigénico; y (ii) un sitio de fijación que ocurre naturalmente con el antígeno o determinante antigénico. Una guía acerca de cómo modificar la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL para unirse a la partícula tipo virus se da a lo largo de la solicitud. Los segundos sitios de fijación que se prefieren contienen un residuo de cisteína para unirse a la VLP derivada y ejemplos se dan en la descripción anterior y en los ejemplos 12 y 13.
Se ha construido un modelo para la estructura tridimensional de la región de RANKL humana que es homóloga a FNT-\alpha. Se ha encontrado que la cisteína que ocurre naturalmente podría no ser accesible en la estructura doblada para su interacción con un primer sitio de fijación sobre la VLP de acuerdo con la presente invención. El presente modelo fue confirmado por la estructura de rayos X de RANKL de ratón que fue resuelta recientemente (Lam, J. y otros, J. Clin. Invest., 108:971-979 (2002)). El término N se prefiere para unir un segundo sitio de fijación que comprenda el enlazador de aminoácidos con un residuo de cisteína adicional como se muestra en el ejemplo 12. Sin embargo, un enlazador de aminoácidos que contenga un residuo de cisteína como un segundo sitio de fijación y que esté fusionado en el término C de la construcción RANKL lleva a una realización preferida más de la invención como la mostrada en el ejemplo 13. Una construcción RANKL humana con un enlazador de aminoácidos N-terminal que contenga un residuo de cisteína fusionado a la región extracelular de RANKL es una realización muy preferida de la invención.
Se describen las construcciones de fragmento RANKL de ratón (SEQ ID NO: 96 y SEQ ID NO: 99), y también se pueden generar las construcciones de fragmento RANKL humano preferidas y tener, por ejemplo, la secuencia de las SEQ ID NO: 100-104. Construcciones adicionales que se prefieren comprenden la proteína RANKL humana entera, un fragmento RANKL humano seleccionado del grupo de a) la región extracelular de RANKL (SEQ ID NO: 82), b) la isoforma de empalme 1 de RANKL (SEQ ID NO: 80), c) la isoforma de empalme 2 que resulta en una RANKL secretada (SEQ ID NO: 81), d) la región soluble producida proteolíticamente de RANKL (SEQ ID NO: 83), y e) la región homóloga de FNT-\alpha (SEQ ID NO: 84) o secuencias de péptidos RANKL humanos. La inmunización contra proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL usando las composiciones de la invención que comprenden de preferencia una proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL humano unido a una VLP pueden proporcionar una forma de tratamiento o prevención de enfermedades óseas.
En una realización preferida más de la presente invención, la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL comprende al menos un sitio antigénico de una proteína RANKL. La persona capacitada en la técnica conoce cómo identificar los correspondientes péptidos y secuencias de aminoácidos, respectivamente.
En una realización preferida más de la presente invención, el antígeno o determinante antigénico es un péptido RANKL que es crucial para la interacción con el receptor RANK. El presente modelaje de la estructura RANKL humana y la estructura cristalina publicada de la RANKL de ratón mostraron que el monómero de RANKL consiste en un intercalado \beta, compuesto de dos láminas \beta antiparalelas planas. La primera lámina está formada por hebras \beta A'', A, H, C y F mientras que la segunda lámina está formada por hebras \beta B', B, G, D y E. La lámina \beta A''AHCF interior está implicada en la asociación entre subunidades, mientras que la lámina \beta B'BGDE contribuye ampliamente a la superficie exterior. Las hebras \beta están conectadas por medio del tallo AA'', el tallo CD, el tallo DE, el tallo EF. El homotrímero es ensamblado de tal manera que un borde del intercalado \beta en cada monómero de RANKL se empaque contra la superficie hidrofóbica interior de la lámina \beta AHCF del monómero adyacente. El sitio de unión a RANK se cree que abarca la hendidura formada por monómeros adyacentes del homotrímero. Con base en la homología entre la secuencia de ratón y humana se seleccionan péptidos que abarcan el sitio de unión a RANKL. En una realización preferida péptidos del sitio de interacción de RANKL con RANK se seleccionan del grupo que consiste en a) el tallo AA'' que abarca los aminoácidos 171-194 (SEQ ID NO: 87), b) el tallo DE que abarca los aminoácidos 246-253 (SEQ ID NO: 88), c) la hebra \beta D que abarca los aminoácidos 235-245 (SEQ ID NO: 89), d) el tallo CD que abarca los aminoácidos 223-234 (SEQ ID NO: 90), e) el tallo EF que abarca 262-272 (SEQ ID NO: 91), f) la hebra \beta B'-tallo B'B que abarca los aminoácidos 200-207 (SEQ ID NO: 92), g) el tallo GH que abarca los aminoácidos 300-305 (SEQ ID NO: 93), h) cualquier fragmento de estos péptidos a-g, i) cualquier extensión N- y/o C-terminal de los péptidos a-g de al menos un aminoácido y hasta 25 aminoácidos, j) cualquier fusión de péptidos a-i. Otros péptidos RANKL adecuados para usarse en la presente invención se pueden determinar experimentalmente por su propiedad intrínseca para inducir una respuesta a células T o a anticuerpos. Esto se logra generalmente al inmunizar un animal experimental por separado con péptidos seleccionados en una formulación inmunológicamente adecuada y al medir células T y células B, es decir, respuestas a anticuerpos, usando métodos bien conocidos por una persona capacitada en la técnica. En caso de que el antígeno sea una proteína, un polipéptido o un péptido, esta región puede formarse mediante una secuencia de aminoácidos continua. Como alternativa, el epítope de anticuerpo puede formarse por una secuencia de aminoácidos discontinua en la cual, después del doblez tridimensional de la proteína, polipéptido o péptido, los aminoácidos sean dispuestos de tal manera que se junten más espacialmente y formen el epítope. Los fragmentos de péptido continuos de interés pueden identificarse por experimentos de inmunización como se describió anteriormente.
Otros péptidos RANKL que se prefieren adecuados para usarse para la presente invención pueden identificarse mediante el uso de anticuerpos monoclonales o policlonales existentes o futuros, los procedimientos hasta el momento se conocen por los expertos en la técnica.
Otros péptidos RANKL adecuados para usarse para la presente invención se pueden identificar tamizando bibliotecas de péptidos de despliegue de fagos con anticuerpos específicos para RANKL, un método bien conocido por una persona entrenada en la técnica.
En una realización preferida más de la invención, el antígeno o determinado antigénico es RANKL aislada de cualquier animal así como de cualquier fragmento antigénico de RANKL de cualquier animal. Los expertos en la técnica conocen cómo producir fragmentos y péptidos de estas proteínas o fragmentos RANKL aislados.
Se entenderá por parte de cualquier persona de capacidad ordinaria en las técnicas pertinentes que otras modificaciones y adaptaciones adecuadas a los métodos y aplicaciones descritos en la presente son claramente evidentes y pueden hacerse sin salir del alcance de la invención o cualquier realización de la misma. Habiendo descrito ahora la presente invención en detalle, la misma se entenderá más claramente mediante la referencia a los siguientes ejemplos, los cuales están incluidos en la presente por motivos de ilustración únicamente y no se intenta que sean limitativos de la misma.
Ejemplo 1 Construcción y expresión de proteínas de cápside Q\beta mutantes, y purificación de VLP o cápsides de proteína de cápside Q\beta mutante Construcción de plásmidos y clonación de de proteínas de cápside mutantes Construcción de pQ\beta-240
El plásmido pQ\beta10 (Kozlovska, T. M. y otros, Gene 137:133-137) se usó como un plásmido inicial para la construcción de pQ\beta-240. La mutación Lys13\rightarrowArg se creó mediante PCR inversa. Los cebadores inversos se diseñaron en direcciones de cola a cola invertidas:
\quad
5'-GGTAACATCGGTCGAGATGGAAAACAAACTCTGGTCC-3'
y
\quad
5'-GGACCAGAGTTTGTTTTCCATCTCGACCGATGTTACC-3'.
\vskip1.000000\baselineskip
Los productos de la primera PCR se usaron como plantillas para la segunda reacción de PCR, en la cual se usaron un cebador aguas arriba
\quad
5'AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3'
y un cebador aguas abajo
\quad
5'-CGATGCATTTCATCCTTAGTATCAATACGCTGGGTTCAG-3'.
\vskip1.000000\baselineskip
El producto de la segunda PCR fue digerido con XbaI y Mph1103I y clonado en el vector de expresión pQ\beta10, el cual fue cortado por las mismas enzimas de restricción. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo con reactivos de equipo de PCR de acuerdo con el protocolo del productor (MBI Fermentas, Vilnius, Lituania).
La secuenciación usando el método de incorporación de etiqueta directo verificó las mutaciones deseadas. Células de E. coli que portaban pQ\beta-240 soportaron la síntesis eficiente de proteína de 14-kD que co-migraba sobre SDS-PAGE con proteína de cápside Q\beta de control aislada de partículas de fago Q\beta.
Secuencia de aminoácidos resultante: (SEQ ID NO: 23)
\quad
AKLETVTLGNIGRDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP
\quad
ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ
\quad
KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLAASPLLIDAIDQLNPAY
\vskip1.000000\baselineskip
Construcción de pQ\beta-243
El plásmido pQ\beta10 se usó como un plásmido inicial para la construcción de pQ\beta-243. La mutación Asn10\rightarrowLys se creó mediante PCR inversa. Los cebadores inversos se diseñaron en direcciones invertidas de cola a cola:
\quad
5'-GGCAAAATTAGAGACTGTTACTTTAGGTAAGATCGG-3'
y
\quad
5'-CCGATCTTACCTAAAGTAACAGTCTCTAATTTTGCC-3'.
\vskip1.000000\baselineskip
Los productos de la primera PCR se usaron como plantillas para la segunda reacción de PCR, en la cual se usaron un cebador aguas arriba
\quad
5'-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3'
y un cebador aguas abajo
\quad
5'-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3'.
\vskip1.000000\baselineskip
El producto de la segunda PCR fue digerido con XbaI y Mph1103I y se clonó en el vector de expresión pQ\beta10, el cual fue cortado por las mismas enzimas de restricción. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo con reactivos de equipo de PCR y de acuerdo con el protocolo del productor (MBI Fermentas, Vilnius, Lituania).
La secuenciación usando el método de incorporación de etiqueta directo verificó las mutaciones deseadas. Células de E. coli que portaban pQ\beta-243 soportaron la síntesis eficiente de la proteína de 14-kD que co-migraba sobre SDSD-PAGE con proteína de cápside Q\beta de control aislada de partículas de fago Q\beta.
\newpage
Secuencia de aminoácidos resultante: (SEQ ID NO: 24)
\quad
AKLETVTLGKIGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP
\quad
ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ
\quad
KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY
\vskip1.000000\baselineskip
Construcción de pQ\beta-250
El plásmido pQ\beta-240 se usó como un plásmido inicial para la construcción de pQ\beta-250. La mutación Lys2\rightarrowArg fue creada mediante mutagénesis dirigida a sitio. Se usaron un cebador aguas arriba
\quad
5'-GGCCATGGCACGACTCGAGACTGTTACTTTAGG-3'
y un cebador aguas abajo
\quad
5'-GATTTAGGTGACACTATAG-3'
para la síntesis del fragmento de PCR mutante, el cual se introdujo en el vector de expresión pQ\beta-185 en los sitios de restricción únicos NcoI y HindIII. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo con reactivos de equipo para PCR de acuerdo con el protocolo del productor (MBI Fermentas, Vilnius, Lituania).
La secuenciación usando el método de incorporación de etiqueta directo verificó las mutaciones deseadas. Células de E. coli que portaban pQ\beta-250 soportaron la síntesis eficiente de la proteína de 14-kD que co-migraba sobre PAGE con proteína de cápside Q\beta de control aislada de partículas de fago Q\beta.
Secuencia de aminoácido resultante: (SEQ ID NO: 25)
\quad
ARLETVTLGNIGRDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP
\quad
ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPATACTANGSCDPSVTRQ
\quad
KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY
\vskip1.000000\baselineskip
Construcción de pQ\beta-251
El plásmido pQ\beta10 se usó como un plásmido inicial para la construcción de pQ\beta-251. La mutación Lys16\rightarrowArg fue creada mediante PCR inversa. Los cebadores inversos fueron diseñados en direcciones invertidas de cola a cola:
\quad
5'GATGGACGTCAAACTCTGGTCCTCAATCCGCGTGGGG-3'
y
\quad
5'CCCCACGCGGATTGAGGACCAGAGTTTGACGTCCATC-3'.
\vskip1.000000\baselineskip
Los productos de la primera PCR se usaron como plantillas para la segunda reacción de PCR, en la cual se usaron un cebador aguas arriba
\quad
5'-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3'
y un cebador aguas abajo
\quad
5'-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3'.
\vskip1.000000\baselineskip
El producto de la segunda PCR fue digerido con XbaI y Mph1103I y clonado en el vector de expresión pQ\beta10, el cual fue cortado por las mismas enzimas de restricción. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo con reactivos de equipo de PCR y de acuerdo con el protocolo del productor (MBIFermentas, Vilnius, Lituania).
La secuenciación usando el método de incorporación de etiqueta directo verificó las mutaciones deseadas. Células de E. coli que portaban pQ\beta-251 soportaron la síntesis eficiente de proteína de 14-kD que co-migraba sobre SDS-PAGE con proteína de cápside Q\beta de control aislada de partículas de fago Q\beta. La secuencia de aminoácidos resultante codificada por esta construcción se muestra en SEQ. ID NO: 26.
\vskip1.000000\baselineskip
Construcción de pQ\beta-259
El plásmido pQ\beta-251 se usó como un plásmido inicial para la construcción de pQ\beta-259. La mutación Lys2\rightarrowArg fue creada mediante mutagénesis dirigida a sitio. Se usaron un cebador aguas arriba
\quad
5'-GGCCATGGCACGACTCGAGACTGTTACTTTAGG-3'
y un cebador aguas abajo
\quad
5'-GATTTAGGTGACACTATAG-3'
para la síntesis del fragmento de PCR mutante, el cual se introdujo en el vector de expresión pQ\beta-185 en sitios de restricción únicos NcoI y HindIII. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo con reactivos de equipo para PCR de acuerdo con el protocolo del productor (MBI Fermentas, Vilnius, Lituania).
La secuenciación usando el método de incorporación de etiqueta directo verificó las mutaciones deseadas. Células de E. coli que portaban pQ\beta-259 soportaron la síntesis eficiente de proteína de 14-kD que co-migraba sobre SDS-PAGE con proteína de cápside Q\beta de control aislada de partículas de fago Q\beta.
Secuencia de aminoácidos resultante: (SEQ ID NO: 27)
\quad
AKLETVTLGNIGDKGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP
\quad
ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ
\quad
KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimientos generales para la expresión y purificación de Q\beta y mutantes de Q\beta Expresión
JM109 de E. coli se transformó con plásmidos de expresión de proteína de cápside Q\beta. 5 ml de medio líquido LB que contenía 20 \mug/ml de ampicilina fueron inoculados con clones transformados con plásmidos de expresión de proteína de cápside Q\beta. El cultivo inoculado se incubó a 37ºC durante 16-24 horas sin agitación. El inóculo preparado se diluyó subsecuentemente 1:100 en 100-300 ml de medio LB fresco, que contenía 20 \mug/ml de ampicilina y se incubó a 37ºC durante la noche sin agitación. El segundo inóculo resultante se aisló y se diluyó 1:50 en medio M9 que contenía 1% de casaminoácidos y 0,2% de glucosa en matraces, y se incubó a 37ºC durante la noche con agitación.
Purificación
Soluciones y reguladores de pH para el procedimiento de purificación:
1. Regulador de pH de lisis LB
50 mM de Tris-HCl pH 8,0, con 5mM de EDTA, 0,1% de tritón X100 y PMSF recién preparado a una concentración de 5 microgramos por ml. Sin lisozima y ADNasa.
2. SAS
Sulfato de amonio saturado en agua
3. Regulador de pH NET.
20 mM de Tris-HCl, pH 7,8 con 5 mM de EDTA y 150 mM de NaCl.
4. PEG
40% (p/v) de polietilenglicol 6000 en NET
Ruptura y lisis
Las células congeladas fueron resuspendidas en LB a 2 ml/g células. La mezcla se sonificó con 22 kH cinco veces durante 15 segundos, con intervalos de un minuto para enfriar la solución sobre hielo. El lisado se centrifugó después a 14.000 rpm durante una hora usando un rotor Janecki K 60. Las etapas de centrifugación descritas más adelante se llevaron a cabo todas usando el mismo rotor, excepto cuando se indique lo contrario. El sobrenadante fue almacenado a 4ºC, mientras que los restos de células fueron lavados dos veces con LB. Después de la centrifugación, los sobrenadantes del lisado y fracciones de lavado fueron agrupados.
Fraccionamiento
Una solución saturada de sulfato de amonio se añadió por goteo bajo agitación al lisado agrupado anterior. El volumen del SAS se ajustó para que fuera un quinto del volumen total, para obtener 20% de saturación. La solución se dejó reposar durante la noche, y se centrifugó al día siguiente a 14.000 rpm durante 20 minutos. La pella se lavó con una pequeña cantidad de 20% de sulfato de amonio y se centrifugó de nuevo. Los sobrenadantes obtenidos se agruparon y se añadió SAS por goteo para obtener 40% de saturación. La solución se dejó reposar durante la noche y se centrifugó al día siguiente a 14.000 rpm durante 20 minutos. La pella obtenida se solubilizó en regulador de pH NET.
Cromatografía
La cápside o proteína VLP resolubilizada en regulador de pH NET se cargó en una columna Sepharose CL-4B. Tres picos eluyeron durante la cromatografía. El primero contenía principalmente membranas y fragmentos de membrana, y no fue recogido. Las cápsides estaban contenidas en el segundo pico, mientras que el tercero contenía otras proteínas de E. coli.
Las fracciones pico se agruparon, y la concentración de NaCl se ajustó a una concentración final de 0,65 M. Un volumen de solución de PEG que correspondía a una mitad de la fracción pico agrupada se añadió por goteo bajo agitación. La solución se dejó reposar durante la noche sin agitación. La proteína de cápside fue sedimentada mediante centrifugación a 14.000 rpm durante 20 minutos. Después fue solubilizada en un volumen mínimo de NET y cargada de nuevo sobre la columna Sepharose CL-4B. Las fracciones pico fueron agrupadas, y se precipitaron con sulfato de amonio a 60% de saturación (p/v). Después de la centrifugación y resolubilización en regulador de pH NET, la proteína de cápside se cargó en una columna Sepharose CL-6B para la recromatografía.
Diálisis y secado
Las fracciones pico obtenidas anteriormente se agruparon y dializaron extensamente contra agua estéril, y se liofilizaron para su almacenamiento.
Expresión y purificación de Q\beta-240
Células (E. coli JM 109, transformadas con el plásmido pQ\beta-240) se resuspendieron en LB, se sonificaron cinco veces durante 15 segundos (cubierta de agua helada) y se centrifugaron a 13.000 rpm durante una hora. El sobrenadante se almacenó a 4ºC hasta el procesamiento adicional, mientras que los restos fueron lavados dos veces con 9 ml de LB, y finalmente con 9 ml de urea 0,7 M en LB. Todos los sobrenadantes fueron agrupados y cargados en la columna Sepharose CL-4B. Las fracciones pico agrupadas se precipitaron con sulfato de amonio y se centrifugaron. La proteína resolubilizada se purificó después más en una columna Sepharose 2B y finalmente en una columna Sepharose 6B. El pico de cápside fue finalmente dializado extensamente contra agua y liofilizado como se describió anteriormente. El ensamblaje de la proteína de cápside en una cápside se conformó mediante microscopia electrónica.
Expresión y purificación de Q\beta-243
Células (E. coli RR1) fueron resuspendidas en LB y procesadas como se describió en el procedimiento general. La proteína se purificó mediante dos etapas de filtración en gel sucesivas en la columna Sepharose CL-4B y finalmente en una columna Sepharose CL-2B. Las fracciones pico se agruparon y liofilizaron como se describió anteriormente. El ensamblaje de la proteína de cápside en una cápside se confirmó mediante microscopia electrónica.
Expresión y purificación de Q\beta-250
Células (E. coli JM 109, transformadas con pQ\beta-250) fueron resuspendidas en LB y procesadas como se describió anteriormente. La proteína se purificó mediante filtración en gel en una columna Sepharose CL-4B y finalmente en una columna Sepharose CL-2B, y se liofilizaron como se describió anteriormente. El ensamblaje de la proteína de cápside en una cápside se confirmó mediante microscopia electrónica.
Expresión y purificación de Q\beta-259
Células (E. coli JM 109, transformadas con pQ\beta-259) fueron resuspendidas en LB y sonificadas. Los restos fueron lavados una vez con 10 ml de LB y una segunda vez con 10 ml de urea 0,7 M en LB. La proteína se purificó mediante dos etapas de cromatografía de filtración en gel, en una columna Sepharose CL-4. La proteína fue dializada y liofilizada, como se describió anteriormente. El ensamblaje de la proteína de cápside en una cápside se confirmó mediante microscopia electrónica.
\newpage
Ejemplo 2 Inserción de un péptido que contiene residuo de lisina en el epítope c/e1 de HBcAg (1-149)
El epítope c/e1 (residuos 72 a 88) de HBcAg se localiza en la región de punta sobre la superficie de la cápside de virus de Hepatitis B (HBcAg). Una parte de esta región (prolina 79 y alanina 80) fue reemplazada genéticamente por el péptido Gly-Gly-Lys-Gly-Gly (construcción HBcAg-Lys). El residuo de lisina introducido contiene un grupo amino reactivo en su cadena lateral que se puede usar para el entrelazamiento químico intramolecular de partículas de HBcAg con cualquier antígeno que contenga un grupo de cisteína libre.
ADN de HBcAg-Lys, que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 78, fue generado mediante las PCR: los dos fragmentos que codifican fragmentos de HBcAg (residuos de aminoácido 1 a 78 y 81 a 149) fueron amplificados por separado mediante PCR. Los cebadores usados para estas PCR también introdujeron una secuencia de ADN que codificaba el péptido Gly-Gly-Lys-Gly-Gly. El fragmento de HBcAg (1 a 78) fue amplificado de pEco63 usando los cebadores EcoRIHBcAg(s) y Lys-HBcAg(as). El fragmento de HBcAg (81 a 149) se amplificó de pEco63 usando los cebadores Lys-HBcAg(s) y HBcAg(1-149)Hind(as). Los cebadores Lys-HBcAg(as) y Lys-HBcAg(s) introdujeron secuencias de ADN complementarias en los extremos de los dos productos de PCR permitiendo la fusión de los dos productos de PCR en una PCR de ensamblaje subsecuente. Los fragmentos ensamblados fueron amplificados mediante PCR usando los cebadores EcoRIHBcAg(s) y HbcAg(1-149)Hind(as).
Para las PCR, 100 pmolar de cada oligo y 50 ng de los ADN de molde se usaron en las mezclas de reacción de 50 ml con dos unidades de polimerasa Pwo, 0,1 mM de dNTPs y 2 mM de MgSO4. Para ambas reacciones, los ciclos de temperatura se llevaron a cabo como sigue: 94ºC durante 2 minutos; 30 ciclos de 94ºC (1 minuto), 50ºC (1 minuto), 72ºC (2 minutos).
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencias cebadores:
EcoRIHBcAg(s):
(5'-CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG-3');
\vskip1.000000\baselineskip
Lys-HBcAg(as):
(5'-CCTAGAGCCACCTTTGCCACCATCTTCTAAATTA-GTACCACCCAGGTAGC-3');
\vskip1.000000\baselineskip
Lys-HBcAg(s):
(5'-GAAGATGGTGGCAAAGGTGGCTCTAGGGACCTAGTA-GTCAGTTATGTC-3');
\vskip1.000000\baselineskip
HbcAg(1-149)Hind(as):
(5'-CGCGTCCCAAGCTTCTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG-3').
\vskip1.000000\baselineskip
Para la fusión de los dos fragmentos de PCR mediante PCR, se usaron 100 pmolar de cebaodres EcoRIHBcAg(S) y HBcAg(1-149)Hind(as) con 100 ng de los dos fragmentos de PCR purificados en una mezcla de reacción de 50 ml que contenía dos unidades de polimerasa Pwo, 0,1 mM de dNTPs y 2 mM de MgSO_{4}. Las condiciones de los ciclos de PCR fueron: 94ºC durante 2 minutos; 30 ciclos de 94ºC (1 minuto), 50ºC (1 minuto), 72ºC (2 minutos). El producto de PCR ensamblado se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa, se purificó y se digirió durante 19 horas en un regulador de pH adecuado con enzimas de restricción EcoRI y HindIII. El fragmento de ADN digerido fue ligado en vector pKK digerido con EcoRI/HindIII para generar el vector de expresión pKK-HBcAg-Lys. La inserción del producto de PCR en el vector se analizó mediante análisis de restricción con EcoRI/HindIII y secuenciación de ADN del inserto.
Ejemplo 3 Expresión y purificación de HBcAg-Lys
Cepas de E. coli K802 o JM109 fueron transformadas con pKK-HBcAg-Lys. Un ml de un cultivo nocturno de bacterias se usó para inocular 100 ml de medio LB que contenía 100 \mug/ml de ampicilina. Este cultivo se dejó crecer durante cuatro horas a 37ºC hasta que se alcanzara una OD a 600 nm de aproximadamente 0,8. La inducción de la síntesis de HBcAg-Lys se llevó a cabo mediante la adición de IPTG hasta una concentración final de 1 mM. Después de la inducción, las bacterias se agitaron más a 37ºC durante cuatro horas. Las bacterias se cosecharon mediante centrifugación a 5000 x g durante 15 minutos. La pella se congeló a -80ºC. La pella se descongeló y se resuspendió en regulador de pH de lisis de bacterias (10 mM de Na_{2}HPO_{4}, pH 7,0, 30 mM de NaCl, 0,25% de Tween-20, 10 mM de EDTA) complementado con 200 \mug/ml de lisozima y 10 \mul de Benzonase (Merck). Las células se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente y se rompieron mediante sonificación. Células de E. coli que portaban el plásmido de expresión pKK-HBcAg-Lys o un plásmido de control se usaron para la inducción de la expresión de HBcAg-Lys con IPTG. Antes de la adición de IPTG, se removió una muestra del cultivo de bacterias que portaba el plásmido pKK-HBcAg-Lys y de un cultivo que portaba el plásmido de control. Cuatro horas después de la adición de IPTG, las muestras se removieron de nuevo del cultivo que contenía pKK-HBcAg-Lys y del cultivo de control. La expresión de la proteína se monitoreó mediante SDS-PAGE seguida por tinción de Coomassie.
El lisado se centrifugó después durante 30 minutos a 12.000 x g para remover así restos celulares insolubles. El sobrenadante y la pella se analizaron mediante realización de Western Blot usando un anticuerpo monoclonal contra HBcAg (YVS1841, comprado de Accurate Chemical and Scientific Corp., Westbury, NY, EE.UU.), indicando que una cantidad significativa de proteína HBcAg-Lys era soluble. Brevemente, lisados de células de E. coli que expresaban HBcAg-Lys y de células de control fueron centrifugados a 14.000 x g durante 30 minutos. Sobrenadante (= fracción soluble) y pella (= fracción insoluble) fueron separados y diluidos con regulador de pH de muestra SDS hasta volúmenes iguales. Las muestras se analizaron mediante SDS-PAGE seguido por realización de Western Blot con anticuerpo monoclonal anti-HBcAg YVS 1841.
El lisado de células clarificado se usó para la centrifugación de gradiente por etapas usando una gradiente de etapa de sacarosa que consistía en una solución de sacarosa al 65% de 4 ml colocada cubierta con una solución de sacarosa al 15% de 3 ml seguida por 4 ml de lisado bacteriano. La muestra se centrifugó durante 3 horas con 100.000 x g a 4ºC. Después de la centrifugación, fracciones de 1 ml de la parte superior de la gradiente se ercogieron y analizaron mediante SDS-PAGE seguida por tinción de Coomassie. La proteína HBcAg-Lys se detectó mediante tinción de Coomassie.
La proteína HBcAg-Lys fue enriquecida en la interfaz entre 15 y 65% de sacarosa indicando que había formado una partícula de cápside. Gran parte de las proteínas bacterianas permanecieron en la capa superior libre de sacarosa de la gradiente, y por lo tanto la centrifugación de gradiente por etapas de las partículas de HBcAg-Lys llevó tanto al enriquecimiento como a una purificación parcial de las partículas.
La expresión y purificación de HBcAg-Lys a gran escala se llevó a cabo como sigue. Un cultivo nocturno se preparó al inocular una sola colonia en 100 ml de LB, 100 \mug/ml de ampicilina y dejando crecer el cultivo durante la noche a 37ºC. Veinticinco ml del precultivo fueron diluidos en 800 ml de medio de ampicilina LB al día siguiente, y el cultivo se dejó crecer hasta una densidad óptica OD^{600} de 0,6-0,8. El cultivo se indujo después con 1 mM de IPTG, y se dejó crecer durante otras cuatro horas. Las células se cosecharon y lisaron esencialmente como se describió
anteriormente.
HBcAg-Lys se purificó después al precipitar primero la proteína con sulfato de amonio (30% de saturación) del lisado de células clarificado, cargando después la pella resolubilizada en una columna de filtración en gel (Sephacryl S-400, Pharmacia). Las fracciones agrupadas fueron precipitadas de nuevo con sulfato de amonio, la pella resolubilizada y cargada una segunda vez sobre la misma columna de filtración en gel. Las fracciones fueron finalmente agrupadas y concentradas, y la concentración se estableció usando una prueba de Bradford (BioRad).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 4 Construcción de un HBcAg desprovisto de residuos de cisteína libres y que contiene un residuo de lisina insertado
Un antígeno de núcleo de Hepatitis (HBcAg), denominado en la presente HBcAg-lys-2cys-Mut, desprovisto de residuos de cisteína en las posiciones que corresponden a 48 y 107 en SEQ ID NO: 77 y que contenía un residuo de lisina insertado fue construido usando los siguientes métodos.
Las dos mutaciones se introdujeron al amplificar por separado primero tres fragmentos del gen HBcAg-Lys preparado como se describió anteriormente en el ejemplo 2 con las siguientes combinaciones de cebadores de PCR. Se usaron métodos de PCR y técnicas de clonación convencionales para preparar el gen HBcAg-lys-2cys-Mut.
Brevemente, se usaron los siguientes cebadores para preparar el fragmento 1:
Cebador 1: EcoRIHBcAg(s)
CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador 2: 48as
GTGCAGTATGGTGAGGTGAGGAATGCTCAGGAGACTC
\newpage
Se usaron los siguientes cebadores para preparar el fragmento 2:
Cebador 3: 48s
GSGTCTCCTGAGCATTCCTCACCTCACCATACTGCAC
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador 4: 107as
CTTCCAAAAGTGAGGGAAGAAATGTGAAACCAC
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron los siguientes cebadores para preparar el fragmento 3:
Cebador 5: HBcAg149hind-as
CGCGTCCCAAGCTTCTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAGCGTTGATAG
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador 6: 107s
GTGGTTTCACATTTCTTCCCTCACTTTTGGAAG
\vskip1.000000\baselineskip
Los fragmentos 1 y 2 se combinaron después con cebadores de PCR EcoRIHBcAg(s) y 107as para dar el fragmento 4. El fragmento 4 y fragmento 3 se combinaron después con los cebadores EcoRIHBcAg(s) y HBcAg149hind-as para producir el gen de longitud completa. El gen de longitud completa se digirió después con las enzimas EcoRI (GAATTC) y HindIII (AAGCTT) y se clonó en el vector pKK (Pharmacia) cortado en los mismos sitios de restricción. La expresión y purificación de HBcAg-lys-2cys-Mut se llevaron a cabo como se describió en el ejemplo 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 5 Construcción de HBcAg1-185-Lys
Antígeno de núcleo de hepatitis (HBcAg) 1-185 se modificó como se describió en el ejemplo 2. Una parte de la región de epítope c/e1 (residuos 72 a 88) (Prolina 79 y Alanina 80) fue reemplazada genéticamente por el péptido Gly-Gly-Lys-Gly-Gly (construcción HBcAg1-185-Lys). El residuo de lisina introducido contiene un grupo amino reactivo en su cadena lateral que se puede usar para el entrelazamiento químico intermolecular de partículas HBcAg con cualquier antígeno que contenga un grupo de cisteína libre. Se usaron métodos de PCR y técnicas de clonación convencionales para preparar el gen HBcAg1-185-Lys.
La secuencia Gly-Gly-Lys-Gly-Gly se insertó al amplificar dos fragmentos separados del gen HBcAg de pEco63, como se describió anteriormente en el ejemplo 2 y fusionando posteriormente los dos fragmentos mediante PCR para ensamblar el gen de longitud completa. Se usaron las siguientes combinaciones de cebadores de PCR:
Fragmento 1:
Cebador 1: EcoRIHBcAg(s) (véase el ejemplo 2)
Cebador 2: Lys-HBcAg(as) (véase el ejemplo 2)
\vskip1.000000\baselineskip
Fragmento 2:
Cebador 3: Lys-HBcAg(s) (véase el ejemplo 2)
Cebador 4: HBcAgwtHindIII
CGCGTCCCAAGCTTCTAACATTGAGATTCCCGAGATTG
\vskip1.000000\baselineskip
Ensamblaje:
Cebador 1: EcoRIHBcAg(s) (véase el ejemplo 2)
Cebador 2: HBcAgwtHindIII
\vskip1.000000\baselineskip
El gen de longitud completa ensamblado se digirió después con las enzimas EcoRI (GAATTC) y HindIII
(AAGCTT) y se clonó en el vector pKK (Pharmacia) cortado en los mismos sitios de restricción.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 6 Fusión de un epítope de péptido en la región MIR de HbcAg
Los residuos 79 y 80 de HBcAg1-185 fueron sustituidos con el epítope C\varepsilonH3 de la secuencia VNLTWSRASG. La secuencia C\varepsilonH3 inicia desde la secuencia del tercer dominio constante de la cadena pesada de IgE humana. La epítope se insertó en la secuencia de HBcAg1-185 usando un método de ensamblaje por PCR. En la primera etapa de PCR, el gen HBcAg1-185 que se originaba del clon de ATCC pEco63 y amplificado con los cebadores HBcAg-wt EcoRIfwd y HBcAg-wt HindIIIrev se usó como plantilla en dos reacciones separadas para amplificar dos fragmentos que contenían elementos de secuencia que codifican la secuencia C\varepsilonH3. Estos dos fragmentos se ensamblaron después en una segunda etapa de PCR, en una reacción de PCR de ensamblaje.
Combinaciones de cebadores en la primera etapa de PCR: C\varepsilonH3fwd con HbcAg-wt HindIIIrev, y HbcAg-wt EcoRIfwd con C\varepsilonH3rev. En la reacción de PCR de ensamblaje, los dos fragmentos aislados en la primera etapa de PCR se ensamblaron primero durante tres ciclos de PCR sin cebadores exteriores, los cuales fueron añadidos posteriormente a la mezcla de reacción para los siguientes 25 ciclos. Cebadores exteriores: HBcAg-wt EcoRIfwd y HBcAg-wt HindIIIrev.
El producto de PCR se clonó en el pKK223.3 usando los sitios EcoRI y HindIII, para la expresión en E. coli (véase el ejemplo 2). La VLP quimérica se expresó en E. coli y se purificó como se describió en el ejemplo 2. El volumen de elución al cual el HBcAg1-185-C\varepsilonH3 eluyó de la filtración en gel mostró el ensamblaje de las proteínas de fusión en una VLP quimérica.
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencias cebadores:
300
HBcAg-wt EcoRIfwd:
5'CCGGgaattcATGGACATTGACCCTTATAAAG
\vskip1.000000\baselineskip
HBcAg-wt HindIIIrev:
5'CGCGTCCCaagcttCTAACATTGAGATTCCCGAGATTG
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 7 Fusión de un epítope de péptido RANKL en la región MIR del HbcAg
Los residuos 79 y 80 de HBcAg1-185 fueron sustituidos con el epítope de péptido RANKL de la secuencia: SIKIPSSH. Dos cebadores sobrepuestos se diseñan usando la misma estrategia descrita en el ejemplo 6, y la proteína de fusión se construye mediante PCR de ensamblaje. El producto de PCR se clona en el vector pKK223.3 y se expresa en E. coli K802. Las VLP quiméricas se expresan y se purifican como se describió en el ejemplo 3.
\newpage
Ejemplo 8 Fusión de un epítope de péptido RANKL al término C de la proteína A1 de Q\beta truncada en la posición 19 de la extensión de CP
Un cebador que se fijaba al extremo 5' del gen A1 de Q\beta y un cebador que se fijaba al extremo 3' del gen A1 y que comprendía además un elemento de secuencia de codificación para el epítope de péptido RANKL de la secuencia: SIKIPSSH, se usan en una reacción de PCR con pQ\beta10 como plantilla. El producto de PCR se clona en pQ\beta10 (Kozlovska T. M. y otros, Gene 137:133-37 (1993)), y la VLP quimérica se expresa y purifica como se describió en el ejemplo 1.
Ejemplo 9 Inserción de un epítope de péptido RANKL entre las posiciones 2 y 3 de proteína de cápside fr
Cebadores complementarios que codifican la secuencia del epítope de péptido RANKL que tiene la secuencia: SIKIPSSH, y que contienen extremos compatibles con Bsp119I y nucleótidos adicionales que hacen posible la inserción en cuadro, se insertan en el sitio Bsp119I del vector pFrd8 (Pushko, P. y otros, Prot. Eng. 6:883-91 (1993)) mediante técnicas de biología molecular estándares. Como alternativa, las extensiones del vector pFrd8 se llenan con Klenow después de la digestión con Bsp119I, y los oligonucleótidos que codifican la secuencia de la proteína RANKL, fragmento RANKL o péptido RANKL y nucleótidos adicionales para la clonación en cuadro se ligan en pFrd8 después del tratamiento con Klenow. Los clones con el inserto en la orientación correcta se analizan mediante secuenciación. La expresión y purificación de la proteína de fusión quimérica en E. coli JM109 o E. coli K802 se lleva a cabo como se describe en Pushko, P. y otros, Prot. Eng. 6:883-91 (1993), excepto por las etapas de cromatografía, que se llevan a cabo usando una columna Sepharose CL-4B o Sephacryl S-400 (Pharmacia). El lisado de células se precipita con sulfato de amonio y se purifica mediante dos etapas de purificación de filtración en gel sucesivas, similarmente al procedimiento descrito para Q\beta en el ejemplo 1.
Ejemplo 10 Inserción de un epítope de péptido RANKL entre las posiciones 67 y 68 de proteína p1 de Ty1 en el vector pOGS8111
Se sintetizaron dos oligonucleótidos complementarios que codifican el péptido RANKL de la secuencia: SIKIPSSH, con extremos compatibles con el sitio NheI de pOGS8111. Se añaden nucleótidos adicionales para permitir la inserción en cuadro de una secuencia que codifica el epítope RANKL de acuerdo con la descripción del documento EP 0677111. Los aminoácidos AS y SS que flanquean el epítope insertado son codificados por los sitios NheI alterados que resultan de la inserción del oligonucleótido en el gen TyA(d) de pOGS8111.
POGS8111 se transforma en la cepa MC2 de S. cervisiae para la expresión de la VLP de Ty quimérica como se describe en el documento EP 0677111 y las referencias del mismo. La Ty de VLP quimérica se purifica mediante ultracentrifugación con gradiente de sacarosa como se describe en el documento EP 0677111.
Ejemplo 11 Inserción de un epitope de péptido RANKL en la principal proteína de cápside L1 de virus de papiloma tipo 1 (BPV-1)
Una secuencia que codifica el epítope de péptido RANKL de la secuencia SIKIPSSH se sustituye por la secuencia que codifica los aminoácidos 130-136 del gen L1 de BPV-1 clonado en el vector pFastBac1 (GIBCO/BRL) como se describe en (Chackerian, B. y otros, Proc. Natl. Acad. USA 96:2373-2378 (1999)). La secuencia de la construcción se verifica mediante análisis de secuencia de nucleótidos. Se genera un baculovirus recombinante usando el sistema de baculovirus GIBCO/BRL como se describe por el fabricante. Las VLP quiméricas se purifican de células Sf9 infectadas con bculovirus como se describe por Kirnbauer, R. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. 89:12180-84 (1992) y Greenstone, H. L. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. 95:1800-05 (1998).
Ejemplo 12 Introducción de un enlazador que contiene cys N-terminal, expresión y purificación de RANKL
Un fragmento de RANKL fue expresado en forma recombinante con un enlazador N-terminal que contenía una cisteína para el acoplamiento a VLP.
Construcción del plásmido de expresión
La región de codificación C-terminal del gen RANKL fue amplificada mediante PCR con oligos RANKL-UP y RANKL-DOWN (Oligos: RANKL-UP: 5'-CTGCCAGGGGCCCGGGTGCGGCGGTGGCCATCATCACCACCATCACCAGCGCTTCTCAGGAG-3'; RANKL-DOWN: 5'-CCGCTCGAGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGAAAG-3'. RANKL-UP tenía un sitio ApaI interno y RANKL-DOWN tenía un sitio XhoI interno. El producto de PCR fue digerido con ApaI y XhoI y ligado en pGEX-6p1 (Amersham Pharmacia). El plásmido resultante fue llamado pGEX-RANKL. Todas las etapas se llevaron a cabo mediante protocolos de biología molecular estándares y la secuencia fue verificada. El plásmido pGEX-RANKL codifica para una proteína de fusión de un enlazador de aminoácidos que contiene cisteína de sitio de corte con glutationa S-transferasa-Prescission-RANKL (GST-PS-C-RANKL). El enlazador de aminoácidos que contiene cisteína tenía la secuencia GPGCGGG. La construcción contiene también un marcador de hexa-histidina entre el enlazador de aminoácidos que contiene cisteína y la secuencia de RANKL. Secuencias del ADNc resultante y construcciones de proteínas se dan como SEQ-ID NO: 94 y SEQ-ID NO: 95.
Expresión y purificación de C-RANKL
Células Gold pLys de BL21 (DE3) de Escherichia coli competentes fueron transformadas con el plásmido pGEX-RANKL. Colonias individuales de placas de agar que contenían ampicilina fueron expandidas en cultivo líquido (medio LB, 100 \mug/ml de ampicilina) y se incubaron a 30ºC con agitación de 220 rpm durante la noche. Un litro de LB (con 100 \mug/ml de ampicilina) fue después inoculado 1:100 v/v con el cultivo nocturno y cultivado a 24ºC hasta una OD_{600}=1. La expresión fue inducida con 0,4 mM de IPTG. Las células fueron cosechadas después de 16 horas y centrifugadas a 5000 rpm. La pella de células se resuspendió en regulador de pH de lisis (50 mM de Tris-HCl, pH 8,0; 25% de sacarosa; 1 mM de EDTA, 1% de NaN_{3}; 10 mM de DTT; 5 mM de MgCl_{2}; 1 mg/ml de lisozima; 0,4 U/ml de ADNasa) durante 30 min. Después se añadieron 2,5 volúmenes de regulador de pH A (50 mM de Tris-HCl, pH 8,0; 1% de Triton X100; 100 mM de NaCl; 0,1% de NaN_{3}; 10 mM de DTT; 1 mM de PMSF) y se incubaron a 37ºC durante 15 min. Las células fueron sonificadas y granuladas a 9000 rpm durante 15 min. El sobrenadante se usó inmediatamente para cromatografía de afinidad a GST.
Una columna GST-Trap FF de 5 ml (Amersham Pharmacia) se equilibró en PBS, pH 7,3 (140 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na_{2}HPO_{4}, 1,8 mM de KH_{2}PO_{4}). El sobrenadante se cargó sobre la columna GST-Trap FF de 5 ml y posteriormente la columna se enjuagó con cinco volúmenes de columna de PBS. La proteína GST-PS-C-RANKL fue eluida con 50 mM de Tris-HCl, pH 8,0 que contenía 10 mM de glutationa reducida.
La proteína GST-PS-C-RANKL purificada fue digerida usando la proteasa PreScission (Amersham Pharmacia). La digestión se llevó a cabo a 37ºC durante una hora usando una relación molar de 500/1 de GST-PS-C-RANKL a PreScission.
Además, la reacción de la digestión con proteasa fue intercambiada en regulador de pH usando una columna de desalificación HiPrep 26/10 (Amersham Pharmacia), las fracciones que contenían las proteínas fueron agrupadas y usadas inmediatamente para otra etapa de cromatografía de afinidad a GST usando las mismas condiciones expuestas anteriormente. La purificación de C-RANKL se analizó en un gel SDS-PAGE bajo condiciones de reducción, mostradas en la figura 1. La C-RANKL cortada está presente en el flujo de paso (fracción no unida) mientras que la GST-PS-C-RANKL no cortada, la GST-PS cortada y la PreScission permanecen unidas a la columna. La proteína C-RANKL (SEQ ID NO: 96) del tamaño esperado de 22 kDa se obtuvo en alta pureza.
Ejemplo 13 Introducción de un enlazador que contiene cys C-terminal, expresión y purificación de RANKL
Un fragmento del RANKL fue expresado recombinantemente con un enlazador C-terminal que contenía una cisteína para el acoplamiento a VLP.
Construcción del plásmido de expresión
El MCS de pET22b(+) (Novagen, Inc.) fue cambiado por GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGATCC
GGCTAGCGCTCGAGGGTTTAAACGGCGGCCGCATGCACC al reemplazar la secuencia original del sitio NdeI al sitio XhoI con los oligos fijados cebador MCS-1F y cebador MCS-1R (fijando en el regulador de pH 15 mM de TrisHCl pH 8). El plásmido resultante fue llamado pMod00, el cual tenía los sitios de restricción NdeI, BamHI, NheI, XhoI, PmeI y NotI en su MCS. El par fijado de oligos Bamhis6-EK-Nhe-F y Bamhis6-EKNhe-R y el par fijado de oligo1F-C-glicina-enlazador y oligo1R-C-glicina-enlazador fueron ligados juntos en plásmido pMod00 digerido con BamHI-NotI para obtener pModEC1, el cual tenía un marcador de hexahistidina N-terminal, un sitio de corte con enterocinasa y un enlazador de glicina de aminoácidos C-terminal que contenía un residuo de cisteína.
Un fragmento de ADN que comprendía el gen de glutationa S-transferasa con un sitio de corte con enterocinasa C-terminal se amplificó mediante PCR con oligonucleótidos GST-UP y GST-EK del plásmido SP-GST-EK-pCEP-Pu (Wuttke, M. y otros, J. Biol. Chem. 276:36839-36848), digerido con NheI y BamHI y clonado en el vector pModEC1.
El plásmido resultante pMod-GST-EK-C1 comprende el gen que codifica glutationa S transferasa fusionado a un sitio de corte con enterocinasa y un enlazador que contiene cys C-terminal. La secuencia de codificación C-terminal de RANKL se amplificó después mediante PCR con oligonucleótidos mRANKL-1 y mRANKL-2, se digirió con NheI y XhoI y se clonó en el plásmido pMod-GST-EK-C1. El plásmido resultante pMod-GST-EK-mRANKL-C1 codifica para una proteína de fusión que consiste en glutationa S-transferasa, un sitio de corte con enterocinasa, el fragmento RANKL y un enlazador de aminoácidos que contiene cisteína (GST-EK-RANKL-C). Las secuencias del ADNc y construcciones de proteínas resultantes se dan como SEQ ID NO: 97 y SEQ ID NO: 98.
Secuencia de oligonucleótidos:
GST-UP: 5'-ATATATGGATCCTATACTAGGTTATTGGAAAAT-3';
GST-EK: 5'-ATATATGCTAGCTTATCGTCATCGTCG-3';
mRANKL-1: 5'-ATATATGCTAGCAAAGCCTGAGGCCCAGCCATTTG3';
mRANKL-2: 5'-ATATATCTCGAGGTCTATGTCCTGAACTTTGAAAG3'.
\vskip1.000000\baselineskip
Expresión y purificación de RANKL-C
Células Gold pLys de BL21 (DE3) de Escherichia coli competentes se transformaron con el plásmido pMod-GST-EK-mRANKL-C1. Colonias individuales de placas de agar que contenían ampicilina fueron expandidas en 100 ml de cultivo líquido (medio LB, 200 \mug/ml de ampicilina) incubadas a 30ºC con agitación a 200 rpm durante la noche. Un litro de medio (SB con 150 mM de MOPS, pH 7,0, 200 \mug/ml de Amp) fue inoculado después 1:100 v/v con el cultivo nocturno y dejado crecer a 30ºC con agitación a 125 rpm hasta una OD_{600}=2,5. Los cultivos fueron desplazados después a 18ºC y la expresión de las proteínas se indujo después de 30 minutos mediante la adición de 0,1 mM de IPTG. Las bacterias fueron cosechadas después del cultivo nocturno a 18ºC mediante centrifugación (SLA-3000, 15 min., 4ºC, 6000 rpm), resuspendidas en 40 ml de regulador de pH de lisis (10 mM de Na_{2}HPO_{4}, 30 mM de NaCl, 10 mM de EDTA y 0,25% de Tween-20) e incubadas durante 30 minutos sobre hielo con 0,8 mg/ml de lisozima. Las bacterias se lisaron después mediante sonificación y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con MgCl_{2} 0,2 M y 8 \mul de Benzonase. El lisado se clarificó del material insoluble mediante centrifugación (SS-34, 30 min., 4ºC, 20000 rpm) y se usó inmediatamente para cromatografía de afinidad a glutationa sefarosa.
Una columna GST-Trap FF de 5 ml (Amersham Pharmacia) se equilibró por lo tanto con regulador de pH de lisis (10 mM de Na_{2}HP_{4}, 30 mM de NaCl, 10 mM de EDTA y 0,25% de Tween-20) y se cargó con el lisado clarificado a una velocidad de flujo constante de 0,5 ml/min. La columna se lavó después tres veces con 5 volúmenes de columna de regulador de pH de lisis y la proteína GST-EK-RANKL-C fue eluida en 9 fracciones de 1 ml de regulador de pH de elución (50 mM de Tris-CHl, pH 8,0, 10 mM de glutationa reducida) cada uno. La purificación, mostrada en la figura 2A, dio como resultado la proteína de fusión GST-EK-RANKL-C de aproximadamente 45 kDa con una pequeña proporción de GST-EK.
Las fracciones de elución fueron agrupadas y la proteína GST-EK-RANKL-C purificada fue digerida usando EnterokinaseMax® (Invitrogen). La digestión se llevó a cabo a 4ºC durante 16 horas usando 10 unidades de EnterokinaseMax por mg de GST-EK-RANKL-C purificada. La figura 2B muestra que la reacción de corte llevó a RANKL-C con un peso molecular aparente de aproximadamente 16 kDa.
Después del corte la solución de proteínas se dializó con PBS pH 7,2 (140 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na_{2}HPO_{4}, 1,8 mM de KH_{2}PO_{4}) y la glutationa S transferasa fue removida por una segunda cromatografía de afinidad a glutationa sefarosa. Por lo tanto, una columna GST-Trap FF de 5 ml fue equilibrada con PBS pH 7,2, y la solución de proteínas se cargó sobre la columna a una velocidad de flujo constante de 0,5 ml/min. Las fracciones de proteína se analizaron antes y después de la cromatografía de glutationa sefarosa en geles SDS. Como se muestra en la figura 12, la proteína RANKL-C cortada (SEQ ID NO: 99) estaba contenida en el flujo en alta pureza, mientras que la proteína GST-EK permanecía unida a la columna.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 14 Acoplamiento de C-RANKL a proteína de cápside Q\beta
Una solución de 1,48 ml de 6 mg/ml de proteína de cápside Q\beta en 20 mM de Hepes, 150 mM de NaCl pH 7,2 se hizo reaccionar durante 30 minutos con 14,8 \mul de un SMPH (Pierce) (de una solución de abastecimiento 100 mM disuelta en DMSO) a 25ºC. La solución de reacción se dializó subsecuentemente dos veces durante 3 horas contra 2 litros de 20 mM de Hepes, 150 mM de NaCl, pH 7,0 a 4ºC. Una solución de 230 \mul de 9,8 mg/ml de proteína C-RANKL en 20 mM de Hepes, 150 mM de NaCl pH 7,2 fue hecha reaccionar durante 30 minutos con 1,7 \mul de una solución 100 mM de TCEP (Pierce) a 25ºC. Para el acoplamiento, 80 \mul de la Q\beta derivada y dializada se mezclaron después con 24 \mul de C-RANKL reducida y 96 \mul de 20 mM de Hepes, 150 mM de NaCl, pH 7,0 y se incubaron durante la noche a 25ºC.
Los productos acoplados se analizaron en geles de 16% SDS-PAGE bajo condiciones de reducción. Los geles fueron o bien teñidos con azul brillante de Coomassie o bien colocados sobre membranas de nitrocelulosa. En este último caso, las membranas fueron bloqueadas e incubadas ya sea con un antisuero anti-Q\beta de conejo policlonal (dilución 1:2000) seguido por una IgG anti-conejo de cabra conjugada a peroxidasa de rábano (diluciones 1:5000), o un anticuerpo anti-RANKL monoclonal de ratón (dilución 1:2000) seguido por un anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado a peroxidasa de rábano (dilución 1:5000). Después se desarrollaron borrones con los reactivos ECL® (Amersham Pharmacia) de detección de realización de Western Blot. Los resultados se muestran en la figura 3 y figura 3B. Los productos acoplados pueden ser detectados en los geles teñidos con Coomassie (figura 3A) y tanto por antisuero anti-Q\beta como el anticuerpo anti-RANKL (figura 3B), demostrando claramente el acoplamiento covalente de C-RANKL a proteína de cápside Q\beta.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 15 Inmunización de ratones con C-RANKL acoplada a proteína de cápside Q\beta
Un total de 8 ratones Balb/c hembra fueron vacunados con C-RANKL acoplada a proteína de cápside Q\beta. Veinticinco \mug de proteína total de cada muestra fueron diluidos en PBS a 200 \mul e inyectados subcutáneamente (100 \mul sobre dos lados ventrales) el día 0, día 16 y día 64. Cuatro ratones recibieron la vacuna sin adición de adyuvantes mientras que los otros cuatro recibieron la vacuna con la adición de alumbre. Los ratones fueron sangrados retroorbitalmente el día 0, 16, 23, 64 y 78 y su suero se analizó usando un ELISA específico para RANKL.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 16 Detección de anticuerpos específicos para RANKL en un ELISA
Placas de ELISA fueron recubiertas con C-RANKL a una concentración de 10 \mug/ml. Las placas fueron bloqueadas y luego incubadas con sueros de ratón diluidos en serie del día 16, 23, 64 y 78. Los anticuerpos unidos fueron detectados con anticuerpo IgG anti-ratón marcado enzimáticamente. Como un control, suero preinmune de los mismos ratones también fue probado. La figura 4 muestra las concentraciones promedio de anticuerpos específicos para RANKL que pudieron ser detectados en sueros de ratones que habían sido inmunizados con Q\beta-C-RANKL con o sin alumbre.
Las concentraciones de ELISA se expresan como diluciones en suero que llevan a la OD media máxima en el ensayo ELISA. En ratones inmunizados sin alumbre se alcanzó una concentración promedio de 28000, mientras que la concentración promedio en ratones inmunizados con la adición de alumbre fue de 160000. Los sueros preinmunes no mostraron ninguna reactividad con C-RANKL. Esto demuestra claramente que un conjugado RANKL-VLP es capaz de inducir una alta concentración de anticuerpos contra una autoproteína.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 17 Inhibición de la interacción RANKL-RANK por suero de ratones inmunizados con Q\beta-C-RANKL
Para probar si los anticuerpos generados en ratones vacunados con Q\beta-C-RANKL tienen actividad neutralizante, un ensayo de unión in vitro para RANKL y su receptor cognado RANKL fue establecido. Placas de ELISA fueron recubiertas por lo tanto con proteína C-RANKL a una concentración de 10 \mug/ml e incubadas con diluciones en serie de una proteína de fusión RANK-Fc purificada o una proteína de fusión a Fc no relacionada como control negativo. Las proteínas de unión se detectaron con un anticuerpo anti-Fc conjugado a peroxidasa de rábano. La figura 5A muestra el resultado de este análisis. Se encontró que la proteína de fusión RANK-Fc purificada se unía con una alta afinidad (unión máxima media a 1-3 nM) a su ligando RANKL, mientras que no se observó casi ninguna unión cuando se usó la proteína fusionada a Fc no relacionada.
Sueros de ratones vacunados con C-RANKL acoplada a Q\beta fueron probados después para verificar su capacidad para inhibir la unión de RANKL a RANKL-Fc. Placas de ELISA fueron por lo tanto recubiertas con proteína C-RANKL a una concentración de 10 \mug/ml, y co-incubadas con diluciones seriales de sueros de ratón del día 78 mezclados con 1 nM de proteína de fusión RANK-Fc. La unión de la proteína de fusión RANK-Fc a C-RANKL se detectó con anticuerpo anti-Fc conjugado a peroxidasa de rábano. La figura 5B muestra que todos los ocho ratones, que recibieron la vacuna, produjeron anticuerpos que inhibían específicamente la unión de RANK-Fc a C-RANKL. En promedio, la inhibición máxima media se logró cuando se usaron diluciones en sueros de 1:90. Esto demuestra claramente que la inmunización con un conjugado RANKL-VLP no induce anticuerpos con altas concentraciones que son capaces de inhibir la interacción de RANKL con su RANK receptor. De esta manera, la inhibición de la interacción RANK-RANKL por medio de la inyección de la realización específica de esta invención puede revertir o prevenir enfermedades óseas caracterizadas por resorción de hueso incrementada.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 18 Expresión y purificación de VLP AP205 recombinante A. Expresión de VLP AP205 recombinante
Cepa JM109 de E. coli se transformó con el plásmido pAP283-58. Cinco ml de medio líquido LB con 20 \mug/ml de ampicilina fueron inoculados con una sola colonia, e incubados a 37ºC durante 16-24 horas sin agitación.
El inóculo preparado se diluyó 1:100 en 100-300 ml de medio LB, que contenía 20 \mug/ml de ampicilina y se incubaron a 37ºC durante la noche sin agitación. El segundo inóculo resultante se diluyó 1:50 en medio 2TY, que contenía 0,2% de glucosa y fosfato para la regulación de pH, y se incubaron a 37ºC durante la noche en un agitador. Las células se cosecharon mediante centrifugación y se congelaron a -80ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
B. Purificación de VLP AP205 recombinante
Soluciones y reguladores de pH:
1. Regulador de pH de lisis
50 mM de Tris-HCl, pH 8,0 con 5 mM de EDTA, 0,1% de Triton X100 y PMSF a 5 microgramos por ml.
2. SAS
Sulfato de amonio saturado en agua
3. Regulador de pH NET.
20 mM de Tris-HCl, pH 7,8 con 5 mM de EDTA y 150 mM de NaCl.
4. PEG
40% (p/v) de polietilenglicol 6000 en NET
\vskip1.000000\baselineskip
Lisis
Células congeladas se resuspendieron en regulador de pH de lisis a 2 ml/g células. La mezcla se sonificó con 22 kH cinco minutos durante 15 segundos, con intervalos de un minuto para enfriar la solución en hielo. El lisado se centrifugó después durante 20 minutos a 12.000 rpm, usando un rotor F34-6-38 (Ependorf). Las etapas de centrifugación descritas más adelante se llevaron a cabo todas usando el mismo rotor, excepto que se indique lo contrario. El sobrenadamente se almacenó a 4ºC, mientras que los restos celulares se lavaron dos veces con regulador de pH de lisis. Después de la centrifugación, los sobrenadantes del lisado y fracciones de lavado fueron agrupados.
\vskip1.000000\baselineskip
Fraccionamiento
La precipitación con sulfato de amonio puede usarse además para purificar VLP AP205. En una primera etapa, se selecciona una concentración de sulfato de amonio a la cual VLP AP205 no se precipita. La pella resultante se descarta. En la siguiente etapa, se selecciona una concentración de sulfato de amonio a la cual VLP AP205 se precipita cuantitativamente, y VLP AP205 se aísla de la pella de esta etapa de precipitación mediante centrifugación (14.000 rpm durante 20 minutos). La pella obtenida se solubiliza en regulador de pH NET.
\vskip1.000000\baselineskip
Cromatografía
La proteína de cápside de los sobrenadantes agrupados se carga sobre una columna Sepharose 4B (2,8 x 70 cm), y luego se eluye con regulador de pH NET, a 4 ml/hora/fracción. Fracciones 28-40 fueron recogidas, y precipitadas con sulfato de amonio a 60% de saturación. Las fracciones se analizaron mediante SDS-PAGE y Western Blot con un antisuero específico para AP205 antes de la precipitación (figura 6A y figura 6B). La pella aislada mediante centrifugación se resolubilizó en regulador de pH NET, y se cargó sobre una columna Sepharose 2B (2,3 x 65 cm), eluida a 3 ml/h/fracción. Las fracciones se analizaron mediante SDS-PAGE y las fracciones 44-50 fueron recogidas, agrupadas y precipitadas con sulfato de amonio a 60% de saturación. La pella aislada mediante centrifugación se resolubilizó en regulador de pH NET, y se purificó en una columna Sepharose 6B (2,5 x 47 cm), eluida a 3 ml/hora/fracción. Las fracciones se analizaron mediante SDS-PAGE. Las fracciones 23-27 fueron recogidas, la concentración de sal se ajustó a 0,5 M y se precipitó con PEG 6000, añadido a partir de una solución de abastecimiento al 40% en agua y hasta una concentración final de 13,3%. La pella aislada mediante centrifugación fue resolubilizada en regulador de pH NET, y se cargó sobre la misma columna Sepharose 2B que la anterior, eluida de la misma manera. El análisis de las fracciones mediante SDS-PAGE se muestra en la figura 6C. Las fracciones 43-53 fueron recogidas y precipitadas con sulfato de amonio a una saturación de 60%. La pella aislada mediante centrifugación fue resolubilizada en agua, y la solución de proteínas obtenida se dializó extensamente contra agua. Aproximadamente 10 mg de proteína purificada por gramo de células pudieron ser aislados.
El examen de las partículas tipo virus en microscopia electrónica mostró que eran idénticas a las partículas de fago (figura 7A y 7B).
La figura 6A muestra, en el panel superior, la SDS-PAGE teñida con plata, ejecutada bajo condiciones reductoras de las fracciones de la primera etapa de cromatografía en Sepharose 4B. Las líneas 1-13 fueron cargadas con cada segunda fracción de la fracción 20 a 44. La fracción 50 se cargó en la línea 14. Un segundo gel fue cargado con las mismas fracciones y analizado mediante de realización de Western Blot con un anti-suero específico para AP205, y se muestra en el panel inferior (figura 6B).
La figura 6C muestra la SDS-PAGE, teñida con plata, ejecutada bajo condiciones de reducción de las fracciones de la última etapa de cromatografía en Sepharose 2B. Las fracciones 38-54 se cargan en la línea 1-16.
La figura 7A muestra una fotografía EM de partículas de fago AP205, mientras que una fotografía EM de partículas auto-ensambladas de VLP AP205 recombinante se muestra en la figura 7B.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 19 Inhibición de la formación de osteoclastos inducida por RANKL por sueros de ratones inmunizados con Q\beta-C-RANKL
Para probar si los anticuerpos generados en ratones inmunizados con Q\beta-C-RANKL son capaces de inhibir la actividad biológica de RANKL, se estableció un ensayo de diferenciación de osteoclastos in vitro. Células de médula ósea fueron por lo tanto aisladas de ratones Balb/c (4 semanas de edad) e incubadas a una densidad de 10^{6}/ml con M-CSF de ratón recombinante (5 ng/ml) en un \alpha-MEM/10% FCS durante 16 horas. Las células flotantes se recogieron después y se cultivaron más con M-CSF (30 ng/ml), PGE2 (1 \muM) y concentraciones diferentes de C-RANKL. El cuarto día la formación de osteoclastos fue evaluada por el número de células multinucleadas que teñían positivo para fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP). Se encontró que C-RANKL inducía un número significativo de células multinucleadas positivas a TRAP a una concentración de 100-1000 ng/ml.
Los sueros de ratones vacunados con Q\beta-C-RANKL se prueban después para verificar su capacidad para inhibir la formación de osteoclastos de células de médula ósea tratadas con C-RANKL. Células precursoras de osteoclastos son por lo tanto aisladas de ratones Balb/c e incubadas con M-CSF (30 ng/ml), PGE_{2} (1 \muM), C-RANKL (1000 ng/ml) y diluciones en serie de sueros derivadas de ratones inmunizados en \alpha-MEM/10% FCS durante cuatro días. La formación de osteoclastos se ensaya después al contar el número de células multinucleadas positivas a TRAP y la comparación con los controles incubados con C-RANKL sola y con C-RANKL y sueros preinmunes.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 20 Inhibición de la pérdida ósea mediante vacunación con Q\beta-C-RANKL en un modelo de ovariectomía de murino
Para probar si la vacunación con Q\beta-C-RANKL protege de la pérdida ósea inducida por deficiencia de estrógenos se establece un modelo de ovariectomía de ratón (ovx). Un total de 40 ratones C57/BL6 con la edad de 12 semanas es por lo tanto clasificado aleatoriamente en cuatro grupos y tratado como sigue: el grupo 1 no es inmunizado y se somete a una operación simulada, el grupo 2 no es inmunizado y se somete a ovx, el grupo 3 es inmunizado con 25 \mug de Q\beta-C-RANKL sin alumbre y sometido a ovx, y el grupo 4 se inmuniza con 25 \mug de Q\beta-C-RANKL con alumbre y también se somete a ovx. Los animales del grupo 3 y 4 reciben inmunizaciones los días 0, 14, 21 y 42 y todos los animales son operados (ya sea simulada u ovx) el día 28 y sacrificados el día 63. El peso corporal se mide en los días 0, 28 y 63 y se toman muestras de sangre los días 0, 14, 21, 28, 42 y 63. Las concentraciones de anticuerpos así como la formación de hueso y los marcadores de degradación ósea se monitorean continuamente y la densidad mineral ósea se determina después del sacrificio de los animales mediante escaneo DXA de las columnas vertebrales extirpadas y el escaneo pQCT de fémures extirpados en un sitio distal y uno medio.
Habiendo descrito ahora completamente la presente invención en cierto detalle a manera de ilustración y ejemplo por motivos de claridad de entendimiento, será obvio para un experto en la técnica que la misma puede ser llevada a cabo al modificar o cambiar la invención dentro de una amplia y equivalente variedad de condiciones, formulaciones y otros parámetros sin afectar el alcance de la invención o cualquier realización específica de la misma, y que estas modificaciones o cambios están destinados a ser abarcados dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.
Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente mencionadas en esta memoria descriptiva son indicadoras del nivel de capacidad de los expertos en la técnica a la cual esta invención pertenece.
\newpage
Listado de secuencias
SEQ ID NO: 1
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 2
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 3
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 4
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 5
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 6
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 7
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 8
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 9
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 10
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 11
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 12
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 13
...
\newpage
SEQ ID NO: 14
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 15
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 16
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 17
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 18
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 19
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 20
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 21
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 22
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 23
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 24
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 25
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 26
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 27
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 28
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 29
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 30
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 31
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 32
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 33
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 34
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 35
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 36
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 37
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 38
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 39
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 40
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 41
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 42
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 43
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 44
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 45
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 46
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 47
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 48
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 49
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 50
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 51 (Xaa en 28 puede ser cualquier aminoácido)
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 52
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 53
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 54
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 55
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 56
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 57
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 58
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 59
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 60
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 61
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 62
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 63
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 64
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 65
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 66
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 67
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 68
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 69
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 70
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 71
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 72
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 73
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 74
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 75
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 76
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 77
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 78
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 79
RANKL_humano TrEMBL: 014788 longitud total
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 80
RANKL_humano TrEMBL: 014788 isoforma de empalme 1
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 81
RANKL_humano TrEMBL: 014788 isoforma de empalme 2
...
\newpage
SEQ ID NO: 82
RANKL_humano TrEMBL: 014788 región extracelular
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 83
RANKL_humano TrEMBL: 014788 región cortada por una proteasa tipo TACE
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 84
RANKL_humano TrEMBL: 014788 región homóloga a FNTa
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 85
RANKL_ratón TrEMBL: 035235 dominio extracelular
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 86
RANKL_ratón isoformas empalmadas: TrEMBL: Q9JJK8
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 87
RANKL péptidos tallo AA''
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 88
RANKL péptidos tallo DE
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 89
RANKL péptido hebra b D
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 90
RANKL péptido tallo CD
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 91
RANKL péptido tallo EF
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 92
RANKL péptido hebra B - tallo B'B
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 93
RANKL péptido tallo GH
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 94
GST-PS-C-RANKL secuencia de ADNc (RANKL de ratón)
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 95
GST-PS-C-RANKL secuencia de proteína (RANKL de ratón)
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 96
RANKL-C secuencia de proteína (RANKL de ratón)
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 97
GST-EK-RANKL-C secuencia de ADNc (RANKL de ratón)
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 98
GST-EK-RANKL-C secuencia de proteína (RANKL de ratón)
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 99
RANKL-C secuencia de proteína (RANKL de ratón)
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 100
C-RANKL humano correspondiente a C-RANKL 96 de ratón
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 101
C-RANKL humano correspondiente a RANKL-C 99 de ratón
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 102
C-RANKL humano con enlazador correspondiente a C-RANKL 96 de ratón
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 103
C-RANKL humano con enlazador correspondiente a RANKL-C 99 de ratón
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 104
RANKL péptidos tallo AA''
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 105
RANKL péptidos tallo DE
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 106
RANKL péptido hebra b D
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 107
RANKL péptido tallo CD
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 108
RANKL péptido tallo EF
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 109
RANKL péptido hebra B - tallo B'B
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 110
RANKL péptido tallo GH
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 111
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 112
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 113
...
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 114
...
<110> Cytos Biotechnology AG
\hskip1cm
Bachmann, Martin F 
\hskip1cm
Maurer, Patrik 
\hskip1cm
Spohn, Gunther 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> DISPOSICIONES DE ANTÍGENOS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES ÓSEAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> C38912PC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/3331,045
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2001-11-07
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 10/050,902
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2002-01-18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PCT/IB02/00166
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2002-01-21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/396,635
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2002-07-19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 162
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haemophilus influenzae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
1
2 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 139
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pseudomonas stutzeri 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
3
4 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Caulobacter crescentus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
5 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 173
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
6
7 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 173
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
8 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 181
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
10 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 172
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
11 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 182
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
12
13 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 853
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
14
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 132
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago Q beta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
16 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 329
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago Q beta
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
17
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 129
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago R17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 130
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago fr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 130
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago GA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
21
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 132
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago SP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
23 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 329
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago SP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
25
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 130
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago MS2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
27
28 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 133
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago M11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 133
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago MX1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 330
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago NL95
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
31
32 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 129
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago F2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
33 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 128
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago PP7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
34
35 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 132
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Mutante 243 de Bacteriófago Q-beta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
36 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 132
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Mutante 243 de Bacteriófago Q-beta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
38 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 132
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Mutante 250 de Bacteriófago Q-beta
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
40 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 132
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Mutante 251 de Bacteriófago Q-beta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
41
42 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 132
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Mutante 259 de Bacteriófago Q-beta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
43 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 185
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
44 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 183
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
46 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 183
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
47
48 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
49
50 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
51
52 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 183
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
53
54 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
55
56 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
57
58 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
59
60 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
61
62 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 183
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
63
64 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 183
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
65
66 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
67
68 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
69
70 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 183
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción sintética de Hepatitis B Humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
71
72 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
73
74 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 183
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
75 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 183
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
76 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 183
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
77 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
78
79 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
80
81 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
82
83 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
84
85 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA_MISC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (28)..(28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Puede ser cualquier aminoácido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
86 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
89 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
91 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
93 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
95 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
97 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
99 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
101 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 183
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
103 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 183
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
104
105 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
106
107 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
108
109 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 183
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
110
111 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
112
113 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 183
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
114
115 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
116
117 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
118
119 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
120
121 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
122
123 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
124
125 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 183
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
126
127 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 183
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
128 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 188
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
130 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 217
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip1.000000\baselineskip
131 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 262
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip1.000000\baselineskip
132
133 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 305
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\vskip1.000000\baselineskip
134
135 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 185
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Variante de virus de Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\vskip1.000000\baselineskip
136
137 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 152
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> variante de HBc4g
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\vskip1.000000\baselineskip
138
139 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 317
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\vskip1.000000\baselineskip
140
141 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 270
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\vskip1.000000\baselineskip
142
143 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 244
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\vskip1.000000\baselineskip
145 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 249
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
\vskip1.000000\baselineskip
146 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 178
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\vskip1.000000\baselineskip
148 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 159
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
\vskip1.000000\baselineskip
149 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 247
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
\vskip1.000000\baselineskip
150
151 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 199
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
\vskip1.000000\baselineskip
152
153 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Asa AA'' de péptidos RANKL
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
\vskip1.000000\baselineskip
154 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Asa DE de péptidos RANKL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 88
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
155 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hebra-b D de péptidos RANKL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 89
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
156 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Asa CD de péptidos RANKL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 90
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
157 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Asa EF de péptidos RANKL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 91
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
158 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Asa de hebra-B'B B de péptidos RANKL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 92
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
159 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Asa GH de péptidos RANKL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 93
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
160 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1269
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ADNc GST-PS-C-RANKL (RANKL de ratón)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 94
\vskip1.000000\baselineskip
161
162 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 418
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de proteína GST-PS-C-RANKL (RANKL de ratón)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 95
\vskip1.000000\baselineskip
163
164 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 193
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 96
166 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1221
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ADNc GST-Ek-RANKL-C (RANKL de ratón)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 97
\vskip1.000000\baselineskip
167 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 407
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de proteína GST-EK-RANKL-C (RANKL de ratón)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 98
168
169 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 170
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 99
\vskip1.000000\baselineskip
170
171 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 180
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 100
\vskip1.000000\baselineskip
172
173 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 158
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 101
\vskip1.000000\baselineskip
174
175 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 187
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> C-RANKL-Humana con enlazador que corresponde a C-RANKL 96 de ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 102
\vskip1.000000\baselineskip
176 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 165
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> C-RANKL-Humana con enlazador que corresponde a C-RANKL 99 de ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 103
\vskip1.000000\baselineskip
177 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Asa AA'' de péptidos RANKL
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 104
\hskip1cm
178 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Asa DE de péptidos RANKL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 105
\hskip1cm
179 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 106
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hebra-b D de péptidos RANKL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 106
\hskip1cm
180 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Asa CD de péptidos RANKL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 107
\hskip1cm
181 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Asa EF de péptidos RANKL
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 108
\hskip1cm
182 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Asa de hebra-B'B B de péptidos RANKL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 109
\hskip1cm
183 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Asa GH de péptidos RANKL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 110
\hskip1cm
184 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36345
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Plásmido, pAP283-58, que codifica para proteína de cápside AP205 de fago de AR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 111
\vskip1.000000\baselineskip
185
186
187 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 112
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 131
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de cápside AP205
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 112
\vskip1.000000\baselineskip
188
189 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 131
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de cápside AP205
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 113
\vskip1.000000\baselineskip
190 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 114
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3613
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Plásmido, pAP281-32, que codifica para proteína de cápside AP205 de fago AR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 114
\vskip1.000000\baselineskip
192
193
194 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 115
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de unión ribosómico putativo en pAP283-58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 115
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
195 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de Shine Dalgarno en pQb785
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 116
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
196 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 117
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de péptidos usada para mediar la unión de proteína RANKL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 117
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
197 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 118
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Enlazadores de glicina-serina N terminales
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Repetición
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La glicina puede repetirse de cero a cinco veces
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Repetición
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La glicina puede repetirse de cero a diez veces
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Repetición
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La serina puede repetirse de cero a dos veces
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Repetición
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)..(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Estos residuos pueden repetirse de cero a tres veces como un grupo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 118
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
198 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 119
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Enlazadores de glicina-serina C terminales
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Repetición
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La glicina puede repetirse de cero a diez veces
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Repetición
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)..(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La serina puede repetirse de cero a diez veces
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Repetición
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Estos residuos pueden repetirse de cero a tres veces como un grupo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Repetición
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La glicina puede repetirse de cero a ocho veces
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Repetición
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)..(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La glicina puede repetirse de cero a cinco veces
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 119
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
199 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 120
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Enlazadores de glicina-serina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 120
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
200 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 121
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Gamma 1 N-terminal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 121
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
201 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 122
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Gamma 1 C terminal
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 122
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
202 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 123
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Gamma 3 N terminal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 123
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
203 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 124
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Gamma 3 C terminal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 124
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
204 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 125
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Enlazador de glicina N terminal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 125
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
205 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 126
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Enlazador de glicina C terminal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 126
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
206 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 127
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Enlazador de glicina-lisina C terminal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 127
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
207 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 128
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Enlazador de glicina-lisina N terminales
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 128
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
208 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 129
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 129
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
209 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 130
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 130
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
210 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 131
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 131
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
211 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 132
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 132
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
212 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 133
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 133
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
213 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 134
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 134
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
214 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 135
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 135
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
215 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 136
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 136
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
216 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 137
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 137
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
217 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 138
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 138
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
218 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 139
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 139
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
219 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 140
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 140
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
220 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 141
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 141
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
221 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 142
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 142
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
222 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 143
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 143
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
223 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 144
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 144
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
224 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 145
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 145
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
225 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 146
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótidos HbcAg149hind-as
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 146
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
226 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 147
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 147
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
227 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 148
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 148
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
228 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 149
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> epítope CepsilonH3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 149
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
229 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 150
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(51)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 150
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
230 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 151
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 151
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
231 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 152
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótidos C-epsilon H3rev
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 152
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
232 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 153
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido que codifica para oligonucleótido C-epsilon H3rev
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 153
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
233 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 154
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótidos RANKL-ARRIBA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 154
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
234 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 155
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótidos RANKL-ABAJO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 155
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
235 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 156
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Enlazador de aminoácido que contiene cisteína
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 156
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
236 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 157
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pMod00 MCS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 157
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
237 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 158
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótidos GST-ARRIBA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 158
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
239 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 159
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótidos GST-EK
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 159
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
240 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 160
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótidos MRANKL-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 160
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
241 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 161
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótidos MRANKL-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 161
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
242 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 162
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Enlazador C terminal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 162
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
243

Claims (29)

1. Una composición que comprende:
(a) una partícula similar a virus de un fago de ARN; y
(b) por lo menos un antígeno o determinante antigénico, en donde dicho antígeno o dicho determinante antigénico es una proteína RANKL, un fragmento RANKL o un péptido RANKL, y
en donde dicho por lo menos un antígeno o determinante antigénico está unido a dicha partícula similar a virus por al menos un enlace covalente no peptídico.
2. La composición de la reivindicación 1, en la que la partícula similar a virus es una partícula similar a virus recombinante.
3. La composición de la reivindicación 1, en la que dicha partícula similar a virus comprende proteínas recombinantes de un fago de ARN.
4. La composición de la reivindicación 1, en la que dicha partícula similar a virus comprende proteínas recombinantes de un fago de ARN, en donde preferiblemente dicho fago de ARN se selecciona del grupo que consiste en:
(a) bacteriófago Q\beta;
(b) bacteriófago R17;
(c) bacteriófago fr;
(d) bacteriófago GA;
(e) bacteriófago SP;
(f) bacteriófago MS2;
(g) bacteriófago M11;
(h) bacteriófago MX1;
(i) bacteriófago NL95;
(j) bacteriófago f2;
(k) bacteriófago PP7; y
(l) bacteriófago AP205.
5. La composición de la reivindicación 1, en la que dicha partícula similar a virus comprende proteínas recombinantes de fago de ARN Q\beta.
6. La composición de la reivindicación 1, en la que dicha partícula similar a virus comprende proteínas recombinantes de fago de ARN fr.
7. La composición de la reivindicación 1, en la que dicha partícula similar a virus comprende proteínas recombinantes de fago de ARN AP205.
8. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho antígeno o determinante antigénico es una proteína RANKL o un fragmento RANKL.
9. La composición de la reivindicación 8, en la que dicho antígeno o determinante antigénico es una proteína RANKL humana o un fragmento RANKL humano.
10. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho antígeno o determinante antigénico tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:
(a) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 79;
(b) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 80;
(c) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 81;
(d) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 82;
(e) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 83;
(f) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 84;
(g) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 100;
(h) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 101; y
(i) la secuencia de aminoácidos de un fragmento de cualquiera de una cualquiera de las SEC ID NO: 79-84, 100 y 101.
11. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho antígeno o determinante antigénico es un péptido RANKL.
12. La composición de la reivindicación 11, en la que dicho péptido RANKL es un péptido RANKL humano.
13. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho antígeno o determinante antigénico es un péptido RANKL que comprende por lo menos un sitio antigénico de una proteína RANKL.
14. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho antígeno o determinante antigénico es un péptido RANKL que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:
(a) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 87;
(b) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 88;
(c) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 89;
(d) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 90;
(d) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 91;
(e) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 92;
(f) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 93;
(g) la secuencia de aminoácidos de un fragmento de cualquiera de las SEC ID NO: 87-93.
15. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho antígeno o determinante antigénico comprende además por lo menos un sitio de unión seleccionado del grupo que consiste en:
(i) un sitio de unión que no se presenta de manera natural con dicho antígeno o determinante antigénico; y
(ii) un sitio de unión que se presenta de manera natural con dicho antígeno o determinante antigénico.
16. La composición de la reivindicación 15, en la que dicho antígeno o determinante antigénico con por lo menos dicho segundo sitio de unión comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:
(a) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 104;
(b) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 105;
(c) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 106;
(d) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 107;
(e) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 108;
(f) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 109;
(g) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 110;
(h) la secuencia de aminoácidos de un fragmento de cualquiera de una de las SEC ID NO: 104-110.
17. Una composición farmacéutica que comprende:
(a) la composición de la reivindicación 1; y
(b) un vehículo farmacéutico aceptable.
18. Una composición de vacuna que comprende la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.
19. La composición de vacuna de la reivindicación 18, en la que dicha partícula similar a virus comprende proteínas recombinantes de un fago de ARN, en donde preferiblemente dicha partícula similar a virus comprende proteínas recombinantes de fago de ARN Q\beta, de fago de ARN fr o de fago de ARN AP205.
20. La composición de la reivindicación 18, en la que dicho antígeno o determinante antigénico es una proteína RANKL humana o un fragmento RANKL humano.
21. La composición de vacuna de la reivindicación 18, en la que dicho antígeno o determinante antigénico es un péptido RANKL humano.
22. Un proceso para producir una composición de la reivindicación 1, que comprende:
(a) proporcionar una partícula similar a virus; y
(b) proporcionar por lo menos un antígeno o determinante antigénico, en donde dicho antígeno o determinante antigénico es una proteína RANKL, un fragmento RANKL o un péptido RANKL;
(c) combinar dicha partícula similar a virus y dicho por lo menos un antígeno o determinante antigénico de manera que dicho por lo menos un antígeno o determinante antigénico se une a dicha partícula similar a virus.
23. Composición de la reivindicación 1, para uso como un medicamento.
24. Uso de una composición de la reivindicación 1, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades óseas.
25. El uso de la reivindicación 24, en el que dicha composición se usa en combinación con por lo menos un medicamento adecuado para tratar enfermedades óseas.
26. Una composición de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 16, para uso en un método para inmunizar un animal o humano, en el que dicha composición se administra a dicho animal o humano.
27. La composición para uso de la reivindicación 26, en la que dicho antígeno o determinante antigénico es un auto-antígeno; en particular en la que dicho antígeno o determinante antigénico es un fragmento RANKL o un péptido RANKL humanos.
28. Uso de una composición de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 16, para la elaboración de una vacuna, en el que la composición se ha de administrar a un animal o humano.
29. El uso de la reivindicación 28, en el que dicho antígeno o determinante antigénico es un auto-antígeno; en particular en el que dicho antígeno o determinante antigénico es una proteína RANKL, un fragmento RANKL o un péptido RANKL humanos.
ES02779538T 2001-11-07 2002-11-07 Disposicion ordenada de antigenos que comprende rankl para el tratamiento de enfermedades oseas. Expired - Lifetime ES2316628T3 (es)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US33104501P 2001-11-07 2001-11-07
US331045P 2001-11-07
US50902 2002-01-18
US10/050,902 US7264810B2 (en) 2001-01-19 2002-01-18 Molecular antigen array
PCT/IB2002/000166 WO2002056905A2 (en) 2001-01-19 2002-01-21 Molecular antigen array
WOPCT/IB02/00166 2002-01-21
US39663502P 2002-07-19 2002-07-19
US396635P 2002-07-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2316628T3 true ES2316628T3 (es) 2009-04-16

Family

ID=27452009

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES02779538T Expired - Lifetime ES2316628T3 (es) 2001-11-07 2002-11-07 Disposicion ordenada de antigenos que comprende rankl para el tratamiento de enfermedades oseas.

Country Status (14)

Country Link
EP (1) EP1441764B1 (es)
KR (2) KR20050044314A (es)
CN (1) CN100509057C (es)
AT (1) ATE412428T1 (es)
AU (1) AU2002342891B2 (es)
BR (1) BR0213941A (es)
CA (1) CA2465981A1 (es)
DE (1) DE60229659D1 (es)
DK (1) DK1441764T3 (es)
ES (1) ES2316628T3 (es)
IL (1) IL161146A0 (es)
NZ (1) NZ532515A (es)
PL (1) PL369685A1 (es)
WO (1) WO2003039225A2 (es)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7320793B2 (en) * 2001-01-19 2008-01-22 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen array
EP1450856B1 (en) 2001-09-14 2009-11-11 Cytos Biotechnology AG Packaging of immunostimulatory cpg into virus-like particles: method of preparation and use
CN102061288A (zh) * 2002-07-17 2011-05-18 希托斯生物技术股份公司 使用衍生自ap205外壳蛋白的病毒样颗粒的分子抗原阵列
PL375522A1 (en) * 2002-07-19 2005-11-28 Cytos Biotechnology Ag Ghrelin-carrier conjugates
US7537767B2 (en) 2003-03-26 2009-05-26 Cytis Biotechnology Ag Melan-A- carrier conjugates
CA2553594A1 (en) * 2004-01-20 2005-07-28 Cytos Biotechnology Ag Particle-induced ghrelin immune response
US20080019991A1 (en) * 2004-06-02 2008-01-24 Cytos Biotechnology Ag Carrier Conjugates Of Tnf-Peptides
AU2005249218A1 (en) * 2004-06-02 2005-12-15 Cytos Biotechnology Ag Medical uses of carrier conjugates of non-human TNF-peptides
EP1791870A1 (en) * 2004-09-21 2007-06-06 Cytos Biotechnology AG Virus-like particles comprising a fusion protein of the coat protein of ap205 and an antigenic polypeptide
JP2008523132A (ja) * 2004-12-13 2008-07-03 サイトス バイオテクノロジー アーゲー Ｉｌ−１５抗原アレイとその使用法
EP1868642B1 (en) * 2005-03-18 2013-05-08 Cytos Biotechnology AG Cat allergen fusion proteins and uses thereof
AU2006325225B2 (en) 2005-12-14 2013-07-04 Cytos Biotechnology Ag Immunostimulatory nucleic acid packaged particles for the treatment of hypersensitivity
MX2008015529A (es) 2006-06-12 2009-01-13 Cytos Biotechnology Ag Procesos para empacar oligonucleotidos en particulas similares a virus de bacteriofagos de arn.
JP2012525134A (ja) * 2009-04-30 2012-10-22 サイトス バイオテクノロジー アーゲー インフルエンザ赤血球凝集素の組成物とその使用
CN102241776B (zh) * 2010-05-25 2013-05-08 首都医科大学 Rankl-tnf样区融合蛋白及其制备方法和应用
WO2013019658A2 (en) 2011-07-29 2013-02-07 Selecta Biosciences, Inc. Synthetic nanocarriers comprising polymers comprising multiple immunomodulatory agents
CN104011080B (zh) 2011-12-22 2017-10-20 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 用于真核细胞的全长抗体展示系统及其用途
WO2016112921A1 (en) 2015-01-15 2016-07-21 University Of Copenhagen Virus-like particle with efficient epitope display
WO2016186071A1 (ja) * 2015-05-20 2016-11-24 国立大学法人大阪大学 炎症性サイトカイン分泌抑制活性を有するオリゴペプチド
ES2854726T3 (es) 2015-10-30 2021-09-22 The Univ Of Copenhagen Partícula similar a virus con presentación eficiente de epítopos

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1123114B1 (en) * 1998-10-21 2005-12-28 THE UNITED STATES GOVERNMENT as represented by THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Virus-like particles for the induction of autoantibodies
MXPA01005389A (es) * 1998-11-30 2003-03-27 Cytos Biotechnology Ag Presentacion molecular ordenada de antigenos, metodos de preparacion y uso.
WO2001085208A2 (en) * 2000-05-05 2001-11-15 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen arrays and vaccines

Also Published As

Publication number Publication date
BR0213941A (pt) 2004-08-31
PL369685A1 (en) 2005-05-02
CA2465981A1 (en) 2003-05-15
WO2003039225A2 (en) 2003-05-15
EP1441764A2 (en) 2004-08-04
CN100509057C (zh) 2009-07-08
ATE412428T1 (de) 2008-11-15
DE60229659D1 (de) 2008-12-11
AU2002342891B2 (en) 2007-12-13
WO2003039225A3 (en) 2004-03-04
KR20050044316A (ko) 2005-05-12
NZ532515A (en) 2005-10-28
KR20050044314A (ko) 2005-05-12
DK1441764T3 (da) 2009-01-26
CN1582164A (zh) 2005-02-16
IL161146A0 (en) 2004-08-31
EP1441764B1 (en) 2008-10-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2316628T3 (es) Disposicion ordenada de antigenos que comprende rankl para el tratamiento de enfermedades oseas.
US7785873B2 (en) Antigen arrays for treatment of bone disease
RU2325202C2 (ru) Конъюгаты грелин-носитель
US20090123414A1 (en) Il-15 Antigen Arrays And Uses Thereof
ES2320638T3 (es) Disposicion ordenada de antigenos il-5, il-13 o eotasina, para el tratamiento de enfermedades alergicas con un componente eosinofilico.
US20090155302A1 (en) Antigen Arrays for Treatment of Allergic Eosinophilic Diseases
JP2008501658A (ja) 非ヒトｔｎｆ−ペプチドの担体コンジュゲートの医学上の使用
JP2009510025A (ja) インターロイキン−１コンジュゲート及びその使用
JP2007518762A (ja) グレリン−担体結合体
AU2002342891A1 (en) Antigen arrays comprising RANKL for treatment of bone disease
JP4533626B2 (ja) アレルギー性好酸球性疾患を治療するための抗原アレイ
US20090123471A1 (en) T-Cadherin antigen arrays and uses thereof
JP2010090127A (ja) 骨疾患治療用の抗原アレイ
JP2005514347A5 (es)
ES2365706T3 (es) Composiciones de vacuna que contienen disposiciones de antígeno beta 1-6 amiloide.
ZA200402015B (en) Antigen arrays comprising rankl for treatment of bone disease.
MXPA06008170A (es) Respuesta inmune a la grelina inducida por particulas