ES2320638T3 - Disposicion ordenada de antigenos il-5, il-13 o eotasina, para el tratamiento de enfermedades alergicas con un componente eosinofilico. - Google Patents

Disposicion ordenada de antigenos il-5, il-13 o eotasina, para el tratamiento de enfermedades alergicas con un componente eosinofilico. Download PDF

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Abstract

Una composición que comprende: (a) una partícula tipo virus de un fago de ARN, y (b) al menos un antígeno o determinante antigénico, en donde dicho antígeno o dicho determinante antigénico es una proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina, y en la que dicho al menos un antígeno o determinante antigénico está unido a dicha partícula tipo virus por al menos un enlace covalente no péptido.

Description

Disposición ordenada de antígenos IL-5, IL-13 o eotaxina, para el tratamiento de enfermedades alérgicas con un componente eosinofílico.
Antecedentes de la invención Campo de la invención
La presente invención se refiere a los campos de la biología molecular, virología, inmunología y medicina. La invención proporciona una composición que comprende una disposición ordenada y repetitiva de antígenos o determinantes antigénicos, y en particular una disposición que comprende una proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina. La composición comprende una partícula tipo virus de un fago de ARN y al menos una proteína o péptido de IL-5, IL-13 y/o eotaxina unido a la misma por al menos un enlace covalente, no péptido. La invención también proporciona un proceso para producir la composición. Las composiciones de la invención son útiles en la producción de vacunas para el tratamiento de enfermedades alérgicas con un componente eosinofílico y como una Pharmaccine® para prevenir o curar enfermedades alérgicas con un componente eosinofílico y para inducir de manera eficiente respuestas inmunes, en particular respuestas de anticuerpos. Además, las composiciones de la invención son particularmente útiles para inducir de manera eficiente las respuestas autoinmunes específicas dentro del contexto indicado.
Técnica relacionada
Una variedad de enfermedades alérgicas que incluyen el asma, renitis nasal, pólipos nasales, síndromes eosinofílicos y dermatitis atópica tienen componentes inflamatorios, prominentes caracterizados por la infiltración eosinofílica pronunciada.
El grupo médicamente más importante de estas enfermedades, el asma atópica es reconocida como una enfermedad inflamatoria, crónica de las vías aéreas que está caracterizada clínicamente por la obstrucción del flujo aéreo episódico, inflamación de las vías aéreas y reactividad bronquial, mejorada a los alérgenos no específicos. El grado de obstrucción de las vías aéreas y la hiperreactividad frecuentemente se correlacionan con el nivel de la inflación de las vías aéreas. Estas características clínicas son indicativas de la gravedad del asma (Kay, A. B., J Allergy Clin Immunol, 1991, 87:893; De Monchy, J. G. y colaboradores, Am Rev Respir Dis, 1985, 131:373; Beasley, R. y colaboradores, Am Rev Respir Dis, 1989, 139:806; Azzawi; M. y colaboradores, Am Rev Respir Dis, 1990, 142:1407; Ohashi, Y. y colaboradores, Am Rev Respir Dis, 1992, 145:1469; Nakajima, H. y colaboradores, Am Rev Respir Dis, 1992, 146:374; Broide, D. H. y colaboradores, Allergy Clin immunol, 1991, 88:637; Warlaw, A. J. y colaboradores, Am Rev Respir Dis, 1988, 137:62). La infiltración celular se correlaciona con el progreso de la enfermedad e indica la inflamación de las vías aéreas que es un factor contribuyente, principal para la patogénesis y la patobiología. El infiltrado inflamatorio en el asma es complejo; sin embargo, ahora se reconoce ampliamente que los linfocitos CD4^{+} Th con un perfil Th2 (células Th2) de la expresión de citoquina juegan un papel esencial en la expresión clínica y patogénesis de este trastorno (Robinson, D.S. y colaboradores, J Allergy Clin Immunol, 1993, 92:397; Walker, C. y colaboradores, J Allergy Clin Immunol, 1991, 88:935). Las células Th2 regulan el progreso de la enfermedad y la hipersensibilidad de las vías aéreas (AHR, por sus siglas en inglés) al orquestar la inflamación alérgica de las vías aéreas a través de la liberación de un rengo de citoquinas tales como IL-4, -5, -9, -10, -13 (Robinson, D. S. y colaboradores, N Eng J Med, 1992, 326:298; Robinson, D. S. y colaboradores, J Allergy Clin Immunol, 1993, 92:313; Walker, C. y colaboradores Am Rev Respir Dis, 1992, 146:109; Drazen, J. M. y colaboradores, J Exp Med, 1996, 183:1). Al igual que las células Th2, los niveles de eosinófilos y sus productos inflamatorios en el pulmón se correlacionan con la gravedad de la enfermedad y la acumulación de este leucocito en las vías aéreas es una característica central de la disfunción bronquial durante la respuesta asmática de la ultima fase (Bousquet, J. y colaboradores, N Eng J Med, 1990, 323:1033). Aunque las células Th2 orquestan muchas facetas de la respuesta alérgica, se piensa que su papel en la regulación de la eosinofilia a través de la secreción de IL-5 es una vía proinflamatoria principal en el asma.
La interleucina 5 (IL-5) es una citoquina proinflamatoria que es expresada a niveles altos en pacientes asmáticos. Además, la IL-5 es una citoquina involucrada principalmente en la patogénesis de enfermedades atópicas. Ésta controla específicamente la producción, activación y localización de eosinófilos, la causa principal del daño de tejido en enfermedades atópicas. Además, la IL-5 es una citoquina derivada de células T, inducible con especificidad remarcable por el linaje de eosinófilos. La IL-5 es controlada al nivel de la transcripción y la regulación del gen representa un objetivo prometedor para la terapia de enfermedades alérgicas dependientes de eosinófilos tales como el asma, eccema y rinitis.
Existe un gran conjunto de evidencia que los eosinófilos son un componente clave de la respuesta alérgica en el asma. La IL-5 está involucrada originalmente en la producción de eosinófilos, y con una variedad de otras citoquinas tales como IL-13, quimioquinas tales como Eotaxina y otros factores controla su activación, localización y supervivencia. De esta manera, la IL-5 se ha convertido un fármaco importante que es un objetivo para nuevos compuestos anti-asmáticos (Foster, P. S. y colaboradores, Pharmacol ter, 2002, 94(3):253; Foster, P. S. y colaboradores, Trends Mol Med, 2002, 8(4):162).
\newpage
Existe 71% de homología entre las proteínas de humano y de murino (Cytokine hand Book). La IL-5 no exhibe una homología de secuencia de aminoácidos significante con otras citoquinas, excepto por tramos cortos en las proteínas interleucina-3 de murino, GM-CSF de murino e interferón-y de murino. Las masas moleculares predichas de las secuencias de proteínas tanto de humano como de ratón son de 13,1 kDa. La IL-5 biológicamente activa es un homodímero unido a disulfuro que está unido de manera covalente por residuos de cisteína altamente conservados (44-86' y 86-44') que orientan los monómeros en una configuración de cabeza a cola (Takahashi T. y colaboradores, Mol. Immunol. 27:911-920 1990). Aunque la IL-5 monomérica de tipo no cultivado es biológicamente inactiva, se ha diseñado un monómero de IL-5 funcional mediante la mutagénesis de inserción (Dickason RR y colaboradores J. Mol. Med 74:535-46 1996). El análisis de la estructura cristalina de IL-5 de humano demostró una configuración novedosa de dos dominios con cada dominio que requiere la participación de dos cadenas, con un alto grado de similitud con el pliegue de citoquina encontrado en GM-CSF, interleucina-3 e interleucina-4 (Milbum M.V. y colaboradores Nature 363:172-176). La región C-terminal de la IL-5 parece ser importante para ligarse al receptor de IL-5 y para la actividad biológica (Proudfoot y colaboradores J. Protein Chem. 15(5):491-9. 1996). Se piensa que el enlace de la IL-5 a su receptor ocurre en regiones que traslapan las hélices A y D, donde la hélice A está involucrada principalmente en el enlace de la subunidad \alpha del receptor (Graber P. y colaboradores, J. Biol. Chem. 270:15762-15769 1995). La IL-5 de humano, nativa tiene dos sitios de glicosilación potenciales y la IL-5 de ratón tiene tres. La IL-5 de humano está tanto N-glicosilada como O-glicosilada en Thr3. La IL-5 recombinante expresada en los sistemas eucarióticos exhibe un amplio rango de masas moleculares de 45-60 kDa debido a la glicosilación diferencial. La IL-5 desglicosilada y la IL-5 expresada en células procarióticas retienen la actividad biológica completa (Tominaga A. y colaboradores, J. Immunol 144:1345-1352, 1990).
Las rutas para el descubrimiento de fármacos se basan típicamente en la selección de inhibidores de la producción de IL-5, antagonistas de ligandos, control de expresión de receptores y activación de receptores. En particular, la inhibición de la acción de IL-5 podría proporcionar una forma de tratamiento contra el asma y otras enfermedades asociadas con eosinófilos. La inmunoterapia representa otro planteamiento muy atractivo para controlar los niveles de IL-5 y las condiciones de enfermedad asociadas con la eosinofilia, tales como el asma.
Actualmente, el tratamiento más común para la prevención de los síntomas del asma es el uso de corticosteroides inhalados. Generalmente, el uso de estos agentes es completamente seguro y barato. Sin embargo, éstos funcionan al inducir un efecto inmunosupresivo general y existen efectos colaterales adversos que están asociados con su uso a largo plazo que incluyen presión sanguínea alta, osteoporosis y desarrollo de cataratas. Los corticosteroides deben ser tomados cada día y por lo tanto la complacencia del paciente es otro problema en el uso exitoso de estas medicinas. Además, existen pacientes asmáticos refractarios para el uso de los corticosteroides que necesitan el uso de terapias alternativas. La fijación como objetivo de manera selectiva de los eosinófilos utilizando agentes inmunoterapéuticos dirigidos contra la IL-5 puede superar los efectos adversos del uso de agentes inmunosupresivos, generales con acciones pleiotrópicas.
El posible tratamiento futuro de enfermedades tales como el sama puede incluir la inmunización masiva y, de esta manera, el uso de anticuerpos monoclonales específicos para la IL-5. Las pruebas clínicas con anticuerpos monoclonales, humanizados contra la IL-5 dirigidas a la reducción de la eosinofilia en pacientes asmáticos están en curso. En particular, se han comunicado pruebas clínicas que utilizan SCH55700 (eslizumab, Schering Plugh) el cual es un anticuerpo monoclonal, humanizado con actividad contra la IL-5 de varias especies [Egan, R. W. y colaboradores, Arzneimittel-Forschung, 1999, 48:779] y SB240563 (mepolizumab, Glaxo Smith Kline) el cual es un anticuerpo humanizado con especificidad por la interleucina-5 de humano y primate [Hart, T. K. y colaboradores, Am J Respir Crit Care Med, 1998, 157:A744; Zia-Amirthosseini. P. y colaboradores, J Pharmacol Exp Ther, 1999, 291:1060]. Ambos anticuerpos monoclonales demostraron perfiles de seguridad aceptables en las pruebas de fase 1 y condujeron a la reducción de número de eosinófilos pero no se observó la reducción en la hiperreactividad de las vías aéreas. Se piensa que la acción dañina que los eosinófilos ejercen sobre las vías aéreas de los pacientes asmáticos es un fenómeno crónico que involucra la remodelación del tejido. Los estudios diseñados para someter a prueba la eficacia de la terapia anti-IL-5 en este contexto necesitan ser valorados y están en desarrollo.
Sin embargo, el tratamiento con mAbs ocasiona varias desventajas. Los anticuerpos monoclonales son agentes terapéuticos costosos, los cuales deben ser tomados cada mes o cada dos meses. El problema de la falta de complacencia del paciente resultante de las visitas repetidas al médico para la administración del fármaco inyectado es un problema importante. Además, la variación de alotipia entre el paciente y el anticuerpo terapéutico puede conducir a que la terapia con anticuerpos monoclonales se vuelva eventualmente no efectiva. La dosis alta de mAb y la posibilidad de la formación de complejos inmunes también pueden reducir la eficacia de la inmunización pasiva. Una estrategia de vacunación activa limita estas complicaciones.
Otro planteamiento para proporcionar agentes terapéuticos para el asma crónica u otros estados de enfermedad con eosinofilia demostrada u otras condiciones asociadas con la IL-5 ha sido descrito en el documento WO 97/45448. En él, se ha propuesto el uso de "formas modificadas y variantes de moléculas de IL-5 capaces de antagonizar la actividad de IL-5" en el mejoramiento, disminución o de otra manera reducción de los efectos aberrantes causados por las formas nativas o mutantes de la IL-5. Se comunica que el efecto antagonista es el resultado de las formas variantes del enlace de IL-5 a una cadena de baja afinidad de IL5R pero no a los receptores de alta afinidad. Por medio de esta manera de acción, las variantes se completan con la IL-5 para el enlace a sus receptores sin ejercer los efectos fisiológicos de la IL-5.
La eotaxina es una quimioquina específica para el receptor 3 de Quimioquina, presente en los eosinófilos, basófilos y células Th2. Sin embargo, la eotaxina tiene una alta especificidad por los eosinófilos (Zimmerman y colaboradores, J. Immunol. 165: 5839-46 (2000)). La migración de eosinófilos es reducida por 70% en ratones genéticamente deficientes de eotaxina-1, los cuales, sin embargo, aún pueden desarrollar la eosinofilia (Rothenberg y colaboradores, J. Exp. Med. 185: 785-90 (1997)). Parece que la IL-5 es responsable de la migración de eosinófilos de la médula ósea a la sangre y la eotaxina de la migración local en el tejido (Humbles y colaboradores, J. Exp. Med. 186: 601-12 (1997). De esta manera, la fijación como objetivo de la eotaxina además de la IL-5 puede mejorar las inmunoterapias dirigidas hacia la disminución de la eosinofilia.
El genoma humano contiene 3 genes de eotaxina, eotaxina 1-3 los cuales comparten 30% de homología. A la fecha, 2 genes son conocidos en el ratón: eotaxina 1 y eotaxina 2 (Zimmerman y colaboradores, J. Immunol. 165: 5839-46 (2000)). Éstos comparten 38% de homología. La eotaxina 2 de murino comparte 59% de homología con la eotaxina 2 de humano. En el ratón, la eotaxina-1 parece ser expresada de manera ubicua en el tracto gastrointestinal, mientras que la eotaxina 2 parece ser expresada predominantemente en el yeyuno (Zimmerman y colaboradores, J. Immunol. 165: 5839-46 (2000)). La eotaxina 1 está presente en el fluido bronquioalveolar (Teixeira y colaboradores, J. Clin. Invest. 100: 1657-66 (1997)). La secuencia de la eotaxina 1 de humano se muestra en la SEC ID No.: 242 (los aa 1-23 corresponden al péptido de señal), la secuencia de la eotaxina-2 de humano se muestra en la SEC ID No.: 243 (los aa 1-26 corresponden al péptido de señal), la secuencia de la eotaxina-3 de humano se muestra en la SEC ID No.: 244 (los aa 1-23 corresponden al péptido de señal), la secuencia de la eotaxina-1 de ratón se muestra en la SEC ID No.: 245 (los aa 1-23 corresponden al péptido de señal), y la secuencia de la eotaxina-2 de ratón se muestra en la SEC ID No.: 246 (los aa 1-23 corresponden al péptido de señal).
El monómero de eotaxina tiene una masa de 8,3 kDa y está en equilibrio con la eotaxina dimérica sobre un amplio rango de condiciones. El Kd estimado es 1,3 mM a 37ºC, sin embargo, el monómero es la forma predominante (Crump y colaboradores, J. Biol. Chem. 273: 22471-9 (1998). La estructura de la Eotaxina ha sido elucidada por medio de la espectroscopia de RMN. El sitio de enlace para su receptor CCR3 es en la terminación N y la región que precede la primera cisteína es crucial (Crump y colaboradores, J. Biol. Chem. 273: 22471-9 1998). Los péptidos derivados de receptores de quimioquinas unidos a la eotaxina confirmaron este descubrimiento. La eotaxina tiene cuatro cisteínas que forman dos puentes de disulfuro y pueden ser sintetizadas químicamente (Clark-Lewis y colaboradores, Biochemistry 30:3128-3135 1991). La eotaxina 1 es O-glicosilada de manera variable en Thr71 (Noso, N. y colaboradores Eur J. Biochem. 253: 114-122). La expresión de la eotaxina 1 en citosol de E. coli también ha sido descrita (Crump y colaboradores, J. Biol. Chem. 273: 22471-9 (1998)). La expresión en E. coli como cuerpos de inclusión con el repliegue subsecuente (Mayer y colaboradores, Biochemistry 39: 8382-95 (2000)) y la expresión en células de insecto (Forssmann y colaboradores, J. Exp. Med. 185: 2171-6 (1997)) han sido comunicadas para la Eotaxina-2.
La interleucina 13 (IL-13) es secretada como una citoquina Th2 monomérica, biológicamente activa. La forma madura de la IL-13 comprende 112 aminoácidos en humanos y 111 aminoácidos en ratones. La masa molecular calculada de la proteína es aproximadamente 12,4 kDa. La IL-13 puede ser glicosilada N-enlazada (Fitzgerald K.A. y colaboradores, The Cytokines Fact Book 2^{a} edición Academic Press). La IL-13 es producida por las células Th2, mastocitos, basófilos y linfocitos citocida naturales (Brombacher F, 2000 Bioessays Jul; 22(7):646-56). El receptor de IL-13 funcional es un heterodímero compuesto de la cadena \alpha del receptor de interleucina 4 (cadena \alpha de IL-4R) y una de las proteínas de enlace \alpha del receptor de IL-13 (Brombacher F, 2000 Bioessays Jul; 22(7):646-56).
La IL-13 juega un papel significante en la patología del asma. Se ha mostrado que la IL-13 está involucrada en las características centrales de esta enfermedad. Ésta tiene efectos directos sobre la hipersensibilidad de las vías aéreas inducida por alérgenos (AHR) y la producción de moco y tiene un envolvimiento en la eosinofilia (Kuperman D.A. 2002 Nature Medicine epub ahead of print). La neutralización selectiva de IL-13 en ratones atenuó significantemente el fenotipo del asma. Además, la administración de IL-13 confirió un fenotipo similar al asma a ratones deficientes en células T o naturales (naïve) no sensibilizados, respectivamente (Grünig G. y colaboradores, 1998 Science, 282(5397):2261-3, Wills-Karp, M. y colaboradores, 1998 Science 282(5397):2258-61). Los ratones con una supresión fijada como objetivo de la IL-13 fallaron en desarrollar la AHR inducida por alérgenos y mostraron una disminución marcada en la producción de moco (Walter, D.M. y colaboradores, 2001 J Immunol 167(8):4668-75). Puesto que la IL-13 también influye en la eosinofilia en el modelo de asma de murino (Grünig G. y colaboradores, 1998 Science, 282(5397):2261-3), es posible que la IL-13 esté involucrada en muchas enfermedades más alérgicas asociadas con la eosinofilia y la neutralización de sus actividad puede ofrecer un tratamiento prometedor para los pacientes.
Adicionalmente, la sobrerregulación de la IL-13 y el receptor de IL-13 se ha encontrado en muchos tipos de tumor (por ejemplo en todas las líneas de células de enfermedad de linfoma de Hodgkin examinadas a la fecha). De esta manera, la inmunización contra la IL-13 puede proporcionar una manera para curar a los pacientes de tumor que sobreexpresan la IL-13.
Una manera para mejorar la eficacia de la vacunación es incrementar el grado de repetitividad del antígeno aplicado. A diferencia de las proteínas aisladas, los virus inducen a las respuestas inmunes inmediatas y eficientes en ausencia de algún adyuvante tanto con o sin un auxiliar de células T (Bachmann y Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol: 15:235-270 (1991)). Aunque los virus consisten frecuentemente en algunas proteínas, éstos son capaces de desencadenar respuestas inmunes mucho más fuertes que sus componentes aislados. Para las respuestas de células B, se sabe que un factor crucial para la inmunogenicidad de los virus es la repetitividad y el orden de los epítopos de la superficie. Muchos virus exhiben una superficie casi cristalina que exhibe una disposición regular de epítopos que reticula de manera eficiente las inmunoglobulinas específicas para los epítopos en las células B (Bachmann y Zinkernagel, Immunol. Today 17:553-558 (1996)). Esta reticulación de las inmunoglobulinas de la superficie en las células B es una señal de activación fuerte que induce directamente el progreso del ciclo celular y la producción de anticuerpos IgM. Además, estas células B desencadenadas son capaces de activar las células auxiliares T, las cuales a su vez inducen a la conmutación de la producción de anticuerpos de IgM a IgG en células B y la generación de la memoria de células B con vida prolongada - el objetivo de cualquier vacunación (Bachmann y Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol: 15:235-270 (1997)). La estructura viral está unida aún a la generación de anticuerpos en una enfermedad autoinmune y como parte de la respuesta natural a los agentes patógenos (véase Fehr, T. y colaboradores, J Exp. Med. 185:1785-1792 (1997)). De esta manera, los anticuerpos presentados por una superficie viral altamente organizada son capaces de inducir fuertes respuestas de anticuerpos.
Sin embargo, como se indica, el sistema inmune usualmente falla en producir anticuerpos contra estructuras autoderivadas. Para los antígenos solubles presentes en bajas concentraciones, esto es debido a la tolerancia al nivel de las células Th. Bajo estas condiciones, el acoplamiento del antígeno del propio organismo a un excipiente que puede suministrar el auxiliar T puede romper la tolerancia. Para las proteínas solubles que están presentes en altas concentraciones o proteínas de membrana a una concentración baja, las células B y Th pueden ser tolerantes. Sin embargo, la tolerancia a las células B puede ser reversible (energia) y puede ser rota por la administración del antígeno en una forma altamente organizada que está acoplada a un excipiente extraño (Bachmann y Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol: 15:235-270 (1997)). El documento WO 00/23955 se refiere a partículas tipo virus quiméricas o conjugadas y su uso, particularmente para el estudio de tolerancia del toro y el tratamiento y la prevención de enfermedades humanas.
Breve sumario de la invención
Ahora se ha descubierto que una proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina unido a una partícula de núcleo que tiene una estructura con una organización repetitiva, inherente y por esto en particular a las partículas tipo virus (VLP's, por sus siglas en inglés) y subunidades de VLP's, respectivamente, lo que conduce a conjugados altamente ordenados y repetitivos representa inmunógenos potentes para inducción de anticuerpos específicos para IL-5, IL-13 o eotaxina. Además, estos anticuerpos autorreactivos inhiben la eosinofilia en un modelo de ratón de asma. Por lo tanto, la presente invención proporciona un medio terapéutico para el tratamiento de una enfermedad eosinofílica, alérgica, el cual se basa en una disposición ordenada y repetitiva de proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina-partícula de núcleo y en particular un conjugado y disposición de VLP-proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina, respectivamente. Este compuesto terapéutico es capaz de inducir altos títulos de anticuerpos anti-IL-5, IL-13 o eotaxina en un animal vacunado e inhiben la eosinofilia en un modelo de ratón de asma.
De esta manera, la presente invención proporciona una composición que comprende: (a) una partícula de núcleo con al menos un primer sitio de unión; y (b) al menos un antígeno o determinante antigénico con al menos un segundo sitio de unión, en donde el antígeno o determinante antigénico es una proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina y en donde el segundo sitio de unión se selecciona del grupo que consiste en (i) un sitio de unión que no ocurre naturalmente con el antígeno o determinante antigénico; y (ii) un sitio de unión que ocurre naturalmente con el antígeno o determinante antigénico, en donde el segundo sitio de unión es capaz de la asociación con el primer sitio de unión; y en donde el antígeno o determinante antigénico y la partícula de núcleo interactúan a través de la asociación para formar una disposición de antígenos ordenada y repetitiva. Las realizaciones preferidas de las partículas de núcleo adecuadas para el uso en la presente invención son un virus, una partícula tipo virus, un bacteriófago, pilus (nombre en latín de pelo o fimbria) o flagelos bacterianos o cualquier otra partícula de núcleo que tenga una estructura repetitiva, inherente capaz de formar una disposición de antígenos ordenada y repetitiva de acuerdo con la presente
invención.
La invención proporciona una composición que comprende una disposición de antígenos o determinantes antigénicos ordenada y repetitiva, y con lo cual en los conjugados particulares de proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina-VLP. La invención proporciona una composición que comprende una partícula tipo virus de un fago de ARN y al menos una proteína o péptido IL-5, IL-13 o eotaxina unido a la misma. La invención también proporciona un procedimiento para producir los conjugados y las disposiciones ordenadas y repetitivas, respectivamente. Las composiciones de la invención son útiles en la producción de vacunas para el tratamiento de enfermedades alérgicas con un componente eosinofílico y como un medicamento Pharmaccine® para prevenir o curar enfermedades alérgicas con un componente eosinofílico y para inducir de manera eficiente respuestas inmunes, en particular respuestas de anticuerpos. Además, las composiciones de la invención son particularmente útiles para inducir de manera eficiente las respuestas autoinmunes, específicas dentro del contexto indicado.
En la presente invención, una proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina está unido a una partícula de núcleo y VLP, respectivamente, típicamente de una manera orientada, para producir una disposición de proteínas o péptidos de IL-5, IL-13 o eotaxina-antígenos ordenada y repetitiva. Además, la estructura altamente repetitiva y organizada de las partículas de núcleo y las VLPs, respectivamente, media la exhibición de la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina de una forma altamente ordenada y repetitiva que conduce a una disposición de antígenos altamente organizada y repetitiva. Además, el enlace de la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina a la partícula de núcleo y VLP, respectivamente, proporciona epítopos de células auxiliares T, puesto que la partícula de núcleo y la VLP son extrañas para el hospedante inmunizado con la disposición de partícula de núcleo-proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina y la disposición de VLP-proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina, respectivamente. Esas disposiciones difieren de los conjugados de la técnica anterior en su estructura altamente organizada, dimensiones y en la repetitividad del antígeno en la superficie de la disposición.
En un aspecto de la invención, la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina es expresado en un hospedante de expresión adecuado que es compatible con el plegamiento apropiado de la proteína de IL-5, IL-13 o eotaxina o el péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina, o es sintetizado, mientras que la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente, son expresadas y purificadas desde un hospedante de expresión que es adecuado para el plegamiento y el ensamblaje de la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente. La proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina puede ser sintetizado químicamente. La disposición de proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina luego es ensamblada mediante el enlace de la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina a la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende (a) una partícula tipo virus y (b) al menos un antígeno o determinante antigénico, en donde dicho antígeno o dicho determinante antigénico es una proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina como composición farmacéutica que comprende (a) la composición según la reivindicación 1, y (b) un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En un aspecto aún adicional, la presente invención proporciona una composición de vacuna como se define en las reivindicaciones 21-24 que comprende una composición que comprende: (a) una partícula tipo virus de un fago de ARN; y (b) al menos un antígeno o determinante antigénico, en donde dicho antígeno o determinante antigénico es una proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina.
En un aspecto aún adicional, la presente invención proporciona una composición de vacuna que comprende una composición, en la que dicha composición comprende (a) una partícula tipo virus de un fago de ARN; y (b) al menos un antígeno o determinante antigénico, en donde dicho antígeno o determinante antigénico es una proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina; y en la que dicho al menos un antígeno o determinante antigénico está unido a dicha partícula tipo virus por al menos un enlace covalente no péptido.
En un aspecto aún adicional, la presente invención proporciona un proceso para producir una composición según la reivindicación 1 que comprende: (a) proporcionar una partícula tipo virus de un fago de ARN y (b) proporcionar al menos un antígeno o proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina; (c) combinar dicha partícula tipo virus y dicho al menos un antígeno o determinante antigénico de manera que dicho al menos un antígeno o determinante antigénico se une a dicha partícula tipo virus por al menos un enlace covalente no péptido.
En un aspecto aún adicional, la presente invención proporciona un proceso para producir una composición de la invención que comprende: (a) proporcionar una VLP como se define en las reivindicaciones, (b) proporcionar al menos un antígeno o determinante antigénico, en donde dicho antígeno o determinante antigénico es una proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina, y (c) combinar dicha VLP y dicho al menos un antígeno o determinante antigénico, y en la que dicho antígeno o determinante antigénico y dicha partícula interactúan a través de dicha asociación para formar una disposición de antígenos ordenada y repetitiva.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona la composición según la reivindicación 1 para uso como médicamente para un animal o un humano.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un uso de una composición según la reivindicación 1 para la fabricación de un médicamente para el tratamiento de enfermedades alérgicas con un componente eosinofílico.
En un aspecto aún adicional, la presente invención proporciona un uso de una composición según la reivindicación 1 para la preparación de un médicamente para el tratamiento terapéutico o profiláctico de enfermedades alérgicas con un componente eosinofílico, preferiblemente asma. Además, en un aspecto aún adicional, la presente invención proporciona un uso de una composición según la reivindicación 1, ya sea aisladamente ya sea en combinación con otros agentes, para la fabricación de una composición, vacuna, fármaco o medicamento para la terapia o la profilaxis de enfermedades alérgicas con un componente eosinofílico, en particular asma.
Por lo tanto, la invención proporciona, en particular, composiciones de vacuna las cuales son adecuadas para prevenir y/o atenuar enfermedades alérgicas con un componente eosinofílico y condiciones relacionadas a las mismas. La invención además proporciona métodos de inmunización y vacunación, respectivamente, para prevenir y/o atenuar enfermedades alérgicas con un componente eosinofílico o condiciones relacionadas a las mismas, en animales, y en particular en vacas, ovejas y ganado vacuno así como también en humanos. Las composiciones inventivas pueden utilizarse de manera profiláctica o terapéutica.
En realizaciones específicas, la invención proporciona métodos para prevenir y/o atenuar enfermedades alérgicas con un componente eosinofílico o composiciones relacionadas a las mismas, las cuales son causadas o exacerbadas por productos de genes "del propio organismo", es decir "antígenos del propio organismo" como se utiliza en este texto. En las realizaciones relacionadas, la invención proporciona métodos para inducir respuestas inmunológicas en animales e individuos, respectivamente, los cuales conducen a la producción de anticuerpos que previenen y/o atenúan enfermedades alérgicas con un componente eosinofílico y condiciones relacionadas a las mismas, las cuales son causadas o exacerbadas para productos de genes "del propio organismo".
Como sería entendido por una persona de pericia ordinaria en el campo técnico, cuando las composiciones de la invención son administradas a un animal o un humano, éstas pueden estar en una composición la cual contiene sales, tampones, adyuvantes u otras sustancias, las cuales son deseables para mejorar la eficacia de la composición. Los ejemplos de materiales adecuados para el uso en la preparación de composiciones farmacéuticas se proporcionan en numerosas fuentes que incluyen Remington's Pharmaceutical Science (Osol, A, ed., Mack Publishing Co. (1990)).
Se dice que las composiciones de la invención son "farmacéuticamente aceptables" si su administración puede ser tolerada por un receptor individual. Además, las composiciones de la invención serán administradas en una "cantidad terapéuticamente efectiva" (es decir, una cantidad que produce un efecto fisiológico deseado).
Las composiciones de la presente invención pueden ser administradas por diversos métodos conocidos en el campo técnico, pero serán administradas normalmente por medio de la inyección, infusión, inhalación, administración oral u otros métodos físicos que sean adecuados. Las composiciones pueden ser administradas alternativamente por vía intramuscular, intravenosa o subcutánea. Los componentes de las composiciones para la administración incluyen soluciones y suspensiones acuosas, estériles (solución salina fisiológica) o no acuosas. Los ejemplos de solventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos, inyectables tales como oleato de etilo. Los excipientes o materiales de curación oclusivos se pueden utilizar para incrementar la permeabilidad de la piel y mejorar la absorción de los antígenos.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Expresión de His-C-IL5 de ratón. Los extractos de la fracción celular, insoluble obtenidos después del cultivo de pMODC6-IL5/BL21-DE3, ya sea con o sin IPTG, se prepararon como se describiera anteriormente. Las cantidades equivalentes de extracto se cargaron en un gel de poliacrilamida-SDS al 16%, se sometieron a la electroforesis y se tiñeron con azul de Coomassie. Carril M, Marcador de Tamaño (marcador teñido previamente, Rango amplio, NEB), Carril 1, Extracto de cultivo no inducido, Carril 2, extracto de cultivo inducido durante 4 horas con IPTG.
Figura 2. Análisis en SDS-PAGE de la purificación de His-C-IL-5 con Ni-NTA. Las muestras de varias etapas de la purificación se aplicaron a SDS-PAGE al 16% y se condujeron bajo condiciones reducidas. Las proteínas fueron teñidas con azul de Coomassie. M, Marcador; 1: Cuerpos de inclusión solubilizados; 2: Flujo a través de (material no unido); 3: Lavado 1, pH 6,5; 4: Lavado 2, pH 6,5; 5: Lavado 3, pH 5,9; 6-8: Eluato, pH 4,5; 9: IL-5 de ratón recombinante, pura.
Figura 3. SDS-PAGE que muestra la purificación de His-C-IL5 de ratón recombinante. Las alícuotas de cinco \mug de His-C-IL5 de ratón purificada se separaron en gel de poliacrilamida-SDS al 16% ya sea en presencia (2º carril a la izquierda) o ausencia (3^{er} carril a la izquierda) de ditiotreitol. El gel fue teñido por la proteína con Azul de Coomassie R-250. El carril M contiene un marcador de tamaño (marcador teñido previamente, Rango amplio, NEB).
Figura 4. Efecto de His-C-IL-5 sobre la proliferación de células BCL1. Las células BCL1 se incubaron con ^{3}H-Timidina en presencia de lo siguiente: IL-5 de Murino (30 ng/ml) His-C-IL5, (30 ng/ml); Q\beta (200 ng/ml); Q\beta-reticulada químicamente con una citoquina no relacionada (200 ng/ml) o Q\beta-His-C-IL5 (105 ng/ml). Las concentraciones de inicio no diluidas se indican entre paréntesis y se hicieron diluciones seriales cinco veces a partir de las concentraciones de inicio indicadas. La incorporación de ^{3}H-Timidina se determinó por medio del conteo de centelleo líquido.
Figura 5. Análisis de reacción de acoplamiento por medio de SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie. Carril M: marcador de peso molecular teñido previamente Carril 1, His-C-IL-5 Purificada, Carril 2, Q\beta después de la derivatización con el reticular químico SMPH. Carril 3, reacción de acoplamiento, Carril 4, reacción de acoplamiento después de la diálisis. La identidad de las diferentes especies moleculares en la reacción de acoplamiento es identificada a la derecha de la figura.
Figura 6. Análisis de la reacción de acoplamiento por medio de la técnica de inmunotransferencia Western. Carril M: marcador de peso molecular; Carril 1, His-C-IL-5 Purificada, Carril 2, Q\beta después de la derivatización con el reticulador químico SMPH. Carril 3, reacción de acoplamiento. El anticuerpo primario para detectar la His-C-IL5 fue un anticuerpo anti-His de rata incubado subsecuentemente con un anticuerpo anti-rata conjugado con HRP. Q\beta se detectó mediante la tinción con anti-suero policlonal de conejo contra Q\beta seguido por un anticuerpo anti-conejo conjugado con HRP. Las manchas idénticas se tiñeron como se indica.
Figura 7: ELISA cuádruple. A. Representación esquemática de ELISA de captura. Los diversos componentes del ensayo son 1, IgG anti-conejo de cabra; 2, anti-suero policlonal anti-Q\beta de conejo; 3, ya sea Q\beta-His-C-IL5, Q\beta o PBS; 4, Ab monoclonal anti-IL5, TRFK 4 o 5; 5, IgG anti-ratón-HRP. B. Resultados del ELISA cuádruple. La capacidad de neutralización de los anticuerpos monoclonales para interactuar con His-C-IL5 acoplado covalentemente a la disposición de antígenos ordenada se determinó por medio de un ensayo ELISA.
Figura 8. ELISA de sueros contra IL-5. Las placas de ELISA se revistieron con His-C-IL5 y se incubaron con ya sea pre-inmune o colectado el día 21 de ratones vacunados con Q\beta-His-C-IL5 (4 ratones) o Q\beta mezclada con His-C-IL5 (5 ratones). La dilución de inicio de los sueros fue 1:50 y se hicieron cinco veces las diluciones. El enlace de los anticuerpos específicos para Il-5 se determinó con IgG anti-ratón conjugada con HRP y el substrato cromogénico.
Figura 9. Inducción de expresión de GST-EK-IL13-C1-His recombinante en BL21. El tinte azul de Coomassie de una SDS-PAGE al 16%. La carga corresponde a 0,1 OD_{600} de los lisados bacterianos, indicados. La expresión de la proteína de fusión de IL-13 se indujo con IPTG 0,75 mM y las muestras se analizaron después de 4 horas por medio de SDS-PAGE. Se debe observar que existe una fuerte expresión de la proteína de fusión de IL-13 en las bacterias que habían sido transformadas con el plásmido correspondiente (pMod-GST-EK-IL13-C1-His) e inducidas con IPTG (véase la flecha).
Figura 10. Purificación de GST-EK-IL13-C1-His bajo desnaturalización. El tinte azul de Coomassie de dos SDS-PAGEs al 16%. La carga corresponde a 5 \mul de la fracción indicada. La proteína de fusión de IL-13 se obtuvo a partir de cuerpos de inclusión, se solubilizó en tampón desnaturalizante de guanidina-HCl se cargó en una columna de N1^{2+}-agarosa, se desequilibró con el mismo tampón. Las proteínas ligadas se eluyeron en dos pasos con diferente pH. La figura muestra el análisis de las alícuotas precipitadas en TCA de las fracciones indicadas (#5-#30) eluidas con el segundo tampón a pH 4,5. Se debe observar que, debido a la etiqueta His C-terminal, la proteína de fusión de IL-13 se ligó de manera eficiente a la columna de Ni^{2+}-agarosa y se eluyó al disminuir el pH.
Figura 11. Análisis de la proteína de fusión de IL-13 soluble después del repliegue. La proteína de fusión GST-EK-IL13-C1-His se replegó como se describe en la sección 18D. Después de que se terminó la reacción de repliegue, una alícuota de la solución de proteína se analizó por medio de SDS-PAGE seguido por la tinción con azul de Coomassie (A) o por la técnica de inmunotransferencia Western (B). Los anticuerpos primarios, indicados se adquirieron de R&D Systems (\alpha-IL-13, AF-413-NA), por Qiagen (\alpha-Penta-His, 34660) y Amersham Biosciences (\alpha-GST, 24-4577), respectivamente. Los anticuerpos se utilizaron en concentraciones de acuerdo con los manuales del fabricante.
Figura 12. Expresión de eotaxina-C1 de ratón. Los sobrenadantes de lisados celulares de las células BL21/DE3 transformadas con pmEo-C1, después de 9 horas de inducción con 1 mM de IPTG se condujeron en gel de PAGE al 16%, se inmunotransfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se hicieron reaccionar con anticuerpo de eotaxina anti-ratón de cabra (R & D system). Carril 1: Marcador de proteína teñido previamente (New England Biolabs). Carril 2: el sobrenadante de los lisados celulares de las células BL21/DE3 transformadas con pmEo-C1, después de 9 horas de inducción con 1 mM de IPTG. Carril 3: Marcador de proteína teñido previamente (New England Biolabs). Carril 4: Técnica de inmunotransferencia Western de los mismos lisados como el carril 2 sondeados con anticuerpo de eotaxina anti-ratón.
Descripción detallada de la invención
A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este texto tienen los mismos significados entendidos comúnmente por una persona de pericia ordinaria en el campo técnico al cual pertenece esta invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a aquellos descritos en este texto se puede utilizar en la práctica o en la prueba de la presente invención, los métodos y materiales preferidos se describen posteriormente en este texto.
1. Definiciones
Enfermedades alérgicas con un componente eosinofílico: El término enfermedades alérgicas con un componente eosinofílico utilizado en este texto se refiere a estados o condiciones de enfermedad donde existe un incremento en el número de eosinófilos en la sangre circulante o tejidos y fluidos corporales. Las enfermedades donde los eosinófilos se elevan y tienen un efecto ya sea directo o indirecto sobre el estado de la enfermedad incluyen: asma, fiebre del heno, rinitis nasal, pólipos nasales, síndromes eosinofílicos idiopáticos, dermatitis atópica, enfermedades de la piel y exantemas, enfermedades pulmonares, tales como síndrome de Löefflers, neumonía eosinofílica crónica, síndrome de Churg-Strauss y síndromes hiper-eosinofílicos de causas desconocidas. Aquellas personas expertas en el campo técnico pueden reconocer las enfermedades alérgicas con un componente eosinofílico.
Formador de enlaces de aminoácidos: Un "formador de enlaces de aminoácidos", o también solo denominado "formador de enlaces" dentro de esta memoria descriptiva, como se utiliza en este texto, asocia ya sea el antígeno o determinante antigénico con el segundo sitio de unión, o más preferiblemente, ya comprende o contiene el segundo sitio de unión, típicamente -pero no necesariamente- como un residuo de aminoácido, preferiblemente como un residuo de cisteína. El término "formador de enlaces de aminoácidos" utilizado en este texto, sin embargo, no propone implicar que este formador de enlaces de aminoácidos consiste exclusivamente en residuos de aminoácidos, aún si un formador de enlaces de aminoácidos que consiste en residuos de aminoácidos es una realización preferida de la presente invención. Los residuos de aminoácidos del formador de enlaces de aminoácidos están, preferiblemente, compuestos de aminoácidos de origen natural o aminoácidos no naturales conocidos en el campo técnico, todos L y todos D o mezclas de los mismos. Sin embargo, un formador de enlaces de aminoácidos que comprende una molécula con un grupo sulfhidrilo o un residuo de cisteína también está incluido dentro de la invención. Esta molécula comprende preferiblemente una porción de alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, cicloalquilo (C5,C6), arilo o heteroarilo. Sin embargo, además de un formador de enlaces de aminoácidos, un formador de enlaces que comprende preferiblemente una porción de alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, cicloalquilo (C5,C6), arilo o heteroarilo y libre de cualquier aminoácido también debe ser incluido dentro del alcance de la invención. La asociación entre el antígeno o determinante antigénico u opcionalmente el segundo sitio de unión y el formador de enlaces de aminoácidos es preferiblemente por medio de al menos un enlace covalente, más preferiblemente por medio de al menos un enlace de péptido.
Animal: Como se utiliza en este texto, el término "animal" se propone para incluir, por ejemplo, humanos, ovejas, alces, ciervos, venados, visones, mamíferos, monos, caballos, ganado vacuno, cerdos, cabras, perros, gatos, ratas, ratones, aves, pollos, reptiles, peces, insectos y arácnidos.
Anticuerpo: Como se utiliza en este texto, el término "anticuerpo" se refiere a moléculas las cuales son capaces de ligarse a un epítopo o determinante antigénico. El término se propone para incluir anticuerpos completos y fragmentos de enlace de antígenos de los mismos, inclusive anticuerpos de cadena individual. Más preferiblemente, los anticuerpos son fragmentos de anticuerpos de enlace de antígenos de humano e incluyen, pero no están limitados a, Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, Fvs de cadena individual (scFv), anticuerpos de cadena individual, Fvs unidos a disulfuro (sdFv) y fragmentos que comprenden ya sea un domino V_{L} o V_{H}. Los anticuerpos pueden ser de cualquier origen animal, inclusive aves y mamíferos. Preferiblemente, los anticuerpos son de humano, murino, conejo, cabra, cobayo, camello, caballo o pollo. Como se utiliza en este texto, los anticuerpos de "humano" incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina de humano e incluyen anticuerpos aislados de genotecas de inmunoglobulinas de humano o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas de humano y que no expresan inmunoglobulinas endógenas, como se describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 5.939.598 por Kucherlapati y colaboradores.
Antígeno: Como se utiliza en este texto, el término "antígeno" se refiere a una molécula capaz de ser ligada por un anticuerpo o un receptor de células T (TCR, por sus siglas en inglés) si es expresado por moléculas de MHC. El término "antígeno", como se utiliza en este texto, también incluye epítopos de células T. Adicionalmente, un antígeno puede ser reconocido por el sistema inmune y/o puede ser capaz de inducir una respuesta inmune, humoral y/o una respuesta inmune celular que conduce a la activación de linfocitos B y/o T. Sin embargo, esto puede requerir que, al menos en ciertos casos, el antígeno contenga o sea reticulado a un epítopo de células Th y se proporcione en un adyuvante. Un antígeno puede tener uno o más epítopos (epítopos B y T). La reacción específica referida anteriormente se propone para indicar que el antígeno reaccionará preferiblemente, típicamente de una manera altamente selectiva, con su anticuerpo correspondiente o TCR y no con la multitud de otros anticuerpos o TCRs, los cuales pueden ser evocados por otros antígenos. Los antígenos utilizados en este texto también pueden ser mezclas de varios antígenos individuales.
Determinante antigénico: Como se utiliza en este texto, el término "determinante antigénico" se propone para referirse a aquella porción de un antígeno que es reconocida especialmente por los linfocitos ya sea B o T. Los linfocitos B que responden a determinantes antigénicos producen anticuerpos, mientras que los linfocitos T responden a determinantes antigénicos por medio de la proliferación y establecimiento de funciones efectoras que son críticas para la mediación de la inmunidad celular y/o humoral.
Asociación: Como se utiliza en este texto, el término "asociación" cuando se aplica al primer sitio de unión y el segundo sitio de unión, se refiere al enlace del primer sitio de unión y el segundo sitio de unión que es preferiblemente por medio de al menos un enlace no peptídico. La naturaleza de la asociación puede ser covalente, iónica, hidrófoba, polar o cualquier combinación de las mismas, preferiblemente, la naturaleza de la asociación es covalente.
Sitio de unión, primero: Como se utiliza en este texto, la frase "primer sitio de unión" se refiere a un elemento de origen natural o no natural, al cual puede asociarse el segundo sitio de unión localizado en el antígeno o determinante antigénico. El primer sitio de unión puede ser una proteína, polipéptido, aminoácido, péptido, azúcar, polinucleótido, polímero natural o sintético, metabolito o compuesto secundario (biotina, fluoresceína, retinol, digoxigenina, iones metálicos, fenilmetilsulfonilfloruro), o una combinación de los mismos, o un grupo químicamente reactivo de los mismos. El primer sitio de unión está localizado, típica y preferiblemente, en la superficie de la partícula de núcleo tal como, preferiblemente, la partícula tipo virus. Los múltiples primeros sitios de unión están presentes en la superficie de la partícula de núcleo y tipo virus, respectivamente, típicamente en una configuración repetitiva.
Sitio de unión, segundo: Como se utiliza en este texto, la frase "segundo sitio de unión" se refiere a un elemento asociado con el antígeno o determinante antigénico al cual el primer sitio unión localizado en la superficie de la partícula del núcleo y la partícula tipo virus, respectivamente, puede asociarse. El segundo sitio de unión del antígeno o determinante antigénico puede ser una proteína, polipéptido, péptido, azúcar, polinucleótido, polímero natural o sintético, metabolito o compuesto secundario (biotina, fluoresceína, retinol, digoxigenina, iones metálicos, fenilmetilsulfonilfloruro), o una combinación de los mismos, o un grupo químicamente reactivo de los mismos. Al menos un segundo sitio de unión está presente en el antígeno o determinante antigénico. El término "antígeno o determinante antigénico con al menos un segundo sitio de unión" se refiere, por lo tanto, a un antígeno o construcción antigénica que comprende al menos el antígeno o determinante antigénico y el segundo sitio unión. Sin embargo, en particular para un segundo de unión, el cual es de origen no natural, es decir que no se encuentra naturalmente dentro del antígeno o determinante antigénico, estos antígenos o construcciones antigénicas comprenden un "formador de enlaces de aminoácidos".
Ligado: Como se utiliza en este texto, el término "ligado" se refiere al enlace o unión que puede ser covalente, por ejemplo, por medio del acoplamiento químico, o no covalente. Por ejemplo, interacciones iónicas, interacciones hidrófobas, enlaces de hidrógeno, etcétera. Los enlace covalentes pueden ser, por ejemplo, éster, éter, fosfoéster, amida, péptido, imida, enlaces de carbono-azufre, enlaces de carbono-fósforo y similares. El término "ligado" es más amplio que e incluye los términos tales como "acoplado", "fusionado" y "unido".
Proteína(s) de recubrimiento: Como se utiliza en este texto, el término "proteína(s) de recubrimiento" se refiere a
la(s) proteína(s) de un bacteriófago o un fago de ARN capaz de ser incorporado dentro del ensamblaje de la cápside del bacteriófago o el fago de ARN. Sin embargo, cuando se refiere al producto de gen específico del gen de la proteína de recubrimiento de los fagos de ARN se utiliza en término "CP". Por ejemplo, el producto de gen específico del gen de la proteína de recubrimiento del fago de ARN de Q\beta es referido como "CP de Q\beta", mientras que las "proteínas de recubrimiento" del bacteriófago Q\beta comprenden la "CP de Q\beta" así como también la proteína A1. La cápside del Bacteriófago Q\beta está comprendida principalmente de la CP de Q\beta, con un contenido menor de la proteína A1. De igual manera, la
proteína de recubrimiento VLP de Q\beta contiene principalmente CP de Q\beta, con un contenido menor de la proteína A1.
Partícula de núcleo: Como se utiliza en este texto, el término "partícula de núcleo" se refiere a una estructura rígida con una organización repetitiva, inherente. Una partícula de núcleo, como se utiliza en este texto, puede ser el producto de un proceso sintético o el producto de un proceso biológico.
Acoplado: El término "acoplado", como se utiliza en este texto, se refiere a la unión por enlaces covalentes o por interacciones no covalentes, fuertes, típica y preferiblemente a la unión por enlaces covalentes. Cualquier método utilizado normalmente por aquellas personas expertas en el campo técnico para el acoplamiento de materiales biológicamente activos se puede utilizar en la presente invención.
Cantidad efectiva: Como se utiliza en este texto, el término "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad necesaria o suficiente para alcanzar un efecto biológico, deseado. Una cantidad efectiva de la composición sería la cantidad que logra este resultado seleccionado y esta cantidad podría ser determinada a manera de rutina por una persona experta en el campo técnico. Por ejemplo, una cantidad efectiva para tratar una deficiencia en el sistema inmune podría ser aquella cantidad necesaria para causar la activación del sistema inmune, que da por resultado el desarrollo de una respuesta inmune específica para el antígeno con la exposición al antígeno. El término también es sinónimo de "cantidad suficiente".
La cantidad efectiva para cualquier aplicación particular puede variar dependiendo de factores tales como la enfermedad o condición que es tratada, la composición particular que es administrada, el tamaño del sujeto y/o la gravedad de la enfermedad o condición. Una persona experta ordinaria en el campo técnico puede determinar empíricamente la cantidad efectiva de una composición particular de la presente invención sin necesitar una experimentación indebida.
Proteína de eotaxina: El término "proteína de eotaxina", como se utiliza en este texto, se refiere a una proteína codificada por un gen de eotaxina. Las diferentes variantes de la proteína de eotaxina pueden ser causadas por mutaciones de puntos de nucleótidos y polimorfismos, respectivamente, así como también inserciones, supresiones y/o sustituciones de uno o más nucleótidos y deben ser incluidas explícitamente dentro del alcance de la presente invención. La variabilidad adicional puede ser causada por medio de modificaciones pos-traslacionales, tales como formas diferencialmente glicosiladas de eotaxina así como también formas proteolíticamente disociadas de eotaxina. El término "proteína de eotaxina", como se utiliza en este texto, también debe incluir variantes de proteína de eotaxina, que incluyen, pero no están limitadas a, los ejemplos preferidos que se indican anteriormente.
Péptido de eotaxina: Como se utiliza en este texto, el término "péptido de eotaxina" es definido ampliamente como cualquier péptido que representa una fracción de una proteína de eotaxina y contiene al menos dos, preferiblemente al menos tres, más preferiblemente al menos cuatro, más preferiblemente al menos cinco, más preferiblemente al menos seis aminoácidos consecutivos de la proteína de eotaxina original que representa parte de una proteína de eotaxina, más preferiblemente que representa una parte plegada de eotaxina que contiene un epítopo de células B y de nuevo más preferiblemente de la parte de eotaxina que contiene un epítopo neutralizante.
El término "péptido de eotaxina" debe incluir preferiblemente, además cualquier fracción del péptido de eotaxina, en donde la fracción puede ser, preferiblemente, derivada por medio de la supresión de uno o más aminoácidos en la terminación N y/o C de la proteína de eotaxina. El péptido de eotaxina puede obtenerse por medio de la expresión recombinante en sistemas de expresión eucarióticos o procarióticos como un péptido de eotaxina solo o como una fusión con otros aminoácidos o proteínas, por ejemplo para facilitar el plegamiento, expresión o solubilidad del péptido de eotaxina o para facilitar la purificación del péptido de eotaxina. Para hacer posible el acoplamiento de los péptidos eotaxina y proteínas de subunidades de VLP's o cápsides, al menos un segundo sitio de unión puede ser adicionado preferiblemente al péptido de eotaxina. Alternativamente, los péptidos de eotaxina pueden ser sintetizados utilizando métodos conocidos en el campo técnico. El término péptido de eotaxina como se utiliza en este texto también debe incluir preferiblemente un péptido que simula la estructura de superficie tridimensional de la eotaxina. Este péptido de eotaxina no es derivado necesariamente de una secuencia de aminoácidos continua de eotaxina, pero puede formarse por medio de residuos de aminoácidos discontinuos de eotaxina. Estos péptidos pueden aún contener aminoácidos los cuales no están presentes en la proteína de eotaxina correspondiente.
Epítopo: Como se utiliza en este texto, el término "epítopo" se refiere a porciones continuas o discontinuas de un polipéptido que tiene actividad antigénica o inmunogénica en un animal, preferiblemente un mamífero, y más preferiblemente en un humano. Un epítopo es reconocido por medio de un anticuerpo o una célula T a través de su receptor de células T en el contexto de una molécula de MHC. Un "epítopo inmunogénico", como se utiliza en este texto, es definido como una porción de un polipéptido que produce una respuesta de anticuerpos o induce una respuesta en células T en un animal, como se determina por cualquier método conocido en el campo técnico. (Véase, por ejemplo, Geysen y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 81:3998-4002 (1983)). El término "epítopo antigénico", como se utiliza en este texto, es definido como una porción de una proteína a la cual un anticuerpo puede ligar inmunoespecíficamente su antígeno como se determina por cualquier método bien conocido en el campo técnico. El enlace inmunoespecífico excluye el enlace no específico pero no necesariamente excluye la reactividad cruzada con otros antígenos. Los epítopos antigénicos no son necesariamente inmunogénicos. Los epítopo antigénicos también pueden ser epítopos de células T, caso en cual éstos pueden ser ligados inmunoespecíficamente por un receptor de células T dentro del contexto de una molécula de MHC.
Un epítopo puede comprender 3 aminoácidos en una conformación espacial la cual es única para el epítopo. Generalmente, un epítopo consiste en al menos aproximadamente 5 de estos aminoácidos y, más usualmente, consiste en al menos 8-10 de tales aminoácidos. Si el epítopo es una molécula orgánica, puede ser tan pequeña como Nitrofenilo.
Fusión: Como se utiliza en este texto, el término "fusión" se refiere a la combinación de secuencias de aminoácidos de diferente origen en una cadena de polipéptidos en una combinación dentro de la estructura de sus secuencias de nucleótidos de codificación. El término "fusión" incluye explícitamente fusiones internas, es decir, inserción de secuencias de diferente origen dentro de una cadena de polipéptidos, además de la fusión a una de sus terminaciones.
Respuesta inmune: Como se utiliza en este texto, el término "respuesta inmune" se refiere a una respuesta inmune, humoral y/o respuesta inmune, celular que conduce a la activación o proliferación de linfocitos B y/o T y/o células que presentan antígenos. Sin embargo, en algunos casos las respuestas inmunes pueden ser de baja intensidad y se vuelven detectables solo cuando se utiliza al menos una sustancia de acuerdo con la invención. "Inmunógenos" se refiere a un agente utilizado para estimular el sistema inmune de un organismo vivo, de manera que una o más funciones del sistema inmune son incrementadas y dirigidas hacia el agente inmunogénico. Un "polipéptido inmunógeno" es un polipéptido que produce una respuesta inmune celular y/o humoral, ya sea solo o unido a un excipiente en presencia o ausencia de un adyuvante. Preferiblemente, una célula que presenta antígenos puede ser activada.
Una sustancia la cual "mejora" una respuesta inmune se refiere a una sustancia en la cual se observa una respuesta inmune que es mayor o es intensificada o desviada en cualquiera manera con la adición de la sustancia cuando se compara a la misma respuesta inmune medida sin la adición de la sustancia. Por ejemplo, la actividad lítica de las células T citotóxicas puede ser medida utilizando, por ejemplo, un ensayo de liberación de ^{51}Cr, en muestras obtenidas con o sin el uso de la sustancia durante la inmunización. La cantidad de la sustancia en la cual la actividad lítica de CTL es mejorada en comparación con la actividad lítica de CTL sin la sustancia se dice que es una cantidad suficiente para mejorar la respuesta del animal al antígeno. En una realización preferida, la respuesta inmune es mejorada por un factor de al menos aproximadamente 2, más preferiblemente por un factor de aproximadamente 3 o más. La cantidad o tipo de las citoquinas secretadas también puede ser alterada. Alternativamente, la cantidad de anticuerpos inducidos y sus subclases pueden ser alteradas.
Inmunización: Como se utiliza en este texto, los términos "inmunizar" o "inmunización" o términos relacionados se refieren a conferir la capacidad para montar una respuesta inmune sustancial (que comprende anticuerpos y/o inmunidad celular tal como CTL efector) contra un antígeno o epítopo objetivo. Estos términos no requieren que sea creada la inmunidad completa, sino preferiblemente que sea producida una respuesta inmune, la cual es sustancialmente mayor que la línea de base. Por ejemplo, un mamífero puede ser considerado que es inmunizado contra un antígeno objetivo si la respuesta inmune celular y/o humoral al antígeno objetivo ocurre después de la aplicación de los métodos de la invención.
Origen natural: Como se utiliza en este texto, el término "origen natural" significa que el total o partes de los mismos no son sintéticos y existen o son producidos en la naturaleza.
No natural: Como se utiliza en este texto, el término significa generalmente que no es de la naturaleza, más específicamente, el término significa que proviene de la mano del hombre.
Origen no natural: Como se utiliza en este texto, el término "origen no natural" significa generalmente sintético o de origen no natural: más específicamente, el término significa que proviene de la mano del hombre.
Disposición de antígenos o determinantes antigénicos ordenada y repetitiva: Como se utiliza en este texto, el término "disposición de antígenos o determinantes antigénicos ordenada y repetitiva" se refiere generalmente a un patrón de repetición de antígenos o determinantes antigénicos, caracterizado por un ordenamiento espacial típico y preferiblemente uniforme de antígenos o determinantes antigénicos con respecto a la partícula de núcleo y la partícula tipo virus, respectivamente. En una realización de la invención, el patrón de repetición puede ser un patrón geométrico. Los ejemplos típicos y preferidos de las disposiciones de antígenos o determinantes antigénicos ordenados y repetitivos, adecuadas son aquellas que poseen órdenes paracristalinos estrictamente repetitivos de antígenos o determinantes antigénicos, preferiblemente con separaciones de 1 a 30 nanómetros, preferiblemente 5 a 15 nanómetros.
Pili: Como se utiliza en este texto, el término "pili" (del singular "pilus") se refiere a estructuras extracelulares de células bacterianas compuestas de monómeros proteínicos (por ejemplo, monómeros de pilina), los cuales están organizados en patrones ordenados y repetitivos. Además, pili son estructuras las cuales están involucradas en procedimientos tales como la unión de células bacterianas a receptores de superficie de células hospedantes, intercambios genéticos entre células y reconocimiento de célula-célula. Los ejemplos de pili incluyen pili Tipo-1, pili-P, pili F1C, pili-S y pili-987P. Los ejemplos adicionales de pili se exponen posteriormente.
Estructura tipo pilus: Como se utiliza en este texto, la frase "estructura tipo pilus" se refiere a estructuras que tienen características similares a aquellas de pili y están compuestas de monómeros proteínicos. Un ejemplo de una "estructura tipo pilus" es una estructura formada por una célula bacteriana la cual expresa proteínas de pilina modificadas que no forman disposiciones ordenadas y repetitivas que son idénticas a aquellas de pili naturales.
Polipéptido: Como se utiliza en este texto, el término "polipéptido" se refiere a una molécula compuesta de monómeros (aminoácidos) unidos linealmente por enlaces de amida (también conocidos como enlaces de péptidos). Éste indica una cadena molecular de aminoácidos y no se refiere a una longitud específica del producto. De esta manera, los péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos y proteínas están incluidos dentro de la definición de polipéptido. El término también se propone para referirse a las modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares. Un polipéptido recombinante o derivado no es traducido necesariamente de una secuencia de ácido nucleico designada. También puede ser generado de cualquier manera, incluyendo la síntesis química.
Proteína de IL-5: El término "proteína de IL-5" se utiliza en este texto para referirse a una proteína codificada por un gen de IL-5. Las diferentes variantes de la proteína de IL-5 pueden ser causadas mediante mutaciones puntuales de nucleótidos y polimorfismos, respectivamente, así como también inserciones, supresiones y/o sustituciones de uno o más nucleótidos, y deben ser incluidas explícitamente dentro del alcance de la presente invención. La variabilidad adicional puede ser causada por modificaciones posteriores a la traducción, tales como formas diferencialmente glicosiladas de IL-5 así como también formas proteolíticamente escindidas de IL-5. El término "proteína de IL-5", como se utiliza en este texto, también debe incluir variantes de proteína de IL-5, inclusive, pero no limitadas a, los ejemplos preferidos que son indicados anteriormente.
Péptido de IL-5: Como se utiliza en este texto, el término "péptido de IL-5" se define ampliamente como cualquier péptido que representa una fracción de una proteína de IL-5 y que contiene al menos dos, preferiblemente al menos tres, más preferiblemente al menos cuatro, más preferiblemente al menos cinco, más preferiblemente al menos seis aminoácidos consecutivos de la proteína de IL-5 original, la cual representa parte de una proteína de IL-5, más preferiblemente es representativa de una parte plegada de IL-5 que contiene un epítopo de células B, y de nuevo más preferiblemente de la parte de la IL-5 que contiene un epítopo neutralizante.
El término "péptido de IL-5" debe incluir preferiblemente, además cualquier fracción del péptido de IL-5, en donde la fracción puede ser, preferiblemente, derivada por la supresión de uno o más aminoácidos en la terminación N y/o C de la proteína de IL-5. El péptido de IL-5 puede obtenerse por medio de la expresión recombinante en sistemas de expresión eucarióticos o procarióticos como un péptido de IL-5 solo o como una fusión con otros aminoácidos o proteínas, por ejemplo para facilitar el plegamiento, expresión o solubilidad del péptido de IL-5 o para facilitar la purificación del péptido de IL-5. Para hacer posible el acoplamiento de los péptidos de IL-5 y proteínas de subunidades de VLP's y cápsides, al menos un segundo sitio de unión puede ser adicionado preferiblemente al péptido de IL-5. Alternativamente, los péptidos de IL-5 pueden ser sintetizados utilizando métodos conocidos en el campo técnico. El término péptido de IL-5, como se utiliza en este texto, también debe incluir preferiblemente un péptido que simula la estructura de superficie tridimensional de la IL-5. Este péptido de IL-5 no es derivado necesariamente de una secuencia de aminoácidos continua de la IL-5, pero puede estar formado por residuos de aminoácidos discontinuos de la IL-5. Estos péptidos pueden aún contener aminoácidos los cuales no están presentes en la proteína de IL-5 correspondiente.
Proteína de IL-13: El término "proteína de IL-3", como se utiliza en este texto, se refiere a una proteína codificada por un gen de IL-13. Las diferentes variantes de la proteína de IL-13 pueden ser causadas por mutaciones puntuales de nucleótidos y polimorfismos, respectivamente, así como también inserciones, supresiones y/o sustituciones de uno o más nucleótidos, y deben ser incluidas explícitamente dentro del alcance de la presente invención. La variabilidad adicional puede ser causada por modificaciones posteriores a la traducción, tales como formas diferencialmente glicosiladas de la IL-13 así como también formas proteolíticamente escindidas de IL-13. El término "proteína de IL-13", como se utiliza en este texto, también debe incluir variantes de proteína de IL-13, que incluyen, pero no están limitadas a, los ejemplos preferidos que se indican anteriormente.
Péptido de IL-13: Como se utiliza en este texto, el término "péptido de IL-13" es definido ampliamente como cualquier péptido que representa una fracción de una proteína de IL-13 y que contiene al menos dos, preferiblemente al menos tres, más preferiblemente al menos cuatro, más preferiblemente al menos cinco, más preferiblemente al menos seis, aminoácidos consecutivos de la proteína de IL-13 original, que representa parte de la proteína de IL-13, más preferiblemente es representativa de una parte plegada de IL-13 que contiene un epítopo de células B y de nuevo más preferiblemente de la parte de IL-13 que contiene un epítopo neutralizante.
El término "péptido de IL-13" debe incluir preferiblemente, además cualquier fracción del péptido de IL-13, en donde la fracción puede ser, preferiblemente, derivada por la supresión de uno o más aminoácidos en la terminación N y/o C de la proteína de IL-13. El péptido de IL-13 se puede obtener por medio de la expresión recombinante en sistemas de expresión eucarióticos o procarióticos como el péptido de IL-13 solo o como una fusión con otros aminoácidos o proteínas, por ejemplo para facilitar el plegamiento, expresión o solubilidad del péptido de IL-13 o para facilitar la purificación del péptido de IL-13. Para hacer posible el acoplamiento de los péptidos de IL-13 y proteínas de subunidades de VLP's y cápsides, al menos un segundo sitio de unión puede ser adicionado preferiblemente al péptido de IL-13. Alternativamente, los péptidos de IL-13 pueden ser sintetizados utilizando métodos conocidos en el campo técnico. El término péptido de IL-13 como se utiliza en este texto también debe incluir preferiblemente un péptido que simula la estructura de superficie tridimensional de la IL-13. Este péptido de IL-13 no es derivado necesariamente de una secuencia de aminoácidos continua de IL-13, pero puede formarse por residuos de aminoácidos discontinuos de la IL-13. Estos péptidos pueden aún contener aminoácidos los cuales no están presentes en la proteína de IL-13 correspondiente.
Residuo: Como se utiliza en este texto, el término "residuo" se propone que signifique un aminoácido específico en una cadena lateral o cadena principal de polipéptidos.
Antígeno del propio organismo: Como se utilizan en este texto, el término "antígeno del propio organismo" se refiere a proteínas codificadas por el ADN del hospedante y los productos generados por proteínas o ARN codificado por el ADN del hospedante son definidos como del propio organismo. Además, las proteínas que resultan de una combinación de dos o varias moléculas del propio organismo o que representan una fracción de una molécula del propio organismo y proteínas que tienen una alta homología con dos moléculas del propio organismo como se definiera anteriormente (>95%, preferiblemente >97%, más preferiblemente >99%) también pueden ser consideradas del propio organismo.
Tratamiento: Como se utiliza en este texto, los términos "tratamiento", "tratar", "tratado" o "tratando" se refieren a la profilaxis y/o terapia. Cuando se utilizan con respecto a una enfermedad infecciosa, por ejemplo, el término se refiere a un tratamiento profiláctico el cual incrementa la resistencia de un sujeto a la infección con un agente patógeno o, en otras palabras, disminuye la probabilidad que el sujeto sea infectado con el agente patógeno o muestre signos de enfermedad atribuibles a la infección, así como también un tratamiento después de que el sujeto ha sido infectado a fin de luchar contra la infección, por ejemplo, reducir o eliminar la infección o prevenir que sea peor. Cuando se utiliza con respecto a enfermedades alérgicas con un componente eosinofílico, el término "tratamiento" se refiere a un tratamiento profiláctico o terapéutico el cual inhibe o reduce, entre otras cosas y preferiblemente, los componentes inflamatorios, alérgicos asociados con enfermedades eosinofílicas, alérgicas.
Vacuna: Como se utiliza en este texto, el término "vacuna" se refiere a una formulación que contiene la composición de la presente invención y la cual está en una forma que es capaz de ser administrada a un animal. Típicamente, la vacuna comprende una solución salina convencional o un medio de solución acuosa, amortiguada en el cual la composición de la presente invención es suspendida o disuelta. En esta forma, la composición de la presente invención puede utilizarse convenientemente para prevenir, mejorar o de otra manera tratar una condición. Con la introducción en un hospedante, la vacuna es capaz de provocar una respuesta inmune que incluye, pero no está limitada a, la producción de anticuerpos y/o citoquinas y/o la activación de células T citotóxicas, células que presentan antígenos, células T auxiliares, células dendríticas y/u otras respuestas celulares.
Opcionalmente, la vacuna de la presente invención incluye adicionalmente un adyuvante el cual puede estar presente en ya sea una proporción menor o mayor con relación al compuesto de la presente invención. El término "adyuvante", como se utiliza en este texto, se refiere a estimuladores no específicos de la respuesta inmune o sustancias que permiten la generación de un depósito en el hospedante, las cuales cuando se combinan con la vacuna de la presente invención proporcionan una respuesta inmune aún más mejorada. Se puede utilizar una variedad de adyuvantes. Los ejemplos incluyen adyuvante de Freund completo e incompleto, hidróxido de aluminio y muramildipéptido modificado.
Partícula tipo virus (VLP): Como se utiliza en este texto, el término "partícula tipo virus" se refiere a una estructura que se asemeja a una partícula de virus. Además, una partícula tipo virus de acuerdo con la invención no es replicativa y no es infecciosa puesto que carece de todo o parte del genoma viral, en particular los componentes replicativos e infecciosos del genoma viral. Una partícula tipo virus, de acuerdo con la invención, puede contener ácido nucleico distinto de su genoma. Una realización típica y preferida de una partícula tipo virus de acuerdo con la presente invención es una cápside viral tal como la cápside viral del virus correspondiente, bacteriófago o fago de ARN. Los términos "cápside viral" o "cápside", utilizados de manera intercambiable en este texto, se refieren a un ensamblaje macromolecular compuesto de subunidades de proteínas virales. Típica y preferiblemente, las subunidades de proteínas virales se ensamblan en una cápside viral y cápside, respectivamente, que tiene una estructura con una organización repetitiva inherente, en donde la estructura es, típicamente, esférica o tubular. Por ejemplo, las cápsides de fagos de ARN o HBcAg's tienen una forma esférica de simetría y icosaédrica. El término "estructura similar a cápsides" como se utiliza en este texto, se refiere a un ensamblaje macromolecular compuesto de subunidades de proteínas virales que se asemeja a la morfología de una cápside en el sentido definido anteriormente pero que se desvía del ensamblaje típico, simétrico, mientras que mantiene un grado suficiente de orden y repetitividad.
Partícula tipo virus de un bacteriófago: Como se utiliza en este texto, el término "partícula tipo virus de un bacteriófago" se refiere a una partícula tipo virus que se asemeja a la estructura de un bacteriófago, que no es replicativa y no es infecciosa y carece al menos del gen o genes que codifican la maquinaría de replicación del bacteriófago, y típicamente también carece del gen o genes que codifican la proteína o proteínas responsables de la unión viral a o la entrada en el hospedante. Sin embargo, esta definición también debe incluir partículas tipo virus de bacteriófagos, en las cuales el gen o genes mencionados anteriormente aún están presentes pero inactivos y, por lo tanto, también conducen a partículas tipo virus no replicativas y no infecciosas de un bacteriófago.
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VLP de proteína de recubrimiento de fago de ARN: La estructura de cápside formada del autoensamblaje de 180 subunidades de la proteína de recubrimiento de fago de ARN y que contiene opcionalmente ARN del hospedante es referida como "VLP de la proteína de recubrimiento de fago de ARN". Un ejemplo específico es la VLP de la proteína de recubrimiento Q\beta. En este caso particular, la VLP de la proteína de recubrimiento Q\beta puede ser ya sea ensamblada exclusivamente de las subunidades de CP de Q\beta (generadas mediante la expresión de un gen de CP de Q\beta que contiene, por ejemplo, un codón de detención TAA que evita cualquier expresión de una proteína A1 más grande a través de la expresión, véase, Kozlovska, T.M. y colaboradores, Intervirology 39:9-15 (1996)), o contiene adicionalmente subunidades de proteína A1 en el ensamblaje de la cápside.
Partícula de virus: El término "partícula de virus", como se utiliza en este texto, se refiere a la forma morfológica de un virus. En algunos tipos de virus, comprende un genoma circundado por una cápside de proteína; otras tienen estructuras adicionales (por ejemplo, envolturas, colas, etcétera).
Uno, un o una: Cuando los términos "uno", "un" o "una" se utilizan en esta descripción, éstos significan "al menos uno" o "uno o más", a menos que se indique de otra manera.
Como será claro para aquellas personas expertas en el campo técnico, ciertas realizaciones de la invención involucran el uso de tecnologías de ácido nucleico recombinante tales como clonación, reacción en cadena de polimerasa, purificación de ADN y ARN, expresión de proteínas recombinantes en células procarióticas y eucarióticas, etcétera. Estas metodologías son bien conocidas para aquellas personas expertas en el campo técnico y se pueden encontrar convenientemente en manuales publicados de método de laboratorio (por ejemplo, Sambrook, J. y colaboradores, eds., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel, F. y colaboradores, eds., Current Protocols in Molecular Biology, John H. Wiley & Sons, Inc. (1997)). Las técnicas de laboratorio fundamentales para trabajar con líneas de células de cultivo celular (Celis, J., ed., Cell Biology, Academic Press, 2^{a} edición, (1988)) y tecnologías basadas en anticuerpos (Harlow, E. y Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988); Deutscher, M.P., "Guide to Protein Purification", Meth. Enzymol. 128, Academic Press San Diego (1990); Scope, R.K., Protein Purification Principles and Practice, 3^{a} edición, Springer-Verlag, Nueva York (1994)) se describen de manera adecuada en la bibliografía, todas las cuales se incorporan en este texto a manera de referencia.
2. Composiciones y métodos para mejorar una respuesta inmune
La invención descrita proporciona composiciones y métodos para mejorar una respuesta inmune contra una proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina en un animal. Las composiciones de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, (a) una partícula de núcleo con al menos un primer sitio de unión; y (b) al menos un antígeno o determinante antigénico con al menos un segundo sitio de unión, en donde el antígeno o determinante antigénico es una proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina y en donde el segundo sitio de unión se selecciona del grupo que consiste en (i) un sitio de unión que no ocurre naturalmente con el antígeno o determinante antigénico; y (ii) un sitio de unión que ocurre naturalmente con el antígeno o determinante antigénico, en donde el segundo sitio de unión es capaz de la asociación con el primer sitio de unión; y en donde el antígeno o determinante antigénico y la partícula de núcleo interactúan a través de la asociación para formar una disposición de antígenos ordenada y repetitiva. Las composiciones de la invención pueden comprender, o alternativamente consisten en, una partícula tipo virus de un fago de ARN y al menos un antígeno o determinante antigénico, en donde el antígeno o el determinante antigénico es una proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina, y en donde al menos un antígeno o determinante antigénico está ligado a la partícula tipo virus para formar una disposición de antígeno-VLP ordenada y repetitiva. Además, la invención hace posible de manera conveniente que el facultativo construya tal composición para, entre otras cosas, el tratamiento y/o la prevención profiláctica de enfermedades alérgicas con un componente eosinofílico.
En una realización, una partícula de núcleo es una partícula tipo virus de un fago de ARN y una partícula adicional de núcleo puede comprender un virus, un pilus bacteriano, una estructura formada de pilina bacteriana, un bacteriófago, partícula tipo virus, partícula de cápside viral o una forma recombinante de las mismas. Cualquier virus conocido en el campo técnico que tiene una estructura de proteína de recubrimiento y/o de núcleo ordenada y repetitiva se puede seleccionar como una partícula de núcleo de la invención; ejemplos de virus adecuados incluyen sindbis y otros alfavirus, rhabdovirus (por ejemplo, virus de estomatitis vesicular) picornavirus (por ejemplo, rino-virus humano, virus Aichi), togavirus (por ejemplo, virus de rubela), ortomixovirus (por ejemplo, virus Thogoto, virus Batken, virus de plagas aviarias), poliomavirus (por ejemplo, poliomavirus BK, poliomavirus JC, poliomavirus aviario BFDV), parvovirus, rotavirus, virus Norwalk, virus de la fiebre aftosa, retrovirus, virus de hepatitis B, virus de mosaico de Tabaco, virus Flock House y Papillomavirus de humano, y preferiblemente un fago de ARN, bacteriófago Q\beta, bacteriófago R17, bacteriófago M11, bacteriófago MX1, bacteriófago NL95, bacteriófago fr, bacteriófago GA, bacteriófago SP, bacteriófago MS2, bacteriófago f2, bacteriófago PP7 (por ejemplo, véase la tabla 1 en Bachmann, M.F. y Ainkernagel, R.M., Inmmunol, Today 17:553-558 (1996)).
En una realización adicional, la invención utiliza la ingeniería genética de un virus para crear una fusión entre una proteína de envoltura viral ordenada y repetitiva y un primer sitio de unión que comprende una proteína heteróloga, péptido, determinante antigénico o un residuo de aminoácido reactivo de la selección. Otras manipulaciones genéticas conocidas para aquellas personas expertas en el campo técnico se pueden incluir en la construcción de las composiciones inventivas; por ejemplo, puede ser deseable restringir la capacidad de replicación del virus recombinante a través de la mutación genética. Además, el virus utilizado para la presente invención es incompetente para la replicación debido a la inactivación química o física o, como se indica, debido a la falta de un genoma de replicación competente. La proteína viral seleccionada para la fusión con el primer sitio de unión debe tener una estructura organizada y repetitiva. Esta estructura organizada y repetitiva incluye organizaciones paracristalinas con una separación de 5-30 nm, preferiblemente 5-15 nm, en la superficie del virus. La creación de este tipo de proteína de fusión dará por resultado primeros sitios de unión múltiples, ordenados y repetitivos en la superficie del virus y reflejará la organización normal de la proteína viral nativa. Como será entendido por aquellas personas expertas en el campo técnico, el primer sitio de unión puede ser o es parte de cualquier proteína adecuada, polipéptido, azúcar, polinucleótido, péptido (aminoácido), polímero natural o sintético, metabolito secundario o combinación de los mismos que pueda servir para unir específicamente el antígeno o determinante antigénico que conduce a una disposición de antígenos ordenada y repetitiva.
En otra realización de la invención, la partícula de núcleo es un alfavirus recombinante y, más específicamente, un virus Sinbis recombinante. Los alfavirus son virus de ARN de cadena positiva que replican su ARN genómico completamente en el citoplasma de la célula infectada y sin un intermediario de ADN (Strauss, J. y Strauss, E., Microbiol. Rev. 58:491-562 (1994)). Varios miembros de la familia de alfavirus, Sindbis (Xiong, C. y colaboradores, Science 243:1188-1191 (1989); Schlesinger, S., Trends Biotechnol. 11:18-22 (1993)), virus Semliki Forest (SFV) (Liljeström, P. & Garoff, H., Biol/Technology 9:1356-1361 (1991)) y otros (Davis, N.L. y colaboradores, Virology 171:189-204 (1989)), han recibido una atención considerable para el uso como vectores de expresión basados en virus para una variedad de diferentes proteínas (Lundstrom, K., Curr. Opin. Biotechnol. 8:578-582 (1997); Liljeström, P., Curr. Opin. Biotechnol. 5:495-500 (1994)) y como candidatos para el desarrollo de vacunas. Recientemente, una variedad de patentes que se han expedido se dirigieron al uso de alfavirus para la expresión de proteínas heterólogas y el desarrollo de vacunas (véase las patentes de EE.UU. n^{os} 5.766.602; 5.792.462; 5.739.026; 5.789.245 y 5.814.482). La construcción de las partículas de núcleo alfavirales de la invención se puede hacer por medios conocidos generalmente en el campo técnico de tecnología de ADN recombinante, como se describe por aquellos artículos mencionados anteriormente, los cuales se incorporan en este texto a manera de referencia.
Una variedad de diferentes células hospedantes, recombinantes se pueden utilizar para producir una partícula de núcleo basada en virus para la unión de antígenos o determinantes antigénicos. Por ejemplo, se sabe que los alfavirus tienen un amplio rango de hospedantes; el virus Sindbis infecta células cultivadas de mamífero, reptil y anfibio, así como también algunas células de insecto (Clark, H., J. Natl. Cancer Inst. 51:645 (1973); Leake, C., J. Gen. Virol. 35:335 (1977); Stollar, V. en THE TOGAVIRUSES, R.W. Schlesinger. Ed., Academic Press, (1980), páginas 583-621). De esta manera, se pueden utilizar numerosas células hospedantes, recombinantes en la práctica de la invención. Las células BHK, COS, Vero, HeLa y CHO son particularmente adecuadas para la producción de proteínas heterólogas debido a que tienen el potencial para glicosilar las proteínas heterólogas de una manera similar a las células humanas (Watson, E. y colaboradores, Glycobiology 4:227, (1994)) y se pueden seleccionar (Zang, M. y colaboradores, Bio/Technology 13:389 (1995)) o diseñadas genéticamente (Renner W. y colaboradores, Biotech. Bioeng. 4:476 (1995); Lee K. y colaboradores, Biotech Bioeng. 50:336 (1996)) para desarrollar en un medio libre de suero, así como también en suspensión.
La introducción de vectores de polinucléotidos en las células hospedantes puede efectuarse por métodos descritos en los manuales de laboratorio estándar (véase, por ejemplo, Sambrook, J. y colaboradores, eds., Molecular Cloning, A laboratory Manual, 2^{a} edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Capítulo 9; Ausubel, F. y colaboradores, eds., Current Protocols in Molecular Biology, John H. Wiley & Sons, Inc. (1997), Capítulo 16), que incluyen métodos tales como electroporación, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección, microinyección, transfección mediada por lípidos catiónicos, transducción, carga de raspado, introducción balística e infección. Los métodos para la introducción de secuencias de ADN exógenas en las células hospedantes se describen en Felgner, P. y colaboradores, patente de EE.UU. nº 5.580.859.
Las secuencias de ARN empacadas también se pueden utilizar para infectar las células hospedantes. Estas secuencias de ARN empacadas se pueden introducir a las células hospedantes al adicionarlas al medio de cultivo. Por ejemplo, la preparación de partículas alfavirales no infectivas se describe en una variedad de fuentes, que incluyen "Sindbis Expression System", Versión C (Invitrogen, Catálogo No. K750-1).
Cuado se utilizan células de mamífero como células hospedantes, recombinantes para la producción de partículas de núcleo basadas en virus, estas células serán cultivadas generalmente en un cultivo de tejido. Los métodos para desarrollar células en cultivos son bien conocidos en el campo técnico (véase, por ejemplo, Celis, J., ed., Cell Biology, Academic Press, 2^{a} edición, (1988); Sambrook, J. y colaboradores, eds., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^{a} edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Ausubel, F. y colaboradores, eds., Curreent Protocols in Molecular Biology, John H. Wiley & Sons, Inc. (1997); Freshney, R., Culture of Animal Cells, Alan R. Liss, Inc. (1983)).
Los ejemplos adicionales de virus de ARN adecuados para el uso como partículas de núcleo en la presente invención incluyen, pero no están limitados a, los siguientes: miembros de la familia Reoviridae, que incluyen el género Orthoreovirus (múltiples serotipos de retrovirus tanto mamíferos como aviarios), el género Orbivirus (virus Bluetongue, virus Eugenangee, virus de Kemerovo, virus de peste equina africana y virus de fiebre de garrapatas del Colorado), el género Rotavirus (rotavirus de humano, virus de diarrea de terneros de Nebraska, rotavirus de murino, rotavirus de simio, rotavirus de bovino u ovino, rotavirus aviario); la familia Picomaviridae, que incluye el género Enterovirus (poliovirus, virus Coxsackie A y B, virus huérfano de humano citopático, entérico (ECHO), virus de hepatitis A, C, D, E y G, enterovirus de Simio, virus de encefalomielitis de murino (ME), Poliovirus muris, enterovirus de Bovino, enterovirus de porcino, el género Cardiovirus (virus de encefalitis y miocarditis (EMC), Mengovirus), el género Rhinovirus (rinovirus de Humano que incluye al menos 113 subtipos; otros rinovirus), el género Apthovirus (enfermedad de Fiebre Aftosa (FMDV); la familia Calciviridae, que incluye virus de exantema vesicular de porcino, virus de leones marinos de San Miguel, piconarvirus Felino y virus Norwalk; la familia Togaviridae, que incluye el género Alphavirus (virus de encefalitis equina del Eastern, virus del bosque Semliki, virus Sindbis, virus Chikungunya, virus O'Nyong-Nyong, virus del río Ross, virus de encefalitis equina de Venezuela, virus de encefalitis equina del Oeste), el género Flavirius (virus de fiebre amarilla transmitido por mosquitos, virus del dengue, virus de encefalitis japonesa, virus de encefalitis de San Luis, virus de encefalitis de Murray Valley, virus del Nilo occidental, virus Kunjin, virus transmitido por garrapatas de Europa Central, virus transmitido por garrapatas del Extremo Este, virus del bosque Kyasanur, virus Louping III, virus Powassan, virus de fiebre hemorrágica de Omsk), el género Rubivirus (virus de Rubella), el género Pestivirus (virus de enfermedad de la mucosa, virus de cólera porcina, virus de enfermedad de la frontera); la familia Bunyaviridae, que incluye el género Bunyvirus (virus Bunyamwera y virus relacionados, virus del grupo de encefalitis de California), el género Phlebovirus (virus Siciliano de los flebótomos, virus de fiebre de Rift Valley), el género Nairovirus (virus de fiebre hemorrágica de Crimea, virus de enfermedad de Nairobi) y el género Uukuvirus (virus Uukuniemi y virus relacionados); la familia Orthomixoviridae, que incluye el género virus de Influenza (virus de Influenza tipo A, muchos subtipos humanos); virus de Influenza Porcina y virus de Influenza Aviaria y Equina; Influenza tipo B (muchos subtipos humanos) e influenza tipo C (posibles géneros separados); la familia paramyxoviridae, que incluye el género Paramyxovirus (virus de Parainfluenza tipo 1, virus Sendai, virus Hemadsorption, virus de Parainfluenza tipo 2 a 5, virus de Enfermedad de Newcastle, virus de las paperas), el género Morbillivirus (virus de Sarampión, virus de panencefalitis esclerosante subaguda, virus de moquillo, virus de la peste bovina), el género Pneumovirus (virus sincitial respiratorio (RSV), virus sincitial respiratorio de bovino y virus de neumonía de ratones); virus del bosque, virus Sindbis, virus Chikungunya, virus O'Nyong-Nyong, virus del río Ross, virus de encefalomielitis equina de Venezuela, virus de encefalomielitis equina del Occidente), el género Flavirius (virus de fiebre amarilla transmitido por mosquitos, virus del dengue, virus de encefalitis Japonesa, virus de encefalitis de San Luis, virus de encefalitis de Murray Valley, virus del Nilo occidental, virus Kunjin, virus transmitido por garrapatas de Europa Central, virus transmitido por garrapatas del Extremo Este, virus del bosque Kyasanur, virus del mal de Louping III, virus Powassan, virus de fiebre hemorrágica de Omsk), el género Rubivirus (virus de Rubella), el género Pestivirus (virus de enfermedad de la mucosa, virus de cólera porcina, virus de enfermedad de la frontera); la familia Bunyaviridae, que incluye el género Bunyvirus (virus Bunyamwera y virus relacionados, virus del grupo de encefalitis de California), el género Phlebovirus (virus Siciliano de los flebótomos, virus de fiebre de Rift Valley, el género Nairovirus (virus de fiebre hemorrágica de Crimea, virus de enfermedad de Nairobi) y el género Uukuvirus (virus Uukuniemi y virus relacionados); la familia Orthomyxoviridae, que incluye el género virus de Influenza (virus de Influenza tipo A, muchos subtipos humanos); virus de Influenza Porcina y virus de Influenza Aviaria y Equina; virus de Influenza tipo B (muchos subtipos humanos) y virus de influenza tipo C (posibles géneros separados); la familia paramyxoviridae, que incluye el género Paramyxovirus (virus de Parainfluenza tipo 1, virus Sendai, virus Hemadsorption, virus de Parainfluenza tipos 2 a 5, virus de enfermedad de Newcastle, virus de las paperas), el género Morbillivirus (virus de Sarampión, virus de panencefalitis esclerosante, subaguda, virus de moquillo, virus de la peste bovina), el género Pneumovirus (virus sincitial respiratorio (RSV), virus sincitial respiratorio de bovino y virus de neumonía de ratones); la familia Rhabdoviridae, que incluye el género Vesiculovirus (VSV), virus de Chandipura, virus Flanders-Hart Park), el género Lyssavirus (virus de las rabias), Rhabdovirus de peces y, filovirus (virus Marburg y virus de Ebola); la familia Arenaviridae, que incluye virus de coriomeningitis Linfocítica (LCM), complejo de virus Tacaribe y virus Lassa; la familia Coronoaviridae, que incluye el virus de bronquitis infecciosa (IBV), virus de hepatitis de ratón, virus corona entérico de humano y peritonitis infecciosa de felino (coronavirus de felino).
Los virus de ADN ilustrados que pueden utilizarse como partículas de núcleo incluyen, pero no están limitados a: la familia Poxviridae, que incluye el género Orthopoxivirus (Variola mayor, Variola menor, pox Vaccinia de Mono, viruela de vacas, viruela de Búfalo, viruela de conejos, Ectromelia), el género de Leporipoxvirus (Mixoma, Fibroma), el género Avipoxvirus (viruela aviar, otros virus de viruela aviaria), el género Capripoxvirus (viruela de ovejas, viruela de cabras), el género Suipoxvirus (viruela porcina), el género Parapoxvirus (virus de dermatitis postular contagioso, pseudoviruela de vaca, virus de estomatitis papulosa de bovino), la familia Iridoviridae (virus de peste bovina africana, virus Frog 2 y 3, virus de Linfocitis de peces); la familia Herpesviridae, que incluye los alfa-Herpesvirus (Herpes Simples tipos 1 y 2, Varicella-Zoster, virus de aborto equino, virus de herpes equino 2 y 3, virus de pseudorrabias, virus de queratoconjunctivitis de bovino infecciosa, virus de rinotraqueitis de bovino infecciosa, virus de rinotraqueitis felina, virus de laringotraqueitis infecciosa) los Beta-herpesvirus (citomegalovirus humano y citomegalovirus de cerdos, monos y roedores); gamma-herpesvirus (virus Epstein-Barr (EBV), virus de enfermedad de Marek, Herpes saimiri, Herpesvirus ateles, Herpesvirus Sylvilagus, virus de herpes de cobayo, virus de tumor Lucke); la familia Adenoviridae, que incluye el género Mastadenovirus (subgrupos humanos A, B, C, D y E y no agrupados, adenovirus de simio (al menos 23 serotipos), hepatitis canina infecciosa y adenovirus de ganado vacuno, cerdos, ovejas, ranas y muchas otras especies, el género Aviadenovirus (adenovirus aviario); y adenovirus no cultivables; la familia Papoviridae, que incluye el género Papillomavirus (virus de papiloma humano, virus de papiloma bovino, virus de papiloma de conejos Shope y varios virus de papiloma patógenos de otras especies), el género Polyomavirus (polyomavirus, agente vacuolar de simio (SV-40), agente vacuolar de conejo (RKV), virus K, virus BK, virus, JC y otros virus de polioma de primates tales como virus de papiloma Linfotrópico); la familia Parvoviridae que incluye el género de virus Adeno-asociados, el género Parvovirus (virus de panleucopenia de felino, parvovirus de bovino, parvovirus de canino, virus de enfermedad de visón de las Aleutianas, etcétera). Finalmente, los virus de ADN pueden incluir virus tales como agentes neuropáticos, infecciosos, crónicos (virus CHINA).
En otras realizaciones, una pilina bacteriana, una subporción de una pilina bacteriana o una proteína de fusión que contiene ya sea una pilina bacteriana o una subporción de la misma se utiliza para preparar las composiciones y composiciones de vacuna, respectivamente, de la invención. Los ejemplos de proteínas de pilinas incluyen pilinas producidas por Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Caulobacter crescentus, Pseudomonas stutzeri y Pseudomonas aeruginosa. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas de pilinas adecuadas para el uso con la presente invención incluyen aquellas expuestas en los informes de GenBank AJ000636 (SEC ID NO:1), AJ132364 (SEC ID NO:2), AF229646 (SEC ID NO:3), AF051814 (SEC ID NO:4), AF051815 (SEC ID NO:5) y X00981 (SEC ID NO:6), las descripciones completas de las cuales se incorporan en este texto a manera de referencia.
Las proteínas de pilinas bacterianas son procesadas generalmente para eliminar las secuencias líder N-terminales antes de exportar de las proteínas dentro del periplasma bacteriano. Además, como una persona experta en el campo técnico reconocería, las proteínas de pilinas bacterianas utilizadas para preparar composiciones y composiciones de vacuna, respectivamente, de la invención no tendrán generalmente la secuencia líder naturalmente presente.
Un ejemplo específico de una proteína de pilina adecuada para el uso en la presente invención es la proteína P-pilina de E. coli (informe de GenBank AF237482 (SEC ID NO:7)). Un ejemplo de una pilina de E. coli tipo 1 adecuada para el uso con la invención es una pilina que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en el informe de GenBank P04128 (SEC ID NO:8), la cual es codificada por ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos expuesta en el informe de GenBank M277603 (SEC ID NO:9). Las descripciones completas de estos informes de GenBank son incorporadas en este texto a manera de referencia. Nuevamente, la forma madura de la proteína referida anteriormente se utilizará generalmente para preparar composiciones y composiciones de vacuna, respectivamente, de la invención.
Las pilinas bacterianas o subporciones de pilina adecuadas para el uso en la práctica de la presente invención serán capaces generalmente de asociarse para formar disposiciones de antígenos ordenadas y repetitivas.
Los métodos para preparar los pili y estructuras tipo pilus in vitro son conocidas en el campo técnico. Bullitt y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci EE.UU. 93:12890-12895 (1996), por ejemplo, describen la reconstitución in vitro de las subunidades P-pili de E. coli. Además, Eshdat y colaboradores, J. Bacteriol. 148:308-314 (1981) describen métodos adecuados para disociar los pili tipo 1 de E. coli y la reconstitución de los pili bacterianos. En resumen, estos métodos son como sigue: los pili son disociados por medio de la incubación a 37ºC en clorhidrato de guanidina saturado. Las proteínas de pilina entonces son purificadas mediante la cromatografía, después de lo cual se forman dímeros de pilina por medio de la diálisis contra clorhidrato de tri(hidroximetil)aminometano 5 mM (pH 8,0). Eshdat y colaboradores, también descubrieron que los dímeros de pilina se reensamblan para formar pili con la diálisis contra el tri(hidroximetil)aminometano 5 mM (pH 8,0) que contiene MgCl_{2} 5 mM.
Además, utilizando, por ejemplo, la ingeniería genética convencional y los métodos de modificación de proteínas, las proteínas de pilina pueden ser modificadas para contener un primer sitio de unión al cual un antígeno o determinante antigénico es unido a través de un segundo sitio de unión. Alternativamente, los antígenos o determinantes antigénicos pueden ser unidos directamente a través de un segundo sitio de unión a los residuos de aminoácidos que son residentes naturalmente en estas proteínas. Estas proteínas de pilina modificadas entonces pueden utilizarse en las composiciones de vacunas de la invención.
Las proteínas de pilina bacteriana utilizadas para preparar las composiciones y composiciones de vacuna, respectivamente, de la invención pueden ser modificadas de manera similar a aquella descrita en este texto para HBcAg. Por ejemplo, los residuos de cisteína y lisina pueden ser ya sea suprimidos o sustituidos con otros residuos de aminoácidos y los primeros sitios de unión pueden ser adicionados a estas proteínas. Además, las proteínas de pilina pueden ser ya sea expresadas en forma modificada o pueden ser modificas químicamente después de la expresión. De manera similar, los pili intactos pueden ser recolectados de bacterias y luego modificados químicamente.
En otra realización, los pili o estructuras tipo pilus son recolectados de las bacterias (por ejemplo E. coli) y se utilizan para formar composiciones y composiciones de vacuna de la invención. Un ejemplo de pili adecuados para preparar composiciones y composiciones de vacuna es el pilus tipo 1 de E. coli, el cual se forma a partir de monómeros de pilina que tienen la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO:8.
En el campo técnico se conoce una variedad de métodos para recolectar pili bacterianos. Bullit y Makowski (Biophys. J. 74:623-632 (1998)), por ejemplo, describen un método y purificación de pilus para la recolección de P-pili de E. coli. De acuerdo con este método, los pili son cortados de E. coli excesivamente llenas de peli que contienen un plásmido de P-pilus y son purificados por ciclos de solubilización y precipitación en MgCl_{2} (1,0 M).
Una vez recolectados, los pili o estructuras tipo pilus pueden ser modificados de una variedad de maneras. Por ejemplo, un primer sitio de unión puede ser adicionado a los pili a los cuales los antígenos o determinantes antigénicos pueden estar unidos a través de un segundo sitio de unión. En otras palabras, los pili bacterianos o estructuras tipo pilus pueden ser recolectados y modificados para conducir a disposiciones de antígenos ordenadas y repetitivas.
Los antígenos o determinantes antigénicos podrían estar unidos a residuos de cisteína de origen natural o residuos de lisina presentes en los pili o estructuras tipo pilus. En tales casos, el alto orden y repetitividad de un residuo de aminoácido de origen natural guiaría al acoplamiento de los antígenos o determinantes antigénicos a los pili o estructuras tipo pilus. Por ejemplo, los pili o estructuras tipo pilus podrían ser unidos a los segundos sitios de unión de los antígenos o determinantes antigénicos utilizando un agente de reticulación heterobifuncional.
Cuando estructuras que son sintetizadas naturalmente por organismos (por ejemplo pili) se utilizan para preparar composiciones y composiciones de vacuna de la invención, frecuentemente será ventajoso diseñar genéticamente estos organismos de manera que produzcan estructuras que tengan características deseables. Por ejemplo, cuando se utilizan pili tipo-1 de E. coli, la bacteria E. coli de la cual se recolectan estos pili pueden ser modificado para producir estructuras con características específicas. Los ejemplos de modificaciones posibles de proteínas de pilina incluyen la inserción de uno o más residuos de lisina, la supresión o substitución de uno o más de los residuos de lisina naturalmente residentes y la supresión o sustitución de uno o más residuos de cisteína naturalmente residentes (por ejemplo, los residuos de cisteína en las posiciones 44 y 84 en la SEC ID NO:8).
Además, se pueden hacer modificaciones adicionales a los genes de pilina, las cuales dan por resultado la expresión de productos que contienen un primer sitio de unión diferente de un residuo de lisina (por ejemplo, un dominio FOS o JUN). Por supuesto, los primeros sitios de unión adecuados serán limitados generalmente a aquellos que no presentan proteínas de pilina a partir de la formación de pili o estructuras tipo pilus adecuadas para el uso en composiciones de vacuna de la invención.
Los genes de pilina que residen naturalmente en las células bacterianas pueden ser modificados in vivo (por ejemplo, por medio de la recombinación homologa) o los genes de pilina con características particulares pueden ser insertados en estas células. Por ejemplo, los genes de pilina podrían ser introducidos en células bacterianas como un componente de ya sea un vector de clonación replicable o un vector el cual se inserta en el cromosoma bacteriano. Los genes de pilina insertados también pueden ser unidos a las secuencias de control reguladoras de expresión (por ejemplo, un operador lac).
En la mayoría de casos, los pili o estructuras tipo pilus utilizados en composiciones y composiciones de vacuna, respectivamente, de la invención estarán compuestos de un tipo individual de una subunidad de pilina. Los pili o estructuras tipo pilus compuestos de subunidades idénticas se utilizarán generalmente debido a que se espera que éstos formen estructuras las cuales presentan disposiciones de antígenos altamente ordenadas y repetitivas.
Sin embargo, las composiciones de la invención también incluyen composiciones y vacunas que comprenden pili y estructuras tipo pilus formados de subunidades de pilina heterogéneas. Las subunidades de pilina que forman estos pili o estructuras tipo pilus pueden ser expresadas a partir de genes que residen naturalmente en la célula bacteriana o pueden ser introducidos en las células. Cuando un gen de pilina naturalmente residente y un gen introducido son expresados ambos en una célula que forma pili o estructuras tipo pilus, el resultado será generalmente estructuras formadas de una mezcla de estas proteínas de pilina. Además, cuando dos o más genes de pilina son expresados en una célula bacteriana, la expresión relativa de cada gen de pilina será típicamente el factor que determina la relación de las diferentes subunidades de pilina en los pili o estructuras tipo pilus.
Cuando se desean pili o estructuras tipo pilus que tienen una composición particular de subunidades de pilina mezcladas, la expresión de al menos uno de los genes de pilina puede ser regulada por un promotor inducible heterólogo. Tales promotores, así como también otros elementos genéticos, se pueden utilizar para regular las cantidades relativas de diferentes subunidades de pilina producidas en la célula bacteriana y, por lo tanto, la composición de los pili o estructuras tipo pilus.
Además, el antígeno o determinante antigénico puede ser enlazado a pili bacterianos o estructuras tipo pilus por medio de un enlace que no es un enlace de péptido, las células bacterianas que producen pili o estructuras tipo pilus utilizadas en las composiciones de la invención pueden ser diseñadas genéticamente para generar proteínas de pilina las cuales se fusionan a un antígeno o determinante antigénico. Estas proteínas de fusión que forman pili o estructuras tipo pilus son adecuadas para el uso en composiciones de vacuna de la invención.
Las partículas tipo virus en el contexto de la presente solicitud se refieren a estructuras que se asemejan a una partícula de virus pero que no son patógenas. En general, las partículas tipo virus carecen de genoma viral y, por lo tanto, no son infecciosas. También, las partículas tipo virus pueden producirse en grandes cantidades por medio de la expresión heteróloga y se pueden purificar fácilmente.
En una realización preferida, la partícula tipo virus es una partícula tipo virus recombinante. El técnico experto puede producir VLPs utilizando tecnología de ADN recombinante y secuencias de codificación de virus, las cuales son fácilmente disponibles para el público. Por ejemplo, la secuencia de codificación de una proteína de envoltura o de núcleo viral puede ser diseñada para la expresión en un vector de expresión de baculovirus utilizando un vector de baculovirus comercialmente disponible, bajo el control regulatorio de un promotor de virus, con modificaciones apropiadas de la secuencia para permitir el enlace funcional de la secuencia de codificación a la secuencia reguladora. La secuencia de codificación de una proteína de envoltura o de núcleo viral también puede ser diseñada para la expresión en un vector de expresión bacteriano, por ejemplo.
Los ejemplos de VLPs incluyen, pero no están limitados a, las proteínas de cápside de virus de hepatitis B (Ulrich y colaboradores, Virus Res. 50:141-182 (1998)), virus de sarampión (Warnes y colaboradores, Gene 160:173-178 (1995)), virus Sindbis, rotavirus (documentos US 5.071.651 y US 5.374.426), virus de fiebre aftosa (Twomey y colaboradores, Vaccine 13:1603-1610, (1995)), virus Norwalk (Jiang, X. y colaboradores, Science 250:1580-1583 (1990); Matsui, S.M. y colaboradores, J. Clin. Invest. 87:1456-1461 (1991)), la proteína GAG retroviral (documento WO 96/30523), la proteína p1 del retrotransposón Ty, la proteína de superficie de virus de hepatitis B (documento WO 92/11291), virus de papiloma humano (documento WO 98/15631, fagos de ARN, Ty, fr-fago, GA-fago y Q\beta).
Como será fácilmente evidente para aquellas personas expertas en el campo técnico, la VLP de la invención no está limitada a alguna forma específica. La partícula puede ser sintetizada químicamente o a través de procesos biológicos, los cuales pueden ser naturales o no naturales. A manera de ejemplo, este tipo de realización incluye una partícula tipo virus o una forma recombinante de la misma.
En una realización más específica, la VLP puede comprender, o alternativamente consiste de manera esencial en, o alternativamente consiste en, polipéptidos recombinantes, o fragmentos de los mismos, que se seleccionan de polipéptidos recombinantes de Rotavirus, polipéptidos recombinantes de virus Noewalk, polipéptidos recombinantes de Alphavirus, polipéptidos recombinantes de virus de fiebre aftosa, polipéptidos recombinantes de virus de sarampión, polipéptidos recombinantes de virus Sindbis, polipéptidos recombinantes de Polyomavirus, polipéptidos recombinantes de Retrovirus, polipéptidos recombinantes de virus de hepatitis B (por ejemplo, HBcAg), polipéptidos recombinantes de virus de mosaico de Tabaco, polipéptidos recombinantes de virus Flock House, polipéptidos recombinantes de Papillomavirus de humano, polipéptidos recombinantes de bacteriófagos, polipéptidos recombinantes de fagos de ARN, polipéptidos recombinantes de Ty, polipéptidos recombinantes de fr-fago, polipéptidos recombinantes de GA-fago y polipéptidos recombinantes de Q\beta-fago. La partícula tipo virus puede comprender además, o alternativamente consiste de manera esencial en, o alternativamente consiste en, uno o más fragmentos de tales polipéptidos, así como también variantes de tales polipéptidos. Las variantes de polipéptidos pueden compartir, por ejemplo, al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% de identidad al nivel de aminoácidos con sus contrapartes de tipo no cultivado.
De acuerdo con la presente invención, la composición de la invención comprende una partícula tipo virus que comprende, consiste esencialmente, o alternativamente consiste en, proteínas recombinantes o fragmentos de las mismas, de un fago de ARN. Preferiblemente, el fago de ARN se selecciona del grupo que consiste en a) bacteriófago Q\beta; b) bacteriófago R17; c) bacteriófago fr; d) bacteriófago GA; e) bacteriófago SP; f) bacteriófago MS2; g) bacteriófago M11; h) bacteriófago MX1; i) bacteriófago NL95; k) bacteriófago f2; l) bacteriófago PP7.
En otra realización preferida de la presente invención, la partícula tipo virus comprende, o alternativamente consiste de manera esencial en, o alternativamente consiste en, proteínas recombinantes, o fragmentos de las mismas, del ARN-bacteriófago Q\beta o del ARN-bacteriófago fr.
En una realización preferida adicional de la presente invención, las proteínas recombinantes comprenden, o alternativamente consisten de manera esencial en, o alternativamente consisten en, proteínas de recubrimiento de fagos de ARN.
Las proteínas de recubrimiento de fagos de ARN que forman cápsides o VLP's o fragmentos de las proteínas de recubrimiento de bacteriófagos compatibles con el autoensamblaje en una cápside o una VLP son, por lo tanto, realizaciones preferidas adicionales de la presente invención. Las proteínas de recubrimiento de bacteriófago Q\beta, por ejemplo, pueden ser expresadas de manera recombinante en E. coli. Además, con esta expresión, estas proteínas forman espontáneamente cápsides. Adicionalmente, estas cápsides forman una estructura con una organización repetitiva, inherente.
Los ejemplos preferidos, específicos de proteínas de recubrimiento de bacteriófagos, las cuales se pueden utilizar para preparar las composiciones de la invención, incluyen proteínas de recubrimiento de ARN-bacteriófagos tales como el bacteriófago Q\beta (SEC ID NO:10; base datos PIR, número de acceso VCBPQ\beta que se refiere a CP de Q\beta y SEC ID NO:11; número de acceso AAA16663 que se refiere a la proteína A1 de Q\beta); el bacteriófago R17 (SEC ID NO: 12; número de acceso de PIR VCBPR7), el bacteriófago fr (SEC ID NO:13; número de acceso de PIR VCBPFR), el bacteriófago GA (SEC ID NO: 14; número de acceso de GenBank NP-040754), el bacteriófago SP (SEC ID NO: 15; número de acceso de GenBank CAA30374 referido para CP de SP y SEC ID NO:16; número de acceso que se refiere a la proteína A1 de SP), el bacteriófago MS2 (SEC ID NO: 17; número de acceso de PIR VCBPM2), el bacteriófago M11 (SEC ID NO: 18; número de acceso de GenBank AAC06250), el bacteriófago MX1 (SEC ID NO: 19; número de acceso de GenBank AAC14699), el bacteriófago NL95 (SEC ID NO: 20; número de acceso de GenBank AAC14704), el bacteriófago f2 (SEC ID NO: 21; número de acceso de GenBank P03611), el bacteriófago PP7 (SEC ID NO: 22). Además, la proteína A1 del bacteriófago Q\beta o las formas truncadas C-terminales que carecen de tanto como 100, 150 o 180 aminoácidos de su terminación C pueden ser incorporadas en un ensamblaje de cápside de las proteínas de recubrimiento Q\beta. Generalmente, el porcentaje de la proteína A1 de Q\beta con relación a CP de Q\beta en el ensamblaje de cápsides será limitado, a fin de asegurar la formación de cápsides.
También se ha descubierto que la proteína de recubrimiento Q\beta se autoensambla en cápsides cuando se expresa en E. coli (Kozlovska TM. y colaboradores, GENE 137:133-137 (1993)). Las cápsides obtenidas o las partículas tipo virus mostradas en la estructura de cápsides similares a fagos icosaédricos con un diámetro de 25 nm y una quasi simetría T=3. Además, la estructura cristalina del fago Q\beta ha sido resuelta. La cápside contiene 180 copias de la proteína de recubrimiento, las cuales están enlazadas en pentámeros y hexámeros covalentes por puentes de disulfuro. (Golmohammadi, R. y colaboradores, Structure 4: 543-5554 (1996)) lo que conduce a una estabilidad remarcable de la cápside de la proteína de recubrimiento Q\beta. Las cápsides o VLP's hechas a partir de la proteína de recubrimiento Q\beta recombinante pueden contener, sin embargo, subunidades no enlazadas por medio de enlaces de disulfuro a otras subunidades dentro de la cápside, o pueden ser enlazadas incompletamente. De esta manera, con la carga de la cápside Q\beta recombinante sobre SDS-PAGE no reductora, las bandas que corresponden a la proteína de recubrimiento Q\beta monómerica así como también las bandas que corresponden al hexámero o pentámero de la proteína de recubrimiento Q\beta son visibles. Las subunidades enlazadas de manera incompleta a disulfuro podrían aparecer como una banda de dímeros, trímeros o aún tetrámeros en la SDS-PAGE no reductora. La proteína de la cápside Q\beta también muestra una resistencia inusual a los solventes orgánicos y agentes de desnaturalización. Sorprendentemente, se ha observado que las concentraciones de DMSO y acetonitrilo tan altas como 30% y las concentraciones de Guanidinio tan altas como 1M no afectan la estabilidad de la cápside. La alta estabilidad de la cápside de la proteína de recubrimiento Q\beta es una característica ventajosa, en particular, para su uso en la inmunización y vacunación de mamíferos y humanos de acuerdo con la presente invención.
Con la expresión en E. coli, la metionina N-terminal de la proteína de recubrimiento Q\beta es removida usualmente, como se observó por la secuenciación Edman N-terminal descrita en Stoll, E. y colaboradores, J. Biol. Chem. 252:990-993 (1997). La VLP compuesta de proteínas de recubrimiento Q\beta donde la metionina N-terminal no ha sido removida, o las VLPs que comprenden una mezcla de proteínas de recubrimiento Q\beta donde la metionina N-terminal es ya sea escindida o está presente también están dentro del alcance de la presente invención.
Además, también se ha mostrado que las proteínas de recubrimiento fagos de ARN se autoensamblan con la expresión en un hospedante bacteriano (Kastelein, RA. y colaboradores, Gene 23:245-254 (1983), Kozlovskaya, TM. y colaboradores, Dokl. Akad. Nauk SSSR 287:452-455 (1986), Adhin, MR. y colaboradores, Virology 170:238-242 (1989), Ni, CZ. y colaboradores, Protein Sci, 5:2485-2493 (1996), Priano, C. y colaboradores, J. Mol. Biol. 249:283-297 (1995)). La cápside de fagos Q\beta contiene, además de la proteína de recubrimiento, comúnmente llamada proteína A1 de lectura completa y la proteína de maduración A2. La proteína A1 es generada mediante la supresión en el codón de detención UGA y tiene una longitud de 329 aa. La cápside de la proteína de recubrimiento recombinante de fagos Q\beta utilizada en la invención está desprovista de la proteína de lisis A2 y contiene ARN del hospedante. La proteína de recubrimiento de los fagos de ARN es una proteína de enlace de ARN e interactúa con el circuito de raíz del sitio de enlace ribosómico del gen de replicasa que actúa como un represor de traducción durante el ciclo de vida del virus. La secuencia y elementos estructurales de la interacción son conocidos (Witherell, GW. y Uhlenbeck, OC. Biochemistry 28:71-76 (1989); Lim F. y colaboradores, J. Biol. Chem. 271:31839-31845 (1996)). Se sabe que el circuito de raíz y el ARN en general están involucrados en el ensamblaje de virus (Golmohammadi, R. y colaboradores, Structure 4:543-5554 (1996)).
La partícula tipo virus comprende, o alternativamente consiste de manera esencial en, o alternativamente consiste en, proteínas recombinantes o fragmentos de las mismas, de un fago de ARN, en donde las proteínas recombinantes comprenden, consisten esencialmente en, o alternativamente consisten en, proteínas de recubrimiento mutantes de un fago de ARN, preferiblemente de proteínas de recubrimiento mutantes de los fagos de ARN mencionados anteriormente. En otra realización preferida, las proteínas de recubrimiento mutantes del fago de ARN han sido modificadas por la remoción de al menos un residuo de lisina por medio de la sustitución, o por la adición de al menos un residuo de lisina por medio de la sustitución; alternativamente, las proteínas de recubrimiento mutantes del fago de ARN han sido modificadas por la supresión de al menos un residuo de lisina o por la adición de al menos un residuo de lisina por medio de la inserción.
En otra realización preferida, la partícula tipo virus comprende, o alternativamente consiste de manera esencial en, o alternativamente consiste en, proteínas recombinantes, o fragmentos de las mismas, del ARN-bacteriófago Q\beta, en donde las proteínas recombinantes comprenden, o alternativamente consisten de manera esencial en, o alternativamente consisten en, proteínas de recubrimiento que tienen una secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:10 o una mezcla de proteínas de recubrimiento que tienen secuencias de aminoácidos de la SEC ID NO:10 y de la SEC ID NO:11 o mutantes de la SEC ID NO:11 y en donde la metionina N-terminal es escindida preferiblemente.
En una realización preferida adicional de la presente invención, la partícula tipo virus comprende, o alternativamente consiste de manera esencial en, o alternativamente consiste en, proteínas recombinantes de Q\beta, o fragmentos de las mismas, en donde las proteínas recombinantes comprenden, o alternativamente consisten de manera esencial en, o alternativamente consisten en, proteínas de recubrimiento Q\beta mutantes. En otra realización preferida, estas proteínas de recubrimiento mutantes han sido modificadas por la remoción de al menos un residuo de lisina por medio de la sustitución, o por la adición de al menos un residuo de lisina por medio de la sustitución. Alternativamente, estas proteínas de recubrimiento mutantes han sido modificadas por la supresión de al menos un residuo de lisina o por la adición de al menos un residuo de lisina por medio de la inserción.
Se exponen cuatro residuos de lisina en la superficie de la cápside de la proteína de recubrimiento Q\beta Los mutantes Q\beta, por los cuales los residuos de lisina expuestos son reemplazados por argininas, también se pueden utilizar para la presente invención. Los siguientes mutantes de proteínas de recubrimiento Q\beta y VLP's de Q\beta mutantes pueden utilizarse, de esta manera, en la práctica de la invención: "Q\beta-240" (Lys13-Arg; SEC ID NO:23), "Q\beta-243" (Asn 10-Lys; SEC ID NO:24), "Q\beta-250" (Lys 2-Arg, Lys13-Arg; SEC ID NO:25), "Q\beta-251" (SEC ID NO:26) y "Q\beta-259" (Lys 2-Arg, Lys16-Arg; SEC ID NO:27). De esta manera, en una realización preferida adicional de la presente invención, la partícula tipo virus comprende, o alternativamente consiste de manera esencial en, o alternativamente consiste en, proteínas recombinantes de proteínas de recubrimiento Q\beta mutantes, las cuales comprenden proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en a) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:23; b) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:24; c) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:25; d) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:26; y e) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:27. La construcción, expresión y purificación de las proteínas de recubrimiento Q\beta indicadas anteriormente, VLP's de proteínas de recubrimiento Q\beta mutantes y cápsides, respectivamente, se describen en la solicitud norteamericana pendiente No. 10/050.902 presentada por el actual cesionario el 18 de enero de 2002. En particular se refiere con lo cual al ejemplo 18 de la solicitud mencionada anteriormente.
En una realización preferida adicional de la presente invención, la partícula tipo virus comprende, o alternativamente consiste de manera esencial en, o alternativamente consiste en, proteínas recombinantes de Q\beta, o fragmentos de las mismas, en donde las proteínas recombinantes comprenden, o alternativamente consisten de manera esencial en, o alternativamente consisten en, una mezcla de ya sea uno de los mutantes de Q\beta anteriores o la proteína A1 correspondiente.
En una realización preferida adicional de la presente invención, la partícula tipo virus comprende, o alternativamente consiste de manera esencial en, o alternativamente consiste en, proteínas recombinantes, o fragmentos de las mismas, del fago de ARN AP205.
El genoma de AP205 consiste en una proteína de maduración, una proteína de recubrimiento, una replicasa y dos marcos de lectura abierta que no están presentes en los fagos relacionados; un gen de lisis y un marco de lectura abierta que juega un papel principal en la traducción del gen de maduración (Klovins, J. y colaboradores, J. Gen. Virol. 83:1523-33 (2002)). La proteína de recubrimiento AP205 puede ser expresada a partir del plásmido aP283-58 (SEC ID NO:94), el cual es un derivado de pQb10 (Kozlovska, T. M. y colaboradores, Gene 137:133-37 (1993)), y el cual contiene un sitio de enlace ribosómico AP205. Alternativamente, la proteína de recubrimiento AP205 puede ser clonada en pQb185, corriente abajo del sitio de enlace ribosómico presente en el vector. Ambos planteamientos conducen a la expresión de la proteína y la formación de cápsides como se describe en la solicitud provisional de patente de EE.UU. en tramitación simultáneamente, con el título "Molecular Antigen Arrays" y que ha sido presentada por el presente cesionario el 16 julio de 2002, la cual se incorpora a manera de referencia en su totalidad. Los vectores pQb10 y pQb185 son vectores derivados del vector pGEM y la expresión de los genes clonados en estos vectores es controlada por el promotor trp (Kozlovska, T. M. y colaboradores, Gene 137:133-37 (1993)). El plásmido pAP283-58 (SEC ID NO:79) comprende un sitio de enlace ribosómico AP205 putativo en la siguiente secuencia, la cual está corriente abajo del sitio XbaI, e inmediatamente corriente arriba del codón de inicio ATG de la proteína de recubrimiento AP205: tctagaATTTTCTGCGCACCCATCCCGGGTGGCGCCCAAAGTGAGGAAAATCACatg. El vector pQb185 comprende una secuencia Shine Delagarno corriente abajo del sitio XbaI y corriente arriba del codón de inicio (tctagaTTAACCCAACGCGTAGGAGTCAGGCCatg, secuencia Shine Delagarno subrayada).
En una realización preferida adicional de la presente invención, la partícula tipo virus comprende, o alternativamente consiste de manera esencial en, o alternativamente consiste en, proteínas de recubrimiento recombinantes, o fragmentos de las mismas, del fago de ARN AP205.
Esta realización preferida de la presente invención, de esta manera, comprende proteínas de recubrimiento AP205 que forman cápsides. Estas proteínas son expresadas de manera recombinante o son preparadas a partir de fuentes naturales. Las proteínas de recubrimiento AP205 producidas en bacterias forman espontáneamente cápsides, como es evidente a partir de la Microscopía Electrónica (EM) y la inmunodifusión. Las partículas estructurales de la cápside formada por la proteína de recubrimiento AP205 (SEC ID NO:80) y aquellas formadas por la proteína de recubrimiento del fago de ARN AP205 son casi indistinguibles cuando se observan en EM. Las VLPs de AP205 son altamente inmunogénicas y pueden ser enlazadas con antígenos y/o determinantes antigénicos para generar construcciones de vacuna que exhiben los antígenos y/o determinantes antigénicos orientados de manera repetitiva. Los altos títulos son producidos contra los antígenos de esta manera exhibidos lo que muestra que los antígenos ligados y/o determinantes antigénicos ligados son accesibles para interactuar con las moléculas de anticuerpos y son inmunogénicos.
En una realización preferida adicional de la presente invención, la partícula tipo virus comprende, o alternativamente consiste de manera esencial en, o alternativamente consiste en, proteínas de recubrimiento mutantes, recombinantes, o fragmentos de las mismas, del fago de ARN AP205.
Las formas mutantes competentes para el ensamblaje de las VLPs de AP205, incluyendo la proteína de recubrimiento AP205 con la sustitución de prolina en el aminoácido 5 a treonina (SEC ID NO:81), se pueden utilizar también en la práctica de la invención y conducen a una realización preferida adicional de la invención. Estas VLPs, VLPs de AP205 derivadas de fuentes naturales, o partículas virales AP205 se pueden ligar a los antígenos para producir disposiciones repetitivas, ordenadas de los antígenos de acuerdo con la presente invención.
La proteína de recubrimiento mutante AP205 P5-T puede ser expresada a partir del plásmido pAP281-32 (SEC ID NO:82), el cual se deriva directamente de pQb185, y el cual contiene el gen de la proteína de recubrimiento AP205 mutante en lugar del gen de la proteína de recubrimiento Q\beta. Los vectores para la expresión de la proteína de recubrimiento AP205 son transfectados en E. coli para la expresión de la proteína de recubrimiento AP205.
Las cepas de E. coli adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, E. coli K802, JM 109, RP1. Los vectores y cepas adecuados y combinaciones de los mismos pueden ser identificados por medio de la prueba de expresión de la proteína de recubrimiento y la proteína de recubrimiento mutante, respectivamente, por medio de SDS-PAGE y la formación de cápsides y ensamblaje opcionalmente al purificar primero las cápsides por la filtración en gel y subsecuentemente el sometimiento a prueba de éstas en un ensayo de inmunodifusión (prueba Ouchterlony) o Microscopía Electrónica (Kozlovska T.M. y colaboradores, GENE 137:133-137 (1993)).
Las proteínas de recubrimiento AP205 expresadas a partir de los vectores pAP283-58 y pAP281-32 pueden estar desprovistas del aminoácido inicial metionina, debido al procesamiento en el citoplasma de E. coli, las formas escindidas, no escindidas de la VLP de AP205, o mezclas de las mismas son realizaciones preferidas adicionales de la invención.
En una realización preferida adicional de la presente invención, la partícula tipo virus comprende, o alternativamente consiste de manera esencial en, o alternativamente consiste en, una mezcla de proteínas de recubrimiento recombinantes, o fragmentos de las mismas, del fago de ARN AP205 y de proteínas de recubrimiento mutantes, recombinantes, o fragmentos de las mismas, del fago de ARN AP205.
En una realización preferida adicional de la presente invención, la partícula tipo virus comprende, o alternativamente consiste de manera esencial en, o alternativamente consiste en, fragmentos de proteínas de recubrimiento recombinantes, o proteínas de recubrimiento mutantes, recombinantes del fago de ARN AP205.
Los fragmentos de proteínas de recubrimiento AP205 recombinantes que son capaces de ensamblarse en una VLP y una cápside, respectivamente, también son útiles en la práctica de la invención. Estos fragmentos pueden ser generados por medio de la supresión, ya sea internamente o en las terminaciones de la proteína de recubrimiento y la proteína de recubrimiento mutante, respectivamente. Las inserciones en la secuencia de la proteína de recubrimiento y la proteína de recubrimiento mutante o las fusiones de secuencias de antígenos a la secuencia de la proteína de recubrimiento y la proteína de recubrimiento mutante, y que son compatibles con el ensamblaje en una VLP, son realizaciones adicionales de la invención y conducen a proteína de recubrimiento AP205 quiméricas, y partículas, respectivamente. El resultado de las inserciones, supresiones y fusiones a la secuencia de la proteína de recubrimiento, y si es compatible con el ensamblaje en una VLP, puede determinarse por medio de la microscopía electrónica.
Las partículas formadas por la proteína de recubrimiento AP205, fragmentos de la proteína de recubrimiento y proteínas de recubrimiento quiméricas descritas anteriormente, pueden ser aisladas en forma pura por medio de una combinación de pasos de fraccionamiento por medio de pasos de precitación y purificación mediante la filtración en gel utilizando, por ejemplo, columnas de Sepharose® CL-4B, Sepharose® CL-2B, Sepharose® CL-6B y combinaciones de las mismas, como se describe en la solicitud provisional de patente de EE.UU. en tramitación simultáneamente, con el título "Molecular Antigen Arrays" y que ha sido presentada por el presente cesionario el 16 julio de 2002, la cual se incorpora a manera de referencia en su totalidad. Otros métodos de aislamiento de partículas tipo virus son conocidos en el campo técnico y se pueden utilizar para aislar las partículas tipo virus (VLPs) del bacteriófago AP205. Por ejemplo, el uso de la ultracentrifugación para aislar las VLPs del retrotransposón de levadura Ty se describe en la patente de EE.UU. nº 4.918.166, la cual se incorpora a manera de referencia en este texto en su totalidad.
La estructura cristalina de varios ARN-bacteriófagos ha sido determinada (Golmohammadi, R. y colaboradores, Structure 4:543-554 (1996)). Utilizando esta información, los residuos expuestos en la superficie pueden ser identificados y, de esta manera, las proteínas de recubrimiento del fago de ARN pueden ser modificadas de tal manera que uno o más residuos de aminoácidos reactivos pueden ser insertados por medio de la inserción o sustitución. Como consecuencia, aquellas formas modificadas de proteínas de recubrimiento de bacteriófagos también se pueden utilizar para presente invención. De esta manera, las variantes de proteínas que forman cápsides o estructuras similares a cápsides (por ejemplo proteínas de recubrimiento de bacteriófago Q\beta, bacteriófago R17, bacteriófago fr, bacteriófago GA, bacteriófago SP y bacteriófago MS2) también se pueden utilizar para preparar las composiciones de la presente invención.
Aunque la secuencia de las proteínas variantes descrita anteriormente difiera de sus contrapartes de origen natural, estas proteínas variantes retendrán generalmente la capacidad para formar cápsides o estructuras similares a cápsides. De esta manera, la invención además incluye composiciones y composiciones de vacuna, respectivamente, las cuales incluyen adicionalmente variantes de proteínas que forman cápsides o estructuras similares a cápsides, así como también métodos para preparar estas composiciones y composiciones de vacuna, respectivamente, subunidades de proteína individuales utilizadas para preparar estas composiciones y moléculas de ácido nucleico que codifican estas subunidades de proteína. De esta manera, están incluidas dentro del alcance de la invención las formas variantes de las proteínas de origen natural que forman cápsides o estructuras similares a cápsides y que retienen la capacidad para asociarse y formar cápsides o estructuras similares a cápsides.
Como resultado, la invención además incluye composiciones y composiciones de vacuna, respectivamente, que comprenden, o alternativamente consisten de manera esencial en, o alternativamente consisten en, secuencias de aminoácidos las cuales son al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% idénticas a las proteínas de origen natural que forman disposiciones ordenadas y que tienen una estructura repetitiva, inherente, respectivamente.
Además, están incluidas dentro del alcance de la invención las moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas utilizadas para preparar composiciones de la presente invención.
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En otras realizaciones, la invención además incluye composiciones que comprenden proteínas, que comprenden, o alternativamente consisten de manera esencial en, o alternativamente consisten en, secuencias de aminoácidos que son al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% idénticas a cualquiera de las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEC ID NOs:10-27.
Las proteínas adecuadas para el uso en la presente invención también incluyen mutaciones de tratamiento C-terminales de proteínas, las cuales forman cápsides o estructuras similares a cápsides, o VLP's. Los ejemplos específicos de tales mutantes de tratamiento incluyen proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEC ID NOs: 10-27, donde 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15 o 17 aminoácidos han sido eliminados de la terminación C. Típicamente, estas mutaciones de tratamiento C-terminales retendrán la capacidad para formar cápsides o estructuras similares a cápsides.
Las proteínas adicionales que son adecuadas para el uso en la presente invención también incluyen mutaciones de truncamiento N-terminales de proteínas que forman cápsides o estructuras similares a cápsides. Los ejemplos específicos de tales mutantes de truncamiento incluyen proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEC ID NOs: 10-27, donde 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15 o 17 aminoácidos han sido eliminados de la terminación N. Típicamente, estas mutaciones de truncamiento N-terminales retendrán la capacidad para formar cápsides o estructuras similares a cápsides.
Las proteínas adicionales que son adecuadas para el uso en la presente invención incluyen mutaciones de truncamiento N- y C-terminales que forman cápsides o estructuras similares a cápsides. Los mutantes de truncamiento adecuados incluyen proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEC ID NOs: 10-27, donde 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15 o 17 aminoácidos han sido eliminados de la terminación N y 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15 o 17 aminoácidos han sido eliminados de la terminación C. Típicamente, estos mutantes de truncamiento N-terminales y C-terminales retendrán la capacidad para formar cápsides o estructuras similares a cápsides.
La invención además incluye composiciones que comprenden proteínas que comprenden, o alternativamente consisten de manera esencial en, o alternativamente consisten en, secuencias de aminoácidos las cuales son al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% idénticas a las mutaciones de truncamiento descritas anteriormente.
La invención incluye, de esta manera, composiciones y composiciones de vacuna preparadas a partir de proteínas que forman cápsides o VLP's, métodos para preparar estas composiciones a partir de subunidades de proteínas individuales y VLP's o cápsides, métodos para preparar estas subunidades de proteína individuales, moléculas de ácido nucleico que codifican estas subunidades y métodos para vacunar y/o producir respuestas inmunológicas en individuos utilizando estas composiciones de la presente invención.
Como se estableció previamente, la invención incluye partículas tipo virus o formas recombinantes de las mismas. En una realización preferida adicional, las partículas utilizadas en las composiciones de la invención están compuestas de una proteína de núcleo de hepatitis B (HBcAg) o un fragmento de una HBcAg. En una realización adicional, las partículas utilizadas en las composiciones de la invención están compuestas de una proteína de núcleo de hepatitis B (HBcAg) o un fragmento de una proteína HBcAg, la cual ha sido modificada para ya sea eliminar o reducir el número de residuos de cisteína libres. Zhou y colaboradores (J. Virol. 66:5393-5398 (1992)) demostraron que las proteínas HBcAgs que han sido modificadas para remover los residuos de cisteína residentes naturalmente retienen la capacidad para asociarse y formar cápsides. De esta manera, las VLP's adecuadas para el uso en las composiciones de la invención incluyen aquellas que comprenden las proteínas HBcAgs modificadas, o fragmentos de las mismas, en las cuales uno o más de los residuos de cisteína residentes naturalmente han sido ya sea suprimidos o sustituidos con otro residuo de aminoácido (por ejemplo, un residuo de serina).
La proteína HBcAg es una proteína generada por medio del procesamiento de una proteína precursora de antígeno de núcleo de hepatitis B. Se ha identificado una variedad de isótopos de la proteína HBcAg y sus secuencias de aminoácidos son fácilmente disponibles para aquellas personas expertas en el campo técnico. En la mayoría de los casos, las composiciones y composiciones de vacuna, respectivamente, de la invención se prepararán utilizando la forma procesada de una proteína HBcAg (es decir, una proteína HBcAg de la cual la secuencia líder N-terminal de la proteína precursora de núcleo de hepatitis B ha sido removida).
Además, cuando las proteínas HBcAgs son producidas bajo condiciones donde el procesamiento no ocurrirá, las proteínas HBcAgs serán expresadas generalmente en forma "procesada". Por ejemplo, cuando un sistema de expresión de E. coli que dirige la expresión de la proteína al citoplasma se utiliza para producir las proteínas HBcAgs de la invención, estas proteínas serán expresadas generalmente de tal manera que la secuencia líder N-terminal de la proteína precursora de antígenos de núcleo de hepatitis B no está presente.
La preparación de las partículas similares al virus de hepatitis B, las cuales se pueden utilizar para la presente invención, se describe, por ejemplo, en el documento WO 00/32227, y aquí en particular en los ejemplos 17 a 19 y 21 a 24, así como también en el documento WO 01/85208, y aquí en particular en los ejemplos 17 a 19, 21 a 24, 31 y 41.
La presente invención también incluye variantes de HbcAg, las cuales han sido modificadas para suprimir o sustituir uno o más residuos de cisteína adicionales. Se conoce en el campo técnico que los residuos de cisteína libres pueden estar involucrados en una variedad de reacciones secundarias, químicas. Estas reacciones secundarias incluyen intercambios de disulfuro, reacción con sustancias químicas o metabolitos que son, por ejemplo, inyectados o formados en una terapia de combinación con otras sustancias, o la oxidación directa y reacción con nucleótidos con la exposición a la luz UV. De esta manera, se podrían generar aductos tóxicos, considerando especialmente el hecho que las proteínas HBcAgs tienen una fuerte tendencia a unirse a ácidos nucleicos. Los aductos tóxicos serían distribuidos, de esta manera, entre una multiplicidad de especies, las cuales pueden estar presentes, individualmente, cada una en una concentración baja, pero que pueden alcanzar niveles tóxicos cuando se juntan.
En vista de lo anterior, una ventaja del uso de las proteínas HBcAg en las composiciones de vacuna que han sido modificadas para eliminar los residuos de cisteína residentes naturalmente es que los sitios a los cuales se pueden ligar las especies tóxicas, cuando se unen los antígenos o determinantes antigénicos, serían reducidos en número o eliminados conjuntamente.
Un cierto número de variantes de HBcAg de origen natural que son adecuadas para el uso en la táctica de la presente invención han sido identificadas. Yuan y colaboradores (J. Virol. 73:10122-10128 (1999)), por ejemplo, describen variantes en las cuales el residuo de isoleucina en la posición que corresponde a la posición 97 en la SEC ID NO:28 es reemplazado con ya sea un residuo de leucina o un residuo de fenilamina. Las secuencias de aminoácidos de una variedad de variantes de HBcAg, así como también varias variantes de precursores de antígenos de núcleo de hepatitis B se describen en los informes de GenBank AAF121240 (SEC ID NO:29), AF121239 (SEC ID NO:30), X85297 (SEC ID NO:31), X02496 (SEC ID NO:32), X85305 (SEC ID NO:33), X85303 (SEC ID NO:34), AF151735 (SEC ID NO:35), X85259 (SEC ID NO:36), X85286 (SEC ID NO:37), X85260 (SEC ID NO:38), X85317 (SEC ID NO:39), X85298 (SEC ID NO:40), AF043593 (SEC ID NO:41), M20706 (SEC ID NO:42), X85295 (SEC ID NO:43), X80925 (SEC ID NO:44), X85284 (SEC ID NO:45), X85275 (SEC ID NO:46), X72702 (SEC ID NO:47), X85291 (SEC ID NO:48), X65258 (SEC ID NO:49), X85302 (SEC ID NO:50), M32138 (SEC ID NO:51), X85293 (SEC ID NO:52), X85315 (SEC ID NO:53), U95551 (SEC ID NO:54), X85256 (SEC ID NO:55), X85316 (SEC ID NO:56), X85296 (SEQ ID NO:57), ABO33559 (SEC ID NO:58), X59795 (SEC ID NO:59), X85299 (SEC ID NO:60), X85307 (SEC ID NO:61), X65257 (SEC ID NO:62), X85311 (SEC ID NO:63), X85301 (SEC ID NO:64), X85314 (SEC ID NO:65), X85287 (SEC ID NO:66), X85272 (SEC ID NO:67), X85319 (SEC ID NO:68), AB010289 (SEC ID NO:69), X85285 (SEC ID NO:70), AB010289 (SEC ID NO:71), AF121242 (SEC ID NO:72), M90520 (SEC ID NO:73), P03153 (SEC ID NO:74), AF110999 (SEC ID NO:75) y M95589 (SEC ID NO:76), las descripciones de cada una de las cuales se incorporan en este texto a manera de referencia. Estas variantes de HBcAg difieren en la secuencia de aminoácidos en una variedad de posiciones, que incluyen los residuos de aminoácidos que corresponden a los residuos de aminoácidos localizados en las posiciones 12, 13, 21, 22, 24, 29, 32, 33, 35, 38, 40, 42, 44, 45, 49, 51, 57, 58, 59, 64, 66, 67, 69, 74, 77, 80, 81, 87, 92, 93, 97, 98, 100, 103, 105, 106, 109, 113, 116, 121, 126, 130, 133, 135, 141, 147, 149, 157, 176, 178, 182 y 183 en la SEC ID NO:77. Las variantes de HBcAg adicionales que son adecuadas para el uso en las composiciones de la invención y que pueden ser modificadas adicionalmente de acuerdo con la descripción de esta memoria descriptiva se describen en los documentos WO 00/198333, WO 00/177158 y
WO 00/214478.
Como se señaló anteriormente, las proteínas HBcAgs procesadas generalmente (es decir, las que carecen de secuencias líder) se utilizarán en las composiciones y composiciones de vacuna, respectivamente, de la invención. la presente invención incluye composiciones de vacuna, así como también métodos para utilizar estas composiciones, que emplean las proteínas HBcAgs variantes descritas anteriormente.
Si la secuencia de aminoácidos de un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% idéntica a una de las secuencias de aminoácidos de origen natural, anteriores, o una subporción de las mismas, se puede determinar convencionalmente utilizando programas de computadora conocidos, tales como el programa Bestfit. Cuando se utiliza el programa Bestfit o cualquier otro programa de alineamiento de secuencias para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia, los parámetros establecidos, tal como el porcentaje de identidad, son calculados sobre la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de referencia y de tal manera que son permitidos espacios en la homología de hasta 5% del número total de residuos de aminoácidos en la secuencia de referencia.
Las variantes y precursores de HBcAg que tienen las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID NOs: 29-72 y 73-77 son relativamente similares entre sí. De esta manera, la referencia a un residuo de aminoácido de una variante de HBcAg localizada en la posición que corresponde a una porción particular en la SEC ID NO:77, se refiere a un residuo de aminoácido que está presente en esa posición en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO:77. La homología entre estas variantes de HBcAg es para la mayor parte suficientemente alta entre los virus de hepatitis B que infectan a mamíferos de manera que una persona experta en campo técnico tendría poca dificultad de revisar tanto la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO:77 como aquella de una variante de HBcAg particular e identificar los residuos de aminoácidos "correspondientes". Además, la secuencia de aminoácidos de la proteína HBcAg mostrada en SEC ID NO:73, que muestra la secuencia de aminoácidos de una proteína HBcAg derivada de un virus que infecta a las marmotas de Norteamérica, tiene suficiente homología a la proteína HBcAg que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO:77 que es fácilmente aparente que un inserto de tres residuos de aminoácidos está presente en la SEC ID NO:64 entre los residuos de aminoácidos 155 y 156 de la SEC ID NO:77.
La invención también incluye composiciones de vacuna, las cuales comprenden variantes de HBcAg de virus de hepatitis B las cuales infectan a aves, así como también composiciones de vacuna que comprenden fragmentos de esas variantes de HBcAg. Estas variantes de HBcAg, uno, dos, tres o más de los residuos de cisteína presentes naturalmente en estos péptidos podrían ser sustituidos con otro residuo de aminoácido o podrían ser suprimidos antes de su inclusión en las composiciones de vacuna de la invención.
Como se discutió anteriormente, la eliminación de los residuos de cisteína libres reduce el número de sitios donde los componentes tóxicos pueden ligarse a la proteína HBcAg, y también elimina los sitios donde puede ocurrir la reticulación de los residuos lisina y cisteína de la misma molécula o de moléculas de HBcAg vecinas. Por lo tanto, en otra realización de la presente invención, uno o más residuos de cisteína de la proteína de la cápside de virus de hepatitis B han sido ya sea suprimidos o sustituidos con otro residuo de aminoácido.
En otras realizaciones, las composiciones y composiciones de vacuna, respectivamente, de la invención contendrán proteínas HBcAg de las cuales la región C-terminal (por ejemplo, los residuos de aminoácidos 145-185 o 150-185 de la SEC ID NO:77) ha sido removida. De esta manera, las proteínas HBcAgs modificadas adicionales que son adecuadas para el uso en la práctica de la presente invención incluyen mutantes de truncamiento C-terminales. Los mutantes de truncamiento adecuados incluyen las proteínas HBcAgs donde los aminoácidos 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 34, 35 han sido eliminados de la terminación C.
Las HBcAg adecuadas para el uso en la práctica de la presente invención también incluyen mutantes de truncamiento N-terminales. Los mutantes de truncamiento adecuados incluyen proteínas HBcAg modificadas donde los aminoácidos 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15 o 17 han sido eliminados de la terminación N.
Las HBcAgs adicionales que son adecuadas para el uso en la práctica de la presente invención incluyen los mutantes de truncamiento N- y C-terminales. Los mutantes de truncamiento adecuados incluyen proteínas HBcAg donde los aminoácidos 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15 y 17 han sido eliminados de la terminación N y los aminoácidos 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 34, 35 han sido eliminados de la terminación C.
La invención además incluye composiciones y composiciones de vacuna, respectivamente, que comprenden polipéptidos de HBcAg que comprenden, o alternativamente consisten de manera esencial en, o alternativamente consisten en, secuencias de aminoácidos las cuales son al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% idénticas a los mutantes de truncamiento descritos anteriormente.
En ciertas realizaciones de la invención, un residuo de lisina es introducido en un polipéptido de HBcAg, para mediar el enlace de la proteína o péptido de la IL-5, IL-13 o eotaxina o la VLP de la proteína HBcAg. En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención se preparan utilizando una proteína HBcAg que comprende, o alternativamente que consiste en, los aminoácidos 1-444 o 1-149, 1-185 de la SEC ID NO:77, la cual es modificada de manera que los aminoácidos que corresponden a las posiciones 79 y 80 son reemplazados con un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de Gly-Gly-Lys-Gly-Gly (SEC ID NO:79). En las realizaciones preferidas adicionales, los residuos de cisteína en las posiciones 48 y 107 de la SEC ID NO:77 son mutados a serina. La invención además incluye composiciones que comprenden los polipéptidos correspondientes que tienen las secuencias de aminoácidos mostradas en cualquiera de las SEC ID NOs: 29-74, las cuales también tienen las alteraciones de aminoácidos observadas anteriormente. Además, están incluidas dentro del alcance de la invención las variantes de HBcAg adicionales que son capaces de la asociación para formar una cápside o VLP y tienen las alteraciones de aminoácidos observadas anteriormente. De esta manera, la invención además incluye composiciones y composiciones de vacuna, respectivamente, que comprenden polipéptidos de HBcAg que comprenden, o alternativamente consisten en, secuencias de aminoácidos que son al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% idénticas a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de origen natural y formas de estas proteínas que han sido procesadas, donde sea apropiado, para eliminar la secuencia líder N-terminal y han sido modificadas con las alteraciones señaladas anteriormente.
Las composiciones o composiciones de vacuna de la invención pueden comprender mezclas de diferentes proteínas HBcAg. De esta manera, estas composiciones de vacuna pueden estar compuestas de proteínas HBcAg que difieren en la secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, se podrían preparar composiciones de vacuna que comprenden una proteína HBcAg de "tipo no cultivado" y una proteína HBcAg modificada en la cual uno o más residuos de aminoácidos han sido alterados (por ejemplo, suprimidos, insertados o sustituidos). Además, las composiciones de vacuna preferidas de la invención son aquellas que presentan una disposición de antígenos altamente ordenada y repetitiva, en donde el antígeno es una proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina. En una realización preferida adicional de la presente invención, al menos una proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina es ligado a la partícula de núcleo y la partícula tipo virus, respectivamente, por al menos un enlace covalente. Preferiblemente, al menos una proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina es ligado a la partícula de núcleo y la partícula tipo virus, respectivamente, por al menos un enlace covalente, el enlace covalente que es un enlace no peptídico que conduce a una disposición ordenada y repetitiva de partícula de núcleo-proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina y una disposición o conjugado de proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina-VLP, respectivamente. Esta disposición y conjugado proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina-VLP, respectivamente, tiene típica y preferiblemente una estructura repetitiva y ordenada puesto que al menos una, pero usualmente más de una, proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina es ligado a la VLP de una manera orientada. Preferiblemente, más 10, 20, 40, 80, 120 proteínas o péptidos de IL-5, IL-13 o eotaxina son ligados a la VLP o subunidad de VLP. La formación de una disposición y conjugado de proteínas o péptidos de IL-5, IL-13 o eotaxina repetitivos y ordenados, respectivamente, es asegurada por un enlace y unión orientada y dirigida así como también definida, respectivamente, de al menos una proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina a la VLP como será aparente en lo siguiente. Además, la estructura altamente repetitiva y organizada, inherente, típica de las VLP's contribuye de manera ventajosa a la exhibición de la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina en una forma altamente ordenada y repetitiva que conduce a una disposición y conjugado de proteínas o péptidos de IL-5, IL-13 o eotaxina altamente organizada y repetitiva, respectivamente.
Por lo tanto, los conjugados y disposiciones inventivos, preferidos, respectivamente, difieren de los conjugados de la técnica anterior en su estructura altamente organizada, dimensiones y en la repetitividad del antígeno en la superficie de la disposición. La realización preferida de esta invención, además, permite la expresión de tanto la partícula como el antígeno en un hospedante de expresión que garantiza el plegamiento apropiado del antígeno, es decir al menos una proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina y el plegamiento apropiado y ensamblaje de la VLP.
Se describen métodos para ligar una proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina a partículas de núcleo y VLPs, respectivamente. Como se indica, en un aspecto de la invención, la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina es unido a la partícula de núcleo y VLP, respectivamente, por medio de la reticulación química, típica y preferiblemente al utilizar un reticulador heterobifuncional. Varios reticuladores heterobifuncional son conocidos en el campo técnico. En las realizaciones preferidas, el reticulador heterobifuncional contiene un grupo funcional que puede reaccionar con los primeros sitios de unión preferidos, es decir con el grupo amino de la cadena lateral de los residuos de lisina de la partícula de núcleo y la VLP o al menos una subunidad de VLP, respectivamente, y un grupo funcional adicional que puede reaccionar con un segundo sitio de unión preferido, es decir, un residuo de cisteína presente naturalmente, hecho disponible para la reacción por medio de la reducción, o diseñado genéticamente en la proteína o péptido de la IL-5, IL-13 o eotaxina, y también opcionalmente hecho disponible para la reacción por medio de la reducción. El primer paso del procedimiento, llamado típicamente la derivatización, es la reacción de la partícula de núcleo o la VLP con el reticulador. El producto de esta reacción es una partícula de núcleo activada o VLP activada también llamada excipiente activado. En el segundo paso, el reticulador sin reaccionar es removido utilizando métodos usuales, tales como filtración en gel o diálisis. En el tercer paso, la proteína o péptido de la IL-5, IL-13 o eotaxina se hace reaccionar con el excipiente activado y este paso es llamado típicamente el paso de acoplamiento. La proteína o péptido de la IL-5, IL-13 o eotaxina sin reaccionar puede ser removida óptimamente en un cuarto paso, por ejemplo mediante la diálisis. Varios reticuladores heterobifuncionales son conocidos en el campo técnico. Éstos incluyen los reticuladores preferidos SMPH (Pierce), Sulfo-MBS, Sulfo-EMCS, Sulfo-GMBS, Sulfo-SIAB, Sulfo-SMPB, Sulfo-SMCC, SVSB, SIA y otros reticuladores disponibles por ejemplo the Pierce Chemical Company (Rockford, IL, EE.UU.) y que tienen un grupo funcional reactivo hacia los grupos amino y un grupo funcional reactivo hacia los residuos de cisteína. Todos los reticuladores mencionados anteriormente conducen a la formación de una unión de tioéter. Otra clase de reticuladores adecuados en la práctica de la invención está caracterizada por la introducción de una unión de disulfuro entre la proteína o péptido de la IL-5, IL-13 o eotaxina y la partícula de núcleo o VLP con el acoplamiento. Los reticuladores preferidos que pertenecen a esta clase incluye por ejemplo SPDP y Sulfo-LC-SPDP (Pierce). El grado de derivatización de la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente, con el reticulador puede ser influido al variar las condiciones experimentales tales como concentración de cada uno de los compañeros de reacción, el grado de un reactivo sobre otro, pH, temperatura y el potencial iónico. El grado de acoplamiento, es decir la cantidad de proteína o péptido de la IL-5, IL-13 o eotaxina por subunidades de la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente, se puede ajustar al variar las condiciones experimentales descritas anteriormente para adecuarse a los requerimientos de la vacuna. La solubilidad de la proteína o péptido de la IL-5, IL-13 o eotaxina puede imponer una limitación sobre la cantidad de proteína o péptido de la IL-5, IL-13 o eotaxina que se puede acoplar en cada subunidad, y en aquellos casos donde la vacuna obtenida sería insoluble, la reducción de la cantidad de proteína o péptido de la IL-5, IL-13 o eotaxina por subunidad es beneficiosa.
Un método particularmente favorecido de enlace de la proteína o péptido de la IL-5, IL-13 o eotaxina a la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente, es la unión de un residuo de lisina sobre la superficie de la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente, con un residuo de cisteína en la proteína o péptido de la IL-5, IL-13 o eotaxina. De esta manera, en una realización preferida de la presente invención, el primer sitio de unión es un residuo de resina y el segundo sitio de unión es un residuo de cisteína. En algunas realizaciones, puede requerirse el diseño de un formador de enlaces de aminoácidos que contiene un residuo de cisteína, como un segundo sitio de unión o como una parte del mismo, para la proteína o péptido de la IL-5, IL-13 o eotaxina para el acoplamiento a la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente. Alternativamente, una cisteína puede ser introducida ya sea por medio de la inserción o mutación dentro de la proteína o péptido de la IL-5, IL-13 o eotaxina. Alternativamente, el residuo de cisteína o un grupo tiol puede ser introducido por medio del acoplamiento químico.
La selección del formador de enlaces de aminoácidos será dependiente de la naturaleza del antígeno y antígeno del propio organismo, respectivamente, es decir de la naturaleza de la proteína o péptido de la IL-5, IL-13 o eotaxina, de sus propiedades bioquímicas tales como pI, distribución de carga y glicosilación. En general, los formadores de enlaces de aminoácidos flexibles son favorecidos. Las realizaciones preferidas del formador de enlaces de aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste en: (a) CGG; (b) formador de enlaces gamma 1 N-terminal; (c) formador de enlaces gamma 3 N-terminal; (d) regiones de rótula de Ig; (e) formadores de enlaces de glicina N-terminales; (f)
(G)_{k}C(G)_{n} con n=0-12 y k=0-5; (g) formadores de enlaces de glicina-serina N-terminal; (h) (G)_{k}C(G)_{m}(S)_{l}(GGGGS)_{n} con n=0-3, k=0-5, m=0-10, 1=0-2; (i) GGC; (k) GGC-NH2; (l) formador de enlaces gamma 1 C-terminal; formador de enlaces gamma 3 C-terminal; (n) formadores de enlaces de glicina C-terminales; (o) (G)_{n}C(G)_{k} con n=0-12 y k=0-5; (p) formadores de enlaces de glicina-serina C-terminales; (q) (G)_{m}(S)_{l}(GGGGS)_{n}(G)_{o}C(G)_{k} con n=0-3, k=0-5, m=0-10, 1=0-2 y o=0-8.
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Los ejemplos preferidos adicionales de formadores de enlaces de aminoácidos son la región de articulación de las Inmunoglobulinas, formadores de enlaces de glicina (GGGGS)_{n} y formadores de enlaces de glicina (G)_{n}, todos que contienen además un residuo de cisteína como segundo sitio de unión y opcionalmente sitios de glicina adicionales. Típicamente, los ejemplos preferidos de los formadores de enlaces de aminoácidos son gamma 1 N-terminal: CGDKTHTSPP; gamma 1 C-terminal: DKTHTSPPCG; gamma 3 C-terminal: CGGPKPSTPPGSSGGAP; gamma 3 N-terminal: PKPSTPPGSSGGAPGGCG; formador de enlaces de glicina N-terminal: GCGGGG; formador de enlaces de glicina C-terminal: GGGGCG; formador de enlaces de glicina-lisina C-terminal: GGKKGC; formador de enlaces de glicina-lisina N-terminal: CGKKGG.
En una realización preferida adicional de la presente invención, en particular si el antígeno es un péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina, los formadores de enlace GGCG, GGC O GGC-NH2 ("NH2" representa la amidación) en la terminación C del péptido o CGG en su terminación N son preferidos como formadores de enlaces de aminoácidos. En general, los residuos de glicina serán insertados entre los aminoácidos voluminosos y la cisteína a utilizarse como la segunda unión, para evitar un obstáculo estérico, potencial del aminoácido más voluminoso en la reacción de acoplamiento.
El residuo de cisteína presente en la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina tiene que estar en su estado reducido para reaccionar con el reticulador heterobifuncional en la VLP activada, que es una cisteína libre o tiene que estar disponible un residuo de cisteína con un grupo sulfhidrilo libre. En el caso donde el residuo de cisteína funciona como un sitio unión que está en una forma oxidada, por ejemplo si está formando un punto de disulfuro, se requiere la reducción de este puente de disulfuro con, por ejemplo, DTT, TCEP o \beta-mercaptoetanol.
El enlace de la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina a la partícula del núcleo y VLP, respectivamente, mediante el uso de un reticulador heterobifuncional de acuerdo con los métodos preferidos descritos anteriormente, permite el acoplamiento de la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina a la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente, en una forma orientada. Otros métodos de unión de la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina a la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente, incluyen métodos donde la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina es reticulada a la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente, utilizando EDC de carbodiimida y NHS. La proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina también puede ser tiolado primero a través de la reacción, por ejemplo, con SATA, SATP o iminotiolato. La proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina, después de la desprotección si se requiere, entonces puede ser acoplada la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente, como sigue. Después de la separación del reactivo de tiolación en exceso, la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina se hace reaccionar con la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente, activada previamente con un reticulador heterobifuncional que comprende una porción reactiva de cisteína y, por lo tanto, que exhibe al menos uno o varios grupos funcionales reactivos hacia los residuos de cisteína, a los cuales la proteína o péptido tiolado de IL-5, IL-13 o eotaxina pueden reaccionar, tal como se describe anteriormente. Opcionalmente, se incluyen bajas cantidades de un agente de reducción en la mezcla de reacción. En los métodos adicionales, la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina se une a la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente, utilizando un reticulador homobifuncional tal como glutaraldehído, DSG, BM[PEO]_{4}, BS^{3}, (Pierce Chemical Company, Rockford, IL, EE.UU.) u otros reticuladores homobifuncionales conocidos con grupos funcionales reactivos hacia grupos amina o grupos carboxilo de la partícula de núcleo y la VLP,
respectivamente.
En una realización adicional, la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina es ligada a la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente, a través de la modificación de las porciones de carbohidrato presentes en la proteína o péptido glicosilado de IL-5, IL-13 o eotaxina y la reacción subsecuente con la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente. En una realización, la proteína o péptido glicosilado de IL-5, IL-13 o eotaxina se hace reaccionar con peryodato de sodio en una reacción de oxidación suave de la porción de carbohidrato, para producir una proteína o péptido activado de IL-5, IL-13 o eotaxina con uno o más grupos funcionales aldehído. La proteína o péptido de esta manera activado de IL-5, IL-13 o eotaxina se prepara a partir de peryodato de sodio en exceso y se hace reaccionar adicionalmente con la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente, en donde los residuos de lisina de la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente, o de al menos una subunidad de VLP se hacen reaccionar con el grupo funcional de aldehído formado previamente en la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina, por ejemplo como se describe por Hermanson, G.T. en Bioconjugate Techniques, Academic Press Inc., San Diego, CA, EE.UU.. La autopolimerización de la proteína o péptido activado de IL-5, IL-13 o eotaxina se puede controlar al ajustar el pH como se describe en la publicación mencionada anteriormente. La base Schiff formada es reducida preferiblemente además con cianoborohidruro de sodio, el cual es removido subsecuentemente por la filtración en gel o diálisis. Alternativamente, la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente, se pueden hacer reaccionar con EDC en grupos carboxilo de la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente, o al menos una subunidad de VLP y una dihidrazida, tal como dihidrazida de ácido adípico, para producir una porción de hidrazida disponible para la reacción con uno o más grupos funcionales de aldehído presentes en la proteína o péptido activado de IL-5, IL-13 o eotaxina. La hidrazona formada de esta manera puede ser reducida adicionalmente con cianoborohidruro de sodio. Alternativamente, la proteína o péptido activado de IL-5, IL-13 o eotaxina con uno o más grupos funcionables aldehído se hace reaccionar con cisteamina, dando por resultado la producción de un grupo cisteína en la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina. Los métodos de reticulación y los reticuladores adecuados, que son adecuados para la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina para una partícula de núcleo y una VLP, respectivamente, así como también la guía sobre la realización de las reacciones de acoplamiento y sobre el uso de los reticuladores químicos y los procedimientos de reticulación química se pueden encontrar en Hermanson, G.T. en Bioconjugate Techniques, Academic Press Inc., San Diego, CA, EE.UU.
Otros métodos para ligar la VLP a una proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina incluyen los métodos donde la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente, son biotiniladas y la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina expresada como una proteína de fusión de estreptavidina o los métodos en donde tanto la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina y la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente, son biotinilados, por ejemplo, como se describe en el documento WO 00/23955. En este caso, la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina puede ser ligada primero a estreptavidina o vidina al ajustar la relación de proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina a estreptavidina de tal manera que los sitios de enlace libres estén aún disponibles para el enlace de la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente, la cual se adiciona en el siguiente paso. Alternativamente, todos los componentes pueden ser mezcladas en una reacción de "una cacerola". Otros pares de ligandos-receptores, donde está disponible una forma soluble del receptor y el ligando, y pueden ser reticulados a la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente, o la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina, se pueden utilizar como agentes de enlace para el enlace de la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina a la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente. Alternativamente, ya sea el ligando o el receptor pueden ser fusionados a la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina y de esta manera mediar el enlace a la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente, ligada químicamente o fusionada ya sea al receptor o al ligando, respectivamente. La fusión también se puede efectuar mediante la inserción o sustitución.
Como ya se indicó, en una realización favorecida de la presente invención, la VLP es la VLP de un fago de ARN y en una realización más preferida, la VLP es la VLP de una proteína de recubrimiento Q\beta de un fago de ARN.
Una o varias moléculas de antígenos, es decir una proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina, se pueden unir a una subunidad de la cápside o VLP de las proteínas de recubrimiento de fagos de ARN, preferiblemente a través de los residuos de lisina expuestos de la VLP de fagos de ARN, si es estéricamente permisible. Una característica específica de la VLP de la proteína de recubrimiento de los fagos de ARN y en particular de la VLP de la proteína de recubrimiento Q\beta es, de esta manera, la posibilidad de acoplar varios antígenos por subunidad. Esto permite la generación de una disposición de antígenos densa.
En una realización preferida de la invención, el enlace y la unión, respectivamente, de al menos la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina a la partícula de núcleo y la partícula tipo virus, respectivamente, es por medio de la interacción y asociación, respectivamente, entre al menos un primer sitio de unión de la partícula tipo virus y al menos un segundo sitio de unión del antígeno o determinante antigénico.
Las VLPs o cápsides de la proteína de recubrimiento Q\beta exhiben un número definido de residuos de lisina en su superficie, con una topología definida con tres residuos de lisina que apuntan hacia el interior de la cápside y que interactúan con el ARN, y otros cuatro residuos de lisina expuestos al exterior de la cápside. Estas propiedades definidas favorecen la unión de los antígenos al exterior de la partícula, preferiblemente que al interior de la partícula donde los residuos de lisina interactúan con el ARN. Las VLPs de otras proteínas de recubrimiento de fagos de ARN también tienen un número definido de residuos de lisina en su superficie y una topología definida de estos residuos de lisina.
En las realizaciones preferidas adicionales de la presente invención, el primer sitio de unión es un residuo de lisina y/o el segundo sitio de unión comprende un grupo sulfhidrilo o un residuo de cisteína. En una realización muy preferida de la presente invención, el primer sitio de unión es un residuo de lisina y el segundo sitio de unión es un residuo de cisteína.
En las realizaciones muy preferidas de la invención, la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina es ligada por medio de un residuo de cisteína, ya sea presente naturalmente en la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina o diseñada, para los residuos de lisina de la VLP de la proteína de recubrimiento de fago de ARN y en particular para la VLP de la proteína de recubrimiento Q\beta.
Otra ventaja de las VLPs derivadas de fagos de ARN es su alto rendimiento de expresión en bacterias que permite la producción de grandes cantidades de material a un costo permisible.
Como se indica, los conjugados y disposiciones inventivos, respectivamente, difieren de los conjugados de la técnica anterior en su estructura altamente organizada, dimensiones y en la repetitividad del antígeno en la superficie de la disposición. Además, el uso de las VLPs como excipientes permite la formación de disposiciones y conjugados de antígenos robustos, receptivamente, con una densidad de antígenos variable. En particular, el uso de VLPs de fagos de ARN, y con lo cual en particular el uso de la VLP de una proteína de recubrimientos Q\beta de fago de ARN permite lograr una densidad de epítopos muy alta. La preparación de composiciones de VLPs de proteínas de recubrimiento de fagos de ARN con una alta densidad de epítopos puede efectuarse al utilizar la enseñanza de esta solicitud.
El segundo sitio de unión, como se define en este texto, puede estar presente ya sea de manera natural o no natural con el antígeno o el determinante antigénico. En el caso de la ausencia de un segundo sitio de unión de origen natural, adecuado en el antígeno o determinante antigénico, como tal, entonces el segundo sitio de unión no natural tiene que ser diseñado para el antígeno.
Como se describe anteriormente, cuatro residuos de lisina son expuestos en la superficie de la VLP de la proteína de recubrimiento Q\beta. Típicamente, estos residuos son derivados con la reacción con una molécula reticuladora. En el caso donde no todos los residuos de lisina expuestos pueden ser acoplados a un antígeno, los residuos de lisina que han reaccionado con el reticulador se dejan con una molécula reticuladora unida al grupo \varepsilon-amino después del paso de derivatización. Esto conduce a la desaparición de una o varias cargas positivas, las cuales pueden ser dañinas para la solubilidad y estabilidad de la VLP. Al reemplazar algunos de los residuos de lisina con argininas, como en los mutantes de proteínas de recubrimiento Q\beta descritos posteriormente, se impide la desaparición excesiva de cargas positivas puesto que los residuos de arginina no reaccionan con el reticulador. Además, el reemplazo de los residuos de lisina por argininas puede conducir a disposiciones de antígenos más definidas, cuando menos sitios están disponibles para la reacción para el antígeno.
Por consiguiente, los residuos de lisina expuestos fueron reemplazados por argininas en los siguientes mutantes de proteínas de recubrimiento Q\beta y las VLPs de Q\beta mutantes descritas en esta solicitud: Q\beta-240 (Lys13-Arg; SEC ID NO:23), Q\beta-250 (Lys 2-Arg, Lys13-Arg; SEC ID NO:25) y Q\beta-259 (Lys 2-Arg, Lys16-Arg; SEC ID NO:27). Las construcciones fueron clonadas, las proteínas fueron expresadas, las VLPs fueron purificadas y utilizadas para el acoplamiento a antígenos de péptidos y proteínas. La proteína Q\beta-251; (SEC ID NO:26) también fue clonada y la guía sobre como expresar, purificar y acoplar la VLP de la proteína de recubrimiento Q\beta-251 se pueden encontrar por toda la solicitud.
En una realización adicional, se describe una proteína de recubrimiento mutante Q\beta con un residuo de lisina adicional, que es adecuada para obtener disposiciones de densidad aún más alta de antígenos. Esta proteína de recubrimiento Q\beta mutante, Q\beta-243 (Asn 10-Lys; SEC ID NO:24) fue clonada, la proteína fue expresada y la cápside o VLP fue aislada y purificada, mostrando que la introducción del residuo de lisina adicional es compatible con el autoensamblaje de las subunidades a una cápside o VLP. De esta manera, la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina, y los conjugados, respectivamente, se pueden preparar utilizando una VLP de los mutantes de proteína de recubrimiento Q\beta. Un método particularmente favorecido de unión de los antígenos a VLPs, y en particular a VLPs de proteínas de recubrimiento de fagos de ARN es el enlace de un residuo de lisina presente en la superficie de la VLP de las proteínas de recubrimiento de fagos de ARN con un residuo de cisteína presente naturalmente o diseñado en el antígeno, es decir la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina. A fin de que un residuo de cisteína sea efectivo como un segundo sitio de unión, debe estar disponible un grupo sulfhidrilo para el acoplamiento. De esta manera, un residuo de cisteína tiene que estar en su estado reducido, esto es, una cisteína libre o un residuo de cisteína con un grupo sulfhidrilo libre tiene que estar disponible. En el caso donde el residuo de cisteína que funciona como un segundo sitio de unión esté en una forma oxidada, por ejemplo si está formando un puente de disulfuro, se requiere la reducción de este puente de disulfuro con, por ejemplo, DTT, TCEP o \beta-mercaptohetanol. La concentración de agente reductor y el exceso molar de agente reductor sobre el antígeno tienen que ser ajustados para cada antígeno. Un rango de titulación, iniciando de las concentraciones tan bajas como 10 \muM o menos, hasta 10 a 20 mM o más de agente reductor si se requiere se somete a prueba y el acoplamiento del antígeno al excipiente se valora. Aunque las concentraciones bajas de agente reductor son compatibles con la reacción de acoplamiento como se describe en la solicitud de patente de EE.UU. en tramitación nº 10/050.902 presentada por el actual cesionario el 18 de enero de 2002, las concentraciones más altas inhiben la reacción de acoplamiento, como un técnico experto sabría, caso en el cual el agente reductor tiene que ser removido por medio de la diálisis o filtración en gel. De manera ventajosa, el pH de la diálisis o el tampón de equilibrio es inferior a 7, preferiblemente 6. La compatibilidad del tampón de pH bajo con la actividad o la estabilidad del antígeno tiene que ser sometida a prueba.
La densidad de epítopos en la VLP de las proteínas de recubrimiento de fagos de ARN puede ser modulada por medio de la selección del reticulador y otras condiciones de reacción. Por ejemplo, los reticuladores Sulfo-GMBS y SMPH permiten típicamente la reacción de una alta densidad de epítopos. La derivatización es influida positivamente por la alta concentración de agentes reductores y la manipulación de las condiciones de reacción se puede utilizar para controlar el número de antígenos acoplados a las VLPs de las proteínas de recubrimiento de fagos de ARN y en particular a las VLPs de la proteína de recubrimiento Q\beta.
Antes del diseño de un segundo sitio de unión no natural, se debe seleccionar la posición en la cual se debe fusionar, insertar o diseñar generalmente. La selección de la posición del segundo sitio de unión puede basarse, a manera de ejemplo, en una estructura cristalina del antígeno. Esta estructura cristalina del antígeno puede proporcionar información sobre la disponibilidad de las terminaciones C o N de la molécula (determinadas por ejemplo a partir de su accesibilidad al solvente), o sobre la exposición al solvente de residuos adecuados para el uso como segundos sitios de unión, tales como residuos de cisteína. Los puentes de disulfuro expuestos, como es el caso de los fragmentos Fab, también pueden ser una fuente de un segundo sitio de unión, puesto que éstos pueden ser convertidos generalmente a residuos de cisteína individuales a través de una reducción suave. Las condiciones de reacción suaves que no afectan a la inmunogenicidad de la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina serán seleccionadas. En general, en el caso donde la inmunización con un antígeno del propio organismo está dirigido a inhibir la interacción de este antígeno del propio organismo con sus ligandos naturales, el segundo sitio de unión se adicionará de tal manera que permita la generación de anticuerpos contra el sitio de interacción con los ligandos naturales. De esta manera, la ubicación del segundo sitio de unión se seleccionará de tal manera que se evite el obstáculo estérico del segundo sitio de unión o cualquier formador de enlaces de aminoácidos que contiene el mismo. En las realizaciones adicionales, es deseada una respuesta de anticuerpos dirigida a un sitio distinto del sitio de interacción del antígeno del propio organismo con su ligando natural. En estas realizaciones, el segundo sitio de unión puede seleccionarse de tal manera que impida la generación de anticuerpos contra el sitio de interacción del antígeno del propio organismo con sus ligandos
naturales.
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Otros criterios en la selección de la posición del segundo sitio de unión incluyen el estado de oligomerización del antígeno, el sitio de oligomerización, la presencia de un co-factor y la disponibilidad de evidencia experimental que describe los sitios en la estructura del antígeno y la secuencia donde es compatible la modificación del antígeno con la función del antígeno del propio organismo, o con la generación de anticuerpos que reconocen el antígeno del propio organismo.
En las realizaciones más preferidas, la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina comprende un segundo sitio de unión individual o un sitio de unión reactivo, individual capaz de la asociación con los primeros sitios de unión en la partícula de núcleo y las VLPs o subunidades de VLP, respectivamente. Eso asegura un enlace y una asociación definida y uniforme, respectivamente, de al menos uno, pero típicamente más de uno, preferiblemente más de 10, 20, 40, 80, 120 antígenos a la partícula de núcleo y la VLP, respectivamente. La provisión de un segundo sitio de unión individual o un sitio de unión reactivo, individual en el antígeno asegura, de esta manera, un tipo individual y uniforme de enlace y asociación, respectivamente, que conduce a una disposición muy altamente ordenada y repetitiva. Por ejemplo, si el enlace y la asociación, respectivamente, se efectúan por medio de una interacción de lisina (como el primer sitio de unión) y cisteína (como un segundo sitio de unión), se asegura, de acuerdo con esta realización preferida de la invención, que solo un residuo de cisteína por antígeno, independiente de sí este residuo de cisteína está presente de manera natural o no natural en el antígeno, sea capaz del enlace y la asociación, respectivamente, con la VLP y el primer sitio de unión de la partícula de núcleo, respectivamente.
En algunas realizaciones, el diseño de un segundo sitio de unión en el antígeno requiere la fusión de un formador de enlaces de aminoácidos que contiene un aminoácido adecuado como un segundo sitio de unión de acuerdo con las descripciones de esta invención. Por lo tanto, en una realización preferida de la presente invención, un formador de enlaces de aminoácidos es ligado al antígeno o el determinante antigénico por medio de al menos un enlace covalente. Preferiblemente, el formador de enlaces de aminoácidos comprende, o alternativamente consiste en, el segundo sitio de unión. En una realización preferida adicional, el formador de enlaces de aminoácidos comprende un grupo sulfhidrilo o un residuo de cisteína. En otra realización preferida, el formador de enlaces de aminoácidos es cisteína. Algunos criterios de selección del formador de enlaces de aminoácidos así como también las realizaciones preferidas adicionales del formador de enlaces de aminoácidos de acuerdo con la invención ya han sido mencionados anteriormente.
En una realización preferida adicional de la invención, al menos un antígeno o determinante antigénico, es decir la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina, es fusionado a la partícula de núcleo y la partícula tipo virus, respectivamente. Como se resume anteriormente, una VLP está compuesta típicamente de al menos una subunidad que se ensambla en una VLP. De esta manera, en una realización nuevamente preferida adicional de la invención, al antígeno o determinante antigénico, preferiblemente al menos una proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina, es fusionada al menos una subunidad de la partícula tipo virus o de una proteína capaz de ser incorporada en una VLP que genera una fusión de subunidad de VLP quimérica-proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina.
La fusión de la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina puede efectuarse por medio de la inserción en la secuencia de subunidades de VLP, o por medio de la fusión a ya sea la terminación N o C de la subunidad de VLP o proteína que puede ser incorporada en una VLP. Posteriormente, cuando se refiere a proteínas de fusión de un péptido para una subunidad de VLP, la fusión a cualquier extremo de la secuencia de subunidad o inserción interna del péptido dentro de la secuencia de la subunidad están incluidas.
La fusión también puede efectuarse al insertar las secuencias de las proteínas o péptidos de IL-5, IL-13 o eotaxina en una variante de una subunidad de VLP donde parte de la secuencia de la subunidad ha sido suprimida, que son referidas adicionalmente como mutantes de truncamiento. Los mutantes de truncamiento pueden tener supresiones N o C-terminales o internas de parte de la secuencia de la subunidad de VLP. Por ejemplo, la proteína HBcAg de VLP específica con, por ejemplo, una supresión de los residuos de aminoácidos 79 a 81 es un mutante de truncamiento con una supresión interna. La fusión de una proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina a ya sea la terminación N o C de las subunidades de VLP de mutantes de truncamiento también conduce a las realizaciones de la invención. De igual manera, la fusión de un epítopo en la secuencia de la subunidad de VLP también puede efectuarse por medio de la sustitución, donde por ejemplo para la proteína HBcAg de VLP específica, los aminoácidos 79-81 son reemplazados con un epítopo extraño. De esta manera, la fusión, como es referida posteriormente en este texto, puede efectuarse por medio de la inserción de la secuencia de proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina en la secuencia de una subunidad de VLP, por medio de la sustitución de parte de la secuencia de la subunidad de VLP con la secuencia de proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina, o por una combinación de supresión, sustitución o inserción.
La subunidad quimérica de la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina será capaz en general del autoensamblaje en una VLP. La VLP que exhibe epítopos fusionados a sus subunidades también son referidas en este texto como VLPs quiméricas. Como se indica, la partícula tipo virus comprende o alternativamente está compuesta de al menos una subunidad de VLP. En una realización adicional de la invención, la partícula tipo virus comprende o alternativamente está compuesta de una mezcla de subunidades de VLP quiméricas y subunidades de VLP no quiméricas, es decir subunidades de VLP que no tienen un antígeno fusionado a las mismas, lo que conduce a las comúnmente llamadas partículas mosaico. Esto puede ser ventajoso para asegurar la formación de y ensamblaje a una VLP. En esas realizaciones, la proporción de subunidades de VLP quiméricas puede ser 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95% o superior.
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En realizaciones iguales, los residuos de aminoácidos flanqueantes se pueden adicionar a cualquier extremo de la secuencia del péptido o epítopo para ser fusionados a cualquier extremo de la secuencia de la subunidad de una VLP o para una inserción interna de esta secuencia peptídica en la secuencia de la subunidad de una VLP. Los residuos de glicina y serina son aminoácidos particularmente favorecidos para utilizarse en las secuencias flanqueantes para la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina a fusionarse. Los residuos de glicina confieren flexibilidad adicional, la cual puede disminuir el efecto potencialmente desestabilizador de la fusión de una secuencia extraña en la secuencia de una subunidad de VLP.
En una realización específica de la invención, la VLP es una VLP de antígenos de núcleos de hepatitis B. Las proteínas de fusión para ya sea la terminación N de una proteína HBcAg (Neyrinck, S. y colaboradores, Nature Med. 5:1157-1163 (1999)) o las inserciones en la región comúnmente llamada inmunodiminante mayor (MIR, por sus siglas en inglés) han sido descritas (Pumpens, P. y Grens, E. Intervirology 44:98-114 (2001)), documento WO 01/98333) y son realizaciones preferidas de la invención. Las variantes de origen natural de la proteína HBcAg con supresiones en la MIR también han sido descritas (Pumpens, P. y Grens, E. Intervirology 44:98-114 (2001), la cual es incorporada expresamente a manera de referencia en su totalidad) y fusiones para la terminación N o C, así como también inserciones en la posición de la MIR correspondiente al sitio de supresión comparado con wt HBcAg son realizaciones adicionales de la invención. Las fusiones a la terminación C también han sido descritas (Pumpens, P. y Grens, E. Intervirology 44:98-114 (2001)). Una persona experta en el campo técnico encontrará fácilmente una guía sobre como construir proteínas de fusión utilizando técnicas de biología molecular clásicas (Sambrook, J. y colaboradores, eds., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^{a} edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Ho y colaboradores, Gen 77:51 (1989)). Los vectores y plásmidos que codifican la HBcAg y las proteínas de fusión de HBcAg y que son útiles para la expresión de HBcAg y las proteínas de fusión de HBcAg han sido descritos (Pumpens, P. y Grens, E. Intervirology 44:98-114 (2001), Neyrinck, S. y colaboradores, Nature Med. 5:1157-1163 (1999)) y se pueden utilizar en la práctica de la invención. También se describe, a manera de ejemplo (ejemplo 6), la inserción de un epítopo en la MIR de HBcAg, lo que da por resultado una HBcAg autoensamblante, quimérica. Un factor importante para la optimización de la eficacia del autoensamblaje y de la exhibición del epítopo a insertarse en la MIR de la HBcAg es la selección del sitio de inserción, así como también el número de aminoácidos que son suprimidos de la secuencia de HBcAg dentro de la MIR (Pumpens, P. y Grens, E. Intervirology 44:98-114 (2001); documento EP 421635; documento US 6.231.864) con la inserción, en otras palabras, los aminoácidos que forman la HBcAg deben ser sustituidos con el nuevo epítopo. Por ejemplo, la sustitución de los aminoácidos de HBcAg 76-80, 79-81, 79-80, 75-85 o 80-81 con epítopos extraños ha sido descrita (Pumpens, P. y Grens, E. Intervirology 44:98-114 (2001); documento EP 421635; documento US 6.231.864). La proteína HBcAg contiene una cola larga de arginina (Pumpens, P. y Grens, E. Intervirology 44:98-114 (2001)) que es prescindible para el ensamblaje de cápside y es capaz del enlace de ácidos nucleicos (Pumpens, P. y Grens, E. Intervirology 44:98-114 (2001)). Las proteínas HBcAg ya sea que comprenden o que carecen de esta cola de arginina son ambas realizaciones de la invención.
En la invención, la VLP es una VLP de un fago de ARN. Las proteínas de recubrimiento principales de los fagos de ARN se ensamblan espontáneamente en las VLPs con la expresión en bacterias, y en particular en E. coli. Los ejemplos específicos de proteínas de recubrimiento de bacteriófagos que se pueden utilizar para preparar las composiciones de la invención incluyen las proteínas de recubrimiento de ARN-bacteriófagos tales como el bacteriófago Q\beta (SEC ID NO:10; base de datos PIR, número de acceso VCBPQ\beta que se refiere a CP de Q\beta y SEC ID NO:11; número de acceso AAA16663 que se refiere a la proteína Q\beta A1) y el bacteriófago fr (SEC ID NO:4; número de acceso de PIR: VCBPFR).
En una realización más preferida, al menos una proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina es fusionado a una proteína de recubrimiento de Q\beta. Las construcciones de proteínas de fusión en donde los epítopos han sido fusionados a la terminación C de una forma truncada de la proteína A1 de Q\beta, o han sido insertados dentro de la proteína A1, han sido descritas (Kozlovska, T.M. y colaboradores, Intervirology 39:9-15 (1996)). La proteína A1 es generada por medio de la supresión en el codón de detención UGA y tiene una longitud de 329 aa, o 328 aa, si la escisión de la metionina N-terminal se toma en cuenta. La escisión de la metionina N-terminal antes de una alanina (el segundo aminoácido codificado por el gen de CP de Q\beta) toma lugar usualmente en E. coli y este es el caso de las terminaciones N de las proteínas de recubrimiento CP de Q\beta. La parte del gen de A1, 3' del codón ámbar UGA codifica la extensión de CP, la cual tiene una longitud de 195 aminoácidos. La inserción de al menos una proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina entre la posición 72 y 73 de la extensión de CP conduce a realizaciones adicionales de la invención (Kozlovska, T.M. y colaboradores, Intervirology 39:9-15 (1996)). La fusión de una proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina en la terminación C de una proteína A1 de Q\beta truncada en la terminal C conduce a realizaciones preferidas adicionales de la invención. Por ejemplo, Kozlovska y colaboradores, (Intervirology 39:9-15 (1996)) describen fusiones de proteínas A1 de Q\beta donde el epítopo es fusionado en la terminación C de la extensión de CP de Q\beta truncada en la posición 19.
Como es descrito por Kozlovska y colaboradores, (Intervirology 39:9-15 (1996)) el ensamblaje de las partículas que exhiben los epítopos fusionados requiere típicamente la presencia de tanto la fusión de la proteína A1-proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina como la wt CP para formar una partícula mosaico. Sin embargo, las realizaciones que comprenden las partículas tipo virus y con lo cual en particular, las VLPs de la proteína de recubrimiento de Q\beta de fagos de ARN, las cuales están compuestas exclusivamente de subunidades de VLP que tienen al menos una proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina fusionado a las mismas, también están dentro del alcance de la presente invención.
La producción de partículas mosaico puede efectuarse de una variedad de maneras. Kozlovska y colaboradores, Intervirology 39:9-15 (1996), describen dos métodos, los cuales ambos pueden utilizarse en la práctica de la invención. En el primer planteamiento, la exhibición eficiente del epítopo fusionado en las VLPs es mediada por la expresión del plásmido que codifica la fusión de la proteína A1 de Q\beta que tiene un codón de detención UGA entre la CP y la extensión de CP en una cepa de E. coli que alberga un plásmido que codifica un ARNt supresor de UGA clonado, el cual conduce a la traducción del codón UGA en Trp (plásmido pISM3001 (Smiley B.K. y colaboradores, Gene 134:33-40 (1993))). En otro planteamiento, el codón de detención del gen de CP es modificado en UAA, y un segundo plásmido que expresa la fusión de la proteína A1-proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina es co-transformado. El segundo plásmido codifica una resistencia antibiótica, diferente y el origen de la replicación es compatible con el primer plásmido (Kozlovska, T.M. y colaboradores, Intervirology 39:9-15 (1996)). En un tercer planteamiento, una CP y la fusión de la proteína A1-proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina son codificadas de una manera bicistrónica, son unidas operativamente a un promotor tal como el promotor Trp, como se describe en la figura 1 de Kozlovska, T.M. y colaboradores, Intervirology 39:9-15 (1996).
En una realización adicional, la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina es insertada entre el aminoácido 2 y 3 (numeración de la CP escindida, que está en donde la metionina N-terminal es escindida) de la CP de fr, lo que conduce de esta manera a una proteína de fusión de proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina CP de fr. Los vectores y sistemas de expresión para la construcción y expresión de proteínas de fusión CP de fr que se autoensamblan a la VLP y que son útiles en la práctica de la invención han sido descritos (Pushko P. y colaboradores Prot. Eng. 6:883-891 (1993)). En una realización específica, la secuencia de la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina es insertada en una variante de supresión de la CP de fr después del aminoácido 2, en donde los residuos 3 y 4 de la CP de fr han sido suprimidos ((Pushko P. y colaboradores, Prot. Eng. 6:883-891 (1993)).
La fusión de los epítopos en la \beta-horquilla protuberante, N-terminal de la proteína de recubrimiento del fago de ARN MS-2 y la presentación subsecuente del epítopo fusionado en la VLP autoensamblada del fago de ARN MS-2 también ha sido descrita (documento WO 92/13081) y la fusión de la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina por medio de la inserción o la sustitución y la proteína de recubrimiento del fago de ARN MS-2 también se encuentra dentro del alcance de la invención.
En algunas realizaciones de la invención, las proteínas o péptidos de IL-5, IL-13 o eotaxina son fusionados a una proteína de la cápside de virus de papiloma. En una realización más específica, las proteínas o péptidos de IL-5, IL-13 o eotaxina son fusionados a la proteína de la cápside principal L1 del virus de papiloma de bovino tipo 1 (BPV-1). Los vectores y sistemas de expresión para la construcción y expresión de las proteínas de fusión de BPV-1 en un sistema de baculovirus/células de insecto han sido descritos (Chackerian, B. y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 96:2373-2378 (1999), documento WO 00/23955). La sustitución de los aminoácidos 130-136 de L1 de BVP-1 con una proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina conduce a una proteína de fusión de L1 de BPV-1-proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina, la cual es una realización preferida de la invención. La clonación en un vector de baculovirus y la expresión en células Sf9 infectadas con baculovirus ha sido descrita y se puede utilizar en la práctica de la invención (Chackerian, B. y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 96:2373-2378 (1999), documento WO 00/23955). La purificación de las partículas ensambladas que exhiben la proteína o péptido fusionado de IL-5, IL-13 o eotaxina se pueden realizar de una variedad de maneras, tales como por ejemplo la filtración en gel o la ultracentrifugación con gradientes de sacarosa ((Chackerian, B. y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 96:2373-2378 (1999), documento WO 00/23955).
En algunas realizaciones de la invención, la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina se puede fusionar a una proteína de Ty capaz de ser incorporada en una VLP de Ty. En una realización más específica, las proteínas o péptidos de IL-5, IL-13 o eotaxina son fusionados a la proteínas p1 o de la cápside codificada por el gen de TYA (Roth, J.F. Yeast 16:785-795 (2000)). Los retrotransposones de levadura Ty1, 2, 3 y 4 han sido aislados de Saccharomyces Serevisiae, mientras que el retrotransposón Tf1 ha sido aislado de Schizosaccharomyces Pombae (Boeke, J.D. y Sandmeyer, S.B., "Yeast Transposable elements" en The molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces: Genome dynamics, Protein Synthesis, and Energetics., página 193, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1991)). Los retrotransposones Ty1 y 2 están relacionados con la clase copia de los elementos vegetales y animales, mientras que Ty3 pertenece a la familia gypsy de retrotransposones, la cual está relacionada con retrovirus animales y vegetales. En el retrotransposón Ty1, la proteína p1, también referida como la proteína Gag o de la cápside, tiene una longitud de 440 aminoácidos. P1 es escindida durante la maduración de la VLP en la posición 408, lo que conduce a la proteína p2, el componente esencial de la VLP.
Las proteínas de fusión para p1 y los vectores para la expresión de las proteínas de fusión en levadura ya han sido descritos (Adams, S.E. y colaboradores, Nature 329:68-70 (1987)). De esta manera, por ejemplo, una proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina puede ser fusionada a p1 mediante la inserción de una secuencia que codifica la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina en el sitio BamH1 del plásmido pMA5620 (Adams, S.E. y colaboradores, Nature 329:68-70 (1987)). La clonación de secuencias que codifican los epítopos extraños en el vector de pMA5620 conduce a la expresión de proteínas de fusión que comprenden los aminoácidos 1-381 de p1 de Ty1-15, fusionada en la terminal C a la terminación N del epítopo extraño. De igual manera, la fusión N-terminal de la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina, o la inserción interna en la secuencia de p1 o la sustitución de parte de la secuencia de p1 también se propone que este dentro del alcance de la invención. En particular, la inserción de la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina en la secuencia de Ty entre los aminoácidos 30-31, 67-68, 113-114 y 132-133 de la proteína p1 de Ty (EP0677111) conduce a las realizaciones preferidas de la invención.
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Las VLPs adicionales que son adecuadas para la fusión de una proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina son, por ejemplo, partículas tipo Retrovirus (documento WO 9630523), Gag de HIV2 (Kang, Y.C. y colaboradores, Biol. Chem 380:353-364 (1999)), Virus de Mosaico Cowpea (Taylor, K.M. y colaboradores Biol. Chem 380:387-392 (1999)), VLP de parvovirus VP2 (Rueda, P. y colaboradores, Virology 263:89-99 (1999)), HBsAg (documentos US 4.722.840, EP0020416B1).
Los ejemplos de VLPs quiméricas que son adecuadas para la práctica de la invención también son aquellas descritas en Intervirology 39:1 (1996). Los ejemplos adicionales de VLPs contempladas para el uso en la invención son: HPV-1, HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-33, HPV-45, CRPV, COPV, HIV GAG, Virus de Mosaico de Tabaco. Las partículas tipo virus de SV-40, Poliomavirus, Adenovirus, Virus de Herpes Simple, Rotavirus y virus Norwalk también se han hecho y las VLPs quiméricas de aquellas VLPs también están dentro del alcance de la presente invención.
En una realización preferida adicional de la presente invención, el antígeno o determinante antigénico es una proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina.
En una realización preferida adicional de la invención, el antígeno o determinante antigénico es una variante de proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina, por ejemplo que contiene sustituciones de aminoácidos o inserciones de péptidos o polimorfismos. Como ya se indicó, las composiciones y composiciones de vacuna, respectivamente, que comprenden variantes de proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina están incluidas dentro del alcance de la presente invención.
La proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina se puede producir por medio de la expresión del ADNc de IL-5, IL-13 o eotaxina en sistemas de expresión procarióticos o eucarióticos. Hasta ahora se han descrito varios ejemplos en la bibliografía y se pueden utilizar, por ejemplo después de las modificaciones, para expresar cualquier proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina de cualquier especie deseada. Las descripciones de cómo producir una proteína o péptido de IL-5 se proporcionan también en el documento WO 00/65058 y referencias proporcionadas en la misma.
En una realización preferida adicional de la invención, el antígeno o determinante antigénico es un péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina. Estos péptidos de IL-5, L-13 o eotaxina o fragmentos de los mismos se pueden producir utilizando técnicas de biología de molecular estándar donde la secuencia de nucleótidos que codifica el fragmento de interés es amplificada por medio de la PCR y es clonada como una fusión para una etiqueta de polipéptido, tal como la etiqueta GST, etiqueta MBP, etiqueta de histidina, etiqueta Flag, etiqueta myc y la región constante de un anticuerpo (región Fc). Por medio de la introducción de un sitio de escisión de proteasa entre el fragmento de IL-5, IL-13 o eotaxina y la etiqueta, el péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina se puede separar de la etiqueta después de la purificación por medio de la digestión con una proteasa correspondiente. En otro planteamiento, la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina se puede sintetizar in vitro utilizando reacciones de síntesis de péptidos estándar conocidas para aquellas personas expertas en el campo técnico. En un planteamiento adicional, los péptidos de IL-5, IL-13 o eotaxina se pueden producir por medio de la digestión con proteasa o la escisión química de la proteína de longitud completa de IL-5, IL-13 o eotaxina, ambos métodos son bien conocidos para la gente entrenada en el campo técnico.
En una realización preferida, aún adicional de la presente invención, el antígeno o determinante antigénico además comprende al menos un segundo sitio de unión que se selecciona del grupo que consiste en: (i) un sitio de unión que no ocurre naturalmente con el antígeno o determinante antigénico; y (ii) un sitio de unión que ocurre de manera natural con el antígeno o determinante antigénico. La guía sobre como modificar la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina para el enlace a la partícula tipo virus se proporciona por toda la solicitud. Los segundos sitios de unión preferidos contienen un residuo de cisteína para el enlace a la VLP derivatizada y los ejemplos se proporcionan en la descripción anterior y en el ejemplo 12 y 13.
Se ha realizado un análisis del modelo para la estructura tridimensional de IL-5 para la determinar la accesibilidad del segundo sitio de unión seleccionado (terminación NH_{2}) para permitir el acoplamiento al primer sitio de unión en la VLP de acuerdo con la presente invención. La terminación N es preferida para la unión de un segundo sitio de unión que comprende un formador de enlaces de aminoácidos con un residuo de cisteína adicional. Sin embargo, un formador de enlaces de aminoácidos que contiene un residuo de cisteína como segundo sitio de unión y que está fusionado a la terminación C de la construcción de IL-5 conduce a una realización preferida adicional de la invención. Una construcción de IL-5 de humano con un formador de enlaces de aminoácidos N-terminal que contiene un residuo de cisteína fusionado L es una realización muy preferida de la invención.
Se podrían utilizar procedimientos similares por una persona experta en el campo técnico para modelar la accesibilidad de los sitios de unión en la IL-13 y eotaxina para optimizar el acoplamiento al primer sitio de unión de la VLP.
Se describen construcciones de proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina de ratón, y también se pueden generar construcciones preferidas de fragmentos de proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina de humano. Las construcciones preferidas adicionales comprenden la proteína de humano completa de la proteína de IL-5, IL-13 o eotaxina, un péptido humano de IL-5, IL-13 o eotaxina. La inmunización contra una proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina utilizando las composiciones inventivas que comprende, preferiblemente una proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina ligado a una VLP, puede proporcionar una manera para el tratamiento o prevención de enfermedades alérgicas con un componente eosinofílico.
En una realización preferida adicional de la presente invención, la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina comprende al menos un sitio antigénico de una proteína de IL-5, IL-13 o eotaxina. La persona experta en el campo técnico conoce como identificar los péptidos correspondientes y las secuencias de aminoácidos, respectivamente.
En una realización preferida adicional de la presente invención, están incluidos los péptidos contiguos o no contiguos de IL-5, IL-13 o eotaxina, tales como aquellos definidos por los anticuerpos monoclonales, neutralizantes (Dickason, R.R. y colaboradores, J. Immunol. 156(3):1030-7, 1996).
En una realización preferida adicional de la presente invención, están incluidos los péptidos contiguos o no contiguos de IL-5, IL-13 o eotaxina que se predice están involucrados en la interacción de receptores y son cruciales para la interacción con el receptor, tal como aquellos de la terminal COO de IL-5.
Los péptidos adicionales de IL-5, IL-13 o eotaxina que son adecuados para el uso en la presente invención pueden ser determinados empíricamente por su propiedad intrínseca para inducir una respuesta de células T o una respuesta de anticuerpos. Esto se logra generalmente al inmunizar un animal experimental por separado con péptidos seleccionados en una formulación inmunológicamente adecuada y al medir las respuestas de células T y células B, es decir anticuerpos, utilizando métodos conocidos para una persona entrenada en el campo técnico. En el caso donde el antígeno sea una proteína o un péptido, esta región puede estar formada por una secuencia de aminoácidos continua. Alternativamente, el epítopo de anticuerpo puede estar formado por una secuencia de aminoácidos discontinuos en la cual, después del plegamiento tridimensional de la proteína, polipéptido o péptido, los aminoácidos son dispuestos de tal manera que quedan espacialmente juntos y forman el epítopo. Los fragmentos de péptidos continuos de interés se pueden identificar por medio de experimentos de inmunización como se describiera anteriormente.
Los péptidos preferidos adicionales de IL-5, IL-13 o eotaxina que son adecuados para el uso para la presente invención se pueden identificar al utilizar los anticuerpos monoclonales o policlonales existentes o futuros, los procedimientos son conocidos hasta ahora para aquellas personas expertas en el campo técnico.
Los péptidos adicionales de IL-5, IL-13 o eotaxina que son adecuados para el uso para la presente invención se pueden identificar por medio del examen de genotecas de péptidos que exhiben fagos con anticuerpos específicos para la proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina, un método bien conocido para una persona entrenada en el campo técnico.
En una realización preferida adicional de la invención, el antígeno o determinante antigénico es una proteína aislada de IL-5, IL-13 o eotaxina de cualquier animal así como también cualquier péptido antigénico de IL-5, IL-13 o eotaxina de cualquier animal. Aquellas personas expertas en el campo técnico sabrán cómo producir péptidos a partir de estas proteínas o péptidos aislados de IL-5, IL-13 o eotaxina.
En otra realización preferida de la invención, el determinante antigénico es Interleucina 13 (IL-13). La IL-13 es una citoquina que es secretada por los linfocitos T activados e impacta principalmente a los monocitos, macrófagos y células B. La secuencia de aminoácidos de la IL-13 de humano, precursora se muestra en la SEC ID NO:230 y la secuencia de aminoácidos de la IL-13 de humano procesada se muestra en la SEC ID NO:231. Los primeros 20 aminoácidos de la proteína precursora corresponden al péptido de señal y están ausentes de la proteína procesada. La secuencia de ratón también ha sido descrita, y la secuencia de aminoácidos procesada se muestra en la SEC ID NO:232 (Brown K.D. y colaboradores, J. Immunol 142:679-687 (1989)). Dependiendo del hospedante de expresión, la construcción de IL-13 comprenderá la secuencia de la proteína precursora, por ejemplo para la expresión y secreción en hospedantes eucarióticos, o consistirá en la proteína madura, por ejemplo para la expresión citoplásmica en E. coli. Para la expresión en el periplásma de E. coli, el péptido de señal de IL-13 es reemplazado por un péptido de señal bacteriano.
La IL-13 es una citoquina derivada del auxiliar T 2 (como IL-4, IL-5) que ha sido implicada recientemente en respuestas alérgicas de las vías aéreas (asma). La sobrerregulación de la IL-13 y el receptor de IL-13 se ha encontrado en muchos tipos de tumores (por ejemplo, linfoma de Hodgkin). La interleucina 13 es secretada y estimula el crecimiento de las células de Hodgkin y Reed-Sternberg (Kapp U. y colaboradores, J Exp Med. 189:1939-46 (1999)). De esta manera, la inmunización contra la IL-13 proporciona una manera para tratar, entre otros, las condiciones descritas anteriormente, tales como Asma o Linfoma Hodgkins.
Preferiblemente, la composición comprende un formador de enlaces de aminoácidos que contiene un residuo de cisteína libre y que es fusionado a la terminación N o C de la secuencia de la IL-13 madura para introducir un segundo sitio de unión dentro de la proteína. En las realizaciones preferidas adicionales, un formador de enlaces de aminoácidos que contiene una cisteína libre se adiciona a la terminación N de la forma madura de la IL-13, puesto que es accesible libremente de acuerdo con la estructura de RMN de la IL-13 (Eisenmesser, E. Z. y colaboradores, J. Mol. Biol. 310:231 (2001)). En las realizaciones nuevamente preferidas adicionales, el formador de enlaces de aminoácidos que contiene una cisteína libre es fusionado a la terminación N de la secuencia que corresponde a la secuencia de la proteína procesada, o es insertado en la terminación N de la secuencia de la forma madura de la proteína, en la terminación C del péptido de señal. En las realizaciones preferidas, aún adicionales, un formador de enlaces de aminoácidos que contiene un residuo de cisteína libre se adiciona a la terminación C de la proteína.
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La IL-13 puede ser expresada en E. coli (Eisenmesser, E. Z. y colaboradores, Protein Expr. Purif. 20:186-95 (2000)) o en células NS-0 (línea de células eucarióticas) (Cannon-Carlson S. y colaboradores Protein Expr. Purif. 12:239-48 (1998)). El Ejemplo 8 demuestra la clonación y expresión de construcciones y la purificación de la IL-13 de murino, fusionada a un formador de enlaces de aminoácidos que contiene un residuo de cisteína, en bacterias. También se describe la producción y prueba de una vacuna de Eoataxina-VLP. Las construcciones de IL-13 de Humano pueden ser generadas de acuerdo con las enseñanzas del Ejemplo 8 y la producción de las proteínas C-IL-13-F de humano (SEC ID NO:330) y C-IL-13-S de humano (SEC ID NO:331) después de la expresión de las proteínas de fusión y la escisión del Factor Xa y enterocinasa, respectivamente. Las proteínas generadas de esta manera pueden ser acopladas a las VLPs y los Pili, lo que conduce a las realizaciones preferidas de la invención.
En todavía otra realización de la invención, el determinante antigénico es interleucina 5 (IL-5). La IL-5 es una citoquina específica del linaje para la eosinofilopoyesis y juega un papel importante en las enfermedades asociadas con un número incrementado de eosinófilos, tales como el asma. La secuencia de la IL-5 de humano, precursora y procesada se proporciona en la SEC ID NO:233 y en la SEC ID NO:234, respectivamente, y la secuencia de aminoácidos de ratón procesada se muestra en la SEC ID NO:235.
La función biológica de la IL-5 ha sido mostrada en varios estudios (Coffman R.L. y colaboradores, Science 245:308-10 (1989); Kopf y colaboradores, Immunity 4:15-24 (1996)), los cuales apuntan a un efecto beneficioso de la inhibición de la función de IL-5 en enfermedades mediadas a través de eosinófilos. La inhibición de la reacción de IL-5 proporciona, de esta manera, una forma para el tratamiento contra el asma y otras enfermedades asociadas con eosinófilos.
La IL-5 forma un dímero, unido covalentamente por un puente de disulfuro. Se ha comunicado una construcción de cadena individual (sc) en donde dos monómeros de IL-5 son unidos por medio de un formador de enlaces de péptidos.
En las realizaciones preferidas de la invención, un formador de enlaces de péptido que contiene una cisteína libre se adiciona a la terminación N de la secuencia de la forma procesada de IL-5. La adición de un formador de enlaces que contiene una cisteína libre también esta prevista, preferiblemente, en la terminación N de la secuencia de la forma procesada de una scIL-5. En las realizaciones preferidas adicionales, el formador de enlaces de aminoácidos que contiene una cisteína libre es fusionado a la terminación N de la secuencia que corresponde a la secuencia de la proteína procesada, o es insertado en la terminación N de la secuencia de la forma madura de la proteína, en la terminal C del péptido de señal.
En las realizaciones nuevamente preferidas adicionales, un formador de enlaces que contiene una cisteína libre es fusionado a la terminación C de la secuencia de IL-5, o la terminación C de la secuencia de scIL-5.
Se ha descrito una variedad de sistemas de expresión para la IL-5 y se pueden utilizar para preparar las composiciones de la invención. Un sistema de expresión bacteriano que utiliza E. coli ha sido descrito por Proudfoot y colaboradores, (Biochem J. 270:357-61 (1990)). En el caso donde la IL-5 es expresada en el citoplasma de E. coli, la construcción de IL-5 está desprovista de un péptido de señal. Las células de insecto también pueden utilizarse para producir construcciones de IL-5 para preparar las composiciones de la invención (Pierrot C. y colaboradores, Biochem, Biophys. Res. Commun. 253:756-60 (1998)). De igual manera, los sistemas de expresión de Baculovirus (células sf9; Ingley E. y colaboradores, Eur. J. Biochem. 196:623-9 (1991) y Brown P.M. y colaboradores, Protein Expr. Purif. 6:63-71 (1995)) también se pueden utilizar. Finalmente, los sistemas de expresión de mamíferos también han sido comunicados (células CHO) y se pueden utilizar en la preparación de estas composiciones de la invención (Kodama S. y colaboradores J. Biochem. (Tokio) 110:693-701 (1991)).
Los sistemas de expresión de baculovirus (Mitchell y colabradores, Biochem. Soc. Trans. 21:332S (1993); Kunimoto DY. y colaboradores, Cytokine 3:224-30 (1991)) y un sistema de expresión de células de mamífero que utiliza células CHO (Kodama S. y colaboradores, Glycobiology 2:419-27 (1992)) también han sido descritos para la IL-5 de ratón.
Los ejemplos 7 y 10 describen la expresión, purificación, acoplamiento a VLP, inmunización y prueba en un modelo de murino de asma experimental de una construcción de Il-5 de murino en donde la secuencia de IL-5 es fusionada en su terminación N a los formadores de enlaces de aminoácidos que contienen un residuo de cisteína para el acoplamiento a las VLPs y los Pili. Las construcciones de humanos pueden generarse de acuerdo con la enseñanza del Ejemplo 7 y el Ejemplo 10 y pueden producir las proteínas C-IL-5-E de humano (SEC ID NO:335), C-IL-5-F de humano (SEC ID NO:336) y C-IL-5-S de humano (SEC ID NO:337) que son adecuadas para el acoplamiento a las VLPs y Pili y que conducen a las realizaciones preferidas de la invención.
En otra realización específica, el determinante antigénico es eotaxina. La eotaxina es una quimioquina específica para el receptor 3 de Quimioquina, presente en los eosinófilos, basófilos y células Th2. Sin embargo, la etoxina parece ser altamente específica para los eosinófilos (Zimmerman y colaboradores, J. Immunol. 165: 5839-46 (2000)). La migración de eosinófilos es reducida por 70% en los ratones con genes deficientes de eotaxina-1, los cuales, sin embargo, aún pueden desarrollar la eosinofilia (Rothenberg y colaboradores, J. Exp. Med. 185: 785-90 (1997)). Parece que la IL-5 es responsable de la migración de eosinófilos de la médula ósea a la sangre y la eotaxina de la migración local en el tejido (Humbles y colaboradores, J. Exp. Med. 186: 601-12 (1997).
Por lo tanto, en una realización preferida, la composición inventiva comprende un formador de enlaces de aminoácidos que contiene un residuo de cisteína como el segundo sitio de unión y que es, preferiblemente, fusionado a la terminación C de la secuencia de Eotaxina. En otras realizaciones preferidas, un formador de enlaces de aminoácidos que contiene una cisteína libre es fusionado a la terminación N de la secuencia que corresponde a la secuencia de la proteína procesada, o es insertado en la terminación N de la secuencia de la forma madura de la proteína, en la terminal C del péptido de señal. Los genes que codificación estas construcciones específicas son clonados en un vector de expresión adecuado.
Los ejemplos 9 y 11 describen la clonación y expresión de una construcción de eotaxina de murino, en donde la secuencia de eotaxina es fusionada en su terminación C a los formadores de enlaces de aminoácidos que contienen un residuo de cisteína para el acoplamiento a las VLPs y los Pili. Las construcciones de humanos pueden generarse de acuerdo con la enseñanza del Ejemplo 9 y pueden producir proteínas adecuadas para el acoplamiento a VLPs y Pili y conducir a las realizaciones preferidas de la invención. La eotaxina puede ser sintetizada químicamente (Clark-Lewis y colaboradores, Biochemistry 30:3128-3135 (1991)). La expresión en E. coli también ha sido descrita para la eotaxina-1, en el citoplasma (Crump y colaboradores, J. Biol. Chem. 273: 22471-9 (1998)). La expresión en E. coli como cuerpos de inclusión con el repliegue subsecuente (Mayer y colaboradores, Biochemistry 39: 8382-95 (2000)) y la expresión en células de insecto (Forssmann y colaboradores, J. Exp. Med. 185: 2171-6 (1997)) han sido descritas para la Eotaxina-2 y, además, pueden utilizarse para llegar a las realizaciones específicas de la invención.
Será entendido por una persona de pericia ordinaria en el campo técnico técnico pertinente que otras modificaciones y adaptaciones adecuadas para los métodos y aplicaciones descritos en este texto son fácilmente aparentes y se pueden hacer sin apartarse del alcance de la invención o cualquier realización de la misma. Habiendo descrito ahora en detalle la presente invención, la misma será entendida más claramente por referencia a los siguientes ejemplos, los cuales se incluyen en la presente para propósitos de ilustración únicamente y no se propone que sean limitantes de la invención.
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Ejemplos Ejemplo 1 Construcción y expresión de proteínas de recubrimiento de Q\beta mutantes y purificación de VLPs o Cápsides de proteínas de recubrimiento de Q\beta mutantes
Construcción de plásmidos y clonación de proteínas de recubrimiento mutantes.
Construcción de pQ\beta-240:
El plásmido pQ\beta10 (Kozlovska, T.M. y colaboradores, Gene 137:133-137) se utilizó como un plásmido inicial para la construcción de pQ\beta-240. La mutación Lys13\rightarrowArg se creó mediante la PCR inversa. Los cebadores inversos se diseñaron en direcciones invertidas de cola a cola:
5'-GGTAACATCGGTCGAGATGGAAAACAAACTCTGGTCC-3'
y
5'-GGACCAGAGTTTGTTTTCCATCTCGACCGATGTTACC-3'.
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Los productos de la primera PCR se utilizaron como modelos para la segunda reacción PCR, en la cual se utilizó un cebador corriente arriba
5'-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3'
y un cebador corriente abajo
5'-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3'.
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El producto de la segunda PCR fue digerido con XbaI y Mph1103I y fue clonado en el vector de expresión pQ\beta10, el cual fue escindido por las mismas enzimas de restricción. Las reacciones PCR se realizaron con reactivos de equipo de PCR y de acuerdo con el protocolo del productor (MBI Fermentas, Vilnius, Lituania).
La secuenciación utilizando el método de incorporación directa de etiquetas verificó las mutaciones deseadas. Las células de E. coli que albergan el plásmido pQ\beta-240 soportaron la síntesis eficiente de la proteína co de 14-kD que emigra con la SDS-PAGE con la proteína de recubrimiento de Q\beta de control aislada de las partículas de fagos de Q\beta.
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Secuencia de aminoácidos resultante (SEC ID NO:23)
AKLETVTLGNIGRDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP
ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ
KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY
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Construcción de pQ\beta-243:
El plásmido pQ\beta10 se utilizó como un plásmido inicial para la construcción pQ\beta-243. La mutación Asn10\rightarrowLys se creó mediante la PCR inversa. Los cebadores inversos se diseñaron en direcciones invertidas de cola a cola:
5'-GGCAAAATTAGAGACTGTTACTTTAGGTAAGATCGG-3'
y
5'-CCGATCTTACCTAAAGTAACAGTCTCTAATTTTGCC-3'.
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Los productos de la primera PCR se utilizaron como modelos para la segunda reacción PCR, en la cual se utilizó un cebador corriente arriba
5'-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3'
y un cebador corriente abajo
5'-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3'.
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El producto de la segunda PCR se digirió con XbaI y Mph1103I y se clonó en el vector de expresión pQ\beta10, el cual fue escindido por las mismas enzimas de restricción. Las reacciones PCR se realizaron con reactivos de equipo de PCR y de acuerdo con el protocolo del productor (MBI Fermentas, Vilnius, Lituania).
La secuenciación utilizando el método de incorporación directa de etiquetas verificó las mutaciones deseadas. Las células de E. coli que albergan el plásmido pQ\beta-243 soportaron la síntesis eficiente de la proteína co de 14-kD que emigra con la SDS-PAGE con la proteína de recubrimiento de Q\beta de control aislada de las partículas de fagos de Q\beta.
Secuencia de aminoácidos resultante (SEC ID NO:24)
AKLETVTLGKIGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP
ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ
KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY
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Construcción de pQ\beta-250:
El plásmido pQ\beta-240 se utilizó como un plásmido inicial para la construcción de pQ\beta-250. La mutación Lys2\rightarrowArg se creó mediante la mutagénesis dirigida al sitio. Un cebador corriente arriba
5'-GGCCATGGCACGACTCGAGACTGTTACTTTAGG-3'
y un cebador corriente abajo
5' GATTTAGGTGACACTATAG-3'
se utilizaron para la síntesis del fragmento de PCR mutante, el cual se introdujo en el vector de expresión de pQ\beta-185 en los únicos sitios de restricción NcoI y HindIII. Las reacciones PCR se realizaron con reactivos de equipo de PCR y de acuerdo con el protocolo del productor (MBI Fermentas, Vilnius, Lituania).
La secuenciación utilizando el método de incorporación directa de etiquetas verificó las mutaciones deseadas. Las células de E. coli que albergan pQ\beta-250 soportaron la síntesis eficiente de la proteína co de 14-kD que emigra con la PAGE con la proteína de recubrimiento de Q\beta de control aislada de partículas de fagos de Q\beta.
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Secuencia de aminoácidos resultante (SEC ID NO:25)
ARLETVTLGNIGRDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP
ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ
KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY
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Construcción de pQ\beta-251:
El plásmido pQ\beta-10 se utilizó como un plásmido inicial para la construcción de pQ\beta-251. La mutación Lys16\rightarrowArg se creó mediante la PCR inversa. Los cebadores inversos se diseñaron en direcciones invertidas de cola a cola:
5'-GATGGACGTCAAACTCTGGTCCTCAATCCGCGTGGGG-3'
y
5'-CCCCACGCGGATTGAGGACCAGAGTTTGACGTCCATC-3'.
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Los productos de la primera PCR se utilizaron como modelos para la segunda reacción PCR, en la cual se utilizó un cebador corriente arriba
5'-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3'
y un cebador corriente abajo
5'-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3'.
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El producto de la segunda PCR fue digerido con XbaI y Mph1103I y fue clonado en el vector de expresión pQ\beta10, el cual fue escindido por las mismas enzimas de restricción. Las reacciones PCR se realizaron con reactivos de equipo de PCR y de acuerdo con el protocolo del productor (MBI Fermentas, Vilnius, Lituania).
La secuenciación utilizando el método de incorporación directa de etiquetas verificó las mutaciones deseadas. Las células de E. coli que albergan a pQ\beta-251 soportaron la síntesis eficiente de la proteína co de 14-kD que emigra con SDS-PAGE con la proteína de recubrimiento de Q\beta de control aislada de partículas de fagos de Q\beta. La secuencia de aminoácidos resultante codificada por esta construcción se muestra en la SEC ID NO:26.
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Construcción de pQ\beta-259:
El plásmido pQ\beta-251 se utilizó como un plásmido inicial para la construcción pQ\beta-259. La mutación Lys2\rightarrowArg se creó mediante la mutagénesis dirigida al sitio. Un cebador corriente arriba
5'-GGCCATGGCACGACTCGAGACTGTTACTTTAGG-3'
y un cebador corriente abajo
5' GATTTAGGTGACACTATAG-3'
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se utilizaron para la síntesis del fragmento de PCR mutante, el cual se introdujo en el vector de expresión de pQ\beta-185 en los únicos sitios de restricción NcoI y HindIII. Las reacciones PCR se realizaron con los reactivos de equipo de PCR y de acuerdo con el protocolo del productor (MBI Fermentas, Vilnius, Lituania).
La secuenciación utilizando el método de incorporación directa de etiquetas verificó las mutaciones deseadas. Las células E. coli que albergan pQ\beta-259 soportaron la síntesis eficiente de la proteína co de 14-kD que emigra con la SDS-PAGE con la proteína de recubrimiento de Q\beta de control aislada de partículas de fagos de Q\beta.
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Secuencia de aminoácidos resultante (SEC ID NO:27)
AKLETVTLGNIGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP
ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ
KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY
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Procedimientos generales para la expresión y purificación de Q\beta y mutantes de Q\beta Expresión
La bacteria E. coli JM109 se transformó con plásmidos de expresión de proteínas de recubrimiento de Q\beta. Se inocularon 5 ml de medio líquido LB que contenía 20 \mug/ml de ampicilina con clones transformados con los plásmidos de expresión de proteínas de recubrimiento de Q\beta. El cultivo inoculado se incubó a 37ºC durante 16-24 horas sin agitación. El inóculo preparado se diluyó subsecuentemente 1:100 en 100-300 ml de medio LB reciente, que contenía 20 \mug/ml de ampicilina y se incubó a 37ºC durante toda la noche sin agitación. El segundo inóculo resultante se diluyó 1:50 en medio M9 que contenía 1% de ácidos Casamino y 0,2% de glucosa en matraces, y se incubó a 37º durante toda la noche bajo agitación.
Purificación
Soluciones y tampones para el procedimiento de purificación:
1.
Tampón de lisis LB
Tris-HCl 50 mM pH 8,0 con EDTA 5 mM, 0,1%
tritoX100 y PMSF recientemente preparado a una concentración de 5 microgramos por ml. Sin lisozima y ADNsa.
2.
SAS
Sulfato de amonio saturado en agua
3.
Tampón NET
Tris-HCl 20 mM pH 7,8 con EDTA 5 mM y NaCl 150 mM.
4.
PEG
Polietilenglicol 6000 al 40% (p/v) en NET
Disrupción y lisis
Las células congeladas se resuspendieron en L\beta a 2 ml/g de células. La mezcla se sonicó con 22 kH cinco veces durante 15 segundos, con intervalos de un minuto para enfriar la solución sobre hielo. El lisado entonces se centrífugo a 14000 rpm, durante 1 hora utilizando un rotor Janecki K 60. Los pasos de centrifugación descritos posteriormente se realizaron todos utilizando el mismo rotor, excepto donde se establezca de otra manera. El sobrenadante se almacenó a 4ºC, mientras que los desechos de células se lavaron dos veces con LB. Después de la centrifugación, los sobrenadantes del lisado y las fracciones de lavado se conjuntaron.
Fraccionamiento
Una solución saturada de sulfato de amonio se adicionó gota a gota bajo agitación al lisado conjuntado, anterior. El volumen de SAS se ajustó para que fuera una quinta parte del volumen total, para obtener 20% de saturación. La solución se dejó reposar durante toda la noche y se sometió a la centrifugación el siguiente día a 14000 rpm, durante 20 minutos. La pelotilla se lavó con una pequeña cantidad de sulfato de amonio al 20% y se sometió a la centrifugación nuevamente. Los sobrenadantes obtenidos se conjuntaron y se adicionó gota a gota SAS para obtener 40% de saturación. La solución se dejó reposar durante toda la noche y se sometió a la centrifugación el siguiente día a 14000 rpm, durante 20 minutos. La pelotilla obtenida se solubilizó en tampón NET.
Cromatografía
La proteína de la cápside o VLP resolubilizada en tampón NET ser cargó en una columna Sepharose® CL-4B. Se eluyeron tres picos durante la cromatografía. El primero contuvo principalmente membranas y fragmentos de membranas y no fue colectado. Las cápsides estuvieron contenidas en el segundo pico, mientras que el tercero contuvo otras proteínas de E. coli.
Las fracciones de los picos se conjuntaron y la concentración de NaCl se ajustó a una concentración final de 0,65 M. Se adicionó gota a gota un volumen de solución PEG que corresponde a la mitad de la fracción pico conjuntada bajo agitación. La solución se dejó reposar durante toda la noche sin agitación. La proteína de la cápside fue sedimentada mediante la centrifugación a 14000 rpm durante 20 minutos. Luego se solubilizó en un volumen mínimo de NET y se cargó nuevamente en la columna Sepharose® CL-4B. Las fracciones pico se conjuntaron y se precipitaron con sulfato de amonio a 60% de saturación (p/v). Después de la centrifugación y la resolubilización en tampón NET, la proteína de la cápside se cargó en una columna Sepharose® CL-6B para la recromatografía.
Diálisis y secado
Las fracciones pico obtenidas anteriormente se conjuntaron y se dializarón extensivamente contra agua estéril y se liofilizaron para el almacenamiento.
Expresión y purificación de Q\beta-240
Las células (JM 109 de E. coli, transformadas con el plásmido pQ\beta-240) se resuspendieron en LB, se sonicaron cinco veces durante 15 segundos (camisa de agua helada) y se centrifugaron a 13000 rpm durante 1 hora. El sobrenadante se almacenó a 4ºC hasta el procesamiento adicional, mientras que los desechos se lavaron 2 veces con 9 ml de LB, y finalmente con 9 ml de urea 0,7 M en LB. Todos los sobrenadantes se conjuntaron y se cargaron en una columna Sepharose® CL-4B. Las fracciones pico conjuntadas se precipitaron con sulfato de amonio y centrifugaron. La proteína resolubilizada entonces se purificó adicionalmente en una columna Sepharose® 2B y finalmente en una columna Sepharose® 6B. El pico de la cápside fue dializado finalmente de manera extensiva contra agua y fue liofilizado como se describiera anteriormente. El ensamblaje de la proteína de recubrimiento en una cápside se confirmó por medio de la microscopía electrónica.
Expresión y purificación de Q\beta-243
Las células (RR1 de E. coli) se resuspendieron en LB y se procesaron como se describiera en el procedimiento general. La proteína se purificó por medio de dos pasos sucesivos de filtración en gel en la columna Sepharose® CL-4B y finalmente en una columna Sepharose® CL-2B. Las fracciones pico se conjuntaron y se liofilizaron como se describiera anteriormente. El ensamblaje de la proteína de recubrimiento en una cápside se confirmó por medio de la microscopía electrónica.
Expresión y purificación de Q\beta-250
Las células (JM 109 de E. coli, transformadas con pQ\beta-250) se resuspendieron en LB y se procesaron como se describiera anteriormente. La proteína se purificó mediante la filtración en gel en una columna Sepharose® CL-4B y finalmente en una columna Sepharose® CL-2B, y se liofilizaron como se describiera anteriormente. El ensamblaje de la proteína de recubrimiento en una cápside se confirmó por medio de la microscopía electrónica.
Expresión y purificación de Q\beta-259
Las células (JM 109 de E. coli, transformadas con pQ\beta-259) se resuspendieron en LB y se sonicaron. Los desechos se lavaron una vez con 10 ml de L\beta y una segunda vez con 10 ml de urea 0,7 M en LB. La proteína se purificó por medio de dos pasos de cromatografía con filtración en gel, en una columna Sepharose® CL-4B. La proteína fue dializada y liofilizada, como se describiera anteriormente. El ensamblaje de la proteína de recubrimiento en una cápside se confirmó por medio de la microscopía electrónica.
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Ejemplo 2 Inserción de un péptido que contenía un residuo de Lisina en el epítopo c/e1 de HBcAg (1-149)
El epítopo c/e1 (residuos 72 a 78) de HBcAg está localizado en la región de punta en la superficie de la cápside del virus de hepatitis B (HBcAg). Una parte de esta región (Prolina 79 y Alanina 80) fue reemplazada genéticamente por el péptido Gly-Gly-Lys-Gly-Gly (construcción de HBcAg-Lys). El residuo de lisina introducido contiene un grupo amino reactivo en su cadena lateral que puede utilizarse para la reticulación química, intermolecular de partículas de HBcAg con cualquier antígeno que contiene un grupo de cisteína libre.
El ADN de HBcAg-Lys, que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO:78, se generó por medio de PCRs: Los dos fragmentos que codifican los fragmentos de HBcAg (residuos de aminoácidos 1 a 78 y 81 a 149) se amplificaron por separado mediante la PCR. Los cebadores utilizados para estas PCRs también introdujeron una secuencia de ADN que codifica el péptido Gly-Gly-Lys-Gly-Gly. El fragmento de HBcAg (1 a 78) se amplificó a partir de pEco63 utilizando los cebadores EcoRIHBcAg(s) y Lys-HBcAg(s). El fragmento de HBcAg (81 a 149) se amplificó a partir de pEco63 utilizando los cebadores Lys-HBcAg(s) y HBcAg(1-149)Hind(as). Los cebadores Lys-HBcAg(as) y Lys-HBcAg(s) introdujeron secuencias de ADN complementarias en los extremos de los dos productos de PCR permitiendo la fusión de los dos productos de PCR en una PCR de ensamblaje subsecuente. Los fragmentos ensamblados se amplificaron por medio de la PCR utilizando los cebadores EcoRIHBcAg(s) y
HbcAg(1-149)Hind(as).
Para las PCRs, se utilizaron 100 pmol de cada oligo y 50 ng de los ADNs modelo en las mezclas de reacción de 50 ml con dos unidades de polimerasa Pwo, dNTPs 0,1 mM y MgSO4 2 mM. Para ambas reacciones, el ciclo de temperatura se llevó a cabo como sigue: 94ºC durante 2 minutos; 30 ciclos de 94ºC (1 minuto), 50ºC (1 minuto), 72ºC (2 minutos).
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Secuencias de los cebadores:
EcoRIHBcAg(s):
(5'-CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG-3')
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Lys-HBcAg(as):
(5'-CCTAGAGCCACCTTTGCCACCATCTTCTAAATTAGTACCCACCCAGGTAGC-3')
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Lys-HBcAg(s):
(5'-GAAGATGGTGGCAAAGGTGGCTCTAGGGACCTAGTAGTCAGTTATGTC-3')
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HBcAg(1-149)Hind(as):
(5'-CGCGTCCCAAGCTTCTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG-3').
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Para la fusión de los dos fragmentos de PCR por medio de la PCR se utilizaron 100 pmol de los cebadores EcoRIHBcAg(s) y HBcAg(1-149)Hind(as) con 100 ng de los dos fragmentos de PCR purificados en una mezcla de reacción de 50 ml que contenía dos unidades de polimerasa Pwo, dNTPs 0,1 mM y MgSO_{4} 2 mM. Las condiciones del ciclo de PCR fueron: 94ºC durante 2 minutos; 30 ciclos de 94ºC (1 minuto), 50ºC (1 minuto), 72ºC (2 minutos). El producto de PCR ensamblado se analizó por medio de la electroforesis en gel de agarosa, se purificó y se digirió durante 19 horas en un tampón apropiado con las enzimas de restricción EcoRI y HindIII. Los fragmentos de ADN digeridos se ligaron en el vector pKK digerido con EcoRI/HindIII para generar el vector de expresión pKK-HBcAg-Lys. La inserción del producto de la PCR en el vector se analizó por medio del análisis de restricción de EcoRI/HindIII y la secuenciación de ADN del inserto.
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Ejemplo 3 Expresión y purificación de HBcAg-Lys
Las cepas de E. coli K802 y JM109 se transformaron con pKK-HBcAg-Lys. Se utilizó 1 ml de un cultivo durante toda la noche de bacterias para inocular 100 ml de medio LB que contenía 100 \mug/ml de ampicilina. Este cultivo se desarrolló durante 4 horas a 37ºC hasta que se alcanzó una OD a 600 nm de aproximadamente 0,8. La inducción de la síntesis de HBcAg-Lys se realizó por medio de la adición de IPTG a una concentración final de 1 mM. Después de la inducción, las bacterias se agitaron adicionalmente a 37ºC durante 4 horas. Las bacterias se recolectaron por medio de la centrifugación a 5000 x g durante 15 minutos. La pelotilla se congeló a -80ºC. La pelotilla se descongeló y se resuspendió en tampón de lisis de bacterias (Na_{2}HPO_{4} 10 mM, pH 7,0, NaCl 30 mM, Tween-20 al 0,25%, EDTA 10 mM) complementado con 200 \mug/ml de lisozima y 10 \mul de Benzonasa (Merck). Las células se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente y se disrumpieron por sonicación. Las células de E. coli que albergaban el plásmido de expresión pKK-HBcAg-Lys o un plásmido de control se utilizaron para la inducción de la expresión de HBcAg-Lys con IPTG. Antes de la adición de IPTG, se removió una muestra del cultivo de bacterias que llevaba el plásmido pKK-HBcAg-Lys y de un cultivo que llevaba el plásmido de control. Cuatro horas después de la adición de IPTG, las muestras se removieron nuevamente del cultivo que contenía pKK-HBcAg-Lys y del cultivo de control. La expresión de proteínas se monitoreó por medio de SDS-PAGE seguido por la tinción con azul de Coomassie.
El lisado entonces se centrifugó durante 30 minutos a 12000 x g a fin de remover los restos de células insolubles. El sobrenadante y la pelotilla se analizaron por medio de la técnica de inmunotransferencia Western utilizando un anticuerpo monoclonal contra HBcAg (YVS1841, adquirido de Accurate Chemical and Science Corp., Westbury, NY, EE.UU.), que indicaba que una cantidad significante de la proteína HBcAg-Lys fue soluble. En resumen, los lisados de las células de E. coli que expresaban HBcAg-Lys y de las células de control se centrifugaron a 14000 x g durante 30 minutos. El sobrenadante (= fracción soluble) y la pelotilla (= fracción insoluble) se separaron y se diluyeron con tampón de muestra de SDS para igualar los volúmenes. Las muestras se analizaron por medio de SDS-PAGE seguido por la técnica de inmunotransferencia Western con un anticuerpo monoclonal anti-HBcAg YVS1841.
El lisado de células aclarado se utilizó para la centrifugación de gradiente escalonado utilizando un gradiente escalonado de sacarosa que consistía en una solución de sacarosa al 65% de 4 ml cubierta con una solución de sacarosa al 15% de 3 ml seguido por 4 ml de lisado bacteriano. La muestra se centrífugo durante 3 horas con 100000 x g a 4ºC. Después de la centrifugación, se colectaron fracciones de 1 ml de la parte superior del gradiente y se analizaron por medio de SDS-PAGE seguido por la tinción con azul de Coomassie. La proteína HBcAg-Lys se detectó mediante la tinción con azul de Coomassie.
La proteína HBcAg-Lys estuvo enriquecida en la interfaz entre 15 y 65% de sacarosa lo que indica que se había formado una partícula de cápside. La mayoría de las proteínas bacterianas permaneció en la capa superior libre de sacarosa del gradiente, por lo tanto la centrifugación de gradiente escalonado de las partículas de HBcAg-Lys condujo tanto al enriquecimiento como a la purificación parcial de las partículas.
La expresión y purificación de HBcAg-Lys a gran escala se realizó como sigue. Se preparó un cultivo durante toda la noche mediante la inoculación de una columna individual en 100 ml de LB, 100 \mug/ml de ampicilina y el desarrollo del cultivo durante toda la noche a 37ºC. Se diluyeron 25 ml del precultivo con 800 ml de medio de ampicilina LB al siguiente día y el cultivo se desarrolló a una densidad óptica OD^{600} de 0,6-0,8. El cultivo entonces se indujo con IPTG 1 mM y se dejó desarrollar durante otras 4 horas. Las células se recolectaron y se lisaron esencialmente como se describiera anteriormente.
La proteína HBcAg-Lys entonces se purificó al precipitar primero la proteína con sulfato de amonio (30% de saturación) del lisado de células aclarado, y luego cargando la pelotilla resolubilizada en una columna de filtración en gel (Sephacryl S-400, Pharmacia). Las fracciones conjuntadas se precipitaron nuevamente con sulfato de amonio, la pelotilla se resolubilizó y se cargó una segunda vez en la misma columna de filtración en gel. Las fracciones se conjuntaron finalmente y se concentraron y la concentración se valoró utilizando una prueba Bradford (BioRad).
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Ejemplo 4 Construcción de HBcAg desprovista de residuos de cisteína libre y que contiene uno residuo de lisina insertado
Un antígeno de núcleo de hepatitis (HBcAg) referido en este texto como HBcAg-lys-2cys-Mut, desprovisto de residuos de cisteína en las porciones que corresponden a 48 y 107 en la SEC ID NO:77 y contiene un residuo de lisina insertado se construyó utilizando los siguientes métodos.
Las dos mutaciones se introdujeron al amplificar primero de manera separada tres fragmentos del gen de HBcAg-Lys preparado como se describiera anteriormente en el ejemplo 2 con las siguientes combinaciones de cebadores de PCR. Los métodos de PCR y las técnicas de clonación convencionales se utilizaron para preparar el gen de HBcAg-lys-2cys-Mut.
En resumen, los siguientes cebadores se utilizaron para preparar el fragmento 1:
Cebador 1: EcoRIHBcAg(s)
CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG
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Cebador 2: 48as
GTGCAGTATGGTGAGGTGAGGAATGCTCAGGAGACTC
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Los siguientes cebadores se utilizaron para preparar el fragmento 2:
Cebador 3: 48s
GSGTCTCCTGAGCATTCCTCACCTCACCATACTGCAC
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Cebador 4: 107as
CTTCCAAAAGTGAGGGAAGAAATGTGAAACCAC
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Los siguientes cebadores se utilizaron para preparar el fragmento 3:
Cebador 5: HBcAg149hind-as
CGCGTCCCAAGCTTCTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAGCGTTGATAG
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Cebador 6: 107s
GTGGTTTCACATTTCTTCCCTCACTTTTGGAAG
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Los fragmentos 1 y 2 entonces se combinaron con los cebadores de PCR EcoRIHBcAg(s) y 107as para dar el fragmento 4. El fragmento 4 y el fragmento 3 entonces se combinaron con los cebadores EcoRIHBcAg(s) y
HBcAg149hind-as para producir el gen de longitud completa. El gen de longitud completa entonces se digirió con las enzimas EcoRI (GAATTC) y HindIII(AAGCTT) y se clonó en el vector pKK (Pharmacia) cortado en los mismos sitios de restricción. La expresión y purificación de HBcAg-lys-2cys-Mut se realizó como se expone en el
ejemplo 3.
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Ejemplo 5 Construcción de HBcAg1-185-Lys
El antígeno de núcleo de hepatitis (HBcAg) 1-185 se modificó como se describe en el ejemplo 2. Una parte de la región del epítopo c/e1 (residuos 72 a 88) (Prolina 79 y Alanina 80) se reemplazó genéticamente por el péptido Gly-Gly-Lys-Gly-Gly (construcción de HBcAg1-185-Lys). El residuo de lisina introducido contiene un grupo amino reactivo en su cadena lateral que se puede utilizar para la reticulación química, intermolecular de partículas de HBcAg con cualquier antígeno que contiene un grupo de cisteína libre. Los métodos de PCR y las técnicas de clonación convencionales se utilizaron para preparar el gen de HBcAg1-185-Lys.
La secuencia Gly-Gly-Lys-Gly-Gly se insertó mediante la amplificación de dos fragmentos separados del gen de HBcAg a partir de pEco63, como se describiera anteriormente en el ejemplo 2 y la fusión de manera subsecuentemente de los dos fragmentos por medio de PCR para ensamblar el gen de longitud completa. Se utilizaron las siguientes combinaciones de cebadores de PCR:
fragmento 1:
Cebador 1: EcoRIHBcAg(s) (véase ejemplo 2)
Cebador 2: Lys-HBcAg(as) (véase ejemplo 2)
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fragmento 2:
Cebador 3: Lys-HBcAg(s) (véase ejemplo 2)
Cebador 4: HBcAgwtHindIII
CGCGTCCCAAGCTTCTAACATTGAGATTCCCGAGATTG
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Ensamblaje:
Cebador 1: EcoRIHBcAg(s) (véase ejemplo 2)
Cebador 2: HBcAgwtHindIII
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El gen de longitud completa, ensamblado, se digirió entonces con las enzimas EcoRI (GAATTC) y HindII
(AAGCTT) y se clonó en el vector pKK (Pharmacia) cortado en los mismos sitios de restricción.
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Ejemplo 6 Fusión de un epítopo del péptido en la región MIR de HbcAg
Los residuos 79 y 80 de HBcAg1-185 se sustituyeron con el epítopo C\varepsilonH3 y la secuencia VNLTWSRASG. La secuencia C\varepsilonH3 proviene de la secuencia del tercer dominio constante de la cadena pesada de IgE de humano. El epítopo se insertó en la secuencia HBcAg1-185 utilizando un método de PCR de ensamblaje. En el primer paso de PCR, el gen de HBcAg1-185 que se origina del clon de ATCC pEco63 y amplificado con los cebadores HBcAg-wt EcoRI fwd y HBcAg-wt Hindi rev se utilizó como modelo en dos reacciones separadas para amplificar dos fragmentos que contenían elementos de secuencia que codifican la secuencia C\varepsilonH3. Estos dos fragmentos entonces se ensamblaron en segundo paso de PCR, en una reacción de PCR de ensamblaje.
Combinaciones de cebadores en el primer paso de PCR: C\varepsilonH3fwd con HBcAg-wt Hind III rev y HBcAg-wt EcoRI fwd con C\varepsilonH3rev. En la reacción PCR de ensamblaje, los dos fragmentos aislados en el primer paso de PCR se ensamblaron primero durante 3 ciclos de PCR sin cebadores exteriores, los cuales se adicionaron después a la mezcla de reacción durante los siguientes 25 ciclos. Cebadores exteriores: HBcAg-wt EcoRI fwd y HBcAg-wt Hind III rev.
El producto de la PCR fue clonado en pKK223.3 utilizando los sitios EcoRI y HindIII, para la expresión en E. coli (véase ejemplo 2). La VLP quimérica se expresó en E. coli y se purificó como se describiera en el ejemplo 2. El volumen de elusión al cual se eluyó HBcAg1-185- C\varepsilonH3 de la filtración en gel mostró el ensamblaje de las proteínas de fusión a una VLP quimérica.
Secuencias de los cebadores:
C\varepsilonH3fwd:
5'GTT AAC TTG ACC TGG TCT CGT GCT TCT GGT GCA TCC AGG GAT CTA GTA GTC3'
V N L T W S R A S G A80 S R D L V V86
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C\varepsilonH3rev:
5' ACC AGA AGC ACG AGA CCA GGT CAA GTT AAC ATC TTC CAA ATT ATT ACC CAC 3'
D78 E L N N G V72
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HBcAg-wt EcoRI fwd:
5' CCGgaattcATGGACATTGACCCTTAAAG
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HBcAg-wt HindIII rev:
5' CGCGTCCCaagcttCTAACATTGAGATTCCCGAGATTG
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Ejemplo 7 Clonación, expresión y purificación de IL-5 con un formador de enlaces de aminoácidos N-terminal que contiene un residuo de cisteína. Acoplamiento a una VLP, inmunización y demostración de la eficacia en un modelo experimental de asma alérgico con un componente eosinofílico A. Clonación de His-C-IL-5 de ratón y expresión como cuerpos de inclusión en E. coli
La IL-5 se amplificó a partir del clon de ATCC (pmIL5-4G; número de ATTC: 37562) por medio de la PCR utilizando los siguientes dos cebadores: Spelinker3-F1 (SEC ID NO:340) y I15StopXho-R (SEC ID NO:342). El producto de esta PCR se utilizó como modelo para una segunda PCR con los cebadores SpeN inker3-F2 (SEC ID NO:341) y I15StopXho-R. El inserto se digirió con SpeI y NotI. Este inserto fue ligado en un vector pET derivativo (vector
pMODEC3-8), digerido previamente con Nhe I y Not I y transformado en células TG1 de E. coli. La construcción generada mediante la clonación de IL5 en pMODEC3-8 comprende, desde su terminación N, una etiqueta hexa-histidina (para facilitar la purificación), un sitio de escisión de Enterocinasa, un formador de enlaces de aminoácidos derivado gamma 3 (flanqueado en la terminal N por los aminoácidos ALV y en la terminación C por AS) que contenía un residuo de cisteína y el ADN que codifica la forma madura de la proteína de IL-5. La fidelidad del procedimiento de clonación se confirmó por medio de la secuenciación de ADN.
La construcción que contenía la IL-5 descrita anteriormente se denominó pMODC6-IL5.2 (también referida como pMODC6-IL5) y se transformó en la cepa BL21-DE3 de E. coli. La proteína recombinante expresada en E. coli se denomina His-C-IL5.
Las células clonales BL21-DE3 que albergaban pMODC6-IL5 se desarrollaron durante la noche en 5 ml de LB que contenía 1 mg/L de Ampicilina. Una alícuota de 2,0 ml de este cultivo se diluyó en 100 ml de caldo Terrific® (TB) que contenía 1 mg/L de Ampicilina. El cultivo se desarrolló una densidad óptica, OD_{600 \ mm}, de 0,7-1,0 y la expresión se indujo durante 4 horas por la adición de 0,1 ml de una solución madre 1,0 M de \beta-D-Tiogalactopiranosida de Isopropilo (IPTG). La proteína His-C-IL5 recombinante fue expresada en una forma insoluble y localizada en la fracción de cuerpos de inclusión de las células inducidas. La expresión de His-C-IL5 se confirmó de la siguiente manera. Se tomó una muestra de 10 ml de cultivo 4 horas después de la inducción y se centrifugó durante 10 minutos a 4000 x g. La pelotilla se suspendió en 0,5 ml de tampón de lisis que consistía en Tris-HCl 50 mM, EDTA 2 mM, triton X-100 al 1,0% (pH 8,0). A la suspensión se adicionaron 20 \mul de Lisozima (40 mg/ml) y después de 30 minutos a 40ºC se sonicó durante 2 minutos. Se adicionó una alícuota de 1,0 ml de benzonasa y una alícuota de 100 \mul de MgCl_{2} 50 mM y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación durante 15 minutos a 13000 x g, el sobrenadante se desechó y la pelotilla se calentó durante 5 minutos a 98ºC en 100 \mul de tampón de carga de SDS. Las alícuotas de 10 \mul entonces se analizaron mediante SDS-PAGE bajo condiciones de reducción (figura 17A). El análisis de SDS-PAGE demostró una banda de proteína de 17 kDa que corresponde a la masa de IL-5. Como control, las células BL21-DE2 que contenían pMODC6-IL5 se desarrollaron en ausencia de IPTG y los extractos se prepararon de la fracción de células insolubles como se describiera anteriormente.
B. Purificación y repliegue de His-C-IL5 de ratón
Una expresión a escala más grande de IL-5 a partir del clon pMODC6-Il5 en células BL21-DE3 se realizó a fin de obtener suficientes cantidades de IL-5 pura para la producción de vacunas. Los cultivos durante toda la noche se desarrollaron y se diluyeron en volúmenes de ya sea 100 ml o 1L de medio TB que contenía 1,0 mg/L de Ampicilina. Un total de 3 litros de cultivo se preparó de esta manera y se desarrolló a 37ºC hasta que se alcanzó una OD_{600 \ mm} de 0,7, momento en el cual se adicionó IPTG para dar una concentración final de 1,0 mM. Después de 4 horas de incubación, las células se recolectaron por centrifugación durante 30 minutos a 10000 x g. Después de la recolección, la pelotilla se resuspendió en PBS (5,0 ml/g de peso húmedo) y se centrifugaron durante 15 minutos a 10000 x g. La pelotilla lavada se almacenó a -20ºC hasta el uso adicional.
La pelotilla bacteriana se suspendió en PBS (2,0 ml/g de peso húmedo de células) utilizando un homogenizador Dounce. Se adicionó lisozima (0,8 mg/ml) a la suspensión y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. La suspensión se sonicó durante 1 minuto, 3 veces sobre hielo luego se adicionaron benzonase y MgCl_{2} (concentración final 10 mM) y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se adicionó Triton X-100 a una concentración final de 1% (p/v), la mezcla se agitó suavemente a temperatura ambiente durante 30 minutos. La solución se centrifugó durante 20 minutos a 20000 x g (tubos SS34) y el sobrenadante se desechó. La pelotilla que albergaba los cuerpos de inclusión se suspendió (5,0 ml/g de peso húmedo) en tampón de lavado (PBS que contenía urea 2M y Triton X-100 al 1% (p/v)) utilizando un homogenizador Dounce y se agitó durante 5 minutos. La solución se centrifugó durante 20 minutos a 20000 x g y el sobrenadante se desecho. La pelotilla se lavó y se centrífugo como antes 2 veces más. Se realizó un lavado final de los cuerpos de inclusión con tampón de lavado en ausencia de Triton X-100.
La proteína His-C-IL-5 presente en los cuerpos de inclusión de la pelotilla se solubilizó en (5,0 ml/g de peso húmedo de células) tampón desnaturalizante (NaH_{2}PO_{4} 100 mM, Tris-HCl 10 mM, clorhidrato de guanidina 6,0 M, pH 8,0) y se agitó suavemente durante 1 hora a 25ºC. La suspensión se centrifugó durante 20 minutos a 20000 x g y el sobrenadante se mezcló con resina de Ni-NTA (QIAgen, equilibrada con tampón de solubilización). Después de 3 horas de agitación suave a 4ºC, la suspensión espesa se vertió en una columna de vidrio (C10/10) y la resina se lavó con 100 ml de NaH_{2}PO_{4} 100 mM, Tris 10 mM, clorhidrato de guanidina 6,0 M (pH 6,3). Se realizó un paso adicional de lavado con 15 ml de NaH_{2}PO_{4} 100 mM, Tris 10 mM, clorhidrato de guanidina 6,0 M (pH 5,9). La proteína His-C-IL5 de ratón se eluyó de la resina por la aplicación de 20 ml NaH_{2}PO_{4} 100 mM, Tris 10 mM, clorhidrato de guanidina 6,0 M (pH 4,5). La purificación se analizó mediante SDS-PAGE.
Las fracciones del paso de elusión que contenían His-C-IL-5 se conjuntaron y se dializaron contra un tampón que comprendía urea 8,0 M, NaH_{2}PO_{4} 100 mM, Tris-HCl 10 mM, (pH 8,0) a 4ºC utilizando una membrana de corte de 10 kDa. Después de la diálisis, la concentración de la proteína se determinó por medios espectrofotométricos utilizando la siguiente fórmula; Proteína (mg/ml) = (1,55 x A_{28 \ nm}) - (0,76 x A_{260 \ nm}). La concentración de la proteína se diluyó con tampón de diálisis a 0,2 mg/ml. La solución luego se dializó con una membrana de 3,5 kDa durante 24 horas a 4ºC contra tampón de repliegue 1 que comprendía urea 2,0 M, NaH_{2}PO_{4} 50 mM, Glutationa reducida 5 mM, Glutationa oxidada 0,5 mM, arginina 0,5 M, glicerol al 10% (v/v) (pH 8,5) y durante 24 horas adicionales contra otro tampón de repliegue 2 que comprendía NaH_{2}PO_{4} 50 mM, Glutationa reducida 5 mM, Glutationa oxidada 0,5 mM, arginina 0,5 M, glicerol al 10% (v/v), (pH 8,5). Al final, la proteína se dializó durante 24 horas a 4ºC contra PBS, pH 8,0, luego se centrifugó a 10000 x g durante 30 minutos. El contenido de proteína del sobrenadante se estimó por medio del ensayo Bradford.
A fin de purificar adicionalmente la proteína His-C-IL5, se realizó el intercambio aniónico con resina Hitrap Q (Amersham Pharmacia, Uppsala Suecia). La proteína His-C-Il5 se concentró a 1 mg/ml utilizando Filtros de Centrífuga (Ultrafree-15 millipore, corte de 10 kDa) y se dializó durante 14 horas contra tampón de Fosfato 50 mM, pH 8,4. La solución se cargó en una columna Hitrap Q y se lavó con tampón de Fosfato 50 mM, pH 8,4. La proteína His-C-IL-5 se eluyó de la columna al aplicar un gradiente de NaCl de 0-1 M. La proteína His-C-IL5 se eluyó de la columna en NaCl 100 mM. El análisis de la purificación se realizó por medio de SDS-PAGE y la concentración se midió por medio del ensayo Bradford. La estructura cuaternaria de la proteína se valoró por medio de SDS-PAGE realizada bajo condiciones no reductoras.
C. Producción de vacuna: Acoplamiento de His-C-IL5 a Q\beta
Se investigó una variedad de condiciones para optimizar la eficacia de la reacción de acoplamiento. Éstas incluyen la adición del agente de reducción, (TCEP) a His-C-IL5 y la variación de las relaciones morales del monómero de Q\beta y His-C-IL5 en la reacción de acoplamiento y se resumen en la tabla 1. La vacuna para el estudio de la eficacia se produjo de la siguiente manera. La proteína His-C-IL-5 purificada (40 \muM) se redujo durante 1 hora con una cantidad equimolar de TCEP en PBS, pH 8,0. La IL-5 reducida (80 \muM) se incubó durante 4 horas a 22ºC con Q\beta 400 \muM derivatizada con SMPH en un volumen total de 700 \mul. La reacción se dializó 12 horas contra PBS, pH 8,0, utilizando una membrana de diálisis de corte de 300 kDa. La reacción de acoplamiento se analizó por medio de SDS-PAGE y la técnica de inmunotransferencia Western-Blot con anticuerpos anti-His y anti-Q\beta. La concentración de la proteína se midió por medio del ensayo Bradford. La eficacia de acoplamiento [es decir mol de Q\beta-IL5/mol de monómero de Q\beta (total)] se estimo por medio del análisis densitométrico de SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie.
TABLA 1 Diferentes condiciones de acoplamiento utilizadas para optimizar la reticulación química de His-C-IL5 a Q\beta
2 
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D. ELISA para valorar la vacuna
El acoplamiento de His-C-IL5 de ratón a Q\beta se valoró utilizando un ensayo ELISA "cuádruple", el cual representado en la figura 4. La placa de ELISA de 96 pocillos se revistió durante toda la noche con 100 \mul de 1 mg/L de IgG anti-conejo de cabra por pocillo. La placa se lavó cuatro veces de con PBS-Tween 0,1% (v/v) (PBST), luego se bloqueó durante 2 horas a 37ºC con albúmina de suero bovino al 2% (p/v) (BSA) en PBST. Después del lavado con PBST policlonal, se adicionó suero anti-Q\beta de conejo (diluido 1:5000) y se incubó durante 1 hora. La placa se lavó dos veces con PBST y se adicionaron ya sea cantidades variantes de Q\beta-His-C-IL5 o control (figura 5) y se incubó durante 1 hora a 25ºC. Se utilizaron dos diferentes anticuerpos terciarios en el ensayo; IL5 anti-ratón de rata (TRFK4) o IL5 anti-ratón de rata (TRFK5), ambos son anticuerpos monoclonales neutralizantes. Todos se utilizaron en concentraciones de 1 \mug/ml. Los anticuerpos de detección se conjugaron con Peroxidasa de Rábano Picante (HRP) y específica para el fragmento Fc particular del anticuerpo terciario. El enlace en el ensayo de intercalación se midió por medio de la fosforescencia química (ECL) a 450 nm.
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F. Ensayo de actividad de IL-5
La capacidad de la línea de linfoma de células B BCL1 para proliferar en respuesta a IL-5 de murino se utilizó para verificar la bioactividad de la proteína His-C-IL-5 recombinante, replegada (Harriman G.R. (1991) Current Protocols en Immunology 6.5.1-6.5.5 John Wiley and Sons Inc). La actividad proliferativa de His-C-IL5 acoplada covalentemente a Q\beta también se valoró. La IL-5 de murino recombinante (R&D systems, Miniápolis EE.UU.) se utilizó como un control. Las diversas formas de IL-5 recombinante se incubaron en placas de 96 pocillos de fondo plano con 2 x 10^{4} células BCL1 por pocillo y se incubaron durante 24 horas a 37ºC, CO_{2} al 5%. Se adicionó 1 \muCi de ^{3}H-Timidina (Hartmann Analytic, Suiza) a cada pocillo y las placas se incubaron durante otras 6 horas a 37ºC, CO_{2} al 5%. Las células se recolectaron, se lavaron y la incorporación de timidina se determinó por medio del conteo de la emisión \beta con un contador de centelleo líquido.
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G. Protocolo de Inmunización
A fin de generar anticuerpos reactivos del propio organismo para IL-5 de ratón, cuatro ratones BalbC fueron inyectados por vía subcutánea el día 0 y el día 14 con 25 \mug de la vacuna de Q\beta-His-C-IL5 en 200 \mul de PBS. Para servir como control negativo, cinco ratones fueron inmunizados el día 0 y 14 con una mezcla simple de 6,4 \mug de Q\beta y 16 \mul de IL5, es decir no acoplados covalentemente (Q\beta + His-C-IL5) en PBS. Los ratones se sangraron antes de la inmunización y el día 21 del protocolo de inmunización. Los sueros se analizaron por medio del ensayo ELISA.
H. Análisis de sueros
ELISA. Las placas Maxisorp ELISA (Nunc) se revistieron con 50 \mul de la proteína His-C-IL-5 purificada (3 \mug/ml) durante 14 horas a 4ºC. Las placas se lavaron 3 veces con PBS y se bloquearon con BSA al 2% en PBS durante 2 horas a 37ºC, luego se lavaron dos veces con PBS. Se adicionaron diluciones de sueros cinco veces en BSA al 2%, FCS al 0,1% en PBS y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron subsecuentemente 3 veces con PBS y se incubaron con IgG anti-ratón conjugada con HRP (dilución 1:1000) a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron nuevamente 3 veces con PBS y se adicionaron 100 \mul/pocillo de solución de desarrollo (Na2HPO4 0,066 M, ácido cítrico 0,035 M, H_{2}O_{2} al 0,032%, diclorhidrato de 1,2-fenilendiamina al 0,4%). Después de 2 minutos de reacción a temperatura ambiente, el ensayo ELISA se detuvo con 50 \mul por pocillo de H_{2}SO_{4} al 5%. La absorbancia se midió a 450 nm en un espectrofotómetro Spectramax (Molecular Devices).
Tinción de inmunotransferencia Western con suero de ratones inmunizados con Q\beta-IL5. His-C-IL5, Q\beta y los controles se separaron por medio de SDS_PAGE y se electromancharon en una membrana de nitrocelulosa. La membrana se bloqueó durante 1 hora con leche en polvo al 5% (p/v) en PBS, luego se incubaron con 20 \mul del suero del día 21 de los ratones vacunados en 10 ml de leche en polvo al 1% (p/v) en PBS. La membrana se lavó con PBS durante 15 minutos y luego se incubó durante 1 hora con 10 ml de leche en polvo al 1% (p/v) en PBS que contenía anticuerpo IgG anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) en una dilución de 1:1000. La membrana se lavó durante 15 minutos en PBS y se desarrolló con ECL (Amersham Pharmacia, Suiza) y se expuso a una película fotográfica.
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I. Modelos de eosinofilia
Un modelo de asma experimental de inflamación alérgica de las vías aéreas se utilizó para valorar los efectos de la vacunación sobre la eosinofilia. Los ratones Balb/c (4 por grupo) fueron inmunizados con ya sea Q\beta-His-C-IL-5 como se describiera anteriormente. En el día 23 del programa de vacunación, los ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal con 50 \mug de Ovalbúmina (OVA) en Alumbre (Alu-Gel-S). Un tercer grupo de 4 ratones que no recibió inmunización, también se inyectó. Después de 10 días (es decir el día 33), los ratones recibieron 100 \mug de OVA en PBS administrado por vía intranasal cada día durante 4 días. 24 horas después de la última prueba, los ratones se sacrificaron y los pulmones se lavaron con PBS. Las células contenidas en el lavado bronquio-alveolar (BAL) se tiñeron con Maigrünwald-Giemsa y se contaron (Trifilieff A. y colaboradores, Clin Exp Allergy. junio de 2001; 31(6):934-42.
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Resultados y discusión
Expresión. La expresión de la construcción pMODC6-IL5 en células BL21-DE2 se analizó por medio de SDS-PAGE (figura 1). El gel teñido con Azul de Coomassie demostró la expresión inducida por IPTG de una proteína de 17 kDa que corresponde a la masa de IL-5. Como el control, las células BL21-DE2 que contenían pMODC6-IL5 se desarrollaron en ausencia de IPTG y los extractos preparados a partir de la fracción de células insolubles como se describiera anteriormente. Como se esperaba, no hubo inducción de una masa molecular de 17 kDa bajo estas condiciones. La proteína His-C-IL5 estuvo localizada en la fracción de cuerpos de inclusión insolubles.
Extracción, purificación y repliegue. La proteína His-C-Il5 insoluble se extrajo de cuerpos de inclusión lavados con detergente con clorhidrato de guanidina 6M. La proteína solubilizada se purificó por medio de la cromatografía de afinidad de quelatos de metal y se analizó por medio de SDS-PAGE (figura 2). La proteína His-C-IL5 recombinante se encontró que estaba altamente enriquecida por este procedimiento. La proteína desnaturalizada se sujetó a un procedimiento de repliegue en urea como describiera anteriormente y se purificó adicionalmente por medio de la cromatografía de intercambio de aniones. Estos pasos produjeron la proteína His-C-IL5 altamente pura, soluble, lo cual se juzgó por medio de SDS-PAGE (figura 5, carril 1) con una recuperación de 23% y rendimiento de 6,9 mg.
Puesto que la IL-5 nativa, biológicamente activa, es un homodímero enlazado a disulfuro, la capacidad de la His-C-Il5 recombinante purificada para formar dímeros se valoró por medio SDS-PAGE realizada bajo condiciones no reductivas (figura 3). Como se juzgó por medio de la masa molecular de 37 kDa, se demostró que la proteína His-C-IL5 era de naturaleza dimérica, lo que indica la conservación de la estructura cuaternaria, nativa.
La actividad biológica de His-C-IL5 recombinante se valoró al determinar su capacidad para estimular la proliferación de una línea de células B de murino (figura 4). Las células BCL1 cultivadas en presencia de His-C-IL5 se mostró que tenían velocidades de proliferación mejoradas cuando se comparaban con el medio de cultivo solo u otras proteínas. Además, la proliferación mejorada fue similar a aquella observada para una IL-5 de murino obtenida comercialmente. La capacidad de His-C-IL5 para estimular la proliferación de células B, presumiblemente al interactuar con su receptor cognado, y para adoptar una estructura dimérica ambos indican que la proteína recombinante tiene una conformación nativa adoptada.
Producción de vacunas y analítica. El acoplamiento químico covalente de His-C-IL5 a la partícula tipo virus Q\beta se valoró por medio de SDS-PAGE y análisis de inmunotransferencia Western. Los geles teñidos con azul de Coomassie de la reacción de acoplamiento demostraron la aparición de bandas con pesos moleculares que corresponden a aquellos predichos para His-C-IL5 unida covalentemente a Q\beta (figura 5). Además, los análisis de inmunotransferencia Western mostraron la co-localización de estas bandas cuando se tiñeron con ya sea anticuerpos anti-His o anti-Q\beta (figura 6). La eficacia de acoplamiento [es decir mol de Q\beta-IL5/mol de monómero de Q\beta (total)] se estimó, por medio del análisis densitométrico de la SDS-PAGE teñida con azul de Coomassie, que era de 40,6%.
La capacidad de His-C-IL-5 reticulada covalentemente a Q\beta para estimular la proliferación de células B se valoró como se describiera previamente. La figura 5 muestra que Q\beta-His-C-IL5 fue capaz de causar una proliferación mejorada en comparación con Q\beta acoplado a una citoquina no relacionada.
La conformación de His-C-IL5 acoplada a Q\beta se analizó adicionalmente utilizando un ensayo ELISA cuádruple. (figura 7a). La figura 7b demuestra que His-C-IL5 es reconocida por los anticuerpos monoclonales, neutralizantes de IL5, TRFK4 y TRFK5. Cuando se realizó la reacción con Q\beta preferiblemente que Q\beta-His-C-IL-5 no se detectaron señales. El anticuerpo monoclonal TRFK4 reconoce un epítopo neutralizante dentro de IL-5. La capacidad de los anticuerpos monoclonales específicos para IL-5 para reconocer His-C-IL-5 enlazada covalentemente indica que los epítopos neutralizantes son conservados dentro de la preparación de vacuna.
Análisis de sueros. Los sueros preinmunes y los sueros del día 21 de ratones vacunados con Q\beta-His-C-IL5 se colectaron y se analizaron por medio de un ensayo ELISA (figura 8). El resultado muestra que la tolerancia inmunológica hacia IL-5 de antígeno del propio organismo fue superada en ausencia del adyuvante y después solo en ratones vacunados 4/4. Se calculó que los títulos semi-máximos estaban en el rango de 1:2000 a 1:6000. En el grupo de control que recibió Q\beta mezclada con His-C-IL5 no se detectaron títulos anti-IL5 significantes. Sin embargo, 3 de 5 ratones produjeron un bajo título de anticuerpos <1:50. Los sueros inmunes de ratones vacunados con Q\beta-His-C-IL5 se sometieron a prueba adicionalmente por medio del análisis de inmunotransferencia Western. En todos los casos, los sueros inmunes reconocieron específicamente la IL-5 de murino.
Eficacia de la vacuna en un modelo animal de asma experimental. El efecto de la vacunación con Q\beta-His-C-IL-5 sobre la eosinofilia se valoró en un modelo de murino de inflamación alérgica de las vías aéreas que imita los eventos patológicos clave en el asma. Este experimento sometió a prueba la capacidad de los anticuerpos anti-IL-5 generados por medio de la vacunación con Q\beta-His-C-IL-5 para desregular la acción in vivo de la IL-5 endógena. En el experimento de control, los ratones se vacunaron con PBS antes de la sensibilización con OVA y la prueba. En este caso, se contaron altos números de eosinófilos en el BAL. El número promedio de eosinófilos/200 células contadas fue 96 \pm 14 S.D. En contraste, el valor promedio de los eosinófilos de BAL de cuatro ratones vacunados con Q\beta-His-C-IL-5 fue 27,5 + 11 S.D./200 células contadas. Esta es una reducción de 71,4% y es evidencia que los anticuerpos generados por medio de la inmunización con His-C-IL-5 presentados como una disposición inmune altamente ordenada reconocen la molécula objetivo, endógena y con lo cual desregulan la eosinofilia en un modelo experimental de asma.
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Ejemplo 8 Clonación molecular, expresión, repliegue y purificación de mIL-13 de ratón con un formador de enlaces de aminoácidos C-terminal que contiene un residuo de cisteína para el acoplamiento a VLPs y Pili. Acoplamiento de Interleucina 13 de ratón a VLPs y Pili A. Clonación de IL-13 para expresión procariótica
El ADN para la clonación de IL-13 se aisló por medio de RT-PCR a partir de esplenocitos activados in vitro, los cuales se obtuvieron como sigue: las células CD4 + T se aislaron de células de bazo de ratón y se incubaron 3 días en IMDM (FCS +5% + 10 ng/ml de IL4) en placas de 6 pocillos revestidas previamente con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28. El ARN de estas células se utilizó para amplificar el ADNc que codifica la IL13 por medio de la TR-PCR de un paso (equipo de PCR de un paso Qiagen). El cebador HhoIL13-R se utilizó para la transcripción inversa de la ARN y los cebadores NheIL13-F (SEC ID NO:338) y XhoIL13-R (SEC ID NO:339) se utilizaron para la amplificación de PCR del ADNc de IL13. El ADNc de IL13 amplificado se ligó en un vector de pMOD utilizando los sitios de restricción NheI/XhoI (para dar el vector pMODB1-IL13). La identidad de la secuencia de ADNc resultante se determinó por medio de la secuenciación de nucleótidos.
Utilizando el mismo cebador, NheIL13-F (SEC ID NO:338) y XhoIL13-R (SEC ID NO:339), el ADNc de IL-13 fue amplificado a partir del plásmido pModB1-IL13 y fue ligado en el vector pMODGST-EK-Cl dando por resultado el plásmido pModGST-EK-IL13-C1. La secuencia de ADNc de este plásmido fue determinada por medio de la secuenciación de nucleótidos. Un ADNc que comprende la secuencia de codificación para la glutationa-S-transferasa fusionada a un sitio de escisión de enterocinasa seguido por la secuencia de IL-13 con el formador de enlaces C-terminal 1 fue amplificado por medio de la PCR con el cebador GST-BamHI ss y C1-BsmBI/XhoI utilizando el plásmido pModGST-EK-IL13-C1 como modelo. Este ADNc fue digerido con enzimas de restricción BamHI y BsmBI y ligado en el vector pModB-N1 utilizando el sitio de restricción BamHI/XhoI. El plásmido resultante pMod-GCST-EK-IL13-C1-His codifica una proteína de fusión que consiste en glutationa-S-transferasa, un sitio de escisión de enterocinasa, IL-13, un formador de enlaces que contiene cisteína y una etiqueta de polihistidina (GST-EK-IL13-C1-His). La identidad del ADNc que codifica esta proteína de fusión se confirmó por medio de la secuenciación de nucleótidos.
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Secuencia de oligonucleótidos:
GST-BamHI ss:
5'-CGCCGGATCCTATACTAGGTTATTGG-3'
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Cl-BsmBI/XhoI as:
5'-GGGCGCGTCTCCTCGAGACCGCAACCACCACCA-3'
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B. Expresión de IL-13 en E. coli
El plásmido pMod-GST-EK-IL13-C1-His se transformó en la cepa hospedante, bacteriana BL 21 (DE3). Después de 90 minutos de recuperación en Medios LB que contenían Glucosa al 2% (precultivo), 250 ml de Medios SB amortiguados con MOPS que contenían Glucosa al 0,2% y 100 \mug de Ampicilina/l se inoculó con 250 \mul de precultivo y se inoculó en una plataforma de agitación a 37ºC durante toda la noche. A la siguiente mañana, el cultivo de semillas se diluyó con 750 ml de Medios SB amortiguados con MOPS. precalentados que contenían 100 \mug de Ampicilina/l y se incubaron en una plataforma de agitación con 125 rpm a 37ºC durante otros 90 minutos hasta que se alcanzó una OD_{600} de 4,5. El cultivo de 1000 ml se diluyó con 500 ml de Medios SB amortiguados con MOPS que contenían 100 \mug de Ampicilina/l y se cambiaron a una incubadora a 24ºC donde se incubó con una plataforma de agitación durante 30 minutos hasta que se alcanzó una OD_{600} de 3,75. La expresión de la proteína de fusión GST-EK-IL13-C1-His fue inducida al adicionar IPTG 0,75 mM. Después de 4 horas, las bacterias se recolectaron por medio de la centrifugación y se disrumpieron por medio de la sonicación.
C. Purificación de IL-13 a partir de cuerpos de inclusión bajo condiciones de desnaturalización
Después de la lisis, los cuerpos de inclusión fueron sedimentados por medio de la centrifugación a baja velocidad (10000 g, 60 minutos, a 4ºC). El sobrenadante se colectó y se centrifugó nuevamente bajo las mismas condiciones. Las pelotillas se mantuvieron como una fracción cruda de cuerpo de inclusión. Los cuerpos de inclusión se lavaron 4 veces con el siguiente tampón de lavado; Tris-HCl 50 mM, pH 7,6, NaCl 250 mM, MgCl_{2} 5 mM, Urea 2 M, Triton X-100 al 2% y benzonasa 10 U/ml. Los cuerpos de inclusión se colectaron por medio de la centrifugación y se resuspendieron en tampón desnaturalizante que contenía NaH_{2}PO_{4} 100 mM, Tris-HCl 10 mM y HC de Guanidina 6 M, pH 8,0. Los cuerpos de inclusión se sonicaron en presencia de 10 U de Benzonasa/ml y se incubaron durante 2 horas en una rueda giratoria a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, los sobrenadantes se tiñeron nuevamente y las pelotillas se resuspendieron nuevamente en tampón desnaturalizante y se trataron como se describiera anteriormente. Los sobrenadantes se conjuntaron y se cargaron en una columna de Ni^{2+}-agarosa equilibrada con el tampón desnaturalizante. La proteína ligada se eluyó en dos pasos con tampón desnaturalizante, pH 6,3 y pH 4,5. Las alícuotas de las fracciones se analizaron por medio de la tinción con Amidoblack y después la precipitación de TCA por medio de SDS-PAGE (figura 10).
D. Repliegue de GST-EK-IL13-C1-His
Se adicionó \beta-mercaptoetanol a la proteína eluida a una concentración final de 10 mM y se sometió a la diálisis durante toda la noche contra 2 litros de tampón que contenía Urea 8,0 M, NaH_{2}PO_{4} 100 mM, Tris-HCl 10 mM, \beta-Mercaptoetanol 10 mM (pH 8,0) a 4ºC utilizando una membrana de corte de 10 kDa. Después de la diálisis, se determinó la concentración de la proteína y la concentración de la proteína diluida con tampón de diálisis a 0,2 mg/ml. La solución se sometió a la diálisis durante 24 horas a 4ºC contra tampón de repliegue 1 que comprendía Urea 2,0 M, NaH_{2}PO_{4} 50 mM, Glutationa reducida 5 mM, Glutationa oxidada 0,5 mM, Arginina 0,5 M, glicerol al 10% (v/v) (pH 8,5). Al siguiente día el tampón de repliegue 1 se intercambió contra el tampón de repliegue 2 que contenía NaH_{2}PO_{4} 50 mM, Glutationa reducida 2,5 mM, Glutationa oxidada 0,25 mM, Arginina 0,25 M, glicerol al 10% (v/v), (pH 8,5) y se sometió a la diálisis a 4ºC durante otras 24 horas. Finalmente, la solución se sometió a la diálisis a 4ºC contra el tampón de repliegue 3 que comprendía etanolamina 20 mM, NaCl 150 mM y glicerol al 10% (v/v) (pH 9,0). El tampón de repliegue 3 fue intercambiado una vez después de 2 horas y la diálisis procedió durante otras 14 horas. El producto dializado se centrifugó a 4ºC y 20000 g durante 15 minutos. El sobrenadante fue teñido nuevamente y la proteína se concentró por medio de la centrifugación en "dispositivos de filtro de centrífuga biomax" con un corte de peso molecular de 5 kDa (Millipore) a una concentración final de proteína de 2 mg/ml. La proteína se analizó por medio de SDS-PAGE y análisis de inmunotransferencia Western con anticuerpos monoespecíficos contra GST, IL-13 de ratón y etiqueta His, respectivamente.
E. Escisión de la proteína de fusión GST-EK-IL13-C1-His con Enterocinasa
La proteína de fusión GST-EK-IL13-C1-His es incubada con 1 x tampón de enterocinasa (Tris-CHl 50 mM pH 8,0, CaCl_{2} 10 mM y Tween-20 al 1%) y 1 U de Enterocinasa (Invitrogen) por 12,5 \mug de proteína de fusión durante 24 horas a 4ºC.
F. Purificación de IL13-C1-His
Después del tratamiento con enterocinasa, el GST escindido es separado por medio de una combinación de cromatografía de intercambio iónico, filtración en gel y cromatografía de afinidad. La proteína de IL-13-C1-His es concentrada a una concentración final de proteína de 2 mg/ml.
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G. Preparación de la proteína de IL-13-C1-His para la reacción de acoplamiento
A fin de determinar las condiciones optimas para el acoplamiento, la proteína IL-13-C1-His es tratada bajo condiciones de reducción suaves con varias concentraciones (0 \muM a 500 \muM) de un agente reductor (DTT o TCEP). La proteína de IL-13-C1-His reducida se somete a prueba para el acoplamiento eficiente a VLPs y Pili derivatizados.
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H. Acoplamiento de IL-13-C1-His a cápsides de Q\beta
A una solución de cápside de Q\beta 120 \muM en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2, se hace reaccionar durante 30 minutos con un exceso molar 25 veces de un reticulador heterobifuncional como SMPH (Pierce), diluido de una solución madre en DMSO, a 25ºC en un agitador oscilante. La solución de reacción es dializada subsecuentemente dos veces durante 2 horas contra 1 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. La mezcla de reacción de Q\beta derivatizada, dializada entonces se mezcla con la proteína IL-13-C1-His preparada. En la reacción de acoplamiento, la proteína IL-13-C1-His está en un exceso molar dos veces sobre la cápside de Q\beta derivatizada. La reacción de acoplamiento procede durante cuatro horas a 25ºC en un agitador oscilante. Los productos de acoplamiento son analizados por medio de SDS-PAGE y además por medio de la técnica de inmunotransferencia Western.
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Acoplamiento de IL-13-C1-His a proteína de la cápside de fr
Una solución de cápside de fr 120 \muM en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2, se hace reaccionar durante 30 minutos con un exceso molar 25 veces de SMPH (Pierce), diluido de una solución madre en DMSO, a 25ºC en un agitador oscilante. La solución de reacción es dializada subsecuentemente dos veces durante 2 horas contra 1 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. La mezcla de reacción de la proteína de la cápside de fr dializada entonces se hace reaccionar con la proteína IL-13-C1-His preparada. En la reacción de acoplamiento, la proteína IL-13-C1-His está en un exceso molar dos veces sobre la cápside de fr derivatizada. La reacción de acoplamiento procede durante cuatro horas a 25ºC en un agitador oscilante. Los productos de acoplamiento son analizados por medio de SDS-PAGE y además por medio de la técnica de inmunotransferencia Western.
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Acoplamiento de IL-13-C1-His a HBcAg-Lys-2cys-Mut
Una solución de la cápside de HBcAg-Lys-2cys-Mut 120 \muM en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2, se hace reaccionar durante 30 minutos con un exceso molar 25 veces de SMPH (Pierce), diluido de una solución madre en DMSO, a 25ºC en un agitador oscilante. La solución de reacción es dializada subsecuentemente dos veces durante 2 horas contra 1 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. La mezcla de reacción de HBcAg-Lys-2cys-Mut dializada entonces se hace reaccionar con la proteína IL-13-C1-His preparada. En la reacción de acoplamiento, la proteína IL-13-C1-His está en un exceso molar dos veces sobre la cápside de HBcAg-Lys-2cys-Mut derivatizada. La reacción de acoplamiento procede durante cuatro horas a 25ºC en un agitador oscilante. Los productos de acoplamiento son analizados por medio de SDS-PAGE y además por medio de la técnica de inmunotransferencia Western.
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Acoplamiento de la proteína IL-13-C1-His a Pili
Una solución de pili tipo 1 125 \muM de E. coli en Hepes 20 mM, pH 7,4, se hace reaccionar durante 60 minutos con un exceso molar 50 veces de reticulador SMPH diluido de una solución madre en DMSO, a temperatura ambiente en un agitador oscilante. La mezcla de reacción es desalinizada en una columna PD-10 (Amersham-Pharmacia Biotech). Las fracciones que contienen proteína que se eluyen de la columna son conjuntadas, y la proteína de pili derivatizada, desalinizada se hace reaccionar con la proteína IL-13-C1-His. En la reacción de acoplamiento, la proteína IL-13-C1-His está en un exceso molar dos veces sobre los pili tipo 1 derivatizados de E. coli. La reacción de acoplamiento procede durante cuatro horas a 25ºC en un agitador oscilante. Los productos de acoplamiento son analizados por medio de SDS-PAGE y además por medio de la técnica de inmunotransferencia Western.
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Inmunización de ratones con IL-13-C1-His acoplada a la proteína de la cápside de Q\beta
Los ratones hembra Balb/c son vacunados con IL-13-C1-His acoplada a una VLP sin la adición de adyuvantes. Se diluyen 25 \mug de la proteína total de cada muestra en PBS a 200 \mul y se inyectan por vía subcutánea (100 \mul en dos lados ventrales) en el día 0 y el día 14. Los ratones son sangrados retro-orbitalmente el día 31 y su suero es analizado utilizando un ensayo ELISA específico para IL-13.
Ejemplo 9 Clonación, expresión, purificación y acoplamiento de Eotaxina con una secuencia de formadores de enlaces de aminoácidos que contiene cys
La eotaxina de ratón se expresó de manera recombinante con un formador de enlaces de aminoácidos C1 fusionado a su terminación C. Este formador de enlaces contuvo una cisteína para el acoplamiento a una VLP.
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Construcción de pmEo-C1 y pmHisEo-C1
La MCS de pET22b(+) (Novagen, Inc.) se cambió a GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGATCCGGC
TAGCGCTCGAGGGTTTAAACGGCGGCCGCATGCACC al reemplazar la secuencia original del sitio NdeI al sitio XhoI con el cebador de oligos hibridizado MCS-1F y el cebador MCS-1R (hibridación en tampón de Tris-HCl 15 mM, pH 8). El plásmido resultante se denominó pMod00, el cual tuvo los sitios de restricción NdeI, BamHI, NheI, XhoI, PmeI y NotI en su MCS. El par hibridizado de oligos Bamhis6-EK-Nhe-F y Bamhis6-EKNhe-R y el par hibridizado del oligo 1F-C-glicina-formador de enlaces y el oligo 1R-C-glicina-formador de enlaces se ligaron conjuntamente en el plásmido pMod00 digerido con BamHI-NotI para obtener pModEC1, el cual tuvo una etiqueta de hexahistidina N-terminal, un sitio de escisión de enterocinasa y un formador de enlaces de aminoácidos de glicina C-terminal que contiene un residuo de cisteína. La eotaxina de ratón se amplificó a partir de un clon de ATCC (número de ATCC 3148394) por medio de la PCR utilizando los siguientes cebadores: mEotaxina-F, Nhe-mEotaxina-F y mEotaxina-Xho-R. El cebador mEotaxina-F tuvo un sitio interno NdeI, el cebador Nhe-mEotaxina-F tuvo un sitio interno NheI y el mEotaxina-Xho-R tuvo un sitio interno XhoI. El producto de la PCR del par de cebadores mEotaxina-F, mEotaxina-Xho-R se digirió con NdeI y XhoI y se ligó en pModEC1 digerido con las mismas enzimas. El plásmido resultante se denominó pmEo-C1, el cual codifica una proteína de fusión que consiste en eotaxina y un formador de enlaces que contiene cisteína en su terminación C. El producto de la PCR del par de cebadores Nhe-mEotaxina-F y mEotaxina-Xho-R se digirió con NheI y XhoI y se ligó en pModEC1 digerido con las mismas enzimas. El plásmido resultante se denominó pHismEo-C1, el cual codifica una proteína de fusión que contiene una etiqueta His N-terminal seguido por un sitio de escisión de enterocinasa, eotaxina y un formador de enlaces de cisteína.
Para la reacción de PCR, se utilizaron 15 pmol de cada oligo y 1 ng del ADN modelo en 50 \mul de mezcla de reacción (2 unidades de PFX polimerasa, dNTPs 0,3 mM y MgSO_{4} 2 mM). Los ciclos de temperatura fueron como sigue: 94ºC durante 2 minutos, seguido por 30 ciclos de 94ºC (30 segundos) 60ºC (30 segundos), 68ºC (30 segundos) y seguido por 68ºC durante 2 minutos. Todos los otros pasos se realizaron por medio de protocolos de biología molecular estándar.
Secuencia de oligonucleótidos:
mEotaxina-F: 5'GGAATTCCATATGCACCCAGGCTCCATCCCAAC3'
Nhe-mEotaxina-F: 5'CCTAGCTAGCGCACCCAGGCTCCATCCCAAC3'
mEotaxina-Xho-R: 5'CCCGCTCGAGTGGTTTTGGAGTTTGGAGTT3'
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Expresión de pmEo-C1
Las células BL21 (DE3) de E. coli competentes se transformaron con el plásmido pmEo-C1. Las colonias individuales de placas de agar que contenían ampicilina (Amp) se expandieron en un cultivo líquido (SB con MOPS 150 mM, pH 7,0, 100 \mug/ml de Amp, glucosa al 0,5%) y se incubaron a 30ºC con agitación a 220 rpm durante toda la noche. Luego se inoculó 1 l de SB (MOPS 150 mM, pH 7,0, 100 \mug/ml de Amp) 1:50 v/v con el cultivo durante toda la noche y se desarrolló a OD600=1,7 a 30ºC con agitación a 150 rpm. La expresión se indujo con IPTG 1 mM. Las células luego se recolectaron después de una inducción de 9 horas mediante la centrifugación a 6000 rpm durante 5 minutos. La pelotilla de células se suspendió en tampón de lisis (Na_{2}HPO_{4} 10 mM, NaCl 30 mM, EDTA 10 mM y Tween-20 al 0,25%), con 0,8 mg/ml de lisozima, se sonicó y se trató con benzonasa. Después de la centrifugación con 48000 RCF durante 20 minutos, el sobrenadante se resolvió en el gel de PAGE al 16% y la expresión de eotaxina de ratón se confirmó por medio del anticuerpo eotaxina anti-ratón (R & D system) en la técnica de inmunotransferencia Western (figura 12). Esto demostró claramente la expresión de eotaxina-C1 que condujo al peso molecular esperado de 8,8 KD.
Las secuencias de proteínas de eotaxina-C1 de ratón y His-eotaxina-C1 de ratón se tradujeron de las secuencias de ADNc.
Eotaxina-C1 de ratón:
MHPGSIPTSCCFIMTSKKIPNTLLKSYKRITNNRCTLKAIVFKTRLGKEICADPKKKWVQDATKHLDQKL
QTPKPLRGGGGGCG
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His-eotaxina-C1 de ratón:
MDPHHHHHHGSGDDDDKALAHPGSIPTSCCFIMTSKKIPNTLLKSYKRITNNRCTLKAIVFKTRLGKEIC
ADPKKKWVQDATKHLDQKLQTPKPLRGGGGGCG
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Acoplamiento de eotaxina-C1 de ratón a la proteína de la cápside de Q\beta
Una solución de 1,48 ml de 6 mg/mol de proteína de la cápside de Q\beta en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2, se hace reaccionar durante 60 minutos con 14,8 \mul de un SMPH (Pierce) (de una solución madre 100 mM disuelta en DMSO) a 25ºC. La solución de reacción es dializada subsecuentemente dos veces durante 3 horas nuevamente 2 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. Una solución de 1,3 ml de 3,6 mg/mol de proteína de eotaxina-C1 de ratón en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2, se hace reaccionar durante 1 hora con 9,6 \mul de un TCEP (Pierce) (de una solución madre 36 mM disuelta en H_{2}O) a 25ºC. 130 \mul de la Q\beta derivarizada y dializada entonces se hace reaccionar con 129 \mul de eotaxina-1 reducida en 241 \mul de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0 durante toda la noche a 25ºC. Los análisis de inmunotransferencia Western con un anticuerpo anti-Q\beta y un anticuerpo anti-eotaxina demuestran el acoplamiento covalente de eotaxina a Q\beta.
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B. Inmunización de ratones con eotaxina-C1 de ratón acoplada a una proteína de la cápside de Q\beta
Los ratones hembra Balb/c se vacunan con eotaxina-C1 de ratón acoplada a proteína de la cápside de Q\beta sin la adición de adyuvantes. 25 \mug de la proteína total de cada muestra se diluyen en PBS a 200 ul y se inyectan por vía subcutánea (100 \mul en dos lados ventrales) en el día 0 y el día 14. Los ratones son sangrados retroorbitalmente en el día 31 y su suero es analizado utilizando un ensayo ELISA específico para etotaxina.
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C. ELISA
Las placas de ELISA son revestidas con eotaxina-C1 de ratón a una concentración de 5 \mug/ml. Las placas son bloqueadas y luego incubadas con sueros de ratón diluidos en serie. Los anticuerpos ligados se detectan con anticuerpo IgG anti-ratón etiquetado enzimáticamente. Como un control, el suero preinmune de los mismos ratones también se somete a prueba.
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Ejemplo 10 Clonación y expresión de interleucina 5 (IL-5) con un formador de enlaces de aminoácidos N-terminal que contiene un residuo de cisteína para el acoplamiento a VLPs y Pili A. Clonación de IL-5 para expresión como cuerpos de Inclusión en E. coli
La IL-5 fue amplificada de un clon de ATCC (pmIL5-4G; número de ATCC: 37562) mediante la PCR utilizando los siguientes dos cebadores: Spelinker3-F1 (SEC ID NO:340) y I15StopXho-R (SEC ID NO:342). El producto de esta PCR se utilizó como modelo para una segunda PCR con los cebadores SpeN1inker3-F2 (SEC ID NO:341) y I15StopXho-R. El inserto se digirió con SpeI y NotI. Este inserto fue ligado en un derivado de vector pET (vector pMODEC3-8), digerido previamente con NheI y NotI (no desfosforilados) y transformado en células TG1 de E. coli. La construcción de IL-5 generada por medio de la clonación en un vector pMODEC3-8 contiene en su terminación N una etiqueta de hexa-histidina, seguido por un sitio de enterocinasa, un formador de enlaces de aminoácidos gamma 3 N-terminal que contiene un residuo de cisteína, flanqueado en la terminal C por la secuencia AS y en la terminal N por la secuencia ALV y la forma madura del gel de IL-5. La proteína liberada por la escisión con enterocinasa es denominada "C-IL-5-E de ratón" (SEC ID NO:332). El ADN de plásmido del clon resultante pMODC6-IL5.2 (también denominado pMODC6-IL5), cuya secuencia había sido confirmada por medio de la secuenciación de ADN, se transformó en la cepa BL21 de E. coli.
El clon pMODC6-IL5/BL21 se desarrolló durante la noche en 5 ml de LB que contenía 1 mg/L de Ampicilina. Se diluyeron 2 ml de este cultivo en 100 ml de caldo Terrific® (TB) que contenía 1 mg/L de Ampicilina. El cultivo se indujo por medio de la adición de 0,1 ml de una solución 1M de \beta-D-Tiogalactopiranosida de Isopropilo (IPTG) cuando el cultivo alcanzó una densidad óptica OD_{600}=0,7. Se tomaron muestras de 10 ml cada 2 horas. Las muestras se centrifugaron 10 minutos a 4000 x g. La pelotilla se resuspendió en 0,5 ml de tampón de lisis que contenía Tris-HCl 50 mM, EDTA 2 mM, triton X-100 al 0,1% (pH 8). Después de haber adicionado 20 \mul de Lisozima (40 mg/ml) y de haber incubado el tubo durante 30 minutos a 4ºC, las células se sonicaron durante 2 minutos. Se adicionaron 100 \mul de una solución de MgCl_{2} 50 mM y 1 ml de benzonasa. Las células luego se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente y se centrifugaron durante 15 minutos a 13000 x g.
El sobrenadante se desechó y la pelotilla se hirvió durante 5 minutos a 98ºC en 100 \mul de tampón de carga de SDS. Se analizaron 10 \mul de las muestras en el tampón de carga por medio de SDS-PAGE bajo condiciones de reducción (figura 17A). El gel de la figura 17A demuestra claramente la expresión de la construcción IL-5. Las muestras cargadas en el gel de la figura 17A fueron las siguientes:
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Carril M: Marcador (NEB, marcador teñido previamente de rango amplio). Carril 1: extracto celular de un cultivo de 1 ml antes de la inducción. Carril 2: extracto celular de un cultivo de 1 ml 4 horas después de la inducción.
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B. Clonación de IL-5 para la expresión en células de mamífero (HEK-293T) a) IL-5 fusionada en su terminación N a un formador de enlaces de aminoácidos que contiene un residuo de cisteína fusionada en su terminación C al fragmento Fc
El modelo descrito conforme a (A) (clon de ATCC 37562) se utilizó para la clonación de la siguiente construcción. El plásmido pMODB1-IL5 (un derivado de pET) fue digerido con BamHI/XhoI para producir un fragmento pequeño que codifica la IL-5 fusionada a un formador de enlaces de aminoácidos N-terminal que contiene una cisteína. Este fragmento fue ligado en el vector pCEP-SP-XA-Fc*(\DeltaXho) el cual había sido digerido previamente con BamHI y XhoI. El enlace fue electroporado en la cepa TG1 de E. coli y el ADN del plásmido del clon resultante pCEP-SP-IL5-Fc.2, cuya secuencia se había confirmado por medio de la secuenciación de ADN, se utilizó para transfectar las células HEK-293T. La construcción de IL-5 resultante codificada por este plásmido tuvo la secuencia de aminoácidos ADPGCGGGGGLA fusionada a la terminación N de la secuencia madura de IL-5. Esta secuencia comprende la secuencia de formador de enlaces de aminoácidos GCGGGGG que contiene una cisteína y es flanqueada por aminoácidos adicionales introducidos durante el procedimiento de clonación. La proteína de IL-5 liberada por la escisión de la proteína de fusión con el factor Xa es denominada posteriormente "C-IL-5-F de ratón"
(SEC ID NO:333).
Después de la transfección y selección en Puromicina, el sobrenadante de cultivo se analizó por medio de la técnica de inmunotransferencia Western (figura 17B) utilizando un anticuerpo de IgG anti-His (ratón) y un anticuerpo de IgG anti-ratón conjugado a peroxidasa de Rábano picante. El anticuerpo de IgG anti-ratón conjugado a peroxidasa de rábano picante también detecta las proteínas de fusión Fc. La purificación de la proteína se realizó por medio de la cromatografía de afinidad en una resina de proteína A. El resultado de la figura 17B demuestra claramente la expresión de la construcción IL-5.
Las muestras cargadas en la técnica de inmunotransferencia Western de la figura 17B fueron las siguientes:
Carril 1: sobrenadante del cultivo de HEK que expresa IL5-Fc (20 \mul). La SDS-PAGE se realizó bajo condiciones de reducción. Carril 2: sobrenadante de cultivo de HEK que expresa IL13-Fc (20 \mul). La SDS-PAGE se realizó bajo condiciones no reductivas. Carril 3: sobrenadante de cultivo de HEK que expresa IL5-Fc (20 \mul). El SDS-PAGE se realizó bajo condiciones no reductivas.
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B. IL-5 clonada con GST (Glutationa-S-transferasa) y un formador de enlaces de aminoácidos que contiene un residuo de cisteína fusionado a su terminación N
La IL-5 (ATCC 37562) se amplificó con los cebadores Nhe-link1-IL13-F e IL5StopXho-R. Después de la digestión con NheI y XhoI, el inserto fue ligado en pCE-SP-GST-EK, la cual había sido digerida previamente con NheI y XhoI. El plásmido resultante pCEP-SP-DST-IL5 fue secuenciado y utilizado para la transfección de las células HEK-293T. La construcción de IL-5 resultante codificada por este plásmido tuvo la secuencia de aminoácidos LACGGGGG fusionada a la terminación N de la secuencia madura de IL-5. Esta secuencia comprende la secuencia de formador de enlaces de aminoácidos ACGGGGG que contiene un residuo de cisteína y está flanqueada por aminoácidos adicionales introducidos durante el procedimiento de clonación. La proteína liberada por la escisión con enterocinasa fue denominada posteriormente "C-IL-5-S de ratón" (SEC ID NO:334). La purificación de la proteína resultante se realizó por medio de la cromatografía de afinidad en resina de afinidad de Glutationa.
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C. Acoplamiento de C-IL-5-F de ratón o C-IL-5-S de ratón a la proteína de la cápside de Q\beta
Una solución de proteína de la cápside de Q\beta 120 \muM en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2, se hace reaccionar durante 30 minutos con un exceso molar 25 veces de SMPH (Pierce), diluido de una solución madre en DMSO, a 25ºC en un agitador oscilatorio. La solución de reacción es dializada subsecuentemente dos veces durante 2 horas contra 1 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. La mezcla de reacción de Q\beta dializada luego se hace reaccionar con una solución de C-IL-5-F de ratón o C-IL-5-S de ratón (concentraciones finales: proteína de la cápside de Q\beta 60 \muM, C-IL-5-F de ratón o C-IL-5-S de ratón 60 \muM) durante cuatro horas a 25ºC en un agitador oscilatorio. Los productos del acoplamiento se analizan por medio de SDS-PAGE.
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D. Acoplamiento de C-IL-5-F de ratón o C-IL-5-S de ratón a la proteína de la cápside de fr
Una solución de la proteína de la cápside de fr 120 \muM en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2, se hace reaccionar durante 30 minutos con un exceso molar 25 veces de SMPH (Pierce), diluido de una solución madre en DMSO, a 25ºC en un agitador oscilatorio. La solución de reacción se somete a la diálisis subsecuente dos veces durante 2 horas contra 1 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. La mezcla de reacción de fr dializada entonces se hace reaccionar con la solución de C-IL-5-F de ratón o C-IL-5-S de ratón (concentraciones finales: proteína de la cápside de fr 60 \muM, C-IL-5-F de ratón o C-IL-5-S de ratón 60 \muM) durante cuatro horas a 25ºC en un agitador oscilatorio. Los productos del acoplamiento se analizan por medio de SDS-PAGE.
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E. Acoplamiento de solución de C-IL-5-F de ratón o C-IL-5-S de ratón a HBcAg-lys-2cys-Mut
Una solución de la cápside de HBcAg-lys-2cys-Mut 120 \muM en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2, se hace reaccionar durante 30 minutos con un exceso molar 25 veces de SMPH (Pierce), diluido de una solución madre en DMSO, a 25ºC en un agitador oscilatorio. La solución de reacción es dializada subsecuentemente dos veces durante 2 horas contra 1 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. La mezcla de reacción de HBcAg-lys-2cys-Mut dializada entonces se hace reaccionar con la solución de C-IL-5-F de ratón o C-IL-5-S de ratón (concentraciones finales: HBcAg-lys-2cys-Mut 60 \muM, C-IL-5-F de ratón o C-IL-5-S de ratón 60 \muM) durante cuatro horas a 25ºC en un agitador oscilatorio. Los productos del acoplamiento son analizados por medio de SDS-PAGE.
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F. Acoplamiento de solución de C-IL-5-F de ratón o C-IL-5-S de ratón a Pili
Una solución de Pili tipo 1 125 \muM de E. coli en Hepes 20 mM, pH 7,4, se hace reaccionar durante 60 minutos con un exceso molar 50 veces de reticulador SMPH, diluido de una solución madre en DMSO, a temperatura ambiente en un agitador oscilatorio. La mezcla de reacción se desaliniza en una columna PD-10 (Amersham-Pharmacia Biotech). Las fracciones que contienen proteína que son eluidas de la columna son conjuntadas y la proteína de pili derivatizada, desalinizada se hace reaccionar con la solución de C-IL-5-F de ratón o C-IL-5-S de ratón (concentraciones finales: Pili 60 \muM, C-IL-5-F de ratón o C-IL-5-S de ratón 60 \muM) durante cuatro horas a 25ºC en un agitador oscilatorio. Los productos de acoplamiento son analizados por medio de SDS-PAGE.
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Ejemplo 11 Clonación, expresión y purificación de IL-13 a VLPs y Pili A. Clonación y expresión de interleucina 13 (IL-13) con un formador de enlaces de aminoácidos N-terminal que contiene un residuo de cisteína para el acoplamiento a VLPs y Pili a) Clonación de IL-13 de ratón (HEK-293T) para la expresión en células de mamífero como proteína de fusión de Fc
El ADN para la clonación de IL-13 se aisló por medio de RT-PCR de esplenocitos activados in vitro, los cuales se obtuvieron como sigue: las células CD4+ T se aislaron de células de bazo de ratón y se incubaron 3 días en IMDM (+ FCS 5% + 10 ng/ml de IL4) en placas de 6 pocillos, las cuales habían sido revestidas previamente con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28. El ARN de estas células se utilizó para amplificar la IL13 por medio de la RT-PCR de un paso (equipo de PCR de un paso Qiagen). El cebador XhoIL13-R se utilizó para la transcripción inversa del ARN y los cebadores NheIL13-F (SEC ID NO:338) y XhoIL13-R (SEC ID NO:339) se utilizaron para la amplificación de PCR del ADNc de IL13. El ADNc de IL13 amplificado se ligó en un vector pMOD utilizando los sitios de restricción NheI/XhoI (dando el vector pMODB1-IL13). El vector pMODB1-IL13 fue digerido con BamHI/XhoI y el fragmento que contenía la IL13 fue ligado en el vector pCEP-SP-XA-Fc*(\DeltaXho) un análogo de pCEP-SP-XA-Fc*, donde un sitio XhoI en el extremo de la secuencia Fc había sido removido, el cual había sido digerido previamente con BamHI/XhoI. El plásmido resultante de este enlace (pCEP-SP-IL13-Fc) fue secuenciado y utilizado para transfectar las células HEK-293T. La construcción de IL13 resultante codificada por este plásmido tuvo la secuencia de aminoácidos ADPGCGGGGGLA fusionada a la terminación N de la secuencia madura de IL-13. Esta secuencia comprende la secuencia de formador de enlaces de aminoácidos GCGGGGG flanqueada por aminoácidos adicionales introducidos durante el procedimiento de clonación. La IL-13-Fc podría ser purificada con resina de Proteína A del sobrenadante de las células transfectadas con pCEP-SP-IL13-Fc. El resultado de la expresión se muestra en la figura 17B (véase ejemplo 10 para la descripción de las muestras). La IL-12 madura fusionada en su terminación N con la secuencia de aminoácidos mencionada anteriormente es liberada con la escisión de la proteína de fusión con el factor Xa, que conduce a una proteína llamada posteriormente "C-IL-13-F de ratón" y que tiene una secuencia de la SEC ID NO:328. El resultado de la figura 17B demuestra claramente la expresión de la construcción de IL-13.
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b) Clonación de IL-13 de ratón (HEK-293T) para la expresión en células de mamífero con GST (Glutationa-S-transferasa) fusionada en su terminación N
El ADNc se utilizó para la clonación de IL-13 con una GST N-terminal originada del ADNc de células T activadas con TH2 como se describiera anteriormente (a). La IL-13 se amplificó a partir de este ADNc utilizando los cebadores Nhelink1IL13-F e IL13StopXhoNot-R. El producto de la PCR fue digerido con NheI y XhoI y ligado en el vector pCEP-SP-GST-EK digerido previamente con NheI/XhoI. El plásmido que pudo ser aislado del enlace (pCEP-SP-GST-IL13) se utilizó para transfectar las células HEK-293T. La construcción de IL13 resultante codificada por este plásmido tuvo la secuencia de aminoácidos LACGGGGG fusionada a la terminación N de la secuencia madura de IL-13. Esta secuencia comprende la secuencia de formador de enlaces de aminoácidos ACGGGGG flanqueada por un aminoácido adicional introducido durante el procedimiento de clonación. El sobrenadante de cultivo de las células transfectadas con pCEP-SP-GST-IL13 contuvo la proteína de fusión GST-IL13, la cual pudo ser purificada por medio de la cromatografía de afinidad de Glutationa de acuerdo con los protocolos estándar. La IL-13 madura fusionada en su terminación N con la secuencia de aminoácidos mencionada anteriormente es liberada con la escisión de la proteína de fusión con enterocinasa, conduciendo a una proteína llamada posteriormente "C-IL-13-S de ratón" y que tiene una secuencia de la SEC ID NO:329.
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B. Acoplamiento de C-IL-13-F de ratón, C-IL-13-S de ratón a la proteína de la cápside de Q\beta
Una solución de la cápside de Q\beta 120 \muM en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2, se hace reaccionar durante 30 minutos con un exceso molar 25 veces de SMPH (Pierce), diluido de una solución madre en DMSO, a 25ºC en un agitador oscilatorio. La solución de reacción es sometida a la diálisis subsecuentemente dos veces durante 2 horas contra 1 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. La mezcla de reacción de Q\beta dializada entonces se hace reaccionar con la solución de C-IL-13-F de ratón o C-IL-13-S de ratón (concentraciones finales: proteína de la cápside de Q\beta 60 \muM, C-IL-13-F de ratón o C-IL-13-S de ratón 60 \muM) durante cuatro horas a 25ºC en un agitador oscilatorio. Los productos del acoplamiento son analizados por medio de SDS-PAGE.
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C. Acoplamiento de C-IL-13-F de ratón, C-IL-13-S de ratón a la proteína de la cápside de fr
Una solución de la proteína de la cápside de fr 120 \muM en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2, se hace reaccionar durante 30 minutos con un exceso molar 25 veces de SMPH (Pierce), diluido de una solución madre en DMSO, a 25ºC en un agitador oscilatorio. La solución de reacción se somete a la diálisis subsecuentemente dos veces durante 2 horas contra 1 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. La mezcla de reacción de fr dializada entonces se hace reaccionar con la solución de C-IL-13-F de ratón o C-IL-13-S de ratón (concentraciones finales: proteína de la cápside de fr 60 \muM, C-IL-13-F de ratón o C-IL-13-S de ratón 60 \muM) durante cuatro horas a 25ºC en un agitador oscilatorio. Los productos del acoplamiento se analizan por medio de SDS-PAGE.
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D. Acoplamiento de la solución de C-IL-13-F de ratón o C-IL-13-S de ratón a HBcAg-Lys-2cys-Mut
Una solución de la cápside de HBcAg-Lys-2cys-Mut 120 \muM en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2, se hace reaccionar durante 30 minutos con un exceso molar 25 veces de SMPH (Pierce), diluido de una solución madre en DMSO, a 25ºC en un agitador oscilatorio. La solución de reacción se somete a la diálisis subsecuentemente dos veces durante 2 horas contra 1 L de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. La mezcla de reacción de HBcAg-Lys-2cys-Mut dializada entonces se hace reaccionar con la solución de C-IL-13-F de ratón o C-IL-13-S de ratón (concentraciones finales: HBcAg-Lys-2cys-Mut 60 \muM, C-IL-13-F de ratón o C-IL-13-S de ratón 60 \muM) durante cuatro horas a 25ºC en un agitador oscilatorio. Los productos del acoplamiento son analizados por medio de SDS-PAGE.
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E. Acoplamiento de solución de C-IL-13-F de ratón o C-IL-13-S de ratón a Pili
Una solución de pili tipo 1 125 \muM de E. coli en Hepes 20 mM, pH 7,4, se hace reaccionar durante 60 minutos con un exceso molar 50 veces de reticulador SMPH, diluido de una solución madre en DMSO, a temperatura ambiente en un agitador oscilatorio. La mezcla de reacción se desaliniza en una columna PD-10 (Amersham-Pharmacia Biotech). Las fracciones que contienen proteína que se eluyen de la columna son conjuntadas y la proteína de pili derivatizada, desalinizada se hace reaccionar con la solución de C-IL-13-F de ratón o C-IL-13-S de ratón (concentraciones finales: Pili 60 \muM, C-IL-13-F de ratón o C-IL-13-S de ratón 60 \muM) durante cuatro horas a 25ºC en un agitador oscilatorio. Los productos de acoplamiento son analizados por medio de SDS-PAGE.
Habiendo descrito ahora completamente la presente invención con cierto detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, será obvio para una persona de pericia ordinaria en el campo técnico que la misma puede ser realizada al modificar o cambiar la invención dentro de un rango amplio y equivalente de condiciones, formulaciones y otros parámetros sin afectar el alcance de la invención o alguna realización específica de la misma, y que se pretende que tales modificaciones o cambios estén abarcados dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.
Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente mencionadas en esta memoria descriptiva son indicativas del nivel de pericia de los expertos en el campo técnico al cual pertenece esta invención.
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<110> Cytos Biotechnology AG
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<120> Disposiciones de Antigenos para el Tratamiento de Enfermedades Eosinofilicas Alergicas
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<130> C38913PCEPES
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<140> PCT/EP02/12455
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<141> 2002-11-07
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<150> US 60/396,636
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<151> 2002-07-19
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<150> PCT/IB02/00166
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<151> 2002-01-21
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<150> US 10/050,902
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<151> 2002-01-18
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<150> US 60/331,045
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<151> 2001-11-07
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<160> 342
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<170> PatentIn version 3.2
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<210> 1
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<211> 212
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<212> PRT
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<213> Haemophilus influenzae 
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<400> 1
3
4 
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<210> 2
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<211> 139
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<212> PRT
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<213> Pseudomonas stutzeri 
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<400> 2
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5 
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<210> 3
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<211> 59
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<212> PRT
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<213> Caulobacter crescentus 
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<400> 3
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6
7 
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<210> 4
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<211> 173
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<212> PRT
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<213> Escherichia coli 
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<400> 4
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8
9 
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<210> 5
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<211> 173
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<212> PRT
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<213> Escherichia coli 
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<400> 5
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10
11 
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<210> 6
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<211> 181
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<212> PRT
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<213> Echerichia coli 
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<400> 6
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12
13 
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<210> 7
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<211> 172
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<212> PRT
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<213> Echerichia coli 
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<400> 7
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14
15 
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<210> 8
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<211> 182
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<212> PRT
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<213> Echerichia coli 
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<400> 8
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16
17 
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<210> 9
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<211> 853
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<212> DNA
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<213> Echerichia coli 
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<400> 9
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18
19 
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<210> 10
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<211> 132
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<212> PRT
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<213> Bacteriófago Q-beta
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<400> 10
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20
21 
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<210> 11
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<211> 329
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<212> PRT
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<213> CP de Bacteriófago Q-beta
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<400> 11
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22
23
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<210> 12
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<211> 129
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<212> PRT
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<213> Bacteriófago R17
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<400> 12
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25 
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<210> 13
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<211> 130
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<212> PRT
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<213> Bacteriófago fr
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<400> 13
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26 
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<210> 14
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<211> 130
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<212> PRT
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<213> Bacteriófago GA
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<400> 14
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27 
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<210> 15
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<211> 132
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<212> PRT
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<213> Bacteriófago SP
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<400> 15
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28 
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<210> 16
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<211> 329
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<212> PRT
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<213> CP de Bacteriófago SP
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<400> 16
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29
30
31 
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<210> 17
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<211> 130
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<212> PRT
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<213> Bacteriófago MS2
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<400> 17
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32
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<210> 18
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<211> 133
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<212> PRT
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<213> Bacteriófago M11
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<400> 18
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34 
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<210> 19
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<211> 133
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<212> PRT
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<213> Bacteriófago MX1
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<400> 19
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35 
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<210> 20
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<211> 330
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<212> PRT
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<213> Bacteriófago NL95
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<400> 20
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (28)..(28)
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<223> Xaa puede representar cualquier aminoácido
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<220>
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163
164 
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> IL-5 de humano precursora
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165
166 
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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167
168 
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\hskip1cm
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<210> 242
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<223> Eotaxina-1 de humano
\newpage
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<210> 243
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 119
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Eotaxina-2 de humano
\newpage
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<400> 243
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171 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 244
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<211> 94
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<223> Human Eotaxin-3 de humano
\newpage
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172 
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<210> 245
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Eotaxina-1 de ratón
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<400> 245
\vskip1.000000\baselineskip
173
174 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 246
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 119
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Eotaxina-2 de ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 246
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176 
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 315
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 315
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
000 
\hskip1cm
3 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 316
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 316
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
000 
\hskip1cm
3 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 317
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 317
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
000 
\hskip1cm
3 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 318
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 318
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
000 
\hskip1cm
3 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 319
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 319
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
000 
\hskip1cm
3 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 320
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 320
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
000 
\hskip1cm
3 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 321
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 321
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
000 
\hskip1cm
3 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 322
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 322
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
000 
\hskip1cm
3 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 323
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 323
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
000 
\hskip1cm
3 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 324
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 324
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
000 
\hskip1cm
3 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 325
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 325
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
000 
\hskip1cm
3 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 326
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 326
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
000 
\hskip1cm
3 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 327
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 327
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
000 
\hskip1cm
3 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 328
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 132
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> C-IL-13-F de ratón
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 328
\vskip1.000000\baselineskip
177
178 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 329
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 119
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> C-IL-13-S de ratón
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 329
\vskip1.000000\baselineskip
179 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 330
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 133
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> C-IL-13-F de humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 330
\vskip1.000000\baselineskip
180 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 331
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 120
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> C-IL-13-S de humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 331
\vskip1.000000\baselineskip
181 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 332
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 136
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> C-IL-5-E de ratón
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 332
\vskip1.000000\baselineskip
182 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 333
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 134
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> C-IL-5-F de ratón
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 333
\vskip1.000000\baselineskip
183 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 334
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 121
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> C-IL-5-S de ratón
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 334
\vskip1.000000\baselineskip
184 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 335
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 138
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> C-IL-5-E de humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 335
\vskip1.000000\baselineskip
185
186 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 336
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 136
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> C-IL-5-F de humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 336
\vskip1.000000\baselineskip
187
188 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 337
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 123
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> C-IL-5-S de humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 337
\vskip1.000000\baselineskip
189
190 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 338
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador NheIL13-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 338
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctagctagcc gggccggtgc caagatc 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 339
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador NheIL13-R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 339
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tttctcgagg aaggggccgt ggcgaa 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 340
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador Spelinker3-F1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 340
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccccgccggg ttcttctggc ggtgctccgg ctagcatgga gattcccatg agcac 
\hfill
55 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 341
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador SpeNlinker3-F2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 341
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttttactagt tggttgcggc ggcccgaaac cgagcacccc gccgggttct tc 
\hfill
52 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 342
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador IL5StopXho-R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 342
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttttgcggcc gcgtttaaac tcgagttatt agccttccat tgcccactc 
\hfill
49

Claims (37)

1. Una composición que comprende:
(a) una partícula tipo virus de un fago de ARN, y
(b) al menos un antígeno o determinante antigénico, en donde dicho antígeno o dicho determinante antigénico es una proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina, y
en la que dicho al menos un antígeno o determinante antigénico está unido a dicha partícula tipo virus por al menos un enlace covalente no péptido.
\vskip1.000000\baselineskip
2. La composición según la reivindicación 1, en la que dicha partícula tipo virus es una partícula tipo virus recombinante.
3. La composición según la reivindicación 1, en la que dicha partícula tipo virus comprende proteínas recombinantes de un fago de ARN.
4. La composición según la reivindicación 3, en la que dicho fago de ARN se selecciona del grupo que consiste en:
(a) bacteriófago Q\beta;
(b) bacteriófago R17;
(c) bacteriófago fr;
(d) bacteriófago GA;
(e) bacteriófago SP;
(f) bacteriófago MS2;
(g) bacteriófago M11;
(h) bacteriófago MX1;
(i) bacteriófago NL95;
(k) bacteriófago f2;
(l) bacteriófago PP7; y
(m) bacteriófago AP205.
\vskip1.000000\baselineskip
5. La composición según la reivindicación 1, en la que dicha partícula tipo virus comprende proteínas recombinantes del fago de ARN Q\beta.
6. La composición según la reivindicación 1, en la que dicha partícula tipo virus comprende proteínas recombinantes del fago de ARN fr o del fago de ARN AP205.
7. La composición según la reivindicación 1, en la que dicho antígeno o determinante antigénico es una proteína o péptido de IL-5.
8. La composición según la reivindicación 7, en la que dicha proteína o péptido de IL-5 comprende, o alternativamente consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:
(a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:233;
(b) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:234; y
(c) la secuencia de aminoácidos de un fragmento de cualquiera de SEQ ID NO:233 o 234.
\vskip1.000000\baselineskip
9. La composición según la reivindicación 1, en la que dicho antígeno o determinante antigénico es una proteína o péptido de IL-13.
10. La composición según la reivindicación 9, en la que dicha proteína o péptido de IL-13 comprende, o alternativamente consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:
(a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:230;
(b) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:231; y
(c) la secuencia de aminoácidos de un fragmento de cualquiera de SEQ ID NO:230 o 231.
\vskip1.000000\baselineskip
11. La composición según la reivindicación 1, en la que dicho antígeno o determinante antigénico es una proteína o péptido de eotaxina.
12. La composición según la reivindicación 11, en la que dicha proteína o péptido de eotaxina comprende, o alternativamente consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:
(a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:242;
(b) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:243;
(c) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:244; y
(d) la secuencia de aminoácidos de un fragmento de cualquiera de SEQ ID NO:242, 243 o 244.
\vskip1.000000\baselineskip
13. La composición según la reivindicación 1, en la que dicha partícula tipo virus comprende al menos un primer sitio de unión y en la que dicho antígeno o determinante antigénico comprende además al menos un segundo sitio de unión seleccionado del grupo que consiste en:
(i) un sitio de unión que no ocurre naturalmente con dicho antígeno o determinante antigénico, y
(ii) un sitio de unión que ocurre naturalmente con dicho antígeno o determinante antigénico;
en la que dicho segundo sitio de unión es susceptible de asociación con dicho primer sitio de unión; y en la que dicho antígeno o determinante antigénico y dicha partícula tipo virus interactúan a través de dicha asociación para formar una disposición de antígenos ordenada y repetitiva.
\vskip1.000000\baselineskip
14. La composición según la reivindicación 13, en la que dicho antígeno o determinante antigénico es una proteína o péptido de IL-5, y en la que dicho antígeno o determinante antigénico con dicho al menos segundo sitio de unión comprende, o alternativamente consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:
(a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:335;
(b) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:336;
(c) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:337 y
(d) la secuencia de aminoácidos de un fragmento de cualquiera de las SEQ ID NO:335-337.
\vskip1.000000\baselineskip
15. La composición según la reivindicación 13, en la que dicho antígeno o determinante antigénico es una proteína o péptido de IL-13, y en la que dicho antígeno o determinante antigénico con dicho al menos segundo sitio de unión comprende, o alternativamente consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:
(a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:330;
(b) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:331 y
(c) la secuencia de aminoácidos de un fragmento de SEQ ID NO:330 o 331.
\vskip1.000000\baselineskip
16. La composición según la reivindicación 1, en la que dicho antígeno o determinante antigénico es una proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina que comprende al menos un sitio antigénico de una proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina.
17. La composición según la reivindicación 13, en la que dicho primer sitio de unión es un residuo de lisina.
18. La composición según la reivindicación 13, en la que dicho segundo sitio de unión comprende un grupo sulfhidrilo o un residuo de cisteína.
19. La composición según la reivindicación 13, en la que dicho primer sitio de unión es un residuo de lisina y dicho segundo sitio de unión es un residuo de cisteína.
20. Una composición farmacéutica que comprende:
(a) la composición según la reivindicación 1; y
(b) un excipiente farmacéuticamente aceptable.
\vskip1.000000\baselineskip
21. Una composición de vacuna que comprende:
(a) una partícula tipo virus de un fago de ARN, y
(b) al menos un antígeno o determinante antigénico, en donde dicho antígeno o dicho determinante antigénico es una proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina; y
en la que dicho al menos un antígeno o determinante antigénico está unido a dicha partícula tipo virus por al menos un enlace covalente no péptido.
\vskip1.000000\baselineskip
22. La composición de vacuna según la reivindicación 21, que comprende además un adyuvante.
23. La composición de vacuna según la reivindicación 21, en la que dicha partícula tipo virus comprende proteínas recombinantes de un fago de ARN.
24. La composición de vacuna según la reivindicación 21, en la que dicha partícula tipo virus comprende proteínas recombinantes del fago de ARN Q\beta, del fago de ARN fr o del fago de ARN AP205.
25. Un proceso para producir una composición según la reivindicación 1, que comprende:
(a) proporcionar una partícula tipo virus de un fago de ARN;
(b) proporcionar al menos un antígeno o determinante antigénico, en donde dicho antígeno o dicho determinante antigénico es una proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina; y
(c) combinar dicha partícula tipo virus y dicho al menos un antígeno o determinante antigénico de manera que dicho al menos un antígeno o determinante antigénico se une a dicha partícula tipo virus por al menos un enlace covalente no péptido.
\vskip1.000000\baselineskip
26. La composición según la reivindicación 1, para uso como medicamento.
27. Uso de una composición según la reivindicación 1, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades eosinofílicas alérgicas.
28. Una composición que comprende:
(a) al menos una primera partícula de núcleo y al menos una segunda partícula de núcleo, cada una con al menos un primer sitio de unión, en donde dicha al menos una primera partícula de núcleo y/o dicha al menos una segunda partícula de núcleo es una partícula tipo virus de un fago de ARN, y
(b) al menos un primer antígeno o determinante antigénico y al menos un segundo antígeno o determinante antigénico, cada uno con uno o más segundos sitio de unión;
en la que dicho al menos un primer antígeno o determinante antigénico y dicho al menos un segundo antígeno o determinante antigénico se selecciona de una proteína o péptido de IL-5, IL-13 o eotaxina, y en la que dicho segundo sitio de unión se selecciona del grupo que consiste en:
(i) un sitio de unión que no ocurre naturalmente con dicho antígeno o determinante antigénico, y
(ii) un sitio de unión que ocurre naturalmente con dicho antígeno o determinante antigénico;
en la que dicho segundo sitio de unión es susceptible de asociación con dicho primer sitio de unión; y en la que dicho al menos un primer antígeno o determinante antigénico y dicho al menos un segundo antígeno o determinante antigénico y dicha al menos una primera partícula de núcleo y/o dicha al menos una segunda partícula de núcleo interactúan a través de dicha asociación para formar disposiciones de antígenos ordenadas y repetitivas.
\vskip1.000000\baselineskip
29. La composición según la reivindicación 28, en la que dicho al menos un primer antígeno o determinante antigénico es una proteína o péptido de IL-5, y dicho al menos un segundo antígeno o determinante antigénico es una proteína o péptido de IL-13.
30. La composición según la reivindicación 28, en la que dicha al menos una primera partícula de núcleo y dicha al menos una segunda partícula de núcleo es una partícula tipo virus recombinante.
31. La composición según la reivindicación 30, en la que dicha al menos una primera partícula de núcleo y dicha al menos una segunda partícula de núcleo es la misma partícula tipo virus recombinante.
32. La composición según la reivindicación 31, en la que dicha partícula tipo virus comprende proteínas recombinantes de un fago de ARN.
33. La composición según la reivindicación 32, en la que dicho fago de ARN se selecciona del grupo que consiste en:
(a) bacteriófago Q\beta;
(b) bacteriófago R17;
(c) bacteriófago fr;
(d) bacteriófago GA;
(e) bacteriófago SP;
(f) bacteriófago MS2;
(g) bacteriófago M11;
(h) bacteriófago MX1;
(i) bacteriófago NL95;
(k) bacteriófago f2;
(l) bacteriófago PP7; y
(m) bacteriófago AP205.
\vskip1.000000\baselineskip
34. La composición de la reivindicación 5, en la que dichas proteínas recombinantes de fago de ARN Q\beta comprenden, o alternativamente consisten esencialmente en, o alternativamente consisten en, proteínas de recubrimiento que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10.
35. Una composición de acuerdo con las reivindicaciones 1-19 o 28-34, para uso en un método de inmunización que comprende administrar dicha composición a un animal o un humano.
36. La composición para uso según la reivindicación 35, en la que dicho antígeno o determinante antigénico es un antígeno del propio organismo.
37. La composición de la reivindicación 36, en la que dicho animal es un humano y en la que dicho antígeno o dicho determinante antigénico es una proteína o péptido de IL-5 humano, IL-13 humano o eotaxina humana.
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