JP2009132689A - 分子抗原アレイ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】分子生物学、ウイルス学、免疫学及び医学の分野における、正しく規則正しく繰り返えされた抗原又は抗原決定基アレイを含んでなる組成物の開発。および、正しく規則正しく繰り返えされたアレイでの抗原又は抗原決定基を製造する工程の開発。
【選択図】なし
Description
(発明の分野)
本発明は、分子生物学、ウイルス学、免疫学及び医学の分野に関連する。本発明は、規則正しく繰り返された抗原又は抗原決定アレイを含んでなる組成物を提供する。本発明は、また、規則正しく繰り返されたアレイにおける抗原又は抗原決定基を製造する工程を提供する。規則正しく繰り返された抗原又は抗原決定基は、感染症の治療、アレルギー症の治療のためのワクチンの製造にとって、そして癌を予防又は治療、及び自己特異的免疫応答、特に抗体応答を効率的に誘導するファーマシーンとして有用である。
国際公開00/3227は、規則正しく繰り返された抗原又は抗原決定基アレイの製造に関する組成物及び工程を記載する。その組成物は、感染症の予防、アレルギー症の治療、そして癌の治療のためのワクチンの製造にとって有用である。その組成物は、ウイルス又はウイルス様粒子のようなコア粒子を含み、それの少なくとも1つの抗原又は1つの抗原決定基は、規則正しく繰り返された抗原アレイにつながる少なくとも1つの非ペプチド結合によって結合している。
免疫寛容性のために、自己分子に対する免疫応答を誘導することは一般的に困難である。特に、自己分子に特異性を有するリンパ球は、典型的なワクチン接種の手法によって誘導した場合は、通常は低又は非応答性でさえある。
アルツハイマー疾患のマウスモデルでは、Aβ1-42(PDAPP-マウス)を産するように操作したトランスジェニック動物は、その脳でプラーク及び神経損傷を発症する。最近の研究によって、Aβ1-42を用いた若いPDAPP-マウスの免疫化がプラーク形成及び併発するジストロフィー神経炎の阻害を引き起こしたことを示している(Schenk, D. ら., Nature 400:173-77(1999))。
精製タンパク質のみの投与は、通常は、強力な免疫応答を誘導するのに十分ではないことは十分に立証されたことである;単離された抗原は、一般的に、アジュバントと呼ばれる補助物質とともに与えられるべきである。これらアジュバントを伴うことで、投与抗原は急激な分解に対して保護され、このアジュバントは伸張した抗原の低レベルの遊離を提供する。
本発明は、高度に規則正しく繰り返された抗原又は抗原決定基を含む組成物、並びにそれらの生産及び用途に関する工程を提供する。従って、本発明の組成物は、感染症の予防、アレルギー症及び癌の治療にとって、そして自己免疫応答、特に抗体応答を効率的に誘導するのに有用である。
本発明の好ましい実施態様では、コア粒子は、好ましくは、a)バクテリオファージQβ;b)バクテリオファージR17;c)バクテリオファージfr;d)バクテリオファージGA;e)バクテリオファージSP;f)バクテリオファージMS2; g)バクテリオファージM11;h)バクテリオファージMX1;i)バクテリオファージNL95;k)バクテリオファージf2;及びバクテリオファージPP7から成る群から選択されるRNAファージの組み換えタンパク質を含むウイルス様粒子である。
本発明のさらに好ましい実施態様では、RNAファージの組み換えタンパク質は、コートタンパク質を含む。
さらにその他の実施態様では、コア粒子は、1又は複数の肝炎コア(キャプシド)タンパク質(HBcAgs)を含むか、又はそれから成る。関連する実施態様では、これらHBcAgsの1又は複数のシステイン残基は、その他のアミノ酸残基(例えば、セリン残基)によって欠失又は置換のいずれかがなされている。特定の実施態様では、配列番号:134のアミノ酸残基48及び107に一致する本発明の組成物を調製するために利用したHBcAgのシステイン残基は、その他のアミノ酸残基(例えば、セリン残基)によって欠失又は置換のいずれかがなされている。
その他の実施態様では、非天然分子骨格は、ピリンタンパク質から製造又は細菌から収集したかのいずれかである線毛又は線毛様構造を含むか、あるいはそれから成る。線毛又は線毛様構造が本発明の組成物を調製するのに利用された場合、それらは、天然には細菌細胞の常在するが、遺伝子工学的(例えば、相同組み換え)によって改良された線毛遺伝子、又はそれら細胞へ導入された線毛遺伝子の産物から形成され得る。
関連する実施態様では、コア粒子は、線毛タンパク質から調製されるか、又は細菌から収集されるかのいずれかである線毛又は線毛様構造を含むか、あるいはそれから成る。これらコア粒子は、天然に細菌細胞に常在する線毛遺伝子の産物から形成され得る。
前記の一般的な説明と以下の詳細な説明の双方が、単に例示的で説明的であり、主張された本発明のさらなる説明を提供するように意図されていることは、理解されるべきである。
本発明は、また、バクテリオファージQβコートタンパク質とホスホリパーゼA2タンパク質が相互作用して抗原アレイを形成する、バクテリオファージQβコートタンパク質及びホスホリパーゼA2タンパク質を混合させることを含む組成物の製造の方法を提供する。
本発明は、ホスホリパーゼA2タンパク質、及び薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物をも提供する。本発明は、ホスホリパーゼA2タンパク質を含むワクチン組成物をも提供する。好ましい実施態様では、請求項31のワクチン組成物は、少なくとも1つのアジュバントをさらに含む。
本発明は、ハチ毒に対するアレルギーを治療する方法をも提供し、それは、薬学的組成物又は被検者に対するワクチン組成物を投与することを含む。そのような投与の結果、被検者は、低下した毒に対する免疫応答を示す。
1.定義
アルファウイルス:ここで用いられているように、「アルファウイルス」という用語を、アルファウイルス属に含まれる任意のRNAウイルスと呼ぶ。この属のメンバーの記載は、Strauss and Strauss, Microbiol. Rev., 58: 491-562 (1994)にある。アルファウイルスの例には、アウラウイルス、ベバルウイルス、カバッソウウイルス、チクングニヤウイルス、東部部馬脳髄膜炎ウイルス、フォート・モルガンウイルス、ゲタウイルス、クズイルガチャウイルス、マヨアロウイルス、ミドルバーグウイルス、ムカンボウイルス、ヌドゥムウイルス、ピクスナウイルス、トネテウイルス、トリニティウイルス、ウナウイルス、西部部馬脳髄膜炎ウイルス、ワタロアウイルス、シンドビスウイルス(SIN)、セムリキ森林熱ウイルス(SFV)、ベネズエラ馬脳脊髄炎(VEE)、及びロス・リバーウイルスが含まれる。
開示された発明は、規則正しく繰り返された抗原又は抗原決定基アレイを含む組成物を提供する。さらには、本発明は、実施者が、感染症の予防、アレルギーの治療及び癌の治療を含む種々の治療目的のために、規則正しく繰り返された抗原又は抗原決定基アレイを構築することを都合良く可能にする。
本発明の組成物は、2個の要素:(1)非天然分子骨格;及び(2)少なくとも第1の付着部位への非ペプチド結合を介する結合が可能な、少なくとも1つの第2の付着部位を有する抗原又は抗原決定基、を基本的に含むか、又は代替的にそれらで構成される。
本発明の組成物は、抗原又は抗原決定基が直接に結合している細菌線毛タンパク質をも含むか、又は代替的にそれで構成される。
本発明の組成物は、抗原又は抗原決定基が直接に結合しているコア粒子をも含むか、又は代替的にそれで構成される。
本発明は、少なくとも1つの非ペプチド結合を介する第2の付着部位の第1の付着部位との結合による規則正しく繰り返された抗原アレイを提供する。従って、抗原又は抗原決定基及び非天然分子骨格は、規則正しく繰り返された抗原アレイを形成する第1と第2の付着部位の結合を介して集合する。
本発明のある組成物の1つの要素は、コア粒子及びオーガナイザーを含むか、又は代替的にそれらで構成される非天然分子骨格である。ここで用いられているように、成句「非天然分子骨格」は、第1の付着部位の強固な反復性アレイを提供することを担い得る、ヒトの手によって作製された任意の産物を指す。より具体的には、非天然分子骨格は、(a)(1)非天然起源のコア粒子、及び(2)天然起源のコア粒子で構成される群から選択されるコア粒子;そして(b)オーガナイザーが、少なくとも1つの共有結合によって前記コア粒子と結合している、少なくとも第1の付着部位を含むオーガナイザーを含むか、又は代替的にそれらで構成される。
CGGRIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMNHVGC(配列番号:59)
この例では、抗原上の予想される第2の付着部位は、FOSロイシンジッパータンパク質ドメインであり、そのアミノ酸配列は次の通りである:
CGGLTDTLQAETDQVEDEKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAHGGC(配列番号:60)
ある環境下では(例えば、抗原又は抗原決定基を非天然分子骨格へ付着させるのに、ヘテロ二価性架橋剤を用いた場合)、HBcAgの遊離のシステイン残基の存在は、不確定種を形成するための単量体の架橋だけでなく、毒素成分のコア粒子への共有カップリングにつながると信じられている。
及びUV光へ曝すことによるヌクレオチドとの反応が含まれる。従って、特に、HBcAgが核酸と結合する強い傾向を有することを考えると、毒素付加物が生成されるであろう。広範囲にわたる分子量を有する産物の分布が生じるので、遊離のシステイン及びヘテロ二価性剤を含有するHBcAgsを利用して調製したキャプシドを用いての、抗原キャプシドコンジュゲートでのそのような毒素産物の検出は困難であろう。従って、毒素付加物は、様々な種の間に分布するであろうし、その個々は、それぞれ低濃度で存在するが、一緒になると毒素のレベルに達する。
本発明には、上記の非天然分子骨格の調製のための変異体HBcAgsを用いるワクチン組成物を利用する方法だけでなく、ワクチン組成物を含む。
下記の実施例31に設定されているように、溶剤が接触可能な位置48及び107のシステイン残基は、例えば、部位特異的変異法によって取り除くことが可能である。さらには、本発明によって構築した、実施例31に記載のCys-48-Ser、Cys-107-Ser HBcAg二重変異体が大腸菌で発現が可能であることが見出された。
本発明の実施の用途に適したHBcAgは、N末端切断変異体も含む。適した切断変異体は、N末端から1,2,5,7,9,10,12,14,15,又は17アミノ酸が取り除かれた修飾HBcAgを含む。
本発明は、さらに、上に記載の切断変異体と少なくとも80%、85%、90%、95%、97%、又は99%同一であるアミノ酸配列を含むか、あるいはそれから成るHBcAgポリペプチドを含むワクチン組成物を含む。
一実施態様では、本発明は、C末端へ融合させた配列番号:154のアミノ酸残基227から276の配列を有するGCN4ポリペプチドを有するHBcAg、又はその断片を含むHBcAg融合タンパク質を用いて調製したワクチン組成物を提供する。このGCN4ポリペプチドは、HbcAgのN末端へも融合させてもよい。
本発明の実施に用いるのに適した細菌線毛又は線毛サブ部分は、通常は、結合して非天然分子骨格を形成することができる。
その他の実施態様では、線毛又は線毛様構造は細菌から収集され、本発明のワクチン組成物を形成するのに用いられる。ワクチン組成物を調製するのに適した線毛の一例は、大腸菌の1型であり、それは、配列番号:146に設定されているアミノ酸配列を有する線毛単量体から形成される。
一度収集されると、線毛又は線毛様構造は、種々の方法で修飾することができる。例えば、第1の付着部位は、抗原又は抗原決定基が第2の付着部位を介して付着することができる線毛へ添加することが可能である。言い換えると、細菌線毛又は線毛様構造は、収集して非天然分子骨格を形成するように修飾することができる。
細菌細胞に天然に存在する線毛遺伝子は、インビボで修飾(例えば、相同組み換え)することができるか、又は特定の特徴を有する線毛遺伝子は、これら細胞へ挿入することができる。例えば、線毛遺伝子は、複製可能なクローニングベクター又は細菌の染色体へ挿入するベクターのいずれかの成分として、細菌細胞へ導入することが可能である。この挿入された線毛遺伝子は、発現制御コントロール配列とも連結することができる(例えば、lacオペレーター)。
我々は、変化する抗原密度を有する丈夫な抗原アレイの形成を可能にする新規で本発明の組成物を記載する。我々は、通常に他のVLPsで得られるよりも、より高いエピトープ密度が達成できることを示した。我々は、また、適切な間隔による幾つかの抗原の同時表示を有する組成物、及び適切で所望される方法で可溶性を高めるか、又はキャプシドを修飾する、付属分子の付加である組成物を開示する。
N末端ガンマ1:CGDKTHTSPP
C末端ガンマ1:DKTHTSPPCG
N末端ガンマ3:CGGPKPSTPPGSSGGAP
C末端ガンマ3:PKPSTPPGSSGGAPGGCG
N末端グリシンリンカー:GCGGGG
C末端グリシンリンカー:GGGGCG)
抗原のVLPsへの付着で特に好まれる方法、特に、RNAファージコートタンパク質のキャプシドは、RNAファージコートタンパク質のキャプシドの表面上のリジン残基を抗原上のシステイン残基へ連結させることである。第2の付着部位として効果的あるためには、スルフヒドリル基がカップリングにとって利用可能であるべきである。従って、システイン残基は、その還元状態にあるべきであり、遊離のスルフヒドリル基を有する遊離のシステイン又はシステイン残基が利用可能でなければならない。システイン残基が第2の付着部位として機能する場合は酸化状態であり、例えば、それがジスルフィド架橋を形成するならば、例えば、DTT、TCEP又はβ-メルカプトエタノールによるこのジスルフィド架橋の還元が必要である。
さらなる実施態様では、我々は、抗原の高密度アレイを得ることに適した、付加的なリジン残基を有するQβ変異体コートタンパク質を開示する。
さらに、本発明の範囲内に含まれるのは、本発明のワクチン組成物を調製するのに利用されるタンパク質をコードする核酸分子である。
本発明には、従って、配列アレイを形成するタンパク質から調製されるワクチン組成物、個々のタンパク質サブユニットからワクチン組成物を調製する方法、これら個々のタンパク質サブユニットを調製する方法、これらサブユニットをコードする核酸分子、そして、本発明のワクチン組成物を用いて、個体をワクチン接種及び/又は免疫応答を刺激する方法が含まれる。
本発明の組成物の二番目のエレメントは、少なくとも1つの非ペプチド結合を介した非天然分子骨格の第1の付着部位への結合が可能な、少なくとも1つの第2の付着部位を有する抗原又は抗原決定基である。本発明は、所望する治療効果の考慮において選択された抗原又は抗原決定基に従って変化する組成物を提供する。他の組成物は、第2の付着部位のために選択した分子を変化させることによって提供される。
本発明の抗原は、次から成る群から選択することができる:(a)癌細胞に対する免疫応答を誘導するのに適したタンパク質;(b)感染症に対する免疫応答を誘導するのに適したタンパク質;(c)アレルギーに対する免疫応答を誘導するのに適したタンパク質、(d)家畜の免疫応答を誘導するのに適したタンパク質、及び(e)(a)-(b)に設定されたいずれかの断片(例えば、ドメイン)。
組成物調製及びアレルギーの治療法に用いる抗原又は抗原決定基の選択は、そのような疾患を治療する医学分野の熟練者に知られている。そのような抗原又は抗原決定基の代表例は次を含む:ハチ毒ホスホリパーゼA2、Bet v I(カバノキ花粉アレルゲン)、5 Dol m V(白いススメバチアレルゲン)、メリチン及びDer pI(ハウスダストダニアレルゲン)、並びに免疫学的応答を誘発するのに利用できる各断片。
アンギオテンシンIは、腎臓由来の酵素レニンによってアンジオテンシノーゲン(14aa)から切断される。それは、さらに、生物学的に活性な8aaのアンギオテンシンIIへと、アンギオテンシン変換酵素(ACE)によってN末端が切断される。このペプチドは、血管収縮及びアルドステロン遊離へつながるアンギオテンシンレセプターATII及びAT2へ結合する。
本発明の特定の実施態様では、(a)HIVの組み換えタンパク質、(b)インフルエンザウイルスの組み換えタンパク質(例えば、インフルエンザウイルスM2タンパク質又はその断片)、(c)C型肝炎ウイルスの組み換えタンパク質、(d)トキソプラズマの組み換えタンパク質、(e)熱帯マラリア原虫の組み換えタンパク質、(f)3日熱マラリア病原虫の組み換えタンパク質、(g)卵形マラリア原虫の組み換えタンパク質、(h)四日熱マラリア原虫の組み換えタンパク質、(i)乳癌細胞の組み換えタンパク質、(j)腎臓癌細胞の組み換えタンパク質、(k)前立腺癌細胞の組み換えタンパク質、(l)皮膚癌細胞の組み換えタンパク質、(m)脳癌細胞の組み換えタンパク質、(n)白血病細胞の組み換えタンパク質、(o)組み換え体プロファイリング、(p)ハチアレルギーの組み換えタンパク質、(q)木の実アレルギーの組み換えタンパク質、(r)食物アレルギーの組み換えタンパク質、(s)喘息の組み換えタンパク質、(t)クラミジアの組み換えタンパク質、そして(u)(a)-(t)に設定した任意のタンパク質の断片から成る群から選択される。
本発明の1つの実施態様では、第2の付着部位は、FOSロイシンジッパータンパク質ドメイン又はJUNロイシンジッパータンパク質ドメインであり得る。
幾つかのFOS融合コンストラクトは、模範的に提供されている。ヒト成長ホルモン(実施例4)、ハチ毒ホスホリパーゼA2(PLA2)(実施例9)、オボアルブミン(実施例10)及びHIV gp140(実施例12)。
1.pAV1:このベクターは、C末端でFOSと融合したタンパク質の大腸菌細胞膜周辺腔への分泌のために設計された。対象である遺伝子(g.o.i)を、ベクターのStuI/NotI部位にライゲーションしてもよい。
2.pAV2:このベクターは、N末端でFOSと融合したタンパク質の大腸菌細胞膜周辺腔への分泌のために設計した。対象である遺伝子(g.o.i)を、ベクターのNotI/EcoRV(又はNotI/HindIII)部位にライゲーションした。
3.pAV3:このベクターは、大腸菌における、C末端でFOSと融合したタンパク質の細胞質生産のために設計した。対象である遺伝子(g.o.i)を、ベクターのEcoRV/NotI部位にライゲーションしてもよい。
4.pAV4:このベクターは、大腸菌における、N末端でFOSと融合したタンパク質の細胞質生産のために設計した。対象である遺伝子(g.o.i)を、ベクターのNotI/EcoRV(又はNotI/HindIII)部位にライゲーションしてもよい。N末端メチオニン残基は、タンパク質合成の際にタンパク質分解されて取り除かれた(Hirelら., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8247-8251(1989))。
5.pAV5:このベクターは、C末端でFOSと融合したタンパク質の真核生物での生産のために設計された。対象である遺伝子(g.o.i)は、ベクターEco47III/NotI部位へのライゲーションによって、hHGシグナル配列とFOSドメインをコードする配列の間に挿入されてもよい。それに代わって、そのシグナル配列を含有する遺伝子を、StuI/NotI部位へのライゲーションによってFOSコード化領域へ融合させてもよい。
6.pAV6:このベクターは、N末端でFOSと融合したタンパク質の真核生物での生産のために設計された。対象である遺伝子(g.o.i)を、ベクターのNotI/StuI(又はNotI/HindIII)部位へライゲーションさせてもよい。
PLA2ペプチド(例えば、上記の完全長PLA2タンパク質、並びに各サブ部分)も、規則正しく繰り返された抗原アレイの形成を可能にする任意の基質(例えば、その断片のQβキャプシドタンパク質)とカップリングすることができる。
本発明のその他の側面では、本発明は、「自己」遺伝子産物によって生じるか、又は悪化する症状を治療すること及び/又は予防することに、特に適した組成物を提供する。
骨では、RANKが破骨細胞前駆体で発現する一方で、RANKLは間質細胞又は骨芽細胞で発現する。RANKとRANKLの相互作用は、破骨細胞前駆体の成熟破骨細胞への発生にとって重要である。この相互作用は、破骨細胞形成阻害因子によって阻止される可能性がある。
さらに、OPGの注入によって破棄することができるOPGノックアウトマウスにおいて、動脈石灰化が観察された(Minら., J. Exp. Med. 4: 463 (2000))。アジュバンド誘導による関節炎では、OPG注入は、骨損失及び軟骨破壊を防ぐことができるが、炎症(手(足)の腫れ)を防ぐことはできない。活性化T細胞がRANKL媒介による破骨細胞形成及び骨損失につながると考えられている。OPGは、マウスの骨において、前立腺癌誘導破骨細胞形成を阻害し、前立腺腫瘍の成長を防ぐ。OPGは、マウスにおける、進行した骨癌の痛みを消失させる。
上の発見は、IL-17が炎症反応の開始又は維持において中心的な役割を担う可能性があることを示唆している(Jovanovic, D. V.ら, J. Immunol. 160: 3513-3521(1998))。
IL-5の生物学的機能は、幾つかの研究で示されており(Coffman R.L.ら, Science 245: 308-10(1989);Kopfら, Immunity 4:15-24(1996))、それらは、好酸球を介して媒介される疾患でのIL-5機能を阻害することの有益な効果に関する。IL-5の作用の阻害は、従って、喘息及び好酸球に関連する他の疾患に対する治療方法を提供する。
本発明の好ましい実施態様では、遊離システインを有するペプチドリンカーが、IL-5の加工形態の配列のN末端に加えられている。遊離システインを有するリンカーの付加は、また、好ましくは、scIL-5の加工形態の配列のN末端で予見される。さらに好ましい実施態様では、遊離システインを有するアミノ酸リンカーは、加工タンパク質の配列に一致する配列のN末端へ融合しているか、又は、シグナルペプチドのC末端側でタンパク質の成熟型の配列のN末端に挿入されている。
再びさらなる好ましい実施態様では、遊離システインを有するリンカーは、IL-5の配列のC末端か、又はscIL-5配列のC末端へ融合している。
実施例10は、IL-5配列が、そのN末端で、VLPs及び線毛とのカップリングのために、システイン残基を有するアミノ酸リンカーと融合している、マウスIL-5コンストラクトの発現を記載している。ヒトコンストラクトは、実施例10の教示に基づいて作製することが可能であり、VLPs及び線毛へのカップリングに適しており、本発明の好ましい実施態様につながるタンパク質ヒトC-IL-5-E(配列番号:335)、ヒトC-IL-5-F(配列番号:336)及びヒトC-IL-5-S(配列番号:337)を産することが可能である。
マウスCCL21は、ヒト肺癌SCIDマウスモデルの腫瘍及び血管形成(Arenbergら, Cancer J. Immnol. Immunother. 49: 587-92(2001))、及びマウスの結腸癌腫瘍モデル(Vicariら, Immunol. 165:1992-2000(2001))を阻害する。マウスCCL21の血管形成活性は、ラット角膜マイクロポケットアッセイでも検出された(Sotoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8205-10(1998))。
分泌されるCCL21は、マウス及びヒトのそれぞれで110又は111aaで構成されている。それぞれの配列は、配列番号:236(Swissprot:SY21_ヒト)及び配列番号:237(Swissprot:SY21_マウス)に示されている。他のCCサイトカインとは対照的に、CCL21は、伸張領域内のC末端にさらに2つのシステインを有する。すべてのシステインがジスルフィド結合に関わっていると考えられる。
関連する好ましい実施態様では、抗原決定基は、現在はCXCL21と呼ばれているストローマ由来因子-1(SDF-1)である。CXCL21は、骨髄ストローマ細胞によって産生されるケモカインであり、最初は、プレB細胞の刺激因子として同定された。
上ですでに論じたように、ケモカインレセプターCCR7及びCXCR4は、乳癌細胞ではアップレギュレーションされており、それぞれのリガンドであるCCL21及びSDF-1は、乳癌転移の最初の目標を示す臓器で高発現している(Mullerら Nature 410:50-6(2001))。インビトロでのSDF-1/CXCR4媒介走化性は、抗SDF-1及び抗CCL21抗体を中和することによって阻害することが可能である。
SDF-1/CXCR4ケモカインレセプター対は、より初期の造血性前駆体細胞の骨髄への帰巣の効率を高めることが示されている。さらには、CXCR4及びSDF-1は、慢性リンパ球性白血病細胞の分布に影響すると予想されている。これらの細胞は、患者の骨髄へつねに侵入しており、骨髄でのそれらの遊走がCXCR4に依存することが示された。慢性リンパ球性白血病細胞は、ストローマ細胞と同時培養されないならば、アポトーシスを起こす。SDF-1阻止抗体は、ストローマ細胞のこの保護的効果を阻害することができる(Burgerら, Blood 96:2655-63(2000))。従って、CXCL12に対する免疫化は、慢性リンパ球性白血病に対する治療法を提供する。
SDF-1-CXCR4相互作用がリウマチ様関節炎滑膜でのCD4+T細胞蓄積で中心的な役割を担うことも報告されている(Nankiら, 2000)。SDF-1に対する免疫化は、従って、リウマチ様関節炎に対する治療方法を提供する。
アラニンスキャンニング突然変異誘発は、SDF-1上のレセプター結合部位(その一部分)を同定するのに利用され(Ohnishiら, J. Interferon Cytokine Res. 20:691-700(2000))、Elisseevaら(J. Biol. Chem. 275:26799-805(2000))及びHevekerら(Curr. Biol. 8: 369-76(1998))は、レセプター結合(及びHIV侵入)を阻害するSDF-1由来ペプチドを記載している。
ニワトリ胎児線維芽細胞におけるセンダイウイルス系でのSDF-1の発現(Moriyaら, FEBS Letter. 425: 105-11(1998))は、大腸菌での発現(Holmesら, Prot. Expr. Purif. 21:367-77(2001))及びSDF-1の化学合成(Dealwisら, PNAS 95:6941-46(2001))と同じように記載されている。
BLCと相同性のあるIL-8では、N及びC末端は遊離している。さらに好ましい実施態様では、第2の付着部位としてシステイン残基を有するアミノ酸リンカーの付加は、よって、本発明の具体的な組成物の作製のために、BLCのN末端へ成される。
ヒト配列は、配列番号:247(寄託番号:NP_000748)に示されている。本発明のさらに好ましい抗原決定基は、レセプターの可溶化型と一致する配列番号:247の残基33-181又は33-185から成るN末端断片を含む。
マウス配列(寄託番号NP_031804)は、配列番号:248に示されている。成熟配列は、アミノ酸33から始まる。従って、本発明に基づく好ましい抗原決定基は、アミノ酸33-181又は33-185を含む。
レジスチン(Res)は、およそ12KDの114aaのペプチドホルモンである。それは、11のシステインを有し、その中の最もN末端側にある1つは、タンパク質の二量体化を担い、その他の10個は、分子内ジスルフィド結合に関わっていると考えられている(Banerjee及びLazar, J. Biol. Chem. 276: 25970-3(2001))。最初のシステインをアラニンへ変える変異は、mResの二量体化を損なう。
他の実施態様では、抗原決定基はリンホトキシン-βである。リンホトキシン-βに対する免疫化は、プリオンが媒介する疾患の治療に有用である。スクレピー(プリオン媒介疾患)剤複製は、主にリンパ系組織で起こると考えられ、プリオン-タンパク質を発現する濾胞性樹状細胞(FDCs)に依存することが示された(Brownら, Nature Med. 11: 1308-1312(1999))。機能性濾胞性樹状細胞を欠くマウスが、脾臓で正常に機能しないプリオン複製及び神経侵入のわずかな遅延を示すことが後に示された(Montrasioら, Science 288: 1257-1259(2000))。これは、マウスへ可溶性リンホトキシン-βレセプター-Fc-融合タンパク質(LTβR-Fc)を注入することによって達成された。この可溶性レセプターコンストラクトは、T,B又はNK細胞上のリンホトキシン-βのFDCレセプター上のリンホトキシン-βレセプターとの重要な相互作用を妨害することによって、FDCsの発生を阻害する。従って、リンホトキシン-β(TNFγとも呼ばれている)に対するワクチン接種は、クロイツフェルト・ヤコブ病(変異型)又は他のプリオン媒介疾患の治療又は予防のためのワクチンを提供することができ、それによってプリオン複製及び神経侵入を防ぐ。
ヒトリンホトキシン-βの細胞外ドメインの配列は、配列番号:250(TNFC_ヒト)に示されており、マウスリンホトキシン-βの細胞外ドメインの配列は、配列番号:251(TNFC_マウス)に示されている。
以下のマウスペプチドは、TNF-αの活性を中和する抗体が結合していることが示され(Yoneら J. Biol. Chem. 270: 19509-19515)、さらに好ましい実施態様では、VLPs、バクテリオファージ又は細菌線毛とカップリングするためのシステイン残基で修飾されているヒトペプチドへのマウス相同体である。
3' TNF IIペプチド:配列GGCを、成熟マウスTNF-αのアミノ酸残基4-22で構成されるエピトープのC末端へ融合させ、グルタミン21をグリシンへ変異させた。その結果として生じたペプチドの配列は:SSQNSSDKPVAHVVANHGVGGCである。
5' TNF IIペプチド:システイン残基を、成熟マウスTNF-αのアミノ酸残基4-22で構成されるエピトープのN末端へ融合させ、グルタミン21をグリシンへ変異させた。その結果として生じたペプチドの配列は:CSSQNSSDKPVAHVVANHGVである。
本発明は、ここで記載されている抗原又は抗原決定基のミモトープを有する組成物をさらに含む。
本発明の具体的な組成物は、抗体、又は、好ましくは、前記抗体に対する免疫応答の誘導のためのウイルス様粒子又は線毛上に存在する抗体断片を含む。リンパ腫細胞によって産生される抗体又は抗体断片は、リンパ腫に対する保護的免疫応答を誘導するためのウイルス様粒子への付着のために選択することができる。
抗体又は抗体起源のVLP又は線毛へのカップリングは、露出しているジスルフィド架橋の限定的還元によって(Fab断片のCH1とCκ又はCλの間の鎖間ジスルフィド架橋の例)、又は、抗体又は抗体断片のC末端の遊離のシステイン残基を有するリンカーの融合によって達成される。さらに好ましい実施態様では、遊離のシステイン残基を有するリンカーは、VLP又は線毛タンパク質への付着のために、抗体又は抗体断片のN末端へ融合している。
本発明は、ここに記載の抗原又は抗原決定基のミモトープを有する組成物をさらに含む。
本発明のワクチン組成物に用いるのに適したミモトープは、直鎖又は環状ペプチドであってもよい。直鎖又は環状のペプチドであるミモトープは、ペプチド結合ではない結合によって、非天然分子骨格又はコア粒子と連結することができる。
そのような免疫学的応答を誘発するのに利用できるペプチドには、タンパク質、タンパク質分子、IgE分子のドメイン、及びIgE分子に対する特異性を有する抗体の産生を誘発することが可能なミモトープが含まれる。一般的に、ワクチン組成物を調製するのに利用できるIgE分子の一部分は、組成物が投与される種のIgE分子に由来する。例えば、ヒトへの投与が意図されるワクチン組成物は、しばしは、ヒトIgE分子の1又はそれより多い部分、及び/又はヒトIgE分子に対する免疫学的応答を誘発することが可能な1又はそれより多いミモトープを有する。
さらなる具体的な実施態様では、本発明のワクチン組成物は、少なくとも、特定の抗原に対して特異性を有する抗体の産生を生じる免疫応答を誘発することが可能な1つのエピトープを有する。
本発明は、規則正しく繰り返された抗原アレイの構築のための新規組成物及び方法を提供する。当該分野の熟練者が知っているように、規則正しく繰り返された抗原アレイのアセンブリのための条件は、非天然分子骨格の第1の付着部位の特異的な選択と、抗原又は抗原決定基の第2の付着部位の特異的な選択に大きく依存している。従って、組成物の設計における実施者の選択(すなわち、第1及び第2の付着部位、抗原及び非天然分子骨格の選択)は、アルファワクチン粒子のアセンブリ(規則正しく繰り返された抗原アレイ、及び組み合わせた非天然分子骨格)に関する具体的条件を決定する。アルファワクチン粒子のアセンブリに関連する情報は、実施者の役立つ知識に範囲内にあり、実施者を助ける多くの参考文献が存在し(例えば、Sambrook, J. ら, 編, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 第2版, コールドスプリングハーバー研究所出版, コールドスプリングハーバー,ニューヨーク(1989);Ausubel, F. ら, 編, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John H. Wiley & Sons, Inc. (1997);Celis, J., 編, CELL BIOLOGY, Academic Press, 第2版, (1998);Harlow, E. 及び Lane, D., " Antibody: A Laboratory Manual" コールドスプリングハーバー研究所, コールドスプリングハーバー, ニューヨーク(1988))、そのすべてが、参考文献としてここで取り入れられている。
JUN/FOSの実施態様での規則正しく繰り返された抗原アレイのアセンブリは、酸化還元シャッフルの存在下でおこなわれる。E2-JUNウイルス粒子を、4℃で10時間、240倍モル濃度を越えるFOS抗原又はFOS抗原決定基と混合する。続いて、クロマトグラフィーによって、アルファワクチン粒子を濃縮して精製する(実施例16)。
本発明は、疾患又は症状を予防すること及び/又は弱めることに利用することができるワクチン組成物を提供する。本発明は、さらに、個体における疾患又は症状を予防すること/又は弱めることに関するワクチン接種方法を提供する。
1つの実施態様では、本発明は、幅広い種、特に、ヒト、サル、ウシ、犬、猫、馬、豚等の哺乳動物の感染症の予防のためのワクチンを提供する。ワクチンは、ウイルス病因の感染、例えば、HIV、インフルエンザ、ヘルペス、ウイルス肝炎、エプスタイン・バー、ポリオ、ウイルス性脳炎、麻疹、水痘、等;又は細菌病因の感染、例えば、肺炎、結核、梅毒、等;又は寄生虫病因の感染、例えば、マラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症、アメーバ症、等を治療するために設計することができる。
本発明の組成物は、当該分野で知られた種々の方法によって投与することができるが、通常は、注射、注入、吸引、経口、投薬、又は他の適切な物理的方法によって投与することができる。この組成物は、それに代わって、筋肉注射で、静脈内に、又は皮下に投与することができる。投与のための組成物の成分には、無菌水(例えば、生理食塩水)又は非水溶液及び懸濁液が含まれる。非水性溶媒の例には、プロピレン・グリコール、ポリエチレン・グリコール、植物油、例えばオリーブ油、及び注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルがある。担体又は閉鎖包帯は、皮膚の透過性及び抗原吸収を高めるのに利用することが可能である。
本発明の他の実施態様には、本発明の組成物の産生に関する工程、及び前記組成物を用いた治療方法が含まれる。前述の一般的記載及び以下の詳細な説明の双方は、模範的及び単に説明的であり、クレームされた本発明のさらなる説明を提供することを意図している。
ワクチン技術に加えて、本発明の他の実施態様は、癌及びアレルギーに関する治療の方法に関する。
(実施例)
この系は、VLPsへの化学カップリングのために、システイン残基を有する種々のアミノ酸リンカー配列を抗原へ付加するために作製された。
pCep-Pu(Wuttkeら, J. Biol. Chem. 276: 36839-48(2001))を、Kpn I及びBam HIで消化し、新しいマルチクローニング部位を、pCep-MCSへつながる、アニール化したオリゴヌクレオチドPH37(配列番号:270)及びPH38(配列番号:271)とともに導入した。
異なる融合タンパク質の大容量生産に関しては、293-EBNA細胞(インビトロジェン)を製造者指示書に従って、リポフェクタミン2000試薬(life technologies)によって、異なるpCep発現プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの24-36時間後に、その細胞を10%FCSを補充したDMEMでのピューロマイシン選択(1μg/ml)下で1対3の比で分けた。その耐性細胞を、その後、選択培地に拡散させた。融合タンパク質の収集については、耐性細胞集団をポリ-L-リジンでコーティングしたシャーレ上に蒔いた。一度、細胞がコンフルエンスに達したら、シャーレをPBSで2回洗浄し、無血清培地(DMEM)をプレートへ添加した。組織培養の上澄み液を2から4日毎に収集し、1ヶ月の期間まで新鮮なDMEM培地で置き換えた。収集した上澄み液は、4℃で保持した。
組み換えFc融合タンパク質は、プロテインAセファロースCL-4B(アマシャム ファルマシア バイオテク AG)を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製した。手短に言うと、コロマトグラフィーカラムを1-3mlのプロテインA樹脂で詰め込み、0.5〜1.5ml/分の流速で蠕動ポンプ によって、組み換えタンパク質を有する組織培養の上澄み液をカラムへ負荷した。このカラムを、その後、20-50mlのPBSで洗浄した。融合タンパク質によって、プロテアーゼ切断がカラム上でおこなわれるか、又は、タンパク質が下記のようにして溶出された。組み換え融合タンパク質を150mM NaClを補充したクエン酸/リン酸緩衝液(pH3.8)で溶出し、そのタンパク質を有する分画をプールし、ウルトラフリー遠心フィルター(ミリポア)で濃縮した。
エンテロキナーゼ(EK)切断部位を有する溶出した組み換え融合タンパク質を、製造者指示書に従って、EKmaxシステム(インビトロジェン)を利用して切断した。融合タンパク質の切断Fc部分を、プロテインAによるインキュベーションによって除いた。その後、製造者の推奨に従い、EK-Awayシステム(インビトロジェン)によってエンテロキナーゼを除いた。同様に、Xa因子(Xa)切断部位を有する融合タンパク質を、製造者の推奨に従い、制限プロテアーゼXa因子切断及び除去キット(Roche)を用いて切断した。切断Fc部分をプロテインAによるインキュベーションによって取り除き、キットとともに提供されているストレプトアビジン樹脂によってプロテアーゼを取り除いた。
異なる融合タンパク質は、ウルトラフリー遠心フィルター(ミリポア(Millipore))で濃縮して、UV分光光度法によって定量し、後のカップリング反応に用いた。
図1A:pCep-Xa-Fc*:配列が、前方のBamHI部位で示され、異なる特徴が、翻訳配列より上流に示されている。矢印は、Xa因子プロテアーゼの切断部位を示す。
図1B:pCep-EK-Fc*:配列が、前方のBamHI部位で示され、異なる特徴が、翻訳配列より上流に示されている。矢印は、エンテロキナーゼの切断部位を示す。Hind III部位の配列下流は、図1Aに示されているものと同一である。
図1C:pCep-SP-EK-Fc*:配列が、シグナルペプチド上の開始から示され、異なる特徴が、翻訳配列の上流で示されている。シグナルペプチダーゼによって切断されるシグナルペプチド配列は、太字で示されている。矢印は、エンテロキナーゼの切断部位を示す。HindIII部位の配列下流は、図1Aに示されているものと同一である。
A. マウスレジスチンのクローニング
製造者の推奨に従いキアゲン RNeasyキットを用いて、60mgマウス脂肪組織から全RNAを単離した。この全RNAは、40μlのH2Oで溶出させた。この全RNAを、その後、製造者の推奨に従いThemoScript(商品名)RT-PCRシステム(Life Technologies)を用いて、オリゴdTプライマーによる逆転写に用いた。試料は、1時間、50℃でインキュベートし、5分間、85℃で加熱し、37℃で20分間、RNAseHで処理した。
pCep-mRes-Xa-Fc*及びpCep-mRes-EK-Fc*コンストラクトを、その後、実施例1、B章に記載のような組み換えタンパク質の産生のために、293-EBNA細胞をトランスフェクトするのに用いた。組織培養上澄みは、実施例1、C章に記載したように精製した。精製したタンパク質は、その後、実施例1、D章に記載のようにして切断した。その結果として生じた組み換えタンパク質は、用いたベクターに従って、「レジスチン-C-Xa」又は「Res-C-Xa」及び「レジスチン-C-EK」又は「Res-C-EK」と呼ばれた(図2A及び図2Bを参照せよ)。
0.2mlの20mM Hepes、150 mM NaCl pH7.4中の2mg/ml Qβキャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上で、25℃で、5.6μlのDMSO中の100mM SMPH(Pierce)の溶液と30分間反応させた。この反応液について、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。8μlの透析したQβ反応液混合物を、その後、32μlのレジスチン-C-Xa溶液と反応させ(0.39mg/mlの最終濃度のレジスチンとなる)、13μlのQβ反応混合液を、ロッキングシェーカー上で25℃で4時間、27μlレジスチン-C-EK溶液と反応させた(0.67mg/mlの最終濃度のレジスチンとなる)。カップリング産物を、SDS-PAGEによって分析した(図2Cを参照)。24kDaのさらなるバンドがカップリング反応に存在したが、誘導化Qβ及びレジスチンにはそれぞれ存在しなかった。24kDaの大きさは、カップリングした産物に関する予想サイズである24kDaと一致する(Qβの14kDaに加えて、それぞれレジスチン-C-Xa及びレジスチン-C-EKの10kDa)。
0.2mlの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.4中の2mg/ml frキャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上で、25℃で、5.6μlのDMSO中の100mM SMPH(Pierce)の溶液と30分間反応させる。この反応液について、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなう。8μlの透析したfrキャプシドタンパク質反応液混合物を、その後、32μlのレジスチン-C-Xa溶液と反応させ(0.39mg/mlの最終濃度のレジスチンとなる)、13μlのfrキャプシドタンパク質反応混合液を、ロッキングシェーカー上で25℃で4時間、27μlレジスチン-C-EK溶液と反応させた(0.67mg/mlの最終濃度のレジスチンとなる)。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
0.2mlの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の2mg/ml HBcAg-Lys-2cys-Mutの溶液を、ロッキングシェーカー上で、25℃で、5.6μlのDMSO中の100mM SMPH(Pierce)の溶液と30分間反応させる。この反応液について、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対して2時間の透析を2回おこなう。8μlの透析したHBcAg-Lys-2cys-Mut反応液混合物を、その後、32μlのレジスチン-C-Xa溶液と反応させ、13μlのHBcAg-Lys-2cys-Mut反応混合液を、ロッキングシェーカー上で25℃で4時間、27μlレジスチン-C-EK溶液と反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
400μlの20mM Hepes、pH7.4中の2.5mg/ml 大腸菌の1型線毛の溶液を、ロッキングシェーカー上のRTで、60分間、DMSO(Pierce)中の原液から希釈した50倍モル濃度を超える架橋剤SMPHと反応させる。この反応混合物は、PD-10カラム(アマシャム ファルマシア バイオテク)上で脱塩する。このカラムから溶出したタンパク質を含有する分画をプールし、8μlの脱塩し誘導体化した線毛タンパク質を32μlのレジスチン-C-Xa溶液と反応させ、13μlの脱塩し誘導体化した線毛タンパク質を、ロッキングシェーカー上で25℃で4時間、27μlレジスチン-C-EK溶液と反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
マウスリンホトキシン-●(LT-●)の細胞外部分は、そのN末端にCGGアミノ酸リンカーを有して組み換え的に発現させた。このリンカーは、VLPとのカップリングのための1つのシステインを有していた。タンパク質の長い(aa49-306)及び短いバージョン(aa126-306)を、精製のために、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)又はヒスチジン-mycタグのいずれかに対してそのN末端で融合させた。エンテロキナーゼ(EK)切断部位は、タグの切断のために挿入した。
マウスLT●49-309は、pFB-LIBへ挿入したマウス脾臓cDNAライブラリからオリゴ5' LT●及び3' LT●によるPCRによって増幅させた。PCR増幅反応に関しては、0.5μgの各プライマー及び200ngのテンプレートDNAを50●1反応混合液(1ユニットのPFX Platinum ポリメラーゼ、0.3mM dNTPs及び2mM MgSO4)に用いた。温度サイクルは以下の通りである:94℃を2分間、続いて25サイクルの94℃(15秒)、68℃(30秒)、68℃(1分)及び続いて68℃を10分間。PCR産物をT4キナーゼでリン酸化し、EcoRVで切断して脱リン酸化してあるpEntry1A(Life technologies)へライゲーションした。この結果生じたプラスミドは、pEntry1A-LT●49-306と命名された。
すべての他の段階は、標準的分子生物学プロトコールによっておこなわれる。
5' LT●:
5' -CTTGGTGCCGCAGGATCAG-3' (配列番号:284)
3' LT●:
5' -CAGATGGCTGTCACCCCAC -3' (配列番号:285)
5' LT●long-NheI:
5' -GCCCGCTAGCCTGCGGTGGTCAGGATCAGGGACGTCG-3' (配列番号:286)
5' LT●short-NheI:
5' -GCCCGCTAGCCTGCGGTGGTTCTCCAGCTGCGGATTC-3' (配列番号:287)
3' LT●stop-NotI:
5' -CAATGACTGCGGCCGCTTACCCCACCATCACCG-3' (配列番号:288)
プラスミドpCEP-SP-GST-EK-C-LT●49-306、pCEP-SP-GST-EK-C-LT●126-306、pCEP-SP-his-myc-EK-C-LT●49-306及びpCEP-SP-his-myc-EK-C-LT●126-306を、実施例1に記載のようにタンパク質産生のために293-EBNA細胞(インビトロジェン)へトランスフェクトした。その結果として生じたタンパク質を、GST-EK-C-LT●49-306、GST-EK-C-LT●126-306、his-myc-EK-C-LT●49-306及びhis-myc-EK-C-LT●126-306と命名した。
LT●融合タンパク質のタンパク質配列は、cDNA配列から翻訳された:
GST-EK-C-LT●49-306(配列番号:289)
GST-EK-C-LT●126-306(配列番号:290)
his-myc-EK-C-LT●49-306(配列番号:291)
his-myc-EK-C-LT●126-306(配列番号:292)
GST-EK-C-LT●49-306及びGST-EK-C-LT●126-306をグルタチオン-セファロースカラム上で精製し、his-myc-EK-C-LT●49-306及びhis-myc-EK-C-LT●126-306を標準精製プロトコールを用いて、Ni-NTAセファロースカラム上で精製する。その精製タンパク質はエンテロキナーゼで切断し、還元条件下の16%SDS-PAGEゲル上で分析する。
20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の120μMのQβキャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上において25℃で、DMSO中の原液から希釈した25倍モル濃度を超えるSMPH(Pierce)の溶液と30分間反応させる。この反応液について、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなう。この透析したQβ反応混合液を、ロッキングシェーカー上において25℃で4時間、C-LT●49-306及びC-LT●126-306溶液(最終濃度:60μM Qβ、60μM C-LT●49-306及びC-LT●126-306)と反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の120μMのfrキャプシドの溶液を、ロッキングシェーカー上において25℃で、DMSO中の原液から希釈した25倍モル濃度を超えるSMPH(Pierce)の溶液と30分間反応させる。この反応液について、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなう。この透析したfrキャプシドタンパク質反応混合液を、ロッキングシェーカー上において25℃で4時間、C-LT●49-306及びC-LT●126-306溶液(最終濃度:60μM fr、60μM C-LT●49-306及びC-LT●126-306)と反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の120μMのHBcAg-Lys-2cys-Mutキャプシドの溶液を、ロッキングシェーカー上において25℃で、DMSO中の原液から希釈した25倍モル濃度を超えるSMPH(Pierce)の溶液と30分間反応させる。この反応液について、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなう。この透析したHBcAg-Lys-2cys-Mut反応混合液を、ロッキングシェーカー上において25℃で4時間、C-LT●49-306及びC-LT●126-306溶液(最終濃度:60μM HBcAg-Lys-2cys-Mut、60μM C-LT●49-306及びC-LT●126-306)と反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
20mM Hepes、pH7.4中の125μM 大腸菌の1型線毛の溶液を、ロッキングシェーカー上でのRTで、60分間、DMSO(Pierce)中の原液から希釈した50倍モル濃度を超える架橋剤SMPHと反応させる。この反応混合物は、PD-10カラム(アマシャム ファルマシア バイオテク)上で脱塩する。このカラムから溶出したタンパク質含有分画をプールし、脱塩し誘導体化した線毛タンパク質をロッキングシェーカー上において25℃で4時間、C-LT●49-306及びC-LT●126-306溶液(最終濃度:60μM 線毛、60μM C-LT●49-306及びC-LT●126-306)と反応させる。カップリング産物を、還元条件下のSDS-PAGEによって分析する。
ラットマクロファージ遊走阻害因子(rMIF)を、そのC末端で3つの異なるアミノ酸リンカーC1、C2及びC3を融合させて、組み換え発現させた。各リンカーは、VLPとのカップリングのための1つのシステインを有していた。
アニール化したオリゴスプライマーMCS-1F及びプライマーMCS-1R(15mM トリスHCl pH緩衝液でのアニーリング)によって、元の配列をNdeI部位からXhoI部位へ置き換えることで、pET22b(+)(ノバジェン, Inc.)のMCSをGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGATCCGGCTAGCGCTCGAGGGTTTAAACGGCGGCCGCATGCACCへ変えた。この結果として生じたプラスミドは、pMod00と命名され、NdeI、BamHI、NheI、XhoI、PmeI及びNotI制限部位をそのMCSに有していた。オリゴ Bamhis6-EK-Nhe-F及びBamhis6-EKNhe-Rのアニール化対、及びオリゴ1F-C-グリシン-リンカー及びオリゴ1R-C-グリシン-リンカーのアニール化対を、N末端ヘキサヒスチジンタグ、エンテロキナーゼ切断部位及び1つのシステイン残基を含有するC末端アミノ酸グリシンリンカーを有するpModEC1を得るために、BamHI-NotIで消化したpMod00プラスミドとともにライゲーションした。オリゴ1F-C-ガンマ1-リンカー及びオリゴ1R-C-ガンマ1-リンカーのアニール化した対とともに、オリゴ Bamhis6-EK-Nhe-F及びBamhis6-EKNhe-Rのアニール化対を、N末端ヘキサヒスチジンタグ、エンテロキナーゼ切断部位及び、1つのシステイン残基を含有するヒト免疫グロブリンγ1のヒンジ領域に由来するC末端●1リンカーを有するpModEC2を得るために、BamHI-NotIで消化したpMod00プラスミドへライゲーションした。オリゴ Bamhis6-EK-Nhe-F及びBamhis6-EKNhe-Rのアニール化対、オリゴ1FA-C-ガンマ1-リンカー及びオリゴ1RA-C-ガンマ3-リンカーのアニール化した対、及びオリゴ1FB-C-ガンマ3-リンカー及びオリゴ1RB-C-ガンマ3-リンカーのアニール化した対を、ともにN末端ヘキサヒスチジンタグ、エンテロキナーゼ切断部位及び、1つのシステイン残基を含有するマウス免疫グロブリン●3のヒンジ領域に由来するC末端●3リンカーを有するpModEC3を得るために、BamHI-NotIで消化したpMod00プラスミドへライゲーションした。
すべての他の段階は、標準的分子生物学プロトコールによっておこなった。
プライマーMCS-1F:
5' -TATGGATCCGGCTAGCGCTCGAGGGTTTAAACGGCGGCCGCAT -3'
(配列番号:293)
プライマーMCS-1R:
5' -TCGAATGCGGCCGCCGTTTAAACCCTCGAGCGCTAGCCGGATCCA-3'
(配列番号:294)
Bamhis6-EK-Nhe-F:
5'-GATCCACACCACCACCACCACCACGGTTCTGGTGACGACGATGACAAAGC GCTAGCCC-3' (配列番号:295)
Bamhis6-EK-Nhe-R:
5'-TCGAGGGCTAGCGCTTTGTCATCGTCGTCACCAGAACCGTGGTGGTGGTG GTGGTGTG-3' (配列番号:296)
オリゴ1F-C-グリシン-リンカー:
5' -TCGAGGGTGGTGGTGGTGGTTGCGGTTAATAAGTTTAAACGC-3' (配列番号:297) オリゴ1R-C-グリシン-リンカー:
5' -GGCCGCGTTTAAACTTATTAACCGCAACCACCACCACCACCC -3'
(配列番号:298)
オリゴ1F-C-ガンマ1-リンカー:
5' -TCGAGGATAAAACCCACACCTCTCCGCCGTGTGGTTAATAAGTTTAAACG C-3'
(配列番号:299)
オリゴ1R-C-ガンマ1-リンカー:
5' -GGCCGCGTTTAAACTTATTAACCACACGGCGGAGAGGTGTGGGTTTTATCC-3'
(配列番号:300)
オリゴ1FA-C-ガンマ3-リンカー:
5' -TCGAGCCGAAACCGTCTACCCCGCCGGGTTCTTCTG-3' (配列番号:301)
オリゴ1RA-C-ガンマ3-リンカー:
5' -CACCACCAGAAGAACCCGGCGGGGTAGACGGTTTCGGC-3'(配列番号:302)
オリゴ2FB-C-ガンマ3-リンカー:
5'-GTGGTGCTCCGGGTGGTTGCGGTTAATAAGTTTAAACGC-3'(配列番号:303)
オリゴ2RB-C-ガンマ3-リンカー:
5'-GGCCGCGTTTAAACTTATTAACCGCAACCACCCGGAG-3'(配列番号:304)
rMIF-F:
5'-GGAATTCCATATGCCTATGT TCATCGTGAACAC-3'(配列番号:305)
rMIF-Xho-R:
5'-CCCGCTCGAGAGCGAAGGTGGAACCGTTC-3'(配列番号:306)
コンピテント大腸菌BL21(DE3)細胞を、プラスミドpMod-rMIF-C1、pMod-rMIF-C2及びpMod-rMIF-C3で形質転換した。アンピシリン含有寒天プレートからの単一コロニーを液体培養(150mM MOPS、pH7.0、200ug/ml Amp、0.5% グルコースを有するSB)に拡散させ、30℃で220rpmの振盪で終夜インキュベートした。その後、1lのSB(150mM MOPS、pH7.0、200ug/ml Amp)に終夜培養液の1:50v/vを接種し、30℃でOD600=2.5まで生育させた。発現は、2mM IPTGによって誘導した。細胞を終夜の培養後に収集し、6000rpmで遠心分離した。細胞ペレットを0.8mg/ml リゾチームを含む溶解緩衝液(10mM Na2HPO4、30mM NaCl、10mM EDTA及び0.25% Tween-20)に懸濁し、超音波処理をしてベンゾナーゼで処理した。その後、2mlのライセートを20ml Q XL-及び20ml SP XL-カラムに流した。タンパク質rMIF-C1、rMIF-C2、及びrMIF-C3は、貫流液にあった。
rMIF-Csのタンパク質配列は、cDNA配列から翻訳した。
rMIF-C1:配列番号:307
rMIF-C2:配列番号:308
rMIF-C3:配列番号:309
1.48mlの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の6mg/ml Q●キャプシドタンパク質の溶液を、25℃で14.8μlのSMPH(Pierce)(DMSOに溶かした100mM 原液からの)と30分間反応させた。この反応液について、その後、4℃で2lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.0に対する3時間の透析を2回おこなった。 1.3mlの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の3.6mg/ml rMIF-C1タンパク質の溶液を、25℃で9.6μlのTCEP(Pierce)(H2Oに溶かした36mM 原液からの)と1時間反応させた。130μlの誘導化及び透析Q●を、25℃で241μlの20mM Hepes、150mM NaCl、pH 7.0中の129μlの還元rMIF-C1と終夜反応させた。
0.9mlの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の5.5mg/ml Q●キャプシドタンパク質の溶液を、25℃で9μlのSMPH(Pierce)(DMSOに溶かした100mM 原液からの)と30分間反応させた。この反応液について、その後、4℃で2lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなった。 850μlの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の5.80mg/ml rMIF-C2タンパク質の溶液を、RTで8.5μlのTCEP(Pierce)(H2Oに溶かした36mM 原液からの)と1時間反応させた。80μlの誘導化及び透析Q●を、25℃で85μlの20mM Hepes、150mM NaCl、pH 7.2中の335μlの還元rMIF-C2と終夜反応させた。
1.48mlの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の6mg/ml Q●キャプシドタンパク質の溶液を、25℃で14.8μlのSMPH(Pierce)(DMSOに溶かした100mM 原液からの)と30分間反応させた。この反応液について、その後、4℃で2lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.0に対す3時間の透析を2回おこなった。
720μlの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の5.98mg/ml rMIF-C3タンパク質の溶液を、25℃で9.5μlのTCEP(Pierce)(H2Oに溶かした36mM 原液からの)と1時間反応させた。130μlの誘導化及び透析Q●を、25℃で80μlの290μlの20mM Hepes、150mM NaCl、pH 7.0中の還元rMIF-C3と終夜反応させた。
図4Bは、MIF-C1のQβとのカップリングを示す。カップリング産物を、還元条件下の16%SDS-PAGEゲル上で分析した。レーン1:カップリング前のMIF-C1.レーン2:カップリング前の誘導体化Qβ.レーン3-5:Qβ-MIF-C1.レーン1-3は、クーマシーブリリアントブルーで染色した。レーン4及び5は、それぞれ抗-MIF抗血清及び抗-Qβ抗血清で現像したカップリング反応のウエスタンブロットを示す。マーカータンパク質の分子量は、左端に示されている。
雌Balb/cマウスは、アジュバンドを添加せずにQβキャプシドタンパク質とカップリングさせたMIF-C1でワクチン接種した。各試料の25μgの全タンパク質を、PBSで200ulとなるまで希釈し、0日目と14日目に皮下注射(100mlを2つの腹部へ)した。マウスを31日目に逆軌道で出血させ、その血清をMIF-特異的 ELISAを利用して分析した。
ELISAプレートを、5μg/mlの濃度でMIF-C1によってコーティングした。このプレートをブロックし、その後、連続的に希釈したマウス血清とともにインキュベートした。結合した抗体は、酵素的に標識した抗-マウスIgG抗体で検出した。コントロールとして、同じマウスの免疫前血清も試験した。その結果を図4Cに示す。免疫前血清がMIFと反応しなかった一方で、Qβキャプシドタンパク質とカップリングしたMIF-C1に対して産生させたマウス血清の明白な活性があった(図4C及びデータは示さず)。Qβキャプシドタンパク質とカップリングしたMIF-C1に対して産生させた抗血清による連続希釈から、最高力価の半分は、1:84000に達した。
rMIF-C1のfrキャプシドタンパク質とのカップリング
100μlの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の3.1mg/ml frキャプシドタンパク質の溶液を、25℃で3μlのSMPH(Pierce)のDMSOに溶かした100mM 原液と30分間反応させた。並発反応では、frキャプシドタンパク質を、最初にヨードアセトアミドを用いてアルキル化し、その後、上記と同じ反応条件を用いてSMPHと反応させた。この反応液について、その後、4℃で2lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなった。 80μlの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の5.7mg/ml rMIF-C1タンパク質の溶液を、25℃でH2Oに溶かした1μlの36mM TCEP(Pierce)原液と1時間反応させた。50μlの誘導化及び透析frキャプシドタンパク質、及び50μlの誘導体化、アルキル化及び透析したfrキャプシドタンパク質を、その後、それぞれ17μlの還元rMIF-C1と25℃で2時間反応させた。
100μlの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の1.2mg/ml HBcAg-lys-2cys-Mutキャプシドタンパク質の溶液を、25℃で1.4μlのSMPH(Pierce)(DMSOに溶かした100mM 原液)と30分間反応させた。この反応液について、その後、4℃で2lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなった。 80μlの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の5.7mg/ml rMIF-C1タンパク質の溶液を、25℃で1μlのTCEP(Pierce)(H2Oに溶かした36mM 原液)と1時間反応させた。60μlの誘導化及び透析したHBcAg-lys-2cys-Mutキャプシドタンパク質を、その後、20μlの還元rMIF-C1と25℃で2時間反応させた。
レーン1:分子量マーカー.レーン2:カップリング前のrMIF-C1.レーン3:カップリング後のrMIF-C1-frキャプシドタンパク質.レーン4:誘導体化frキャプシドタンパク質.レーン5:アルキル化frキャプシドタンパク質とのカップリング後のrMIF-C1-fr.レーン6:アルキル化及び誘導体化frキャプシドタンパク質.レーン7:カップリング後のrMIF-HBcAg-lys-2cys-Mut.レーン8及び9:誘導体化HBcAg-lys-2cys-Mut.ゲルは、クーマシーブリリアントブルーで染色した。マーカータンパク質の分子量は、左端に示されている。
破骨細胞分化因子とも呼ばれている核因子カッパbリガンド(RANKL)のレセプターアクチベーターの断片、破骨細胞形成阻害因子リガンド、及び腫瘍壊死因子関連活性化誘導サイトカインは、VLPとのカップリングのための1つのシステインを有するN末端リンカーとともに組み換え発現された。
RANKL遺伝子のC末端コード化領域を、オリゴRANKL-UP及びRANKL-DOWNによりPCRによって増幅させた。RANKL-UPは内部ApaI部位を有し、RANKL-DOWNは内部XhoI部位を有していた。そのPCR産物をApaI及びXhoIにより消化させ、pGEX-6p1(アマシャム ファルマシア)へライゲーションした。この結果として生じたプラスミドは、pGEX-RANKLと命名された。すべての段階は、標準的な分子生物学プロトコールによっておこなわれ、その配列が確かめられた。プラスミドpGEX-RANKLは、グルタチオン S-トランスフェラーゼ-Prescission切断部位システイン含有アミノ酸リンカー-RANKL(GST-PS-C-RANKL)の融合タンパク質をコードする。システイン含有アミノ酸リンカーは、配列GCGGGを有する。このコンストラクトは、システイン含有アミノ酸リンカーとRANKL配列の間にヘキサヒスチジンタグも有する。
RANKL-UP:
5'CTGCCAGGGGCCCGGGTGCGGCGGTGGCCATCATCACCACCATCACCAGC GCTTCTCAGGAG-3' (配列番号:316)
RANKL-DOWN:
5'CCGCTCGAGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGAAAG-3' (配列番号:317)
GST-PS-C-RANKL(配列番号:318)のタンパク質及びGST-PS-C-RANKL(配列番号:319)のcDNA配列
コンピテント大腸菌BL21(DE3)Gold pLys細胞をプラスミドpGEX-RANKLで形質転換した。カナマイシン及びクロラムフェニコール含有寒天プレートからの単一コロニーを液体培養(LB培地、30μg/mlカナマイシン、50μg/mlクロラムフェニコール)に拡散させ、30℃で220rpmの振盪で終夜インキュベートした。その後、1lのSB(30μg/mlカナマイシンを有する)に終夜培養液の1:100v/vを接種し、24℃でOD600=1まで生育させた。発現は、0.4mM IPTGによって誘導した。細胞を16時間後に収集し、5000rpmで遠心分離した。細胞ペレットを含む溶解緩衝液(50mM トリス-HCl、pH=8;25% スクロース;1mM EDTA、1% NaN3;10mM DTT;5mM MgCl2;1mg/ml リゾチーム;0.4u/ml デオキシリボヌクレアーゼ(DNase))に30分間懸濁した。その後、2.5mlの緩衝液A(50mMトリス-HCl、pH=8.0;1%TritonX100;100mM NaCl;0.1% NaN3;10mM DTT;1mM PMSF)を添加し、37℃で15分間インキュベートした。細胞は、超音波処理して15分間の9000rpmでペレットにした。その上澄み液を、直ちにGST-アフィニティークロマトグラフィーに用いた。
精製したGST-PS-RANKLタンパク質は、プロテアーゼ PreScission(アマシャム ファルマシア)を用いて消化した。この消化は、PreScissionに対するGST-PS-RANKLのモル比500/1によって1時間、37℃でおこなった。
レーン1:分子量マーカー。レーン2及び3:IPTG0.4mMによる16時間の誘導後の、それぞれからのベクターpGEX6p1及びpGEX-RANKLで形質転換したBL21/DE3細胞の細胞溶解物の上澄み液。レーン4:GST-Trap FFカラム後の精製GST-C-RANKLタンパク質。レーン5:GST-Trap FFカラム未結合分画。レーン6:PreScissionプロテアーゼによる切断後の精製GST-PS-C-RANKLタンパク質。レーン7:精製C-RANKLを有する、GST-RANKL消化物とともに負荷したGST-Trap FFカラムの未結合分画。レーン8:GST-PS-C-RANKL消化物で負荷し、GSHで溶出したGST-Trap FFカラムの結合分画。
20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の120μMのQβキャプシドの溶液を、ロッキングシェーカー上において25℃で、DMSO中の原液から希釈した25倍モル濃度を超えるSMPH(Pierce)の溶液と30分間反応させる。 この反応液について、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなう。この透析したQβ反応混合液を、ロッキングシェーカー上において25℃で4時間、C-RANKL溶液(最終濃度:60μM Qβ、60μM C-RANKL)と反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の120μMのfrキャプシドの溶液を、ロッキングシェーカー上において25℃で、DMSO中の原液から希釈した25倍モル濃度を超えるSMPH(Pierce)の溶液と30分間反応させる。この反応液について、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなう。この透析したfrキャプシドタンパク質反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上において25℃で4時間、C-RANKL溶液(最終濃度:60μM frキャプシドタンパク質、60μM C-RANKL)と反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の120μM HBcAg-Lys-2cys-Mutキャプシドの溶液を、ロッキングシェーカー上において25℃で、DMSO中の原液から希釈した25倍モル濃度を超えるSMPH(Pierce)の溶液と30分間反応させる。この反応液について、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなう。この透析したHBcAg-lys-2cys-Mutキャプシドタンパク質反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上において25℃で4時間、C-RANKL溶液(最終濃度:60μM HBcAg-Lys-2cys-Mutキャプシドタンパク質、60μM C-RANKL)と反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
20mM Hepes、pH7.4中の125μM 大腸菌の1型線毛の溶液を、ロッキングシェーカー上でのRTで、60分間、DMSO(Pierce)中の原液から希釈した50倍モル濃度を超える架橋剤SMPHと反応させる。この反応混合物は、PD-10カラム(アマシャム ファルマシア バイオテク)上で脱塩する。このカラムから溶出したタンパク質含有分画をプールし、脱塩し誘導体化した線毛タンパク質をロッキングシェーカー上において25℃で4時間、C-RANKL溶液(最終濃度:60μM 線毛、60μM C-RANKL)と反応させる。カップリング産物を、還元条件下のSDS-PAGEによって分析する。
マウスプリオンタンパク質(mPrPtと呼ぶ)の切断型(aa121-230)を、VLPs及び線毛とのカップリングのためにそのC末端で融合させたGGGGCGアミノ酸リンカーとともに組み換え発現させた。このタンパク質は、精製のためにヒトFc-断片のN末端と融合させた。エンテロキナーゼ(EK)切断部位をEK切断部位の後ろに導入し、精製後に融合タンパク質のFc部分を切断するようにした。
プラスミドpBPCMVPrP-Fcをテンプレートととして用い、プライマー5' PrP-BamHI及び3' PrP-NheIによるPCRによってマウスPrPtを増幅した。pBPCMVPrP-Fcは、マウスプリオンタンパク質の野生型配列を有する。5' PrP-BamHIは内部BamHI部位を有し、ATGを含有し、3' PrP-NheIは内部NheI部位を有していた。
PCR反応に関しては、0.5μgの各プライマー及び200ngのテンプレートDNAを50●1反応混合液(1ユニットのPFX Platinum ポリメラーゼ、0.3mM dNTPs及び2mM MgSO4)に用いた。温度サイクルは以下の通りである:94℃を2分間、続いて5サイクルの94℃(15秒)、50℃(30秒)、68℃(45秒)、続いて20サイクルの94℃(15秒)、64℃(30秒)、68℃(45秒)、及び続いて68℃を10分間。
PCR産物をBamHI及びNheIで消化し、EK切断配列の5' 末端にGGGGCGリンカー配列を有するpCEP-SP-EK-Fc*へ挿入した。この結果として生じたプラスミドは、pCEP-SP-mPrPtEK-Fc* と命名された。
すべての他の段階は、標準的分子生物学プロトコールによっておこなわれた。
プライマー5' PrP-BamHI
5'-CGGGATCCCACCATGGTGGGGGGCCTTGG-3' (配列番号:321)
プライマー3' PrP-NheI
5'-CTAGCTAGCCTGGATCTTCTCCCG-3' (配列番号:322)
プラスミドpCEP-SP-mPrPt-EK-Fc*を293-EBNA細胞(インビトロジェン)へトランスフェクトし、実施例1に記載したように、プロテインA-セファロースカラム上で精製した。
mPrPt-EK-Fc*のタンパク質配列は、配列番号:323で同定されている。切断後のmPrPtは、そのC末端にGGGGCGリンカーを有する配列番号:324で同定されているような配列を有する。
図7のゲル上に負荷した試料は、以下の通りである:
レーン1:分子量マーカー。レーン2:切断前のmPrPt-EK-Fc*。レーン3:切断後のmPrPt。
20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の120μMのQβキャプシドの溶液を、ロッキングシェーカー上において25℃で、DMSO中の原液から希釈した25倍モル濃度を超えるSMPH(Pierce)の溶液と30分間反応させる。 この反応液について、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなう。この透析したQβ反応混合液を、ロッキングシェーカー上において25℃で4時間、mPrPt溶液(最終濃度:60μM Qβ、60μM mPrPt)と反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の120μMのfrキャプシドの溶液を、ロッキングシェーカー上において25℃で、DMSO中の原液から希釈した25倍モル濃度を超えるSMPH(Pierce)の溶液と30分間反応させる。この反応液について、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなう。この透析したfrキャプシドタンパク質反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上において25℃で4時間、mPrPt溶液(最終濃度:60μM frキャプシドタンパク質、60μM mPrPt)と反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の120μM HBcAg-lys-2cys-Mutキャプシドの溶液を、ロッキングシェーカー上において25℃で、DMSO中の原液から希釈した25倍モル濃度を超えるSMPH(Pierce)の溶液と30分間反応させる。この反応液について、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなう。この透析したHBcAg-lys-2cys-Mut反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上において25℃で4時間、mPrPt溶液(最終濃度:60μM HBcAg-lys-2cys-Mut、60μM mPrPt)と反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
20mM Hepes、pH7.4中の125μM 大腸菌の1型線毛の溶液を、ロッキングシェーカー上でのRTで、60分間、DMSO中の原液から希釈した50倍モル濃度を超える架橋剤SMPH(Pierce)と反応させる。この反応混合物は、PD-10カラム(アマシャム ファルマシア バイオテク)上で脱塩する。このカラムから溶出したタンパク質含有分画をプールし、脱塩し誘導体化した線毛タンパク質をロッキングシェーカー上において25℃で4時間、mPrPt溶液(最終濃度:60μM 線毛、60μM mPrPt)と反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
以下のプリオンペプチドを化学的に合成した:
VLPs及び線毛とのカップリングのための付加したN末端システイン残基を含み、以下に記載のようにQβとの化学的カップリングに用いる、CSAMSRPMIHFGNDWEDRYYRENMYR("cprplong")及びCGNDWEDRYYRENMYR("cprpshort")。
レーン1:精製Q●キャプシドタンパク質。レーン2:カップリング前の誘導体化したQβキャプシドタンパク質。レーン3-6:1:2ペプチド/Q●比(レーン3及び4)及び1:1ペプチド/Q●比(レーン5及び6)でのQβキャプシドタンパク質-cprpshortカップリング。可溶性分画(レーン3及び5)及び不溶性分画(レーン4及び6)が示されている。
図16Bのゲル上に負荷した試料は、以下の通りである:
レーン1:分子量マーカー。レーン2:カップリング前の誘導体化したQβキャプシドタンパク質。レーン3及び4:Qβキャプシドタンパク質-cprplongカップリング反応。可溶性分画(レーン3)及び不溶性分画(レーン4)が示されている。
20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の120μMのfrキャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上において25℃で、DMSO中の原液から希釈した10倍モル濃度を超えるSMPH(Pierce)の溶液と30分間反応させる。この反応液について、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなう。 この透析したfr反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上において16℃で終夜、ペプチドcprpshortの等モル濃度又は1:2比のcprplong/frと反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の120μM HBcAg-Lys-2cys-Mutの溶液を、ロッキングシェーカー上において25℃で、DMSO中の原液から希釈した10倍モル濃度を超えるSMPH(Pierce)の溶液と30分間反応させる。この反応液について、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなう。この透析したHBcAg-Lys-2cys-Mut反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上において16℃で終夜、ペプチドcprpshortの等モル濃度又は1:2比のcprplong/HBcAg-Lys-2cys-Mutと反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
20mM Hepes、pH7.4中の125μM 大腸菌の1型線毛の溶液を、ロッキングシェーカー上でのRTで、60分間、DMSO中の原液から希釈した50倍モル濃度を超える架橋剤SMPH(Pierce)と反応させる。この反応混合物は、PD-10カラム(アマシャム ファルマシア バイオテク)上で脱塩する。
このカラムから溶出したタンパク質含有分画をプールし、脱塩し誘導体化した線毛タンパク質をロッキングシェーカー上において16℃で終夜、等モル又は1:2ペプチド線毛の比のプリオンペプチドと反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
A.VLPs及び線毛とのカップリングのためのシステイン残基を有するN末端アミノ酸リンカーとのインターロイキン13(IL-13)のクローニング及び発現
a)Fc融合タンパク質として哺乳動物細胞での発現のためのマウスIL-13のクローニング
IL-13のクローニングのためのDNAは、インビトロ活性化脾細胞からRT-PCRによって単離され、その脾細胞は、以下のようにして得られた:CD4+T細胞は、マウス脾臓細胞から単離され、3日間、前もって抗CD3及びCD28抗体でコーティングしてある6ウェルプレートのIMDM(+5%FCS+10ng/ml IL4)でインキュベートした。これら細胞からのRNAを用いて、ワンステップRT-PCRによってIL13を増幅した(キアゲンワンステップPCRキット)。プライマーXhoIL13-RをRNAの逆転写に用い、プライマーNheIL13-F(配列番号:338)及びXhoIL13-R(配列番号:339)を、IL13cDNAのPCR増幅に用いた。増幅したIL13cDNAは、NheI/XhoI制限部位を用いて、pMODベクターにライゲーションした(ベクターpMODB1-IL13を与える)。pMODB1-IL13は、BamHI/XhoIで消化し、IL13を含む断片は、前もってBamHI/XhoIで消化したFc配列の末端のXhoI部位が除かれたpCEP-SP-XA-Fc*のアナログである、pCEP-SP-XA-Fc*(△xho)ベクターにライゲーションした。このライゲーションで得られたプラスミド(pCEP-SP-IL13-Fc)をシーケンシングし、HEK-293Tをトランスフェクトするのに用いた。このプラスミドによってコードされた結果として得られたIL13は、IL-13成熟配列のN末端で融合したアミノ酸配列ADPGCGGGGGLAを有していた。この配列は、クローニング手順の間に導入された付加的アミノ酸が近接している、アミノ酸リンカー配列GCGGGGGを含む。IL13-Fcは、pCEP-SP-IL13-Fcでトランスフェクトした上澄み液の細胞から、プロテイン-Aによって精製することが可能である。発現の結果は、図17Bに示されている(サンプルの記載として実施例10を参照)。前述のN末端で融合した成熟IL-13は、Xa因子による融合タンパク質の切断によって遊離し、配列番号:328の配列を有するタンパク質となり、この後で「マウスC-IL-13-F」と呼ばれる。図17Bの結果は、IL-13コンストラクトの発現を明白示されている。
IL-13とN末端GSTのクローニングに用いるcDNAは、上記(a.)のTH2活性化T細胞のcDNAに起源を有する。IL-13は、プライマーNhelink1IL13-F及びIL13StopXhoNot-Rを用いて、このcDNAから増幅された。このPCR産物は、NheI及びXhoIで消化され、前もってNheI/XhoIで消化したpCEP-SP-GST-EKベクターへライゲーションした。ライゲーション(pCEP-SP-GST-IL13)から単離が可能なプラスミドは、HEK-293細胞のトランスフェクトに利用された。このプラスミドによってコードされた結果として得られたIL13コンストラクトは、IL-13成熟配列のN末端で融合したアミノ酸配列LACGGGGGを有した。この配列は、クローニング手順の間に導入された付加的なアミノ酸が近接するアミノ酸リンカー配列ACGGGGGを含む。pCEP-SP-GST-IL13でトランスフェクトした細胞はの培養上澄みは、標準的プロトコールに従ってグルタチオンアフィニティークロマトグラフィーによって精製が可能な融合タンパク質GST-IL13を含有した。N末端で前出のアミノ酸配列が融合した成熟IL-13は、エンテロキナーゼによる融合タンパク質の切断によって遊離し、この後で「マウスC-IL-13-S」と呼ばれるタンパク質となり、配列番号:329の配列を有する。
20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の120μMのQβキャプシドの溶液を、ロッキングシェーカー上において25℃で、DMSO中の原液から希釈した25倍モル濃度を超えるSMPH(Pierce)の溶液と30分間反応させる。 この反応液について、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなう。この透析したQβ反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上において25℃で4時間、マウスC-IL-13-F又はマウスC-IL-13-S溶液(最終濃度:60μM Qβキャプシドタンパク質、60μM マウスC-IL-13-F又はマウスC-IL-13-S)と反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の120μMのfrキャプシドの溶液を、ロッキングシェーカー上において25℃で、DMSO中の原液から希釈した25倍モル濃度を超えるSMPH(Pierce)の溶液と30分間反応させる。この反応液について、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなう。この透析したfr反応溶液を、その後、ロッキングシェーカー上において25℃で4時間、マウスC-IL-13-F又はマウスC-IL-13-S溶液(最終濃度:60μM frキャプシドタンパク質、60μM マウスC-IL-13-F、マウスC-IL-13-S)と反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の120μM HBcAg-lys-2cys-Mutキャプシドの溶液を、ロッキングシェーカー上において25℃で、DMSO中の原液から希釈した25倍モル濃度を超えるSMPH(Pierce)の溶液と30分間反応させる。この反応液について、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなう。この透析したHBcAg-lys-2cys-Mut反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上において25℃で4時間、マウスC-IL-13-F又はマウスC-IL-13-S溶液(最終濃度:60μM HBcAg-lys-2cys-Mut、60μM マウスC-IL-13-F又はマウスC-IL-13-S溶液)と反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
20mM Hepes、pH7.4中の125μM 大腸菌の1型線毛の溶液を、ロッキングシェーカー上でのRTで、60分間、DMSO(Pierce)中の原液から希釈した50倍モル濃度を超える架橋剤SMPHと反応させる。この反応混合物は、PD-10カラム(アマシャム ファルマシア バイオテク)上で脱塩する。このカラムから溶出したタンパク質含有分画をプールし、脱塩し誘導体化した線毛タンパク質をロッキングシェーカー上において25℃で4時間、マウスC-IL-13-F又はマウスC-IL-13-S溶液(最終濃度:60μM 線毛、60μM マウスC-IL-13-F又はマウスC-IL-13-S)と反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
A.大腸菌における封入体としての発現のためのIL-5のクローニング
IL-5は、以下の2つのプライマーを用いるPCRによって、ATCCクローン(pmIL5-4G;ATCC番号37562)から増幅した:Spelinker3-F1(配列番号:340)及びIL5StopXho-R(配列番号:342)。このPCRの産物は、プライマーSpeNlinker3-F2(配列番号:341)及びIl5StopXho-Rによる二番目のPCRでのテンプレートとして利用した。挿入物は、SpeI及びNotIで消化した。この挿入物は、NheI及びNotI(脱リン酸化していない)によって前もって消化したpETベクター誘導体(pMODEC3-8ベクター)へライゲーションし、大腸菌TG1細胞へ形質転換した。pMODEC3-8ベクターへクローニングすることによって生成したIL5コンストラクトは、エンテロキナーゼ部位、C末端に配列ASが近接し、N末端に配列ALVが近接しているシステイン残基を含有するN末端ガンマ3アミノ酸リンカー、及びIL5遺伝子の成熟型が後に続くN末端のヘキサヒスチジンタグを有する。エンテロキナーゼによる切断によって遊離されるタンパク質は、「マウスC-IL-5-E」(配列番号:332)と呼ばれる。配列がDNAシーケンシングによって確かめられたプラスミドDNAの結果として生じたクローンpMODC6-IL5.2(pMODC6-IL5とも呼ばれる)を大腸菌株BL21へ形質転換した。
レーンM:マーカー(NEB、Broad range prestained marker)。レーン1:誘導前の1ml培養の細胞抽出物。レーン2:誘導の4時間後の1ml培養の細胞抽出物。
a)N末端でシステイン残基を含有するアミノ酸リンカーと融合し、C末端でFc断片と融合したIL-5
(A)(ATCCクローン37562)で記載されたテンプレートを、以下のコンストラクトのクローニングに用いた。プラスミドpMODB1-IL5(pET誘導体の1つ)をBamHI/XhoIで消化し、システインを含有するN末端アミノ酸リンカーと融合したIL5をコードする小断片を得た。この断片は、BamHI及びXhoIで前もって消化したベクターpCEP-SP-XA-Fc*(△Xho)でライゲーションした。ライゲーションしたものを大腸菌株TG1へ電気穿孔し、DNAシーケンシングによって配列が確かめられたプラスミドDNAの結果として得られたクローンpCEP-SP-IL5-Fc.2を、HEK-293T細胞をトランスフェクトするのに用いた。このプラスミドによってコードされる結果として得られたIL-5コンストラクトは、IL-5成熟配列のN末端に融合したアミノ酸配列ADPGCGGGGGLAを有していた。この配列は、システインを有し、クローニング手順の間に導入された付加的なアミノ酸が近接しているアミノ酸リンカー配列GCGGGGGを含む。Xa因子での融合タンパク質の切断によって遊離したIL-5タンパク質は、この後、「マウスC-IL-5-F」(配列番号:333)と命名されている。
図17Bのウェスタンブロットに負荷した試料は、以下の通りである:
レーン1:IL5-Fcを発現しているHEK培養の上澄み液(20μl)。SDS-PAGEは、還元条件下でおこなった。レーン2:IL13-Fcを発現しているHEK培養の上澄み液(20μl)。SDS-PAGEは、非還元条件下でおこなった。レーン3:IL5-Fcを発現しているHEK培養の上澄み液(20μl)。SDS-PAGEは、非還元条件下でおこなった。
IL-5(ATCC37562)を、プライマーNhe-link1-IL13-F及びIL5StopXho-Rで増幅した。NheI及びXhoIで消化した後、挿入物をNheI及びXhoIで前もって消化したpCEP-SP-GST-EKへライゲーションした。その結果として得られたプラスミドpCEP-SP-GST-IL5をシーケンシングし、HEK-293T細胞のトランスフェクションに用いた。このプラスミドによってコードされた結果として得られたIL-5コンストラクトは、IL-5成熟配列のN末端で融合したアミノ酸配列LACGGGGGを有していた。この配列は、システイン残基を有し、クローニング手順の間に導入された付加的なアミノ酸が近接しているアミノ酸リンカー配列ACGGGGGを含む。エンテロキナーゼによる切断で遊離したタンパク質は、今後、「マウスC-IL-5-S」(配列番号:334)と命名された。この結果として得られたタンパク質の精製は、グルタチオンアフィニティー樹脂によるアフィニティークロマトグラフィーによっておこなわれた。
20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の120μMのQβキャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上において25℃で、DMSO中の原液から希釈した25倍モル濃度を超えるSMPH(Pierce)の溶液と30分間反応させる。この反応液について、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなう。この透析したQβ反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上において25℃で4時間、マウスC-IL-5-F又はマウスC-IL-5-S溶液(最終濃度:60μM Qβキャプシドタンパク質、60μM マウスC-IL-5-F又はマウスC-IL-5-S)と反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の120μMのfrキャプシドの溶液を、ロッキングシェーカー上において25℃で、DMSO中の原液から希釈した25倍モル濃度を超えるSMPH(Pierce)の溶液と30分間反応させる。この反応液について、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなう。この透析したfr反応溶液を、その後、ロッキングシェーカー上において25℃で4時間、マウスC-IL-5-F又はマウスC-IL-5-S溶液(最終濃度:60μM frキャプシドタンパク質、60μM マウスC-IL-5-F又はマウスC-IL-5-S)と反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の120μM HBcAg-Lys-2cys-Mutキャプシドの溶液を、ロッキングシェーカー上において25℃で、DMSO中の原液から希釈した25倍モル濃度を超えるSMPH(Pierce)の溶液と30分間反応させる。この反応液について、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなう。この透析したHBcAg-Lys-2cys-Mut反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上において25℃で4時間、マウスマウスC-IL-5-F又はマウスC-IL-5-S溶液(最終濃度:60μM HBcAg-Lys-2cys-Mut、60μM マウスC-IL-5-F又はマウスC-IL-5-S溶液)と反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
20mM Hepes、pH7.4中の125μM 大腸菌の1型線毛の溶液を、ロッキングシェーカー上でのRTで、60分間、DMSO(Pierce)中の原液から希釈した50倍モル濃度を超える架橋剤SMPHと反応させる。この反応混合物は、PD-10カラム(アマシャム ファルマシア バイオテク)上で脱塩する。このカラムから溶出したタンパク質含有分画をプールし、脱塩し誘導体化した線毛タンパク質をロッキングシェーカー上において25℃で4時間、マウスC-IL-5-F又はマウスC-IL-5-S溶液(最終濃度:60μM 線毛、60μM マウスC-IL-5-F又はマウスC-IL-5-S)と反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
二番目と3番目の細胞外ドメインを含んでなるマウス内皮成長因子-2(mVEGFR-2、FLK1)を、VLPs及び線毛とのカップリングのためにC末端にシステイン残基を含有するアミノ酸リンカーをともなうFc融合タンパク質として組み換え発現した。mVEGFR-2(2-3)のタンパク質配列は、マウスFLK-1のcDNA配列から翻訳された((Matthewsら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9026-9030(1991)):寄託番号:X59397;Ig-様 C2-型ドメイン2:アミノ酸143-209;Ig-様 C2-型ドメイン3:アミノ酸241-306)。mVEGFR-2(2-3)コンストラクトは、アミノ酸プロリン126からリジン329のmVEGFR-2の配列を含む(前駆体タンパク質の番号を付けることで)。このコンストラクトは、免疫グロブリン様C2型ドメイン2及び3の他に、mVEGFR-2の配列のドメイン2の前及びドメイン3の後の近接する領域をも含み、アミノ酸スペーサー部分を付加する。システイン残基を含有するアミノ酸リンカーは、pCEP-SP-EK-Fc*ベクターへのクローニング(実施例1)を介して、mVEGFR-2配列のC末端と融合した。pCEP-SP-EK-Fc*ベクターへクローニングされたmVEGFR-2の断片は、以下のアミノ酸配列(配列番号:345)をコードした:
PFIAS VSDQHGIVYI TENKNKTVVI PCRGSISNLN VSLCARYPEK
RFVPDGNRIS WDSEIGFTLP SYMISYAGMV FCEAKINDET YQSIMYIVVV
VGYRIYDVIL SPPHEIELSA GEKLVLNCTA RTELNVGLDF TWHSPPSKSH
HKKIVNRDVK PFPGTVAKMF LSTLTIESVT KSDQGEYTCV ASSGRMIKRN
RTFVRVHTKP
組み換えmVEGFR-2(2-3)を、pCEP-SP-EK-Fc*ベクターを用いて、EBNA293細胞で発現させた。pCEP-SP-EK-Fc*ベクターは、BamHI及びNhe1部位を有し、1つのシステイン残基を含有するアミノ酸リンカー、エンテロキナーゼ切断部位、及びC末端にヒトFc領域をコードしている。mVEGFR-2(2-3)を、マウスの7日目胎児のcDNA(Marathon-Ready cDNA, Clontech)からのプライマー対BamH1-FLK1-F及びNhe1-FLK1-BによるPCRによって増幅した。PCR反応に関しては、10pmolの各オリゴ及び0.5ngのcDNA(マウス7日胎児cDNA Marathon-Ready cDNA, Clontech)を、50●l 反応混合液(1●lのAdvantage 2ポリメラーゼ ミックス(50x)、0.2mM dNTPs及び5●l 10x cDNA PCR反応緩衝液)で用いた。温度サイクルは以下の通りである:1分間の94●Cを5サイクル、30秒間の94●C、30秒間の54●C、1分間の72●C、その後に続く5サイクルの94●C(30秒)、54●C(30秒)、70●C(1分)及びその後に続く30サイクルの94●C(20秒)、54●C(30秒)及び68●C(1分)。このPCR産物をBamH1及びNhe1で消化し、同じ酵素で消化したpCEP-SP-EK-Fc*ベクターへ挿入した。結果として得られたプラスミドは、mVEGFR-2(2-3)-pCep-EK-Fcと命名された。すべての他の段階は、標準的分子生物学プロトコールによっておこなわれた。
1.プライマーBamH1-FLK1-F
5'-CGCGGATCCATTCATCGCCTCTGTC-3' (配列番号:343)
2.プライマーNhe1-FLK1-B
5'-CTAGCTAGCTTTGTGTGAACTCGGAC-3' (配列番号:344)
組み換え体mVEGFR-2(2-3)のトランスフェクション及び発現
EBNA293細胞を、上記のmVEGFR-2(2-3)-pCep-Ek-Fcコンストラクトでトランスフェクトし、実施例1に記載のような精製のために細胞の無血清上澄み液を収集した。
発現Fc-EK-mVEGFR-2(2-3)タンパク質のプロテインA精製を、実施例1に記載のようにおこなった。続いて、融合タンパク質のプロテインAとの結合の後、エンテロキナーゼ(EnterokinaseMax, インビトロジェン)を用いて、プロテインAと結合したFc部分からmVEGFR-2(2-3)を切断した。消化は、37●Cで終夜おこなった(2.5ユニット エンテロキナーゼ/結合融合タンパク質を有する100μlプロテインAビーズ)。遊離したmVEGFR-2(2-3)を、クロマトグラフィーカラム(Micro Bio Spin, Biorad)での短い遠心分離によって、いまだプロテインAと結合しているFc部分から分離した。エンテロキナーゼを除くために、製造者の指示書に従って、貫流液をエンテロキナーゼアウェイ(インビトロジェン)で処理した。
A.マウスVEGFR-2ペプチドのVLPs及び線毛とのカップリング
以下のペプチドを化学的に合成した(Eurogentec, Belgium):マウスVEGFR-2ペプチドCTARTELNVGLDFTWHSPPSKSHHKK、及び下記のように線毛との化学的カップリングに用いた。
レーン1:マーカータンパク質;レーン2-5:カップリングした試料(線毛マウス:マウスペプチドとカップリングした線毛;線毛ヒト:ヒトペプチドとカップリングした線毛);レーン6:Sulfo-MBS架橋剤で誘導体化した線毛;レーン7-9:PD-10カラムの溶出液の3分画。分画2はピーク分画、分画1及び3は、ピークの境界で取得した分画。カップリングバンドは、ゲル上で明白に見ることが可能であり、それは、マウスVEGFR-2の線毛とのカップリングが成功したことを示している。
レーン1:マーカータンパク質;レーン2、5:Qβキャプシドタンパク質;レーン3,6:Sulfo-MBSで誘導体化したQβキャプシドタンパク質;レーン4,7:マウスVEGFR-2ペプチドとカップリングさせたQβキャプシドタンパク質。カップリングバンドは、ゲル上で明白に見ることが可能であり、このことは、マウスVEGFR-2のQβキャプシドタンパク質とのカップリングが成功したことを示している。
レーン1:マーカータンパク質;レーン2,4,6,8:10倍モル濃度を超えるペプチドとおこなった上澄み液(S)及びペレット(P)のカップリング反応;レーン3,5,7,9:2.5倍モル濃度を超えるペプチドとおこなった上澄み液(S)及びペレット(P)のカップリング反応;レーン10:Sulfo-MBSで誘導体化したHbcAg-lys-2cys-Mut;レーン11:HbcAg-lys-2cys-Mut。
カップリングバンドは、ゲル上で明白に見ることが可能であり、このことは、マウスVEGFR-2のHbcAg-lys-2cys-Mutタンパク質とのカップリングが成功したことを示している。
線毛-ペプチドワクチン:
雌C3H-HeJ(Toll様レセプター4欠損)及びC3H-HeN(野生型)マウスを、アジュバンドの添加無しに、線毛タンパク質とカップリングしたマウスVEGFR-2ペプチドでワクチン接種した。各試料のおよそ100μgの全タンパク質をPBSで希釈して200μlとし、0日目、14及び28日目に皮下注射した。マウスを14、28及び42日目に逆軌道で出血させ、42日目の血清をヒトVEGFR-2特異的 ELISAを利用して分析した。
6匹の 雌黒マウスを、アジュバンド(水酸化アルミニウム)の添加した場合としない場合で、Qβキャプシドタンパク質とカップリングしたマウスVEGFR-2ペプチドでワクチン接種した。各試料のおよそ100μgの全タンパク質をPBSで希釈して200μlとし、0日目、14及び28日目に皮下注射した。マウスを14、28及び42日目に逆軌道で出血させ、42日目の血清をヒトVEGFR-2特異的 ELISAを利用して分析した。
6匹の 雌黒マウスを、アジュバンド(水酸化アルミニウム)の添加した場合としない場合で、HbcAg-lys-2cys-Mutタンパク質とカップリングしたマウスVEGFR-2ペプチドでワクチン接種した。各試料のおよそ100μgの全タンパク質をPBSで希釈して200μlとし、0日目、14及び28日目に皮下注射した。マウスを14、28及び42日目に逆軌道で出血させ、42日目の血清をヒトVEGFR-2特異的 ELISAを利用して分析した。
免疫化マウスの血清を、固定化マウスVEGFR-2ペプチドによるELISAで試験した。マウスVEGFR-2ペプチドを、化学架橋剤Sulfo-SPDPを用いたウシリボヌクレアーゼ(RNAse)とカップリングさせた。ELISAプレートは、10μg/mlの濃度のカップリングさせたRNAseAでコーティングした。このプレートをブロックし、その後、連続希釈したマウス血清でインキュベートした。結合した抗体は、酵素的に標識した抗マウスIgG抗体で検出した。コントロールとして、同じマウスの免疫前血清も試験した。カップリングしていない担体で免疫化したマウスの血清を用いたコントロールELISA実験によって、検出された抗体がそれぞれのペプチドに対して特異的であることが示された。この結果は、図4-6に示されている。
ELISAの結果が、図18Dに示されている。示された血清希釈に関する結果は、450nmでの光学密度により示している。各3匹のマウスの平均(標準偏差を含む)が示されている。すべてのワクチン化したマウスは、マウスVEGFR-2ペプチドに対するIgG抗体力価を作り出した。Toll様レセプター4が欠損しているマウスと野生型マウスの間では、何の違いも認められず、このことは、線毛とカップリングした場合の、マウスでの自己抗原マウスVEGFR-2ペプチドの免疫原性を示している。マウスに注入されたワクチンは、対応する分析された血清を表している。
指示された血清希釈に関する結果が、450nmでの光学密度として図18Eに示されている。各2匹のマウスの平均(標準偏差を含む)が示されている。すべてのワクチン化したマウスは、マウスVEGFR-2ペプチドに対するIgG抗体力価を作り出し、このことは、Qβキャプシドタンパク質とカップリングした場合の、マウスでの自己抗原マウスVEGFR-2ペプチドの免疫原性を示している。マウスに注入されたワクチンは、対応する分析された血清を表している。
指示された血清希釈に関する結果が、450nmでの光学密度として図18Fに示されている。各3匹のマウスの平均(標準偏差を含む)が示されている。すべてのワクチン化したマウスは、マウスVEGFR-2ペプチドに対するIgG抗体力価を作り出し、このことは、Qβキャプシドタンパク質とカップリングした場合の、マウスでの自己抗原マウスVEGFR-2ペプチドの免疫原性を示している。マウスに注入されたワクチンは、対応する分析された血清を表している。
以下のAβペプチドを化学的に合成した
ヒトAβの残基1-15のアミノ酸配列を含むペプチドで、VLPs及び線毛とのカップリングのために、そのC末端で配列GGCと融合した(DAEFRHDSGYEVHHQGGC)。
833.3μlの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.4中の1.2mg/ml HBc-Ag-lys-2cys-Mutタンパク質の溶液を、30分間、ロッキングシェーカー上にて25℃でH2O中の17μlの65mM SMPH(Pierce)溶液と反応させた。この反応溶液については、その後、2回、分画分子量10000Daの透析チューブによって、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対して2時間の透析をした。833.3μlのこの透析反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上にて15℃で2時間、7.1μlの50mM ペプチド原液(DMSO中のペプチド原液)と反応させた。この反応混合液については、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対して終夜、透析をした。この試料は、その後、液体窒素でアリコートで凍結し、マウスの免疫化まで−80℃で貯蔵した。
500μlの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.4中の2mg/ml frキャプシドタンパク質の溶液を、30分間、ロッキングシェーカー上にて25℃でH2O中の23μlの65mM SMPH(Pierce)溶液と反応させた。この反応溶液については、その後、2回、分画分子量10000Daの透析チューブによって、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対して2時間の透析をした。500μlのこの透析反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上にて15℃で2時間、5.7μlの50mM ペプチド原液(DMSO中のペプチド原液)と反応させた。この反応混合液については、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対して終夜、透析をした。この試料は、その後、液体窒素でアリコートで凍結し、マウスの免疫化まで−80℃で貯蔵した。試料のカップリング反応は、還元条件下のSDS-PAGEによって分析した。
以下の試料を、図19Aのゲルに負荷した。
1:タンパク質マーカー(kDa マーカー7708S BioLabs.ゲルの頂点からの分子量マーカーバンド:175,83,62,47.5,32.5,25,16.5,6.5kDa)。2:誘導体化HBc-Ag-lys-2cys-Mut.3:Aβ1-15とカップリングしたHBc-Ag-lys-2cys-Mut、カップリング反応の最後に取得した試料の上澄み液、及びその遠心分離したもの。4:Aβ1-15とカップリングしたHBc-Ag-lys-2cys-Mut、カップリング反応の最後に取得した試料のペレット、及びその遠心分離したもの。5:誘導体化frキャプシドタンパク質。6:Aβ1-15とカップリングしたfrキャプシドタンパク質、カップリング反応の最後に取得した試料の上澄み液、及びその遠心分離したもの。4:Aβ1-15とカップリングしたfrキャプシドタンパク質、カップリング反応の最後に取得した試料のペレット、及びその遠心分離したもの。
雌Balb/cマウスは、無菌PBSで希釈した10μgのAβ1-15とカップリングさせたfrキャプシドタンパク質(Fr-Aβ1-15)、又は10μgのAβ1-15とカップリングさせたHBc-Ag-lys-2cys-Mut(HBc-Aβ1-15)のいずれかで、0日目及び14日目の2回、ワクチン接種した。マウスを22日目に逆軌道で出血させ、その血清をAβ1-15-特異的 ELISAを利用して分析した。
化学架橋剤sulfo-SPDPを用いて、Aβ1-15ペプチドをウシRNAse Aとカップリングさせた。ELISAプレートは、10μg/mlの濃度でAβ1-15-リボヌクレアーゼ(RNAse) コンジュゲートでコーティングした。このプレートをブロックし、その後、連続的に希釈した血清試料とともにインキュベートした。結合した抗体は、酵素的に標識した抗-マウスIgGで検出した。コントロールとして、未処理マウスの血清も試験した。
図19Bに示されているのは、それぞれワクチンFr-Aβ 1-15、及びHBc-Aβ1-15で免疫化したマウスの血清で、22日目に得られたELISAシグナルである。未処理マウス(免疫前血清)のコントロール血清も含まれた。異なる血清希釈の結果は、450nmの光学密度で示している。各3匹のワクチン接種マウスから得られた平均的な結果が示されている。すべてのワクチン接種マウスは、その血清にAβ1-15-特異的IgG抗体を有する。
架橋剤SMPHを用いたAβ1-15、Aβ1-27及びAβ33-42ペプチドの線毛とのカップリング。
以下のAβペプチドを化学的に合成した:
ヒトAβの残基1-15のアミノ酸配列を含むペプチドで、線毛及びVLPsとのカップリングのために、そのC末端で配列GGCと融合したDAEFRHDSGYEVHHQGGC(「Aβ1-15」)、
ヒトAβの残基1-27のアミノ酸配列を含むペプチドで、線毛及びVLPsとのカップリングのために、そのC末端で配列GGCと融合したDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNGGC(「Aβ1-27」)、及び
Aβの残基33-42のアミノ酸配列を含むペプチドで、線毛及びVLPsとのカップリングのために、そのN末端で配列CGHGNKSと融合したCGHGNKSGLMVGGVVIA(「Aβ33-42」)。全3ペプチドは、以下に記載のような線毛との化学カップリングに用いた。
200μlの解凍脱塩反応混合物を、その後、ロッキングシェーカー上にてRTで3.5時間、200μl DMSO及び2.5μlの各対応するDMSO中の50mM ペプチド原液と混合させた。400μlの反応混合液を、その後3回、分画分子量10000Daの透析チューブによって、4℃で1リッターの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対して1時間の透析を3回した。この試料は、その後、液体窒素でアリコートで凍結し、−80℃で貯蔵した。
カップリング実験の結果は、還元条件下のSDS-PAGEによって分析した。全3ペプチドに関して、明らかなカップリングバンドを見ることができ、このことは、Aβペプチドの線毛とのカップリングを示している。
A.APP23マウスの免疫化
3つの異なるAβペプチド(Aβ1-27-Gly-Gly-Cys-NH2;H-Cys-Gly-His-Gly-Asn-Lys-Ser-Aβ33-42;Aβ1-15-Gly-Gly-Cys-NH2)をQβキャプシドタンパク質とカップリングさせた。結果として得られたワクチンは、「Qb-Ab1-15」、「Qb-Ab1-27」、「Qb-Ab33-42」と呼ばれた。ヒトAPP導入遺伝子を有する8ヶ月齢の雌APP23マウス(Sturchler-Pierratら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 13287-13292(1997))を、ワクチン接種に用いた。このマウスを、無菌PBSで希釈した25μgワクチンで皮下注射し、14日後に、同じ量のワクチンで追加免疫した。免疫化の開始前及び追加免疫注射の7日後に、マウスを尾部から出血させた。血清は、ELISAによって分析した。
Aβ1-40及びAβ1-42ペプチド原液をDMSO中で作製し、使用する前にコーティング緩衝液で希釈した。ELISAプレートは、0.1μg/ウェルAβ1-40又はAβ1-42ペプチドでコーティングした。このプレートをブロックし、その後、連続希釈マウス血清とともにインキュベートした。結合した抗体は、酵素的に標識した抗マウスIgG抗体で検出した。コントロールとして、ワクチン接種前に得た血清も含めた。ベースラインより上の平均値±3標準偏差を示す血清希釈を計算し、「ELISA力価」として定義した。試験された3つのワクチンすべては、APP23マウスで免疫原性があり、Aβペプチド1-40及び/又はAβ1-42に対する高い抗体力価を誘導した。この結果は、図20に示されている。同じマウスの免疫前血清では、特異的な抗体は検出されなかった(データは示さず)。
20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の4.0mg/ml Qβキャプシドタンパク質の溶液を、30分間、ロッキングシェーカー上にて25℃で2.8mM SMPH(Pierce)(DMSOに溶解した原液から)と反応させた。この反応溶液については、その後、2回、4℃で2lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対して2時間の透析をした。
ヒトIgGのパパイン消化によって産生されたヒトIgGのFab断片を、Jackson Immunolabから購入した。この溶液(11.1mg/ml)を、20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中で2.5mg/mlの濃度へと希釈し、ジチオスレイトール(DTT)又はトリカルボキシエチルホスフィン(TCEP)のいずれかの異なる濃度(0-1000μM)と25℃で30分間反応させた。
その反応産物は、還元条件下の16%SDS-PAGEゲル上で分析した。ゲルは、クーマシーブリリアントブルーで染色した。この結果は、図21に示されている。
約40kDaのカップリング産物は、Fabが、10μM TCEP、10μM DTT又は1000μM DTTではなくて、25-1000μM TCEP及び25-100μM DTT(図21、矢印)によるカップリングの前に還元された試料中で検出されることが可能である。このカップリングしたバンドは、抗Qβ抗血清とも反応し(データは示さず)、このことは、Qβキャプシドタンパク質とFab断片の共有的カップリングを明示している。
レーン1:分子量マーカー。レーン2及び3:カップリング前の誘導体化Qβキャプシドタンパク質。レーン4-13:4によるFabの還元後のQβ-Fabカップリング反応 4:10μM TCEPによるFabの還元後のQβ-Fabカップリング反応。5:25μM TCEPによるFabの還元後のQβ-Fabカップリング反応。6:50μM TCEPによるFabの還元後のQβ-Fabカップリング反応。7:100μM TCEPによるFabの還元後のQβ-Fabカップリング反応。8:1000μM TCEPによるFabの還元後のQβ-Fabカップリング反応。9:10μM DTTによるFabの還元後のQβ-Fabカップリング反応。10:25μM DTTによるFabの還元後のQβ-Fabカップリング反応。11:50μM DTTによるFabの還元後のQβ-Fabカップリング反応。12:100μM DTTによるFabの還元後のQβ-Fabカップリング反応。13:1000μM DTTによるFabの還元後のQβ-Fabカップリング反応。レーン14:カップリング前。このゲルは、クーマシーブリリアントブルーで染色した。マーカータンパク質の分子量は、左端に示されている。その矢印は、カップリングしたバンドを示す。
A.APP23マウスの免疫化
3つの異なるAβペプチド(Aβ1-27-Gly-Gly-Cys-NH2;H-Cys-Gly-His-Gly-Asn-Lys-Ser-Aβ33-42;Aβ1-15-Gly-Gly-Cys-NH2)をQβキャプシドタンパク質とカップリングさせた。結果として得られたワクチンは、「Qb-Ab1-15」、「Qb-Ab1-27」、「Qb-Ab33-42」と呼ばれた。ヒトAPP導入遺伝子を有する8ヶ月齢の雌APP23マウス(Struchler-Pierratら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 13287-13292(1997))を、ワクチン接種に用いた。このマウスを、無菌PBSで希釈した25μgワクチンで皮下注射し、14日後に、同じ量のワクチンで追加免疫した。免疫化の開始前及び追加免疫注射の7日後に、マウスを尾部から出血させた。血清は、ELISAによって分析した。
Aβ1-40及びAβ1-42ペプチドをDMSO中で作製し、使用する前にコーティング緩衝液で希釈した。ELISAプレートは、0.1μg/ウェルAβ1-40又はAβ1-42ペプチドでコーティングした。このプレートをブロックし、その後、連続希釈マウス血清とともにインキュベートした。結合した抗体は、酵素的に標識した抗マウスIgG抗体で検出した。コントロールとして、ワクチン接種前に得た血清も含めた。ベースラインより上の平均値±3標準偏差(σ)を示す血清希釈を計算し、「ELISA力価」として定義した。試験された3つのワクチンすべては、APP23マウスで免疫原性があり、Aβペプチド1-40及び/又はAβ1-42に対する高い抗体力価を誘導した。この結果は、図20示されている。同じマウスの免疫前血清では、特異的な抗体は検出されなかった(データは示さず)。
pQβ-240の構築
プラスミドpQβ10(Kozlovska, TM, ら, Gene 137:133-137)を、pQβ-240の構築のための初期プラスミドとして用いた。変異Lys13→Argは、インバースPCRによって作製した。逆方向プライマーを、逆方向のテールからテール方向で消化した:
5'-GGTAACATCGGTCGAGATGGAAAACAAACTCTGGTCC-3' 及び
5'-GGACCAGAGTTTGTTTTCCATCTCGACCGATGTTACC-3'。
5'-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3' 及び下流プライマー
5'-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3'
を用いた。二回目のPCRの産物を、XbaI及びMph1103Iで消化し、同じ制限酵素によって切断したpQβ10発現ベクターへクローニングした。PCR反応は、PCRキット試薬、及び手順プロトコールに従っておこなった(MBI Fermentas、ヴィリニゥス、リトアニア)。
結果として得られたアミノ酸配列:(配列番号:255)
AKLETVTLGNIGRDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP
ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTANGSCDPSVTRQ
KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDQLNPAY
プラスミドpQβ10を、pQβ-243の構築のための初期プラスミドとして用いた。変異Asn10→Lysは、インバースPCRによって作製した。逆方向プライマーを、逆方向のテールからテール方向で消化した:
5'-GGCAAAATTAGAGACTGTTACTTTAGGTAAGATCGG-3' 及び
5'-CCGATCTTACCTAAAGTAACAGTCTCTAATTTTGCC-3'。
5'-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3' 及び下流プライマー
5'-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3'
を用いた。二回目のPCRの産物を、XbaI及びMph1103Iで消化し、同じ制限酵素によって切断したpQβ10発現ベクターへクローニングした。PCR反応は、PCRキット試薬、及び手順プロトコールに従っておこなった(MBI Fermentas、ヴィリニゥス、リトアニア)。
結果として得られたアミノ酸配列:(配列番号:256)
AKLETVTLGKIGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP
ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ
KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY
プラスミドpQβ-240を、pQβ-250の構築のための初期プラスミドとして用いた。変異Lys2→Argは、部位特異的突然変異法によって作製した。上流プライマー
5'-GGCCATGGCACGACTCGAGACTGTTACTTTAGG-3' 及び
下流プライマー5'-GATTTAGGTGACACTATAG-3' を独特の制限部位NcoI及びHind IIIでpQβ-185発現ベクターへ導入された、変異体PCR断片の合成のために用いた。PCR反応は、PCRキット試薬、及び手順プロトコールに従っておこなった(MBI Fermentas、ヴィリニゥス、リトアニア)。
結果として得られたアミノ酸配列:(配列番号:257)
ARLETVTLGNIGRDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP
ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ
KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLASPLLIDAIDQLNPAY
プラスミドpQβ10を、pQβ-251の構築のための初期プラスミドとして用いた。変異Lys16→Argは、インバースPCRによって作製した。逆方向プライマーを、逆方向のテールからテール方向で消化した:
5'-GATGGACGTCAAACTCTGGTCCTCAATCCGCGTGGGG-3' 及び
5'-CCCCACGCGGATTGAGGACCAGAGTTTGACGTCCATC-3'。
5'-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3' 及び下流プライマー
5'-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3'
を用いた。二回目のPCRの産物を、XbaI及びMph1103Iで消化し、同じ制限酵素によって切断したpQβ10発現ベクターへクローニングした。PCR反応は、PCRキット試薬、及び手順プロトコールに従っておこなった(MBI Fermentas、ヴィリニゥス、リトアニア)。
プラスミドpQβ-251を、pQβ-259の構築のための初期プラスミドとして用いた。変異Lys2→Argは、部位特異的突然変異法によって作製した。上流プライマー
5'-GGCCATGGCACGACTCGAGACTGTTACTTTAGG-3' 及び
下流プライマー5'-GATTTAGGTGACACTATAG-3' を独特の制限部位NcoI及びHind IIIでpQβ-185発現ベクターへ導入された、変異体PCR断片の合成のために用いた。PCR反応は、PCRキット試薬、及び手順プロトコールに従っておこなった(MBI Fermentas、ヴィリニゥス、リトアニア)。
結果として得られたアミノ酸配列:(配列番号:258)
AKLETVTLGNIGKDGKQTLVLNPRGVNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP
ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQKIQNPTACTANGSCDPSVTTRQ
KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLDAIDQLNPAY
発現
大腸菌JM109をQ-β発現プラスミドで形質転換する。5mlのLB液体培地に、20●g/mlアンピシリン、Q-β発現プラスミドで形質転換したクローンを接種する。振盪せずに、37℃で16-24時間インキュベートする。
20●g/mlを含有するLB培地の100-300mlに、1:100で調製した種菌をせ接種する。振盪せずに、37℃で16-24時間インキュベートする。フラスコ中のM9+1%カザミノ酸+0.2%グルコース培地を、調製した種菌1:50で接種し、振盪下で終夜、37℃でインキュベートする。
精製方法のための溶液及び緩衝液:
1.溶解緩衝液LB
50mM EDTA、0.1%トリトンX100及び新鮮に調製したPMSFを1mlあたり5マイクログラムを含む、50mM トリス-HCl pH8.0。リゾチーム及びデオキシリボヌクレアーゼ(DNase)を含まない。
2.SAS
水中の飽和硫酸アンモニウム
3.緩衝液NET.
5mM EDTA及び150mM NaClを含む、20mM トリス-HCl pH7.8。
4.PEG
NET中の40%(w/v)ポリエチレングリコール6000
凍結細胞を、2ml/g細胞でLBに懸濁した。この混合液を、氷上で溶液を冷やすための1分間のインターバルを含めて、5回の15秒間の22kHによって超音波処理をした。このライセートを、その後でJanecki K 60 ローターを用いて1時間、14000rpmで遠心分離した。下記の遠心分離ステップは、別途記載がなければ、同じローターを用いて、すべてをおこなった。その上澄み液を4℃で貯蔵し、その一方では、細胞片をLBで2回洗浄した。遠心分離の後、ライセートと洗浄分画の上澄み液をプールした。
飽和硫酸アンモニウム溶液を、撹拌しながら、上記をプールしライセートへ滴状に添加した。SASの容量は、20%の飽和を得るように、全容量の5分の1となるように調製した。この溶液は、終夜、静置させ、次の日に20分間、14000rpmで遠心分離した。ペレットを、少量の20%硫酸アンモニウムで洗浄し、再び遠心分離した。得られた上澄み液をプールし、40%の飽和を得るために、SASを滴状に添加した。この溶液を終夜、静置させ、次の日に20分間、14000rpmで遠心分離した。得られたペレットは、NET緩衝液で可溶化した。
NET緩衝液に再可溶化したキャプシドタンパク質を、セファロースCL-4Bカラムに負荷した。クロマトグラフィーの間に、3つのピークが溶出した。最初のものは、主に膜及び膜断片を有しており、収集しなかった。キャプシドは、二番目のピークに含まれており、その一方で、3番目のピークは他の大腸菌タンパク質を有していた。
このピーク分画をプールし、NaCl濃度を0.65Mの最終濃度へ調製した。プールしたピーク分画の2分の1に相当するPEG溶液の容量を、撹拌しながら滴状に添加した。この溶液は、終夜、静置させた。キャプシドタンパク質は、20分間の14000rpmでの遠心分離によって沈降させた。その後、それを最少容量のNETに可溶化し、再びセファロースCL-4Bカラムに負荷した。そのピーク分画をプールし、60%の飽和で硫酸アンモニウムによって沈殿させた。遠心分離及びNET緩衝液での再可溶化の後、再クロマトグラフィーのために、キャプシドタンパク質をセファロースCL-6Bに負荷した。
上記で得られたピーク分画をプールし、無菌水に対して十分に透析し、貯蔵のために凍結乾燥した。
細胞(プラスミドpQβ-240で形質転換した大腸菌JM109)をLBに再懸濁し、15秒間で5回、超音波処理(ウォーターアイスジャケット)し、1時間、13000rpmで遠心分離した。この上澄み液を、さらなる処理までに4℃で貯蔵し、その一方で、細胞片を9mlのLBで2回洗浄し、最後には、9mlのLBの0.7M尿素で洗浄した。すべての上澄み液をプールし、セファロースCL-4Bカラムに負荷した。プールピーク分画を、硫酸アンモニウムで沈殿させて遠心分離した。その再可溶化タンパク質を、その後、さらにセファロース2Bカラム、最終的にはセファロース6Bカラムで精製した。キャプシドピークを、最後に、水に対して十分に透析し、上記のようにして凍結乾燥した。キャプシドへのコートタンパク質のアセンブリは、電子顕微鏡検査法によって確かめた。
細胞(大腸菌RR1)を、一般的な手順に記載のようにLBに再懸濁して処理した。タンパク質は、セファロースCL-4Bカラム及び最後はセファロースCL-2Bカラムによる2連続ゲル濾過によって精製した。ピーク分画は、上記のようにして、プールして凍結乾燥した。キャプシドへのコートタンパク質のアセンブリは、電子顕微鏡検査法によって確かめた。
細胞(pQβ-250で形質転換した大腸菌JM109)を、上記のようにしてLBに再懸濁して処理した。タンパク質は、セファロースCL-4Bカラム及び最後はセファロースCL-2Bカラムによる2連続ゲル濾過で精製し、上記のようにして凍結乾燥した。ピーク分画は、上記のようにして、プールして凍結乾燥した。キャプシドへのコートタンパク質のアセンブリは、電子顕微鏡検査法によって確かめた。
細胞(pQβ-259で形質転換した大腸菌JM109)を、上記のようにしてLBに再懸濁し、超音波処理した。細胞片は、1回目は10mlのLBで、2回目は10mlのLB中の0.7M 尿素で洗浄した。タンパク質は、セファロースCL-4Bカラム及び最後はセファロースCL-2Bカラムによる2連続ゲル濾過によって精製した。タンパク質は、上記のようにして、透析して凍結乾燥した。キャプシドへのコートタンパク質のアセンブリは、電子顕微鏡検査法によって確かめた。
C.ワクチン接種によるアレルギー性マウスの脱感作
雌CBA/Jマウス(8週齢)をPLA2で感作した:マウスあたり、Latoxan(フランス)の0.1ug PLA2を、30分間ボルテックスすることによって1mg ミョウバン(Imject, Pierce)に吸収させて全容量を66ulとし、その後で皮下注射した。この工程を14日毎で合計4回繰り返した。この処理は、IgG2aではなく、PLA2特異的IgEの発生を引き出した。最後の感作の1ヶ月後、マウスに、Qβキャプシドタンパク質とカップリングさせた組み換えPLA2で構成される10ug ワクチンを皮下注射した。1及び2週間後に、それらマウスを、再び同じ量のワクチンで処理した。最後の処理の1週間後に、マウスを出血させて、その後で25ug PLA2(Latoxan)により腹腔内を免疫性の試験をし、直腸温を目盛り付きデジタル温度計を用いて60分間測定した。コントロールとしては、Qβキャプシドタンパク質-PLA2で処理していない感作マウスを用いた。すべてのコントロールマウスがPLA2による免疫性の試験後に直腸温の劇的な低下を反映するアナフィラキシー応答を経験する一方で、ワクチン接種されたマウスは、完全又は少なくとも部分的に保護された。結果は、図25Aに示されている。
ELISAプレート(Maxisorp、Nunc)を、5μg/mlのPLA2(Latoxan)でコーティングした。このプレートをブロックし、その後で連続希釈血清によってインキュベートした。IgE抗体の検出に関しては、血清を、室温のシェーカー上で60分間、プロテインGビーズ(ファルマシア)によって前処理した。このビーズは遠心分離で取り除き、その上澄み液をELISAに用いた。PLA2と結合した抗体は、酵素標識した抗マウスIgG2a又はIgE抗体で検出した。ELISA力価は、最高光学密度の半分(OD50%)で測定し、IgG2aの100倍前希釈血清のIog5として、そして、IgEの10倍前希釈血清のIog5として示された。すべてのマウスについては、血清中のPLA2-特異的IgG2a及びIgEを、ワクチン接種処理の前と終わりに測定した。ワクチン接種は、IgE力価に一貫した変化が見られないが、PLA2-特異的IgG2aの劇的な増加につながった。この結果は、ワクチン接種がTh1様免疫応答の誘導につながることをしめしている(IgG2aの産生による影響)。結果は、図25Bに示されている。
マウスをPLA2に感作させ、その後、Qβキャプシドタンパク質とカップリングさせたPLA2で構成される10ugのワクチンで3回、皮下処理した。コントロールマウスは、ワクチン接種しなかったが、感作した。最後のワクチン接種の1週間後に、すべてのマウスを、25ug PLA2により腹腔内を免疫性の試験をし、直腸温を60分間、測定することで、アナフィラキシー応答をモニターした。すべてのコントロールマウスが体温の劇的な低下を示したのに対して、ワクチン接種マウスは、アナフィラキシー反応から完全又は部分的に保護された。
封入体の発現及び調製
実施例xxxのPLA2-Cys遺伝子を含有するpET11aプラスミドを、大腸菌BL21DERill(ストラタジーン)へ形質転換した。終夜培養は、100μg/mlアンピシリン及び15μg/mlクロラムフェニコールを含有するdYT培地で生育させた。この培養液を、アンピシリン及びクロラムフェニコールを含有する新鮮なdYT培地で希釈し、37℃でOD600nm=1に達するまで生育させた。この培養液を1mM IPTGで誘導し、さらなる4時間生育させた。細胞を遠心分離によって収集し、0.5mg/mlリゾチームを含有するPBS緩衝液に再懸濁した。氷上でのインキュベーション後、細胞を氷上で超音波処理し、10mM の濃度までMgCl2を添加した。6μlのベンゾナーゼ(メルク)を細胞ライセートに添加し、そのライセートをRTで30分間インキュベートした。トリトンを1%の最終濃度まで添加し、このライセートを、氷上で30分間さらにインキュベートした。その封入体ペレットは、20mMトリス、23%スクロース、1mM EDTA、pH8.0を含有する洗浄緩衝液で洗浄した。IBsは、200mM DTTを含有する6Mグアニジウム-HCl、20mM トリス、pH8.0に可溶化した。この可溶化IBsを50000gで遠心分離し、その上澄み液を6Mグアニジウム-HCl、20mM トリス、pH8.0に対して、続いて0.1mM DTTを含有する同じ緩衝液に対して透析した。酸化型グルタチオンを50mMの最終濃度まで添加し、可溶化IBsをRTで1時間インキュベートした。この可溶化IBsは、6Mグアニジウム-HCl、20mM トリス、pH8.0に対して透析した。IB溶液の濃度は、ブラッドフォード分析及びSDS-PAGEによって推定した。
4℃でリフォールディングを始める前に5mM還元型グルタチオン及び酸化型グルタチオンを添加した、2mM EDTA、0.2mM ベンズアミジン(Benzamidin)、0.2mM アミノカプロン酸、0.2mM グアニジニウム-HCl、0.4M L-アルギニン、pH6.8を含有するリフォールディング緩衝液へ、IB溶液を24時間毎にゆっくりと3部分で、3μMの最終濃度となるように添加した。このリフォールディング溶液は、YM10膜(Millipore)を用いた超遠心分離によって半分の容量に濃縮し、0.1mM DTTを含有するPBS、pH7.2に対して透析した。タンパク質を限外濾過によってさらに濃縮し、精製のために、20mM Hepes、150mM NaCl、0.1mM DTT、4℃で平衡化したSuperdex G-75カラム(ファルマシア)へ負荷した。平衡化緩衝液のpHは、RTで7.2に調製した。単量体の分画をプールした。
0.75mL 20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4中の1.5mg Qβの溶液を、RTで45分間、0.06mL Sulfo-SMPB(Pierce;H2O中の31mM ストック)と反応させた。この反応混合液を終夜、20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対して透析し、この溶液の0.75mLを1.5mLの0.1mM DTT(62μM)中のPLA2-Cys溶液、及び0.43mLのRTでpH7.4に調製した20mM Hepes、150mM NaCl、137μM DTTと混合した。カップリング反応を、RTで4時間進めるように放置し、その反混合液は、分画分子量300000Da(Spectrum)のSpectra Por透析チューブを用いて、20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対して終夜、透析した。カップリング反応は、SDS-PAGE及びクーマシー染色、並びにヤギ抗-ウサギアルカリフォスファターゼコンジュゲート(1:10000に希釈)で展開させるウサギ抗ハチ毒抗血清(1:10000に希釈)、又はヤギ抗-ウサギアルカリフォスファターゼコンジュゲート(1:10000に希釈)で展開させるウサギ抗Qβ抗血清(1:5000に希釈)のいずれかを利用するウェスタンブロッティングによって分析された。試料は、還元条件下の双方の場合におこなった。
レーン1:タンパク質マーカー。2:透析したカップリング反応1。3:カップリング反応1。4:カップリング反応2。5:カップリング反応2。6:カップリング反応1。7:透析したカップリング反応1。8:タンパク質マーカー。9:カップリング反応2。10:カップリング反応1。11:透析したカップリング反応1。12:タンパク質マーカー。
20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の4.0mg/ml Qβキャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で、30分間、10倍モル濃度を超えるSMPH(Pierce)(DMSOに溶解させた100mM 原液の)と反応させた。この反応液について、続いて、4℃で2lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなった。VAE051溶液(2.4mg/ml)を、TCEPの等モル濃度によって25℃で60分間、還元した。
46μlの透析Qβ反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上にて16℃で2時間、全容量680μlの50mM酢酸ナトリウム中の340μlのTCEP処理VAE051溶液溶液(2.4mg/ml)と反応させた。
Qβ-VAE051カップリング溶液について、分画分子量が300000Daの膜を用いて、20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する透析をおこなった。0日目及び14日目に、2匹の雌Balb/cマウスへ50μgのQβ-VAE051を腹膜内注射した。28日目に、マウスを逆軌道で出血させ、その血清をIgE-及びVAE051-特異的 ELISAを利用して分析した。
ELISAプレートを、0.8μg/mlの濃度のヒトIgEで、又は10μg/ml VAE051でコーティングした。このプレートはブロックされ、その後で連続希釈マウス血清とともにインキュベートした。結合した抗体は、酵素標識された抗マウスIgG抗体で検出した(図28B)。
双方のマウスは、ヒトIgEと同様にVAE051に対しても高い活性を示した。同じマウスの免疫前血清は、VAE051及びIgEに対して何ら活性を示さなかった(図28B)。これは、「親」分子IgEをも認識する、抗イディオタイプIgEミモボディ(mimobody)VAE051に対する抗体が産生されたことを示す。
カップリングのために、N末端にシステインが付加されたDerp1,2ペプチドは、化学合成されて、以下の配列を有していた:H2N-CQIYPPNANKIREALAOTHSA-COOH。このペプチドは、Qβキャプシドタンパク質への化学カップリングに利用され、以下に記載されている。
2mg/mlの濃度の20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2中のQβキャプシドタンパク質を、ロッキングシェーカー上にて25℃で30分間、5又は20倍過度の架橋剤SMPH(Pierce)と反応させた。その反応液について、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなった。この透析反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上にて25℃で2時間、5倍を超えるDerp1,2ペプチドと反応させた。
図24のゲルに負荷された試料は、以下の通りである:
レーン1:タンパク質マーカー。2:5倍を超えるSMPHで誘導体化したQβキャプシドタンパク質。4:5倍の誘導体化Qβキャプシドタンパク質のカップリング反応。5:20倍誘導体化Qβキャプシドタンパク質のカップリング反応。5:20倍の誘導体化Qβキャプシドタンパク質のカップリング反応。
HBcAgのc/e1エピトープ(残基72〜88)は、B型肝炎キャプシド(HBcAg)の表面の先端領域に位置する。この領域の一部分(プロリン79及びアラニン80)は、通常は、ペプチドGly-Gly-Lys-Gly-Gly(HBcAg-Lysコンストラクト)によって置き換えられている。導入されたリジン残基は、HBcAg粒子と遊離のシステイン基を含有する任意の抗原の分子間化学架橋に利用することができる活性アミノ基をその側鎖に有している。
PCRsについては、100pmolの各オリゴ及び50ngのテンプレートDNAsを、2ユニットのPwo-ポリメラーゼ、0.1mM dNTPs及びMgSO4を含む50ml 反応混合液に用いた。双方の反応については、温度サイクルを以下のようにしておこなった:94℃を2分間;30サイクルの94℃(1分間)、50℃(1分間)、72℃(2分間)。
EcoRIHBcAg(s):
(5'-CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG-3')(配列番号:79);
Lys-HBcAg(as):
(5'-CCTAGAGCCACCTTTGCCACCATCTTCTAAATTAGTACCCACCCAGGTAGC-3')
(配列番号:80);
Lys-HBcAg(s):
(5'-GAAGATGGTGGCAAAGGTGGCTCTAGGGACCTAGTAGTCAGTTATGTC-3')
(配列番号:81);
HBcAg(1-149)Hind(as):
(5'-CGCGTCCCAAGCTTCTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG-3')
(配列番号:82);
大腸菌株XL-1ブルーをpKK-HBcAg-Lysで形質転換した。1mlの細菌の終夜培養を、100μg/mlアンピシリンを含有する100mlのLB培地を接種するのに用いた。この培地は、およそ0.8のOD600に達するまで、37℃で4時間、生育させた。HBcAg-Lysの合成の誘導は、1mMの最終濃度となるようなIPTGの添加によっておこなった。誘導の後、細菌をさらに37℃で16時間、振盪した。細菌は、15分間、5000xgでの遠心分離によって収集した。そのペレットは、−20℃で貯蔵した。このペレットを解凍し、200μg/mlリゾチーム及び10μlのベンゾナーゼ(メルク)を補充した細菌ライセート緩衝液(10mM Na2HPO4、pH7.0、30mM NaCl、0.25% トウィン-20、10mM EDTA、10mM DTT)に再懸濁した。細胞を室温で30分間、インキュベートし、フレンチプレス細胞破砕機(French pressure cell)を用いて破壊した。トリトンX-100を、0.2%の最終濃度となるようにライセートへ添加し、このライセートを氷上で30分間、インキュベートして時々振盪した。pKK-HBcAg-Lys発現プラスミドを有する大腸菌細胞、又はコントロールプラスミドを、IPTGによるHBcAg-Lys発現の誘導に用いた。IPTGの添加の前に、pKK-HBcAg-Lysプラスミドを有する細菌培養及びコントロールプラスミドを有する培養から試料を取り除いた。IPTGの添加の16時間後、pKK-HBcAg-Lysを有する培養及びコントロール培養から試料を取り除いた。タンパク質発現は、SDS-PAGEとその後のクーマシー染色によってモニターした。
アミノ末端(アミノ酸配列CGGDYKDDDDK(配列番号:147))にシステイン残基を有する合成FLAGペプチドを、FLAGペプチドに対する免疫応答を誘起するために、精製したHBcAg-Lys粒子と化学的にカップリングさせた。600mlのHBcAg-Lys粒子(2mg/ml)の95%純溶液を、ヘテロ二価機能性架橋剤N-サクシニミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)(0.5mM)と室温で30分間、インキュベートした。この反応の完了後、混合液を終夜、1リッターの150mM NaClを含む50mM リン酸緩衝液(pH7.2)に対して透析し、遊離のSPDPを取り除いた。その後、500mlの誘導体化HBcAg-Lysキャプシド(2mg/ml)を、金属触媒されたスルフヒドリル酸化を防ぐために、10mM EDTAの存在下で0.1mM FLAGペプチド(アミノ末端システインを含有する)と混合した。この反応は、ペプチドの遊離システインとの反応による、SPDPからのピリジン-2-チオンの遊離による、343nmでの溶液の光学密度の増加によってモニターした。ペプチドと誘導体化Lys残基の反応は、およそ30分後に完了した。
FLAG修飾粒子を、マウスへ注入した。
gp140遺伝子を、オリゴgp140CysEcoRI及びSalIgp140を用いて、pCytTSgp140FOSからPCRによって増幅した。PCRsについては、100pmolの各オリゴ及び50ngのテンプレートDNAsを、2ユニットのPwoポリメラーゼ、0.1mM dNTPs及び2mM MgSO4とともに50ml反応混合物において用いた。双方の反応では、温度サイクルを以下のようにしておこなった:94℃を2分間;30サイクルの94℃(0.5分間)、55℃(0.5分間)、72℃(2分間)。
PCR産物は、QiaEXIIキットを用いて精製し、SalI/EcoRIで消化し、同じ酵素で切断したベクターpMPSVHEへライゲーションした。
Gp140CysEcoRI:
5'-GCCGAATTCCTAGCAGCTAGCACCGAATTTATCTAA-3'(配列番号:83)
SalIgp140:
5'-GGTTAAGTCGACATGAGAGTGAAGGAGAAATAT-3'(配列番号:84)
pMPSVgp140Cys(20μg)を、制限消化によって直線化した。この反応は、フェノール/クロラムフェニコール抽出、その後に続く直線化DNAのイソプロパノール沈殿によって止めた。制限消化は、アガロースゲル電気泳動によって評価した。トランスフェクションについては、5.4μgの直線化pMPSVgp140-Cysを、30μlH2O中の0.6μgの直線化pSV2Neoと混合し、30μlの1M CaCl2溶液を添加した。60μlリン酸緩衝液(50mM HEPES、280mM NaCl、1.5mM Na2HPO4、pH7.05)の添加後、この溶液を5秒間ボルテックスし、それに続いて25秒間、室温でインキュベートした。即座に、この溶液を2%FCS(2%FCS培地)を含有する2ml HP-1培地へ添加した。その後、80%コンフルエントBHK21細胞培養(6-ウェルプレート)の培地を、DNA含有培地によって置き換えた。CO2インキュベーターにおける37℃で5時間のインキュベーション後、このDNA含有培地を取り除き、2mlの2%FCS培地中の15%グリセロールによって置き換えた。グリセロール含有培地は、30秒のインキュベーション期間後に取り除き、その細胞を、5mlの10%FCSを含有するHP-1培地によって洗浄した。最後に、2mlの10%FCSを含有する新鮮HP-1培地を添加した。
抗gp120抗体は、NHS/EDC活性化デキストランと共有的にカップリングし、クロマトグラフィーカラムへ詰め込んだ。GP140Cysを有するGP140Cysをこのカラムへ負荷し、十分に洗浄したの後、0.1M HClを用いてGP140Cysを溶出した。1Mトリス pH7.2を用いたコレクションチューブにおける収集の間、この溶出液を直接に中和した。
ジスルフィド結合形成が精製の間に起こり得るので、収集した試料を、25℃で2時間、10mMトリス pH7.5中の10mM DTTで処理する。
その後の10mM Mes;80mM NaCl pH6.0対する透析によって、DTTを取り除く。最後には、実施例16に記載のようなE2のJUN残基を有するアルファウイルス粒子とGP140Cysを混合する。
PLA2遺伝子を、オリゴEcoRIPLA及びPLA-Cys-hindを用いて、pAV3LAfosからPCRによって増幅した。PCRsについては、100pmolの各オリゴ及び50ngのテンプレートDNAsを、2ユニットのPwoポリメラーゼ、0.1mM dNTPs及び2mM MgSO4とともに50ml反応混合物で用いた。反応については、温度サイクルを以下のようにしておこなった:94℃を2分間;30サイクルの94℃(0.5分間)、55℃(0.5分間)、72℃(2分間)。
PCR産物は、QiaEXIIキットを用いて精製し、EcoRI/HindIIIで消化し、同じ酵素で切断したベクターpAV3へライゲーションした。
EcoRIPLA:
5'-TAACCGAATTCAGGAGGTAAAAAGATATGG-3'(配列番号:85)
PLA Cys-hind:
5'-GAAGTAAAGCTTTTAACCACCGCAACCACCAGAAG-3'(配列番号:86)
Cysタグタンパク質の細胞質産生については、大腸菌XL-1ブルー株をベクターpAV3::PLA及びpPLA-Cysで形質転換した。培養液は、アンピシリンの存在下のリッチ培地にて、37℃で振盪してインキュベートした。光学密度(550nm)では、1mM IPTGを添加し、インキュベーションをさらに5時間、継続した。細胞を遠心分離で収集し、デオキシリボヌクレアーゼ(DNase)、リボヌクレアーゼ(RNase)及びリゾチームを有する適切な緩衝液(例えば、トリス-HCl、pH7.2、150mM NaCl)に再懸濁し、フレンチプレス細胞破砕機を通過させることによって破壊した。遠心分離(Sorvall RC-5C、SS34ローター、15000rpm、10分, 4℃)の後、ペレットを4℃で25ml封入体緩衝液(20mM トリス-HCl、23%スークロース、0.5%トリトンX-100、1mM EDTA、pH8)に再懸濁し、上記のようにして再遠心分離した。遠心分離後の上澄み液がほとんど透明になるまで、この工程を繰り返した。封入体を、室温で20ml可溶化緩衝液(5.5Mグアニジニウム塩酸、25mM トリス-HCl、pH7.5)に再懸濁し、不溶性物質を遠心分離及びそれに続く無菌フィルターへ上澄み液を通過させることによって取り除いた(0.45μm)。タンパク質は、10mM EDTA及び100mM DTTの存在下で少なくとも10時間、4℃に保持し、その後、10容量の5.5M グアニジニウム塩酸、25mM トリス-HCl、10mM EDTA、pH6に対して3回透析した。この溶液を、適切なレドックスシャッフル(酸化型グルタチオン/還元型グルタチオン;システイン/システイン)の存在下で51 2M 尿素、4mM EDTA、0.1M NH4Cl、20mM 臭化ナトリウム(pH8.3)に対して2回透析した。その後、リフォールディングしたタンパク質をイオン交換クロマトグラフィーに適用した。このタンパク質は、システイン残基を還元型に保つために、2-10mM DTTの存在下でpH が7以上の適切な緩衝液に貯蔵した。アルファウイルス粒子とのこのタンパク質のカップリングの前に、タンパク質溶液をセファデックスG-25ゲル濾過カラムに流すことによって、DTTを取り除いた。
ここでHBcAg-lys-2cys-Mutと呼ばれ、配列番号:134の48及び107と一致する位置のシステイン残基を欠き、挿入リジン残基を含有する肝炎コア抗原(HBcAg)を、以下の方法を利用して構築した。
下記のPCRプライマーの組み合わせにより、実施例23に記載のようにして調製したHBcAg-Lys遺伝子の3つの断片を最初に別々に増幅することで、2つの変異を導入した。実施例1に記載のような基本的なPCR法、及び常套的クローニング方法を、HBcAg-lys-2cys-Mut遺伝子を調製するのに用いた。
プライマー1:EcoRIHBcAg(s)
CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG(配列番号:148)
プライマー2:48as
GTGCAGTATGGTGAGGTGAGGAATGCTCAGGAGACTC(配列番号:149)
以下のプライマーを用いて、断片2を調製した:
プライマー3:48s
GSGTCTCCTGAGCATTCCTCACCTCACCATACTGCAC(配列番号:150)
プライマー4:107as
CTTCCAAAAGTGAGGGAAGAAATGTGAAACCAC (配列番号:151)
以下のプライマーを用いて、断片3の調製をした:
プライマー5:HBcAg149hind-as
CGCGTCCCAAGCTTCTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAGCGTTGATAG
(配列番号:152)
プライマー6:107s
GTGGTTTCACATTTCTTCCCTCACTTTTGGAAG(配列番号:153)
実施例23に記載のようの調製したHBcAg-Lysの遊離システイン残基を、ヨードアセトアミドを用いてブロックした。ブロックしたHBcAg-Lysを、その後、ヘテロ二価機能性架橋剤であるm-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシニミドエステル(Sulfo-MBS)によってFLAGと架橋させた。
A.導入
細菌線毛又は線毛は、幅広い細菌によって産生された繊維状表面細胞小器官である。これら細胞小器官は、宿主細胞の表面レセプターへの細菌の付着を媒介し、膀胱炎、腎盂腎炎、新しく生まれた髄膜炎及び下痢のような多くの細菌性感染症の発症に必要とされる。
1型線毛の場合は、1型線毛シャペロンFimCの遺伝子は、ATGコドンに代わってGTGで始まり、このことが翻訳効率の低下につながる。最終的には、fimH遺伝子の分析は、激しく翻訳を阻害するステム-ループを形成するfimH mRNAの傾向を明らかにする。要約すると、細菌線毛生合成は、すべてのレベルのタンパク質生合成に作用する幅広い異なる機構によって制御されている。
後にサブユニット/サブユニット相互作用を可能にする表面を表示するフォールディングしたサブユニットは、従って、他のサブユニットとの相互作用から遮断され、単量体で、アセンブリ-コンピテントな状態に保たれると思われる。
最終的には、線毛シャペロンは、外膜がアセンブリする位置でのサブユニットの誘発による遊離を可能にすると考えられ、異なった効率でそうすることによって、成熟線毛の組成及び配列に影響を与える(下の別々の章も参照)。
しかしながら、いくつかの知見は、上で概要が記載された線毛シャペロン分画のモデルでは容易に説明されない。一例は、多量体シャペロン/サブユニット複合体(Striker, R. T., ら, J. Biol. Chem. 269: 12233-122239(1994))の存在であり、1つのシャペロンは三量体のサブユニット二量体と結合する。「二重に埋める」ことができるフォールディングテンプレートを想像することは、困難である。シャペロン/サブユニット相互作用の分子の詳細に関する研究(下を参照)は、上で要約された機能を部分的に支持したが、新たな疑問も生じせしめた。
大腸菌株W3110をLB(10g/Lトリプトン、5g/L酵母抽出物、5g/L NaCl、pH7.5、1% 寒天(w/v))プレートに拡散し、、37℃で終夜、インキュベートした。その後、単一のコロニーを用いて、5mlのLB開始培養液(10g/Lトリプトン、5g/L酵母抽出物、5g/L NaCl、pH7.5)を接種した。1型線毛を産する細菌が好む条件下での24時間のインキュベーション(37℃で撹拌せずに)の後、1リッターLBを含有する5つの振盪フラスコを1ミリリッターの開始培養液で接種した。その後、この細菌培養液を、さらなる48〜72時間、37℃で撹拌せずにインキュベートした。細菌を、この後、遠心分離(5000rpm、4℃、10分間)によって収集し、この結果得られたペレットを、250ミリリッターの10mM トリス/HCl、pH7.5に再懸濁した。17,000rpmでの常套的なミキサーによる5分間の撹拌によって、線毛を細菌から切り離した。4℃、10,000rpmで10分間の遠心分離後、上澄み液を含有する線毛を収集し、1M MgCl2を100mMの最終濃度となるように添加した。この溶液を1時間で4℃に保ち、その後、沈殿した線毛を遠心分離(10,000rpm、20分間、4℃)によってペレットにした。このペレットを、その後、10mM HEPES、pH7.5に再懸濁し、線毛溶液を、次いで、最後の遠心分離段階によって透明化して残存細胞片を取り除いた。
600μlの細菌1型線毛の95%純粋溶液(2mg/ml)を、ヘテロ二価機能性架橋剤sulfo-MBS(0.5mM)により、室温で30分間、インキュベートした。その後、この混合液を、150mM NaClを含む1リッターの50mM リン酸緩衝液(pH7.2)に大して透析し、遊離のsulfo-MBSを取り除いた。この後、500μlの誘導体化した線毛(2mg/ml)を、10mM EDTAの存在下で0.5mM FLAGペプチド(アミノ末端システインを含有する)と混合させ、金属触媒によるスルホヒドリル酸化を防いだ。非カップリングペプチドは、サイズ排除クロマトグラフィーによって除かれた。
ここで参考文献によって全開示が取り入れられているGenBank寄託番号U14003に開示されたDNA配列は、ヌクレオチド番号233947〜ヌクレオチド番号240543の1型線毛の産生に必要なすべての大腸菌遺伝子を有する(fim遺伝子クラスター)。この部分の配列は、遺伝子fimA、fimI、fimC、fimD、fimF、fimG、及びfimHの配列を有する。3つの異なるPCRsを、下に示すように、大腸菌ゲノムのこの部分の増幅、及びそれに続くpUC19(GenBank寄託番号L09137及びX02514)へのクローニングに用いた。
10mlの上澄み液を、その後、下で定めたようにして、50pmolのPCRプライマー1及び50pmolのプライマー2と混合させた。その後、5mlの10X PCR緩衝液、0.5mlのTaq-DNA-ポリメラーゼ、及び全部で50mlとなるように水を加えた。すべてのPCRsは、以下のスキームに従って実行した:94℃を2分間、次いで30サイクルの94℃を20秒間、55℃を30秒間、及び72℃を2分間。このPCR産物は、その後、1%アガロースゲル電気泳動によって精製した。
TAGATGATTACGCCAAGCTTATAATAGAAATAGTTTTTTGAAAGGAAAGCAGCATG
(配列番号:196)
及び
GTCAAAGGCCTTGTCGACGTTATTCCATTACGCCCGTCATTTTGG(配列番号:197)
これら2つのオリゴヌクレオチドは、制限部位HindIII及びSalIを介してpuc19へ増幅産物のクローニングを可能にする隣接配列も有する。この結果で得られるプラスミドは、pFIMAICと呼ばれている(配列番号:198)。
AAGATCTTAAGCTAAGCTTGAATTCTCTGACGCTGATTAACC(配列番号:199)
及び
ACGTAAAGCATTTCTAGACCGCGGATAGTAATCGTGCTATC (配列番号:200)。
これら2つのオリゴヌクレオチドは、制限部位HindIII及びXabIを介してpuc19へ増幅産物のクローニングを可能にする隣接配列も有し、この結果で得られるプラスミドは、pFIMDと呼ばれている(配列番号:201)。
AATTACGTGAGCAAGCTTATGAGAAACAAACCTTTTTATC (配列番号:202)
及び
GACTAAGGCCTTTCTAGATTATTGATAAACAAAAGTCACGC (配列番号:203)。
これら2つのオリゴヌクレオチドは、制限部位HindIII及びXabIを介してpuc19へ増幅産物のクローニングを可能にする隣接配列も有する;この結果で得られるプラスミドは、pFIMFGHと呼ばれている(配列番号:204)。
pFIMAICをEcoRI及びHindIII(2237-3982)で消化し、pFIMDをEcoRI及びSstII(2267-5276)で消化し、pFIMFGHをSstII及びHinIII(2327-2231)で消化した。次いで、この断片をライゲーションし、結果として得られた線毛形成に必要なすべてのfim-遺伝子を有するプラスミドは、pFIMAICDFGHと呼ばれた(配列番号:205)。
プラスミドpFIMAICDFGH(配列番号:205)をKpnIで消化し、その後、ヌクレオチド番号8895-8509から成る断片を0.7%アガロースゲル電気泳動によって単離し、自己ライゲーションによって環状化した。この結果で得られたプラスミドは、pFIMAICDFG(配列番号:206)と呼ばれ、それは、fimH遺伝子を欠き、FIMHフリー1型線毛の産生に利用することができる。
大腸菌株W3110をpFIMAICDFGH(配列番号:205)で形質転換し、100μg/mlアンピシリンを含有するLB(10g/Lトリプトン、5g/L酵母抽出物、5g/L NaCl、pH7.5、1% 寒天(w/v))プレートに拡散させ、37℃で終夜、インキュベートした。その後、単一のコロニーを用いて、5mlのLB開始培養液(10g/Lトリプトン、5g/L酵母抽出物、1%(w/v)グルコース、5g/L NaCl、pH7.5、100μg/mlアンピシリン)を接種した。150rpm、37℃での12-16時間のインキュベーションの後、2リッターLB-グルコースを含有する5リッター振盪フラスコを、20ミリリッターの開始培養液で接種した。その後、この細菌培養液を、さらに撹拌(150rpm)し、37℃で24時間インキュベートした。次いで、細菌を遠心分離(5000rpm、4℃、10分間)によって収集し、この結果得られたペレットを、250ミリリッターの10mM トリス/HCl、pH8に再懸濁した。常套的なミキサーによる17,000rpm、5分間の撹拌によって、線毛を細菌から切り離した。10,000rpmで10分間の遠心分離後、繊毛を含有する上澄み液を収集し、1M MgCl2を100mMの最終濃度となるように添加した。この溶液を1時間で4℃に保ち、その後、沈殿した線毛を遠心分離(10,000rpm、20分間、4℃)でペレットにした。次いで、このペレットを室温で30分間、10mM EDTA、30mM EDTA、pH7.5に再懸濁し、この後、この線毛溶液を最後の遠心分離段階によって透明にし、残存細胞片を取り除いた。次いで、この沈殿物を20mM HEPES、pH7.4に対して透析した。
100uM溶液のヘテロ二価機能性架橋剤sulfa-MBSの66μlアリコートを、400μlの細菌1型線毛の95%純溶液(2.5mg/ml、20mM HEPES、pH7.4)へ添加し、続いて、撹拌によって室温で45分間インキュベートした。その後、過度のsulfa-MBSを、PD-10カラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィーによって除いた。あるいは、架橋剤は透析によって取り除くことが可能である。従って、1.1mg/ml ペプチドCe3epi(CGGVNLTWSRA SG(配列番号:207))を含有する1.3μlの溶液、又はペプチドCe3Mim(CGGVNLPWSFGLE(配列番号:208))のいずれかを誘導体化した1mlアリコート(1-1.25mg/ml、20mM HEPES pH7.4)へ添加した。この試料を室温で4時間インキュベートし、20mM HEPES(pH7.4)を含有する2lの緩衝液に対する2回の透析によって、非カップリングペプチドを取り除いた。あるいはまた、この非カップリングペプチドは、サイズ排除クロマトグラフィーによって取り除くことができる。
A.アミノ酸配列AAASGGCGG(配列番号:209)と融合しているPLA2遺伝子触媒的に不活性な変異体の細胞質発現のための代替ベクターの調製
実施例9のPLA2遺伝子コンストラクトを、オリゴecori_Ndel_pla(配列は下にある)及びPLA-Cys-hindを用いるpAV3PLAfosからのPCRによって増幅した(実施例29)。反応については、100pmolの各オリゴ、及び約1μgのpAV3PLAfos DNAを、1.2ユニットのPfx DNAポリメラーゼ(Gibco)、1mM MgSO4、200μM dNTPS及び10倍希釈したPfx enhancer 溶液(Gibco)による50μl反応混合液に用いた。反応については、温度サイクルを以下のようにしておこなった:94℃を2分間、5サイクルの92℃(0.5秒)、58℃(0.5秒)、68℃(1分);25サイクルの92℃(0.5分)、63℃(0.5分)、68℃(1分)。PCR産物をアガロースゲル電気泳動とそれに続くQiagen Qiaquick Kitを用いた断片の単離によって精製し、酵素Nde1及びHindIIIで消化し、同じ酵素で消化したPET11aベクター(ノバジェン)へクローニングした。
TAACCGAATTCAGGAGGTAAAAACATATGGCTATCATCTACC (配列番号:214)
アミノ酸配列MAIIYPGTLWCGHGNKSSGPNELGRFKHTDACCRTQDMCPDVMSAGESKHGLTNTASHTRLSCDCDDKFYDCLKNSADTISSYFVGKMYFNLIDTKCYKLEHPVTGCGERTEGRCLHYTVDKSKPKVYQWFDLRKYAAASGGCGG(配列番号:210)。
600μlのQβキャプシドタンパク質の溶液(20mM Hepesに2mg/ml、pH7.4)を、室温で60分間、176μl Sulfo-MBS(H2Oに13mg/ml)と反応させ、4℃で1Lの20mM Hepes pH7.4 O/Nに対して透析した。次の日、0.1mM DTTを含有する500μlのPLA2溶液(2.5mg/ml)を、5ml Hi-Trapカラム(ファルマシア)で脱塩した。還元し脱塩したPLA2(およそ0.5mg/mlの60μlの溶液)を、活性化及び透析したQβキャプシド(25μlの1.5mg/ml溶液)と混合し、室温で4時間、反応させた。
1 PLA2とのカップリングの前後の双方で撮ったQβキャプシドタンパク質の電子顕微鏡画像で、25-30nmの直径のキャプシドをはっきりと見ることができる。
雌Balb/cマウスを、50μgのPLA2とカップリングしたQβキャプシドにより0日目に静脈内で免疫化し、同じ量の抗原によって14日目に追加免疫した。マウスは、20日目に出血させ、ELISAで血清を分析した。PLA2に対する1:5000の力価が得られた。
以下のアミノ酸配列を有するヒトIgEエピトープを、N末端システイン残基を用いてQβキャプシドタンパク質とカップリングさせた:
Ce3エピトープ:CGGVNLTWSRASG(配列番号:207)
Ce3ミモトープ:CGGVNLPWSFGLE(配列番号:208)
カップリング反応を、Sulfo-MBSで活性化したQβキャプシドタンパク質を用いておこない、それに続いて、透析して過度の架橋剤を取り除いた。それぞれのエピトープ又はミモトープを、活性化Qβキャプシドを含有する反応混合液へ希釈し、室温で4時間反応させた。この反応混合液を、最終的には、PBSに対して4時間、透析し、マウスへ注射した。
ミモトープへスルフヒドリル基を導入するために、ミモトープを最初に、化学基N-サクシニミジル-S-アセチルチオアセテート(SATA)と反応させた。それに続いて、保護基をヒドロキシルアミンによる処理で取り除き、即座に、室温で4時間、活性化Qβキャプシドタンパク質と反応させた。最後に、この反応液を4時間、透析し、マウスへ注射した。
A.HBcAg-Lysキャプシドタンパク質とM2ペプチドのカップリング
M2ペプチドに対する免疫応答を誘発するために、C末端にシステイン残基を有するインフルエンザM2タンパク質のN末端断片と一致する合成M2ペプチド(SLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSDGGGC(配列番号:212)を、精製HBcAg-Lys粒子と化学的にカップリングさせた。Sulfo-MBS(232μl、3mM)を、PBS中の1.4ml HBcAg-Lys(1.6mg/ml)の溶液と反応させた。この混合物を終夜、リン酸緩衝化生理的食塩水(PBS)に対して透析した。M2ペプチドを、DMSO中の24mg/mlの濃度へ希釈した;5μlのこの溶液を300μlPBSで希釈し、その188μlを312μlの透析した活性化HBcAg-Lys溶液へ添加した。EDTA(10μlの1M溶液)を、また、反応混合液へ添加し、その後、この反応を、室温で4時間、進行させた。
雌Balb/cマウスを、0日目に、50μgHBcAg-Lys-M2又はM2ペプチドのみにより静脈内で免疫化し、同じ量の抗原で10日後に追加免疫した。さらなる10日後、マウスをインフルエンザウイルス(50pfu、PR/8)で鼻腔内で感染させ、感染マウスの生存をモニターした。さらには、ウイルス力価を肺で確かめた。M2-HBcAg-Lysで初回刺激したマウスを完全に保護し、7日目までにそのウイルスを除去した。
A.線毛、Qβ-及びcysフリーHbcAg-キャプシドタンパク質のカップリング
Qβ: 1mlの20mM Hepes中の1mg/ml Qβキャプシドタンパク質の溶液。150mM NaCl pH7.2を、30分間、ロッキングシェーカー上においてRTで、H2O中の13mg/ml Sulfo-MBS(Pierce)の93μlの溶液と反応させた。これに続いて、この反応液を、2Lの20mM hepes、150mM NaCl、pH7.2に対して終夜、透析した。次いで、透析反応混合液を、ロッキングシェーカー上にてRTで4時間、58.8μlのDMSO中のM2ペプチド(配列番号:212)の25mM 原液と反応させた。この反応混合液を、続いて、4℃で終夜、2リッターの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対して透析した。
Hbc:M2へ遺伝的に融合させたM2を、Neirynckら Nature Medicine 5: 1157(1999)によって公表されたように、HbcのN末端でクローニングした。MD-HBcを大腸菌で発現させ、ゲル電気泳動によって精製した。M2-HBcのN末端でのM2ペプチドの存在は、エドマンシーケンシングによって確かめられた。
雌Balb/cマウスを、線毛、Qβ及びHbcAgタンパク質とカップリングさせたM2ペプチド、及びアジュバンドの添加無しでHbc免疫原と遺伝的に誘導したM2ペプチドによりワクチン接種した。各試料の35μgタンパク質を、0日目及び14日目に、腹膜内に注射した。27日目にマウスを出血させ、その血清をM2-ペプチド特異的ELISAを用いて分析した。
リボヌクレアーゼとカップリングしている10μg/mlのM2ペプチドを、ELISAプレート上にコーティングした。このプレートをブロックし、その後、連続希釈したマウス血清でインキュベートした。結合している抗体は、酵素標識した抗マウスIgG抗体で検出した。コントロールとして、免疫前血清も試験した。Hbc又は他の担体と架橋させた関連していないペプチドで免疫化したマウスの血清を用いたコントロールELISA実験は、検出された抗体がM2ペプチドに対して特異的であることを示した。この結果は、図27A及びBに示されている。
A.Qβキャプシドタンパク質へのアンギオテンシンI及びアンギオテンシンIIペプチドのカップリング
以下のアンギオテンシンペプチドを化学的に合成した:CGGDRVYIHPF(「アンギオI」)、CGGDRVYIHPFHL(「アンギオII」)、DRVYIHPFHLGGC(「アンギオIII」)、CDRVYIHPFHL(「アンギオIV」)、及び以下に記載のようにQβへの化学カップリングに用いた。
5mlの20mM Hepes中の2mg/mlQβキャプシドタンパク質の溶液。150mM NaCl pH7.4を、ロッキングシェーカー上にて25℃で30分間、507μlのH2O中の13mg/ml Sulfo-MBS(Pierce)の溶液と反応させた。この反応溶液について、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。665μlの透析した反応混合液を、次いで、ロッキングシェーカー上にて25℃で2時間、2.8mlの各対応する100mM ペプチド原液(DMSO中)と反応させた。この反応混合液について、続いて、4℃で2リッターの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。
雌Balb/cマウスを、アジュバンドを添加せずに、Qβキャプシドタンパク質とカップリングさせた4つのアンギオテンシンペプチドのうちの1つでワクチン接種した。50μgの各試料の全タンパク質をPBSで200mlに希釈し、0日目と14日目に皮下注射した(100ml2つの腹側へ)。マウスを21日目に逆軌道で出血させ、その血清をアンギオテンシン-特異的 ELISAを利用して分析した。
すべての4つのアンギオテンシンペプチドを、化学架橋剤sulfo-SPDPを用いて、それぞれウシリボヌクレアーゼAとカップリングさせた。ELISAプレートを、10mg/mlの濃度でカップリングさせたリボヌクレアーゼ調製物でコーティングした。このプレートをブロックし、次いで、連続希釈マウス血清でインキュベートした。結合した抗体は、酵素標識した抗マウスIgG抗体で検出した。コントロールとして、同じマウスの免疫前血清も試験した。Qβ又は他の担体と架橋している関連しないペプチドで免疫化したマウスの血清を用いたコントロールELISA実験では、検出された抗体がそれぞれのペプチドに対して特異的であることが示された。この結果は、図8A-8Dに示されている。
以下のアンギオテンシンペプチドを化学的に合成した: CGGDRVYIHPF(「アンギオI」)、CGGDRVYIHPFHL(「アンギオII」)、DRVYIHPFHLGGC(「アンギオIII」)、CDRVYIHPFHL(「アンギオIV」)、及びHBcAg-149-lys-2cys-Mut、すなわちcysフリーHBcAgへの化学カップリングに用いる。
1.25mlのPBS、pH7.4中の0.8mg/mlHBcAg-149-lys-2cys-Mutキャプシドタンパク質(実施例31を比較せよ)を、ロッキングシェーカー上にて25℃で、93μlのH2O中の13mg/ml Sulfo-MBS(Pierce)の溶液と30分間、反応させる。この反応溶液について、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.4に対する終夜の透析をおこなう。緩衝液を交換した後、この反応液を、さらに2時間、透析した。この透析した反応混合液を、次いで、1.8μlの100mMペプチド原液(DMSO中)と、ロッキングシェーカー上にて25℃で2時間、反応させる。この反応混合液について、続いて、2リッターの20mM Hepes、150mM NaCl ph7.4に対する透析を終夜、4℃でおこない、この後で緩衝液交換をし、さらなる2時間の透析をおこなった。
以下のアンギオテンシンペプチドを化学的に合成した: CGGDRVYIHPF(「アンギオI」)、CGGDRVYIHPFHL(「アンギオII」)、DRVYIHPFHLGGC(「アンギオIII」)、CDRVYIHPFHL(「アンギオIV」)、及び大腸菌の1型線毛への化学カップリングに用いる。
400μlの20mM Hepes、pH7.4中の2.5mg/ml大腸菌の1型線毛を、60分間、ロッキングシェーカー上にてRTで、(H2O)中の60μlの100mM Sulfo-MBS(Pierce)溶液と反応させた。この反応混合液を、PD-10カラム(アマシャム-ファルマシア バイオテク)により脱塩した。カラムから溶出したタンパク質を含有する分画をプール(およそ1mgタンパク質で、すなわち誘導体化線毛)し、3倍モル濃度を超えるペプチドと反応させた。例えば、およそ1mg 誘導体化線毛を含有する500ul溶出液へ、2.34ulの100mM ペプチド原液(DMSO中)を添加した。この混合液をロッキングシェーカー上にて25℃で4時間インキュベートし、続いて、2リッターの20mM Hepes、150mM NaCl ph7.2に対して終夜、4℃で透析した。
Qβキャプシドタンパク質へのDerIペプチドのカップリング
ハウスダストダニアレルゲンDerIに由来する以下のペプチドを、化学的に合成した:CGNQSLDLAEQELVDCASQHGCH(「DerIp52」;aa52-72、N末端に付加的なシステイン-グリシンリンカーを有する)、CQIYPPNANKIREALAQTHSA(「Der p1 p117」;aa117-137)。これらのペプチドは、下記のように、Qβへの化学カップリングに用いた。
雌Balb/cマウスは、アジュバンドを添加せずにQβキャプシドタンパク質とカップリングさせた2つのDer pIのうちの1つでワクチン接種した。各ワクチンについて2匹のマウスを用いた。各試料の30μgの全タンパク質をPBSで200μlまで希釈し、0日目及び14日目に皮下注射した。各試料の25μgの全タンパク質を、PBSで200ulとなるまで希釈し、0日目と14日目に皮下注射(100mlを2つの腹部へ)した。マウスを21日目に逆軌道で出血させ、その血清をDer pI ペプチド-特異的 ELISAを利用して分析した。
Der p Iペプチドである、「Der p I p52」及び「Der p I p117」を、化学架橋剤であるsulf-SPDPを用いて、それぞれ、化学架橋剤ウシリボヌクレアーゼとカップリングさせた。ELISAプレートを10mg/mlの濃度でカップリングさせたリボヌクレアーゼ調製物でコーティングした。このプレートをブロックし、その後で連続希釈血清によってインキュベートした。結合した抗体は、酵素標識した抗マウスIgG抗体で検出した。コントロールとして、同じマウスの免疫前血清も試験した。Qβ又は他の担体と架橋している関連しないペプチドで免疫化したマウスの血清を用いたコントロールELISA実験では、検出された抗体がそれぞれのペプチドに対して特異的であることが示された。この結果は、図9A及び図9Bに示されている。
コントロールとして、同じマウスの免疫前血清を分析した(0日)。意図された血清希釈の結果は、450nmでの光学密度で示されている。21日目には、すべてのワクチン接種したマウスは、他のDer pIペプチドに対するのではなく、それらがワクチン接種されたDer pIペプチドに対する特異的IgG抗体を産した。ワクチン接種の前では、Der pIペプチド特異的抗体が検出されなかった(0日)。
両Der pIペプチドは、アジュバンドがないと、高度な免疫原性があった。すべてのワクチン接種したマウスは、ワクチン調製におけるペプチドに特異的な良好な抗体応答を産した。
ハウスダストダニアレルゲンDerIに由来する以下のペプチドを、化学的に合成した:Der I p52(aa52-72、N末端に付加的なシステイン-グリシンリンカーを有する):CGNQSLDLAEQELVDCASQHGCH、Der p1 p117(aa117-137):CQIYPPNANKIREALAQTHSA。これらのペプチドは、HBcAg-149-lys-2cys-Mut、すなわちcysフリーHBcAgへの化学カップリングに用いた。
ハウスダストダニアレルゲンDer p Iに由来する以下のペプチドを化学的に合成した:Der p I p52(aa 52-72で、N末端に付加的なシステイン-グリシンリンカーを有する)及びCGNQSLDLAEQELDLAEQELVDCASQHGCH、Der p I p117(aa 117-137):CQIYPPNANKIREALAQTHSA。これらのペプチドは、大腸菌の1型線毛との化学カップリングに用いた。
大腸菌の1型線毛へのヒトVEGFR-IIペプチドのカップリング
配列CTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKを有するヒトVEGFRIIペプチドを、化学的に合成し、大腸菌の1型線毛への化学カップリングに用いた。
雌C3H-HeJ(Toll様レセプター4欠損、LPS非レスポンダーマウス)及びC3H-HeN(野生型)マウスをアジュバンドを添加せずに、1型線毛タンパク質とカップリングしたヒトVEGFRIIペプチドでワクチン接種した。各試料のおよそ100μgの全タンパク質を、PBSで200μlまで希釈し、0日目、14日目及び28日目に皮下注射した。マウスを14日目、28日目に逆軌道で出血させ、42日目の血清をヒトVEGFR-II特異的 ELISAを利用して分析した。
免疫化したマウスの血清を、固定化ヒトVEGFR-IIペプチド及びヒトVEGFR-IIの細胞外ドメインを有するELISAで試験した(R&D System GmbH, Wiesbaden)。
ヒトVEGFR-IIは、化学架橋剤sulf-SPDPを用いてウシリボヌクレアーゼAとカップリングさせた。ELISAプレートは、10μg/mlの濃度でカップリングしたリボヌクレアーゼAでコーティングした。VEGFR-IIのヒト細胞外ドメインを、2μg/mlの濃度でプレートに吸収させた。このプレートをブロックし、次いで、連続希釈したマウス血清でインキュベートした。結合した抗体は、酵素標識した抗マウスIgG抗体で検出した。コントロールとして、同じマウスの免疫前血清も試験した。非カップリング担体で免疫化したマウスの血清を用いたコントロールELISA実験によって、検出された抗体が、それぞれのペプチドに対して特異的であることが示された。1型線毛とカップリングしたヒトVEGFRIIペプチドの結果は、図10に示されている。特に、図10A及び図10Bは、それぞれ1型線毛タンパク質とカップリングしたヒトVEGFRIIペプチド及びヒトVEGFRIIの細胞外ドメインに対して免疫化したマウスの血清中の、それぞれヒトVEGFRIIペプチド及びヒトVEGFRIIの細胞外ドメインに対して特異的なIgG抗体のELISA分析を示す。
Qβキャプシドタンパク質へのヒトVEGFR-IIペプチドのカップリング
配列CTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKを有するヒトVEGFRIIペプチドを、化学的に合成し、Qβキャプシドタンパク質との化学カップリングに用いた。
1mlの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.4中の1mg/mlQβキャプシドタンパク質の溶液を、45分間、ロッキングシェーカー上にてRTで、(H2O)中の20μlの100mM Sulfo-MBS(Pierce)溶液と反応させた。この反応液について、その後、4℃で2Lの20mM Hepes、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。次いで、1000μlの透析したQβ反応液混合物を、45分間、ロッキングシェーカー上にて25℃で、12μlの10mM ヒトVEGFRIIペプチド溶液(DMSO中)と反応させた。この反応混合液について、その後、2リッターの20mM Hepes、pH7.4に対して4℃で2時間の透析を2回おこなった。
C57BL/6マウスを、アジュバンドを添加せずにQβタンパク質とカップリングしたヒトVEGFRIIペプチドでワクチン接種する。各試料のおよそ50μgの全タンパク質をマウスをPBSで200μlまで希釈し、0日目、14日目及び28日目に皮下注射した。マウスを14日目、28日目に逆軌道で出血させ、42日目の血清をヒトVEGFR-II特異的 ELISAを利用して分析する。
HBcAg-149-lys-2cys-Mutキャプシドタンパク質へのヒトVEGFR-IIペプチドのカップリング
配列CTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKを有するヒトVEGFRIIペプチドを化学的に合成し、HBcAg-149-lys-2cys-Mutキャプシドタンパク質との化学カップリングに用いる。
3mlのPBS、pH7.4中の0.9mg/mlcysフリーHBcAgキャプシドタンパク質(参照.実施例31)の溶液を、45分間、ロッキングシェーカー上にてRTで、(H2O)中の37.5μlの100mM Sulfo-MBS(Pierce)溶液と反応させる。この反応液について、その後、2Lの20mM Hepes、pH7.4に対する終夜の透析を2回おこなう。緩衝液交換の後、この反応溶液を、さらなる2時間、透析する。この透析した反応混合液を、次いで、ロッキングシェーカー上にて25℃で4時間、3μlの10mMのヒトVEGFRIIペプチド溶液(DMSO中)と反応させる。この反応混合液について、その後、2リッターの20mM Hepes、pH7.4に対して4℃で終夜の透析をおこない、続いて緩衝液を交換し、さらに2時間の透析をおこなう。
肝炎コア抗原(HBcAg)1-183を、実施例23に記載のように修飾した。c/e1エピトープ(残基72〜88)領域(プロリン79及びアラニン80)の一部分を、ペプチドGly-Gly-Lys-Gly-Gly(HBcAg1-183Lysコンストラクト)によって遺伝的に置換した。導入したリジン残基は、その側鎖に遊離のシステイン基を含有する任意の抗原とのHBcAg粒子の分子間化学架橋に利用できる活性アミノ基を有する。基本的に実施例1に記載のようなPCR法及び常套的なクローニング技術を用いて、HBcAg1-183Lys遺伝子を調製した。
断片1:
プライマー1:EcoRIHBcAg(s)(実施例23を参照)
プライマー2:Lys-HBcAg(as)(実施例23を参照)
断片2:
プライマー3:Lys-HBcAg(s)(実施例23を参照)
プライマー4:HBcAgwtHindIII
CGCGTCCCAAGCTTCTAACATTGAGATTCCCGAGATTG
アセンブリ:
プライマー1:EcoRIHBcAg(s)(実施例23を参照)
プライマー2:HBcAgwtHindIII
アセンブリした完全長遺伝子を、次いで、EcoRI(GAATTC)及びHindIII(AAGCTT)酵素で消化し、同じ制限酵素部位を切断したpKKベクター(ファルマシア)へクローニングした。
A.HBcAg1-183LysへのmuTNFaペプチドのカップリング
0.6mg/ml(29μM)の濃度のHBcAg1-183Lysを、実施例32に記載のようにヨードアセトアミドで処理した。その後、HBcAg1-183Lysを、実施例32に記載のように50倍過度の架橋剤Sulfo-MBSと反応させ、20mM Hepes、pH7.2に対して4℃で終夜、透析した。活性化(誘導体化)HBcAg1-183Lysは、4℃にてロッキングシェーカー上で4時間、5倍モル濃度過度のペプチドmuTNFa(配列:CGGVEEQLEWLSQR、DMSO中の100mM原液から直接にHBcAg1-183Lys溶液へ直接に希釈)と反応させた。カップリング反応液(約1ml溶液)を、4℃で4時間、2リッターの20mM HEPES pH7.2に対して2回透析した。この透析したカップリング反応をアリコートで液体窒素で凍結し、マウスの免疫化まで−80℃で貯蔵した。
2匹のマウス(雌Balb/c)を、0日目及び14日目に、アジュバンド無しで、動物あたりmuTNFaペプチドとカップリングさせた100μgのHBcAg1-183Lysで静脈内で免疫化した。血清のmuTNFaペプチド(リボヌクレアーゼAコンジュゲートとしてコーティング)及び天然TNFαタンパク質(シグマ)に対して特異的な抗体を、ELISAによって21日目に測定した。
マウスTNFαタンパク質(シグマ)を、2mg/mlの濃度でコーティングした。コントロールとして、免疫化に用いた同じマウスからの免疫前血清を試験した。図14はELISA実験の結果を示し、それは、muTNFaペプチドとカップリングしたHBcAg1-183Lys(完全長HBc-TNF)による免疫化により、マウスTNFαタンパク質に対して特異的な免疫応答を生じたことを示している。0日目(免疫前)及び21日目に出血させたマウスの血清を、3つの異なる希釈で試験した。各棒線は、2匹のマウスの血清から得たシグナルの平均である。従って、muTNFaペプチドのアミノ酸配列がマウスTNFαタンパク質の配列に由来するので、muTNFaペプチドとカップリングさせたHBcAg1-183Lysによるワクチン接種によって、自己抗原に対する免疫応答が誘導された。
2cysLys-mutHBcAg1-149への3' TNFIIペプチドのカップリング
2cysLys-mutHBcAg1-149を2mg/mlの濃度で30分間、RTで、20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2中の50倍過度の架橋剤と反応させた。過度の架橋剤を終夜の透析によって取り除き、活性化(誘導体化)2cysLys-mut HBcAg1-149キャプシドタンパク質を、100mM原液から希釈した10倍過度の3' TNF II ペプチド(配列:SSQNSSDKPVAHVVANHGVGGC、DMSO中の100mM原液から希釈)とRTで4時間、反応させた。次いで、この反応混合液を、終夜、分画分子量50000Daの透析チューブによって透析し、液体窒素で凍結し、マウスの免疫化まで−80℃で貯蔵した。
8週齢の3匹のC3H/HeNマウスを、アジュバンドの添加をせずに、2cysLys-mut HBcAg1-149とカップリングさせた3' TNFIIペプチドでワクチン接種した。50μgの全タンパク質をマウスをPBSで200μlまで希釈し、0日目及び14日目に皮下注射(100μlを2つの鼠径部)した。マウスを0日目、21日目に逆軌道で出血させ、それらの血清をマウスTNFαタンパク質に特異的な ELISAを利用して分析した。
マウスTNFαタンパク質(シグマ)を、2mg/mlの濃度でコーティングした。コントロールとして、免疫化に用いた同じマウスからの免疫前血清を試験した。図15はELISA実験の結果を示し、それは、3' TNF IIペプチドとカップリングした2cysLys-mut HBcAg1-149による免疫化により、マウスTNFαタンパク質に対して特異的な免疫応答を生じたことを示している。0日目(免疫前)及び21日目に出血させたマウスの血清を、3つの異なる希釈で試験した。各棒線は、3匹のマウスの血清から得たシグナルの平均である。従って、3' TNF IIペプチドのアミノ酸配列がマウスTNFαタンパク質の配列に由来するので、3' TNF IIペプチドとカップリングさせた2cysLys-mut HBcAg1-149によるワクチン接種によって、自己抗原に対する免疫応答が誘導された。
A.架橋剤SMPHを用いた、Qβキャプシドタンパク質へのAβ1-15及びAβ33-42ペプチドのカップリング。
以下のAβペプチドを化学的に合成した:Qβキャプシドタンパク質とのカップリングために、C末端で配列GGCと融合したヒトAβの残基1-15のアミノ酸配列を含むペプチドである、DAEFRHDSGYEVHHQGGC(「Aβ1-15」と省略)、及びQβキャプシドタンパク質とのカップリングために、N末端で配列CGHGNKSと融合したヒトAβの残基33-42のアミノ酸配列を含むペプチドである、CGHGNKSGLMVGGVVIA(「Aβ33-42」と省略)。両ペプチドを、以下の記載のように、Qβへの化学カップリングに用いた。
1:誘導化Qβ;2:「Aβ1-15」とカップリングさせたQβであって、カップリング反応の最後に取り出した試料の上澄液で、遠心分離したもの;3:「Aβ1-15」とカップリングさせたQβであって、カップリング反応の最後に取り出した試料のペレットで、遠心分離したもの;4:「Aβ1-15」とカップリングさせたQβであって、24時間、4℃で静置させた試料の上澄み液で、透析せずに遠心分離したもの。5:「Aβ1-15」とカップリングさせたQβであって、24時間、4℃で静置させた試料のペレットで、透析せずに遠心分離したもの。6:「Aβ1-15」とカップリングさせたQβであって、カップリング反応の透析の後に取り出した試料の上澄み液で、遠心分離したもの。
1:誘導化Qβ 2:「Aβ33-42」とカップリングさせたQβであって、カップリング反応の最後に取り出した試料の上澄液で、遠心分離したもの;3:「Aβ33-42」とカップリングさせたQβであって、カップリング反応の最後に取り出した試料のペレットで、遠心分離したもの。4:「Aβ33-42」とカップリングさせたQβであって、24時間、4℃で静置させた試料の上澄み液で、透析せずに遠心分離したもの。5:「Aβ33-42」とカップリングさせたQβであって、24時間、4℃で静置させた試料のペレットで、透析せずに遠心分離したもの。
6:「Aβ33-42」とカップリングさせたQβであって、カップリング反応の透析の後に取り出した試料の上澄み液で、遠心分離したもの。
次のAβペプチド(「Aβ1-27」)を化学的に合成したDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNGGC。このペプチドは、Qβキャプシドタンパク質とのカップリングのために、C末端で配列GGCと融合した、ヒトAβの残基1-27のアミノ酸配列を含む。
1.5mlの20mM Hepes 150mM NaCl pH7.4中の2mg/ml Qβキャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で30分間、16.6μlのH2O中の65mM SMPH(Pierce)の溶液と反応させた。この反応液について、その後、分画分子量10000Daの透析チューブにより、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。450μlの透析反応混合液を、次いで、ロッキングシェーカー上にて15℃で2時間、6.5μlの50mMペプチド原液(DMSO中)と反応させた。その次に、200μlのこの反応混合液を等分し、液体窒素で凍結して、マウスの免疫化まで−80℃で貯蔵した。
500μlの20mM Hepes 150mM NaCl pH7.4中のQβキャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で30分間、11.3μlのH2O中の32.5mM SMPH(Pierce)の溶液と反応させた。この反応液について、その後、分画分子量3500Da(SnakeSkin, Pierce)の透析チューブにより、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。次いで、この透析した反応混合液を、ロッキングシェーカー上にて15℃で2時間、3.6μlの50mMペプチド原液(DMSO中)と反応させた。この反応混合液について、その後、分画分子量50000Da(Spectrapor, spectrum)の透析膜を用いて、1lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する1時間の透析を2回、そして、緩衝液の最後の交換の後に終夜の透析をおこなった。この反応混合液を、次いで、等分量、液体窒素で凍結し、マウスの免疫化まで−80℃で貯蔵した。「Qβ-Aβ1-27バッチ1」を最初の免疫化に用い、その一方で、「Qβ-Aβ1-27バッチ2」を追加免疫に用いた。
図13Cのゲル上に負荷した試料は、以下の通りである:
M:タンパク質マーカー。1:Qβキャプシドタンパク質 2:誘導体化Qβであって、誘導体化反応の最後に取り出した試料の上澄み液で、遠心分離したもの。3:誘導体化Qβであって、カップリング反応の最後に取り出した試料のペレットで、遠心分離したもの。4:「Aβ1-27」とカップリングさせたQβであって、誘導体化反応の最後に取り出した試料の上澄み液で、遠心分離したもの。5:「Aβ1-27」とカップリングさせたQβであって、カップリング反応の最後に取り出した試料のペレットで、遠心分離したもの。6:「Aβ1-27」とカップリングさせたQβであって、カップリング反応の透析後に取り出した試料の上澄み液で、遠心分離したもの。7:「Aβ1-27」とカップリングさせたQβであって、カップリング反応の透析後に取り出した試料のペレットで、遠心分離したもの。
500μlの20mM Hepes 150mM NaCl pH7.4中の2mg/lQβキャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で30分間、5.5μlのH2O中の65mM SMPH(Pierce)の溶液と反応させた。この反応液について、その後、分画分子量10000Daの透析チューブにより、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。次いで、500μlのこの透析した反応混合液を、ロッキングシェーカー上にて15℃で2時間、6.5μlの50mMペプチド原液(DMSO中)と反応させた。200μlのこの反応混合液について、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する終夜の透析をおこない、翌朝、緩衝液の交換後にさらに2時間の透析をおこなった。この反応混合液を、次いで、等分量、液体窒素で凍結し、マウスの免疫化まで−80℃で貯蔵した。
図13Dのゲル上に負荷した試料は、以下の通りである:
M:タンパク質マーカー。1:誘導体化Qβ 2:「Aβ1-15」とカップリングしたQβであって、カップリング反応の最後に取り出した試料の上澄み液で、遠心分離したもの。3:「Aβ1-15」とカップリングしたQβであって、カップリング反応の最後に取り出した試料のペレットで、遠心分離したもの。4:「Aβ1-15」とカップリングしたQβであって、24時間、4℃で静置させた試料の上澄み液で、透析せずに遠心分離したもの。5:「Aβ1-15」とカップリングしたQβであって、24時間、4℃で静置させた試料のペレットで、透析せずに遠心分離したもの。6:「Aβ1-15」とカップリングしたQβであって、カップリング反応の透析後に取り出した試料の上澄み液で、遠心分離したもの。
500μlの20mM Hepes 150mM NaCl pH7.4中のQβキャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で30分間、14.7μlのH2O中の100mM Sulfo-MBS(Pierce)の溶液と反応させた。この反応液について、その後、分画分子量3500Daの透析チューブ(SnakeSkin, Pierce)により、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。次いで、この透析した反応混合液を、ロッキングシェーカー上にて15℃で2時間、7.2μlの50mMペプチド原液(DMSO中)と反応させた。この反応混合液について、その後、分画分子量50000Da(Spectrapor, spectrum)の透析膜を用いて、2lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する4時間の透析を3回おこなった。この反応混合液を、次いで、等分量、液体窒素で凍結し、マウスの免疫化まで−80℃で貯蔵した。
図13Eのゲル上に負荷した試料は、以下の通りである:
1:Qβキャプシドタンパク質 2:誘導体化Qβであって、誘導体化反応の最後に取り出した試料の上澄み液で、遠心分離したもの。3:誘導体化Qβであって、誘導体化反応の最後に取り出した試料のペレットで、遠心分離したもの。4:誘導体化Qβであって、誘導体化反応の透析の最後に取り出した試料の上澄み液で、遠心分離したもの。5:誘導体化Qβであって、誘導体化反応の透析の最後に取り出した試料のペレットで、遠心分離したもの。6:「Aβ1-15」とカップリングしたQβであって、カップリング反応の透析後に取り出した試料の上澄み液で、遠心分離したもの。7:「Aβ1-15」とカップリングしたQβであって、カップリング反応の最後に取り出した試料のペレットで、遠心分離したもの。8:「Aβ1-15」とカップリングしたQβであって、カップリング反応の透析後に取り出した試料の上澄み液で、遠心分離したもの。
8週齢のグループあたり3匹の雌C57BL/6マウスの5グループを、アジュバンドの添加をせずに、5つのAβペプチド-Qβキャプシドタンパク質コンジュゲートのうちの1つで、そえぞれをワクチン接種した。各試料の25μgの全タンパク質をPBSで200μlまで希釈し、0日目及び14日目に皮下注射した。マウスを0日目(免疫前)、21日目に逆軌道で出血させ、それらの血清をELISAで分析した。「Aβ1-15」ペプチドを3つの異なる架橋剤でQβとカップリングさせ、その結果として、3つの異なるワクチン調製物(「Qb-Aβ-15 SMPH」、「Qb-Aβ-15 SMBS」;結果については、ELISAの章を参照)を得た。
すべて3つのAβペプチドを、それぞれ、以下のように化学架橋剤SPDPを用いて、ウシリボヌクレアーゼAとカップリングさせた:2mL PBS(50mM リン酸緩衝液、150mM NaCl pH7.2)中の10mg リボヌクレアーゼAの溶液を、ロッキングシェーカー上にて60分間、25℃で、DMSO中の100μlの20mM SPDP溶液と反応させた。過度の架橋剤を、PD10カラム(ファルマシア)を用いるゲル濾過によって活性化(誘導体化)リボヌクレアーゼAから分離した。分画を含有するタンパク質をプールし、遠心濾過器(5000MWCO)を用いて、2mlの容量へ濃縮した。誘導体化リボヌクレアーゼA溶液の333μlの試料を、2μlのペプチド原液(DMSO中で50mM)と反応させた。このカップリング反応を、分光光度法によって追跡した。
A.Qβキャプシドタンパク質へのカップリングのためのミモボディーの発現に関するプラスミドの構築
プラスミドは、発現プラスミドVAE051-pASK116に基づいた。このプラスミドは、ミモボディーの重鎖及び軽鎖に関するコード領域を有する。以下のプライマーを、重鎖のC末端へcys-含有リンカーを導入するのに用いた。
プライマーCA2F:
CGGCTCGAGCATCACCATCACCATCACGGTGAAGTTAAACTGCAGCTGGAGTCG
プライマーCA1R:
CATGCCATGGTTAACCACAGGTGTGGGTTTTATCACAAGATTTGGGCTCAAC
プライマーCB1R:
CATGCCATGGTTAACCACACGGAGAGGTGTGGGTTTTATCACAAGATTTGGGCTCAAC
プライマーCC1R:
CCAGAAGAACCCGGCGGGGTAGACGGTTTCGGGCTAGCACAAGATTTGGGCTCAACTC
プライマーCC1F:
CGCCGGGTTCTTCTGGTGGTGCTCCGGGTGGTTGCGGTTAACCATGGAGAAAATAAAGTG
プライマーCCR2:
CTCCCGGGTAGAAGTCAC
プライマーCA2F及びCA1Rを用いて、cys-含有リンカー配列をコードする伸張を有する重鎖の一部分をコードする741bp断片を増幅した。(92℃で初期変性、サイクル:92℃、30秒;48℃、30秒;68℃、60秒)を5サイクル、その後、92℃、30秒;58℃、30秒;68℃、1分による30サイクルのPCR cycler(Robo)におけるPfxポリメラーゼ(Roche)のテンプレートとして、VAE-pASK116は機能した。適切な大きさのPCR産物は、Qiagen PCR精製キットを用いて精製し、製造者(Gibco)の薦めに従って、XhoI及びNcoIで消化した。その産物は、Qiagenゲル抽出キットによってアガロースゲルから精製した。プラスミドVAE-pASK116をXhoI及びNcoIで同時に切断し、3.7kbバンドをアガロースゲルから精製した。XhoI-NcoI消化PCR産物の適切な等分量及びプラスミドを、製造者プロトコール(Gibco)に従いT4 DNAリガーゼを用いて、16℃で終夜、ライゲーションした。このライゲーション産物を、クロラムフェニコールを含有するアガロースプレート上にプレートしたコンピテント大腸菌XL-1細胞へ形質転換した。単一のコロニーをLB/クロラムフェニコール培地に広げ、プラスミドを調製(Qiagen mini プラスミド キット)し、相当する酵素による消化の後、適切なXhoI-NcoI挿入サイズの存在について試験した。pCA2と呼ばれる相当するポジティブプラスミドを、cys含有リンカーを含むプラスミドの同一性を確かめた両ストランドのシーケンシングのために取り寄せた。
プライマーCA2F及びCB1Rを用いて、重鎖コード化配列の5' 末端にリンカー2を、そしてセクションA1に記載のと同じ条件を導入した。この結果として得られたPCR産物は750bpで、これをセクションA1に記載のように、VAE051-pASK116へクローニングした。
プラスミドpCC2は、2段階手法によって構築された:754bpの最初のPCR産物を、プライマーCA2F及びCC1Rを用いて増幅した。560bpの二番目のPCR産物を、プライマーCC1F及びCC2Rを用いて作製した。両PCRに関して、VAE051-pASK116をテンプレートとして利用し、条件はセクションA1に記載の通りであった。両PCR産物をアガロースゲルから単離し、プライマーCA2F及びCC2Rと混合させ、3番目のPCRをおこない、1298bp断片を結果として得た。この断片を単離して、XhoI及びNcoIで消化した。この結果として生じた780bp断片を、セクションA.1.に記載のように、VAE-pASK100へクローニングした。
コンピテント大腸菌W3110細胞を、プラスミドpCA2、pCB2及びpCC2で形質転換した。クロラムフェニコールアガロースプレートからの単一コロニーを、37℃で終夜、液体培養(LB+15μg/ml クロラムフェニコール)で増やした。1lのTB培地を、次いで、終夜培養で1:50v/vで接種し、28℃でOD600=3まで生育させた。発現は、1mg/l無水テトラサイクリンで誘導した。細胞を終夜培養の後に収集し、6000rpmで遠心分離した。ペリプラズマを、硫酸ポリミキシンBを補充したライセート緩衝液での4℃で2時間のインキュベートによって細胞ペレットから単離した。スフェロプラストを、6000rpmでの遠心分離によって分離した。この結果として得られた上澄み液はミモボディーを含有し、それを20mMトリス、pH8.0に対して透析した。
導入されたhis6-タグは、製造者の薦めに従ったNi-NTAファーストフロー(キアゲン)によるクロマトグラフィーによるミモボディーの精製を可能にした。必要ならば、プロテインGファーストフローカラム(アマシャム ファルマシア)におけるポリシングステップを後に続けた。ミモボディーを0.1Mグリシン pH2.7で溶出し、即座にNaOHの添加によって中和し、20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対して透析した。
pCC2を、プロテインGのみによるアフィニティークロマトグラフィーで精製した。純度は、SDS-PAGEによって分析した。
ミモボディーのタンパク質配列は、cDNA配列から翻訳された。N末端配列は、pCA2及びpCB2のエドマンシーケンシングによって確かめられた。
DIELVVTQPASVSGSPGQSITISCTGTRSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKL
MIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTL
GVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVT
VAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQ
VTHEGSTVEKTVAPTECS
EVKLQLEHHHHHHGEVKLQLESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSGGYY
WTWIRQRPGKGLEWIGYIYYSGSTSYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLRLT
SVTAADTAVYYCARERGETGLYYPYYYIDVWGTGTTVTVSSASTKGPSV
FPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ
SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTC
G
EVKLQLEHHHHHHGEVKLQLESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSGGYY
WTWIRQRPGKGLEWIGYIYYSGSTSYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLRLT
SVTAADTAVYYCARERGETGLYYPYYYIDVWGTGTTVTVSSASTKGPSV
FPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ
SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTS
PPCG
EVKLQLEHHHHHHGEVKLQLESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSGGYY
WTWIRQRPGKGLEWIGYIYYSGSTSYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLRLT
SVTAADTAVYYCARERGETGLYYPYYYIDVWGTGTTVTVSSASTKGPSV
FPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ
SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCASPKPS
TPPGSSGGAPGGC
D.1.Qβキャプシドタンパク質へのミモボディーpCC2のカップリング:
1.25mlの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の4.5mg/ml Qβキャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で、30分間、40μlのSMPH(Pierce)(DMSOに溶解させた100mM 原液の)と反応させた。この反応液について、続いて、4℃で2lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなった。6μlの透析反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上にて25℃で終夜、30μlのpCC2溶液(2.88mg/ml)と反応させた。
1.25mlの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の4.5mg/ml Qβキャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で、30分間、40μlのSMPH(Pierce)(DMSOに溶解させた100mM 原液の)と反応させた。この反応液について、続いて、4℃で2lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなった。 pCA2(1.2mg/ml)を25℃で30分間、20mM TCEPで、pCB2(4.2mg/ml)を37℃で50mM メルカプトエチルアミンで還元した。両ミモボディーについて、その後、4℃で20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する透析を2回おこなった。カップリングは、ロッキングシェーカー上にて25℃で、30μlのミモボディーへ6μlの誘導体化Qβを添加することによっておこなった。
約40kDaのカップリング産物を、pCA2及びpCB2の双方に関して検出することができる(図15A及び図15B、矢印)。抗Qβ抗血清及びミモボディーを認識する抗his6抗体とのその反応性は、Qβへのミモボディーの共有的カップリングを明白に示した。
カップリングのために、N末端にCGG配列が付加されたFlag ペプチドは化学的に合成され、以下の配列を有していた:CGGDYKDDDDK。以下に示しているように、このペプチドを、wtQβキャプシドタンパク質、及びQβ変異体キャプシドタンパク質への化学カップリングに利用した。
100ulの20mM Hepes 150mM NaCl pH7.2中の2mg/ml Qβキャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で、60分間、7μlの65mM Sulfo-GMBS(Pierce)と反応させた。この反応液について、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなった。100μlの透析反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上にて25℃で2時間、0.58μlの100mM Flagペプチド原液(H2O中)と反応させた。この反応混合液を、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなった。
100ulの20mM Hepes 150mM NaCl pH7.2中の2mg/ml Qβ-240キャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で、60分間、7μlの65mM Sulfo-GMBS(Pierce)と反応させた。この反応液について、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなった。100μlの透析反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上にて25℃で2時間、0.58μlの100mM Flagペプチド原液(H2O中)と反応させた。この反応混合液を、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなった。
100ulの20mM Hepes 150mM NaCl pH7.4中の2mg/ml Qβ-250キャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で、60分間、7μlの65mM Sulfo-GMBS(Pierce)と反応させた。この反応液について、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなった。100μlの透析反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上にて25℃で2時間、0.58μlの100mM Flagペプチド原液(H2O中)と反応させた。この反応混合液を、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなった。
100ulの20mM Hepes 150mM NaCl pH7.4中の2mg/ml Qβ-259キャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で、60分間、7μlの65mM Sulfo-GMBS(Pierce)と反応させた。この反応液について、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。100μlの透析反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上にて25℃で2時間、0.58μlの100mM Flagペプチド原液(H2O中)と反応させた。この反応混合液を、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。
1.誘導体化Qβ-240 2.FlagペプチドとカップリングさせたQβ-240 3.誘導体化Qβ-250 4.FlagペプチドとカップリングさせたQβ-250 5.誘導体化Qβ-259 6.FlagペプチドとカップリングさせたQβ-259 7.誘導体化wtQβ 8.FlagペプチドとカップリングさせたwtQβ 9.タンパク質マーカー
カップリングのために、N末端にCGG配列が付加されたFlag ペプチドは化学的に合成され、以下の配列を有していた:CGGDYKDDDDK。以下に示しているように、このペプチドを、wtQβキャプシドタンパク質、及びQβ変異体キャプシドタンパク質への化学カップリングに利用した。
100ulの20mM Hepes 150mM NaCl pH7.2中の2mg/ml Qβキャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で、60分間、7μlの65mM Sulfo-GMBS(Pierce)と反応させた。この反応液について、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなった。100μlの透析反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上にて25℃で2時間、0.58μlの100mM Flagペプチド原液(H2O中)と反応させた。この反応混合液を、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなった。
100ulの20mM Hepes 150mM NaCl pH7.2中の2mg/ml Qβ-240キャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で、60分間、7μlの65mM Sulfo-GMBS(Pierce)と反応させた。この反応液について、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなった。100μlの透析反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上にて25℃で2時間、0.58μlの100mM Flagペプチド原液(H2O中)と反応させた。この反応混合液を、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。
100ulの20mM Hepes 150mM NaCl pH7.2中の2mg/ml Qβ-250キャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で、60分間、7μlの65mM Sulfo-GMBS(Pierce)と反応させた。この反応液について、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなった。100μlの透析反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上にて25℃で2時間、0.58μlの100mM Flagペプチド原液(H2O中)と反応させた。この反応混合液を、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなった。
100ulの20mM Hepes 150mM NaCl pH7.2中の2mg/ml Qβ-259キャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で、60分間、7μlの65mM Sulfo-GMBS(Pierce)と反応させた。この反応液について、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなった。100μlの透析反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上にて25℃で2時間、0.58μlの100mM Flagペプチド原液(H2O中)と反応させた。この反応混合液を、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。
1.タンパク質マーカー 2.誘導体化Qβ-240 3.FlagペプチドとカップリングさせたQβ-240 4.誘導体化Qβ-250 5.FlagペプチドとカップリングさせたQβ-250 6.誘導体化Qβ-259 7.FlagペプチドとカップリングさせたQβ-259 8.誘導体化wtQβ 9.FlagペプチドとカップリングさせたwtQβ
カップリングのために、N末端にCGG配列が付加されたFlag ペプチドは化学的に合成され、以下の配列を有していた:CGGDYKDDDDK。以下に示しているように、このペプチドを、Qβ変異体キャプシドタンパク質への化学カップリングに利用した。
100ulの20mM Hepes 150mM NaCl pH7.4中の2mg/ml Qβ-240キャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で、30分間、DMSO中の2.94μlの100mMSMPH(Pierce)と反応させた。この反応液について、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。90μlの透析反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上にて25℃で2時間、1.3μlの50mM Flagペプチド原液(DMSO中)と反応させた。この反応混合液を、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。
100ulの20mM Hepes 150mM NaCl pH7.4中の2mg/ml Qβ-250キャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で、30分間、2.94μlの100mMSMPH(Pierce)と反応させた。この反応液について、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。90μlの透析反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上にて25℃で2時間、1.3μlの50mM Flagペプチド原液(DMSO中)と反応させた。この反応混合液を、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。
100ulの20mM Hepes 150mM NaCl pH7.4中の2mg/ml Qβ-259キャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で、30分間、2.94μlの100mMSMPH(Pierce)と反応させた。この反応液について、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。90μlの透析反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上にて25℃で2時間、1.3μlの50mM Flagペプチド原液(DMSO中)と反応させた。この反応混合液を、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。
1.タンパク質マーカー 2.FlagとカップリングさせたQβ-240であって、カップリング反応のペレット 3.FlagとカップリングさせたQβ-240であって、カップリング反応の上澄み液 4.SMPH5で誘導体化したQβ-240 5.FlagとカップリングさせたQβ-250であって、カップリング反応のペレット 6.FlagとカップリングさせたQβ-250であって、カップリング反応の上澄み液 7.SMPH5で誘導体化したQβ-250 8.FlagとカップリングさせたQβ-259であって、カップリング反応のペレット 9.FlagとカップリングさせたQβ-259であって、カップリング反応の上澄み液 10.SMPHで誘導体化したQβ-259。
誘導体化反応とカップリング反応の比較は、すべての変異体に関しては、サブユニットあたり1、それぞれ2ペプチドに相当するバンドが目で見ることができることを示している。サブユニットあたり3、それぞれ4ペプチドに相当するバンドも、変異体Qβ-250に関して目で見ることができる。
凍結乾燥した変異体Qβキャプシドタンパク質を、20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4で終夜、膨張させた。
A.Qβ-240キャプシドタンパク質へのPLA2-Cysタンパク質のカップリング
100ulの20mM Hepes 150mM NaCl pH7.4中の2mg/ml Qβ-240キャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で、30分間、DMSO中の2.94μlの100mM SMPH(Pierce)と反応させた。この反応液について、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。90μlの透析反応混合液を146ulの20mM Hepes 、150mM NaCl pH7.4と混合させ、そしてロッキングシェーカー上にて25℃で4時間、85.7ulの2.1mg/ml PLA2-Cysペプチド原液と反応させた。この反応混合液について、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。
100ulの20mM Hepes 150mM NaCl pH7.4中の2mg/ml Qβ-250キャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で、30分間、DMSO中の2.94μlの100mM SMPH(Pierce)と反応させた。この反応液について、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。90μlの透析反応混合液を146ulの20mM Hepes 、150mM NaCl pH7.4と混合させ、そしてロッキングシェーカー上にて25℃で4時間、85.7ulの2.1mg/ml PLA2-Cysペプチド原液と反応させた。この反応混合液について、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。
100ulの20mM Hepes 150mM NaCl pH7.4中の2mg/ml Qβ-259キャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で、30分間、DMSO中の2.94μlの100mM SMPH(Pierce)と反応させた。この反応液について、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。90μlの透析反応混合液を146ulの20mM Hepes 、150mM NaCl pH7.4と混合させ、そしてロッキングシェーカー上にて25℃で4時間、85.7ulの2.1mg/ml PLA2-Cysペプチド原液と反応させた。この反応混合液について、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。
1.タンパク質マーカー 2.誘導体化Qβ-240 3.Pla2CysとカップリングさせたQβ-240であって、カップリング反応の上澄み液 4.PLA2-CysとカップリングさせたQβ-240であって、カップリング反応のペレット 5.誘導体化Qβ-250 6.PLA2-CysとカップリングさせたQβ-250であって、カップリング反応の上澄み液 7.PLA2-CysとカップリングさせたQβ-250であって、カップリング反応のペレット 8.誘導体化Qβ-259 9.PLA2-CysとカップリングさせたQβ-259であって、カップリング反応の上澄み液 10.PLA2-CysとカップリングさせたQβ-250であって、カップリング反応のペレット 11.PLA2-Cys。
Claims (219)
- (a)(i)コア粒子、及び、
(ii)少なくとも1つの第1の付着部位を有するオーガナイザー
を含んでなる非天然分子骨格であって、
前記オーガナイザーが前記コア粒子に少なくとも1つの共有結合により連結され、前記コア粒子がバクテリオファージの組換えタンパク質、又はその断片を含むウイルス様粒子である非天然分子骨格、
(b)少なくとも1つの第2の付着部位を持つ抗原又は抗原決定基であって、前記第2の付着部位が、
(i)前記抗原又は抗原決定基に天然に存在しない付着部位、及び、
(ii)前記抗原又は抗原決定基に天然に存在する付着部位
からなる群から選択される抗原又は抗原決定基、
を含んでなる組成物であって、
前記第2の付着部位が、少なくとも1つの非ペプチド結合を介して前記第1の付着部位に結合することができ、そして、
前記抗原又は抗原決定基及び前記骨格が前記結合を介して相互作用して、規則正しく繰り返される抗原アレイを形成する、組成物。 - 前記結合が、少なくとも1つの共有結合による、請求項1に記載の組成物。
- 前記第1の付着部位がリジン残基であり、前記第2の付着部位がシステイン残基である、請求項1に記載の組成物。
- 前記第2の付着部位がスルフヒドリル基又はシステイン残基であるか、それを含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記バクテリオファージがRNA-ファージである、請求項1に記載の組成物。
- 前記RNA-ファージが、
a)バクテリオファージQβ;
b)バクテリオファージR17;
c)バクテリオファージfr;
d)バクテリオファージGA;
e)バクテリオファージSP;
f)バクテリオファージMS2;
g)バクテリオファージM11;
h)バクテリオファージMX1;
i)バクテリオファージNL95;
k)バクテリオファージf2;及び
l)バクテリオファージPP7;
からなる群から選択される、請求項5に記載の組成物。 - 前記組換えタンパク質が、
a)配列番号:159のアミノ酸配列;
b)配列番号:160のアミノ酸配列;
c)配列番号:161のアミノ酸配列;
d)配列番号:162のアミノ酸配列;
e)配列番号:163のアミノ酸配列;
f)配列番号:164のアミノ酸配列;
g)配列番号:165のアミノ酸配列;
h)配列番号:166のアミノ酸配列;
i)配列番号:167のアミノ酸配列;
j)配列番号:215のアミノ酸配列;
k)配列番号:253のアミノ酸配列;
l)配列番号:217及びその変異体のアミノ酸配列;
m)配列番号:254のアミノ酸配列;
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するコートタンパク質を含む、請求項5に記載の組成物。 - 前記組換えタンパク質が、変異体コートタンパク質を含む、請求項5に記載の組成物。
- 前記変異体コートタンパク質が、置換による少なくとも1つのリジン残基の除去により、又は置換による少なくとも1つのリジン残基の追加により改変されている、請求項8に記載の組成物。
- 前記変異体コートタンパク質が、少なくとも1つのリジン残基の欠失により、又は少なくとも1つのリジン残基の挿入を介する付加により改変されている、請求項8に記載の組成物。
- 前記バクテリオファージがバクテリオファージQβである、請求項1に記載の組成物。
- 前記バクテリオファージがバクテリオファージfrである、請求項1に記載の組成物。
- 前記組換えタンパク質が、配列番号:159のアミノ酸配列を有するコートタンパク質、又は配列番号:159及び配列番号:217又は配列番号:217の変異体のアミノ酸配列を有するコートタンパク質の混合物を含む、請求項11に記載の組成物。
- 前記コア粒子が、配列番号:159のアミノ酸配列を有するコートタンパク質から実質的になる、又は配列番号:217、又はその変異体、及び配列番号:159のアミノ酸配列を有するコートタンパク質の混合物から実質的になるバクテリオファージQβのウイルス様粒子である、請求項1に記載の組成物。
- 前記組換えタンパク質が変異体Qβコートタンパク質を含む、請求項11に記載の組成物。
- 前記変異体コートタンパク質が、置換による少なくとも1つのリジン残基の除去により、又は置換による少なくとも1つのリジン残基の追加により改変されている、請求項15に記載の組成物。
- 前記変異体Qβコートタンパク質が、少なくとも1つのリジン残基の欠失により、又は少なくとも1つのリジン残基の付加により改変されている、請求項15に記載の組成物。
- 前記変異体Qβコートタンパク質が、
a)配列番号:255のアミノ酸配列;
b)配列番号:256のアミノ酸配列;
c)配列番号:257のアミノ酸配列;
d)配列番号:258のアミノ酸配列;及び
e)配列番号:259のアミノ酸配列;
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含む、請求項15に記載の組成物。 - 前記コア粒子が、
a)配列番号:255のアミノ酸配列;
b)配列番号:256のアミノ酸配列;
c)配列番号:257のアミノ酸配列;
d)配列番号:258のアミノ酸配列;
e)配列番号:259のアミノ酸配列;及び
f)a)−e)の何れか及び対応するA1タンパク質の混合物から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する変異体Qβコートタンパク質から実質的に成るバクテリオファージQβのウイルス様粒子である、請求項1に記載の組成物。 - 前記オーガナイザーが、前記バクテリオファージQβ又は前記バクテリオファージfrの不可欠な部分である、請求項11に記載の組成物。
- 前記コア粒子が、バクテリオファージの組換えタンパク質からなるウイルス様粒子である、請求項1に記載の組成物。
- 前記第1及び/又は第2の付着部位が、
(a)抗原及びそれに対する抗体又は抗体断片;
(b)ビオチン及びアビジン;
(c)ストレプトアビジン及びビオチン;
(d)レセプター及びそのリガンド;
(e)リガンド結合性タンパク質及びそのリガンド;
(f)相互作用するロイシンジッパーポリペプチド;
(g)アミノ基及びそれと反応性の化学基;
(h)カルボキシル基及びそれと反応性の化学基;
(i)スルフヒドリル基及びそれと反応性の化学基;又は
(j)これらの組み合わせ
を含む、請求項1に記載の組成物。 - 前記第1の付着部位がアミノ基であり、第2の付着部位がスルフヒドリル基である、請求項1に記載の組成物。
- 前記第1の付着部位がリジン残基であり、第2の付着部位がシステイン残基である、請求項1に記載の組成物。
- 前記第2の付着部位が、前記抗原又は抗原決定基内に天然に存在しない、請求項1に記載の組成物。
- 前記第1の付着部位がアミノ基であり、第2の付着部位がスルフヒドリル基である、請求項25に記載の組成物。
- 前記第1の付着部位がリジン残基であり、第2の付着部位がシステイン残基である、請求項25に記載の組成物。
- 前記第2の付着部位が、スルフヒドリル基又はシステイン残基である又はそれを含む、請求項25に記載の組成物。
- 前記組成物がアミノ酸リンカーを含む、請求項25に記載の組成物。
- 前記アミノ酸リンカーが、少なくとも1つの共有結合によって前記抗原又は抗原決定基に結合した、請求項29に記載の組成物。
- 前記アミノ酸リンカーが、前記第2の付着部位を含むか、あるいはそれからなる、請求項29に記載の組成物。
- 前記アミノ酸リンカーが、スルフヒドリル基又はシステイン残基を含む、請求項31に記載の組成物。
- 前記アミノ酸リンカーが、
(a)CGG
(b)N-末端ガンマ1-リンカー;
(c)N-末端ガンマ3-リンカー;
(d)Igヒンジ領域;
(e)N-末端グリシンリンカー;
(f)n=0−12かつk=0−5である場合の(G)kC(G)n;
(g)N-末端グリシン-セリンリンカー;
(h)n=0−3、k=0−5、m=0−10,l=0−2である場合の(G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n;
(i)GGC
(k)GGC-NH2
(l)C-末端ガンマ1-リンカー
(m)C-末端ガンマ3-リンカー;
(n)C-末端グリシンリンカー;
(o)n=0−12かつk=0−5である場合の(G)nC(G)k;
(p)C-末端グリシン-セリンリンカー;
(q)n=0−3、k=0−5、m=0−10,l=0−2及びo=0−8である場合
の(G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k
からなる群から選択される、請求項31に記載の組成物。 - 前記抗原又は前記抗原決定基が、自己抗原又はその断片、又は抗-イディオタイプ抗体又は抗-イディオタイプ抗体断片である、請求項1に記載の組成物。
- 前記自己抗原が、
a)リンホトキシン;
b)リンホトキシンレセプター;
c)RANKL;
d)VEGF;
e)VEGFR;
f)インターロイキン5;
g)インターロイキン17;
h)インターロイキン13;
i)アンギオテンシン;
k)CCL21;
l)CXCL12;
m)SDF-1;
n)MCP-1;
o)エンドグリン(Endoglin);
p)レジスチン(Resistin);
q)GHRH;
r)LHRH;
s)TRH;
t)MIF;
u)エオタキシン(Eotaxin);
v)ブラジキニン;
w)BLC;
x)腫瘍壊死因子α(TNFα);
y)アミロイドベータペプチド(Aβ1−42);及び
z)ヒトIgE
からなる群から選択されるタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項34に記載の組成物。 - 前記自己抗原が、アンギオテンシンペプチド又はその断片である、請求項34に記載の組成物。
- 前記第2の付着部位が、前記抗原又は抗原決定基内に天然に存在しない、請求項36に記載の組成物。
- 前記第2の付着部位が、スルフヒドリル基又はシステイン残基である又はそれを含む、請求項36に記載の組成物。
- 前記組成物がアミノ酸リンカーを含む、請求項36に記載の組成物。
- 前記アミノ酸リンカーが、前記第2の付着部位を含むか、あるいはそれからなる、請求項39に記載の組成物。
- 前記アミノ酸リンカーが、スルフヒドリル基又はシステイン残基を含む、請求項40に記載の組成物。
- 前記第2の付着部位を持つ前記アンギオテンシンペプチドが、
a)CGGDRVYIHPFのアミノ酸配列;
b)CGGDRVYIHPFHLのアミノ酸配列;
c)DRVYIHPFHLGGCのアミノ酸配列;及び
d)CDRVYIHPFHLのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項36に記載の組成物。 - 前記自己抗原が、VEGFR-IIペプチド又はその断片である、請求項34に記載の組成物。
- 前記第2の付着部位が、前記抗原又は抗原決定基内に天然に存在しない、請求項43に記載の組成物。
- 前記第2の付着部位が、スルフヒドリル基又はシステイン残基である又はそれを含む、請求項43に記載の組成物。
- 前記組成物がアミノ酸リンカーを含む、請求項43に記載の組成物。
- 前記アミノ酸リンカーが、前記第2の付着部位を含むか、あるいはそれからなる、請求項46に記載の組成物。
- 前記アミノ酸リンカーが、スルフヒドリル基又はシステイン残基を含む、請求項47に記載の組成物。
- 前記第2の付着部位を持つ前記VEGFR-IIペプチドが、CTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKのアミノ酸配列を有する、請求項43に記載の組成物。
- 前記自己抗原が、腫瘍壊死因子α(TNF-α)、その断片又はTNF-αのペプチドである、請求項34に記載の組成物。
- 前記第2の付着部位が、前記抗原又は抗原決定基内に天然に存在しない、請求項50に記載の組成物。
- 前記第2の付着部位が、スルフヒドリル基又はシステイン残基である又はそれを含む、請求項50に記載の組成物。
- 前記組成物がアミノ酸リンカーを含む、請求項50に記載の組成物。
- 前記アミノ酸リンカーが、前記第2の付着部位を含むか、あるいはそれからなる、請求項53に記載の組成物。
- 前記アミノ酸リンカーが、スルフヒドリル基又はシステイン残基を含む、請求項54に記載の組成物。
- 前記第2の付着部位を持つ前記腫瘍壊死因子α(TNF-α)、その断片又はTNF-αのペプチドが、
a)CSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQのアミノ酸配列;
b)SSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQGGCのアミノ酸配列;及び
c)CGGQLQWLNRRANAのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項50に記載の組成物。 - 前記自己抗原が、レジスチン又はその断片である、請求項34に記載の組成物。
- 前記第2の付着部位が、前記抗原又は抗原決定基内に天然に存在しない、請求項57に記載の組成物。
- 前記第2の付着部位が、スルフヒドリル基又はシステイン残基である又はそれを含む、請求項57に記載の組成物。
- 前記組成物がアミノ酸リンカーを含む、請求項57に記載の組成物。
- 前記アミノ酸リンカーが、前記第2の付着部位を含むか、あるいはそれからなる、請求項60に記載の組成物。
- 前記アミノ酸リンカーが、スルフヒドリル基又はシステイン残基を含む、請求項61に記載の組成物。
- 前記第2の付着部位を持つ前記レジスチンタンパク質又はその断片が、
a)配列番号:325のアミノ酸配列;
b)配列番号:326のアミノ酸配列;及び
c)配列番号:327のアミノ酸配列;
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項57に記載の組成物。 - 前記自己抗原が、
a)リンホトキシンα(LTα)
b)リンホトキシンβ(LTβ)
c)LTα及びLTβの混合物又は組み合わせ
からなる群から選択されるリンホトキシン又はその断片である、請求項34に記載の組成物。 - 前記第2の付着部位が、前記抗原又は抗原決定基内に天然に存在しない、請求項64に記載の組成物。
- 前記第2の付着部位が、スルフヒドリル基又はシステイン残基である又はそれを含む、請求項64に記載の組成物。
- 前記組成物がアミノ酸リンカーを含む、請求項64に記載の組成物。
- 前記アミノ酸リンカーが、前記第2の付着部位を含むか、あるいはそれからなる、請求項67に記載の組成物。
- 前記アミノ酸リンカーが、スルフヒドリル基又はシステイン残基を含む、請求項68に記載の組成物。
- 前記自己抗原がリンホトキシンβ又はその断片であり、前記第2の付着部位を持つ前記リンホトキシンβが、
a)配列番号:346のアミノ酸配列;及び
b)配列番号:347のアミノ酸配列;
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項64に記載の組成物。 - 前記自己抗原が、ヒト-MIF又はその断片である、請求項34に記載の組成物。
- 前記第2の付着部位が、前記抗原又は抗原決定基内に天然に存在しない、請求項71に記載の組成物。
- 前記第2の付着部位が、スルフヒドリル基又はシステイン残基である又はそれを含む、請求項71に記載の組成物。
- 前記組成物がアミノ酸リンカーを含む、請求項71に記載の組成物。
- 前記アミノ酸リンカーが、前記第2の付着部位を含むか、あるいはそれからなる、請求項74に記載の組成物。
- 前記アミノ酸リンカーが、スルフヒドリル基又はシステイン残基を含む、請求項75に記載の組成物。
- 前記第2の付着部位を持つ前記ヒト-MIFタンパク質又はその断片が、
a)配列番号:310のアミノ酸配列;
b)配列番号:311のアミノ酸配列;
c)配列番号:312のアミノ酸配列;
d)配列番号:313のアミノ酸配列;
e)配列番号:314のアミノ酸配列;及び
f)配列番号:315のアミノ酸配列;
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項71に記載の組成物。 - 前記自己抗原が、ヒト-RANKL又はその断片である、請求項34に記載の組成物。
- 前記自己抗原が、ヒト-RANKLの細胞外部分又はその断片である、請求項34に記載の組成物。
- 前記第2の付着部位が、前記抗原又は抗原決定基内に天然に存在しない、請求項78又は79に記載の組成物。
- 前記第2の付着部位が、スルフヒドリル基又はシステイン残基である又はそれを含む、請求項78又は79に記載の組成物。
- 前記組成物がアミノ酸リンカーを含む、請求項78又は79に記載の組成物。
- 前記アミノ酸リンカーが、前記第2の付着部位を含むか、あるいはそれからなる、請求項82に記載の組成物。
- 前記アミノ酸リンカーが、スルフヒドリル基又はシステイン残基を含む、請求項83に記載の組成物。
- 前記第2の付着部位を持つ前記ヒト-RANKL又はその断片が、配列番号:320のアミノ酸配列又はその断片を有する、請求項78に記載の組成物。
- 前記アミノ酸リンカーが、
(a)CGG
(b)N-末端ガンマ1-リンカー;
(c)N-末端ガンマ3-リンカー;
(d)Igヒンジ領域;
(e)N-末端グリシンリンカー;
(f)n=0−12かつk=0−5である場合の(G)kC(G)n;
(g)N-末端グリシン-セリンリンカー;
(h)n=0−3、k=0−5、m=0−10,l=0−2である場合の(G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n;
(i)GGC
(k)GGC-NH2
(l)C-末端ガンマ1-リンカー
(m)C-末端ガンマ3-リンカー;
(n)C-末端グリシンリンカー;
(o)n=0−12かつk=0−5である場合の(G)nC(G)k;
(p)C-末端グリシン-セリンリンカー;
(q)n=0−3、k=0−5、m=0−10,l=0−2及びo=0−8である場合
の(G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k
からなる群から選択される、請求項39、46、53、60、67、74又は82に記載の組成物。 - (a)(i)(1)非天然起源のコア粒子;及び、
(2)天然起源のコア粒子
からなる群から選択されるコア粒子、及び、
(ii)少なくとも1つの第1の付着部位を有するオーガナイザー
を含んでなる非天然分子骨格であって、
前記オーガナイザーが前記コア粒子に少なくとも1つの共有結合により連結された非天然分子骨格、
(b)少なくとも1つの第2の付着部位を持つ抗原又は抗原決定基であって、
前記抗原又は抗原決定基が抗-イディオタイプ抗体又は抗-イディオタイプ抗体断片であり、前記第2の付着部位が、
(i)前記抗原又は抗原決定基に天然に存在しない付着部位、及び、
(ii)前記抗原又は抗原決定基に天然に存在する付着部位
からなる群から選択される抗原又は抗原決定基、
を含んでなる組成物において、
前記第2の付着部位が、少なくとも1つの非ペプチド結合を介して前記第1の付着部位に結合することができ、そして、
前記抗原又は抗原決定基及び前記骨格が前記結合を介して相互作用して、規則正しく繰り返される抗原アレイを形成する組成物。 - 前記結合が、少なくとも1つの共有結合による、請求項87に記載の組成物。
- 前記第1の付着部位がリジン残基であり、前記第2の付着部位がシステイン残基である、請求項87に記載の組成物。
- 前記コア粒子が、
i)ウイルス;
ii)ウイルス様粒子;
iii)バクテリオファージ;
iv)細菌性線毛;
v)ウイルスキャプシド粒子;及び
vi)(i)、(ii)、(iii)、(iv)又は(v)の組換え体
からなる群から選択される、請求項87に記載の組成物。 - 前記コア粒子が、
i)ウイルス様粒子;
ii)細菌性線毛;及び
iii)RNA-ファージのウイルス様粒子
からなる群から選択される、請求項87に記載の組成物。 - 前記ウイルス様粒子が、
(a)B型肝炎ウイルスの組換えタンパク質;
(b)麻疹ウイルスの組換えタンパク質;
(c)シンドビスウイルスの組換えタンパク質;
(d)ロタウイルスの組換えタンパク質;
(e)口蹄疫ウイルスの組換えタンパク質;
(f)レトロウイルスの組換えタンパク質;
(g)ノーウォークウイルスの組換えタンパク質;
(h)アルファウイルスの組換えタンパク質;
(i)ヒト乳頭腫ウイルスの組換えタンパク質;
(j)ポリオーマウイルスの組換えタンパク質;
(k)バクテリオファージの組換えタンパク質;及び
(l)RNA-ファージの組換えタンパク質;
(m)Qβ-ファージの組換えタンパク質;
(n)GA-ファージの組換えタンパク質;
(o)fr-ファージの組換えタンパク質;及び
(p)Tyの組換えタンパク質
からなる群から選択される組換えタンパク質又はその断片を含む、請求項91に記載の組成物。 - 前記ウイルス様粒子が、RNA-ファージの組換えタンパク質又はその断片を含むか、あるいはそれから実質的になる、請求項91に記載の組成物。
- 前記ウイルス様粒子が、
a)バクテリオファージQβ;
b)バクテリオファージR17;
c)バクテリオファージfr;
d)バクテリオファージGA;
e)バクテリオファージSP;
f)バクテリオファージMS2;
g)バクテリオファージM11;
h)バクテリオファージMX1;
i)バクテリオファージNL95;
k)バクテリオファージf2;及び
l)バクテリオファージPP7;
からなる群から選択されるRNA-ファージの組換えタンパク質又はその断片を含むか、あるいはそれから実質的になる、請求項91に記載の組成物。 - 前記ウイルス様粒子が、バクテリオファージQβ又はバクテリオファージfrの組換えタンパク質又はその断片を含むか、あるいはそれから実質的になる、請求項105に記載の組成物。
- 前記第2の付着部位が、前記抗原又は抗原決定基内に天然に存在しない、請求項87に記載の組成物。
- 前記組成物がアミノ酸リンカーを含む、請求項96に記載の組成物。
- 前記アミノ酸リンカーが、前記第2の付着部位を含むか、あるいはそれからなる、請求項97に記載の組成物。
- 前記アミノ酸リンカーが、スルフヒドリル基又はシステイン残基を含む、請求項98に記載の組成物。
- (a)(i)(1)非天然起源のコア粒子;及び、
(2)天然起源のコア粒子
からなる群から選択されるコア粒子、及び、
(ii)少なくとも1つの第1の付着部位を有するオーガナイザー
を含んでなる非天然分子骨格であって、
前記オーガナイザーが前記コア粒子に少なくとも1つの共有結合により連結された非天然分子骨格、
(b)少なくとも1つの第2の付着部位を持つ抗原又は抗原決定基であって、
前記抗原又は抗原決定基が自己抗原又はその断片であり、前記第2の付着部位が、
(i)前記抗原又は抗原決定基に天然に存在しない付着部位、及び、
(ii)前記抗原又は抗原決定基に天然に存在する付着部位
からなる群から選択される抗原又は抗原決定基、
を含んでなる組成物において、
前記第2の付着部位が、少なくとも1つの非ペプチド結合を介して前記第1の付着部位に結合することができ、そして、
前記抗原又は抗原決定基及び前記骨格が前記結合を介して相互作用して、規則正しく繰り返される抗原アレイを形成する、組成物。 - 前記結合が、少なくとも1つの共有結合による、請求項100に記載の組成物。
- 前記第1の付着部位がリジン残基であり、前記第2の付着部位がシステイン残基である、請求項100に記載の組成物。
- 前記コア粒子が、
i)ウイルス;
ii)ウイルス様粒子;
iii)バクテリオファージ;
iv)細菌性線毛;
v)ウイルスキャプシド粒子;及び
vi)(i)、(ii)、(iii)、(iv)又は(v)の組換え体
からなる群から選択される、請求項100に記載の組成物。 - 前記オーガナイザーが、ポリペプチド又はその残基であり、前記第2の付着部位がポリペプチド又はその残基である、請求項103に記載の組成物。
- 前記コア粒子がウイルス様粒子である、請求項100又は103に記載の組成物。
- 前記ウイルス様粒子が、配列番号:158のアミノ酸1−147を含むポリペプチドの二量体又は多量体である、請求項105に記載の組成物。
- 前記ウイルス様粒子が、配列番号:158のアミノ酸1−152を含むポリペプチドの二量体又は多量体である、請求項106に記載の組成物。
- 前記第1の付着部位がアミノ基であるかそれを含み、前記第2の付着部位がスルフヒドリル基であるかそれを含む、請求項105に記載の組成物。
- 前記ウイルス様粒子が、B型肝炎ウイルスキャプシドタンパク質である、請求項105に記載の組成物。
- 前記第1の付着部位がリジン残基であるかそれを含み、前記第2の付着部位がシステイン残基であるかそれを含む、請求項109に記載の組成物。
- 前記B型肝炎ウイルスキャプシドタンパク質の1又は複数のシステイン残基が、欠失されているか他のアミノ酸残基で置換されている、請求項110に記載の組成物。
- 前記B型肝炎ウイルスキャプシドタンパク質が、
a)配列番号:89のアミノ酸配列;
b)配列番号:90のアミノ酸配列;
c)配列番号:93のアミノ酸配列;
d)配列番号:98のアミノ酸配列;
e)配列番号:99のアミノ酸配列;
f)配列番号:102のアミノ酸配列;
g)配列番号:104のアミノ酸配列;
h)配列番号:105のアミノ酸配列;
i)配列番号:106のアミノ酸配列;
j)配列番号:119のアミノ酸配列;
k)配列番号:120のアミノ酸配列;
l)配列番号:123のアミノ酸配列;
m)配列番号:125のアミノ酸配列;
n)配列番号:131のアミノ酸配列;
o)配列番号:132のアミノ酸配列;
p)配列番号:134のアミノ酸配列;
q)配列番号:157のアミノ酸配列;及び
r)配列番号:158のアミノ酸配列;
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項110に記載の組成物。 - 前記B型肝炎ウイルスキャプシドタンパク質の1又は複数のシステイン残基が、欠失されているか他のアミノ酸残基で置換されている、請求項112に記載の組成物。
- 配列番号:134のアミノ酸48及び107に相当するシステイン残基が、欠失されているか他のアミノ酸残基で置換されている、請求項113に記載の組成物。
- 前記B型肝炎ウイルスキャプシドタンパク質の1又は複数のリジン残基が、欠失されているか他のアミノ酸残基で置換されている、請求項112に記載の組成物。
- 前記コア粒子が細菌性線毛である、請求項100に記載の組成物。
- 前記細菌性線毛が大腸菌のタイプ-1線毛である、請求項100に記載の組成物。
- 前記タイプ-1線毛のピリンサブユニットが、配列番号:146に示すアミノ酸配列を含む、請求項117に記載の組成物。
- 前記コア粒子が、細菌性ピリンポリペプチドを含む、請求項100に記載の組成物。
- 前記細菌性ピリンポリペプチドが、配列番号:146に示すアミノ酸配列を含む、請求項119に記載の組成物。
- 前記ウイルス様粒子が、
(a)B型肝炎ウイルスの組換えタンパク質;
(b)麻疹ウイルスの組換えタンパク質;
(c)シンドビスウイルスの組換えタンパク質;
(d)ロタウイルスの組換えタンパク質;
(e)口蹄疫ウイルスの組換えタンパク質;
(f)レトロウイルスの組換えタンパク質;
(g)ノーウォークウイルスの組換えタンパク質;
(h)アルファウイルスの組換えタンパク質;
(i)ヒト乳頭腫ウイルスの組換えタンパク質;
(j)ポリオーマウイルスの組換えタンパク質;
(k)バクテリオファージの組換えタンパク質;及び
(l)RNA-ファージの組換えタンパク質;
(m)Qβ-ファージの組換えタンパク質;
(n)GA-ファージの組換えタンパク質;
(o)fr-ファージの組換えタンパク質;及び
(p)Tyの組換えタンパク質
からなる群から選択される組換えタンパク質又はその断片を含む、請求項105に記載の組成物。 - 前記ウイルス様粒子が、RNA-ファージの組換えタンパク質又はその断片を含むか、あるいはそれから実質的になる、請求項105に記載の組成物。
- 前記ウイルス様粒子が、
a)バクテリオファージQβ;
b)バクテリオファージR17;
c)バクテリオファージfr;
d)バクテリオファージGA;
e)バクテリオファージSP;
f)バクテリオファージMS2;
g)バクテリオファージM11;
h)バクテリオファージMX1;
i)バクテリオファージNL95;
k)バクテリオファージf2;及び
l)バクテリオファージPP7;
からなる群から選択されるRNA-ファージの組換えタンパク質又はその断片を含むか、あるいはそれから実質的になる、請求項105に記載の組成物。 - 前記ウイルス様粒子が、バクテリオファージQβ又はバクテリオファージfrの組換えタンパク質又はその断片を含むか、あるいはそれから実質的になる、請求項105に記載の組成物。
- 前記コア粒子が、
i)ウイルス様粒子;
ii)細菌性線毛;及び
iii)RNA-ファージのウイルス様粒子
からなる群から選択される、請求項100に記載の組成物。 - 前記第2の付着部位が、前記抗原又は抗原決定基内に天然に存在しない、請求項105、109、112、116、122、123又は124に記載の組成物。
- 前記組成物がアミノ酸リンカーを含む、請求項126に記載の組成物。
- 前記アミノ酸リンカーが、前記抗原又は前記抗原決定基に少なくとも1つの共有結合によって結合した、請求項127に記載の組成物。
- 前記共有結合がペプチド結合である、請求項128に記載の組成物。
- 前記アミノ酸リンカーが、前記第2の付着部位を含むか、あるいはそれからなる、請求項127に記載の組成物。
- 前記アミノ酸リンカーが、スルフヒドリル基又はシステイン残基を含む、請求項130に記載の組成物。
- 前記アミノ酸リンカーが、
(a)CGG
(b)N-末端ガンマ1-リンカー;
(c)N-末端ガンマ3-リンカー;
(d)Igヒンジ領域;
(e)N-末端グリシンリンカー;
(f)n=0−12かつk=0−5である場合の(G)kC(G)n;
(g)N-末端グリシン-セリンリンカー;
(h)n=0−3、k=0−5、m=0−10,l=0−2である場合の(G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n;
(i)GGC
(k)GGC-NH2
(l)C-末端ガンマ1-リンカー
(m)C-末端ガンマ3-リンカー;
(n)C-末端グリシンリンカー;
(o)n=0−12かつk=0−5である場合の(G)nC(G)k;
(p)C-末端グリシン-セリンリンカー;
(q)n=0−3、k=0−5、m=0−10,l=0−2及びo=0−8である場合
の(G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k
からなる群から選択される、請求項130に記載の組成物。 - 前記自己抗原が、
a)リンホトキシン;
b)リンホトキシンレセプター;
c)RANKL;
d)VEGF;
e)VEGF-R;
f)インターロイキン5;
g)インターロイキン17;
h)インターロイキン13;
i)CCL21;
k)CXCL12;
l)SDF-1;
m)MCP-1;
n)レジスチン;
o)GHRH;
p)LHRH;
q)TRH;
r)MIF;
s)エオタキシン;
t)BLC;
u)ヒトIgE
からなる群から選択されるタンパク質である、請求項100に記載の組成物。 - 前記自己抗原が、
a)リンホトキシン;
b)リンホトキシンレセプター;
c)RANKL;
d)VEGF;
e)VEGFR;
f)インターロイキン5;
g)インターロイキン17;
h)インターロイキン13;
i)アンギオテンシン;
k)CCL21;
l)CXCL12;
m)SDF-1;
n)MCP-1;
o)エンドグリン;
p)レジスチン;
q)GHRH;
r)LHRH;
s)TRH;
t)MIF;
u)エオタキシン;
v)ブラジキニン;
w)BLC;
x)腫瘍壊死因子α(TNFα);
y)アミロイドベータペプチド(Aβ1−42);及び
z)ヒトIgE
からなる群から選択されるタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項100に記載の組成物。 - (a)(i)(1)非天然起源のコア粒子;及び、
(2)天然起源のコア粒子
からなる群から選択されるコア粒子、及び、
(ii)少なくとも1つの第1の付着部位を有するオーガナイザー
を含んでなる非天然分子骨格であって、
前記オーガナイザーが前記コア粒子に少なくとも1つの共有結合により連結され、前記コア粒子がバクテリオファージの組換えタンパク質、又はその断片を含むウイルス様粒子である非天然分子骨格、
(b)少なくとも1つの第2の付着部位を持つ抗原又は抗原決定基であって、
前記第2の付着部位が、
(i)前記抗原又は抗原決定基に天然に存在しない付着部位、及び、
(ii)前記抗原又は抗原決定基に天然に存在する付着部位
からなる群から選択される抗原又は抗原決定基、
を含んでなる組成物において、
前記第2の付着部位が、少なくとも1つの非ペプチド結合を介して前記第1の付着部位に結合することができ、そして、
前記抗原又は抗原決定基及び前記骨格が前記結合を介して相互作用して、規則正しく繰り返される抗原アレイを形成する組成物。 - 前記結合が、少なくとも1つの共有結合による、請求項135に記載の組成物。
- 前記1つの共有結合が、非ペプチド結合である、請求項136に記載の組成物。
- 前記コア粒子が、
i)ウイルス;
ii)ウイルス様粒子;
iii)バクテリオファージ;
iv)細菌性線毛;
v)ウイルスキャプシド粒子;及び
vi)(i)、(ii)、(iii)、(iv)又は(v)の組換え体
からなる群から選択される、請求項135に記載の組成物。 - 前記コア粒子が、
i)ウイルス様粒子;
ii)細菌性線毛;及び
iii)RNA-ファージのウイルス様粒子
からなる群から選択される、請求項135に記載の組成物。 - 前記ウイルス様粒子が、
(a)B型肝炎ウイルスの組換えタンパク質;
(b)麻疹ウイルスの組換えタンパク質;
(c)シンドビスウイルスの組換えタンパク質;
(d)ロタウイルスの組換えタンパク質;
(e)口蹄疫ウイルスの組換えタンパク質;
(f)レトロウイルスの組換えタンパク質;
(g)ノーウォークウイルスの組換えタンパク質;
(h)アルファウイルスの組換えタンパク質;
(i)ヒト乳頭腫ウイルスの組換えタンパク質;
(j)ポリオーマウイルスの組換えタンパク質;
(k)バクテリオファージの組換えタンパク質;及び
(l)RNA-ファージの組換えタンパク質;
(m)Qβ-ファージの組換えタンパク質;
(n)GA-ファージの組換えタンパク質;
(o)fr-ファージの組換えタンパク質;及び
(p)Tyの組換えタンパク質
からなる群から選択される組換えタンパク質又はその断片を含む、請求項139に記載の組成物。 - 前記ウイルス様粒子が、RNA-ファージの組換えタンパク質又はその断片を含むか、あるいはそれから実質的になる、請求項139に記載の組成物。
- 前記ウイルス様粒子が、
a)バクテリオファージQβ;
b)バクテリオファージR17;
c)バクテリオファージfr;
d)バクテリオファージGA;
e)バクテリオファージSP;
f)バクテリオファージMS2;
g)バクテリオファージM11;
h)バクテリオファージMX1;
i)バクテリオファージNL95;
k)バクテリオファージf2;及び
l)バクテリオファージPP7;
からなる群から選択されるRNA-ファージの組換えタンパク質又はその断片を含むか、あるいはそれから実質的になる、請求項139に記載の組成物。 - 前記ウイルス様粒子が、バクテリオファージQβ又はバクテリオファージfrの組換えタンパク質又はその断片を含むか、あるいはそれから実質的になる、請求項139に記載の組成物。
- 前記第1及び/又は第2の付着部位が、
(k)抗原及びそれに対する抗体又は抗体断片;
(l)ビオチン及びアビジン;
(m)ストレプトアビジン及びビオチン;
(n)レセプター及びそのリガンド;
(o)リガンド結合性タンパク質及びそのリガンド
(p)相互作用するロイシンジッパーポリペプチド;
(q)アミノ基及びそれと反応性の化学基;
(r)カルボキシル基及びそれと反応性の化学基;
(s)スルフヒドリル基及びそれと反応性の化学基;又は
(t)これらの組み合わせ
を含む、請求項135に記載の組成物。 - 前記第1の付着部位がアミノ基であり、第2の付着部位がスルフヒドリル基である、請求項135に記載の組成物。
- 前記第1の付着部位がリジン残基であり、第2の付着部位がシステイン残基である、請求項135に記載の組成物。
- 前記第2の付着部位が、前記抗原又は抗原決定基内に天然に存在しない、請求項135に記載の組成物。
- 前記第1の付着部位がアミノ基であり、第2の付着部位がスルフヒドリル基である、請求項147に記載の組成物。
- 前記第1の付着部位がリジン残基であり、第2の付着部位がシステイン残基である、請求項147に記載の組成物。
- 前記第2の付着部位が、スルフヒドリル基又はシステイン残基である又はそれを含む、請求項147に記載の組成物。
- 前記組成物がアミノ酸リンカーを含む、請求項147に記載の組成物。
- 前記アミノ酸リンカーが、少なくとも1つの共有結合によって前記抗原又は抗原決定基に結合した、請求項150に記載の組成物。
- 前記アミノ酸リンカーが、前記第2の付着部位を含むか、あるいはそれからなる、請求項151に記載の組成物。
- 前記アミノ酸リンカーが、スルフヒドリル基又はシステイン残基を含む、請求項152に記載の組成物。
- 前記アミノ酸リンカーが、
(a)CGG
(b)N-末端ガンマ1-リンカー;
(c)N-末端ガンマ3-リンカー;
(d)Igヒンジ領域;
(e)N-末端グリシンリンカー;
(f)n=0−12かつk=0−5である場合の(G)kC(G)n;
(g)N-末端グリシン-セリンリンカー;
(h)n=0−3、k=0−5、m=0−10,l=0−2である場合の(G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n;
(i)GGC
(k)GGC-NH2
(l)C-末端ガンマ1-リンカー
(m)C-末端ガンマ3-リンカー;
(n)C-末端グリシンリンカー;
(o)n=0−12かつk=0−5である場合の(G)nC(G)k;
(p)C-末端グリシン-セリンリンカー;
(q)n=0−3、k=0−5、m=0−10,l=0−2及びo=0−8である場合
の(G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k
からなる群から選択される、請求項152に記載の組成物。 - 前記抗原が、
(a)癌細胞に対する免疫反応を誘発するのに適したタンパク質;
(b)感染性疾患に対する免疫反応を誘発するのに適したタンパク質;
(c)アレルゲンに対する免疫反応を誘発するのに適したタンパク質;及び、
(d)家畜又はペットにおける免疫反応を誘発するのに適したタンパク質;
からなる群から選択されるタンパク質又はそれらの断片である、請求項135に記載の組成物。 - 前記抗原が、
(a)HIVの組換えタンパク質;
(b)インフルエンザウイルスの組換えタンパク質;
(c)C型肝炎ウイルスの組換えタンパク質;
(d)トキソプラズマの組換えタンパク質;
(e)熱帯熱マラリア原虫の組換えタンパク質;
(f)三日熱マラリア原虫の組換えタンパク質;
(g)卵形マラリア原虫の組換えタンパク質;
(h)四日熱マラリア原虫の組換えタンパク質;
(i)乳癌細胞の組換えタンパク質;
(j)腎臓癌細胞の組換えタンパク質;
(k)前立腺癌細胞の組換えタンパク質;
(l)皮膚癌細胞の組換えタンパク質;
(m)脳癌細胞の組換えタンパク質;
(n)白血病細胞の組換えタンパク質;
(o)組換えプロフィリン;
(p)ハチ刺されアレルギーの組換えタンパク質;
(q)ナッツアレルギーの組換えタンパク質;
(r)食物アレルギーの組換えタンパク質;
(s)喘息の組換えタンパク質;又は
(t)クラミジア属の組換えタンパク質;
である、請求項155に記載の組成物。 - 前記抗原又は抗原決定基が、
a)ホスホリパーゼA2タンパク質;
b)ヒトIgE;
c)リンホトキシン;
d)インフルエンザM2タンパク質;及び
e)Der p Iペプチド
からなる群から選択されるペプチド、タンパク質、又はそれらの断片である、請求項135に記載の組成物。 - 前記抗原又は抗原決定基が、Der p Iペプチド又はその断片である、請求項157に記載の組成物。
- 前記第2の付着部位を持つ前記Der p Iペプチドが、
a)CGNQSLDLAEQELVDCASQHGCH;及び
b)CQIYPPNANKIREALAQTHSA
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項158に記載の組成物。 - 前記抗原又は抗原決定基が、ホスホリパーゼA2タンパク質又はその断片である、請求項157に記載の組成物。
- 前記ホスホリパーゼA2タンパク質が、
a)配列番号:168のアミノ酸配列;
b)配列番号:169のアミノ酸配列;
c)配列番号:170のアミノ酸配列;
d)配列番号:171のアミノ酸配列;
e)配列番号:172のアミノ酸配列;
f)配列番号:173のアミノ酸配列;
g)配列番号:174のアミノ酸配列;及び
h)配列番号:175のアミノ酸配列;
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項160に記載の組成物。 - 前記抗原又は抗原決定基が、ヒトIgE又はその断片である、請求項157に記載の組成物。
- 前記ヒトIgEが、配列番号:176のアミノ酸配列を有する、請求項162に記載の組成物。
- 前記抗原又は抗原決定基が、インフルエンザM2タンパク質又はその断片である、請求項1163に記載の組成物。
- バクテリオファージコートタンパク質、細菌性線毛、HbcAg及びそれらの断片からなる群から選択されるタンパク質に共有結合により付着したインフルエンザM2タンパク質又はその断片を含んでなる組成物。
- 前記タンパク質がバクテリオファージコートタンパク質又はその断片である、請求項165に記載の組成物。
- 前記タンパク質が細菌性線毛である、請求項165に記載の組成物。
- 前記タンパク質がHBcAgであり、前記共有結合がペプチド結合ではない、請求項165に記載の組成物。
- 前記タンパク質がバクテリオファージコートタンパク質又はその断片、あるいは細菌性線毛又はその断片であり、共有結合が非ペプチド結合である、請求項165に記載の組成物。
- 前記タンパク質がバクテリオファージコートタンパク質又はその断片、あるいは細菌性線毛又はその断片であり、共有結合がペプチド結合である、請求項165に記載の組成物。
- 前記バクテリオファージコートタンパク質が、
a)バクテリオファージQβ;
b)バクテリオファージR17;
c)バクテリオファージfr;
d)バクテリオファージGA;
e)バクテリオファージSP;
f)バクテリオファージMS2;
g)バクテリオファージM11;
h)バクテリオファージMX1;
i)バクテリオファージNL95;
k)バクテリオファージf2;及び
l)バクテリオファージPP7;
からなる群から選択されるバクテリオファージのコートタンパク質を含む、請求項165に記載の組成物。 - 前記バクテリオファージコートタンパク質が、バクテリオファージQβを含む、請求項171に記載の組成物。
- a)請求項1、87、100、135又は165に記載の組成物;及び
b)許容可能な製薬担体
を含んでなる製薬組成物。 - 請求項1、87、100、135又は165に記載の組成物であって、該組成物を患者に投与することを含む免疫化方法に使用される請求項1、87、100、135又は165に記載の組成物。
- 請求項1、87、100、135又は165に記載の組成物を含んでなるワクチン組成物。
- アジュバントを更に含む、請求項160に記載のワクチン組成物。
- 非自然発生の、規則正しく繰り返された抗原アレイの製造方法において、
(a)(i)(1)非天然起源のコア粒子;及び、
(2)天然起源のコア粒子
からなる群から選択されるコア粒子、及び、
(ii)少なくとも1つの第1の付着部位を有するオーガナイザー
を含んでなる非天然分子骨格であって、
前記オーガナイザーが前記コア粒子に少なくとも1つの共有結合により連結された非天然分子骨格を提供し、
(b)少なくとも1つの第2の付着部位を持つ抗原又は抗原決定基であって、
前記抗原又は抗原決定基が自己抗原又はその断片であり、前記第2の付着部位が、
(i)前記抗原又は抗原決定基に天然に存在しない付着部位、及び、
(ii)前記抗原又は抗原決定基に天然に存在する付着部位
からなる群から選択され、
前記第2の付着部位が、少なくとも1つの非ペプチド結合を介して前記第1の付着部位に結合することができる抗原又は抗原決定基を提供し、
(c)前記非天然分子骨格と前記抗原又は抗原決定基とを結合させることを含み、
前記抗原又は抗原決定基と前記骨格とが前記結合を介して相互作用して、規則正しく繰り返される抗原アレイを形成する方法。 - 前記オーガナイザーが、ポリペプチド又はその残基であり、前記第2の付着部位がポリペプチド又はその残基である、請求項177に記載の方法。
- 前記コア粒子がウイルス様粒子である、請求項177又は178に記載の方法。
- 前記コア粒子がウイルス様粒子、配列番号:158のアミノ酸1−147を含むポリペプチドの二量体又は多量体である、請求項179に記載の方法。
- 前記ウイルス様粒子が、配列番号:158のアミノ酸1−152を含むポリペプチドの二量体又は多量体である、請求項179に記載の方法。
- 前記ポリペプチドの1又は複数のシステイン残基が、欠失されているか他のアミノ酸残基で置換されている、請求項180に記載の方法。
- 配列番号:134のアミノ酸48及び107に相当するシステイン残基が、欠失されているか他のアミノ酸残基で置換されている、請求項181に記載の方法。
- 前記ポリペプチドの1又は複数のリジン残基が、欠失されているか他のアミノ酸残基で置換されている、請求項182に記載の方法。
- 前記結合が少なくとも1つの共有結合による、請求項177に記載の方法。
- 前記共有結合が非ペプチド結合である、請求項185に記載の方法。
- 非自然発生の、規則正しく繰り返された抗原アレイの製造方法において、
(a)(i)コア粒子、及び、
(ii)少なくとも1つの第1の付着部位を有するオーガナイザー
を含んでなる非天然分子骨格であって、
前記オーガナイザーが前記コア粒子に少なくとも1つの共有結合により連結され、前記コア粒子がバクテリオファージの組換えタンパク質又はその断片を含むウイルス様粒子である非天然分子骨格を提供し、
(b)少なくとも1つの第2の付着部位を持つ抗原又は抗原決定基であって、
前記第2の付着部位が、
(i)前記抗原又は抗原決定基に天然に存在しない付着部位、及び、
(ii)前記抗原又は抗原決定基に天然に存在する付着部位
からなる群から選択され、
前記第2の付着部位が、少なくとも1つの非ペプチド結合を介して前記第1の付着部位に結合することができる抗原又は抗原決定基を提供し、
(c)前記非天然分子骨格と前記抗原又は抗原決定基とを結合させることを含み、
前記抗原又は抗原決定基と前記骨格とが前記結合を介して相互作用して、規則正しく繰り返される抗原アレイを形成する方法。 - 前記結合が少なくとも1つの共有結合による、請求項187に記載の組成物。
- 前記共有結合が非ペプチド結合である、請求項188に記載の組成物。
- a)配列番号:255のアミノ酸配列;
b)配列番号:256のアミノ酸配列;
c)配列番号:257のアミノ酸配列;
d)配列番号:258のアミノ酸配列;及び
e)配列番号:259のアミノ酸配列;
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する変異体Qβコートタンパク質を含むキャプシドを形成することのできるコートタンパク質。 - 少なくとも1つの抗原又は抗原決定基が結合した、請求項190に記載のコートタンパク質。
- a)配列番号:255のアミノ酸配列;
b)配列番号:256のアミノ酸配列;
c)配列番号:257のアミノ酸配列;
d)配列番号:258のアミノ酸配列;
e)配列番号:259のアミノ酸配列;及び
f)a)−e)及び対応するA1タンパク質の何れかの混合物
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する変異体Qβコートタンパク質から実質的になるキャプシドを形成することのできるコートタンパク質。 - 少なくとも1つの抗原又は抗原決定基が結合した、請求項192に記載のコートタンパク質。
- 前記自己抗原が、リンホトキシンのタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
- 前記自己抗原が、リンホトキシンレセプターのタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
- 前記自己抗原が、RANKLのタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
- 前記自己抗原が、VEGFのタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
- 前記自己抗原が、VEGF-Rのタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
- 前記自己抗原が、インターロイキン5のタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
- 前記自己抗原が、インターロイキン17のタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
- 前記自己抗原が、インターロイキン13のタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
- 前記自己抗原が、アンギオテンシンのタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
- 前記自己抗原が、CCL21のタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
- 前記自己抗原が、CXCL12のタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
- 前記自己抗原が、SDF-1のタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
- 前記自己抗原が、MCP-1のタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
- 前記自己抗原が、エンドグリンのタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
- 前記自己抗原が、レジスチンのタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
- 前記自己抗原が、GHRHのタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
- 前記自己抗原が、LHRHのタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
- 前記自己抗原が、TRHのタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
- 前記自己抗原が、MIFのタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
- 前記自己抗原が、エオタキシンのタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
- 前記自己抗原が、ブラジキニンのタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
- 前記自己抗原が、BLCのタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
- 前記自己抗原が、腫瘍壊死因子α(TNFα)のタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
- 前記自己抗原が、アミロイドベータペプチド(Aβ1−42)のタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
- 前記自己抗原が、ヒトIgEのタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
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