JP2009132689A - 分子抗原アレイ - Google Patents

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Abstract

【課題】感染症の治療、アレルギー症の治療のためのワクチンの生産、癌の予防又は治療、及び特定の抗体応答における自己特異的免疫応答を効果的に誘導するファーマシンとして有用である、正しく規則正しく繰り返えされる抗原又は抗原決定基の提供。
【解決手段】分子生物学、ウイルス学、免疫学及び医学の分野における、正しく規則正しく繰り返えされた抗原又は抗原決定基アレイを含んでなる組成物の開発。および、正しく規則正しく繰り返えされたアレイでの抗原又は抗原決定基を製造する工程の開発。
【選択図】なし

Description

(発明の背景)
(発明の分野)
本発明は、分子生物学、ウイルス学、免疫学及び医学の分野に関連する。本発明は、規則正しく繰り返された抗原又は抗原決定アレイを含んでなる組成物を提供する。本発明は、また、規則正しく繰り返されたアレイにおける抗原又は抗原決定基を製造する工程を提供する。規則正しく繰り返された抗原又は抗原決定基は、感染症の治療、アレルギー症の治療のためのワクチンの製造にとって、そして癌を予防又は治療、及び自己特異的免疫応答、特に抗体応答を効率的に誘導するファーマシーンとして有用である。
(背景技術)
国際公開00/3227は、規則正しく繰り返された抗原又は抗原決定基アレイの製造に関する組成物及び工程を記載する。その組成物は、感染症の予防、アレルギー症の治療、そして癌の治療のためのワクチンの製造にとって有用である。その組成物は、ウイルス又はウイルス様粒子のようなコア粒子を含み、それの少なくとも1つの抗原又は1つの抗原決定基は、規則正しく繰り返された抗原アレイにつながる少なくとも1つの非ペプチド結合によって結合している。
ウイルス様粒子(VLPs)は、その構造的な特徴とその非感染的な性質の双方の理由のために、ワクチン製造の領域で開発されている。VLPsは、1又は複数の型の多くのタンパク質分子によって対称的な様式で構築された超分子構造である。それらは、ウイルスゲノムを欠いており、それ故に非感染的である。VLPsは、しばしば、異種発現によって大量に生産することが可能であり、容易に精製することができる。
VLPsの例には、B型肝炎ウイルス(Ulrich, ら., Virus Res. 50:141-182(1998))、麻疹ウイルス(Warnes,ら., Gene 160:173-178(1995))、シンドビスウイルス、ロタウイルス(米国特許第5,071,651号及び米国特許第5,374,426号)、口蹄疫ウイルス(Twomey, ら., Vaccine 13:1603-1610, (1995))、ノーウォークウイルス(Jiang, X., ら., Science 250:1580-1583(1990);Matsui, S.M., ら., J. Clin. Invest. 87:1456-1461(1991))のキャプシドタンパク質、レトロウイルスGAGタンパク質(国際公開96/30523)、レトロトランスポゾンTyタンパク質p1、B型肝炎ウイルスの表面タンパク質(国際公開92/11291)及びヒト乳頭種ウイルス(国際公開98/15631)が含まれる。
免疫寛容性のために、自己分子に対する免疫応答を誘導することは一般的に困難である。特に、自己分子に特異性を有するリンパ球は、典型的なワクチン接種の手法によって誘導した場合は、通常は低又は非応答性でさえある。
アミロイドBペプチド(Aβ1-42)は、アルツハイマー病の神経病理の中心的役割を担う。領域特異的な、Aβペプチドの細胞外蓄積は、ミクログリオーシス、細胞骨格変化、ジストロフィー神経炎及びシナプス損失をともなう。これら病理学的変化は、疾患を定義する認知の低下に関連していると考えられている。
アルツハイマー疾患のマウスモデルでは、Aβ1-42(PDAPP-マウス)を産するように操作したトランスジェニック動物は、その脳でプラーク及び神経損傷を発症する。最近の研究によって、Aβ1-42を用いた若いPDAPP-マウスの免疫化がプラーク形成及び併発するジストロフィー神経炎の阻害を引き起こしたことを示している(Schenk, D. ら., Nature 400:173-77(1999))。
さらに、AD様神経病理をすでに発症した老年のPDAPPマウスの免疫化によって、神経病理の広がりと進行が低下した。これら研究に関する免疫化プロトコールは以下の通りであった;ペプチドを水溶性緩衝液に溶解させ、完全フロイントアジュバント(一次投与のための)で1:1に混合して100μg/投与量のペプチド濃度とした。後の追加免疫では、不完全フロイントアジュバントを用いた。マウスは、11ヶ月の期間にわたって、11回の免疫化を受けた。1:10000より大きな抗体力価が達成されて維持された。従って、免疫化は、アルツハイマー病に対する効果的な予防的及び治療的作用であり得る。
その他の研究では、Aβ1-42に対して産生させた末梢投与抗体は、血液脳関門を通過してAβペプチドと結合し、そして現存するアミロイドのクリアランスを誘導することができた(Bard, F.ら., Nature Medicine 6:916-19(2000))。この研究では、Aβ1-42に対して産生させたポリクローナル抗体、又はAβの異なる領域に由来する合成断片に対して産生させたモノクローナル抗体のいずれかを用いた。従って、抗体の誘導は、アルツハイマー病の潜在的な治療処置として考慮することができる。
精製タンパク質のみの投与は、通常は、強力な免疫応答を誘導するのに十分ではないことは十分に立証されたことである;単離された抗原は、一般的に、アジュバントと呼ばれる補助物質とともに与えられるべきである。これらアジュバントを伴うことで、投与抗原は急激な分解に対して保護され、このアジュバントは伸張した抗原の低レベルの遊離を提供する。
示したように、アルツハイマー病(AD)における重要な事象の1つは、脳血管の壁の周りの細胞外神経炎プラーク及び沈着物となる、不溶性の繊維状の塊(アミロイド形成)であるアミロイドの沈着である(概略として、Selkoe, D.J. (1999) Nature 399, A23-31を参照せよ)。これらの沈着物は、グリコサミノグリカン及びアポリポ蛋白質等の他のタンパク質も含むが、神経炎プラーク及びコンゴ好染血管障害の主要な構成物はアミロイドβ(Aβ)である。Aβは、アミロイド前駆タンパク質(APPs)として知られているより大きな糖タンパク質からタンパク質分解されたものであり、一本の疎水性膜貫通領域を有する695-770アミノ酸のイソ型を含む。Aβは、修飾だけでなくかなりのアミノ及びカルボキシ末端不均一性(切断)を示す43アミノ酸長までのペプチドの群を形成する(Roher, A.E., Palmer, K. C., Chau, V., & Ball, M. J. (1988) J.Cell Biol. 107, 2703-2716. Roher, A. E., Palmer, K. C., Yurewicz, E. C., Ball, M. J., & Greenberg, B. D.(1993) J. Neurochem. 61, 1916-1926)。顕著なイソ型は、A・1-40及び1-42である。それは、繊維状に凝集するβ-シートを形成する高い傾向がある。最近の研究は、脳アミロイド沈着物のワクチン接種誘導による減少が認知の改善の結果となることを示した(Schenk, D., Barbour, R., Dunn, W., Gordon, G., Grajeda, H., Guido, T., Huang, J., Johnson-Wood, K., Khan, K.,ら. (1999) Nature 400, 173-177)。
我々は、驚くべきことに、高度の規則正しく繰り返されたアレイで表示された自己分子又は自己抗原が、自己特異的免疫応答、特に抗体応答を効率的に誘導することができることを見出した。さらには、そのような応答は、別の方法で抗原表示細胞及び他の免疫細胞を非特異的に活性化するアジュバントの非存在下でさえ誘導されること可能である。
(本発明の要約)
本発明は、高度に規則正しく繰り返された抗原又は抗原決定基を含む組成物、並びにそれらの生産及び用途に関する工程を提供する。従って、本発明の組成物は、感染症の予防、アレルギー症及び癌の治療にとって、そして自己免疫応答、特に抗体応答を効率的に誘導するのに有用である。
最初の側面では、本発明は、(A)非天然分子骨格、及び(B)抗原又は抗原決定基を含む、あるいはそれらから成る新規組成物を提供する。非天然分子骨格は、(i)(1)非天然起源のコア粒子、及び(2)天然起源のコア粒子から成る群から選択されるコア粒子;(ii)オーガナイザーが、少なくとも1つの共有結合によってコア粒子と連結している、少なくとも1つの最初の付着部位を含んでなるオーガナイザーを含むか、あるいはそれらから成る。抗原又は抗原決定基は、その自己抗原又は断片であり、(i)前記抗原又は抗原決定基によって天然には発生しない付着部位;及び(ii)前記抗原又は抗原決定基によって天然に発生する付着部位から成る群から選択される、少なくとも1つの第2の付着部位を有する。本発明は、少なくとも1つの非ペプチド結合による第2の付着部位の最初の付着部位への結合を介して、規則正しく繰り返された自己抗原アレイを提供する。従って、この自己抗原又は自己抗原決定基及び非天然分子骨格は、この最初及び第2の付着部位の結合を介してまとめられて、規則正しく繰り返された抗原アレイを形成する。
二番目の側面では、本発明は、(A)非天然分子骨格、及び(B)抗原又は抗原決定基を含む、あるいはそれらから成る新規組成物を提供する。非天然分子骨格は、コア粒子がバクテリオファージの組み換えタンパク質又はその断片を含むウイルス様粒子であり、オーガナイザーが、少なくとも1つの共有結合によってコア粒子と連結している(i)コア粒子及び(ii)少なくとも1つの最初の付着部位を含んでなるオーガナイザーを含むか、あるいはそれから成る。その抗原又は抗原決定基は、(i)前記抗原又は抗原決定基によって天然には発生しない付着部位;及び(ii)前記抗原又は抗原決定基によって天然に発生する付着部位から成る群から選択される、少なくとも1つの第2の付着部位を有する。本発明は、少なくとも1つの非ペプチド結合による第2の付着部位の最初の付着部位への結合を介して、規則正しく繰り返された自己抗原アレイを提供する。
3番目の側面では、本発明は、(A)非天然分子骨格、及び(B)抗原又は抗原決定基を含む、あるいはそれらから成る新規組成物を提供する。非天然分子骨格は、(i)(1)非天然起源のコア粒子、及び(2)天然起源のコア粒子から成る群から選択されるコア粒子;(ii)オーガナイザーが、少なくとも1つの共有結合によってコア粒子と連結している、少なくとも1つの最初の付着部位を含んでなるオーガナイザーを含むか、あるいはそれらから成る。抗原又は抗原決定基は、アミロイドβペプチド(Aβ1-42)又はその断片であり、(i)前記抗原又は抗原決定基によって天然に発生しない付着部位;及び(ii)前記抗原又は抗原決定基によって天然に発生する付着部位から成る群から選択される、少なくとも1つの第2の付着部位を有する。本発明は、少なくとも1つの非ペプチド結合による第2の付着部位の最初の付着部位への結合を介する規則正しく繰り返された抗原アレイを提供する。
4番目の側面では、本発明は、(A)非天然分子骨格、及び(B)抗原又は抗原決定基を含む、あるいはそれらから成る新規組成物を提供する。非天然分子骨格は、(i)(1)非天然起源のコア粒子、及び(2)天然起源のコア粒子から成る群から選択されるコア粒子;(ii)オーガナイザーが、少なくとも1つの共有結合によってコア粒子と連結している、少なくとも1つの最初の付着部位を含んでなるオーガナイザーを含むか、あるいはそれらから成る。この抗原又は抗原決定基は、抗イディオタイプ抗体又は抗イディオタイプ抗体断片であり、(i)前記抗原又は抗原決定基によって天然には発生しない付着部位;及び(ii)前記抗原又は抗原決定基によって天然に発生する付着部位から成る群から選択される、少なくとも1つの第2の付着部位を有する。本発明は、少なくとも1つの非ペプチド結合による第2の付着部位の第1の付着部位への結合を介する規則正しく繰り返された抗原アレイを提供する。
好ましい実施態様及び本発明の利点、並びにさらなる側面は、特に、詳細な説明、実施例及び添付請求項の観点からだけではなく、以下において明かである。
本発明の好ましい実施態様では、コア粒子は、好ましくは、a)バクテリオファージQβ;b)バクテリオファージR17;c)バクテリオファージfr;d)バクテリオファージGA;e)バクテリオファージSP;f)バクテリオファージMS2; g)バクテリオファージM11;h)バクテリオファージMX1;i)バクテリオファージNL95;k)バクテリオファージf2;及びバクテリオファージPP7から成る群から選択されるRNAファージの組み換えタンパク質を含むウイルス様粒子である。
本発明のその他の好ましい実施態様では、RNAファージの組み換えタンパク質は、野生型コートタンパク質を含む。
本発明のさらに好ましい実施態様では、RNAファージの組み換えタンパク質は、コートタンパク質を含む。
さらにその他の実施態様では、コア粒子は、1又は複数の肝炎コア(キャプシド)タンパク質(HBcAgs)を含むか、又はそれから成る。関連する実施態様では、これらHBcAgsの1又は複数のシステイン残基は、その他のアミノ酸残基(例えば、セリン残基)によって欠失又は置換のいずれかがなされている。特定の実施態様では、配列番号:134のアミノ酸残基48及び107に一致する本発明の組成物を調製するために利用したHBcAgのシステイン残基は、その他のアミノ酸残基(例えば、セリン残基)によって欠失又は置換のいずれかがなされている。
さらに、本発明の組成物を調製するために利用したHBcAg変異体は、一般的に、規則正しく繰り返された抗原又は抗原決定基アレイを表示する二量体又は多量体構造を形成するような他のHBAgsと結合する能力を保持する変異体である。
その他の実施態様では、非天然分子骨格は、ピリンタンパク質から製造又は細菌から収集したかのいずれかである線毛又は線毛様構造を含むか、あるいはそれから成る。線毛又は線毛様構造が本発明の組成物を調製するのに利用された場合、それらは、天然には細菌細胞の常在するが、遺伝子工学的(例えば、相同組み換え)によって改良された線毛遺伝子、又はそれら細胞へ導入された線毛遺伝子の産物から形成され得る。
関連する実施態様では、コア粒子は、線毛タンパク質から調製されるか、又は細菌から収集されるかのいずれかである線毛又は線毛様構造を含むか、あるいはそれから成る。これらコア粒子は、天然に細菌細胞に常在する線毛遺伝子の産物から形成され得る。
特定の実施態様では、オーガナイザーは、少なくとも1つの最初の付着部位を含む。最初と第2の付着部位は、本発明の組成物の特に重要な要素である。本発明の種々の実施態様では、最初及び/又は第2の付着部位は、抗原及び抗体又はその上に抗体断片であり得る;ビオチン及びアビジン;ストレプトアビジン及びビオチン;レセプター及びそのリガンド;リガンド結合タンパク質及びそのリガンド;ロイシンジッパーポリペプチドを相互作用させること;アミノ基及び化学基、その上に反応性の;カルボキシル基及び化学基、その上に反応性の;スルフヒドリル基及び化学基、その上に反応性の;又はその組み合わせ。
さらに好ましい実施態様では、組成物は、さらにアミノ酸リンカーを含む。好ましくは、そのアミノ酸リンカーは、第2の付着部位を含むか、あるいはそれから成る。その第2の付着部位は、抗原のコア粒子への方向付けられそして秩序だった結合及び結合をそれぞれ媒介する。このアミノ酸リンカーの重要な機能は、第2の付着部位の適切な表示及び接触性をさらに確かにし、それ故に、特に化学架橋によって抗原のコア粒子への結合を促進することである。このアミノ酸リンカーのその他の重要な特性は、最適な接触性、そして特に、第2の付着部位の反応性をさらに確かなものにすることである。このアミノ酸リンカーのこれら特性は、タンパク質抗原にとってさらにより重要である。
その他の好ましい実施態様では、アミノ酸リンカーは、(a)CGG;(b)N末端ガンマ1-リンカー;(c)N末端ガンマ3-リンカー;(d)Igヒンジ領域;(e)N末端グリシンリンカー;(f)n=0-12及びk=5である(G)C(G);N末端グリシン-セリンリンカー;(h)n=0-3、k=0-5、m=0-10、l=0-2である(G)C(G)(S)(GGGGS);GGC-NH2;(l)C末端ガンマ1-リンカー;(m)C末端ガンマ3-リンカー;(n)C末端グリシンリンカー;(o)n=0-12及びk=0-5である(G)C(G);(p)C末端グリシン-セリンリンカー;(q)n=0-3、k=0-5、m=0-10、l=0-2、及びo=0-8である(G)(S)(GGGGS)(G)C(G)から成る群から選択される。
グリシン及びグリシンセリンリンカーの重要な特性は、その柔軟性、特に、広範囲にわたるコンフォメーションを可能にし、第2の付着部位の接触性を除外する構造へフォールディングを嫌うその構造常の柔軟性にある。グリシン及びグリシンセリンリンカーは、側鎖残基を含まないか、又は限定された量の側鎖残基のいずれかを含むならば、それらは、抗原との広範な相互作用への関与については限定した傾向を有し、従って、さらに、第2の付着部位の接触性を保証する。グリシンセリンリンカー内のセリン残基は、これらリンカーへ向上した可溶性特性を付与する。従って、グリシン又はグリシンセリンアミノ酸リンカーでの、タンデム又は単離のいずれかにおける1又は2個のアミノ酸の並列又は分離のいずれかによる挿入、特に、極性又は荷電アミノ酸残基の挿入は、また、本発明の教示によって含まれている。
さらに好ましい実施態様では、アミノ酸リンカーは、GGC-NH2、GGC-NMe、GGC-N(Me)2、GGC-NHET又はGGC-N(Et)2のいずれかであり、GGCのシステイン残基のC末端はアミド化されている。これらアミノ酸リンカーは、特にペプチド抗原にとって好まれ、特に、前記第2の付着部位を有する抗原又は抗原決定基がAβペプチド又はその断片を含む、実施態様にとって好まれる。特に好まれるのは、GGC-NH2である。その他の実施態様では、アミノ酸リンカーは、免疫グロブリン(Ig)ヒンジ領域である。Igヒンジ領域の断片は、また、グリシン残基で修飾されたヒンジ領域と同様に、本発明の範囲内にある。好ましくは、Igヒンジ領域は、1つのシステイン残基のみを含む。Igヒンジ領域アミノ酸リンカーの単一システイン残基は、リンカー配列内の幾つかの位置に位置することが可能であり、当該分野に熟練した者は、この発明の教示のガイダンスによってそれらをどのように選択すればよいのかを知っているであろう。
1つの実施態様では、本発明は、ウイルス、細菌の線毛、バクテリオファージ、ウイルス様粒子又はウイルス性キャプシド粒子から形成された構造の表面への殆どどんな選択した抗原のカップリングを提供する。抗原を疑似結晶性「ウイルス様」構造へ結合させることによって、本発明は、高度に効率的な免疫応答、即ち表示された抗原に対するワクチン接種の生産のための宿主の強力な抗ウイルス免疫応答を利用する。
さらにその他の実施態様では、(1)癌細胞に対する免疫応答を誘導するように適したタンパク質;(2)感染症に対する免疫応答を誘導するように適したタンパク質;(3)アレルゲンに対して免疫応答を誘導するように適したタンパク質;(4)自己抗原に対する向上した応答を誘導するのに適したタンパク質;及び(5)家畜又はペットでの免疫応答を誘導するのに適したタンパク質から成る群から選択され得る。その他の実施態様では、最初の付着部位及び/又は第2の付着部位は:(1)遺伝子工学したリジン残基、及び(2)遺伝子工学したシステイン残基、化学的に結合することが可能な2個の残基、を含む群から選択される。
よりさらなる実施態様では、最初の付着部位は、アミノ基を含むか又はそれであり、前記第2の付着部位は、スルフヒドリル基を含むか又はそれである。好ましくは、最初の付着部位は、リジン残基を含むか又はそれであり、前記第2の付着部位は、システイン残基を含むか又はそれである。
本発明は、また、オーガナイザー粒子が単一の第1の付着部位のみを有し、抗原又は抗原決定基が単一の第2の付着部位を有する実施態様を含む。従って、そのような実施態様を利用して規則正しく繰り返された抗原アレイが調製される場合、各オーガナイザーは、単一の抗原又は抗原決定基と結合する。
さらなる側面では、本発明は、(a)コア粒子が、ウイルス様粒子、細菌線毛、線毛様構造、又は修飾HBCAg、又はその断片を含み、オーガナイザーが、少なくとも1つの共有結合によってコア粒子と連結している(i)非天然起源及び天然起源のコア粒子から成る群から選択されるコア粒子、及び(ii)少なくとも1つの付着部位を含むオーガナイザーを含む非天然分子骨格、並びに(b)第2の付着部位が、最初の付着部位との少なくとも1つのペプチド結合を介しての結合が可能であり、抗原又は抗原決定基と骨格が、結合を介して相互作用して規則正しく繰り返された抗原アレイを形成する、(i)抗原又は抗原決定基によって天然に発生しない付着部位、及び(ii)抗原又は抗原決定基によって天然に発生する付着部位から成る群から第2の付着部位が選択される、少なくとも1つの第2の付着部位を有する抗原又は抗原決定基を含むか、あるいはそれから成る組成物を提供する。
本発明の他の実施態様は、本発明の組成物の生産に関する工程、及びここに記載のワクチン組成物を利用した療法の方法を含む。
前記の一般的な説明と以下の詳細な説明の双方が、単に例示的で説明的であり、主張された本発明のさらなる説明を提供するように意図されていることは、理解されるべきである。
よりさらなる側面では、本発明は、ホスホリパーゼAタンパク質、又はその断片との共有結合によって付着したバクテリオファージQβコートタンパク質を含んでなる組成物を提供する。好ましい実施態様では、ホスホリパーゼAタンパク質、又はその断片、及びバクテリオファージQβコートタンパク質は、共有結合を介して相互作用し、配列されて反復性抗原アレイを形成する。その他の好ましい実施例では、この共有結合は、ペプチド結合ではない。その他の好ましい実施態様では、ホスホリパーゼAタンパク質は、配列番号:168のアミノ酸配列、配列番号:169のアミノ酸配列、配列番号:170のアミノ酸配列、配列番号:171のアミノ酸配列、配列番号:172、配列番号:173のアミノ酸配列、配列番号:174のアミノ酸配列、及び配列番号:175のアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸を含む。
本発明は、また、バクテリオファージQβコートタンパク質とホスホリパーゼAタンパク質が相互作用して抗原アレイを形成する、バクテリオファージQβコートタンパク質及びホスホリパーゼAタンパク質を混合させることを含む組成物の製造の方法を提供する。
その他の側面では、本発明は、また、バクテリオファージQβコートタンパク質を含む非天然分子骨格を含む組成物、及びオーガナイザーが少なくとも1つの共有結合によってバクテリオファージQβコートタンパク質と連結している、少なくとも1つの付着部位を含むオーガナイザー;及びホスホリパーゼAタンパク質、又はその断片、又は少なくとも1つの第2の付着部位を有するその変異体、ホスホリパーゼAタンパク質によって天然に発生しない付着部位から成る群から選択された第2の付着部位、又はその断片;及び第2の付着部位が少なくとも1つの非ペプチド結合を介して最初の付着部位へ結合し、その抗原又は抗原決定基及び骨格が結合を介して相互作用して規則正しく繰り返された抗原アレイを形成する、ホスホリパーゼAタンパク質によって天然に発生する付着部位、又はその断片を提供する。好ましい実施態様では、ホスホリパーゼAタンパク質は、配列番号:168のアミノ酸配列、配列番号:169のアミノ酸配列、配列番号:170のアミノ酸配列、配列番号:171のアミノ酸配列、配列番号:172のアミノ酸配列、配列番号:173のアミノ酸配列、配列番号:174のアミノ酸配列、配列番号:175のアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸を含む。
本発明は、バクテリオファージQβコートタンパク質とホスホリパーゼAタンパク質が相互作用して抗原アレイを形成する、バクテリオファージQβコートタンパク質とホスホリパーゼAタンパク質を組み合わせることを含む組成物の作製方法をも提供する。好ましくは、この抗原アレイは配列された及び/又は反復性である。
本発明は、ホスホリパーゼAタンパク質、及び薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物をも提供する。本発明は、ホスホリパーゼAタンパク質を含むワクチン組成物をも提供する。好ましい実施態様では、請求項31のワクチン組成物は、少なくとも1つのアジュバントをさらに含む。
本発明は、ハチ毒に対するアレルギーを治療する方法をも提供し、それは、薬学的組成物又は被検者に対するワクチン組成物を投与することを含む。そのような投与の結果、被検者は、低下した毒に対する免疫応答を示す。
本発明は、抗リンホトキシンβ、抗リンホトキシンα、抗リンホトキシンα又は抗リンホトキシンβレセプターの誘導によるプリオン媒介疾患の予防のためのワクチンにも関連する。このワクチンは、リンホトキシンβ又はその断片、リンホトキシンα又はその断片、又はリンホトキシンβレセプター又断片とカップリングしている免疫化されたヒト又は動物にとって外来性であるタンパク質を含む。このワクチンは、内因性のリンホトキシンβ、リンホトキシンα、又はリンホトキシンβレセプターに対して特異的な抗体を誘導するために、ヒト又は動物へ注射される。これらの誘導された抗リンホトキシンβ、リンホトキシンα又は抗リンホトキシンβレセプター抗体は、リンパ器官に存在する濾胞性樹状細胞のプールを減じるか又は除去する。リンパ器官でのプリオン複製及び中枢神経系への輸送が濾胞性樹状細胞の非存在によって損傷するので、この治療はプリオン媒介疾患の進行を阻害する。さらに、リンホトキシンβの阻止は、I型糖尿病のような自己免疫疾患の患者にとって有益である。
(発明の詳細な説明)
1.定義
アルファウイルス:ここで用いられているように、「アルファウイルス」という用語を、アルファウイルス属に含まれる任意のRNAウイルスと呼ぶ。この属のメンバーの記載は、Strauss and Strauss, Microbiol. Rev., 58: 491-562 (1994)にある。アルファウイルスの例には、アウラウイルス、ベバルウイルス、カバッソウウイルス、チクングニヤウイルス、東部部馬脳髄膜炎ウイルス、フォート・モルガンウイルス、ゲタウイルス、クズイルガチャウイルス、マヨアロウイルス、ミドルバーグウイルス、ムカンボウイルス、ヌドゥムウイルス、ピクスナウイルス、トネテウイルス、トリニティウイルス、ウナウイルス、西部部馬脳髄膜炎ウイルス、ワタロアウイルス、シンドビスウイルス(SIN)、セムリキ森林熱ウイルス(SFV)、ベネズエラ馬脳脊髄炎(VEE)、及びロス・リバーウイルスが含まれる。
抗原:ここで用いられているように、「抗原」という用語は、抗体による結合が可能な分子である。抗原は、さらに、B及び/又はTリンパ球の産生につながる体液性免疫反応及び/又は細胞性免疫反応を誘導することが可能である。抗原は、1又は複数のエピトープ(B又はTエピトープ)を有することが可能である。上記を指す特異的な反応は、抗体が、高度に選択的な様式で、対応する抗体と反応し、他の抗原によって惹起され得る他の多くの抗体とは反応しないことを意味する。
抗原決定基:ここで用いられているように、「抗原決定基」という用語は、B又はTリンパ球のいずれかによって特異的に認識される抗原の一部分を指す。Bリンパ球は抗体産生を介して外来の抗原決定基と反応し、それに対して、Tリンパ球は細胞性免疫のメディエーターである。従って、抗原決定基又はエピトープは、抗体、又はMHCと照らして、T細胞レセプターによって認識される抗原のそれらの部分である。
結合:ここで用いられているように、第1及び第2の付着部位へ適用されているような「結合」という用語は、少なくとも1つの非ペプチド結合を指す。結合の性質は、共有、イオン、疎水、極性又は任意のその組み合わせであってもよい。
第1の付着部位:ここで用いられているように、「第1の付着部位」という文句は、抗原又は抗原決定基上に位置する第2の付着部位が結合している、非ランダム様式でコア粒子と結合している「オーガナイザー」のエレメントを指す。第1の付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、天然又は合成ポリマー、二次代謝物又は化合物(ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフッ化物)又はその組み合わせ、又はその化学的反応基であり得る。複数の最初の付着部位は、反復的な構造で、非天然分子骨格の表面に存在する。
第2の付着部位:ここで用いられているように、「第2の付着部位」という文句は、非天然分子骨格の表面に位置する「オーガナイザー」の第1の付着部位が結合する抗原又は抗原決定基と結合しているエレメントを指す。抗原又は抗原決定基の第2の付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、天然又は合成ポリマー、二次代謝物又は化合物(ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフッ化物)又はその組み合わせ、又はその化学的反応基であり得る。少なくとも、1つの第2の付着部位は、抗原又は抗原決定基上に存在する。従って、「少なくとも1つの第2の付着部位を有する抗原又は抗原決定基」とは、少なくとも抗原又は抗原決定基及び第2の付着部位を含む抗原又は抗原構成物を指す。しかしながら、特に、抗原又は抗原決定基内で天然に発生しない第2の付着部位では、これら抗原又は抗原構成物は、「アミノ酸リンカー」を含む。それらアミノ酸リンカー、又は、この明細書内でも単に「リンカー」と呼ばれているものは、抗原又は抗原決定基を第2の付着部位と結合させるか、又はより好ましくは、既に、第2の付着部位、必須ではないが一般的には、1つのアミノ酸残基として、好ましくはシステイン残基を含む又は含有するかのいずれかである。しかしながら、アミノ酸残基で構成されるアミノ酸リンカーが本発明の好ましい実施態様であっても、ここで用いられている用語「アミノ酸リンカー」は、そのようなアミノ酸リンカーがアミノ酸残基のみで構成されることを意味しない。アミノ酸リンカーのアミノ酸残基は、好ましくは、当該分野で知られている天然に発生するアミノ酸又は非天然アミノ酸で構成され、すべてL又はすべてD又はその混合物である。しかしながら、スルフヒドリル基又はシステイン基を有する分子を含むアミノ酸リンカーは、本発明にも含まれる。そのような分子は、好ましくは、C1-C6アルキル、シクロアルキル(C5、C6)、アリール又はヘテロアリール部分を含む。抗原又は抗原決定基又は代替的に第2の付着部位とアミノ酸リンカーの間の結合は、好ましくは、少なくとも1つの共有結合によって、より好ましくは少なくとも1つのペプチド結合による。
ここで用いられているように、用語「結合」は、例えば化学的なカップリング、又は非共有的、例えばイオン性相互作用、疎水性相互作用、水素結合等による共有結合的であり得る結合又は付着を指す。共有結合は、例えば、エステル、エーテル、ホスホエステル、アミド、ペプチド、イミド、炭素-硫黄結合、炭素-リン結合等であってよい。用語「結合」は、「カップリング」、「融合」及び「付着」などの用語よりも幅広く、そしてそれらを含む。
コア粒子:ここで用いられているように、用語「コア粒子」は、「オーガナイザー」の付着にとっての基礎を提供する固有の反復性組織を有する堅い構造を指す。ここで用いられているようなコア粒子は、合成工程の産物、又は生物学的工程の産物である。
コアタンパク質:ここで用いられているように、用語「コートタンパク質」は、バクテリオファージ又はRNAファージのキャプシドアセンブリに取り込まれることが可能なバクテリオファージ又はRNAファージのタンパク質を指す。しかしながら、RNAファージのコートタンパク質遺伝子の特定遺伝子産物を指す場合には、用語「CP」が用いられる。バクテリオファージQbの「コートタンパク質」がA1タンパク質だけでなく「Qβ CP」を含む一方で、例えば、RNAファージQβのコートタンパク質遺伝子の特定遺伝子産物は「Qβ CP」と呼ばれる。
シス活性化:ここで用いられているように、成句「シス活性化」配列は、レプリカーゼが結合してRNA分子のRNA依存複製を触媒する核酸配列を指す。これら複製は、完全長及び部分的RNA分子の複製を引き起こす結果となり、従って、アルファウイルスサブゲノムプロモーターも「シス活性化」配列である。シス活性化配列は、内部だけでなく、核酸分子の5'末端、3' 末端、又は双方の末端の近くに位置し得る。
融合:ここで用いられているように、用語「融合」とは、コード化ヌクレオチド配列のインフレーム・コンビネーションによる、1つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列の異なる起源の組み合わせを指す。用語「融合」は、内部融合、すなわち、ポリペプチド鎖末端の1つへの融合に加えて、ポリペプチド鎖内の異なる起源の配列の挿入をはっきりと含む。
非相同的な配列:ここで用いられるように、用語「非相同的な配列」は、本発明のベクターに存在する二番目のヌクレオチド配列を指す。用語「非相同的な配列」とは、また、本発明のベクターに含まれる非相同的なDNA配列によってコードされる任意のアミノ酸又はRNA配列を指す。非相同的なヌクレオチド配列は、通常は細胞型で発現されるタンパク質又はRNAをコードすることができ、それらは、その中に存在するか、又は通常はその中で発現されない(例えば、シンドビス構造タンパク質)。
単離された:ここで用いられているように、用語「単離された」が分子に関して用いられる場合、この用語は、分子が天然の環境から取り除かれたことを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在するポリヌクレオオチド又はポリペプチドは「単離された」のではなく、その天然の状態の共存する物質から単離された同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは「単離された」のである。さらには、ベクターに含まれる組み換えDNA分子は、本発明の目的のために単離されたと考えられる。単離されたRNA分子には、DNA及びRNA分子のインビボ又はインビトロRNA複製産物が含まれる。単離された核酸分子は、さらに、合成的に産生された分子を含む。さらには、組み換え宿主細胞に含まれるベクター分子も単離されている。従って、すべての「単離された」分子が「精製される」必要があるのではない。
免疫療法:ここで用いられているように、用語「免疫療法」は、疾患又は疾病の治療のための組成物である。より具体的には、その用語は、アレルギーの治療方法、又は癌の治療方法を指すために用いられる。
個体:ここで用いられているように、用語「個体」は、多細胞生物を指し、そして植物及び動物の双方を含む。好ましい多細胞生物は、動物、より好ましくは脊椎動物、さらにより好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトである。
低又は検出不可能:ここで用いられているように、遺伝子発現レベルを指すのに用いられる成句「低又は検出不可能」とは、遺伝子が最大に誘導され(例えば、少なくとも5倍低い)るか、又は、以下の実施例の章で用いられている方法によって容易に検出可能ではない場合のいずれかに見られるよりも顕著に低い発現のレベルを指す。
レクチン:ここで用いられているように、特にマメ科植物の種子から得られるが、同じく多くの他の植物及び動物起源からも得られる、特定の単又は多糖類のための結合部位を有する。例としては、糖タンパク質の研究での分析的及び調製剤として広く用いられるコンカナバリンA及び小麦胚アグルチニンを含む。
ここで用いられているように、用語「ミモトープ」は、抗原又は抗原決定基に対する免疫応答を誘導する物質である。一般的には、用語ミモトープは、特定の抗原に関して用いられる。例えば、ホスホリパーゼA(PLA)に対する抗体の産生を誘発するペプチドは、抗体が結合する抗原決定基のミモトープである。ミモトープは、免疫応答を誘導する抗原又は抗原決定基と相当な構造類似性を有し、構造特性を共有する可能性あるか又は無い。特定の抗原又は抗原決定基に対する免疫応答を誘導するミモトープを生成して同定する方法は、当該分野で知られており、ここの他の箇所に記載されている。
天然起源:ここで用いられるように、用語「天然起源」とは、その全体又は部分が合成ではなく、そして天然に存在又は産せられるという意味である。
非天然:ここで用いられているように、この用語は、通常は天然からを意味するのではなく、より具体的には、この用語は、ヒトの手によることを意味する。
非天然起源:ここで用いられているように、用語「非天然起源」は、通常は、合成又は天然からではないことを意味する;より具体的には、この用語は、ヒトの手によることを意味する。
非天然分子骨格:ここで用いられているように、成句「非天然分子骨格」は、第1の付着部位の強固で反復性のアレイを提供することを担い得るヒトの手によって作成される任意の産物を指す。理想的であって必須ではないが、これら第1の付着部位は、幾何学的な秩序である。非天然分子骨格は、有機又は非有機であり得て、そして、部分又は全体が化学的又は生物学的工程を介して合成され得る。この非天然分子骨格は:(a)天然又は非天然起源のいずれかのコア粒子;及び(b)少なくとも1つの第1の付着部位を含み、少なくとも1つの共有結合によってコア粒子と結合しているオーガナイザーによって構成される。特定の実施態様では、非天然分子骨格は、ウイルス、ウイルス様粒子、細菌線毛、ウイルスキャプシド粒子、ファージ、その組み換え体、又は合成粒子であってもよい。
規則正しく繰り返された抗原又は抗原決定基:ここで用いられているように、用語「規則正しく繰り返された抗原又は抗原決定基」は、通常は、非天然分子骨格に関する抗原又は抗原決定基の均一な空間的配置によって特徴付けられる、抗原又は抗原決定基の繰り返しパターンを指す。本発明の一実施態様では、繰り返しパターンは、幾何学的パターンであってもよい。適当な規則正しく繰り返された抗原又は抗原決定基アレイの例は、5から15ナノメーターの間隔を有する抗原又は抗原決定基の厳密な繰り返し準結晶整列を有する物である。
オーガナイザー:ここで用いられているように、用語「オーガナイザー」は、規則正しく繰り返されたアレイを作成するための核形成部位を提供するコア粒子と非ランダム様式で結合しているエレメントを指すのに用いる。オーガナイザーは、少なくとも1つの共有結合によってコア粒子と結合している、少なくとも1つの付着部位を含む任意のエレメントである。オーガナイザーは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸(即ち、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの残基)、糖、ポリヌクレオチド、天然又は合成ポリマー、二次代謝産物又は化合物(ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフッ化物)又はその化合物、又はその化学的反応基であってもよい。従って、このオーガナイザーは、さらに、本発明に基づき、規則正しく繰り返された抗原アレイの形成を確かなものにする。本発明の典型的な実施態様では、コア粒子は、コア粒子及び少なくとも1つの共有結合によってコア粒子と結合しているオーガナイザーを含む非天然分子骨格を作成するために、例えば、遺伝子操作又は化学反応によって改良される。しかしながら、本発明のある実施例では、このオーガナイザーは、コア粒子の一部として選択される。従って、これら実施態様にとっては、コア粒子の改良は、コア粒子及びオーガナイザーを含む非天然分子骨格を作成するために、そして、規則正しく繰り返された抗原アレイの形成を確かめるために必ずしも必要ではない。
許容温度:ここで用いられているように、成句「許容温度」は、酵素が比較的に高いレベルの触媒活性を有する温度を指す。
線毛:ここで用いられているように、用語「線毛(pili)」(単数では「pilus」)は、配列された繰り返しパターンへ組織されたタンパク質単量体(例えば、ピリン単量体)で構成される細菌細胞の細胞外構造を指す。さらには、線毛は、細菌細胞の宿主細胞表面レセプターへの付着、細胞間遺伝的交換、及び細胞-細胞認識等のプロセスに関わっている。線毛の例には、1型、線毛、P-線毛、F1C線毛、S-線毛及び987P-線毛が含まれる。線毛のさらなる例は、以下に示されている。
線毛様構造:ここで用いられているように、成句「線毛様構造」は、線毛の構造に類似する構造を有するタンパク質単量体で構成される構造を指す。「線毛様構造」の一例は、天然の線毛と基本的に同一である規則正しく繰り返されたアレイを形成しない修飾線毛タンパク質を発現する細菌細胞によって形成される構造である。
ポリペプチド:ここで用いられているように、用語「ポリペプチド」は、通常は、ペプチド結合を介して結合している天然アミノ酸残基である、アミノ酸残基で構成されているポリマーを指す。ポリペプチドは大きさで必ずしも限定され得ないが、用語ポリペプチドは、殆どは、約10から約50アミノ酸の大きさのペプチドと関連させて用いられる。
タンパク質:ここで用いられるように、用語タンパク質は、通常は、20より大きい、さらに特異的には50アミノ酸残基より大きいポリペプチドを指す。タンパク質は、大抵は明確な三次元構造を有しないが、むしろ多くの異なるコンフォメーションをとることができ、そしてアンフォールドと呼ばれるペプチド及びポリペプチドに対抗して、必ずしも呼ばれる必要はないが大抵はフォールドと呼ばれ、通常は、明確な三次元構造を有する。タンパク質のこの明確な三次元構造は、第2の付着部位によって媒介され、特に、化学架橋を用いた第1と第2の付着部位の間の化学架橋を介したコア粒子と抗原の間の結合のとって特に重要である。このアミノ酸リンカーは、また、本発明のある側面におけるタンパク質の構造的特性に密接に関連している。
精製:ここで用いられているように、用語「精製」が分子に関連して用いられる場合、それは、精製された分子の濃度は、その天然の環境と関連している分子と比例して増加していたことを意味する。天然に関連している分子には、タンパク質、核酸、脂質及び糖を含むが、一般的に、完全性を維持するか、又は精製された分子の精製を促進するために添加した水、緩衝液、試薬を含まない。例えば、オリゴdTカラムクロマトグラフィーの間に、mRNAが水溶性溶媒で希釈され、天然(関連)核酸及び他の生物学的分子がカラムに結合せず、主題のmRNA分子から分離されるならば、mRNA分子は、このクロマトグラフィーによって精製される。
レセプター:ここで用いられているように、用語「レセプター」は、リガンドと呼ばれるその他の分子と相互作用が可能なタンパク質又は糖タンパク質又はその断片を指す。このリガンドは、生化学的又は化学的化合物の任意のクラスに属する。このレセプターは、必ずしも膜結合タンパク質である必要はない。可溶化タンパク質、例えば、マルトース結合タンパク質又はレチノール結合タンパク質は、レセプターでもある。
残基:ここで用いられているように、用語「残基」は、ポリペプチドバックボーン又は側鎖の特定のアミノ酸を意味することを意図している。
組み換え宿主細胞:ここで用いられているように、用語「組み換え宿主細胞」は、本発明の1又は複数の核酸分子が導入された宿主細胞を指す。
組み換えウイルス:ここで用いられているように、成句「組み換えウイルス」は、ヒトの手によって遺伝的に改良されるウイルスを指す。この成句は、当該分野で知られている任意のウイルスを包含する。より具体的には、この成句は、ヒトの手によって遺伝的に改良されたアルファウイルス、そして最も具体的には、この成句は、ヒトの手よって遺伝的に改良されたシンドビスウイルスを指す。
制限的温度:ここで用いられているように、成句「制限的温度」は、酵素が低い又は検出不可能なレベルの触媒活性有する温度を指す。「熱」及び「冷」感受性変異体の双方が知られており、従って、制限温度は、許容温度よりもより高いか又はより低い。
RNA依存性RNA複製事象:ここで用いられているように、成句「RNA依存性RNA複製事象」は、RNA分子をテンプレートとして利用するRNA分子の形成を結果として生じるプロセスを指す。
RNA依存性RNAポリメラーゼ:ここで用いられているように、成句「RNA依存性RNAポリメラーゼ」は、その他のRNA分子からのRNA分子の産生を触媒するポリメラーゼを指す。
RNAファージ:ここで用いられているように、用語「RNAファージ」は、細菌に感染するRNAウイルス、好ましくは、細菌に感染する一本鎖ポジティブセンスRNAを指す。
自己抗原:ここで用いられている、用語「自己抗原」は、宿主DNAによってコードされているタンパク質を指し、タンパク質又は宿主DNAによってコードされているRNAにより生成された産物は、自己と定義される。さらには、2個又は幾つかの自己分子の組み合わせから生じ、又は自己分子の画分を示すタンパク質、そして、上に定義した高いホモロジーの2個の自己分子を有するタンパク質(>95%)も自己と考慮される。
温度感受性:ここで用いられているように、成句「温度感受性」は、1つの温度での反応で容易に触媒するが、その他の温度で同じ反応をゆっくりと触媒するか又は全く触媒しない酵素を指す。温度感受性酵素の例としては、pCYTtsベクターによってコードされるレプリカーゼタンパク質があり、それは、34℃より低い温度で容易に検出可能なレプリカーゼ活性を有し、37℃で低いか又は検出不可能な活性を有する。
転写:ここで用いられているように、用語「転写」は、RNAポリメラーゼによって触媒されるDNAテンプレートからのRNA分子の産生を指す。
非翻訳RNA:ここで用いられているように、成句「非翻訳RNA」は、オープンリーディングフレームをコードしないか、又はオープンリーディングフレーム、又はその一部をコードするが、アミノ酸配列が産せられないであろうフォーマットを指す(例えば、開始コドンは存在しない)。そのような分子の例は、tRNA分子、rRNA分子、そしてリボザイムである。
ベクター:ここで用いられている、用語「ベクター」は、遺伝的物質を宿主細胞へ伝達するのに利用される因子(例えば、プラスミド又はウイルス)を指す。ベクターは、DNA又はRNAのいずれかで構成されてもよい。
ここで用いられているように、用語「ウイルス様粒子」は、ウイルス粒子に似ている構造を指す。さらには、ウイルスゲノムのすべて又は一部分、特に、ウイルスゲノムの複製可能で感染性の成分を欠くために、本発明のよるウイルス様粒子は、非複製的であり、非感染性である。本発明によるウイルス様粒子は、ゲノムとは異なる核酸を含んでもよい。
バクテリオファージのウイルス様粒子:ここで用いられているように、用語「バクテリオファージのウイルス様粒子」は、非複製的で非感染性で、及び少なくともバクテリオファージの複製機構をコードする遺伝子又は遺伝子群を欠き、及び典型的には、宿主へのウイルス付着又は宿主への侵入を担うタンパク質又はタンパク質群をコードする遺伝子又は遺伝子群をも欠くバクテリオファージの構造に類似するウイルス様粒子を指す。しかしながら、この定義は、前出の遺伝子又は遺伝子群がまだ存在するが不活性であり、それ故に、バクテリオファージの非複製的及び非感染性ウイルス様粒子へもつながる、バクテリオファージのウイルス様粒子をも含む。
ウイルス粒子:ここで用いられている、用語「ウイルス粒子」は、ウイルスの形態学的形態を指す。幾つかのウイルス型では、それは、タンパク質キャプシドによって囲まれるゲノムを含み;他は、付加的な構造を有する(例えば、外皮、尾、等)。
1つ、a又はan:用語「1つ」、「a」、又は「an」が、この開示で用いられる場合、それらは、他に示されないならば、「少なくとも1つ」又は「1又はより多くの」を意味する。
2.規則正しく繰り返された抗原又は抗原決定基の組成物、及びそれを作製する方法
開示された発明は、規則正しく繰り返された抗原又は抗原決定基アレイを含む組成物を提供する。さらには、本発明は、実施者が、感染症の予防、アレルギーの治療及び癌の治療を含む種々の治療目的のために、規則正しく繰り返された抗原又は抗原決定基アレイを構築することを都合良く可能にする。
本発明の組成物は、2個の要素:(1)非天然分子骨格;及び(2)少なくとも第1の付着部位への非ペプチド結合を介する結合が可能な、少なくとも1つの第2の付着部位を有する抗原又は抗原決定基、を基本的に含むか、又は代替的にそれらで構成される。
本発明の組成物は、抗原又は抗原決定基が直接に結合している細菌線毛タンパク質をも含むか、又は代替的にそれで構成される。
非天然分子骨格は、(a)(1)非天然起源のコア粒子、及び(2)天然起源のコア粒子で構成される群から選択されるコア粒子、及び;(b)オーガナイザーが、少なくとも1つの共有結合によって前記コア粒子と結合している、少なくとも1つの第1の付着部位を含むオーガナイザーを含むか、又は代替的にそれらで構成される。
本発明の組成物は、抗原又は抗原決定基が直接に結合しているコア粒子をも含むか、又は代替的にそれで構成される。
抗原又は抗原決定基は、(a)前記抗原又は抗原決定基によって天然に発生しない付着部位;及び(b)前記抗原又は抗原決定基によって天然に発生する付着部位で構成される群から選択される、少なくとも1つの第2の付着部位を有する。
本発明は、少なくとも1つの非ペプチド結合を介する第2の付着部位の第1の付着部位との結合による規則正しく繰り返された抗原アレイを提供する。従って、抗原又は抗原決定基及び非天然分子骨格は、規則正しく繰り返された抗原アレイを形成する第1と第2の付着部位の結合を介して集合する。
実施者は、非天然分子骨格と結合したすべての抗原又は抗原決定基の配列又は、ある実施態様では、コア粒子が統一するように、特に、抗原又は抗原決定基及び第2の付着部位を設計する。例えば、カルボキシ又はアミノ末端の抗原又は抗原決定基上に単一の第2の付着部位を配してもよく、よって、非天然分子骨格に付着しているすべての抗原又は抗原決定基分子は統一した様式で配されている設計を介して確かめられる。従って、本発明は、明確な順序と反復パターンを形成する様式で、任意の抗原又は抗原決定基を非天然分子骨格上に配する簡便な方法を提供する。
当該分野に熟練した者にとって明かなように、本発明のある実施態様は、クローニング、ポリメラーゼ連鎖反応法、DNA及びRNAの精製、原核及び真核細胞での組み換え体タンパク質の発現等の組み換え核酸技術の利用を含む。そのような方法論は、当該分野に熟練した者にとって良く知られており、出版されている実験室方法マニュアルに容易に見出すことが可能である(例えば、Sambrook, J.ら, 編, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 第2版 編集, コールド・スプリング・ハーバー, ニューヨーク(1989);Ausubel, F.ら, 編, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John H. Wiley & Sons, Inc. (1997))。組織培養細胞株による研究のための基礎実験室技術(Celis, J., 編, CELL BIOLOGY, Academic Press, 第2版, (1998))及び抗体ベース技術(Harlow, E.及びLane, D., 「Antibodies:A Laboratory Manual」, コールド・スプリング・ハーバー研究所, コールド・スプリング・ハーバー, ニューヨーク(1988);Deutscher, M.P., 「Guide to Purification」, Meth. Enzymol. 128, Academic Press サンディエゴ(1990);Scope, R.K., 「Protein Purification Principle and Practice」第3編, Springer-Verlag, New York(1994)は、また、文献に十分に記載されていて、それらのすべては、参考文献として、ここに取り入れられている。
A.コア粒子及び非天然分子骨格
本発明のある組成物の1つの要素は、コア粒子及びオーガナイザーを含むか、又は代替的にそれらで構成される非天然分子骨格である。ここで用いられているように、成句「非天然分子骨格」は、第1の付着部位の強固な反復性アレイを提供することを担い得る、ヒトの手によって作製された任意の産物を指す。より具体的には、非天然分子骨格は、(a)(1)非天然起源のコア粒子、及び(2)天然起源のコア粒子で構成される群から選択されるコア粒子;そして(b)オーガナイザーが、少なくとも1つの共有結合によって前記コア粒子と結合している、少なくとも第1の付着部位を含むオーガナイザーを含むか、又は代替的にそれらで構成される。
当該分野に熟練した者にとって容易に明かであるように、本発明の非天然分子骨格のコア粒子は、任意の特定の形態に限定されない。このコア粒子は有機又は非有機性であり、化学的又は生物学的工程を介して合成される。
一実施態様では、非天然コア粒子は、合成ポリマー、脂質ミセル又は金属であってもよい。このようなコア粒子は当該分野で知られており、本発明の新規の非天然分子骨格を構築する基礎を提供する。例によっては、合成ポリマー又は金属コア粒子は、「抗体模倣物」の作製における多くのペプチドループへ付着しているカリックスアレーン有機骨格の用途を開示している米国特許第5,770,380号に記載されており、米国特許第5,334,394号には、金属又はセラミックスを含む幅広い種々の無機物質で構成されるウイルスデコイとして利用されるナノ結晶性粒子が記載されている。適当な金属には、クロミウム、ルビジウム、鉄、亜鉛、セレニウム、ニッケル、金、銀、白金が含まれる。この実施態様における適当なセラミック物質には、シリコン、二酸化物、二酸化チタニウム、酸化アルミニウム、酸化ルテニウム及び酸化スズが含まれる。この実施態様のコア粒子は、炭素(ダイアモンド)を含む有機物質から作製される。適当なポリマーには、ポリスチレン、ナイロン及びニトロセルロースが含まれる。この型のナノ結晶性粒子として、酸化スズ、二酸化チタニウム又は炭素(ダイアモンド)から作製された粒子も利用することができる。脂質ミセルは、当該分野で知られて任意の手法によって調製することができる。例えば、ミセルは、Baiselle及びMiller(Biophys. Chem. 4:355-361(1975))、又はCortiら(Chem. Phys. Lipids 38:197-214(1981))又はLopezら(FEBS Letter. 426:314-318(1998))又はTopchieva及びKarezin(J. Colloid Interface Sci.213:29-35(1999)又はMoreinら, (Nature 308: 457-460(1984))に記載の手法によって調製することが可能である。
コア粒子は、天然又は非天然であってもよい、生物学的工程を介しても産生されることが可能である。例としては、この型の実施態様には、ウイルス、ウイルス様粒子、細菌線毛、ファージ、ウイルスキャプシド粒子又はその組み換え型を含むか、又は代替的にそれで構成されるコア粒子を含み得る。より具体的な実施態様では、このコア粒子は、ロタウイルスの組み換えタンパク質、ノーウォークウイルスの組み換えタンパク質、アルファウイルスの組み換えタンパク質、細菌線毛又は線毛様構造を形成する組み換えタンパク質、口蹄疫ウイルスの組み換えタンパク質、レトロウイルスの組み換えタンパク質、B型肝炎の組み換えタンパク質(例えば、HBcAg)、タバコモザイクウイルスの組み換えタンパク質、フロックハウスウイルスの組み換えタンパク質、及びヒトパピローマウイルスの組み換えタンパク質を含むか、又は代替的にそれらで構成され得る。コア粒子は、さらに、規則正しく繰り返された抗原又は抗原決定基アレイを形成するよに互いに結合する能力を保持するそのようなタンパク質の変異体だけでなく、そのようなタンパク質の1又はそれより多い断片を含むか、又は代替的にそれらで構成され得る。
以下にさらに説明されているように、規則正しく繰り返された抗原又は抗原決定基アレイを形成するように互いに結合する能力を保持するタンパク質の変異体は、例えば、それらの野生型の対応物とアミノ酸レベルで、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%又は99%の同一性を共有する。例として、配列番号:89に示すアミノ酸配列を有するHBAcgを用いて、本発明は、配列番号:89に示すアミノ酸配列、及び適切であるN末端リーダー配列を除くように加工されたこのタンパク質の形態と少なくとも80%、85%、90%、95%、97%又は99%の同一であるアミノ酸配列を含むか、又は代替的にそれで構成されるHBcAgポリペプチドを含むワクチン組成物を含む。これらの変異体は、一般的に、結合して二量体又は多量体構造を形成することができる。タンパク質が、そのような構造を形成するのか否かを確かめるのに用いることができる方法には、ゲル濾過、アガロースゲル電気泳動、ショ糖密度勾配遠心分離及び電子顕微鏡検査を含む(例えば、Koschel, M.ら, J. Virol 73: 2153-2160(1999))。
規則正しく繰り返された抗原又は抗原決定基アレイを形成するように互いに結合する能力を保持するタンパク質の断片は、15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95,100,110,120,130,140,150,160,170,180,190,又は200アミノ酸長のポリペプチドを含むか、又は代替的にそれで構成され得る。そのようなタンパク質断片の例には、コア粒子及び/又は非天然分子骨格の調製に適した、ここで論じているタンパク質の断片を含む。
天然又は非天然であろうと、本発明のコア粒子は、通常は、少なくとも1つの共有結合によって天然又は非天然コア粒子と付着しているオーガナイザーを有する。このオーガナイザーは、規則正しく繰り返された抗原アレイを作製するための核形成部位を提供する、非ランダム様式でコア粒子と結合するエレメントである。必須ではないが、理想的には、オーガナイザーは、幾何学的秩序でコア粒子と結合する。最小的には、このオーガナイザーは、第1の付着部位を含む。
本発明の幾つかの実施態様では、規則正しく繰り返されたアレイは、(1)コア粒子又は非天然分子骨格と(2)(a)抗原又は抗原決定基又は(b)1又はより多くの抗原又は抗原決定基のいずれかの間の結合によって形成される。例えば、細菌線毛又は線毛様構造は、規則正しく繰り返された構造へ組織化されるタンパク質から形成される。従って、多くの例では、直接又はオーガナイザーを介するかのいずれかで、これら構成物を細菌線毛又は繊毛様構造へ結合させることによって、抗原又は抗原決定基の配列したアレイを形成することが可能である。
前述のように、オーガナイザーは、少なくとも1つの共有結合によってコア粒子と結合している少なくとも1つの第1の付着部位のを含む任意のエレメントであってもよい。オーガナイザーは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸(即ち、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの残基)、糖、ポリヌクレオチド、天然又は合成ポリマー、二次代謝産物又は化合物(ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフッ化物)又はその化合物、又はその化学的反応基であってもよい。より具体的な実施態様では、オーガナイザーは、抗原、抗体又は抗体断片、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、レセプター、レセプターリガンド、リガンド、リガンド結合タンパク質、相互作用しているロイシンジッパーポリペプチド、アミノ基、アミノ基と反応する化学基;カルボキシ基、カルボキシ基と反応する化学基、スルフヒドリル基、スルフヒドリル基と反応する化学基、又はその組み合わせを含んでもよい。
一実施態様では、非天然分子骨格のコア粒子は、ウイルス、細菌線毛、細菌線毛から形成された構造、バクテリオファージ、ウイルス様粒子、ウイルス様キャプシド粒子又はその組み換え型を含む。規則正しく繰り返されたコート及び/又はコアタンパク質構造を有する当該分野で知られている任意のウイルスは、本発明の非天然分子骨格として選択されてもよい;適したウイルスの例には、シンドビス及び他のアルファウイルス、ラブドウイルス(例えば、水疱性口内炎ウイルス)、ピコルナウイルス(例えば、ヒトライノウイルス、アイチウイルス)、 トガウィルス(例えば、風疹ウイルス)、オルソミクソウイルス(例えば、トゴトウイルス、バットケンウイルス、家禽ペストウイルス)、ポリオーマウイルス(例えば、ポリオーマウイルスBK、ポリオーマウイルスJC、トリポリオーマウイルスBFDV)、パルボウイルス、ロタウイルス、バクテリオファージQβ、バクテリオファージR17、バクテリオファージM11、バクテリオファージMX1、バクテリオファージNL95、バクテリオファージfr、バクテリオファージGA、バクテリオファージSP、バクテリオファージMS2,バクテリオファージf2、バクテリオファージPP7、ノーウォークウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルス、タバコモザイクウイルス、ロックハウスウイルス、及びヒトパピローマウイルス(例えば、Bachman, M.F. 及びZinkernagel, R.M., Immunol. Today 17:553-558(1996)の表1を参照せよ)を含む。
一実施態様では、本発明は、規則正しく繰り返されたウイルス外皮タンパク質と非相同的タンパク質、ペプチド、抗原決定基又は選択した反応性アミノ酸残基を含むオーガナイザーの間の融合を作製するために、ウイルスの遺伝子操作を利用する。これら分野で知られている他の遺伝子操作は、非天然分子骨格の構築に含まれ得る;例えば、遺伝的変異を介して組み換えウイルスの複製能力を制限することは望ましいことであろう。オーガナイザー(即ち、第1の付着部位)タンパク質への融合のために選択されるウイルスタンパク質は、規則正しく繰り返された構造を有する。そのような組織化された反復性構造は、ウイルスの表面上の5-15nmの間隔を有する準結晶構造を含む。この型の融合タンパク質の作製によって、ウイルスの表面上に複数の規則正しく繰り返されたオーガナイザーが結果として生じる。従って、それから結果として生じた第1の付着部位の規則正しく繰り返された組織は、天然ウイルスタンパク質の正常な組織を反映する。
ここでより詳しく論じているように、本発明のその他の実施態様では、非天然分子骨格は組み換えアルファウイルスであり、そしてより具体的には、組み換えシンドビスウイルスである。アルファウイルスは、DNA中間体を伴わずに、感染細胞の細胞質でもっぱらゲノムRNAが複製するポジテイブ鎖RNAウイルスである(Strauss, J. 及びStrauss, E., Microbiol. Rev. 58: 491-562(1994))。アルファウイルスファミリーの幾つかのメンバー、シンドビス(Xiong, C. ら, Science 243: 1188-1191(1989);Schlesinger, S., Trends Biotechnol. 11: 18-22(1993))、セムリキ森林ウイルス(SFV)(Lilijestrom, P. & Garoff, H., Bio/Technology 9:1356-1361(1991)及び他(Davis, N.L.ら, Virology 171:189-204(1989))は、種々の異なるタンパク質のためのウイルス-ベース発現ベクターとしての用途(Lundstrom, K., Curr. Opin. Biotechnol. 8:578-582(1997);Liljestrom, P., Curr. Opin. Biotechol. 5:495-500(1994))、及びワクチン開発のための候補として、かなりの注目を受けてきた。最近、非相同的タンパク質の発現とワクチンの開発のためのアルファウイルスの用途に関する多くの特許が発行されている(米国特許第5,766,602号;5,792,462号;5,739,026号;5,789,245号及び5,814,482号を参照せよ)。本発明のアルファウイルス骨格の構築は、ここで参考文献として取り入れらている前出の論文によって記載された、組み換えDNA技術の分野で広く知られている手段によっておこなうことが可能である。
種々の異なる組み換え宿主細胞は、抗原又は抗原決定基のためのウイルス-ベースコア粒子を産生するために利用することができる。例えば、アルファウイルスは、幅広い範囲の宿主を持つことが知られている:シンドビスウイルスは、幾つかの昆虫細胞だけでなく、培養哺乳動物、爬虫類、及び両生類細胞に感染する(Clark, H., J. Natl. Cancer Inst. 51:645(1973);Leake, C., J.Gen. Virol. 35:335(1997);Stollar, V. in THE TOGAVIRUSES, R.W. Schlesinger, 編, Academic Press, (1980), pp.583-621)。従って、多くの組み換え宿主細胞を、本発明で用いることができる。BHK, COS, Vero, HeLa及びCHO細胞は、ヒト細胞に類似して、非相同的タンパク質をグリコシル化する能力を有するために、非相同的タンパク質の産生に特に適しており(Watson, E.ら, Glycobiology 4:227, (1994))、懸濁液だけでなく、無血清培地で生育するように選択(Zang, M.ら, Bio/Technology 13:389(1995))又は遺伝子操作することができる(Renner W.ら, Biotech. Bioeng. 4:476(1995);Lee K.ら Biotech. Bioeng. 50:336(1996))。
宿主細胞へのポリヌクレオチドベクターの導入は、標準的な実験室マニュアルに記載されている方法によって影響を受け(Sambrook, J.ら, 編, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 第2版 編集, コールド・スプリング・ハーバー研究所出版, コールド・スプリング・ハーバー, ニューヨーク(1989)第9章;Ausubel, F.ら, 編, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John H. Wiley & Sons, Inc. (1997), 第16章)、それには、エレクトロポレーション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、トランスダクション、スクレープローディング (scrape loading)、弾丸導入(ballistic introduction)、感染が含まれる。外来DNA配列を宿主細胞へ導入する方法は、Felgner,P.ら, 米国特許第5,580,859号で論じられている。
パッケージRNA配列も、宿主細胞を感染するのに利用することができる。これらのパッケージRNA配列は、培養培地へそれらを添加することで宿主細胞へ導入することができる。例えば、非感染性アルファウイルス粒子の調製は、「Sindbis Expression System」,バージョンC(インビトロジェン カタログ第K750-1号)を含む、多くのソースに記載されている。
哺乳動物細胞がウイルス-ベースコア粒子の産生のための組み換え宿主細胞として用いられる場合、これらの細胞は、通常は組織培養で生育される。培養で細胞を生育させる方法は、当該分野で良く知られている(例えば、Celis, J.., 編, CELL BIOLOGY, Academic Press, 第2版, (1998);Sambrook, J. ら, 編, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 第2版 編集, コールド・スプリング・ハーバー研究所出版, コールド・スプリング・ハーバー, ニューヨーク(1989);Ausubel, F.ら, 編, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John H. Wiley & Sons, Inc. (1997);Freshney, R., CULTURE OF ANAMAL CELLS, Alan R. Liss, Inc. (1983))。
当該分野で理解されているように、第1の付着部位は、適切なタンパク質、ポリペプチド、糖、ポリヌクレオチド、ペプチド(アミノ酸)、天然又は合成ポリマー、非天然分子骨格に対する選択した抗原又は抗原決定基を特異的に付着させることを担うであろう二次代謝物又はその組み合わせであってもよく、又はその任意の一部分であってもよい。一実施態様では、付着部位は、当該分野から選択され得るタンパク質又はペプチドである。例えば、第1の付着部位は、以下の群から選択してもよい:リガンド、レセプター、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、HA又はT7タグ等のエピトープ、Myc、Max、免疫グロブリンドメイン、及び第1の付着部位として有用な当該分野で知られた任意の他のアミノ酸配列。
本発明のその他の実施態様によって、第1の付着部位は、キャプシドタンパク質に対するインフレーム融合を構築することに利用されるオーガナイザー(即ち、タンパク質又はポリペプチド)の補助として作製され得る。例えば、タンパク質は、特定の様式でグリコシル化されることが知られるアミノ酸配列を有する外膜タンパク質との融合に利用しることが可能であり、添加された糖部分は、結果として、抗原の第2の付着部位として機能するレクチンへの結合による、ウイルス骨格の第1の付着部位で機能する。あるいは、オーガナイザー配列をインビボでビオチン化することが可能であり、そのビオチン部分は、本発明の第1の付着部位として機能するか、又はそのオーガナイザー配列を、インビトロで、明確なアミノ酸残基の化学修飾に供することが可能であり、その修飾は、第1の付着部位として機能する。
本発明のその他の実施態様では、第1の付着部位は、B型肝炎(コア)タンパク質(HBcAg)へフレーム単位で融合したJUN-FOSロイシンジッパータンパク質として選択される。しかしながら、当該分野のすべての個人にとって、他のウイルスキャプシドタンパク質が、本発明の非天然分子骨格の第1の付着部位を配するために融合タンパク質で利用され得ることは明かである。
本発明のその他の実施態様では、第1の付着部位は、HBcAgへフレーム単位で融合するリジン又はシステインが選択される。しかしながら、当該分野のすべての個人にとって、他のウイルスキャプシド又はウイルス様粒子が、本発明の非天然分子骨格の第1の付着を配するために、融合タンパク質コンストラクトで利用され得ることは明かである。
第1の付着部位のために利用されるJUNアミノ酸配列は、次の通りである:
CGGRIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMNHVGC(配列番号:59)
この例では、抗原上の予想される第2の付着部位は、FOSロイシンジッパータンパク質ドメインであり、そのアミノ酸配列は次の通りである:
CGGLTDTLQAETDQVEDEKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAHGGC(配列番号:60)
これらの配列は、それぞれに両側にシステイン残基を含有する短い配列が隣接している転写因子JUN及びFOSから誘導される。これらの配列は、互いに相互作用することが知られている。JUN-FOS二量体に関して提案された本来の仮説的構造によって、1つの単量体の疎水性側鎖が、ジッパー様形式で他の単量体の対応する側鎖と互いに入り込むことが想定された(Landschulzら, Science 240: 1759-1764(1988))。しかしながら、この仮説は間違っていることが証明され、これらのタンパク質は、α-ヘリックコイルを形成していることが知られている(O'Sheaら, Science 243:538-542(1989);O'Sheaら, Cell 68:699-708(1992);Cohen&Parry, Trends Biochem. Sci. 11:245-248(1986))。従って、「ロイシンジッパー」という用語は、構造上よりも歴史的理由のために、これらタンパク質ドメインを指すのにしばしば用いられる。この特許を通して、「ロイシンジッパー」という用語は、上に示した配列か又は上に示した1つに極めて類似している配列を指すのに利用される。JUN及びFOSという用語は、JUN及びFOSタンパク質全体よりもそれぞれのロイシンジッパードメインについて用いられる。
前出のように、この発明は、ウイルス、ウイルス様粒子、ファージ、ウイルスキャプシド粒子又はその組み換え型を含むか、あるいはそれらで構成されるウイルスベースコア粒子を含む。熟練技術者は、そのようなコア粒子を製造し、それへオーガナイザーを付着させる知識を有する。コア粒子としてのB型肝炎様粒子及び麻疹ウイルスキャプシド粒子の産生は、国際公開00/32227の実施例17から22に開示されており、参考文献として明白に取り入れている。そのような実施態様では、JUNロイシンジッパータンパク質ドメイン又はFOSロイシンジッパータンパク質は、本発明の非天然分子骨格のために、オーガナイザーとして、そしてそれ故に第1の付着部位として用いることができる。
実施例23-29は、それぞれ第1及び第2の付着部位として反応性のリジン残基を有するフレーム単位の融合ペプチドを有するB型肝炎コア粒子、そして遺伝的に融合させたシステイン残基を有する抗原の産生の詳細を提供する。
1 他の実施態様では、本発明の組成物で利用されたコア粒子は、B型肝炎キャプシド(コア)タンパク質(HBcAg)、HBcAgの断片、又は配列したアレイを形成することができる他のタンパク質又はペプチドであり、それらは、遊離のシステイン残基の数を除くか又は減じることいずれかで修飾される。Zhouら(J. Virol. 66:5393-5398(1992))は、天然に存在するシステイン残基を取り除くために修飾したHBcAgsが、結合し、多量体構造を形成する能力を保持することを示した。従って、本発明の組成物で利用するのに適したコア粒子には、修飾HBcAgs、又はその断片を含み、それらは、1又はそれより多い天然に内在するシステイン残基が欠失しているか、又はその他のアミノ酸残基で置換されているかのいづれかである(例えば、セリン残基)。
2 HBcAgは、B型肝炎コア抗原前駆体タンパク質のプロセッシングによって生成されるタンパク質である。HBcAgの多くのアイソタイプは同定されている。例えば、配列番号:132に示すアミノ酸配列を有するHBcAgタンパク質は183アミノ酸長であり、212アミノ酸B型肝炎コア抗原前駆体タンパク質のプロセッシングによって生成される。このプロセッシングは、B型肝炎コア抗原前駆体タンパク質のN末端から29のアミノ酸を取り除く結果となる。同じように、配列番号:134に示すアミノ酸配列を有するHBcAgタンパク質は185アミノ酸長であり、214アミノ酸B型肝炎コア抗原前駆体タンパク質のプロセッシングによって生成される。配列番号:132に示すアミノ酸配列と比較して、配列番号:134に示すアミノ酸配列は、配列番号:134の位置152及び153に2個のアミノ酸挿入を持つ。
殆どの例では、本発明のワクチン組成物は、HBcAgのプロセス型を用いて調製される(即ち、B型肝炎コア抗原前駆体タンパク質のN末端リーダー配列(例えば、配列番号:134に示す最初の29アミノ酸残基)のHBcAgは取り除かれている)。
さらには、プロセッシングがおこらない条件下でHBcAgが産生される場合、このHBcAgは、通常は「プロセッシング」型で発現される。例えば、大腸菌のような細菌系は、真核生物細胞で発現されるタンパク質の「シグナルペプチド」とも呼ばれるリーダー配列を、通常は取り除かない。従って、本発明のHBcAgを産するのに大腸菌発現系を用いた場合、これらのタンパク質は、B型肝炎コア抗原前駆体タンパク質のN末端リーダー配列が存在しないように、通常は発現される。
本発明の1つの実施態様では、配列番号:134に示すアミノ酸配列、又はその一部分を含む修飾HBcAgを、非天然分子骨格を調製するために用いた。特に、本発明の実施に用いるのに適した修飾HBcAgは、配列番号:134に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の位置48,61,107及び185と一致する位置の1又はそれより多いシステイン残基が、他のアミノ酸残基(例えば、セリン残基)を欠失させたか、又はそれで置換したかのいずれかのタンパク質を含む。当該分野に熟練している者が認識できるであろうように、配列番号:134に示すのとは異なったアミノ酸配列を有するHBcAg変異体の類似の位置のシステイン残基も他のアミノ酸残基を欠失させるか、又はそれで置換することが可能であろう。修飾HBcAg変異体は、その後、本発明のワクチン組成物を調製するのに用いることが可能である。
本発明は、配列番号:134に示すアミノ酸配列を有するポリぺプチドには見出されない1又はそれより多いアミノ酸残基を欠失させるか、、又はそれを置換するように修飾されたHBcAg変異体をも含む。そのようなHBcAg変異体の例は、配列番号:90及び132に示すアミノ酸配列を有する。これらの変異体は、配列番号:134のアミノ酸残基147に一致する位置にシステイン残基を有する。従って、本発明のワクチン組成物にには、配列番号:134に示すアミノ酸配列には存在しないシステイン残基が欠失しているHBcAgを含む組成物が含まれる。
ある環境下では(例えば、抗原又は抗原決定基を非天然分子骨格へ付着させるのに、ヘテロ二価性架橋剤を用いた場合)、HBcAgの遊離のシステイン残基の存在は、不確定種を形成するための単量体の架橋だけでなく、毒素成分のコア粒子への共有カップリングにつながると信じられている。
さらには、多くの例では、これらの毒素成分は、本発明の組成物に施したアッセイでは検出できない。毒素成分の非天然分子骨格への共有カップリングが、HBcAgsの毒素成分が異なるシステイン残基、又は幾つかの場合はシステインではない残基と連結している多様な種の集団の形成を結果として生じる。言い換えると、各HBcAgの遊離のシステイン残基は、毒素成分と共有的に連結してはいない。さらには、多くの例では、特定のHBcAgのシステイン残基のどれも、毒素成分と連結しているのではない。従って、これら毒素成分の存在は、それらが、分子の混合集団で存在していることから、検出が困難であろう。しかしながら、毒素成分を含有するHBcAg種の個体への投与は、かなり深刻な副作用につながる。
遊離のシステイン残基が多くの化学副反応に関わっていることは、当該分野では良く知られている。これら副反応には、例えば、注入されたか、又は併用療法で他の物質によって形成された化学物質又は代謝産物との反応であるジスルフィド交換、又は直接酸化
及びUV光へ曝すことによるヌクレオチドとの反応が含まれる。従って、特に、HBcAgが核酸と結合する強い傾向を有することを考えると、毒素付加物が生成されるであろう。広範囲にわたる分子量を有する産物の分布が生じるので、遊離のシステイン及びヘテロ二価性剤を含有するHBcAgsを利用して調製したキャプシドを用いての、抗原キャプシドコンジュゲートでのそのような毒素産物の検出は困難であろう。従って、毒素付加物は、様々な種の間に分布するであろうし、その個々は、それぞれ低濃度で存在するが、一緒になると毒素のレベルに達する。
上記の点に照らして、天然に内在するシステイン残基を取り除くように修飾したワクチン組成物にHBcAgsを利用する1つの利点は、抗原又は抗原決定基が非天然分子骨格と付着する場合に毒素種が結合できる部位が、その数が低下するか又はすべて除去されるであろうことである。さらには、架橋剤の高い濃度は、多くのHBcAg単量体の未確定な架橋種(即ち、架橋単量体HbcAgsの多様な混合物)を生成するという欠点をともなわずに、高度に修飾された粒子を産するのに用いることができる。
本発明の粒子として用いるのに適切な天然発生HBcAg変異体の多くが同定されている。例えば、Yuanら,(J. Virol. 73:10122-10128(1999))は、配列番号:134の位置97に一致する位置のイソロイシン残基が、ロイシン残基又はフェニルアラニン残基のいずれかで置換されている変異体について記載している。幾つかのB型肝炎コア抗原前駆体変異体だけでなく、多くのHBcAg変異体のアミノ酸配列は、GenBankレポートAAF121240(配列番号:89)、AF121239(配列番号:90)、X85297(配列番号:91)、X02496(配列番号:92)、X85305(配列番号:93)、X85303(配列番号:94)、AF151735(配列番号:95)、X85259(配列番号:96)、X85286(配列番号:97)、X85260(配列番号:98)、X85317(配列番号:99)、X85298(配列番号:100)、AF043593(配列番号:101)、M20706(配列番号:102)、X85295(配列番号:103)、X80925(配列番号:104)、X85284(配列番号:105)、X85275(配列番号:106)、X72702(配列番号:107)、X85291(配列番号:108)、X65258(配列番号:109)、X85302(配列番号:110)、M32138(配列番号:111)、X85293(配列番号:112)、X85315(配列番号:113)、U95551(配列番号:114)、X85256(配列番号:115)、X85316(配列番号:114)、X85256(配列番号:115)、X85316(配列番号:116)、X85296(配列番号:117)、AB033559(配列番号:118)、X59795(配列番号:119)、X85299(配列番号:120)、X85307(配列番号:121)、X65257(配列番号:122)、X85311(配列番号:123)、X85301(配列番号:124)、X85314(配列番号:125)、X85287(配列番号:126)、X85272(配列番号:127)、X85319(配列番号:128)、AB010289(配列番号:129)、X85285(配列番号:130)、AB010289(配列番号:131)、AF121242(配列番号:132)、M90520(配列番号:135)、P03153(配列番号:136)、AF110999(配列番号:137)、及びM95589(配列番号:138)に開示されていて、それぞれの開示は、ここに参考文献として取り入れられている。これらHBcAg変異体は、多くの位置でアミノ酸配列が異なり、それには、配列番号:134の位置12,13,21,22,24,29,32,33,35,38,40,42,44,49,51,59,64,66,67,69,74,77,80,81,87,92,93,97,98,100,103,105,106,109,113,116,121,126,130,133,135,141,147,149,157,176,178,182及び183に一致するアミノ酸残基が含まれる。
本発明に適したHBcAgsは、それらが結合して規則正しく繰り返された抗原アレイを形成することができる限り、任意の生物体から誘導することができる。従って、配列番号:136、137、又は138に示すアミノ酸配列を有するHBcAgsが本発明のワクチン組成物を調製するために用いられる場合、通常は、これら各タンパク質のそれぞれN末端の30,35-43、又は35-43アミノ酸残基が除かれる。
本発明には、上記の非天然分子骨格の調製のための変異体HBcAgsを用いるワクチン組成物を利用する方法だけでなく、ワクチン組成物を含む。
本発明の範囲内にさらに含まれるのは、結合して二量体又は多量体構造を形成することが可能な、付加的なHBcAg変異体である。従って、本発明は、さらに、配列番号:89-132及び134-138に示すアミノ酸配列の何れかと少なくとも80%、85%、90%、95%、97%、又は99%の同一であるアミノ酸配列を含むか、あるいはそれで構成されるHBcAgポリペプチド、及びN末端のリーダー配列を取り除くように適切に加工されたこれらタンパク質の形態を含むワクチン組成物を含む。
ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号:89-132及び134-138に示す1つのアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、97%、又は99%同一であるアミノ配列、又はその一部分を有するのかどうかは、ベストフィットプログラム(Bestfit Program)等の既知のコンピュータープログラムを利用して慣習的に決定することができる。ベストフィット(Bestfit )又は任意の他の配列アラインメントプログラムを利用して、特定の遺伝子が、例えば、本発明に記載の引用アミノ酸配列と95%同一であるかどうかを確かめる場合、同一性の百分率が引用アミノ酸配列の完全長にわたって計算され、引用配列のアミノ酸残基の全数の5%までのギャップが許容されるように、そのパラメーターは設定される。
配列番号:89-132及び134-136に設定されたアミノ酸配列を有するHBcAg変異体及び前駆体は、相対的に互いに類似している。従って、配列番号:134の特定の位置に一致する位置にあるHBcAg変異体のアミノ酸残基に関することは、配列番号:134に示すアミノ酸配列の位置に存在するアミノ酸残基を指す。これらHBcAg変異体の間のホモロジーは、殆どの部分が哺乳動物を感染するB型肝炎ウイルスの中で十分に高いので、当該分野に熟練した者は、配列番号:134に示すアミノ酸配列と特定のHBcAg変異体のそれの双方を概説し、「相当する」アミノ酸残基を同定することについて困難性が殆ど無い。例えば、ウッドチャックに感染するウイルスに由来するHBcAgのアミノ酸配列を示す、配列番号:135に示すHBcAgアミノ酸配列は、配列番号:134に示すアミノ酸配列を有するHBcAgに対して十分なホモロジーを有していて、3個のアミノ酸の挿入が、配列番号:134のアミノ酸残基155と156の間の配列番号:135に存在することは容易に明白である。
白雁とアヒルに感染するB型肝炎ウイルスのHBcAgは、哺乳動物に感染するB型肝炎ウイルスのHBcAgのアミノ酸配列とは全くことなり、このタンパク質のこれら形態の配列番号:134に示すアミノ酸配列とのアラインメントは困難である。しかしながら、本発明は、これらHBcAg変異体の断片を含むワクチン組成物だけでなく、鳥類に感染するB型肝炎ウイルスのHBcAg変異体を含むウイルス組成物を含む。本発明のワクチン組成物を調製するために用いるのに適したHBcAg断片には、配列番号:137の36-240、36-269、44-240、44-269、36-305、及び44-305、又は配列番号:138の36-269、36-269、44-240、44-269、36-305、及び44-305から成る群から選択されるアミノ酸残基を含むか、あるいはそれで構成されるポリペプチド断片を含有する組成物を含む。当該分野に熟練した者が認識するであろうように、これらポリペプチドに天然に存在する1つ、2個、3個又はそれより多いシステイン残基(例えば、配列番号:137の位置153、又は配列番号:138の位置34,43,及び196のシステイン残基)は、その他のアミノ酸残基で置換されるか、又は本発明のワクチン組成物へのそれれらの封入の前に欠失されるかのいずれかをなすことができる。
一実施態様では、配列番号:134に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の位置48及び107のシステイン残基は、欠失されるか、又はその他のアミノ酸残基で置換されるが、位置61のシステインはそのままにされる。さらには、修飾ポリペプチドは、その後、本発明のワクチン組成物を調製するのに利用される。
下記の実施例31に設定されているように、溶剤が接触可能な位置48及び107のシステイン残基は、例えば、部位特異的変異法によって取り除くことが可能である。さらには、本発明によって構築した、実施例31に記載のCys-48-Ser、Cys-107-Ser HBcAg二重変異体が大腸菌で発現が可能であることが見出された。
上で論じたように、遊離のシステイン残基の除去によって、毒素成分がHBcAgと結合できる部位の数が減り、同じ又は近接のHBcAg分子のリジンとシステイン残基の架橋が生じることが可能な部位も除かれる。二量体形成に関わり、その他のHBcAgの位置61のシステインとジスルフィド架橋を形成する位置61のシステインは、本発明のHBcAg二量体及び多量体の安定化のために無傷のままである。
実施例32に示すように、(1)遊離のシステイン残基を含有するHBcAg、及び(2)遊離のシステイン残基がヨードアセトアミドによって不活性にされたHBcAgで実行した架橋実験は、HBcAgの遊離のシステイン残基が、ヘテロ二価機能性架橋誘導体化リジン側鎖と遊離システイン残基の間の反応を介するHBcAg間の架橋を担うことを示す。実施例32は、HBcAgサブユニットの架橋が、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって解析できない未確定な大きさの高分子量種の形成につながる。
抗原又は抗原決定基がリジン残基を介して非天然分子骨格と連結する場合、HBcAg変異体に存在する他のリジン残基だけでなく、配列番号:134の位置7及び96に一致する位置にある天然に存在するリジン残基の1又は双方を置換又は欠失させることのいずれかは有益である。これらリジン残基の除去は、配列したアレイを破壊することができ、最終的なワクチン組成物の質と均一性を向上させる、抗原又は抗原決定基の結合部位の除去を生じる結果となる。
多くの例では、配列番号:134の位置7及び96に一致する位置の天然に存在するリジン残基の双方が除去された場合、その他のリジンが、抗原又は抗原決定基の付着部位としてHBcAgへ導入される。そのようなリジン残基を挿入する方法は、例えば、下の実施例23に設定されている。例えば、配列番号:134の位置7及び96に一致する位置の天然に存在するリジン残基の双方が改変されて、ヘテロ二価機能性架橋剤を用いて非天然分子骨格へ抗原又は抗原決定基を付着することを目的とする場合、リジン残基をHBcAgへ導入することは有益である。
HBcAgのC末端が、このタンパク質の核局在化を方向付けることが示されている(Eckhardtら, J. Virol. 65:575-582(1991))。さらに、タンパク質のこの領域は、HBcAgへ核酸と結合する能力を付与するとも考えられている。
ある実施態様では、本発明のワクチン組成物は、核酸結合活性を有するHBcAgを含有する(例えば、天然に存在するHBcAg核酸結合ドメイン)。1又はそれより多くの核酸結合ドメインを含有するHBcAgは、増幅したT細胞刺激活性を示すワクチン組成物を調製するのに有用である。従って、本発明のワクチン組成物は、核酸結合活性を有するHBcAgを含有する組成物を含む。さらに含まれるのは、ワクチン接種プロトコールでのそのような組成物の用途だけでなく、HBcAgが核酸と結合したワクチン組成物である。これらHBcAgは、個々への投与の前に核酸と結合し得るか、又は投与後に核酸と結合し得る。
他の実施態様では、本発明のワクチン組成物は、C末端領域(例えば、配列番号:134のアミノ酸残基145-185又は150-185)が取り除かれ、核酸と結合しないHBcAgsを含有する。従って、本発明の実施に適したさらなる修飾HBcAgは、C末端切断変異体を含む。適切な切断変異体は、C末端から1,5,10,15,20,25,30,34,35,36,37,38,39,40,41,42又は48アミノ酸が取り除かれたHBcAgを含む。
本発明の実施の用途に適したHBcAgは、N末端切断変異体も含む。適した切断変異体は、N末端から1,2,5,7,9,10,12,14,15,又は17アミノ酸が取り除かれた修飾HBcAgを含む。
本発明の実施の用途に適したさらなるHBcAgは、N及びC末端切断変異体を含む。適した切断変異体は、N末端から1,2,5,7,9,10,12,14,15,及び17アミノ酸が取り除かれ、C末端から1,5,10,15,20,25,30,34,35,36,37,38,39,40,41,42又は48アミノ酸が取り除かれたHBcAgを含む。
本発明は、さらに、上に記載の切断変異体と少なくとも80%、85%、90%、95%、97%、又は99%同一であるアミノ酸配列を含むか、あるいはそれから成るHBcAgポリペプチドを含むワクチン組成物を含む。
上で論じたように、本発明のある実施態様では、リジン残基は、非天然分子骨格を形成するポリペプチドへ第1の付着部位として導入される。好ましい実施態様では、本発明のワクチン組成物は、位置79及び80に一致するアミノ酸がGly-Gly-Lys-Gly-Gly(配列番号:158)のアミノ酸配列を有するペプチドによって置換され、位置61のシステインがそのままである一方で、位置48及び107のシステイン残基が欠失又はその他のアミノ酸残基で置換されるように、配列番号:134のアミノ酸1-144又はアミノ酸1-149を含むか、あるいはそれで構成されるHBcAgを用いて調製される。本発明は、さらに、上記のアミノ酸改変をも有する配列番号:89-132及び135-136のいずれかに示すアミノ酸配列を有するポリペプチドの相当する断片を含むワクチン組成物を含む。
本発明は、さらに、配列番号:134の対応する位置には存在しないシステイン残基が欠失された、配列番号:134に示すのとは異なるアミノ酸配列を含むか、又は代わって、それで構成されるHBcAgの断片を含むワクチン組成物を含む。そのような断片の一例は、位置147のシステイン残基がその他のアミノ酸で置換されたか、又は欠失されたかいずれかである、配列番号:132のアミノ酸1-149を含むか、又は代わって、それで構成されるポリペプチドであろう。
本発明は、さらに、配列番号:158のアミノ酸1-147又は1-152だけでなく、配列番号:134のアミノ酸1-144又は1-149、及び配列番号:89-132又は134-136のいずれかに示すアミノ酸配列を含むポリペプチドの対応するサブ部分と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%、又は99%同一であるアミノ酸配列を含むか、又は代わって、それで構成されるHBcAgポリペプチドを含むワクチン組成物を含む。
本発明は、また、配列番号:137のアミノ酸36-240、36-269、44-240、44-269、36-305及び44-305、又は配列番号:138の36-240、36-269、44-240、44-269、36-305、及び44-305と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%、又は99%同一であるアミノ酸配列を含むか、又は代わって、それで構成されるHBcAgポリペプチドを含むワクチン組成物を含む。
本発明のワクチン組成物は、異なるHBcAgsの混合物を含み得る。従って、これらワクチン組成物は、アミノ酸配列が異なるHBcAgsで構成されてもよい。例えば、ワクチン組成物は、「野生型」HBcAg及び1又はそれより多いアミノ酸残基が改変された(例えば、欠損、挿入又は置換)修飾HBcAgを含んで調製することができる。しかしながら、殆どの用途では、1つの型のHBcAgのみ、又は少なくとも本質的に等価な第1の付着部位を有するHBcAgsが用いられるが、それは、そのようなHBcAgsを利用して調製したワクチンが、抗原又は抗原決定基の高度に規則正しく繰り返されたアレイを示すためである。さらには、本発明の好ましいワクチン組成物は、高度に規則正しく繰り返された抗原アレイを示すものである。
本発明は、さらに、非天然分子骨格が、その他のタンパク質と融合したHBcAgを用いて調製されるワクチン組成物を含む。上で論じたように、そのような融合タンパク質の一例は、HBcAg/FOS融合物である。本発明のワクチン組成物の用途に適したHBcAg融合タンパク質の一例は、HBcAg二量体及び多量体の形成及び/又は安定化を助けるアミノ酸配列が添加された融合タンパク質を含む。この付加的なアミノ酸配列は、HBcAgのN又はC末端のいずれかに融合することが可能である。このような融合タンパク質の一例は、サッカロミセス・セレビシエ(GenBank寄託番号P03069(配列番号:154))のGCN4へリックス領域とHBcAgの融合物である。
GCN4タンパク質のへリックスドメインは、HBcAg二量体及び多量体を調製して安定化するのに利用できる非共有的相互作用を介するホモ二量体を形成する。
一実施態様では、本発明は、C末端へ融合させた配列番号:154のアミノ酸残基227から276の配列を有するGCN4ポリペプチドを有するHBcAg、又はその断片を含むHBcAg融合タンパク質を用いて調製したワクチン組成物を提供する。このGCN4ポリペプチドは、HbcAgのN末端へも融合させてもよい。
HBcAg/srcホモロジー3(SH3)ドメイン融合タンパク質も、本発明のワクチン組成物を調製するのに利用することができる。SH3ドメインは、タンパク質結合パートナーの特定のプロリンリッチ配列と相互作用する能力を付与する多くのタンパク質に見出される、比較的に小さなドメインである(McPherson, Cell Signal 11:229-238(1999))。HBcAg/SH3融合タンパク質は、幾つかの方法で利用することができる。最初に、SH3ドメインは、抗原又は抗原決定基の第2の付着部位と相互作用する第1の付着部位を形成することができる。同じように、プロリンリッチアミノ酸配列は、HBcAgへ添加することができ、抗原又は抗原決定基のSH3ドメインの第2の付着部位に対する第1の付着部位として利用されることが可能である。二番目に、SH3ドメインとプロリンリッチSH3相互作用部位は、同じ又は異なるHBcAgのいずれかに挿入し、本発明の二量体及び多量体を形成して安定化させるのに利用することができる。
他の実施態様では、細菌の線毛、細菌の線毛のサブ部分、又は細菌の線毛又はそのサブ部分のいずれかを含有する融合タンパク質を、本発明のワクチン組成物を調製するのに用いる。繊毛の例には、大腸菌、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、淋菌(Neisseria gonorrhoeae )、カウロバクター・クレセンタス(Caulobacter crescentus )、シュードモナス・スタッツェリ(Pseudomonas stutzeri)、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)によって産せられる線毛が含まれる。本発明で用いるのに適した線毛タンパク質のアミノ酸配列は、GenBankレポートAJ000636(配列番号:139)、AJ132364(配列番号:140)、AF229646(配列番号:141)、AF051814(配列番号:142)、AF051815(配列番号:143)、及びX00981(配列番号:155)を含み、その全開示は、ここに参考文献として取り入れられている。
細菌線毛タンパク質は、通常は、細菌ペリプラズムへのタンパク質の輸送の前に、N末端リーダー配列が取り除かれるよう加工される。さらには、当該分野に熟練した者が認識するであろうように、本発明のワクチン組成物を調製するのに用いる細菌線毛は、通常は、天然に存在するリーダー配列を有しない。
本発明の用途に適した線毛タンパク質の1つの具体的な例は、大腸菌のP線毛(GenBankレポート AF237482(配列番号:144))である。本発明で用いるのに適した1型大腸菌線毛の例は、GenBankレポート PO4128(配列番号:146)に設定されたアミノ酸配列を有する線毛であり、それは、GenBankレポート M27603(配列番号:145)に設定されているヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされている。これらGenBankレポートの全開示は、ここで、参考文献として取り入れられている。再び、上の引例タンパク質の成熟形態は、通常は、本発明のワクチン組成物を調製するのに用いられる。
本発明の実施に用いるのに適した細菌線毛又は線毛サブ部分は、通常は、結合して非天然分子骨格を形成することができる。
インビボで線毛及び線毛様構造を調製する方法は、当該分野で知られている。例えば、Bullittら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:12890-12895(1986)は、大腸菌P線毛サブユニットのインビトロ再構築を記載している。さらには、Eshdatら, J.Bacteriol. 148:308-314(1981)は、大腸菌の1型線毛を解離させること、及び線毛の再構築に適した方法を記載している。要約すると、これらの方法は次の通りである:線毛は、飽和塩酸グアニジン中で37℃でのインキュベートによって解離させる。線毛タンパク質を、その後でクロマトグラフィーで精製し、その後、5mM MgClを含む5mMトリス(ハイドロキシメチル)アミノメタン塩酸(pH8.0)に対する透析によって線毛二量体を形成させた。
さらには、例えば、常套的な遺伝子工学及びタンパク質修飾法を用いて、抗原又は抗原決定基が第2の付着部位を介して連結する第1の付着部位を含有するように、線毛タンパク質を修飾することができる。あるいは、抗原又は抗原決定基は、第2の付着部位を介して、これらタンパク質に天然に存在するアミノ酸残基と直接に連結することができる。これら修飾線毛タンパク質は、その後、本発明のワクチン組成物に用いることができる。
本発明のワクチン組成物を調製するのに用いる細菌線毛タンパク質は、ここでHBcAgのために記載したのと同じような様式で修飾することができる。例えば、システイン及びリジン残基は、欠失されるか、又は他のアミノ酸残基で置換されるかいずれかである可能性があり、第1の付着部位は、これらタンパク質へ添加することができる。さらには、線毛タンパク質は、修飾形態で発現されるか、又は発現の後に化学的に修飾されるかのいずれかであり得る。同じように、無傷の線毛は細菌から収集し、その後で化学的に修飾することができる。
その他の実施態様では、線毛又は線毛様構造は細菌から収集され、本発明のワクチン組成物を形成するのに用いられる。ワクチン組成物を調製するのに適した線毛の一例は、大腸菌の1型であり、それは、配列番号:146に設定されているアミノ酸配列を有する線毛単量体から形成される。
細菌線毛を収集する多くの方法は、当該分野で知られている。例えば、Bullitt及びMakowski(Biophys. J. 74:623-632(1998))には、大腸菌からP線毛を収集するための線毛精製方法が記載されている。この方法によれば、線毛は、P線毛プラスミドを有する過剰に線毛のある大腸菌から剪断され、可溶化のサイクルとMgCl(1.0M)沈殿によって精製される。同じような精製方法が下の実施例33で設定されている。
一度収集されると、線毛又は線毛様構造は、種々の方法で修飾することができる。例えば、第1の付着部位は、抗原又は抗原決定基が第2の付着部位を介して付着することができる線毛へ添加することが可能である。言い換えると、細菌線毛又は線毛様構造は、収集して非天然分子骨格を形成するように修飾することができる。
線毛又は線毛様構造は、非天然オーガナイザーの非存在下で、抗原又は抗原決定基の付着によっても修飾することができる。例えば、抗原又は抗原決定基は、天然に生じるシステイン残基又はリジン残基と連結させることが可能である。そのような例では、天然に発生するアミノ酸残基の高い秩序及び反復性は、抗原又は抗原決定基のカップリングを線毛又は線毛様構造へと導く。例えば、ヘテロ二価機能性架橋剤を用いて、線毛又は線毛様構造を、抗原又は抗原決定基の第2の付着部位へ連結させることが可能である。
生物体によって天然に合成される構造(例えば、線毛)が、本発明のワクチン組成物を調製するのに用いられる場合、それらが所望する特性を有する構造を産するように、これらの生物体を遺伝子操作することは、しばしば有益なことである。例えば、大腸菌の1型線毛が用いられる場合、これら線毛が収集される大腸菌を、特異的な特徴を有する構造を産するように修飾することが可能である。線毛タンパク質の可能性がある修飾の例には、1又はそれより多いリジン残基の挿入、1又はそれより多い天然に存在するリジン残基の欠失又は置換、そして1又はそれより多い天然に存在するシステイン残基の欠失又は置換が含まれる(例えば、配列番号:146の位置44及び84のシステイン残基)。
さらには、リジン残基以外の第1の付着部位を含有する発現産物を生じる線毛遺伝子へ付加的修飾を施すことが可能である(例えば、FOS又はJUNドメイン)。当然ながら、適切な第1の付着部位は、通常は、本発明のワクチン組成物での利用に適した線毛又は線毛様構造を形成することから線毛タンパク質を妨げないものへ限定されない。
細菌細胞に天然に存在する線毛遺伝子は、インビボで修飾(例えば、相同組み換え)することができるか、又は特定の特徴を有する線毛遺伝子は、これら細胞へ挿入することができる。例えば、線毛遺伝子は、複製可能なクローニングベクター又は細菌の染色体へ挿入するベクターのいずれかの成分として、細菌細胞へ導入することが可能である。この挿入された線毛遺伝子は、発現制御コントロール配列とも連結することができる(例えば、lacオペレーター)。
殆どの例では、本発明のワクチン組成物で用いられる線毛又は線毛様構造は、線毛サブユニットの単一型で構成される。同一のサブユニットで構成される線毛又は線毛構造は、それらが高度に規則正しく繰り返された抗原アレイを示す構造を形成することが期待されるので、通常は用いられる。
しかしながら、本発明の組成物は、異種線毛サブユニットから形成される線毛又は線毛構造を含むワクチンをも含む。これら線毛又は線毛構造を形成する線毛サブユニットは、細菌細胞に天然に存在する遺伝子から発現されることが可能であるか、又は、その細胞へ導入することが可能である。天然に存在する線毛及び導入遺伝子の双方が、線毛又は線毛様構造を形成する細胞で発現される場合、その結果は、通常は、これら線毛タンパク質の混合物から形成される構造である。さらには、2又はそれより多い繊毛遺伝子が細菌細胞で発現する場合、各線毛遺伝子の相対発現は、典型的には、線毛又は線毛様構造の異なる線毛サブユニットの割合を決定する因子である。
混合線毛サブユニットの特定組成物を有する線毛又は線毛様構造が望ましい場合、少なくとも1つの線毛遺伝子の発現は、異種で、誘導可能なプロモーターによって制御することができる。他の遺伝的エレメントだけでなく、そのようなプロモーターは、細菌細胞で生産される異なる線毛サブユニットの相対量を制御に、それ故に、線毛又は線毛様構造の組成物を制御するのに用いることができる。
さらには、殆どの場合、抗原又は抗原決定基が、ペプチド結合ではない結合によって細菌線毛又は線毛様構造と連結している一方で、本発明の組成物に用いられる線毛又は線毛様構造を産する細菌細胞を、抗原又は抗原決定基と融合している線毛タンパク質を生成するように遺伝的に操作することができる。線毛又は線毛様構造を形成するこのような融合タンパク質は、本発明のワクチン組成物での用途に適している。
既に論じたように、ウイルスキャプシドは、(1)表示又は抗原又は抗原決定基、及び(2)本発明のワクチン組成物の調製に用いることが可能である。特に、本発明の実施において有用なのは、ウイルスキャプシドタンパク質であり、それは、ここでは「コートタンパク質」と呼ばれていて、発現によってキャプシド又はキャプシド様構造を形成する。従って、これらキャプシドタンパク質は、コア粒子及び非天然分子骨格を形成することが可能である。一般的に、これらキャプシド又はキャプシド様構造は、抗原又は抗原決定基の表示、及び本発明のワクチン組成物の調製に利用することが可能である。
1又はそれより多い(例えば、1、2、3、4、5、等)抗原又は抗原決定基を、幾つかの数の方法によって、他のタンパク質だけでなく、1又はそれより多いウイルスキャプシド又はキャプシド様構造(例えば、バクテリオファージコートタンパク質)を形成するタンパク質へ付着させることができる。例えば、抗原又は抗原決定基を、第1及び第2の付着部位を利用してコア粒子と付着させることができる。さらには、1又はそれより多い(例えば、1,2,3,4,5等)のヘテロ二価機能性架橋は、ウイルスキャプシド又はキャプシド様構造を形成する1又はそれより多いタンパク質へ抗原又は抗原決定基を付着させるのに利用することができる。
ウイルスキャプシドタンパク質、又はその断片は、例えば、コア粒子及び本発明のワクチン組成物を調製するのに利用することができる。例えば、バクテリオファージQβコートタンパク質は、大腸菌で組み換え的に発現させることが可能である。さらには、これらのキャプシドは、抗原表示及びワクチン組成物の調製に利用することが可能な規則正しく繰り返された抗原又は抗原決定基アレイを形成する。下の実施例38に記載のように、バクテリオファージQβコートタンパク質は、抗原決定基に対する免疫学的応答を誘導するワクチン組成物を調製するのに利用することが可能である。
本発明の組成物を調製するのに利用することが可能な、バクテリオファージコートタンパク質の具体的な例には、RNAバクテリオファージのコートタンパク質、例えば、バクテリオファージQβ(配列番号:159;PIR データベース、Qβ CPを指す寄託番号VCBPQB及び配列番号:217;Qβ A1タンパク質を指す寄託番号AAA16663)、バクテリオファージR17(配列番号:160;PIR寄託番号VCBPR7)、バクテリオファージfr(配列番号:161;PIR寄託番号VCBPFR)、バクテリオファージGA(配列番号:162;GenBank寄託番号NP-040754)、バクテリオファージSP(SP CPを指す配列番号:163;GenBank寄託番号CAA30374及び配列番号:254;SP A1タンパク質を指す寄託番号)、バクテリオファージMS2(配列番号:164;PIR寄託番号VCBPM2)、バクテリオファージM11(配列番号:165;GenBank寄託番号AAC06250)、バクテリオファージMX1(配列番号:166;GenBank寄託番号AAC14699)、バクテリオファージNL95(配列番号:167;GenBank寄託番号AAC14704)、バクテリオファージf2(配列番号:215;GenBank寄託番号P03611)、バクテリオファージPP7(配列番号:253)が含まれる。当該分野の熟練者が認識するであろうように、キャプシド又はキャプシド様構造を形成する任意のタンパク質は、本発明のワクチン組成物の調製に用いることが可能である。さらには、バクテリオファージQβのA1タンパク質、又はそのC末端から100、150又は180アミノ酸ほどを失ったC末端切断形態は、Qβコートタンパク質のキャプシドアセンブリに取り入れられる可能性がある。このA1タンパク質は、また、オーガナイザー、よって、第2の付着部位を含有する抗原の付着のための第1の付着部位へ融合することができる。一般的には、キャプシドアセンブリにおけるQβ CPに相対的なA1タンパク質の百分率は、キャプシド形成のために限定されている。A1タンパク質寄託番号AAA16663(配列番号:217)。
Qβコートタンパク質は、また、大腸菌で発現する場合にキャプシドへ自己アセンブリすることが見出されている(Kozlovska TM.ら, GENE 137:133-137(1993))。得られたキャプシド又はウイルス様粒子は、25nmの直径及びT=3疑似対称を有する正二十面体ファージ様キャプシドを示した。さらには、ファージQβの結晶構造が解析された。このキャプシドは、コートタンパク質の180コピーを含有し、それらは、ジスルフィド架橋によって共有的五量体及び六量体で連結している(Golmohammadi, R.ら, Structure 4:543-5554(1996))。他のRNAファージコートタンパク質は、細菌宿主での発現において自己アセンブリすることも示されている(Kastelein, RA.ら, Gene 23:245-254(1983), Kozlovskaya, TM.ら, Dokl. Akad. Nauk SSSR 287: 452-455(1986), Adhin, MR. ら, Virology 170: 238-242(1989), Ni, CZ., ら, Protein Sci. 5:2485-2493(1996), Priano, C.ら, J. Mol. Biol. 249:283-297(1995))。コートタンパク質の他に、Qβファージキャプシドは、リードスルータンパク質A1と呼ばれるコートタンパク質と、成熟タンパク質A2を含有する。A1は、UGAストップコドンでのサプレッションによって生成され、329aaの長さを有する。本発明で利用されるファージQβ組み換えコートタンパク質のキャプシドは、A2分解タンパク質を欠き、宿主からのRNAを有する。RNAファージのコートタンパク質は、RNA結合タンパク質であり、ウイルスのライフサイクルの間で翻訳レプレッサーとして作用するレプリカーゼ遺伝子のリボゾーム結合部位のステムループと相互作用する。配列及び構造エレメントの相互作用は知られている(Witherell, GW. & Uhlenbeck, OC. Biochemistry 28:71-76(1989);Lim F. ら, J. Biol. Chem. 271: 31839-31845(1996))。ステムループ及びRNAは、一般的に、ウイルスアセンブリに関わっていることが知られている(Golmohammadi, R.ら, Structure 4:543-5554(1996))。
タンパク質又はタンパク質ドメインは、ましてや短いペプチドよりも粒子の構造及びアセンブリに作用し得る。例としては、ジスルフィド結合を含む抗原の適切なフォールディングは、Qβ粒子が発現している大腸菌の細胞質では一般的には不可能である。同じように、グリコシル化は、一般的には、原核生物発現系では不可能である。従って、ここで記載されている考慮された発明にとって、すでにアセンブリした粒子及び単離された抗原で開始することによって、抗原を粒子へ付着させることは有益である。これは、発現宿主での粒子と抗原の双方の発現を可能にし、抗原の適切なフォールディング、及び粒子の適切なフォールディングとアセンブリを保証する。
1又は幾つかの抗原分子が、RNAファージコートタンパク質のキャプシドの1つのサブユニットと付着することができることは、この発明の発見である。RNAファージのコートタンパク質のキャプシド、特にQβキャプシドの具体的な特徴は、従って、サブユニット当たり幾つかの抗原をカップリングさせる可能性である。これは、密度の高い抗原アレイの生成を可能にする。例えば、主要免疫優性領域でのリジン残基によるHBcAg修飾等の化学架橋による抗原の共有的付着に用いた他のウイルス(MIR; WO 00/32227)は、サブユニット当たり最高で0.5抗原のカップリング密度を示す。HBcAgのスパイクの間の距離(MIRに一致する)は、50Aであり(Wynne, SA.ら, Mol. Cell 3:771-780(1999))、従って、50Aよりも短い距離の抗原アレイは生成できない。
Qβコートタンパク質のキャプシドは、その表面に明かな数のリジン残基を表示し、それらは、キャプシドの内部へ伸びる3つのリジン残基による明確なトポロジーを有し、4つの他のリジン残基がキャプシドの外部へ露出している。これらの明確な特性は、粒子の外部への抗原の付着を好むが、リジン残基がRNAと相互作用する内部への付着は好まない。他のRNAファージコートタンパク質のキャプシドも、その表面上に明確な数のリジン残基とこれらリジン残基の明確なトポロジーを有している。RNAファージに由来するキャプシドのその他の利点は、細菌における高発現生産であり、それは、手頃なコストでの大量の物質生産を可能にする。
Qβコートタンパク質のキャプシドのその他の特徴は、その安定性にある。Qβサブユニットは、互いにジスルフィド結合を介して結合していて、サブユニットを共有的に連結させている。Qβキャプシドタンパク質は、有機溶媒と変性剤に対して通常ではない耐性も示す。驚いたことに、我々は、30%と同じ濃度のDMSO及びアセトニトリル、そして1Mと同じ濃度のグアニジウム濃度は、キャプシドの抗原アレイを形成する安定性又は能力に影響を与えずに利用できることを見出した。従って、有機溶媒は、疎水的特性を連関させるために利用することができる。Qβコートタンパク質の高度な安定性は、特に、哺乳動物及びヒトの免疫化及びワクチン接種のためのその用途に関する重要な特徴である。キャプシドの有機溶媒に対する耐性は、水溶性緩衝液に溶解しない抗原のカップリングを可能にする。
RNAファージMS-2のコートタンパク質のN末端βヘアピンへのシステイン残基の挿入は、特許出願米国/5,698,424号に記載されている。しかしながら、キャプシドでの露出した遊離システイン残基の存在は、ジスルフィド架橋形成によるキャプシドのオリゴマー形成につながる。特許出願米国/5,698,424号で考慮されている他の付着には、その抗原とQβ粒子の間のジスルフィド架橋の形成が含まれる。そのような付着は、スルフヒドリル基を有する分子に対して不安定である。
Qβ上のcys残基で形成された最初のジスルフィド架橋と遊離のスルフヒドリル残基を有する抗原との間の反応によって、抗原以外にスルフヒドリルを有する種が遊離する。これら新規に形成されたスルフヒドリル含有種は、粒子上にある他のジスルフィド架橋と反応し、それによって平衡状態を達成している。粒子上に形成されているジスルフィド架橋との反応によって、抗原は、粒子のcys残基と、又は粒子上の最初のジスルフィド架橋を形成した脱離基分子のcys残基のいずれかとジスルフィド架橋を形成することができる。さらには、一方の側のQβ粒子上のシステインと、そして他の側の抗原上のリジン残基と反応するヘテロ二価機能性架橋試薬を利用した、記載されている付着の他の方法は、粒子上への抗原のランダムな配向につながる。
我々は、さらに、Qβ及びFrコートタンパク質のキャプシドとは対照的に、特許出願米国特許/5,698,424号に記載の組み換え体MS-2は、核酸がまったくなく、その一方で、RNAは、上記の2つのキャプシドの内側にパッケージされいる。
我々は、変化する抗原密度を有する丈夫な抗原アレイの形成を可能にする新規で本発明の組成物を記載する。我々は、通常に他のVLPsで得られるよりも、より高いエピトープ密度が達成できることを示した。我々は、また、適切な間隔による幾つかの抗原の同時表示を有する組成物、及び適切で所望される方法で可溶性を高めるか、又はキャプシドを修飾する、付属分子の付加である組成物を開示する。
高いエピトープ密度を有するRNAファージコートタンパク質のキャプシドの組成物の調製は、この出願に開示されている。当該分野の熟練者が知りうるように、規則正しく繰り返された抗原アレイのアセンブリの条件は、殆どの部分が抗原及び抗原上の第2の付着部位の選択に依存する。有用な第2の付着部位が存在しない場合、そのような二番目の付着は、抗原へ操作されるべきである。
第2の付着部位を設計するための前提条件は、それが融合され、挿入され、又は普遍的に操作されるべき位置の選択である。熟練者は、第2の付着部位の位置を選択することの手引きをどのように見出すのかを知っているであろう。抗原の結晶構造は、分子のC又はN末端の利用可能性に関する情報か、又は、システイン残基のような第2の付着部位としての用途に適した残基の溶媒への曝露に関する情報を提供することができる。一般的に、穏和な還元によって単一のシステイン残基へ変換されることが可能であることから、Fab断片のような、露出したジスルフィド架橋も第2の付着部位の起源となり得る。一般的に、自己免疫による免疫化が、この自己抗原とその天然リガンドとの相互作用を阻害することを目的としている場合、天然リガンドとの相互作用の部位に対する抗体の生成を可能にするように、第2の付着部位は添加される。従って、第2の付着部位の位置は、第2の付着部位又はそれを含有する任意のアミノ酸リンカーによる立体障害が避けられるように選択される。さらなる実施態様では、自己抗原の天然リガンドとの相互作用部位とは異なる部位へ向けられた抗体応答が所望される。そのような実施態様では、第2の付着部位は、自己抗原の天然リガンドとの相互作用部位に対する抗体の生成を妨げるように選択することができる。
第2の付着部位の位置を選択するための他の基準には、抗原のオリゴマー形成状態、オリゴマー形成の部位、補因子の存在、そして、抗原の修飾が自己抗原の機能又は自己抗原を認識する抗体の生成と適合する場合の、抗原構造及び配列の部位を開示する実験的証拠の利用可能性が含まれる。
ある実施態様では、抗原上への第2の付着部位の操作は、本発明の開示に記載の第2の付着部位として適したアミノ酸を有するアミノ酸リンカーの融合を必要とする。好ましい実施態様では、このアミノ酸はシステインである。アミノ酸リンカーの選択は、自己抗原、その生化学的特性、例えば、pI、負荷分布、グリコシル化の性質に依存する。アミノ酸リンカーの例としては、免疫グロブリンのヒンジ領域、グリシン セリンリンカー(GGGGS)、及びグリシンリンカー(G)であり、すべてはさらに第2の付着部位としてシステイン残基、そして場合によっては、さらにグリシン残基を有する。(次のものは、前記アミノ酸リンカーの例である
N末端ガンマ1:CGDKTHTSPP
C末端ガンマ1:DKTHTSPPCG
N末端ガンマ3:CGGPKPSTPPGSSGGAP
C末端ガンマ3:PKPSTPPGSSGGAPGGCG
N末端グリシンリンカー:GCGGGG
C末端グリシンリンカー:GGGGCG)
ペプチドについては、ペプチドのC末端のGGCGリンカー、又はそのN末端のCGGは、有用であることが示されている。一般的に、グリシン残基は、かさ高いアミノ酸と第2の付着部位として利用されるシステインの間に挿入される。
抗原のVLPsへの付着で特に好まれる方法、特に、RNAファージコートタンパク質のキャプシドは、RNAファージコートタンパク質のキャプシドの表面上のリジン残基を抗原上のシステイン残基へ連結させることである。第2の付着部位として効果的あるためには、スルフヒドリル基がカップリングにとって利用可能であるべきである。従って、システイン残基は、その還元状態にあるべきであり、遊離のスルフヒドリル基を有する遊離のシステイン又はシステイン残基が利用可能でなければならない。システイン残基が第2の付着部位として機能する場合は酸化状態であり、例えば、それがジスルフィド架橋を形成するならば、例えば、DTT、TCEP又はβ-メルカプトエタノールによるこのジスルフィド架橋の還元が必要である。
RNAファージコートタンパク質のキャプシド上のエピトープ密度が、架橋剤及び他の反応条件の選択によって調節することができることは、この出願の発見である。例えば、架橋剤であるスルホ-MBS及びSMPHは、同じ反応条件下での架橋剤スルホ-MBSよりもより高いエピトープ密度に達することを可能にする。誘導体化は、高濃度の反応物によってポジティブに影響を受け、反応条件の操作は、RNAファージキャプシドタンパク質、特にQβキャプシドタンパク質とカップリングしている抗原の数のコントロールに利用することができる。
理論的な計算からは、最も高く達成可能な17kDaの大きさの球状タンパク質抗原の数は、0.5を越えない。従って、Qβコートタンパク質のキャプシドの幾つかのリジン残基は、抗原を欠いているが、架橋剤分子によって誘導体化される。これは、ポジティブ電荷の消失につながり、それは、コンジュゲートの可溶性及び安定性にとって有害であり得る。幾つかのリジン残基をアルギニンで置換することによって、それは、開示されたQβコートタンパク質変異体の場合であり、アルギニン残基が架橋剤と反応しないために、我々は、ポジティブ電荷の過度の消失を防ぐ。
さらなる実施態様では、我々は、抗原の高密度アレイを得ることに適した、付加的なリジン残基を有するQβ変異体コートタンパク質を開示する。
幾つかのRNAバクテリオファージの結晶構造が決定されている(Golmohammadi, R. ら, Structure 4:543-554(1996))。そのような情報を利用して、当該分野の熟練者は、表面に露出した残基を容易に同定し、1又はそれより多い活性アミノ酸残基を挿入することが可能なように、バクテリオファージコートタンパク質を修飾することができる。従って、当該分野に熟練した者は、本発明の実施に利用することが可能なバクテリオファージコートタンパク質の修飾型を容易に作製して同定することができる。従って、キャプシド又はキャプシド様構造を形成するタンパク質の変異体(例えば、バクテリオファージQβのコートタンパク質、バクテリオファージR17、バクテリオファージfr、バクテリオファージGA、バクテリオファージSP、及びバクテリオファージMS2)は、本発明のワクチン組成物を調製するのにも利用することができる。
上で論じた変異体タンパク質の配列は、その対応する野生型とは異なるが、これら変異体タンパク質は、一般的に、キャプシド又はキャプシド様構造を形成する能力を保持する。従って、本発明は、さらに、キャプシド又はキャプシド様構造を形成するタンパク質の変異体を有するワクチン組成物、並びにそのようなワクチン組成物を調製する方法、そしてこれらタンパク質サブユニットをコードする核酸分子を含む。従って、本発明の範囲内に含まれるのは、規則正しく繰り返された抗原アレイを形成し、結合してキャプシド又はキャプシド様構造(例えば、キャプシド又はキャプシド様構造を形成するタンパク質の変異体)を形成する能力を保持する野生型の変異体型である。
結果として、本発明は、さらに、配列アレイを形成する野生型タンパク質と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%、又は99%同一であるアミノ酸配列を含むか、又は代わって、それで構成されるタンパク質を含むワクチン組成物を含む。多くの例では、これらタンパク質は、加工されてシグナルペプチドが除かれる(例えば、異種シグナルペプチド)。
さらに、本発明の範囲内に含まれるのは、本発明のワクチン組成物を調製するのに利用されるタンパク質をコードする核酸分子である。
特定の実施態様では、本発明は、さらに、配列番号:159-167に示す任意のアミノ酸配列と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%、又は99%同一であるアミノ酸配列、及び適切である場合には、N末端リーダー配列を取り除くように加工されたこれらタンパク質の形態を含むか、又はそれに代わってそれらで構成されるタンパク質を含むワクチン組成物を含む。
本発明の実施に用いるのに適したタンパク質は、キャプシド又はキャプシド様構造を形成するタンパク質のC末端切断変異体、並びに他の配列アレイをも含む。そのような切断変異体の具体例には、1,2,5,7,9,10,12,14,15,又は17アミノ酸がC末端から取り除かれた配列番号:159-167のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質が含まれる。通常、本発明の実施に用いられるC末端切断変異体は、キャプシド又はキャプシド様構造を形成する能力を保持する。
本発明の実施に用いるのに適したさらなるタンパク質には、キャプシド又はキャプシド様構造を形成するタンパク質のN末端切断変異体も含まれる。そのような切断変異体の具体的例には、1,2,5,7,9,10,12,14,15,又は17アミノ酸がN末端から取り除かれた配列番号:159-167のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質が含まれる。通常は、本発明の実施に用いられるN末端切断変異体は、キャプシド又はキャプシド様構造を形成する能力を保持する。
本発明の実施に用いるのに適した付加的なタンパク質には、キャプシド又はキャプシド様構造を形成するC末端切断変異体が含まれる。適切な切断変異体には、1,2,5,7,9,10,12,14,15,又は17アミノ酸がN末端から取り除かれ、及び1,2,5,7,9,10,12,14,15,又は17アミノ酸がC末端から取り除かれた配列番号:159-167のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質が含まれる。通常は、本発明の実施に用いられるN末端及びC末端切断変異体は、キャプシド又はキャプシド様構造を形成する能力を保持する。
本発明には、さらに、上で論じた切断変異体と、少なくとも80%、85%、90%、95%、97%、又は99%同一であるアミノ酸配列を含むか、又は代わってそれで構成されるタンパク質を含むワクチン組成物を含む。
本発明には、従って、配列アレイを形成するタンパク質から調製されるワクチン組成物、個々のタンパク質サブユニットからワクチン組成物を調製する方法、これら個々のタンパク質サブユニットを調製する方法、これらサブユニットをコードする核酸分子、そして、本発明のワクチン組成物を用いて、個体をワクチン接種及び/又は免疫応答を刺激する方法が含まれる。
B.第2の付着部位による抗原又は抗原決定基の構築
本発明の組成物の二番目のエレメントは、少なくとも1つの非ペプチド結合を介した非天然分子骨格の第1の付着部位への結合が可能な、少なくとも1つの第2の付着部位を有する抗原又は抗原決定基である。本発明は、所望する治療効果の考慮において選択された抗原又は抗原決定基に従って変化する組成物を提供する。他の組成物は、第2の付着部位のために選択した分子を変化させることによって提供される。
しかしながら、細菌線毛、又は線毛様構造、線毛タンパク質が本発明のワクチン組成物を調製するのに利用される場合、抗原又は抗原決定基を、線毛/抗原融合タンパク質の発現によって線毛タンパク質へ付着することが可能である。同じように、線毛タンパク質以外のタンパク質(例えば、ウイルスキャプシドタンパク質)が本発明のワクチン組成物を調製するのに利用される場合、抗原又は抗原決定基を、非線毛タンパク質/抗原融合タンパク質の発現によって、これら非線毛タンパク質へ付着させることができる。抗原又は抗原決定基も、細菌線毛、線毛様構造、線毛タンパク質、及び非ペプチド結合を介して配列アレイを形成する他のタンパク質へ付着させることができる。
本発明の抗原は、次から成る群から選択することができる:(a)癌細胞に対する免疫応答を誘導するのに適したタンパク質;(b)感染症に対する免疫応答を誘導するのに適したタンパク質;(c)アレルギーに対する免疫応答を誘導するのに適したタンパク質、(d)家畜の免疫応答を誘導するのに適したタンパク質、及び(e)(a)-(b)に設定されたいずれかの断片(例えば、ドメイン)。
本発明の1つの特定の実施態様では、抗原又は抗原決定基は、感染症の予防に有用なものである。そのような治療は、幅広い宿主、例えば、ヒト、畜牛、羊、豚、犬、猫、他の哺乳動物種及び非哺乳動物種等に冒す様々な感染症を治療するのに有用である。治療可能な感染症は、当該分野の熟練者には良く知られており、その例には、ウイルス病因、例えばHIV、インフルエンザ、ヘルペス、ウイルス性肝炎、EBウイルス、ポリオ、ウイルス性脳炎、水痘等;又は細菌病因の感染、例えば肺炎、結核、梅毒等;又は寄生虫病因の感染、例えばマラリア、トリパノソーマ症、レーシュマニア症、トリコモナス症、アメーバ症等が含まれる。従って、本発明の組成物のために選択した抗原又は抗原決定基は、医学分野の者にとって良く知られている;抗原又は抗原決定基の例には次のものが含まれる:HIV抗原gp140及びgp160;インフルエンザ抗原赤血球凝集素。M2タンパク質及びノイラミニダーゼ、B型肝炎表面抗原、マラリアのスポロゾイト周囲タンパク質。
特定の実施態様では、本発明は、「自己」遺伝子産物(例えば、腫瘍壊死因子)によって生じるか、又は悪化する疾患又は症状を予防及び/又は弱める方法で用いる適切なワクチン組成物を提供する。従って、本発明のワクチン組成物は、「自己」遺伝子産物によって生じるか、又は悪化する疾患又は症状を予防及び/又は弱める抗体の生産につながる組成物を含む。そのような疾患又は症状の例には、移植片対宿主病、IgE媒介アレルギー反応、アナフィラキシー、成人呼吸窮迫症候群、クローン病、アレルギー喘息、急性リンパ性白血病(ALL)、非ホジキンリンパ腫(NHL)、グレーブス病、全身性エリテマトーデス(SLE)、炎症性自己免疫疾患、重症筋無力症、免疫増殖性疾患リンパ節腫脹(IPL)、血管免疫増殖性リンパ節腫脹(AIL)、免疫芽細胞性リンパ節症(IBL)、リウマチ様関節炎、糖尿病、多発性硬化症、アルツハイマー病及び骨粗鬆症が含まれる。
関連する特定の実施態様では、本発明の組成物は、アレルギー又は癌の治療に用いることが可能な免疫療法剤である。
組成物調製及びアレルギーの治療法に用いる抗原又は抗原決定基の選択は、そのような疾患を治療する医学分野の熟練者に知られている。そのような抗原又は抗原決定基の代表例は次を含む:ハチ毒ホスホリパーゼA、Bet v I(カバノキ花粉アレルゲン)、5 Dol m V(白いススメバチアレルゲン)、メリチン及びDer pI(ハウスダストダニアレルゲン)、並びに免疫学的応答を誘発するのに利用できる各断片。
示されているように、好ましい抗原又は抗原決定基はDer pIである。Der pIは、ハウスダストダニ糞便粒子に見出された25kDのプロテアーゼである。Der pIは、ハウスダストダニの主要なアレルギー性分子である。従って、ダニアレルギー性患者の80%が抗Der pI IgE抗体を有する。特に、他の中でペプチドp52-72及びp117-133は、天然Der pIに対して特異的な抗体によって認識されるエピトープを含むことが知られている。全抗原に対するポリクローナル応答で産生させたIgE抗体は、高親和性によって、ペプチド領域59-94と結合する(L. Pierson-Mullanyら(2000) Molecular Immunology)。他の領域も、高い親和性でIgEと結合する。ペプチドp117-133はN末端に遊離のシステインを有し、それは、好ましくは、本発明に基づいて第2の付着部位を示す。3Dモデルによって、全タンパク質の表面にペプチドp52-72及びp117-133が付けられる。しかしながら、Der pIタンパク質の他の断片は、好ましくは本発明にとって適したB細胞エピトープを含む可能性がある。
組成物及び癌の治療法のための抗原又は抗原決定基の選択は、そのような疾患を治療する医学分野の熟練者に知られているであろう。そのような型の抗原又は抗原決定基の代表的な例には、次の物が含まれる:Her2(乳癌)、GD2(神経芽細胞腫)、CEA(延髄甲状腺癌)、及びCD52(白血病)、ヒトメラノーマタンパク質 gp100、ヒトメラノーマタンパク質melan-A/MART-1、チロシナーゼ、NA17-A nt タンパク質、MAGE-3タンパク質、p53タンパク質、HPV16 E7タンパク質、並びに免疫学的応答を誘発するのに用いる各断片が含まれる。癌ための組成物及び治療法に有用な、さらに好ましい抗原決定基は、血管形成に関わる分子及び抗原決定基である。新しい血管の形成である血管形成は、生理学的及び病理学的プロセス、例えば創傷治癒及び固形腫瘍成長の各々において必須の役割を担う(Folkman, J. (1995) Nat. medicine 1, 27-31;Folkman, J., 及びKlagsbrun, M.(1987) Science 235, 442-446;Martiny-Baron, G., 及びMarme, D. (1995) Curr. Opin. Biotechnol. 6, 675-680;Risau, W. (1997) Nature 386, 671-674)。急速な生育腫瘍は、必要な血液供給を提供する血管の形成で始まって、それに依存する。従って、抗血管形成剤は、抗癌療法として効果的である。
同定された幾つかの推定血管形成因子の中で、今のところ、血管内皮成長因子(VEGF)は、潜在的な内皮細胞特異的分裂促進因子であり、多くの固形腫瘍の血管新生の主要な刺激物である。最近の発見によって、血管形成因子の一組が完全に組織化して機能性血管を形成することが示唆されたが、単一の成長因子の遮断でさえも、疾患誘導血管成長を制限することができる。従って、VEGFの遮断は、腫瘍誘導血管形成を遮るための最高の標的であり得る。腫瘍そのものよりも内皮細胞を標的とすることは、腫瘍と取り組むための新しい戦略である(Millauer, B., Shawver, L. K., Plate, K. H., Risau, W., 及びUllrich, A.(1994) Nature 367, 576-579; Kim, J., Li, B., Winer, J., Armanini, M., Gillett, N., Phillip, H. S., Ferrara, N. (1993) Nature 362, 841-844)。免疫系によって容易に認識される変異標的構造である腫瘍とは対照的に、内皮細胞は、通常は、免疫系又は他の治療法から逃れることはできない。
抗VEGFR-II抗体(IMC-1C11)及び抗VEGF抗体が開示されている(Lu, D., Kussie, P., Pytowski, B., Persaud, K., Bohlen, P., Witte, L., Zhu, Z. (2000) J. Biol. Chem. 275, 14321-14330; Presta, L. G, Chen, H., O'Conner, SJ., Chisholm, V., Meng, YG., Krummen, L., Winkler, M., Ferrara N. (1997) Cancer Res. 47, 4593-4599)。以前の中和化モノクローナル抗VEGFR-2抗体は、推定VEGF/VEGFR-II結合部位として同定されたエピトープを認識する(Piossek, C., Schneider-Mergener, J., Schiner, M., Vakalopoulou, E., Germeroth, L., Thierauch, K.H.(1999) J Biol Chem. 274, 5612-5619)。
従って、本発明のその他の好ましい実施態様では、抗原又は抗原決定基は、VEGFR-II接触部位に由来するペプチドである。これは、本発明に基づいた組成物及びワクチン組成物を提供し、それらは、癌の治療に有用な抗血管形成特性を有する可能性がある。VEGFR-2に特異的な血清を用いたマウスにおける腫瘍成長の阻害が立証されている(Wei, YQ., Wang, QR., Zhao, X., Yang, L., Tian, L., Lu, Y., Kang, B., Lu, CJ., Huang, MJ., Lou, YY., Xiao, F., He, QM., Shu, JM., Xie, XJ., Mao, YQ., Lei, S., Luo, F., Zhou, LQ., Liu, CE., Zhou, H., Jiang, Y., Peng, F., Yuan, LP., Li, Q., Wu, Y., Liu, JY. (2000) Nature Medicine 6, 1160-1165)。従って、本発明に基づく本発明の組成物及び抗血管形成ワクチン組成物にとって適した更に好ましい抗原決定基は、配列CTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKのヒトVEGFR-II由来ペプチド、及び/又は配列CTARTELNVGLDFTWHSPPSKSHHKKを有するマウスVEGFR-II由来ペプチド、及び/又はVEGFR-IIの細胞外球状ドメイン1-3のいずれかを含む。
従って、本発明の好ましい実施態様では、ワクチン組成物は、本発明に基づく抗原又は抗原決定基としての、ウイルス様粒子又は細菌線毛、及びVEGFR-II由来ペプチド又はその断片を含む。
自己抗原と関連した他の疾患又は症状のための治療の組成物及び方法のための抗原又は抗原決定基の選択は、そのような疾患を治療する医学分野の熟練者にも知られている。そのような抗原又は抗原決定基の代表的な例は、例えば、リンホトキシン(例えば、リンホトキシンα(LTα)、リンホトキシンβ(LTβ))、及びリンホトキシンレセプター、核因子kBリガンドのレセプターアクチベーター(RANKL)、血管内皮成長因子(VEGF-R)、インターロイキン-5、インターロイキン-17、インターロイキン-13、CCL21、CXCL12、SDF-1、MCP-1、エンドグリン(Endoglin)、レジスチン (Resistin)、GHRH、LHRH、TRH、MIF、エオタキシン(Eotaxin)、 ブラジキニン (Bradykinin) 、BLC、腫瘍壊死因子α及びアミロイドベータペプチド(Aβ1−42)(配列番号:220)、並びに免疫学的応答を誘発することに利用できるそれぞれの断片である。好ましい実施態様では、抗原はアミロイドベータペプチド(Aβ1−42)(DAEFRHDSGYEVHHQKL VFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(配列番号:220))、又はその断片である。このアミロイドベータタンパク質は、配列番号:219である。
本発明のその他の好ましい実施態様では、抗原又は抗原決定基は、アンギオテンシンペプチド又はその断片である。ここで用いられる用語「アンギオテンシンペプチド」は、アンジオテンシノーゲン、アンギオテンシンI又はアンギオテンシンIIの配列、又はその断片を含む任意のペプチドを包含するべきである。その配列は次の通りである:アンジオテンシノーゲン:DRVYIHPFHLVIHN;アンギオテンシンI:DRVYIHPFHL;アンギオテンシンII:DRVYIHPF。典型的には、1又はそれより多くの付加的なアミノ酸が、アンギオテンシンペプチド配列のC末端又はN末端のいずれかに添加される。アンギオテンシンペプチドの配列は、マウスの配列に同一なヒト配列と一致する。従って、本発明に基づいた抗原決定基としてのアンギオテンシンペプチドを含む、ワクチン又は組成物の各々によるヒト又はマウスの免疫化は、自己抗原に対するワクチン接種である。これら付加的なアミノ酸は、特に、コア粒子への方向付けられていて秩序だった結合にとって価値がある。
好ましくは、アンギオテンシンペプチドは、a)CGGDRVYIHPFのアミノ酸配列;b)CGGDRVYIHPFHLのアミノ酸配列;c)DRVYIHPFHLGGCのアミノ酸配列;及びd)CDRVYIHPFHのアミノ酸配列から成る群より選択されるアミノ酸配列を有する。
アンギオテンシンIは、腎臓由来の酵素レニンによってアンジオテンシノーゲン(14aa)から切断される。それは、さらに、生物学的に活性な8aaのアンギオテンシンIIへと、アンギオテンシン変換酵素(ACE)によってN末端が切断される。このペプチドは、血管収縮及びアルドステロン遊離へつながるアンギオテンシンレセプターATII及びAT2へ結合する。
少なくとも1つのアンギオテンシンペプチドを含む本発明に基づくワクチンは、高血圧の治療に利用することができる。
本発明の特定の実施態様では、(a)HIVの組み換えタンパク質、(b)インフルエンザウイルスの組み換えタンパク質(例えば、インフルエンザウイルスM2タンパク質又はその断片)、(c)C型肝炎ウイルスの組み換えタンパク質、(d)トキソプラズマの組み換えタンパク質、(e)熱帯マラリア原虫の組み換えタンパク質、(f)3日熱マラリア病原虫の組み換えタンパク質、(g)卵形マラリア原虫の組み換えタンパク質、(h)四日熱マラリア原虫の組み換えタンパク質、(i)乳癌細胞の組み換えタンパク質、(j)腎臓癌細胞の組み換えタンパク質、(k)前立腺癌細胞の組み換えタンパク質、(l)皮膚癌細胞の組み換えタンパク質、(m)脳癌細胞の組み換えタンパク質、(n)白血病細胞の組み換えタンパク質、(o)組み換え体プロファイリング、(p)ハチアレルギーの組み換えタンパク質、(q)木の実アレルギーの組み換えタンパク質、(r)食物アレルギーの組み換えタンパク質、(s)喘息の組み換えタンパク質、(t)クラミジアの組み換えタンパク質、そして(u)(a)-(t)に設定した任意のタンパク質の断片から成る群から選択される。
一度、組成物の抗原又は抗原決定基が選択されると、少なくとも1つの第2の付着部位が、本発明の非天然分子骨格と結合している組織化された反復性アレイを構築するのに調製している分子へ添加されてもよい。何が適切な第2の付着部位を構成するのかという知見は、当該分野の熟練者にとって知られている。第2の付着部位の代表的な例には、限定されるものではないが、次のものが含まれる:抗原、抗体又は抗体断片、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、レセプター、レセプターリガンド、リガンド、リガンド結合タンパク質、相互作用ロイシンジッパーポリペプチド、アミノ基、アミノ基と反応する化学基;カルボキシ基、カルボキシ基と反応する化学基、スルフヒドリル基、スルフヒドリル基と反応する化学基、又はその組み合わせ。
第1及び第2の付着部位の間の結合は、少なくとも1つの非ペプチド結合を含むが、選択したそれぞれの分子の特徴によって確かめられる。第1及び第2の付着部位の組み合わせによって、結合の性質は、共有、イオン性、疎水性、極性、又はその組み合わせであってもよい。
本発明の1つの実施態様では、第2の付着部位は、FOSロイシンジッパータンパク質ドメイン又はJUNロイシンジッパータンパク質ドメインであり得る。
本発明のより特定の実施態様では、選択される第2の付着部位は、FOSロイシンジッパータンパク質ドメインであり、それは、本発明の非天然分子骨格のJUNロイシンジッパータンパク質ドメインと特異的に結合する。JUNとFOSロイシンジッパータンパク質ドメインの結合は、骨格の表面上の組織化した反復性の抗原又は抗原決定基アレイの形成の基礎を提供する。FOSロイシンジッパータンパク質ドメインは、望ましいならば、タンパク質のアミノ末端、カルボキシ末端又は内部のいずれかに位置する選択した抗原又は抗原決定基とフレーム単位で融合し得る。
幾つかのFOS融合コンストラクトは、模範的に提供されている。ヒト成長ホルモン(実施例4)、ハチ毒ホスホリパーゼA(PLA)(実施例9)、オボアルブミン(実施例10)及びHIV gp140(実施例12)。
FOS融合コンストラクトを単純化するために、幾つかのベクターが、抗原又は抗原決定基の設計及び構築に関する選択を提供するように開示されている(実施例6を参照せよ)。ベクターpAV1-4を、大腸菌におけるFOS融合物の発現のために設計した;ベクターpAV5及びpA6を、真核細胞におけるFOS融合タンパク質の発現のために設計した。これらベクターの目的は、手短に記載されている:
1.pAV1:このベクターは、C末端でFOSと融合したタンパク質の大腸菌細胞膜周辺腔への分泌のために設計された。対象である遺伝子(g.o.i)を、ベクターのStuI/NotI部位にライゲーションしてもよい。
2.pAV2:このベクターは、N末端でFOSと融合したタンパク質の大腸菌細胞膜周辺腔への分泌のために設計した。対象である遺伝子(g.o.i)を、ベクターのNotI/EcoRV(又はNotI/HindIII)部位にライゲーションした。
3.pAV3:このベクターは、大腸菌における、C末端でFOSと融合したタンパク質の細胞質生産のために設計した。対象である遺伝子(g.o.i)を、ベクターのEcoRV/NotI部位にライゲーションしてもよい。
4.pAV4:このベクターは、大腸菌における、N末端でFOSと融合したタンパク質の細胞質生産のために設計した。対象である遺伝子(g.o.i)を、ベクターのNotI/EcoRV(又はNotI/HindIII)部位にライゲーションしてもよい。N末端メチオニン残基は、タンパク質合成の際にタンパク質分解されて取り除かれた(Hirelら., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8247-8251(1989))。
5.pAV5:このベクターは、C末端でFOSと融合したタンパク質の真核生物での生産のために設計された。対象である遺伝子(g.o.i)は、ベクターEco47III/NotI部位へのライゲーションによって、hHGシグナル配列とFOSドメインをコードする配列の間に挿入されてもよい。それに代わって、そのシグナル配列を含有する遺伝子を、StuI/NotI部位へのライゲーションによってFOSコード化領域へ融合させてもよい。
6.pAV6:このベクターは、N末端でFOSと融合したタンパク質の真核生物での生産のために設計された。対象である遺伝子(g.o.i)を、ベクターのNotI/StuI(又はNotI/HindIII)部位へライゲーションさせてもよい。
当該分野に熟練した者によって理解されているように、FOS抗原又は抗原決定基融合タンパク質の構築には、組み換えタンパク質の産生が促進されるように、ある遺伝的因子の添加が含まれてもよい。実施例4には、翻訳のためのある大腸菌制御因子の添加に関する手引きが提供され、実施例7は、真核生物シグナル配列の添加に関する手引きが提供されている。他の遺伝的因子は、実施者の具体的な必要性に依存して選択されてもよい。
本発明は、細菌(実施例5)又は真核生物細胞(実施例8)のいずれかにおける、FOS抗原又はFOS抗原決定基融合タンパク質の産生を含むとも考えられる。融合タンパク質を発現する細胞型の選択は、熟練者の知識の範囲内にあり、翻訳後修飾は組成物の設計において重要な考慮点であるのか否か等の要因に依存する。
前出のように、本発明は、pAVベクターの利用による、FOS抗原又はFOS抗原決定基融合タンパク質の構築に関する種々の方法を開示する。原核生物及び真核生物発現を可能にすることの他に、これらのベクターは、実施者が、FOSロイシンジッパータンパク質ドメインの抗原へNとC末端の間を加えることを選択することを可能にする。具体的例として、N末端及びC末端FOS融合物がPLA(実施例9)及びオボアルブミン(実施例10)で生成されることが提供されている。実施例11は、PLA及びオボアルブミンFOS融合タンパク質の精製を示している。
より具体的な実施例では、本発明は、HIVゲノムによってコードする抗原又は抗原決定基に関する。より具体的には、HIV抗原又は抗原決定基はgp140である。実施例11-15で提供しているように、HIVgp140は、FOSロイシンジッパータンパク質、及び本発明の非天然分子骨格との付着のために合成及び精製した融合タンパク質によって生成することができる。当該分野の熟練者が知っているように、他のHIV抗原又は抗原決定基は、本発明の組成物の作製に用いることができる。
その他のより具体的な実施例では、本発明は、少なくともインフルエンザウイルス核酸によってコードされている1つの抗原又は抗原決定基を含むワクチン組成物、そして免疫応答を刺激するためのそのようなウイルス組成物の用途に関する。さらにより具体的な実施例では、このインフルエンザ抗原又は抗原決定基は、M2タンパク質であってもよい(例えば、配列番号:213、GenBank寄託番号P06821、又は配列番号:212、PIR寄託番号MFIV62に示すアミノ酸配列を有するM2タンパク質、又はその断片(例えば、配列番号:213のアミノ酸約2から24、配列番号:212のアミノ酸配列)。さらには、インフルエンザ抗原又は抗原決定基は、ペプチド又は非ペプチド結合のいずれかを介する非然分子骨格又はコア粒子とカップリングする可能性がある。インフルエンザ抗原又は抗原決定基が、ペプチド結合を介して非然分子骨格又はコア粒子とカップリングする場合、規則正しく繰り返されたアレイを形成する分子は、通常は、融合タンパク質発現産物として調製される。しかしながら、より好ましい実施態様は、M2ペプチドが、本発明の開示に基づいて、化学架橋によってQβキャプシドタンパク質HBcAgキャプシドタンパク質又は線毛とカップリングしている組成物である。
免疫応答が求める他のタンパク質だけでなく、本発明で利用するのに適したM2タンパク質の一部分(例えば、配列番号:213のアミノ酸配列を有するM2タンパク質)は、典型的には、少なくとも6アミノ酸長(例えば、ペプチド6,7,8,9,10,12,15,18,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95,又は97アミノ酸長)であるが、任意のアミノ酸長のペプチドを含むか、又は代わって、それで構成されてもよい。
本発明のその他の具体的実施態様では、選択される第2の付着部位は、本発明の非天然分子骨格又はコア粒子のリジン残基と特異的に結合するシステイン残基であるか、又は、選択される第2の付着部位は、本発明の非天然分子骨格又はコア粒子のリジン残基と特異的に結合するリジン残基である。リジン残基(Lys)とシステイン残基(Cys)の化学架橋は、骨格又はコア粒子の表面上での組織化した反復性抗原又は抗原決定基アレイの形成に関する基礎を提供する。システイン又はリジン残基は、アミノ末端、カルボキシ末端又は所望されるならばタンパク質の内部に位置するかのいずれかに、選択した抗原又は抗原決定基はフレーム単位で操作されるてもよい。例としては、PLA2及びHIV gp140は、リジン残基の第1の付着部位への架橋のためにシステイン残基によって提供されている。さらなる具体的な実施態様では、本発明は、アレルギー反応、例えばアナフィラキシーにつながるアレルギー反応を予防及び/又は弱める方法で利用するのに適したワクチン組成物を提供する。従って、本発明のワクチン組成物は、アレルギー反応を予防及び/弱める抗体の生産につながる組成物を含む。従って、ある実施態様では、本発明のワクチン組成物には、アレルギーに対する免疫応答を誘発する組成物が含まれる。そのようなアレルギーの例には、ホスホリパーゼ、例えばセイヨウミツバチ(Apis mellifera )(配列番号:168、GenBank寄託番号443189;配列番号:169、GenBank寄託番号229378)、オオミツバチ(Apis dorsata)(配列番号:170、GenBank寄託番号B59055)、トウヨウミツバチ(Apis cerana)(配列番号:171、GenBank寄託番号A59055)、マルハナバチ(Bombus pennsylvanicus)(配列番号:172 GenBank寄託番号B56338)、及びアメリカドクトカゲ(Heloderma suspectum )(配列番号:173、GenBank寄託番号P80003;寄託番号:174、GenBank寄託番号S14764;配列番号:175、GenBank寄託番号226711)のホスホリパーゼA(PLA)が含まれる。
例図として、セイヨウミツバチ(Apis mellifera )(配列番号:168)のPLAタンパク質のアミノ酸配列を用いて、全PLA 配列の任意の部分を示す、少なくとも約60アミノ酸長のペプチドを、また、アレルギー反応を予防及び/又は弱める組成物に用いることができる。そのようなペプチドの例には、配列番号:168のアミノ酸1-60、配列番号:168のアミノ酸1-70、配列番号:168のアミノ酸10-70、配列番号:168のアミノ酸20-80、配列番号:168のアミノ酸30-90、配列番号:168のアミノ酸40-100、配列番号:168のアミノ酸47-99、配列番号:168のアミノ酸50-110、配列番号:168のアミノ酸60-120、配列番号:168のアミノ酸70-130、又は配列番号:168のアミノ酸のアミノ酸90-134を含むペプチド、並びに他のPLAタンパク質の対応する部分(例えば、上記のPLAタンパク質)が含まれる。そのようなペプチドのさらなる例には、配列番号:168のアミノ酸1-10、配列番号:168のアミノ酸5-15、配列番号:168のアミノ酸10-20、配列番号:168のアミノ酸20-30、配列番号:168のアミノ酸30-40、配列番号:168のアミノ酸40-50、配列番号:168のアミノ酸50-60、配列番号:168のアミノ酸60-70、配列番号:168のアミノ酸70-80、配列番号:168のアミノ酸80-90、配列番号:168のアミノ酸90-100、配列番号:168のアミノ酸100-110、配列番号:168のアミノ酸110-120、又は配列番号:168のアミノ酸120-130、並びに他のPLAタンパク質の対応する部分(例えば、上記のPLAタンパク質)が含まれる。
本発明での用途に適した、PLAの部分、並びに免疫応答が求められる他のタンパク質の部分は、典型的には、少なくとも6アミノ酸長(例えば、ペプチド6,7,8,9,10,12,15,18,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95,又は100アミノ酸長)のペプチドを含むか、又は代わって、それで構成されてもよい。
PLAペプチド(例えば、上記の完全長PLAタンパク質、並びに各サブ部分)も、規則正しく繰り返された抗原アレイの形成を可能にする任意の基質(例えば、その断片のQβキャプシドタンパク質)とカップリングすることができる。
本発明のその他の側面では、本発明は、「自己」遺伝子産物によって生じるか、又は悪化する症状を治療すること及び/又は予防することに、特に適した組成物を提供する。
本発明の好ましい実施態様では、抗原決定基はRANKL(NFκBリガンドのレセプターアクチベーター)である。RANKLは、TRANCE(TNF関連活性化誘導サイトカイン)、ODF(破骨細胞分化因子)又はOPGL(破骨細胞形成阻害因子リガンド)としても知られている。ヒトRANKLの細胞外部分のアミノ酸配列は、配列番号:221(RANKL_ヒト:TrEMBL:O14788)に示されている一方で、ヒトアイソ型のアミノ酸配列は、配列番号:222に示されている。マウスRANKLの細胞外部分及びアイソ型に関する配列は、それぞれ配列番号:223(RANKL_マウス:TrEMBL:O35235)、及び配列番号:224(RANKL_マウス スプライス型:TrEMBL:Q9JJK8及びTrEMBL:Q9JJK9)に示されている。
RANKLが破骨細胞形成にとって必須因子であることが示されている。RANKLのそのレセプターRANKとの相互作用の阻害は、破骨細胞形成の抑制につながり、それによって骨粗鬆症及び他の症状にみられるような過度の骨吸収を止める手段を提供する可能性がある。RANKL/RANK相互作用は、RANK-Fc融合タンパク質又は破骨細胞形成阻害因子OPGと呼ばれるRANKLの可溶性おとりレセプターによるいずれかで阻害された。
免疫系では、RANKが抗原提示細胞上に見出される一方で、RANKLはT細胞で発現される。RANKL-RANK相互作用は、CD40-L非依存性Tヘルパー細胞活性にとって重要であり(Bachmannら., J. Exp. Med. 7: 1025(1999))、樹状細胞の寿命とアジュバンド特性を高めることが示されている(Josienら., J Exp Med. 191:495(2000))。
骨では、RANKが破骨細胞前駆体で発現する一方で、RANKLは間質細胞又は骨芽細胞で発現する。RANKとRANKLの相互作用は、破骨細胞前駆体の成熟破骨細胞への発生にとって重要である。この相互作用は、破骨細胞形成阻害因子によって阻止される可能性がある。
OPG依存性マウスは、組み換えOPGの注入によってレスキューされることが可能な骨粗鬆症を発生する。これは、OPGが骨粗鬆症を破棄することが可能であることを意味している。従って、本発明のこの具体的な実施態様の注入によって、RANK-RANKL相互作用の阻害は、骨粗鬆症を破棄することができる。
さらに、OPGの注入によって破棄することができるOPGノックアウトマウスにおいて、動脈石灰化が観察された(Minら., J. Exp. Med. 4: 463 (2000))。アジュバンド誘導による関節炎では、OPG注入は、骨損失及び軟骨破壊を防ぐことができるが、炎症(手(足)の腫れ)を防ぐことはできない。活性化T細胞がRANKL媒介による破骨細胞形成及び骨損失につながると考えられている。OPGは、マウスの骨において、前立腺癌誘導破骨細胞形成を阻害し、前立腺腫瘍の成長を防ぐ。OPGは、マウスにおける、進行した骨癌の痛みを消失させる。
RANKLは、TNFスーパーファミリーに属する245aaの膜貫通タンパク質である。細胞外領域(178aa)の一部分は、TACE様プロテアーゼによって消させることが可能である(Lumら., J Biol Chem. 274: 13613(1999))。さらに、膜貫通ドメインを欠くスプライス変異体が記載されている(Ikedaら., Endocrinology 142: 1419(2001))。消失した部分は、可溶性TNF-αとの相同性が高いドメインを有する。RANKLのこの細胞外ドメインは、TNF-αに見られるホモ三量体を形成する。C末端は、三量体接触部位に関わっていると思われる。1つのシステインが、配列のこの領域に存在する。
我々は、RANKLの対応する領域の3次元構造に関するモデルを構築し、フォールディング構造では、本発明の第1の付着部位上の担体との相互作用にとって、天然に存在するシステインは接触可能ではない可能性があることを見出した。N末端は、アミノ酸リンカーを含む第2の付着部位をさらなるシステイン残基へ付着させることにとって好ましい。RANKLの細胞外ドメイン部分と融合したシステイン残基を有するN末端アミノリンカーを持つヒトRANKLコンストラクトは、本発明の非常に好ましい実施態様である。しかしながら、第2の付着部位としてシステイン残基を有し、RANKL配列又はRANKLの細胞外部分のC末端で融合しているアミノ酸リンカーは、本発明のさらに好ましい実施態様につながる。
配列番号:320に同定されているようなヒトRANKLコンストラクトは、実施例6に開示されている教示に従って作製され、当該分野の熟練者は、ヒトRANKLの配列の一部分を同定して実施例6に記載されているベクターへクローンするために、タンパク質配列アライメントでマウスとヒトRANKL配列を比較することができる。アミノ酸138-317を有し、ヒトRANKLの細胞外ドメインのC末端領域と一致する断片は、本発明の特に好ましい実施態様であり、本発明の教示に基づいて必須とされるVLPs及び線毛へのカップリングのために修飾することが可能である。しかしながら、他の適切なベクターを、下に記載の適切な宿主での発現のためにも利用することができる。さらには、ヒトRANKLコンストラクト、特に、細胞外領域の部分(178aa)、又はTACE様プロテアーゼによって消失することが可能なその断片(Lumら., J Biol Chem. 274:13613(1999))、又は膜貫通ドメインを欠く選択的スプライシング変異体と一致する配列、並びにその保存的断片は、本発明の範囲内に含まれるように意図されている。アミノ酸165-317を含むヒトC末端断片も、本発明の実施態様である。あるいは、全細胞外領域(アミノ酸71-317)を含み、本発明の教示に基づいて必須とされるVLPs及び線毛へのカップリングのために修飾することが可能な断片も、本発明の範囲内にある。
RANKLは、異なる系(大腸菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞)で発現されて活性であることが示され、従って、幾つかの発現系を、組成物の抗原の産生のために利用することができる。タンパク質の発現が大腸菌のペリプラズムに方向付けられる場合、RANKL、又はタンパク質の細胞外部分から成るRANKLコンストラクトのシグナルペプチド、及び本発明に基づいて第2の付着部位を含むように修飾された可能性のある双方を、細菌シグナルペプチドによって置き換える。大腸菌の細胞質でのタンパク質の発現のために、RANKLコストラクトからシグナルペプチドを除いた。
本発明のその他の好ましい実施態様では、抗原決定基は、MIF又はその断片である。MIFは、その機能はマクロファージ遊走の阻害であるとして1966年に最初に記載された。それは、後期型早期応答タンパク質6(DER6)、グリコシル化阻害因子又はフェニルピルビン酸トートメラーゼとしても知られている。後の方の名称は、MIFの酵素的活性に由来するが、その内在基質はまだ同定されていない。
MIFが、幅広い症状に関係していることが示された。MIF(mRNA及びタンパク質)は、ツベルクリンによって誘導される遅延型過敏症(DTH)反応でアップレギュレーションされ、抗MIF抗体は、このDTH反応を阻害する。MIFは、また、腎臓の同時移植の拒絶反応でアップレギュレーションされている。眼球の自己免疫疾患のモデルでは、実験用自己免疫ブドウ膜網膜炎(EAU)、抗MIF治療は、EAUの発症の遅延を生じせしめた。患者では、MIFの血清の増加があり、それは、また、ベーチェット病患者及び虹彩毛様体炎で苦しむ患者の場合にもある。MIFに対する免疫化は、リュウマチ様関節炎に対する治療の方法を提供し得る。
高血清MIF濃度は、アトピー性皮膚炎の患者に見出された。皮膚損傷では、MIFは、コントロールされている基底細胞層に見出されたのに代わって広く発現している。MIF濃度は、ステロイド治療の後で減少し、炎症でのMIFの役割と一致する。MIFは、糸球体腎炎の発症に貢献していることも見出されている。抗MIF抗体で治療した動物は、顕著な糸球体腎炎の減少を示す。MIFは、例えばLPS刺激によって下垂体から誘導、分泌され、そして内毒素血症を増強する。従って、組み換えMIFが腹膜炎の致死率を顕著に高める一方で、抗MIFmAbは、内毒素血症及び敗血性ショックを阻害する。MIFは、サイトカイン産生のグルココルチコイド誘導モジュレーターでもあり、炎症を促進する。
MIFは、T細胞(Th2)によって産生され、T細胞の増殖を支え、そして、抗MIF治療は、T細胞増殖とIgGレベルを低下させる。多発性硬化及びニューロベーチェット症患者の脳脊髄液には、MIF濃度の増加がみられる。高いMIFレベルは、長引く乾癬の患者の血清にも見出された。高いMIFレベルが潰瘍性大腸炎患者の血清には見られたが、クローン病患者には見出されなかった。
高いMIFのレベルは、気管支喘息の患者の血清に見出された。MIFは、また、リュウマチ関節炎の滑膜でアップレギュレーションされている。抗MIF療法は、マウス及びラットモデルのリュウマチ関節炎を効果的に減少させた(Mikulowskaら., J. Immunol. 158:5514-7(1997);Leechら., Arthritis Rheum. 41:910-7(1998), Leechら. Arthritis Rhem. 43:827-33(2000)、Santosら., Clin. Exp. Immunol. 123:309-14(2001))。従って、MIFを抗原決定基として含む組成物を利用する、MIF活性を阻害するために方向付けられた治療法は、上記の症状にとって有益であり得る。
マウス、ラット及びヒトからのMIFは、配列番号:225(MIF_ラット:SwissProt)、配列番号:226(MIF_マウス:SwissProt)及び配列番号:227(MIF_ヒト:SwissProt)に示すように、114のアミノ酸から成り、3つの保存されたシステインを有する。これらのサブユニットは、ジスルフィド結合では安定化されないホモ三量体を形成する。幾つかの文献はジスルフィド結合の存在を主張したが、そのX線構造が解析され、3つの遊離のシステインを示した(Sunら., PNAS 93:5191-96(1996))。にもかかわらず、担体上に存在する可能性な第1の付着部位との最適相互作用のために十分に曝露しているシステインは無い。従って、タンパク質のC末端が三量体構造で露出されると、ラットMIFに関して実施例4に例示的に記載されているように、本発明のこの好ましい実施態様の第2の付着部位の生成のために、遊離のシステイン残基を有するアミノ酸リンカーは、好ましくはタンパク質のC末端に添加される。
マウスとラットMIFの間では、1つのアミノ酸のみの変化があり、同じように、ヒトとラットMIF、又はヒトとマウスMIFの間に非常に高い配列相同性(約90%配列同一性)がある。本発明に記載のヒト及びマウスMIFコンストラクトが記載されていて、実施例4に開示されているように作製することが可能である。本発明に基づいたコア粒子と結合しているMIFタンパク質、又はその断片の自己特異的免疫応答を誘導する高い潜在力を示すため、Qβキャプシドタンパク質とカップリングさせたラットMIFコンストラクトをマウスへ注入した。ラットMIFで免疫化したマウスによって得られた高い抗体力価は、自己抗原による免疫化に対する寛容性は、ウイルス様粒子、特にQβキャプシドタンパク質とカップリングしているMIFコンストラクトによる免疫化によって克服したことを示す(実施例4)。従って、コア粒子、好ましくは線毛又はウイルス様粒子、そしてより好ましくはRNAファージのウイルス様粒子、さらにより好ましくはRNAファージQβ又はfrと結合しているヒトMIFタンパク質を含む本発明に基づく組成物は、本発明の非常に好ましい実施態様を示す。
しかしながら、MIFの配列のN末端に加えられた遊離システインを有するアミノ酸リンカーは、本発明のさらに好ましい実施態様につながる。MIFは大腸菌で発現され、完全に機能することが示された(Bernhagenら., Biochemistry 33: 14144-155(1994))。従って、MIFを、好ましくは、本発明の好ましい実施態様を作製するための大腸菌で発現してもよい。
開始メチオニンがコンストラクトから切断されていないのならば、MIFのトートメラーゼ活性は阻害される。大腸菌で発現し、実施例4に記載のMIFコンストラクトは、トートメラーゼ活性を示す。開始メチオニンが切断されていて、配列中の開始メチオニン直後のプロリン残基がアラニンへ変異しているMIFの変異体もトートメラーゼ活性を示さず、このようなMIFの変異体は本発明のさらなる実施態様を示し、本発明の範囲内に含まれるように意図されている。ある特定の実施態様では、トートメラーゼ活性を欠くMIF変異体による免疫化が考察される。
本発明のその他の好ましい実施態様では、抗原決定基は、インターロイキン-17(IL-17)である。ヒトIL-17は、33kDaで、ジスルフィド結合があり、多様なグリコシル化を有するホモ二量体である(Yao, Z. ら, J. Immunol. 155:J.5483-5486(19959;) Fossiez, F.ら., Exp. Med. 183: 2593-2603(1996))。このタンパク質は155のアミノ酸を含み、19-23残基のN末端分泌シグナル配列を含む。IL-17のアミノ酸配列は、ヘルペスウイルスタンパク質(HSV13)のみに類似していて、他のサイトカイン又は既知のタンパク質とは類似していない。ヒトIL-17のアミノ酸配列は、配列番号:228(寄託番号#:AAC50341)に示されている。マウスタンパク質配列は、配列番号:229(寄託番号#:AAA37490)に示されている。評価された多くの組織及び細胞株では、IL-17をコードするmRNA転写物は、活性化T細胞及びホルボール12-ミリスチン酸 13-アセテート/イオノマイシン-刺激末梢血単核細胞のみで検出された(Yao, Z.ら, J. Immunol 155:5483-5486(1995);Fossiez, F. ら, J. Exp. Med. 183: 2593-2603(1996))。ヒト及びマウス配列の双方は、6つのシステイン残基を有する。
IL-17のレセプターは、多くの組織及び細胞型で幅広く発現している(Yao, Z. ら, Cytokine 9:794-800(1997))。ヒトIL-17レセプター(866aa)のアミノ酸配列からは、一本鎖膜貫通ドメイン及び525aa長の細胞内ドメインが予想されるが、レセプター配列は独特であり、サイトカイン/成長因子レセプターファミリーの任意のレセプターの配列とは類似していない。IL-17それ自体の他の既知のタンパク質との類似性の欠如に加えて、これは、IL-17及びそのレセプターがシグナル伝達タンパク質及びレセプターの新規ファミリーの一部分であり得ることを示している。臨床研究は、IL-17が多くの炎症疾患に関わっている可能性があることを示している。IL-17は、リウマチ様関節炎患者の滑膜T細胞によって分泌され、炎症メディエーターの産生を刺激する(Chabaud, M. ら, J. Immunol. 161: 409-414(1998);Chabaud, M. ら, Arthritis Rheum. 42: 963-970(1999))。高レベルのIL-17が、リウマチ様関節炎の患者で報告されている(Ziolkowska M.ら, J Immunol. 164:2832-8(2000))。
インターロイキン17は、マウス膝関節のプロテオグリカン分解への作用を有し(Dudler J. ら, Ann Rheum Dis. 59: 529-32(2000))、滑膜マトリックスの破壊に寄与する(Chabaud, M. ら, Cytokine. 12:1092-9(2000))。MIFに対する免疫化の効果を試験するための動物では、関連する関節炎モデルがある(Chabaud, M. ら, Cytokine. 12:1092-9(2000))。IL-17 mRNAの上昇したレベルが、多発性硬化症の患者の単核球に見出された(Matusevicius, D.ら, Mult. Scler. 5:101-104(1999))。上昇したIL-17の血清のレベルが、全身性紅斑性狼瘡エリテマトーデスに冒されている患者で観察された(Wong C.K. ら, Lupus 9: 589-93(2000))。さらには、IL-17 mRNAのレベルは、損傷性の乾癬性皮膚から単離されたT細胞で上昇している(Teunissen, M. B. ら, J. Invest. Dermatol. 111: 645-649(1998))。
腎臓移植片の拒絶におけるIL-17の関与も示されている(Fossies F. ら, Int. Rev. Immunol. 16:541-51(1998))。臓器の同種移植の拒絶反応におけるIL-17の役割に関する証拠は、IL-17が樹状突起細胞前駆体の機能分化を促進することを示したAntonysamyら(J. Immunol. 162: 577-84(1999))によっても示された。これらの発見は、DCsに対する成熟誘導効果を介して一部分は媒介される可能性のある、同種T細胞増殖におけるIL-17に関する役割を示唆する。さらには、同じグループは、インターロイキン17の拮抗効果が慢性ではなくて急性血管拒絶を阻害する、急性血管拒絶の免疫病因におけるIL-17の役割を報告している(Tang J.L.ら, Transplantation 72:348-50(2001))。IL-17は、同種移植の拒絶反応における治療的処置のための新しい標的としての可能性を有すると思われる。
上の発見は、IL-17が炎症反応の開始又は維持において中心的な役割を担う可能性があることを示唆している(Jovanovic, D. V.ら, J. Immunol. 160: 3513-3521(1998))。
抗IL-17モノクローナル抗体mAb5(Schering-Plough Research Institute)は、50ng/mlのIL-17による誘導後のリウマチ様関節炎(RA)滑膜の上清からのIL-6の産生を、完全に阻害することができる。関連のないmAb MX1は、このアッセイでは何の効果もなかった。mAb5は、ヒトrIL-17(r=組み換え体)による免疫化後に得られたマウスIgG1である。mAb5の1μg/mlの濃度は、このアッセイ系におけるIL-6産生を完全に阻害することができる(Chabaud, M.ら, J. Immunol. 161:409-414(1998))。従って、IL-17に対する免疫化は、上記の種々の症状に関する治療方法を提供する。
本発明のその他の好ましい実施態様では、従って、組成物は、第2の付着部位を有し、組み換えIL-17のC末端と融合しているリンカーを含む。本発明のさらに好ましい実施態様では、しかしながら、遊離システインを有するアミノ酸リンカーは、加工されたタンパク質の配列に一致する配列のN末端へ融合されるか、又は、シグナルペプチドのC末端側である成熟型タンパク質の配列のN末端に挿入される。真核生物発現系については、ここで示された他の自己抗原に関する場合のように、IL-17遺伝子のシグナルペプチドは、必要ならば、その他のシグナルペプチドによって置換されてもよい。細菌での発現については、シグナルペプチドは、ペリプラズムでの可溶性発現のために細菌のシグナルペプチドで置換するか、又は細胞質での発現のために欠失されるかのいずれかである。シグナルペプチドを欠くヒトIL-17のコンストラクトは、好ましくは、残基24-155、22-155、21-155又は20-155を含む。シグナルペプチドを欠くマウスIL-17のコンストラクトは、好ましくは、残基26-158、25-158、24-158又は27-155を含む。ヒトIL-17は、CV1/EBNA細胞で発現することが可能である;組み換えhIL-17は、グリコシル化及び非グリコシル化形態の双方で分泌されることが示された(Yao, Z.ら, J. Immunol. 155: 5483-5486(1995))。IL-17は、また、後の融合タンパク質からのIL-17タンパク質の切断をともなう、hIL-17/Fc融合タンパク質として発現されることが可能である。IL-17は、酵母ピキア・パストリス(Pichia pastoris)でも発現させることができる(Murphy K.P.ら., Protein Expr Purif. 12: 208-14(1998))。ヒトIL-17は、大腸菌でも発現させることができる。大腸菌でのIL-17の発現がペリプラズムへ方向付けられた場合、IL-17のシグナルペプチドは、細菌シグナルペプチドによって置き換えられる。大腸菌の細胞質でのタンパク質の発現については、IL-17コンストラクトは、シグナルペプチドを欠く。
本発明のその他の好ましい実施態様では、抗原決定基はインターロイキン13(IL-13)である。IL-13は、活性化Tリンパ球によって分泌され、最初に単球、マクロファージ、そしてB細胞に作用するサイトカインである。前駆体ヒトIL-13のアミノ酸配列は、配列番号:230に示されており、加工されたヒトIL-13のアミノ酸配列は、配列番号:231に示されている。前駆体タンパク質の最初の20のアミノ酸は、シグナルペプチドと一致し、加工タンパク質が存在しない。マウス配列も記載されており、その加工アミノ酸配列は、配列番号:232に示されている(Brown K.D.ら, J. Immunol. 142:679-687(1989))。発現宿主によっては、IL-13コンストラクトは、例えば、真核宿主での発現及び分泌ための前駆体タンパク質の配列を含むか、又は、例えば、大腸菌での細胞質発現ための成熟タンパク質で構成されるかである。大腸菌のペリプラズムでの発現については、IL-13のシグナルペプチドは、細菌のシグナルペプチドによって置換される。
IL-13は、最近、アレルギー性気道応答(喘息)に関係していることが示されたTヘルパー2誘導サイトカイン(IL-4、IL-5のような)である。IL-13及びIL-13レセプターのアップレギュレーションは、多くの腫瘍の型で見出されている(例えば、ホジキンリンパ腫)。インターロイキン13は、ホジキン及びリード・シュテルンベルグ細胞の成長によって分泌され、それらを刺激する(Kapp Uら., J Exp Med. 189: 1939-46(1999))。従って、IL-13に対する免疫化は、他の中で、喘息又はホジキンリンパ腫等の上記の症状を治療する方法を提供する。
好ましくは、組成物は、遊離システイン残基を有し、成熟IL-13のN又はC末端と融合してタンパク質へ第2の付着部位を導入するアミノ酸リンカーを含む。さらに好ましい実施態様では、遊離システインを有するアミノ酸リンカーを、IL-13のNMR構造によると自由に接触可能であることから、IL-13の成熟型のN末端に加える(Eisenmesser, E.Z.ら, J. Mol. Biol. 310: 231(2001))。再び、さらに好ましい実施態様では、遊離システインを有するアミノ酸リンカーは、加工されたタンパク質の配列と一致する配列のN末端に融合しているか、又は、シグナルペプチドのC末端側であるタンパク質の成熟型の配列のN末端へ挿入されている。さらなる好ましい実施態様では、遊離システイン残基を有するアミノ酸リンカーを、タンパク質のC末端へ加える。
IL-13は、大腸菌(Eisenmesser E.Z.ら, Protein Expr. Purif. 20:186-95(2000))、又は、NS-0細胞(真核生物細胞株)で発現させる(Cannon-Carlson S.ら, Protein Expr. Purif. 12:239-48(1998))。実施例9は、細菌及び真核生物宿主における、システイン残基を有するアミノ酸リンカーへ融合したマウスIL-13のコンストラクト及びコンストラクトの発現を記載する。ヒトIL-13コンストラクトは、実施例9の教示に基づいて作製し、融合タンパク質の発現後にタンパク質ヒトC-IL-13-F(配列番号:330)及びヒトC-IL-13-S(配列番号:331)を産し、Xa因子及びエンテロキナーゼをそれぞれ切断することができる。このように作製されたタンパク質は、VLPs及び線毛とカップリングすることが可能であり、このことは、本発明の好ましい実地態様へつながる。
本発明さらにその他の実施態様では、抗原決定基は、インターロイキン5(IL-5)である。IL-5は、好酸球(eosinophilopoiesis)のための架橋特異的サイトカインであり、喘息のように、好酸球の数の増加関連している疾患において重要な部分を担う。前駆体及び加工されたヒトIL-5の配列は、配列番号:233及び配列番号:234にそれぞれ提供されていて、加工マウスのアミノ酸配列は、配列番号:235に示されている。
IL-5の生物学的機能は、幾つかの研究で示されており(Coffman R.L.ら, Science 245: 308-10(1989);Kopfら, Immunity 4:15-24(1996))、それらは、好酸球を介して媒介される疾患でのIL-5機能を阻害することの有益な効果に関する。IL-5の作用の阻害は、従って、喘息及び好酸球に関連する他の疾患に対する治療方法を提供する。
IL-5は、ジスルフィド架橋で共有結合する二量体を形成する。IL-5の2つの単量体がペプチドリンカーによって連結している、一本鎖(sc)コンストラクトが報告されている。
本発明の好ましい実施態様では、遊離システインを有するペプチドリンカーが、IL-5の加工形態の配列のN末端に加えられている。遊離システインを有するリンカーの付加は、また、好ましくは、scIL-5の加工形態の配列のN末端で予見される。さらに好ましい実施態様では、遊離システインを有するアミノ酸リンカーは、加工タンパク質の配列に一致する配列のN末端へ融合しているか、又は、シグナルペプチドのC末端側でタンパク質の成熟型の配列のN末端に挿入されている。
再びさらなる好ましい実施態様では、遊離システインを有するリンカーは、IL-5の配列のC末端か、又はscIL-5配列のC末端へ融合している。
IL-5に関する多くの発現系が記載されていて、本発明の組成物を調製するのに利用することができる。大腸菌を利用した細菌発現系が、Proudfootら,(Biochem J. 270:357-61(1990))によって記載されている。大腸菌の細胞質でIL-5が発現している場合、IL-5コンストラクトはシグナルペプチドを欠いている。昆虫細胞は、本発明の組成物を作製するためのIL-5コンストラクトを産するのにも利用することが可能である(Pierrot C.ら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 253: 756-60(1998))。同様に、バキュロウイルス発現系(sf9細胞;Ingley E.ら, Eur. J. Biochem. 196: 623-9(1991)及びBrown P. M. ら, Protein Expr. Purif 6: 63-71(1995))も利用することができる。最終的には、哺乳動物発現系も報告されており(CHO細胞)、これらを本発明の組成物を調製することに利用することが可能である(Kodama Sら, J. Biochem. (Tokyo)110:693-701(1991))。
バキュロウイルス発現系(Mitchellら, Biochem. Soc. Trans. 21:332S(1993);Kunimoto DYら, Cytokine 3: 224-30(1991))及びCHO細胞を利用した哺乳動物細胞発現系(Kodama Sら, Glycobiology 2:419-27(1992))が、マウスIL-5に関して記載されている。
実施例10は、IL-5配列が、そのN末端で、VLPs及び線毛とのカップリングのために、システイン残基を有するアミノ酸リンカーと融合している、マウスIL-5コンストラクトの発現を記載している。ヒトコンストラクトは、実施例10の教示に基づいて作製することが可能であり、VLPs及び線毛へのカップリングに適しており、本発明の好ましい実施態様につながるタンパク質ヒトC-IL-5-E(配列番号:335)、ヒトC-IL-5-F(配列番号:336)及びヒトC-IL-5-S(配列番号:337)を産することが可能である。
本発明のその他の好ましい実施態様では、抗原決定基はCCL-21である。CCL-21は、小さな誘導可能なサイトカインA21として、エクソダス-2として、SLD(二次リンパ球サイトカイン)として、TCA4(胸腺由来走化性剤4)又は6Cカイン(6Ckine)としても知られているCCサブファミリーのケモカインである。
CCL21は、造血を阻害し、胸腺細胞、活性化T細胞及び樹状細胞の走化性を刺激するが、B細胞、マクロファージ又は好中球を刺激しない。それは、天然のT細胞への差別的な活性を示す。それは、強力なメサンギウム細胞化学遊走物質でもある。CCL21は、ケモカインレセプターCCR7及びCXCR3へ結合する(種に依存する)。それは、生理学的切断下で循環するリンパ球のインテグリン依存性の迅速な静止を誘引することが可能であり、高内皮細静脈によって高発現する。
マウスCCL21は、ヒト肺癌SCIDマウスモデルの腫瘍及び血管形成(Arenbergら, Cancer J. Immnol. Immunother. 49: 587-92(2001))、及びマウスの結腸癌腫瘍モデル(Vicariら, Immunol. 165:1992-2000(2001))を阻害する。マウスCCL21の血管形成活性は、ラット角膜マイクロポケットアッセイでも検出された(Sotoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8205-10(1998))。
ケモカインレセプターCCR7及びCXCR4は、乳癌細胞ではアップレギュレーションされており、それぞれのリガンドであるCCL21及びCXCL12は、乳癌転移の最初の目標を示す臓器で高発現している(Mullerら Nature 410:50-6(2001))。インビトロでのCCL21媒介走化性は、それぞれの抗体によりCXCR4-媒介走化性が阻害されたのと同様に、抗CCL21抗体を中和することによって阻止することが可能である。従って、CCL21に対する抗体は、癌、より具体的には乳癌で広がる転移に対する治療方法を提供する。
分泌されるCCL21は、マウス及びヒトのそれぞれで110又は111aaで構成されている。それぞれの配列は、配列番号:236(Swissprot:SY21_ヒト)及び配列番号:237(Swissprot:SY21_マウス)に示されている。他のCCサイトカインとは対照的に、CCL21は、伸張領域内のC末端にさらに2つのシステインを有する。すべてのシステインがジスルフィド結合に関わっていると考えられる。
以下では、CCL21抗原決定基を含む本発明の組成物を作製するための、コンストラクト及び発現系が記載されている。相同性タンパク質エオタキシン(eotaxin)のNMR構造では、N及びC末端の双方が溶媒へ露出している。ある具体的な実施態様では、第2の付着部位として遊離のシステイン残基を有するアミノ酸リンカーは、タンパク質のC末端に加えられる。アルカリホスファターゼとの融合タンパク質(CCL21のC末端)が発現されて、CCL21のC末端での融合が、レセプター結合と互換性があることを示して、機能性であることが示された。他の具体的な実施態様では、遊離システインを有するアミノ酸リンカーは、加工タンパク質の配列に一致する配列のN末端と融合しているか、又は、シグナルペプチドのC末端であるタンパク質の成熟型の配列のN末端に挿入されている。
幾つかの発現系が、CCL21の産生に関して記載されている(例えば、Hedrickら, J Immunol. 159: 1589-93(1997))。例えば、それは、バキュロウイルス系で発現させてもよい(Nagiraら, J. Biol. Chem. 272: 19518-24(1997))。
関連する好ましい実施態様では、抗原決定基は、現在はCXCL21と呼ばれているストローマ由来因子-1(SDF-1)である。CXCL21は、骨髄ストローマ細胞によって産生されるケモカインであり、最初は、プレB細胞の刺激因子として同定された。
上ですでに論じたように、ケモカインレセプターCCR7及びCXCR4は、乳癌細胞ではアップレギュレーションされており、それぞれのリガンドであるCCL21及びSDF-1は、乳癌転移の最初の目標を示す臓器で高発現している(Mullerら Nature 410:50-6(2001))。インビトロでのSDF-1/CXCR4媒介走化性は、抗SDF-1及び抗CCL21抗体を中和することによって阻害することが可能である。
ヒトMDA-MB-231乳癌細胞株を用いたSCIDマウスの乳癌転移モデルでは、マウスを抗CXCR4抗体で治療した場合に、肺転移の顕著な減少が観察された。流入領域リンパ節では、鼠蹊部及び腋窩リンパ腺への転移の減少(コントロールの100%転移に代わって38%)が観察された。従って、CXCL12に対する免疫化は、癌、より具体的には乳癌の転移に対する治療方法を提供する。
SDF-1/CXCR4ケモカインレセプター対は、より初期の造血性前駆体細胞の骨髄への帰巣の効率を高めることが示されている。さらには、CXCR4及びSDF-1は、慢性リンパ球性白血病細胞の分布に影響すると予想されている。これらの細胞は、患者の骨髄へつねに侵入しており、骨髄でのそれらの遊走がCXCR4に依存することが示された。慢性リンパ球性白血病細胞は、ストローマ細胞と同時培養されないならば、アポトーシスを起こす。SDF-1阻止抗体は、ストローマ細胞のこの保護的効果を阻害することができる(Burgerら, Blood 96:2655-63(2000))。従って、CXCL12に対する免疫化は、慢性リンパ球性白血病に対する治療法を提供する。
CXCR4は、HIVのT細胞への侵入のためのコーレセプターであるとことが示されている。SDF-1は、X4(CXCR4-依存性)HIV株によるCD4+細胞の感染を阻害する(Oberlinら, Nature 382: 833-5(1996);Bleulら, Nature 382:829-33(1996),Rusconiら, Antivir. Ther. 5:199-204(2000))。SDF-1の合成ペプチド類似体は、CXCR4レセプターを介するHIV-1侵入及び感染を効果的に阻害することが示されている(国際公開第59928A1号)。従って、CXCL21に対する免疫化は、T細胞でのHIV侵入を阻止する方法、よってAIDSを治療する方法を提供する。
SDF-1-CXCR4相互作用がリウマチ様関節炎滑膜でのCD4+T細胞蓄積で中心的な役割を担うことも報告されている(Nankiら, 2000)。SDF-1に対する免疫化は、従って、リウマチ様関節炎に対する治療方法を提供する。
ヒト及びマウスSDF-1は、1つの遺伝子からデファレンシャルスプライシングによって、SDF-1α及びSDF-1βの2つの形態を生じることが知られている。それらは、SDF-1β(74aa)に存在し、SDF-1α(70aa)には存在しない4つのC末端アミノ酸において異なる。ヒトの配列は、配列番号:238(Swissprot:SDF1_ヒト)に示され、マウスSDF-1の配列は、配列番号:239(Swissprot:SDF1_マウス)に示されている。SDF-1は、2つの分子内ジスルフィド結合を形成する4つの保存システインを含む。SDFの結晶構造は、非共有結合二量体を示している(Dealwisら, PNAS 95: 6941-46(1998))。SDF-1構造は、また、長いN末端伸張を示す。
アラニンスキャンニング突然変異誘発は、SDF-1上のレセプター結合部位(その一部分)を同定するのに利用され(Ohnishiら, J. Interferon Cytokine Res. 20:691-700(2000))、Elisseevaら(J. Biol. Chem. 275:26799-805(2000))及びHevekerら(Curr. Biol. 8: 369-76(1998))は、レセプター結合(及びHIV侵入)を阻害するSDF-1由来ペプチドを記載している。
以下においては、SDF-1に関連する本発明の組成物の作製にとって適したコンストラクト及び発現系を記載している。SDF-1のN及びC末端が、溶媒に露出している。具体的な実施態様では、第2の付着部位として遊離のシステインを有するアミノ酸リンカーは、タンパク質配列のC末端へ融合しているが、その一方で、他の具体的な実施態様において、第2の付着部位として遊離のシステインを有するアミノ酸リンカーがタンパク質配列のN末端へ融合している。遊離のシステインを有するアミノ酸リンカーは、加工タンパク質の配列に一致する配列のN末端と融合しているか、又は、シグナルペプチドのC末端側でタンパク質の成熟型の配列のN末端に挿入されている。これら特異的コンストラクトをコードする遺伝子を、適切な発現ベクターへクローニングすることができる。
ニワトリ胎児線維芽細胞におけるセンダイウイルス系でのSDF-1の発現(Moriyaら, FEBS Letter. 425: 105-11(1998))は、大腸菌での発現(Holmesら, Prot. Expr. Purif. 21:367-77(2001))及びSDF-1の化学合成(Dealwisら, PNAS 95:6941-46(2001))と同じように記載されている。
本発明のさらにその他の実施態様では、抗原決定基はBLCである。Bリンパ球化学遊走物質(BLC、CXCL13)は、脾臓、パイエル板及びリンパ腺で発現している(Gunnら, 1998)。その発現は、胚中心で最も強いが、B細胞は、体細胞成熟及び親和性成熟を起こす。それは、CXCケモカインファミリーに属し、その最も近い相同体はGROα_である(Gunnら, Narture 391: 799-803(1998))。ヒトBLCは、マウスBLCと64%相同性がある。そのレセプターは、CXCR5である。BLCは、また、補充したB細胞上でリンホトキシンα1β2(LT?α1β2)の発現を誘導する。LT?α1β2がBLC発現を促進することから、このことは、ポジティブフィードバックループを提供する(Anselら., Nature 406: 309-314 (2000))。BLCは、また、IL-8と相同性を共有する。BLCは、脾臓及びパイエル板のような二次リンパ系臓器の濾胞へB細胞を補充する。BLCは、また、濾胞性樹状細胞(FDCs)に富むリンパ節のコンパートメントへB細胞を補充するのに必須である(Anselら, Nature 406:309-314(2000))。BLCは、また、リンパ系新生を誘導することができることが示されている(Lutherら, Immunity 12:471-481(2000))。FDCsは、BLCも発現すると思われる。従って、BLCに対する免疫化は、リウマチ滑膜炎及びリウマチ様関節炎又はI型糖尿病等のリンパ系新生が関わっている自己免疫疾患に対する治療法を提供することができる。C末端his-タッグを生じるBLCのコンストラクトが記載されており、それは、機能性がある(Ansel, K. M.ら, J. Exp. Med. 190: 1123-1134(1999))。
従って、本発明の好ましい実施態様では、組成物は、第2の付着部位としてシステイン残基を有し、BLC配列のC末端で融合しているリンカーを含む。
BLCと相同性のあるIL-8では、N及びC末端は遊離している。さらに好ましい実施態様では、第2の付着部位としてシステイン残基を有するアミノ酸リンカーの付加は、よって、本発明の具体的な組成物の作製のために、BLCのN末端へ成される。
本発明のさらに好ましい実施態様では、組成物は、遊離のシステインを有し、加工タンパク質の配列と一致する配列のN末端と融合しているか、又は、シグナルペプチドのC末端側でタンパク質の成熟型の配列のN末端に挿入されているアミノ酸リンカーを含む。これら特定のコンストラクトをコードする遺伝子は、適切な発現ベクターにクローニングされて、それによって発現されることができる。ヒトBLCの配列は、配列番号:240(寄託番号:NP_006410)に示されている。配列のアミノ酸1-22は、シグナルペプチドである。マウス配列は、配列番号:241(寄託番号 NP_061354)に示されている。。配列のアミノ酸1-21は、シグナルペプチドである。BLCを抗原決定基とする本発明の組成物は、好ましくは、本発明の組成物の作製のために、タンパク質の成熟型を用いる。
その他の具体的な実施態様では、抗原決定基はエオタキシンである。エオタキシンは、好酸球、好塩基球及びTh2細胞上にあるケモカインレセプター3に特異的なケモカインである。エオタキシンは、しかしながら、好酸球に高度に特異的であると思われる(Zimmermanら, J. Immunol. 165: 5839-46(2000))。好酸球遊走は、エオキサン-1ノックアウトマウスで70%減少しているが、しかしながら、まだ好酸球増加症を発症する(Rothenbergら, J. Exp. Med. 185: 785-90(1997))。IL-5は、骨髄から血液までの好酸球の遊走を担い、エオタキシンは、組織での局所的遊走を担うと思われる(Humblesら, J. Exp. Med. 186: 601-12(1997))。
ヒトゲノムは、エオタキシン1-3の3つのエオタキシン遺伝子を有する。それらは、互いに30%の相同性を有する。2つの遺伝子は、今のところマウスで知られている:エオタキシン1及びエオタキシン2(Zimmermanら, J. Immunol. 165: 5839-46(2000))。それらは、38%の相同性を有する。マウスのエオタキシン-2は、ヒトのエオタキシン-2と59%の相同性を共有する。マウスでは、エオタキシン-1は、胃腸路で遍在的に発現しているようであるが、その一方で、エオタキシン-2は、主に空腸で発現している(Zimmermanら, J. Immunol. 165: 5839-46(2000))。エオタキシン-1は、気管支肺胞液に存在する(Teixeiraら, J. Clin. Invest. 100: 1657-66(1997))。ヒトのエオタキシン-1の配列は、配列番号:242(シグナルペプチドと一致するaa 1-23)に示され、ヒトのエオタキシン-2の配列は、配列番号:243(シグナルペプチドと一致するaa 1-26)に示され、ヒトのエオタキシン-3の配列は、配列番号:244(シグナルペプチドと一致するaa 1-23に示され)、マウスのエオタキシン-1の配列は、配列番号:245(シグナルペプチドと一致するaa 1-23)に示され、そして、マウスのエオタキシン-2の配列は、配列番号:246(シグナルペプチドと一致するaa 1-23)に示されている。
エオタキシンは、8.3kDaの分子量である。それは、37℃で1.3mMの推定Kdを有し、幅広い条件下で、単量体と二量体の間の平衡状態にある(Crumpら, J. Biol. Chem. 273: 22471-9(1998))。しかしながら、単量体の形態が支配的である。エオタキシンの構造は、NMR分光法によって明らかにされてきた。そのレセプターCCR3への結合部位は、N末端であり、最初のシステインの前の領域は重要である(Crumpら, J. Biol. Chem. 273: 22471-9(1998))。エオタキシンと結合しているケモカインのペプチドによって、この発見が確かめられた。エオタキシンは、2つのジスルフィド結合を形成する4つのシステインを有している。従って、好ましい実施態様では、本発明の組成物は、第2の付着部位としてシステイン残基を有し、好ましくは、エオタキシン配列のC末端と融合しているアミノ酸リンカーを含む。他の好ましい実施態様では、遊離のシステインを有するアミノ酸リンカーは、加工タンパク質の配列と一致する配列のN末端と融合するか、又は、シグナルペプチドのC末端側で、タンパク質の成熟型の配列のN末端に挿入されている。これら特定のコンストラクトをコードする遺伝子は、適切な発現ベクターへクローニングされる。
エオタキシンは、化学的に合成することができる(Clark-Lewisら, Biochemistry 30:3128-3135(1991))。細胞質でのエオタキシン-1に関して、大腸菌での発現も記載されている(Crumpら, J. Biol. Chem. 273: 22471-9(1998))。後のリフォールディングをともなう、封入体(インクルージョンボディー)としての大腸菌での発現(Mayerら, Biochemistry 39: 8382-95(2000))、及び昆虫細胞発現(Forssmannら, J. Exp. Med. 185: 2171-6(1997))がエオタキシン-2に関して記載され、そして、さらには、本発明の具体的な実施態様に帰着するように利用できる。
さらに、本発明のその他の具体的な実施態様では、抗原決定基は、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF又はCSF-1)である。M-CSF又はCSF-1は、マクロファージ及びその骨髄前駆体の増殖、分化及び生存物のレギュレーターである。M-CSFのレセプターは、プロトオンコジーンcfmsによってコードされている細胞表面チロシンキナーゼレセプターである。M-CSF及びそのレセプターの上昇した発現は、乳房、子宮及び卵巣癌等の幾つかの上皮癌の劣った予後と関連している。腫瘍の進行は、乳腺癌(PyMT)に罹りやすいトランスジェニックマウスとcsf-1遺伝子に劣性無発現変異を有するマウスの交配から生じるマウス系統で研究されている。これらのマウスは、PyMTマウスと比べて、弱力化した後期浸潤癌及び肺転移を示す(Linら, J. Exp. Med. 193:727-739(2001))。その原因は、新生組織へのマクロファージ補充が無いことだと思われる。ルイス肺癌の皮下成長は、また、csf.1ヌルマウスで弱められる。腫瘍成長のマクロファージ増強の機構は、マクロファージが産する血管形成因子、成長因子及びプロテアーゼを介してであろうとすい推論される。
M-CSFの可溶化型の構造データは入手可能であり(結晶構造:Panditら, Science 258:1358-62(1992))、タンパク質のN及びC末端の双方が接触可能であることを示す。しかしながら、N末端は、レセプターとの相互作用の部位に近接している。さらには、M-CSFは、膜貫通領域がC末端にある、可溶性及び細胞表面形態の双方に存在する。従って、本発明の好ましい実施態様では、発明の組成物は、システインを有し、好ましくは、M-CSF又はその断片のC末端、又はM-CSFの可溶化型のC末端に付加されているアミノ酸リンカーを含む。さらに好ましい実施態様では、遊離のシステインを有するアミノ酸リンカーは、加工タンパク質又はタンパク質の可溶化型の配列と一致する配列のN末端と融合、又はシグナルペプチドのC末端側のタンパク質の成熟型又はタンパク質の可溶化型の配列のN末端に挿入されている。M-CSFは二量体であり、その2つの単量体は、分子間ジスルフィド架橋を介して連結している。
大腸菌の発現系が、M-CSFのN末端149アミノ酸断片(機能性)に関して記載されている(Kothsら, Mol. Reprod. Dev. 46:31-37(1997))。好ましくは、上で概説したように修飾したM-CSFの断片は、本発明に基づく好ましい抗原決定基を表す。
ヒト配列は、配列番号:247(寄託番号:NP_000748)に示されている。本発明のさらに好ましい抗原決定基は、レセプターの可溶化型と一致する配列番号:247の残基33-181又は33-185から成るN末端断片を含む。
マウス配列(寄託番号NP_031804)は、配列番号:248に示されている。成熟配列は、アミノ酸33から始まる。従って、本発明に基づく好ましい抗原決定基は、アミノ酸33-181又は33-185を含む。
その他の具体的な実施態様では、抗原決定基はレジスチン(Resistin)である。受動免疫研究を、細菌で発現させた、GSTと融合させたマウスレジスチン(mRes)の融合タンパク質に対して生成させたウサギポリクローナル抗体によって行った。この受動免疫は、動物肥満症/II型糖尿病モデルにおけるグルコース摂取の改善につながる(Steppanら, Nature 409: 307-12(2001))。
レジスチン(Res)は、およそ12KDの114aaのペプチドホルモンである。それは、11のシステインを有し、その中の最もN末端側にある1つは、タンパク質の二量体化を担い、その他の10個は、分子内ジスルフィド結合に関わっていると考えられている(Banerjee及びLazar, J. Biol. Chem. 276: 25970-3(2001))。最初のシステインをアラニンへ変える変異は、mResの二量体化を損なう。
C末端にFLAGタッグを有するmResは、なお動物モデルで活性があり(Steppanら, Nature 409: 307-12(2001))、同じように、レジスチンのC末端のHAタグ(赤血球凝集素 タグ)バージョンは、組織培養アッセイで活性があることが示され(Kimら, J. Biol. Chem. 276: 11252-6(2001))、このことは、C末端が導入された修飾に対してあまり感受性がないことを示唆している。従って、好ましい実施態様では、本発明の組成物は、第2の付着部位としてシステイン残基を有し、レジスチン配列のC末端と融合しているアミノ酸リンカーを含む。さらに好ましい実施態様では、遊離のシステインを有するアミノ酸リンカーは、加工タンパク質の配列に一致する配列のN末端と融合するか、又は、シグナルペプチドのC末端側のタンパク質の成熟型の配列のN末端に挿入されている。
本発明の好ましい実施態様では、MRes又はhuResは、また、レジスチンとコンストラクトのFc部分の間、好ましくは、C末端側の真核生物発現系の融合タンパク質のFc部分のヒンジ領域の1つ又はそれより多いシステイン残基に挿入したプロテアーゼ切断部位を有するFc融合分子として、又は、より好ましくは、実施例2の記載及び開示に基づいて発現させてもよい。この融合タンパク質の切断によって、実施例2に記載のようなシステイン残基を有するアミノ酸リンカー、又は、C末端にシステイン残基を含む、VLPs又は線毛とカップリングするのに適した融合タンパク質のFc部分のヒンジ領域の一部分又は全てのいずれかを付加的に含むレジスチンが遊離する。ヒトレジスチン配列は、配列番号:249(寄託番号 AF323081)に示されている。マウス配列は、配列番号:250(寄託番号 AF323080)に示されている。本発明の好ましい実施態様は、システイン残基を有するアミノ酸リンカーとC末端で融合しているヒトレジスチンタンパク質である。ヒトレジスチンコンストラクトは、実施例2に開示の教示によって作製することが可能であり、そして、実施例2の教示に基づいて実施例1及び実施例2に記載のベクター、又は他の適した発現ベクターにクローニングされるヒトレジスチンの配列の部分を同定するために、タンパク質配列アライメントのマウス及びヒトレジスチン配列を比較することによって作製することが可能である。本発明の組成物を作製するのに適したヒトレジスチンコンストラクトの例は、ヒトレジスチン-C-Xa:(配列番号:325)、ヒトレジスチン-C-EK:(配列番号:326)及びヒトレジスチン-C:(配列番号:327)である。
そのように作製されるヒトレジスチンコンストラクトは、本発明の好ましい実施態様である。本発明の前出の組成物を用いたレジスチンに対するワクチン接種は、従って、II型糖尿病及び肥満を治療する方法を提供する。
他の実施態様では、抗原決定基はリンホトキシン-βである。リンホトキシン-βに対する免疫化は、プリオンが媒介する疾患の治療に有用である。スクレピー(プリオン媒介疾患)剤複製は、主にリンパ系組織で起こると考えられ、プリオン-タンパク質を発現する濾胞性樹状細胞(FDCs)に依存することが示された(Brownら, Nature Med. 11: 1308-1312(1999))。機能性濾胞性樹状細胞を欠くマウスが、脾臓で正常に機能しないプリオン複製及び神経侵入のわずかな遅延を示すことが後に示された(Montrasioら, Science 288: 1257-1259(2000))。これは、マウスへ可溶性リンホトキシン-βレセプター-Fc-融合タンパク質(LTβR-Fc)を注入することによって達成された。この可溶性レセプターコンストラクトは、T,B又はNK細胞上のリンホトキシン-βのFDCレセプター上のリンホトキシン-βレセプターとの重要な相互作用を妨害することによって、FDCsの発生を阻害する。従って、リンホトキシン-β(TNFγとも呼ばれている)に対するワクチン接種は、クロイツフェルト・ヤコブ病(変異型)又は他のプリオン媒介疾患の治療又は予防のためのワクチンを提供することができ、それによってプリオン複製及び神経侵入を防ぐ。
リンホトキシン-βに対する免疫化も、糖尿病の治療方法を提供する。非肥満性の糖尿NODマウスでの可溶性LTβR-Fc融合タンパク質の導入遺伝子発現は、糖尿病の発症を阻止するが膵島炎の発症は阻止しなかった(Ettingerら, J. Exp. Med. 193: 1333-40 K(2001))。Wuら(J. Exp. Med. 193: 1327-32 (2001))も、彼らがLTβR-Fc融合タンパク質を注入したトランスジェニック動物に代わって、NODマウスを用いてリンホトキシン-βの関与を研究した。彼らは、糖尿病の発症の強力な阻害及び膵島炎の阻害を認めた。最も興味深いことは、彼らが、融合タンパク質療法によって、前から存在する膵島炎を破棄さえもできる。膵臓では、従って、リンパ系濾胞性構造の形成を破棄することができる。リンホトキシン-βに対するワクチン接種は、よって、I型糖尿病に対する治療法を提供することができる。
ヒトリンホトキシン-βの細胞外ドメインの配列は、配列番号:250(TNFC_ヒト)に示されており、マウスリンホトキシン-βの細胞外ドメインの配列は、配列番号:251(TNFC_マウス)に示されている。
さらに好ましい実施態様では、本発明の組成物は、遊離のシステインを有し、リンホトキシン-βの加工型と一致する配列のN末端に付加されているか、又は、シグナルペプチドのC末端側の、タンパク質の成熟型と一致する配列のN末端とシグナルペプチドの間に挿入されているアミノ酸リンカーを含む。本発明のさらに好ましい実施態様では、リンホトキシン-βの細胞外部分は、リンホトキシン-βのN末端側へ融合したグルタチオン-S-トランスフェラーゼと、又は、再びリンホトキシン-βの細胞外部分のN末端側へ、myc-タグが後に続くよう6ヒスチジン-タグのいずれかとの融合タンパク質として発現される。プロテアーゼ切断部位のC末端側に、遊離のシステインを付着部位として有するリンカー配列だけでなく、プロテアーゼ切断部位を有するアミノ酸スペーサーは、リンホトキシン-βの細胞外部分の配列のN末端へ融合している。好ましくは、リンホトキシン-βの細胞外部分は、リンホトキシン-βのアミノ酸49-306又は126-306と一致する断片で構成される。本発明の具体的な組成物は、pCEP-Pu真核生物ベクターでクローニングし、発現することができる。さらに好ましい実施態様では、本発明の組成物は、第2の付着部位として遊離のシステイン残基を有し、リンホトキシン-βのC末端又はリンホトキシン-β断片と融合したアミノ酸リンカーを含む。特に好ましい実施態様では、VLPS及び線毛とカップリングするためのシステイン残基を有するアミノ酸リンカーACGGを含むアミノ酸配列LACGCは、リンホトキシン-βの細胞外部分のN末端:又は、リンホトキシン-βの細胞外部分の断片と融合し、実施例3に記載のように、ベクターpCEP-SP-GST-EK又はベクターpCP-SP-his-myc-EKのいずれかで発現される対応する融合タンパク質のエンテロキナーゼによる切断後に、タンパク質ヒトC-LT・49−306(配列番号:346)及びヒトC-LT・126−306(配列番号:347)を産する。
好ましい実施態様では、抗原又は抗原決定基は、プリオンタンパク質、その断片及び特に、プリオンタンパク質のペプチドである。一実施態様では、プリオンタンパク質はヒトプリオンタンパク質である。cpre粒子との結合のために、どのようにヒトプリオンタンパク質を修飾するのかに関するガイダンスは、本明細書を通して、特に実施例7に示されている。マウスプリオンタンパク質コンストラクトが開示され、ヒトプリオンタンパク質コンストラクトも作製が可能であり、例えば、配列番号:348の配列を有する。さらなるコンストラクトは、全ヒトプリオンタンパク質配列及び本発明のさらなる組成物であるヒトプリオンタンパク質の他の断片を含む。プリオンタンパク質に対する免疫化は、クロイツフェルト・ヤコブ病(変異型)又は他のプリオン媒介疾患の治療又は予防方法を提供することができる。プリオンタンパク質を含む本発明の組成物を利用した免疫化は、他の動物におけるプリオン媒介疾患に対する治療方法を提供することができ、ウシ及び羊プリオンタンパク質コンストラクトの対応する配列は、それぞれ配列番号:349及び配列番号:350に示されている。実施例8に記載のマウスペプチドと一致するヒトプリオンタンパク質のペプチド、そしてアミノ酸配列CSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHR(「ヒトcprplong」)及びCGSDYEDRYYRENMHR(「ヒトcprshort」)は、本発明の好ましい実施態様につながる。これらペプチドは、VLPs及び線毛とのカップリングのために付加されたN末端システイン残基を含む。対応するウシ及び羊ペプチドは、CSAMSRPLIHFGNDYEDRYYRENMHR(「ウシcprplong」)及びCGNDYEDRYYRENMHR(「ウシcprpshort」)、CSAMSRPLIHFGNDYEDRYYRENMYR(「羊cprplong」)及びCGNDYEDRYYRENMYR(「羊cprpshort」)であり、すべてが本発明の実施態様へつながる。
本発明のさらなる好ましい実施態様では、抗原決定基は、腫瘍壊死因子(TNF-α)、その断片又はTNF-αのペプチドである。特に、TNF-αのペプチド又は断片は、全タンパク質に対する自己特異的免疫応答を誘導するのに利用することができ、それは、ヒト又は動物をそれぞれ、ワクチン及び本発明に基づくそのようなペプチド又は断片を含む組成物で免疫化することによる。好ましくは、VLPs、バクテリオファージ又は細菌線毛は、本発明に従って、TNF-α、ペプチド又はその断片が付着しているコア粒子として利用される。
以下のマウスペプチドは、TNF-αの活性を中和する抗体が結合していることが示され(Yoneら J. Biol. Chem. 270: 19509-19515)、さらに好ましい実施態様では、VLPs、バクテリオファージ又は細菌線毛とカップリングするためのシステイン残基で修飾されているヒトペプチドへのマウス相同体である。
MuTNFa ペプチド:配列CGGは、成熟マウスTNF-α:CGGVEEQLEWLSQRのアミノ酸残基22-32で構成されるエピトープのN末端に付加された。
3' TNF IIペプチド:配列GGCを、成熟マウスTNF-αのアミノ酸残基4-22で構成されるエピトープのC末端へ融合させ、グルタミン21をグリシンへ変異させた。その結果として生じたペプチドの配列は:SSQNSSDKPVAHVVANHGVGGCである。
5' TNF IIペプチド:システイン残基を、成熟マウスTNF-αのアミノ酸残基4-22で構成されるエピトープのN末端へ融合させ、グルタミン21をグリシンへ変異させた。その結果として生じたペプチドの配列は:CSSQNSSDKPVAHVVANHGVである。
4-22エピトープの対応するヒト配列は、SSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQである。マウス配列に関するように、好ましくは、システインは、エピトープのN末端に融合しているか、又は配列GGCは、本発明に基づくVLPs、バクテリオファージ又は細菌線毛との共有結合のために、エピトープのC末端に融合している。しかしながら、他のシステインを有する配列がエピトープのN又はC末端に融合していることは、本発明の範囲内である。一般的に、1又は2つのグリシン残基が、好ましくは、付加したシステイン残基とエピトープの配列の間に挿入されている。しかしながら、他のアミノ酸も、グリシン残基に代わって挿入されることができ、これらのアミノ酸残基は、好ましくは、セリンのような小さなアミノ酸である。
アミノ酸残基22-32と一致するヒト配列は、QLQWLNRRANAである。好ましくは、配列CGGは、本発明に基づくVLPs又は細菌線毛との共有結合のために、エピトープのN末端に融合している。本発明で用いるのに適した他のTNF-α_エピトープが、Yoneら(J. Biol. Chem 270: 19509-19515)によって記載され、例として開示された。
本発明は、ここで記載されている抗原又は抗原決定基のミモトープを有する組成物をさらに含む。
本発明の具体的な組成物は、抗体、又は、好ましくは、前記抗体に対する免疫応答の誘導のためのウイルス様粒子又は線毛上に存在する抗体断片を含む。リンパ腫細胞によって産生される抗体又は抗体断片は、リンパ腫に対する保護的免疫応答を誘導するためのウイルス様粒子への付着のために選択することができる。
他のさらなる実施態様では、抗原を模倣する抗体又は抗体断片は、粒子へ付着している。模倣抗体又は抗体断片は、免疫化とハイブリドーマ技術(Gherardi, E.ら, J. Immunol. Methods 126: 61-68(1990))、ファージディスプレイ(Harrisonら, Methods Enzymol. 267: 83-109(1996))、リボゾームディスプレイ(Hanes, J.ら, Nat. Biotechnol. 18: 1287-1292(2000))、酵母ツーハイブリッド(Visintin, M.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 11723-11728(1999))、酵母表層ディスプレイ(Boder, ET. & Wittrup, KD. Methods. Enzym. 328: 430-444(2000))、細菌表層ディスプレイ(Daugherty, PS.ら, Protein Eng. 12:613-621(1999))等の当該分野で知られている任意の方法による、その後の模倣した抗体又は抗体断片の単離によって作製することができる。この模倣抗体は、また、例えば、上記の方法等の当該分野で知られた方法を利用して、抗体ライブラリ又は天然抗体ライブラリから単離することができる。
さらに好ましい実施態様では、その他の抗体の組み合わせ部位を認識する抗体、すなわち、抗イディオタイプ抗体、さらに免疫化抗体と呼ばれているものが利用されてもよい。抗イディオタイプ抗体によって認識される抗体は、さらに中和化抗体と呼ばれている。従って、抗イディオタイプ抗体に対する免疫化によって、中和化抗体の特異性を有する分子は、インサイツで作製される;我々は、これら作製された抗体を誘導抗体と呼ぶ。その他の好ましい実施態様では、免疫化抗体は、免疫化を目標としている標的分子のリガンド分子と相互作用するように選択される。このリガンド分子は、標的分子と相互作用する任意の分子であるが、標的分子の部位と優先的に相互作用し、抗体は、その標的分子の部位の機能を阻害するために作製されるべきものである。リガンド分子は、標的分子の天然リガンドであってもよいし、又は、適切な結合特性を有する操作、設計又は単離されたリガンドであってもよい。
免疫化抗体は、例えば、天然又は免疫ヒト抗体ライブラリから単離されたヒト起源であってもよいし、又は、例えば、マウス起源等、その他の動物起源から作製されたライブラリから単離されていてもよい。
抗体又は抗体起源のVLP又は線毛へのカップリングは、露出しているジスルフィド架橋の限定的還元によって(Fab断片のCH1とCκ又はCλの間の鎖間ジスルフィド架橋の例)、又は、抗体又は抗体断片のC末端の遊離のシステイン残基を有するリンカーの融合によって達成される。さらに好ましい実施態様では、遊離のシステイン残基を有するリンカーは、VLP又は線毛タンパク質への付着のために、抗体又は抗体断片のN末端へ融合している。
ミモトープを用いるワクチン組成物の数は、当該分野で知られており、それは、特定のエピトープのミモトープを作製して同定するための方法である。例えば、その全開示が参考文献によってここで取り入れられている、Arnonら, Immunology 101:555-562(2000)は、マンソン住血吸虫 (Schistosoma mansoni)に対するミモトープペプチドベースワクチンを記載する。これらワクチンで用いるミモトープは、マンソン住血吸虫に対する保護的モノクローナル抗体により認識されるエピトープのミモトープを同定するために、固相8merランダムペプチドライブラリをスクリーニングすることによって得られる。同じように、参考文献によって、全開示がここで取り入れられているOlszewskaら, Virology 272: 98-105(2000)は、麻疹ウイルス融合タンパク質のエピトープを模倣する合成ペプチドの同定、及びマウスの免疫化のためのこれらペプチドの用途を記載している。さらには、参考文献によって、全開示がここで取り入れられているZuercherら, Eur. J. Immunol. 30:128-135(2000)は、エピトープ-ディスプレイングファージを利用した経口抗IgE免疫化の組成物及び方法を記載している。特に、エピトープディスプレイングM13バクテリオファージは、経口抗IgEワクチンの担体として用いられている。試験されるワクチンは、モノクローナル抗IgE抗体BSW17のミモトープ及びエピトープを有する。
本発明は、従って、特定の抗原に対しての免疫応答を誘発するミモトープを有する組成物を含むワクチン、並びに、これらワクチン組成物を構成する個々のミモトープ/コア粒子コンジュゲート、及び個々のミモトープ/非天然発生分子骨格コンジュゲート、そして特定の抗原又は抗原決定基に対する免疫応答を誘発するこれらワクチン組成物の用途を含む。ミモトープは、また、抗イディオタイプ抗体のようなポリペプチドであってもよい。従って、本発明のさらに好ましい実施態様では、抗原又は抗原決定基は、抗イディオタイプ抗体又は抗イディオタイプ抗体断片である。
本発明は、ここに記載の抗原又は抗原決定基のミモトープを有する組成物をさらに含む。
特定の抗原のミモトープは、ランダムペプチドファージディスプレイライブラリのスクリーニングを含むかなり多くの手法によって作製して同定することがきる(例えば、参考文献によって、全開示の取り入れられている、国際公開第97/31948号)。そのようなライブラリのスクリーニングは、特定の抗原に対する特異性を有する1又はそれより多い抗体と結合しているペプチドを同定するためにしばしば実行される。
本発明のワクチン組成物に用いるのに適したミモトープは、直鎖又は環状ペプチドであってもよい。直鎖又は環状のペプチドであるミモトープは、ペプチド結合ではない結合によって、非天然分子骨格又はコア粒子と連結することができる。
上で示唆したように、ヒトIgE分子に対する免疫応答を誘発する多くのヒトIgEミモトープ及びエピトープが同定されてきた(例えば、国際公開第97/31948号を参照せよ)。従って、ある実施態様では、本発明のワクチン組成物は、免疫グロブリン分子に対する免疫応答を誘発する組成物を含む(例えば、IgE分子)。
そのような免疫学的応答を誘発するのに利用できるペプチドには、タンパク質、タンパク質分子、IgE分子のドメイン、及びIgE分子に対する特異性を有する抗体の産生を誘発することが可能なミモトープが含まれる。一般的に、ワクチン組成物を調製するのに利用できるIgE分子の一部分は、組成物が投与される種のIgE分子に由来する。例えば、ヒトへの投与が意図されるワクチン組成物は、しばしは、ヒトIgE分子の1又はそれより多い部分、及び/又はヒトIgE分子に対する免疫学的応答を誘発することが可能な1又はそれより多いミモトープを有する。
具体的な実施態様では、ヒトへの投与が意図される本発明のワクチン組成物は、少なくとも、配列番号:176;寄託番号AAB59424(配列番号:176)に設定されているIgE重鎖の定常領域の一部分を有する。より具体的な実施態様では、本発明のワクチン組成物を調製するのに利用されるIgEペプチドは、次のアミノ酸配列を有するペプチドを含むか、又はそれに代わって、それで構成されている:CGGVNLTWSRASG(配列番号:178)。
さらなる具体的な実施態様では、本発明のワクチン組成物は、少なくとも、特定の抗原に対して特異性を有する抗体の産生を生じる免疫応答を誘発することが可能な1つのエピトープを有する。
本発明のワクチン組成物の調製の用途に適したIgEのミモトープの例には、次のアミノ酸配列を有するペプチドが含まれる:
Figure 2009132689
C.アルファワクチン粒子の調製
本発明は、規則正しく繰り返された抗原アレイの構築のための新規組成物及び方法を提供する。当該分野の熟練者が知っているように、規則正しく繰り返された抗原アレイのアセンブリのための条件は、非天然分子骨格の第1の付着部位の特異的な選択と、抗原又は抗原決定基の第2の付着部位の特異的な選択に大きく依存している。従って、組成物の設計における実施者の選択(すなわち、第1及び第2の付着部位、抗原及び非天然分子骨格の選択)は、アルファワクチン粒子のアセンブリ(規則正しく繰り返された抗原アレイ、及び組み合わせた非天然分子骨格)に関する具体的条件を決定する。アルファワクチン粒子のアセンブリに関連する情報は、実施者の役立つ知識に範囲内にあり、実施者を助ける多くの参考文献が存在し(例えば、Sambrook, J. ら, 編, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 第2版, コールドスプリングハーバー研究所出版, コールドスプリングハーバー,ニューヨーク(1989);Ausubel, F. ら, 編, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John H. Wiley & Sons, Inc. (1997);Celis, J., 編, CELL BIOLOGY, Academic Press, 第2版, (1998);Harlow, E. 及び Lane, D., " Antibody: A Laboratory Manual" コールドスプリングハーバー研究所, コールドスプリングハーバー, ニューヨーク(1988))、そのすべてが、参考文献としてここで取り入れられている。
本発明の具体的な実施態様では、JUN及びFOSロイシンジッパータンパク質ドメインは、それぞれ、本発明の第1及び第2の付着部位として利用されている。アルファワクチン粒子の調製では、非天然分子骨格上への規則正しく繰り返された抗原アレイのセンブリを促進する条件下で、抗原は産生されて精製されるべきである。特定のJUN/FOSロイシンジッパータンパク質ドメインの実施態様では、ジスルフィド結合の形成の頻度を低下させるか又は取り除くために、FOS抗原又はFOS抗原決定基を、還元剤(例えば、ジチオスレイトール(DTT))で処理するべきである(実施例15)。
JUN/FOSロイシンジッパータンパク質ドメインの実施態様の非天然分子骨格(すなわち、組み換えシンドビスウイルス)の調製については、組み換えE2-JUNウイルス粒子は、濃縮、中和そして還元剤で処理されるべきである(実施例16を参照せよ)。
JUN/FOSの実施態様での規則正しく繰り返された抗原アレイのアセンブリは、酸化還元シャッフルの存在下でおこなわれる。E2-JUNウイルス粒子を、4℃で10時間、240倍モル濃度を越えるFOS抗原又はFOS抗原決定基と混合する。続いて、クロマトグラフィーによって、アルファワクチン粒子を濃縮して精製する(実施例16)。
1 本発明のその他の実施態様では、非天然分子骨格の抗原又は抗原決定基へのカップリングは、化学架橋結合によって達成することができる。具体的な実施態様では、化学剤は、ヘテロ二価機能性架橋結合剤、例えばε-マレイミドカプロン酸 N-ヒドロキシスクシニミドエステル(Tanimoriら, J. Pharm. Dyn. 4: 812(1981);Fujiwaraら, J. Immunol. Meth. 45: 195 (1981))であり、それは、(1)アミノ基と反応するスクシニミド基、及び(2)SH基と反応するマレイミド基を有する。第1の付着部位の異種タンパク質又はポリペプチドを、ヘテロ二価機能性架橋剤のスクシニミド基部分の反応性部分として機能する1つ又はそれより多いリジン残基を有するように操作してもよい。一度、異種タンパク質のリジン残基と化学的にカップリングすると、ヘテロ二価機能性架橋結合剤のマレイミド基は、抗原又は抗原決定基のシステイン残基のSH基と反応することが可能である。この場合の抗原又は抗原決定基の調製は、システイン残基を第2の付着部位として選んだタンパク質又はポリペプチドへ操作して挿入することを必要とする可能性があり、それによって、それが、非天然分子骨格第1の付着部位と結合している架橋結合剤上の遊離のマレイミド基と反応することができる。従って、このような場合には、ヘテロ二価機能性架橋結合剤は、非天然分子骨格の第1の付着部位と結合し、その骨格を抗原又は抗原決定基の二番目の結合部位と連結させる。
3.組成物、ワクチン、及びその投与、そして治療方法
本発明は、疾患又は症状を予防すること及び/又は弱めることに利用することができるワクチン組成物を提供する。本発明は、さらに、個体における疾患又は症状を予防すること/又は弱めることに関するワクチン接種方法を提供する。
1つの実施態様では、本発明は、幅広い種、特に、ヒト、サル、ウシ、犬、猫、馬、豚等の哺乳動物の感染症の予防のためのワクチンを提供する。ワクチンは、ウイルス病因の感染、例えば、HIV、インフルエンザ、ヘルペス、ウイルス肝炎、エプスタイン・バー、ポリオ、ウイルス性脳炎、麻疹、水痘、等;又は細菌病因の感染、例えば、肺炎、結核、梅毒、等;又は寄生虫病因の感染、例えば、マラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症、アメーバ症、等を治療するために設計することができる。
その他の実施態様では、本発明は、幅広い種、特に、ヒト、サル、ウシ、犬、猫、馬、豚等の哺乳動物の癌の予防のためのワクチンを提供する。ワクチンは、すべての型の癌を治療するために設計することができる:リンパ腫、癌腫、肉腫、メラノーマ、等。
本発明のその他の実施態様では、本発明の組成物は、アレルギーの治療のためのワクチンの設計に利用することができる。IgEアイソタイプの抗体は、アレルギー反応の重要な成分である。マスト細胞は、その表面でIgE抗体と結合し、特異的抗原のマスト細胞表面に結合したIgE分子への結合によって、ヒスタミン及びアレルギー反応の他のメディエーターを遊離する。従って、IgE抗体の産生の阻害は、アレルギーから守るための有望な標的である。これは、所望するTヘルパー細胞応答を達成することによって可能である。Tヘルパー細胞応答は、1型(TH1)及び2型(TH2)Tヘルパー細胞応答へ分けることが可能である(Romagnani, Immunol. Today 18:263-266(1997))。TH1細胞は、B細胞がIgG1-3抗体を産生することを誘発するインターフェロン-ガンマ及び他のサイトカインを分泌する。対照的に、TH2細胞によって産生される主要なサイトカインはIL-4であり、それは、B細胞がIgG4及びIgEを産するようにする。多くの実験系では、TH1細胞がTH2細胞の誘導を抑制し、逆の場合も同じであるので、TH1及びTH2応答の発生は、相互に相容れない。従って、強いTH1応答を誘発する抗原は、同時にTH2応答の発生を抑制し、よって、IgE抗体の産生を抑制する。興味深いことに、実質上、すべてのウイルスは、宿主でTH1を誘導し、IgE抗体の産生を誘発することができない(Coutelierら, J. Exp. Med. 165:64-69(1987))。このアイソタイプパターンは、生きているウイルスに限定されるものではなく、不活性又は組み換えウイルス粒子についても認められる(LoManら, Eur. J. Immunol. 28: 1401-1407(1998))。従って、本発明のプロセスを利用することによって(例えば、アルファワクチン技術)、ウイルス粒子は、種々のアレルゲンで装飾し、免疫化に利用することが可能である。結果として生じたアレルゲンの「ウイルス構造」によって、TH1応答が誘発され、「保護」IgG1-3抗体が産生され、アレルギー反応を起こすIgE抗体の産生が妨げられる。このアレルゲンは、アレルゲンそのものよりも異なるヘルパーT細胞の一組により認識されるウイルス粒子によって表示されるので、前から存在するアレルゲンに特異的なTH2細胞を有するアレルギー性個体の中でさえも、アレルゲン特異性IgG1-3抗体は誘導されるようである。IgG抗体の高濃度の存在によって、マスト細胞に結合したIgEへアレルゲンが結合することを妨げられることがあり、それによって、ヒスタミンの遊離が阻害される。従って、IgG抗体の存在は、IgE媒介アレルギー性反応から保護する。アレルギーを起こす典型的な物質には:草、ブタクサ、樺の木又は山杉花粉、ハウスダスト、ダニ、動物の鱗屑、カビ、昆虫毒又は薬剤(例えば、ペニシリン)が含まれる。従って、アレルゲンで修飾したウイルス粒子による個体の免疫化は、アレルギーの始まりの前だけでなく、その後で有益である。
具体的な実施態様では、本発明は、「自己」遺伝子産物(例えば、腫瘍懐死因子)、すなわち、「自己抗原」としてここで用いられているものによって生じるか、又は悪化する疾患又は症状を予防する及び/又は弱める方法を提供する。関連する実施態様では、本発明は、「自己」遺伝子産物によって生じる又は悪化する疾患又は症状を予防及び/又は弱める抗体の産生につながる個体における免疫応答を誘導する方法を提供する。そのような疾患又は症状の例には、移植片対宿主病、IgE媒介アレルギー反応、アナフィラキシー、成人呼吸窮迫症候群、クローン病、アレルギー性喘息、急性リンパ性白血病(ALL)、非ホジキンリンパ腫(NHL)、グレーブス病、炎症性自己免疫疾患、筋無力症、全身性エリテマトーデス(SLE)、免疫増殖疾患性リンパ節腫脹(IPL)、血管免疫増殖性リンパ節腫脹(AIL)、免疫芽球性リンパ腺腫(IBL)、リウマチ様関節炎、糖尿病、多発性硬化症、骨粗鬆症及びアルツハイマー病が含まれる。
当該分野の典型的な技術者によって理解されているように、本発明の組成物が個体に投与される場合、それらは、塩、緩衝液、アジュバンド、又は組成物の効果を向上させるのに望ましい他の基質を有する組成物であってもよい。医薬的組成物を調製する用途に適した物質の例は、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Osol, A, 編, Mack Publishing Co, (1990))を含む多くのソースに提供されている。
本発明の組成物は、その投与が受容者である個体によって耐えられることが可能ならば、「薬理学的に許容可能」であると言える。さらには、本発明の組成物は、「治療的に有効量」(すなわち、望ましい生理学的効果を産する量)で投与される。
本発明の組成物は、当該分野で知られた種々の方法によって投与することができるが、通常は、注射、注入、吸引、経口、投薬、又は他の適切な物理的方法によって投与することができる。この組成物は、それに代わって、筋肉注射で、静脈内に、又は皮下に投与することができる。投与のための組成物の成分には、無菌水(例えば、生理食塩水)又は非水溶液及び懸濁液が含まれる。非水性溶媒の例には、プロピレン・グリコール、ポリエチレン・グリコール、植物油、例えばオリーブ油、及び注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルがある。担体又は閉鎖包帯は、皮膚の透過性及び抗原吸収を高めるのに利用することが可能である。
プロリン媒介疾患は、社会にとって高まる恐怖の1つである。特に、畜牛のプロリン誘導BSEは、長きにわたって無視され、ヨーロッパ中でかなり多くの動物に感染することができる疾患を表す。さらには、CJDの変異型は、プロリン感染畜牛の肉の消費後のヒトの感染によるものである。今までの感染した人の数は比較的に低いが、この疾患が疫病になり得る可能性があると思われる。しかしながら、感染と明白な疾患の間の潜伏期間が非常に長いために(およそ10年)、vCJDの発生に関する長期の予後は特に困難である可能性ある。
プリオンは、殆どの哺乳動物種に存在する細胞タンパク質である。プリオンタンパク質は、通常は健康な個体(PrPC)に存在する正常にフォールディングした型、及び疾患を起こすミスフォールディングした型(PrpSc)の2つの型で存在する。現在のプリオンの仮説は、ミスフォールディングしたプリオン型(PrpSc)が健康なプリオンPrPCの疾患を起こすPrpSc へのリフォールディングを触媒することが可能であることを想定している(A. Aguzzi, Haematologica 85, 3-10(2000))。幾つかの希な例では、この転移は同時にも起こり得て、ヒトで古典的なCJDを起こす。PrPCにおける幾つかの変異は、この同時転移が高まることに関連していて、家族性CJDの種々の型を起こす。しかしながら、PrpSc は、感染性である可能性があり、輸血又は食物連鎖によって感染する可能性がある。プリオン媒介疾患の後の型は、クールー クールー(Kuru Kuru)として知られており、ヒト食人で発生したものであった。しかしながら、その個体で摂食する種は多くはないので、この型の経口感染疾患は、他の種にとって記録できないほどに珍しかった。
今では、、ヨーロッパ中の牛肉産物による畜牛の大量飼育は、近年、劇的に増加した数十万の畜牛を冒している感染型のBSEを引き起こすPrpScで感染された畜牛の状況と数を変えた。大量のBSE疾患畜牛の突然の出現は、同じような疾患がヒトで誘発され得るという大きな恐怖を人集団に引き起こした。実際に、1996には、PrpSc感染牛肉の消費に原因があるであろうCJDの変異型の最初のケースが報告された。現在までに、感染した人の数が、後の数年間に一定の割合で増加し、治療法が見当たらないことから、この恐怖は、さらに高まっている。さらには、スクレピーと呼ばれるプリオン媒介疾患で死ぬ羊のため、及び他の哺乳動物種がPrpSc に感染する可能性があるためである。
実験的には、BSE様疾患が他の種でも起こり得ることは可能性がある。プリオン感染の機構は、かなり詳しく研究されている。プリオンは、最初に、感染したマウスのリンパ器官で複製し、その次に、中枢神経系へ伝染する。リンパ器官では希な細胞集団である濾胞性樹状細胞(FDCs)は、リンパ器官のプリオンタンパク質の複製と中枢神経系への伝染の双方にとって必須であると思われる(S. Brandner, M. A. Klein, A. Aguzzi, Transfus Clin Biol 6, 17-23(1999);F. Montrasio, ら, Science 288, 1257-9(2000))。FDCsは、あまり研究されていない細胞型であるが、その発生のためには、それが、B細胞によるリンホトキシン及び/又はTNFの産生に依存していることが現在は明らかとなっている(F. Mackay, J. L. Browning, Nature 395, 26-27(1998))。実際に、リンホトキシンを欠くマウスは、FDCsを示さない(M. S. Matsumoto, ら, Science 264, 703-707(1996))。さらには、それは、プリオンで生産的に感染されず、疾患で死ぬこともない。FDCsの他に、抗体は、疾患の進行も担い得る(S. Brandner, M. A. Klein, A. Aguzzi, Trnasfus Clin Biol 6, 17-23(1999))。
最近では、LtbレセプターFc融合分子を利用したLTb経路のブロッキングは、マウスのFDCsを取り除くだけでなく、PrPSc による感染もブロックする(F. Montrasioら, Science 288, 1257-9(2000))。従って、LTbに特異的な抗体を誘導するワクチン、又はそのレセプターは、1つの個体からその他への、又は末梢から中枢神経系へのPrPSc の伝染をブロックすることが可能であり得る。
しかしながら、常套的なワクチン接種によって自己分子への抗体反応を誘導することが不可能ではないとしても、それは通常は難しい。ワクチン接種の効率を向上させる1つの方法は、応用する抗原の反復性の程度を高めることである。単離したタンパク質とは異なり、ウイルスは、T細胞の助けがあってもなくても、どんなアジュバンドの非存在下で迅速かつ効率的な免疫応答を誘導する(Bachmann&Zinkemagel, Ann. Rev. Immunol. 15:235-270(1991))。ウイルスは、しばしば僅かのタンパク質で構成されるが、それは、その単離された成分よりももっとより強力な免疫応答を誘発することが可能である。B細胞応答にとっては、ウイルスの免疫原性にとって1つの重要な要因は、反復性及び表面エピトープの配列である。多くのウイルスが、B細胞上のエピトープ特異的免疫グロブリンを効率的に架橋するエピトープの規則的なアレイを表示する準結晶表面を示す(Bachmann&Zinkenagel, Immunol. Today 17:553-558(1996))。B細胞上の表面の免疫グロブリンの架橋は、細胞周期の進行とIgM抗体の産生を直接に誘導する強力な活性化シグナルである。さらには、誘発されたB細胞は、Tヘルパー細胞を活性化することが可能であり、これは、次に、B細胞でのIgMからIgG抗体産生へのスイッチ、長寿記憶B細胞の生成−任意のワクチン接種の目標をを誘導する(Bachmann&Zinkenagel, Ann. Rev. Immunol. 15:235-270(1997))。ウイルス構造は、自己免疫疾患における抗-抗体の生成にさえもつながり、病原体への天然の応答の一部分である(Fehr, T., ら, J Exp. Med. 185:1785-1792(1997))。従って、高度に組織化されたウイルス表面によって示される抗体は、強力な抗-抗体応答を誘導することが可能である。
免疫系は、通常は、自己に由来する構造に対する抗体を産生しない。低濃度で存在する可溶性抗原に関しては、これは、Th細胞レベルでのトレランスのためである。これらの条件下では、Tヘルパーを供給することが可能な担体への自己抗原のカップリングは、トレランスを破壊する。高濃度で存在する可溶性タンパク質、又は低濃度の膜タンパク質に関しては、B及びTh細胞がトレランスである可能性がある。しかしながら、B細胞トレランスは可逆性(アネルギー)である可能性があり、外来担体とカップリングした高度に組織化した方法での抗原の投与によって破壊することが可能である(Bachmann& Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol. 15:235-270(1997))。従って、ウイルス、ウイルス様粒子又は細菌線毛と同じように高度に組織化されたLTb、LTa又はLTbレセプターは、B細胞トレランスを破壊し、これら分子に特異的な抗体を誘導することが可能である。
本発明は、分子生物学、ウイルス学、免疫学及び医学の分野に関連する。本発明は、内在性リンホトキシン(LT)b、LTa又はLTbレセプターに対して特異的な抗体の誘導を促進する方法を提供する。本発明は、また、変異型クロイツフェルト・ヤコブ病(vCJD)又は牛海綿状脳症(BSE)等のプリオン媒介疾患の予防及び治療、そして自己免疫疾患組織のリンパ器官様構造の除去にとって有用なLTb、LTa又はLTbレセプターに対して特異的な抗体を誘発することができる抗原又は抗原決定基を産生する工程を提供する。
本発明の目的は、LTb、LTa又はLTbレセプターに対して特異的な抗体を誘導し、それによってリンパ器官からFDCsを取り除くことができるワクチンを提供する。この治療は、末梢から中枢神経系へのPrPScによる感染又はPrPScの拡散を防ぐことを可能することができる。さらには、この治療は、自己免疫疾患によって標的とされる器官でのリンパ器官様構造の生成を阻止し、そのような存在する構造を溶解し、疾患の症状を改善することさえできる。
LTb、LTa又はLTbレセプター又はその断片は、宿主にとって外来物であるタンパク質担体とカップリングする。本発明の好ましい実施態様では、LTb、LTa又はLTbレセプター又はその断片は、これら分子へ高度に規則正しくくり返された組織性を付与するために、高度に組織化した構造とカップリングしている。高度に組織化した構造は、細菌線毛、バクテリオファージQβの組み換えタンパク質、ロタウイルスの組み換えタンパク質、ノーウォーク・ウイルスの組み換えタンパク質、アルファ・ウイルスの組み換えタンパク質、口蹄疫ウイルスの組み換えタンパク質、レトロウイルスの組み換えタンパク質、B型肝炎の組み換えタンパク質、タバコモザイクウイルスの組み換えタンパク質、フロックハウスウイルスの組み換えタンパク質、及びヒト乳頭腫ウイルスの組み換えタンパク質によって産出されるウイルス様粒子(VLP)であってもよい。高度に組織化した構造上のLTb、LTa又はLTbレセプター又はその断片の三次元構造を最適化するためには、化学的に活性なアミノ酸等の付着部位を高度に組織化した構造へ導入し(それが、天然になかったならば)、化学的に活性なアミノ酸等の結合部位をLTb、LTa又はLTbレセプター又はその断片上に導入する(それが、天然になかったならば)。高度に組織化された構造上の付着部位、及びLTb、LTa又はLTbレセプター又はその断片上の結合部位の存在は、効率的なB細胞応答の誘導にとって必須である、方向付けられており規則正しい様式の反復構造へこれら分子をカップリングすることを可能にする。
同じように好ましい実施態様では、反復性構造へ導入された付着部位は、ストレプトアビジンに特異的に結合するビオチンである。ビオチンは、化学修飾によって導入される。LTb、LTa又はLTbレセプター又はその断片は、ストレプトアビジンと連結し、ビオチン化した反復性構造と結合することができる。
本発明の他の実施態様には、本発明の組成物の産生に関する工程、及び前記組成物を用いた治療方法が含まれる。前述の一般的記載及び以下の詳細な説明の双方は、模範的及び単に説明的であり、クレームされた本発明のさらなる説明を提供することを意図している。
ワクチン技術に加えて、本発明の他の実施態様は、癌及びアレルギーに関する治療の方法に関する。
ここで言及したすべての特許及び刊行物は、それらがすべてが参考文献として明らかに取り入れられている。
(実施例)
以下の実験で利用する酵素及び試薬には:New England Biolabsから得たT4 DNAリガーゼ;キアゲンから得たTaq DNA ポリメラーゼ、QIAprep Spin Plasmid Kit、キアゲン Plasmid Midi Kit、QiaExII Gel Extraction Kit、QIAquick PCR Purification Kit;ファルマシア(Pharmacia)から得たQuickPrep Micro mRNA Purification Kit;Gibco BRLから得たSuperScript One-step RT PCR Kit、ウシ胎児血清(FCS)、バクトトリプトン(bacto tryptone)及び酵母エキス;Microsynth(スイス)から得たオリゴヌクレオチド;ベーリンガー・マンハイム(Boehringer Mannheim)、New England Biolabs又はMBI Fermentasから得た制限エンドヌクレアーゼ;ベーリンガー・マンハイム(Boehringer Mannheim)から得たPwo ポリメラーゼ及びdNTPsが含まれる。HP-1培地は、Cell culture technologies(Glattbrugg、スイス)から得た。すべての標準化学品はFluka-Sigma-Aldrichから得て、すべての細胞培養材料はTPPから得た。
DNA操作は、標準的技術を利用して行った。DNAは、QIAprep Spin Plasmid Kitを用いて2mlの細菌培養液から、又は、キアゲン Plasmid Midi Kitを用いて50ml培養液からのいずれかの製造者指示書に従って調製した。制限酵素消化に関しては、DNAは、製造者の奨励する条件下(緩衝液及び温度)で、1mg DNA当たり5-10ユニット(U)酵素の濃度の適切な制限酵素によって、少なくとも2時間インキュベートした。反応条件がすべての酵素で適切であったならば、1つ以上の酵素による消化を同時におこない、そうでなければ継続的におこなった。さらなる操作のために単離したDNA断片を、0.7から1.5%アガロースゲルの電気泳動によって分離し、そのゲルからの切り取り、そして製造者が提供した指示書に従ってQiaExII Gel Extraction Kitで精製した。DNA断片のライゲーションに関しては、100から200pgの精製ベクターDNAを、製造者によって提供された緩衝液の中において、1U T4 DNAリガーゼの存在下の16℃で、3倍モル濃度を超える挿入断片とともに終夜インキュベートした(全容量:10-20μl)。ライゲーション反応のアリコート(0.1から0.5μl)を、大腸菌XL1-Blueの形質転換に利用した(ストラタジーン)。形質転換は、200 Ohm、25μF、1.7kVで、Gene Pulser(BioRAD)及び0.1cm Gene Pulser Cuvettes(BioRAD)を用いたエレクトロポレーションによっておこなった。エレクトロポレーションの後、選択S.O.B.寒天上にプレートする前に、細胞を、1ml S.O.B.培地(Miller, 1972)で1時間、振盪することでインキュベートした。
抗原をVLPsとカップリングさせるためのモジュラー真核生物発現系
この系は、VLPsへの化学カップリングのために、システイン残基を有する種々のアミノ酸リンカー配列を抗原へ付加するために作製された。
A.システイン含有アミノ酸リンカー及び開裂可能なFc-TagをコードするEBNA由来発現系の構築:
pCep-Pu(Wuttkeら, J. Biol. Chem. 276: 36839-48(2001))を、Kpn I及びBam HIで消化し、新しいマルチクローニング部位を、pCep-MCSへつながる、アニール化したオリゴヌクレオチドPH37(配列番号:270)及びPH38(配列番号:271)とともに導入した。
幾つかのグリシンが近接している遊離システイン、プロテアーゼ切断部位、及びヒトIgG1の定常領域を有するモジュラー系を以下のようして作製した。pSec2/HygroB(インビトロジェン カタログ第V910-20号)をBsp120I及びHindIIIで消化し、アニール化したオリゴヌクレオチドSU7(配列番号:278)及びSU8(配列番号:279)でライゲーションしてpSec-B-MCSを構築した。pSec-B-MCSを、その後、NheI及びHindIIIで消化し、アニール化したオリゴヌクレオチドPH29(配列番号:264)及びPH30(配列番号:265)でライゲーションしてpSec29/30を構築した。コンストラクトpSec-FL-EK-Fcを、次の断片の3断片ライゲーションによって構築した;最初にEcoRI及びHindIIIで消化したpSec29/30、アニール化したオリゴヌクレオチドPH31(配列番号:266)及びPH32(配列番号:267)、及びヒトIgG1定常領域の修飾バージョンを有するプラスミド(pSP-Fc-C1)のBgII/EcoRI断片(hu IgG1配列の詳細に関しては、最終コンストラクトpCep-Xa-Fcの配列を参照し、図1A-1Cを参照せよ)。pCep-Xa-Fcの完全な配列は、配列番号:283で与えられている。結果として生じたコンストラクトは、pSec-FL-EK-Fcと命名された。このプラスミドから、リンカー領域及びヒトIgG1 Fc部分をNheIで切り出し、PmeIで消化して、NheI及びPmeIで消化したpCep-MCSへクローニングしてpCep-FL-EK-Fcを構築した。従って、NheI及びHindIII部位の間に位置するリンカー配列及びプロテアーゼ切断部位を作製したモジュラーベクターは、容易にアニール化オリゴヌクレオチドで交換することが可能である。切断可能な融合タンパク質に関しては、ベクターpCep-FL-EK-FcをNheI及びHindIIIで消化し、アミノ酸GGGGCGがN末端に近接したXa因子切断部位を、アニール化したオリゴヌクレオチドPH35(配列番号:268)及びPH36(配列番号:269)とともに導入し、GGGGCGがN末端に近接したエンテロキナーゼ部位を、アニール化したオリゴヌクレオチドPH39(配列番号:272)及びPH40(配列番号:273)とともに導入し、それぞれコンストラクトpCeP-Xa-Fc(図1Aを参照)及びpCep-EK-Fc(図1Bを参照)へ導いた。さらに真核生物シグナルペプチドを有するpCep-SP-EK-Fc(図1Cを参照)は、Kpn I/Bam HIで消化したpCeP-EK-Fc、アニール化したオリゴPH41(配列番号:274)及びPH42(配列番号:275)、及びアニール化したオリゴPH43(配列番号:276)及びPH44(配列番号:277)の3断片のライゲーションによって作製される。
B.融合タンパク質の大容量生産:
異なる融合タンパク質の大容量生産に関しては、293-EBNA細胞(インビトロジェン)を製造者指示書に従って、リポフェクタミン2000試薬(life technologies)によって、異なるpCep発現プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの24-36時間後に、その細胞を10%FCSを補充したDMEMでのピューロマイシン選択(1μg/ml)下で1対3の比で分けた。その耐性細胞を、その後、選択培地に拡散させた。融合タンパク質の収集については、耐性細胞集団をポリ-L-リジンでコーティングしたシャーレ上に蒔いた。一度、細胞がコンフルエンスに達したら、シャーレをPBSで2回洗浄し、無血清培地(DMEM)をプレートへ添加した。組織培養の上澄み液を2から4日毎に収集し、1ヶ月の期間まで新鮮なDMEM培地で置き換えた。収集した上澄み液は、4℃で保持した。
C.融合タンパク質の精製
組み換えFc融合タンパク質は、プロテインAセファロースCL-4B(アマシャム ファルマシア バイオテク AG)を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製した。手短に言うと、コロマトグラフィーカラムを1-3mlのプロテインA樹脂で詰め込み、0.5〜1.5ml/分の流速で蠕動ポンプ によって、組み換えタンパク質を有する組織培養の上澄み液をカラムへ負荷した。このカラムを、その後、20-50mlのPBSで洗浄した。融合タンパク質によって、プロテアーゼ切断がカラム上でおこなわれるか、又は、タンパク質が下記のようにして溶出された。組み換え融合タンパク質を150mM NaClを補充したクエン酸/リン酸緩衝液(pH3.8)で溶出し、そのタンパク質を有する分画をプールし、ウルトラフリー遠心フィルター(ミリポア)で濃縮した。
D.組み換え融合タンパク質のプロテアーゼ切断(Xa因子、エンテロキナーゼ):
エンテロキナーゼ(EK)切断部位を有する溶出した組み換え融合タンパク質を、製造者指示書に従って、EKmaxシステム(インビトロジェン)を利用して切断した。融合タンパク質の切断Fc部分を、プロテインAによるインキュベーションによって除いた。その後、製造者の推奨に従い、EK-Awayシステム(インビトロジェン)によってエンテロキナーゼを除いた。同様に、Xa因子(Xa)切断部位を有する融合タンパク質を、製造者の推奨に従い、制限プロテアーゼXa因子切断及び除去キット(Roche)を用いて切断した。切断Fc部分をプロテインAによるインキュベーションによって取り除き、キットとともに提供されているストレプトアビジン樹脂によってプロテアーゼを取り除いた。
異なる融合タンパク質は、ウルトラフリー遠心フィルター(ミリポア(Millipore))で濃縮して、UV分光光度法によって定量し、後のカップリング反応に用いた。
図1A-1Cは、用いられた異なる真核生物発現ベクターの部分配列を示す。修飾された配列が示されているのみである。
図1A:pCep-Xa-Fc:配列が、前方のBamHI部位で示され、異なる特徴が、翻訳配列より上流に示されている。矢印は、Xa因子プロテアーゼの切断部位を示す。
図1B:pCep-EK-Fc:配列が、前方のBamHI部位で示され、異なる特徴が、翻訳配列より上流に示されている。矢印は、エンテロキナーゼの切断部位を示す。Hind III部位の配列下流は、図1Aに示されているものと同一である。
図1C:pCep-SP-EK-Fc:配列が、シグナルペプチド上の開始から示され、異なる特徴が、翻訳配列の上流で示されている。シグナルペプチダーゼによって切断されるシグナルペプチド配列は、太字で示されている。矢印は、エンテロキナーゼの切断部位を示す。HindIII部位の配列下流は、図1Aに示されているものと同一である。
真核生物発現及びマウスレジスチンのVLPs及び線毛とのカップリング
A. マウスレジスチンのクローニング
製造者の推奨に従いキアゲン RNeasyキットを用いて、60mgマウス脂肪組織から全RNAを単離した。この全RNAは、40μlのHOで溶出させた。この全RNAを、その後、製造者の推奨に従いThemoScript(商品名)RT-PCRシステム(Life Technologies)を用いて、オリゴdTプライマーによる逆転写に用いた。試料は、1時間、50℃でインキュベートし、5分間、85℃で加熱し、37℃で20分間、RNAseHで処理した。
2μlのRT反応を、マウスレジスチンのPCR増幅に利用した。そのPCRは、プライマーPH19(配列番号:260)及びPH20(配列番号:261)を用いて、製造者の推奨に従いPlatiniumTAQ(Life Technologies)を用いておこなった。プライマーPH19(配列番号:260)は、マウスレジスチン配列の位置58-77、そしてプライマーPH20(配列番号:261)は位置454-435と一致する。PCR混合物は、最初に2分間、94℃で変性させ、その後で以下のようにして35サイクルをおこなった:30秒間の94℃、30秒間の56℃、及び1分間の72℃、末期の試料は、10分間、72℃に放置した。このPCR断片を、pGEMT-mResに至るように、精製してTAクローニングすることによってpGEMTeasyベクター(インビトロジェン)へクローニングした。適切な制限部位を付加するために、二回目のPCRを、上記と同じサイクルプログラムを用いて、プライマーPH21(配列番号:262)及びPH22(配列番号:263)でpGEMT-mResに施した。その前方向プライマー(PH21(配列番号:262)は、マウスレジスチン配列のBamHI部位及びヌクレオチド81-102を有する。その逆方向プライマー(PH22(配列番号:263))は、マウスレジスチン配列のXbaI部位及びヌクレオチド426-406を有する。示された位置は、マウスレジスチン配列遺伝子寄託番号AF323080に当てはまる。この遺伝子産物を、pcmv-mRes-Fcコンストラクトに至るように、精製してBamHI及びXbaIで消化し、BamHI及びXbaIで消化したpcmv-Fc*-C1へサブクローニングした。
レジスチンのオープンリーディングフレームをBamHI/XbaI消化で切り出し、それぞれがコンストラクトpCep-mRes-Xa-Fc及びpCep-mRes-EK-FcとなるようにBamHI及びNheIで消化したpCep-Xa-Fc及びpCep-EK-Fc(実施例1、B章を参照)へクローニングした。
B.レジスチンの産生、精製及び切断
pCep-mRes-Xa-Fc及びpCep-mRes-EK-Fcコンストラクトを、その後、実施例1、B章に記載のような組み換えタンパク質の産生のために、293-EBNA細胞をトランスフェクトするのに用いた。組織培養上澄みは、実施例1、C章に記載したように精製した。精製したタンパク質は、その後、実施例1、D章に記載のようにして切断した。その結果として生じた組み換えタンパク質は、用いたベクターに従って、「レジスチン-C-Xa」又は「Res-C-Xa」及び「レジスチン-C-EK」又は「Res-C-EK」と呼ばれた(図2A及び図2Bを参照せよ)。
図2A及び図2Bは、発現及びさらなるカップリングに用いる組み換えマウスレジスチンタンパク質の配列を示す。Res-C-Xa(図2A)及びRes-C-EK(図2B)は、翻訳されたDNA配列を示す。シグナルペプチダーゼによってタンパク質分泌において切断されるレジスチンシグナル配列は、イタリック文字で示されている。シグナルペプチダーゼ及び特異的プロテアーゼ(Xa因子又はエンテロキナーゼ)切断によって生じるアミノ酸配列は、太字で示されている。太字の配列は、カップリングに利用された実際のタンパク質配列、すなわち配列番号:280、配列番号:281と一致する。配列番号:282は、選択的なレジスチンタンパク質コンストラクトと一致し、本発明によるウイルス様粒子及び線毛とのカップリングにも利用することができる。
C.Qβキャプシドタンパク質とのレジスチン-C-Xa及びレジスチン-C-EKのカップリング
0.2mlの20mM Hepes、150 mM NaCl pH7.4中の2mg/ml Qβキャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上で、25℃で、5.6μlのDMSO中の100mM SMPH(Pierce)の溶液と30分間反応させた。この反応液について、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。8μlの透析したQβ反応液混合物を、その後、32μlのレジスチン-C-Xa溶液と反応させ(0.39mg/mlの最終濃度のレジスチンとなる)、13μlのQβ反応混合液を、ロッキングシェーカー上で25℃で4時間、27μlレジスチン-C-EK溶液と反応させた(0.67mg/mlの最終濃度のレジスチンとなる)。カップリング産物を、SDS-PAGEによって分析した(図2Cを参照)。24kDaのさらなるバンドがカップリング反応に存在したが、誘導化Qβ及びレジスチンにはそれぞれ存在しなかった。24kDaの大きさは、カップリングした産物に関する予想サイズである24kDaと一致する(Qβの14kDaに加えて、それぞれレジスチン-C-Xa及びレジスチン-C-EKの10kDa)。
図2Cは、Qβとのレジスチン-C-Xa及びレジスチン-C-EKのカップリングの結果を示す。カップリング産物を、還元条件下の16%SDS-PAGEゲル上で分析した。レーン1:分子量マーカー。レーン2:カップリング前のレジスチン-C-EK。レーン3:カップリング後のレジスチン-C-EK。レーン4:誘導体化Qβ。レーン5:カップリング前のレジスチン-C-Xa。レーン6:カップリング後のレジスチン-C-Xa-Qβ。マーカータンパク質の分子量は、左端に示されている。カップリングしたバンドは、矢印で示されている。
D.frキャプシドタンパク質とのレジスチン-C-Xa及びレジスチン-C-EKのカップリング
0.2mlの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.4中の2mg/ml frキャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上で、25℃で、5.6μlのDMSO中の100mM SMPH(Pierce)の溶液と30分間反応させる。この反応液について、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなう。8μlの透析したfrキャプシドタンパク質反応液混合物を、その後、32μlのレジスチン-C-Xa溶液と反応させ(0.39mg/mlの最終濃度のレジスチンとなる)、13μlのfrキャプシドタンパク質反応混合液を、ロッキングシェーカー上で25℃で4時間、27μlレジスチン-C-EK溶液と反応させた(0.67mg/mlの最終濃度のレジスチンとなる)。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
E.HBcAg-Lys-2cys-Mutとのレジスチン-C-Xa及びレジスチン-C-EKのカップリング
0.2mlの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の2mg/ml HBcAg-Lys-2cys-Mutの溶液を、ロッキングシェーカー上で、25℃で、5.6μlのDMSO中の100mM SMPH(Pierce)の溶液と30分間反応させる。この反応液について、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対して2時間の透析を2回おこなう。8μlの透析したHBcAg-Lys-2cys-Mut反応液混合物を、その後、32μlのレジスチン-C-Xa溶液と反応させ、13μlのHBcAg-Lys-2cys-Mut反応混合液を、ロッキングシェーカー上で25℃で4時間、27μlレジスチン-C-EK溶液と反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
F.線毛とのレジスチン-C-Xa及びレジスチン-C-EKのカップリング
400μlの20mM Hepes、pH7.4中の2.5mg/ml 大腸菌の1型線毛の溶液を、ロッキングシェーカー上のRTで、60分間、DMSO(Pierce)中の原液から希釈した50倍モル濃度を超える架橋剤SMPHと反応させる。この反応混合物は、PD-10カラム(アマシャム ファルマシア バイオテク)上で脱塩する。このカラムから溶出したタンパク質を含有する分画をプールし、8μlの脱塩し誘導体化した線毛タンパク質を32μlのレジスチン-C-Xa溶液と反応させ、13μlの脱塩し誘導体化した線毛タンパク質を、ロッキングシェーカー上で25℃で4時間、27μlレジスチン-C-EK溶液と反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
A.cys-含有リンカーの導入、マウスリンホトキシン-βの発現及び精製
マウスリンホトキシン-●(LT-●)の細胞外部分は、そのN末端にCGGアミノ酸リンカーを有して組み換え的に発現させた。このリンカーは、VLPとのカップリングのための1つのシステインを有していた。タンパク質の長い(aa49-306)及び短いバージョン(aa126-306)を、精製のために、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)又はヒスチジン-mycタグのいずれかに対してそのN末端で融合させた。エンテロキナーゼ(EK)切断部位は、タグの切断のために挿入した。
C-LT●49-306及びC-LT●126-306の構築
マウスLT●49-309は、pFB-LIBへ挿入したマウス脾臓cDNAライブラリからオリゴ5' LT●及び3' LT●によるPCRによって増幅させた。PCR増幅反応に関しては、0.5μgの各プライマー及び200ngのテンプレートDNAを50●1反応混合液(1ユニットのPFX Platinum ポリメラーゼ、0.3mM dNTPs及び2mM MgSO)に用いた。温度サイクルは以下の通りである:94℃を2分間、続いて25サイクルの94℃(15秒)、68℃(30秒)、68℃(1分)及び続いて68℃を10分間。PCR産物をT4キナーゼでリン酸化し、EcoRVで切断して脱リン酸化してあるpEntry1A(Life technologies)へライゲーションした。この結果生じたプラスミドは、pEntry1A-LT●49-306と命名された。
二番目のPCR反応は、オリゴス5' LT●long-NheI及び3' LT●stop-NotI resp. 5' LT●short-NheI及び3' LT●stop-NotI、pEntry1A-LT●49-306をテンプレートとしておこなった。オリゴス5' LT●long-NheI及び5' LT●short-NheIは内部NheI部位を有し、Cys-Gly-Glyリンカーのコドンを含有し、3' LT●stop-NotIは内部NotI部位を有し、終止コドンを含有していた。二番目のPCR増幅反応に関しては、0.5μgの各プライマー及び150ngのテンプレートDNAを50●1反応混合液(1ユニットのPFX Platinum ポリメラーゼ、0.3mM dNTPs及び2mM MgSO)に用いた。温度サイクルは以下の通りである:94℃を2分間、続いて5サイクルの94℃(15秒)、50℃(30秒)、68℃(1分)、続いて20サイクルの94℃(15秒)、64℃(30秒)、68℃(1分)、及び続いて68℃を10分間。
PCR産物をNheI及びNotIで消化し、pCEP-SP-GST-EK又はpCEP-SP-his-myc-EKのいずれかへ挿入した(Wuttkeら. J. Biol. Chem. 276:36839-48(2001))。結果として生じたプラスミドは、それぞれpCEP-SP-GST-EK-C-LT●49-306、pCEP-SP-GST-EK-C-LT●126-306、pCEP-SP-his-myc-EK-C-LT●49-306、pCEP-SP-his-myc-EK-C-LT●126-306と命名された。GSTはグルタチオン-S-トランスフェラーゼ、EKはエンテロキナーゼ、hisはヘキサヒスチジンタグ、そしてmycは抗c-mycエピトープを意味する。Cは、付加的なシステインを有するCGGリンカーを示唆する。
すべての他の段階は、標準的分子生物学プロトコールによっておこなわれる。
オリゴヌクレオチドの配列:
5' LT●:
5' -CTTGGTGCCGCAGGATCAG-3' (配列番号:284)
3' LT●:
5' -CAGATGGCTGTCACCCCAC -3' (配列番号:285)
5' LT●long-NheI:
5' -GCCCGCTAGCCTGCGGTGGTCAGGATCAGGGACGTCG-3' (配列番号:286)
5' LT●short-NheI:
5' -GCCCGCTAGCCTGCGGTGGTTCTCCAGCTGCGGATTC-3' (配列番号:287)
3' LT●stop-NotI:
5' -CAATGACTGCGGCCGCTTACCCCACCATCACCG-3' (配列番号:288)
GST-EK-C-LT●49-306、GST-EK-C-LT●126-306、his-myc-EK-C-LT●49-306及びhis-myc-EK-C-LT●126-306の発現及び産生
プラスミドpCEP-SP-GST-EK-C-LT●49-306、pCEP-SP-GST-EK-C-LT●126-306、pCEP-SP-his-myc-EK-C-LT●49-306及びpCEP-SP-his-myc-EK-C-LT●126-306を、実施例1に記載のようにタンパク質産生のために293-EBNA細胞(インビトロジェン)へトランスフェクトした。その結果として生じたタンパク質を、GST-EK-C-LT●49-306、GST-EK-C-LT●126-306、his-myc-EK-C-LT●49-306及びhis-myc-EK-C-LT●126-306と命名した。
LT●融合タンパク質のタンパク質配列は、cDNA配列から翻訳された:
GST-EK-C-LT●49-306(配列番号:289)
GST-EK-C-LT●126-306(配列番号:290)
his-myc-EK-C-LT●49-306(配列番号:291)
his-myc-EK-C-LT●126-306(配列番号:292)
融合タンパク質は、還元条件下の12%SDS-PAGEゲル上で分析した。ゲルは、ニトロセルロース膜上にブロットした。膜をブロックし、モノクローナルマウス抗-myc抗体によって、又は抗-GST抗体とともにインキュベートした。ブロットは、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ-コンジュゲートヤギ抗-マウスIgG、又は西洋ワサビペルオキシダーゼ-コンジュゲートウサギ抗-ヤギIgGとともにインキュベートした。その結果は、図3に示す。GST-EK-C-LT●49-306及びGST-EK-C-LT●126-306は、抗-GST抗体によって、それぞれ62kDa及び48kDaの分子量で検出することが可能である。 his-myc-EK-C-LT●49-306及びhis-myc-EK-C-LT●126-306は、抗-myc抗体によって、それぞれ40-56kDa及び33-39kDaで検出することが可能である。
図3A及び図3Bは、LT●融合タンパク質の発現の結果を示す。LT●融合タンパク質は、還元条件下の12%SDS-PAGEゲル上で分析する。ゲルは、ニトロセルロース膜上にブロットする。膜をブロックし、モノクローナルマウス抗-myc抗体(希釈1:2000)(図3A)とともに、又は抗-GST抗体(希釈1:2000)によってインキュベートした。ブロットは、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ-コンジュゲートヤギ抗-マウスIgG(希釈1:4000)(図3A)、又は西洋ワサビペルオキシダーゼ-コンジュゲートウサギ抗-ヤギIgG(希釈1:4000)(図3B)とともにインキュベートした。A:レーン1及び2:his-myc-EK-C-LT●126-306.レーン3及び4:his-myc-EK-C-LT●49-306.B:レーン1及び2:GST-EK-C-LT●126-306.レーン3及び4:GST-EK-C-LT●49-306 .マーカータンパク質の分子量は、左端上に示されている。
B.GST-EK-C-LT●49-306、GST-EK-C-LT●126-306、his-myc-EK-C-LT●49-306及びhis-myc-EK-C-LT●126-306の精製
GST-EK-C-LT●49-306及びGST-EK-C-LT●126-306をグルタチオン-セファロースカラム上で精製し、his-myc-EK-C-LT●49-306及びhis-myc-EK-C-LT●126-306を標準精製プロトコールを用いて、Ni-NTAセファロースカラム上で精製する。その精製タンパク質はエンテロキナーゼで切断し、還元条件下の16%SDS-PAGEゲル上で分析する。
C.C-LT●49-306及びC-LT●126-306のQβキャプシドタンパク質とのカップリング
20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の120μMのQβキャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上において25℃で、DMSO中の原液から希釈した25倍モル濃度を超えるSMPH(Pierce)の溶液と30分間反応させる。この反応液について、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなう。この透析したQβ反応混合液を、ロッキングシェーカー上において25℃で4時間、C-LT●49-306及びC-LT●126-306溶液(最終濃度:60μM Qβ、60μM C-LT●49-306及びC-LT●126-306)と反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
D.C-LT●49-306及びC-LT●126-306のfrキャプシドタンパク質とのカップリング
20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の120μMのfrキャプシドの溶液を、ロッキングシェーカー上において25℃で、DMSO中の原液から希釈した25倍モル濃度を超えるSMPH(Pierce)の溶液と30分間反応させる。この反応液について、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなう。この透析したfrキャプシドタンパク質反応混合液を、ロッキングシェーカー上において25℃で4時間、C-LT●49-306及びC-LT●126-306溶液(最終濃度:60μM fr、60μM C-LT●49-306及びC-LT●126-306)と反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
E.C-LT●49-306及びC-LT●126-306のHBcAg-Lys-2cys-Mutとのカップリング
20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の120μMのHBcAg-Lys-2cys-Mutキャプシドの溶液を、ロッキングシェーカー上において25℃で、DMSO中の原液から希釈した25倍モル濃度を超えるSMPH(Pierce)の溶液と30分間反応させる。この反応液について、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなう。この透析したHBcAg-Lys-2cys-Mut反応混合液を、ロッキングシェーカー上において25℃で4時間、C-LT●49-306及びC-LT●126-306溶液(最終濃度:60μM HBcAg-Lys-2cys-Mut、60μM C-LT●49-306及びC-LT●126-306)と反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
F.C-LT●49-306及びC-LT●126-306の線毛とのカップリング
20mM Hepes、pH7.4中の125μM 大腸菌の1型線毛の溶液を、ロッキングシェーカー上でのRTで、60分間、DMSO(Pierce)中の原液から希釈した50倍モル濃度を超える架橋剤SMPHと反応させる。この反応混合物は、PD-10カラム(アマシャム ファルマシア バイオテク)上で脱塩する。このカラムから溶出したタンパク質含有分画をプールし、脱塩し誘導体化した線毛タンパク質をロッキングシェーカー上において25℃で4時間、C-LT●49-306及びC-LT●126-306溶液(最終濃度:60μM 線毛、60μM C-LT●49-306及びC-LT●126-306)と反応させる。カップリング産物を、還元条件下のSDS-PAGEによって分析する。
A.cys-含有リンカーの導入、ラットマクロファージ遊走阻害因子MIFの発現、精製及びQβへのカップリング
ラットマクロファージ遊走阻害因子(rMIF)を、そのC末端で3つの異なるアミノ酸リンカーC1、C2及びC3を融合させて、組み換え発現させた。各リンカーは、VLPとのカップリングのための1つのシステインを有していた。
rMIF-C1、rMIF-C2、及びrMIF-C3の構築
アニール化したオリゴスプライマーMCS-1F及びプライマーMCS-1R(15mM トリスHCl pH緩衝液でのアニーリング)によって、元の配列をNdeI部位からXhoI部位へ置き換えることで、pET22b(+)(ノバジェン, Inc.)のMCSをGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGATCCGGCTAGCGCTCGAGGGTTTAAACGGCGGCCGCATGCACCへ変えた。この結果として生じたプラスミドは、pMod00と命名され、NdeI、BamHI、NheI、XhoI、PmeI及びNotI制限部位をそのMCSに有していた。オリゴ Bamhis6-EK-Nhe-F及びBamhis6-EKNhe-Rのアニール化対、及びオリゴ1F-C-グリシン-リンカー及びオリゴ1R-C-グリシン-リンカーのアニール化対を、N末端ヘキサヒスチジンタグ、エンテロキナーゼ切断部位及び1つのシステイン残基を含有するC末端アミノ酸グリシンリンカーを有するpModEC1を得るために、BamHI-NotIで消化したpMod00プラスミドとともにライゲーションした。オリゴ1F-C-ガンマ1-リンカー及びオリゴ1R-C-ガンマ1-リンカーのアニール化した対とともに、オリゴ Bamhis6-EK-Nhe-F及びBamhis6-EKNhe-Rのアニール化対を、N末端ヘキサヒスチジンタグ、エンテロキナーゼ切断部位及び、1つのシステイン残基を含有するヒト免疫グロブリンγ1のヒンジ領域に由来するC末端●1リンカーを有するpModEC2を得るために、BamHI-NotIで消化したpMod00プラスミドへライゲーションした。オリゴ Bamhis6-EK-Nhe-F及びBamhis6-EKNhe-Rのアニール化対、オリゴ1FA-C-ガンマ1-リンカー及びオリゴ1RA-C-ガンマ3-リンカーのアニール化した対、及びオリゴ1FB-C-ガンマ3-リンカー及びオリゴ1RB-C-ガンマ3-リンカーのアニール化した対を、ともにN末端ヘキサヒスチジンタグ、エンテロキナーゼ切断部位及び、1つのシステイン残基を含有するマウス免疫グロブリン●3のヒンジ領域に由来するC末端●3リンカーを有するpModEC3を得るために、BamHI-NotIで消化したpMod00プラスミドへライゲーションした。
ラットMIF cDNAを有するpBS-rMIFを、オリゴrMIF-F及びrMIF-Xho-RによるPCRによって増幅した。rMIF-Fは内部NdeI部位を有し、rMIF-Xho-Rは内部XhoI部位を有していた。PCR産物をNdeI及びXhoIで消化し、同じ酵素で消化したpModEC1、pModEC2及びpModEC3へライゲーションした。結果として生じたプラスミドは、それぞれpMod-rMIF-C1、pMod-rMIF-C2及びpMod-rMIF-C3と命名された。
PCR反応に関しては、15pmolの各オリゴ及び1ngのテンプレートDNAを50●1反応混合液(2ユニットのPFX ポリメラーゼ、0.3mM dNTPs及び2mM MgSO)に用いた。温度サイクルは以下の通りである:94℃を2分間、続いて30サイクルの94℃(30秒)、60℃(30秒)、68℃(30秒)、及び続いて68℃を2分間。
すべての他の段階は、標準的分子生物学プロトコールによっておこなった。
オリゴヌクレオチドの配列:
プライマーMCS-1F:
5' -TATGGATCCGGCTAGCGCTCGAGGGTTTAAACGGCGGCCGCAT -3'
(配列番号:293)
プライマーMCS-1R:
5' -TCGAATGCGGCCGCCGTTTAAACCCTCGAGCGCTAGCCGGATCCA-3'
(配列番号:294)
Bamhis6-EK-Nhe-F:
5'-GATCCACACCACCACCACCACCACGGTTCTGGTGACGACGATGACAAAGC GCTAGCCC-3' (配列番号:295)
Bamhis6-EK-Nhe-R:
5'-TCGAGGGCTAGCGCTTTGTCATCGTCGTCACCAGAACCGTGGTGGTGGTG GTGGTGTG-3' (配列番号:296)
オリゴ1F-C-グリシン-リンカー:
5' -TCGAGGGTGGTGGTGGTGGTTGCGGTTAATAAGTTTAAACGC-3' (配列番号:297) オリゴ1R-C-グリシン-リンカー:
5' -GGCCGCGTTTAAACTTATTAACCGCAACCACCACCACCACCC -3'
(配列番号:298)
オリゴ1F-C-ガンマ1-リンカー:
5' -TCGAGGATAAAACCCACACCTCTCCGCCGTGTGGTTAATAAGTTTAAACG C-3'
(配列番号:299)
オリゴ1R-C-ガンマ1-リンカー:
5' -GGCCGCGTTTAAACTTATTAACCACACGGCGGAGAGGTGTGGGTTTTATCC-3'
(配列番号:300)
オリゴ1FA-C-ガンマ3-リンカー:
5' -TCGAGCCGAAACCGTCTACCCCGCCGGGTTCTTCTG-3' (配列番号:301)
オリゴ1RA-C-ガンマ3-リンカー:
5' -CACCACCAGAAGAACCCGGCGGGGTAGACGGTTTCGGC-3'(配列番号:302)
オリゴ2FB-C-ガンマ3-リンカー:
5'-GTGGTGCTCCGGGTGGTTGCGGTTAATAAGTTTAAACGC-3'(配列番号:303)
オリゴ2RB-C-ガンマ3-リンカー:
5'-GGCCGCGTTTAAACTTATTAACCGCAACCACCCGGAG-3'(配列番号:304)
rMIF-F:
5'-GGAATTCCATATGCCTATGT TCATCGTGAACAC-3'(配列番号:305)
rMIF-Xho-R:
5'-CCCGCTCGAGAGCGAAGGTGGAACCGTTC-3'(配列番号:306)
rMIF-Csの発現及び精製
コンピテント大腸菌BL21(DE3)細胞を、プラスミドpMod-rMIF-C1、pMod-rMIF-C2及びpMod-rMIF-C3で形質転換した。アンピシリン含有寒天プレートからの単一コロニーを液体培養(150mM MOPS、pH7.0、200ug/ml Amp、0.5% グルコースを有するSB)に拡散させ、30℃で220rpmの振盪で終夜インキュベートした。その後、1lのSB(150mM MOPS、pH7.0、200ug/ml Amp)に終夜培養液の1:50v/vを接種し、30℃でOD600=2.5まで生育させた。発現は、2mM IPTGによって誘導した。細胞を終夜の培養後に収集し、6000rpmで遠心分離した。細胞ペレットを0.8mg/ml リゾチームを含む溶解緩衝液(10mM NaHPO、30mM NaCl、10mM EDTA及び0.25% Tween-20)に懸濁し、超音波処理をしてベンゾナーゼで処理した。その後、2mlのライセートを20ml Q XL-及び20ml SP XL-カラムに流した。タンパク質rMIF-C1、rMIF-C2、及びrMIF-C3は、貫流液にあった。
rMIF-Csのタンパク質配列は、cDNA配列から翻訳した。
rMIF-C1:配列番号:307
rMIF-C2:配列番号:308
rMIF-C3:配列番号:309
rMIF-C1のQ●キャプシドタンパク質とのカップリング
1.48mlの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の6mg/ml Q●キャプシドタンパク質の溶液を、25℃で14.8μlのSMPH(Pierce)(DMSOに溶かした100mM 原液からの)と30分間反応させた。この反応液について、その後、4℃で2lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.0に対する3時間の透析を2回おこなった。 1.3mlの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の3.6mg/ml rMIF-C1タンパク質の溶液を、25℃で9.6μlのTCEP(Pierce)(HOに溶かした36mM 原液からの)と1時間反応させた。130μlの誘導化及び透析Q●を、25℃で241μlの20mM Hepes、150mM NaCl、pH 7.0中の129μlの還元rMIF-C1と終夜反応させた。
rMIF-C2のQ●キャプシドタンパク質とのカップリング
0.9mlの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の5.5mg/ml Q●キャプシドタンパク質の溶液を、25℃で9μlのSMPH(Pierce)(DMSOに溶かした100mM 原液からの)と30分間反応させた。この反応液について、その後、4℃で2lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなった。 850μlの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の5.80mg/ml rMIF-C2タンパク質の溶液を、RTで8.5μlのTCEP(Pierce)(HOに溶かした36mM 原液からの)と1時間反応させた。80μlの誘導化及び透析Q●を、25℃で85μlの20mM Hepes、150mM NaCl、pH 7.2中の335μlの還元rMIF-C2と終夜反応させた。
rMIF-C3のQ●キャプシドタンパク質とのカップリング
1.48mlの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の6mg/ml Q●キャプシドタンパク質の溶液を、25℃で14.8μlのSMPH(Pierce)(DMSOに溶かした100mM 原液からの)と30分間反応させた。この反応液について、その後、4℃で2lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.0に対す3時間の透析を2回おこなった。
720μlの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の5.98mg/ml rMIF-C3タンパク質の溶液を、25℃で9.5μlのTCEP(Pierce)(HOに溶かした36mM 原液からの)と1時間反応させた。130μlの誘導化及び透析Q●を、25℃で80μlの290μlの20mM Hepes、150mM NaCl、pH 7.0中の還元rMIF-C3と終夜反応させた。
すべての3つのカップリング産物を、還元条件下の16%SDS-PAGEゲル上で分析した。ゲルには、クーマシーブリリアントブルーで染色するか、又はニトロセルロース膜上にブロットするかのいずれかを施した。膜はブロックし、ポリクローナルウサギ抗-Qb抗血清(希釈1:2000)、又は精製ウサギ抗-MIF抗体(Torrey Pines Biolabs, Inc.)でインキュベートした(希釈1:2000)。ブロットを、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ-コンジュゲートヤギ抗-ウサギIgG(希釈1:2000)とともにインキュベートした。その結果は、図4A及び図4Bに示す。カップリング産物はクーマシー染色ゲル(図4A)で検出が可能であり、●抗-Qβ●抗血清及び抗-MIF抗体の双方(図4B)によって、すべて3つのrMIF変異体のQβ●キャプシドタンパク質との共有カップリングを明白示されている。
図4Aは、MIFコンストラクトのQβとのカップリングを示す。カップリング産物を、還元条件下の16%SDS-PAGEゲル上で分析した。そのゲルは、クーマシーブリリアントブルーで染色した。マーカータンパク質の分子量は、左端に示されている。
図4Bは、MIF-C1のQβとのカップリングを示す。カップリング産物を、還元条件下の16%SDS-PAGEゲル上で分析した。レーン1:カップリング前のMIF-C1.レーン2:カップリング前の誘導体化Qβ.レーン3-5:Qβ-MIF-C1.レーン1-3は、クーマシーブリリアントブルーで染色した。レーン4及び5は、それぞれ抗-MIF抗血清及び抗-Qβ抗血清で現像したカップリング反応のウエスタンブロットを示す。マーカータンパク質の分子量は、左端に示されている。
B.Qβキャプシドタンパク質とカップリングさせたMIF-C1によるマウスの免疫化
雌Balb/cマウスは、アジュバンドを添加せずにQβキャプシドタンパク質とカップリングさせたMIF-C1でワクチン接種した。各試料の25μgの全タンパク質を、PBSで200ulとなるまで希釈し、0日目と14日目に皮下注射(100mlを2つの腹部へ)した。マウスを31日目に逆軌道で出血させ、その血清をMIF-特異的 ELISAを利用して分析した。
C.ELISA
ELISAプレートを、5μg/mlの濃度でMIF-C1によってコーティングした。このプレートをブロックし、その後、連続的に希釈したマウス血清とともにインキュベートした。結合した抗体は、酵素的に標識した抗-マウスIgG抗体で検出した。コントロールとして、同じマウスの免疫前血清も試験した。その結果を図4Cに示す。免疫前血清がMIFと反応しなかった一方で、Qβキャプシドタンパク質とカップリングしたMIF-C1に対して産生させたマウス血清の明白な活性があった(図4C及びデータは示さず)。Qβキャプシドタンパク質とカップリングしたMIF-C1に対して産生させた抗血清による連続希釈から、最高力価の半分は、1:84000に達した。
図4Cに示してあるのは、Qβキャプシドタンパク質とカップリングしたMIF-C1でワクチン接種したマウスの血清によって得られたELISAシグナルである。雌Balb/cマウスを、0日目と14日目に25μgのPBS中のワクチンで皮下へワクチン接種した。MIF-C1に対する血清IgGは、31日目に測定した。コントロールとして、1つのマウスからの免疫前血清を分析した。示された血清希釈についての結果は、450nmでの光学密度で示されている。すべてのワクチン接種マウスは、高いIgG抗体力価を作り出した。コントロールでは、MIF-特異的抗体は検出されなかった(免疫前マウス)。
rMIF-C1のfrキャプシドタンパク質及びHBcAg-lys-2cys-Mutキャプシドタンパク質とのカップリング
rMIF-C1のfrキャプシドタンパク質とのカップリング
100μlの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の3.1mg/ml frキャプシドタンパク質の溶液を、25℃で3μlのSMPH(Pierce)のDMSOに溶かした100mM 原液と30分間反応させた。並発反応では、frキャプシドタンパク質を、最初にヨードアセトアミドを用いてアルキル化し、その後、上記と同じ反応条件を用いてSMPHと反応させた。この反応液について、その後、4℃で2lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなった。 80μlの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の5.7mg/ml rMIF-C1タンパク質の溶液を、25℃でHOに溶かした1μlの36mM TCEP(Pierce)原液と1時間反応させた。50μlの誘導化及び透析frキャプシドタンパク質、及び50μlの誘導体化、アルキル化及び透析したfrキャプシドタンパク質を、その後、それぞれ17μlの還元rMIF-C1と25℃で2時間反応させた。
カップリング産物を、還元条件下の16%SDS-PAGEゲル上で分析した(図5)。27kDa(rMIF-C1:見かけ上の分子量13kDa、frキャプシドタンパク質見かけ上の分子量14kDa)及び29kDa(rMIF-C1:見かけ上の分子量13kDa、HBcAg-lys-2cys-Mut:見かけ上の分子量15kDa)の見込みの大きさのさらなるバンドは、カップリング反応で検出することができるが、frキャプシドタンパク質及びrMIF-C1溶液では検出できず、明白にカップリングを示している。
rMIF-C1の肝炎HBcAg-lys-2cys-Mutキャプシドタンパク質とのカップリング
100μlの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の1.2mg/ml HBcAg-lys-2cys-Mutキャプシドタンパク質の溶液を、25℃で1.4μlのSMPH(Pierce)(DMSOに溶かした100mM 原液)と30分間反応させた。この反応液について、その後、4℃で2lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなった。 80μlの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の5.7mg/ml rMIF-C1タンパク質の溶液を、25℃で1μlのTCEP(Pierce)(HOに溶かした36mM 原液)と1時間反応させた。60μlの誘導化及び透析したHBcAg-lys-2cys-Mutキャプシドタンパク質を、その後、20μlの還元rMIF-C1と25℃で2時間反応させた。
カップリング産物を、還元条件下の16%SDS-PAGEゲル上で分析した(図5)。約28kDa(rMIF-C1:見かけ上の分子量13kDa、HBcAg-lys-2cys-Mut:見かけ上の分子量15kDa)の見込みの大きさのさらなるバンドは、カップリング反応で検出することができるが、HBcAg-lys-2cys-Mut及びrMIF-C1溶液では検出できず、明白にカップリングを示している。
図5のゲル上に負荷した試料は以下の通りである:
レーン1:分子量マーカー.レーン2:カップリング前のrMIF-C1.レーン3:カップリング後のrMIF-C1-frキャプシドタンパク質.レーン4:誘導体化frキャプシドタンパク質.レーン5:アルキル化frキャプシドタンパク質とのカップリング後のrMIF-C1-fr.レーン6:アルキル化及び誘導体化frキャプシドタンパク質.レーン7:カップリング後のrMIF-HBcAg-lys-2cys-Mut.レーン8及び9:誘導体化HBcAg-lys-2cys-Mut.ゲルは、クーマシーブリリアントブルーで染色した。マーカータンパク質の分子量は、左端に示されている。
A.システイン残基を含有するアミノ酸リンカーの導入、マウスRANKLの発現及び精製
破骨細胞分化因子とも呼ばれている核因子カッパbリガンド(RANKL)のレセプターアクチベーターの断片、破骨細胞形成阻害因子リガンド、及び腫瘍壊死因子関連活性化誘導サイトカインは、VLPとのカップリングのための1つのシステインを有するN末端リンカーとともに組み換え発現された。
発現プラスミドの構築
RANKL遺伝子のC末端コード化領域を、オリゴRANKL-UP及びRANKL-DOWNによりPCRによって増幅させた。RANKL-UPは内部ApaI部位を有し、RANKL-DOWNは内部XhoI部位を有していた。そのPCR産物をApaI及びXhoIにより消化させ、pGEX-6p1(アマシャム ファルマシア)へライゲーションした。この結果として生じたプラスミドは、pGEX-RANKLと命名された。すべての段階は、標準的な分子生物学プロトコールによっておこなわれ、その配列が確かめられた。プラスミドpGEX-RANKLは、グルタチオン S-トランスフェラーゼ-Prescission切断部位システイン含有アミノ酸リンカー-RANKL(GST-PS-C-RANKL)の融合タンパク質をコードする。システイン含有アミノ酸リンカーは、配列GCGGGを有する。このコンストラクトは、システイン含有アミノ酸リンカーとRANKL配列の間にヘキサヒスチジンタグも有する。
オリゴ:
RANKL-UP:
5'CTGCCAGGGGCCCGGGTGCGGCGGTGGCCATCATCACCACCATCACCAGC GCTTCTCAGGAG-3' (配列番号:316)
RANKL-DOWN:
5'CCGCTCGAGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGAAAG-3' (配列番号:317)
GST-PS-C-RANKL(配列番号:318)のタンパク質及びGST-PS-C-RANKL(配列番号:319)のcDNA配列
Figure 2009132689
C-RANKLの発現及び精製
コンピテント大腸菌BL21(DE3)Gold pLys細胞をプラスミドpGEX-RANKLで形質転換した。カナマイシン及びクロラムフェニコール含有寒天プレートからの単一コロニーを液体培養(LB培地、30μg/mlカナマイシン、50μg/mlクロラムフェニコール)に拡散させ、30℃で220rpmの振盪で終夜インキュベートした。その後、1lのSB(30μg/mlカナマイシンを有する)に終夜培養液の1:100v/vを接種し、24℃でOD600=1まで生育させた。発現は、0.4mM IPTGによって誘導した。細胞を16時間後に収集し、5000rpmで遠心分離した。細胞ペレットを含む溶解緩衝液(50mM トリス-HCl、pH=8;25% スクロース;1mM EDTA、1% NaN;10mM DTT;5mM MgCl2;1mg/ml リゾチーム;0.4u/ml デオキシリボヌクレアーゼ(DNase))に30分間懸濁した。その後、2.5mlの緩衝液A(50mMトリス-HCl、pH=8.0;1%TritonX100;100mM NaCl;0.1% NaN;10mM DTT;1mM PMSF)を添加し、37℃で15分間インキュベートした。細胞は、超音波処理して15分間の9000rpmでペレットにした。その上澄み液を、直ちにGST-アフィニティークロマトグラフィーに用いた。
5mlのカラムGST-Trap FF(アマシャム ファルマシア)を、PBS、pH7.3(140mM NaCl、2.7mM KCl、10mM NaHPO、1.8mM KHPO)で平衡化した。その上澄み液を5ml GST-Trap FFカラムに負荷し、その後でそのカラムを5カラム容量のPBSで洗浄した。タンパク質GST-PS-RANKLを、GSH 10mMを含有する50mMトリス-HCl、pH=8.0で溶出させた。
精製したGST-PS-RANKLタンパク質は、プロテアーゼ PreScission(アマシャム ファルマシア)を用いて消化した。この消化は、PreScissionに対するGST-PS-RANKLのモル比500/1によって1時間、37℃でおこなった。
さらには、プロテアーゼ消化の反応緩衝液は、HiPrep 26/10脱塩カラム(アマシャム ファルマシア)を利用して交換し、タンパク質を含有する分画はプールして、以前に報告したのと同じ条件を用いるGSTアフィニティークロマトグラフィーによるもう一つの段階に用いた。C-RANKLの精製は、図6に示すように、還元条件下のSDS-PAGEゲル上で分析した。マーカータンパク質の分子量は、図の中のゲルの左端上に示してある。このゲルは、クーマシーブリリアントブルーで染色した。切断したC-RANKLは、貫流中(未結合分画)に存在しており、その一方で、GST-PS-C-RANKL、切断GST-PS及びPreScissionは、カラムと結合したままであった。22kDaの予想の大きさのC-RANKLタンパク質を高純度で得た。
図6のゲル上に負荷した試料は、以下の通りである:
レーン1:分子量マーカー。レーン2及び3:IPTG0.4mMによる16時間の誘導後の、それぞれからのベクターpGEX6p1及びpGEX-RANKLで形質転換したBL21/DE3細胞の細胞溶解物の上澄み液。レーン4:GST-Trap FFカラム後の精製GST-C-RANKLタンパク質。レーン5:GST-Trap FFカラム未結合分画。レーン6:PreScissionプロテアーゼによる切断後の精製GST-PS-C-RANKLタンパク質。レーン7:精製C-RANKLを有する、GST-RANKL消化物とともに負荷したGST-Trap FFカラムの未結合分画。レーン8:GST-PS-C-RANKL消化物で負荷し、GSHで溶出したGST-Trap FFカラムの結合分画。
B.C-RANKLのQβキャプシドタンパク質とのカップリング
20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の120μMのQβキャプシドの溶液を、ロッキングシェーカー上において25℃で、DMSO中の原液から希釈した25倍モル濃度を超えるSMPH(Pierce)の溶液と30分間反応させる。 この反応液について、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなう。この透析したQβ反応混合液を、ロッキングシェーカー上において25℃で4時間、C-RANKL溶液(最終濃度:60μM Qβ、60μM C-RANKL)と反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
C.C-RANKLのfrキャプシドタンパク質とのカップリング
20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の120μMのfrキャプシドの溶液を、ロッキングシェーカー上において25℃で、DMSO中の原液から希釈した25倍モル濃度を超えるSMPH(Pierce)の溶液と30分間反応させる。この反応液について、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなう。この透析したfrキャプシドタンパク質反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上において25℃で4時間、C-RANKL溶液(最終濃度:60μM frキャプシドタンパク質、60μM C-RANKL)と反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
D.C-RANKLのHBcAg-lys-2cys-Mutとのカップリング
20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の120μM HBcAg-Lys-2cys-Mutキャプシドの溶液を、ロッキングシェーカー上において25℃で、DMSO中の原液から希釈した25倍モル濃度を超えるSMPH(Pierce)の溶液と30分間反応させる。この反応液について、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなう。この透析したHBcAg-lys-2cys-Mutキャプシドタンパク質反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上において25℃で4時間、C-RANKL溶液(最終濃度:60μM HBcAg-Lys-2cys-Mutキャプシドタンパク質、60μM C-RANKL)と反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
E.C-RANKLの線毛とのカップリング
20mM Hepes、pH7.4中の125μM 大腸菌の1型線毛の溶液を、ロッキングシェーカー上でのRTで、60分間、DMSO(Pierce)中の原液から希釈した50倍モル濃度を超える架橋剤SMPHと反応させる。この反応混合物は、PD-10カラム(アマシャム ファルマシア バイオテク)上で脱塩する。このカラムから溶出したタンパク質含有分画をプールし、脱塩し誘導体化した線毛タンパク質をロッキングシェーカー上において25℃で4時間、C-RANKL溶液(最終濃度:60μM 線毛、60μM C-RANKL)と反応させる。カップリング産物を、還元条件下のSDS-PAGEによって分析する。
A.システイン残基を含有するアミノ酸リンカーの導入、切断型のマウスプリオンタンパク質の発現及び精製
マウスプリオンタンパク質(mPrPtと呼ぶ)の切断型(aa121-230)を、VLPs及び線毛とのカップリングのためにそのC末端で融合させたGGGGCGアミノ酸リンカーとともに組み換え発現させた。このタンパク質は、精製のためにヒトFc-断片のN末端と融合させた。エンテロキナーゼ(EK)切断部位をEK切断部位の後ろに導入し、精製後に融合タンパク質のFc部分を切断するようにした。
mPrPt-EK-Fcの構築
プラスミドpBPCMVPrP-Fcをテンプレートととして用い、プライマー5' PrP-BamHI及び3' PrP-NheIによるPCRによってマウスPrPtを増幅した。pBPCMVPrP-Fcは、マウスプリオンタンパク質の野生型配列を有する。5' PrP-BamHIは内部BamHI部位を有し、ATGを含有し、3' PrP-NheIは内部NheI部位を有していた。
PCR反応に関しては、0.5μgの各プライマー及び200ngのテンプレートDNAを50●1反応混合液(1ユニットのPFX Platinum ポリメラーゼ、0.3mM dNTPs及び2mM MgSO)に用いた。温度サイクルは以下の通りである:94℃を2分間、続いて5サイクルの94℃(15秒)、50℃(30秒)、68℃(45秒)、続いて20サイクルの94℃(15秒)、64℃(30秒)、68℃(45秒)、及び続いて68℃を10分間。
PCR産物をBamHI及びNheIで消化し、EK切断配列の5' 末端にGGGGCGリンカー配列を有するpCEP-SP-EK-Fcへ挿入した。この結果として生じたプラスミドは、pCEP-SP-mPrPtEK-Fc と命名された。
すべての他の段階は、標準的分子生物学プロトコールによっておこなわれた。
オリゴ:
プライマー5' PrP-BamHI
5'-CGGGATCCCACCATGGTGGGGGGCCTTGG-3' (配列番号:321)
プライマー3' PrP-NheI
5'-CTAGCTAGCCTGGATCTTCTCCCG-3' (配列番号:322)
mPrPt-EK-Fcの発現及び精製
プラスミドpCEP-SP-mPrPt-EK-Fcを293-EBNA細胞(インビトロジェン)へトランスフェクトし、実施例1に記載したように、プロテインA-セファロースカラム上で精製した。
mPrPt-EK-Fcのタンパク質配列は、配列番号:323で同定されている。切断後のmPrPtは、そのC末端にGGGGCGリンカーを有する配列番号:324で同定されているような配列を有する。
精製融合タンパク質mPrPt-EK-Fcをエンテロキナーゼで切断し、エンテロキナーゼ切断の前後で、還元条件下の16%SDS-PAGEゲル上で分析した。このゲルは、クーマシーブリリアントブルーで染色した。結果を図7に示す。マーカータンパク質の分子量は、図中のゲルの左端に示す。mPrPt-EK-Fc融合タンパク質は、50kDaバンドとして検出することができる。C末端に融合しているGGGGCGアミノ酸リンカーを含有する切断mPrPtタンパク質は、18と25kDaの間の太いバンドとして検出することができる。mPrPtの同一性は、ウェスタンブロッティングによって確かめられた(データは示さず)。従って、システイン残基を有するC末端アミノ酸リンカーを持つmPrPtは、VLPs及び線毛とのカップリングに用いるために、発現及び精製することができる。
図7のゲル上に負荷した試料は、以下の通りである:
レーン1:分子量マーカー。レーン2:切断前のmPrPt-EK-Fc。レーン3:切断後のmPrPt。
B.mPrPtのQβキャプシドとのカップリング
20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の120μMのQβキャプシドの溶液を、ロッキングシェーカー上において25℃で、DMSO中の原液から希釈した25倍モル濃度を超えるSMPH(Pierce)の溶液と30分間反応させる。 この反応液について、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなう。この透析したQβ反応混合液を、ロッキングシェーカー上において25℃で4時間、mPrPt溶液(最終濃度:60μM Qβ、60μM mPrPt)と反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
C.mPrPtのfrキャプシドタンパク質とのカップリング
20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の120μMのfrキャプシドの溶液を、ロッキングシェーカー上において25℃で、DMSO中の原液から希釈した25倍モル濃度を超えるSMPH(Pierce)の溶液と30分間反応させる。この反応液について、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなう。この透析したfrキャプシドタンパク質反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上において25℃で4時間、mPrPt溶液(最終濃度:60μM frキャプシドタンパク質、60μM mPrPt)と反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
D.mPrPtのHBcAg-lys-2cys-Mutとのカップリング
20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の120μM HBcAg-lys-2cys-Mutキャプシドの溶液を、ロッキングシェーカー上において25℃で、DMSO中の原液から希釈した25倍モル濃度を超えるSMPH(Pierce)の溶液と30分間反応させる。この反応液について、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなう。この透析したHBcAg-lys-2cys-Mut反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上において25℃で4時間、mPrPt溶液(最終濃度:60μM HBcAg-lys-2cys-Mut、60μM mPrPt)と反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
E. mPrPtの線毛とのカップリング
20mM Hepes、pH7.4中の125μM 大腸菌の1型線毛の溶液を、ロッキングシェーカー上でのRTで、60分間、DMSO中の原液から希釈した50倍モル濃度を超える架橋剤SMPH(Pierce)と反応させる。この反応混合物は、PD-10カラム(アマシャム ファルマシア バイオテク)上で脱塩する。このカラムから溶出したタンパク質含有分画をプールし、脱塩し誘導体化した線毛タンパク質をロッキングシェーカー上において25℃で4時間、mPrPt溶液(最終濃度:60μM 線毛、60μM mPrPt)と反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
A.プリオンペプチドのQβキャプシドタンパク質とのカップリング:プリオンペプチドワクチン
以下のプリオンペプチドを化学的に合成した:
VLPs及び線毛とのカップリングのための付加したN末端システイン残基を含み、以下に記載のようにQβとの化学的カップリングに用いる、CSAMSRPMIHFGNDWEDRYYRENMYR("cprplong")及びCGNDWEDRYYRENMYR("cprpshort")。
20mM Hepes、150mM NaCl pH7.4中の140μM Qβキャプシドタンパク質の5mlの溶液を、ロッキングシェーカー上において25℃で、H2O中のSMPH(Pierce)の65mM 溶液の108μlと30分間反応させる。この反応液について、その後、4℃で5Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなう。この透析した反応混合液の100μlを、その後、ペプチドcprpshort(1:2 ペプチド/Q● キャプシドタンパク質比)の2mM原液(DMSO中)、又は2.7μlの同じ原液(1:1 ペプチド/Q● 比)のいずれかと反応させた。ペプチドcprplongの10mM 原液(DMSO中)の1μlを、100μlの透析反応混合液と反応させた。カップリング反応は、15℃でウォーターバスにおいて終夜にわたっておこなった。反応混合液は、その後、4℃で2x 5Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対して24時間透析した。
カップリング産物を遠心分離し、上澄み液及びペレットを還元条件下の16%SDS-PAGEゲル上で分析した。ゲルは、クーマシーブリリアントブルーで染色した。その結果を図16に示す。マーカータンパク質の分子量は、図中のゲルの左端に示す。16.5と25kDaの間の分子量のバンドは、ペプチドcprpshortとcprplongのQ●キャプシドタンパク質との共有カップリングを明白に示した。
図16Aのゲル上に負荷した試料は、以下の通りである:
レーン1:精製Q●キャプシドタンパク質。レーン2:カップリング前の誘導体化したQβキャプシドタンパク質。レーン3-6:1:2ペプチド/Q●比(レーン3及び4)及び1:1ペプチド/Q●比(レーン5及び6)でのQβキャプシドタンパク質-cprpshortカップリング。可溶性分画(レーン3及び5)及び不溶性分画(レーン4及び6)が示されている。
図16Bのゲル上に負荷した試料は、以下の通りである:
レーン1:分子量マーカー。レーン2:カップリング前の誘導体化したQβキャプシドタンパク質。レーン3及び4:Qβキャプシドタンパク質-cprplongカップリング反応。可溶性分画(レーン3)及び不溶性分画(レーン4)が示されている。
B.プリオンペプチドのfrキャプシドタンパク質とのカップリング
20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の120μMのfrキャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上において25℃で、DMSO中の原液から希釈した10倍モル濃度を超えるSMPH(Pierce)の溶液と30分間反応させる。この反応液について、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなう。 この透析したfr反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上において16℃で終夜、ペプチドcprpshortの等モル濃度又は1:2比のcprplong/frと反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
C.プリオンペプチドのHBcAg-Lys-2cys-Mutとのカップリング
20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の120μM HBcAg-Lys-2cys-Mutの溶液を、ロッキングシェーカー上において25℃で、DMSO中の原液から希釈した10倍モル濃度を超えるSMPH(Pierce)の溶液と30分間反応させる。この反応液について、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなう。この透析したHBcAg-Lys-2cys-Mut反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上において16℃で終夜、ペプチドcprpshortの等モル濃度又は1:2比のcprplong/HBcAg-Lys-2cys-Mutと反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
D.プリオンペプチドの線毛とのカップリング
20mM Hepes、pH7.4中の125μM 大腸菌の1型線毛の溶液を、ロッキングシェーカー上でのRTで、60分間、DMSO中の原液から希釈した50倍モル濃度を超える架橋剤SMPH(Pierce)と反応させる。この反応混合物は、PD-10カラム(アマシャム ファルマシア バイオテク)上で脱塩する。
このカラムから溶出したタンパク質含有分画をプールし、脱塩し誘導体化した線毛タンパク質をロッキングシェーカー上において16℃で終夜、等モル又は1:2ペプチド線毛の比のプリオンペプチドと反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
IL-13の発現及び精製、VLPs及び線毛とのクローニング
A.VLPs及び線毛とのカップリングのためのシステイン残基を有するN末端アミノ酸リンカーとのインターロイキン13(IL-13)のクローニング及び発現
a)Fc融合タンパク質として哺乳動物細胞での発現のためのマウスIL-13のクローニング
IL-13のクローニングのためのDNAは、インビトロ活性化脾細胞からRT-PCRによって単離され、その脾細胞は、以下のようにして得られた:CD4+T細胞は、マウス脾臓細胞から単離され、3日間、前もって抗CD3及びCD28抗体でコーティングしてある6ウェルプレートのIMDM(+5%FCS+10ng/ml IL4)でインキュベートした。これら細胞からのRNAを用いて、ワンステップRT-PCRによってIL13を増幅した(キアゲンワンステップPCRキット)。プライマーXhoIL13-RをRNAの逆転写に用い、プライマーNheIL13-F(配列番号:338)及びXhoIL13-R(配列番号:339)を、IL13cDNAのPCR増幅に用いた。増幅したIL13cDNAは、NheI/XhoI制限部位を用いて、pMODベクターにライゲーションした(ベクターpMODB1-IL13を与える)。pMODB1-IL13は、BamHI/XhoIで消化し、IL13を含む断片は、前もってBamHI/XhoIで消化したFc配列の末端のXhoI部位が除かれたpCEP-SP-XA-Fc*のアナログである、pCEP-SP-XA-Fc*(△xho)ベクターにライゲーションした。このライゲーションで得られたプラスミド(pCEP-SP-IL13-Fc)をシーケンシングし、HEK-293Tをトランスフェクトするのに用いた。このプラスミドによってコードされた結果として得られたIL13は、IL-13成熟配列のN末端で融合したアミノ酸配列ADPGCGGGGGLAを有していた。この配列は、クローニング手順の間に導入された付加的アミノ酸が近接している、アミノ酸リンカー配列GCGGGGGを含む。IL13-Fcは、pCEP-SP-IL13-Fcでトランスフェクトした上澄み液の細胞から、プロテイン-Aによって精製することが可能である。発現の結果は、図17Bに示されている(サンプルの記載として実施例10を参照)。前述のN末端で融合した成熟IL-13は、Xa因子による融合タンパク質の切断によって遊離し、配列番号:328の配列を有するタンパク質となり、この後で「マウスC-IL-13-F」と呼ばれる。図17Bの結果は、IL-13コンストラクトの発現を明白示されている。
b)N末端でGST(グルタチオン-S-トランスフェラーゼ)融合した、哺乳動物細胞でのマウスIL-13(HEK-293T)のクローニング
IL-13とN末端GSTのクローニングに用いるcDNAは、上記(a.)のTH2活性化T細胞のcDNAに起源を有する。IL-13は、プライマーNhelink1IL13-F及びIL13StopXhoNot-Rを用いて、このcDNAから増幅された。このPCR産物は、NheI及びXhoIで消化され、前もってNheI/XhoIで消化したpCEP-SP-GST-EKベクターへライゲーションした。ライゲーション(pCEP-SP-GST-IL13)から単離が可能なプラスミドは、HEK-293細胞のトランスフェクトに利用された。このプラスミドによってコードされた結果として得られたIL13コンストラクトは、IL-13成熟配列のN末端で融合したアミノ酸配列LACGGGGGを有した。この配列は、クローニング手順の間に導入された付加的なアミノ酸が近接するアミノ酸リンカー配列ACGGGGGを含む。pCEP-SP-GST-IL13でトランスフェクトした細胞はの培養上澄みは、標準的プロトコールに従ってグルタチオンアフィニティークロマトグラフィーによって精製が可能な融合タンパク質GST-IL13を含有した。N末端で前出のアミノ酸配列が融合した成熟IL-13は、エンテロキナーゼによる融合タンパク質の切断によって遊離し、この後で「マウスC-IL-13-S」と呼ばれるタンパク質となり、配列番号:329の配列を有する。
B.マウスC-IL-13-F、マウスC-IL-13-SのQβキャプシドタンパク質へのカップリング
20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の120μMのQβキャプシドの溶液を、ロッキングシェーカー上において25℃で、DMSO中の原液から希釈した25倍モル濃度を超えるSMPH(Pierce)の溶液と30分間反応させる。 この反応液について、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなう。この透析したQβ反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上において25℃で4時間、マウスC-IL-13-F又はマウスC-IL-13-S溶液(最終濃度:60μM Qβキャプシドタンパク質、60μM マウスC-IL-13-F又はマウスC-IL-13-S)と反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
C.マウスC-IL-13-F、マウスC-IL-13-Sのfrキャプシドタンパク質とのカップリング
20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の120μMのfrキャプシドの溶液を、ロッキングシェーカー上において25℃で、DMSO中の原液から希釈した25倍モル濃度を超えるSMPH(Pierce)の溶液と30分間反応させる。この反応液について、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなう。この透析したfr反応溶液を、その後、ロッキングシェーカー上において25℃で4時間、マウスC-IL-13-F又はマウスC-IL-13-S溶液(最終濃度:60μM frキャプシドタンパク質、60μM マウスC-IL-13-F、マウスC-IL-13-S)と反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
D.マウスC-IL-13-F又はマウスC-IL-13-S溶液のHBcAg-lys-2cys-Mutとのカップリング
20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の120μM HBcAg-lys-2cys-Mutキャプシドの溶液を、ロッキングシェーカー上において25℃で、DMSO中の原液から希釈した25倍モル濃度を超えるSMPH(Pierce)の溶液と30分間反応させる。この反応液について、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなう。この透析したHBcAg-lys-2cys-Mut反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上において25℃で4時間、マウスC-IL-13-F又はマウスC-IL-13-S溶液(最終濃度:60μM HBcAg-lys-2cys-Mut、60μM マウスC-IL-13-F又はマウスC-IL-13-S溶液)と反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
E. マウスC-IL-13-F又はマウスC-IL-13-S溶液の線毛とのカップリング
20mM Hepes、pH7.4中の125μM 大腸菌の1型線毛の溶液を、ロッキングシェーカー上でのRTで、60分間、DMSO(Pierce)中の原液から希釈した50倍モル濃度を超える架橋剤SMPHと反応させる。この反応混合物は、PD-10カラム(アマシャム ファルマシア バイオテク)上で脱塩する。このカラムから溶出したタンパク質含有分画をプールし、脱塩し誘導体化した線毛タンパク質をロッキングシェーカー上において25℃で4時間、マウスC-IL-13-F又はマウスC-IL-13-S溶液(最終濃度:60μM 線毛、60μM マウスC-IL-13-F又はマウスC-IL-13-S)と反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
インターロイキン5(IL-5)のVLPs及び線毛とのカップリングのためのシステイン残基を含有するN末端アミノ酸リンカーとのクローニング及び発現
A.大腸菌における封入体としての発現のためのIL-5のクローニング
IL-5は、以下の2つのプライマーを用いるPCRによって、ATCCクローン(pmIL5-4G;ATCC番号37562)から増幅した:Spelinker3-F1(配列番号:340)及びIL5StopXho-R(配列番号:342)。このPCRの産物は、プライマーSpeNlinker3-F2(配列番号:341)及びIl5StopXho-Rによる二番目のPCRでのテンプレートとして利用した。挿入物は、SpeI及びNotIで消化した。この挿入物は、NheI及びNotI(脱リン酸化していない)によって前もって消化したpETベクター誘導体(pMODEC3-8ベクター)へライゲーションし、大腸菌TG1細胞へ形質転換した。pMODEC3-8ベクターへクローニングすることによって生成したIL5コンストラクトは、エンテロキナーゼ部位、C末端に配列ASが近接し、N末端に配列ALVが近接しているシステイン残基を含有するN末端ガンマ3アミノ酸リンカー、及びIL5遺伝子の成熟型が後に続くN末端のヘキサヒスチジンタグを有する。エンテロキナーゼによる切断によって遊離されるタンパク質は、「マウスC-IL-5-E」(配列番号:332)と呼ばれる。配列がDNAシーケンシングによって確かめられたプラスミドDNAの結果として生じたクローンpMODC6-IL5.2(pMODC6-IL5とも呼ばれる)を大腸菌株BL21へ形質転換した。
クローンpMODC6-IL5/BL21は、1mg/Lアンピシリンを含有する5ml LBで終夜、生育させた。この培養の2mlを、1mg/Lアンピシリンを含有する100ml Terrific Broth(TB)で希釈した。培養が光学密度OD600=0.7に達した時に、0.1mlのイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)の1M溶液を添加することによって培養を誘導した。10ml試料を2時間毎に取り出した。この試料は、4000xgで10分間、遠心分離した。ペレットを、50mM トリス-HCl、2mM EDTA、0.1%トリトンX-100(pH8)を含有する0.5ml 溶解緩衝液に懸濁した。20μlのリゾチーム(40mg/ml)を添加し、4℃で30分間、試験管をインキュベートした後、細胞を2分間、超音波処理した。100μlの50mM MgCl溶液及び1mlのベンゾナーゼを添加した。その後、細胞を室温で30分間インキュベートし、13000xgで15分間遠心分離した。
上澄み液を破棄し、ペレットを100μlのSDSローディング緩衝液中にて98℃で5分間煮沸した。10μlのローディング緩衝液中の試料を、還元条件下のSDS-PAGEで分析した(図17A)。図17Aのゲルは、IL-5コンストラクトの発現を明白に示されている。図17Aのゲルへ負荷した試料は以下の通りである:
レーンM:マーカー(NEB、Broad range prestained marker)。レーン1:誘導前の1ml培養の細胞抽出物。レーン2:誘導の4時間後の1ml培養の細胞抽出物。
B.哺乳動物細胞(HEK-293T)での発現のためのIL-5のクローニング
a)N末端でシステイン残基を含有するアミノ酸リンカーと融合し、C末端でFc断片と融合したIL-5
(A)(ATCCクローン37562)で記載されたテンプレートを、以下のコンストラクトのクローニングに用いた。プラスミドpMODB1-IL5(pET誘導体の1つ)をBamHI/XhoIで消化し、システインを含有するN末端アミノ酸リンカーと融合したIL5をコードする小断片を得た。この断片は、BamHI及びXhoIで前もって消化したベクターpCEP-SP-XA-Fc*(△Xho)でライゲーションした。ライゲーションしたものを大腸菌株TG1へ電気穿孔し、DNAシーケンシングによって配列が確かめられたプラスミドDNAの結果として得られたクローンpCEP-SP-IL5-Fc.2を、HEK-293T細胞をトランスフェクトするのに用いた。このプラスミドによってコードされる結果として得られたIL-5コンストラクトは、IL-5成熟配列のN末端に融合したアミノ酸配列ADPGCGGGGGLAを有していた。この配列は、システインを有し、クローニング手順の間に導入された付加的なアミノ酸が近接しているアミノ酸リンカー配列GCGGGGGを含む。Xa因子での融合タンパク質の切断によって遊離したIL-5タンパク質は、この後、「マウスC-IL-5-F」(配列番号:333)と命名されている。
トランスフェクション及びピューロマイシンでの選択の後、抗His(マウス)及び西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗マウスIgG抗体を用いて、培養上澄み液をウェスタンブロット(図17B)によって分析した。西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗マウスIgG抗体は、Fc融合タンパク質も検出した。タンパク質の精製は、プロテインA樹脂のアフィニティークロマトグラフィーによっておこなわれた。図17Bの結果は、IL-5コンストラクトの発現を明白に示されている。
図17Bのウェスタンブロットに負荷した試料は、以下の通りである:
レーン1:IL5-Fcを発現しているHEK培養の上澄み液(20μl)。SDS-PAGEは、還元条件下でおこなった。レーン2:IL13-Fcを発現しているHEK培養の上澄み液(20μl)。SDS-PAGEは、非還元条件下でおこなった。レーン3:IL5-Fcを発現しているHEK培養の上澄み液(20μl)。SDS-PAGEは、非還元条件下でおこなった。
b)GST(グルタチオン-S-トランスフェラーゼ)及びN末端で融合したシステイン残基を含有するアミノ酸リンカーでクローニングしたIL-5
IL-5(ATCC37562)を、プライマーNhe-link1-IL13-F及びIL5StopXho-Rで増幅した。NheI及びXhoIで消化した後、挿入物をNheI及びXhoIで前もって消化したpCEP-SP-GST-EKへライゲーションした。その結果として得られたプラスミドpCEP-SP-GST-IL5をシーケンシングし、HEK-293T細胞のトランスフェクションに用いた。このプラスミドによってコードされた結果として得られたIL-5コンストラクトは、IL-5成熟配列のN末端で融合したアミノ酸配列LACGGGGGを有していた。この配列は、システイン残基を有し、クローニング手順の間に導入された付加的なアミノ酸が近接しているアミノ酸リンカー配列ACGGGGGを含む。エンテロキナーゼによる切断で遊離したタンパク質は、今後、「マウスC-IL-5-S」(配列番号:334)と命名された。この結果として得られたタンパク質の精製は、グルタチオンアフィニティー樹脂によるアフィニティークロマトグラフィーによっておこなわれた。
C.マウスC-IL-5-F又はマウスC-IL-5-SのQβキャプシドタンパク質へのカップリング
20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の120μMのQβキャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上において25℃で、DMSO中の原液から希釈した25倍モル濃度を超えるSMPH(Pierce)の溶液と30分間反応させる。この反応液について、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなう。この透析したQβ反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上において25℃で4時間、マウスC-IL-5-F又はマウスC-IL-5-S溶液(最終濃度:60μM Qβキャプシドタンパク質、60μM マウスC-IL-5-F又はマウスC-IL-5-S)と反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
D.マウスマウスC-IL-5-F又はマウスC-IL-5-Sのfrキャプシドタンパク質とのカップリング
20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の120μMのfrキャプシドの溶液を、ロッキングシェーカー上において25℃で、DMSO中の原液から希釈した25倍モル濃度を超えるSMPH(Pierce)の溶液と30分間反応させる。この反応液について、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなう。この透析したfr反応溶液を、その後、ロッキングシェーカー上において25℃で4時間、マウスC-IL-5-F又はマウスC-IL-5-S溶液(最終濃度:60μM frキャプシドタンパク質、60μM マウスC-IL-5-F又はマウスC-IL-5-S)と反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
F.マウスC-IL-5-F又はマウスC-IL-5-S溶液のHBcAg-Lys-2cys-Mutとのカップリング
20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の120μM HBcAg-Lys-2cys-Mutキャプシドの溶液を、ロッキングシェーカー上において25℃で、DMSO中の原液から希釈した25倍モル濃度を超えるSMPH(Pierce)の溶液と30分間反応させる。この反応液について、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなう。この透析したHBcAg-Lys-2cys-Mut反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上において25℃で4時間、マウスマウスC-IL-5-F又はマウスC-IL-5-S溶液(最終濃度:60μM HBcAg-Lys-2cys-Mut、60μM マウスC-IL-5-F又はマウスC-IL-5-S溶液)と反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
E. マウスC-IL-5-F又はマウスC-IL-5-S溶液の線毛とのカップリング
20mM Hepes、pH7.4中の125μM 大腸菌の1型線毛の溶液を、ロッキングシェーカー上でのRTで、60分間、DMSO(Pierce)中の原液から希釈した50倍モル濃度を超える架橋剤SMPHと反応させる。この反応混合物は、PD-10カラム(アマシャム ファルマシア バイオテク)上で脱塩する。このカラムから溶出したタンパク質含有分画をプールし、脱塩し誘導体化した線毛タンパク質をロッキングシェーカー上において25℃で4時間、マウスC-IL-5-F又はマウスC-IL-5-S溶液(最終濃度:60μM 線毛、60μM マウスC-IL-5-F又はマウスC-IL-5-S)と反応させる。カップリング産物は、SDS-PAGEによって分析する。
システイン残基を有するアミノ酸リンカーの導入、マウス血管内皮成長因子-2(mVEGFR-2、FLK1)断片の発現、精製及びカップリング
二番目と3番目の細胞外ドメインを含んでなるマウス内皮成長因子-2(mVEGFR-2、FLK1)を、VLPs及び線毛とのカップリングのためにC末端にシステイン残基を含有するアミノ酸リンカーをともなうFc融合タンパク質として組み換え発現した。mVEGFR-2(2-3)のタンパク質配列は、マウスFLK-1のcDNA配列から翻訳された((Matthewsら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9026-9030(1991)):寄託番号:X59397;Ig-様 C2-型ドメイン2:アミノ酸143-209;Ig-様 C2-型ドメイン3:アミノ酸241-306)。mVEGFR-2(2-3)コンストラクトは、アミノ酸プロリン126からリジン329のmVEGFR-2の配列を含む(前駆体タンパク質の番号を付けることで)。このコンストラクトは、免疫グロブリン様C2型ドメイン2及び3の他に、mVEGFR-2の配列のドメイン2の前及びドメイン3の後の近接する領域をも含み、アミノ酸スペーサー部分を付加する。システイン残基を含有するアミノ酸リンカーは、pCEP-SP-EK-Fc*ベクターへのクローニング(実施例1)を介して、mVEGFR-2配列のC末端と融合した。pCEP-SP-EK-Fc*ベクターへクローニングされたmVEGFR-2の断片は、以下のアミノ酸配列(配列番号:345)をコードした:
PFIAS VSDQHGIVYI TENKNKTVVI PCRGSISNLN VSLCARYPEK
RFVPDGNRIS WDSEIGFTLP SYMISYAGMV FCEAKINDET YQSIMYIVVV
VGYRIYDVIL SPPHEIELSA GEKLVLNCTA RTELNVGLDF TWHSPPSKSH
HKKIVNRDVK PFPGTVAKMF LSTLTIESVT KSDQGEYTCV ASSGRMIKRN
RTFVRVHTKP
真核生物細胞での組み換えmVEGFR-2(2-3)の発現
組み換えmVEGFR-2(2-3)を、pCEP-SP-EK-Fc*ベクターを用いて、EBNA293細胞で発現させた。pCEP-SP-EK-Fc*ベクターは、BamHI及びNhe1部位を有し、1つのシステイン残基を含有するアミノ酸リンカー、エンテロキナーゼ切断部位、及びC末端にヒトFc領域をコードしている。mVEGFR-2(2-3)を、マウスの7日目胎児のcDNA(Marathon-Ready cDNA, Clontech)からのプライマー対BamH1-FLK1-F及びNhe1-FLK1-BによるPCRによって増幅した。PCR反応に関しては、10pmolの各オリゴ及び0.5ngのcDNA(マウス7日胎児cDNA Marathon-Ready cDNA, Clontech)を、50●l 反応混合液(1●lのAdvantage 2ポリメラーゼ ミックス(50x)、0.2mM dNTPs及び5●l 10x cDNA PCR反応緩衝液)で用いた。温度サイクルは以下の通りである:1分間の94●Cを5サイクル、30秒間の94●C、30秒間の54●C、1分間の72●C、その後に続く5サイクルの94●C(30秒)、54●C(30秒)、70●C(1分)及びその後に続く30サイクルの94●C(20秒)、54●C(30秒)及び68●C(1分)。このPCR産物をBamH1及びNhe1で消化し、同じ酵素で消化したpCEP-SP-EK-Fc*ベクターへ挿入した。結果として得られたプラスミドは、mVEGFR-2(2-3)-pCep-EK-Fcと命名された。すべての他の段階は、標準的分子生物学プロトコールによっておこなわれた。
オリゴ
1.プライマーBamH1-FLK1-F
5'-CGCGGATCCATTCATCGCCTCTGTC-3' (配列番号:343)
2.プライマーNhe1-FLK1-B
5'-CTAGCTAGCTTTGTGTGAACTCGGAC-3' (配列番号:344)

組み換え体mVEGFR-2(2-3)のトランスフェクション及び発現
EBNA293細胞を、上記のmVEGFR-2(2-3)-pCep-Ek-Fcコンストラクトでトランスフェクトし、実施例1に記載のような精製のために細胞の無血清上澄み液を収集した。
組み換え体mVEGFR-2(2-3)の精製
発現Fc-EK-mVEGFR-2(2-3)タンパク質のプロテインA精製を、実施例1に記載のようにおこなった。続いて、融合タンパク質のプロテインAとの結合の後、エンテロキナーゼ(EnterokinaseMax, インビトロジェン)を用いて、プロテインAと結合したFc部分からmVEGFR-2(2-3)を切断した。消化は、37●Cで終夜おこなった(2.5ユニット エンテロキナーゼ/結合融合タンパク質を有する100μlプロテインAビーズ)。遊離したmVEGFR-2(2-3)を、クロマトグラフィーカラム(Micro Bio Spin, Biorad)での短い遠心分離によって、いまだプロテインAと結合しているFc部分から分離した。エンテロキナーゼを除くために、製造者の指示書に従って、貫流液をエンテロキナーゼアウェイ(インビトロジェン)で処理した。
マウスVEGFR-2ペプチドのQβキャプシドタンパク質、HbcAg-lys-2cys-Mut及び線毛とのカップリング、並びにマウスのVLP-ペプチド及び線毛ペプチドワクチンによる免疫化
A.マウスVEGFR-2ペプチドのVLPs及び線毛とのカップリング
以下のペプチドを化学的に合成した(Eurogentec, Belgium):マウスVEGFR-2ペプチドCTARTELNVGLDFTWHSPPSKSHHKK、及び下記のように線毛との化学的カップリングに用いた。
マウスVEGFR-2ペプチドの線毛とのカップリング: 1400μlの20mM Hepes、pH7.4中の1mg/ml線毛タンパク質の溶液を、60分間、ロッキングシェーカー上でRTの(H2O)中の85μlの100mM Sulfo-MBS(Pierce)溶液と反応させた。この反応混合物は、PD-10カラム(アマシャム ファルマシア バイオテク)上で脱塩した。このカラムから溶出したタンパク質を含有する分画をプール(およそ1.4mgタンパク質を含有)し、それぞれ2.5倍モル濃度を超す(最終濃度)マウスVEGFR-2ペプチドと反応させた。例えば、およそ0.2mg誘導体化線毛を有する200μl溶出液、2.4μlの10mM ペプチド溶液(DMSO中の)を添加した。この混合液をロッキングシェーカー上において25℃で4時間インキュベートし、その後、4℃で終夜、2リットルの20mM Hepes、pH7.2に対して透析した。カップリングの結果は、還元条件下のSDS-PAGEによって分析し、図18Aに示してある。各試料の上澄み液(S)及びペレット(P)を、線毛及びSulfo-MBS架橋剤(Pierce)で誘導体化した線毛とともにゲルへ負荷した。図18Aのゲルに負荷した試料は、以下の通りである:
レーン1:マーカータンパク質;レーン2-5:カップリングした試料(線毛マウス:マウスペプチドとカップリングした線毛;線毛ヒト:ヒトペプチドとカップリングした線毛);レーン6:Sulfo-MBS架橋剤で誘導体化した線毛;レーン7-9:PD-10カラムの溶出液の3分画。分画2はピーク分画、分画1及び3は、ピークの境界で取得した分画。カップリングバンドは、ゲル上で明白に見ることが可能であり、それは、マウスVEGFR-2の線毛とのカップリングが成功したことを示している。
マウスVEGFR-2ペプチドのQβキャプシドタンパク質とのカップリング: 1mlの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.4中の1mg/ml Qβキャプシドタンパク質の溶液を、45分間、ロッキングシェーカー上でRTの(H2O)中の20μlの100mM Sulfo-MBS(Pierce)溶液と反応させた。この反応液について、その後、4℃で2Lの20mM Hepes、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。1000μlの透析反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上で25℃で4時間、12μlの10mM ペプチド溶液(DMSO中)と反応させた。この反応液について、その後、4℃で2リッターの20mM Hepes、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。カップリングの結果は、還元条件下のSDS-PAGEによって分析し、図18Bに示してある。各試料の上澄み液(S)を、Qβキャプシドタンパク質及びSulfo-MBS架橋剤で誘導体化したQβキャプシドタンパク質とともにゲルへ負荷した。カップリングは、二重におこなった。以下の試料をゲルへ負荷した:
レーン1:マーカータンパク質;レーン2、5:Qβキャプシドタンパク質;レーン3,6:Sulfo-MBSで誘導体化したQβキャプシドタンパク質;レーン4,7:マウスVEGFR-2ペプチドとカップリングさせたQβキャプシドタンパク質。カップリングバンドは、ゲル上で明白に見ることが可能であり、このことは、マウスVEGFR-2のQβキャプシドタンパク質とのカップリングが成功したことを示している。
マウスVEGFR-2ペプチドのHbcAg-lys-2cys-Mutとのカップリング: PBS、pH7.4中の3mlの0.9mg/ml cysフリーHbcAgキャプシドタンパク質(実施例31)の溶液を、45分間、ロッキングシェーカー上でRTの(H2O)中の37.5μlの100mM Sulfo-MBS(Pierce)溶液と反応させた。この反応液について、その後、2Lの20mM Hepes、pH7.4に対する終夜の透析をおこなった。緩衝液の交換の後、この反応液について、同じ緩衝液に対してさらに2時間透析した。その後、この透析反応混合液を、ロッキングシェーカー上で25℃で4時間、3μlの10mM ペプチド溶液(DMSO中)と反応させた。この反応混合液について、その後、4℃で終夜、2リッターの20mM Hepes、pH7.4に対する透析を2回おこない、その後で緩衝液を交換し、同じ緩衝液に対してさらに2時間の透析をおこなった。カップリングの結果を還元条件下のSDS-PAGEによって分析し、図18Cに示してある。各試料の上澄み液(S)を、HbcAg-lys-2cys-Mutタンパク質及びSulfo-MBS架橋剤で誘導体化したHbcAg-lys-2cys-Mutタンパク質と同様にゲルへ負荷した。カップリングは、二重におこなった。カップリング反応は、2.5倍及び10倍モル濃度を超えるペプチドでおこなった。以下の試料をゲルへ負荷した:
レーン1:マーカータンパク質;レーン2,4,6,8:10倍モル濃度を超えるペプチドとおこなった上澄み液(S)及びペレット(P)のカップリング反応;レーン3,5,7,9:2.5倍モル濃度を超えるペプチドとおこなった上澄み液(S)及びペレット(P)のカップリング反応;レーン10:Sulfo-MBSで誘導体化したHbcAg-lys-2cys-Mut;レーン11:HbcAg-lys-2cys-Mut。
カップリングバンドは、ゲル上で明白に見ることが可能であり、このことは、マウスVEGFR-2のHbcAg-lys-2cys-Mutタンパク質とのカップリングが成功したことを示している。
B.マウスの免疫化
線毛-ペプチドワクチン:
雌C3H-HeJ(Toll様レセプター4欠損)及びC3H-HeN(野生型)マウスを、アジュバンドの添加無しに、線毛タンパク質とカップリングしたマウスVEGFR-2ペプチドでワクチン接種した。各試料のおよそ100μgの全タンパク質をPBSで希釈して200μlとし、0日目、14及び28日目に皮下注射した。マウスを14、28及び42日目に逆軌道で出血させ、42日目の血清をヒトVEGFR-2特異的 ELISAを利用して分析した。
Qβキャプシドタンパク質-ペプチドワクチン:
6匹の 雌黒マウスを、アジュバンド(水酸化アルミニウム)の添加した場合としない場合で、Qβキャプシドタンパク質とカップリングしたマウスVEGFR-2ペプチドでワクチン接種した。各試料のおよそ100μgの全タンパク質をPBSで希釈して200μlとし、0日目、14及び28日目に皮下注射した。マウスを14、28及び42日目に逆軌道で出血させ、42日目の血清をヒトVEGFR-2特異的 ELISAを利用して分析した。
HbcAg-lys-2cys-Mutワクチン:
6匹の 雌黒マウスを、アジュバンド(水酸化アルミニウム)の添加した場合としない場合で、HbcAg-lys-2cys-Mutタンパク質とカップリングしたマウスVEGFR-2ペプチドでワクチン接種した。各試料のおよそ100μgの全タンパク質をPBSで希釈して200μlとし、0日目、14及び28日目に皮下注射した。マウスを14、28及び42日目に逆軌道で出血させ、42日目の血清をヒトVEGFR-2特異的 ELISAを利用して分析した。
C.ELISA
免疫化マウスの血清を、固定化マウスVEGFR-2ペプチドによるELISAで試験した。マウスVEGFR-2ペプチドを、化学架橋剤Sulfo-SPDPを用いたウシリボヌクレアーゼ(RNAse)とカップリングさせた。ELISAプレートは、10μg/mlの濃度のカップリングさせたRNAseAでコーティングした。このプレートをブロックし、その後、連続希釈したマウス血清でインキュベートした。結合した抗体は、酵素的に標識した抗マウスIgG抗体で検出した。コントロールとして、同じマウスの免疫前血清も試験した。カップリングしていない担体で免疫化したマウスの血清を用いたコントロールELISA実験によって、検出された抗体がそれぞれのペプチドに対して特異的であることが示された。この結果は、図4-6に示されている。
線毛-ペプチドワクチン:
ELISAの結果が、図18Dに示されている。示された血清希釈に関する結果は、450nmでの光学密度により示している。各3匹のマウスの平均(標準偏差を含む)が示されている。すべてのワクチン化したマウスは、マウスVEGFR-2ペプチドに対するIgG抗体力価を作り出した。Toll様レセプター4が欠損しているマウスと野生型マウスの間では、何の違いも認められず、このことは、線毛とカップリングした場合の、マウスでの自己抗原マウスVEGFR-2ペプチドの免疫原性を示している。マウスに注入されたワクチンは、対応する分析された血清を表している。
Qβキャプシドタンパク質-ペプチドワクチン:
指示された血清希釈に関する結果が、450nmでの光学密度として図18Eに示されている。各2匹のマウスの平均(標準偏差を含む)が示されている。すべてのワクチン化したマウスは、マウスVEGFR-2ペプチドに対するIgG抗体力価を作り出し、このことは、Qβキャプシドタンパク質とカップリングした場合の、マウスでの自己抗原マウスVEGFR-2ペプチドの免疫原性を示している。マウスに注入されたワクチンは、対応する分析された血清を表している。
HbcAg-lys-2cys-Mutワクチン:
指示された血清希釈に関する結果が、450nmでの光学密度として図18Fに示されている。各3匹のマウスの平均(標準偏差を含む)が示されている。すべてのワクチン化したマウスは、マウスVEGFR-2ペプチドに対するIgG抗体力価を作り出し、このことは、Qβキャプシドタンパク質とカップリングした場合の、マウスでの自己抗原マウスVEGFR-2ペプチドの免疫原性を示している。マウスに注入されたワクチンは、対応する分析された血清を表している。
Aβ1-15ペプチドのHBc-Ag-lys-2cys-Mut及びfrキャプシドタンパク質のカップリング
以下のAβペプチドを化学的に合成した
ヒトAβの残基1-15のアミノ酸配列を含むペプチドで、VLPs及び線毛とのカップリングのために、そのC末端で配列GGCと融合した(DAEFRHDSGYEVHHQGGC)。
A.a.)架橋剤SMPHを用いた、Aβ1-15ペプチドのHBc-Ag-lys-2cys-Mutとのカップリング
833.3μlの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.4中の1.2mg/ml HBc-Ag-lys-2cys-Mutタンパク質の溶液を、30分間、ロッキングシェーカー上にて25℃でH2O中の17μlの65mM SMPH(Pierce)溶液と反応させた。この反応溶液については、その後、2回、分画分子量10000Daの透析チューブによって、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対して2時間の透析をした。833.3μlのこの透析反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上にて15℃で2時間、7.1μlの50mM ペプチド原液(DMSO中のペプチド原液)と反応させた。この反応混合液については、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対して終夜、透析をした。この試料は、その後、液体窒素でアリコートで凍結し、マウスの免疫化まで−80℃で貯蔵した。
b)架橋剤SMPHを用いたAβ1-15ペプチドのfrキャプシドタンパク質とのカップリング
500μlの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.4中の2mg/ml frキャプシドタンパク質の溶液を、30分間、ロッキングシェーカー上にて25℃でH2O中の23μlの65mM SMPH(Pierce)溶液と反応させた。この反応溶液については、その後、2回、分画分子量10000Daの透析チューブによって、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対して2時間の透析をした。500μlのこの透析反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上にて15℃で2時間、5.7μlの50mM ペプチド原液(DMSO中のペプチド原液)と反応させた。この反応混合液については、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対して終夜、透析をした。この試料は、その後、液体窒素でアリコートで凍結し、マウスの免疫化まで−80℃で貯蔵した。試料のカップリング反応は、還元条件下のSDS-PAGEによって分析した。
カップリング実験の結果は、SDS-PAGEによって分析し、図19A示されている。frキャプシドタンパク質又はHBc-Ag-lys-2cys-MutのいずれかとのAβ1-15のカップリングと一致する明白なカップリングバンドは、ゲル上で明らかであり、図中の矢印によって示されており、Aβ1-15のfrキャプシドタンパク質及びHBc-Ag-lys-2cys-Mutキャプシドタンパク質とのカップリングが成功したことを示している。frキャプシドタンパク質とのカップリングに関して、複数のカップリングバンドが明らかであるが、その一方で、HBc-Ag-lys-2cys-Mutに関しては、主に1つのカップリングバンドが明らかである。
以下の試料を、図19Aのゲルに負荷した。
1:タンパク質マーカー(kDa マーカー7708S BioLabs.ゲルの頂点からの分子量マーカーバンド:175,83,62,47.5,32.5,25,16.5,6.5kDa)。2:誘導体化HBc-Ag-lys-2cys-Mut.3:Aβ1-15とカップリングしたHBc-Ag-lys-2cys-Mut、カップリング反応の最後に取得した試料の上澄み液、及びその遠心分離したもの。4:Aβ1-15とカップリングしたHBc-Ag-lys-2cys-Mut、カップリング反応の最後に取得した試料のペレット、及びその遠心分離したもの。5:誘導体化frキャプシドタンパク質。6:Aβ1-15とカップリングしたfrキャプシドタンパク質、カップリング反応の最後に取得した試料の上澄み液、及びその遠心分離したもの。4:Aβ1-15とカップリングしたfrキャプシドタンパク質、カップリング反応の最後に取得した試料のペレット、及びその遠心分離したもの。
B.Balb/cマウスの免疫化
雌Balb/cマウスは、無菌PBSで希釈した10μgのAβ1-15とカップリングさせたfrキャプシドタンパク質(Fr-Aβ1-15)、又は10μgのAβ1-15とカップリングさせたHBc-Ag-lys-2cys-Mut(HBc-Aβ1-15)のいずれかで、0日目及び14日目の2回、ワクチン接種した。マウスを22日目に逆軌道で出血させ、その血清をAβ1-15-特異的 ELISAを利用して分析した。
C.ELISA
化学架橋剤sulfo-SPDPを用いて、Aβ1-15ペプチドをウシRNAse Aとカップリングさせた。ELISAプレートは、10μg/mlの濃度でAβ1-15-リボヌクレアーゼ(RNAse) コンジュゲートでコーティングした。このプレートをブロックし、その後、連続的に希釈した血清試料とともにインキュベートした。結合した抗体は、酵素的に標識した抗-マウスIgGで検出した。コントロールとして、未処理マウスの血清も試験した。
図19Bに示されているのは、それぞれワクチンFr-Aβ 1-15、及びHBc-Aβ1-15で免疫化したマウスの血清で、22日目に得られたELISAシグナルである。未処理マウス(免疫前血清)のコントロール血清も含まれた。異なる血清希釈の結果は、450nmの光学密度で示している。各3匹のワクチン接種マウスから得られた平均的な結果が示されている。すべてのワクチン接種マウスは、その血清にAβ1-15-特異的IgG抗体を有する。
Aβ1-15、Aβ1-27及びAβ33-42ペプチドのI型線毛とのカップリング
架橋剤SMPHを用いたAβ1-15、Aβ1-27及びAβ33-42ペプチドの線毛とのカップリング。
以下のAβペプチドを化学的に合成した:
ヒトAβの残基1-15のアミノ酸配列を含むペプチドで、線毛及びVLPsとのカップリングのために、そのC末端で配列GGCと融合したDAEFRHDSGYEVHHQGGC(「Aβ1-15」)、
ヒトAβの残基1-27のアミノ酸配列を含むペプチドで、線毛及びVLPsとのカップリングのために、そのC末端で配列GGCと融合したDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNGGC(「Aβ1-27」)、及び
Aβの残基33-42のアミノ酸配列を含むペプチドで、線毛及びVLPsとのカップリングのために、そのN末端で配列CGHGNKSと融合したCGHGNKSGLMVGGVVIA(「Aβ33-42」)。全3ペプチドは、以下に記載のような線毛との化学カップリングに用いた。
2mlの20mM Hepes 150mM NaCl pH7.4中の2mg/ml 線毛の溶液を、45分間、ロッキングシェーカー上にて25℃でH2O中の468μlの33.3mM SMPH(Pierce)溶液と反応させた。この反応液を、PD10カラム(ファルマシア)へ負荷し、6X 500μlの20mM Hepes 150mM NaCl pH7.4で溶出した。分画は、ニトロセルロース(Schleicher& Schuell)上に点在させ、アミドブラックで染色することで分析した。分画3-6をプールした。この試料は、その後、液体窒素でアリコートで凍結し、カップリングまで−80℃で貯蔵した。
200μlの解凍脱塩反応混合物を、その後、ロッキングシェーカー上にてRTで3.5時間、200μl DMSO及び2.5μlの各対応するDMSO中の50mM ペプチド原液と混合させた。400μlの反応混合液を、その後3回、分画分子量10000Daの透析チューブによって、4℃で1リッターの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対して1時間の透析を3回した。この試料は、その後、液体窒素でアリコートで凍結し、−80℃で貯蔵した。
SDS-Pageのための試料調製を、以下のようにしておこなった:100μlの透析カップリング反応を、氷上で10分間、10%TCA中でインキュベートし、その後で遠心分離した。そのペレットを50μl 8.5M グアニジン-HCl溶液に懸濁させ、70℃で15分間、インキュベートした。この試料を、その後、エタノールで沈殿させ、二回目の遠心分離の後、ペレットを試料緩衝液に懸濁させた。
カップリング実験の結果は、還元条件下のSDS-PAGEによって分析した。全3ペプチドに関して、明らかなカップリングバンドを見ることができ、このことは、Aβペプチドの線毛とのカップリングを示している。
Qβキャプシドタンパク質とカップリングさせたAβペプチドによるAPP23マウスのワクチン接種
A.APP23マウスの免疫化
3つの異なるAβペプチド(Aβ1-27-Gly-Gly-Cys-NH2;H-Cys-Gly-His-Gly-Asn-Lys-Ser-Aβ33-42;Aβ1-15-Gly-Gly-Cys-NH2)をQβキャプシドタンパク質とカップリングさせた。結果として得られたワクチンは、「Qb-Ab1-15」、「Qb-Ab1-27」、「Qb-Ab33-42」と呼ばれた。ヒトAPP導入遺伝子を有する8ヶ月齢の雌APP23マウス(Sturchler-Pierratら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 13287-13292(1997))を、ワクチン接種に用いた。このマウスを、無菌PBSで希釈した25μgワクチンで皮下注射し、14日後に、同じ量のワクチンで追加免疫した。免疫化の開始前及び追加免疫注射の7日後に、マウスを尾部から出血させた。血清は、ELISAによって分析した。
B.ELISA
Aβ1-40及びAβ1-42ペプチド原液をDMSO中で作製し、使用する前にコーティング緩衝液で希釈した。ELISAプレートは、0.1μg/ウェルAβ1-40又はAβ1-42ペプチドでコーティングした。このプレートをブロックし、その後、連続希釈マウス血清とともにインキュベートした。結合した抗体は、酵素的に標識した抗マウスIgG抗体で検出した。コントロールとして、ワクチン接種前に得た血清も含めた。ベースラインより上の平均値±3標準偏差を示す血清希釈を計算し、「ELISA力価」として定義した。試験された3つのワクチンすべては、APP23マウスで免疫原性があり、Aβペプチド1-40及び/又はAβ1-42に対する高い抗体力価を誘導した。この結果は、図20に示されている。同じマウスの免疫前血清では、特異的な抗体は検出されなかった(データは示さず)。
図20に示されているのは、22日目に、それぞれワクチンFr-Aβ1-15、及びHBc-Aβ1-15で免疫化したマウスの血清によって得られたELISAシグナルである。未処理マウス(免疫前血清)のコントロール血清も含まれる。異なる血清の希釈による結果は、450nmでの光学密度として示されている。3匹のワクチン接種したマウスそれぞれから結果として得られた平均が示されている。
マウスA21-A30はワクチンQb-Ab1-15を受け取り、マウスA31-A40はQb-Ab1-27を受け取り、マウスA41-49はQb-Ab 33-42を受け取った。それぞれのマウスにとって、Aβ1-40及びAβ1-42ペプチド特異的血清抗体力価は、21日目に、ELISAによって決定された。ベースラインより上の平均値±3標準偏差を示す血清希釈として定義されるELISA力価が、個々のマウスについて示されている。Qb-Ab1-15又はQb-Ab1-27でワクチン接種したマウスは、Aβ1-40及びAβ1-42の双方に対する高い抗体力価を生成したが、その一方で、Qb-Ab 33-42でワクチン接種したマウスは、Aβ1-42ペプチドに対する高い抗体力価のみを有していた。
Qβキャプシドタンパク質とFab抗体断片のカップリング
20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の4.0mg/ml Qβキャプシドタンパク質の溶液を、30分間、ロッキングシェーカー上にて25℃で2.8mM SMPH(Pierce)(DMSOに溶解した原液から)と反応させた。この反応溶液については、その後、2回、4℃で2lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対して2時間の透析をした。
ヒトIgGのパパイン消化によって産生されたヒトIgGのFab断片を、Jackson Immunolabから購入した。この溶液(11.1mg/ml)を、20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中で2.5mg/mlの濃度へと希釈し、ジチオスレイトール(DTT)又はトリカルボキシエチルホスフィン(TCEP)のいずれかの異なる濃度(0-1000μM)と25℃で30分間反応させた。
カップリングは、誘導体化及び透析Qβキャプシドタンパク質溶液と非還元又は還元Fab溶液(最終濃度:1.14mg/ml Qβ及び1.78mg/ml Fab)を混合し、ロッキングシェーカー上にて25℃で終夜混合を進めることによって誘導した。
その反応産物は、還元条件下の16%SDS-PAGEゲル上で分析した。ゲルは、クーマシーブリリアントブルーで染色した。この結果は、図21に示されている。
約40kDaのカップリング産物は、Fabが、10μM TCEP、10μM DTT又は1000μM DTTではなくて、25-1000μM TCEP及び25-100μM DTT(図21、矢印)によるカップリングの前に還元された試料中で検出されることが可能である。このカップリングしたバンドは、抗Qβ抗血清とも反応し(データは示さず)、このことは、Qβキャプシドタンパク質とFab断片の共有的カップリングを明示している。
図21のゲルに負荷した試料は、以下の通りである:
レーン1:分子量マーカー。レーン2及び3:カップリング前の誘導体化Qβキャプシドタンパク質。レーン4-13:4によるFabの還元後のQβ-Fabカップリング反応 4:10μM TCEPによるFabの還元後のQβ-Fabカップリング反応。5:25μM TCEPによるFabの還元後のQβ-Fabカップリング反応。6:50μM TCEPによるFabの還元後のQβ-Fabカップリング反応。7:100μM TCEPによるFabの還元後のQβ-Fabカップリング反応。8:1000μM TCEPによるFabの還元後のQβ-Fabカップリング反応。9:10μM DTTによるFabの還元後のQβ-Fabカップリング反応。10:25μM DTTによるFabの還元後のQβ-Fabカップリング反応。11:50μM DTTによるFabの還元後のQβ-Fabカップリング反応。12:100μM DTTによるFabの還元後のQβ-Fabカップリング反応。13:1000μM DTTによるFabの還元後のQβ-Fabカップリング反応。レーン14:カップリング前。このゲルは、クーマシーブリリアントブルーで染色した。マーカータンパク質の分子量は、左端に示されている。その矢印は、カップリングしたバンドを示す。
Qβキャプシドタンパク質とカップリングしたAβペプチドによるAPP23マウスのワクチン接種
A.APP23マウスの免疫化
3つの異なるAβペプチド(Aβ1-27-Gly-Gly-Cys-NH2;H-Cys-Gly-His-Gly-Asn-Lys-Ser-Aβ33-42;Aβ1-15-Gly-Gly-Cys-NH2)をQβキャプシドタンパク質とカップリングさせた。結果として得られたワクチンは、「Qb-Ab1-15」、「Qb-Ab1-27」、「Qb-Ab33-42」と呼ばれた。ヒトAPP導入遺伝子を有する8ヶ月齢の雌APP23マウス(Struchler-Pierratら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 13287-13292(1997))を、ワクチン接種に用いた。このマウスを、無菌PBSで希釈した25μgワクチンで皮下注射し、14日後に、同じ量のワクチンで追加免疫した。免疫化の開始前及び追加免疫注射の7日後に、マウスを尾部から出血させた。血清は、ELISAによって分析した。
B.ELISA
Aβ1-40及びAβ1-42ペプチドをDMSO中で作製し、使用する前にコーティング緩衝液で希釈した。ELISAプレートは、0.1μg/ウェルAβ1-40又はAβ1-42ペプチドでコーティングした。このプレートをブロックし、その後、連続希釈マウス血清とともにインキュベートした。結合した抗体は、酵素的に標識した抗マウスIgG抗体で検出した。コントロールとして、ワクチン接種前に得た血清も含めた。ベースラインより上の平均値±3標準偏差(σ)を示す血清希釈を計算し、「ELISA力価」として定義した。試験された3つのワクチンすべては、APP23マウスで免疫原性があり、Aβペプチド1-40及び/又はAβ1-42に対する高い抗体力価を誘導した。この結果は、図20示されている。同じマウスの免疫前血清では、特異的な抗体は検出されなかった(データは示さず)。
図20に示されているのは、22日目に、それぞれワクチンQb-Ab1-15、及びQb-Ab1-27及びQb-Ab33-42で免疫化したマウスの血清によって得られたELISAシグナルである。マウスA21-A30はワクチンQb-Ab1-15を受け取り、マウスA31-A40はQb-Ab1-27を受け取り、マウスA41-49はQb-Ab 33-42を受け取った。それぞれのマウスについて、Aβ1-40及びAβ1-42ペプチド特異的血清抗体力価は、21日目に、ELISAによって決定された。ベースラインより上の平均値±3標準偏差(σ)を示す血清希釈として定義されるELISA力価が、個々のマウスについて示されている。Qb-Ab1-15又はQb-Ab1-27でワクチン接種したマウスは、Aβ1-40及びAβ1-42の双方に対する高い抗体力価を生成したが、その一方で、Qb-Ab 33-42でワクチン接種したマウスは、Aβ1-42ペプチドに対する高い抗体力価のみを有していた。ヒトAβ導入遺伝子を発現するトランスジェニックマウスにおいて、ヒトAβペプチドによって得られた非常に強い免疫応答は、AβペプチドをQβキャプシドタンパク質とカップリングすることによって、自己抗原に対する寛容が克服できることを示している。
変異体Qβコートタンパク質の構築、発現及び精製
pQβ-240の構築
プラスミドpQβ10(Kozlovska, TM, ら, Gene 137:133-137)を、pQβ-240の構築のための初期プラスミドとして用いた。変異Lys13→Argは、インバースPCRによって作製した。逆方向プライマーを、逆方向のテールからテール方向で消化した:
5'-GGTAACATCGGTCGAGATGGAAAACAAACTCTGGTCC-3' 及び
5'-GGACCAGAGTTTGTTTTCCATCTCGACCGATGTTACC-3'。
最初のPCRの産物を、二回目のPCR反応のテンプレートとして用い、上流プライマー
5'-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3' 及び下流プライマー
5'-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3'
を用いた。二回目のPCRの産物を、XbaI及びMph1103Iで消化し、同じ制限酵素によって切断したpQβ10発現ベクターへクローニングした。PCR反応は、PCRキット試薬、及び手順プロトコールに従っておこなった(MBI Fermentas、ヴィリニゥス、リトアニア)。
直接標識取り込み法を利用したシーケンシングによって、所望される変異が確かめられた。pQβ-240を有する大腸菌は、Qβファージ粒子から単離したコントロールのQβコートタンパク質とともに、PAGEによって共遊走する14-kDタンパク質の効率的な合成を支えた。
結果として得られたアミノ酸配列:(配列番号:255)
AKLETVTLGNIGRDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP
ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTANGSCDPSVTRQ
KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDQLNPAY
pQβ-243の構築
プラスミドpQβ10を、pQβ-243の構築のための初期プラスミドとして用いた。変異Asn10→Lysは、インバースPCRによって作製した。逆方向プライマーを、逆方向のテールからテール方向で消化した:
5'-GGCAAAATTAGAGACTGTTACTTTAGGTAAGATCGG-3' 及び
5'-CCGATCTTACCTAAAGTAACAGTCTCTAATTTTGCC-3'。
最初のPCRの産物を、二回目のPCR反応のテンプレートとして用い、上流プライマー
5'-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3' 及び下流プライマー
5'-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3'
を用いた。二回目のPCRの産物を、XbaI及びMph1103Iで消化し、同じ制限酵素によって切断したpQβ10発現ベクターへクローニングした。PCR反応は、PCRキット試薬、及び手順プロトコールに従っておこなった(MBI Fermentas、ヴィリニゥス、リトアニア)。
直接標識取り込み法を利用したシーケンシングによって、所望される変異が確かめられた。pQβ-243を有する大腸菌は、Qβファージ粒子から単離したコントロールのQβコートタンパク質とともに、PAGEによって共遊走する14-kDタンパク質の効率的な合成を支えた。
結果として得られたアミノ酸配列:(配列番号:256)
AKLETVTLGKIGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP
ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ
KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY
pQβ-250の構築
プラスミドpQβ-240を、pQβ-250の構築のための初期プラスミドとして用いた。変異Lys2→Argは、部位特異的突然変異法によって作製した。上流プライマー
5'-GGCCATGGCACGACTCGAGACTGTTACTTTAGG-3' 及び
下流プライマー5'-GATTTAGGTGACACTATAG-3' を独特の制限部位NcoI及びHind IIIでpQβ-185発現ベクターへ導入された、変異体PCR断片の合成のために用いた。PCR反応は、PCRキット試薬、及び手順プロトコールに従っておこなった(MBI Fermentas、ヴィリニゥス、リトアニア)。
直接標識取り込み法を利用したシーケンシングによって、所望される変異が確かめられた。pQβ-250を有する大腸菌は、Qβファージ粒子から単離したコントロールのQβコートタンパク質とともに、PAGEによって共遊走する14-kDタンパク質の効率的な合成を支えた。
結果として得られたアミノ酸配列:(配列番号:257)
ARLETVTLGNIGRDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP
ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ
KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLASPLLIDAIDQLNPAY
pQβ-251のコンストラクト
プラスミドpQβ10を、pQβ-251の構築のための初期プラスミドとして用いた。変異Lys16→Argは、インバースPCRによって作製した。逆方向プライマーを、逆方向のテールからテール方向で消化した:
5'-GATGGACGTCAAACTCTGGTCCTCAATCCGCGTGGGG-3' 及び
5'-CCCCACGCGGATTGAGGACCAGAGTTTGACGTCCATC-3'。
最初のPCRの産物を、二回目のPCR反応のテンプレートとして用い、上流プライマー
5'-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3' 及び下流プライマー
5'-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3'
を用いた。二回目のPCRの産物を、XbaI及びMph1103Iで消化し、同じ制限酵素によって切断したpQβ10発現ベクターへクローニングした。PCR反応は、PCRキット試薬、及び手順プロトコールに従っておこなった(MBI Fermentas、ヴィリニゥス、リトアニア)。
直接標識取り込み法を利用したシーケンシングによって、所望される変異が確かめられた。pQβ-251を有する大腸菌は、Qβファージ粒子から単離したコントロールのQβコートタンパク質とともに、PAGEによって共遊走する14-kDタンパク質の効率的な合成を支えた。このコンストラクトによってコードされている結果として得られたアミノ酸配列は、配列番号:259に示されている。
pQβ-259の構築
プラスミドpQβ-251を、pQβ-259の構築のための初期プラスミドとして用いた。変異Lys2→Argは、部位特異的突然変異法によって作製した。上流プライマー
5'-GGCCATGGCACGACTCGAGACTGTTACTTTAGG-3' 及び
下流プライマー5'-GATTTAGGTGACACTATAG-3' を独特の制限部位NcoI及びHind IIIでpQβ-185発現ベクターへ導入された、変異体PCR断片の合成のために用いた。PCR反応は、PCRキット試薬、及び手順プロトコールに従っておこなった(MBI Fermentas、ヴィリニゥス、リトアニア)。
直接標識取り込み法を利用したシーケンシングによって、所望される変異が確かめられた。pQβ-259を有する大腸菌は、Qβファージ粒子から単離したコントロールのQβコートタンパク質とともに、PAGEによって共遊走する14-kDタンパク質の効率的な合成を支えた。
結果として得られたアミノ酸配列:(配列番号:258)
AKLETVTLGNIGKDGKQTLVLNPRGVNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP
ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQKIQNPTACTANGSCDPSVTTRQ
KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLDAIDQLNPAY
Qβ及びQβ変異体の発現及び精製に関する一般的な手法
発現
大腸菌JM109をQ-β発現プラスミドで形質転換する。5mlのLB液体培地に、20●g/mlアンピシリン、Q-β発現プラスミドで形質転換したクローンを接種する。振盪せずに、37℃で16-24時間インキュベートする。
20●g/mlを含有するLB培地の100-300mlに、1:100で調製した種菌をせ接種する。振盪せずに、37℃で16-24時間インキュベートする。フラスコ中のM9+1%カザミノ酸+0.2%グルコース培地を、調製した種菌1:50で接種し、振盪下で終夜、37℃でインキュベートする。
精製
精製方法のための溶液及び緩衝液:
1.溶解緩衝液LB
50mM EDTA、0.1%トリトンX100及び新鮮に調製したPMSFを1mlあたり5マイクログラムを含む、50mM トリス-HCl pH8.0。リゾチーム及びデオキシリボヌクレアーゼ(DNase)を含まない。
2.SAS
水中の飽和硫酸アンモニウム
3.緩衝液NET.
5mM EDTA及び150mM NaClを含む、20mM トリス-HCl pH7.8。
4.PEG
NET中の40%(w/v)ポリエチレングリコール6000
破壊及び溶解
凍結細胞を、2ml/g細胞でLBに懸濁した。この混合液を、氷上で溶液を冷やすための1分間のインターバルを含めて、5回の15秒間の22kHによって超音波処理をした。このライセートを、その後でJanecki K 60 ローターを用いて1時間、14000rpmで遠心分離した。下記の遠心分離ステップは、別途記載がなければ、同じローターを用いて、すべてをおこなった。その上澄み液を4℃で貯蔵し、その一方では、細胞片をLBで2回洗浄した。遠心分離の後、ライセートと洗浄分画の上澄み液をプールした。
分画
飽和硫酸アンモニウム溶液を、撹拌しながら、上記をプールしライセートへ滴状に添加した。SASの容量は、20%の飽和を得るように、全容量の5分の1となるように調製した。この溶液は、終夜、静置させ、次の日に20分間、14000rpmで遠心分離した。ペレットを、少量の20%硫酸アンモニウムで洗浄し、再び遠心分離した。得られた上澄み液をプールし、40%の飽和を得るために、SASを滴状に添加した。この溶液を終夜、静置させ、次の日に20分間、14000rpmで遠心分離した。得られたペレットは、NET緩衝液で可溶化した。
クロマトグラフィー
NET緩衝液に再可溶化したキャプシドタンパク質を、セファロースCL-4Bカラムに負荷した。クロマトグラフィーの間に、3つのピークが溶出した。最初のものは、主に膜及び膜断片を有しており、収集しなかった。キャプシドは、二番目のピークに含まれており、その一方で、3番目のピークは他の大腸菌タンパク質を有していた。
このピーク分画をプールし、NaCl濃度を0.65Mの最終濃度へ調製した。プールしたピーク分画の2分の1に相当するPEG溶液の容量を、撹拌しながら滴状に添加した。この溶液は、終夜、静置させた。キャプシドタンパク質は、20分間の14000rpmでの遠心分離によって沈降させた。その後、それを最少容量のNETに可溶化し、再びセファロースCL-4Bカラムに負荷した。そのピーク分画をプールし、60%の飽和で硫酸アンモニウムによって沈殿させた。遠心分離及びNET緩衝液での再可溶化の後、再クロマトグラフィーのために、キャプシドタンパク質をセファロースCL-6Bに負荷した。
透析及び乾燥
上記で得られたピーク分画をプールし、無菌水に対して十分に透析し、貯蔵のために凍結乾燥した。
発現及び精製Qβ-240
細胞(プラスミドpQβ-240で形質転換した大腸菌JM109)をLBに再懸濁し、15秒間で5回、超音波処理(ウォーターアイスジャケット)し、1時間、13000rpmで遠心分離した。この上澄み液を、さらなる処理までに4℃で貯蔵し、その一方で、細胞片を9mlのLBで2回洗浄し、最後には、9mlのLBの0.7M尿素で洗浄した。すべての上澄み液をプールし、セファロースCL-4Bカラムに負荷した。プールピーク分画を、硫酸アンモニウムで沈殿させて遠心分離した。その再可溶化タンパク質を、その後、さらにセファロース2Bカラム、最終的にはセファロース6Bカラムで精製した。キャプシドピークを、最後に、水に対して十分に透析し、上記のようにして凍結乾燥した。キャプシドへのコートタンパク質のアセンブリは、電子顕微鏡検査法によって確かめた。
Qβ-243の発現及び精製
細胞(大腸菌RR1)を、一般的な手順に記載のようにLBに再懸濁して処理した。タンパク質は、セファロースCL-4Bカラム及び最後はセファロースCL-2Bカラムによる2連続ゲル濾過によって精製した。ピーク分画は、上記のようにして、プールして凍結乾燥した。キャプシドへのコートタンパク質のアセンブリは、電子顕微鏡検査法によって確かめた。
Qβ-250の発現及び精製
細胞(pQβ-250で形質転換した大腸菌JM109)を、上記のようにしてLBに再懸濁して処理した。タンパク質は、セファロースCL-4Bカラム及び最後はセファロースCL-2Bカラムによる2連続ゲル濾過で精製し、上記のようにして凍結乾燥した。ピーク分画は、上記のようにして、プールして凍結乾燥した。キャプシドへのコートタンパク質のアセンブリは、電子顕微鏡検査法によって確かめた。
Qβ-259の発現及び精製
細胞(pQβ-259で形質転換した大腸菌JM109)を、上記のようにしてLBに再懸濁し、超音波処理した。細胞片は、1回目は10mlのLBで、2回目は10mlのLB中の0.7M 尿素で洗浄した。タンパク質は、セファロースCL-4Bカラム及び最後はセファロースCL-2Bカラムによる2連続ゲル濾過によって精製した。タンパク質は、上記のようにして、透析して凍結乾燥した。キャプシドへのコートタンパク質のアセンブリは、電子顕微鏡検査法によって確かめた。
Qβキャプシドタンパク質とカップリングしたPLA2によるアレルギー性マウスの脱感作
C.ワクチン接種によるアレルギー性マウスの脱感作
雌CBA/Jマウス(8週齢)をPLA2で感作した:マウスあたり、Latoxan(フランス)の0.1ug PLA2を、30分間ボルテックスすることによって1mg ミョウバン(Imject, Pierce)に吸収させて全容量を66ulとし、その後で皮下注射した。この工程を14日毎で合計4回繰り返した。この処理は、IgG2aではなく、PLA2特異的IgEの発生を引き出した。最後の感作の1ヶ月後、マウスに、Qβキャプシドタンパク質とカップリングさせた組み換えPLA2で構成される10ug ワクチンを皮下注射した。1及び2週間後に、それらマウスを、再び同じ量のワクチンで処理した。最後の処理の1週間後に、マウスを出血させて、その後で25ug PLA2(Latoxan)により腹腔内を免疫性の試験をし、直腸温を目盛り付きデジタル温度計を用いて60分間測定した。コントロールとしては、Qβキャプシドタンパク質-PLA2で処理していない感作マウスを用いた。すべてのコントロールマウスがPLA2による免疫性の試験後に直腸温の劇的な低下を反映するアナフィラキシー応答を経験する一方で、ワクチン接種されたマウスは、完全又は少なくとも部分的に保護された。結果は、図25Aに示されている。
B.ELISA
ELISAプレート(Maxisorp、Nunc)を、5μg/mlのPLA2(Latoxan)でコーティングした。このプレートをブロックし、その後で連続希釈血清によってインキュベートした。IgE抗体の検出に関しては、血清を、室温のシェーカー上で60分間、プロテインGビーズ(ファルマシア)によって前処理した。このビーズは遠心分離で取り除き、その上澄み液をELISAに用いた。PLA2と結合した抗体は、酵素標識した抗マウスIgG2a又はIgE抗体で検出した。ELISA力価は、最高光学密度の半分(OD50%)で測定し、IgG2aの100倍前希釈血清のIog5として、そして、IgEの10倍前希釈血清のIog5として示された。すべてのマウスについては、血清中のPLA2-特異的IgG2a及びIgEを、ワクチン接種処理の前と終わりに測定した。ワクチン接種は、IgE力価に一貫した変化が見られないが、PLA2-特異的IgG2aの劇的な増加につながった。この結果は、ワクチン接種がTh1様免疫応答の誘導につながることをしめしている(IgG2aの産生による影響)。結果は、図25Bに示されている。
ワクチン接種及び非ワクチン接種マウスにおけるアナフィラキシー応答は、図25Aに示されている。
マウスをPLA2に感作させ、その後、Qβキャプシドタンパク質とカップリングさせたPLA2で構成される10ugのワクチンで3回、皮下処理した。コントロールマウスは、ワクチン接種しなかったが、感作した。最後のワクチン接種の1週間後に、すべてのマウスを、25ug PLA2により腹腔内を免疫性の試験をし、直腸温を60分間、測定することで、アナフィラキシー応答をモニターした。すべてのコントロールマウスが体温の劇的な低下を示したのに対して、ワクチン接種マウスは、アナフィラキシー反応から完全又は部分的に保護された。
ワクチン接種によるPLA-2特異的IgG2aの誘導は、図25Bに示されている。マウスをPLA2で感作し、その後、Qβキャプシドタンパク質とカップリングさせたPLA2で構成される10ug ワクチンで3回処理した。コントロールマウスは、ワクチン接種せずに、感作した。処理を開始するの前及び処理の完了前、免疫性の試験の前に、血清を感作したマウスから取り出した。ワクチン接種したマウス(パネルの左手)では、PLA2-特異的IgG2aの劇的な増加が認められた。
Pla2-Cys(PLA2融合タンパク質とも呼ばれる)の発現、リフォールディング、精製及びカップリング
封入体の発現及び調製
実施例xxxのPLA2-Cys遺伝子を含有するpET11aプラスミドを、大腸菌BL21DERill(ストラタジーン)へ形質転換した。終夜培養は、100μg/mlアンピシリン及び15μg/mlクロラムフェニコールを含有するdYT培地で生育させた。この培養液を、アンピシリン及びクロラムフェニコールを含有する新鮮なdYT培地で希釈し、37℃でOD600nm=1に達するまで生育させた。この培養液を1mM IPTGで誘導し、さらなる4時間生育させた。細胞を遠心分離によって収集し、0.5mg/mlリゾチームを含有するPBS緩衝液に再懸濁した。氷上でのインキュベーション後、細胞を氷上で超音波処理し、10mM の濃度までMgCl2を添加した。6μlのベンゾナーゼ(メルク)を細胞ライセートに添加し、そのライセートをRTで30分間インキュベートした。トリトンを1%の最終濃度まで添加し、このライセートを、氷上で30分間さらにインキュベートした。その封入体ペレットは、20mMトリス、23%スクロース、1mM EDTA、pH8.0を含有する洗浄緩衝液で洗浄した。IBsは、200mM DTTを含有する6Mグアニジウム-HCl、20mM トリス、pH8.0に可溶化した。この可溶化IBsを50000gで遠心分離し、その上澄み液を6Mグアニジウム-HCl、20mM トリス、pH8.0に対して、続いて0.1mM DTTを含有する同じ緩衝液に対して透析した。酸化型グルタチオンを50mMの最終濃度まで添加し、可溶化IBsをRTで1時間インキュベートした。この可溶化IBsは、6Mグアニジウム-HCl、20mM トリス、pH8.0に対して透析した。IB溶液の濃度は、ブラッドフォード分析及びSDS-PAGEによって推定した。
B.リフォールディング及び精製
4℃でリフォールディングを始める前に5mM還元型グルタチオン及び酸化型グルタチオンを添加した、2mM EDTA、0.2mM ベンズアミジン(Benzamidin)、0.2mM アミノカプロン酸、0.2mM グアニジニウム-HCl、0.4M L-アルギニン、pH6.8を含有するリフォールディング緩衝液へ、IB溶液を24時間毎にゆっくりと3部分で、3μMの最終濃度となるように添加した。このリフォールディング溶液は、YM10膜(Millipore)を用いた超遠心分離によって半分の容量に濃縮し、0.1mM DTTを含有するPBS、pH7.2に対して透析した。タンパク質を限外濾過によってさらに濃縮し、精製のために、20mM Hepes、150mM NaCl、0.1mM DTT、4℃で平衡化したSuperdex G-75カラム(ファルマシア)へ負荷した。平衡化緩衝液のpHは、RTで7.2に調製した。単量体の分画をプールした。
C.カップリング
0.75mL 20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4中の1.5mg Qβの溶液を、RTで45分間、0.06mL Sulfo-SMPB(Pierce;H2O中の31mM ストック)と反応させた。この反応混合液を終夜、20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対して透析し、この溶液の0.75mLを1.5mLの0.1mM DTT(62μM)中のPLA2-Cys溶液、及び0.43mLのRTでpH7.4に調製した20mM Hepes、150mM NaCl、137μM DTTと混合した。カップリング反応を、RTで4時間進めるように放置し、その反混合液は、分画分子量300000Da(Spectrum)のSpectra Por透析チューブを用いて、20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対して終夜、透析した。カップリング反応は、SDS-PAGE及びクーマシー染色、並びにヤギ抗-ウサギアルカリフォスファターゼコンジュゲート(1:10000に希釈)で展開させるウサギ抗ハチ毒抗血清(1:10000に希釈)、又はヤギ抗-ウサギアルカリフォスファターゼコンジュゲート(1:10000に希釈)で展開させるウサギ抗Qβ抗血清(1:5000に希釈)のいずれかを利用するウェスタンブロッティングによって分析された。試料は、還元条件下の双方の場合におこなった。
カップリング反応の結果は、図26に示されている。PLA2-CysへのQβキャプシドタンパク質のカップリング産物と一致するバンドは、クーマシー染色したSDS-PAGE(左のパネル)、Qβキャプシドタンパク質とPLA2-Cysの間のカップリング反応の抗Qβウェスタンブロット(中央パネル)及び抗-PLA2ウェスタンブロット(右パネル)で明白に見ることができ、図においては矢印によって示されている。15μlのカップリング反応及び50μlの透析カップリング反応を、ゲルに負荷した。
レーン1:タンパク質マーカー。2:透析したカップリング反応1。3:カップリング反応1。4:カップリング反応2。5:カップリング反応2。6:カップリング反応1。7:透析したカップリング反応1。8:タンパク質マーカー。9:カップリング反応2。10:カップリング反応1。11:透析したカップリング反応1。12:タンパク質マーカー。
Qβとの抗イディオタイプIgEミモボディ(mimobody)VAE051のカップリング、マウスの免疫化及び抗血清の試験
20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の4.0mg/ml Qβキャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で、30分間、10倍モル濃度を超えるSMPH(Pierce)(DMSOに溶解させた100mM 原液の)と反応させた。この反応液について、続いて、4℃で2lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなった。VAE051溶液(2.4mg/ml)を、TCEPの等モル濃度によって25℃で60分間、還元した。
46μlの透析Qβ反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上にて16℃で2時間、全容量680μlの50mM酢酸ナトリウム中の340μlのTCEP処理VAE051溶液溶液(2.4mg/ml)と反応させた。
反応産物は、還元条件下の16%SDS-PAGEゲル上で分析した。ゲルは、どちらかは、クーマシーブリリアントブルーで染色した。カップリング反応における2つの付加的なバンド(VAE又はQβ溶液には無い)は、QβとカップリングしたVAE051の重鎖及び軽鎖を示す(図28)。バンドの同定は、それぞれ重及び軽鎖に対して特異的な抗体によるウェスタンブロッティングによって確かめられた。
マウスの免疫化
Qβ-VAE051カップリング溶液について、分画分子量が300000Daの膜を用いて、20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する透析をおこなった。0日目及び14日目に、2匹の雌Balb/cマウスへ50μgのQβ-VAE051を腹膜内注射した。28日目に、マウスを逆軌道で出血させ、その血清をIgE-及びVAE051-特異的 ELISAを利用して分析した。
ELISA
ELISAプレートを、0.8μg/mlの濃度のヒトIgEで、又は10μg/ml VAE051でコーティングした。このプレートはブロックされ、その後で連続希釈マウス血清とともにインキュベートした。結合した抗体は、酵素標識された抗マウスIgG抗体で検出した(図28B)。
双方のマウスは、ヒトIgEと同様にVAE051に対しても高い活性を示した。同じマウスの免疫前血清は、VAE051及びIgEに対して何ら活性を示さなかった(図28B)。これは、「親」分子IgEをも認識する、抗イディオタイプIgEミモボディ(mimobody)VAE051に対する抗体が産生されたことを示す。
架橋剤SMPHを用いたwtQβキャプシドタンパク質へのDerpIペプチドの高占有カップリング
カップリングのために、N末端にシステインが付加されたDerp1,2ペプチドは、化学合成されて、以下の配列を有していた:H2N-CQIYPPNANKIREALAOTHSA-COOH。このペプチドは、Qβキャプシドタンパク質への化学カップリングに利用され、以下に記載されている。
D.Qβキャプシドタンパク質へのFlagペプチドのカップリング
2mg/mlの濃度の20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2中のQβキャプシドタンパク質を、ロッキングシェーカー上にて25℃で30分間、5又は20倍過度の架橋剤SMPH(Pierce)と反応させた。その反応液について、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなった。この透析反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上にて25℃で2時間、5倍を超えるDerp1,2ペプチドと反応させた。
カップリング反応の結果は、図24に見ることができる。サブユニットあたり1,2及び3ペプチドと一致するカップリングバンドは、それぞれ、ゲル上で明白に見ることができ、矢印で示されている。平均してサブユニットあたり2つのペプチドが、キャプシド上に表示されている。
図24のゲルに負荷された試料は、以下の通りである:
レーン1:タンパク質マーカー。2:5倍を超えるSMPHで誘導体化したQβキャプシドタンパク質。4:5倍の誘導体化Qβキャプシドタンパク質のカップリング反応。5:20倍誘導体化Qβキャプシドタンパク質のカップリング反応。5:20倍の誘導体化Qβキャプシドタンパク質のカップリング反応。
HBcAg(1-149)のc/e1エピトープへのリジン残基を含有するペプチドの挿入
HBcAgのc/e1エピトープ(残基72〜88)は、B型肝炎キャプシド(HBcAg)の表面の先端領域に位置する。この領域の一部分(プロリン79及びアラニン80)は、通常は、ペプチドGly-Gly-Lys-Gly-Gly(HBcAg-Lysコンストラクト)によって置き換えられている。導入されたリジン残基は、HBcAg粒子と遊離のシステイン基を含有する任意の抗原の分子間化学架橋に利用することができる活性アミノ基をその側鎖に有している。
配列番号:158に示すアミノ酸配列を有するHBcAg-Lys DNAは、PCRsによって作製した:HBcAg断片(アミノ酸残基1から78、及び81から149)をコードする2つの断片を、PCRによって別々に増幅した。また、これらPCRsに用いたプライマーにより、Gly-Gly-Lys-Gly-GlyペプチドをコードするDNA配列を導入した。HBcAg(1から78)断片は、プライマーEcoRIHBcAg(s)及びLys-HBcAg(as)を用いて、pEco63から増幅した。HBcAg(81-149)断片は、プライマーLys-HBcAg(s)及びHBcAg(1-149)Hind(as)を用いて、pEco63から増幅した。プライマーLys-HBcAg(as)及びLys-HBcAg(s)により、2つのPCR産物の末端に相補的なDNA配列を導入し、それにより、後のアセンブリPCRで2つのPCR産物の融合を可能になった。アセンブリされた断片は、プライマーEcoRIHBcAg(s)及びHbcAg(1-149)Hind(s)を用いるPCRによって増幅された。
PCRsについては、100pmolの各オリゴ及び50ngのテンプレートDNAsを、2ユニットのPwo-ポリメラーゼ、0.1mM dNTPs及びMgSO4を含む50ml 反応混合液に用いた。双方の反応については、温度サイクルを以下のようにしておこなった:94℃を2分間;30サイクルの94℃(1分間)、50℃(1分間)、72℃(2分間)。
プライマー配列:
EcoRIHBcAg(s):
(5'-CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG-3')(配列番号:79);
Lys-HBcAg(as):
(5'-CCTAGAGCCACCTTTGCCACCATCTTCTAAATTAGTACCCACCCAGGTAGC-3')
(配列番号:80);
Lys-HBcAg(s):
(5'-GAAGATGGTGGCAAAGGTGGCTCTAGGGACCTAGTAGTCAGTTATGTC-3')
(配列番号:81);
HBcAg(1-149)Hind(as):
(5'-CGCGTCCCAAGCTTCTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG-3')
(配列番号:82);
PCRによる2つのPCR断片の融合については、100pmolのプライマーEcoRIHBcAg(s)及びHBcAg(1-149)Hind(as)を、2ユニットのPwo-ポリメラーゼ、0.1mM dNTPs及びMgSO4を含む50ml 反応混合液における100ngの2つの精製PCR断片とともに用いた。PCRサイクル条件は:94℃を2分間;30サイクルの94℃(1分間)、50℃(1分間)、72℃(2分間)。アセンブリしたPCR産物を、アガロースゲル電気泳動によって分析して精製し、EcoRI及びHindIII制限酵素によって適切な酵素中で19時間、消化した。消化したDNA断片をEcoRI/HindIII消化pKKベクターへライゲーションし、pKK-HBcAg-Lys発現ベクターを作製した。ベクターへのPCR産物の挿入は、EcoRI/HindIII制限酵素解析、及び挿入物のDNAシーケンシングによって分析した。
HBcAg-Lysの発現及び部分精製
大腸菌株XL-1ブルーをpKK-HBcAg-Lysで形質転換した。1mlの細菌の終夜培養を、100μg/mlアンピシリンを含有する100mlのLB培地を接種するのに用いた。この培地は、およそ0.8のOD600に達するまで、37℃で4時間、生育させた。HBcAg-Lysの合成の誘導は、1mMの最終濃度となるようなIPTGの添加によっておこなった。誘導の後、細菌をさらに37℃で16時間、振盪した。細菌は、15分間、5000xgでの遠心分離によって収集した。そのペレットは、−20℃で貯蔵した。このペレットを解凍し、200μg/mlリゾチーム及び10μlのベンゾナーゼ(メルク)を補充した細菌ライセート緩衝液(10mM Na2HPO4、pH7.0、30mM NaCl、0.25% トウィン-20、10mM EDTA、10mM DTT)に再懸濁した。細胞を室温で30分間、インキュベートし、フレンチプレス細胞破砕機(French pressure cell)を用いて破壊した。トリトンX-100を、0.2%の最終濃度となるようにライセートへ添加し、このライセートを氷上で30分間、インキュベートして時々振盪した。pKK-HBcAg-Lys発現プラスミドを有する大腸菌細胞、又はコントロールプラスミドを、IPTGによるHBcAg-Lys発現の誘導に用いた。IPTGの添加の前に、pKK-HBcAg-Lysプラスミドを有する細菌培養及びコントロールプラスミドを有する培養から試料を取り除いた。IPTGの添加の16時間後、pKK-HBcAg-Lysを有する培養及びコントロール培養から試料を取り除いた。タンパク質発現は、SDS-PAGEとその後のクーマシー染色によってモニターした。
ライセートは、不溶性細胞片を取り除くために、その後で12,000xgで30分間、遠心分離した。その上澄み液及びペレットは、HBcAgに対するモノクローナル抗体(YVS1841、Accurate Chemical and Scientific Corp., ウェストベリー, ニューヨーク, アメリカ合衆国から購入)を用いたウェスタンブロッティングによって分析し、そのれによると、顕著な量のHBcAg-Lysタンパク質が可溶性であることが示された。手短に言うと、HBcAg-Lysを発現する大腸菌細胞及びコントロール細胞からのライセートを、30分間、14,000xgで遠心分離した。上澄み液(可溶性分画)及びペレット(不溶性分画)を分離し、SDS試料緩衝液で等容量となるまで希釈した。試料は、SDS-PAGE、その後に続く抗HBcAgモノクローナル抗体YVS1841によるウェスタンブロッティングによって分析した。
透明な細胞ライセートを、3mlの15%スークロース溶液、その後に続いて4mlの細菌ライセートをかぶせた4mlの65%スークロース溶液で構成されるスークロースステップグラジェントを利用したステップグラジェント遠心分離に利用した。試料を、4℃で100,000xg、3時間で遠心分離した。遠心分離後、グラジェントの頂点の1ml分画を収集し、SDS-PAGE、その後に続くクーマシー染色によって分析した。HBcAg-Lysタンパク質は、クーマシー染色によって検出した。HBcAg-Lysタンパク質は、15及び65%スークロースの間の境界面に豊富にあり、このことは、それがキャプシド粒子を形成していることを示している。殆どの細菌タンパク質は、グラジェントのスークロースフリー上層に残っており、従って、HBcAG-Lys粒子のステップグラジェント遠心分離は、双方の濃縮及び粒子の部分精製へ導いた。
ヘテロ二価機能性架橋剤SPDPを用いた、HbcAg-LysへのFLAGペプチドの化学カップリング
アミノ末端(アミノ酸配列CGGDYKDDDDK(配列番号:147))にシステイン残基を有する合成FLAGペプチドを、FLAGペプチドに対する免疫応答を誘起するために、精製したHBcAg-Lys粒子と化学的にカップリングさせた。600mlのHBcAg-Lys粒子(2mg/ml)の95%純溶液を、ヘテロ二価機能性架橋剤N-サクシニミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)(0.5mM)と室温で30分間、インキュベートした。この反応の完了後、混合液を終夜、1リッターの150mM NaClを含む50mM リン酸緩衝液(pH7.2)に対して透析し、遊離のSPDPを取り除いた。その後、500mlの誘導体化HBcAg-Lysキャプシド(2mg/ml)を、金属触媒されたスルフヒドリル酸化を防ぐために、10mM EDTAの存在下で0.1mM FLAGペプチド(アミノ末端システインを含有する)と混合した。この反応は、ペプチドの遊離システインとの反応による、SPDPからのピリジン-2-チオンの遊離による、343nmでの溶液の光学密度の増加によってモニターした。ペプチドと誘導体化Lys残基の反応は、およそ30分後に完了した。
FLAG修飾粒子を、マウスへ注入した。
pMPSV-gp140cysの構築
gp140遺伝子を、オリゴgp140CysEcoRI及びSalIgp140を用いて、pCytTSgp140FOSからPCRによって増幅した。PCRsについては、100pmolの各オリゴ及び50ngのテンプレートDNAsを、2ユニットのPwoポリメラーゼ、0.1mM dNTPs及び2mM MgSO4とともに50ml反応混合物において用いた。双方の反応では、温度サイクルを以下のようにしておこなった:94℃を2分間;30サイクルの94℃(0.5分間)、55℃(0.5分間)、72℃(2分間)。
PCR産物は、QiaEXIIキットを用いて精製し、SalI/EcoRIで消化し、同じ酵素で切断したベクターpMPSVHEへライゲーションした。
オリゴ配列:
Gp140CysEcoRI:
5'-GCCGAATTCCTAGCAGCTAGCACCGAATTTATCTAA-3'(配列番号:83)
SalIgp140:
5'-GGTTAAGTCGACATGAGAGTGAAGGAGAAATAT-3'(配列番号:84)
pMPSVgp140Cysの発現
pMPSVgp140Cys(20μg)を、制限消化によって直線化した。この反応は、フェノール/クロラムフェニコール抽出、その後に続く直線化DNAのイソプロパノール沈殿によって止めた。制限消化は、アガロースゲル電気泳動によって評価した。トランスフェクションについては、5.4μgの直線化pMPSVgp140-Cysを、30μlH2O中の0.6μgの直線化pSV2Neoと混合し、30μlの1M CaCl2溶液を添加した。60μlリン酸緩衝液(50mM HEPES、280mM NaCl、1.5mM Na2HPO4、pH7.05)の添加後、この溶液を5秒間ボルテックスし、それに続いて25秒間、室温でインキュベートした。即座に、この溶液を2%FCS(2%FCS培地)を含有する2ml HP-1培地へ添加した。その後、80%コンフルエントBHK21細胞培養(6-ウェルプレート)の培地を、DNA含有培地によって置き換えた。CO2インキュベーターにおける37℃で5時間のインキュベーション後、このDNA含有培地を取り除き、2mlの2%FCS培地中の15%グリセロールによって置き換えた。グリセロール含有培地は、30秒のインキュベーション期間後に取り除き、その細胞を、5mlの10%FCSを含有するHP-1培地によって洗浄した。最後に、2mlの10%FCSを含有する新鮮HP-1培地を添加した。
安定にトランスフェクトした細胞を選択し、CO2インキュベーターにおいて37℃で選択培地(G418で補充したHP-1培地)で生育させた。混合集団をコンフルエントになるまで生育させ、その培地を2つのシャーレに分け、その後に37℃での12時間の生育期間が続いた。1つのシャーレを30℃に移行し、可溶性GP140-FOSの発現を誘導した。他のシャーレは、37℃に保持した。
可溶性GP-140-Cysの発現は、ウェスタンブロッティング解析によって確かめた。培養培地(0.5ml)をメタノール/クロロホルム沈降させ、そのペレットをSDS-PAGE試料緩衝液に再懸濁した。15%アクリルアミドゲルへ適用する前に、試料を95℃で5分間、加熱した。SDS-PAGEの後、Bass及びYang, in Creighton, T.E., 編, Protein Function:A Practical Approach, 第2編, IRL Press, Oxford (1997), pp.29-55によって記載のように、タンパク質をProtanニトロセルロース膜(Schleider&Schuell, ドイツ)へ移した。この膜を室温で1時間、TBS(1リッターあたり10xTBS:87.7g NaCl、66.1g Trizma 塩酸(シグマ)及びTrizma塩基(シグマ)、pH7.4)中の1% ウシアルブミン(シグマ)でブロックし、それに続いて、1時間、抗GP140又はGP-160抗体でインキュベーションした。ブロットをTBS-T(0.05%トゥイン20を含むTBS)による10分間の洗浄を3回おこない、アルカリ-ホスファターゼ-抗マウス/ウサギ/サル/ヒトIgGコンジュゲートで1時間インキュベートした。TBS-Tで10分間の洗浄を2回、及びTBSによる10分間の洗浄を2回おこなった後、アルカリホスファターゼ検出試薬(50μl NBT溶液(70%ジメチルホルムアミド中の7.7% ニトロ・ブルー・テトラゾリウム(シグマ))を有する10ml AP緩衝液(100mM トリス/HCl、100mM NaCl、pH 9.5))及び37μlのリン酸溶液(ジメチルホルムアミド中の5%の5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸)を用いて、展開反応をおこなった。
gp140Cysの精製
抗gp120抗体は、NHS/EDC活性化デキストランと共有的にカップリングし、クロマトグラフィーカラムへ詰め込んだ。GP140Cysを有するGP140Cysをこのカラムへ負荷し、十分に洗浄したの後、0.1M HClを用いてGP140Cysを溶出した。1Mトリス pH7.2を用いたコレクションチューブにおける収集の間、この溶出液を直接に中和した。
ジスルフィド結合形成が精製の間に起こり得るので、収集した試料を、25℃で2時間、10mMトリス pH7.5中の10mM DTTで処理する。
その後の10mM Mes;80mM NaCl pH6.0対する透析によって、DTTを取り除く。最後には、実施例16に記載のようなE2のJUN残基を有するアルファウイルス粒子とGP140Cysを混合する。
PLA2-Cysの構築
PLA2遺伝子を、オリゴEcoRIPLA及びPLA-Cys-hindを用いて、pAV3LAfosからPCRによって増幅した。PCRsについては、100pmolの各オリゴ及び50ngのテンプレートDNAsを、2ユニットのPwoポリメラーゼ、0.1mM dNTPs及び2mM MgSO4とともに50ml反応混合物で用いた。反応については、温度サイクルを以下のようにしておこなった:94℃を2分間;30サイクルの94℃(0.5分間)、55℃(0.5分間)、72℃(2分間)。
PCR産物は、QiaEXIIキットを用いて精製し、EcoRI/HindIIIで消化し、同じ酵素で切断したベクターpAV3へライゲーションした。
オリゴ
EcoRIPLA:
5'-TAACCGAATTCAGGAGGTAAAAAGATATGG-3'(配列番号:85)
PLA Cys-hind:
5'-GAAGTAAAGCTTTTAACCACCGCAACCACCAGAAG-3'(配列番号:86)
PLA2-Cysの発現及び精製
Cysタグタンパク質の細胞質産生については、大腸菌XL-1ブルー株をベクターpAV3::PLA及びpPLA-Cysで形質転換した。培養液は、アンピシリンの存在下のリッチ培地にて、37℃で振盪してインキュベートした。光学密度(550nm)では、1mM IPTGを添加し、インキュベーションをさらに5時間、継続した。細胞を遠心分離で収集し、デオキシリボヌクレアーゼ(DNase)、リボヌクレアーゼ(RNase)及びリゾチームを有する適切な緩衝液(例えば、トリス-HCl、pH7.2、150mM NaCl)に再懸濁し、フレンチプレス細胞破砕機を通過させることによって破壊した。遠心分離(Sorvall RC-5C、SS34ローター、15000rpm、10分, 4℃)の後、ペレットを4℃で25ml封入体緩衝液(20mM トリス-HCl、23%スークロース、0.5%トリトンX-100、1mM EDTA、pH8)に再懸濁し、上記のようにして再遠心分離した。遠心分離後の上澄み液がほとんど透明になるまで、この工程を繰り返した。封入体を、室温で20ml可溶化緩衝液(5.5Mグアニジニウム塩酸、25mM トリス-HCl、pH7.5)に再懸濁し、不溶性物質を遠心分離及びそれに続く無菌フィルターへ上澄み液を通過させることによって取り除いた(0.45μm)。タンパク質は、10mM EDTA及び100mM DTTの存在下で少なくとも10時間、4℃に保持し、その後、10容量の5.5M グアニジニウム塩酸、25mM トリス-HCl、10mM EDTA、pH6に対して3回透析した。この溶液を、適切なレドックスシャッフル(酸化型グルタチオン/還元型グルタチオン;システイン/システイン)の存在下で51 2M 尿素、4mM EDTA、0.1M NH4Cl、20mM 臭化ナトリウム(pH8.3)に対して2回透析した。その後、リフォールディングしたタンパク質をイオン交換クロマトグラフィーに適用した。このタンパク質は、システイン残基を還元型に保つために、2-10mM DTTの存在下でpH が7以上の適切な緩衝液に貯蔵した。アルファウイルス粒子とのこのタンパク質のカップリングの前に、タンパク質溶液をセファデックスG-25ゲル濾過カラムに流すことによって、DTTを取り除いた。
遊離のシステイン残基を欠き、挿入されたリジン残基を含有するHBcAgの構築
ここでHBcAg-lys-2cys-Mutと呼ばれ、配列番号:134の48及び107と一致する位置のシステイン残基を欠き、挿入リジン残基を含有する肝炎コア抗原(HBcAg)を、以下の方法を利用して構築した。
下記のPCRプライマーの組み合わせにより、実施例23に記載のようにして調製したHBcAg-Lys遺伝子の3つの断片を最初に別々に増幅することで、2つの変異を導入した。実施例1に記載のような基本的なPCR法、及び常套的クローニング方法を、HBcAg-lys-2cys-Mut遺伝子を調製するのに用いた。
手短に言うと、以下のプライマーを用いて、断片1を調製した:
プライマー1:EcoRIHBcAg(s)
CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG(配列番号:148)
プライマー2:48as
GTGCAGTATGGTGAGGTGAGGAATGCTCAGGAGACTC(配列番号:149)
以下のプライマーを用いて、断片2を調製した:
プライマー3:48s
GSGTCTCCTGAGCATTCCTCACCTCACCATACTGCAC(配列番号:150)
プライマー4:107as
CTTCCAAAAGTGAGGGAAGAAATGTGAAACCAC (配列番号:151)
以下のプライマーを用いて、断片3の調製をした:
プライマー5:HBcAg149hind-as
CGCGTCCCAAGCTTCTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAGCGTTGATAG
(配列番号:152)
プライマー6:107s
GTGGTTTCACATTTCTTCCCTCACTTTTGGAAG(配列番号:153)
断片1及び2を、その後でPCRプライマーEcoRIHBcAg(s)及び107と組み合わせて、断片4を与えた。その次に、断片4及び断片3をプライマーEcoRIHBcAg(s)及びHBcAg149hind-asと組み合わせて、完全長遺伝子を産した。その次に、この完全長遺伝子をEcoRI(GAATTC)及びHindIII(AAGCTT)酵素で消化し、pKKベクター(ファルマシア)の同じ制限部位で切断した部位へクローニングした。
架橋剤に続くHBcAgの遊離システイン残基の妨害物
実施例23に記載のようの調製したHBcAg-Lysの遊離システイン残基を、ヨードアセトアミドを用いてブロックした。ブロックしたHBcAg-Lysを、その後、ヘテロ二価機能性架橋剤であるm-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシニミドエステル(Sulfo-MBS)によってFLAGと架橋させた。
遊離システイン残基をブロックし、HBcAg-Lysを架橋するのに用いた方法は、以下の通りである。HBcAg-Lys(550μg/ml)を室温で15分間、全容量1mlの50mMの濃度のリン酸緩衝生理的食塩水(PBS)(50mM リン酸ナトリウム、150mM 塩化ナトリウム)、pH7.2において、ヨードアセトアミド(Fluka Chemie、ブルーク,スイス)と反応させた。そのように修飾したHBcAg-Lysを、その後、室温で1時間、段階1の反応混合液中で直接に、330μMの濃度のSulfo-MBS(Pierce)と即座に反応させた。この反応混合液を、その後で氷上で冷やし、1000容量のPBS pH7.2に対して透析した。この透析反応混合液を、最終的には、活性化HBcAg-LysとカップリングするためのN末端の遊離システインを含有する300μMのFLAGペプチド(CGGDYDDDDK(配列番号:147))と反応させ、分析のためにSDS-PAGEに負荷した。
SDS-PAGEゲル上の結果として得られたバンドのパターンは、FLAGペプチドとは反応していないが、架橋剤と誘導体化したコントロールHBcAg-Lysよりも遅く移動する明白な付加的なバンドを示した。ヨードアセトアミドとのシステインの前もった誘導体化なしで、同じ条件下でおこなわれた反応は、より高い分子量種とHBcAg-Lysの単量体の完全な架橋につながった。
ヘテロ二価機能性架橋剤を用いた大腸菌の1型線毛へのFLAGペプチドの単離及び化学カップリング
A.導入
細菌線毛又は線毛は、幅広い細菌によって産生された繊維状表面細胞小器官である。これら細胞小器官は、宿主細胞の表面レセプターへの細菌の付着を媒介し、膀胱炎、腎盂腎炎、新しく生まれた髄膜炎及び下痢のような多くの細菌性感染症の発症に必要とされる。
線毛は、そのレセプター特異性(異なる種の血液細胞の凝集)、そのアセンブリ経路(細胞外核形成、通常の分泌、シャペロン/門番、代替シャペロン)、及びその形態学的特性(太い、堅い線毛;細い、柔軟な線毛;莢膜を含む非定型的な構造;カール;など)に関して異なるクラスに分けることができる。シャペロン/門番経路と呼ばれているものを介してアセンブリし、宿主糖タンパク質との接着を媒介する右回りへリックスを形成する太くて、堅い線毛の例には、1型線毛、P-線毛、S-線毛、F1C-線毛、及び987P-線毛が含まれる。このクラスの線毛の最も著名で最も特徴付けられたメンバーは、P-線毛及び1型線毛である(接着構造、そのアセンブリ及び関連疾患の概説については、Soto, G.E.&Hultgren, S, J., J. Bacteriol. 181: 1059-1071(1991);Bullitt & Makowski, Biophys. J. 74:623-632(1998);Hung, D. L. & Hultgren, S. J., Struct, Biol. 124:201-220(1998))。
1型線毛は、大腸菌の表面の長い、繊維状重合体構造である。それらは、ある宿主組織の表面に表示されるマンノース含有レセプターとの結合を可能にする接着特性を有する。1型線毛は、単離大腸菌の70-80%によって発現されることが可能であり、単一の大腸菌は、500の線毛まで持ちこたえられる。線毛型は、6〜7nmの直径で、2.0〜2.5nmの中央穴であるターンあたり3.125サブユニットの右回りへリックスと関連する平均数が1000タンパク質サブユニットである、典型的には0.2から2μMの長さに達する。
全線毛タンパク質の98%を示す、1型線毛の主な成分であるFimAは、15.8kDaタンパク質である。微量な線毛成分であるFimF、FimG及びFimHは、頂点及び線毛軸にそって規則的な距離で組み込まれている(Klemm, P.&Krogfelt, K.A., "Type I fimbriae of Esherichia coli," in:Fimbriae. Klemm, P.(編), CRC Press Inc., (1994) pp. 9-26)。29.1kDaタンパク質であるFimHは、1型線毛のマンノース結合接着因子であると示されており(Krogfelt, K. A., ら, Infect. Immun. 58:1995-1998(1990);Klemm, P., ら, Microbiol. 4:553-560(1990);Hanson, M. S. & Brinton, C. C. J., Nature 17:265-268(1988))、その取り込みは、恐らくは、FimG及びFimFによって促進される(Klemm, P. & Christiansen, G., Mol. Gen. Genetics 208: 439-445 (1987);Russell, P. W. & Orndorff, P. E., J. Bacteriol. 174: 5923-5935 (1992))。最近では、FimHは、線毛の末尾で細いチップ-フィブリウム(tip fibrillum)も形成し得ることが示された(Jones, C. H.,ら, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 92:2081-2085(1995))。個々の成熟線毛における主要及び微量成分の順序は、非常に類似しており、このことは、高度な配列したアセンブリ工程を示している(Soto, G. E.&Hultgren, S. J., J. Bacteriol. 181: 1059-1071(1999))。
大腸菌のP-線毛は、極めて類似した構造であり、6.8nmの直径、1.5nmの軸穴、及びターンあたり3.28サブユニットを有する(Bullitt&Makowski, Biophys. J. 74:623-632(1998))。16.6kDa PapAは、この線毛型の主要な成分であり、FimAに対して36%配列同一性及び59%類似性を示す(表1を参照)。1型線毛では、36.0kDa P-線毛接着因子PapG及び分化したアダプタータンパク質は、全線毛タンパク質の僅かな分画のみを構成している。1型との最も明かな違いは、線毛ロッドの不可欠な部分であるアドヘシンが無いこと、及び、1型線毛にはない分化したアダプタータンパク質を介して線毛ロッドと連結しているチップ-フィブリウム(tip fibrillum)において、それが占有的に位置していることである(Hultgren, S. J., ら, Cell 73:887-901(1993))。
表1: 1型及びP-線毛(百分率で)の幾つかの構造線毛タンパク質間の類似性及び 同一性。アドヘシンは除く。
Figure 2009132689
1型線毛は、極めて安定なヘテロオリゴマー複合体である。SDS処理又はプロテアーゼ消化、煮沸又は変性剤の添加のいずれでも、1型線毛を個々のタンパク質成分へ解離することはできない。pH1.8で100℃でのインキュベーションのような異なる方法の組み合わせは、最初に、その成分の脱重合化及び分離を可能にすると認められた(Eshdat, Y., ら, J. Bacteriol. 148:308-314(1981);Brinton, C.C.J., Trans, N.Y. Acad. Sci. 27:1003-1054(1965);Hanson, A.S., ら, J. Bacteriol., 170:3350-3358(1988);Klemm, P.& Krogfelt, K. A. "Type I fimbriae of Escherichia coli," in: Fimbriae. Klemm, P. (編), CRC Press Inc., (1994)pp.9-26)。興味あることに、1型線毛は、FimHが機械的撹拌によって組み込まれた位置で壊れる傾向にあり、この結果として、その頂点でFimHアドヘシンを示す断片となる。これは、機械的ストレスの下で線毛を効率的な長さへと短くする細菌の機構として解釈されている(Klemm, P. & Krogfelt, K. A., "Type I fimbriae of Escherichia coli,"in:Fimbriae. Klemm, P(編), CRC Press Inc., (1994)pp.9-26)。異常な安定性にもかかわらず、1型線毛は、50%グリセロールの存在下で、部分的に解明されていることが示された;それらは、らせん構造を失い、伸張していて柔軟な2nmの幅の広いタンパク質鎖を形成する(Abraham, S.N., J. Bacteriol. 174:5145-5148(1992))。
P-線毛及び1型線毛は、およそ10kbの大腸菌染色体の単一遺伝子クラスターによってコードされている(Klemm, P. & Krogfelt, K. A., "Type I fimbriae of Escherichia coli,"in:Fimbriae. Klemm, P(編), CRC Press Inc., (1994)pp.9-26;Orndorff, P. E. & Falkow, S., J. Bacteriol. 160: 61-66(1984))。合計で9つの遺伝子が1型線毛遺伝子クラスターで見出されており、11の遺伝子がP-線毛クラスターで見出されている(Hultgren, S. J., ら, Adv. Prot. Chem. 44: 99-123(1993))。双方のクラスターは、完全に類似している。
リコンビナーゼをコードする最初の2つのfim遺伝子、fimB及びfimEは、線毛発現の制御に関わっている(McClain, M. S., ら, J. Bacteriol. 173:5308-5314(1991))。主な構造上の線毛タンパク質は、クラスターの次の遺伝子、fimAによってコードされている(Klemm, P., Euro. J. Biochem. 143: 395-400(1984);Orndorff, P. E. & Falkow, S., J. Bacteriol. 160: 61-66(1984);Orndorff, P. E. & Falkow, S., J. Bacteriol. 162: 454-457(1985)。fimIの正確な役割は不明である。同じように線毛へ取り込まれたと報告されてきた(Klemm, P. & Krogfelt, K. A., "Type I fimbriae of Escherichia coli,"in:Fimbriae. Klemm, P(編), CRC Press Inc., (1994)pp.9-26)近接するfimCは、成熟線毛の構造的成分ではなく、線毛のアセンブリに必須の線毛シャペロンとよばれるものをコードしている(Klemm, P., Res. Microbiol. 143:831-838(1992);Jones, C.H.,ら., Proc. Nat. Acad Sci. USA 90:8397-8401(1993))。
成熟線毛が固着している細菌外膜でのアセンブリ基本骨格は、fimDによってコードされている(Klemm, P.&Christiansen, G., Mol. Gen, Genetics 220:334-338(1990))。1型線毛の3つの微量成分である、FimF、FimG及びFimHは、少なくとも3つの遺伝子のクラスターによってコードされている(Klemm, P.&Christiansen, G., Mol. Gen, Genetics 208:439-445(1987))。fimB及びfimEは別として、すべての遺伝子は、sec経路を介してペリプラズムへの分泌のための前駆体タンパク質をコードする。
シャペロン/門番経路に続く異なる線毛の類似性は、その形態学的特性に限定されるものではない。これらの遺伝子は、また、非常に類似する様式で配列される。一般的に、主な構造サブユニットの遺伝子は、遺伝子クラスターの始まりにある制御エレメントの直ぐ下流に見出されおり、その後には、さらなる構造サブユニットの遺伝子が続く(1型線毛の場合のfimI、及びP-線毛の場合のpapH)。PapHが示され、FimIは、線毛アセンブリを止めると予想される(Hultgren, S. J., ら, Cell 73:887-901(1993))。線毛の形成の工程を導く2つのタンパク質、すなわち分化した線毛シャペロン及び外膜アセンブリ基本骨格は、下流の近傍に位置している。クラスターの末端では、アドヘシンを含む可変的な数の微量線毛成分がコードされている。形態学的構造、配列(表1を参照)、遺伝的組織及び制御の類似性は、これら細胞小器官についての近接する進化上の関係及び類似アセンブリ工程を示している。
1型線毛を産する細菌は、相変異と呼ばれるものを示す。いずれの細菌も完全に線毛化するか、又は裸になるかのいずれかである。これは、fimAプロモーターを含有する314bpゲノムDNA断片の転移によって達成され、従って、線毛遺伝子の「すべてオン」又は「すべてオフ」発現を誘導する(McClain, M. S., ら, J. Bacteriol. 173: 5308-5314(1991))。fimA発現への他の構造的線毛の発現のカップリングは、いまだ知られていない機構によって達成する。しかしながら、幅広い研究によって、2つの表現型の間の変換に影響する機構が解明された。
1型線毛クラスター最初の2つの遺伝子である、fimB及びfimEは、反転可能なプロモーターに隣接する二分子対称性の9bp DNAセグメントを認識する。FimBが線毛化を「オン」へ変換する一方で、FimEは、「オフ」の方向でプロモーターを回転する。fimB又はfimE発現のいずれかのアップ又はダウン制御は、従って、「fim-スイッチ」と呼ばれる位置をコントロールする(McClain, M. S., ら, J. Bacteriol. 173: 5308-5314(1991);Blomfield, I. C., ら, J. Bacteriol. 173:5298-5307(1991))。
2つの制御タンパク質、fimB及びfimEは、異なるプロモーターから転写され、その転写は、幅広い異なる因子によって影響されることが示されていて、その因子には、組込み宿主因子(IHF)(Blomfield, I. C., ら, Mol. Microbiol. 23:705-717(1997))及びロイシン応答制御タンパク質(LRP)(Blomfield, I. C.,ら, J. Bacteriol. 175:27-36(1993);Gally, D. L.,ら, J. Bacteriol. 175: 6186-6193 (1993);Gally, D. L.,ら, Microbiol. 21: 725-738 (1996);Roesch, R. L. & Blomfield, I. C., Mol. Microbiol, 27: 751-761(1998))が含まれる。前出の変異は、細菌を「オン」又は「オフ」期のいずれかに固定し、その一方で、LRP変異体は、減少した頻度と変換する。さらには、線毛生合成へのleuXの効果が示された。この遺伝子は、染色体上のfim遺伝子の近傍に位置し、UUGコドンに関する希少なロイシンtRNA種をコードする。fimBが5つのUUGコドンを有する一方で、fimEは2つのみを有し、増大したleuX転写は、FimE発現よりもFimBを好むであろう(Burghoff, R. L., ら, Infect. Immun. 61: 1293-1300(1993);Newman, J. V., ら, FEMS Mol. Microbiol. Lett. 122: 281-287(1994);Ritter, A., ら, Microbial, 25: 871-882(1997))。
さらには、温度、培地成分及び他の環境因子が、FimB及びFimEの活性に影響を与えることが示された。最後には、fimAプロモーターの突発的で統計的な切り替えが報告された。この突発的な切り替えの頻度は、およそ世代あたり10−3(Eisenstein, B. I., Science 214: 337-339(1981);Abraham, S. M., ら, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 82: 5724-5727(1985))であるが、上記の因子によって強力に影響される。
遺伝子fimI及びfimCは、また、fimAプロモーターから転写されるが、fimAの直ぐに下流では、恐らくは部分転写ターミネーターを示す二次構造を形成する強力な傾向のあるDNAセグメントが同定され(Klemm, P., Euro. J. Biochem. 143: 395-400(1984));従って、fimI及びfimC転写をかなり減じると予想されている。fimCの3'末端では、付加的なプロモーターがfimD転写をコントロールする;fimDの3'末端では、最も最近に知られたfimプロモーターが位置し、FimF、FimG及びFimHのレベルを制御する。従って、すべての希少な1型線毛タンパク質は、単一のmRNAとして転写される(Klemm, P.& Krogfelt, K. A., " Type I fimbriae of Escherichia coli," in : Fimbriae. Klemm, P. (編), CRC Press Inc.,(1994)pp.9-26)。これは、恐らくはタンパク質レベルで維持されているであろう、mRNAレベルでの1:1:1化学両論を確かなものにする。
P-線毛の場合は、mRNAの半減期が異なるP-線毛遺伝子について確かめられた場合、さらなる制御機構が見出された。papAのmRNAは、異常に寿命が長いが、制御線毛タンパク質であるpapBのmRNAは、短い寿命のmRNAによってコードされている(Naureckiene, S. & Uhlin. B. E., Mol. Microbiol. 21:55-68(1996);Nilsson, P.,ら, J. Bacterial. 178:683-690(1996))。
1型線毛の場合は、1型線毛シャペロンFimCの遺伝子は、ATGコドンに代わってGTGで始まり、このことが翻訳効率の低下につながる。最終的には、fimH遺伝子の分析は、激しく翻訳を阻害するステム-ループを形成するfimH mRNAの傾向を明らかにする。要約すると、細菌線毛生合成は、すべてのレベルのタンパク質生合成に作用する幅広い異なる機構によって制御されている。
ペリプラズム線毛タンパク質は、Sec機構を介して内膜を越えるトランスロケーションを可能にするN末端シグナル配列を有する前駆体として通常は合成される。トランスロケーションの後、この前駆体は、通常はシグナルペプチダーゼIによって切断される。構造的1型線毛サブユニットは、通常はジスルフィド結合を有し、その形成は、DsbA、そして恐らくはDsbC及びDsbG遺伝子産物によって触媒される。
1型線毛シャペロンFimCは、システイン残基を欠いている。対照的に、P-線毛、PapDのシャペロンは、ジスルフィド結合を有する線毛シャペロンファミリーの唯一のメンバーであり、DsbAへのP-線毛の依存がはっきりと示されている(Jacob-Dubuisson, F., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91: 11552-11556(1994))。PapDは、△dsbA株のペリプラズムに蓄積せず、このことは、P-線毛アセンブリ機構の妨害が、シャペロンの欠如によって生じることを示している(Jacob-Dubuisson, F., ら, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:11552-11556(1994))。これは、レベルの低下にもかかわらず、1型線毛が△dsbA株でいまだアセンブリしているという知見と一致する(Hultgren, S. J.,ら, "Bacterial Adhesion and Their Assembly" , in Escherichia coli and Salmonella, Neidhardt, F. C.(編)ASM Press, (1996) pp. 2730-2756)。
P-線毛と同様に1型は、それぞれFimA及びPapAと呼ばれる単一又は主要な構造的サブユニットで98%が作られている。双方のタンパク質は、〜15.5kDaの大きさを有する。線毛遺伝子クラスターにコードされているさらなる希少成分は、非常に類似している(表1を参照せよ)。アドヘシンを除くサブユニットの配列及び大きさの類似性は、すべてが同一のフォールディングモチーフを共有し、互いに対するその親和性に関してのみ異なることを示唆している。特に、これらタンパク質のN及びC末端領域は、良く保存されており、線毛でのサブユニット/サブユニット相互作用だけでなく、シャペロン/サブユニット相互作用において、重要な役割を担うと予想される(Soto, G. E. & Hultgren, S. J., J. Bacteriol. 181: 1059-1071(1999))。興味あることに、保存されたN末端セグメントは、線毛アドヘシンの中間に見出すことができ、このことは、保存モチーフで始まり、企てられたC末端ドメインであるアドヘシンの2つのドメイン組織が、構造的線毛サブユニットと一致する一方で、N末端ドメインが宿主レセプターの認識を担うことを示している(Hultgren, S. J., ら, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:4357-4361(1989);Haslam, D. B., ら, Mol. Microbiol. 14:399-409(1994);Soto, G. E., EMBO J. 17: 6155-6167(1998))。異なるサブユニットが、線毛の形態学的特性に影響することも示された。幾つかの遺伝子の除去は、1型又はP-線毛の数を減じるか、又はそれらの長さ(fimH、papG、papK、fimF、fimG)を増加させることが報告され(Russell, P. W. & Orndorff, P. E., J. Bacteriol. 174:5923-5935(1992);Jacob-Dubuisson, R., ら., EMBO J. 12:837-847(1993);Soto, G. E. & Hultgren, S. J., J. Bacteriol. R., 181: 1059-1071(1999));遺伝子欠失の組み合わせが、これら効果を増幅するか、又は線毛化のすべての損失につながる(Jacob-Dubuisson, R., ら, EMBO J. 12:837-847(1993))。
シャペロン/門番系、例えばMyf線毛及びCS3線毛を介してもアセンブリした非線毛接着細胞小器官では、保存されたC末端領域は異なる。これは、間接的に、四次相互作用に関するこれらC末端サブユニットセグメントの重要性を証明している(Hultgren, S. J., "Bacterial Adhesion and Their Assembly" , in : Escherichia coli and Salmonella, Neidhartdt, F. C.(編)ASM Press, (1966)pp. 2730-2756)。
遺伝子の欠失研究によって、線毛シャペロンの除去がP-線毛及び1型における線毛化の全体的な損失につながることが証明された(Lindberg, F.,ら, J. Bacteriol. 171: 6052-6058(1989);Klemm, P., Res. Microbiol. 143: 831-838(1992);Jones, C. H., ら, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 8397-8401(1993))。△fimC株のペリプラズム抽出物は、主なサブユニットFimAの蓄積を示したが、線毛は検出できなかった(Klemm, P., Microbiol. 143:831-838(1992))。個々のP-線毛を過剰発現させる試みは失敗し、タンパク質分解された型のみが、PapD無しで検出することができた;さらには、P-線毛アドヘシンが、シャペロンがない内膜分画とともに精製された(Lindberg, F.,ら, J. Bacteriol. 171: 6052-6058(1989))。しかしながら、構造線毛タンパク質とそのシャペロンの同時発現は、アドヘシンPapG及び主なサブユニットPapAを含む異なるPap-タンパク質の場合と同様に、FimC/FimH複合体の場合にペリプラズムのシャペロン/サブユニット複合体の検出を可能にする(Tewari, R., ら, J. Biol. Chem. 268: 3009-3015 (1993);Lindberg, F., ら, J. Bacteriol. 171: 6052-6058(1989))。シャペロン/サブユニット複合体のアセンブリ基本骨格に対するシャペロン/サブユニット複合体の親和性をインビトロで調べ、強く異なることが見出された(Dodsonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3670-3674(1993))。これらの結果から、以下の機能が線毛シャペロンについて示唆された。
それらは、フォールディングしていない線毛サブユニットを認識し、それらの凝集を防ぎ、そして天然構造の形成を導く「フォールディングテンプレート」を提供する。
後にサブユニット/サブユニット相互作用を可能にする表面を表示するフォールディングしたサブユニットは、従って、他のサブユニットとの相互作用から遮断され、単量体で、アセンブリ-コンピテントな状態に保たれると思われる。
最終的には、線毛シャペロンは、外膜がアセンブリする位置でのサブユニットの誘発による遊離を可能にすると考えられ、異なった効率でそうすることによって、成熟線毛の組成及び配列に影響を与える(下の別々の章も参照)。
外膜でのサブユニットの遊離の後、シャペロンは、さらなる一巡の基質結合、フォールディング補助、ペリプラズムを介するサブユニット輸送、及びアセンブリ部位への特異的送達に関して遊離型である。ペリプラズムがエネルギー源を欠くので、ATPのように、全線毛アセンブリ工程は、熱力学的に駆動されなければならない(Jacob-Dubuisson, F.,ら, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91: 11552-11556(1994))。線毛シャペロンに寄与する広い範囲の異なる分画は、非常に微調整されたカスケードの段階を結びつける。
しかしながら、いくつかの知見は、上で概要が記載された線毛シャペロン分画のモデルでは容易に説明されない。一例は、多量体シャペロン/サブユニット複合体(Striker, R. T., ら, J. Biol. Chem. 269: 12233-122239(1994))の存在であり、1つのシャペロンは三量体のサブユニット二量体と結合する。「二重に埋める」ことができるフォールディングテンプレートを想像することは、困難である。シャペロン/サブユニット相互作用の分子の詳細に関する研究(下を参照)は、上で要約された機能を部分的に支持したが、新たな疑問も生じせしめた。
今までの遺伝的研究又は配列解析によって同定されたすべての31ペリプラズムシャペロンは、約10の際だって高いpI値のおよそ25kDaのタンパク質である。これらシャペロンの10が、桿体様線毛のアセンブリを補助し、4つが細い線毛の形成に関わり、10が非定型的な細い構造の生合成(キャプシド様構造を含む)にとって重要であり、2つの接着性構造がいまだ確かめられていない(Holmgren, A., ら, EMBO J. 11: 1617-1622 (1992);Bonci, A., ら, J. Mol. Evolution 44: 299-309(1997);Smyth, C. J.,ら, FEMS Immun. Med. Microbiol. 16: 127-139 (1996);Hung, D. L. & Hultgren, S. J. Struct, Biol. 124: 201-220(1998))。これらシャペロンとPapDの間の対を成す配列同一性は、25〜56%の範囲にあり、これは、全部で同一であることを示している(Hung, D. L., EMBO J. 15: 3792-3805(1996))。
シャペロン/基質認識の機構に関する最初の研究は、すべての既知の線毛シャペロンのC末端が異常に類似しているという観察に基づいていた。P-線毛タンパク質のC末端と一致する合成ペプチドは、ELISAアッセイにおいて、PapDと結合することが示された(Kuehn, M. J., ら, Science 262: 1234-1241(1993))。もっとも重要なことに、PapDが、アドヘシンPapG又は微量線毛成分PapKのいずれかのC末端と一致する19残基ペプチドとともに同時結晶化されて、2つの複合体のX線構造は解析された(Kuehn, M. J., ら, Science 262: 1234-1241(1993);Soto, G. E., ら, EMBO J. 17:6155-6167 (1998))。両ペプチドは、ドメイン間の間隙へ向いているN末端シャペロンドメインのβ-ストランドと伸張したコンフォーメーションによって結合し、それによって、さらなるストランドによりβ-シートが伸張する。ペプチドのC末端カルボン酸基は、Arg8及びLys112への水素結合を介して固着し、これら2つの残基は、線毛シャペロンのファミリーでは変化しない。これらのアラニンへの変換がペリプラズムでの非機能性線毛シャペロンの蓄積となることから、突然変異誘発研究によって、それらの重要性が確かめられた(Slonim, L. N.,ら, EMBO J. 11: 4747-4756 (1992))。PapDの結晶構造は、Arg8又はLys112のいずれもシャペロンの安定化に関与していないが、完全に溶媒へ曝露していることを示す(Holmgren, A. & Branden, C. I., Nature 342: 248-251(1989))。基質側では、C末端PapA残基の交換がP-線毛形成を廃すること、P-線毛アドヘシンPapGの保存されたC末端セグメントに関する類似の実験がP-線毛へのその取り込みを防いだことが報告された(Hultgren, S. J.,ら, "Bacterial Adhesion and Their Assembly" , in : Escherichia coli and Salmonella, Neidhardt, F. C.(編)ASM Press, (1996) pp. 2730-2756)。従って、すべての証拠は、サブユニットのC末端セグメントを介する線毛サブユニット認識を示した。
P-線毛アドヘシンPapGのC末端アミノ酸交換に関するより最近の研究は、さらに詳細な図式を示した。C末端に対する位置-2、-4、-6、及び-8でのアミノ酸置換の範囲は許容できたが、線毛の安定性が変化した(Soto, G. E., ら, EMBO J. 17: 6155-6167 (1998))。
このモデルをさらに厳密に調べると、いまだ、ある課題が浮かび上がる。関連する線毛シャペロンの存在に依存もしているならば、堅固で桿体様の線毛へアセンブリしない接着性細菌構造は、保存されたC末端セグメントを欠く(Hultgren, S. J.,ら, "Bacterial Adhesion and Their Assembly" , in : Escherichia coli and Salmonella, Neidhardt, F. C.(編)ASM Press, (1996) pp. 2730-2756)。これは、すなわち、成熟線毛における四次相互作用の媒介である、線毛サブユニットのC末端セグメントに関する異なった一般的な役割を示す。さらには、NMRによるC末端ペプチドのシャペロンとの複合体の構造を解明する試みは、シャペロンへのペプチドの弱い結合によってかなり妨害され(Walse, B., ら, FEBS Lett. 412: 115-120(1997));その一方で、シャペロン認識についてのC末端セグメントの基本的な寄与は、相対的に高い親和性相互作用を意味する。
異なるサブユニットの間の可変性が考慮されるならば、さらなる課題が生じる。C末端セグメントが保存されたならば、幅広い保存的置換が見出される。例えば、19アミノ酸残基のうちの15は、PapDと同時結晶化された2つのペプチドの間で異なる(Soto, G. E., ら, EMBO J. 17: 6155-6167 (1998))。これは、主にバックボーン相互作用を介して起こり、側鎖相互作用を介しては特異的には起こらない、シャペロンと基質の間の相互作用のようなものによって説明されてきた。従って、再び、ある基質に関するシャペロンの特異性は、容易に説明されていない。前出で論じたこととは反対に、保存された残基が、特異性の証拠として取り上げられてきた(Hultgren, S. J.,ら, "Bacterial Adhesion and Their Assembly" , in : Escherichia coli and Salmonella, Neidhardt, F. C.(編)ASM Press, (1996) pp. 2730-2756)。
文献では「門番」とも呼ばれる外膜アセンブリ基本骨格は、1型及びP-線毛の場合には、それぞれFimD又はPapCのホモオリゴマーによって形成されている(Klemm, P. & Christiansen, G., Mol. Gen, Genetics 220: 334-338(1990);Thanassi, D. G., ら, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95: 3146-3151 (1998))。電子顕微鏡による1型線毛の伸長に関する研究は、基底からの線毛の伸長を示す(Lowe, M. A.,ら, J. Bacteriol. 169: 157-163 (1987))。細胞膜周辺腔へのフォールディングしていないサブユニットの分泌とは対照的に、完全にフォールディングしたタンパク質は、恐らくはオリゴマー型で、外膜を介してトランスローケーションされるべきである(Thanassi, D. G., ら, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95: 3146-3151 (1998))。これは、最初に、通過を許容するのに十分な幅の膜穴、二番目に、熱力学的に駆動する輸送機構を必要とする(Jacob-Dubuisson, F., ら., J. Biol. Chem. 269: 1244-12455 (1994))。
FimD発現だけでは、細菌の生育に有害な影響を有することが示され、線毛サブユニットの同時発現により、正常な生育行動が回復する(Klemm, P. & Christiansen, G., Mol. Gen, Genetics 220: 334-338(1990))。これに基づいて、門番は、恐らくは、線毛によって完全に満たされている穴を形成すると結論づけることができる。PapCが取り込まれた膜担体に関する電子顕微鏡によって、2nmの内部直径の穴形成構造が確かめられた(Thanassi, D. G., ら, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95: 3146-3151 (1998))。繊毛桿体の通過を許容するには、穴の内部直径があまりにも小さいので、成熟線毛のらせん配置は、細菌表面の外部で形成される。グリセロールが、結果としておよそ2nmのタンパク質鎖を形成する繊毛の解明つながるという知見は、この仮説と良く一致するが、それは、サブユニットの伸長した鎖が、第一段階として穴で形成される可能性があるためである(Abraham, S. N.,ら, J. Bacteriol. 174: 5145-5148 (1992);Thanassi, D. G., ら, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95: 3146-3151 (1998))。従って、細菌膜の外部でのらせん線毛桿体の形成は、膜を介する成長中の線毛のトランスローケーションを担う駆動力であり得る。
また、1型及びP-線毛の門番タンパク質が、異なる親和性によるシャペロン/サブユニット複合体との三次元複合体を形成することが示されている(Dodson, K. W.,ら, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 3670-3674 (1993);Saulino, E. T., EMBO J. 17: 2177-2185 (1998))。これは、線毛における線毛タンパク質の定まった配列を可能にする「力学的基本骨格」と呼ばれている。さらには、構造タンパク質は、線毛タンパク質の他の型とのみ一致する結合表面を示すと示唆されてきた;これは、成熟線毛における高度に定まった配列のサブユニットを達成するその他の機構であろう(Saulino, E. T.,ら, EMBO J. 17: 2177-2185 (1998))。
B.大腸菌の1型線毛の産生
大腸菌株W3110をLB(10g/Lトリプトン、5g/L酵母抽出物、5g/L NaCl、pH7.5、1% 寒天(w/v))プレートに拡散し、、37℃で終夜、インキュベートした。その後、単一のコロニーを用いて、5mlのLB開始培養液(10g/Lトリプトン、5g/L酵母抽出物、5g/L NaCl、pH7.5)を接種した。1型線毛を産する細菌が好む条件下での24時間のインキュベーション(37℃で撹拌せずに)の後、1リッターLBを含有する5つの振盪フラスコを1ミリリッターの開始培養液で接種した。その後、この細菌培養液を、さらなる48〜72時間、37℃で撹拌せずにインキュベートした。細菌を、この後、遠心分離(5000rpm、4℃、10分間)によって収集し、この結果得られたペレットを、250ミリリッターの10mM トリス/HCl、pH7.5に再懸濁した。17,000rpmでの常套的なミキサーによる5分間の撹拌によって、線毛を細菌から切り離した。4℃、10,000rpmで10分間の遠心分離後、上澄み液を含有する線毛を収集し、1M MgCl2を100mMの最終濃度となるように添加した。この溶液を1時間で4℃に保ち、その後、沈殿した線毛を遠心分離(10,000rpm、20分間、4℃)によってペレットにした。このペレットを、その後、10mM HEPES、pH7.5に再懸濁し、線毛溶液を、次いで、最後の遠心分離段階によって透明化して残存細胞片を取り除いた。
C.マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスルフォスクシンイミドエステル(sulfo-MBS)を用いた大腸菌の精製1型線毛へのFLAGのカップリング
600μlの細菌1型線毛の95%純粋溶液(2mg/ml)を、ヘテロ二価機能性架橋剤sulfo-MBS(0.5mM)により、室温で30分間、インキュベートした。その後、この混合液を、150mM NaClを含む1リッターの50mM リン酸緩衝液(pH7.2)に大して透析し、遊離のsulfo-MBSを取り除いた。この後、500μlの誘導体化した線毛(2mg/ml)を、10mM EDTAの存在下で0.5mM FLAGペプチド(アミノ末端システインを含有する)と混合させ、金属触媒によるスルホヒドリル酸化を防いだ。非カップリングペプチドは、サイズ排除クロマトグラフィーによって除かれた。
大腸菌の1型線毛の発現のための発現プラスミドの構築
ここで参考文献によって全開示が取り入れられているGenBank寄託番号U14003に開示されたDNA配列は、ヌクレオチド番号233947〜ヌクレオチド番号240543の1型線毛の産生に必要なすべての大腸菌遺伝子を有する(fim遺伝子クラスター)。この部分の配列は、遺伝子fimA、fimI、fimC、fimD、fimF、fimG、及びfimHの配列を有する。3つの異なるPCRsを、下に示すように、大腸菌ゲノムのこの部分の増幅、及びそれに続くpUC19(GenBank寄託番号L09137及びX02514)へのクローニングに用いた。
PCRテンプレートは、大腸菌株W3110の10mlのグリセロール原液を90mlの水と混合し、この混合液を10分間、95℃で煮沸し、これ続いて、ベンチトップ遠心分離で10分間、14,000rpmで遠心分離し、その上澄み液を収集することで調製した。
10mlの上澄み液を、その後、下で定めたようにして、50pmolのPCRプライマー1及び50pmolのプライマー2と混合させた。その後、5mlの10X PCR緩衝液、0.5mlのTaq-DNA-ポリメラーゼ、及び全部で50mlとなるように水を加えた。すべてのPCRsは、以下のスキームに従って実行した:94℃を2分間、次いで30サイクルの94℃を20秒間、55℃を30秒間、及び72℃を2分間。このPCR産物は、その後、1%アガロースゲル電気泳動によって精製した。
以下の配列を有するオリゴヌクレオチドを、fimA、fimI、及びfimG遺伝子を含む、ヌクレオチド番号233947からヌクレオチド番号235863の配列を増幅するのに用いた:
TAGATGATTACGCCAAGCTTATAATAGAAATAGTTTTTTGAAAGGAAAGCAGCATG
(配列番号:196)
及び
GTCAAAGGCCTTGTCGACGTTATTCCATTACGCCCGTCATTTTGG(配列番号:197)
これら2つのオリゴヌクレオチドは、制限部位HindIII及びSalIを介してpuc19へ増幅産物のクローニングを可能にする隣接配列も有する。この結果で得られるプラスミドは、pFIMAICと呼ばれている(配列番号:198)。
以下の配列を有するオリゴヌクレオチドを、fimD遺伝子を含む、ヌクレオチド番号235654からヌクレオチド番号238666の配列を増幅するのに用いた:
AAGATCTTAAGCTAAGCTTGAATTCTCTGACGCTGATTAACC(配列番号:199)
及び
ACGTAAAGCATTTCTAGACCGCGGATAGTAATCGTGCTATC (配列番号:200)。
これら2つのオリゴヌクレオチドは、制限部位HindIII及びXabIを介してpuc19へ増幅産物のクローニングを可能にする隣接配列も有し、この結果で得られるプラスミドは、pFIMDと呼ばれている(配列番号:201)。
以下の配列を有するオリゴヌクレオチドを、fimF、fimG及びfimH遺伝子を含む、ヌクレオチド番号238575からヌクレオチド番号240543の配列を増幅するのに用いた:
AATTACGTGAGCAAGCTTATGAGAAACAAACCTTTTTATC (配列番号:202)
及び
GACTAAGGCCTTTCTAGATTATTGATAAACAAAAGTCACGC (配列番号:203)。
これら2つのオリゴヌクレオチドは、制限部位HindIII及びXabIを介してpuc19へ増幅産物のクローニングを可能にする隣接配列も有する;この結果で得られるプラスミドは、pFIMFGHと呼ばれている(配列番号:204)。
以下のクローニング手法は、続いて、上記fim-遺伝子すべてを有するプラスミドを作製するためにおこなわれた:
pFIMAICをEcoRI及びHindIII(2237-3982)で消化し、pFIMDをEcoRI及びSstII(2267-5276)で消化し、pFIMFGHをSstII及びHinIII(2327-2231)で消化した。次いで、この断片をライゲーションし、結果として得られた線毛形成に必要なすべてのfim-遺伝子を有するプラスミドは、pFIMAICDFGHと呼ばれた(配列番号:205)。
アドヘシンFimHを欠く大腸菌1型線毛の発現プラスミドの構築
プラスミドpFIMAICDFGH(配列番号:205)をKpnIで消化し、その後、ヌクレオチド番号8895-8509から成る断片を0.7%アガロースゲル電気泳動によって単離し、自己ライゲーションによって環状化した。この結果で得られたプラスミドは、pFIMAICDFG(配列番号:206)と呼ばれ、それは、fimH遺伝子を欠き、FIMHフリー1型線毛の産生に利用することができる。
プラスミドpFIMAICDFGHを用いる1型線毛の発現
大腸菌株W3110をpFIMAICDFGH(配列番号:205)で形質転換し、100μg/mlアンピシリンを含有するLB(10g/Lトリプトン、5g/L酵母抽出物、5g/L NaCl、pH7.5、1% 寒天(w/v))プレートに拡散させ、37℃で終夜、インキュベートした。その後、単一のコロニーを用いて、5mlのLB開始培養液(10g/Lトリプトン、5g/L酵母抽出物、1%(w/v)グルコース、5g/L NaCl、pH7.5、100μg/mlアンピシリン)を接種した。150rpm、37℃での12-16時間のインキュベーションの後、2リッターLB-グルコースを含有する5リッター振盪フラスコを、20ミリリッターの開始培養液で接種した。その後、この細菌培養液を、さらに撹拌(150rpm)し、37℃で24時間インキュベートした。次いで、細菌を遠心分離(5000rpm、4℃、10分間)によって収集し、この結果得られたペレットを、250ミリリッターの10mM トリス/HCl、pH8に再懸濁した。常套的なミキサーによる17,000rpm、5分間の撹拌によって、線毛を細菌から切り離した。10,000rpmで10分間の遠心分離後、繊毛を含有する上澄み液を収集し、1M MgCl2を100mMの最終濃度となるように添加した。この溶液を1時間で4℃に保ち、その後、沈殿した線毛を遠心分離(10,000rpm、20分間、4℃)でペレットにした。次いで、このペレットを室温で30分間、10mM EDTA、30mM EDTA、pH7.5に再懸濁し、この後、この線毛溶液を最後の遠心分離段階によって透明にし、残存細胞片を取り除いた。次いで、この沈殿物を20mM HEPES、pH7.4に対して透析した。
大腸菌の1型線毛へのIgEエピトープ及びミモトープ(mimotopes)のカップリング
100uM溶液のヘテロ二価機能性架橋剤sulfa-MBSの66μlアリコートを、400μlの細菌1型線毛の95%純溶液(2.5mg/ml、20mM HEPES、pH7.4)へ添加し、続いて、撹拌によって室温で45分間インキュベートした。その後、過度のsulfa-MBSを、PD-10カラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィーによって除いた。あるいは、架橋剤は透析によって取り除くことが可能である。従って、1.1mg/ml ペプチドCe3epi(CGGVNLTWSRA SG(配列番号:207))を含有する1.3μlの溶液、又はペプチドCe3Mim(CGGVNLPWSFGLE(配列番号:208))のいずれかを誘導体化した1mlアリコート(1-1.25mg/ml、20mM HEPES pH7.4)へ添加した。この試料を室温で4時間インキュベートし、20mM HEPES(pH7.4)を含有する2lの緩衝液に対する2回の透析によって、非カップリングペプチドを取り除いた。あるいはまた、この非カップリングペプチドは、サイズ排除クロマトグラフィーによって取り除くことができる。
Qβキャプシドタンパク質とカップリングしているハチ毒ホスホリパーゼA(PLA2)融合タンパク質によるマウスの免疫化
A.アミノ酸配列AAASGGCGG(配列番号:209)と融合しているPLA2遺伝子触媒的に不活性な変異体の細胞質発現のための代替ベクターの調製
実施例9のPLA2遺伝子コンストラクトを、オリゴecori_Ndel_pla(配列は下にある)及びPLA-Cys-hindを用いるpAV3PLAfosからのPCRによって増幅した(実施例29)。反応については、100pmolの各オリゴ、及び約1μgのpAV3PLAfos DNAを、1.2ユニットのPfx DNAポリメラーゼ(Gibco)、1mM MgSO4、200μM dNTPS及び10倍希釈したPfx enhancer 溶液(Gibco)による50μl反応混合液に用いた。反応については、温度サイクルを以下のようにしておこなった:94℃を2分間、5サイクルの92℃(0.5秒)、58℃(0.5秒)、68℃(1分);25サイクルの92℃(0.5分)、63℃(0.5分)、68℃(1分)。PCR産物をアガロースゲル電気泳動とそれに続くQiagen Qiaquick Kitを用いた断片の単離によって精製し、酵素Nde1及びHindIIIで消化し、同じ酵素で消化したPET11aベクター(ノバジェン)へクローニングした。
オリゴ: ecori_Ndel_pla:
TAACCGAATTCAGGAGGTAAAAACATATGGCTATCATCTACC (配列番号:214)
アミノ酸配列MAIIYPGTLWCGHGNKSSGPNELGRFKHTDACCRTQDMCPDVMSAGESKHGLTNTASHTRLSCDCDDKFYDCLKNSADTISSYFVGKMYFNLIDTKCYKLEHPVTGCGERTEGRCLHYTVDKSKPKVYQWFDLRKYAAASGGCGG(配列番号:210)。
Qβキャプシドタンパク質へのPLA2融合タンパク質のカップリング
600μlのQβキャプシドタンパク質の溶液(20mM Hepesに2mg/ml、pH7.4)を、室温で60分間、176μl Sulfo-MBS(H2Oに13mg/ml)と反応させ、4℃で1Lの20mM Hepes pH7.4 O/Nに対して透析した。次の日、0.1mM DTTを含有する500μlのPLA2溶液(2.5mg/ml)を、5ml Hi-Trapカラム(ファルマシア)で脱塩した。還元し脱塩したPLA2(およそ0.5mg/mlの60μlの溶液)を、活性化及び透析したQβキャプシド(25μlの1.5mg/ml溶液)と混合し、室温で4時間、反応させた。
1 PLA2とのカップリングの前後の双方で撮ったQβキャプシドタンパク質の電子顕微鏡画像で、25-30nmの直径のキャプシドをはっきりと見ることができる。
C.Qβキャプシドタンパク質とカップリングさせたPLA2によるマウスの免疫化
雌Balb/cマウスを、50μgのPLA2とカップリングしたQβキャプシドにより0日目に静脈内で免疫化し、同じ量の抗原によって14日目に追加免疫した。マウスは、20日目に出血させ、ELISAで血清を分析した。PLA2に対する1:5000の力価が得られた。
Qβキャプシドタンパク質へのIgEミモトープ及びエピトープのカップリング
以下のアミノ酸配列を有するヒトIgEエピトープを、N末端システイン残基を用いてQβキャプシドタンパク質とカップリングさせた:
Ce3エピトープ:CGGVNLTWSRASG(配列番号:207)
Ce3ミモトープ:CGGVNLPWSFGLE(配列番号:208)
カップリング反応を、Sulfo-MBSで活性化したQβキャプシドタンパク質を用いておこない、それに続いて、透析して過度の架橋剤を取り除いた。それぞれのエピトープ又はミモトープを、活性化Qβキャプシドを含有する反応混合液へ希釈し、室温で4時間反応させた。この反応混合液を、最終的には、PBSに対して4時間、透析し、マウスへ注射した。
以下の環状ミモトープをQβキャプシドタンパク質へもカップリングさせた:Ce4ミモトープ:GEFCINHRGYWVCGDPA(配列番号:211)。
ミモトープへスルフヒドリル基を導入するために、ミモトープを最初に、化学基N-サクシニミジル-S-アセチルチオアセテート(SATA)と反応させた。それに続いて、保護基をヒドロキシルアミンによる処理で取り除き、即座に、室温で4時間、活性化Qβキャプシドタンパク質と反応させた。最後に、この反応液を4時間、透析し、マウスへ注射した。
M2ペプチドとカップリングしたHBcAg-Lysによるマウスの免疫化
A.HBcAg-Lysキャプシドタンパク質とM2ペプチドのカップリング
M2ペプチドに対する免疫応答を誘発するために、C末端にシステイン残基を有するインフルエンザM2タンパク質のN末端断片と一致する合成M2ペプチド(SLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSDGGGC(配列番号:212)を、精製HBcAg-Lys粒子と化学的にカップリングさせた。Sulfo-MBS(232μl、3mM)を、PBS中の1.4ml HBcAg-Lys(1.6mg/ml)の溶液と反応させた。この混合物を終夜、リン酸緩衝化生理的食塩水(PBS)に対して透析した。M2ペプチドを、DMSO中の24mg/mlの濃度へ希釈した;5μlのこの溶液を300μlPBSで希釈し、その188μlを312μlの透析した活性化HBcAg-Lys溶液へ添加した。EDTA(10μlの1M溶液)を、また、反応混合液へ添加し、その後、この反応を、室温で4時間、進行させた。
M2ペプチドとカップリングさせたHBcAg-Lysによるマウスの免疫化
雌Balb/cマウスを、0日目に、50μgHBcAg-Lys-M2又はM2ペプチドのみにより静脈内で免疫化し、同じ量の抗原で10日後に追加免疫した。さらなる10日後、マウスをインフルエンザウイルス(50pfu、PR/8)で鼻腔内で感染させ、感染マウスの生存をモニターした。さらには、ウイルス力価を肺で確かめた。M2-HBcAg-Lysで初回刺激したマウスを完全に保護し、7日目までにそのウイルスを除去した。
線毛、Qβ及びcys-フリーHbcAg-キャプシドタンパク質へのM2ペプチドのカップリング、及びこれらカップリングした線毛及びキャプシドによるマウスの免疫化によって得られた抗体力価と、HbcAg1-183へのM2ペプチドのN末端融合タンパク質によるマウスの免疫化によって得られた力価との比較
A.線毛、Qβ-及びcysフリーHbcAg-キャプシドタンパク質のカップリング
Qβ: 1mlの20mM Hepes中の1mg/ml Qβキャプシドタンパク質の溶液。150mM NaCl pH7.2を、30分間、ロッキングシェーカー上においてRTで、H2O中の13mg/ml Sulfo-MBS(Pierce)の93μlの溶液と反応させた。これに続いて、この反応液を、2Lの20mM hepes、150mM NaCl、pH7.2に対して終夜、透析した。次いで、透析反応混合液を、ロッキングシェーカー上にてRTで4時間、58.8μlのDMSO中のM2ペプチド(配列番号:212)の25mM 原液と反応させた。この反応混合液を、続いて、4℃で終夜、2リッターの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対して透析した。
Cys-フリーHbcAg: 1.25mlのpH7.2、PBS中の0.8mg/ml cys-フリーHbcAgキャプシドタンパク質(実施例31)の溶液を、30分間、ロッキングシェーカー上にてRTで、93μlのH2O中の13mg/ml Sulfo-MBS(Pierce)の溶液と反応させた。これに続いて、この反応液を、2Lの20mM hepes、150mM NaCl、pH7.2に対して終夜、透析した。次いで、透析反応混合液を、ロッキングシェーカー上にてRTで4時間、58.8μlのDMSO中のM2ペプチド(配列番号:212)の25mM 原液と反応させた。この反応混合液を、続いて、4℃で終夜、2リッターの20mM hepes、150mM NaCl、pH7.2に対して透析した。
線毛: 400μlの20mM Hepes、pH7.4中の2.5mg/ml線毛タンパク質の溶液を、45分間、ロッキングシェーカー上にてRTで、(H2O)中の60μlの100mM Sulfo-MBS(Pierce)溶液と反応させた。この反応混合液を、PD-10カラム(アマシャム-ファルマシア バイオテク)により脱塩し、カラムから溶出した500μlタンパク質の二番目の分画(およそ1gタンパク質を含有)を、ロッキングシェーカー上にてRTで4時間、58.8μlのDMSO中のM2ペプチド(配列番号:212)の25mM 原液と反応させた。この反応混合液を、続いて、4℃で終夜、2リッターの20mM hepes、150mM NaCl、pH7.2に対して透析した。
HbcAg1-183へのM2ペプチドの遺伝的融合
Hbc:M2へ遺伝的に融合させたM2を、Neirynckら Nature Medicine 5: 1157(1999)によって公表されたように、HbcのN末端でクローニングした。MD-HBcを大腸菌で発現させ、ゲル電気泳動によって精製した。M2-HBcのN末端でのM2ペプチドの存在は、エドマンシーケンシングによって確かめられた。
マウスの免疫化:
雌Balb/cマウスを、線毛、Qβ及びHbcAgタンパク質とカップリングさせたM2ペプチド、及びアジュバンドの添加無しでHbc免疫原と遺伝的に誘導したM2ペプチドによりワクチン接種した。各試料の35μgタンパク質を、0日目及び14日目に、腹膜内に注射した。27日目にマウスを出血させ、その血清をM2-ペプチド特異的ELISAを用いて分析した。
ELISA
リボヌクレアーゼとカップリングしている10μg/mlのM2ペプチドを、ELISAプレート上にコーティングした。このプレートをブロックし、その後、連続希釈したマウス血清でインキュベートした。結合している抗体は、酵素標識した抗マウスIgG抗体で検出した。コントロールとして、免疫前血清も試験した。Hbc又は他の担体と架橋させた関連していないペプチドで免疫化したマウスの血清を用いたコントロールELISA実験は、検出された抗体がM2ペプチドに対して特異的であることを示した。この結果は、図27A及びBに示されている。
QβへのアンギオテンシンI及びアンギオテンシンIIペプチドのカップリング、及びQβ-アンギオテンシンペプチドワクチンによるマウスの免疫化
A.Qβキャプシドタンパク質へのアンギオテンシンI及びアンギオテンシンIIペプチドのカップリング
以下のアンギオテンシンペプチドを化学的に合成した:CGGDRVYIHPF(「アンギオI」)、CGGDRVYIHPFHL(「アンギオII」)、DRVYIHPFHLGGC(「アンギオIII」)、CDRVYIHPFHL(「アンギオIV」)、及び以下に記載のようにQβへの化学カップリングに用いた。
5mlの20mM Hepes中の2mg/mlQβキャプシドタンパク質の溶液。150mM NaCl pH7.4を、ロッキングシェーカー上にて25℃で30分間、507μlのH2O中の13mg/ml Sulfo-MBS(Pierce)の溶液と反応させた。この反応溶液について、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。665μlの透析した反応混合液を、次いで、ロッキングシェーカー上にて25℃で2時間、2.8mlの各対応する100mM ペプチド原液(DMSO中)と反応させた。この反応混合液について、続いて、4℃で2リッターの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。
マウスの免疫化:
雌Balb/cマウスを、アジュバンドを添加せずに、Qβキャプシドタンパク質とカップリングさせた4つのアンギオテンシンペプチドのうちの1つでワクチン接種した。50μgの各試料の全タンパク質をPBSで200mlに希釈し、0日目と14日目に皮下注射した(100ml2つの腹側へ)。マウスを21日目に逆軌道で出血させ、その血清をアンギオテンシン-特異的 ELISAを利用して分析した。
ELISA
すべての4つのアンギオテンシンペプチドを、化学架橋剤sulfo-SPDPを用いて、それぞれウシリボヌクレアーゼAとカップリングさせた。ELISAプレートを、10mg/mlの濃度でカップリングさせたリボヌクレアーゼ調製物でコーティングした。このプレートをブロックし、次いで、連続希釈マウス血清でインキュベートした。結合した抗体は、酵素標識した抗マウスIgG抗体で検出した。コントロールとして、同じマウスの免疫前血清も試験した。Qβ又は他の担体と架橋している関連しないペプチドで免疫化したマウスの血清を用いたコントロールELISA実験では、検出された抗体がそれぞれのペプチドに対して特異的であることが示された。この結果は、図8A-8Dに示されている。
図8A、8B,8C及び8Dは、それぞれ、Qβキャプシドタンパク質とカップリングしたアンギオI-IVに対して免疫化したマウスの血清中のそれぞれ「アンギオI」、「アンギオII」、「アンギオIII」、「アンギオIV」、に対して特異的なIgG抗体のELISA分析を示す。図で用いられているように、Qβ-アンギオI、Qβ-アンギオII、Qβ-アンギオIII、及びQβ-アンギオIVは、アンギオテンシンペプチドの上での定義に従って、血清が誘導されたマウスへ注入したワクチンを意味する。
雌Balb/cマウスを、0日目及び14日目にPBS中の50mgのワクチンで皮下へワクチン接種した。Qβ-アンギオI、Qβ-アンギオII、Qβ-アンギオIII、及びQβ-アンギオIVでワクチン接種したマウスの血清中のIgG抗体を、21日目に、すべての4つのペプチド(リボヌクレアーゼAとカップリングした)、すなわち「アンギオI」(図8A)、「アンギオII」(図8B)に対して、「アンギオIII」(図8C)及び「アンギオIV」(図8D)について測定した。コントロールとして、同じマウスの免疫前血清を分析した。意図された血清希釈の平均は、450nmの光学密度で示されている。3匹のマウスの平均(標準偏差を含む)が示されている。すべてのワクチン接種されたマウスは、試験したすべて4つのペプチドに対する高いIgG抗体力価を産した。コントロールには、アンギオテンシン特異的抗体が検出されなかった(免疫前マウス)。
HBcAg-149-lys-2cys-Mut、すなわちcysフリーHBcAgへのアンギオテンシンI及びアンギオテンシンIIペプチドのカップリング
以下のアンギオテンシンペプチドを化学的に合成した: CGGDRVYIHPF(「アンギオI」)、CGGDRVYIHPFHL(「アンギオII」)、DRVYIHPFHLGGC(「アンギオIII」)、CDRVYIHPFHL(「アンギオIV」)、及びHBcAg-149-lys-2cys-Mut、すなわちcysフリーHBcAgへの化学カップリングに用いる。
1.25mlのPBS、pH7.4中の0.8mg/mlHBcAg-149-lys-2cys-Mutキャプシドタンパク質(実施例31を比較せよ)を、ロッキングシェーカー上にて25℃で、93μlのH2O中の13mg/ml Sulfo-MBS(Pierce)の溶液と30分間、反応させる。この反応溶液について、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.4に対する終夜の透析をおこなう。緩衝液を交換した後、この反応液を、さらに2時間、透析した。この透析した反応混合液を、次いで、1.8μlの100mMペプチド原液(DMSO中)と、ロッキングシェーカー上にて25℃で2時間、反応させる。この反応混合液について、続いて、2リッターの20mM Hepes、150mM NaCl ph7.4に対する透析を終夜、4℃でおこない、この後で緩衝液交換をし、さらなる2時間の透析をおこなった。
大腸菌の1型線毛へのアンギオテンシンI及びアンギオテンシンIIペプチドのカップリング
以下のアンギオテンシンペプチドを化学的に合成した: CGGDRVYIHPF(「アンギオI」)、CGGDRVYIHPFHL(「アンギオII」)、DRVYIHPFHLGGC(「アンギオIII」)、CDRVYIHPFHL(「アンギオIV」)、及び大腸菌の1型線毛への化学カップリングに用いる。
400μlの20mM Hepes、pH7.4中の2.5mg/ml大腸菌の1型線毛を、60分間、ロッキングシェーカー上にてRTで、(H2O)中の60μlの100mM Sulfo-MBS(Pierce)溶液と反応させた。この反応混合液を、PD-10カラム(アマシャム-ファルマシア バイオテク)により脱塩した。カラムから溶出したタンパク質を含有する分画をプール(およそ1mgタンパク質で、すなわち誘導体化線毛)し、3倍モル濃度を超えるペプチドと反応させた。例えば、およそ1mg 誘導体化線毛を含有する500ul溶出液へ、2.34ulの100mM ペプチド原液(DMSO中)を添加した。この混合液をロッキングシェーカー上にて25℃で4時間インキュベートし、続いて、2リッターの20mM Hepes、150mM NaCl ph7.2に対して終夜、4℃で透析した。
QβへのDerIペプチドのカップリング、及びQβ-DerIワクチンによるマウスの免疫化
Qβキャプシドタンパク質へのDerIペプチドのカップリング
ハウスダストダニアレルゲンDerIに由来する以下のペプチドを、化学的に合成した:CGNQSLDLAEQELVDCASQHGCH(「DerIp52」;aa52-72、N末端に付加的なシステイン-グリシンリンカーを有する)、CQIYPPNANKIREALAQTHSA(「Der p1 p117」;aa117-137)。これらのペプチドは、下記のように、Qβへの化学カップリングに用いた。
20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4中の2mg/mlQβキャプシドタンパク質で構成される1mlの溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で、102μlのH2O中の13mg/ml Sulfo-MBS(Pierce)の溶液と30分間、反応させた。この反応溶液について、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対して2時間の透析を2回おこなった。440μlのこの透析した反応混合液を、次いで、ロッキングシェーカー上にて25℃で2時間、1.9μlの100mMペプチド原液(DMSO中)と反応させた。この反応混合液について、続いて、4℃で2リッターの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対して2時間の透析を2回おこなった。
マウスの免疫化:
雌Balb/cマウスは、アジュバンドを添加せずにQβキャプシドタンパク質とカップリングさせた2つのDer pIのうちの1つでワクチン接種した。各ワクチンについて2匹のマウスを用いた。各試料の30μgの全タンパク質をPBSで200μlまで希釈し、0日目及び14日目に皮下注射した。各試料の25μgの全タンパク質を、PBSで200ulとなるまで希釈し、0日目と14日目に皮下注射(100mlを2つの腹部へ)した。マウスを21日目に逆軌道で出血させ、その血清をDer pI ペプチド-特異的 ELISAを利用して分析した。
ELISA
Der p Iペプチドである、「Der p I p52」及び「Der p I p117」を、化学架橋剤であるsulf-SPDPを用いて、それぞれ、化学架橋剤ウシリボヌクレアーゼとカップリングさせた。ELISAプレートを10mg/mlの濃度でカップリングさせたリボヌクレアーゼ調製物でコーティングした。このプレートをブロックし、その後で連続希釈血清によってインキュベートした。結合した抗体は、酵素標識した抗マウスIgG抗体で検出した。コントロールとして、同じマウスの免疫前血清も試験した。Qβ又は他の担体と架橋している関連しないペプチドで免疫化したマウスの血清を用いたコントロールELISA実験では、検出された抗体がそれぞれのペプチドに対して特異的であることが示された。この結果は、図9A及び図9Bに示されている。
図9A及び図9Bは、Qβキャプシドタンパク質とカップリングさせたDer p Iペプチドに対して免疫化したマウスの血清中の「Der p I p52」(図9A)に対して特異的、及び「Der p I p117」(図9B)に対して特異的なIgG抗体のELISA分析を示す。図9A及び9Bに示す「p52」及び「p117」は、血清が得られたマウスへ注射したワクチンを意味する。
コントロールとして、同じマウスの免疫前血清を分析した(0日)。意図された血清希釈の結果は、450nmでの光学密度で示されている。21日目には、すべてのワクチン接種したマウスは、他のDer pIペプチドに対するのではなく、それらがワクチン接種されたDer pIペプチドに対する特異的IgG抗体を産した。ワクチン接種の前では、Der pIペプチド特異的抗体が検出されなかった(0日)。
両Der pIペプチドは、アジュバンドがないと、高度な免疫原性があった。すべてのワクチン接種したマウスは、ワクチン調製におけるペプチドに特異的な良好な抗体応答を産した。
HBcAg-149-lys-2cys-Mut、すなわちcysフリーHBcAgへのDer p1ペプチドのカップリング
ハウスダストダニアレルゲンDerIに由来する以下のペプチドを、化学的に合成した:Der I p52(aa52-72、N末端に付加的なシステイン-グリシンリンカーを有する):CGNQSLDLAEQELVDCASQHGCH、Der p1 p117(aa117-137):CQIYPPNANKIREALAQTHSA。これらのペプチドは、HBcAg-149-lys-2cys-Mut、すなわちcysフリーHBcAgへの化学カップリングに用いた。
1.25mlのpH7.4、PBS中の0.8mg/ml HBcAg-149-lys-2cys-Mutキャプシドタンパク質(実施例31)の溶液と、ロッキングシェーカー上にて25℃で、93μlのH2O中の13mg/ml Sulfo-MBS(Pierce)の溶液と反応させた。この反応溶液を、続いて、2Lの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.4に対して、終夜、透析した。緩衝液交換の後、この反応溶液を、さらに2時間、透析した。透析した反応混合液を、次いで、ロッキングシェーカー上にて25℃で2時間、1.8μlの100mM ペプチド原液(DMSO中)と反応させた。この反応混合液を、続いて、4℃で終夜、2リッターの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.4に対して透析し、その後、緩衝液を交換し、さらに2時間の透析をした。
大腸菌の1型線毛へのDer p Iペプチドのカップリング
ハウスダストダニアレルゲンDer p Iに由来する以下のペプチドを化学的に合成した:Der p I p52(aa 52-72で、N末端に付加的なシステイン-グリシンリンカーを有する)及びCGNQSLDLAEQELDLAEQELVDCASQHGCH、Der p I p117(aa 117-137):CQIYPPNANKIREALAQTHSA。これらのペプチドは、大腸菌の1型線毛との化学カップリングに用いた。
400μlの20mM Hepes、pH7.4中の2.5mg/ml大腸菌の1型線毛の溶液を、60分間、ロッキングシェーカー上にてRTで、(H2O)中の60μlの100mM Sulfo-MBS(Pierce)溶液と反応させる。この反応混合液を、PD-10カラム(アマシャム-ファルマシア バイオテク)により脱塩する。カラムから溶出したタンパク質を含有する分画をプール(およそ1mgタンパク質で、すなわち誘導体化線毛)し、3倍モル濃度を超えるペプチドと反応させる。例えば、およそ1mg 誘導体化線毛を含有する500ul溶出液へ、2.34ulの100mM ペプチド原液(DMSO中)を添加する。この混合液をロッキングシェーカー上にて25℃で4時間インキュベートし、続いて、2リッターの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2に対して終夜、4℃で透析する。
大腸菌の1型線毛へのヒトVEGFR-IIペプチドのカップリング、及び1型線毛-ヒトVEGFR-IIペプチドアレイを含むワクチンによるマウスの免疫化
大腸菌の1型線毛へのヒトVEGFR-IIペプチドのカップリング
配列CTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKを有するヒトVEGFRIIペプチドを、化学的に合成し、大腸菌の1型線毛への化学カップリングに用いた。
1400μlの20mM Hepes、pH7.4中の1mg/ml大腸菌の1型線毛の溶液を、60分間、ロッキングシェーカー上にてRTで、(H2O)中の60μlの100mM Sulfo-MBS(Pierce)溶液と反応させた。この反応混合液を、PD-10カラム(アマシャム-ファルマシア バイオテク)により脱塩した。カラムから溶出したタンパク質含有分画をプール(およそ1.4mgのタンパク質)し、2.5倍モル濃度を超えるペプチドと反応させた。例えば、およそ0.2mg 誘導体化線毛を含有する200μl溶出液へ、2.4ulの10mM ペプチド原液(DMSO中)を添加した。この混合液をロッキングシェーカー上にて25℃で4時間インキュベートし、続いて、2リッターの20mM Hepes、pH7.2に対して終夜、4℃で透析した。
マウスの免疫化
雌C3H-HeJ(Toll様レセプター4欠損、LPS非レスポンダーマウス)及びC3H-HeN(野生型)マウスをアジュバンドを添加せずに、1型線毛タンパク質とカップリングしたヒトVEGFRIIペプチドでワクチン接種した。各試料のおよそ100μgの全タンパク質を、PBSで200μlまで希釈し、0日目、14日目及び28日目に皮下注射した。マウスを14日目、28日目に逆軌道で出血させ、42日目の血清をヒトVEGFR-II特異的 ELISAを利用して分析した。
ELISA
免疫化したマウスの血清を、固定化ヒトVEGFR-IIペプチド及びヒトVEGFR-IIの細胞外ドメインを有するELISAで試験した(R&D System GmbH, Wiesbaden)。
ヒトVEGFR-IIは、化学架橋剤sulf-SPDPを用いてウシリボヌクレアーゼAとカップリングさせた。ELISAプレートは、10μg/mlの濃度でカップリングしたリボヌクレアーゼAでコーティングした。VEGFR-IIのヒト細胞外ドメインを、2μg/mlの濃度でプレートに吸収させた。このプレートをブロックし、次いで、連続希釈したマウス血清でインキュベートした。結合した抗体は、酵素標識した抗マウスIgG抗体で検出した。コントロールとして、同じマウスの免疫前血清も試験した。非カップリング担体で免疫化したマウスの血清を用いたコントロールELISA実験によって、検出された抗体が、それぞれのペプチドに対して特異的であることが示された。1型線毛とカップリングしたヒトVEGFRIIペプチドの結果は、図10に示されている。特に、図10A及び図10Bは、それぞれ1型線毛タンパク質とカップリングしたヒトVEGFRIIペプチド及びヒトVEGFRIIの細胞外ドメインに対して免疫化したマウスの血清中の、それぞれヒトVEGFRIIペプチド及びヒトVEGFRIIの細胞外ドメインに対して特異的なIgG抗体のELISA分析を示す。
雌C3H-HeJ(Toll様レセプター4欠損、LPS非レスポンダーマウス)及びC3H-HeN(野生型)マウスを、PBS中の100μgのワクチンによって、0日目、14日目及び28日目に皮下にワクチン接種した。このペプチド(リボヌクレアーゼAとカップリング)に対する血清IgG及びヒトVEGFRIIの細胞外ドメインを42日目に測定した。コントロールとして、同じマウスの免疫前血清を分析した。意図した血清希釈の結果は、450nmでの光学密度で示されている。3匹のマウスそれぞれの平均(標準偏差を含む)が示されている。すべてのワクチン接種したマウスは、ヒトVEGFR-II(KDR)の細胞外ドメインだけでなく、ヒトVEGFR-IIペプチドに対する高いIgG抗体力価を産し、Toll様レセプター4を欠失したマウスと野生型マウスの間には、相違は認められなかった。ヒトVEGFR-IIの細胞外ドメインだけでなく、ヒトVEGFR-IIペプチドに対する高いIgG抗体力価の形成がエントドキシンの夾雑とは関係ないことが示されたたことから、後者は顕著である。
Qβキャプシドタンパク質へのヒトVEGFRIIペプチドのカップリング、及びQβキャプシドタンパク質-ヒトVEGFRIIペプチドアレイを含むワクチンによるマウスの免疫化
Qβキャプシドタンパク質へのヒトVEGFR-IIペプチドのカップリング
配列CTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKを有するヒトVEGFRIIペプチドを、化学的に合成し、Qβキャプシドタンパク質との化学カップリングに用いた。
1mlの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.4中の1mg/mlQβキャプシドタンパク質の溶液を、45分間、ロッキングシェーカー上にてRTで、(H2O)中の20μlの100mM Sulfo-MBS(Pierce)溶液と反応させた。この反応液について、その後、4℃で2Lの20mM Hepes、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。次いで、1000μlの透析したQβ反応液混合物を、45分間、ロッキングシェーカー上にて25℃で、12μlの10mM ヒトVEGFRIIペプチド溶液(DMSO中)と反応させた。この反応混合液について、その後、2リッターの20mM Hepes、pH7.4に対して4℃で2時間の透析を2回おこなった。
1mlの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4中の2mg/ml Qβキャプシドタンパク質を含有する溶液を、30分間、ロッキングシェーカー上にて25℃で、(H2O)中の102μlの13mg/ml Sulfo-MBS(Pierce)溶液と反応させた。この反応溶液については、その後、4℃で2Lの150mM Hepes、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。440μlの透析した反応混合液を、次いで、1時間、ロッキングシェーカー上にて25℃で、1.9μlの100mMペプチド原液(DMSO中)と反応させた。この反応混合液について、その後、4℃で1Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。
マウスの免疫化
C57BL/6マウスを、アジュバンドを添加せずにQβタンパク質とカップリングしたヒトVEGFRIIペプチドでワクチン接種する。各試料のおよそ50μgの全タンパク質をマウスをPBSで200μlまで希釈し、0日目、14日目及び28日目に皮下注射した。マウスを14日目、28日目に逆軌道で出血させ、42日目の血清をヒトVEGFR-II特異的 ELISAを利用して分析する。
HBcAg-149-lys-2cys-Mutキャプシドタンパク質、すなわちcysフリーHBcAgへのヒトVEGFRIIペプチドのカップリング、及びHBcAg-149-lys-2cys-Mutキャプシドタンパク質-ヒトVEGFRIIペプチドアレイを含むワクチンによおるマウスの免疫化
HBcAg-149-lys-2cys-Mutキャプシドタンパク質へのヒトVEGFR-IIペプチドのカップリング
配列CTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKを有するヒトVEGFRIIペプチドを化学的に合成し、HBcAg-149-lys-2cys-Mutキャプシドタンパク質との化学カップリングに用いる。
3mlのPBS、pH7.4中の0.9mg/mlcysフリーHBcAgキャプシドタンパク質(参照.実施例31)の溶液を、45分間、ロッキングシェーカー上にてRTで、(H2O)中の37.5μlの100mM Sulfo-MBS(Pierce)溶液と反応させる。この反応液について、その後、2Lの20mM Hepes、pH7.4に対する終夜の透析を2回おこなう。緩衝液交換の後、この反応溶液を、さらなる2時間、透析する。この透析した反応混合液を、次いで、ロッキングシェーカー上にて25℃で4時間、3μlの10mMのヒトVEGFRIIペプチド溶液(DMSO中)と反応させる。この反応混合液について、その後、2リッターの20mM Hepes、pH7.4に対して4℃で終夜の透析をおこない、続いて緩衝液を交換し、さらに2時間の透析をおこなう。
HBcAg1-183Lysの構築
肝炎コア抗原(HBcAg)1-183を、実施例23に記載のように修飾した。c/e1エピトープ(残基72〜88)領域(プロリン79及びアラニン80)の一部分を、ペプチドGly-Gly-Lys-Gly-Gly(HBcAg1-183Lysコンストラクト)によって遺伝的に置換した。導入したリジン残基は、その側鎖に遊離のシステイン基を含有する任意の抗原とのHBcAg粒子の分子間化学架橋に利用できる活性アミノ基を有する。基本的に実施例1に記載のようなPCR法及び常套的なクローニング技術を用いて、HBcAg1-183Lys遺伝子を調製した。
上の実施例23に記載のように、pEco63からのHBcAg遺伝子の2つの分離断片を増幅し、その後、完全長遺伝子をアセンブリするためにPCRによって2つの断片を融合することによって、Gly-Gly-Lys-Gly-Gly配列を挿入した。以下のPCRプライマーの組み合わせを用いた:
断片1:
プライマー1:EcoRIHBcAg(s)(実施例23を参照)
プライマー2:Lys-HBcAg(as)(実施例23を参照)
断片2:
プライマー3:Lys-HBcAg(s)(実施例23を参照)
プライマー4:HBcAgwtHindIII
CGCGTCCCAAGCTTCTAACATTGAGATTCCCGAGATTG
アセンブリ:
プライマー1:EcoRIHBcAg(s)(実施例23を参照)
プライマー2:HBcAgwtHindIII
アセンブリした完全長遺伝子を、次いで、EcoRI(GAATTC)及びHindIII(AAGCTT)酵素で消化し、同じ制限酵素部位を切断したpKKベクター(ファルマシア)へクローニングした。
HBcAg1-183LysへのmuTNFaペプチドのカップリング、及びHBcAg1-183Lys-muTNFaペプチドアレイを含むワクチンによるマウスの免疫化
A.HBcAg1-183LysへのmuTNFaペプチドのカップリング
0.6mg/ml(29μM)の濃度のHBcAg1-183Lysを、実施例32に記載のようにヨードアセトアミドで処理した。その後、HBcAg1-183Lysを、実施例32に記載のように50倍過度の架橋剤Sulfo-MBSと反応させ、20mM Hepes、pH7.2に対して4℃で終夜、透析した。活性化(誘導体化)HBcAg1-183Lysは、4℃にてロッキングシェーカー上で4時間、5倍モル濃度過度のペプチドmuTNFa(配列:CGGVEEQLEWLSQR、DMSO中の100mM原液から直接にHBcAg1-183Lys溶液へ直接に希釈)と反応させた。カップリング反応液(約1ml溶液)を、4℃で4時間、2リッターの20mM HEPES pH7.2に対して2回透析した。この透析したカップリング反応をアリコートで液体窒素で凍結し、マウスの免疫化まで−80℃で貯蔵した。
免疫化
2匹のマウス(雌Balb/c)を、0日目及び14日目に、アジュバンド無しで、動物あたりmuTNFaペプチドとカップリングさせた100μgのHBcAg1-183Lysで静脈内で免疫化した。血清のmuTNFaペプチド(リボヌクレアーゼAコンジュゲートとしてコーティング)及び天然TNFαタンパク質(シグマ)に対して特異的な抗体を、ELISAによって21日目に測定した。
ELISA
マウスTNFαタンパク質(シグマ)を、2mg/mlの濃度でコーティングした。コントロールとして、免疫化に用いた同じマウスからの免疫前血清を試験した。図14はELISA実験の結果を示し、それは、muTNFaペプチドとカップリングしたHBcAg1-183Lys(完全長HBc-TNF)による免疫化により、マウスTNFαタンパク質に対して特異的な免疫応答を生じたことを示している。0日目(免疫前)及び21日目に出血させたマウスの血清を、3つの異なる希釈で試験した。各棒線は、2匹のマウスの血清から得たシグナルの平均である。従って、muTNFaペプチドのアミノ酸配列がマウスTNFαタンパク質の配列に由来するので、muTNFaペプチドとカップリングさせたHBcAg1-183Lysによるワクチン接種によって、自己抗原に対する免疫応答が誘導された。
2cysLys-mutHBcAg1-149への3' TNFIIペプチドのカップリング、及び2cysLys-mutHBcAg1-149-3' TNFIIペプチドアレイを含むワクチンによるマウスの免疫化
2cysLys-mutHBcAg1-149への3' TNFIIペプチドのカップリング
2cysLys-mutHBcAg1-149を2mg/mlの濃度で30分間、RTで、20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2中の50倍過度の架橋剤と反応させた。過度の架橋剤を終夜の透析によって取り除き、活性化(誘導体化)2cysLys-mut HBcAg1-149キャプシドタンパク質を、100mM原液から希釈した10倍過度の3' TNF II ペプチド(配列:SSQNSSDKPVAHVVANHGVGGC、DMSO中の100mM原液から希釈)とRTで4時間、反応させた。次いで、この反応混合液を、終夜、分画分子量50000Daの透析チューブによって透析し、液体窒素で凍結し、マウスの免疫化まで−80℃で貯蔵した。
マウスの免疫化
8週齢の3匹のC3H/HeNマウスを、アジュバンドの添加をせずに、2cysLys-mut HBcAg1-149とカップリングさせた3' TNFIIペプチドでワクチン接種した。50μgの全タンパク質をマウスをPBSで200μlまで希釈し、0日目及び14日目に皮下注射(100μlを2つの鼠径部)した。マウスを0日目、21日目に逆軌道で出血させ、それらの血清をマウスTNFαタンパク質に特異的な ELISAを利用して分析した。
ELISA
マウスTNFαタンパク質(シグマ)を、2mg/mlの濃度でコーティングした。コントロールとして、免疫化に用いた同じマウスからの免疫前血清を試験した。図15はELISA実験の結果を示し、それは、3' TNF IIペプチドとカップリングした2cysLys-mut HBcAg1-149による免疫化により、マウスTNFαタンパク質に対して特異的な免疫応答を生じたことを示している。0日目(免疫前)及び21日目に出血させたマウスの血清を、3つの異なる希釈で試験した。各棒線は、3匹のマウスの血清から得たシグナルの平均である。従って、3' TNF IIペプチドのアミノ酸配列がマウスTNFαタンパク質の配列に由来するので、3' TNF IIペプチドとカップリングさせた2cysLys-mut HBcAg1-149によるワクチン接種によって、自己抗原に対する免疫応答が誘導された。
QβへのAβ1-15、Aβ1-27及びAβ33-42ペプチドのカップリング、及びQβ-Aβペプチドアレイを含むワクチンによるマウスの免疫化
A.架橋剤SMPHを用いた、Qβキャプシドタンパク質へのAβ1-15及びAβ33-42ペプチドのカップリング。
以下のAβペプチドを化学的に合成した:Qβキャプシドタンパク質とのカップリングために、C末端で配列GGCと融合したヒトAβの残基1-15のアミノ酸配列を含むペプチドである、DAEFRHDSGYEVHHQGGC(「Aβ1-15」と省略)、及びQβキャプシドタンパク質とのカップリングために、N末端で配列CGHGNKSと融合したヒトAβの残基33-42のアミノ酸配列を含むペプチドである、CGHGNKSGLMVGGVVIA(「Aβ33-42」と省略)。両ペプチドを、以下の記載のように、Qβへの化学カップリングに用いた。
1.5mlの20mM Hepes 150mM NaCl pH7.4中の2mg/ml Qβキャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で30分間、16.6μlのH2O中の65mM SMPH(Pierce)の溶液と反応させた。この反応液について、その後、分画分子量10000Daの透析チューブにより、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。活性化(誘導体化)Qβを含有する450μlの透析反応混合液を、次いで、ロッキングシェーカー上にて25℃で2時間、6.5μlの各相当する50mMペプチド原液(DMSO中)と反応させた。その後、200μlのこの反応混合液を、2リッターの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対して4℃で終夜、透析し、翌朝、緩衝液を交換した後、さらに2時間、透析した。この反応混合液を、次いで、アリコートで液体窒素にて凍結し、マウスの免疫化まで、−80℃で貯蔵した。
カップリング実験の結果は、SDS-PAGEによって分析し、図13A及び図13Bに示されている。矢印は1つに相当し、それぞれ、2つのペプチドは1つのQβサブユニットとカップリング(図13A)するか、又は1つのペプチドは1つのQβサブユニットとカップリングした。マーカータンパク質の分子量は、図13A及び図13Bの左端に示されている。
図13Aのゲル上に負荷した試料は、以下の通りである:
1:誘導化Qβ;2:「Aβ1-15」とカップリングさせたQβであって、カップリング反応の最後に取り出した試料の上澄液で、遠心分離したもの;3:「Aβ1-15」とカップリングさせたQβであって、カップリング反応の最後に取り出した試料のペレットで、遠心分離したもの;4:「Aβ1-15」とカップリングさせたQβであって、24時間、4℃で静置させた試料の上澄み液で、透析せずに遠心分離したもの。5:「Aβ1-15」とカップリングさせたQβであって、24時間、4℃で静置させた試料のペレットで、透析せずに遠心分離したもの。6:「Aβ1-15」とカップリングさせたQβであって、カップリング反応の透析の後に取り出した試料の上澄み液で、遠心分離したもの。
図13Bのゲル上に負荷した試料は、以下の通りである:
1:誘導化Qβ 2:「Aβ33-42」とカップリングさせたQβであって、カップリング反応の最後に取り出した試料の上澄液で、遠心分離したもの;3:「Aβ33-42」とカップリングさせたQβであって、カップリング反応の最後に取り出した試料のペレットで、遠心分離したもの。4:「Aβ33-42」とカップリングさせたQβであって、24時間、4℃で静置させた試料の上澄み液で、透析せずに遠心分離したもの。5:「Aβ33-42」とカップリングさせたQβであって、24時間、4℃で静置させた試料のペレットで、透析せずに遠心分離したもの。
6:「Aβ33-42」とカップリングさせたQβであって、カップリング反応の透析の後に取り出した試料の上澄み液で、遠心分離したもの。
B.架橋剤SMPHを用いた、Qβキャプシドタンパク質と「Aβ1-27」ペプチドのカップリング
次のAβペプチド(「Aβ1-27」)を化学的に合成したDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNGGC。このペプチドは、Qβキャプシドタンパク質とのカップリングのために、C末端で配列GGCと融合した、ヒトAβの残基1-27のアミノ酸配列を含む。
以下において「Qβ-Aβ1-27バッチ1」と省略されている、Qβキャプシドタンパク質とカップリングした「Aβ1-27」の最初のバッチは、以下のようにして調製した:
1.5mlの20mM Hepes 150mM NaCl pH7.4中の2mg/ml Qβキャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で30分間、16.6μlのH2O中の65mM SMPH(Pierce)の溶液と反応させた。この反応液について、その後、分画分子量10000Daの透析チューブにより、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。450μlの透析反応混合液を、次いで、ロッキングシェーカー上にて15℃で2時間、6.5μlの50mMペプチド原液(DMSO中)と反応させた。その次に、200μlのこの反応混合液を等分し、液体窒素で凍結して、マウスの免疫化まで−80℃で貯蔵した。
以下において「Qβ-Aβ1-27バッチ2」と省略されている、Qβキャプシドタンパク質とカップリングした「Aβ1-27」の最初のバッチは、以下のようにして調製した:
500μlの20mM Hepes 150mM NaCl pH7.4中のQβキャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で30分間、11.3μlのH2O中の32.5mM SMPH(Pierce)の溶液と反応させた。この反応液について、その後、分画分子量3500Da(SnakeSkin, Pierce)の透析チューブにより、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。次いで、この透析した反応混合液を、ロッキングシェーカー上にて15℃で2時間、3.6μlの50mMペプチド原液(DMSO中)と反応させた。この反応混合液について、その後、分画分子量50000Da(Spectrapor, spectrum)の透析膜を用いて、1lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する1時間の透析を2回、そして、緩衝液の最後の交換の後に終夜の透析をおこなった。この反応混合液を、次いで、等分量、液体窒素で凍結し、マウスの免疫化まで−80℃で貯蔵した。「Qβ-Aβ1-27バッチ1」を最初の免疫化に用い、その一方で、「Qβ-Aβ1-27バッチ2」を追加免疫に用いた。
カップリング実験の結果は、SDS-PAGEによって分析し、図13Cに示している。矢印は、1つのQβサブユニットとカップリングした1つのペプチドに相当するバンドを指す。
図13Cのゲル上に負荷した試料は、以下の通りである:
M:タンパク質マーカー。1:Qβキャプシドタンパク質 2:誘導体化Qβであって、誘導体化反応の最後に取り出した試料の上澄み液で、遠心分離したもの。3:誘導体化Qβであって、カップリング反応の最後に取り出した試料のペレットで、遠心分離したもの。4:「Aβ1-27」とカップリングさせたQβであって、誘導体化反応の最後に取り出した試料の上澄み液で、遠心分離したもの。5:「Aβ1-27」とカップリングさせたQβであって、カップリング反応の最後に取り出した試料のペレットで、遠心分離したもの。6:「Aβ1-27」とカップリングさせたQβであって、カップリング反応の透析後に取り出した試料の上澄み液で、遠心分離したもの。7:「Aβ1-27」とカップリングさせたQβであって、カップリング反応の透析後に取り出した試料のペレットで、遠心分離したもの。
C.架橋剤Sulfo-GMBSを用いたQβキャプシドタンパク質と「Aβ1-15」ペプチドのカップリング
500μlの20mM Hepes 150mM NaCl pH7.4中の2mg/lQβキャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で30分間、5.5μlのH2O中の65mM SMPH(Pierce)の溶液と反応させた。この反応液について、その後、分画分子量10000Daの透析チューブにより、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。次いで、500μlのこの透析した反応混合液を、ロッキングシェーカー上にて15℃で2時間、6.5μlの50mMペプチド原液(DMSO中)と反応させた。200μlのこの反応混合液について、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する終夜の透析をおこない、翌朝、緩衝液の交換後にさらに2時間の透析をおこなった。この反応混合液を、次いで、等分量、液体窒素で凍結し、マウスの免疫化まで−80℃で貯蔵した。
カップリング実験の結果は、SDS-PAGEによって分析し、図13Dに示している。矢印は、1つのQβサブユニットとカップリングしている、それぞれ1、2及び3つのペプチドに相当するバンドを指す。
図13Dのゲル上に負荷した試料は、以下の通りである:
M:タンパク質マーカー。1:誘導体化Qβ 2:「Aβ1-15」とカップリングしたQβであって、カップリング反応の最後に取り出した試料の上澄み液で、遠心分離したもの。3:「Aβ1-15」とカップリングしたQβであって、カップリング反応の最後に取り出した試料のペレットで、遠心分離したもの。4:「Aβ1-15」とカップリングしたQβであって、24時間、4℃で静置させた試料の上澄み液で、透析せずに遠心分離したもの。5:「Aβ1-15」とカップリングしたQβであって、24時間、4℃で静置させた試料のペレットで、透析せずに遠心分離したもの。6:「Aβ1-15」とカップリングしたQβであって、カップリング反応の透析後に取り出した試料の上澄み液で、遠心分離したもの。
D.架橋剤Sulfo-MBSを用いたQβキャプシドタンパク質への「Aβ1-15」のカップリング
500μlの20mM Hepes 150mM NaCl pH7.4中のQβキャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で30分間、14.7μlのH2O中の100mM Sulfo-MBS(Pierce)の溶液と反応させた。この反応液について、その後、分画分子量3500Daの透析チューブ(SnakeSkin, Pierce)により、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。次いで、この透析した反応混合液を、ロッキングシェーカー上にて15℃で2時間、7.2μlの50mMペプチド原液(DMSO中)と反応させた。この反応混合液について、その後、分画分子量50000Da(Spectrapor, spectrum)の透析膜を用いて、2lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する4時間の透析を3回おこなった。この反応混合液を、次いで、等分量、液体窒素で凍結し、マウスの免疫化まで−80℃で貯蔵した。
カップリング実験の結果は、SDS-PAGEによって分析し、図13Eに示している。矢印は、1つのQβサブユニットとカップリングしている1つのペプチドに相当するバンドを指す。
図13Eのゲル上に負荷した試料は、以下の通りである:
1:Qβキャプシドタンパク質 2:誘導体化Qβであって、誘導体化反応の最後に取り出した試料の上澄み液で、遠心分離したもの。3:誘導体化Qβであって、誘導体化反応の最後に取り出した試料のペレットで、遠心分離したもの。4:誘導体化Qβであって、誘導体化反応の透析の最後に取り出した試料の上澄み液で、遠心分離したもの。5:誘導体化Qβであって、誘導体化反応の透析の最後に取り出した試料のペレットで、遠心分離したもの。6:「Aβ1-15」とカップリングしたQβであって、カップリング反応の透析後に取り出した試料の上澄み液で、遠心分離したもの。7:「Aβ1-15」とカップリングしたQβであって、カップリング反応の最後に取り出した試料のペレットで、遠心分離したもの。8:「Aβ1-15」とカップリングしたQβであって、カップリング反応の透析後に取り出した試料の上澄み液で、遠心分離したもの。
E.マウスの免疫化:
8週齢のグループあたり3匹の雌C57BL/6マウスの5グループを、アジュバンドの添加をせずに、5つのAβペプチド-Qβキャプシドタンパク質コンジュゲートのうちの1つで、そえぞれをワクチン接種した。各試料の25μgの全タンパク質をPBSで200μlまで希釈し、0日目及び14日目に皮下注射した。マウスを0日目(免疫前)、21日目に逆軌道で出血させ、それらの血清をELISAで分析した。「Aβ1-15」ペプチドを3つの異なる架橋剤でQβとカップリングさせ、その結果として、3つの異なるワクチン調製物(「Qb-Aβ-15 SMPH」、「Qb-Aβ-15 SMBS」;結果については、ELISAの章を参照)を得た。
F.ELISA
すべて3つのAβペプチドを、それぞれ、以下のように化学架橋剤SPDPを用いて、ウシリボヌクレアーゼAとカップリングさせた:2mL PBS(50mM リン酸緩衝液、150mM NaCl pH7.2)中の10mg リボヌクレアーゼAの溶液を、ロッキングシェーカー上にて60分間、25℃で、DMSO中の100μlの20mM SPDP溶液と反応させた。過度の架橋剤を、PD10カラム(ファルマシア)を用いるゲル濾過によって活性化(誘導体化)リボヌクレアーゼAから分離した。分画を含有するタンパク質をプールし、遠心濾過器(5000MWCO)を用いて、2mlの容量へ濃縮した。誘導体化リボヌクレアーゼA溶液の333μlの試料を、2μlのペプチド原液(DMSO中で50mM)と反応させた。このカップリング反応を、分光光度法によって追跡した。
ELISAプレートを、10μl/mlの濃度でペプチドにカップリングしたリボヌクレアーゼAでコーティングした。このプレートをブロックし、次いで、連続希釈マウス血清とともにインキュベートした。結合した抗体は、酵素標識した抗マウスIgG抗体で検出した。Qβとコンジュゲートした関連していないペプチドによって免疫化したマウスからの免疫前血清又はコントロール血清は、検出された抗体は、それぞれのペプチドに対して特異的であることを示した。それぞれ図14A、図14B及び図14Cは、それぞれQβキャプシドタンパク質とカップリングさせた「Aβ1-15」、「Aβ1-27」及び「Aβ33-42」に対して免疫化したマウスの血清における、「Aβ1-15」、「Aβ1-27」及び「Aβ33-42」に対して特異的なIgG抗体のELISA分析を示す。横座標の種類は、血清の起源であるマウスへ注射したワクチンを意味し、それぞれのワクチンを産するために使用したペプチド及び架橋剤を記載している。すべての血清は、リボヌクレアーゼAとカップリングした3つのペプチドに対して測定し、その結果は、ペプチド1-15と1-27に対して産生させた抗体の間の交差活性がある一方で、ペプチド33-42に対しては何ら交差活性が観察されなかったことを示し、このことは、免疫応答の特異性を示している。同じように、ELISAシグナルのバックグラウンドより上の平均値±3標準偏差を産する血清の希釈として示された、得られたELISA力価は、非常に高く、60’000から600’000の範囲であった。コントロールでは、何のAβペプチド特異的抗体も検出されなかった(免疫前マウス)。
cys含有リンカーの導入、発現、及び抗イデオタイプIgE抗体の精製、及びそれらのQβキャプシドタンパク質へのカップリング
A.Qβキャプシドタンパク質へのカップリングのためのミモボディーの発現に関するプラスミドの構築
プラスミドは、発現プラスミドVAE051-pASK116に基づいた。このプラスミドは、ミモボディーの重鎖及び軽鎖に関するコード領域を有する。以下のプライマーを、重鎖のC末端へcys-含有リンカーを導入するのに用いた。
プライマーCA2F:
CGGCTCGAGCATCACCATCACCATCACGGTGAAGTTAAACTGCAGCTGGAGTCG
プライマーCA1R:
CATGCCATGGTTAACCACAGGTGTGGGTTTTATCACAAGATTTGGGCTCAAC
プライマーCB1R:
CATGCCATGGTTAACCACACGGAGAGGTGTGGGTTTTATCACAAGATTTGGGCTCAAC
プライマーCC1R:
CCAGAAGAACCCGGCGGGGTAGACGGTTTCGGGCTAGCACAAGATTTGGGCTCAACTC
プライマーCC1F:
CGCCGGGTTCTTCTGGTGGTGCTCCGGGTGGTTGCGGTTAACCATGGAGAAAATAAAGTG
プライマーCCR2:
CTCCCGGGTAGAAGTCAC
A.1. pCA2の構築
プライマーCA2F及びCA1Rを用いて、cys-含有リンカー配列をコードする伸張を有する重鎖の一部分をコードする741bp断片を増幅した。(92℃で初期変性、サイクル:92℃、30秒;48℃、30秒;68℃、60秒)を5サイクル、その後、92℃、30秒;58℃、30秒;68℃、1分による30サイクルのPCR cycler(Robo)におけるPfxポリメラーゼ(Roche)のテンプレートとして、VAE-pASK116は機能した。適切な大きさのPCR産物は、Qiagen PCR精製キットを用いて精製し、製造者(Gibco)の薦めに従って、XhoI及びNcoIで消化した。その産物は、Qiagenゲル抽出キットによってアガロースゲルから精製した。プラスミドVAE-pASK116をXhoI及びNcoIで同時に切断し、3.7kbバンドをアガロースゲルから精製した。XhoI-NcoI消化PCR産物の適切な等分量及びプラスミドを、製造者プロトコール(Gibco)に従いT4 DNAリガーゼを用いて、16℃で終夜、ライゲーションした。このライゲーション産物を、クロラムフェニコールを含有するアガロースプレート上にプレートしたコンピテント大腸菌XL-1細胞へ形質転換した。単一のコロニーをLB/クロラムフェニコール培地に広げ、プラスミドを調製(Qiagen mini プラスミド キット)し、相当する酵素による消化の後、適切なXhoI-NcoI挿入サイズの存在について試験した。pCA2と呼ばれる相当するポジティブプラスミドを、cys含有リンカーを含むプラスミドの同一性を確かめた両ストランドのシーケンシングのために取り寄せた。
A.2.pCB2の構築
プライマーCA2F及びCB1Rを用いて、重鎖コード化配列の5' 末端にリンカー2を、そしてセクションA1に記載のと同じ条件を導入した。この結果として得られたPCR産物は750bpで、これをセクションA1に記載のように、VAE051-pASK116へクローニングした。
A.3.pCC2の構築
プラスミドpCC2は、2段階手法によって構築された:754bpの最初のPCR産物を、プライマーCA2F及びCC1Rを用いて増幅した。560bpの二番目のPCR産物を、プライマーCC1F及びCC2Rを用いて作製した。両PCRに関して、VAE051-pASK116をテンプレートとして利用し、条件はセクションA1に記載の通りであった。両PCR産物をアガロースゲルから単離し、プライマーCA2F及びCC2Rと混合させ、3番目のPCRをおこない、1298bp断片を結果として得た。この断片を単離して、XhoI及びNcoIで消化した。この結果として生じた780bp断片を、セクションA.1.に記載のように、VAE-pASK100へクローニングした。
B.ミモボディーの発現
コンピテント大腸菌W3110細胞を、プラスミドpCA2、pCB2及びpCC2で形質転換した。クロラムフェニコールアガロースプレートからの単一コロニーを、37℃で終夜、液体培養(LB+15μg/ml クロラムフェニコール)で増やした。1lのTB培地を、次いで、終夜培養で1:50v/vで接種し、28℃でOD600=3まで生育させた。発現は、1mg/l無水テトラサイクリンで誘導した。細胞を終夜培養の後に収集し、6000rpmで遠心分離した。ペリプラズマを、硫酸ポリミキシンBを補充したライセート緩衝液での4℃で2時間のインキュベートによって細胞ペレットから単離した。スフェロプラストを、6000rpmでの遠心分離によって分離した。この結果として得られた上澄み液はミモボディーを含有し、それを20mMトリス、pH8.0に対して透析した。
C.ミモボディーの精製
導入されたhis6-タグは、製造者の薦めに従ったNi-NTAファーストフロー(キアゲン)によるクロマトグラフィーによるミモボディーの精製を可能にした。必要ならば、プロテインGファーストフローカラム(アマシャム ファルマシア)におけるポリシングステップを後に続けた。ミモボディーを0.1Mグリシン pH2.7で溶出し、即座にNaOHの添加によって中和し、20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対して透析した。
pCC2を、プロテインGのみによるアフィニティークロマトグラフィーで精製した。純度は、SDS-PAGEによって分析した。
ミモボディーのタンパク質配列は、cDNA配列から翻訳された。N末端配列は、pCA2及びpCB2のエドマンシーケンシングによって確かめられた。
pCA2、pCB2及びpCC2の軽鎖の配列は、以下の通りである:
DIELVVTQPASVSGSPGQSITISCTGTRSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKL
MIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTL
GVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVT
VAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQ
VTHEGSTVEKTVAPTECS
pCA2の重鎖の配列:
EVKLQLEHHHHHHGEVKLQLESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSGGYY
WTWIRQRPGKGLEWIGYIYYSGSTSYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLRLT
SVTAADTAVYYCARERGETGLYYPYYYIDVWGTGTTVTVSSASTKGPSV
FPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ
SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTC
G
pCB2の重鎖の配列:
EVKLQLEHHHHHHGEVKLQLESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSGGYY
WTWIRQRPGKGLEWIGYIYYSGSTSYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLRLT
SVTAADTAVYYCARERGETGLYYPYYYIDVWGTGTTVTVSSASTKGPSV
FPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ
SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTS
PPCG
pCC2の重鎖の配列:
EVKLQLEHHHHHHGEVKLQLESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSGGYY
WTWIRQRPGKGLEWIGYIYYSGSTSYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLRLT
SVTAADTAVYYCARERGETGLYYPYYYIDVWGTGTTVTVSSASTKGPSV
FPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ
SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCASPKPS
TPPGSSGGAPGGC
D.Qβキャプシドタンパク質へのミモボディーのカップリング
D.1.Qβキャプシドタンパク質へのミモボディーpCC2のカップリング:
1.25mlの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の4.5mg/ml Qβキャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で、30分間、40μlのSMPH(Pierce)(DMSOに溶解させた100mM 原液の)と反応させた。この反応液について、続いて、4℃で2lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなった。6μlの透析反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上にて25℃で終夜、30μlのpCC2溶液(2.88mg/ml)と反応させた。
反応産物は、還元条件下の16%SDS-PAGEゲル上で分析した。ゲルを、クーマシーブリリアントブルーで染色するか、又はニトロセルロース膜上にブロットした。膜はブロックし、ポリクローナルウサギ抗-Qb抗血清(希釈1:2000)、又はマウスモノクローナル抗-Fab-mAb(Jackson ImmunoResearch)(希釈1:2000)とインキュベートした。ブロットを、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ-コンジュゲートヤギ抗-ウサギIgG、又は西洋ワサビペルオキシダーゼ-コンジュゲートヤギ抗-ウサギIgG(希釈 1:7000)でそれぞれインキュベートした。
結果は、図13Aに示されている。カップリング産物及び抽出物は、還元条件下の16%SDS-PAGEゲル上で分析した。図13Aでは、「pCC2」は、カップリング前のミモボディーと一致する。「Qβderiv」とは、カップリング前に誘導体化したQβを意味し、「Qβ-pCC2」とは、カップリング反応の産物を意味する。ゲルは、クーマシーブリリアントブルーで染色するか、又はニトロセルロース膜上にブロットした。膜はブロックし、ポリクローナルウサギ抗-Qb抗血清(希釈1:2000)、又はマウスモノクローナル抗-Fab-mAb(Jackson ImmunoResearch)(希釈1:2000)とインキュベートした。ブロットを、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ-コンジュゲートヤギ抗-ウサギIgG、又は西洋ワサビペルオキシダーゼ-コンジュゲートヤギ抗-マウスIgG(希釈 1:7000)でそれぞれインキュベートした。増強した化学発光(アマシャム ファルマシア ELCキット)を用いて、免疫活性バンドを視覚化した。マーカータンパク質の分子量を、左端に示している。
約40kDaのカップリング産物を検出することができる(図13A、矢印)。抗Qβ抗血清及びミモボディーを認識する抗Fab抗体とのその反応性は、Qβへのミモボディーの共有的カップリングを明白に示した。
D.2.Qβキャプシドタンパク質へのミモボディーpCA2及びpCB2のカップリング
1.25mlの20mM Hepes、150mM NaCl pH7.2中の4.5mg/ml Qβキャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で、30分間、40μlのSMPH(Pierce)(DMSOに溶解させた100mM 原液の)と反応させた。この反応液について、続いて、4℃で2lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなった。 pCA2(1.2mg/ml)を25℃で30分間、20mM TCEPで、pCB2(4.2mg/ml)を37℃で50mM メルカプトエチルアミンで還元した。両ミモボディーについて、その後、4℃で20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する透析を2回おこなった。カップリングは、ロッキングシェーカー上にて25℃で、30μlのミモボディーへ6μlの誘導体化Qβを添加することによっておこなった。
反応産物は、還元条件下の16%SDS-PAGEゲル上で分析した。ゲルを、クーマシーブリリアントブルーで染色するか、又はニトロセルロース膜上にブロットした。膜はブロックし、ポリクローナルウサギ抗-Qb抗血清(Cytos, 希釈1:2000)、又はマウスモノクローナル抗-his6-mAb(キアゲン)(希釈1:5000)とインキュベートした。ブロットを、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ-コンジュゲートヤギ抗-ウサギIgG、又は西洋ワサビペルオキシダーゼ-コンジュゲートヤギ抗-マウスIgG(希釈 1:5000)でそれぞれインキュベートした。
結果は、図13B及び図13Cに示されている。カップリング産物及び抽出物は、還元条件下の16%SDS-PAGEゲル上で分析した。図15A及び図15Bでは、「pCA2」及び「pCB2」は、カップリング前のミモボディーと一致する。「Qβderiv」とは、カップリング前に誘導体化したQβを意味し、「Qβ-pCA2」及び「Qβ-pCA2」とは、カップリング反応の産物を意味する。ゲルは、クーマシーブリリアントブルーで染色するか、又はニトロセルロース膜上にブロットした。膜はブロックし、ポリクローナルウサギ抗-Qb抗血清(希釈1:2000)、又はマウスモノクローナル抗-his-mAb(キアゲン)(希釈1:5000)とインキュベートした。ブロットを、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ-コンジュゲートヤギ抗-ウサギIgG、又は西洋ワサビペルオキシダーゼ-コンジュゲートヤギ抗-マウスIgG(希釈 1:5000)でそれぞれインキュベートした。増強した化学発光(アマシャム ファルマシア ELCキット)を用いて、免疫活性バンドを視覚化した。マーカータンパク質の分子量を、左端に示している。
約40kDaのカップリング産物を、pCA2及びpCB2の双方に関して検出することができる(図15A及び図15B、矢印)。抗Qβ抗血清及びミモボディーを認識する抗his6抗体とのその反応性は、Qβへのミモボディーの共有的カップリングを明白に示した。
架橋剤Sulfo-GMBSを用いた、wt及びQβキャプシドタンパク質へのFlagペプチドのカップリング
カップリングのために、N末端にCGG配列が付加されたFlag ペプチドは化学的に合成され、以下の配列を有していた:CGGDYKDDDDK。以下に示しているように、このペプチドを、wtQβキャプシドタンパク質、及びQβ変異体キャプシドタンパク質への化学カップリングに利用した。
E.Qβキャプシドタンパク質へのFlag ペプチドのカップリング
100ulの20mM Hepes 150mM NaCl pH7.2中の2mg/ml Qβキャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で、60分間、7μlの65mM Sulfo-GMBS(Pierce)と反応させた。この反応液について、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなった。100μlの透析反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上にて25℃で2時間、0.58μlの100mM Flagペプチド原液(H2O中)と反応させた。この反応混合液を、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなった。
B.Qβ-240キャプシドタンパク質へのFlag ペプチドのカップリング
100ulの20mM Hepes 150mM NaCl pH7.2中の2mg/ml Qβ-240キャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で、60分間、7μlの65mM Sulfo-GMBS(Pierce)と反応させた。この反応液について、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなった。100μlの透析反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上にて25℃で2時間、0.58μlの100mM Flagペプチド原液(H2O中)と反応させた。この反応混合液を、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなった。
C.Qβ-250キャプシドタンパク質へのFlagペプチドのカップリング
100ulの20mM Hepes 150mM NaCl pH7.4中の2mg/ml Qβ-250キャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で、60分間、7μlの65mM Sulfo-GMBS(Pierce)と反応させた。この反応液について、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなった。100μlの透析反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上にて25℃で2時間、0.58μlの100mM Flagペプチド原液(H2O中)と反応させた。この反応混合液を、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなった。
D.Qβ-259キャプシドタンパク質へのFlagペプチドのキャプシド
100ulの20mM Hepes 150mM NaCl pH7.4中の2mg/ml Qβ-259キャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で、60分間、7μlの65mM Sulfo-GMBS(Pierce)と反応させた。この反応液について、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。100μlの透析反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上にて25℃で2時間、0.58μlの100mM Flagペプチド原液(H2O中)と反応させた。この反応混合液を、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。
SDS-PAGEによって分析したFlagペプチドへのQβ変異体240、250及び259のカップリング反応の結果は、図22Aに示されている。ローディング・パターンは、以下の通りである:
1.誘導体化Qβ-240 2.FlagペプチドとカップリングさせたQβ-240 3.誘導体化Qβ-250 4.FlagペプチドとカップリングさせたQβ-250 5.誘導体化Qβ-259 6.FlagペプチドとカップリングさせたQβ-259 7.誘導体化wtQβ 8.FlagペプチドとカップリングさせたwtQβ 9.タンパク質マーカー
誘導体化反応とカップリング反応の比較は、すべての変異体及びwtに関しては、サブユニットあたりの1及び2ペプチドに相当するバンドが目で見ることを示している。カップリングしていないQβサブユニットに相当するバンドは非常に弱く、このことは、殆どすべてのサブユニットが、少なくとも1つのFlag ペプチドと反応したことを示している。Qβ-250変異体及びwtQβに関しては、サブユニットあたり3つのペプチドに相当するバンドが目で見ることができる。サブユニットあたり2つのペプチドに相当するバンドと、サブユニットあたり1つのペプチドに相当するバンドの強度の割合は、wtに関して最も強く、比は1:1であり、こ割合は、Qβ-250変異体にとってまだ高く、その一方で、Qβ-240変異体にとって顕著に弱く、Qβ-259変異体にとって最も弱い。
架橋剤Sulfo-MBSを用いた、Qβキャプシドタンパク質へのFlagペプチドのカップリング
カップリングのために、N末端にCGG配列が付加されたFlag ペプチドは化学的に合成され、以下の配列を有していた:CGGDYKDDDDK。以下に示しているように、このペプチドを、wtQβキャプシドタンパク質、及びQβ変異体キャプシドタンパク質への化学カップリングに利用した。
F.Qβキャプシドタンパク質へのFlag ペプチドのカップリング
100ulの20mM Hepes 150mM NaCl pH7.2中の2mg/ml Qβキャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で、60分間、7μlの65mM Sulfo-GMBS(Pierce)と反応させた。この反応液について、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなった。100μlの透析反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上にて25℃で2時間、0.58μlの100mM Flagペプチド原液(H2O中)と反応させた。この反応混合液を、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなった。
B.Qβ-240キャプシドタンパク質へのFlag ペプチドのカップリング
100ulの20mM Hepes 150mM NaCl pH7.2中の2mg/ml Qβ-240キャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で、60分間、7μlの65mM Sulfo-GMBS(Pierce)と反応させた。この反応液について、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなった。100μlの透析反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上にて25℃で2時間、0.58μlの100mM Flagペプチド原液(H2O中)と反応させた。この反応混合液を、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。
C.Qβ-250キャプシドタンパク質へのFlagペプチドのカップリング
100ulの20mM Hepes 150mM NaCl pH7.2中の2mg/ml Qβ-250キャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で、60分間、7μlの65mM Sulfo-GMBS(Pierce)と反応させた。この反応液について、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなった。100μlの透析反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上にて25℃で2時間、0.58μlの100mM Flagペプチド原液(H2O中)と反応させた。この反応混合液を、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなった。
D.Qβ-259キャプシドタンパク質へのFlagペプチドのキャプシド
100ulの20mM Hepes 150mM NaCl pH7.2中の2mg/ml Qβ-259キャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で、60分間、7μlの65mM Sulfo-GMBS(Pierce)と反応させた。この反応液について、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.2に対する2時間の透析を2回おこなった。100μlの透析反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上にて25℃で2時間、0.58μlの100mM Flagペプチド原液(H2O中)と反応させた。この反応混合液を、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。
SDS-PAGEによって分析したFlagペプチドへのQβ変異体240、250及び259のカップリング反応の結果は、図1に示されている。ローディング・パターンは、以下の通りである:
1.タンパク質マーカー 2.誘導体化Qβ-240 3.FlagペプチドとカップリングさせたQβ-240 4.誘導体化Qβ-250 5.FlagペプチドとカップリングさせたQβ-250 6.誘導体化Qβ-259 7.FlagペプチドとカップリングさせたQβ-259 8.誘導体化wtQβ 9.FlagペプチドとカップリングさせたwtQβ
誘導体化反応とカップリング反応の比較は、すべての変異体及びwtに関して、サブユニットあたりの1及び2ペプチドに相当するバンドが目で見ることを示している。また、変異体Qβ-250及びwtQβについて、サブユニットあたり2つのペプチドに相当するバンドを目で見ることができる。サブユニットあたり1つのペプチドと、カップリングしていないサブユニットそれぞれに相当するバンドの強度の割合は、Qβ-250変異体及びwtQβにについては、一層高い。Qβ-240変異体について、サブユニットあたり2つのペプチドに相当する弱いバンドが目で見ることができる。
架橋剤SMPHを用いた、Qβ変異体へのFlagペプチドのカップリング
カップリングのために、N末端にCGG配列が付加されたFlag ペプチドは化学的に合成され、以下の配列を有していた:CGGDYKDDDDK。以下に示しているように、このペプチドを、Qβ変異体キャプシドタンパク質への化学カップリングに利用した。
A.Qβ-240キャプシドタンパク質へのFlag ペプチドのカップリング
100ulの20mM Hepes 150mM NaCl pH7.4中の2mg/ml Qβ-240キャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で、30分間、DMSO中の2.94μlの100mMSMPH(Pierce)と反応させた。この反応液について、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。90μlの透析反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上にて25℃で2時間、1.3μlの50mM Flagペプチド原液(DMSO中)と反応させた。この反応混合液を、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。
B.Qβ-250キャプシドタンパク質へのFlagペプチドのカップリング
100ulの20mM Hepes 150mM NaCl pH7.4中の2mg/ml Qβ-250キャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で、30分間、2.94μlの100mMSMPH(Pierce)と反応させた。この反応液について、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。90μlの透析反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上にて25℃で2時間、1.3μlの50mM Flagペプチド原液(DMSO中)と反応させた。この反応混合液を、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。
C.Qβ-259キャプシドタンパク質へのFlagペプチドのキャプシド
100ulの20mM Hepes 150mM NaCl pH7.4中の2mg/ml Qβ-259キャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で、30分間、2.94μlの100mMSMPH(Pierce)と反応させた。この反応液について、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。90μlの透析反応混合液を、その後、ロッキングシェーカー上にて25℃で2時間、1.3μlの50mM Flagペプチド原液(DMSO中)と反応させた。この反応混合液を、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。
SDS-PAGEによって分析したFlagペプチドへのQβ変異体240、250及び259のカップリング反応の結果は、図1に示されている。ローディング・パターンは、以下の通りである:
1.タンパク質マーカー 2.FlagとカップリングさせたQβ-240であって、カップリング反応のペレット 3.FlagとカップリングさせたQβ-240であって、カップリング反応の上澄み液 4.SMPH5で誘導体化したQβ-240 5.FlagとカップリングさせたQβ-250であって、カップリング反応のペレット 6.FlagとカップリングさせたQβ-250であって、カップリング反応の上澄み液 7.SMPH5で誘導体化したQβ-250 8.FlagとカップリングさせたQβ-259であって、カップリング反応のペレット 9.FlagとカップリングさせたQβ-259であって、カップリング反応の上澄み液 10.SMPHで誘導体化したQβ-259。
誘導体化反応とカップリング反応の比較は、すべての変異体に関しては、サブユニットあたり1、それぞれ2ペプチドに相当するバンドが目で見ることができることを示している。サブユニットあたり3、それぞれ4ペプチドに相当するバンドも、変異体Qβ-250に関して目で見ることができる。
変異体Qβキャプシドタンパク質へのPLA2-Cysのカップリング
凍結乾燥した変異体Qβキャプシドタンパク質を、20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4で終夜、膨張させた。
A.Qβ-240キャプシドタンパク質へのPLA2-Cysタンパク質のカップリング
100ulの20mM Hepes 150mM NaCl pH7.4中の2mg/ml Qβ-240キャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で、30分間、DMSO中の2.94μlの100mM SMPH(Pierce)と反応させた。この反応液について、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。90μlの透析反応混合液を146ulの20mM Hepes 、150mM NaCl pH7.4と混合させ、そしてロッキングシェーカー上にて25℃で4時間、85.7ulの2.1mg/ml PLA2-Cysペプチド原液と反応させた。この反応混合液について、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。
B.Qβ-250キャプシドタンパク質へのPLA2-Cysタンパク質のカップリング
100ulの20mM Hepes 150mM NaCl pH7.4中の2mg/ml Qβ-250キャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で、30分間、DMSO中の2.94μlの100mM SMPH(Pierce)と反応させた。この反応液について、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。90μlの透析反応混合液を146ulの20mM Hepes 、150mM NaCl pH7.4と混合させ、そしてロッキングシェーカー上にて25℃で4時間、85.7ulの2.1mg/ml PLA2-Cysペプチド原液と反応させた。この反応混合液について、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。
C.Qβ-259キャプシドタンパク質へのPLA2-Cysタンパク質のカップリング
100ulの20mM Hepes 150mM NaCl pH7.4中の2mg/ml Qβ-259キャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカー上にて25℃で、30分間、DMSO中の2.94μlの100mM SMPH(Pierce)と反応させた。この反応液について、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。90μlの透析反応混合液を146ulの20mM Hepes 、150mM NaCl pH7.4と混合させ、そしてロッキングシェーカー上にて25℃で4時間、85.7ulの2.1mg/ml PLA2-Cysペプチド原液と反応させた。この反応混合液について、続いて、4℃で2Lの20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対する2時間の透析を2回おこなった。
SDS-PAGEによって分析したカップリング反応の結果は、図1に示されている。ローディング・パターンは、以下の通りである:
1.タンパク質マーカー 2.誘導体化Qβ-240 3.Pla2CysとカップリングさせたQβ-240であって、カップリング反応の上澄み液 4.PLA2-CysとカップリングさせたQβ-240であって、カップリング反応のペレット 5.誘導体化Qβ-250 6.PLA2-CysとカップリングさせたQβ-250であって、カップリング反応の上澄み液 7.PLA2-CysとカップリングさせたQβ-250であって、カップリング反応のペレット 8.誘導体化Qβ-259 9.PLA2-CysとカップリングさせたQβ-259であって、カップリング反応の上澄み液 10.PLA2-CysとカップリングさせたQβ-250であって、カップリング反応のペレット 11.PLA2-Cys。
カップリングバンド(図では、矢印によって示されている)は、すべての変異体に関して、目で見ることができ、このことは、PLA2-Cysタンパク質が、すべての変異体Qβキャプシドタンパク質とカップリングすることができることを示している。
1 ここで言及したすべての特許及び刊行物は、明白に参考文献として取り入れられている。
2 ともに1999年11月39日に出願された、米国特許出願09/449,631及び国際公開00/3227のすべての開示は、ここで、そのすべてを参考文献として取り入れている。上記にて言及したすべての刊行物及び特許は、ここで、それらのすべてが参考文献として取り入れられている。
本発明による抗原の発現のためのモジュラー真核生物発現ベクター; Qβキャプシドタンパク質へのレジスチンのクローニング、発現及びカップリング; ウイルス様粒子及び線毛へのカップリングのためのリンホトキシン-βコンストラクトのクローニング及び発現。 Qβキャプシドタンパク質へのMIFコンストラクトのクローニング、発現及びカップリング。 Qβキャプシドタンパク質とカップリングしたMIFタンパク質に対して免疫化したマウスの血清のMIFに特異的なIgG抗体のELISA解析。 SDS-Pageで解析した、MIFコンストラクトのfrキャプシドタンパク質及びHBcAg-lys-2cys-Mutキャプシドタンパク質へのカップリング。 ヒト-C-RANKLのクローニング及び発現。 プリオンタンパク質のクローニング及び発現。 Qβキャプシドタンパク質とカップリングしたアンギオテンシンペプチドに対して免疫化したマウスの血清の「アンギオI」に特異的なIgG抗体のELISA解析。 Qβキャプシドタンパク質とカップリングしたアンギオテンシンペプチドに対して免疫化したマウスの血清の「アンギオII」に特異的なIgG抗体のELISA解析。 Qβキャプシドタンパク質とカップリングしたアンギオテンシンペプチドに対して免疫化したマウスの血清の「アンギオIII」に特異的なIgG抗体のELISA解析。 Qβキャプシドタンパク質とカップリングしたアンギオテンシンペプチドに対して免疫化したマウスの血清の「アンギオIV」に特異的なIgG抗体のELISA解析。 Qβキャプシドタンパク質とカップリングしたDer pIペプチドに対して免疫化したマウスの血清の「Der p I p52」に特異的なIgG抗体のELISA解析。 Qβキャプシドタンパク質とカップリングしたDer pIペプチドに対して免疫化したマウスの血清の「Der p I p117」に特異的なIgG抗体のELISA解析。 ともに1型線毛タンパク質とカップリングしたヒトVEGFRIIペプチド及びヒトVEGFRIIの細胞外ドメインに対して免疫化したマウスの血清のヒトVEGFRIIペプチドに特異的なIgG抗体のELISA解析。 ともに1型線毛タンパク質とカップリングしたヒトVEGFRIIペプチド及びヒトVEGFRIIの細胞外ドメインに対して免疫化したマウスの血清のヒトVEGFRIIの細胞外ドメインに特異的なIgG抗体のELISA解析。 完全長HBc-TNFに対して免疫化したマウスの血清の抗-TNFαタンパク質に特異的なIgG抗体のELISA解析。 3' TNFIIペプチドとカップリングした2cysLys-mut HBcAg1-149に対して免疫化したマウスの血清の抗-TNFαタンパク質に特異的なIgG抗体のELISA解析。 架橋剤SMPHを利用した、「Aβ1-15」のQβキャプシドタンパク質へのカップリングのSDS-PAGE分析。 架橋剤SMPHを利用した、「Aβ33-42」のQβキャプシドタンパク質へのカップリングのSDS-PAGE分析。 架橋剤SMPHを利用した、「Aβ1-27」のQβキャプシドタンパク質へのカップリングのSDS-PAGE分析。 架橋剤Sulfo-GMBSを利用した、「Aβ1-15」のQβキャプシドタンパク質へのカップリングのSDS-PAGE分析。 架橋剤Sulfo-MBSを利用した、「Aβ1-15」のQβキャプシドタンパク質へのカップリングのSDS-PAGE分析。 Qβキャプシドタンパク質とカップリングした「Aβ1-15」に対して免疫化したマウスの血清の「Aβ1-15」に特異的なIgG抗体のELISA解析。 Qβキャプシドタンパク質とカップリングした「Aβ1-27」に対して免疫化したマウスの血清の「Aβ1-27」に特異的なIgG抗体のELISA解析。 Qβキャプシドタンパク質とカップリングした「Aβ33-42」に対して免疫化したマウスの血清の「Aβ33-42」に特異的なIgG抗体のELISA解析。 pCC2のQβキャプシドタンパク質へのカップリングのSDS-PAGE分析。 pCA2のQβキャプシドタンパク質へのカップリングのSDS-PAGE分析。 pCB2のQβキャプシドタンパク質へのカップリングのSDS-PAGE分析。 プリオンペプチドのQβキャプシドタンパク質へのカップリング;SDS-PAGE分析。 細菌でのIL-5の発現のSDS-PAGE分析。 真核生物細胞でのIL-5及びIL-13の発現のウェスタンブロット解析。 マウスVEGFR-2ペプチドの線毛へのカップリングのSDS-PAGE分析。 マウスVEGFR-2ペプチドのQβキャプシドタンパク質へのカップリングのSDS-PAGE分析。 マウスVEGFR-2ペプチドのHBc-lys-2cys-MutへのカップリングのSDS-PAGE分析。 線毛とカップリングしたマウスVEGFR-2ペプチドに対して免疫化したマウスの血清のマウスVEGFR-2ペプチドに特異的なIgG抗体のELISA解析。 Qβキャプシドタンパク質とカップリングしたマウスVEGFR-2ペプチドに対して免疫化したマウスの血清のマウスVEGFR-2ペプチドに特異的なIgG抗体のELISA解析。 HBcAg-lys-2cys-MutとカップリングしたマウスVEGFR-2に対して免疫化したマウスの血清のマウスVEGFR-2ペプチドに特異的なIgG抗体のELISA解析。 Aβ1-15ペプチドのHBcAg-lys-2cys-Mut及びfrキャプシドタンパク質へのカップリングのSDS-PAGE分析。 HBcAg-lys-2cys-Mut又はキャプシドタンパク質とカップリングしたAβ1-15ペプチドに対して免疫化したマウスの血清のAβ1-15ペプチドに特異的なIgG抗体のELISA解析。 Qβキャプシドタンパク質とカップリングしたヒトAβペプチドで免疫化したトランスジェニックAPP23マウスの血清のヒトAβに特異的なIgG抗体のELISA解析。 Fab抗体断片のQβキャプシドタンパク質へのカップリングのSDS-PAGE分析。 変異体Qβキャプシドタンパク質とカップリングしたflagペプチドの架橋剤sulfoGMBSとのカップリングのSDS-PAGE分析。 変異体Qβキャプシドタンパク質とカップリングしたflagペプチドの架橋剤sulfoMBSとのカップリングのSDS-PAGE分析。 変異体Qβキャプシドタンパク質とカップリングしたflagペプチドの架橋剤SMPHとのカップリングのSDS-PAGE分析。 変異体Qβキャプシドタンパク質とカップリングしたPLA-cysタンパク質の架橋剤SMPHとのカップリングのSDS-PAGE分析。 変異体Qβキャプシドタンパク質及びfrキャプシドとカップリングしたM2ペプチドによる免疫化のELISA解析。 変異体Qβキャプシドタンパク質とカップリングしたDERp1,2 ポリペプチドのカップリングのSDS-PAGE分析。 Qβキャプシドタンパク質とカップリングしたPLA2によるアレルギー性マウスの脱感作:温度測定 Qβキャプシドタンパク質とカップリングしたPLA2-cysによるアレルギー性マウスの脱感作:IgG2A及びIgE力価 PLA-cysのQβキャプシドタンパク質へのカップリングのSDS-PAGE分析及びウェスタンブロット解析 HBcAg-lys-2cys-Mut、Qβキャプシドタンパク質、frキャプシドタンパク質、HBcAg-lys-1-183及びHBcAg1-183と融合したM2エピトープとカップリングしたM2ペプチドに対して免疫化したマウスの血清のM2ペプチドに特異的なIgG抗体のELISA解析 抗イディオタイプIgEミモボディーVAE051のQβキャプシドタンパク質とのカップリングのSDS-PAGE分析 Qβキャプシドタンパク質とカップリングしたVAE051に対して免疫化したマウスの血清の抗イディオタイプ抗体 VAE501及びヒトIgEに特異的なIgG抗体のELISA解析

Claims (219)

  1. (a)(i)コア粒子、及び、
    (ii)少なくとも1つの第1の付着部位を有するオーガナイザー
    を含んでなる非天然分子骨格であって、
    前記オーガナイザーが前記コア粒子に少なくとも1つの共有結合により連結され、前記コア粒子がバクテリオファージの組換えタンパク質、又はその断片を含むウイルス様粒子である非天然分子骨格、
    (b)少なくとも1つの第2の付着部位を持つ抗原又は抗原決定基であって、前記第2の付着部位が、
    (i)前記抗原又は抗原決定基に天然に存在しない付着部位、及び、
    (ii)前記抗原又は抗原決定基に天然に存在する付着部位
    からなる群から選択される抗原又は抗原決定基、
    を含んでなる組成物であって、
    前記第2の付着部位が、少なくとも1つの非ペプチド結合を介して前記第1の付着部位に結合することができ、そして、
    前記抗原又は抗原決定基及び前記骨格が前記結合を介して相互作用して、規則正しく繰り返される抗原アレイを形成する、組成物。
  2. 前記結合が、少なくとも1つの共有結合による、請求項1に記載の組成物。
  3. 前記第1の付着部位がリジン残基であり、前記第2の付着部位がシステイン残基である、請求項1に記載の組成物。
  4. 前記第2の付着部位がスルフヒドリル基又はシステイン残基であるか、それを含む、請求項1に記載の組成物。
  5. 前記バクテリオファージがRNA-ファージである、請求項1に記載の組成物。
  6. 前記RNA-ファージが、
    a)バクテリオファージQβ;
    b)バクテリオファージR17;
    c)バクテリオファージfr;
    d)バクテリオファージGA;
    e)バクテリオファージSP;
    f)バクテリオファージMS2;
    g)バクテリオファージM11;
    h)バクテリオファージMX1;
    i)バクテリオファージNL95;
    k)バクテリオファージf2;及び
    l)バクテリオファージPP7;
    からなる群から選択される、請求項5に記載の組成物。
  7. 前記組換えタンパク質が、
    a)配列番号:159のアミノ酸配列;
    b)配列番号:160のアミノ酸配列;
    c)配列番号:161のアミノ酸配列;
    d)配列番号:162のアミノ酸配列;
    e)配列番号:163のアミノ酸配列;
    f)配列番号:164のアミノ酸配列;
    g)配列番号:165のアミノ酸配列;
    h)配列番号:166のアミノ酸配列;
    i)配列番号:167のアミノ酸配列;
    j)配列番号:215のアミノ酸配列;
    k)配列番号:253のアミノ酸配列;
    l)配列番号:217及びその変異体のアミノ酸配列;
    m)配列番号:254のアミノ酸配列;
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するコートタンパク質を含む、請求項5に記載の組成物。
  8. 前記組換えタンパク質が、変異体コートタンパク質を含む、請求項5に記載の組成物。
  9. 前記変異体コートタンパク質が、置換による少なくとも1つのリジン残基の除去により、又は置換による少なくとも1つのリジン残基の追加により改変されている、請求項8に記載の組成物。
  10. 前記変異体コートタンパク質が、少なくとも1つのリジン残基の欠失により、又は少なくとも1つのリジン残基の挿入を介する付加により改変されている、請求項8に記載の組成物。
  11. 前記バクテリオファージがバクテリオファージQβである、請求項1に記載の組成物。
  12. 前記バクテリオファージがバクテリオファージfrである、請求項1に記載の組成物。
  13. 前記組換えタンパク質が、配列番号:159のアミノ酸配列を有するコートタンパク質、又は配列番号:159及び配列番号:217又は配列番号:217の変異体のアミノ酸配列を有するコートタンパク質の混合物を含む、請求項11に記載の組成物。
  14. 前記コア粒子が、配列番号:159のアミノ酸配列を有するコートタンパク質から実質的になる、又は配列番号:217、又はその変異体、及び配列番号:159のアミノ酸配列を有するコートタンパク質の混合物から実質的になるバクテリオファージQβのウイルス様粒子である、請求項1に記載の組成物。
  15. 前記組換えタンパク質が変異体Qβコートタンパク質を含む、請求項11に記載の組成物。
  16. 前記変異体コートタンパク質が、置換による少なくとも1つのリジン残基の除去により、又は置換による少なくとも1つのリジン残基の追加により改変されている、請求項15に記載の組成物。
  17. 前記変異体Qβコートタンパク質が、少なくとも1つのリジン残基の欠失により、又は少なくとも1つのリジン残基の付加により改変されている、請求項15に記載の組成物。
  18. 前記変異体Qβコートタンパク質が、
    a)配列番号:255のアミノ酸配列;
    b)配列番号:256のアミノ酸配列;
    c)配列番号:257のアミノ酸配列;
    d)配列番号:258のアミノ酸配列;及び
    e)配列番号:259のアミノ酸配列;
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含む、請求項15に記載の組成物。
  19. 前記コア粒子が、
    a)配列番号:255のアミノ酸配列;
    b)配列番号:256のアミノ酸配列;
    c)配列番号:257のアミノ酸配列;
    d)配列番号:258のアミノ酸配列;
    e)配列番号:259のアミノ酸配列;及び
    f)a)−e)の何れか及び対応するA1タンパク質の混合物から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する変異体Qβコートタンパク質から実質的に成るバクテリオファージQβのウイルス様粒子である、請求項1に記載の組成物。
  20. 前記オーガナイザーが、前記バクテリオファージQβ又は前記バクテリオファージfrの不可欠な部分である、請求項11に記載の組成物。
  21. 前記コア粒子が、バクテリオファージの組換えタンパク質からなるウイルス様粒子である、請求項1に記載の組成物。
  22. 前記第1及び/又は第2の付着部位が、
    (a)抗原及びそれに対する抗体又は抗体断片;
    (b)ビオチン及びアビジン;
    (c)ストレプトアビジン及びビオチン;
    (d)レセプター及びそのリガンド;
    (e)リガンド結合性タンパク質及びそのリガンド;
    (f)相互作用するロイシンジッパーポリペプチド;
    (g)アミノ基及びそれと反応性の化学基;
    (h)カルボキシル基及びそれと反応性の化学基;
    (i)スルフヒドリル基及びそれと反応性の化学基;又は
    (j)これらの組み合わせ
    を含む、請求項1に記載の組成物。
  23. 前記第1の付着部位がアミノ基であり、第2の付着部位がスルフヒドリル基である、請求項1に記載の組成物。
  24. 前記第1の付着部位がリジン残基であり、第2の付着部位がシステイン残基である、請求項1に記載の組成物。
  25. 前記第2の付着部位が、前記抗原又は抗原決定基内に天然に存在しない、請求項1に記載の組成物。
  26. 前記第1の付着部位がアミノ基であり、第2の付着部位がスルフヒドリル基である、請求項25に記載の組成物。
  27. 前記第1の付着部位がリジン残基であり、第2の付着部位がシステイン残基である、請求項25に記載の組成物。
  28. 前記第2の付着部位が、スルフヒドリル基又はシステイン残基である又はそれを含む、請求項25に記載の組成物。
  29. 前記組成物がアミノ酸リンカーを含む、請求項25に記載の組成物。
  30. 前記アミノ酸リンカーが、少なくとも1つの共有結合によって前記抗原又は抗原決定基に結合した、請求項29に記載の組成物。
  31. 前記アミノ酸リンカーが、前記第2の付着部位を含むか、あるいはそれからなる、請求項29に記載の組成物。
  32. 前記アミノ酸リンカーが、スルフヒドリル基又はシステイン残基を含む、請求項31に記載の組成物。
  33. 前記アミノ酸リンカーが、
    (a)CGG
    (b)N-末端ガンマ1-リンカー;
    (c)N-末端ガンマ3-リンカー;
    (d)Igヒンジ領域;
    (e)N-末端グリシンリンカー;
    (f)n=0−12かつk=0−5である場合の(G)C(G)
    (g)N-末端グリシン-セリンリンカー;
    (h)n=0−3、k=0−5、m=0−10,l=0−2である場合の(G)C(G)(S)(GGGGS)
    (i)GGC
    (k)GGC-NH2
    (l)C-末端ガンマ1-リンカー
    (m)C-末端ガンマ3-リンカー;
    (n)C-末端グリシンリンカー;
    (o)n=0−12かつk=0−5である場合の(G)C(G)
    (p)C-末端グリシン-セリンリンカー;
    (q)n=0−3、k=0−5、m=0−10,l=0−2及びo=0−8である場合
    の(G)(S)(GGGGS)(G)C(G)
    からなる群から選択される、請求項31に記載の組成物。
  34. 前記抗原又は前記抗原決定基が、自己抗原又はその断片、又は抗-イディオタイプ抗体又は抗-イディオタイプ抗体断片である、請求項1に記載の組成物。
  35. 前記自己抗原が、
    a)リンホトキシン;
    b)リンホトキシンレセプター;
    c)RANKL;
    d)VEGF;
    e)VEGFR;
    f)インターロイキン5;
    g)インターロイキン17;
    h)インターロイキン13;
    i)アンギオテンシン;
    k)CCL21;
    l)CXCL12;
    m)SDF-1;
    n)MCP-1;
    o)エンドグリン(Endoglin);
    p)レジスチン(Resistin);
    q)GHRH;
    r)LHRH;
    s)TRH;
    t)MIF;
    u)エオタキシン(Eotaxin);
    v)ブラジキニン;
    w)BLC;
    x)腫瘍壊死因子α(TNFα);
    y)アミロイドベータペプチド(Aβ1−42);及び
    z)ヒトIgE
    からなる群から選択されるタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項34に記載の組成物。
  36. 前記自己抗原が、アンギオテンシンペプチド又はその断片である、請求項34に記載の組成物。
  37. 前記第2の付着部位が、前記抗原又は抗原決定基内に天然に存在しない、請求項36に記載の組成物。
  38. 前記第2の付着部位が、スルフヒドリル基又はシステイン残基である又はそれを含む、請求項36に記載の組成物。
  39. 前記組成物がアミノ酸リンカーを含む、請求項36に記載の組成物。
  40. 前記アミノ酸リンカーが、前記第2の付着部位を含むか、あるいはそれからなる、請求項39に記載の組成物。
  41. 前記アミノ酸リンカーが、スルフヒドリル基又はシステイン残基を含む、請求項40に記載の組成物。
  42. 前記第2の付着部位を持つ前記アンギオテンシンペプチドが、
    a)CGGDRVYIHPFのアミノ酸配列;
    b)CGGDRVYIHPFHLのアミノ酸配列;
    c)DRVYIHPFHLGGCのアミノ酸配列;及び
    d)CDRVYIHPFHLのアミノ酸配列
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項36に記載の組成物。
  43. 前記自己抗原が、VEGFR-IIペプチド又はその断片である、請求項34に記載の組成物。
  44. 前記第2の付着部位が、前記抗原又は抗原決定基内に天然に存在しない、請求項43に記載の組成物。
  45. 前記第2の付着部位が、スルフヒドリル基又はシステイン残基である又はそれを含む、請求項43に記載の組成物。
  46. 前記組成物がアミノ酸リンカーを含む、請求項43に記載の組成物。
  47. 前記アミノ酸リンカーが、前記第2の付着部位を含むか、あるいはそれからなる、請求項46に記載の組成物。
  48. 前記アミノ酸リンカーが、スルフヒドリル基又はシステイン残基を含む、請求項47に記載の組成物。
  49. 前記第2の付着部位を持つ前記VEGFR-IIペプチドが、CTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKのアミノ酸配列を有する、請求項43に記載の組成物。
  50. 前記自己抗原が、腫瘍壊死因子α(TNF-α)、その断片又はTNF-αのペプチドである、請求項34に記載の組成物。
  51. 前記第2の付着部位が、前記抗原又は抗原決定基内に天然に存在しない、請求項50に記載の組成物。
  52. 前記第2の付着部位が、スルフヒドリル基又はシステイン残基である又はそれを含む、請求項50に記載の組成物。
  53. 前記組成物がアミノ酸リンカーを含む、請求項50に記載の組成物。
  54. 前記アミノ酸リンカーが、前記第2の付着部位を含むか、あるいはそれからなる、請求項53に記載の組成物。
  55. 前記アミノ酸リンカーが、スルフヒドリル基又はシステイン残基を含む、請求項54に記載の組成物。
  56. 前記第2の付着部位を持つ前記腫瘍壊死因子α(TNF-α)、その断片又はTNF-αのペプチドが、
    a)CSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQのアミノ酸配列;
    b)SSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQGGCのアミノ酸配列;及び
    c)CGGQLQWLNRRANAのアミノ酸配列
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項50に記載の組成物。
  57. 前記自己抗原が、レジスチン又はその断片である、請求項34に記載の組成物。
  58. 前記第2の付着部位が、前記抗原又は抗原決定基内に天然に存在しない、請求項57に記載の組成物。
  59. 前記第2の付着部位が、スルフヒドリル基又はシステイン残基である又はそれを含む、請求項57に記載の組成物。
  60. 前記組成物がアミノ酸リンカーを含む、請求項57に記載の組成物。
  61. 前記アミノ酸リンカーが、前記第2の付着部位を含むか、あるいはそれからなる、請求項60に記載の組成物。
  62. 前記アミノ酸リンカーが、スルフヒドリル基又はシステイン残基を含む、請求項61に記載の組成物。
  63. 前記第2の付着部位を持つ前記レジスチンタンパク質又はその断片が、
    a)配列番号:325のアミノ酸配列;
    b)配列番号:326のアミノ酸配列;及び
    c)配列番号:327のアミノ酸配列;
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項57に記載の組成物。
  64. 前記自己抗原が、
    a)リンホトキシンα(LTα)
    b)リンホトキシンβ(LTβ)
    c)LTα及びLTβの混合物又は組み合わせ
    からなる群から選択されるリンホトキシン又はその断片である、請求項34に記載の組成物。
  65. 前記第2の付着部位が、前記抗原又は抗原決定基内に天然に存在しない、請求項64に記載の組成物。
  66. 前記第2の付着部位が、スルフヒドリル基又はシステイン残基である又はそれを含む、請求項64に記載の組成物。
  67. 前記組成物がアミノ酸リンカーを含む、請求項64に記載の組成物。
  68. 前記アミノ酸リンカーが、前記第2の付着部位を含むか、あるいはそれからなる、請求項67に記載の組成物。
  69. 前記アミノ酸リンカーが、スルフヒドリル基又はシステイン残基を含む、請求項68に記載の組成物。
  70. 前記自己抗原がリンホトキシンβ又はその断片であり、前記第2の付着部位を持つ前記リンホトキシンβが、
    a)配列番号:346のアミノ酸配列;及び
    b)配列番号:347のアミノ酸配列;
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項64に記載の組成物。
  71. 前記自己抗原が、ヒト-MIF又はその断片である、請求項34に記載の組成物。
  72. 前記第2の付着部位が、前記抗原又は抗原決定基内に天然に存在しない、請求項71に記載の組成物。
  73. 前記第2の付着部位が、スルフヒドリル基又はシステイン残基である又はそれを含む、請求項71に記載の組成物。
  74. 前記組成物がアミノ酸リンカーを含む、請求項71に記載の組成物。
  75. 前記アミノ酸リンカーが、前記第2の付着部位を含むか、あるいはそれからなる、請求項74に記載の組成物。
  76. 前記アミノ酸リンカーが、スルフヒドリル基又はシステイン残基を含む、請求項75に記載の組成物。
  77. 前記第2の付着部位を持つ前記ヒト-MIFタンパク質又はその断片が、
    a)配列番号:310のアミノ酸配列;
    b)配列番号:311のアミノ酸配列;
    c)配列番号:312のアミノ酸配列;
    d)配列番号:313のアミノ酸配列;
    e)配列番号:314のアミノ酸配列;及び
    f)配列番号:315のアミノ酸配列;
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項71に記載の組成物。
  78. 前記自己抗原が、ヒト-RANKL又はその断片である、請求項34に記載の組成物。
  79. 前記自己抗原が、ヒト-RANKLの細胞外部分又はその断片である、請求項34に記載の組成物。
  80. 前記第2の付着部位が、前記抗原又は抗原決定基内に天然に存在しない、請求項78又は79に記載の組成物。
  81. 前記第2の付着部位が、スルフヒドリル基又はシステイン残基である又はそれを含む、請求項78又は79に記載の組成物。
  82. 前記組成物がアミノ酸リンカーを含む、請求項78又は79に記載の組成物。
  83. 前記アミノ酸リンカーが、前記第2の付着部位を含むか、あるいはそれからなる、請求項82に記載の組成物。
  84. 前記アミノ酸リンカーが、スルフヒドリル基又はシステイン残基を含む、請求項83に記載の組成物。
  85. 前記第2の付着部位を持つ前記ヒト-RANKL又はその断片が、配列番号:320のアミノ酸配列又はその断片を有する、請求項78に記載の組成物。
  86. 前記アミノ酸リンカーが、
    (a)CGG
    (b)N-末端ガンマ1-リンカー;
    (c)N-末端ガンマ3-リンカー;
    (d)Igヒンジ領域;
    (e)N-末端グリシンリンカー;
    (f)n=0−12かつk=0−5である場合の(G)C(G)
    (g)N-末端グリシン-セリンリンカー;
    (h)n=0−3、k=0−5、m=0−10,l=0−2である場合の(G)C(G)(S)(GGGGS)
    (i)GGC
    (k)GGC-NH2
    (l)C-末端ガンマ1-リンカー
    (m)C-末端ガンマ3-リンカー;
    (n)C-末端グリシンリンカー;
    (o)n=0−12かつk=0−5である場合の(G)C(G)
    (p)C-末端グリシン-セリンリンカー;
    (q)n=0−3、k=0−5、m=0−10,l=0−2及びo=0−8である場合
    の(G)(S)(GGGGS)(G)C(G)
    からなる群から選択される、請求項39、46、53、60、67、74又は82に記載の組成物。
  87. (a)(i)(1)非天然起源のコア粒子;及び、
    (2)天然起源のコア粒子
    からなる群から選択されるコア粒子、及び、
    (ii)少なくとも1つの第1の付着部位を有するオーガナイザー
    を含んでなる非天然分子骨格であって、
    前記オーガナイザーが前記コア粒子に少なくとも1つの共有結合により連結された非天然分子骨格、
    (b)少なくとも1つの第2の付着部位を持つ抗原又は抗原決定基であって、
    前記抗原又は抗原決定基が抗-イディオタイプ抗体又は抗-イディオタイプ抗体断片であり、前記第2の付着部位が、
    (i)前記抗原又は抗原決定基に天然に存在しない付着部位、及び、
    (ii)前記抗原又は抗原決定基に天然に存在する付着部位
    からなる群から選択される抗原又は抗原決定基、
    を含んでなる組成物において、
    前記第2の付着部位が、少なくとも1つの非ペプチド結合を介して前記第1の付着部位に結合することができ、そして、
    前記抗原又は抗原決定基及び前記骨格が前記結合を介して相互作用して、規則正しく繰り返される抗原アレイを形成する組成物。
  88. 前記結合が、少なくとも1つの共有結合による、請求項87に記載の組成物。
  89. 前記第1の付着部位がリジン残基であり、前記第2の付着部位がシステイン残基である、請求項87に記載の組成物。
  90. 前記コア粒子が、
    i)ウイルス;
    ii)ウイルス様粒子;
    iii)バクテリオファージ;
    iv)細菌性線毛;
    v)ウイルスキャプシド粒子;及び
    vi)(i)、(ii)、(iii)、(iv)又は(v)の組換え体
    からなる群から選択される、請求項87に記載の組成物。
  91. 前記コア粒子が、
    i)ウイルス様粒子;
    ii)細菌性線毛;及び
    iii)RNA-ファージのウイルス様粒子
    からなる群から選択される、請求項87に記載の組成物。
  92. 前記ウイルス様粒子が、
    (a)B型肝炎ウイルスの組換えタンパク質;
    (b)麻疹ウイルスの組換えタンパク質;
    (c)シンドビスウイルスの組換えタンパク質;
    (d)ロタウイルスの組換えタンパク質;
    (e)口蹄疫ウイルスの組換えタンパク質;
    (f)レトロウイルスの組換えタンパク質;
    (g)ノーウォークウイルスの組換えタンパク質;
    (h)アルファウイルスの組換えタンパク質;
    (i)ヒト乳頭腫ウイルスの組換えタンパク質;
    (j)ポリオーマウイルスの組換えタンパク質;
    (k)バクテリオファージの組換えタンパク質;及び
    (l)RNA-ファージの組換えタンパク質;
    (m)Qβ-ファージの組換えタンパク質;
    (n)GA-ファージの組換えタンパク質;
    (o)fr-ファージの組換えタンパク質;及び
    (p)Tyの組換えタンパク質
    からなる群から選択される組換えタンパク質又はその断片を含む、請求項91に記載の組成物。
  93. 前記ウイルス様粒子が、RNA-ファージの組換えタンパク質又はその断片を含むか、あるいはそれから実質的になる、請求項91に記載の組成物。
  94. 前記ウイルス様粒子が、
    a)バクテリオファージQβ;
    b)バクテリオファージR17;
    c)バクテリオファージfr;
    d)バクテリオファージGA;
    e)バクテリオファージSP;
    f)バクテリオファージMS2;
    g)バクテリオファージM11;
    h)バクテリオファージMX1;
    i)バクテリオファージNL95;
    k)バクテリオファージf2;及び
    l)バクテリオファージPP7;
    からなる群から選択されるRNA-ファージの組換えタンパク質又はその断片を含むか、あるいはそれから実質的になる、請求項91に記載の組成物。
  95. 前記ウイルス様粒子が、バクテリオファージQβ又はバクテリオファージfrの組換えタンパク質又はその断片を含むか、あるいはそれから実質的になる、請求項105に記載の組成物。
  96. 前記第2の付着部位が、前記抗原又は抗原決定基内に天然に存在しない、請求項87に記載の組成物。
  97. 前記組成物がアミノ酸リンカーを含む、請求項96に記載の組成物。
  98. 前記アミノ酸リンカーが、前記第2の付着部位を含むか、あるいはそれからなる、請求項97に記載の組成物。
  99. 前記アミノ酸リンカーが、スルフヒドリル基又はシステイン残基を含む、請求項98に記載の組成物。
  100. (a)(i)(1)非天然起源のコア粒子;及び、
    (2)天然起源のコア粒子
    からなる群から選択されるコア粒子、及び、
    (ii)少なくとも1つの第1の付着部位を有するオーガナイザー
    を含んでなる非天然分子骨格であって、
    前記オーガナイザーが前記コア粒子に少なくとも1つの共有結合により連結された非天然分子骨格、
    (b)少なくとも1つの第2の付着部位を持つ抗原又は抗原決定基であって、
    前記抗原又は抗原決定基が自己抗原又はその断片であり、前記第2の付着部位が、
    (i)前記抗原又は抗原決定基に天然に存在しない付着部位、及び、
    (ii)前記抗原又は抗原決定基に天然に存在する付着部位
    からなる群から選択される抗原又は抗原決定基、
    を含んでなる組成物において、
    前記第2の付着部位が、少なくとも1つの非ペプチド結合を介して前記第1の付着部位に結合することができ、そして、
    前記抗原又は抗原決定基及び前記骨格が前記結合を介して相互作用して、規則正しく繰り返される抗原アレイを形成する、組成物。
  101. 前記結合が、少なくとも1つの共有結合による、請求項100に記載の組成物。
  102. 前記第1の付着部位がリジン残基であり、前記第2の付着部位がシステイン残基である、請求項100に記載の組成物。
  103. 前記コア粒子が、
    i)ウイルス;
    ii)ウイルス様粒子;
    iii)バクテリオファージ;
    iv)細菌性線毛;
    v)ウイルスキャプシド粒子;及び
    vi)(i)、(ii)、(iii)、(iv)又は(v)の組換え体
    からなる群から選択される、請求項100に記載の組成物。
  104. 前記オーガナイザーが、ポリペプチド又はその残基であり、前記第2の付着部位がポリペプチド又はその残基である、請求項103に記載の組成物。
  105. 前記コア粒子がウイルス様粒子である、請求項100又は103に記載の組成物。
  106. 前記ウイルス様粒子が、配列番号:158のアミノ酸1−147を含むポリペプチドの二量体又は多量体である、請求項105に記載の組成物。
  107. 前記ウイルス様粒子が、配列番号:158のアミノ酸1−152を含むポリペプチドの二量体又は多量体である、請求項106に記載の組成物。
  108. 前記第1の付着部位がアミノ基であるかそれを含み、前記第2の付着部位がスルフヒドリル基であるかそれを含む、請求項105に記載の組成物。
  109. 前記ウイルス様粒子が、B型肝炎ウイルスキャプシドタンパク質である、請求項105に記載の組成物。
  110. 前記第1の付着部位がリジン残基であるかそれを含み、前記第2の付着部位がシステイン残基であるかそれを含む、請求項109に記載の組成物。
  111. 前記B型肝炎ウイルスキャプシドタンパク質の1又は複数のシステイン残基が、欠失されているか他のアミノ酸残基で置換されている、請求項110に記載の組成物。
  112. 前記B型肝炎ウイルスキャプシドタンパク質が、
    a)配列番号:89のアミノ酸配列;
    b)配列番号:90のアミノ酸配列;
    c)配列番号:93のアミノ酸配列;
    d)配列番号:98のアミノ酸配列;
    e)配列番号:99のアミノ酸配列;
    f)配列番号:102のアミノ酸配列;
    g)配列番号:104のアミノ酸配列;
    h)配列番号:105のアミノ酸配列;
    i)配列番号:106のアミノ酸配列;
    j)配列番号:119のアミノ酸配列;
    k)配列番号:120のアミノ酸配列;
    l)配列番号:123のアミノ酸配列;
    m)配列番号:125のアミノ酸配列;
    n)配列番号:131のアミノ酸配列;
    o)配列番号:132のアミノ酸配列;
    p)配列番号:134のアミノ酸配列;
    q)配列番号:157のアミノ酸配列;及び
    r)配列番号:158のアミノ酸配列;
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項110に記載の組成物。
  113. 前記B型肝炎ウイルスキャプシドタンパク質の1又は複数のシステイン残基が、欠失されているか他のアミノ酸残基で置換されている、請求項112に記載の組成物。
  114. 配列番号:134のアミノ酸48及び107に相当するシステイン残基が、欠失されているか他のアミノ酸残基で置換されている、請求項113に記載の組成物。
  115. 前記B型肝炎ウイルスキャプシドタンパク質の1又は複数のリジン残基が、欠失されているか他のアミノ酸残基で置換されている、請求項112に記載の組成物。
  116. 前記コア粒子が細菌性線毛である、請求項100に記載の組成物。
  117. 前記細菌性線毛が大腸菌のタイプ-1線毛である、請求項100に記載の組成物。
  118. 前記タイプ-1線毛のピリンサブユニットが、配列番号:146に示すアミノ酸配列を含む、請求項117に記載の組成物。
  119. 前記コア粒子が、細菌性ピリンポリペプチドを含む、請求項100に記載の組成物。
  120. 前記細菌性ピリンポリペプチドが、配列番号:146に示すアミノ酸配列を含む、請求項119に記載の組成物。
  121. 前記ウイルス様粒子が、
    (a)B型肝炎ウイルスの組換えタンパク質;
    (b)麻疹ウイルスの組換えタンパク質;
    (c)シンドビスウイルスの組換えタンパク質;
    (d)ロタウイルスの組換えタンパク質;
    (e)口蹄疫ウイルスの組換えタンパク質;
    (f)レトロウイルスの組換えタンパク質;
    (g)ノーウォークウイルスの組換えタンパク質;
    (h)アルファウイルスの組換えタンパク質;
    (i)ヒト乳頭腫ウイルスの組換えタンパク質;
    (j)ポリオーマウイルスの組換えタンパク質;
    (k)バクテリオファージの組換えタンパク質;及び
    (l)RNA-ファージの組換えタンパク質;
    (m)Qβ-ファージの組換えタンパク質;
    (n)GA-ファージの組換えタンパク質;
    (o)fr-ファージの組換えタンパク質;及び
    (p)Tyの組換えタンパク質
    からなる群から選択される組換えタンパク質又はその断片を含む、請求項105に記載の組成物。
  122. 前記ウイルス様粒子が、RNA-ファージの組換えタンパク質又はその断片を含むか、あるいはそれから実質的になる、請求項105に記載の組成物。
  123. 前記ウイルス様粒子が、
    a)バクテリオファージQβ;
    b)バクテリオファージR17;
    c)バクテリオファージfr;
    d)バクテリオファージGA;
    e)バクテリオファージSP;
    f)バクテリオファージMS2;
    g)バクテリオファージM11;
    h)バクテリオファージMX1;
    i)バクテリオファージNL95;
    k)バクテリオファージf2;及び
    l)バクテリオファージPP7;
    からなる群から選択されるRNA-ファージの組換えタンパク質又はその断片を含むか、あるいはそれから実質的になる、請求項105に記載の組成物。
  124. 前記ウイルス様粒子が、バクテリオファージQβ又はバクテリオファージfrの組換えタンパク質又はその断片を含むか、あるいはそれから実質的になる、請求項105に記載の組成物。
  125. 前記コア粒子が、
    i)ウイルス様粒子;
    ii)細菌性線毛;及び
    iii)RNA-ファージのウイルス様粒子
    からなる群から選択される、請求項100に記載の組成物。
  126. 前記第2の付着部位が、前記抗原又は抗原決定基内に天然に存在しない、請求項105、109、112、116、122、123又は124に記載の組成物。
  127. 前記組成物がアミノ酸リンカーを含む、請求項126に記載の組成物。
  128. 前記アミノ酸リンカーが、前記抗原又は前記抗原決定基に少なくとも1つの共有結合によって結合した、請求項127に記載の組成物。
  129. 前記共有結合がペプチド結合である、請求項128に記載の組成物。
  130. 前記アミノ酸リンカーが、前記第2の付着部位を含むか、あるいはそれからなる、請求項127に記載の組成物。
  131. 前記アミノ酸リンカーが、スルフヒドリル基又はシステイン残基を含む、請求項130に記載の組成物。
  132. 前記アミノ酸リンカーが、
    (a)CGG
    (b)N-末端ガンマ1-リンカー;
    (c)N-末端ガンマ3-リンカー;
    (d)Igヒンジ領域;
    (e)N-末端グリシンリンカー;
    (f)n=0−12かつk=0−5である場合の(G)C(G)
    (g)N-末端グリシン-セリンリンカー;
    (h)n=0−3、k=0−5、m=0−10,l=0−2である場合の(G)C(G)(S)(GGGGS)
    (i)GGC
    (k)GGC-NH2
    (l)C-末端ガンマ1-リンカー
    (m)C-末端ガンマ3-リンカー;
    (n)C-末端グリシンリンカー;
    (o)n=0−12かつk=0−5である場合の(G)C(G)
    (p)C-末端グリシン-セリンリンカー;
    (q)n=0−3、k=0−5、m=0−10,l=0−2及びo=0−8である場合
    の(G)(S)(GGGGS)(G)C(G)
    からなる群から選択される、請求項130に記載の組成物。
  133. 前記自己抗原が、
    a)リンホトキシン;
    b)リンホトキシンレセプター;
    c)RANKL;
    d)VEGF;
    e)VEGF-R;
    f)インターロイキン5;
    g)インターロイキン17;
    h)インターロイキン13;
    i)CCL21;
    k)CXCL12;
    l)SDF-1;
    m)MCP-1;
    n)レジスチン;
    o)GHRH;
    p)LHRH;
    q)TRH;
    r)MIF;
    s)エオタキシン;
    t)BLC;
    u)ヒトIgE
    からなる群から選択されるタンパク質である、請求項100に記載の組成物。
  134. 前記自己抗原が、
    a)リンホトキシン;
    b)リンホトキシンレセプター;
    c)RANKL;
    d)VEGF;
    e)VEGFR;
    f)インターロイキン5;
    g)インターロイキン17;
    h)インターロイキン13;
    i)アンギオテンシン;
    k)CCL21;
    l)CXCL12;
    m)SDF-1;
    n)MCP-1;
    o)エンドグリン;
    p)レジスチン;
    q)GHRH;
    r)LHRH;
    s)TRH;
    t)MIF;
    u)エオタキシン;
    v)ブラジキニン;
    w)BLC;
    x)腫瘍壊死因子α(TNFα);
    y)アミロイドベータペプチド(Aβ1−42);及び
    z)ヒトIgE
    からなる群から選択されるタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項100に記載の組成物。
  135. (a)(i)(1)非天然起源のコア粒子;及び、
    (2)天然起源のコア粒子
    からなる群から選択されるコア粒子、及び、
    (ii)少なくとも1つの第1の付着部位を有するオーガナイザー
    を含んでなる非天然分子骨格であって、
    前記オーガナイザーが前記コア粒子に少なくとも1つの共有結合により連結され、前記コア粒子がバクテリオファージの組換えタンパク質、又はその断片を含むウイルス様粒子である非天然分子骨格、
    (b)少なくとも1つの第2の付着部位を持つ抗原又は抗原決定基であって、
    前記第2の付着部位が、
    (i)前記抗原又は抗原決定基に天然に存在しない付着部位、及び、
    (ii)前記抗原又は抗原決定基に天然に存在する付着部位
    からなる群から選択される抗原又は抗原決定基、
    を含んでなる組成物において、
    前記第2の付着部位が、少なくとも1つの非ペプチド結合を介して前記第1の付着部位に結合することができ、そして、
    前記抗原又は抗原決定基及び前記骨格が前記結合を介して相互作用して、規則正しく繰り返される抗原アレイを形成する組成物。
  136. 前記結合が、少なくとも1つの共有結合による、請求項135に記載の組成物。
  137. 前記1つの共有結合が、非ペプチド結合である、請求項136に記載の組成物。
  138. 前記コア粒子が、
    i)ウイルス;
    ii)ウイルス様粒子;
    iii)バクテリオファージ;
    iv)細菌性線毛;
    v)ウイルスキャプシド粒子;及び
    vi)(i)、(ii)、(iii)、(iv)又は(v)の組換え体
    からなる群から選択される、請求項135に記載の組成物。
  139. 前記コア粒子が、
    i)ウイルス様粒子;
    ii)細菌性線毛;及び
    iii)RNA-ファージのウイルス様粒子
    からなる群から選択される、請求項135に記載の組成物。
  140. 前記ウイルス様粒子が、
    (a)B型肝炎ウイルスの組換えタンパク質;
    (b)麻疹ウイルスの組換えタンパク質;
    (c)シンドビスウイルスの組換えタンパク質;
    (d)ロタウイルスの組換えタンパク質;
    (e)口蹄疫ウイルスの組換えタンパク質;
    (f)レトロウイルスの組換えタンパク質;
    (g)ノーウォークウイルスの組換えタンパク質;
    (h)アルファウイルスの組換えタンパク質;
    (i)ヒト乳頭腫ウイルスの組換えタンパク質;
    (j)ポリオーマウイルスの組換えタンパク質;
    (k)バクテリオファージの組換えタンパク質;及び
    (l)RNA-ファージの組換えタンパク質;
    (m)Qβ-ファージの組換えタンパク質;
    (n)GA-ファージの組換えタンパク質;
    (o)fr-ファージの組換えタンパク質;及び
    (p)Tyの組換えタンパク質
    からなる群から選択される組換えタンパク質又はその断片を含む、請求項139に記載の組成物。
  141. 前記ウイルス様粒子が、RNA-ファージの組換えタンパク質又はその断片を含むか、あるいはそれから実質的になる、請求項139に記載の組成物。
  142. 前記ウイルス様粒子が、
    a)バクテリオファージQβ;
    b)バクテリオファージR17;
    c)バクテリオファージfr;
    d)バクテリオファージGA;
    e)バクテリオファージSP;
    f)バクテリオファージMS2;
    g)バクテリオファージM11;
    h)バクテリオファージMX1;
    i)バクテリオファージNL95;
    k)バクテリオファージf2;及び
    l)バクテリオファージPP7;
    からなる群から選択されるRNA-ファージの組換えタンパク質又はその断片を含むか、あるいはそれから実質的になる、請求項139に記載の組成物。
  143. 前記ウイルス様粒子が、バクテリオファージQβ又はバクテリオファージfrの組換えタンパク質又はその断片を含むか、あるいはそれから実質的になる、請求項139に記載の組成物。
  144. 前記第1及び/又は第2の付着部位が、
    (k)抗原及びそれに対する抗体又は抗体断片;
    (l)ビオチン及びアビジン;
    (m)ストレプトアビジン及びビオチン;
    (n)レセプター及びそのリガンド;
    (o)リガンド結合性タンパク質及びそのリガンド
    (p)相互作用するロイシンジッパーポリペプチド;
    (q)アミノ基及びそれと反応性の化学基;
    (r)カルボキシル基及びそれと反応性の化学基;
    (s)スルフヒドリル基及びそれと反応性の化学基;又は
    (t)これらの組み合わせ
    を含む、請求項135に記載の組成物。
  145. 前記第1の付着部位がアミノ基であり、第2の付着部位がスルフヒドリル基である、請求項135に記載の組成物。
  146. 前記第1の付着部位がリジン残基であり、第2の付着部位がシステイン残基である、請求項135に記載の組成物。
  147. 前記第2の付着部位が、前記抗原又は抗原決定基内に天然に存在しない、請求項135に記載の組成物。
  148. 前記第1の付着部位がアミノ基であり、第2の付着部位がスルフヒドリル基である、請求項147に記載の組成物。
  149. 前記第1の付着部位がリジン残基であり、第2の付着部位がシステイン残基である、請求項147に記載の組成物。
  150. 前記第2の付着部位が、スルフヒドリル基又はシステイン残基である又はそれを含む、請求項147に記載の組成物。
  151. 前記組成物がアミノ酸リンカーを含む、請求項147に記載の組成物。
  152. 前記アミノ酸リンカーが、少なくとも1つの共有結合によって前記抗原又は抗原決定基に結合した、請求項150に記載の組成物。
  153. 前記アミノ酸リンカーが、前記第2の付着部位を含むか、あるいはそれからなる、請求項151に記載の組成物。
  154. 前記アミノ酸リンカーが、スルフヒドリル基又はシステイン残基を含む、請求項152に記載の組成物。
  155. 前記アミノ酸リンカーが、
    (a)CGG
    (b)N-末端ガンマ1-リンカー;
    (c)N-末端ガンマ3-リンカー;
    (d)Igヒンジ領域;
    (e)N-末端グリシンリンカー;
    (f)n=0−12かつk=0−5である場合の(G)C(G)
    (g)N-末端グリシン-セリンリンカー;
    (h)n=0−3、k=0−5、m=0−10,l=0−2である場合の(G)C(G)(S)(GGGGS)
    (i)GGC
    (k)GGC-NH2
    (l)C-末端ガンマ1-リンカー
    (m)C-末端ガンマ3-リンカー;
    (n)C-末端グリシンリンカー;
    (o)n=0−12かつk=0−5である場合の(G)C(G)
    (p)C-末端グリシン-セリンリンカー;
    (q)n=0−3、k=0−5、m=0−10,l=0−2及びo=0−8である場合
    の(G)(S)(GGGGS)(G)C(G)
    からなる群から選択される、請求項152に記載の組成物。
  156. 前記抗原が、
    (a)癌細胞に対する免疫反応を誘発するのに適したタンパク質;
    (b)感染性疾患に対する免疫反応を誘発するのに適したタンパク質;
    (c)アレルゲンに対する免疫反応を誘発するのに適したタンパク質;及び、
    (d)家畜又はペットにおける免疫反応を誘発するのに適したタンパク質;
    からなる群から選択されるタンパク質又はそれらの断片である、請求項135に記載の組成物。
  157. 前記抗原が、
    (a)HIVの組換えタンパク質;
    (b)インフルエンザウイルスの組換えタンパク質;
    (c)C型肝炎ウイルスの組換えタンパク質;
    (d)トキソプラズマの組換えタンパク質;
    (e)熱帯熱マラリア原虫の組換えタンパク質;
    (f)三日熱マラリア原虫の組換えタンパク質;
    (g)卵形マラリア原虫の組換えタンパク質;
    (h)四日熱マラリア原虫の組換えタンパク質;
    (i)乳癌細胞の組換えタンパク質;
    (j)腎臓癌細胞の組換えタンパク質;
    (k)前立腺癌細胞の組換えタンパク質;
    (l)皮膚癌細胞の組換えタンパク質;
    (m)脳癌細胞の組換えタンパク質;
    (n)白血病細胞の組換えタンパク質;
    (o)組換えプロフィリン;
    (p)ハチ刺されアレルギーの組換えタンパク質;
    (q)ナッツアレルギーの組換えタンパク質;
    (r)食物アレルギーの組換えタンパク質;
    (s)喘息の組換えタンパク質;又は
    (t)クラミジア属の組換えタンパク質;
    である、請求項155に記載の組成物。
  158. 前記抗原又は抗原決定基が、
    a)ホスホリパーゼAタンパク質;
    b)ヒトIgE;
    c)リンホトキシン;
    d)インフルエンザM2タンパク質;及び
    e)Der p Iペプチド
    からなる群から選択されるペプチド、タンパク質、又はそれらの断片である、請求項135に記載の組成物。
  159. 前記抗原又は抗原決定基が、Der p Iペプチド又はその断片である、請求項157に記載の組成物。
  160. 前記第2の付着部位を持つ前記Der p Iペプチドが、
    a)CGNQSLDLAEQELVDCASQHGCH;及び
    b)CQIYPPNANKIREALAQTHSA
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項158に記載の組成物。
  161. 前記抗原又は抗原決定基が、ホスホリパーゼAタンパク質又はその断片である、請求項157に記載の組成物。
  162. 前記ホスホリパーゼA2タンパク質が、
    a)配列番号:168のアミノ酸配列;
    b)配列番号:169のアミノ酸配列;
    c)配列番号:170のアミノ酸配列;
    d)配列番号:171のアミノ酸配列;
    e)配列番号:172のアミノ酸配列;
    f)配列番号:173のアミノ酸配列;
    g)配列番号:174のアミノ酸配列;及び
    h)配列番号:175のアミノ酸配列;
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項160に記載の組成物。
  163. 前記抗原又は抗原決定基が、ヒトIgE又はその断片である、請求項157に記載の組成物。
  164. 前記ヒトIgEが、配列番号:176のアミノ酸配列を有する、請求項162に記載の組成物。
  165. 前記抗原又は抗原決定基が、インフルエンザM2タンパク質又はその断片である、請求項1163に記載の組成物。
  166. バクテリオファージコートタンパク質、細菌性線毛、HbcAg及びそれらの断片からなる群から選択されるタンパク質に共有結合により付着したインフルエンザM2タンパク質又はその断片を含んでなる組成物。
  167. 前記タンパク質がバクテリオファージコートタンパク質又はその断片である、請求項165に記載の組成物。
  168. 前記タンパク質が細菌性線毛である、請求項165に記載の組成物。
  169. 前記タンパク質がHBcAgであり、前記共有結合がペプチド結合ではない、請求項165に記載の組成物。
  170. 前記タンパク質がバクテリオファージコートタンパク質又はその断片、あるいは細菌性線毛又はその断片であり、共有結合が非ペプチド結合である、請求項165に記載の組成物。
  171. 前記タンパク質がバクテリオファージコートタンパク質又はその断片、あるいは細菌性線毛又はその断片であり、共有結合がペプチド結合である、請求項165に記載の組成物。
  172. 前記バクテリオファージコートタンパク質が、
    a)バクテリオファージQβ;
    b)バクテリオファージR17;
    c)バクテリオファージfr;
    d)バクテリオファージGA;
    e)バクテリオファージSP;
    f)バクテリオファージMS2;
    g)バクテリオファージM11;
    h)バクテリオファージMX1;
    i)バクテリオファージNL95;
    k)バクテリオファージf2;及び
    l)バクテリオファージPP7;
    からなる群から選択されるバクテリオファージのコートタンパク質を含む、請求項165に記載の組成物。
  173. 前記バクテリオファージコートタンパク質が、バクテリオファージQβを含む、請求項171に記載の組成物。
  174. a)請求項1、87、100、135又は165に記載の組成物;及び
    b)許容可能な製薬担体
    を含んでなる製薬組成物。
  175. 請求項1、87、100、135又は165に記載の組成物であって、該組成物を患者に投与することを含む免疫化方法に使用される請求項1、87、100、135又は165に記載の組成物。
  176. 請求項1、87、100、135又は165に記載の組成物を含んでなるワクチン組成物。
  177. アジュバントを更に含む、請求項160に記載のワクチン組成物。
  178. 非自然発生の、規則正しく繰り返された抗原アレイの製造方法において、
    (a)(i)(1)非天然起源のコア粒子;及び、
    (2)天然起源のコア粒子
    からなる群から選択されるコア粒子、及び、
    (ii)少なくとも1つの第1の付着部位を有するオーガナイザー
    を含んでなる非天然分子骨格であって、
    前記オーガナイザーが前記コア粒子に少なくとも1つの共有結合により連結された非天然分子骨格を提供し、
    (b)少なくとも1つの第2の付着部位を持つ抗原又は抗原決定基であって、
    前記抗原又は抗原決定基が自己抗原又はその断片であり、前記第2の付着部位が、
    (i)前記抗原又は抗原決定基に天然に存在しない付着部位、及び、
    (ii)前記抗原又は抗原決定基に天然に存在する付着部位
    からなる群から選択され、
    前記第2の付着部位が、少なくとも1つの非ペプチド結合を介して前記第1の付着部位に結合することができる抗原又は抗原決定基を提供し、
    (c)前記非天然分子骨格と前記抗原又は抗原決定基とを結合させることを含み、
    前記抗原又は抗原決定基と前記骨格とが前記結合を介して相互作用して、規則正しく繰り返される抗原アレイを形成する方法。
  179. 前記オーガナイザーが、ポリペプチド又はその残基であり、前記第2の付着部位がポリペプチド又はその残基である、請求項177に記載の方法。
  180. 前記コア粒子がウイルス様粒子である、請求項177又は178に記載の方法。
  181. 前記コア粒子がウイルス様粒子、配列番号:158のアミノ酸1−147を含むポリペプチドの二量体又は多量体である、請求項179に記載の方法。
  182. 前記ウイルス様粒子が、配列番号:158のアミノ酸1−152を含むポリペプチドの二量体又は多量体である、請求項179に記載の方法。
  183. 前記ポリペプチドの1又は複数のシステイン残基が、欠失されているか他のアミノ酸残基で置換されている、請求項180に記載の方法。
  184. 配列番号:134のアミノ酸48及び107に相当するシステイン残基が、欠失されているか他のアミノ酸残基で置換されている、請求項181に記載の方法。
  185. 前記ポリペプチドの1又は複数のリジン残基が、欠失されているか他のアミノ酸残基で置換されている、請求項182に記載の方法。
  186. 前記結合が少なくとも1つの共有結合による、請求項177に記載の方法。
  187. 前記共有結合が非ペプチド結合である、請求項185に記載の方法。
  188. 非自然発生の、規則正しく繰り返された抗原アレイの製造方法において、
    (a)(i)コア粒子、及び、
    (ii)少なくとも1つの第1の付着部位を有するオーガナイザー
    を含んでなる非天然分子骨格であって、
    前記オーガナイザーが前記コア粒子に少なくとも1つの共有結合により連結され、前記コア粒子がバクテリオファージの組換えタンパク質又はその断片を含むウイルス様粒子である非天然分子骨格を提供し、
    (b)少なくとも1つの第2の付着部位を持つ抗原又は抗原決定基であって、
    前記第2の付着部位が、
    (i)前記抗原又は抗原決定基に天然に存在しない付着部位、及び、
    (ii)前記抗原又は抗原決定基に天然に存在する付着部位
    からなる群から選択され、
    前記第2の付着部位が、少なくとも1つの非ペプチド結合を介して前記第1の付着部位に結合することができる抗原又は抗原決定基を提供し、
    (c)前記非天然分子骨格と前記抗原又は抗原決定基とを結合させることを含み、
    前記抗原又は抗原決定基と前記骨格とが前記結合を介して相互作用して、規則正しく繰り返される抗原アレイを形成する方法。
  189. 前記結合が少なくとも1つの共有結合による、請求項187に記載の組成物。
  190. 前記共有結合が非ペプチド結合である、請求項188に記載の組成物。
  191. a)配列番号:255のアミノ酸配列;
    b)配列番号:256のアミノ酸配列;
    c)配列番号:257のアミノ酸配列;
    d)配列番号:258のアミノ酸配列;及び
    e)配列番号:259のアミノ酸配列;
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する変異体Qβコートタンパク質を含むキャプシドを形成することのできるコートタンパク質。
  192. 少なくとも1つの抗原又は抗原決定基が結合した、請求項190に記載のコートタンパク質。
  193. a)配列番号:255のアミノ酸配列;
    b)配列番号:256のアミノ酸配列;
    c)配列番号:257のアミノ酸配列;
    d)配列番号:258のアミノ酸配列;
    e)配列番号:259のアミノ酸配列;及び
    f)a)−e)及び対応するA1タンパク質の何れかの混合物
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する変異体Qβコートタンパク質から実質的になるキャプシドを形成することのできるコートタンパク質。
  194. 少なくとも1つの抗原又は抗原決定基が結合した、請求項192に記載のコートタンパク質。
  195. 前記自己抗原が、リンホトキシンのタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
  196. 前記自己抗原が、リンホトキシンレセプターのタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
  197. 前記自己抗原が、RANKLのタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
  198. 前記自己抗原が、VEGFのタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
  199. 前記自己抗原が、VEGF-Rのタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
  200. 前記自己抗原が、インターロイキン5のタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
  201. 前記自己抗原が、インターロイキン17のタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
  202. 前記自己抗原が、インターロイキン13のタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
  203. 前記自己抗原が、アンギオテンシンのタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
  204. 前記自己抗原が、CCL21のタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
  205. 前記自己抗原が、CXCL12のタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
  206. 前記自己抗原が、SDF-1のタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
  207. 前記自己抗原が、MCP-1のタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
  208. 前記自己抗原が、エンドグリンのタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
  209. 前記自己抗原が、レジスチンのタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
  210. 前記自己抗原が、GHRHのタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
  211. 前記自己抗原が、LHRHのタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
  212. 前記自己抗原が、TRHのタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
  213. 前記自己抗原が、MIFのタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
  214. 前記自己抗原が、エオタキシンのタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
  215. 前記自己抗原が、ブラジキニンのタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
  216. 前記自己抗原が、BLCのタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
  217. 前記自己抗原が、腫瘍壊死因子α(TNFα)のタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
  218. 前記自己抗原が、アミロイドベータペプチド(Aβ1−42)のタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
  219. 前記自己抗原が、ヒトIgEのタンパク質、ペプチド又はそれらの断片である、請求項1又は100に記載の組成物。
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