ES2344302T3 - Alfa glucosidasa acida y fragmentos de la misma. - Google Patents
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Abstract
Una proteína de fusión terapéutica dirigida que comprende un agente terapéutico que comprende los restos aminoacídicos 70-952 de la GAA humana, estando los restos 1-69 delecionados y un marcador peptídico, en el que el marcador peptídico se une directa o indirectamente al resto aminoacídico 70 de la GAA humana y dicho marcador comprende el resto 1 del IGF-II seguido por los restos 8-67, estando los restos 2-7 delecionados.
Description
Alfa glucosidasa ácida y fragmentos de la
misma.
La presente solicitud reivindica el beneficio
del documento de Estados Unidos Nº de Serie 60/543.812 presentado
el 10 de febrero de 2004.
La alfa glucosidasa ácida (GAA) es una enzima
lisosomal que hidroliza el enlace alfa 1-4 en
maltosa y otros oligosacáridos lineales, incluyendo las
ramificaciones externas del glucógeno, degradando de esta manera el
exceso de glucógeno en el lisosoma (Hirschhorn y col. (2001) en The
Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease, Scriver, y
col., eds. (2001), McGraw-Hill: Nueva York, págs.
3389-3420). Al igual que otras enzimas lisosomales
de mamíferos, la GAA se sintetiza en el citosol y atraviesa el RE
donde se glicosila con carbohidratos de tipo alto contenido en
manosa, unidos a N. En el aparato de Golgi, el carbohidrato de alto
contenido en manosa se modifica en proteínas lisosomales por la
adición de manosa-6-fosfato (M6P)
que dirige estas proteínas al lisosoma. Las proteínas modificadas
con M6P se suministran al lisosoma mediante la interacción con cada
uno de dos receptores de M6P. La forma de modificación más favorable
es cuando se añaden dos M6P a un carbohidrato de alto contenido en
manosa.
La actividad de GAA insuficiente en el lisosoma
da como resultado la enfermedad de Pompe, una enfermedad también
conocida como deficiencia de maltasa ácida (AMD), enfermedad de
almacenamiento de glucógeno de tipo II (GSDII), glucogénesis de
tipo II o deficiencia de GAA. La actividad enzimática disminuida se
produce debido a una diversidad de mutaciones erróneas y sin
sentido en el gen que codifica la GAA. Por consiguiente, el
glucógeno se acumula en los lisosomas de todas las células en
pacientes con la enfermedad de Pompe. En particular, la acumulación
de glucógeno es más pronunciada en los lisosomas del músculo
cardiaco y esquelético, hígado y otros tejidos. El glucógeno
acumulado en última instancia perjudica la función muscular. En las
formas más graves de la enfermedad de Pompe, la muerte se produce
después de dos años de edad debido a fallos
cardiorrespiratorios.
Actualmente, no se ha aprobado ningún
tratamiento disponible para curar o retrasar el progreso de la
enfermedad de Pompe. Las terapias de reemplazo enzimático
actualmente en ensayos clínicos requieren que las células del los
tejidos muscular y hepático capten la GAA administrada recombinante
y se transporten a los lisosomas en estas células de una manera
dependiente de M6P. Sin embargo, la GAA recombinante producida en
células CHO modificadas por ingeniería genética y en la leche de
conejos transgénicos, dos fuentes de enzimas usadas en ensayos
recientes de terapia de reemplazo enzimático de Pompe, contiene muy
poca M6P (Van Hove y col. (1996) Proc Natl Acad Sci USA, 93 (1):
65-70; y en la Patente de Estados Unidos Nº
6.537.785). Por lo tanto, el suministro dependiente de M6P de la
GAA recombinante a los lisosomas no es eficaz, necesitando dosis
elevadas e infusiones frecuentes. Por consiguiente, sigue
existiendo una necesidad de procedimientos nuevos, más simples, más
eficaces y más rentables para dirigir la enzima GAA terapéutica a
los lisosomas de los pacientes.
La presente invención permite el
direccionamiento independiente de MP6 de las enzimas GAA o de tipo
GAA humanas a los lisosomas del paciente usando una estrategia de
direccionamiento basada en marcadores peptídicos. Como resultado,
la presente invención proporciona el suministro eficaz de las
enzimas GAA o de tipo GAA hacia las células diana.
La invención se refiere, en parte, al
descubrimiento de que la GAA puede expresarse de manera recombinante
usando una pluralidad de fases de lectura abierta que codifican
polipéptidos que representan diferentes partes de la proteína GAA.
Cuando se proporcionan juntas, los polipéptidos resultantes pueden
cooperar para proporcionar la actividad enzimática deseada.
Por consiguiente, la presente invención se
refiere en un aspecto a una proteína de fusión terapéutica dirigida
como se define en las reivindicaciones.
Las Figuras 1-1 a
1-14 representan un alineamiento de secuencias de
aminoácidos de los miembros seleccionados de 31 familias de
glucósido hidrolasas.
La Figura 2 es una representación esquemática de
la proteína GAA.
La Figura 3 representa estrategias ejemplares
para la creación de una GAA marcada con péptidos.
La Figura 4 representa un experimento de
captación ejemplar usando GAA de tipo silvestre y
SS-GAA\Delta1-69.
La Figura 5 representa un experimento de
captación ejemplar usando
SS-GAA\Delta1-69 y
SS-GILT\Delta2-7-GAA\Delta1-69.
La Figura 6 representa un análisis de
transferencia de Western ejemplar de las proteínas GAA marcadas con
1-87-IGF-II; el
panel de la izquierda se probó con un anticuerpo
anti-GAA; el panel de la derecha se probó con un
anticuerpo anti-IGF-II. Carril 1:
pCEP-GILT1-87-GAA56-952;
carril 2:
pCEP-GILT1-87-R68A-GAA56-952-1;
carril 3:
pCEP-GILT1-87-R68A-\DeltaGS-GAA56-952-1;
carril 4:
pCEP-GILT\Delta2-7-spcr1-GAA70-952-1;
carril 5: pCEP-GAA; carril 6:
pCEP-GILT-GAA29-952.
La Figura 7 representa un análisis de
transferencia de Western ejemplar comparando la proteolisis de la
GAA de tipo silvestre con la GAA-791Asc.
La Figura 8 representa un análisis de
transferencia de Western ejemplar de construcciones de la GAA de
tipo silvestre y de la GAA con un marcador GILT modificado por
ingeniería genética con un sitio proteasa de Factor X corriente
abajo, GAA787GILTXa, GAA779GILTXa y GAA796GILTXa. También representa
un modelo de procesamiento de GAA C-terminal.
La presente invención proporciona un medio para
la producción de GAA que es más eficaz dirigiendo a los lisosomas
de las células de mamíferos, por ejemplo, células del músculo
cardíaco y esquelético humano. La GAA es un miembro de 31 familias
de glucósido hidrolasas (Figuras 1-1 a
1-14). La GAA humana se sintetiza como un precursor
de 110 kDal (Wisselaar y col. (1993) J. Biol. Chem. 268 (3):
2223-31). La forma madura de la enzima es una
mezcla de monómeros de 70 y 76 kDal (Wisselaar y col. (1993) J.
Biol. Chem. 268(3): 2223-31). La enzima
precursora tiene siete sitios potenciales de glicosilación y cuatro
de éstos se conservan en la enzima madura (Wisselaar y col. (1993)
J. Biol. Chem. 268(3): 2223-31). Los eventos
de escisión proteolítica que producen la enzima madura ocurren en
endosomas tardíos o en el lisosoma (Wisselaar y col. (1993) J. Biol.
Chem. 268(3): 2223-31).
Los 160 aminoácidos C-terminal
no se encuentran en la especie madura de 70 y 76 kDal. Sin embargo,
determinados alelos de Pompe que dan como resultado la pérdida
completa de la actividad de GAA mapean en esta región, por ejemplo
Val949Asp (Becker y col. (1998) J. Hum. Genet. 62: 991). El fenotipo
de este mutante indica que la parte C-terminal de
la proteína, aunque no la parte de la especie de 70 ó 76 kDal,
desempeña un papel importante en la función de la proteína. Se ha
descrito recientemente que la parte C-terminal de la
proteína, aunque se escinde del resto de la proteína durante el
procesamiento, permanece asociada con la especie principal
(Moreland y col. (1 de nov, 2004) J. Biol. Chem., Manuscript
404008200). Por consiguiente, los restos C-terminal
podrían desempeñar una función directa en la actividad catalítica de
la proteína. De manera alternativa, los restos
C-terminal pueden estar implicados en promover el
plegamiento adecuado de las partes N-terminal de la
proteína.
Esta última posibilidad se sustenta por el
comportamiento de determinados alelos de
sacarasa-isomaltasa, una proteína relacionada. Esta
familia incluye la proteína sacarasa-isomaltasa (SI)
que contiene los dos dominios catalíticos glucósido hidrolasa
homólogos, pero distintos, en tándem en un sólo polipéptido. Cada
uno de éstos es similar en tamaño al polipéptido GAA completo y los
dos dominios comparten una identidad del 36 y del 39% con GAA. La
SI se expresa en las células intestinales de borde en cepillo y se
localiza en la membrana apical de estas células polarizadas con los
dominios catalíticos orientados hacia el lumen intestinal debido a
un dominio transmembrana amino-terminal. Una vez
que llega a la membrana apical, el dominio sacarasa se escinde del
dominio isomaltasa amino-proximal por tripsina,
mientras que el dominio isomaltasa permanece asociado a la
membrana. Recientes estudios indican que el dominio sacarasa es
necesario para el plegamiento adecuado y posterior transporte del
dominio isomaltasa; se dice que la sacarasa es una acompañante
intramolecular necesaria para el plegamiento del dominio isomaltasa
(Jacob y col. (2002) J. Biol. Chem. 277: 32141).
El análisis de la expresión de varios casetes de
GAA modificados genéticamente ha permitido la identificación de dos
regiones que, aunque se escinden del polipéptido maduro, sin embargo
son necesarias para la secreción de la proteína funcional de las
células de mamíferos. La Figura 2 resume la organización de la GAA
como se entiende ahora. El polipéptido precursor posee una
secuencia de señal y un dominio transmembrana supuesto adyacente,
un dominio en trébol (PFAM PF00088) que es un dominio rico en
cisteína de aproximadamente 45 aminoácidos que contiene 3 enlaces
disulfuro y se piensa que está implicado en las interacciones
proteína-proteína o
proteína-carbohidratos (Thim (1989) FEBS Lett. 250:
85), el dominio definido por el polipéptido maduro de 70/76 kDal y
el dominio C-terminal. Una mutación en el dominio en
trébol de SI tiene un impacto sobre el patrón de clasificación de
membrana apical de SI (Spodsberg (2001) J. Biol. Chem. 276: 23506).
Los datos presentados en los ejemplos 1 y 2 indican que tanto el
dominio en trébol como el dominio C-terminal son
necesarios para la producción de GAA funcional. Es posible que el
dominio C-terminal interaccione con el dominio en
trébol durante el plegamiento de la proteína facilitando quizás la
formación de puentes disulfuro apropiados en el dominio en
trébol.
El péptido de señal de GAA no se escinde en el
RE causando por lo tanto que CAA se una a la membrana en el RE
(Tsuji y col. (1987) Biochem. Int. 15(5):
945-952). En algunos tipos de células, la enzima
puede encontrarse unida a la membrana plasmática con retención de
la topología de la membrana del RE presumiblemente debido a que no
escinde el péptido de señal (Hirschhom y col., en The Metabolic and
Molecular Basis of Inherited Disease, Valle, ed., 2001,
McGraw-Hill: Nueva York, págs.
3389-3420). El análisis de secuencia sugiere la
presencia de un dominio transmembrana adyacente al péptido de señal,
que presumiblemente permite a la enzima permanecer unida a la
membrana en determinadas condiciones.
Es posible que la asociación de GAA a la
membrana mediante su péptido de señal sea un factor importante que
contribuye al correcto direccionamiento de la enzima al lisosoma.
Esto podría ocurrir de dos maneras: en primer lugar, la asociación
a la membrana podría dirigir directamente la proteína al lisosoma.
En segundo lugar, la asociación a la membrana podría aumentar el
tiempo de residencia de la GAA en el aparato de Golgi aumentando de
esta manera el nivel de
manosa-6-fosfato añadido a la
proteína. Esto tendría el efecto neto de aumentar la proporción de
la enzima que se secreta hacia el lisosoma. En cualquier caso, si se
eliminase esta asociación a la membrana, entonces se secretaría más
de la enzima producida y si el último modelo fuera correcto la
enzima secretada tendría menos
manosa-6-fosfato.
La interrupción de la asociación de GAA a la
membrana puede conseguirse sustituyendo el péptido de señal de GAA
y la secuencia adyacente con un péptido de señal alterno para
GAA.
La presente invención permite dirigir un agente
terapéutico a un lisosoma usando una proteína o un análogo de una
proteína, que se une específicamente a un receptor celular para esta
proteína. El exterior de la superficie celular es topológicamente
equivalente a los compartimentos endosomales, lisosomales, del
aparato de Golgi y del retículo endoplásmico. Por tanto, la
endocitosis de una molécula a través de la interacción con un
receptor (o receptores) apropiado permite el transporte de la
molécula a cualquiera de estos compartimentos sin atravesar una
membrana. Una deficiencia genética debe dar como resultado una
deficiencia de una actividad enzimática particular en cualquiera de
estos compartimentos, el suministro de una proteína terapéutica
puede conseguirse dirigiéndola con un ligando para el receptor (o
receptores) apropiado.
La invención permite dirigir un agente
terapéutico a un lisosoma. El direccionamiento puede ocurrir, por
ejemplo, a través de la unión de un receptor de la membrana
plasmática que luego pasa a través de un lisosoma. De manera
alternativa, el direccionamiento puede ocurrir a través de la unión
de un receptor plasmático que luego pasa a través de un endosoma
tardío; el agente terapéutico puede después desplazarse desde el
endosoma tardío hacia el lisosoma. Un mecanismo de direccionamiento
lisosomal preferido implica la unión al receptor de M6P
independiente de cationes.
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El receptor de M6P independiente de cationes es
una glucoproteína transmembrana de cadena única de 275 kDa
expresada de manera ubicua en los tejidos de mamíferos. Es uno de
los dos receptores de mamíferos que se unen a M6P: el segundo se
denomina receptor de M6P dependiente de cationes. El receptor de M6P
dependiente de cationes requiere cationes divalentes para la unión
a M6P; el receptor de M6P independiente de cationes no. Estos
receptores desempeñan una función importante en el tránsito de las
enzimas lisosomales a través del reconocimiento del resto de M6P en
carbohidratos de alto contenido en manosa en las enzimas
lisosomales. El dominio extracelular del receptor de M6P
independiente de cationes contiene 15 dominios homólogos
("repeticiones") que se unen a varios grupos de ligandos en
localizaciones específicas en el receptor.
El receptor de M6P independiente de cationes
contiene dos sitios de unión para M6P: uno localizado en las
repeticiones 1-3 y el otro localizado en las
repeticiones 7-9. El receptor se une a ligandos de
M6P monovalentes con una constante de disociación en el intervalo
de \muM mientras que la unión a ligandos de M6P divalentes tiene
una constante de disociación en el intervalo de nM, probablemente
debido a la oligomerización del receptor. La captación del
IGF-II por el receptor se potencia por la unión
concomitante de ligandos de M6P multivalentes tales como enzimas
lisosomales para el receptor.
El receptor de M6P independiente de cationes
también contiene sitios de unión para al menos tres ligandos
distintos que pueden usarse como restos de direccionamiento. El
receptor de M6P independiente de cationes se une al
IGF-II con una constante de disociación de
aproximadamente 14 nM a un pH de aproximadamente 7,4,
principalmente a través de interacciones con la repetición 11. De
acuerdo con su función en el direccionamiento del
IGP-II hacia el lisosoma, la constante de
disociación aumenta aproximadamente 100 veces a un pH de
aproximadamente 5,5 promoviendo la disociación del
IGP-II en endosomas tardíos ácidos. Los receptores
pueden unirse a formas del IGF-II
O-glicosiladas de elevado peso molecular.
\vskip1.000000\baselineskip
Un desafío en la terapia para enfermedades de
almacenamiento lisosomal es que muchas de estas enfermedades tienen
implicaciones neurológicas significativas. Las enzimas terapéuticas
administradas en la corriente sanguínea generalmente no atraviesan
la barrera hematoencefálica y por lo tanto no puede aliviar los
síntomas neurológicos asociados con las enfermedades. Sin embargo,
se ha notificado que el IGF-II promueve el
transporte a través de la barrera en hematoencefálica mediante
transcitosis (Bickel y col. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev.
46(1-3): 247-79). Por tanto,
construcciones GILT diseñadas apropiadamente deben poder atravesar
la barrera hematoencefálica, permitiendo por primera vez un medio
para tratar síntomas neurológicos asociados con enfermedades de
almacenamiento lisosomal. Las construcciones pueden ensayarse
usando ratones desprovistos de GUS como se describe en el Ejemplo
12. En el documento U. S. Nº de Serie 60/329.650, presentado el 16
octubre del año 2001 y en el documento U. S. Nº de Serie
10/136.639, presentado el 30 abril del año 2002 se describen
detalles adicionales con respecto al diseño, construcción y ensayo
de terapéuticos dirigidos que pueden transportarse desde la sangre
al tejido neuronal.
Dos equipos han resuelto la estructura del
IGP-II por RMN (Terasawa y col. (1994) EMBO J.
13(23): 5590-7; Torres y col. (1995) J. Mol.
Biol. 248(2): 385-401) (véase, por ejemplo,
Protein Data Bank record IIGL). Las características generales de la
estructura del IGF-II son similares a la del
IGF-I y a la insulina. Los dominios A y B del
IGF-II corresponden a las cadenas A y B de la
insulina. Las características estructurales secundarias incluyen
una hélice alfa desde los restos 11-21 de la región
B conectada por un giro inverso en los restos 22-25
a una cadena beta corta en los restos 26-28. Los
restos 25-27 parecen formar una pequeña lámina beta
antiparalela; los restos 59-61 y los restos
26-28 también pueden participar en la formación de
una lámina beta intermolecular. En los dominios A del
IGF-II, las hélices alfa que abarcan los restos
42-49 y 53-59 se disponen en una
configuración antiparalela perpendicular a la hélice de dominio B.
Las agrupaciones hidrófobas formadas por dos de los tres puentes
disulfuro y los restos hidrófobos conservados estabilizan estas
características de la estructura secundaria. Los extremos N y C así
como la región entre los restos 31-40 continúan sin
definirse bien.
El IGF-II se une a los
receptores de IGF-II/M6P e IGF-I con
afinidad relativamente alta y se une con menor afinidad al receptor
de insulina. El IGF-II también interacciona con
varias IGFBP (proteínas de unión a IGF) séricas.
La sustitución de los restos
48-50 (Phe Arg Ser) del IGF-II por
los restos correspondientes de insulina, (Thr, Ser, Ile) o la
sustitución de los restos 54-55 (Ala Leu) por los
restos correspondientes del IGF-I (Arg Arg) da como
resultado la unión disminuida al receptor de
IGF-II/M6P pero la conservación de la unión a los
receptores del IGF-I y de la insulina (Sakano y
col. (1991) J. Biol. Chem. 266(31):
20626-35).
El IGF-I y el
IGF-II comparten idénticas secuencias y estructuras
en la región de los restos 48-50 aunque difieren
1000 veces en la afinidad por el receptor del
IGF-II. La estructura por RMN revela una diferencia
estructural entre el IGF-I y el
IGF-II en la región de los restos
53-58 del IGF-II (restos
54-59 del IGF-I): la hélice alfa se
define mejor en el IGF-II que en el
IGF-I y, a diferencia de IGF-I, no
se pliega en la estructura alrededor de los restos 53 y 54 (Torres
y col. (1995) J. Mol. Biol. 248(2): 385-401).
Esta diferencia estructural se correlaciona con la sustitución de
Ala 54 y Leu 55 en IGF-II por Arg 55 y Arg 56 en
IGF-I. Es posible que la unión al receptor del
IGF-II se interrumpa directamente por la presencia
de restos cargados en esta región o bien que los cambios generados
en la estructura por los restos cargados produzcan los cambios en la
unión para el receptor de IGF-II. En cualquier
caso, la sustitución de restos no cargados por los dos restos de
Arg en el IGF-I da como resultado mayores afinidades
por el receptor del IGF-II (Cacciari y col. (1987)
Pediatrician 14(3): 146-53). Por tanto, la
presencia de restos cargados positivamente en estas posiciones se
correlaciona con la pérdida de unión al receptor del
IGF-II.
El IGF-II se une a la repetición
11 del receptor de M6P independiente de cationes. De hecho, un
minireceptor en el que únicamente la repetición 11 está fusionada a
los dominios transmembrana y citoplásmicos del receptor de M6P
independiente de cationes puede unirse al IGF-II
(con una afinidad aproximadamente de una décima parte de la
afinidad del receptor de longitud completa) y mediar la
internalización del IGF-II y su suministro a los
lisosomas (Grimme y col. (2000) J. Biol. Chem. 275(43):
33697-33703). Se conoce la estructura del dominio
11 del receptor de M6P (Protein Data Base entradas 1GP0 y 1GP3;
Brown y col. (2002) EMBO J. 21(5):
1054-1062). Se cree que el supuesto sitio de unión
al IGF-II es un bolsillo hidrófobo que interacciona
con aminoácidos hidrófobos del IGF-II; los
aminoácidos candidatos del IGF-II incluyen leucina
8, fenilalanina 48, alanina 54 y leucina 55. Aunque la repetición
11 es suficiente para la unión al IGF-II, las
construcciones que incluyen partes más grandes del receptor de M6P
independiente de cationes (por ejemplo, repeticiones
10-13 ó 1-5) generalmente se unen
al IGF-II con mayor afinidad y dependencia de pH
aumentada (véase, por ejemplo, Linnell y col. (2001) J. Biol. Chem.
276(26): 23986-23991).
La sustitución de los restos Tyr 27 por Leu, Leu
43 por Val o Ser 26 por Phe del IGF-II disminuye
94-, 56- y 4 veces respectivamente la afinidad del
IGF-II por el receptor de IGF-I
(Torres y col. (1995) J. Mol. Biol. 248(2):
385-401). La deleción de los restos
1-7 del IGF-II humano da como
resultado una disminución de 30 veces la afinidad por el receptor
del IGF-I humano y un aumento concomitante en la
afinidad de 12 veces para el receptor del IGF-II de
rata (Hashimoto y col. (1995) J. Biol. Chem. 270(30):
18013-8). La estructura por RMN del
IGF-II demuestra que Thr 7 se localiza cerca de los
restos 48 Phe y 50 Ser así como cerca del puente disulfuro 9
Cys-47 Cys. Se cree que la interacción de Thr 7 con
estos restos puede estabilizar el hexapéptido
N-terminal flexible necesario para la unión al
receptor del IGF-I (Terasawa y col. (1994) EMBO J.
13(23) 5590-7). Al mismo tiempo esta
interacción puede modular la unión para el receptor del
IGF-II. El truncamiento del extremo C del
IGF-II (restos 62-67) también parece
disminuir 5 veces la afinidad del IGF-II para el
receptor del IGF-I (Roth y col. (1991) Biochem.
Biophys. Res. Commun. 181(2): 907-14).
El marcador peptídico puede fusionarse
directamente al polipéptido GAA o puede separarse del polipéptido
GAA mediante un engarce. Un engarce aminoacídico incorpora una
secuencia de aminoácidos distinta de la que aparece en esa posición
en la proteína natural y generalmente se diseña para ser flexible o
interponerse a una estructura, tal como una
hélice-\alpha, entre los dos restos de la
proteína. Un engarzador puede ser relativamente corto, tal como la
secuencia Gly-Ala-Pro o
Gly-Gly-Gly-Gly-Pro
o puede ser más largo, tal como, por ejemplo, de 10 a 25
aminoácidos de longitud.
El sitio de un punto de unión de fusión se
selecciona para promover el plegamiento y la actividad adecuados de
los dos compañeros de fusión y para evitar la separación prematura
de un marcador peptídico de un polipéptido GAA. La Figura 3 ilustra
cuatro estrategias ejemplares para crear una GAA marcada con GILT,
basándose en el modelo para la organización de la proteína GAA como
se ilustra en la Figura 2.
- 1.
- Fusión del marcador en el extremo amino.
- 2.
- Inserción del marcador entre el dominio en trébol y la región madura.
- 3.
- Inserción del marcador entre la región madura y el dominio C terminal.
- 4.
- Fusión del marcador en el extremo C de un GAA truncado y co-expresando el dominio C terminal.
El dominio de direccionamiento está fusionado,
directamente o mediante un espaciador, al aminoácido 70 de GAA, una
posición que permite la expresión de la proteína, la actividad
catalítica del resto GAA, y el direccionamiento adecuado por el
resto de direccionamiento como se describe en el Ejemplo 4.
Los terapéuticos diana producidos de acuerdo con
la presente invención pueden administrarse a un huésped mamífero
mediante cualquier vía. Por tanto, según sea apropiado, la
administración puede ser oral o parenteral, incluyendo las vías de
administración intravenosa e intraperitoneal. Además, la
administración puede ser por inyecciones periódicas de un bolo del
terapéutico o puede realizarse de manera continua por administración
intravenosa o intraperitoneal a partir de un depósito que es
externo (por ejemplo, una bolsa i.v.). En determinadas
realizaciones, los terapéuticos de la presente invención pueden ser
de uso farmacéutico. Es decir, determinadas realizaciones cumplen
las normativas de pureza y control de calidad, necesarias para la
administración en seres humanos. Las aplicaciones veterinarias
también se incluyen dentro del significado pretendido como se usa en
el presente documento.
Las formulaciones, tanto para su uso veterinario
como para su uso médico en seres humanos, de los terapéuticos de
acuerdo con la presente invención incluyen típicamente dichos
terapéuticos en asociación con un transportador farmacéuticamente
aceptable para este efecto y opcionalmente otro ingrediente (o
ingredientes). Los transportadores pueden ser "aceptables" en
el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de las
formulaciones y no perjudiciales al propio receptor. Los
transportadores farmacéuticamente aceptables, en este aspecto,
pretenden incluir cualquiera y todos los disolventes, medios de
dispersión, agentes de recubrimiento, antibacterianos y
antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y
similares, compatibles con la administración del producto
farmacéutico. El uso de dichos medios y agentes para la sustancia
farmacéuticamente activa se conoce en la técnica. Excepto en la
medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible
con el compuesto activo, se contempla el uso de los mismos en las
composiciones. Los compuestos activos complementarios
(identificados de acuerdo con la invención y/o conocidos en la
técnica) también pueden incorporarse en la composición. Las
formulaciones pueden presentarse de manera conveniente en formas
farmacéuticas unitarias y pueden prepararse mediante cualquiera de
los procedimientos bien conocidos en la técnica de la
farmacia/microbiología. En general, algunas formulaciones se
preparan poniendo en contacto el terapéutico con un transportador
líquido o un transportador sólido finamente dividido o los dos, y
después, si es necesario, dar forma al producto en la formulación
deseada.
Una composición farmacéutica de la invención se
formula para ser compatible con su vía de administración pretendida.
Los ejemplos de vías de administración incluyen administración oral
o parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, por
inhalación, transdérmica (tópica), transmucosa y a través del recto.
Las soluciones o suspensiones usadas para la aplicación parenteral,
intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes:
un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina,
aceites no volátiles, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol
u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tal como
alcohol bencílico o metil parabenos; antioxidantes tales como ácido
ascórbico o bisulfito sódico; agentes quelantes tales como ácido
etilendiaminotetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o
fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tal como cloruro
de sodio o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, tales
como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio.
Las soluciones útiles para la administración
oral o parenteral pueden prepararse por cualquiera de los
procedimientos bien conocidos en la técnica farmacéutica,
descritos, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences,
(Gennaro, A., ed.), Mack Pub., 1990. Las formulaciones para la
administración parenteral también pueden incluir glicocolato para
la administración bucal, metoxisalicilato para la administración en
el recto o ácido cítrico para la administración en la vagina. La
preparación parenteral puede introducirse en ampollas, jeringas
desechables o en viales de dosis múltiples fabricados de vidrio o
plástico. Los supositorios para la administración en el recto
también pueden prepararse mezclando el fármaco con un excipiente no
irritante tal como manteca de cacao, otros glicéridos u otras
composiciones que son sólidas a temperatura ambiente y líquidas a
temperatura corporal. Las formulaciones también pueden incluir, por
ejemplo, polialquilen glicoles tales como polietilenglicol, aceites
de origen vegetal, naftalenos hidrogenados y similares. Las
formulaciones para la administración directa pueden incluir
glicerol y otras composiciones de elevada viscosidad. Otros
transportadores parenterales potencialmente útiles para estos
terapéuticos incluyen partículas de copolímero de
etilen-vinil acetato, bombas osmóticas, sistemas de
infusión implantables y liposomas. Las formulaciones para la
administración por inhalación pueden contener como excipientes, por
ejemplo, lactosa, o pueden ser soluciones acuosas que contienen, por
ejemplo, polioxietilen-9-lauril
éter, glicocolato y desoxicolato o soluciones oleaginosas para
administrar en forma de gotas nasales o como un gel para aplicarse
por vía manera intranasal. Los enemas de retención también pueden
usarse para el suministro en el recto.
Las formulaciones de la presente invención
adecuadas para administración oral pueden ser en forma de unidades
separadas tales como cápsulas, cápsulas de gelatina, sobres,
comprimidos, trociscos o pastillas para chupar, conteniendo cada
una, una cantidad predeterminada del fármaco; en forma de un polvo o
gránulos, en forma de una solución o una suspensión en un líquido
acuoso o no acuoso; o en forma de una emulsión de aceite en agua o
una emulsión de agua en aceite. El terapéutico también puede
administrarse en forma de un bolo, electuario o pasta. Un
comprimido puede fabricarse por compresión o moldeo del fármaco
opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Los
comprimidos preparados por compresión pueden prepararse
comprimiendo, en una máquina adecuada, el fármaco en una forma
fluida tal como un polvo o gránulos, opcionalmente mezclados con un
agente aglutinante, lubricante, diluyente inerte, tensioactivo o
dispersante. Los comprimidos moldeados pueden fabricarse moldeando,
en una máquina adecuada, una mezcla del fármaco en polvo y un
transportador humedecido con un diluyente líquido inerte.
Las composiciones orales generalmente incluyen
un diluyente inerte o un transportador comestible. Para el
propósito de la administración terapéutica oral, el compuesto activo
puede incorporarse con excipientes. Las composiciones orales
preparadas usando un transportador líquido para su uso como un
elixir bucal incluyen el compuesto en el transportador líquido y se
aplican por vía oral y se enjuagan y expectoran o se tragan. Los
agentes aglutinantes farmacéuticamente compatibles, y/o materiales
adyuvantes pueden incluirse como parte de la composición. Los
comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y similares pueden
contener cualquiera de los siguientes ingredientes o compuestos de
una naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa
microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal
como almidón o lactosa; un agente disgregante tal como ácido
algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante tal como
estearato de magnesio o Sterotes; un emoliente tal como dióxido de
silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o
sacarina; un agente saporífero tal como saporífero de menta, metil
salicilato o naranja.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para
el uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (es decir,
hidrolubles) o dispersiones y polvos estériles para la preparación
improvisada de soluciones o dispersiones estériles inyectables.
Para la administración intravenosa, los transportadores adecuados
incluyen solución salina fisiológica, agua bacteroestática,
Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina tamponada
con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición puede ser
estéril y puede ser líquida de manera que pueda introducirse
fácilmente en una jeringuilla. Puede ser estable en condiciones de
fabricación y almacenaje y puede conservarse contra la acción
contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El
transportador puede ser un disolvente o un medio de dispersión que
contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol,
propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares) y mezclas
adecuadas de los mismos. La correcta fluidez puede mantenerse, por
ejemplo, usando un recubrimiento tal como lecitina, manteniendo el
tamaño necesario de las partículas en el caso de dispersión y
usando tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos
puede conseguirse por diversos agentes antibacterianos y
antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido
ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible
incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes,
tales como manitol, sorbitol y cloruro de sodio en la composición.
La absorción prolongada en las composiciones inyectables puede
llevarse a cabo incluyendo en la composición un agente que retrase
la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles pueden
prepararse incorporando el compuesto activo en la cantidad necesaria
en un disolvente apropiado con uno o una combinación de
ingredientes enumerados anteriormente, si se requiere, seguido por
esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan
incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que
contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes
necesarios de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos
estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles,
los procedimientos de preparación incluyen el secado al vacío y la
liofilización que producen un polvo del principio activo más
cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución
filtrada estéril del mismo.
Las formulaciones adecuadas para la
administración intra-articular pueden ser en forma
de una preparación acuosa estéril del terapéutico que puede estar
en forma microcristalina, por ejemplo, en forma de una suspensión
microcristalina acuosa. Las formulaciones liposomales o los sistemas
de polímeros biodegradables también pueden usarse para presentar la
composición terapéutica tanto para la administración
intra-articular como oftálmica.
Las formulaciones adecuadas para la
administración tópica, incluyen tratamientos oculares, incluyen
preparaciones líquidas o semilíquidas tales como linimentos,
lociones, geles, pomadas, emulsiones de aceite en agua o de agua en
aceite, tales como cremas, pomadas o pastas; o soluciones o
suspensiones tales como gotas. Las formulaciones para la
administración tópica en la superficie de la piel pueden prepararse
dispersando el terapéutico con un transportador dermatológicamente
aceptable tal como una loción, crema, pomada o jabón. En algunas
realizaciones, los transportadores útiles pueden formar una
película o una capa sobre la piel para localizar la aplicación e
impedir la retirada. Cuando se desea la adhesión en la superficie
del tejido, la composición puede incluir el terapéutico dispersado
en una composición de trombina-fibrinógeno u otro
bioadhesivo. El terapéutico puede después pintarse, pulverizarse o
de otra manera aplicarse en la superficie del tejido deseado. Para
la administración tópica en las superficies tisulares internas, el
agente puede dispersarse en un adhesivo tisular líquido u otra
sustancia conocida para potenciar la absorción en una superficie
tisular. Por ejemplo, como ventaja puede usarse soluciones de
hidroxipropil celulosa o de fibrinógeno/trombina. De manera
alternativa, también pueden usarse soluciones de recubrimiento
tisular, tales como formulaciones que contienen pectina.
Para los tratamientos por inhalación, tales como
para asma, puede usarse la inhalación de polvos (formulaciones
autopropulsadas o por pulverización) distribuidos con un
pulverizador, un nebulizador o un atomizador. Dichas formulaciones
pueden ser en forma de un polvo finamente triturado, para la
administración pulmonar, desde un dispositivo de inhalación de
polvo o formulaciones autopropulsadas de distribución de polvo. En
el caso de soluciones autopropulsadas y formulaciones para
pulverizar, el efecto puede conseguirse seleccionando una válvula
que tenga las características de pulverización deseadas (es decir,
que pueda producir una pulverización que tenga el tamaño de
partícula deseado) o incorporando el agente activo como un polvo
suspendido en un tamaño de partícula controlado. Para la
administración por inhalación, los terapéuticos también pueden
suministrarse en forma de una pulverización en aerosol desde un
envase o dispensador presurizado que contiene un propulsor
adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono o un
nebulizador. También puede usarse gotas nasales.
La administración sistémica también puede ser
por medios transmucosos o transdérmicos. Para la administración
transmucosa o transdérmica, en la formulación se usan penetrantes
apropiados para penetrar la barrera. Dichos penetrantes
generalmente se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, para
la administración transmucosa, detergentes, sales biliares y
derivados del ácido fusídico. La administración transmucosa puede
conseguirse a través del uso de pulverizadores nasales o
supositorios. Para la administración transdérmica, los terapéuticos
se formulan típicamente en pomadas, solvatos, geles o cremas como se
conoce generalmente en la técnica.
En una realización, los terapéuticos se preparan
con transportadores que protegerán contra la eliminación rápida del
cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, que
incluye implantes y sistemas de suministro microencapsulados.
Pueden usarse polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como
etileno vinil acetato, polianhídridos, ácido poliglicólico,
colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los procedimientos
para la preparación de dichas formulaciones serán evidentes para los
expertos en la materia. Los materiales también pueden obtenerse en
el mercado en Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Las
suspensiones liposomales también pueden usarse como transportadores
farmacéuticamente aceptables. Éstas pueden prepararse de acuerdo
con los procedimientos conocidos por los expertos en la materia, por
ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº
4.522.2811. También pueden usarse microsomas y micropartículas.
Las composiciones orales o parenterales pueden
formularse en formas farmacéuticas unitarias para facilitar su
administración y uniformidad de la dosificación. Las formas
farmacéuticas unitarias se refieren a unidades físicamente
separadas ajustadas como dosificaciones unitarias para el sujeto a
tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada del
compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico
deseado junto con el transportador farmacéutico necesario. La
especificación para las formas farmacéuticas unitarias de la
invención se establece y dependen directamente de las
características particulares del compuesto activo, del efecto
terapéutico particular a conseguir y de las limitaciones inherentes
en la técnica de la preparación de compuestos tal como un compuesto
activo para el tratamiento de individuos.
Generalmente, los terapéuticos identificados de
acuerdo con la invención pueden formularse para la administración
parenteral u oral en seres humanos u otros mamíferos, por ejemplo,
en cantidades terapéuticamente eficaces, por ejemplo, cantidades
que proporcionan concentraciones apropiadas del fármaco al tejido
diana durante un tiempo suficiente para inducir el efecto deseado.
Adicionalmente, los terapéuticos de la presente invención pueden
administrarse en solitario o en combinación con otras moléculas que
se sabe que tienen un efecto beneficioso sobre la enfermedad o
indicación particular de interés. A modo de ejemplo únicamente, los
cofactores útiles incluyen cofactores para el alivio sintomático,
que incluyen antisépticos, antibióticos, agentes antivirales
antifúngicos y analgésicos y anestésicos.
La concentración eficaz de los terapéuticos
identificados de acuerdo con la invención que va a suministrarse en
una composición terapéutica variarán dependiendo de varios factores,
incluyendo la dosificación final deseada del fármaco a administrar
y de la vía de administración. La dosificación preferida a
administrar es probable que también dependa de dichas variables
como el tipo y alcance de la enfermedad o indicación a tratar, el
estado general de salud del paciente particular, la eficacia
biológica relativa del agente terapéutico suministrado, la
formulación del agente terapéutico, la presencia y tipos de
excipientes en la formulación y de la vía de administración. En
algunas realizaciones, los terapéuticos de la presente invención
pueden proporcionarse a un individuo usando unidades de dosis
típicas deducidas de los estudios en mamíferos descritos
anteriormente usando primates no humanos y roedores. Como se ha
descrito anteriormente, una unidad de dosificación se refiere a una
unitaria, es decir una sola dosis que puede administrarse a un
paciente y que puede manipularse y envasarse fácilmente,
permaneciendo como una dosis unitaria física y biológicamente
estable que comprende o el agente terapéutico como tal o una mezcla
de este con diluyentes o transportadores farmacéuticos sólidos o
líquidos.
En determinadas realizaciones los organismos se
modifican por ingeniería genética para producir los terapéuticos
identificados de acuerdo con la invención. Estos organismos pueden
liberar el terapéutico para recogerse o pueden introducirse
directamente en un paciente. En otra serie de realizaciones, las
células pueden utilizarse para servir como un transportador de los
terapéuticos identificados de acuerdo con la invención.
Los terapéuticos de la invención también
incluyen los derivados de "profármacos". El término profármaco
se refiere a un derivado farmacológicamente inactivo (o
parcialmente inactivo) de una molécula precursora que requiere
biotransformación, o espontánea o enzimática, dentro del organismo
para liberar o activar el componente activo. Los profármacos son
variaciones o derivados de los terapéuticos de la invención que
tienen grupos que pueden escindirse en condiciones metabólicas. Los
profármacos se convierten en los terapéuticos de la invención de
que son farmacéuticamente activos in vivo, cuando
experimentan solvólisis en condiciones fisiológica o experimentan
degradación enzimática. El profármaco de la presente invención puede
denominarse sencillo, doble, triple y así sucesivamente,
dependiendo del número de etapas de biotransformación necesarias
para liberar el o activar el componente farmacológico activo dentro
del organismo e indicando el número de funcionalidades presente en
la forma de tipo precursora. Las formas de los profármacos a menudo
ofrecen ventajas de solubilidad, compatibilidad tisular o
liberación prolongada en el organismo de los mamíferos (véase,
Bundgard, Design of Prodrugs, págs. 7-9,
21-24, Elsevier, Amsterdam 1985 y Silverman, The
Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action, págs.
352-401, Academic Press, San Diego, Calif., 1992).
Además, los derivados de los profármacos de acuerdo con la presente
invención pueden combinarse con otras características para potenciar
la biodisponibilidad.
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Ejemplo
1
Para generar un casete génico que contiene la
secuencia de señal del IGF-II humano fusionada a los
restos 791-952 de la GAA humana (el dominio C
terminal), se usaron los siguientes cebadores: GAA41:
GGAATTCAGGCGCGCCG
GCAGCTCCCCGTGAGCCAGCC GAA27: GCTCTAGACTAACACCAGCTGACGAGAAACTGC. GAA41 y
GAA27 se usaron para amplificar el dominio C terminal de GAA por PCR. El fragmento amplificado contiene un sitio Asc I en el extremo 5'. El marcador-N SS que codifica la secuencia de señal del IGF-II (restos 1-25) con un sitio Asc I en el extremo 3' se fusionó después en el sitio Asc I al dominio C terminal de GAA y el casete se clonó en pCEP4 para generar el plásmido pCEP-SS-GAA-791-952. A continuación se muestra la secuencia de ácido nucleico del marcador-N SS.
GCAGCTCCCCGTGAGCCAGCC GAA27: GCTCTAGACTAACACCAGCTGACGAGAAACTGC. GAA41 y
GAA27 se usaron para amplificar el dominio C terminal de GAA por PCR. El fragmento amplificado contiene un sitio Asc I en el extremo 5'. El marcador-N SS que codifica la secuencia de señal del IGF-II (restos 1-25) con un sitio Asc I en el extremo 3' se fusionó después en el sitio Asc I al dominio C terminal de GAA y el casete se clonó en pCEP4 para generar el plásmido pCEP-SS-GAA-791-952. A continuación se muestra la secuencia de ácido nucleico del marcador-N SS.
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Secuencia de ADN del marcador-N
SS:
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\vskip1.000000\baselineskip
De manera similar se generaron los siguientes
plásmidos adicionales: pCEP-GAA \Delta
817-952 que carece de los restos GAA C terminales
817-952 y pCEP-GAA \Delta
817-952-GILT \Delta
1-7 que es similar a pCEP-GAA
\Delta 817-952 excepto por la adición de un
marcador GILT\Delta1-7 C-terminal.
Introduciendo un codón de terminación después del resto
aminoacídico 816, se generó GAA \Delta 817-952.
Para facilitar el proceso de clonación, el codón de terminación
continuó después por el sitio de restricción XbaI en el extremo 3' y
un extremo 5' que contiene un sitio de restricción EcoRI. A
continuación se muestran las secuencias de ADN y de aminoácidos de
GAA \Delta 817-952.
\newpage
Secuencia de ADN de GAA \Delta
817-952.
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\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de aminoácidos de GAA \Delta
817-952.
Para determinar si la región C- terminal de GAA
funciona cuando se expresa en trans, el
pCEP-SS-GAA-791-952
se transfectó sólo en células HEK293, así como en combinación con
el plásmido pCEP-GAA \Delta
817-952 o con pCEP-GAA \Delta
817-952-GILT \Delta
1-7. Como control, pCEP-GAA \Delta
817-952 y pCEP-GAA \Delta
817-952-GILT \Delta
1-7 también se transfectaron en sólo en células
HEK293. Para los experimentos se usaron procedimientos de
transfección convencionales. Para las transfecciones plasmídicas
únicas, se usó 1 \mug de ADN plasmídico. Para las
co-transfecciones, se usaron 0,5 \mug de cada
plásmido. Se mezcló 1 \mug de ADN total con 96 \mul de medio de
cultivo con HEK293 sin suero y 4 \mul de FuGene6 (Roche) según lo
indicado por el fabricante. Se añadieron 50 \mul de la mezcla a
cada pocillo de células HEK293 por duplicado que crecían en placas
de 12 pocillos en 1 ml de Medio Eagle modificado por Dulbecco
complementado con 1,5 g/l de bicarbonato sódico, FBS inactivado con
calor al 10% y L-glutamina 4 mM: las células se
incubaron durante 2-3 días a 37ºC en CO_{2} al
5%.
El medio de cultivo se recogió y se ensayó para
determinar la actividad de GAA como se describe (Reuser, A.J., y
col. (1978) Am. J. Hum. Genet 30:1 32-143). No se
detectó actividad de GAA en el medio recogido de las células HEK293
transfectadas sólo con plásmidos. Por el contrario, GAA presentaba
actividad en el medio de cultivo recogido de células HEK293
cotransfectadas con
pCEP-SS-GAA-791-952
y o con pCEP-GAAA817-952 o con
pCEP-GAA0817-952-GILT\Delta1-7
(Tabla 1).
Por lo tanto, las dos construcciones de deleción
C-terminal
pCEP-GAA\Delta817-952 y
pCEP-GAA\Delta817-952-GILT\Delta1-7
sólo expresan proteínas funcionales cuando se
co-expresan con el plásmido del dominio C terminal,
pCEP-SS-GAA-791-952.
Este experimento demostró que la región C terminal de GAA coopera
con la región N terminal, madura cuando se
co-expresa en trans.
Ejemplo
2
En el experimento de
co-transfección transitoria descrito en el Ejemplo
1, la región GAA que incluye los restos aminoacídicos
792-817 está presente en las dos mitades de las
construcciones de expresión en trans. Para determinar si para la
expresión en trans eficaz es necesario el solapamiento de esta
región, se diseño un par de construcciones,
pCEP-GAA\Delta791-952-GILT\Delta1-7
y
PCEP-SSGAA-791-952,
sin solapamiento y el marcador GILT se fusionó en la posición 791.
Como se indica en la Tabla 2, los experimentos de
co-transfección transitoria demuestran que para la
expresión en trans eficaz de GAA, se requiere la presencia de los
restos aminoacídicos 792-817 dentro del dominio
C-terminal.
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Ejemplo
3
Para generar primero una inserción de la
secuencia de nucleótidos GGCGCGCCG (SEC ID Nº: 11) después del
nucleótido 2370 de la secuencia de GAA humana completa (SEC ID Nº:
9) se usó PCR. Esta inserción forma un sitio de restricción AscI
anterior a Ala791. El marcador GILT se amplificó por PCR con los
siguientes oligonucleótidos de ADN:
- IGF7:
- gctctagaggcgcgccCTCGGACTTGGCGGGGGTAGC
- IGF8:
- ggaattcaggcgcgcgccgGCTTACCGCCCCAGTGAGAC
El marcador GILT amplificado contiene un sitio
de restricción AscI en cada extremo. Este marcador GILT se digirió
con AscI y se insertó en el sitio AscI anterior a Ala791 de GAA como
se describió anteriormente. La secuenciación del ADN confirmó la
orientación en fase de lectura de la inserción de GILT. Este casete
GALA que contiene un marcador GILT interno anterior a Ala791 se
expresó en el vector pCEP4 en un plásmido denominado
pCEP-GAA-IRGILT-4.
Se observó que
pCEP-GAA-IRGILT-4
contenía una mutación generada por PCR T1712C dentro de la
secuencia codificante de GAA. Esta construcción produjo la proteína
GAA funcional.
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Ejemplo
4
Usando los cebadores indicados en la tabla 3, se
generó una serie de cinco marcadores adecuados para la expresión de
GAA N-terminal (marcadores-N) por
amplificación con PCR. El marcador-N GILT contiene
la secuencia de señal nativa del IGF-II y el
epítope de GILT completo. El marcador-N SS sólo
contiene la secuencia de señal del IGF-II.
Por ejemplo, el marcador-N
GILT\Delta1-7 contiene la secuencia de señal del
IGF-II y los restos 8-67 epitópicos
de GILT. Este se generó con tres reacciones PCR; (1) amplificación
por PCR del molde de ADN del IGF-II humano usando
los cebadores IGF1 e IGF4; (2) amplificación por PCR del molde de
ADN del IGF-II humano usando los cebadores IGF2 e
IGF7; y (3) amplificación por PCR de los productos de las dos
primeras reacciones de PCR usando los cebadores IGF1 e IGF7.
El marcador-N
GILT\Delta2-7 de la invención contiene la
secuencia de señal IGF-II y el resto 1 epitópico de
GILT seguido por los restos 8-67. Este se generó con
tres reacciones PCR: (1) (1) amplificación por PCR del molde de ADN
del IGF-II humano usando los cebadores IGF1 e IGF5;
(2) amplificación por PCR del molde de ADN del
IGF-II humano usando los cebadores IGF3 e IGF7; y
(3) amplificación por PCR de los productos de las dos primeras
reacciones de PCR usando los cebadores IGF1 e IGF7.
El marcador-N
SSGAA-GILT contiene la secuencia de señal GAA dentro
de los restos 1-69, seguido por el epítopo completo
de GILT. Este se generó con tres reacciones PCR: (1) amplificación
por PCR del molde de ADN de la GAA humana usando los cebadores
GAA13 y GI1; (2) amplificación por PCR del molde de
IF-11 humano usando los cebadores GI2 e IGF7; y (3)
amplificación por PCR de los productos de las dos primeras
reacciones de PCR usando los cebadores GAA13 e IGF7.
Cada marcador-N contiene un
sitio de restricción EcoRI en 5' y sitios AscI y Xbal en 3'. El
sitio AscI se usó para fusionar cada marcador con las
construcciones de deleción N-terminal de GAA
descritas a continuación.
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Usando técnicas de PCR, se delecionaron partes
de la secuencia de ADN de GAA humana N-terminal y se
sustituyeron por un sitio de restricción AscI. Los oligonucleótidos
de ADN 5' usados para definir el sitio de deleción se indican a
continuación (Tabla 4). Dentro de la secuencia codificante de GAA se
emparejaron oligonucleótidos 5' con diversos oligonucleótidos 3' y
los fragmentos de ADN resultantes se fusionaron posteriormente con
la secuencia codificante de GAA C-terminal
completa. Para completar los casetes de expresión, los sitios AscI
N-terminal se fusionaron a uno de los cinco
marcadores N-terminal (marcadores-N)
indicados anteriormente (Tabla 4).
\vskip1.000000\baselineskip
Los casetes de expresión indicados en la Taba 4
contienen un marcador N-terminal
(marcador-N) fusionado a una deleción de GAA
N-terminal en un sitio AscI común. Los casetes se
clonaron dentro del sitio de clonación múltiple del vector de
expresión pCEP4 y se transfectaron dentro de células HEK293 usando
el reactivo de transfección FuGene6 (Roche): Se recogió medio de la
expresión transitoria 2-3 días después de la
transfección y se ensayó para determinar la actividad de la GAA
secretada usando un ensayo enzimático convencional (Reuser, A.J., y
col. (1978) Am. J. Hum. Genet. 30: 132-143).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Como indican estos datos, la parte
N-terminal de GAA que incluye los restos
1-80 es indispensable para la expresión
transitoria, pero las deleciones que interrumpen o eliminan el
dominio en trébol no producen la proteína funcional.
Adicionalmente, como se indica en la Tabla 6, la
secreción de GAA puede mejorarse colocando apropiadamente un
péptido de señal heterólogo, en este caso el péptido de señal
IGF-II. La colocación del péptido de señal
IGF-II en el resto 56 ó 70 de GAA proporciona un
aumento triple de la secreción de GAA en comparación con el GAA
nativo, mientras que la colocación del péptido de señal
IGF-II en la posición 29 no produce esto. Esto
puede deberse a la conservación de un supuesto dominio transmembrana
adyacente al péptido de señal de GAA.
Sin embargo, la sustitución del péptido de señal
de GAA nativo y el dominio transmembrana con un péptido de señal
heterólogo disminuye el nivel captación celular dependiente de
manosa-6-fosfato asociada con la
proteína (Figura 4). En la Solicitud de Patente de Estados Unidos
Nº 20040005309 y 20040006008, se describieron experimentos de
captación, cuyos contenidos se incorporan en el presente documento
por referencia. Como se ilustra en la Figura 4,
pCEP-SS-GAA\Delta1-69
tenía un tercio de la cantidad de captación en fibroblastos de Pompe
al igual que pCEP-GAA de tipo silvestre.
En cambio, como se ilustra en la Figura 5,
comparando la captación de
pCEP-SS-GAA\Delta1-69
con una construcción con el marcador GILT,
pCEP-SS-GILT\Delta2-7-GAA\Delta1-69,
era evidente que el marcador GILT promueve la captación específica
que puede competir por IGF-II. Por tanto, la
colocación del marcador peptídico en la posición 70 no sólo permite
la expresión eficaz de la proteína de fusión y la actividad de GAA,
sino que también proporciona un marcador peptídico que se pliega
adecuadamente y es accesible, lo que permite la captación mediada
por el receptor en las células diana.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Claims (4)
1. Una proteína de fusión terapéutica dirigida
que comprende un agente terapéutico que comprende los restos
aminoacídicos 70-952 de la GAA humana, estando los
restos 1-69 delecionados y un marcador peptídico, en
el que el marcador peptídico se une directa o indirectamente al
resto aminoacídico 70 de la GAA humana y dicho marcador comprende
el resto 1 del IGF-II seguido por los restos
8-67, estando los restos 2-7
delecionados.
2. El terapéutico dirigido de la reivindicación
1 que comprende adicionalmente un espaciador entre el agente
terapéutico y el marcador peptídico.
3. El terapéutico dirigido de la reivindicación
2 en el que el espaciador es un engarce
Gly-Ala-Pro.
4. El terapéutico dirigido de una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores para su uso en el tratamiento de la
enfermedad de Pompe.
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