ES2344302T3 - Alfa glucosidasa acida y fragmentos de la misma. - Google Patents

Alfa glucosidasa acida y fragmentos de la misma. Download PDF

Info

Publication number
ES2344302T3
ES2344302T3 ES05713310T ES05713310T ES2344302T3 ES 2344302 T3 ES2344302 T3 ES 2344302T3 ES 05713310 T ES05713310 T ES 05713310T ES 05713310 T ES05713310 T ES 05713310T ES 2344302 T3 ES2344302 T3 ES 2344302T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
gaa
igf
remains
therapeutic
marker
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES05713310T
Other languages
English (en)
Other versions
ES2344302T9 (es
Inventor
Jonathan Lebowitz
John Maga
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zystor Therapeutics Inc
Original Assignee
Zystor Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zystor Therapeutics Inc filed Critical Zystor Therapeutics Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2344302T3 publication Critical patent/ES2344302T3/es
Publication of ES2344302T9 publication Critical patent/ES2344302T9/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Una proteína de fusión terapéutica dirigida que comprende un agente terapéutico que comprende los restos aminoacídicos 70-952 de la GAA humana, estando los restos 1-69 delecionados y un marcador peptídico, en el que el marcador peptídico se une directa o indirectamente al resto aminoacídico 70 de la GAA humana y dicho marcador comprende el resto 1 del IGF-II seguido por los restos 8-67, estando los restos 2-7 delecionados.

Description

Alfa glucosidasa ácida y fragmentos de la misma.
Referencia con solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica el beneficio del documento de Estados Unidos Nº de Serie 60/543.812 presentado el 10 de febrero de 2004.
Antecedentes
La alfa glucosidasa ácida (GAA) es una enzima lisosomal que hidroliza el enlace alfa 1-4 en maltosa y otros oligosacáridos lineales, incluyendo las ramificaciones externas del glucógeno, degradando de esta manera el exceso de glucógeno en el lisosoma (Hirschhorn y col. (2001) en The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease, Scriver, y col., eds. (2001), McGraw-Hill: Nueva York, págs. 3389-3420). Al igual que otras enzimas lisosomales de mamíferos, la GAA se sintetiza en el citosol y atraviesa el RE donde se glicosila con carbohidratos de tipo alto contenido en manosa, unidos a N. En el aparato de Golgi, el carbohidrato de alto contenido en manosa se modifica en proteínas lisosomales por la adición de manosa-6-fosfato (M6P) que dirige estas proteínas al lisosoma. Las proteínas modificadas con M6P se suministran al lisosoma mediante la interacción con cada uno de dos receptores de M6P. La forma de modificación más favorable es cuando se añaden dos M6P a un carbohidrato de alto contenido en manosa.
La actividad de GAA insuficiente en el lisosoma da como resultado la enfermedad de Pompe, una enfermedad también conocida como deficiencia de maltasa ácida (AMD), enfermedad de almacenamiento de glucógeno de tipo II (GSDII), glucogénesis de tipo II o deficiencia de GAA. La actividad enzimática disminuida se produce debido a una diversidad de mutaciones erróneas y sin sentido en el gen que codifica la GAA. Por consiguiente, el glucógeno se acumula en los lisosomas de todas las células en pacientes con la enfermedad de Pompe. En particular, la acumulación de glucógeno es más pronunciada en los lisosomas del músculo cardiaco y esquelético, hígado y otros tejidos. El glucógeno acumulado en última instancia perjudica la función muscular. En las formas más graves de la enfermedad de Pompe, la muerte se produce después de dos años de edad debido a fallos cardiorrespiratorios.
Actualmente, no se ha aprobado ningún tratamiento disponible para curar o retrasar el progreso de la enfermedad de Pompe. Las terapias de reemplazo enzimático actualmente en ensayos clínicos requieren que las células del los tejidos muscular y hepático capten la GAA administrada recombinante y se transporten a los lisosomas en estas células de una manera dependiente de M6P. Sin embargo, la GAA recombinante producida en células CHO modificadas por ingeniería genética y en la leche de conejos transgénicos, dos fuentes de enzimas usadas en ensayos recientes de terapia de reemplazo enzimático de Pompe, contiene muy poca M6P (Van Hove y col. (1996) Proc Natl Acad Sci USA, 93 (1): 65-70; y en la Patente de Estados Unidos Nº 6.537.785). Por lo tanto, el suministro dependiente de M6P de la GAA recombinante a los lisosomas no es eficaz, necesitando dosis elevadas e infusiones frecuentes. Por consiguiente, sigue existiendo una necesidad de procedimientos nuevos, más simples, más eficaces y más rentables para dirigir la enzima GAA terapéutica a los lisosomas de los pacientes.
Sumario de la invención
La presente invención permite el direccionamiento independiente de MP6 de las enzimas GAA o de tipo GAA humanas a los lisosomas del paciente usando una estrategia de direccionamiento basada en marcadores peptídicos. Como resultado, la presente invención proporciona el suministro eficaz de las enzimas GAA o de tipo GAA hacia las células diana.
La invención se refiere, en parte, al descubrimiento de que la GAA puede expresarse de manera recombinante usando una pluralidad de fases de lectura abierta que codifican polipéptidos que representan diferentes partes de la proteína GAA. Cuando se proporcionan juntas, los polipéptidos resultantes pueden cooperar para proporcionar la actividad enzimática deseada.
Por consiguiente, la presente invención se refiere en un aspecto a una proteína de fusión terapéutica dirigida como se define en las reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
Las Figuras 1-1 a 1-14 representan un alineamiento de secuencias de aminoácidos de los miembros seleccionados de 31 familias de glucósido hidrolasas.
La Figura 2 es una representación esquemática de la proteína GAA.
La Figura 3 representa estrategias ejemplares para la creación de una GAA marcada con péptidos.
La Figura 4 representa un experimento de captación ejemplar usando GAA de tipo silvestre y SS-GAA\Delta1-69.
La Figura 5 representa un experimento de captación ejemplar usando SS-GAA\Delta1-69 y SS-GILT\Delta2-7-GAA\Delta1-69.
La Figura 6 representa un análisis de transferencia de Western ejemplar de las proteínas GAA marcadas con 1-87-IGF-II; el panel de la izquierda se probó con un anticuerpo anti-GAA; el panel de la derecha se probó con un anticuerpo anti-IGF-II. Carril 1: pCEP-GILT1-87-GAA56-952; carril 2: pCEP-GILT1-87-R68A-GAA56-952-1; carril 3: pCEP-GILT1-87-R68A-\DeltaGS-GAA56-952-1; carril 4: pCEP-GILT\Delta2-7-spcr1-GAA70-952-1; carril 5: pCEP-GAA; carril 6: pCEP-GILT-GAA29-952.
La Figura 7 representa un análisis de transferencia de Western ejemplar comparando la proteolisis de la GAA de tipo silvestre con la GAA-791Asc.
La Figura 8 representa un análisis de transferencia de Western ejemplar de construcciones de la GAA de tipo silvestre y de la GAA con un marcador GILT modificado por ingeniería genética con un sitio proteasa de Factor X corriente abajo, GAA787GILTXa, GAA779GILTXa y GAA796GILTXa. También representa un modelo de procesamiento de GAA C-terminal.
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona un medio para la producción de GAA que es más eficaz dirigiendo a los lisosomas de las células de mamíferos, por ejemplo, células del músculo cardíaco y esquelético humano. La GAA es un miembro de 31 familias de glucósido hidrolasas (Figuras 1-1 a 1-14). La GAA humana se sintetiza como un precursor de 110 kDal (Wisselaar y col. (1993) J. Biol. Chem. 268 (3): 2223-31). La forma madura de la enzima es una mezcla de monómeros de 70 y 76 kDal (Wisselaar y col. (1993) J. Biol. Chem. 268(3): 2223-31). La enzima precursora tiene siete sitios potenciales de glicosilación y cuatro de éstos se conservan en la enzima madura (Wisselaar y col. (1993) J. Biol. Chem. 268(3): 2223-31). Los eventos de escisión proteolítica que producen la enzima madura ocurren en endosomas tardíos o en el lisosoma (Wisselaar y col. (1993) J. Biol. Chem. 268(3): 2223-31).
Los 160 aminoácidos C-terminal no se encuentran en la especie madura de 70 y 76 kDal. Sin embargo, determinados alelos de Pompe que dan como resultado la pérdida completa de la actividad de GAA mapean en esta región, por ejemplo Val949Asp (Becker y col. (1998) J. Hum. Genet. 62: 991). El fenotipo de este mutante indica que la parte C-terminal de la proteína, aunque no la parte de la especie de 70 ó 76 kDal, desempeña un papel importante en la función de la proteína. Se ha descrito recientemente que la parte C-terminal de la proteína, aunque se escinde del resto de la proteína durante el procesamiento, permanece asociada con la especie principal (Moreland y col. (1 de nov, 2004) J. Biol. Chem., Manuscript 404008200). Por consiguiente, los restos C-terminal podrían desempeñar una función directa en la actividad catalítica de la proteína. De manera alternativa, los restos C-terminal pueden estar implicados en promover el plegamiento adecuado de las partes N-terminal de la proteína.
Esta última posibilidad se sustenta por el comportamiento de determinados alelos de sacarasa-isomaltasa, una proteína relacionada. Esta familia incluye la proteína sacarasa-isomaltasa (SI) que contiene los dos dominios catalíticos glucósido hidrolasa homólogos, pero distintos, en tándem en un sólo polipéptido. Cada uno de éstos es similar en tamaño al polipéptido GAA completo y los dos dominios comparten una identidad del 36 y del 39% con GAA. La SI se expresa en las células intestinales de borde en cepillo y se localiza en la membrana apical de estas células polarizadas con los dominios catalíticos orientados hacia el lumen intestinal debido a un dominio transmembrana amino-terminal. Una vez que llega a la membrana apical, el dominio sacarasa se escinde del dominio isomaltasa amino-proximal por tripsina, mientras que el dominio isomaltasa permanece asociado a la membrana. Recientes estudios indican que el dominio sacarasa es necesario para el plegamiento adecuado y posterior transporte del dominio isomaltasa; se dice que la sacarasa es una acompañante intramolecular necesaria para el plegamiento del dominio isomaltasa (Jacob y col. (2002) J. Biol. Chem. 277: 32141).
El análisis de la expresión de varios casetes de GAA modificados genéticamente ha permitido la identificación de dos regiones que, aunque se escinden del polipéptido maduro, sin embargo son necesarias para la secreción de la proteína funcional de las células de mamíferos. La Figura 2 resume la organización de la GAA como se entiende ahora. El polipéptido precursor posee una secuencia de señal y un dominio transmembrana supuesto adyacente, un dominio en trébol (PFAM PF00088) que es un dominio rico en cisteína de aproximadamente 45 aminoácidos que contiene 3 enlaces disulfuro y se piensa que está implicado en las interacciones proteína-proteína o proteína-carbohidratos (Thim (1989) FEBS Lett. 250: 85), el dominio definido por el polipéptido maduro de 70/76 kDal y el dominio C-terminal. Una mutación en el dominio en trébol de SI tiene un impacto sobre el patrón de clasificación de membrana apical de SI (Spodsberg (2001) J. Biol. Chem. 276: 23506). Los datos presentados en los ejemplos 1 y 2 indican que tanto el dominio en trébol como el dominio C-terminal son necesarios para la producción de GAA funcional. Es posible que el dominio C-terminal interaccione con el dominio en trébol durante el plegamiento de la proteína facilitando quizás la formación de puentes disulfuro apropiados en el dominio en trébol.
El péptido de señal de GAA no se escinde en el RE causando por lo tanto que CAA se una a la membrana en el RE (Tsuji y col. (1987) Biochem. Int. 15(5): 945-952). En algunos tipos de células, la enzima puede encontrarse unida a la membrana plasmática con retención de la topología de la membrana del RE presumiblemente debido a que no escinde el péptido de señal (Hirschhom y col., en The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease, Valle, ed., 2001, McGraw-Hill: Nueva York, págs. 3389-3420). El análisis de secuencia sugiere la presencia de un dominio transmembrana adyacente al péptido de señal, que presumiblemente permite a la enzima permanecer unida a la membrana en determinadas condiciones.
Es posible que la asociación de GAA a la membrana mediante su péptido de señal sea un factor importante que contribuye al correcto direccionamiento de la enzima al lisosoma. Esto podría ocurrir de dos maneras: en primer lugar, la asociación a la membrana podría dirigir directamente la proteína al lisosoma. En segundo lugar, la asociación a la membrana podría aumentar el tiempo de residencia de la GAA en el aparato de Golgi aumentando de esta manera el nivel de manosa-6-fosfato añadido a la proteína. Esto tendría el efecto neto de aumentar la proporción de la enzima que se secreta hacia el lisosoma. En cualquier caso, si se eliminase esta asociación a la membrana, entonces se secretaría más de la enzima producida y si el último modelo fuera correcto la enzima secretada tendría menos manosa-6-fosfato.
La interrupción de la asociación de GAA a la membrana puede conseguirse sustituyendo el péptido de señal de GAA y la secuencia adyacente con un péptido de señal alterno para GAA.
Dominios de direccionamiento subcelular
La presente invención permite dirigir un agente terapéutico a un lisosoma usando una proteína o un análogo de una proteína, que se une específicamente a un receptor celular para esta proteína. El exterior de la superficie celular es topológicamente equivalente a los compartimentos endosomales, lisosomales, del aparato de Golgi y del retículo endoplásmico. Por tanto, la endocitosis de una molécula a través de la interacción con un receptor (o receptores) apropiado permite el transporte de la molécula a cualquiera de estos compartimentos sin atravesar una membrana. Una deficiencia genética debe dar como resultado una deficiencia de una actividad enzimática particular en cualquiera de estos compartimentos, el suministro de una proteína terapéutica puede conseguirse dirigiéndola con un ligando para el receptor (o receptores) apropiado.
Restos de direccionamiento lisosomal
La invención permite dirigir un agente terapéutico a un lisosoma. El direccionamiento puede ocurrir, por ejemplo, a través de la unión de un receptor de la membrana plasmática que luego pasa a través de un lisosoma. De manera alternativa, el direccionamiento puede ocurrir a través de la unión de un receptor plasmático que luego pasa a través de un endosoma tardío; el agente terapéutico puede después desplazarse desde el endosoma tardío hacia el lisosoma. Un mecanismo de direccionamiento lisosomal preferido implica la unión al receptor de M6P independiente de cationes.
\vskip1.000000\baselineskip
Receptor de M6P independiente de cationes
El receptor de M6P independiente de cationes es una glucoproteína transmembrana de cadena única de 275 kDa expresada de manera ubicua en los tejidos de mamíferos. Es uno de los dos receptores de mamíferos que se unen a M6P: el segundo se denomina receptor de M6P dependiente de cationes. El receptor de M6P dependiente de cationes requiere cationes divalentes para la unión a M6P; el receptor de M6P independiente de cationes no. Estos receptores desempeñan una función importante en el tránsito de las enzimas lisosomales a través del reconocimiento del resto de M6P en carbohidratos de alto contenido en manosa en las enzimas lisosomales. El dominio extracelular del receptor de M6P independiente de cationes contiene 15 dominios homólogos ("repeticiones") que se unen a varios grupos de ligandos en localizaciones específicas en el receptor.
El receptor de M6P independiente de cationes contiene dos sitios de unión para M6P: uno localizado en las repeticiones 1-3 y el otro localizado en las repeticiones 7-9. El receptor se une a ligandos de M6P monovalentes con una constante de disociación en el intervalo de \muM mientras que la unión a ligandos de M6P divalentes tiene una constante de disociación en el intervalo de nM, probablemente debido a la oligomerización del receptor. La captación del IGF-II por el receptor se potencia por la unión concomitante de ligandos de M6P multivalentes tales como enzimas lisosomales para el receptor.
El receptor de M6P independiente de cationes también contiene sitios de unión para al menos tres ligandos distintos que pueden usarse como restos de direccionamiento. El receptor de M6P independiente de cationes se une al IGF-II con una constante de disociación de aproximadamente 14 nM a un pH de aproximadamente 7,4, principalmente a través de interacciones con la repetición 11. De acuerdo con su función en el direccionamiento del IGP-II hacia el lisosoma, la constante de disociación aumenta aproximadamente 100 veces a un pH de aproximadamente 5,5 promoviendo la disociación del IGP-II en endosomas tardíos ácidos. Los receptores pueden unirse a formas del IGF-II O-glicosiladas de elevado peso molecular.
\vskip1.000000\baselineskip
Barrera hematoencefálica
Un desafío en la terapia para enfermedades de almacenamiento lisosomal es que muchas de estas enfermedades tienen implicaciones neurológicas significativas. Las enzimas terapéuticas administradas en la corriente sanguínea generalmente no atraviesan la barrera hematoencefálica y por lo tanto no puede aliviar los síntomas neurológicos asociados con las enfermedades. Sin embargo, se ha notificado que el IGF-II promueve el transporte a través de la barrera en hematoencefálica mediante transcitosis (Bickel y col. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 46(1-3): 247-79). Por tanto, construcciones GILT diseñadas apropiadamente deben poder atravesar la barrera hematoencefálica, permitiendo por primera vez un medio para tratar síntomas neurológicos asociados con enfermedades de almacenamiento lisosomal. Las construcciones pueden ensayarse usando ratones desprovistos de GUS como se describe en el Ejemplo 12. En el documento U. S. Nº de Serie 60/329.650, presentado el 16 octubre del año 2001 y en el documento U. S. Nº de Serie 10/136.639, presentado el 30 abril del año 2002 se describen detalles adicionales con respecto al diseño, construcción y ensayo de terapéuticos dirigidos que pueden transportarse desde la sangre al tejido neuronal.
Estructura del IGF-II
Dos equipos han resuelto la estructura del IGP-II por RMN (Terasawa y col. (1994) EMBO J. 13(23): 5590-7; Torres y col. (1995) J. Mol. Biol. 248(2): 385-401) (véase, por ejemplo, Protein Data Bank record IIGL). Las características generales de la estructura del IGF-II son similares a la del IGF-I y a la insulina. Los dominios A y B del IGF-II corresponden a las cadenas A y B de la insulina. Las características estructurales secundarias incluyen una hélice alfa desde los restos 11-21 de la región B conectada por un giro inverso en los restos 22-25 a una cadena beta corta en los restos 26-28. Los restos 25-27 parecen formar una pequeña lámina beta antiparalela; los restos 59-61 y los restos 26-28 también pueden participar en la formación de una lámina beta intermolecular. En los dominios A del IGF-II, las hélices alfa que abarcan los restos 42-49 y 53-59 se disponen en una configuración antiparalela perpendicular a la hélice de dominio B. Las agrupaciones hidrófobas formadas por dos de los tres puentes disulfuro y los restos hidrófobos conservados estabilizan estas características de la estructura secundaria. Los extremos N y C así como la región entre los restos 31-40 continúan sin definirse bien.
El IGF-II se une a los receptores de IGF-II/M6P e IGF-I con afinidad relativamente alta y se une con menor afinidad al receptor de insulina. El IGF-II también interacciona con varias IGFBP (proteínas de unión a IGF) séricas.
Unión al receptor de IGF-II/M6P
La sustitución de los restos 48-50 (Phe Arg Ser) del IGF-II por los restos correspondientes de insulina, (Thr, Ser, Ile) o la sustitución de los restos 54-55 (Ala Leu) por los restos correspondientes del IGF-I (Arg Arg) da como resultado la unión disminuida al receptor de IGF-II/M6P pero la conservación de la unión a los receptores del IGF-I y de la insulina (Sakano y col. (1991) J. Biol. Chem. 266(31): 20626-35).
El IGF-I y el IGF-II comparten idénticas secuencias y estructuras en la región de los restos 48-50 aunque difieren 1000 veces en la afinidad por el receptor del IGF-II. La estructura por RMN revela una diferencia estructural entre el IGF-I y el IGF-II en la región de los restos 53-58 del IGF-II (restos 54-59 del IGF-I): la hélice alfa se define mejor en el IGF-II que en el IGF-I y, a diferencia de IGF-I, no se pliega en la estructura alrededor de los restos 53 y 54 (Torres y col. (1995) J. Mol. Biol. 248(2): 385-401). Esta diferencia estructural se correlaciona con la sustitución de Ala 54 y Leu 55 en IGF-II por Arg 55 y Arg 56 en IGF-I. Es posible que la unión al receptor del IGF-II se interrumpa directamente por la presencia de restos cargados en esta región o bien que los cambios generados en la estructura por los restos cargados produzcan los cambios en la unión para el receptor de IGF-II. En cualquier caso, la sustitución de restos no cargados por los dos restos de Arg en el IGF-I da como resultado mayores afinidades por el receptor del IGF-II (Cacciari y col. (1987) Pediatrician 14(3): 146-53). Por tanto, la presencia de restos cargados positivamente en estas posiciones se correlaciona con la pérdida de unión al receptor del IGF-II.
El IGF-II se une a la repetición 11 del receptor de M6P independiente de cationes. De hecho, un minireceptor en el que únicamente la repetición 11 está fusionada a los dominios transmembrana y citoplásmicos del receptor de M6P independiente de cationes puede unirse al IGF-II (con una afinidad aproximadamente de una décima parte de la afinidad del receptor de longitud completa) y mediar la internalización del IGF-II y su suministro a los lisosomas (Grimme y col. (2000) J. Biol. Chem. 275(43): 33697-33703). Se conoce la estructura del dominio 11 del receptor de M6P (Protein Data Base entradas 1GP0 y 1GP3; Brown y col. (2002) EMBO J. 21(5): 1054-1062). Se cree que el supuesto sitio de unión al IGF-II es un bolsillo hidrófobo que interacciona con aminoácidos hidrófobos del IGF-II; los aminoácidos candidatos del IGF-II incluyen leucina 8, fenilalanina 48, alanina 54 y leucina 55. Aunque la repetición 11 es suficiente para la unión al IGF-II, las construcciones que incluyen partes más grandes del receptor de M6P independiente de cationes (por ejemplo, repeticiones 10-13 ó 1-5) generalmente se unen al IGF-II con mayor afinidad y dependencia de pH aumentada (véase, por ejemplo, Linnell y col. (2001) J. Biol. Chem. 276(26): 23986-23991).
Unión al receptor del IGF-I
La sustitución de los restos Tyr 27 por Leu, Leu 43 por Val o Ser 26 por Phe del IGF-II disminuye 94-, 56- y 4 veces respectivamente la afinidad del IGF-II por el receptor de IGF-I (Torres y col. (1995) J. Mol. Biol. 248(2): 385-401). La deleción de los restos 1-7 del IGF-II humano da como resultado una disminución de 30 veces la afinidad por el receptor del IGF-I humano y un aumento concomitante en la afinidad de 12 veces para el receptor del IGF-II de rata (Hashimoto y col. (1995) J. Biol. Chem. 270(30): 18013-8). La estructura por RMN del IGF-II demuestra que Thr 7 se localiza cerca de los restos 48 Phe y 50 Ser así como cerca del puente disulfuro 9 Cys-47 Cys. Se cree que la interacción de Thr 7 con estos restos puede estabilizar el hexapéptido N-terminal flexible necesario para la unión al receptor del IGF-I (Terasawa y col. (1994) EMBO J. 13(23) 5590-7). Al mismo tiempo esta interacción puede modular la unión para el receptor del IGF-II. El truncamiento del extremo C del IGF-II (restos 62-67) también parece disminuir 5 veces la afinidad del IGF-II para el receptor del IGF-I (Roth y col. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 181(2): 907-14).
Mutantes de deleción del IGF-II - Puntos de unión de fusión
El marcador peptídico puede fusionarse directamente al polipéptido GAA o puede separarse del polipéptido GAA mediante un engarce. Un engarce aminoacídico incorpora una secuencia de aminoácidos distinta de la que aparece en esa posición en la proteína natural y generalmente se diseña para ser flexible o interponerse a una estructura, tal como una hélice-\alpha, entre los dos restos de la proteína. Un engarzador puede ser relativamente corto, tal como la secuencia Gly-Ala-Pro o Gly-Gly-Gly-Gly-Pro o puede ser más largo, tal como, por ejemplo, de 10 a 25 aminoácidos de longitud.
El sitio de un punto de unión de fusión se selecciona para promover el plegamiento y la actividad adecuados de los dos compañeros de fusión y para evitar la separación prematura de un marcador peptídico de un polipéptido GAA. La Figura 3 ilustra cuatro estrategias ejemplares para crear una GAA marcada con GILT, basándose en el modelo para la organización de la proteína GAA como se ilustra en la Figura 2.
1.
Fusión del marcador en el extremo amino.
2.
Inserción del marcador entre el dominio en trébol y la región madura.
3.
Inserción del marcador entre la región madura y el dominio C terminal.
4.
Fusión del marcador en el extremo C de un GAA truncado y co-expresando el dominio C terminal.
El dominio de direccionamiento está fusionado, directamente o mediante un espaciador, al aminoácido 70 de GAA, una posición que permite la expresión de la proteína, la actividad catalítica del resto GAA, y el direccionamiento adecuado por el resto de direccionamiento como se describe en el Ejemplo 4.
Administración
Los terapéuticos diana producidos de acuerdo con la presente invención pueden administrarse a un huésped mamífero mediante cualquier vía. Por tanto, según sea apropiado, la administración puede ser oral o parenteral, incluyendo las vías de administración intravenosa e intraperitoneal. Además, la administración puede ser por inyecciones periódicas de un bolo del terapéutico o puede realizarse de manera continua por administración intravenosa o intraperitoneal a partir de un depósito que es externo (por ejemplo, una bolsa i.v.). En determinadas realizaciones, los terapéuticos de la presente invención pueden ser de uso farmacéutico. Es decir, determinadas realizaciones cumplen las normativas de pureza y control de calidad, necesarias para la administración en seres humanos. Las aplicaciones veterinarias también se incluyen dentro del significado pretendido como se usa en el presente documento.
Las formulaciones, tanto para su uso veterinario como para su uso médico en seres humanos, de los terapéuticos de acuerdo con la presente invención incluyen típicamente dichos terapéuticos en asociación con un transportador farmacéuticamente aceptable para este efecto y opcionalmente otro ingrediente (o ingredientes). Los transportadores pueden ser "aceptables" en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de las formulaciones y no perjudiciales al propio receptor. Los transportadores farmacéuticamente aceptables, en este aspecto, pretenden incluir cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, agentes de recubrimiento, antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y similares, compatibles con la administración del producto farmacéutico. El uso de dichos medios y agentes para la sustancia farmacéuticamente activa se conoce en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso de los mismos en las composiciones. Los compuestos activos complementarios (identificados de acuerdo con la invención y/o conocidos en la técnica) también pueden incorporarse en la composición. Las formulaciones pueden presentarse de manera conveniente en formas farmacéuticas unitarias y pueden prepararse mediante cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica de la farmacia/microbiología. En general, algunas formulaciones se preparan poniendo en contacto el terapéutico con un transportador líquido o un transportador sólido finamente dividido o los dos, y después, si es necesario, dar forma al producto en la formulación deseada.
Una composición farmacéutica de la invención se formula para ser compatible con su vía de administración pretendida. Los ejemplos de vías de administración incluyen administración oral o parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, por inhalación, transdérmica (tópica), transmucosa y a través del recto. Las soluciones o suspensiones usadas para la aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites no volátiles, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tal como alcohol bencílico o metil parabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito sódico; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tal como cloruro de sodio o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio.
Las soluciones útiles para la administración oral o parenteral pueden prepararse por cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica farmacéutica, descritos, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, (Gennaro, A., ed.), Mack Pub., 1990. Las formulaciones para la administración parenteral también pueden incluir glicocolato para la administración bucal, metoxisalicilato para la administración en el recto o ácido cítrico para la administración en la vagina. La preparación parenteral puede introducirse en ampollas, jeringas desechables o en viales de dosis múltiples fabricados de vidrio o plástico. Los supositorios para la administración en el recto también pueden prepararse mezclando el fármaco con un excipiente no irritante tal como manteca de cacao, otros glicéridos u otras composiciones que son sólidas a temperatura ambiente y líquidas a temperatura corporal. Las formulaciones también pueden incluir, por ejemplo, polialquilen glicoles tales como polietilenglicol, aceites de origen vegetal, naftalenos hidrogenados y similares. Las formulaciones para la administración directa pueden incluir glicerol y otras composiciones de elevada viscosidad. Otros transportadores parenterales potencialmente útiles para estos terapéuticos incluyen partículas de copolímero de etilen-vinil acetato, bombas osmóticas, sistemas de infusión implantables y liposomas. Las formulaciones para la administración por inhalación pueden contener como excipientes, por ejemplo, lactosa, o pueden ser soluciones acuosas que contienen, por ejemplo, polioxietilen-9-lauril éter, glicocolato y desoxicolato o soluciones oleaginosas para administrar en forma de gotas nasales o como un gel para aplicarse por vía manera intranasal. Los enemas de retención también pueden usarse para el suministro en el recto.
Las formulaciones de la presente invención adecuadas para administración oral pueden ser en forma de unidades separadas tales como cápsulas, cápsulas de gelatina, sobres, comprimidos, trociscos o pastillas para chupar, conteniendo cada una, una cantidad predeterminada del fármaco; en forma de un polvo o gránulos, en forma de una solución o una suspensión en un líquido acuoso o no acuoso; o en forma de una emulsión de aceite en agua o una emulsión de agua en aceite. El terapéutico también puede administrarse en forma de un bolo, electuario o pasta. Un comprimido puede fabricarse por compresión o moldeo del fármaco opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Los comprimidos preparados por compresión pueden prepararse comprimiendo, en una máquina adecuada, el fármaco en una forma fluida tal como un polvo o gránulos, opcionalmente mezclados con un agente aglutinante, lubricante, diluyente inerte, tensioactivo o dispersante. Los comprimidos moldeados pueden fabricarse moldeando, en una máquina adecuada, una mezcla del fármaco en polvo y un transportador humedecido con un diluyente líquido inerte.
Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un transportador comestible. Para el propósito de la administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes. Las composiciones orales preparadas usando un transportador líquido para su uso como un elixir bucal incluyen el compuesto en el transportador líquido y se aplican por vía oral y se enjuagan y expectoran o se tragan. Los agentes aglutinantes farmacéuticamente compatibles, y/o materiales adyuvantes pueden incluirse como parte de la composición. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa; un agente disgregante tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un emoliente tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; un agente saporífero tal como saporífero de menta, metil salicilato o naranja.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para el uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (es decir, hidrolubles) o dispersiones y polvos estériles para la preparación improvisada de soluciones o dispersiones estériles inyectables. Para la administración intravenosa, los transportadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteroestática, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición puede ser estéril y puede ser líquida de manera que pueda introducirse fácilmente en una jeringuilla. Puede ser estable en condiciones de fabricación y almacenaje y puede conservarse contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El transportador puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La correcta fluidez puede mantenerse, por ejemplo, usando un recubrimiento tal como lecitina, manteniendo el tamaño necesario de las partículas en el caso de dispersión y usando tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede conseguirse por diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes, tales como manitol, sorbitol y cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada en las composiciones inyectables puede llevarse a cabo incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el compuesto activo en la cantidad necesaria en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, si se requiere, seguido por esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos de preparación incluyen el secado al vacío y la liofilización que producen un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución filtrada estéril del mismo.
Las formulaciones adecuadas para la administración intra-articular pueden ser en forma de una preparación acuosa estéril del terapéutico que puede estar en forma microcristalina, por ejemplo, en forma de una suspensión microcristalina acuosa. Las formulaciones liposomales o los sistemas de polímeros biodegradables también pueden usarse para presentar la composición terapéutica tanto para la administración intra-articular como oftálmica.
Las formulaciones adecuadas para la administración tópica, incluyen tratamientos oculares, incluyen preparaciones líquidas o semilíquidas tales como linimentos, lociones, geles, pomadas, emulsiones de aceite en agua o de agua en aceite, tales como cremas, pomadas o pastas; o soluciones o suspensiones tales como gotas. Las formulaciones para la administración tópica en la superficie de la piel pueden prepararse dispersando el terapéutico con un transportador dermatológicamente aceptable tal como una loción, crema, pomada o jabón. En algunas realizaciones, los transportadores útiles pueden formar una película o una capa sobre la piel para localizar la aplicación e impedir la retirada. Cuando se desea la adhesión en la superficie del tejido, la composición puede incluir el terapéutico dispersado en una composición de trombina-fibrinógeno u otro bioadhesivo. El terapéutico puede después pintarse, pulverizarse o de otra manera aplicarse en la superficie del tejido deseado. Para la administración tópica en las superficies tisulares internas, el agente puede dispersarse en un adhesivo tisular líquido u otra sustancia conocida para potenciar la absorción en una superficie tisular. Por ejemplo, como ventaja puede usarse soluciones de hidroxipropil celulosa o de fibrinógeno/trombina. De manera alternativa, también pueden usarse soluciones de recubrimiento tisular, tales como formulaciones que contienen pectina.
Para los tratamientos por inhalación, tales como para asma, puede usarse la inhalación de polvos (formulaciones autopropulsadas o por pulverización) distribuidos con un pulverizador, un nebulizador o un atomizador. Dichas formulaciones pueden ser en forma de un polvo finamente triturado, para la administración pulmonar, desde un dispositivo de inhalación de polvo o formulaciones autopropulsadas de distribución de polvo. En el caso de soluciones autopropulsadas y formulaciones para pulverizar, el efecto puede conseguirse seleccionando una válvula que tenga las características de pulverización deseadas (es decir, que pueda producir una pulverización que tenga el tamaño de partícula deseado) o incorporando el agente activo como un polvo suspendido en un tamaño de partícula controlado. Para la administración por inhalación, los terapéuticos también pueden suministrarse en forma de una pulverización en aerosol desde un envase o dispensador presurizado que contiene un propulsor adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono o un nebulizador. También puede usarse gotas nasales.
La administración sistémica también puede ser por medios transmucosos o transdérmicos. Para la administración transmucosa o transdérmica, en la formulación se usan penetrantes apropiados para penetrar la barrera. Dichos penetrantes generalmente se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados del ácido fusídico. La administración transmucosa puede conseguirse a través del uso de pulverizadores nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los terapéuticos se formulan típicamente en pomadas, solvatos, geles o cremas como se conoce generalmente en la técnica.
En una realización, los terapéuticos se preparan con transportadores que protegerán contra la eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Pueden usarse polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como etileno vinil acetato, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los procedimientos para la preparación de dichas formulaciones serán evidentes para los expertos en la materia. Los materiales también pueden obtenerse en el mercado en Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposomales también pueden usarse como transportadores farmacéuticamente aceptables. Éstas pueden prepararse de acuerdo con los procedimientos conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 4.522.2811. También pueden usarse microsomas y micropartículas.
Las composiciones orales o parenterales pueden formularse en formas farmacéuticas unitarias para facilitar su administración y uniformidad de la dosificación. Las formas farmacéuticas unitarias se refieren a unidades físicamente separadas ajustadas como dosificaciones unitarias para el sujeto a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada del compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado junto con el transportador farmacéutico necesario. La especificación para las formas farmacéuticas unitarias de la invención se establece y dependen directamente de las características particulares del compuesto activo, del efecto terapéutico particular a conseguir y de las limitaciones inherentes en la técnica de la preparación de compuestos tal como un compuesto activo para el tratamiento de individuos.
Generalmente, los terapéuticos identificados de acuerdo con la invención pueden formularse para la administración parenteral u oral en seres humanos u otros mamíferos, por ejemplo, en cantidades terapéuticamente eficaces, por ejemplo, cantidades que proporcionan concentraciones apropiadas del fármaco al tejido diana durante un tiempo suficiente para inducir el efecto deseado. Adicionalmente, los terapéuticos de la presente invención pueden administrarse en solitario o en combinación con otras moléculas que se sabe que tienen un efecto beneficioso sobre la enfermedad o indicación particular de interés. A modo de ejemplo únicamente, los cofactores útiles incluyen cofactores para el alivio sintomático, que incluyen antisépticos, antibióticos, agentes antivirales antifúngicos y analgésicos y anestésicos.
La concentración eficaz de los terapéuticos identificados de acuerdo con la invención que va a suministrarse en una composición terapéutica variarán dependiendo de varios factores, incluyendo la dosificación final deseada del fármaco a administrar y de la vía de administración. La dosificación preferida a administrar es probable que también dependa de dichas variables como el tipo y alcance de la enfermedad o indicación a tratar, el estado general de salud del paciente particular, la eficacia biológica relativa del agente terapéutico suministrado, la formulación del agente terapéutico, la presencia y tipos de excipientes en la formulación y de la vía de administración. En algunas realizaciones, los terapéuticos de la presente invención pueden proporcionarse a un individuo usando unidades de dosis típicas deducidas de los estudios en mamíferos descritos anteriormente usando primates no humanos y roedores. Como se ha descrito anteriormente, una unidad de dosificación se refiere a una unitaria, es decir una sola dosis que puede administrarse a un paciente y que puede manipularse y envasarse fácilmente, permaneciendo como una dosis unitaria física y biológicamente estable que comprende o el agente terapéutico como tal o una mezcla de este con diluyentes o transportadores farmacéuticos sólidos o líquidos.
En determinadas realizaciones los organismos se modifican por ingeniería genética para producir los terapéuticos identificados de acuerdo con la invención. Estos organismos pueden liberar el terapéutico para recogerse o pueden introducirse directamente en un paciente. En otra serie de realizaciones, las células pueden utilizarse para servir como un transportador de los terapéuticos identificados de acuerdo con la invención.
Los terapéuticos de la invención también incluyen los derivados de "profármacos". El término profármaco se refiere a un derivado farmacológicamente inactivo (o parcialmente inactivo) de una molécula precursora que requiere biotransformación, o espontánea o enzimática, dentro del organismo para liberar o activar el componente activo. Los profármacos son variaciones o derivados de los terapéuticos de la invención que tienen grupos que pueden escindirse en condiciones metabólicas. Los profármacos se convierten en los terapéuticos de la invención de que son farmacéuticamente activos in vivo, cuando experimentan solvólisis en condiciones fisiológica o experimentan degradación enzimática. El profármaco de la presente invención puede denominarse sencillo, doble, triple y así sucesivamente, dependiendo del número de etapas de biotransformación necesarias para liberar el o activar el componente farmacológico activo dentro del organismo e indicando el número de funcionalidades presente en la forma de tipo precursora. Las formas de los profármacos a menudo ofrecen ventajas de solubilidad, compatibilidad tisular o liberación prolongada en el organismo de los mamíferos (véase, Bundgard, Design of Prodrugs, págs. 7-9, 21-24, Elsevier, Amsterdam 1985 y Silverman, The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action, págs. 352-401, Academic Press, San Diego, Calif., 1992). Además, los derivados de los profármacos de acuerdo con la presente invención pueden combinarse con otras características para potenciar la biodisponibilidad.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos, incluyendo ejemplos comparativos
Ejemplo 1
Expresión en trans de GAA
Para generar un casete génico que contiene la secuencia de señal del IGF-II humano fusionada a los restos 791-952 de la GAA humana (el dominio C terminal), se usaron los siguientes cebadores: GAA41: GGAATTCAGGCGCGCCG
GCAGCTCCCCGTGAGCCAGCC GAA27: GCTCTAGACTAACACCAGCTGACGAGAAACTGC. GAA41 y
GAA27 se usaron para amplificar el dominio C terminal de GAA por PCR. El fragmento amplificado contiene un sitio Asc I en el extremo 5'. El marcador-N SS que codifica la secuencia de señal del IGF-II (restos 1-25) con un sitio Asc I en el extremo 3' se fusionó después en el sitio Asc I al dominio C terminal de GAA y el casete se clonó en pCEP4 para generar el plásmido pCEP-SS-GAA-791-952. A continuación se muestra la secuencia de ácido nucleico del marcador-N SS.
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de ADN del marcador-N SS:
\vskip1.000000\baselineskip
1 
\vskip1.000000\baselineskip
De manera similar se generaron los siguientes plásmidos adicionales: pCEP-GAA \Delta 817-952 que carece de los restos GAA C terminales 817-952 y pCEP-GAA \Delta 817-952-GILT \Delta 1-7 que es similar a pCEP-GAA \Delta 817-952 excepto por la adición de un marcador GILT\Delta1-7 C-terminal. Introduciendo un codón de terminación después del resto aminoacídico 816, se generó GAA \Delta 817-952. Para facilitar el proceso de clonación, el codón de terminación continuó después por el sitio de restricción XbaI en el extremo 3' y un extremo 5' que contiene un sitio de restricción EcoRI. A continuación se muestran las secuencias de ADN y de aminoácidos de GAA \Delta 817-952.
\newpage
Secuencia de ADN de GAA \Delta 817-952.
2
3 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de aminoácidos de GAA \Delta 817-952.
4
5
Para determinar si la región C- terminal de GAA funciona cuando se expresa en trans, el pCEP-SS-GAA-791-952 se transfectó sólo en células HEK293, así como en combinación con el plásmido pCEP-GAA \Delta 817-952 o con pCEP-GAA \Delta 817-952-GILT \Delta 1-7. Como control, pCEP-GAA \Delta 817-952 y pCEP-GAA \Delta 817-952-GILT \Delta 1-7 también se transfectaron en sólo en células HEK293. Para los experimentos se usaron procedimientos de transfección convencionales. Para las transfecciones plasmídicas únicas, se usó 1 \mug de ADN plasmídico. Para las co-transfecciones, se usaron 0,5 \mug de cada plásmido. Se mezcló 1 \mug de ADN total con 96 \mul de medio de cultivo con HEK293 sin suero y 4 \mul de FuGene6 (Roche) según lo indicado por el fabricante. Se añadieron 50 \mul de la mezcla a cada pocillo de células HEK293 por duplicado que crecían en placas de 12 pocillos en 1 ml de Medio Eagle modificado por Dulbecco complementado con 1,5 g/l de bicarbonato sódico, FBS inactivado con calor al 10% y L-glutamina 4 mM: las células se incubaron durante 2-3 días a 37ºC en CO_{2} al 5%.
El medio de cultivo se recogió y se ensayó para determinar la actividad de GAA como se describe (Reuser, A.J., y col. (1978) Am. J. Hum. Genet 30:1 32-143). No se detectó actividad de GAA en el medio recogido de las células HEK293 transfectadas sólo con plásmidos. Por el contrario, GAA presentaba actividad en el medio de cultivo recogido de células HEK293 cotransfectadas con pCEP-SS-GAA-791-952 y o con pCEP-GAAA817-952 o con pCEP-GAA0817-952-GILT\Delta1-7 (Tabla 1).
Por lo tanto, las dos construcciones de deleción C-terminal pCEP-GAA\Delta817-952 y pCEP-GAA\Delta817-952-GILT\Delta1-7 sólo expresan proteínas funcionales cuando se co-expresan con el plásmido del dominio C terminal, pCEP-SS-GAA-791-952. Este experimento demostró que la región C terminal de GAA coopera con la región N terminal, madura cuando se co-expresa en trans.
TABLA 1 Co-transfección transitoria de los dominios C-terminal y N- terminal de GAA
6
Ejemplo 2
Región necesaria para expresión en trans eficaz de GAA
En el experimento de co-transfección transitoria descrito en el Ejemplo 1, la región GAA que incluye los restos aminoacídicos 792-817 está presente en las dos mitades de las construcciones de expresión en trans. Para determinar si para la expresión en trans eficaz es necesario el solapamiento de esta región, se diseño un par de construcciones, pCEP-GAA\Delta791-952-GILT\Delta1-7 y PCEP-SSGAA-791-952, sin solapamiento y el marcador GILT se fusionó en la posición 791. Como se indica en la Tabla 2, los experimentos de co-transfección transitoria demuestran que para la expresión en trans eficaz de GAA, se requiere la presencia de los restos aminoacídicos 792-817 dentro del dominio C-terminal.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 2 Los restos aminoacídicos 792-817 son necesarios para la expresión en trans eficaz de GAA
7 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3
Construcción de una proteína GAA con un marcador GILT interno
Para generar primero una inserción de la secuencia de nucleótidos GGCGCGCCG (SEC ID Nº: 11) después del nucleótido 2370 de la secuencia de GAA humana completa (SEC ID Nº: 9) se usó PCR. Esta inserción forma un sitio de restricción AscI anterior a Ala791. El marcador GILT se amplificó por PCR con los siguientes oligonucleótidos de ADN:
IGF7:
gctctagaggcgcgccCTCGGACTTGGCGGGGGTAGC
IGF8:
ggaattcaggcgcgcgccgGCTTACCGCCCCAGTGAGAC
El marcador GILT amplificado contiene un sitio de restricción AscI en cada extremo. Este marcador GILT se digirió con AscI y se insertó en el sitio AscI anterior a Ala791 de GAA como se describió anteriormente. La secuenciación del ADN confirmó la orientación en fase de lectura de la inserción de GILT. Este casete GALA que contiene un marcador GILT interno anterior a Ala791 se expresó en el vector pCEP4 en un plásmido denominado pCEP-GAA-IRGILT-4. Se observó que pCEP-GAA-IRGILT-4 contenía una mutación generada por PCR T1712C dentro de la secuencia codificante de GAA. Esta construcción produjo la proteína GAA funcional.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 4
Construcciones de deleción de GAA con el marcador GILT N-terminal
Usando los cebadores indicados en la tabla 3, se generó una serie de cinco marcadores adecuados para la expresión de GAA N-terminal (marcadores-N) por amplificación con PCR. El marcador-N GILT contiene la secuencia de señal nativa del IGF-II y el epítope de GILT completo. El marcador-N SS sólo contiene la secuencia de señal del IGF-II.
Por ejemplo, el marcador-N GILT\Delta1-7 contiene la secuencia de señal del IGF-II y los restos 8-67 epitópicos de GILT. Este se generó con tres reacciones PCR; (1) amplificación por PCR del molde de ADN del IGF-II humano usando los cebadores IGF1 e IGF4; (2) amplificación por PCR del molde de ADN del IGF-II humano usando los cebadores IGF2 e IGF7; y (3) amplificación por PCR de los productos de las dos primeras reacciones de PCR usando los cebadores IGF1 e IGF7.
El marcador-N GILT\Delta2-7 de la invención contiene la secuencia de señal IGF-II y el resto 1 epitópico de GILT seguido por los restos 8-67. Este se generó con tres reacciones PCR: (1) (1) amplificación por PCR del molde de ADN del IGF-II humano usando los cebadores IGF1 e IGF5; (2) amplificación por PCR del molde de ADN del IGF-II humano usando los cebadores IGF3 e IGF7; y (3) amplificación por PCR de los productos de las dos primeras reacciones de PCR usando los cebadores IGF1 e IGF7.
El marcador-N SSGAA-GILT contiene la secuencia de señal GAA dentro de los restos 1-69, seguido por el epítopo completo de GILT. Este se generó con tres reacciones PCR: (1) amplificación por PCR del molde de ADN de la GAA humana usando los cebadores GAA13 y GI1; (2) amplificación por PCR del molde de IF-11 humano usando los cebadores GI2 e IGF7; y (3) amplificación por PCR de los productos de las dos primeras reacciones de PCR usando los cebadores GAA13 e IGF7.
Cada marcador-N contiene un sitio de restricción EcoRI en 5' y sitios AscI y Xbal en 3'. El sitio AscI se usó para fusionar cada marcador con las construcciones de deleción N-terminal de GAA descritas a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 3 Construcciones del marcador N-terminal
8 
\vskip1.000000\baselineskip
Usando técnicas de PCR, se delecionaron partes de la secuencia de ADN de GAA humana N-terminal y se sustituyeron por un sitio de restricción AscI. Los oligonucleótidos de ADN 5' usados para definir el sitio de deleción se indican a continuación (Tabla 4). Dentro de la secuencia codificante de GAA se emparejaron oligonucleótidos 5' con diversos oligonucleótidos 3' y los fragmentos de ADN resultantes se fusionaron posteriormente con la secuencia codificante de GAA C-terminal completa. Para completar los casetes de expresión, los sitios AscI N-terminal se fusionaron a uno de los cinco marcadores N-terminal (marcadores-N) indicados anteriormente (Tabla 4).
TABLA 4 Construcciones de deleción N-terminal de GAA. Las secuencias complementarias a la secuencia codificante de GAA se indican en mayúsculas. Los sitios de restricción EcoRI y AscI se indican en minúsculas
9 
\vskip1.000000\baselineskip
Los casetes de expresión indicados en la Taba 4 contienen un marcador N-terminal (marcador-N) fusionado a una deleción de GAA N-terminal en un sitio AscI común. Los casetes se clonaron dentro del sitio de clonación múltiple del vector de expresión pCEP4 y se transfectaron dentro de células HEK293 usando el reactivo de transfección FuGene6 (Roche): Se recogió medio de la expresión transitoria 2-3 días después de la transfección y se ensayó para determinar la actividad de la GAA secretada usando un ensayo enzimático convencional (Reuser, A.J., y col. (1978) Am. J. Hum. Genet. 30: 132-143).
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 5 Expresión transitoria relativa de las construcciones de GAA marcadas con N
10
11 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Como indican estos datos, la parte N-terminal de GAA que incluye los restos 1-80 es indispensable para la expresión transitoria, pero las deleciones que interrumpen o eliminan el dominio en trébol no producen la proteína funcional.
Adicionalmente, como se indica en la Tabla 6, la secreción de GAA puede mejorarse colocando apropiadamente un péptido de señal heterólogo, en este caso el péptido de señal IGF-II. La colocación del péptido de señal IGF-II en el resto 56 ó 70 de GAA proporciona un aumento triple de la secreción de GAA en comparación con el GAA nativo, mientras que la colocación del péptido de señal IGF-II en la posición 29 no produce esto. Esto puede deberse a la conservación de un supuesto dominio transmembrana adyacente al péptido de señal de GAA.
TABLA 6 El cambio de las posiciones de la secuencia de señal de GAA influye en la secreción de GAA
12
Sin embargo, la sustitución del péptido de señal de GAA nativo y el dominio transmembrana con un péptido de señal heterólogo disminuye el nivel captación celular dependiente de manosa-6-fosfato asociada con la proteína (Figura 4). En la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 20040005309 y 20040006008, se describieron experimentos de captación, cuyos contenidos se incorporan en el presente documento por referencia. Como se ilustra en la Figura 4, pCEP-SS-GAA\Delta1-69 tenía un tercio de la cantidad de captación en fibroblastos de Pompe al igual que pCEP-GAA de tipo silvestre.
En cambio, como se ilustra en la Figura 5, comparando la captación de pCEP-SS-GAA\Delta1-69 con una construcción con el marcador GILT, pCEP-SS-GILT\Delta2-7-GAA\Delta1-69, era evidente que el marcador GILT promueve la captación específica que puede competir por IGF-II. Por tanto, la colocación del marcador peptídico en la posición 70 no sólo permite la expresión eficaz de la proteína de fusión y la actividad de GAA, sino que también proporciona un marcador peptídico que se pliega adecuadamente y es accesible, lo que permite la captación mediada por el receptor en las células diana.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 5
Construcciones con el marcador GILT1-87 y variantes

Claims (4)

1. Una proteína de fusión terapéutica dirigida que comprende un agente terapéutico que comprende los restos aminoacídicos 70-952 de la GAA humana, estando los restos 1-69 delecionados y un marcador peptídico, en el que el marcador peptídico se une directa o indirectamente al resto aminoacídico 70 de la GAA humana y dicho marcador comprende el resto 1 del IGF-II seguido por los restos 8-67, estando los restos 2-7 delecionados.
2. El terapéutico dirigido de la reivindicación 1 que comprende adicionalmente un espaciador entre el agente terapéutico y el marcador peptídico.
3. El terapéutico dirigido de la reivindicación 2 en el que el espaciador es un engarce Gly-Ala-Pro.
4. El terapéutico dirigido de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Pompe.
ES05713310T 2004-02-10 2005-02-10 Alfa glucosidasa acida y fragmentos de la misma. Expired - Lifetime ES2344302T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US54381204P 2004-02-10 2004-02-10
US543812P 2004-02-10

Publications (2)

Publication Number Publication Date
ES2344302T3 true ES2344302T3 (es) 2010-08-24
ES2344302T9 ES2344302T9 (es) 2011-03-11

Family

ID=34860468

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES05713310T Expired - Lifetime ES2344302T3 (es) 2004-02-10 2005-02-10 Alfa glucosidasa acida y fragmentos de la misma.

Country Status (11)

Country Link
US (2) US20050244400A1 (es)
EP (1) EP1716232B9 (es)
JP (1) JP4914224B2 (es)
CN (1) CN1922313B (es)
AT (1) ATE465250T1 (es)
AU (1) AU2005212435B2 (es)
CA (1) CA2553955C (es)
DE (1) DE602005020745D1 (es)
ES (1) ES2344302T3 (es)
IL (2) IL177079A (es)
WO (1) WO2005078077A2 (es)

Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2416492C (en) 2000-07-18 2008-04-29 Duke University Treatment of glycogen storage disease type ii
US7560424B2 (en) 2001-04-30 2009-07-14 Zystor Therapeutics, Inc. Targeted therapeutic proteins
US7629309B2 (en) 2002-05-29 2009-12-08 Zystor Therapeutics, Inc. Targeted therapeutic proteins
US20030072761A1 (en) 2001-10-16 2003-04-17 Lebowitz Jonathan Methods and compositions for targeting proteins across the blood brain barrier
JP4914224B2 (ja) 2004-02-10 2012-04-11 バイオマリン ファーマシューティカル インコーポレイテッド 酸性αグルコシダーゼおよびそのフラグメント
EP3782655A1 (en) 2005-05-17 2021-02-24 Amicus Therapeutics, Inc. A method for the treatment of pompe disease using 1-deoxynojirimycin and derivatives
GB0612623D0 (en) * 2006-06-26 2006-08-02 Ares Trading Sa Proteins
CN101636200A (zh) * 2006-11-13 2010-01-27 齐斯特治疗公司 用于治疗庞贝氏症的方法
EP2099523A2 (en) * 2006-11-13 2009-09-16 ZyStor Therapeutics , Inc. Methods for treating pompe disease
US20120322861A1 (en) 2007-02-23 2012-12-20 Barry John Byrne Compositions and Methods for Treating Diseases
CA2887752C (en) * 2007-04-03 2020-03-24 Vib Vzw Glycosylation of molecules
JP5901877B2 (ja) 2007-07-27 2016-04-13 アーメイゲン・テクノロジーズ・インコーポレイテッドＡｒｍａｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ． 中枢神経系のα−Ｌ−イデュロニダーゼ活性を増加させるための方法および組成物
US20110223147A1 (en) 2008-05-07 2011-09-15 Zystor Therapeutics, Inc. Lysosomal targeting peptides and uses thereof
EP2305309A2 (en) * 2008-06-13 2011-04-06 Proyecto de Biomedicina Cima, S.L. Conjugates for the administration of biologically active compounds
WO2010117785A1 (en) * 2009-03-31 2010-10-14 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Leptin antagonist and methods of use
ES2758827T3 (es) 2009-06-17 2020-05-06 Biomarin Pharm Inc Formulaciones para enzimas lisosómicas
CN102712914A (zh) 2009-09-29 2012-10-03 根特大学 水解甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接为磷酸-6-甘露糖
ES2725200T3 (es) 2009-10-09 2019-09-20 Armagen Inc Métodos y composiciones para aumentar la actividad de iduronato 2-sulfatasa en el SNC
DK2501805T3 (en) 2009-11-19 2019-04-15 Oxyrane Uk Ltd Yeast strains producing mammalian-like complex N-Glycans
UA115648C2 (uk) 2010-06-25 2017-12-11 Шае Хюмен Дженетік Терапіс, Інк. Доставка терапевтичних агентів до цнс
PL2593131T3 (pl) 2010-06-25 2020-01-31 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Sposoby i kompozycje do dostarczania sulfatazy-2-iduronianiu do oun
RU2012154576A (ru) 2010-06-25 2014-07-27 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. Способы и композиции для доставки к цнс гепаран-n-сульфатазы
NZ702801A (en) 2010-06-25 2016-08-26 Shire Human Genetic Therapies Treatment of sanfilippo syndrome type b
CN104857504A (zh) 2010-06-25 2015-08-26 夏尔人类遗传性治疗公司 芳基硫酸酯酶a cns递送的方法和组合物
BR112012033216B1 (pt) 2010-06-25 2022-10-11 Shire Human Genetic Therapies, Inc Uso de uma formulação estável compreendendo uma proteína arilsulfatase a (asa) e formulação estável para administração intratecal
WO2012042387A2 (en) 2010-09-29 2012-04-05 Oxyrane Uk Limited De-mannosylation of phosphorylated n-glycans
BR112013007616B1 (pt) 2010-09-29 2023-01-24 Oxyrane Uk Limited Métodos para retirar o cap ("uncapping") de porções de manose-1- fosfo-6-manose e desmanosilar n-glicanos fosforilados em uma glicoproteína, para direcionar uma glicoproteína para o interior de uma célula de mamífero, e para converter uma glicoproteína de uma primeira forma que não se liga substancialmente a um receptor de manose-6-fosfato em uma segunda forma que se liga substancialmente a um receptor de manose-6-fosfato em uma célula de mamífero
EP2699676A1 (en) * 2011-04-22 2014-02-26 Genzyme Corporation Modified acid alpha glucosidase with accelerated processing
WO2013096899A2 (en) 2011-12-23 2013-06-27 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Stable formulations for cns delivery of arylsulfatase a
US9404100B2 (en) 2012-03-07 2016-08-02 Amicus Therapeutics, Inc. High concentration alpha-glucosidase compositions for the treatment of Pompe disease
EP3628326B1 (en) 2012-03-15 2024-02-28 Oxyrane UK Limited Methods and materials for treatment of pompe's disease
ES2859761T3 (es) 2012-05-03 2021-10-04 Amicus Therapeutics Inc Pautas posológicas para el tratamiento de enfermedad de Pompe
HUE051632T2 (hu) * 2012-06-19 2021-03-29 Univ Florida Betegségek kezelésére szolgáló készítmények és eljárások
DK3115372T3 (da) * 2012-11-27 2019-06-11 Biomarin Pharm Inc Målrettede terapeutiske lysosomale enzymfusionsproteiner og anvendelser deraf
FI3201320T3 (fi) 2014-09-30 2024-01-08 Amicus Therapeutics Inc Erittäin tehokas hapan alfa-glukosidaasi parannetuilla hiilihydraateilla
EP3220958A1 (en) * 2014-10-24 2017-09-27 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Lysosomal targeting of enzymes, and uses thereof
US20180216111A1 (en) * 2015-02-27 2018-08-02 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense-induced exon2 inclusion in acid alpha-glucosidase
US9981021B1 (en) 2015-04-09 2018-05-29 Kinetiq, Inc. Subcutaneous therapeutic enzyme formulations, uses, and methods for generating thereof
MX2018005258A (es) 2015-11-06 2019-09-04 Biomarin Pharm Inc Ensayos basados en células para la detección de anticuerpos u otros factores que neutralizan la absorción de enzimas lisosómicas.
DK3397273T3 (da) * 2015-12-30 2021-08-09 Amicus Therapeutics Inc Forstærket syre-alfa-glucosidase til behandling af pompes sygdom
CA3010205A1 (en) 2015-12-30 2017-07-06 Amicus Therapeutics, Inc. Augmented acid alpha-glucosidase for the treatment of pompe disease
EP4275751A3 (en) 2016-02-24 2023-12-27 BioMarin Pharmaceutical Inc. Improved naglu fusion protein formulation
AU2017239641A1 (en) 2016-03-30 2018-10-18 Amicus Therapeutics, Inc. Formulations comprising recombinant acid alpha-glucosidase
KR20250050123A (ko) 2016-03-30 2025-04-14 아미쿠스 세라퓨틱스, 인코포레이티드 고 m6p 재조합 단백질의 선택 방법
WO2017184529A1 (en) 2016-04-18 2017-10-26 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense oligomers and methods of using the same for treating diseases associated with the acid alpha-glucosidase gene
NL2017294B1 (en) 2016-08-05 2018-02-14 Univ Erasmus Med Ct Rotterdam Natural cryptic exon removal by pairs of antisense oligonucleotides.
EP3293203A1 (en) * 2016-09-12 2018-03-14 Genethon Acid-alpha glucosidase variants and uses thereof
IL299325B2 (en) * 2016-09-12 2025-08-01 Inst Nat Sante Rech Med Acid-alpha glucosidase variants and uses thereof
PT3624831T (pt) 2017-05-15 2023-07-04 Amicus Therapeutics Inc Alfa-glucosidase ácida humana recombinante
EP3635009B1 (en) 2017-06-07 2026-02-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for internalizing enzymes
IL276464B2 (en) 2018-02-07 2026-01-01 Regeneron Pharma Methods and compositions for administering therapeutic protein
BR112020021962A2 (pt) 2018-04-30 2021-01-26 Amicus Therapeutics, Inc. construtos para terapia gênica e métodos de uso
MA52626A (fr) 2018-05-17 2021-03-24 Regeneron Pharma Anticorps anti-cd63, conjugués et leurs utilisations
US12018087B2 (en) 2018-08-02 2024-06-25 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle-targeting complexes comprising an anti-transferrin receptor antibody linked to an oligonucleotide and methods of delivering oligonucleotide to a subject
AU2019316103B2 (en) 2018-08-02 2026-02-19 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
WO2020077114A2 (en) 2018-10-10 2020-04-16 Amicus Therapeutics, Inc. Disulfide bond stabilized polypeptide compositions and methods of use
EP3898689A1 (en) 2018-12-20 2021-10-27 Armagen, Inc. Purification of iduronate-2-sulfatase immunoglobulin fusion protein
KR20220004696A (ko) * 2019-04-30 2022-01-11 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 폼페병의 치료에 유용한 조성물
AU2020361703A1 (en) * 2019-10-10 2022-04-28 Amicus Therapeutics, Inc. Variant IGF2 constructs
WO2022104261A1 (en) * 2020-11-16 2022-05-19 Avrobio, Inc. Compositions and methods for treating pompe disease
EP4359430A4 (en) 2021-06-23 2025-07-16 Lycia Therapeutics Inc BIFUNCTIONAL COMPOUNDS CONTAINING IGF-2 POLYPEPTIDES

Family Cites Families (76)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4309776A (en) 1980-05-13 1982-01-12 Ramon Berguer Intravascular implantation device and method of using the same
US4749570A (en) 1981-12-31 1988-06-07 The Governors Of The University Of Alberta Targeting conjugates of albumin and therapeutic agents
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
JPS61502657A (ja) 1984-07-13 1986-11-20 チロン　コ−ポレイシヨン プレプロインシュリン様成長因子１及び２
CA1260858A (en) 1985-03-28 1989-09-26 Lawrence S. Cousens Expression using fused genes providing for protein product
US4801575A (en) 1986-07-30 1989-01-31 The Regents Of The University Of California Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier
US4902505A (en) 1986-07-30 1990-02-20 Alkermes Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier
US5470828A (en) 1987-12-24 1995-11-28 Gropep Pty. Ltd. Peptide analogs of insulin-like growth factor II
US5817623A (en) 1995-03-06 1998-10-06 Univ Colorado State Res Found Method for treating diabetic peripheral neuropathy with IGF-I or IGF-II
US5236838A (en) 1988-12-23 1993-08-17 Genzyme Corporation Enzymatically active recombinant glucocerebrosidase
US6451600B1 (en) 1989-12-22 2002-09-17 Genzyme Corporation Enzymatically active recombinant glucocerebrosidase
US5549892A (en) 1988-12-23 1996-08-27 Genzyme Corporation Enhanced in vivo uptake of glucocerebrosidase
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5672683A (en) 1989-09-07 1997-09-30 Alkermes, Inc. Transferrin neuropharmaceutical agent fusion protein
US5977307A (en) 1989-09-07 1999-11-02 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific ligand-neuropharmaceutical agent fusion proteins
WO1993010819A1 (en) 1991-11-26 1993-06-10 Alkermes, Inc. Process for the preparation of transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical or diagnostic agent conjugates
CA2025907A1 (en) 1989-09-21 1991-03-22 Franklin D. Collins Method of transporting compositions across the blood brain barrier
EP0521985B1 (en) 1990-03-20 1997-09-24 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Chimeric antibodies with receptor binding ligands in place of their constant region
US5248606A (en) 1990-06-11 1993-09-28 Dowelanco Dna encoding inactive precursor and active forms of maize ribosome inactivating protein
US5401650A (en) 1990-10-24 1995-03-28 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Cloning and expression of biologically active α-galactosidase A
US5356804A (en) 1990-10-24 1994-10-18 Mount Sinai School Of Medicine Of The City Of New York Cloning and expression of biologically active human α-galactosidase A
US5633235A (en) 1991-04-19 1997-05-27 Regents Of The University Of Michigan Triciribine and analogs as antiviral drugs
US6287792B1 (en) 1991-06-17 2001-09-11 The Regents Of The University Of California Drug delivery of antisense oligonucleotides and peptides to tissues in vivo and to cells using avidin-biotin technology
US5736363A (en) 1991-07-29 1998-04-07 British Bio-Technology Limited IGF-II analogues
WO1993006216A1 (en) 1991-09-26 1993-04-01 Oklahoma Medical Research Foundation Fusion proteins targeted to lysosomes, for the treatment of aids
US6270989B1 (en) 1991-11-05 2001-08-07 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and delivery
US5258453A (en) 1992-01-21 1993-11-02 University Of Utah Drug delivery system for the simultaneous delivery of drugs activatable by enzymes and light
CA2134773A1 (en) 1992-06-04 1993-12-09 Robert J. Debs Methods and compositions for in vivo gene therapy
US5981194A (en) 1992-07-10 1999-11-09 University Of British Columbia Use of p97 and iron binding proteins as diagnostic and therapeutic agents
AU677216B2 (en) 1992-07-27 1997-04-17 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Targeting of liposomes to the blood-brain barrier
US5476779A (en) 1992-09-30 1995-12-19 University Of Maryland At College Park DNA encoding insulin-like growth factor II isolated from rainbow trout
EP0599303A3 (en) 1992-11-27 1998-07-29 Takeda Chemical Industries, Ltd. Peptide conjugate
US5633234A (en) 1993-01-22 1997-05-27 The Johns Hopkins University Lysosomal targeting of immunogens
US5798366A (en) 1993-05-13 1998-08-25 Monsanto Company Method for treatment of CNS-involved lysosomal storage diseases
US6281010B1 (en) 1995-06-05 2001-08-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adenovirus gene therapy vehicle and cell line
US5704910A (en) 1995-06-05 1998-01-06 Nephros Therapeutics, Inc. Implantable device and use therefor
US5817789A (en) 1995-06-06 1998-10-06 Transkaryotic Therapies, Inc. Chimeric proteins for use in transport of a selected substance into cells
US20020013953A1 (en) 1995-08-02 2002-01-31 Reuser Arnold J. Compositions and methods for treating enzyme deficiency
US6118045A (en) 1995-08-02 2000-09-12 Pharming B.V. Lysosomal proteins produced in the milk of transgenic animals
JP3713276B2 (ja) 1995-09-29 2005-11-09 バイオマリン ファーマシューティカル インコーポレイテッド 炎症反応の軽減のためのヘパリナーゼの使用
US6348194B1 (en) 1995-11-13 2002-02-19 Ixsys Incorporated Tumor specific internalizing antigens and methods for targeting therapeutic agents
US6344436B1 (en) 1996-01-08 2002-02-05 Baylor College Of Medicine Lipophilic peptides for macromolecule delivery
ATE364629T1 (de) 1996-01-22 2007-07-15 Curis Inc Methoden zur herstellung von op-1 morphogen analoge
US6020144A (en) 1996-09-12 2000-02-01 Symbiontics, Inc. Sustained delivery device comprising a Leishmania protozoa and methods of making and using the same
US6458574B1 (en) 1996-09-12 2002-10-01 Transkaryotic Therapies, Inc. Treatment of a α-galactosidase a deficiency
US6083725A (en) 1996-09-13 2000-07-04 Transkaryotic Therapies, Inc. Tranfected human cells expressing human α-galactosidase A protein
US6235874B1 (en) 1997-01-10 2001-05-22 Academia Sinica Production of biologically active recombinant insulin-like growth factor II polypeptides
US6329501B1 (en) * 1997-05-29 2001-12-11 Auburn University Methods and compositions for targeting compounds to muscle
ATE359561T1 (de) 1997-06-02 2007-05-15 Univ Johns Hopkins Rechnerverfahren freie energieberechnung für ligandenentwurf verwendend und die voraussage von bindenden zielen
US6472140B1 (en) 1997-09-05 2002-10-29 The General Hospital Corporation α-2- macroglobulin therapies and drug screening methods for Alzheimer's disease.
WO2000009153A1 (en) 1997-10-29 2000-02-24 Genzyme Corporation Compositions and methods for treating lysosomal storage disease
KR20010072372A (ko) 1998-08-11 2001-07-31 맥기 데이비드 알 식물조직의 간질액으로부터 단백질을 추출하는 방법
KR20010101131A (ko) 1998-12-07 2001-11-14 추후기재 폼페병의 치료 방법
US6596500B1 (en) 1998-12-08 2003-07-22 The General Hospital Corporation Binding of retinoids to M6P/IGF-II receptor
US6638727B1 (en) 1999-01-26 2003-10-28 Cytyc Health Corporation Methods for identifying treating or monitoring asymptomatic patients for risk reduction or therapeutic treatment of breast cancer
US6534300B1 (en) 1999-09-14 2003-03-18 Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. Methods for producing highly phosphorylated lysosomal hydrolases
US6569661B1 (en) 1999-11-12 2003-05-27 Biomarin Pharmaceutical Inc. Recombinant α-L-iduronidase, methods for producing and purifying the same and methods for treating diseases caused by deficiencies thereof
DK174076B1 (da) 2000-01-21 2002-05-21 Flowcon Int As Reguleringsindsats til anbringelse i ventiler og ventilenhed
US20020081654A1 (en) 2000-04-07 2002-06-27 Sandrin Mauro Sergio Targeting hydrolase enzymes
CA2416492C (en) 2000-07-18 2008-04-29 Duke University Treatment of glycogen storage disease type ii
WO2002044355A2 (en) 2000-11-30 2002-06-06 Symbiontics, Inc. Protozoan expression systems for lysosomal storage disease genes
US20020142299A1 (en) 2001-01-09 2002-10-03 Davidson Beverly L. PTD-modified proteins
US7723296B2 (en) 2001-01-18 2010-05-25 Genzyme Corporation Methods for introducing mannose-6-phosphate and other oligosaccharides onto glycoproteins and its application thereof
US7320793B2 (en) 2001-01-19 2008-01-22 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen array
US20030004236A1 (en) 2001-04-20 2003-01-02 Meade Thomas J. Magnetic resonance imaging agents for detection and delivery of therapeutic agents and detection of physiological substances
US20040005309A1 (en) 2002-05-29 2004-01-08 Symbiontics, Inc. Targeted therapeutic proteins
AU2002256423B2 (en) * 2001-04-30 2008-07-24 Zystor Therapeutics, Inc. Subcellular targeting of therapeutic proteins
US7560424B2 (en) 2001-04-30 2009-07-14 Zystor Therapeutics, Inc. Targeted therapeutic proteins
US7629309B2 (en) 2002-05-29 2009-12-08 Zystor Therapeutics, Inc. Targeted therapeutic proteins
AU2002347910A1 (en) 2001-10-16 2003-04-28 Symbiontics Inc. Methods and compositions for targeting proteins across the blood brain barrier
JP2006506317A (ja) 2002-01-11 2006-02-23 バイオマリン ファーマシューティカル インコーポレイテッド 治療用リソソーム酵素の送達のための酵素送達系としてのｐ９７の使用
AU2003224880A1 (en) * 2002-04-05 2003-10-27 Genzyme Corporation Methods of enhancing lysosomal storage disease therapy
AU2003237314B2 (en) * 2002-05-29 2010-03-04 Biomarin Pharmaceutical Inc. Targeted therapeutic proteins
EP1587923B1 (en) * 2003-01-22 2011-08-24 Duke University Improved constructs for expressing lysosomal polypeptides
US20050026823A1 (en) 2003-06-20 2005-02-03 Biomarin Pharmaceutical Inc. Use of the chaperone receptor-associated protein (RAP) for the delivery of therapeutic compounds to the brain and other tissues
JP4914224B2 (ja) 2004-02-10 2012-04-11 バイオマリン ファーマシューティカル インコーポレイテッド 酸性αグルコシダーゼおよびそのフラグメント

Also Published As

Publication number Publication date
CN1922313B (zh) 2011-10-26
CN1922313A (zh) 2007-02-28
US20050244400A1 (en) 2005-11-03
DE602005020745D1 (de) 2010-06-02
JP4914224B2 (ja) 2012-04-11
AU2005212435A1 (en) 2005-08-25
IL177079A (en) 2011-10-31
CA2553955C (en) 2012-08-28
ATE465250T1 (de) 2010-05-15
IL177079A0 (en) 2006-12-10
WO2005078077A2 (en) 2005-08-25
IL207446A0 (en) 2010-12-30
AU2005212435B2 (en) 2010-09-09
US20080299640A1 (en) 2008-12-04
EP1716232B1 (en) 2010-04-21
ES2344302T9 (es) 2011-03-11
US7785856B2 (en) 2010-08-31
JP2007521818A (ja) 2007-08-09
EP1716232B9 (en) 2010-10-13
EP1716232A2 (en) 2006-11-02
WO2005078077A3 (en) 2005-10-20
CA2553955A1 (en) 2005-08-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2344302T3 (es) Alfa glucosidasa acida y fragmentos de la misma.
ES2300439T3 (es) Reconocimiento subcelular de proteinas terapeuticas.
ES2830350T3 (es) Péptidos de dirección lisosómica y usos de los mismos
JP2007521818A5 (es)
US9932568B2 (en) Peptide linkers for polypeptide compositions and methods for using same
ES2237790T3 (es) Uso de peptidos glp-1.
ES2729997T3 (es) Proteínas de fusión terapéuticas dirigidas de enzima lisosómica y usos de las mismas
AU2002256423A1 (en) Subcellular targeting of therapeutic proteins
AU2019202865B2 (en) Peptide linkers for polypeptide compositions and methods for using same
HK1124549B (en) Subcellular targeting of therapeutic proteins
HK1229266A1 (en) Formulations for lysosomal enzymes
HK1193352A (en) Peptide linkers for polypeptide compositions and methods for using same
HK1193352B (en) Peptide linkers for polypeptide compositions and methods for using same