CN103797115A - 具有快速加工性能的经过修饰的酸性α葡糖苷酶 - Google Patents

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R.J.莫雷兰
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Abstract

本发明提供了一种修饰的人酸性α-葡糖苷酶多肽，其在N端70kDa加工位点处或其附近具有增加的疏水性，以及制造和使用该修饰的人酸性α-葡糖苷酶治疗糖原贮积症(glycogen storage disorder)的方法。

Description

具有快速加工性能的经过修饰的酸性α葡糖苷酶
本申请要求获得于2011年4月22日提交的美国临时专利申请No.61/478,336的优先权，本文通过引用并入其全部内容。
本公开一般地涉及经过修饰的人酸性α葡糖苷酶及其在治疗糖原贮积病中的使用。
蓬佩病，也称作2型糖原贮积病(GSD)和酸性麦芽糖酶缺陷，是一种由于一种溶酶体酶——酸性α葡糖苷酶(GAA)缺陷导致的常染色体隐性遗传代谢性肌病。GAA是一种1,4和1,6-α-外切葡糖苷酶，在溶酶体中将糖原水解为葡萄糖。GAA缺陷导致糖原在溶酶体中积累，造成呼吸肌、心肌和骨骼肌进行性损伤。病情的范围从急进性婴儿期病程，其通常导致1-2岁前死亡，到进行更缓慢的、更不均一的病程，其在孩童和成年中造成显著的发病和早夭。Hirschhorn RR,The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease,3:3389-3420(2001,McGraw-Hill);Van der Ploeg and Reuser,Lancet372:1342-1351(2008)。
GAA的生物合成、靶定和溶酶体加工中涉及的步骤是复杂的。人GAA的初级翻译产物是一种952个氨基酸的多肽，含有7个共有的N-糖基化位点。Moreland et al.,J.Biol.Chem.280:6780-6791(2005)。GAA上的N-聚糖(N-glycan)包括复杂的和高甘露糖型聚糖，其中一些被甘露糖-6-磷酸修饰。GAA通过不依赖阳离子的甘露糖-6-磷酸受体被靶定到溶酶体。在溶酶体中，该酶被蛋白酶和糖苷酶进一步加工，产生具有提高的糖原清除能力的成熟肽。
图1显示了GAA加工通路的示意图。Moreland et al.,2005。典型地，GAA在加工期间经历最多4个剪切事件。首先，初级GAA翻译产物在57位氨基酸左右被剪切，形成一个表观分子量为100-110-kDa的前体。接着，100-110-kDa的前体在113和122位氨基酸周围被剪切，形成一个3.9-kDa(aa78-113)和一个95-kDa(aa122-952)部分。然后，该95-kDa多肽在781和792位氨基酸左右被剪切，产生76-kDa(aa122-781)和19.4-kDa(aa792-952)的片段。该76-kDa种类仍然与19.4-和3.9-kDa多肽保持关联。进一步的一个蛋白水解切割将76-kDa种类变成70-kDa(aa204-781)种类，其仍然与19.4-,10.4-,和3.9-kDa多肽保持关联。
当前用于治疗蓬佩病的人用疗法涉及施用重组人GAA(例如MYOZYMETM)。尽管重组人GAA可有效减少患者体内糖原的积累，但是其在施用时不会被完全加工成70-kDa形式。因为GAA对糖原的亲和力可能会由于蛋白酶的加工而显著提高(Moreland et al.,2005;Wisselaar et al.,J.Biol.Chem.268:2223-2231(1993))，所以提高重组人GAA的加工速度可能为增加GAA的治疗效力，包括降低GAA疗法的剂量和/或减少施用频率，提供条件。
因此，我们在这里描述修饰的GAA多肽，其与未修饰的人GAA相比可以被更加快速地加工。
某些实施方案包含在N-端70-kDa加工位点或N-端70-kDa加工位点附近具有修饰的人酸性α葡糖苷酶或其催化活性片段。在一些实施方案中，提供这样的多肽，其包含在N-端70-kDa加工位点或N-端70-kDa加工位点附近具有修饰的人酸性α葡糖苷酶(GAA)或其催化活性片段。所述催化活性片段可选自70-kDa,76-kDa,82-kDa,95-kDa或任何其它催化活性片段。在某些实施方案中，多肽还包含受体靶定序列。在一些实施方案中，受体靶定序列是IGF2序列。
在某些情况下，修饰导致N-端70-kDa加工位点或其附近的疏水性增加。在一些情况下，多肽在对应于SEQ ID NO:1的195-209位的一个或多个氨基酸处被修饰。在进一步的实施方案中，修饰位于对应于SEQ ID NO:1的200-204位的一个或多个氨基酸。在某些实施方案中，修饰位于相当于SEQ IDNO:1的201位的氨基酸。在进一步的实施方案中，修饰是用更疏水的氨基酸替代一个或多个氨基酸。在其它实施方案中，修饰是插入一个或多个更疏水的氨基酸。在更进一步的实施方案中，疏水氨基酸选自亮氨酸和酪氨酸。
在某些实施方案中，多肽与SEQ ID NO:1的至少500个氨基酸有至少80%同一性。在一些情况下，多肽与SEQ ID NO:1的至少500个氨基酸有至少90%同一性。在其它情况下，多肽与SEQ ID NO:1的至少500个氨基酸有至少95%同一性。
在某些实施方案中，多肽与未修饰的人酸性α葡糖苷酶相比显示更迅速的溶酶体蛋白酶加工。在一些实施方案中，多肽在施用20个小时后有至少50%被蛋白水解加工成70-kDa形式。在其它实施方案中，多肽在被施用55个小时之内基本上全部被蛋白水解加工成70-kDa形式。
一些实施方案包括与包含至少一个甘露糖-6-磷酸的寡糖缀合的多肽。
在某些实施方案中，提供了一种编码修饰的GAA多肽的核酸。在进一步的实施方案中，提供了一种被该核酸稳定转染的宿主细胞。在进一步的实施方案中，该宿主细胞能够分泌修饰的GAA。
在某些实施方案中，提供了一种减少或防止糖原在组织中积累的方法，包括向有此需要的患者施用有效量的如本文中描述的多肽。在进一步的实施方案中，患者患有糖原贮积病。在更进一步的实施方案中，糖原贮积病是蓬佩病。
在其它实施方案中，提供了一种治疗糖原贮积病的方法，包括向有此需要的患者施用治疗有效量的修饰GAA。在进一步的实施方案中，糖原贮积病是蓬佩病。在其它实施方案中，提供了一种适用于治疗糖原贮积病的药物组合物，其包括如本文中描述的修饰GAA。在一些实施方案中，该多肽是冻干的。
附图简要说明
图1的图示显示了天然人GAA的成熟的模型。
图2显示了重组GAA(泳道1)、人胎盘GAA(泳道2)和牛睾丸GAA(泳道3)的SDS-PAGE。
图3A显示了人GAA氨基酸197-206与来自小鼠、仓鼠、牛和鹌鹑GAA的比对结果。图3B显示了不同的经加工的GAA的Western印迹的比较结果。泳道1显示了从胎盘纯化的人GAA。泳道2和3是从用野生型人GAA构建体转染的293T细胞中纯化的对照GAA。泳道4-7是从用人GAA构建体转染的293T细胞中纯化的修饰GAA，该GAA构建体中的第201位氨基酸组氨酸被改变成精氨酸(泳道4)、亮氨酸(泳道5)、酪氨酸(泳道6)和赖氨酸(泳道7)。
图4显示了rhGAA(H201L)和rhGAA(WT)在稳定转染CHO细胞中的生物合成。
图5显示了蓬佩病成纤维细胞(Pompe fibroblast)摄取和加工rhGAA(WT)和rhGAA(H201L)。
图6显示了用抗GAA183-200(图6A)抗体和单克隆抗体GAA1(图6B)检测的Western印迹结果。
图7是rhGAA(H201L)加工模型的示意图。
实施方案详细说明
为了帮助理解本公开，首先对一些术语进行定义。其他定义在专利申请中各处提供。
如这里所使用的，术语“N-端70-kDa加工位点”是指在对应于SEQ IDNO:1（天然人GAA）的200-204位氨基酸的位置处切割GAA的蛋白水解酶的识别位点。
如这里所使用的，术语“修饰(的)GAA”是指在N-端70-kDa加工位点或其附近具有至少一个与天然人GAA中发现的氨基酸不同的氨基酸的人GAA和GAA变体。修饰的GAA在本说明书中还被称作“修饰的人GAA”。术语“修饰的GAA”包括含有信号序列的全长GAA多肽，以及从细胞分泌的、被部分加工的GAA多肽。
如这里所使用的，除非在上下文中明确指明，否则单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代。因此，例如，当称一种方法涉及“一种化合物”时，包括两种或多种化合物的混合物。除非在上下文中明确指明，否则术语“或者”一般地采用其包含“和/或”的意义。
在整个说明书中，蛋白和多肽的大小以“kDa”单位提供。本领域的技术人员会意识到，这些尺寸是基于多肽在电泳测定如SDS-PAGE中的表观分子量（见例如Moreland et al.,2005）。确切的分子量将取决于糖基化状态和其它的参数，例如与其它多肽的缔合，并且能够通过各种本领域技术人员熟知的方法加以确定。
本文通过提述并入在本文中引用的全部参考文献的全部内容。当通过提述引入的出版物和专利或专利申请的内容与说明书中包含的本发明相矛盾时，本说明书优先于任何矛盾的材料。
I.酸性α葡糖苷酶(GAA)
如上所述，GAA是一种参与糖原清除的溶酶体酶。术语GAA即包括全长、野生型的蛋白，也包括其它催化活性变体。催化活性GAA和GAA变体至少保持针对糖原的催化活性。本领域技术人员已知有多种天然人GAA的变体，包括已被截短、融合或缀合于其它多肽，改变其氨基酸序列，或通过重组或化学方法改变的变体。例如，已知有至少77个N-端氨基酸可以从天然人GAA(SEQ ID NO:1)中除去而不会丧失活性。Moreland et al.,2005。此外，偶联和融合蛋白也已有人描述。在一些实施方案中，GAA或GAA的催化活性片段可以和受体靶定序列缀合或融合。在一些情况下，受体靶定序列可以被细胞受体识别。例如，截短的GAA可以和IGF2结构域融合，如美国专利7,785,856所述，本文通过提述并入其全部内容。还已有人改变GAA来添加合成部分、碳水化合物部分和/或提高甘露糖-6-磷酸的水平。例如，美国专利7,001,994;7,723,296;7,786,277;美国专利公开2010/0173385;和PCT公开2010/075010描述了具有经过修饰的碳水化合物基团、含有更高水平甘露糖-6-磷酸的溶酶体酶，本文通过提述并入这些文献的全部内容。
在某些实施方案中，本文中描述的GAA与人GAA或GAA变体具有至少80%,90%,95%,或99%同一性。在一些情况下，GAA与SEQ ID NO:1的至少500,550,600,650,700,750,800,850,或900个氨基酸具有至少80%,90%,95%,或99%同一性。
在本部分中描述的任何催化活性人GAA均可用作本文中描述的修饰的GAA的基础序列。本领域的技术人员会知道哪种GAA变体适合于用于在本发明中。当基础GAA序列的长度或糖基化模式与天然人GAA不同时，被加工多肽的大小也将相应变化。
II.修饰的GAA
在多种实施方案中，提供了包含修饰的人GAA的多肽，所述修饰的人GAA在N-端70-kDa加工位点或其附近被修饰。N-端70-kDa加工位点“附近”的区域包括N-端70-kDa加工位点上下游最多5个氨基酸。在某些实施方案中，N-端70-kDa加工位点或其附近的区域包含相应于SEQ ID NO:1位置195-209的氨基酸。
本文中描述的修饰的GAA比未修饰的GAA的加工更加快速。在某些实施方案中，修饰的GAA在N-端70-kDa加工位点或其附近具有更高的疏水性。在一些实施方案中，修饰的GAA被蛋白水解加工成70-kDa成熟形式的速度更快。在一些实施方案中，并且取决于开始序列，修饰的GAA被加工成70-kDa成熟形式的变体。修饰的GAA可以被如此加工，以致成熟的多肽仍保持与额外的多肽片段相缔合。在某些实施方案中，修饰的GAA的加工所经由的通路与未修饰的GAA相同。在其它实施方案中，修饰的GAA的加工所经由的中间体与未修饰的GAA不同。例如，修饰的全长GAA可以经由76-kDa和/或82-kDa中间体进行加工。修饰的GAA可以被与未修饰的GAA相同的蛋白酶所识别，并且以相同或不同的顺序被加工。
在某些实施方案中，GAA修饰是通过将至少一个氨基酸用更疏水的氨基酸代替，从而其N-端70-kDa加工位点或其附近的疏水性增加。在一些实施方案中，替换可以发生在N-端70-kDa加工位点上游或下游5个氨基酸内。在某些实例中，氨基酸替换可以发生在对应于SEQ ID NO:1第195-209位的氨基酸。在其它情况下，氨基酸替换可以发生在对应于SEQ ID NO:1第100-204位的氨基酸。在进一步的实施方案中，修饰的人GAA在对应于SEQID NO:1第201位氨基酸处含有疏水氨基酸。在一些实施方案中，GAA的修饰是通过在N-端70-kDa加工位点或其附近插入一个或多个疏水氨基酸。其他修饰包括在N-端70-kDa加工位点或其附近删除一个或多个氨基酸。
在某些实施方案中，提供了一种修饰的人GAA，其在N-端70-kDa加工位点或其附近的超过1个位置处或在N-端70-kDa加工位点的5个氨基酸内含有一个疏水氨基酸（天然的或合成的）。在一个实施方案中，其中一个经过修饰的氨基酸位于对应于SEQ ID NO:1第201位的氨基酸。
在各种实施方案中，疏水氨基酸从下组中选出：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸或丙氨酸。在进一步的实施方案中，疏水氨基酸是亮氨酸或酪氨酸。在一些实施方案中，修饰的人GAA含有显示疏水性质的合成或非天然氨基酸。一般地，被替换的氨基酸比野生型氨基酸更加疏水，因此增加N-端70-kDa加工位点或其附近的疏水性。
在一个示例实施方案中，修饰的GAA在对应于SEQ ID NO:1第201位氨基酸的位置处具有一个亮氨酸。在另一个实施方案中，修饰的GAA在对应于SEQ ID NO:1第201位氨基酸的位置处具有一个酪氨酸。
在某些实施方案中，提供了修饰的GAA，其与SEQ ID NO:1的至少500,550,600,650,700,750,800,850或900个氨基酸具有至少80%,90%,95%或99%同源性，并且其中修饰的人GAA在N-端70-kDa加工位点处的至少一个氨基酸被一个更加疏水的氨基酸替换。
在一些实施方案中，有至少50%的修饰的人GAA在溶酶体中在20、30或40小时之内被加工成70-kDa形式。在更进一步的实施方案中，基本上全部的修饰的人GAA在溶酶体中44、65或75小时之内被加工成70-kDa形式。
在某些实施方案中，本发明的修饰的人GAA可以通过其更快速地被蛋白水解加工成成熟70-kDa形式或其相应的变体来加以鉴别。在其它实施方案中，本文中描述的修饰的人GAA可以通过在天然人GAA的蛋白水解加工中不会产生的82-kDa中间体多肽的产生来加以鉴别。在进一步的实施方案中，修饰的人GAA可以通过在未修饰的人GAA的蛋白水解加工中产生的76-kDa中间多肽的缺失来加以鉴别。
III.修饰的GAA的产生
在各种实施方案中，修饰的GAA多肽可以根据本领域技术人员已知的方法加以产生。例如，修饰的GAA多肽可以由被编码修饰的GAA的核酸稳定转染的细胞系表达并分泌。合适的细胞系包括成纤维细胞、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞、293T细胞或植物细胞，以及本领域的技术人员可认识到的其他细胞。美国专利Nos.7,351,410和7,138,262和美国专利公开No.2010/0196345描述了细胞系和生产方法实例，本文通过提述引入其全部内容。在某些实施方案中，编码修饰的GAA的核酸被插入到含有用于在细胞系中表达的合适启动子和调节序列的质粒或载体中。可用于在哺乳动物细胞系中产生修饰的GAA的启动子包括rpS21和β-肌动蛋白启动子(见例如美国专利No.7,423,135)，以及本领域的技术人员所认可的许多其它的启动子。在某些实施方案中，修饰的GAA被进一步改变以增加或降低糖基化或甘露糖-6-磷酸的水平，借此提高分泌和/或溶酶体靶定。
IV.药物组合物
在某些实施方案中，修饰的GAA存在于药物组合物中，其包括至少一种添加物如填充剂(filler)、膨胀剂、崩解剂、缓冲剂、稳定化剂或赋形剂。标准的药物制剂技术是本领域技术人员熟知的（见例如2005Physicians’Desk
Figure BDA0000442853400000071
,Thomson Healthcare:Montvale,NJ,2004;Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,第20版,Gennado等编著.LippincottWilliams&Wilkins:Philadelphia,PA,2000）。合适的药物添加剂包括，例如，甘露醇、淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯(propylene)、乙二醇(glycol)、水、乙醇等。在某些实施方案中，药物组合物还可以包含pH缓冲剂和润湿剂或乳化剂。在进一步的实施方案中，组合物可以含有防腐剂或稳定剂。
在一些实施方案中，包含修饰的人GAA的药物组合物可以进一步包括如下的一种或多种：甘露醇、聚山梨酯(polysorbate)80、七水合磷酸氢二钠，和一水合磷酸二氢钠。在另一个实施方案中，药物组合物可以含有10mM组氨酸pH6.5及最多2%甘氨酸、最多2%甘露醇、和最多0.01%聚山梨酯80。更多示例药物组合物可以参阅PCT公布文本No.2010/075010。
药物组合物的配制可以根据预期的给药途径和其它参数而变化（见例如Rowe等,Handbook of Pharmaceutical Excipients,第4版,APhA Publications,2003.）在一些实施方案中，修饰的GAA组合物可以是冻干的饼或粉末。冻干的组合物可以重建用于静脉注射给药，例如使用注射用无菌水USP重建。在其它实施方案中，组合物可以是无菌的非热原性溶液。
本文中描述的药物组合物可以包含修饰的GAA作为唯一的活性化合物，或者可以和另一种化合物、组分或生物材料组合递送。例如，药物组合物还可以包括一种或多种用于治疗蓬佩病和/或与蓬佩病或其治疗相关的副作用的小分子。在一些实施方案中，组合物可以包含美格鲁特(miglustat)和/或一种或多种在例如美国专利申请公开Nos.2003/0050299,2003/0153768;2005/0222244;或2005/0267094中描述的化合物。在一些实施方案中，药物组合物还可以包含一种或多种免疫抑制剂、mTOR抑制剂或自噬抑制剂。免疫抑制剂的实例包括雷帕霉素和万珂(velcade)。雷帕霉素还是一种mTOR抑制剂。
V.治疗方法
在一些实施方案中，修饰的GAA用于减少或防止糖原在患者组织中的积累。在其它实施方案中，修饰的GAA用于治疗糖原贮积病。在进一步的实施方案中，糖原贮积症是蓬佩病。在示例实施方案中，修饰的GAA在施用给患者之后在溶酶体中被加工成为成熟的GAA。
本文中描述的修饰的GAA可以通过任何合适的递送系统施用，并可以包括，没有限制，胃肠外(包括皮下、静脉内、颅内、髓腔内、关节内、肌肉内、鞘内或腹膜内注射)、经皮或经口(例如胶囊、悬液或药片)。在一个实施方案中，修饰的GAA通过静脉内给药递送。
在其他的实施方案中，可以递送编码修饰的GAA的核酸给患者。该核酸可以用适用于基因治疗的载体加以递送。基因治疗方法的实例在例如美国专利5,952,516;6,066,626;6,071,890;和6,287,857中有描述。
施用给患者可以以单一剂量或以重复施用的形式发生，可以施用多种生理可接受的盐形式的任何一种，和/或与可接受的药物载体和/或添加剂一起作为药物组合物的一部分。
本文中描述的修饰的GAA组合物以治疗有效量施用。一般地，治疗有效量可以随着受试者的年龄、一般状况、和性别，以及受试者病症的严重程度而变化。剂量可以由医生确定，并根据需要调节以适合观察到的治疗效果。
本文中描述的修饰的GAA可以在门诊环境下通过静脉内输注施用，例如每1,2,3,4,5,6,7,8,9,10或更多天施用一次，或例如每周、每两周、每月、每两个月施用一次。化合物的合适治疗有效剂量由处置医师选择，范围可以是大约1μg/kg-大约500mg/kg，大约10mg/kg-大约100mg/kg，大约20mg/kg-大约100mg/kg，和大约20mg/kg-大约50mg/kg。在一些实施方案中，合适的剂量从下选出：例如0.1,0.25,0.5,0.75,1,5,10,15,20,30,40,50,60,70,和100mg/kg。此外，具体剂量的实例可以在Physicians’Desk
Figure BDA0000442853400000091
中找到。
在一些实施方案中，该方法包括施用修饰的人GAA，借此将受试者体内的糖原清除相对于内源活性增加例如至少10%,15%,20%,25%,30%,35%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,或100%。在一些实施方案中，该方法包括施用修饰的人GAA，借此将受试者体内的糖原清除相对于内源活性增加例如至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,30,40,50,100,或1000倍。增加的糖原清除可以通过例如临床症状的减少加以确定，或通过合适的临床测定或生物测定，如溶酶体糖原贮积测定来加以确定。
在某些实施方案中，用包含修饰的人GAA的药物组合物治疗受试者之后增加的糖原清除可以通过生物化学观察(见例如Zhu et al.,J.Biol.Chem.279:50336-50341(2004))或组织学观察到溶酶体糖原的积累减少，例如在心肌细胞、骨骼肌细胞或皮肤成纤维细胞中的积累减少加以确定。还可以测定例如肌肉活组织检查样品中，培养的皮肤成纤维细胞中，淋巴细胞中，和干燥的血斑中的GAA活性。干燥血斑测定在例如Umpathysivam et al.,Clin.Chem.47:1378-1383(2001)和Li et al.,Clin.Chem.50:1785-1796(2004)中有描述。蓬佩病的治疗也可以例如通过如下的方法进行评估：肌酐激酶的血清水平、运动功能的增加(gains in motor function)(例如通过阿尔伯塔婴儿运动量表(Alberta Infant Motor Scale)进行评估)，通过超声心动图测量的左心室质量指数变化，和通过超声心动图衡量的心电活动。施用包含修饰的人GAA的药物组合物还可导致蓬佩病的一种或多种症状减轻，所述症状例如心脏肥大、心肌病、白天嗜睡(daytime somnolescence)、劳累性呼吸困难、发育停滞、喂养困难、“懒散(floppiness)”、步态异常(gait abnormalities)、头痛、肌肉张力低下、器官巨大症（例如心脏、舌头、肝脏肥大）、脊柱前弯症、平衡丧失、下背部疼痛、晨起头痛、肌肉无力、呼吸功能不全、翼状肩胛、脊柱侧凸、深腱反射减低、睡眠呼吸暂停、呼吸道感染的易感性、和呕吐。
在某些实施方案中，该方法包括在一种或多种其他治疗中施用包含修饰的人GAA的药物组合物。该一种或多种其他治疗可以在修饰的人GAA的施用同时（包括作为组合制剂同时施用）、之前或之后施用。在一些情况下，其他治疗可以在修饰的GAA两次给药之间施用。例如，小分子治疗可以用于减慢糖原的再积累，从而为减少修饰的GAA的给药频率提供条件。
在一些实施方案中，该方法包括用解热药、抗组胺剂、和/或免疫抑制剂治疗受试者（在如前文所述的用修饰的人GAA治疗之前、之后或期间）。在某些实施方案中，可以在用修饰的人GAA治疗之前，用解热药、抗组胺剂、和/或免疫抑制剂治疗受试者，以减少或防止输注相关反应。例如，受试者可以用如下的一种或多种药物进行预先治疗：对乙酰氨基酚、硫唑嘌呤、环磷酰胺、环孢菌素A、苯海拉明、甲氨蝶呤、霉酚酸酯、口服类固醇、或雷帕霉素。
在一些实施方案中，该方法包括（在用修饰的人GAA治疗之前、之后或期间）用小分子疗法和/或基因疗法治疗受试者，小分子疗法和/或基因疗法包括旨在治疗糖原贮积症的小分子疗法和基因疗法。小分子疗法可以包括施用美格鲁特和/或一种或多种在例如美国专利申请公开2003/0050299,2003/0153768;2005/0222244;和2005/0267094中描述的化合物。基因疗法可以如例如美国专利Nos.5,952,516;6,066,626;6,071,890;和6,287,857;和美国专利申请公开No.2003/0087868中所述地进行。
VI.实施例
下面的实施例用于例证本公开，并没有任何限制意义。
实施例1：材料和方法
A.测定试剂和材料
伴刀豆球蛋白A、DEAE-Sepharose FF和制备级Superdex200从Amersham Pharmacia Biotech(Piscataway,NJ)获得。α-甲基葡糖苷、苯甲脒、和4-甲基伞形酮α-D-葡糖苷从Sigma-Aldrich(Saint Louis,MO)获得。其它化学品为试剂级或更好的级别，从常规供应商获得。SDS-PAGE凝胶从Invitrogen(San Diego,CA)获得。滚瓶从Corning(Corning,NY)获得。Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)和胎牛血清(FBS)从JRH Biosciences(Lenexa,KS)获得。蓬佩病成纤维细胞(GM00248)从Coriell Cell Repositories(Camden,NJ)获得。
B.酸性α-葡糖苷酶活性和蛋白测定
酸性α-葡糖苷酶在酶标板中使用4-甲基伞形酮α-D-葡糖苷通过荧光定量进行测定，如先前所述。Oude Elferink et al.,Eur.J.Biochem.139:489-495(1984)。通过280nm吸光度评估蛋白浓度，其中假定E1%=10，或使用牛血清白蛋白标准化的微量BCA(Micro-BCA)测定进行评估。Smith et al.,Anal.Biochem.150:76-85(1985)。
C.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
将还原和非还原的样品和分子量标记(Amersham Pharmacia Biotech)施用到4-20%或10%Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶。电泳在150伏进行1.5小时，蛋白用考马斯蓝或银染可视化。Blum et al.,Electrophoresis93-99(1987)。
D.重组和胎盘GAA的单离
重组和人胎盘GAA的产生和纯化如前所述。Martiniuk et al.,Archives ofBiochem.and Biophys.231:454-460(1984);Mutsaers et al.,Biochimica etBiophysica Acta911:244-251(1987);Moreland et al.,(2005)。
E.抗体和Western印迹分析
如前所述(Moreland et al.,2005)，用与KLH偶联的合成肽免疫家兔。每条肽的序列如下：抗-GAA57-74(QQGASRPGPRDAQAHPGR(SEQ ID NO:2)),抗-GAA78-94(VPTQCDVPPNSRFDCA(SEQ ID NO:3)),和抗-GAA183-200(IKDPANRRYEVPLETPRV(SEQ ID NO:4))。产生了针对纯化人胎盘GAA的山羊多克隆抗体。单克隆抗体GAA1如前所述。Moreland et al.,2005。Western印迹的实施如前所述。Moreland et al.,2005。
F.成纤维细胞的rhGAA摄取
对于每个时间点，将大约5x105个蓬佩病成纤维细胞置于含10%FBS的DMEM中，用250nM rhGAA(WT)或rhGAA(H201L)温育。在第16小时，清洗细胞并添加不含GAA的新鲜培养基。在指定的时间点，除去细胞并用磷酸盐缓冲盐水清洗5次，并保存在-80℃。在最后一个时间点之后，将所有细胞离心沉淀解冻并同时用0.25%Triton裂解。离心沉降细胞碎片，并用抗GAA抗体对每个时间点的上清进行Western印迹分析。
G.制备表达载体和瞬时转染
用标准程序在pcDNA6(Invitrogen)中制备用于具有和没有氨基酸取代或缺失的重组GAA的表达质粒。将人肾293T细胞在补充有10%FBS的DMEM中，5%CO2，37℃培养。将6微克的每种质粒与Fugene6转染试剂(Roche)混合，并添加到置于10cm培养盘的2.5x106个细胞中。72小时后，用PBS清洗附着的细胞两次，并用含有0.25%Triton的PBS裂解。通过离心沉淀细胞碎片，将上清保存在-20℃。
H.代谢标记和免疫沉淀
稳定表达rhGAA(WT)或rhGAA(H201L)的CHO细胞系通过先前所述的方法产生。Qiu et al.,J.Biol.Chem.278:32744-32752(2003)。在10cm培养盘中，将大约5x106个细胞在缺少甲硫氨酸和半胱氨酸的DMEM中温育30min。在缺少甲硫氨酸和半胱氨酸的DMEM中将细胞用150μCi/ml(1175Ci/mmol Tran35S标记物)冲激标记2h。将细胞在DMEM中清洗两次并取0h时间点后，将细胞在37℃用没有标记物的DMEM温育。在每个时间点，将细胞用PBS清洗两次。将培养盘保存在-20℃。在最后时间点之后，将细胞用含有0.25%Triton的PBS(PBST)裂解。通过离心除去细胞碎片，并向上清添加60μl50%的伴刀豆蛋白A Sepharose浆液。温育2h后，用PBST清洗珠子3次。用含有0.5Mα-甲基葡糖苷的PBS洗脱被标记的GAA。随后用偶联有亲和纯化的山羊抗-GAA的NHS-Sepharose对洗脱液中存在的GAA进行免疫沉淀。免疫沉淀物用PBST清洗3次，并向珠子添加40μl含有β-巯基乙醇的2x SDS样品缓冲液。将样品煮沸后进行Western印迹分析。
I.缩写
如这里所使用的，“rhGAA”是指重组人酸性α-葡糖苷酶。“CHO”是指中华仓鼠卵巢。“MSX”是指甲硫氨酸亚砜酰亚胺(methionine sulfoximine)。“ERT”是指酶替代疗法。
如这里所使用的，“GAA(H201R)”是指在201位具有组氨酸变为精氨酸的氨基酸替换的修饰的GAA。“GAA(H201L)”是指在201位具有组氨酸变为亮氨酸的氨基酸替换的修饰的GAA。“GAA(H201Y)”是指在201位具有组氨酸变为酪氨酸的氨基酸替换的修饰的GAA。“GAA(H201K)”是指在201位具有组氨酸变为赖氨酸的氨基酸替换的修饰的GAA。
实施例2：人、牛和仓鼠GAA的比较
当通过SDS-PAGE检查从胎盘纯化的GAA时，两条对应于76-和70-kDa多肽的条带具有大约相等的丰度（图2）。类似地，在中华仓鼠卵巢(CHO)细胞中过表达并从细胞裂解物纯化的rhGAA在先前已经证明具有76-和70-kDa条带。Moreland et al.,2005。相比之下，从CHO细胞纯化的仓鼠GAA只作为70-kDa多肽存在。为了确定70-kDa形式的主导地位是否是仓鼠独有的性质，对牛睾丸GAA进行纯化，并通过还原性银染SDS-PAGE(4-20%丙烯酰胺)进行表征，也显示仅含有70-kDa多肽（图2）。
实施例3：GAA第201位氨基酸影响从76-到70-kDa形式转变的效率并决定蛋白水解切割的顺序
哺乳动物GAA序列在氨基酸197-206之间的蛋白水解位点的比对结果（图3A）证明，被保留的序列高度保守，而被切除的序列显示一些差异。人GAA在201位含有一个组氨酸，而仓鼠和牛GAA则分别具有疏水性残基亮氨酸和酪氨酸。为了确定这些氨基酸替换是否导致加工中的种属特异性差异，构建了GAA表达质粒，其中变化氨基酸201。组氨酸被替换为亮氨酸(H201L)、酪氨酸(H201Y)、精氨酸(H201R)或赖氨酸(H201K)。用每种构建体转染人胚胎肾细胞293T，随后用针对GAA的单克隆抗体进行Western印迹分析。细胞裂解物的Western印迹分析表明，当GAA的201位氨基酸被亮氨酸或酪氨酸替换后，从76-kDa向70-kDa形式的转变效率极其显著地高于野生型（图3B，泳道2-7）。疏水氨基酸替换似乎导致形成一个新的～82-kDa中间产物，如星号所示（图3B）。在仅有载体的对照中（图3，泳道8），与来自被瞬时转染的293T细胞的裂解物相比，细胞裂解物上样量需要超过9倍才能显示内源GAA。
为了表征野生型GAA相对于GAA(H201L)的加工速度，进行了脉冲追踪实验(pulse chase experiment)。将稳定表达每种GAA的CHO细胞用Tran35S放射性标记2小时，用不含有标记物的培养基追踪指定的时间（图4）。用Con A从细胞裂解物纯化rhGAA后进行免疫沉淀，如实施例1所述。时间0h在2h脉冲之后。在55小时时间点，GAA(H201L)被完全加工成70-kDa形式，而野生型GAA在120小时后仅有非常少地被加工成70-kDa形式。在表达野生型GAA的细胞中观察到了一个95-kDa种类，但在H201L中没有。该95-kDa中间产物的身份在先前已经有人表征(Moreland et al.,2005)，并且显示在图1中。
为了确定rhGAA(H201L)是否在摄取研究中经历更快的加工，从稳定的重组CHO细胞系纯化了分泌形式的rhGAA(H201L)和rhGAA(WT)。摄取研究在蓬佩病成纤维细胞上实施，因为它们缺少GAA（图5）。如实施例1所述，将GAA缺陷的蓬佩病成纤维细胞(GM00248)与250nM rhGAA(WT)和rhGAA(H201L)温育。在指定的时间点收集成纤维细胞并冷冻在-80℃。用针对人GAA的单克隆抗体（其未知的表位位于204-782位氨基酸之内）探查细胞裂解物的还原SDS-PAGE(7.5%丙烯酰胺)Western印迹。摄取GAA之后，95-kDa和76-kDa形式是rhGAA(WT)的主导形式，而在rhGAA(H201L)中则没有观察到（图5，泳道5-13）。这种加工上的差异再次伴随着在GAA(H201L)中～82-kDa的中间产物的出现。
为了表征该～82-kDa中间产物，用识别氨基酸183-200（因此可结合从完全加工的GAA释放的10.4-kDa片段）的抗-GAA抗体探查含有纯化rhGAA、胎盘GAA和rhGAA(H201L)的Western印迹（图6A）。rhGAA、胎盘GAA和成熟rhGAA(H201L)的纯化如实施例1所述。抗体结合表明，来自胎盘的76-kDa种类仍然含有氨基酸183-200。与之对照的是，82-kDa中间产物不含有这些氨基酸，表现在没有抗体结合。这是因为已经发生了抗体识别位点的切割，如泳道3中～10-kDa条带所证明的。另一种针对GAA的单克隆抗体证明了在rhGAA(H201L)样品中82-kDa中间产物的存在（图6B）。
可以得出结论，82-kDa中间产物来自于氨基酸200-204之间的切割位点处的加速的蛋白水解。该切割发生在氨基酸782-792之间的切割之前。如图6A所示，该82-kDa多肽不含有来自氨基酸122-200的～10-kDa片段。这些结果提示rhGAA(H201L)有另一种加工途径，如图7所示。野生型与GAA(H201L)的加工在95-kDa中间产物之后发生分歧。野生型GAA在羧基端附近（氨基酸781-792之间）被切割而产生76-kDa中间产物，而GAA(H201L)在氨基酸200-204之间被切割而产生82-kDa中间产物。两条通路最终均产生成熟的70-kDa GAA。
本领域的技术人员通过考虑这里公开的专利说明书和实施方案的实践容易想到本公开其它的实施方案。专利说明书和实施例的目的仅是例示说明。
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Figure IDA0000442853470000031
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Claims (30)

1.一种多肽，由在N-端70-kDa加工位点处或其附近具有修饰的人酸性α-葡糖苷酶或其催化活性片段组成。
2.一种多肽，其包含在N-端70-kDa加工位点处或其附近具有修饰的人酸性α-葡糖苷酶或其催化活性片段。
3.权利要求1或2的多肽，其中所述修饰是N-端70-kDa加工位点处或其附近的疏水性增加。
4.权利要求1或2的多肽，其中所述修饰位于对应于SEQ ID NO:1的195-209位的一个或多个氨基酸。
5.权利要求4的多肽，其中所述修饰位于对应于SEQ ID NO:1的200-204位的一个或多个氨基酸。
6.权利要求5的多肽，其中所述修饰位于对应于SEQ ID NO:1的201位的氨基酸。
7.权利要求1-6中任一项的多肽，其中该修饰包括：
a)用更疏水的氨基酸取代一个或多个氨基酸，或者
b)插入一个或多个疏水性氨基酸。
8.权利要求1或2的多肽，其中所述片段选自人酸性α-葡糖苷酶的70-kDa、76-kDa、82-kDa、95-kDa、或任何其它催化活性片段。
9.权利要求8的多肽，其中所述多肽还包含受体靶定序列。
10.权利要求9的多肽，其中所述受体靶定序列是IGF2。
11.权利要求1或2的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO:1的至少500个氨基酸具有至少80%同一性。
12.权利要求11的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO:1的至少500个氨基酸具有至少90%同一性。
13.权利要求11的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO:1的至少500个氨基酸具有至少95%同一性。
14.权利要求1或2的多肽，其中该修饰的多肽与未修饰的人酸性α-葡糖苷酶相比，显示更迅速的溶酶体蛋白酶加工。
15.权利要求14的多肽，其中该多肽在施用20个小时内有至少50%被蛋白水解加工成70-kDa形式。
16.权利要求15的多肽，其中该多肽在施用55个小时内基本上全部被蛋白水解加工成70-kDa形式。
17.权利要求1或2的多肽，其中该多肽与包含至少一个甘露糖-6-磷酸的寡糖缀合。
18.一种核酸，其编码选自权利要求1-17中任一项的多肽。
19.经过权利要求18的核酸稳定转染的宿主细胞。
20.权利要求19的宿主细胞，其中该宿主细胞能够分泌由权利要求18的核酸编码的多肽。
21.一种减少或防止糖原在组织中积累的方法，包括向有此需要的患者施用有效量的权利要求1或2的多肽。
22.权利要求21的方法，其中所述患者患有糖原贮积病。
23.权利要求22的方法，其中所述糖原贮积病是蓬佩病。
24.一种治疗糖原贮积病的方法，包括向有此需要的患者施用治疗有效量的权利要求1或2的多肽。
25.权利要求24的方法，其中所述糖原贮积病是蓬佩病。
26.一种适用于治疗糖原贮积病的药物组合物，包含权利要求1-17中任一项的多肽。
27.权利要求26的药物组合物，其中所述多肽是冻干的。
28.权利要求1-17中任一项的多肽在制造用于减少或防止组织中的糖原积累的药物中的用途。
29.权利要求28的用途，其中所述糖原积累是由于糖原贮积病所致。
30.权利要求29的用途，其中所述糖原贮积病是蓬佩病。
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