JP2014513952A - 促進されたプロセシングを備えた修飾された酸性アルファグルコシダーゼ - Google Patents

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Abstract

修飾されたヒト酸性アルファ−グルコシダーゼポリペプチド、ならびに糖原貯蔵障害を治療するための修飾されたヒト酸性アルファ−グルコシダーゼを製造および使用する方法を提供する。
【選択図】 図7

Description

本願は、2011年4月22日に出願された特許文献1の優先権の利益を請求し、それは全体として参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、一般に修飾されたヒト酸性アルファ−グルコシダーゼおよび糖原病の治療におけるその使用に関する。
ポンペ病は、II型糖原病(GSD)および酸性マルターゼ欠損症、リソソーム酵素酸性アルファ−グルコシダーゼ(GAA)の欠損によって生じる常染色体性劣性代謝性ミオパチーである。GAAは、リソソーム中でグリコーゲンをグルコースに加水分解するエキソ−1,4および1,6−α−グルコシダーゼである。GAAの欠損は、リソソーム中のグリコーゲン蓄積を招き、呼吸器、心臓および骨格の筋肉に進行性損傷を生じる。この疾患は、通常、1〜2歳までに死に至る、急速進行性の乳児期の経過のものから、小児および成人では顕著な罹病率および早期の死亡率をもたらす、より遅い進行性であり、かつ不均一な経過のものまである。非特許文献1;非特許文献2。
GAAの生合成、標的化、およびリソソームプロセシング(processing)に関与するステップは、複雑である。ヒトGAAの一次翻訳産物は、7つのコンセンサスN−グリコシル化部位を含む952個のアミノ酸ポリペプチドである。非特許文献3。GAA上のN−グリカンは、複雑かつ高マンノースタイプのグリカンを含み、そのうちのいくつかはマンノース6−リン酸によって修飾されている。GAAは、カチオン非依存性のマンノース6−リン酸受容体を介してリソソームに対して標的設定される。リソソーム中で、その酵素は、プロテアーゼおよびグリコシダーゼによってさらにプロセシングを受け、グリコーゲンクリアランスを高めることができる成熟ペプチドを生じる。
図1は、GAAプロセシング経路の概略図を示す。Moreland et al., 2005。典型的に、GAAは、プロセシング中に4つまでの切断事象を受ける。最初に、一次GAA翻訳産物をアミノ酸57あたりで切断して100〜110kDaの見かけの分子量を有する前駆体を形成する。次に、この100〜110kDaの前駆体をアミノ酸113および122あたりで切断して3.9kDa(aa78〜113)および95kDa(aa122〜952)の部分を形成する。次いで、この95kDaのポリペプチドをアミノ酸781および792あたりで切断して76kDa(aa122〜781)および19.4kDa(aa792〜952)の断片を得てもよい。この76kDaの種は、19.4kDaおよび3.9kDaのポリペプチドと結合したままである。さらなるタンパク質分解切断は、この76kDaを、19.4、10.4、および3.9kDaのポリペプチドと結合したままである70kDa(aa204〜781)の種に変換する。
米国特許仮出願第61/478,336号
Hirschhorn RR, The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 3: 3389-3420 (2001, McGraw-Hill) Van der Ploeg and Reuser, Lancet 372: 1342-1351 (2008) Moreland et al., J. Biol. Chem. 280: 6780-6791 (2005) Moreland et al., 2005; Wisselaar et al., J. Biol. Chem. 268: 2223-2231 (1993)
ポンペ病を治療するための現在のヒト療法は、組換えヒトGAA(例えば、MYOZYMETM)の投与を含む。組換えヒトGAAは、患者においてグリコーゲン蓄積を効果的に低減するにもかかわらず、投与時に70kDaの形態に完全にプロセシングされない。プロテアーゼプロセシングの結果として、グリコーゲンに対するGAAの親和性をかなり高めることができるため(非特許文献4)、組換えヒトGAAプロセシングの速度を高めることにより、用量の低下および/またはGAA療法の適用頻度の減少を含む、GAAの治療有効性を改善することができた。
したがって、本発明者らは、本明細書において未修飾のヒトGAAより迅速にプロセシングされる修飾されたGAAポリペプチドを記述する。
特定の実施態様は、N末端70kDaのプロセシング部位で、またはその近くで修飾を有するヒト酸性アルファ−グルコシダーゼまたはその触媒活性断片を含む。いくつかの実施態様では、N末端70kDaのプロセシング部位で、またはその近くで修飾を有する、ヒト酸性アルファ−グルコシダーゼ(GAA)またはその触媒活性断片を含むポリペプチドを提供する。触媒活性断片は、70kDa、76kDa、82kDa、95kDaまたは任意の他の触媒活性断片から選択してもよい。特定の実施態様において、ポリペプチドは、受容体標的配列をさらに含む。いくつかの実施態様において、受容体標的配列は、IGF2配列である。
特定の場合において、修飾は、N末端70kDaのプロセシング部位で、またはその近くで疎水性を高める。いくつかの場合において、ポリペプチドは、配列番号1の位置195〜209に相当する1つまたはそれ以上のアミノ酸で修飾される。さらなる実施態様において、修飾は、配列番号1のアミノ酸位置200〜204に相当する1つまたはそれ以上のアミノ酸にある。特定の実施態様において、修飾は、配列番号1の位置201に相当するアミノ酸にある。さらなる実施態様において、修飾は、より疎水性のアミノ酸による1つまたはそれ以上のアミノ酸の置換である。別の実施態様において、修飾は、1つまたはそれ以上の疎水性アミノ酸の挿入である。なおさらなる実施態様において、疎水性アミノ酸は、ロイシンおよびチロシンから選択される。
特定の実施態様において、ポリペプチドは、配列番号1の少なくとも500個のアミノ酸に対して少なくとも80%の同一性を有する。いくつかの場合において、ポリペプチドは、配列番号1の少なくとも500個のアミノ酸に対して少なくとも90%の同一性を有する。別の場合において、ポリペプチドは、配列番号1の少なくとも500個のアミノ酸に対して少なくとも95%の同一性を有する。
特定の実施態様において、未修飾のヒト酸性アルファ−グルコシダーゼと比較したときに、ポリペプチドは、より迅速なリソソームのプロテアーゼプロセシングを示す。いくつかの実施態様において、ポリペプチドの少なくとも50%は、投与20時間以内に70kDa形態にタンパク質分解プロセシングされる。別の実施態様において、実質的にすべてのポリペプチドは、投与55時間以内に70kDa形態にタンパク分解プロセシングされる。
いくつかの実施態様は、少なくとも1つのマンノース−6−リン酸を含むオリゴ糖に複合化された(conjugated)ポリペプチドを含む。
特定の実施態様では、修飾されたGAAポリペプチドをコードする核酸を提供する。さらなる実施態様では、その核酸を用いて安定にトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。さらなる実施態様において、その宿主細胞は、修飾されたGAAを分泌することができる。
特定の実施態様では、本明細書に記載するポリペプチドの有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、組織中のグリコーゲン蓄積を低減または予防する方法を提供する。さらなる実施態様において、患者は、糖原病を有する。なおさらなる実施態様において、糖原病は、ポンペ病である。
別の実施態様では、修飾されたGAAの治療有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、糖原病を治療する方法を提供する。さらなる実施態様において、糖原病は、ポンペ病である。別の実施態様では、糖原病の治療に使用するための、本明細書に記載する修飾されたGAAを含む医薬組成物を提供する。
いくつかの実施態様では、ポリペプチドを凍結乾燥する。
天然のヒトGAAの成熟のためのモデルを示す図である。 組換えGAA(レーン1)、ヒト胎盤GAA(レーン2)およびウシ精巣GAA(レーン3)のSDS−PAGEを示す。 Aは、マウス、ハムスター、ウシ、およびウズラからのGAAを用いたアミノ酸197から206までのヒトGAAのアラインメントを示す。Bは、異なるプロセシングのGAAを比較するウェスタンブロットの結果を示す。レーン1は、胎盤から精製されたヒトGAAを示す。レーン2および3は、野生型ヒトGAA構築物でトランスフェクトされた293T細胞から精製した対照GAAである。レーン4〜7は、アミノ酸201のヒスチジンを以下のアミノ酸:アルギニン(レーン4)、ロイシン(レーン5)、チロシン(レーン6)、およびリシン(レーン7)に変えたヒトGAA構築物でトランスフェクトされた293T細胞から精製した修飾されたGAAである。 安定にトランスフェクトされたCHO細胞中のrhGAA(H201L)およびrhGAA(WT)の生合成を示す。 rhGAA(WT)およびrhGAA(H201L)のポンペ線維芽細胞の取り込みおよびプロセシングを示す。 抗GAA183−200(図6A)およびモノクローナル抗体GAA1(図6B)を用いて調べたウェスタンブロットの結果を示す。 rhGAA(H201L)についてのプロセシングモデルの概略図である。
本開示の理解を助けるために、特定の用語を最初に定義する。さらなる定義を、明細書を通じて提供する。
本明細書に用いるように、用語「N末端70kDaのプロセシング部位」とは、配列番号1(天然のヒトGAA)のアミノ酸200〜204に相当する位置でGAAを切断するタンパク質分解酵素の認識部位のことをいう。
本明細書に用いるように、用語「修飾されたGAA」とは、N末端70kDaのプロセシング部位で、またはその近くで、天然のヒトGAA中に見いだされるアミノ酸と異なる少なくとも1つのアミノ酸を有するヒトGAAおよびGAA変異体のことをいう。また、修飾されたGAAは、本説明において「修飾されたヒトGAA」とも称する。「修飾されたGAA」という用語は、シグナル配列を含む完全長GAAポリペプチドと同様に細胞から分泌された部分的にプロセシングされたGAAポリペプチドを含む。
本明細書に用いるように、単数形で表されたものは、その内容が明らかに別のものを指していなければ、複数の対象を含む。したがって、たとえば、「化合物」を含む方法についての言及は、2つまたはそれ以上の化合物の混合物を含む。用語「または」は、その内容が明らかに別のものを指していなければ、一般に「および/または」を含むその意味において用いる。
本明細書を通して、タンパク質およびポリペプチドのサイズは、「kDa」単位で示す。これらのサイズがSDS−PAGEなどの電気泳動アッセイにおけるポリペプチドの見掛けの分子量に基づくことは、当業者に明らかである(たとえば、Moreland et al., 2005を参照のこと)。正確な分子量は、グリコシル化状態および他のポリペプチドとの結合などの他のパラメーターに左右され、当業者に周知のさまざまな方法によって決定することができる。
本明細書に引用されたすべての文献は、それらの全体として参照によって組み込まれる。参照により組み込まれた刊行物および特許または特許出願が、本明細書に含まれる本発明と矛盾する場合、本明細書は、任意の矛盾材料に優先する。
I.酸性アルファ−グルコシダーゼ(GAA)
上記のように、GAAは、グリコーゲンのクリアランスに関与するリソソーム酵素である。GAAという用語は、このタンパク質の完全長、野生型の両方の形態、ならびに他の触媒活性変異体を包含する。触媒活性GAAおよびGAA変異体は、グリコーゲンに対する触媒的活性を少なくとも保持することになる。天然のヒトGAAの多くの変異体は、当業者に知られており、切断されたもの、他のポリペプチドに融合もしくは結合したもの、そのアミノ酸配列が変化したもの、または組換え的にもしくは化学的に変化したものが含まれる。たとえば、活性を失うことなく、天然のヒトGAA(配列番号1)から少なくとも77個のN末端アミノ酸を除去できることが知られている。Moreland et al., 2005。さらに、複合体(conjugates)および融合タンパク質が記載されている。いくつかの実施態様では、GAAまたはGAAの触媒活性断片は、受容体標的配列に結合または融合することができる。いくつかの場合において、受容体標的配列は、細胞受容体によって認識できる。たとえば、米国特許第7,785,856に記載されたように、切断型GAAをIGF2ドメインに融合してもよく、それは全体として参照により組み込まれる。また、GAAを変化させて合成部分、炭化水素部分および/または増加したレベルのマンノース−6−リン酸を加えたこともある。たとえば、増加したレベルのマンノース−6−リン酸を含む修飾された炭化水素部分を有するリソソーム酵素が、米国特許第7,001,994号;同第7,723,296号;同第7,786,277号;米国特許公開第2010/0173385号;およびPCT公開2010/075010号に記載されており、それらはそれらの全体として参照により組み込まれる。
特定の実施態様において、本明細書に記載したGAAは、ヒトGAAまたはGAA変異体に対して少なくとも80%、90%、95%、または99%の同一性を有する。いくつかの場合において、GAAは、配列番号1の少なくとも500個、550個、600個、650個、700個、750個、800個、850個、または900個のアミノ酸に対して少なくとも80%、90%、95%、または99%の同一性を有する。
このセクションに記載した任意の触媒活性なヒトGAAを、本明細書に記載する修飾されたGAAの塩基配列として用いることができる。どのGAA変異体が本発明における使用に適しているかは、当業者に明らかである。塩基GAA配列が天然のヒトGAAと比較して異なる長さまたはグリコシル化パターンを有する場合、プロセシングされたポリペプチドは、それに応じて変化したサイズを有することになる。
II.修飾されたGAA
さまざまな実施態様では、N末端70kDaのプロセシング部位で、またはその近くで修飾された、修飾されたヒトGAAを含むポリペプチドを提供する。N末端70kDaのプロセシング部位「の近くの」領域には、N末端70kDaのプロセシング部位の上流または下流の5つまでのアミノ酸が含まれる。特定の実施態様において、N末端70kDaのプロセシング部位の、またはその近くの領域には、配列番号1の位置195〜209に相当するアミノ酸が含まれる。
本明細書に記載する修飾されたGAAは、未修飾のGAAよりもさらに迅速にプロセシングされる。特定の実施態様において、修飾されたGAAは、N末端70kDaのプロセシング部位で、またはその近くで疎水性が高められている。いくつかの実施態様において、修飾されたGAAは、70kDaの成熟形態へのより速いタンパク質分解プロセシング速度を有する。いくつかの実施態様において、そして出発配列に応じて、修飾されたGAAは、70kDaの成熟形態の変異体にプロセシングされる。成熟ポリペプチドがさらなるポリペプチド断片と結合したままとなるように、修飾されたGAAがプロセシングされてもよい。特定の実施態様において、修飾されたGAAは、未修飾のGAAと同じ経路を介してプロセシングされる。別の実施態様では、修飾されたGAAは、未修飾のGAAと比較して異なる中間体を介してプロセシングされる。たとえば、修飾された完全長GAAは、76kDaもしくは82kDaの中間体または両方を介してプロセシングされてもよい。修飾されたGAAは、未修飾のGAAと同じプロテアーゼによって認識され、同一または異なる順序でプロセシングされてもよい。
特定の実施態様では、少なくとも1つのアミノ酸をより疎水性のアミノ酸で置換することによってN末端70kDaのプロセシング部位で、またはその近くでGAAを修飾してその疎水性を高める。いくつかの実施態様では、N末端70kDaのプロセシング部位の5アミノ酸上流または下流内で置換を行ってもよい。特定の例では、配列番号1の位置195〜209に相当するアミノ酸のところでアミノ酸置換を行ってもよい。別の場合、配列番号1の位置200〜204に相当するアミノ酸のところでアミノ酸置換を行ってもよい。さらなる実施態様において、修飾されたヒトGAAは、配列番号1のアミノ酸位置201に相当する位置で疎水性アミノ酸を含む。いくつかの実施態様において、N末端70kDaのプロセシング部位で、またはその近くで1つまたはそれ以上の疎水性アミノ酸を挿入することによってGAAを修飾する。さらなる修飾には、N末端70kDaのプロセシング部位の、またはその近くの1つまたはそれ以上のアミノ酸の欠失が含まれる。
特定の実施態様では、N末端70kDaのプロセシング部位の複数の位置で、またはN末端70kDaのプロセシング部位の5アミノ酸以内で疎水性アミノ酸(天然または合成)を含む、修飾されたヒトGAAを提供する。一実施態様において、修飾されたアミノ酸の1つは、配列番号1のアミノ酸201に相当する位置にある。
さまざまな実施態様において、疎水性アミノ酸は、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、システインまたはアラニンから選択される。さらなる実施態様において、疎水性アミノ酸は、ロイシンまたはチロシンである。いくつかの実施態様において、修飾されたヒトGAAは、疎水性を示す、合成または非天然のアミノ酸を含む。一般に、置換されたアミノ酸は、野生型アミノ酸よりもより疎水性であるため、N末端70kDaのプロセシング部位で、またはその近くで疎水性を高める。
一例となる実施態様において、修飾されたGAAは、配列番号1のアミノ酸201に相当する位置でロイシンを有する。別の実施態様において、修飾されたGAAは、配列番号1のアミノ酸201に相当する位置でチロシンを有する。
特定の実施態様では、配列番号1の少なくとも500個、550個、600個、650個、700個、750個、800個、850個、または900個のアミノ酸に対して少なくとも80%、90%、95%、または99%の相同性を有する修飾されたヒトGAAであって、修飾されたヒトGAAが、N末端70kDaプロセシング部位において、より疎水性のアミノ酸で置換された少なくとも1つのアミノ酸を有するヒトGAAを提供する。
いくつかの実施態様では、修飾されたヒトGAAの少なくとも50%が、20、30、または40時間以内にリソソーム中で70kDa形態にプロセシングされる。なおさらなる実施態様では、修飾されたヒトGAAの実質的にすべてが、55、65、または75時間以内にリソソーム中で70kDaの形態にプロセシングされる。
特定の実施態様において、本発明の修飾されたヒトGAAは、成熟した70kDa形態またはその対応する変異体へのそのより迅速なタンパク質分解プロセシングによって同定することができる。別の実施態様において、本明細書に記載した修飾されたヒトGAAは、天然のヒトGAAのタンパク質分解プロセシング中に産生されない82kDaの中間体ポリペプチドの産生によって同定することができる。さらなる実施態様において、修飾されたヒトGAAは、未修飾のヒトGAAのタンパク質分解プロセシング中に産生される76kDaの中間体ポリペプチドの欠如によって同定することができる。
III.修飾されたGAAの産生
さまざまな実施態様において、修飾されたGAAポリペプチドは、当業者に知られた方法に従って産生させることができる。たとえば、修飾されたGAAをコードする核酸で安定にトランスフェクトされた細胞系統から、修飾されたGAAポリペプチドを発現し、分泌させることができる。適した細胞系統としては、当業者に認められたものの中で、線維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、293T細胞、または植物細胞が挙げられる。例となる細胞系統および産生方法は、米国特許第7,351,410号および同第7,138,262号;ならびに米国特許公開第2010/0196345号に記載されており、それらはそれらの全体として参照により本明細書に組み込まれる。特定の実施態様では、修飾されたGAAをコードする核酸を、細胞系統から発現させるための適当なプロモーターおよび調節配列を含むプラスミドまたはベクター中に挿入する。哺乳動物細胞系統における修飾されたGAAの産生に有用なプロモーターには、当業者に認められた多くの他のものの中でrpS21およびベータ−アクチンプロモーター(たとえば、米国特許第7,423,135号を参照のこと)が挙げられる。特定の実施態様では、修飾されたGAAをさらに変化させてグリコシル化のレベルまたはマンノース―6―リン酸を増加または減少させ、それによって分泌および/またはリソソームの標的化を増強する。
IV.医薬組成物
特定の実施態様において、修飾されたGAAは、賦形剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、安定剤、または賦形剤などの少なくとも1つの添加剤を含む医薬組成物中に存在する。標準医薬製剤技術は、当業者によく知られている(たとえば、2005 Physicians' Desk ReferenceR, Thomson Healthcare: Montvale, NJ, 2004; Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed., Gennado et al., Eds. Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2000を参照のこと)。適した医薬添加剤としては、例えば、マンニトール、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ、穀粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール、および同様のものが挙げられる。特定の実施態様において、医薬組成物は、pH緩衝試薬および湿潤剤または乳化剤を含んでもよい。さらなる実施態様において、組成物は、防腐剤または安定剤を含んでもよい。
いくつかの実施態様において、修飾されたヒトGAAを含む医薬組成物は、以下:マンニトール、ポリソルベート80、二塩基性リン酸ナトリウム七水和物、および一塩基性リン酸ナトリウム一水和物の1つまたはそれ以上をさらに含んでもよい。別の実施態様において、医薬組成物は、2%までのグリシン、2%までのマンニトール、および0.01%までのポリソルベート80と共に10mMヒスチジンpH6.5を含んでもよい。さらなる例となる医薬組成物は、PCT公開第2010/075010号に見いだすことができる。
医薬組成物の製剤は、意図する投与経路および他のパラメーターに応じて変化してもよい(たとえば、Rowe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4th ed., APhA Publications, 2003.を参照のこと)。いくつかの実施態様において、修飾されたGAA組成物は、凍結乾燥されたケークまたは粉末であってもよい。静脈注射による投与では、凍結乾燥された組成物を、例えばSterile Water for Injection, USPを用いて再構成してもよい。別の実施態様において、組成物は、非発熱性滅菌溶液であってもよい。
本明細書に記載した医薬組成物は、単独の活性化合物として修飾されたGAAを含んでもよく、または別の化合物、組成物、もしくは生物学的物質と組み合わせて送達してもよい。また、たとえば、医薬組成物は、ポンペ病および/またはポンペ病もしくはその治療に関連する副作用の治療に有用な1つまたはそれ以上の小さな分子を含んでもよい。いくつかの実施態様において、組成物は、ミグルスタットおよび/または、例えば、米国特許出願公開第2003/0050299号、同第2003/0153768号;同第2005/0222244号;もしくは同第2005/0267094号に記載された1つもしくはそれ以上の化合物を含んでもよい。いくつかの実施態様において、医薬組成物は、1つまたはそれ以上の免疫抑制剤、mTOR阻害剤または自己消化阻害剤を含んでもよい。免疫抑制剤の例としては、ラパマイシンおよびベルケードが挙げられる。ラパマイシンは、mTOR阻害剤でもある。
V.治療方法
いくつかの実施態様では、修飾されたヒトGAAを用いて患者の組織中のグリコーゲン蓄積を低減または予防する。別の実施態様では、修飾されたヒトGAAを用いて糖原病を治療する。さらなる実施態様において、糖原病はポンペ病である。例となる実施態様では、修飾されたGAAは、患者への投与後、続いてリソソーム中で成熟GAAにプロセシングされる。
本明細書に記載する修飾されたGAAは、任意の適した送達系によって投与してもよく、非経口(皮下、静脈内、頭蓋内、骨髄内、関節内、筋肉内、髄腔内、または腹腔内注射を含む)、経皮的、または経口(たとえば、カプセル剤、懸濁剤または錠剤中)が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。一実施態様では、修飾されたGAAを静脈内投与によって送達する。
さらなる実施態様において、修飾されたGAAをコードする核酸を患者に送達することができる。遺伝子療法に適したベクターを用いて核酸を送達してもよい。遺伝子療法の方法の例は、たとえば、米国特許第5,952,516号;同第6,066,626号;同第6,071,890号;および同第6,287,857号に記載されている。
患者への投与は、単回投与または反復投与で、そしてさまざまな生理学的に許容しうる塩の形態のいずれかで、ならびに/または医薬組成物の一部として許容しうる薬学的担体および/もしくは添加剤と共に行ってもよい。
本明細書に記載した修飾されたGAA組成物は、治療有効量で投与する。一般に、治療有効量は、被験体の年齢、全身状態および性別、ならびに被験体における医学的状態の重症度に応じて変えてもよい。投与量は、医師によって決定され、必要に応じて、観察された治療効果に合わせて調整してもよい。
本明細書に記載した修飾されたGAAは、たとえば、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、もしくはそれ以上の日数ごとの外来診療の場で静脈内注入によって、または、たとえば、毎週、隔週、毎月、もしくは隔月の投与によって投与してもよい。化合物の適当な治療有効量は、治療する臨床医によって選択され、約1μg/kgから約500mg/kgまで、約10mg/kgから約100mg/kgまで、約20mg/kgから約100mg/kgまで、そして約20mg/kgから約50mg/kgまでの範囲であってもよい。いくつかの実施態様では、適当な治療用量を、たとえば、0.1、0.25、0.5、0.75、1、5、10、15、20、30、40、50、60、70、および100mg/kgから選択する。さらに、具体的な投与量の例を、米医薬品便覧(Physicians' Desk Reference(R))に見いだしてもよい。
いくつかの実施態様において、本方法は、修飾されたヒトGAAを投与し、それによって被験体におけるグリコーゲンクリアランスを、内因性活性と比較して、たとえば、少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%高めることを含む。いくつかの実施態様において、本方法は、修飾されたヒトGAAを投与し、それによって被験体におけるグリコーゲンクリアランスを、内因性活性と比較して、たとえば、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、または1000倍高めることを含む。高められたグリコーゲンクリアランスは、たとえば、臨床症状の低減によって、または適当な臨床的なもしくは生物学的なアッセイ、例えばリソソームグリコーゲン貯蔵アッセイによって決定してもよい。
特定の実施態様において、修飾されたヒトGAAを含む医薬組成物を用いた患者の治療後の高められたグリコーゲンクリアランスは、たとえば、心筋細胞、骨格筋細胞、または皮膚線維芽細胞中の減少したリソソームのグリコーゲン蓄積の生化学的観察(たとえば、Zhu et al., J. Biol. Chem. 279: 50336-50341 (2004)参照)または組織学的観察によって決定してもよい。また、GAA活性は、たとえば、筋生検サンプル中、培養された皮膚線維芽細胞中、リンパ球中、および乾燥血斑中で検定してもよい。乾燥血斑検査は、例えば、Umpathysivam et al., Clin. Chem. 47:1378-1383 (2001) and Li et al., Clin. Chem. 50:1785-1796 (2004)に記載されている。また、ポンペ病の治療は、たとえば、クレアチニンキナーゼの血清レベル、運動機能における増進(たとえば、Alberta Infant Motor Scaleによって評価されるような)、心エコー図によって測定されるような左室重量係数(left ventricular mass index)、および心電図によって測定されるような心臓の電気的活性における変化によって評価してもよい。また、修飾されたヒトGAAを含む医薬組成物の投与により、ポンペ病の1つまたはそれ以上の症状、たとえば心臓肥大、心筋症、日中の傾眠、労作性呼吸困難、成長障害、摂食困難、「だらしなさ(floppiness)」、歩行異常、頭痛、低血圧、臓器巨大症(たとえば、心臓、舌、肝臓の肥大)、脊柱前弯症、平衡感覚の喪失、腰痛、起床時の頭痛、筋力低下、呼吸不全、肩甲骨対称捻転、脊柱側弯症、深部腱反射低下、睡眠時無呼吸、呼吸器感染症に対する感受性、および嘔吐における低減を生じることができる。
特定の実施態様において、本方法は、修飾されたヒトGAAを含む医薬組成物を、1つまたはそれ以上のさらなる治療剤と共に投与することを含む。1つまたはそれ以上のさらなる治療剤は、修飾されたヒトGAAの投与と同時に(合剤として同時投与を含む)、その前に、またはその後に投与してもよい。いくつかの場合において、修飾されたGAAの投与間にさらなる治療剤を投与することができる。たとえば、小分子療法を用いてグリコーゲンの再蓄積を遅らせ、修飾されたGAAの投与頻度を少なくすることができる。
いくつかの実施態様において、本方法は、(上記の修飾されたヒトGAAを用いた治療の前に、その後、またはその間に)解熱剤、抗ヒスタミン剤、および/または免疫抑制剤を用いて被験体を治療することを含む。特定の実施態様において、注入関連の反応を低下させるまたは予防するために、修飾されたヒトGAAを用いた治療の前に、解熱剤、抗ヒスタミン剤、および/または免疫抑制剤を用いて被験体を治療してもよい。たとえば、アセトアミノフェン、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリンA、ジフェンヒドラミン、メトトレキセート、ミコフェノール酸モフェチル、経口ステロイド、またはラパマイシンの1つまたはそれ以上を用いて被験体を前処置してもよい。
いくつかの実施態様において、本方法は、(修飾されたヒトGAAを用いた治療の前に、その後に、またはその間に)糖原貯蔵障害の治療のための小分子療法および遺伝子療法を含む、小分子療法および/または遺伝子療法を用いて被験体を治療することを含む。小分子療法は、ミグルスタットおよび/または、たとえば、米国特許出願第2003/0050299号、同第2003/0153768号;同第2005/0222244号;および同第2005/0267094号に記載された1つもしくはそれ以上の化合物の投与を含んでもよい。遺伝子療法は、たとえば、米国特許第5,952,516号;同第6,066,626号;同第6,071,890号;および同第6,287,857号;ならびに米国特許出願公開第2003/0087868号に記載されたように実施してもよい。
VI.実施例
以下の実施例は、本開示の説明に役立つが、なんら限定されることはない。
実施例1:物質および方法
A.検定用試薬および物質
コンカナバリンA、DEAE−セファロースFFおよびSuperdex 200調製グレードはAmersham Pharmacia Biotech(Piscataway, NJ)から入手した。α−メチルグルコシド(ベンズアミジン)、および4−メチルウンベリフェリルα−D−グルコシドは、Sigma-Aldrich(Saint Louis, MO)から入手した。他の化学物質は、試薬グレードまたはそれより上のものであり、標準的な供給元からであった。SDS−PAGEゲルは、Invitrogen(San Diego, CA)から入手した。ローラーボトルは、Corning(Corning, NY)から入手した。ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)およびウシ胎児血清(FBS)は、JRH Biosciences(Lenexa, KS)から入手した。ポンペ線維芽細胞(GM00248)は、Coriell Cell Repositories(Camden, NJ)から入手した。
B.酸性α−グルコシダーゼ活性およびタンパク質アッセイ
前述のように、4−メチルウンベリフェリルα−D−グルコシダーゼを用いて、酸性グルコシダーゼをマイクロタイタープレートにおいて蛍光定量的に測定した。Oude Elferink et al., Eur. J. Biochem. 139: 489-495 (1984)。タンパク質濃度は、E1%=10と仮定して280nmの吸光度によって、またはウシ血清アルブミンで標準化されたMicro-BCAアッセイを用いて推定した。Smith et al., Anal. Biochem. 150: 76-85 (1985)。
C.SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
還元および非還元サンプルおよび分子量マーカー(Amersham Pharmacia Biotech)を4〜20%または10%トリス−グリシンSDS−PAGEゲルに適用した。電気泳動を150ボルトで1.5時間実施し、タンパク質をクーマシーブルーまたは銀染色のいずれかにより視覚化した。Blum et al., Electrophoresis 93-99 (1987)。
D.組換えおよび胎盤GAAの単離
組換えおよびヒト胎盤GAAの生成および精製は、以前に記載されたとおりである。Martiniuk et al., Archives of Biochem. and Biophys. 231: 454-460 (1984);Mutsaers et al., Biochimica et Biophysica Acta 911: 244-251 (1987); Moreland et al., (2005)。
E.抗体およびウェスタンブロット分析
以前に記載されたとおり(Moreland et al., 2005)、ウサギを、KLHに結合された合成ペプチドで免疫化した。各ペプチドの配列は、以下のとおりであった:抗GAA57−74(QQGASRPGPRDAQAHPGR(配列番号2))、抗GAA78−94(VPTQCDVPPNSRFDCA(配列番号3))、および抗GAA183−200(IKDPANRRYEVPLETPRV(配列番号4))。精製されたヒト胎盤GAAに対してヤギポリクローナル抗体を生成した。モノクローナル抗体GAA1は、以前に記載されたとおりである。Moreland et al., 2005。ウェスタンブロットは、以前に記載されたとおり実施した。Moreland et al., 2005。
F.rhGAAの線維芽細胞取り込み
各時点について、DMEM+10%FBS中の約5×105のポンペ線維芽細胞を、250nMのrhGAA(WT)またはrhGAA(H201L)と共にインキュベートした。16時間で、細胞を洗浄し、GAAを含まない新たな培地を加えた。所定の時点で、細胞を除去し、リン酸緩衝食塩水で5回、洗浄し、そして−80℃で保存した。最終時点の後、すべての細胞沈殿物を解凍し、同時に0.25%トリトンで溶解した。細胞残屑を沈殿させ、抗GAA抗体を含む各時点からの上清においてウェスタンブロット分析を実施した。
G.発現構築物および一過性導入物の調製
標準的方法を用いて、pcDNA6(Invitrogen)中にアミノ酸置換または欠失を伴うおよび伴わない組換えGAAのための発現プラスミドを作製した。ヒト腎臓293T細胞を、37℃、5%CO2下で、10%FBSで補充されたDMEM中で培養した。各プラスミド6マイクログラムをFugene 6トランスフェクション試薬(Roche)と混合し、そして10cmのシャーレ中の2.5×106の細胞に加えた。72時間後、付着細胞をPBSで2回洗浄し、そして0.25%トリトンを含むPBSで溶解した。細胞残屑を遠心分離によって沈殿させ、そして上清を−20℃で保存した。
H.代謝標識および免疫沈降
rhGAA(WT)またはrhGAA(H201L)を発現する安定なCHO細胞系統を以前に記載された方法に従って作製した。Qiu et al., J. Biol. Chem. 278: 32744-32752 (2003)。10cmのシャーレ中の約5×106の細胞を、メチオニンおよびシステインを含まないDMEM中で30分間インキュベートした。メチオニンおよびシステインが欠如したDMEM中の150μCi/ml(1175Ci/mmol Tran35S標識)を用いて、細胞を2時間、瞬間標識(pulse-labele)した。細胞をDMEMで2回洗浄し、0時間の時点とした後、次いで標識なしのDMEM中、37℃で細胞をインキュベートした。各時点で、細胞をPBSで2回洗浄した。シャーレを−20℃で保存した。最終時点の後、0.25%トリトン(PBST)を含むPBSで細胞を溶解した。細胞残屑を遠心分離によって除去し、コンカナバリンAセファロースの50%スラリー60μlを上清に加えた。2時間インキュベーション後、ビーズをPBSTで3回洗浄した。0.5Mα−メチルグルコシドを含むPBSを用いて標識GAAを溶離した。次いで、NHS−セファロースに結合されたアフィニティー精製ヤギ抗GAAを用いて、溶出液中に存在するGAAを免疫沈降させた。免疫沈降物をPBSTで3回洗浄し、β−メルカプトエタノールを含むSDSサンプル緩衝液40μl×2をビーズに加えた。ウェスタンブロット分析前にサンプルを沸騰させた。
I.略語
本明細書に用いるように、「rhGAA」は、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼを意味する。「CHO」は、チャイニーズハムスター卵巣を意味する。「MSX」は、メチオニンスルホキシイミンを意味する。「ERT」は、酵素補充療法を意味する。
本明細書に用いるように、「GAA(H201R)」は、位置201でヒスチジンからアルギニンへのアミノ酸置換を有する修飾されたGAAを意味する。「GAA(H201L)」は、位置201でヒスチジンからロイシンへのアミノ酸置換を有する修飾されたGAAを意味する。「GAA(H201Y)」は、位置201でヒスチジンからチロシンへのアミノ酸置換を有する修飾されたGAAを意味する。「GAA(H201K)」は、位置201でヒスチジンからリシンへのアミノ酸置換を有する修飾されたGAAを意味する。
実施例2:ヒト、ウシおよびハムスターGAAの比較
胎盤から精製されたGAAをSDS−PAGEによって調べたところ、76および70kDaのポリペプチドに相当する2つのバンドは、ほぼ等しい存在量であった(図2)。同様に、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞中で過剰発現し、細胞溶解物から精製されたrhGAAは、76および70kDaのバンドを以前に示している。Moreland et al., 2005。対照的に、CHO細胞から精製されたハムスターGAAは、もっぱら70kDaのポリペプチドとして存在する。70kDa形態の優位性がハムスターに特有であるか決定するため、ウシ精巣GAAを精製し、還元銀で染色したSDS−PAGE(4〜20%アクリルアミド)によって特徴づけすると、同様に70kDaのポリペプチドしか含まないことがわかった(図2)。
実施例3:GAAの位置201のアミノ酸は、76kDa形態から70kDaへの変換効率に影響を及ぼし、タンパク質分解切断の順序を決定する。
アミノ酸197と206との間のタンパク質分解部位での哺乳動物GAA配列のアラインメント(図3A)は、保持された配列が高度に保存されているが、しかし、削除された配列がいくらか変化を示すことを実証している。ヒトGAAは位置201でヒスチジンを含むのに対して、ハムスターおよびウシGAAは、それぞれ、疎水性残基ロイシンおよびチロシンを有する。これらのアミノ酸置換がプロセシングにおける種特異的差異の原因となるかどうかを決定するため、アミノ酸201が変更されたGAA発現プラスミドを作製した。ヒスチジンを、ロイシン(H201L)、チロシン(H201Y)、アルギニン(H201R)またはリシン(H201K)で置換した。ヒト胎生腎細胞(293T)を、各構築物でトランスフェクトした後、GAAに対するモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット分析を続けた。細胞溶解物のウェスタンブロット分析は、GAA中のアミノ酸201をロイシンまたはチロシンで置換したときに、76kDa形態から70kDa形態への変換が野生型と比較して劇的により効率的であることを示した(図3B、レーン2〜7)。疎水性アミノ酸置換は、アスタリスクによって示すように、新たな約82kDaの中間体を形成すると考えられる(図3B)。ベクターのみの対照(図3、レーン8)では、9倍多い細胞溶解物を装填して、一時的にトランスフェクトされた293T細胞からの溶解物と比較して内因性GAAを視覚化した。
GAA(H201L)と比較して、野生型GAAのプロセシング速度を特徴づけるため、パルス追跡実験を実施した。各GAAを発現する安定なCHO細胞系統をTran35Sで2時間放射性標識化し、標識を含まない培地で示された時間追跡した(図4)。ConA、続いて実施例1に記載した免疫沈降によって細胞溶解物からrhGAAを精製した。時間0時間は、2時間追跡後とした。55時間の時点で、GAA(H201L)が70kDa形態に完全にプロセシングされたのに対して、120時間後、野生型GAAのほんの少ししか70kDa形態にプロセシングされなかった。野生型GAAを発現する細胞では、95kDa種が観察されたが、H201Lでは存在しなかった。95kDa中間体の同一性(identity)は、以前に特徴づけられおり(Moreland et al., 2005)、図1に示されている。
取り込み研究(uptake studies)においてrhGAA(H201L)が促進プロセシングを受けるかどうかを決定するため、rhGAA(H201L)およびrhGAA(WT)の分泌形態を、安定な組換えCHO細胞系統から精製した。それらはGAAが欠損しているため、ポンペ線維芽細胞において取り込み研究を実施した(図5)。実施例1に記載したように、GAA欠損ポンペ線維芽細胞(GM00248)を250nMのrhGAA(WT)およびrhGAA(H201L)と共にインキュベートした。指定された時点で、線維芽細胞を集め、−80℃で凍結した。ヒトGAAに対するモノクローナル抗体を用いて、細胞溶解物の還元SDS−PAGE(7.5%アクリルアミド)ウェスタンブロットを調べた(アミノ酸204〜782の範囲内にある未知のエピトープ)。GAAの取り込み後、rhGAA(WT)については、95kDaおよび76kDaの形態が顕著であり、rhGAA(H201L)については観察されなかった(図5、レーン5〜13)。また、プロセシングにおける違いは、GAA(H201L)を有する約82kDa中間体の出現を伴った。
約82kDa中間体を特徴づけるため、アミノ酸183〜200を認識する(したがって、完全にプロセシングされたGAAから放出される10.4kDaの断片を結合する)抗GAA抗体を用いて、精製されたrhGAA、胎盤GAA、およびrhGAA(H201L)を含むウェスタンブロットを調べた(図6A)。rhGAA、胎盤GAAおよび成熟rhGAA(H201L)を、実施例1に記載したとおり精製した。胎盤からの76kDa種は、抗体結合によって示されるように、依然としてアミノ酸183〜200を含んでいた。対照的に、82kDa中間体は、抗体結合の欠如によって示されるように、これらのアミノ酸を含んでいなかった。これは、レーン3の約10kDaバンドによって明示されるように、抗体認識部位の切断がすでに行われたためである。GAAに対する個々のモノクローナル抗体は、rhGAA(H201L)のサンプル中に82kDa中間体の存在を示した(図6B)。
82kDa中間体は、アミノ酸200〜204の間の切断部位で促進されたタンパク質分解から生じたと結論づけることができる。その切断は、アミノ酸782〜792の間での切断前に行われる。図6Aに示すように、82kDaポリペプチドは、アミノ酸122〜200からの約10kDa断片を含まない。これらの結果は、図7に示すrhGAA(H201L)の代替プロセシング経路を示唆している。野生型対GAA(H201L)のプロセシングは、95kDa中間体の後に分かれる。野生型GAAは、カルボキシル末端の近く(アミノ酸781〜792の間)で切断されて76kDa中間体を生じるのに対して、GAA(H201L)は、アミノ酸200〜204の間で切断されて82kDa中間体を生じる。両方の経路は、最終的に成熟70kDaGAAを生じる。
本開示の他の実施態様は、本明細書の考察および本明細書に開示された実施態様の実施から当業者に明らかとなる。本明細書および実施例は、単なる例示とみなすものとする。

Claims (30)

  1. N末端70kDaプロセシング部位で、またはその近くで修飾を有するヒト酸性アルファ−グルコシダーゼまたはその触媒活性断片からなるポリペプチド。
  2. N末端70kDaのプロセシング部位で、またはその近くで修飾を有するヒト酸性アルファ−グルコシダーゼまたはその触媒活性断片を含むポリペプチド。
  3. 修飾がN末端70kDaプロセシング部位で、またはその近くで高められた疎水性である、請求項1または2に記載のポリペプチド。
  4. 修飾が配列番号1の位置195〜209に相当する1つまたはそれ以上のアミノ酸にある、請求項1または2に記載のポリペプチド。
  5. 修飾が配列番号1の位置200〜204に相当する1つまたはそれ以上のアミノ酸にある、請求項4に記載のポリペプチド。
  6. 修飾が配列番号1の位置201に相当するアミノ酸にある、請求項5に記載のポリペプチド。
  7. 修飾が、
    a)より疎水性のアミノ酸による1つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、または
    b)1つまたはそれ以上の疎水性アミノ酸の挿入
    を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載のポリペプチド。
  8. 断片が70kDa、76kDa、82kDa、95kDa、またはヒト酸性アルファ−グルコシダーゼの他の任意の触媒活性断片から選択される、請求項1または2に記載のポリペプチド。
  9. ポリペプチドが受容体標的配列をさらに含む、請求項8に記載のポリペプチド。
  10. 受容体標的配列がIGF2である、請求項9に記載のポリペプチド。
  11. ポリペプチドが配列番号1の少なくとも500個のアミノ酸に対して少なくとも80%の同一性を有する、請求項1または2に記載のポリペプチド。
  12. ポリペプチドが配列番号1の少なくとも500個のアミノ酸に対して少なくとも90%の同一性を有する、請求項11に記載のポリペプチド。
  13. ポリペプチドが配列番号1の少なくとも500個のアミノ酸に対して少なくとも95%の同一性を有する、請求項12に記載のポリペプチド。
  14. 修飾されたポリペプチドが、未修飾のヒト酸性アルファ−グルコシダーゼと比較したときに、より迅速なリソソームプロテアーゼプロセシングを示す、請求項1または2に記載のポリペプチド。
  15. ポリペプチドの少なくとも50%が、投与20時間以内に70kDa形態にタンパク分解プロセシングされる、請求項14に記載のポリペプチド。
  16. 実質的にすべてのポリペプチドが、投与55時間以内に70kDa形態にタンパク分解プロセシングされる、請求項15に記載のポリペプチド。
  17. ポリペプチドが、少なくとも1つのマンノース−6−リン酸を含むオリゴ糖に複合化される、請求項1または2に記載のポリペプチド。
  18. 請求項1〜17のいずれか1項から選択されるポリペプチドをコードする核酸。
  19. 請求項18に記載の核酸により安定にトランスフェクトされた宿主細胞。
  20. 宿主細胞が、請求項18に記載の核酸によってコードされたポリペプチドを分泌することができる、請求項19に記載の宿主細胞。
  21. 請求項1または2に記載のポリペプチドの有効量を、必要とする患者に投与することを含む、組織中のグリコーゲン蓄積を低減または予防する方法。
  22. 患者が糖原病を有する、請求項21に記載の方法。
  23. 糖原病がポンペ病である、請求項22に記載の方法。
  24. 請求項1または2に記載のポリペプチドの治療有効量を、必要とする患者に投与することを含む、糖原病を治療する方法。
  25. 糖原病がポンペ病である、請求項24に記載の方法。
  26. 糖原病の治療に使用するための請求項1〜17のいずれか1項に記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
  27. ポリペプチドが凍結乾燥された、請求項26に記載の医薬組成物。
  28. 組織中のグリコーゲン蓄積を低減または予防する薬剤の製造における請求項1〜17のいずれか1項に記載されたポリペプチドの使用。
  29. グリコーゲン蓄積が糖原病に起因する、請求項28に記載の使用。
  30. 糖原病がポンペ病である、請求項29に記載の使用。
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