JP2002510485A - ヒト酸性α−グルコシダーゼの精製 - Google Patents
ヒト酸性α−グルコシダーゼの精製Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明はヒト酸性αグルコシダーゼを、特にトランスジェニック動物の乳から精製する方法を提供する。本発明は２つのクロマトグラフィー工程を採用する。最初の工程は通常、陰イオン交換クロマトグラフィーであり、そして２番目の工程は疎水性相互作用クロマトグラフィーである。精製手順は容易にヒトαグルコシダーゼを少なくとも９９％ｗ／ｗの純度で産生する。ポーンプ病患者の治療に精製ヒト酸性αグルコシダーゼを使用するための薬学的組成物および方法も提供する。
Description
（関連出願に対する相互参照） １９９６年７月１９日に提出されたＵＳＳＮ０８／７００，７６０が、関連す
る主題に関しており、そして全ての目的のためにその全体が参考として組み込ま
れる。 （技術分野） 本発明はタンパク質化学および薬品の技術的分野に属する。 （背景） 酸性αグルコシダーゼ（酸性マルターゼ）は、グリコーゲンからグルコースへ
のリソソーム分解において必須の機能を有する酵素である［Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ
，Ｅ．Ｌ．（１９７５）Ｐａｔｈｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３．７１−８４］。完全な
酵素の欠損に伴って、または機能する酵素が少量しか存在しない場合、病的な状
態が起こる。グリコーゲンのかなりの蓄積がリソソームに見られ、細胞の機能を
妨害する［Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓ
ｉｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｓｃｒｉｖｅｒ，Ｃ．Ｒ．
、Ｂｅａｕｄｅｔ，Ａ．Ｌ．、Ｓｌｙ，Ｗ．Ｓ．およびＶａｌｌｅ，Ｄ編（Ｍｃ
Ｇｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、第７版、２巻、２４４３−２４６４
頁において、Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ，Ｒ．（１９９５）によって概説されている
］。ヒト酸性αグルコシダーゼは、１９６３年に糖原病（ｇｌｙｃｏｇｅｎｅｓ
ｉｓ）ＩＩ型（ポンペ病）の主要な欠損として発見された［Ｈｅｒｓ，Ｈ．Ｇ．
（１９６３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．８６，１１−１６；Ｈｅｒｓ，Ｈ．Ｇ．およ
びＤｅ Ｂａｒｓｙ，Ｔｈ．（１９７３）Ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ Ｓｔｏ
ｒａｇｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ（Ｈｅｒｓ，Ｈ．Ｇ．およびＶａｎ Ｈｏｏｆ，Ｆ
．編）１９７−２１６頁］。 それまでは、糖原病ＩＩ型は、生後、最初の２年以内に死に至る、遺伝性、全
身性のグリコーゲン貯蔵疾患として知られていた。後にその疾患はよりゆるやか
な形で若年型、および後期発症または成人型で起こり得ることが認識された。そ
の主な臨床症状は骨格筋の虚弱、および心筋のミオパシーである［Ｈｏｗｅｌｌ
，Ｒ．Ｒ．およびＷｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ．Ｃ．（１９８３）Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂ
ｏｌｉｃ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ（Ｓｔａｎ
ｂｕｒｙら編）１４１−１６６頁、Ｍｃｇｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｂｏｏｋ Ｃｏ．
、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ］。いくつかの臨床的な表現型が観察され［Ｔｈｅ Ｍｅｔ
ａｂｏｌｉｃ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｅｓ ｏｆ ｉｎｈｅｒｉ
ｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ（Ｓｃｒｉｖｅｒら編）２４４３−２４６４頁において
、Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ，Ｒ．（１９９５）によって概説されている］、そして
いくつかはヒト酸性αグルコシダーゼ遺伝子において同定された変異と関連して
いる［Ｒｅｕｓｅｒら、Ｓｕｐｐｌ．３（１９９５）Ｍｕｓｃｌｅ ａｎｄ Ｎ
ｅｒｖｅ、Ｓ６１−Ｓ６９頁によって概説されている］。 ヒト酸性αグルコシダーゼは、細胞内で１１０ｋＤの前駆体の形で産生される
。７つの潜在的なＮ結合型糖鎖付加部位は、おそらく全て使用される（Ｈｅｒｍ
ａｎｓら、（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８９、６８１−６８６）。炭水
化物鎖は高マンノース型であると考えられる。ゴルジスタックでは、前駆体に結
合した特定のマンノース残基がリン酸化され、マンノース−６−Ｐを産する。こ
れらの残基は、タンパク質をリソソームへ標的化するマンノース−６−リン酸受
容体によって認識される（Ｖｏｎ ＦｉｇｕｒａおよびＨａｓｉｌｉｋ、（１９
８６）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５、１６７−１９３；Ｋｏｒｎｆｅ
ｌｄ，Ｓ．、（１９９２）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１、３０７−３
３０によって概説されている）。リソソーム内で、ＮおよびＣ末端処理が、９５
ｋＤのヒト酸性αグルコシダーゼ中間体を経て、最終的に成熟７０および７６ｋ
Ｄの酵素へ導く。成熟酵素はグリコーゲンからグルコースへの分解において活性
である（ＨａｓｉｌｉｋおよびＮｅｕｆｅｌｄ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１
９８０）２５５、４９３７−４９４６；ＨａｓｉｌｉｋおよびＮｅｕｆｅｌｄ、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５、４９４６−４９５０；Ｍａｒｔ
ｉｎｉｕｋら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．（１９８４）２３
１、４５４−４６０；Ｒｅｕｓｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８５）
２６０、８３３６−８３４１；Ｒｅｕｓｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．
（１９８７）７９、１６８９−１６９９）。 糖原病ＩＩ型では、より低い酵素活性（または酵素活性の欠如）は、ｍＲＮＡ
レベルが無いまたは一部分しか無い、ヒト酸性αグルコシダーゼ前駆体が合成さ
れない、または成熟酵素への処理が起こらないことのような、多くの因子に起因
し得る。また成熟酵素は生成され得るが、より低い活性しか無いか、または活性
が無い（Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｅ
ｓ ｏｆ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ（Ｓｃｒｉｖｅｒら編）２４４
３−２４６４頁において、Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ，Ｒ．（１９９５）によって概
説される；Ｒｅｕｓｅｒら、Ｍｕｓｃｌｅ＆Ｎｅｒｖｅ、Ｓｕｐｐｌ．３（１９
９５）Ｓ６１−Ｓ６９頁によって概説される）。 この発見および他のリソソーム蓄積症の発見から、ポンペ病患者に対する酵素
補充療法が可能性のある治療として試みられた。しかし、試験は成功しなかった
。治療の期間、および投与した酵素の量が限られていた。さらに、免疫反応を起
こすＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来の非ヒト酸性αグルコシダーゼ、
またはヒト胎盤由来の「低取り込み」（非リン酸化）酵素のいずれかが使用され
た［Ｂａｕｄｈｕｉｎら、（１９６４）Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．１３．１１３９
−１１５２；Ｌａｕｅｒら、（１９６８）Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ ４２、６７２
頁；Ｄｅ Ｂａｒｓｙら、（１９７３）Ｅｎｚｙｍｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ
Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ（Ｄｅｓｎｉｃｋ、Ｂｅｒｎｌｏｈｒ、Ｋｒ
ｉｖｉｔ編）Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、１８４
−１９０頁］。 遺伝子の単離［Ｈｏｅｆｓｌｏｏｔら（１９８８）ＥＭＢＯ Ｊ．７、１６９
７−１７０４；Ｈｏｅｆｓｌｏｏｔら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７２
、４９３−４９７；Ｍａｒｔｉｎｉｕｋら（１９９０）ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉ
ｏｌ．９、８５；Ｍａｒｉｎｉｕｋら（１９９１）ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ
．１０、２８３］から、組換えヒト酸性αグルコシダーゼの発現が報告された。
バキュロウイルス感染昆虫細胞で作成された組換えヒト酸性αグルコシダーゼは
、活性であったがポンペ病患者の繊維芽細胞に効果的に取り込まれなかった［Ｍ
ａｒｔｉｎｉｕｋら（１９９２）ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１、７０１−
７０６］。Ｆｕｌｌｅｒら［（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３４
、９０３−９０９］およびＶａｎ Ｈｏｖｅら［（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３、６５−７０］は、ｃＤＮＡをトランスフ
ェクトしたチャイニーズハムスター卵巣細胞の培養液中で、ヒト前駆体酸性αグ
ルコシダーゼの発現を報告した。 酸性αグルコシダーゼは種々の組織から精製された［Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌ
ｉｃ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｅｓ ｏｆ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ
ｄｉｓｅａｓｅ（Ｓｃｒｉｖｅｒら編）２４４３−２４６４頁のＨｉｒｓｃｈｈ
ｏｒｎ，Ｒ．（１９９５）の概説を参照のこと］。多くの報告された手順は酵素
の２つの性質に基づいている：すなわち（１）酵素はＮ型糖鎖結合（主に高マン
ノース）しているので、セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）のようなマトリッ
クスに結合したレクチンであるコンカナバリンＡを使用し得る。そして（２）酵
素は１，４αおよび１，６αグリコシド結合に親和性を有するので、ある条件下
の酵素はセファデックスのようなゲル濾過マトリックス（１，６結合を含む）で
遅れ、親和性型の精製をもたらす。種々の組織から酸性αグルコシダーゼを精製
する方法の多くの実施例を下記に与える。 Ｊｅｆｆｒｅｙら［（１９７０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．９、１４０３−１４１５］
は、ラット肝臓からの酵素の精製を報告している。ホモジナイゼーションおよび
遠心分離の後、リソソームを破壊し、そして高速遠心分離の後に得られた上清を
４２％硫酸アンモニウムで沈殿させた。このペレットを再懸濁、透析し、そして
セファデックスＧ−１００カラムにかけた。カラムからのαグルコシダーゼ画分
を、弱い陰イオン交換カラムにかけ、そして結合した酵素を２５０ｍＭのＫＣｌ
で溶出した。精製した酵素を凍結乾燥した。 Ｐａｌｍｅｒ［（１９７１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１２４、７０１−７１１］
は、ウサギ筋肉からの酸性αグルコシダーゼの精製を報告している。細かく切っ
たウサギ筋肉を洗浄して血液成分を除去し、ホモジナイズし、凍結／解凍し、遠
心分離し、そして沈殿物を再び抽出した。合わせた上清を酸性化し、再び遠心分
離し、そして上清を最初に３０％硫酸アンモニウムで沈殿させた。上清を再び今
度は６０％硫酸アンモニウムで沈殿させた。このペレットを低塩濃度緩衝液に溶
解し、そして透析した。凍結／乾燥後、酵素をさらに精製するためにセファデッ
クスＧ−１００カラムにかけた。 Ｓｃｈｒａｍら［（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ
５６７、３７０−３８３］は、ヒト肝臓からの酸性αグルコシダーゼの精製を報
告している。ホモジナイゼーションおよび高速遠心分離の後、上清をコンカナバ
リンＡカラムにかけた。結合した酵素を１Ｍのメチルグルコシドで溶出し、濃縮
し、透析し、そしてＳ−２００ゲル濾過カラムにかけ、精製酵素を得た。 Ｍａｒｔｉｎｉｕｋら［（１９８４）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．２３１、４５４］は、ヒト胎盤からの酸性αグルコシダーゼの精製を報告
している。ホモジナイゼーションおよび遠心分離の後、本質的にヘモグロビンを
除去するために上清をＣＭ−セファロースカラムにかけた。２７，０００ｇ（１
５分）での遠心分離の後、ホモジネートを８０％硫酸アンモニウムで沈殿させ、
遠心分離し、そして上清を透析し、再び遠心分離して、そしてセファデックスＧ
−１００カラムにかけ精製酵素を得た。 Ｒｅｕｓｅｒら［（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０、８３３６−
８３４１］は、ヒト胎盤からの酸性αグルコシダーゼの精製を報告している。ホ
モジナイゼーションおよび遠心分離の後、上清を濾過し、そしてコンカナバリン
Ａセファロースカラムにかけた。結合した酵素を１Ｍのメチルグルコシドで溶出
し、濃縮し、透析、そして再び限外濾過によって濃縮して、セファデックスＧ−
２００カラムにかけた。遅延（停滞）した酵素をカラムから回収し、そして凍結
保存した。 Ｌｉｎら［（１９９２）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １１、４９３］は、ヒト尿から
の酸性αグルコシダーゼの精製を報告している。尿を限外濾過、次にコンカナバ
リンＡカラムクロマトグラフィーによって濃縮した。溶出した酵素を８０％硫酸
アンモニウムで沈殿させた。このペレットをＰＢＳに再び溶解し、そしてセファ
デックスＧ−１００カラムにかけた。カラムから溶出した酵素を再び８０％硫酸
アンモニウムで沈殿させ、そして再び溶解したペレットをＤＥＡＥ陰イオンカラ
ムにかけた。結合した酵素を０．１ＭのＮａＣｌ緩衝液で溶出した。７０ｋＤの
酵素をＳＤＳ−ＰＡＧＥで視覚化した。 Ｆｕｌｌｅｒら［（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３４、９０３
−９０９］は、ｃＤＮＡをトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣細
胞の培養液からの、組換えヒト酸性αグルコシダーゼの精製を報告している。培
養液を低速遠心分離によって透明にした後、ｐＨを６．６に調節し、そして培養
液をコンカナバリンＡセファロースカラムにかけた。組換えヒト酸性αグルコシ
ダーゼを１Ｍのメチルグルコシド緩衝液で溶出し、そして限外濾過によって濃縮
する。濃縮物をセファデックスＧ−１００カラムにかけ、そして精製ヒト酸性α
グルコシダーゼを得るために低い流速で分画する。 Ｖａｎ Ｈｏｖｅら［（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ．９３、６５−７０］は、トランスフェクトしたＣＨＯ細胞の培養液中で
産生された組換えヒト酸性αグルコシダーゼの、同様の技術を用いた単離を報告
している。 Ｖａｎ Ｈｏｖｅら［（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎ
ｔ．４３、６１３−６２３］は、トランスフェクトしたＣＨＯ細胞の培養液中で
産生された組換えヒト酸性αグルコシダーゼの、以下の技術を用いた単離を報告
している：すなわち、適当な結合緩衝液を加えた後、培地をコンカナバリンＡカ
ラムにかけた。αグルコシダーゼを１Ｍのメチルグルコシド緩衝液で溶出した。
硫酸アンモニウムを加え、そしてサンプルをフェニルセファロースＨＰカラムに
かけた。カラムを洗浄し、そして混入しているタンパク質を、溶出緩衝液（２０
ｍＭの酢酸塩、ｐＨ５．３）の２５−４５％濃度勾配で溶出した。続いて、αグ
ルコシダーゼを溶出緩衝液の１００％までの濃度勾配で溶出した。酵素を含む画
分を限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ ｓｔｉｒｒｅｄ ｂａｒ ｃｅｌｌ、ＹＭ３０膜
）によって濃縮し、そして酵素をＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ
カラムにアプライした。酵素を２５ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭの酢酸塩緩衝液、
ｐＨ４．６で、２．５ｍｌ／ｍｉｎの低い流速でｉｓｏｃｒａｔｉｃａｌｌｙに
溶出した。酵素を含む溶液をプールし、ｓｔｉｒｒｅｄ ｂａｒ ｃｅｌｌにお
いて１０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのヒスチジン、ｐＨ５．５に対してダイアフ
ィルトレーションを行った。サンプルをソース（Ｓｏｕｒｃｅ）Ｑカラムにかけ
た後、このカラムを２％の溶出緩衝液（５００ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのヒス
チジン、ｐＨ５．５）で洗浄し、そして結合した酸性αグルコシダーゼを溶出緩
衝液の２４％濃度勾配で溶出した。 上記の方法のいくつかの特徴は、治療に使用するヒト酸性αグルコシダーゼの
大規模精製を達成するのに理想的ではない。コンカナバリンＡの使用は、ヒトリ
ンパ球に対して分裂促進的であり、そしてまたアレルギーの問題を引き起こすの
で不利である［Ｍｏｄｙら（１９９５）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏ
ｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３３、１−１０］。酸性αグルコシダーゼを含む画分をゲ
ル濾過カラム、すなわちセファデックスで処理することは、時間がかかりすぎ、
そして大規模な操作には厄介である。 （発明の要旨） よって、１つの局面では、本発明は以下の工程を含むヒト酸性αグルコシダー
ゼの精製方法を提供する。すなわち： （ａ）ヒト酸性αグルコシダーゼを含み、そしてタンパク質が混入しているサン
プルを、αグルコシダーゼがカラムに結合する条件下で、陰イオン交換またはア
フィニティーカラムにアプライする工程。 （ｂ）陰イオン交換またはアフィニティーカラムからαグルコシダーゼを豊富に
含む溶出物を回収すること。 （ｃ）溶出物を以下にアプライする工程： （ｉ）αグルコシダーゼがカラムに結合する条件下で疎水性相互作用カラムにア
プライし、次いでさらにαグルコシダーゼを豊富に含むさらなる溶出物を回収す
る工程、または （ｉｉ）αグルコシダーゼがヒドロキシアパタイトに結合しない条件下で溶出物
をヒドロキシアパタイトと接触させ、次いでαグルコシダーゼを豊富に含む結合
しない画分を回収する工程。 従って、本発明は、αグルコシダーゼを含むサンプルを２つのカラムにアプラ
イする工程を伴う、酸性ヒトαグルコシダーゼの精製方法を提供する。最初のカ
ラムは、陰イオン交換カラムまたはアフィニティーカラムのいずれかであり得る
。酸性αグルコシダーゼを結合条件下でカラムにアプライし、それはカラムに結
合してそして次いで溶出される。酸性αグルコシダーゼを豊富に含む溶出物を、
次いでαグルコシダーゼがカラムに結合する条件下で疎水性相互作用カラムにア
プライするか、またはαグルコシダーゼが結合しない条件下でヒドロキシアパタ
イトに接触させる。疎水性相互作用カラムから取った場合、さらなる溶出物はさ
らにαグルコシダーゼを豊富に含む。ヒドロキシアパタイト培養液から取った場
合、結合していない画分はαグルコシダーゼを豊富に含む。本方法は、例えばウ
シまたはウサギのような、トランスジェニック哺乳類の乳のような複雑な混合物
から、ヒト酸性αグルコシダーゼを精製するのに特に適している。 最初のカラムに好ましい物質はＱ−セファロースである。ヒトαグルコシダー
ゼはそのような材料に低塩濃度緩衝液中で結合し、そしてより高い塩濃度の溶出
緩衝液でカラムから溶出し得る。 あるいは、陰イオン交換カラムは銅キレートセファロース、フェニルホウ酸塩
（ｂｏｒｏｎａｔｅ）またはアミノフェニルホウ酸塩（ｂｏｒｏｎａｔｅ）であ
り得る。 別の好ましい方法では、（ａ）および（ｂ）のアフィニティーカラムはレンチ
ルセファロースである。 本発明の方法の工程（ｃ）に関して、疎水性相互作用カラムが使用される場合
、それは好ましくはフェニルセファロース、より好ましくはソースフェニル（Ｓ
ｏｕｒｃｅ Ｐｈｅｎｙｌ）１５である。溶出物を、約０．５Ｍまたはより高い
モル濃度の硫酸アンモニウムの添加液中で、疎水性相互作用カラムにアプライし
、そして低塩濃度の溶出緩衝液でカラムから溶出し得る。 必要に応じて、１つまたは両方のカラム工程を望ましいだけ反復し得る。精製
方法は通常少なくとも９５％、好ましくは９９％以上、より好ましくは９９．９
％ｗ／ｗ以上の純度を達成する。本方法はまた最初の容積が例えば少なくとも１
００リットルである大規模生成にも修正可能である。 特に好ましいプロセスは、トランスジェニック乳から得られた主に乳清を含む
画分を取る工程、これをバッチまたはカラム形式のいずれかでヒドロキシアパタ
イトと接触させる工程、ヒドロキシアパタイトからαグルコシダーゼを豊富に含
む結合していないサンプルを取り、次いでこれをＱセファロースクロマトグラフ
ィー工程、または上に規定した、または本明細書中で記載した工程にかけること
を含む。 本発明の２番目の局面は、以下を含む、トランスジェニック動物の乳から異種
由来のタンパク質を精製する方法を提供する。すなわち： ａ）トランスジェニック乳またはトランスジェニック乳画分を、異種タンパク質
以外の乳タンパク質種の少なくともかなりの部分がヒドロキシアパタイトに結合
し、そして異種タンパク質が本質的に結合しないままである条件下で、ヒドロキ
シアパタイトと接触させる工程、そして ｂ）ヒドロキシアパタイトから本質的に結合していない異種タンパク質を除去す
る工程。 従って、本発明は、トランスジェニック乳からの任意の異種タンパク質の精製
におけるヒドロキシアパタイトの使用も提供する。そこでは、乳タンパク質は本
質的にヒドロキシアパタイトに結合し得、そして異種タンパク質は本質的に結合
しない。この方法では、トランスジェニック乳の本質的に全ての他のタンパク質
から異種タンパク質を分離する、迅速な単一工程の手順が可能である。 トランスジェニック乳を、いずれの前処理も無しにヒドロキシアパタイトと直
接接触させ得る。しかし好ましくは、トランスジェニック乳は、例えば脱脂およ
び／またはカゼインの除去によって前処理される。 異種タンパク質は、好ましくは関心のある動物の乳に自然には見られないタン
パク質またはポリペプチドである。異種タンパク質は動物本来のタンパク質の自
然にはない変異体であり得、そして必ずしも乳タンパク質ではない。異種タンパ
ク質は、好ましくは問題の動物の乳には通常見られないが、異なった動物では見
られる。好ましくは、しかし、必ずしも他の動物の乳のみに見られるわけではな
い。 乳または乳サンプルのヒドロキシアパタイトとの接触は、十分な時間、および
緩衝液、ｐＨ、イオン強度、他の添加物、温度およびヒドロキシアパタイトの量
の適当な条件下で行われ、そのため異種タンパク質のかなりの部分が溶液中で遊
離したままであり、そしてヒドロキシアパタイトに結合しないままである。対照
的に、異種由来でない乳タンパク質のかなりの部分がヒドロキシアパタイトに結
合し、従って有利に分離を実施する。 ヒドロキシアパタイトに対する乳タンパク質の結合および所定の異種タンパク
質の不結合の、最も大きな差を確実にする最適な条件を決定することは、タンパ
ク質精製の分野における普通の技術の１つによって容易に実施され得ることであ
る。 本質的に結合していない異種タンパク質の除去は、好ましくは少なくともヒド
ロキシアパタイトの１部を通る液体の流れを含む。液体の流れは、ポンプ、吸引
、重力、および遠心分離の力から選択される１つ以上の力の結果として起こり得
る。本方法はバッチ手順として有利に実施され得る。 ヒドロキシアパタイトはカラムの形式で使用され得、従って、必要に応じて本
方法は液体カラムクロマトグラフィー手順として実施され得る。カラム手順では
、結合していない異種タンパク質画分は、カラムの添加手順の一部として、カラ
ムから通過したものの中で回収され得る。 使用されるヒドロキシアパタイトの量は、異種タンパク質の、ほかのトランス
ジェニック乳タンパク質からの分離を最適化するために、好ましくは乳または乳
サンプルの全タンパク質含有量に関連して調節される必要がある。これは当業者
にとって単なる日常的なことである。 異種タンパク質は、以下のいかなるものによっても例示され得る。すなわち、
ラクトフェリン、トランスフェリン、ラクトアルブミン、第ＶＩＩＩ因子および
第ＩＸ因子のような凝固因子、成長ホルモン、αアンチトリプシン、血清アルブ
ミン、Ｃ１−エステラーゼ阻害剤およびフィブリノーゲンのような血漿タンパク
質、コラーゲン、免疫グロブリン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、イン
ターフェロン、インターロイキン、ペプチドホルモン、ならびにαグルコシダー
ゼ、α−Ｌ-イズロニダーゼ、イズロン酸硫酸スルファターゼ、ヘキソサミニダ ーゼＡおよびＢ、ガングリオシドアクチベータータンパク質、アリルスルファタ
ーゼＡおよびＢ、イズロン酸スルファターゼ、ヘパランＮ−スルファターゼ、ガ
ラクトセラミダーゼ、αガラクトシルセラミダーゼＡ、スフィンゴミエリナーゼ
、αフコシダーゼ、αマンノシダーゼ、アスパルチルグルコサミンアミドヒドラ
−ゼ、酸性リパーゼ、Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミン−６−硫酸スルファ
ターゼ、αおよびβガラクトシダーゼ、βグルクロニダーゼ、βマンノシダーゼ
、セラミダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニ
ダーゼ、および保護タンパク質のようなリソソームタンパク質など。上記は対立
遺伝子、同起源および誘導変異体、ならびに同じもののポリペプチドフラグメン
トを含む。 異種タンパク質は、好ましくは動物の乳に通常見られないものである。 ３番目の局面では、本発明は、ヒト酸性αグルコシダーゼを含み、およびタン
パク質が混入しているサンプルを、αグルコシダーゼがヒドロキシアパタイトに
結合しない条件下でヒドロキシアパタイトに接触させる工程、次いでαグルコシ
ダーゼを豊富に含む結合していない画分を回収する工程を含む、ヒト酸性αグル
コシダーゼの精製方法を提供する。本方法は単純さのためにバッチ法として実施
され得、そして結合および結合していないαグルコシダーゼを、遠心分離を含む
沈降法でヒドロキシアパタイトから分離する。有利なことに、ヒドロキシアパタ
イトは一工程の精製手順を提供し得る。 しかし、ヒドロキシアパタイトはカラムの形式であり得、そしてその場合、結
合していない画分は、カラムの添加過程の一部としてカラムから通過したものの
中で回収され得る。 本発明の上記で述べた任意の局面によって、サンプルは、好ましくはαグルコ
シダーゼをその乳に発現するトランスジェニック哺乳類によって産生される乳で
ある。好ましいトランスジェニック乳は例えばウシまたはウサギのものである。 本発明の任意の方法は、乳から脂肪および／またはカゼインを除去するために
追加の工程をさらに含み得る。従って、本方法は乳を遠心分離する工程および脂
肪を除去して脱脂乳にする工程をさらに含み得る。本方法はまた、除去した脂肪
を水溶液で洗浄する工程、再遠心分離、脂肪を除去すること、および上清を脱脂
乳と共にプールする工程をさらに含み得る。さらなる工程は、脱脂乳からカゼイ
ンを除去することを含み得る。カゼインを除去する場合、本発明の方法は、好ま
しくは高速遠心分離に続く濾過、連続的に減少するフィルターのサイズを用いた
濾過、および直交流濾過（ｃｒｏｓｓ ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）から
なるグループから選択される工程を含む。 サンプルは、好ましくは少なくとも１００リットルの容積を有する。 ３番目の局面で、本発明は少なくとも９５％、好ましくは９９％、より好まし
くは９９．８％、さらにより好ましくは少なくとも９９．９％ｗ／ｗ純粋なヒト
酸性αグルコシダーゼを提供する。 本発明は本質的に他の生物学的物質を含まないヒト酸性αグルコシダーゼを提
供する。 本発明は本質的に混入物を含まないヒト酸性αグルコシダーゼを提供する。 本発明は上記で記載した本発明の任意の方法によって産生された、上記で規定
したヒト酸性αグルコシダーゼを提供する。 好ましくは、本発明のαグルコシダーゼは酵素的に活性であり、静脈内注射の
後、患者の肝臓、心臓、および／または筋肉細胞に有意なレベルで取り込まれる
形態である。内因性の酵素の欠損を有する患者において、酵素活性が統計上有意
に増加（ｐが０．０５以上）した場合、取り込みは有意である。 本発明はさらに、内因性のαグルコシダーゼ活性を欠損している患者を治療す
るための、医薬品組成物および方法を提供する。１回の静脈内投与に適した薬学
的組成物は、代表的には少なくとも０．５から２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは２か
ら１０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは５ｍｇ／ｋｇの、９５％、好ましくは９９％
、より好ましくは９９．８％、さらにより好ましくは９９．９％ｗ／ｗ純粋なヒ
ト酸性αグルコシダーゼを含む。治療の方法は、代表的には少なくとも０．５か
ら２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは２から１０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは５ｍｇ／
ｋｇの投与量の、９５％、好ましくは９９％、より好ましくは９９．８％、さら
により好ましくは９９．９％ｗ／ｗ純粋なヒト酸性αグルコシダーゼを患者に静
脈内投与することを伴い、それによってαグルコシダーゼは患者の肝臓および筋
肉細胞に取り込まれる。 従って、本発明は少なくとも５ｍｇ／ｋｇの、９５％、好ましくは９９％、よ
り好ましくは９９．８％、さらにより好ましくは９９．９％（ｗ／ｗ）純粋なヒ
ト酸性αグルコシダーゼを含む、単回静脈内投与のための薬学的組成物を提供す
る。 本発明は上記で規定されたヒト酸性αグルコシダーゼを含む医薬品組成物を提
供する。 本発明は医薬品として使用するための上記で規定されたヒト酸性αグルコシダ
ーゼを提供する。 本発明は、少なくとも５ｍｇ／ｋｇの投与量の、９５％、好ましくは９９％、
より好ましくは９９．８％、さらにより好ましくは９９．９％（ｗ／ｗ）純粋な
ヒト酸性αグルコシダーゼを患者に静脈内投与する工程を含む、内因性αグルコ
シダーゼを欠損している患者を治療する方法を提供し、それによってαグルコシ
ダーゼは患者の肝臓、心臓、および／または筋肉細胞に取り込まれる。 本発明は、ヒト酸性αグルコシダーゼ欠損症治療のための薬物を製造するため
に、本明細書中、上記で規定されたヒト酸性αグルコシダーゼの使用を提供する
。１２番目の局面で、本発明はヒト酸性αグルコシダーゼ欠損症治療のために静
脈内投与する薬物を製造するために、本明細書中、上記で規定されたヒト酸性α
グルコシダーゼの使用を提供する。 （定義） 「実質的に純粋」または「単離された」という用語は、その天然の環境の構成
要素から同定および分離ならびに／または回収されたヒト酸性αグルコシダーゼ
を意味する。通常、目的の種は、存在する優性な種であり（すなわち、モルの基
準でそれは構成要素中において、いかなる他の個々の種よりも、より大量である
）、そして好ましくは、実質的に精製された画分は、目的の種が存在する全ての
高分子種の少なくとも約５０％（モルの基準で）を占める組成物である。一般的
に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全ての高分子種の、重量の約
８０〜９０％より多くを占める。最も好ましくは、目的の種は９５％、９９％、
または９９．９％純粋にまでまたは本質的に均一になるまで精製される（夾雑物
種は慣習的な検出方法によって組成物中に検出され得ない）。ここで組成物は本
質的に単一の高分子種の誘導体からなる。 低塩緩衝液は、塩濃度が１００ｍＭより低い、および好ましくは５０ｍＭより
低い緩衝液を意味する。高塩緩衝液は、塩濃度が３００ｍＭより高い、および好
ましくは少なくとも５００ｍＭである緩衝液を意味する。 （詳細な説明） 本発明は、とりわけ異種タンパク質、好ましくはヒト酸性αグルコシダーゼを
トランスジェニック動物の乳汁から精製する方法を提供する。この方法は大規模
な産生に従い、そして治療的投与に適切な形態でαグルコシダーゼを含むタンパ
ク質を生じる。この方法は、ヒトタンパク質および特にヒト酸性αグルコシダー
ゼを、トランスジェニック動物によって産生された乳汁から単離するのに特に適
切である。１つの局面では、本発明は２つのクロマトグラフィー工程（１つは陰
イオン交換カラムまたはアフィニティークロマトグラフィー工程、もう１つは疎
水性相互作用カラムまたは、バッチもしくはカラムクロマトグラフィー形式でヒ
ドロキシルアパタイトを使用すること）を伴う方法を提供する。２つの異なった
分離は相乗的な様式で作用し、実質的に乳汁組成物に存在するタンパク質の混入
を排除する。例えば、陰イオン交換カラムは、ヒト酸性αグルコシダーゼを酸性
乳清タンパク質から分離するが、血清アルブミンおよびトランスフェリンから完
全には分離しない。疎水性相互作用カラムは、ヒト酸性αグルコシダーゼを血清
アルブミンおよびトランスフェリンから効果的に分離するが、酸性乳清タンパク
質からは分離しない。 代表的な精製手順は、上記のカラム精製の前および後にさらなる工程を含み得
る。例えば、ヒト酸性αグルコシダーゼを乳汁から精製する場合、脂肪およびカ
ゼインをカラムクロマトグラフィーの前に乳汁から除去する。その手順はまた、
存在し得るあらゆるウイルスを除去するためにさらなる工程を含み得る。次いで
αグルコシダーゼを、上記で述べた２つのカラム工程によって、乳清タンパク質
および他の乳汁タンパク質から分離する。これらのそれぞれまたは両方は、所望
の精製の程度が達成されるまで、１回より多く実施され得る。カラムクロマトグ
ラフィーの後、αグルコシダーゼを必要に応じて濃縮し、そして保存緩衝液に再
懸濁する。 別の局面において、本発明は、最適化された条件下でヒドロキシルアパタイト
を含む手順を提供する。ここで、異種タンパク質は、実質的にマトリックスに結
合できず、一方混入した乳汁タンパク質が、実質的に結合する。この方法は、目
的の異種タンパク質の所定の実質的な精製を完了する、迅速かつ再現性のある１
つの工程を提供する。 （Ｉ．αグルコシダーゼの供給源） 述べたように、この方法は、トランスジェニック動物の乳汁からヒト酸性αグ
ルコシダーゼを精製するために特に適している。トランスジェニック動物の乳汁
におけるαグルコシダーゼの産生は、ＷＯ９７／０５７７１（全ての目的のため
にその全体が参考として援用される）によって記載される。手短に言えば、α−
ｓ１−カゼインのような乳腺特異的遺伝子由来の調節性配列を、αグルコシダー
ゼをコードする配列に作動可能に連結する。次いで、導入遺伝子を胚に導入し、
それをトランスジェニック哺乳動物に成長させる。雌性トランスジェニック哺乳
動物は、それらの乳腺において導入遺伝子を発現し、そしてヒト酸性αグルコシ
ダーゼを乳汁中へ分泌する。マウスでは１リットルあたり４ｇまでのレベルを、
そしてウサギでは１リットルあたり７ｇまでのレベルを獲得し得る。 トランスジェニックウサギは、それらは速く繁殖するので短い期間で生産群が
確立され得、そしてそれらは、１リットルあたり約１５０ｇのタンパク質を含む
有意な量の乳汁（０．５リットル／週まで）を産生するので、特に目的のもので
ある。トランスジェニックウシ（ＤｅＢｏｅｒら、ＷＯ９１／０８２１６）もま
た、低いコストで、１リットルあたり約３５ｇのタンパク質を含む大量の乳汁（
約１０，０００リットル／年）を産生するので、目的のものである［Ｓｗａｉｓ
ｇｏｏｄ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｄａｉｒｙ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
−１、Ｆｏｘ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂ
ｌｉｓｈｅｒ、Ｌｏｎｄｏｎ（１９８２）１−５９頁］。ヤギ、ヒツジ、ブタ、
マウスおよびラットもまた、それらの乳汁にαグルコシダーゼを発現させるため
に適切な宿主である（例えば、Ｒｏｓｅｎ、ＥＰ２７９，５８２、Ｓｉｍｏｎら
、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６、１７９−１８３（１９８８）を参照のこ
と）。 ヒト酸性αグルコシダーゼの他の供給源は、細胞発現系（例えば、細菌、昆虫
、酵母、または哺乳動物）およびヒト組織（例えば、死体由来の肝臓）のような
天然の供給源を含む。 （ＩＩ．乳汁の脱脂） ウサギ乳汁の脱脂を、通常の技術（例えばＨｅｔｔｉｃｈ Ｒｏｔａｎｔａ
ＲＰ、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ−５Ｂ、または必要とされる脂肪除去の有効性を生
じるＥｌｅｃｒｅｍのような連続フロー遠心分離（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｆｌ
ｏｗ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）機を用いる低速遠心分離（約２０００ｇ
））を使用して実施し得る。乳汁を回収し、そして直接凍結し得るか、または最
初に脱脂し、次いで凍結し得る。必要に応じて、分離した脂肪を水または低塩緩
衝液で洗浄し、続いて洗浄したものを再遠心分離して精製されるべき産物の回収
率を改善し得る。また、脂肪除去のためにウシ酪農産業で使用される他の方法も
適用し得る（例えば濾過）。 （ＩＩＩ．乳汁からのカゼインの除去） カゼインは、種々の方法によって乳汁から除去され得る。いくつかの方法は、
酸処理または熱ショックのいずれかを使用する。例えば、１つの方法では、脱脂
乳をｐＨ４．７にして、約３０分間インキュベートし、続いて、例えば遠心分離
する。必要に応じて、温度ショックを、ｐＨ４．７に調節した後、例えば１０℃
から約３５℃までで適用し得、続いて再び遠心分離（低速：約２０００ｇで数分
間）する。この方法は、ヒト酸性αグルコシダーゼを含む乳汁からのカゼインの
分離において使用し得るが、これは、ヒト酸性αグルコシダーゼがｐＨおよび温
度処理の両方に感受性であるので、好ましくない。一般的に、ヒト酸性αグルコ
シダーゼ活性は、ｐＨが４．５より下に下がるかまたは温度が４０℃を超えて上
昇した場合、有意に減少する。 乳汁からカゼインを分離する他の方法は、高速遠心分離および／またはデッド
エンドフィルトレーション（ｄｅａｄ−ｅｎｄ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）および
／または接線流濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ
）を使用する。カゼインを除去するために、Ｐｏｗｅｒｆｕｇｅ（数百リットル
の脱脂乳）を用いて遠心分離を大規模に実施し得る。カゼイン除去の能率は１０
０％ではなく、むしろ８０〜９０％に近いので、遠心分離した乳清を続くクロマ
トグラフィーの前にさらに浄化する。デッドエンドフィルトレーション（すなわ
ち、孔の大きさが連続的に小さくなる膜を使用する）または直交流濾過（すなわ
ちＴＦＦ）を使用し得るかのいずれかにより浄化を行い得る。 接線流濾過は、一番良い結果を与える：酸性αグルコシダーゼが膜を高率で通
過し、清澄な乳清を得る（ダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｉｏ
ｎ）後、９０％を超える回収率で産物を獲得し得る）。接線流濾過（直交流濾過
としても知られる）は、膜を横切って再循環する流れのために、膜の詰まりがよ
り少ない特別な濾過の方法である。製薬的（工業的）プロセスにおける利点は、
これらの型の膜は、デッドエンドフィルターと対照的に、クリーニングの後再使
用し得ることである。続く精製のための酸性αグルコシダーゼの供給源として使
用されるのと同様に、ＴＦＦから得られた乳清を使用して、乳清を含む食品を産
生し得る。分離したカゼインもまた、食品の産生に使用され得る。 接線流濾過の様式で、いくつかの型の膜を試験した。種々の膜が適切であるこ
とが見出された（高率の酸性αグルコシダーゼ通過を伴う清澄な濾液を意味する
）：孔は、約０．０５〜０．３μｍ、好ましくは０．１〜０．２μｍの孔の大き
さで変化した。Ｂｉｏｍａｘ １０００ｋ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通すＰｏ
ｗｅｒｆｕｇｅ乳清画分の処理は、６０〜８０％のヒト酸性αグルコシダーゼ通
過を伴う清澄な乳清濾過物を生じた。いわゆるダイアフィルトレーションの様式
で、得られた（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）画分を緩衝液（例えば２０ｍＭのリン酸ナ
トリウム緩衝液、ｐＨ７．０）で洗浄した後、回収率が、９７％を超えるまで増
加され得る。 直交流濾過（ｃｒｏｓｓ−ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を使用して、予
め高速遠心分離する工程なしに乳汁からカゼインを分離し得る。６５〜３５％の
ヒト酸性αグルコシダーゼの通過によって清澄な乳清を得る。ダイアフィルトレ
ーションによって（容積を保つために緩衝液を加える）、回収率を、９０％を超
えるまで増加させ得る。ダイアフィルトレーションの後、濾液は濃縮しなければ
ならない。これは、例えばＢｉｏｍａｘ ３０ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）膜、ま
たは孔の大きさが小さいために酸性αグルコシダーゼが膜を通らない任意の他の
膜を使用する限外濾過を用いて容易に行い得る。 （ＩＶ．カラムクロマトグラフィー） 本発明に従う１つの好ましい方法は、２つのカラムクロマトグラフィー工程（
１つは陰イオン交換カラムまたはアフィニティーカラム、もう１つは疎水性相互
作用カラム）を使用する。この工程はいずれかの順序で実施され得る。工程のい
ずれかまたはいずれも、高い純度を得るために反復し得る。 陰イオン交換カラムは２つの構成要素（マトリックスおよびリガンド）を有す
る。マトリックスは、例えばセルロース、デキストラン、アガロースまたはポリ
スチレンであり得る。リガンドは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、ポリエ
チレンイミン（ＰＥＩ）または第４級アンモニウム官能基であり得る。陰イオン
交換カラムの強度は、リガンドのイオン化状態に関連している。第４級アンモニ
ウムリガンドを有する陰イオン交換カラムような、強い陰イオン交換カラムは、
広いｐＨの領域にわたる恒常的な陽性電荷を有する。ＤＥＡＥおよびＰＥＩのよ
うな弱い陰イオン交換カラムでは、陽性電荷の存在はカラムのｐＨに依存する。
Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、または金属キレートＳｅｐｈａｒｏｓｅ（例え
ばＣｕ2+キレートＳｅｐｈａｒｏｓｅ）のような強い陰イオン交換カラムが好ま
しい。陰イオン交換カラムは一般的に、αグルコシダーゼのｐＩより上のｐＨで
、低塩緩衝液を用いてロードされる。αグルコシダーゼの計算したｐＩは５．４
である（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータベース）。カラムを低塩緩衝液で数回洗浄
し、結合していないタンパク質を溶出する。次いで、結合したタンパク質を、塩
濃度を増加させた緩衝液を用いて溶出する。 Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦは、好ましい陰イオン交換カラムである。なぜ
なら、この物質は他の陰イオン交換カラムに比べて比較的安価であり、そして大
規模の精製に適切な比較的大きいビーズサイズを有するからである。特定の条件
下で、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦはヒト酸性αグルコシダーゼに結合し、そ
してαグルコシダーゼを最も強く結合する（乳汁）タンパク質から有効に分離す
る。これらの強く結合するタンパク質のいくつか（例えばウサギ乳清酸性タンパ
ク質（ＷＡＰ））は、続く疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程で
αグルコシダーゼと共に同時溶出される傾向があるので、これは重要である。ヒ
ト酸性αグルコシダーゼのＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦへの良好な結合を得る
ために、カラムを低塩（すなわち、５０ｍＭより低い、好ましくは３５ｍＭより
低い、リン酸ナトリウム緩衝液またはカリウム緩衝液あるいはトリスのような他
の適切な塩）で予め平衡化する。ヒト酸性αグルコシダーゼのカラムへの良好な
結合を得るために、緩衝液のｐＨは約７．０＋／−１．０であるべきである。よ
り高いｐＨは適切ではない。なぜなら、ヒト酸性αグルコシダーゼがある程度不
活化されるからである。より低いｐＨは、αグルコシダーゼの陰イオン交換物質
への結合を弱める。 次いで、ヒト酸性αグルコシダーゼを増加させた塩濃度で段階的に溶出するか
、または勾配溶出する。段階溶出は、より大規模な精製に従う。ロードしたヒト
酸性αグルコシダーゼの約８５％が、比較的高い純度で、Ｑ ＦＦカラムから一
工程で（約０．１Ｍの塩で）溶出され得る。αグルコシダーゼをウサギの乳汁か
ら精製する場合、主なタンパク質混入物は、トランスフェリンおよび血清アルブ
ミンのようなウサギ乳汁由来タンパク質である。ＷＡＰのような強く結合した乳
汁タンパク質は、より高い塩濃度（例えば１Ｍの塩）でＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
ＦＦから溶出される。 必要に応じて、陰イオン交換工程は、アフィニティークロマトグラフィー工程
と置換され得るが、それは好ましくない。適切なアフィニティー試薬は、レクチ
ンおよび抗体を含む。レクチンは、糖タンパク質に対して親和性を有する、植物
由来の炭水化物結合タンパク質である。代表的に、タンパク質を、約１ｍＭのＣ
ａ2+またはＭｇ2+を含む、約１５０ｍＭの塩および中性ｐＨの緩衝液でレクチン
カラムにロードする。糖タンパク質を、そのようなカラムから０．１〜０．５Ｍ
の濃度のスクロースのような単糖を含む緩衝液を用いて溶出し得る。レクチンア
フィニティーカラムの例は、レンチルＳｅｐｈａｒｏｓｅ（コンカナバリンＡに
比べて毒性が低いと報告されている）のようなＳｅｐｈａｒｏｓｅ（または他の
マトリックス）と結合したレクチンを含む。また、（アミノ）フェニルボロネー
ト（ｂｏｒｏｎａｔｅ）のような、隣接するジオールを認識するリガンドを使用
し得る。ヒト酸性αグルコシダーゼに対するモノクローナル抗体またはポリクロ
ーナル抗体もまた、アフィニティー試薬として使用され得る。抗体を代表的には
臭化シアン活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合させる。非特異的に結合したまたは
弱く結合したタンパク質を、そのようなカラムから、中程度の高塩濃度（すなわ
ち、約０．５Ｍより高い）の中性緩衝液を用いて溶出し得る。特異的に結合した
αグルコシダーゼを、低いｐＨの緩衝液（例えば５０ｍＭのクエン酸、ｐＨ３．
０）を用いて溶出する。溶出に続いて、αグルコシダーゼを中性化するべきであ
る。抗体は比較的高価な試薬であり、および精製の最終的な目的が治療的使用の
ためのタンパク質を産生することである場合、生物製剤としてＦＤＡの再審査を
受けるので、抗体に基づくアフィニティー精製は、陰イオン交換に比べて好まし
くない。 ヒト酸性αグルコシダーゼを単離するために使用される第二のカラムは、疎水
性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムである。ＨＩＣカラムは、２つ
の構成要素（マトリックスおよびリガンド）を有する。適切なマトリックスはＳ
ｅｐｈａｒｏｓｅおよびポリスチレンを含む。適切なリガンドはフェニル基、ブ
チル基、オクチル基、およびエーテル基を含む。Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅTMまたは（Ｓｏｕｒｃｅ Ｐｈｅｎｙｌ １５（フェニル基がポリスチレン
カラムに結合した））が特に適切である。ＨＩＣクロマトグラフィーのためのロ
ーディング緩衝液は、疎水性相互作用に有利である高濃度の塩を含む。適切な陰
イオンは、リン酸塩、硫酸塩、および酢酸塩である。適切な陽イオンは、アンモ
ニウム、ルビジウム、およびカリウムである。例えば、約０．５＋／−０．２Ｍ
の硫酸アンモニウム溶液（ｐＨ６）が適切である。これらの条件下で、ほとんど
の他のタンパク質が結合しないのに対して、ヒト酸性αグルコシダーゼはカラム
に結合する。次いで、αグルコシダーゼを低塩溶出緩衝液で溶出し得る。例えば
、２５〜１００ｍＭ（好ましくは５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液）、ｐＨ約
６．０（＋／−１．０）の緩衝液が適切である。 ヒト酸性αグルコシダーゼおよび他の乳汁タンパク質の溶出の相対的な順序は
、カラムの性質に依存する。例えば、フェニルＳｅｐｈａｒｏｓｅカラムでは、
αグルコシダーゼが血清アルブミンよりよく結合する。（Ｓｏｕｒｃｅ Ｐｈｅ
ｎｙｌ １５）カラムでは、この場合と逆である。トランスフェリンはＳｏｕｒ
ｃｅ Ｐｈｅｎｙｌ １５カラムおよびフェニルＳｅｐｈａｒｏｓｅカラムによ
り弱く結合する。トランスフェリンの結合を、（例えば０．５Ｍの硫酸アンモニ
ウム）で阻害し得る。 （Ｖ．ウイルスの除去） ウイルスの除去のために、溶媒／界面活性剤工程を、手順のあらゆる位置に（
通常、乳汁から脂肪およびカゼインを除去した後に）組み込み得る。１％のＴｗ
ｅｅｎ−８０と組み合せた０．３％のトリ−ｎ−ブチルホスフェート（ＴｎＢＰ
）のような、溶媒および界面活性剤の特定の組み合せは、エンベロープ化（ｅｎ
ｖｅｌｏｐｅｄ）ウイルスを除去するのに非常に有効である（Ｈｏｒｏｗｉｔｚ
ら（１９８５）Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２５、５１６−５２２頁）。直交流濾
過の後に得られた乳清画分を、０．３％のＴｎＢＰおよび１％のＴｗｅｅｎ−８
０と共に２５℃で６時間インキュベートした。このインキュベーションの後、乳
清をＱ ＦＦクロマトグラフィーカラムで直接ロードした。カラムを結合緩衝液
で洗浄し、そして結合した酸性αグルコシダーゼを塩緩衝液（実施例を参照のこ
と）で溶出した後、ほとんどの溶媒および界面活性剤が、本発明者らの産物のα
グルコシダーゼから除去された。残りの非エンベロープ化ウイルス（小さいパル
ボウイルスのような）の除去を確実にするために、特別にナノ濾過（ｎａｎｏｆ
ｉｌｔｒａｉｏｎ）工程を、このプロセスの最後の工程の１つに組み込み得る。
これらのフィルターは、現在では十分に定義されている（例えばＰｌａｎｏｖａ
１５または３５）。 （ＶＩ．再懸濁、保存、および濃縮） クロマトグラフィーカラムから回収した後、ヒト酸性αグルコシダーゼを必要
に応じて濃縮および、保存または使用に適切な緩衝液に再懸濁する。必要に応じ
て、ヒト酸性αグルコシダーゼを保存目的のために凍結乾燥し得る。 （精製されたヒト酸性αグルコシダーゼの使用） 本発明に従い産生された、精製されたヒト酸性αグルコシダーゼは、酵素置換
治療手順における使用を見出す。酵素の不足を引き起こす遺伝的または他の欠損
を有する患者を、患者に外来性の酵素を投与することによって処置し得る。その
ような処置を必要とする患者は症状から同定され得る（例えば、心臓肥大、肝脾
腫大、リソソームの数およびそのマーカーの増加、関節の硬化）。あるいは、ま
たはそれに加えて、患者を、αグルコシダーゼによって処理される代謝物の過剰
な蓄積を明らかにするために、組織サンプルの生化学的な分析によって、または
酸性αグルコシダーゼの欠損を明らかにするために、人工もしくは天然の物質を
用いた酵素アッセイによって診断し得る。特定の酵素の欠損を測定することによ
って、またはＤＮＡ分析によって、症状の発生または代謝物の過剰な蓄積の前に
診断し得る（Ｓｃｒｉｖｅｒら、前出、リソソーム貯蔵障害の章）。αグルコシ
ダーゼ貯蔵疾患は、遺伝性である。従って、αグルコシダーゼによって罹患した
メンバーを有することが知られている家族の子孫においては、しばしば最終的な
診断がなされ得る前でさえ予防的な処置を始めることが賢明である。 いくつかの方法では、ヒト酸性αグルコシダーゼは、精製された形態で薬学的
キャリアと共に、薬学的組成物として投与される。好ましい形態は、意図する投
与および治療的適用の様式に依存する。薬学的キャリアは、患者にポリペプチド
を送達するために適切な、任意の適合性の非毒性の物質であり得る。滅菌水、ア
ルコール、脂肪、ワックス、および不活性な固体をキャリアとして使用し得る。
薬学的に受容可能なアジュバント、緩衝剤、分散剤などもまた、薬学的組成物中
に組み込まれ得る。 薬学的組成物中の酵素の濃度は、広範に異なり得る（すなわち、重量で約０．
１％より少ないものから、通常は少なくとも重量で約１％、重量で２０％以上ま
で）。 経口投与では、活性成分は、カプセル、錠剤、および粉末のような固体投薬形
態で、またはエリキシル、シロップ、および懸濁液のような液体投薬形態で投与
され得る。活性成分をゼラチンカプセルに、不活性成分および粉末キャリア（例
えば、グルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、デンプン、セルロ
ースまたはセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッ
カリンナトリウム、タルカム、炭酸マグネシウムなど）とともにカプセル化し得
る。望ましい色、味、安定性、緩衝化能、分散または他の公知の所望の特徴を提
供するために添加され得るさらなる不活性成分の例は、赤色酸化鉄、シリカゲル
、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタン、食用白色インクなどである。同様の
賦形剤を使用して、圧縮した錠剤を作製し得る。錠剤およびカプセルの両方は、
数時間の間にわたって薬剤の持続的な放出を提供するために、徐放性産物として
産生され得る。圧縮錠剤は、あらゆる不快な味をマスクし、そして錠剤を環境か
ら保護するために、糖衣またはフィルムコートされ得るか、または胃腸管内での
選択的な分解のために腸溶性コートされ得る。経口投与のための液体投薬形態は
、患者の受容を増すために着色および味付けを含み得る。 静脈内注入のための代表的な組成物を、必要に応じて２０％アルブミン溶液を
補充した、１００〜５００ｍｌの滅菌０．９％ＮａＣｌまたは５％グルコースお
よび１００〜５００ｍｇの酵素を含むように作成し得る。筋肉内注射のための代
表的な薬学的組成物を、例えば１ｍｌの滅菌緩衝化水および１〜１０ｍｇの本発
明の精製酵素を含むように作成する。非経口的に投与可能な組成物を調製する方
法は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ（第１５版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、
１９８０）（全ての目的のためにその全体が参考として援用される）を含む、種
々の情報源でより詳細に記載されている。 本発明の薬学的組成物は、通常静脈内投与される。皮内、筋肉内、または経口
投与もまた、ある状況では可能である。組成物は、リソソーム酵素欠乏性疾患に
罹患しているか、またはそのおそれのある個体を予防的に処置するために投与さ
れ得る。治療的な適用では、薬学的組成物は、確立した疾患に罹患した患者に、
蓄積した代謝物の濃度を減少する、および／または代謝物のさらなる蓄積を阻害
または阻止するのに十分な量を投与される。リソソーム酵素欠乏性疾患のおそれ
のある個体では、薬学的組成物は代謝物の蓄積を防止または阻害のいずれかをす
るのに十分な量で予防的に投与される。これを達成するのに適切な量は、「治療
的に有効な用量」または「予防的に有効な用量」として定義される。そのような
有効な投薬量は、状態の重症度、および患者の健康の一般的状態に依存するが、
一般的に体重１ｋｇあたり約０．１〜１０ｍｇの精製酵素の範囲である。 トランスジェニック動物の乳汁で産生されたヒト酸性αグルコシダーゼは、多
くの他の利用法を有する。例えば、αグルコシダーゼは、他のαアミラーゼと共
通して、デンプン、ビール、および医薬品の産生に重要な手段である。Ｖｉｈｉ
ｎｅｎおよびＭａｎｔｓａｌａ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．２４、３２９−４０１（１９８９）を参照のこと（全ての目的のため
にその全体が参考として援用される）。ヒト酸性αグルコシダーゼはまた、実験
用化学薬品または食品を産生するのに有用である。例えば、酸性αグルコシダー
ゼは１，４および１，６α−グリコシド結合を分解し、そしてこれらの結合を含
む種々の炭水化物（例えば、マルトース、イソマルトース、デンプンおよびグリ
コーゲン）を分解してグルコースを産生するのに使用され得る。酸性αグルコシ
ダーゼはまた、腸のマルターゼまたはイソマルターゼ欠損を有する患者に投与す
るのに有用である。そうでなければ消化されないマルトースの存在によって引き
起こされる症状が避けられる。そのような適用では、酵素は予め乳汁から分別す
ることなく、そのような乳汁に由来する食品として（例えばアイスクリームまた
はチーズ）、または薬学的組成物として投与され得る。精製された組換えリソソ
ーム酵素はまた、組織サンプルにおける未知量のそのような酵素をアッセイする
ための診断キットに、コントロールとして含むのに有用である。 （実施例） （１．材料および方法） （酸性αグルコシダーゼアッセイ） ９６ウェルマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ）を氷上に置き、そして２０
μｌの４−ＭＵ基質（４−メチルウンベリフェリル−ａ−Ｄ−グルコピラノシド
、Ｍｅｌｌｆｏｒｄ Ｌａｂｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、０．２Ｍの酢酸ナトリウム緩衝
液、ｐＨ４．３中で２．２ｍＭ）をウェルに加えた。試験すべき試料（１０μｌ
、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）＋０．５％のＢＳＡ（ｗ／ｖ、Ｓｉｇｍａ
ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ）で希釈）を加え、そして３７℃で３０分間インキュベ
ートした。反応を２００μｌの０．５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．５）
で停止させた。マイクロタイタープレートを蛍光計でアッセイした（励起波長＝
３６０ｎｍ、発光波長＝４６０ｎｍ）。スタンダードとして、組換えヒト成熟酸
性αグルコシダーゼをそれぞれのアッセイでインキュベートした。 （酸性αグルコシダーゼの放射性ヨウ素化） トランスジェニックウサギ乳（系統６０）から精製した組換えヒト前駆体酸性
αグルコシダーゼを、クロラミンＴ法で放射性ヨウ素化した。標識化は本質的に
以下のように行った。すなわち、０．２ｍｌの前駆体（約０．１ｍｇ）に１０μ
ｌのＮａ125Ｉ（約１ｍＣｉ）を加えた。クロラミンＴ（５０μｌ、ＰＢＳ中で ０．４ｍｇ／ｍｌ）を加え、そして６０秒間インキュベートした。次いで、５０
μｌのＮａ2Ｓ2Ｏ5（ＰＢＳ中で１ｍｇ／ｍｌ）およびＰＢＳ中１００μｌの０ ．２ｍｇ／ｍｌ ＮａＩ溶液を加えた。ＰＢＳ、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０、
１ＭのＮａＣｌ、０．０５％のアジ化ナトリウムで平衡化したＰＤ １０ゲル濾
過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で、遊離の125Ｉを分離した。標識化したタン パク質をプールし、そして−８０℃で保存した。 （金属キレート化セファロースおよびレクチンセファロースを用いたラジオア
ッセイ） 放射性ヨウ素化された前駆体酸性αグルコシダーゼの、金属キレート化セファ
ロースへの結合を測定し、特定の金属が（放射性標識）酵素と相互作用するか否
かを決定した。レクチンセファロースへの結合もまた決定した。 キレート化セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を製造会社の推奨によって種
々の塩とインキュベートした。本質的に、セファロースを以下のように調製した
。すなわち、３．５ｍｌの包装セファロースビーズを５００ｍｌの水に希釈し、
遠心分離し（３５００ｒｐｍ、１０分）、そして上清を除去した後、ビーズを５
０ｍｌのＣｕＣｌ2（２５７ｍｇ）、ＺｎＣｌ2（２１５ｍｇ）、硫酸鉄（ＩＩＩ
）（４００ｍｇ）、または硫酸鉄（ＩＩ）（４１７ｍｇ）のいずれかに再懸濁し
た。一晩インキュベート（回転）した後、ビーズを水で３回洗浄し、そして次い
でＰＢＳ、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０、１ＭのＮａＣｌで洗浄し、そして５０
ｍｌの水中、４℃で保存した。結合実験のために、０．５ｍｌのセファロースビ
ーズを、ＰＢＳ、０．０２％のＴｗｅｅｎ−２０、またはＰＢＳ、０．１％のＴ
ｗｅｅｎ−２０、０．５ＭのＮａＣｌで５回洗浄した。放射性標識した前駆体酵
素（ＰＢＳ、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０中５０μｌ、約５０，０００ｃｐｍ）
を、０．５ｍｌのビーズ懸濁液に加え、そして室温で一晩インキュベート（回転
）した。セファロースビーズをＰＢＳ、０．０２％のＴｗｅｅｎ−２０で４回洗
浄し、そして結合した標識の量を液体シンチレーションカウンターで計測した。 （２．トランスジェニック乳の脱脂（ｓｋｉｍｍｉｎｇ（ｄｅｆａｔｔｉｎｇ
））） Ａ．乳を２５℃の水浴中で振とうしながら解凍した。次いで標的タンパク質の
回収率を最大限にするために乳を水で２倍に希釈し、そして遠心分離用ボトルま
たはチューブに入れた。 ２８００×ｇ、１５〜３０分間、４℃で遠心分離することによって、乳を脱脂
した。脂肪を、スプーンを用いてまたは吸引によって除去した。また、全（脱脂
していない）乳を同じ条件下で遠心分離した。得た脂肪画分を、（１）水で洗浄
し、そして再遠心分離、または（２）別のバッチを低塩濃度緩衝液で洗浄し、そ
して再遠心分離した。脱脂乳および洗浄画分（再遠心分離の後）をさらなる処理
のためにプールした。 Ｂ．乳を２５℃の水浴中で振とうしながら解凍し、次いで乳を連続的な遠心分
離を用いるＥｌｅｃｒｅｍ遠心分離に入れた。プールした脱脂乳中のヒト酸性α
グルコシダーゼの回収率を最大限にするために、脂肪画分を回収し、水で希釈し
、そして再遠心分離した。９０％より大きい回収率が得られ得る。 （３．遠心分離およびデッドエンドフィルトレーション（ｄｅａｄ−ｅｎｄ
ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を用いた、脱脂トランスジェニック乳からの乳清画分の
調製） Ｐｏｗｅｒｆｕｇｅ（Ｃａｒｒ）における２０，０００×ｇ、３０−４５分間
、５−２０℃での連続的な遠心分離によって、（希釈）脱脂ウサギ乳からカゼイ
ンを除去した。生じた乳清画分をデッドエンドフィルトレーション（ｄｅａｄ−
ｅｎｄ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によってクロマトグラフィーに適当なようにし
た。 デッドエンドフィルトレーション（ｄｅａｄ−ｅｎｄ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ
）：まずＣＰ１５またはＡＰ１５プレフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用
し、続いて１．２μｍＲＡ、０．８μｍＡＡ、０．６５μｍＤＡおよび０．４５
μｍＨＡ膜フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、直径４７ｍｍのディスクフィルタ
ー）を通して、緩慢な圧力下で濾過した。フィルターの目詰まりが起きたら、新
しいフィルターを使用した。０．４５μｍの膜濾過後に得られた濾液がクロマト
グラフィーに適当であった。Ｃａｒｒ Ｐｏｗｅｒｆｕｇｅによる遠心分離の後
、標的タンパク質の回収率は一般的に約６０〜８０％であった。デッドエンドフ
ィルトレーションはヒト酸性αグルコシダーゼ活性の最低限の損失、一般的には
３％より小さい損失を引き起こした。 （４．ＴＦＦを用いた脱脂トランスジェニック乳からの乳清画分の調製） 約４．５リットルの希釈脱脂ウサギ乳からＴＦＦによって乳清を調製した。Ｂ
ｉｏｍａｘ１０００（０．５ｍ2）膜カセットを、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＰｒｏ ｆｌｕｘ ＭＡにつなげたカセットホルダーに配置した。カゼインミセルの非常
によい保持（濾液が非常に透明であることを意味する）および約３０〜６０％の
ヒト酸性αグルコシダーゼの通過を与えるので、この膜を選択した。処理条件は
以下であった。 Ｐ−入口＝１．０バール、Ｐ−出口＝０．７バール、Ｐ−濾過＝０．７バール、
膜透過圧（ＴｒａｎｓＭｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ）（ＴＭＰ）＝０．
１５バール、流量＝約１５Ｌ／時／ｍ2、処理温度＝１０〜３５℃、好ましくは 約２０℃（室温）。濾過におけるヒト酸性αグルコシダーゼの回収率を改善する
ために、保持物を低塩濃度緩衝液、例えばｐＨ７．０の２０ｍＭのリン酸ナトリ
ウム緩衝液に希釈した。約６ダイアフィルトレーション容量の後、濾過における
ヒト酸性αグルコシダーゼ活性の回収率は８０％より大きかった。ダイアフィル
トレーションにより、乳清画分（濾液）の容量は劇的に増加した。同じＴＦＦ装
置で、Ｂｉｏｍａｘ ３０膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、０．５ｍ2）を用いた限外 濾過によって、濾液を約７倍に濃縮した。この型の膜は、αグルコシダーゼを通
さない。この工程において５０Ｌ／時／ｍ2の流量を容易に得ることができる。 ＴＭＰは１．０バールであった。濾液に活性は検出されず、全ての活性は保持物
画分に回収された。浸透したものが多くの塩化ナトリウムを含む場合、２０ｍＭ
のリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０でダイアフィルトレーションを行い、塩
化ナトリウムの濃度を５ｍＭより下に減少させた。 （５．溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）によるウイルスの不活化） 乳清画分のウイルス不活化（少なくともエンベロープに包まれたウイルス）を
、乳清を１％のＴｗｅｅｎ−８０および０．３％のトリ−ｎ−ブチルホスフェー
ト（ＴｎＢＰ）の存在下で、連続的にかつ穏かに攪拌しながら、４〜８時間（好
ましくは６時間）、２５℃でインキュベートすることによって行った。αグルコ
シダーゼ活性の有意な損失は見られなかった（＜１０％）。 （６．濾過した乳清または乳清画分に存在するヒト酸性αグルコシダーゼの、
Ｑセファロースファストフローへの結合） Ｑセファロースファストフロー（ＱＦＦ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）クロマトグラ
フィー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＸＫ−５０カラム、ベッドの高さ１５ｃｍ、流速
２５０ｃｍ／ｈｒ、全てのカラムクロマトグラフィーはＰｈａｒｍａｃｉａのＡ
ＫＴＡシステムによって制御し、タンパク質をオンラインで２８０ｎｍでの吸光
を測定することによって検出した）を、以下のプロトコールを用いて行った。 １．カラムを２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０（緩衝液Ａ）で平
衡化した。 ２．Ｓ／Ｄインキュベートした乳清画分（約５００から６００ｍｌ）を供した。 ３．乳清画分を供した後、カラムを７カラム容量（ｃｖ）の緩衝液Ａで洗浄した
。 ４．ヒト酸性αグルコシダーゼ画分をＱ ＦＦカラムから１００ｍＭの塩化ナト
リウムを含む３．５ｃｖの緩衝液Ａで溶出した。 ５．全ての強く結合したタンパク質を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐ
Ｈ７．０中に１Ｍの塩化ナトリウムを含む、約３ｃｖの１００％緩衝液Ｂで溶出
した。 Ｑ ＦＦクロマトグラフィー作業の代表的な溶出プロファイルを図１に示す。
この特定の作業で、Ｑ ＦＦカラムに供した乳清試料をＳ／Ｄ前処理した。Ｓ／
Ｄ前処理をせずにＱ ＦＦカラムに供した乳清画分で、本質的に同様の溶出プロ
ファイルを得た。１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａで溶出した組換え
ヒト酸性αグルコシダーゼ画分に、Ｔｗｅｅｎ−８０またはＴｎＢＰは検出され
得なかった。本質的に全てのＴｗｅｅｎ−８０およびＴｎＢＰは、（結合しない
）通過した画分に検出され得る。組換えヒト酸性αグルコシダーゼの回収率（工
程４）は、約８０〜８５％であった。約１５％のαグルコシダーゼ活性が、１０
０％緩衝液Ｂで溶出した画分に存在した。 （７．Ｑ ＦＦセファロースのヒト酸性αグルコシダーゼを含む画分の、フェ
ニルセファロースハイパフォーマンス（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）へ
の結合） １容量の１Ｍ硫酸アンモニウムを、主なヒト酸性αグルコシダーゼ画分（０．
１Ｍの塩化ナトリウム、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０で得た
、実施例６を参照のこと）を含むＱ ＦＦセファロースヒト酸性αグルコシダー
ゼ溶出物に、連続的に攪拌しながら加えた。フェニルＨＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
）カラムクロマトグラフィー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＸＫ−５０カラム、ベッド
の高さ１４ｃｍ、流速１５０ｃｍ／時）を、室温で以下のプロトコールを用いて
行った。 １．カラムを０．５Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液
、ｐＨ６．０（緩衝液Ｃ）で平衡化した。 ２．０．５Ｍの硫酸アンモニウムでインキュベートしたヒト酸性αグルコシダー
ゼ溶出物を供した。動的容量（ｄｙｎａｍｉｃ ｃａｐａｃｉｔｙ）は、フェニ
ルセファロースハイパフォーマンス１ｍｌあたり約１．２ｍｇのヒト酸性αグル
コシダーゼであった。 ３．試料を供した後、カラムを２ｃｖの緩衝液Ｃで洗浄した。 ４．ほとんどのヒト酸性αグルコシダーゼを、フェニルＨＰカラムから、４ｃｖ
の緩衝液Ｄ（５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）で溶出した。 ５．最も強く結合しているタンパク質を、最初は水で、そして次いで２０％エタ
ノールで溶出した。 フェニルセファロースＨＰクロマトグラフィー作業の代表的な溶出プロファイ
ルを図２に示す。 工程４におけるヒト酸性αグルコシダーゼ活性の回収率は、一般的に８５％よ
り大きかった。 （８．フェニルＨＰカラムからのヒト酸性αグルコシダーゼ画分の、Ｓｏｕｒ
ｃｅ Ｐｈｅｎｙｌ １５における結合および溶出） ２Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０を
、フェニルＨＰカラムからのヒト酸性αグルコシダーゼ溶出物に、最終的な濃度
が０．８５Ｍの硫酸アンモニウムに達するまで加えた。溶液を連続的におよびお
だやかに攪拌した。 Ｓｏｕｒｃｅ Ｐｈｅｎｙｌ １５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）クロマトグラフィ
ー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅｌｉｎｅ １００カラム、ベッドの高さ１５
ｃｍ、流速７６ｃｍ／時）を、以下のプロトコールを用いて行った。 １．カラムを０．８５Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝
液、ｐＨ７．０（緩衝液Ｅ）で平衡化した。 ２．フェニルＨＰからの硫酸アンモニウム希釈ヒト酸性αグルコシダーゼ溶出物
をカラムに供した。動的容量はＳｏｕｒｃｅ １５ Ｐｈｅｎｙｌ １ｍｌあた
り約２ｍｇの組換えヒト酸性αグルコシダーゼであった。 ３．試料を供した後、ヒト酸性αグルコシダーゼを、Ｓｏｕｒｃｅ １５ Ｐｈ
ｅｎｙｌカラムから、１０ｃｖの、１００％緩衝液Ｅから１００％緩衝液Ｆ（緩
衝液Ｆ：５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）への直線的勾配で溶
出した。いくつかの混入タンパク質はαグルコシダーゼのすぐ後に溶出するので
、溶出画分の注意深いプールが必要である（クーマシーブリリアントブルー染色
を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるカラム画分の純度プロファイルに基づく）。 ４．残りの結合しているタンパク質を、カラムから水および／または２０％エタ
ノールで溶出した。 Ｓｏｕｒｃｅ １５ Ｐｈｅｎｙｌクロマトグラフィー作業の代表的な溶出プ
ロファイルを図３に示す。 プールした画分におけるヒト酸性αグルコシダーゼ活性の回収率（工程４）は
、一般的に７０％より大きかった。 （９．最終的な濾過工程：限外濾過、ダイア濾過、滅菌濾過、およびナノ濾過
） Ｓｏｕｒｃｅ １５ Ｐｈｅｎｙｌカラムからプールしたヒト酸性αグルコシ
ダーゼ画分を、ＴＦＦ方式で、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＰｒｏｆｌｕｘ Ｍ１２シ
ステムにつなげた０．１ｍ2のＢｉｏｍａｘ ３０膜を通した限外濾過によって 濃縮した。７倍に濃縮した後、保持物を１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐ
Ｈ７．０でダイアフィルトレートした（約６ダイアフィルトレーション容量を使
用した）。最終的に、酸性αグルコシダーゼ画分を滅菌濾過した（０．２μｍの
デッドエンドフィルター）。これらの濾過工程後の、ヒト酸性αグルコシダーゼ
の回収率は８５％より大きかった。必要に応じて、ウイルス除去工程を組み込み
得る。Ｐｌａｎｏｖａ １５および３５のようなウイルス除去フィルター（ナノ
フィルター）が適している。 （１０．精製ヒト酸性αグルコシダーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨＰ−ＳＥ
Ｃ分析） 精製ヒト酸性αグルコシダーゼを銀染色ＳＤＳ／ＰＡＧＥおよびサイズ排除Ｈ
ＰＬＣ（ＨＰ−ＳＥＣ）によって分析した。図４は精製作業中に得られた種々の
乳画分の、クーマシーブリリアントブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（４〜１２
％、ＮｕＰａｇｅ）を示す。同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを銀染色によって視覚
化した。少数の小さいバンドが存在した。酸性αグルコシダーゼに対するポリク
ローナル抗体を用いたゲルのウェスタンブロッティングは、これらの小さいバン
ドのほとんどを、前駆体酸性αグルコシダーゼの２量体および処理された形であ
ると同定した。少なくとも２つの宿主に関連した不純物が、精製した組換えヒト
酸性αグルコシダーゼ調製物に存在した。ゲルの濃度測定走査によって定量した
これらの宿主関連不純物の量は、供した全タンパク質の約１％程度であった。精
製組換えヒト酸性αグルコシダーゼを、高速液体クロマトグラフィーシステムに
つなげたサイズ排除カラム（ＨＰ−ＳＥＣ）でも分析した。結果を図５に示す。
サイズ排除カラムは、タンパク質を本質的にその分子量に基づいて分離すること
ができる。従って、原則としてこのカラムは、１１０ｋＤａの前駆体αグルコシ
ダーゼと比較して異なった分子量のタンパク質不純物を視覚化および定量するこ
とができる。予期したように、主なタンパク質のピークは、組換えヒト酸性αグ
ルコシダーゼ前駆体であり、ピーク表面分析は、このピークは全ての視覚化され
たピークの、全表面積の９９％であることを示した。１１０ｋＤａのαグルコシ
ダーゼ単量体の分子量は、このカラムでは１２７ｋＤａであると見積もられた。
ほかの小さいピークがいくつか見られた。それらの溶出プロファイルに基づいて
、それらは約２４０ｋＤａ（１１０ｋＤａのαグルコシダーゼ２量体）、約６７
ｋＤａ（血清アルブミン）、および約２０ｋＤａ（未知）の分子量を有すると考
えられた。また、いくつかのタンパク質が大きい分子量の領域に存在した。 （１１．金属キレートおよびレクチンセファロースを用いたヒト酸性αグルコ
シダーゼの精製） 種々の金属キレートセファロースを、製造会社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の推奨
に従って調製した。放射性標識したヒト前駆体酸性αグルコシダーゼを、種々の
セファロースと共に一晩インキュベートした（詳細は実施例１を参照のこと）。
洗浄によって結合していない標識を除去した後、ビーズに結合した放射活性を液
体シンチレーションカウンターで測定した。結果を図６に示す。明らかに、Ｃｕ 2+ キレートセファロースは、放射性標識したヒト前駆体酸性αグルコシダーゼに
非常に良く結合している。従って、Ｆｅ2+、Ｆｅ3+、およびＺｎ2+セファロース
と対照的に、このリガンドは乳および他の供給源から酵素を精製するのに適当で
あり得る。 放射性標識したヒト前駆体酸性αグルコシダーゼはまた、コンカナバリンＡの
ようなレクチンセファロースにも良く結合する（予期したように）。しかし予期
せずレンチルセファロースにも良く結合する（図５）。従って、レンチルセファ
ロースも乳からの酸性αグルコシダーゼの精製に適当であるようである。 （１２．種々のＨＩＣ媒体を用いたヒト酸性αグルコシダーゼの精製） 精製した酸性αグルコシダーゼおよびウサギ乳画分を、フェニルセファロース
以外のＨＩＣ媒体と共にインキュベートした。図７に、セファロース（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ）および／またはＴｏｙｏｐｅａｒｌ（ＴｏｓｏＨａａｓ）ビーズに
結合したブチル、オクチル、エーテルリガンドを含むカラムを用いたクロマトグ
ラフィー実験の結果を示す。ＨＩＣの通常の条件下では、αグルコシダーゼは種
々の媒体により強くまたは弱く結合することが見出された。 （１３．ヒドロキシアパタイトを用いたヒト酸性αグルコシダーゼの精製−実
験１） ヒドロキシアパタイトを、組換えヒト酸性αグルコシダーゼを夾雑（乳清）タ
ンパク質から分離する能力に関して試した。ヒドロキシアパタイトは、リン酸カ
ルシウムの結晶形態である。タンパク質の結合は、タンパク質のカルボキシル基
およびアミノ基、ならびにヒドロキシアパタイト結晶格子のＣａ2+およびＰＯ4 3 - 基を通じて媒介される（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏ ｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｂ．Ｍ．Ｄｕｎｎ、Ｈ．
Ｌ．Ｐｌｏｅｇｈ、Ｄ．Ｗ．Ｓｐｅｉｃｈｅｒ、Ｐ．Ｔ．Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ編
、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．（１９９５）、補遺８．６．９−
８．６．１２）。静電気的な相互作用および特異的な効果が、中性および酸性タ
ンパク質のＣａ2+部位への結合に関与する。しかし、多くのタンパク質のヒドロ
キシアパタイトとの相互作用はｐＩのみでは説明できない。ＤＮＡもまた荷電し
たリン酸骨格のためにマトリックスに結合する（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｂ
．Ｍ．Ｄｕｎｎ、Ｈ．Ｌ．Ｐｌｏｅｇｈ、Ｄ．Ｗ．Ｓｐｅｉｃｈｅｒ、Ｐ．Ｔ．
Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．（１９９５
）、補遺８．６．９−８．６．１２）。 トランスジェニックおよび非トランスジェニックウサギ乳清を、セラミックヒ
ドロキシアパタイトＩ型（ＢｉｏＲａｄ）を含むカラムに、低塩濃度で供した。
供した後、結合したタンパク質を４００ｍＭのリン酸ナトリウム（ＮａＰｉ）、
ｐＨ６．８への濃度勾配で溶出した。図８に示すクロマトグラフィープロファイ
ルは、明らかに非トランスジェニック乳清に比べてトランスジェニック乳清で通
過するものが増加したことを示す。銀染色を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図９
）は、明らかにこの画分が、ＷＡＰタンパク質と共に組換えヒト酸性αグルコシ
ダーゼを含むことを示した。ほとんど全ての他の乳清タンパク質は、カラムに結
合した（図８のｘ軸は、図９のゲルにおけるレーンの上の画分番号に対応する画
分番号を示す）。酸性αグルコシダーゼ活性のアッセイは、ほとんどの活性は通
過画分に存在し、および５％より少ないものがカラムに結合したことを示した。 これらの結果は、予期せずに、異種タンパク質（組換えヒト）酸性αグルコシ
ダーゼはヒドロキシアパタイトに結合せず、一方ほとんど全ての他の乳清タンパ
ク質は結合することを明らかに示している。これはヒドロキシアパタイトカラム
を、精製方法の一工程として、Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｐｈｅに加えるかまたはその
代わりに、または両方のＨＩＣカラムの代わりにさえ、同様に使用し得ることを
意味する。もちろんヒドロキシアパタイトを、より複雑な全体の方法の仕上げ工
程に使用し得る。ヒドロキシアパタイトをまた、最初の工程（不純物の捕獲）と
して使用し得、続いて例えばＱセファロースクロマトグラフィーまたはゲル濾過
を行い得る。ヒドロキシアパタイトでは速い流速を得ることができ、カラムは清
掃（消毒）するのが容易であり、そしてヒトに注射した場合、少量のリン酸カル
シウムの潜在的な漏れは有害ではない（例えば骨はリン酸カルシウムを含む）。
供給業者はドラッグマスターファイル（ＤＭＦ）を提供し得る。 （１４．ヒドロキシアパタイトを用いたヒト酸性αグルコシダーゼの精製−実
験２） ２０ｍＭのＮａＰｉ緩衝液、ｐＨ７．０中で、約３％（ｗ／ｗ）の組換えヒト
酸性αグルコシダーゼを含む、ウサギ由来のトランスジェニック乳清を、接線流
濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）（ＴＦＦ）に
よって作成した。トランスジェニックウサギ乳清を、水またはリン酸ナトリウム
緩衝液のいずれかで希釈し、最終的なリン酸ナトリウム（ＮａＰｉ）（Ｎａ2Ｈ ＰＯ4／ＮａＨ2ＰＯ4）緩衝液の濃度が５、１０、２０、３０、４０、または５ ０ｍＭである、一連のトランスジェニック乳清試料を作成した。 供する試料の緩衝液の強さに対応するように、５、１０、２０、３０、４０、
または５０ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ６．０でカラムを平衡化した。１ｍｌの試料（
２．５ｍｇのタンパク質を含む）を個々に２．５ｍｌのセラミックヒドロキシア
パタイト（ｃＨＴ）１型（ＢｉｏＲａｄ）カラム（ベッドの高さ１５ｃｍ）に供
した。供した後、あらゆる結合していないタンパク質を除去するために、カラム
を５ｃｖの平衡化緩衝液で洗浄した。次いで結合したタンパク質を、問題の試料
のモル濃度から４００ｍＭまで、リン酸ナトリウムの濃度勾配で溶出した。１．
９ｍｌの画分をカラム溶出物から採取し、そして次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析ま
で４℃で保存した。 図１０から１５は、５、１０、２０、３０、４０、および５０ｍＭのＮａＰｉ
緩衝液、ｐＨ７．０の乳清試料それぞれの、ヒドロキシアパタイトクロマトグラ
フィーで得たクロマトグラフィックトレースを示す。図１２、１３、および１４
では（試料＝それぞれ３０、４０、および５０ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ７．０）、
トレースの左のピークは少なくとも一部の通過した物質を表し、そしてこれらの
図におけるピークエリアは、図１０および１５（試料＝それぞれ５および６０ｍ
ＭのＮａＰｉ、ｐＨ７．０）における対応するピークから見られるものよりも有
意に大きい。 画分の銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、５、１０、および２０ｍＭのリン酸ナ
トリウムでは、大部分のαグルコシダーゼは通過したものの中に見られ、一方実
質的に全ての乳清タンパク質はｃＨＴビーズに結合したことを示した。３０、４
０、および５０ｍＭのＮａＰｉでは、αグルコシダーゼの大部分は通過したもの
の中に留まるが、還流したものの中の、乳清タンパク質の量が増加した。 本実験は、５と２０ｍＭとの間のリン酸ナトリウム緩衝液試料濃度で、トラン
スジェニック乳清からのαグルコシダーゼに関して、許容できるタンパク質回収
率のよい精製が、どのように達成し得るかを示す。より少ない回収率のよりよい
精製が必要な場合、より低い試料緩衝液濃度を使用し得る。 （１５．ヒドロキシアパタイトを用いたヒト酸性αグルコシダーゼの精製−実
験３） 上記の実験２で述べたように、約３％（ｗ／ｗ）の組換えヒト酸性αグルコシ
ダーゼを含むトランスジェニックウサギ乳清を接線フローフィルトレーション（
ＴＦＦ）によって作成した。トランスジェニック乳清を水で希釈し、最終的なリ
ン酸ナトリウム（ＮａＰｉ）緩衝液の濃度をｐＨ７．２で５ｍＭにした。約２．
５ｍｇのタンパク質を含む、５００μｌの希釈乳清を、２．５ｍｌのセラミック
ヒドロキシアパタイト（ｃＨＴ）１型（ＢｉｏＲａｄ）カラム（ベッドの高さ１
５ｃｍ）に供した。それぞれのカラムを、ｐＨ６．０、６．５、７．０、または
７．５の５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化した（図１６から１９）。試料
を供した後、カラムを５ｃｖの平衡化緩衝液で洗浄した。結合したタンパク質を
流速７２３ｃｍ／時で、それぞれｐＨ６．０、６．５、７．０、または７．５の
４００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液への濃度勾配を用いて溶出した。１．０ｍｌ
の画分を、銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質の含有量に関して分
析した。 銀染色した画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの結果をみると、ｐＨ６．０では、α
グルコシダーゼは弱くｃＨＴに結合するのみ（すなわち、いくらかは通過した）
であり、一方実質的に全ての乳清タンパク質はｃＨＴにより強く結合したことを
見ることができる。ｐＨ６．５では、約９０％のαグルコシダーゼがカラムから
通過するものの中にあり、および低分子量（ＬＭＷ）タンパク質（おそらく乳清
酸性タンパク質（ＷＡＰ））もまたαグルコシダーゼとともに通過したものの中
にあったが、カラムでいくらか遅れた。ｐＨ７．０では、全てのαグルコシダー
ゼおよびほとんどのＬＭＷタンパク質（おそらくＷＡＰ）およびＨＭＷタンパク
質（おそらく免疫グロブリン）は通過したものの中にあった。約８０ｋＤのタン
パク質（おそらくトランスフェリン）も通過したものの中にあったが、カラムで
いくらか遅れた。 これらの結果に基づいて、ｐＨ６．５がαグルコシダーゼを乳清タンパク質か
ら分離するのに最適であるようである。 （１６．ＱセファロースＦＦおよびヒドロキシアパタイトを用いたヒト酸性α
グルコシダーゼの精製） 接線フローフィルトレーションによって生成したトランスジェニック乳清（組
換えヒト酸性αグルコシダーゼを含む）を、ＱセファロースＦＦ（カラム容量２
５リットル）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に、
２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ＮａＰｉ）、ｐＨ７．０緩衝液中で供することに
よって、パイロットプラント設備で処理した（図２０）。カラムを４ｃｖの５０
ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ７．０、および次いで２ｃｖの２０ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ
７．０で平衡化した。αグルコシダーゼを含む画分を、２．７ｃｖの０．１Ｍの
ＮａＣｌ、ｐＨ７．０で溶出した。４７．３リットルの試料を採取し、そしてこ
れは２６５ｇのタンパク質を含んでいた。０．１Ｍ画分の試料を１０ｍＭのリン
酸ナトリウム（ＮａＰｉ）、ｐＨ６．５緩衝液に対して透析した（３，５００ダ
ルトンの分子量カットオフ、Ｓｐｅｃｔｒａ Ｐｏｒ）。 ６０ｍｌの透析した０．１Ｍ試料（３．９１ｍｇ／ｍｌタンパク質、１．３３
ｍＳ／ｃｍ）を、３０ｍｌのｃＨＴ１型カラム（ＸＫ１６／１５）（ＢｉｏＲａ
ｄ）に、流速１５０ｃｍ／時（５ｍｌ／分）で供した（図２１）。試料を供した
後、カラムを５ｃｖの平衡化緩衝液（１０ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ６．５）で洗浄
した。１０ｍｌの画分を回収し、そしてαグルコシダーゼは通過したものに見ら
れ、一方大部分の乳清タンパク質はｃＨＴビーズに結合した。結合したタンパク
質を、１０から４００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液の直線的な濃度勾配で溶出
した。この工程は、αグルコシダーゼを含むＱセファロースＦＦ画分において、
不純物のレベルを９０％から、ｃＨＴカラムの通過画分における＜０．５％まで
減少させた。αグルコシダーゼの回収率は８０％より多かった。図２１はｃＨＴ
における試料の実施のクロマトグラムを示す。 図２２は、ｃＨＴカラムからの通過画分（レーン１−３、５−７、および９−
１１）、分子量スタンダード（レーン４）、およびｃＨＴカラムに供したＱＦＦ
溶出物の試料（レーン１２）を示す、銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。 前述の発明は明快さと理解の目的のために、いくらか詳細に記載されているが
、本開示を読むことから、形式および詳細における種々の変更が、本発明の本来
の範囲から逸脱することなくなされ得ることが、当該業者にとって明らかである
。本出願において引用された全ての出版物および特許書類は、個々の出版物また
は特許書類は、個々にそう示されるような同じ程度で、全ての目的のためにその
全体において参考文献として援用される。
る主題に関しており、そして全ての目的のためにその全体が参考として組み込ま
れる。 （技術分野） 本発明はタンパク質化学および薬品の技術的分野に属する。 （背景） 酸性αグルコシダーゼ（酸性マルターゼ）は、グリコーゲンからグルコースへ
のリソソーム分解において必須の機能を有する酵素である［Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ
，Ｅ．Ｌ．（１９７５）Ｐａｔｈｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３．７１−８４］。完全な
酵素の欠損に伴って、または機能する酵素が少量しか存在しない場合、病的な状
態が起こる。グリコーゲンのかなりの蓄積がリソソームに見られ、細胞の機能を
妨害する［Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓ
ｉｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｓｃｒｉｖｅｒ，Ｃ．Ｒ．
、Ｂｅａｕｄｅｔ，Ａ．Ｌ．、Ｓｌｙ，Ｗ．Ｓ．およびＶａｌｌｅ，Ｄ編（Ｍｃ
Ｇｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、第７版、２巻、２４４３−２４６４
頁において、Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ，Ｒ．（１９９５）によって概説されている
］。ヒト酸性αグルコシダーゼは、１９６３年に糖原病（ｇｌｙｃｏｇｅｎｅｓ
ｉｓ）ＩＩ型（ポンペ病）の主要な欠損として発見された［Ｈｅｒｓ，Ｈ．Ｇ．
（１９６３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．８６，１１−１６；Ｈｅｒｓ，Ｈ．Ｇ．およ
びＤｅ Ｂａｒｓｙ，Ｔｈ．（１９７３）Ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ Ｓｔｏ
ｒａｇｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ（Ｈｅｒｓ，Ｈ．Ｇ．およびＶａｎ Ｈｏｏｆ，Ｆ
．編）１９７−２１６頁］。 それまでは、糖原病ＩＩ型は、生後、最初の２年以内に死に至る、遺伝性、全
身性のグリコーゲン貯蔵疾患として知られていた。後にその疾患はよりゆるやか
な形で若年型、および後期発症または成人型で起こり得ることが認識された。そ
の主な臨床症状は骨格筋の虚弱、および心筋のミオパシーである［Ｈｏｗｅｌｌ
，Ｒ．Ｒ．およびＷｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ．Ｃ．（１９８３）Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂ
ｏｌｉｃ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ（Ｓｔａｎ
ｂｕｒｙら編）１４１−１６６頁、Ｍｃｇｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｂｏｏｋ Ｃｏ．
、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ］。いくつかの臨床的な表現型が観察され［Ｔｈｅ Ｍｅｔ
ａｂｏｌｉｃ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｅｓ ｏｆ ｉｎｈｅｒｉ
ｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ（Ｓｃｒｉｖｅｒら編）２４４３−２４６４頁において
、Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ，Ｒ．（１９９５）によって概説されている］、そして
いくつかはヒト酸性αグルコシダーゼ遺伝子において同定された変異と関連して
いる［Ｒｅｕｓｅｒら、Ｓｕｐｐｌ．３（１９９５）Ｍｕｓｃｌｅ ａｎｄ Ｎ
ｅｒｖｅ、Ｓ６１−Ｓ６９頁によって概説されている］。 ヒト酸性αグルコシダーゼは、細胞内で１１０ｋＤの前駆体の形で産生される
。７つの潜在的なＮ結合型糖鎖付加部位は、おそらく全て使用される（Ｈｅｒｍ
ａｎｓら、（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８９、６８１−６８６）。炭水
化物鎖は高マンノース型であると考えられる。ゴルジスタックでは、前駆体に結
合した特定のマンノース残基がリン酸化され、マンノース−６−Ｐを産する。こ
れらの残基は、タンパク質をリソソームへ標的化するマンノース−６−リン酸受
容体によって認識される（Ｖｏｎ ＦｉｇｕｒａおよびＨａｓｉｌｉｋ、（１９
８６）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５、１６７−１９３；Ｋｏｒｎｆｅ
ｌｄ，Ｓ．、（１９９２）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１、３０７−３
３０によって概説されている）。リソソーム内で、ＮおよびＣ末端処理が、９５
ｋＤのヒト酸性αグルコシダーゼ中間体を経て、最終的に成熟７０および７６ｋ
Ｄの酵素へ導く。成熟酵素はグリコーゲンからグルコースへの分解において活性
である（ＨａｓｉｌｉｋおよびＮｅｕｆｅｌｄ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１
９８０）２５５、４９３７−４９４６；ＨａｓｉｌｉｋおよびＮｅｕｆｅｌｄ、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５、４９４６−４９５０；Ｍａｒｔ
ｉｎｉｕｋら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．（１９８４）２３
１、４５４−４６０；Ｒｅｕｓｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８５）
２６０、８３３６−８３４１；Ｒｅｕｓｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．
（１９８７）７９、１６８９−１６９９）。 糖原病ＩＩ型では、より低い酵素活性（または酵素活性の欠如）は、ｍＲＮＡ
レベルが無いまたは一部分しか無い、ヒト酸性αグルコシダーゼ前駆体が合成さ
れない、または成熟酵素への処理が起こらないことのような、多くの因子に起因
し得る。また成熟酵素は生成され得るが、より低い活性しか無いか、または活性
が無い（Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｅ
ｓ ｏｆ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ（Ｓｃｒｉｖｅｒら編）２４４
３−２４６４頁において、Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ，Ｒ．（１９９５）によって概
説される；Ｒｅｕｓｅｒら、Ｍｕｓｃｌｅ＆Ｎｅｒｖｅ、Ｓｕｐｐｌ．３（１９
９５）Ｓ６１−Ｓ６９頁によって概説される）。 この発見および他のリソソーム蓄積症の発見から、ポンペ病患者に対する酵素
補充療法が可能性のある治療として試みられた。しかし、試験は成功しなかった
。治療の期間、および投与した酵素の量が限られていた。さらに、免疫反応を起
こすＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来の非ヒト酸性αグルコシダーゼ、
またはヒト胎盤由来の「低取り込み」（非リン酸化）酵素のいずれかが使用され
た［Ｂａｕｄｈｕｉｎら、（１９６４）Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．１３．１１３９
−１１５２；Ｌａｕｅｒら、（１９６８）Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ ４２、６７２
頁；Ｄｅ Ｂａｒｓｙら、（１９７３）Ｅｎｚｙｍｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ
Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ（Ｄｅｓｎｉｃｋ、Ｂｅｒｎｌｏｈｒ、Ｋｒ
ｉｖｉｔ編）Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、１８４
−１９０頁］。 遺伝子の単離［Ｈｏｅｆｓｌｏｏｔら（１９８８）ＥＭＢＯ Ｊ．７、１６９
７−１７０４；Ｈｏｅｆｓｌｏｏｔら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７２
、４９３−４９７；Ｍａｒｔｉｎｉｕｋら（１９９０）ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉ
ｏｌ．９、８５；Ｍａｒｉｎｉｕｋら（１９９１）ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ
．１０、２８３］から、組換えヒト酸性αグルコシダーゼの発現が報告された。
バキュロウイルス感染昆虫細胞で作成された組換えヒト酸性αグルコシダーゼは
、活性であったがポンペ病患者の繊維芽細胞に効果的に取り込まれなかった［Ｍ
ａｒｔｉｎｉｕｋら（１９９２）ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１、７０１−
７０６］。Ｆｕｌｌｅｒら［（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３４
、９０３−９０９］およびＶａｎ Ｈｏｖｅら［（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３、６５−７０］は、ｃＤＮＡをトランスフ
ェクトしたチャイニーズハムスター卵巣細胞の培養液中で、ヒト前駆体酸性αグ
ルコシダーゼの発現を報告した。 酸性αグルコシダーゼは種々の組織から精製された［Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌ
ｉｃ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｅｓ ｏｆ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ
ｄｉｓｅａｓｅ（Ｓｃｒｉｖｅｒら編）２４４３−２４６４頁のＨｉｒｓｃｈｈ
ｏｒｎ，Ｒ．（１９９５）の概説を参照のこと］。多くの報告された手順は酵素
の２つの性質に基づいている：すなわち（１）酵素はＮ型糖鎖結合（主に高マン
ノース）しているので、セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）のようなマトリッ
クスに結合したレクチンであるコンカナバリンＡを使用し得る。そして（２）酵
素は１，４αおよび１，６αグリコシド結合に親和性を有するので、ある条件下
の酵素はセファデックスのようなゲル濾過マトリックス（１，６結合を含む）で
遅れ、親和性型の精製をもたらす。種々の組織から酸性αグルコシダーゼを精製
する方法の多くの実施例を下記に与える。 Ｊｅｆｆｒｅｙら［（１９７０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．９、１４０３−１４１５］
は、ラット肝臓からの酵素の精製を報告している。ホモジナイゼーションおよび
遠心分離の後、リソソームを破壊し、そして高速遠心分離の後に得られた上清を
４２％硫酸アンモニウムで沈殿させた。このペレットを再懸濁、透析し、そして
セファデックスＧ−１００カラムにかけた。カラムからのαグルコシダーゼ画分
を、弱い陰イオン交換カラムにかけ、そして結合した酵素を２５０ｍＭのＫＣｌ
で溶出した。精製した酵素を凍結乾燥した。 Ｐａｌｍｅｒ［（１９７１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１２４、７０１−７１１］
は、ウサギ筋肉からの酸性αグルコシダーゼの精製を報告している。細かく切っ
たウサギ筋肉を洗浄して血液成分を除去し、ホモジナイズし、凍結／解凍し、遠
心分離し、そして沈殿物を再び抽出した。合わせた上清を酸性化し、再び遠心分
離し、そして上清を最初に３０％硫酸アンモニウムで沈殿させた。上清を再び今
度は６０％硫酸アンモニウムで沈殿させた。このペレットを低塩濃度緩衝液に溶
解し、そして透析した。凍結／乾燥後、酵素をさらに精製するためにセファデッ
クスＧ−１００カラムにかけた。 Ｓｃｈｒａｍら［（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ
５６７、３７０−３８３］は、ヒト肝臓からの酸性αグルコシダーゼの精製を報
告している。ホモジナイゼーションおよび高速遠心分離の後、上清をコンカナバ
リンＡカラムにかけた。結合した酵素を１Ｍのメチルグルコシドで溶出し、濃縮
し、透析し、そしてＳ−２００ゲル濾過カラムにかけ、精製酵素を得た。 Ｍａｒｔｉｎｉｕｋら［（１９８４）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．２３１、４５４］は、ヒト胎盤からの酸性αグルコシダーゼの精製を報告
している。ホモジナイゼーションおよび遠心分離の後、本質的にヘモグロビンを
除去するために上清をＣＭ−セファロースカラムにかけた。２７，０００ｇ（１
５分）での遠心分離の後、ホモジネートを８０％硫酸アンモニウムで沈殿させ、
遠心分離し、そして上清を透析し、再び遠心分離して、そしてセファデックスＧ
−１００カラムにかけ精製酵素を得た。 Ｒｅｕｓｅｒら［（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０、８３３６−
８３４１］は、ヒト胎盤からの酸性αグルコシダーゼの精製を報告している。ホ
モジナイゼーションおよび遠心分離の後、上清を濾過し、そしてコンカナバリン
Ａセファロースカラムにかけた。結合した酵素を１Ｍのメチルグルコシドで溶出
し、濃縮し、透析、そして再び限外濾過によって濃縮して、セファデックスＧ−
２００カラムにかけた。遅延（停滞）した酵素をカラムから回収し、そして凍結
保存した。 Ｌｉｎら［（１９９２）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １１、４９３］は、ヒト尿から
の酸性αグルコシダーゼの精製を報告している。尿を限外濾過、次にコンカナバ
リンＡカラムクロマトグラフィーによって濃縮した。溶出した酵素を８０％硫酸
アンモニウムで沈殿させた。このペレットをＰＢＳに再び溶解し、そしてセファ
デックスＧ−１００カラムにかけた。カラムから溶出した酵素を再び８０％硫酸
アンモニウムで沈殿させ、そして再び溶解したペレットをＤＥＡＥ陰イオンカラ
ムにかけた。結合した酵素を０．１ＭのＮａＣｌ緩衝液で溶出した。７０ｋＤの
酵素をＳＤＳ−ＰＡＧＥで視覚化した。 Ｆｕｌｌｅｒら［（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３４、９０３
−９０９］は、ｃＤＮＡをトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣細
胞の培養液からの、組換えヒト酸性αグルコシダーゼの精製を報告している。培
養液を低速遠心分離によって透明にした後、ｐＨを６．６に調節し、そして培養
液をコンカナバリンＡセファロースカラムにかけた。組換えヒト酸性αグルコシ
ダーゼを１Ｍのメチルグルコシド緩衝液で溶出し、そして限外濾過によって濃縮
する。濃縮物をセファデックスＧ−１００カラムにかけ、そして精製ヒト酸性α
グルコシダーゼを得るために低い流速で分画する。 Ｖａｎ Ｈｏｖｅら［（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ．９３、６５−７０］は、トランスフェクトしたＣＨＯ細胞の培養液中で
産生された組換えヒト酸性αグルコシダーゼの、同様の技術を用いた単離を報告
している。 Ｖａｎ Ｈｏｖｅら［（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎ
ｔ．４３、６１３−６２３］は、トランスフェクトしたＣＨＯ細胞の培養液中で
産生された組換えヒト酸性αグルコシダーゼの、以下の技術を用いた単離を報告
している：すなわち、適当な結合緩衝液を加えた後、培地をコンカナバリンＡカ
ラムにかけた。αグルコシダーゼを１Ｍのメチルグルコシド緩衝液で溶出した。
硫酸アンモニウムを加え、そしてサンプルをフェニルセファロースＨＰカラムに
かけた。カラムを洗浄し、そして混入しているタンパク質を、溶出緩衝液（２０
ｍＭの酢酸塩、ｐＨ５．３）の２５−４５％濃度勾配で溶出した。続いて、αグ
ルコシダーゼを溶出緩衝液の１００％までの濃度勾配で溶出した。酵素を含む画
分を限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ ｓｔｉｒｒｅｄ ｂａｒ ｃｅｌｌ、ＹＭ３０膜
）によって濃縮し、そして酵素をＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ
カラムにアプライした。酵素を２５ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭの酢酸塩緩衝液、
ｐＨ４．６で、２．５ｍｌ／ｍｉｎの低い流速でｉｓｏｃｒａｔｉｃａｌｌｙに
溶出した。酵素を含む溶液をプールし、ｓｔｉｒｒｅｄ ｂａｒ ｃｅｌｌにお
いて１０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのヒスチジン、ｐＨ５．５に対してダイアフ
ィルトレーションを行った。サンプルをソース（Ｓｏｕｒｃｅ）Ｑカラムにかけ
た後、このカラムを２％の溶出緩衝液（５００ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのヒス
チジン、ｐＨ５．５）で洗浄し、そして結合した酸性αグルコシダーゼを溶出緩
衝液の２４％濃度勾配で溶出した。 上記の方法のいくつかの特徴は、治療に使用するヒト酸性αグルコシダーゼの
大規模精製を達成するのに理想的ではない。コンカナバリンＡの使用は、ヒトリ
ンパ球に対して分裂促進的であり、そしてまたアレルギーの問題を引き起こすの
で不利である［Ｍｏｄｙら（１９９５）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏ
ｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３３、１−１０］。酸性αグルコシダーゼを含む画分をゲ
ル濾過カラム、すなわちセファデックスで処理することは、時間がかかりすぎ、
そして大規模な操作には厄介である。 （発明の要旨） よって、１つの局面では、本発明は以下の工程を含むヒト酸性αグルコシダー
ゼの精製方法を提供する。すなわち： （ａ）ヒト酸性αグルコシダーゼを含み、そしてタンパク質が混入しているサン
プルを、αグルコシダーゼがカラムに結合する条件下で、陰イオン交換またはア
フィニティーカラムにアプライする工程。 （ｂ）陰イオン交換またはアフィニティーカラムからαグルコシダーゼを豊富に
含む溶出物を回収すること。 （ｃ）溶出物を以下にアプライする工程： （ｉ）αグルコシダーゼがカラムに結合する条件下で疎水性相互作用カラムにア
プライし、次いでさらにαグルコシダーゼを豊富に含むさらなる溶出物を回収す
る工程、または （ｉｉ）αグルコシダーゼがヒドロキシアパタイトに結合しない条件下で溶出物
をヒドロキシアパタイトと接触させ、次いでαグルコシダーゼを豊富に含む結合
しない画分を回収する工程。 従って、本発明は、αグルコシダーゼを含むサンプルを２つのカラムにアプラ
イする工程を伴う、酸性ヒトαグルコシダーゼの精製方法を提供する。最初のカ
ラムは、陰イオン交換カラムまたはアフィニティーカラムのいずれかであり得る
。酸性αグルコシダーゼを結合条件下でカラムにアプライし、それはカラムに結
合してそして次いで溶出される。酸性αグルコシダーゼを豊富に含む溶出物を、
次いでαグルコシダーゼがカラムに結合する条件下で疎水性相互作用カラムにア
プライするか、またはαグルコシダーゼが結合しない条件下でヒドロキシアパタ
イトに接触させる。疎水性相互作用カラムから取った場合、さらなる溶出物はさ
らにαグルコシダーゼを豊富に含む。ヒドロキシアパタイト培養液から取った場
合、結合していない画分はαグルコシダーゼを豊富に含む。本方法は、例えばウ
シまたはウサギのような、トランスジェニック哺乳類の乳のような複雑な混合物
から、ヒト酸性αグルコシダーゼを精製するのに特に適している。 最初のカラムに好ましい物質はＱ−セファロースである。ヒトαグルコシダー
ゼはそのような材料に低塩濃度緩衝液中で結合し、そしてより高い塩濃度の溶出
緩衝液でカラムから溶出し得る。 あるいは、陰イオン交換カラムは銅キレートセファロース、フェニルホウ酸塩
（ｂｏｒｏｎａｔｅ）またはアミノフェニルホウ酸塩（ｂｏｒｏｎａｔｅ）であ
り得る。 別の好ましい方法では、（ａ）および（ｂ）のアフィニティーカラムはレンチ
ルセファロースである。 本発明の方法の工程（ｃ）に関して、疎水性相互作用カラムが使用される場合
、それは好ましくはフェニルセファロース、より好ましくはソースフェニル（Ｓ
ｏｕｒｃｅ Ｐｈｅｎｙｌ）１５である。溶出物を、約０．５Ｍまたはより高い
モル濃度の硫酸アンモニウムの添加液中で、疎水性相互作用カラムにアプライし
、そして低塩濃度の溶出緩衝液でカラムから溶出し得る。 必要に応じて、１つまたは両方のカラム工程を望ましいだけ反復し得る。精製
方法は通常少なくとも９５％、好ましくは９９％以上、より好ましくは９９．９
％ｗ／ｗ以上の純度を達成する。本方法はまた最初の容積が例えば少なくとも１
００リットルである大規模生成にも修正可能である。 特に好ましいプロセスは、トランスジェニック乳から得られた主に乳清を含む
画分を取る工程、これをバッチまたはカラム形式のいずれかでヒドロキシアパタ
イトと接触させる工程、ヒドロキシアパタイトからαグルコシダーゼを豊富に含
む結合していないサンプルを取り、次いでこれをＱセファロースクロマトグラフ
ィー工程、または上に規定した、または本明細書中で記載した工程にかけること
を含む。 本発明の２番目の局面は、以下を含む、トランスジェニック動物の乳から異種
由来のタンパク質を精製する方法を提供する。すなわち： ａ）トランスジェニック乳またはトランスジェニック乳画分を、異種タンパク質
以外の乳タンパク質種の少なくともかなりの部分がヒドロキシアパタイトに結合
し、そして異種タンパク質が本質的に結合しないままである条件下で、ヒドロキ
シアパタイトと接触させる工程、そして ｂ）ヒドロキシアパタイトから本質的に結合していない異種タンパク質を除去す
る工程。 従って、本発明は、トランスジェニック乳からの任意の異種タンパク質の精製
におけるヒドロキシアパタイトの使用も提供する。そこでは、乳タンパク質は本
質的にヒドロキシアパタイトに結合し得、そして異種タンパク質は本質的に結合
しない。この方法では、トランスジェニック乳の本質的に全ての他のタンパク質
から異種タンパク質を分離する、迅速な単一工程の手順が可能である。 トランスジェニック乳を、いずれの前処理も無しにヒドロキシアパタイトと直
接接触させ得る。しかし好ましくは、トランスジェニック乳は、例えば脱脂およ
び／またはカゼインの除去によって前処理される。 異種タンパク質は、好ましくは関心のある動物の乳に自然には見られないタン
パク質またはポリペプチドである。異種タンパク質は動物本来のタンパク質の自
然にはない変異体であり得、そして必ずしも乳タンパク質ではない。異種タンパ
ク質は、好ましくは問題の動物の乳には通常見られないが、異なった動物では見
られる。好ましくは、しかし、必ずしも他の動物の乳のみに見られるわけではな
い。 乳または乳サンプルのヒドロキシアパタイトとの接触は、十分な時間、および
緩衝液、ｐＨ、イオン強度、他の添加物、温度およびヒドロキシアパタイトの量
の適当な条件下で行われ、そのため異種タンパク質のかなりの部分が溶液中で遊
離したままであり、そしてヒドロキシアパタイトに結合しないままである。対照
的に、異種由来でない乳タンパク質のかなりの部分がヒドロキシアパタイトに結
合し、従って有利に分離を実施する。 ヒドロキシアパタイトに対する乳タンパク質の結合および所定の異種タンパク
質の不結合の、最も大きな差を確実にする最適な条件を決定することは、タンパ
ク質精製の分野における普通の技術の１つによって容易に実施され得ることであ
る。 本質的に結合していない異種タンパク質の除去は、好ましくは少なくともヒド
ロキシアパタイトの１部を通る液体の流れを含む。液体の流れは、ポンプ、吸引
、重力、および遠心分離の力から選択される１つ以上の力の結果として起こり得
る。本方法はバッチ手順として有利に実施され得る。 ヒドロキシアパタイトはカラムの形式で使用され得、従って、必要に応じて本
方法は液体カラムクロマトグラフィー手順として実施され得る。カラム手順では
、結合していない異種タンパク質画分は、カラムの添加手順の一部として、カラ
ムから通過したものの中で回収され得る。 使用されるヒドロキシアパタイトの量は、異種タンパク質の、ほかのトランス
ジェニック乳タンパク質からの分離を最適化するために、好ましくは乳または乳
サンプルの全タンパク質含有量に関連して調節される必要がある。これは当業者
にとって単なる日常的なことである。 異種タンパク質は、以下のいかなるものによっても例示され得る。すなわち、
ラクトフェリン、トランスフェリン、ラクトアルブミン、第ＶＩＩＩ因子および
第ＩＸ因子のような凝固因子、成長ホルモン、αアンチトリプシン、血清アルブ
ミン、Ｃ１−エステラーゼ阻害剤およびフィブリノーゲンのような血漿タンパク
質、コラーゲン、免疫グロブリン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、イン
ターフェロン、インターロイキン、ペプチドホルモン、ならびにαグルコシダー
ゼ、α−Ｌ-イズロニダーゼ、イズロン酸硫酸スルファターゼ、ヘキソサミニダ ーゼＡおよびＢ、ガングリオシドアクチベータータンパク質、アリルスルファタ
ーゼＡおよびＢ、イズロン酸スルファターゼ、ヘパランＮ−スルファターゼ、ガ
ラクトセラミダーゼ、αガラクトシルセラミダーゼＡ、スフィンゴミエリナーゼ
、αフコシダーゼ、αマンノシダーゼ、アスパルチルグルコサミンアミドヒドラ
−ゼ、酸性リパーゼ、Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミン−６−硫酸スルファ
ターゼ、αおよびβガラクトシダーゼ、βグルクロニダーゼ、βマンノシダーゼ
、セラミダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニ
ダーゼ、および保護タンパク質のようなリソソームタンパク質など。上記は対立
遺伝子、同起源および誘導変異体、ならびに同じもののポリペプチドフラグメン
トを含む。 異種タンパク質は、好ましくは動物の乳に通常見られないものである。 ３番目の局面では、本発明は、ヒト酸性αグルコシダーゼを含み、およびタン
パク質が混入しているサンプルを、αグルコシダーゼがヒドロキシアパタイトに
結合しない条件下でヒドロキシアパタイトに接触させる工程、次いでαグルコシ
ダーゼを豊富に含む結合していない画分を回収する工程を含む、ヒト酸性αグル
コシダーゼの精製方法を提供する。本方法は単純さのためにバッチ法として実施
され得、そして結合および結合していないαグルコシダーゼを、遠心分離を含む
沈降法でヒドロキシアパタイトから分離する。有利なことに、ヒドロキシアパタ
イトは一工程の精製手順を提供し得る。 しかし、ヒドロキシアパタイトはカラムの形式であり得、そしてその場合、結
合していない画分は、カラムの添加過程の一部としてカラムから通過したものの
中で回収され得る。 本発明の上記で述べた任意の局面によって、サンプルは、好ましくはαグルコ
シダーゼをその乳に発現するトランスジェニック哺乳類によって産生される乳で
ある。好ましいトランスジェニック乳は例えばウシまたはウサギのものである。 本発明の任意の方法は、乳から脂肪および／またはカゼインを除去するために
追加の工程をさらに含み得る。従って、本方法は乳を遠心分離する工程および脂
肪を除去して脱脂乳にする工程をさらに含み得る。本方法はまた、除去した脂肪
を水溶液で洗浄する工程、再遠心分離、脂肪を除去すること、および上清を脱脂
乳と共にプールする工程をさらに含み得る。さらなる工程は、脱脂乳からカゼイ
ンを除去することを含み得る。カゼインを除去する場合、本発明の方法は、好ま
しくは高速遠心分離に続く濾過、連続的に減少するフィルターのサイズを用いた
濾過、および直交流濾過（ｃｒｏｓｓ ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）から
なるグループから選択される工程を含む。 サンプルは、好ましくは少なくとも１００リットルの容積を有する。 ３番目の局面で、本発明は少なくとも９５％、好ましくは９９％、より好まし
くは９９．８％、さらにより好ましくは少なくとも９９．９％ｗ／ｗ純粋なヒト
酸性αグルコシダーゼを提供する。 本発明は本質的に他の生物学的物質を含まないヒト酸性αグルコシダーゼを提
供する。 本発明は本質的に混入物を含まないヒト酸性αグルコシダーゼを提供する。 本発明は上記で記載した本発明の任意の方法によって産生された、上記で規定
したヒト酸性αグルコシダーゼを提供する。 好ましくは、本発明のαグルコシダーゼは酵素的に活性であり、静脈内注射の
後、患者の肝臓、心臓、および／または筋肉細胞に有意なレベルで取り込まれる
形態である。内因性の酵素の欠損を有する患者において、酵素活性が統計上有意
に増加（ｐが０．０５以上）した場合、取り込みは有意である。 本発明はさらに、内因性のαグルコシダーゼ活性を欠損している患者を治療す
るための、医薬品組成物および方法を提供する。１回の静脈内投与に適した薬学
的組成物は、代表的には少なくとも０．５から２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは２か
ら１０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは５ｍｇ／ｋｇの、９５％、好ましくは９９％
、より好ましくは９９．８％、さらにより好ましくは９９．９％ｗ／ｗ純粋なヒ
ト酸性αグルコシダーゼを含む。治療の方法は、代表的には少なくとも０．５か
ら２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは２から１０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは５ｍｇ／
ｋｇの投与量の、９５％、好ましくは９９％、より好ましくは９９．８％、さら
により好ましくは９９．９％ｗ／ｗ純粋なヒト酸性αグルコシダーゼを患者に静
脈内投与することを伴い、それによってαグルコシダーゼは患者の肝臓および筋
肉細胞に取り込まれる。 従って、本発明は少なくとも５ｍｇ／ｋｇの、９５％、好ましくは９９％、よ
り好ましくは９９．８％、さらにより好ましくは９９．９％（ｗ／ｗ）純粋なヒ
ト酸性αグルコシダーゼを含む、単回静脈内投与のための薬学的組成物を提供す
る。 本発明は上記で規定されたヒト酸性αグルコシダーゼを含む医薬品組成物を提
供する。 本発明は医薬品として使用するための上記で規定されたヒト酸性αグルコシダ
ーゼを提供する。 本発明は、少なくとも５ｍｇ／ｋｇの投与量の、９５％、好ましくは９９％、
より好ましくは９９．８％、さらにより好ましくは９９．９％（ｗ／ｗ）純粋な
ヒト酸性αグルコシダーゼを患者に静脈内投与する工程を含む、内因性αグルコ
シダーゼを欠損している患者を治療する方法を提供し、それによってαグルコシ
ダーゼは患者の肝臓、心臓、および／または筋肉細胞に取り込まれる。 本発明は、ヒト酸性αグルコシダーゼ欠損症治療のための薬物を製造するため
に、本明細書中、上記で規定されたヒト酸性αグルコシダーゼの使用を提供する
。１２番目の局面で、本発明はヒト酸性αグルコシダーゼ欠損症治療のために静
脈内投与する薬物を製造するために、本明細書中、上記で規定されたヒト酸性α
グルコシダーゼの使用を提供する。 （定義） 「実質的に純粋」または「単離された」という用語は、その天然の環境の構成
要素から同定および分離ならびに／または回収されたヒト酸性αグルコシダーゼ
を意味する。通常、目的の種は、存在する優性な種であり（すなわち、モルの基
準でそれは構成要素中において、いかなる他の個々の種よりも、より大量である
）、そして好ましくは、実質的に精製された画分は、目的の種が存在する全ての
高分子種の少なくとも約５０％（モルの基準で）を占める組成物である。一般的
に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全ての高分子種の、重量の約
８０〜９０％より多くを占める。最も好ましくは、目的の種は９５％、９９％、
または９９．９％純粋にまでまたは本質的に均一になるまで精製される（夾雑物
種は慣習的な検出方法によって組成物中に検出され得ない）。ここで組成物は本
質的に単一の高分子種の誘導体からなる。 低塩緩衝液は、塩濃度が１００ｍＭより低い、および好ましくは５０ｍＭより
低い緩衝液を意味する。高塩緩衝液は、塩濃度が３００ｍＭより高い、および好
ましくは少なくとも５００ｍＭである緩衝液を意味する。 （詳細な説明） 本発明は、とりわけ異種タンパク質、好ましくはヒト酸性αグルコシダーゼを
トランスジェニック動物の乳汁から精製する方法を提供する。この方法は大規模
な産生に従い、そして治療的投与に適切な形態でαグルコシダーゼを含むタンパ
ク質を生じる。この方法は、ヒトタンパク質および特にヒト酸性αグルコシダー
ゼを、トランスジェニック動物によって産生された乳汁から単離するのに特に適
切である。１つの局面では、本発明は２つのクロマトグラフィー工程（１つは陰
イオン交換カラムまたはアフィニティークロマトグラフィー工程、もう１つは疎
水性相互作用カラムまたは、バッチもしくはカラムクロマトグラフィー形式でヒ
ドロキシルアパタイトを使用すること）を伴う方法を提供する。２つの異なった
分離は相乗的な様式で作用し、実質的に乳汁組成物に存在するタンパク質の混入
を排除する。例えば、陰イオン交換カラムは、ヒト酸性αグルコシダーゼを酸性
乳清タンパク質から分離するが、血清アルブミンおよびトランスフェリンから完
全には分離しない。疎水性相互作用カラムは、ヒト酸性αグルコシダーゼを血清
アルブミンおよびトランスフェリンから効果的に分離するが、酸性乳清タンパク
質からは分離しない。 代表的な精製手順は、上記のカラム精製の前および後にさらなる工程を含み得
る。例えば、ヒト酸性αグルコシダーゼを乳汁から精製する場合、脂肪およびカ
ゼインをカラムクロマトグラフィーの前に乳汁から除去する。その手順はまた、
存在し得るあらゆるウイルスを除去するためにさらなる工程を含み得る。次いで
αグルコシダーゼを、上記で述べた２つのカラム工程によって、乳清タンパク質
および他の乳汁タンパク質から分離する。これらのそれぞれまたは両方は、所望
の精製の程度が達成されるまで、１回より多く実施され得る。カラムクロマトグ
ラフィーの後、αグルコシダーゼを必要に応じて濃縮し、そして保存緩衝液に再
懸濁する。 別の局面において、本発明は、最適化された条件下でヒドロキシルアパタイト
を含む手順を提供する。ここで、異種タンパク質は、実質的にマトリックスに結
合できず、一方混入した乳汁タンパク質が、実質的に結合する。この方法は、目
的の異種タンパク質の所定の実質的な精製を完了する、迅速かつ再現性のある１
つの工程を提供する。 （Ｉ．αグルコシダーゼの供給源） 述べたように、この方法は、トランスジェニック動物の乳汁からヒト酸性αグ
ルコシダーゼを精製するために特に適している。トランスジェニック動物の乳汁
におけるαグルコシダーゼの産生は、ＷＯ９７／０５７７１（全ての目的のため
にその全体が参考として援用される）によって記載される。手短に言えば、α−
ｓ１−カゼインのような乳腺特異的遺伝子由来の調節性配列を、αグルコシダー
ゼをコードする配列に作動可能に連結する。次いで、導入遺伝子を胚に導入し、
それをトランスジェニック哺乳動物に成長させる。雌性トランスジェニック哺乳
動物は、それらの乳腺において導入遺伝子を発現し、そしてヒト酸性αグルコシ
ダーゼを乳汁中へ分泌する。マウスでは１リットルあたり４ｇまでのレベルを、
そしてウサギでは１リットルあたり７ｇまでのレベルを獲得し得る。 トランスジェニックウサギは、それらは速く繁殖するので短い期間で生産群が
確立され得、そしてそれらは、１リットルあたり約１５０ｇのタンパク質を含む
有意な量の乳汁（０．５リットル／週まで）を産生するので、特に目的のもので
ある。トランスジェニックウシ（ＤｅＢｏｅｒら、ＷＯ９１／０８２１６）もま
た、低いコストで、１リットルあたり約３５ｇのタンパク質を含む大量の乳汁（
約１０，０００リットル／年）を産生するので、目的のものである［Ｓｗａｉｓ
ｇｏｏｄ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｄａｉｒｙ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
−１、Ｆｏｘ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂ
ｌｉｓｈｅｒ、Ｌｏｎｄｏｎ（１９８２）１−５９頁］。ヤギ、ヒツジ、ブタ、
マウスおよびラットもまた、それらの乳汁にαグルコシダーゼを発現させるため
に適切な宿主である（例えば、Ｒｏｓｅｎ、ＥＰ２７９，５８２、Ｓｉｍｏｎら
、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６、１７９−１８３（１９８８）を参照のこ
と）。 ヒト酸性αグルコシダーゼの他の供給源は、細胞発現系（例えば、細菌、昆虫
、酵母、または哺乳動物）およびヒト組織（例えば、死体由来の肝臓）のような
天然の供給源を含む。 （ＩＩ．乳汁の脱脂） ウサギ乳汁の脱脂を、通常の技術（例えばＨｅｔｔｉｃｈ Ｒｏｔａｎｔａ
ＲＰ、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ−５Ｂ、または必要とされる脂肪除去の有効性を生
じるＥｌｅｃｒｅｍのような連続フロー遠心分離（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｆｌ
ｏｗ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）機を用いる低速遠心分離（約２０００ｇ
））を使用して実施し得る。乳汁を回収し、そして直接凍結し得るか、または最
初に脱脂し、次いで凍結し得る。必要に応じて、分離した脂肪を水または低塩緩
衝液で洗浄し、続いて洗浄したものを再遠心分離して精製されるべき産物の回収
率を改善し得る。また、脂肪除去のためにウシ酪農産業で使用される他の方法も
適用し得る（例えば濾過）。 （ＩＩＩ．乳汁からのカゼインの除去） カゼインは、種々の方法によって乳汁から除去され得る。いくつかの方法は、
酸処理または熱ショックのいずれかを使用する。例えば、１つの方法では、脱脂
乳をｐＨ４．７にして、約３０分間インキュベートし、続いて、例えば遠心分離
する。必要に応じて、温度ショックを、ｐＨ４．７に調節した後、例えば１０℃
から約３５℃までで適用し得、続いて再び遠心分離（低速：約２０００ｇで数分
間）する。この方法は、ヒト酸性αグルコシダーゼを含む乳汁からのカゼインの
分離において使用し得るが、これは、ヒト酸性αグルコシダーゼがｐＨおよび温
度処理の両方に感受性であるので、好ましくない。一般的に、ヒト酸性αグルコ
シダーゼ活性は、ｐＨが４．５より下に下がるかまたは温度が４０℃を超えて上
昇した場合、有意に減少する。 乳汁からカゼインを分離する他の方法は、高速遠心分離および／またはデッド
エンドフィルトレーション（ｄｅａｄ−ｅｎｄ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）および
／または接線流濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ
）を使用する。カゼインを除去するために、Ｐｏｗｅｒｆｕｇｅ（数百リットル
の脱脂乳）を用いて遠心分離を大規模に実施し得る。カゼイン除去の能率は１０
０％ではなく、むしろ８０〜９０％に近いので、遠心分離した乳清を続くクロマ
トグラフィーの前にさらに浄化する。デッドエンドフィルトレーション（すなわ
ち、孔の大きさが連続的に小さくなる膜を使用する）または直交流濾過（すなわ
ちＴＦＦ）を使用し得るかのいずれかにより浄化を行い得る。 接線流濾過は、一番良い結果を与える：酸性αグルコシダーゼが膜を高率で通
過し、清澄な乳清を得る（ダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｉｏ
ｎ）後、９０％を超える回収率で産物を獲得し得る）。接線流濾過（直交流濾過
としても知られる）は、膜を横切って再循環する流れのために、膜の詰まりがよ
り少ない特別な濾過の方法である。製薬的（工業的）プロセスにおける利点は、
これらの型の膜は、デッドエンドフィルターと対照的に、クリーニングの後再使
用し得ることである。続く精製のための酸性αグルコシダーゼの供給源として使
用されるのと同様に、ＴＦＦから得られた乳清を使用して、乳清を含む食品を産
生し得る。分離したカゼインもまた、食品の産生に使用され得る。 接線流濾過の様式で、いくつかの型の膜を試験した。種々の膜が適切であるこ
とが見出された（高率の酸性αグルコシダーゼ通過を伴う清澄な濾液を意味する
）：孔は、約０．０５〜０．３μｍ、好ましくは０．１〜０．２μｍの孔の大き
さで変化した。Ｂｉｏｍａｘ １０００ｋ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通すＰｏ
ｗｅｒｆｕｇｅ乳清画分の処理は、６０〜８０％のヒト酸性αグルコシダーゼ通
過を伴う清澄な乳清濾過物を生じた。いわゆるダイアフィルトレーションの様式
で、得られた（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）画分を緩衝液（例えば２０ｍＭのリン酸ナ
トリウム緩衝液、ｐＨ７．０）で洗浄した後、回収率が、９７％を超えるまで増
加され得る。 直交流濾過（ｃｒｏｓｓ−ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を使用して、予
め高速遠心分離する工程なしに乳汁からカゼインを分離し得る。６５〜３５％の
ヒト酸性αグルコシダーゼの通過によって清澄な乳清を得る。ダイアフィルトレ
ーションによって（容積を保つために緩衝液を加える）、回収率を、９０％を超
えるまで増加させ得る。ダイアフィルトレーションの後、濾液は濃縮しなければ
ならない。これは、例えばＢｉｏｍａｘ ３０ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）膜、ま
たは孔の大きさが小さいために酸性αグルコシダーゼが膜を通らない任意の他の
膜を使用する限外濾過を用いて容易に行い得る。 （ＩＶ．カラムクロマトグラフィー） 本発明に従う１つの好ましい方法は、２つのカラムクロマトグラフィー工程（
１つは陰イオン交換カラムまたはアフィニティーカラム、もう１つは疎水性相互
作用カラム）を使用する。この工程はいずれかの順序で実施され得る。工程のい
ずれかまたはいずれも、高い純度を得るために反復し得る。 陰イオン交換カラムは２つの構成要素（マトリックスおよびリガンド）を有す
る。マトリックスは、例えばセルロース、デキストラン、アガロースまたはポリ
スチレンであり得る。リガンドは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、ポリエ
チレンイミン（ＰＥＩ）または第４級アンモニウム官能基であり得る。陰イオン
交換カラムの強度は、リガンドのイオン化状態に関連している。第４級アンモニ
ウムリガンドを有する陰イオン交換カラムような、強い陰イオン交換カラムは、
広いｐＨの領域にわたる恒常的な陽性電荷を有する。ＤＥＡＥおよびＰＥＩのよ
うな弱い陰イオン交換カラムでは、陽性電荷の存在はカラムのｐＨに依存する。
Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、または金属キレートＳｅｐｈａｒｏｓｅ（例え
ばＣｕ2+キレートＳｅｐｈａｒｏｓｅ）のような強い陰イオン交換カラムが好ま
しい。陰イオン交換カラムは一般的に、αグルコシダーゼのｐＩより上のｐＨで
、低塩緩衝液を用いてロードされる。αグルコシダーゼの計算したｐＩは５．４
である（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータベース）。カラムを低塩緩衝液で数回洗浄
し、結合していないタンパク質を溶出する。次いで、結合したタンパク質を、塩
濃度を増加させた緩衝液を用いて溶出する。 Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦは、好ましい陰イオン交換カラムである。なぜ
なら、この物質は他の陰イオン交換カラムに比べて比較的安価であり、そして大
規模の精製に適切な比較的大きいビーズサイズを有するからである。特定の条件
下で、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦはヒト酸性αグルコシダーゼに結合し、そ
してαグルコシダーゼを最も強く結合する（乳汁）タンパク質から有効に分離す
る。これらの強く結合するタンパク質のいくつか（例えばウサギ乳清酸性タンパ
ク質（ＷＡＰ））は、続く疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程で
αグルコシダーゼと共に同時溶出される傾向があるので、これは重要である。ヒ
ト酸性αグルコシダーゼのＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦへの良好な結合を得る
ために、カラムを低塩（すなわち、５０ｍＭより低い、好ましくは３５ｍＭより
低い、リン酸ナトリウム緩衝液またはカリウム緩衝液あるいはトリスのような他
の適切な塩）で予め平衡化する。ヒト酸性αグルコシダーゼのカラムへの良好な
結合を得るために、緩衝液のｐＨは約７．０＋／−１．０であるべきである。よ
り高いｐＨは適切ではない。なぜなら、ヒト酸性αグルコシダーゼがある程度不
活化されるからである。より低いｐＨは、αグルコシダーゼの陰イオン交換物質
への結合を弱める。 次いで、ヒト酸性αグルコシダーゼを増加させた塩濃度で段階的に溶出するか
、または勾配溶出する。段階溶出は、より大規模な精製に従う。ロードしたヒト
酸性αグルコシダーゼの約８５％が、比較的高い純度で、Ｑ ＦＦカラムから一
工程で（約０．１Ｍの塩で）溶出され得る。αグルコシダーゼをウサギの乳汁か
ら精製する場合、主なタンパク質混入物は、トランスフェリンおよび血清アルブ
ミンのようなウサギ乳汁由来タンパク質である。ＷＡＰのような強く結合した乳
汁タンパク質は、より高い塩濃度（例えば１Ｍの塩）でＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
ＦＦから溶出される。 必要に応じて、陰イオン交換工程は、アフィニティークロマトグラフィー工程
と置換され得るが、それは好ましくない。適切なアフィニティー試薬は、レクチ
ンおよび抗体を含む。レクチンは、糖タンパク質に対して親和性を有する、植物
由来の炭水化物結合タンパク質である。代表的に、タンパク質を、約１ｍＭのＣ
ａ2+またはＭｇ2+を含む、約１５０ｍＭの塩および中性ｐＨの緩衝液でレクチン
カラムにロードする。糖タンパク質を、そのようなカラムから０．１〜０．５Ｍ
の濃度のスクロースのような単糖を含む緩衝液を用いて溶出し得る。レクチンア
フィニティーカラムの例は、レンチルＳｅｐｈａｒｏｓｅ（コンカナバリンＡに
比べて毒性が低いと報告されている）のようなＳｅｐｈａｒｏｓｅ（または他の
マトリックス）と結合したレクチンを含む。また、（アミノ）フェニルボロネー
ト（ｂｏｒｏｎａｔｅ）のような、隣接するジオールを認識するリガンドを使用
し得る。ヒト酸性αグルコシダーゼに対するモノクローナル抗体またはポリクロ
ーナル抗体もまた、アフィニティー試薬として使用され得る。抗体を代表的には
臭化シアン活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合させる。非特異的に結合したまたは
弱く結合したタンパク質を、そのようなカラムから、中程度の高塩濃度（すなわ
ち、約０．５Ｍより高い）の中性緩衝液を用いて溶出し得る。特異的に結合した
αグルコシダーゼを、低いｐＨの緩衝液（例えば５０ｍＭのクエン酸、ｐＨ３．
０）を用いて溶出する。溶出に続いて、αグルコシダーゼを中性化するべきであ
る。抗体は比較的高価な試薬であり、および精製の最終的な目的が治療的使用の
ためのタンパク質を産生することである場合、生物製剤としてＦＤＡの再審査を
受けるので、抗体に基づくアフィニティー精製は、陰イオン交換に比べて好まし
くない。 ヒト酸性αグルコシダーゼを単離するために使用される第二のカラムは、疎水
性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムである。ＨＩＣカラムは、２つ
の構成要素（マトリックスおよびリガンド）を有する。適切なマトリックスはＳ
ｅｐｈａｒｏｓｅおよびポリスチレンを含む。適切なリガンドはフェニル基、ブ
チル基、オクチル基、およびエーテル基を含む。Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅTMまたは（Ｓｏｕｒｃｅ Ｐｈｅｎｙｌ １５（フェニル基がポリスチレン
カラムに結合した））が特に適切である。ＨＩＣクロマトグラフィーのためのロ
ーディング緩衝液は、疎水性相互作用に有利である高濃度の塩を含む。適切な陰
イオンは、リン酸塩、硫酸塩、および酢酸塩である。適切な陽イオンは、アンモ
ニウム、ルビジウム、およびカリウムである。例えば、約０．５＋／−０．２Ｍ
の硫酸アンモニウム溶液（ｐＨ６）が適切である。これらの条件下で、ほとんど
の他のタンパク質が結合しないのに対して、ヒト酸性αグルコシダーゼはカラム
に結合する。次いで、αグルコシダーゼを低塩溶出緩衝液で溶出し得る。例えば
、２５〜１００ｍＭ（好ましくは５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液）、ｐＨ約
６．０（＋／−１．０）の緩衝液が適切である。 ヒト酸性αグルコシダーゼおよび他の乳汁タンパク質の溶出の相対的な順序は
、カラムの性質に依存する。例えば、フェニルＳｅｐｈａｒｏｓｅカラムでは、
αグルコシダーゼが血清アルブミンよりよく結合する。（Ｓｏｕｒｃｅ Ｐｈｅ
ｎｙｌ １５）カラムでは、この場合と逆である。トランスフェリンはＳｏｕｒ
ｃｅ Ｐｈｅｎｙｌ １５カラムおよびフェニルＳｅｐｈａｒｏｓｅカラムによ
り弱く結合する。トランスフェリンの結合を、（例えば０．５Ｍの硫酸アンモニ
ウム）で阻害し得る。 （Ｖ．ウイルスの除去） ウイルスの除去のために、溶媒／界面活性剤工程を、手順のあらゆる位置に（
通常、乳汁から脂肪およびカゼインを除去した後に）組み込み得る。１％のＴｗ
ｅｅｎ−８０と組み合せた０．３％のトリ−ｎ−ブチルホスフェート（ＴｎＢＰ
）のような、溶媒および界面活性剤の特定の組み合せは、エンベロープ化（ｅｎ
ｖｅｌｏｐｅｄ）ウイルスを除去するのに非常に有効である（Ｈｏｒｏｗｉｔｚ
ら（１９８５）Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２５、５１６−５２２頁）。直交流濾
過の後に得られた乳清画分を、０．３％のＴｎＢＰおよび１％のＴｗｅｅｎ−８
０と共に２５℃で６時間インキュベートした。このインキュベーションの後、乳
清をＱ ＦＦクロマトグラフィーカラムで直接ロードした。カラムを結合緩衝液
で洗浄し、そして結合した酸性αグルコシダーゼを塩緩衝液（実施例を参照のこ
と）で溶出した後、ほとんどの溶媒および界面活性剤が、本発明者らの産物のα
グルコシダーゼから除去された。残りの非エンベロープ化ウイルス（小さいパル
ボウイルスのような）の除去を確実にするために、特別にナノ濾過（ｎａｎｏｆ
ｉｌｔｒａｉｏｎ）工程を、このプロセスの最後の工程の１つに組み込み得る。
これらのフィルターは、現在では十分に定義されている（例えばＰｌａｎｏｖａ
１５または３５）。 （ＶＩ．再懸濁、保存、および濃縮） クロマトグラフィーカラムから回収した後、ヒト酸性αグルコシダーゼを必要
に応じて濃縮および、保存または使用に適切な緩衝液に再懸濁する。必要に応じ
て、ヒト酸性αグルコシダーゼを保存目的のために凍結乾燥し得る。 （精製されたヒト酸性αグルコシダーゼの使用） 本発明に従い産生された、精製されたヒト酸性αグルコシダーゼは、酵素置換
治療手順における使用を見出す。酵素の不足を引き起こす遺伝的または他の欠損
を有する患者を、患者に外来性の酵素を投与することによって処置し得る。その
ような処置を必要とする患者は症状から同定され得る（例えば、心臓肥大、肝脾
腫大、リソソームの数およびそのマーカーの増加、関節の硬化）。あるいは、ま
たはそれに加えて、患者を、αグルコシダーゼによって処理される代謝物の過剰
な蓄積を明らかにするために、組織サンプルの生化学的な分析によって、または
酸性αグルコシダーゼの欠損を明らかにするために、人工もしくは天然の物質を
用いた酵素アッセイによって診断し得る。特定の酵素の欠損を測定することによ
って、またはＤＮＡ分析によって、症状の発生または代謝物の過剰な蓄積の前に
診断し得る（Ｓｃｒｉｖｅｒら、前出、リソソーム貯蔵障害の章）。αグルコシ
ダーゼ貯蔵疾患は、遺伝性である。従って、αグルコシダーゼによって罹患した
メンバーを有することが知られている家族の子孫においては、しばしば最終的な
診断がなされ得る前でさえ予防的な処置を始めることが賢明である。 いくつかの方法では、ヒト酸性αグルコシダーゼは、精製された形態で薬学的
キャリアと共に、薬学的組成物として投与される。好ましい形態は、意図する投
与および治療的適用の様式に依存する。薬学的キャリアは、患者にポリペプチド
を送達するために適切な、任意の適合性の非毒性の物質であり得る。滅菌水、ア
ルコール、脂肪、ワックス、および不活性な固体をキャリアとして使用し得る。
薬学的に受容可能なアジュバント、緩衝剤、分散剤などもまた、薬学的組成物中
に組み込まれ得る。 薬学的組成物中の酵素の濃度は、広範に異なり得る（すなわち、重量で約０．
１％より少ないものから、通常は少なくとも重量で約１％、重量で２０％以上ま
で）。 経口投与では、活性成分は、カプセル、錠剤、および粉末のような固体投薬形
態で、またはエリキシル、シロップ、および懸濁液のような液体投薬形態で投与
され得る。活性成分をゼラチンカプセルに、不活性成分および粉末キャリア（例
えば、グルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、デンプン、セルロ
ースまたはセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッ
カリンナトリウム、タルカム、炭酸マグネシウムなど）とともにカプセル化し得
る。望ましい色、味、安定性、緩衝化能、分散または他の公知の所望の特徴を提
供するために添加され得るさらなる不活性成分の例は、赤色酸化鉄、シリカゲル
、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタン、食用白色インクなどである。同様の
賦形剤を使用して、圧縮した錠剤を作製し得る。錠剤およびカプセルの両方は、
数時間の間にわたって薬剤の持続的な放出を提供するために、徐放性産物として
産生され得る。圧縮錠剤は、あらゆる不快な味をマスクし、そして錠剤を環境か
ら保護するために、糖衣またはフィルムコートされ得るか、または胃腸管内での
選択的な分解のために腸溶性コートされ得る。経口投与のための液体投薬形態は
、患者の受容を増すために着色および味付けを含み得る。 静脈内注入のための代表的な組成物を、必要に応じて２０％アルブミン溶液を
補充した、１００〜５００ｍｌの滅菌０．９％ＮａＣｌまたは５％グルコースお
よび１００〜５００ｍｇの酵素を含むように作成し得る。筋肉内注射のための代
表的な薬学的組成物を、例えば１ｍｌの滅菌緩衝化水および１〜１０ｍｇの本発
明の精製酵素を含むように作成する。非経口的に投与可能な組成物を調製する方
法は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ（第１５版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、
１９８０）（全ての目的のためにその全体が参考として援用される）を含む、種
々の情報源でより詳細に記載されている。 本発明の薬学的組成物は、通常静脈内投与される。皮内、筋肉内、または経口
投与もまた、ある状況では可能である。組成物は、リソソーム酵素欠乏性疾患に
罹患しているか、またはそのおそれのある個体を予防的に処置するために投与さ
れ得る。治療的な適用では、薬学的組成物は、確立した疾患に罹患した患者に、
蓄積した代謝物の濃度を減少する、および／または代謝物のさらなる蓄積を阻害
または阻止するのに十分な量を投与される。リソソーム酵素欠乏性疾患のおそれ
のある個体では、薬学的組成物は代謝物の蓄積を防止または阻害のいずれかをす
るのに十分な量で予防的に投与される。これを達成するのに適切な量は、「治療
的に有効な用量」または「予防的に有効な用量」として定義される。そのような
有効な投薬量は、状態の重症度、および患者の健康の一般的状態に依存するが、
一般的に体重１ｋｇあたり約０．１〜１０ｍｇの精製酵素の範囲である。 トランスジェニック動物の乳汁で産生されたヒト酸性αグルコシダーゼは、多
くの他の利用法を有する。例えば、αグルコシダーゼは、他のαアミラーゼと共
通して、デンプン、ビール、および医薬品の産生に重要な手段である。Ｖｉｈｉ
ｎｅｎおよびＭａｎｔｓａｌａ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．２４、３２９−４０１（１９８９）を参照のこと（全ての目的のため
にその全体が参考として援用される）。ヒト酸性αグルコシダーゼはまた、実験
用化学薬品または食品を産生するのに有用である。例えば、酸性αグルコシダー
ゼは１，４および１，６α−グリコシド結合を分解し、そしてこれらの結合を含
む種々の炭水化物（例えば、マルトース、イソマルトース、デンプンおよびグリ
コーゲン）を分解してグルコースを産生するのに使用され得る。酸性αグルコシ
ダーゼはまた、腸のマルターゼまたはイソマルターゼ欠損を有する患者に投与す
るのに有用である。そうでなければ消化されないマルトースの存在によって引き
起こされる症状が避けられる。そのような適用では、酵素は予め乳汁から分別す
ることなく、そのような乳汁に由来する食品として（例えばアイスクリームまた
はチーズ）、または薬学的組成物として投与され得る。精製された組換えリソソ
ーム酵素はまた、組織サンプルにおける未知量のそのような酵素をアッセイする
ための診断キットに、コントロールとして含むのに有用である。 （実施例） （１．材料および方法） （酸性αグルコシダーゼアッセイ） ９６ウェルマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ）を氷上に置き、そして２０
μｌの４−ＭＵ基質（４−メチルウンベリフェリル−ａ−Ｄ−グルコピラノシド
、Ｍｅｌｌｆｏｒｄ Ｌａｂｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、０．２Ｍの酢酸ナトリウム緩衝
液、ｐＨ４．３中で２．２ｍＭ）をウェルに加えた。試験すべき試料（１０μｌ
、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）＋０．５％のＢＳＡ（ｗ／ｖ、Ｓｉｇｍａ
ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ）で希釈）を加え、そして３７℃で３０分間インキュベ
ートした。反応を２００μｌの０．５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．５）
で停止させた。マイクロタイタープレートを蛍光計でアッセイした（励起波長＝
３６０ｎｍ、発光波長＝４６０ｎｍ）。スタンダードとして、組換えヒト成熟酸
性αグルコシダーゼをそれぞれのアッセイでインキュベートした。 （酸性αグルコシダーゼの放射性ヨウ素化） トランスジェニックウサギ乳（系統６０）から精製した組換えヒト前駆体酸性
αグルコシダーゼを、クロラミンＴ法で放射性ヨウ素化した。標識化は本質的に
以下のように行った。すなわち、０．２ｍｌの前駆体（約０．１ｍｇ）に１０μ
ｌのＮａ125Ｉ（約１ｍＣｉ）を加えた。クロラミンＴ（５０μｌ、ＰＢＳ中で ０．４ｍｇ／ｍｌ）を加え、そして６０秒間インキュベートした。次いで、５０
μｌのＮａ2Ｓ2Ｏ5（ＰＢＳ中で１ｍｇ／ｍｌ）およびＰＢＳ中１００μｌの０ ．２ｍｇ／ｍｌ ＮａＩ溶液を加えた。ＰＢＳ、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０、
１ＭのＮａＣｌ、０．０５％のアジ化ナトリウムで平衡化したＰＤ １０ゲル濾
過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で、遊離の125Ｉを分離した。標識化したタン パク質をプールし、そして−８０℃で保存した。 （金属キレート化セファロースおよびレクチンセファロースを用いたラジオア
ッセイ） 放射性ヨウ素化された前駆体酸性αグルコシダーゼの、金属キレート化セファ
ロースへの結合を測定し、特定の金属が（放射性標識）酵素と相互作用するか否
かを決定した。レクチンセファロースへの結合もまた決定した。 キレート化セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を製造会社の推奨によって種
々の塩とインキュベートした。本質的に、セファロースを以下のように調製した
。すなわち、３．５ｍｌの包装セファロースビーズを５００ｍｌの水に希釈し、
遠心分離し（３５００ｒｐｍ、１０分）、そして上清を除去した後、ビーズを５
０ｍｌのＣｕＣｌ2（２５７ｍｇ）、ＺｎＣｌ2（２１５ｍｇ）、硫酸鉄（ＩＩＩ
）（４００ｍｇ）、または硫酸鉄（ＩＩ）（４１７ｍｇ）のいずれかに再懸濁し
た。一晩インキュベート（回転）した後、ビーズを水で３回洗浄し、そして次い
でＰＢＳ、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０、１ＭのＮａＣｌで洗浄し、そして５０
ｍｌの水中、４℃で保存した。結合実験のために、０．５ｍｌのセファロースビ
ーズを、ＰＢＳ、０．０２％のＴｗｅｅｎ−２０、またはＰＢＳ、０．１％のＴ
ｗｅｅｎ−２０、０．５ＭのＮａＣｌで５回洗浄した。放射性標識した前駆体酵
素（ＰＢＳ、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０中５０μｌ、約５０，０００ｃｐｍ）
を、０．５ｍｌのビーズ懸濁液に加え、そして室温で一晩インキュベート（回転
）した。セファロースビーズをＰＢＳ、０．０２％のＴｗｅｅｎ−２０で４回洗
浄し、そして結合した標識の量を液体シンチレーションカウンターで計測した。 （２．トランスジェニック乳の脱脂（ｓｋｉｍｍｉｎｇ（ｄｅｆａｔｔｉｎｇ
））） Ａ．乳を２５℃の水浴中で振とうしながら解凍した。次いで標的タンパク質の
回収率を最大限にするために乳を水で２倍に希釈し、そして遠心分離用ボトルま
たはチューブに入れた。 ２８００×ｇ、１５〜３０分間、４℃で遠心分離することによって、乳を脱脂
した。脂肪を、スプーンを用いてまたは吸引によって除去した。また、全（脱脂
していない）乳を同じ条件下で遠心分離した。得た脂肪画分を、（１）水で洗浄
し、そして再遠心分離、または（２）別のバッチを低塩濃度緩衝液で洗浄し、そ
して再遠心分離した。脱脂乳および洗浄画分（再遠心分離の後）をさらなる処理
のためにプールした。 Ｂ．乳を２５℃の水浴中で振とうしながら解凍し、次いで乳を連続的な遠心分
離を用いるＥｌｅｃｒｅｍ遠心分離に入れた。プールした脱脂乳中のヒト酸性α
グルコシダーゼの回収率を最大限にするために、脂肪画分を回収し、水で希釈し
、そして再遠心分離した。９０％より大きい回収率が得られ得る。 （３．遠心分離およびデッドエンドフィルトレーション（ｄｅａｄ−ｅｎｄ
ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を用いた、脱脂トランスジェニック乳からの乳清画分の
調製） Ｐｏｗｅｒｆｕｇｅ（Ｃａｒｒ）における２０，０００×ｇ、３０−４５分間
、５−２０℃での連続的な遠心分離によって、（希釈）脱脂ウサギ乳からカゼイ
ンを除去した。生じた乳清画分をデッドエンドフィルトレーション（ｄｅａｄ−
ｅｎｄ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によってクロマトグラフィーに適当なようにし
た。 デッドエンドフィルトレーション（ｄｅａｄ−ｅｎｄ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ
）：まずＣＰ１５またはＡＰ１５プレフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用
し、続いて１．２μｍＲＡ、０．８μｍＡＡ、０．６５μｍＤＡおよび０．４５
μｍＨＡ膜フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、直径４７ｍｍのディスクフィルタ
ー）を通して、緩慢な圧力下で濾過した。フィルターの目詰まりが起きたら、新
しいフィルターを使用した。０．４５μｍの膜濾過後に得られた濾液がクロマト
グラフィーに適当であった。Ｃａｒｒ Ｐｏｗｅｒｆｕｇｅによる遠心分離の後
、標的タンパク質の回収率は一般的に約６０〜８０％であった。デッドエンドフ
ィルトレーションはヒト酸性αグルコシダーゼ活性の最低限の損失、一般的には
３％より小さい損失を引き起こした。 （４．ＴＦＦを用いた脱脂トランスジェニック乳からの乳清画分の調製） 約４．５リットルの希釈脱脂ウサギ乳からＴＦＦによって乳清を調製した。Ｂ
ｉｏｍａｘ１０００（０．５ｍ2）膜カセットを、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＰｒｏ ｆｌｕｘ ＭＡにつなげたカセットホルダーに配置した。カゼインミセルの非常
によい保持（濾液が非常に透明であることを意味する）および約３０〜６０％の
ヒト酸性αグルコシダーゼの通過を与えるので、この膜を選択した。処理条件は
以下であった。 Ｐ−入口＝１．０バール、Ｐ−出口＝０．７バール、Ｐ−濾過＝０．７バール、
膜透過圧（ＴｒａｎｓＭｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ）（ＴＭＰ）＝０．
１５バール、流量＝約１５Ｌ／時／ｍ2、処理温度＝１０〜３５℃、好ましくは 約２０℃（室温）。濾過におけるヒト酸性αグルコシダーゼの回収率を改善する
ために、保持物を低塩濃度緩衝液、例えばｐＨ７．０の２０ｍＭのリン酸ナトリ
ウム緩衝液に希釈した。約６ダイアフィルトレーション容量の後、濾過における
ヒト酸性αグルコシダーゼ活性の回収率は８０％より大きかった。ダイアフィル
トレーションにより、乳清画分（濾液）の容量は劇的に増加した。同じＴＦＦ装
置で、Ｂｉｏｍａｘ ３０膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、０．５ｍ2）を用いた限外 濾過によって、濾液を約７倍に濃縮した。この型の膜は、αグルコシダーゼを通
さない。この工程において５０Ｌ／時／ｍ2の流量を容易に得ることができる。 ＴＭＰは１．０バールであった。濾液に活性は検出されず、全ての活性は保持物
画分に回収された。浸透したものが多くの塩化ナトリウムを含む場合、２０ｍＭ
のリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０でダイアフィルトレーションを行い、塩
化ナトリウムの濃度を５ｍＭより下に減少させた。 （５．溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）によるウイルスの不活化） 乳清画分のウイルス不活化（少なくともエンベロープに包まれたウイルス）を
、乳清を１％のＴｗｅｅｎ−８０および０．３％のトリ−ｎ−ブチルホスフェー
ト（ＴｎＢＰ）の存在下で、連続的にかつ穏かに攪拌しながら、４〜８時間（好
ましくは６時間）、２５℃でインキュベートすることによって行った。αグルコ
シダーゼ活性の有意な損失は見られなかった（＜１０％）。 （６．濾過した乳清または乳清画分に存在するヒト酸性αグルコシダーゼの、
Ｑセファロースファストフローへの結合） Ｑセファロースファストフロー（ＱＦＦ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）クロマトグラ
フィー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＸＫ−５０カラム、ベッドの高さ１５ｃｍ、流速
２５０ｃｍ／ｈｒ、全てのカラムクロマトグラフィーはＰｈａｒｍａｃｉａのＡ
ＫＴＡシステムによって制御し、タンパク質をオンラインで２８０ｎｍでの吸光
を測定することによって検出した）を、以下のプロトコールを用いて行った。 １．カラムを２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０（緩衝液Ａ）で平
衡化した。 ２．Ｓ／Ｄインキュベートした乳清画分（約５００から６００ｍｌ）を供した。 ３．乳清画分を供した後、カラムを７カラム容量（ｃｖ）の緩衝液Ａで洗浄した
。 ４．ヒト酸性αグルコシダーゼ画分をＱ ＦＦカラムから１００ｍＭの塩化ナト
リウムを含む３．５ｃｖの緩衝液Ａで溶出した。 ５．全ての強く結合したタンパク質を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐ
Ｈ７．０中に１Ｍの塩化ナトリウムを含む、約３ｃｖの１００％緩衝液Ｂで溶出
した。 Ｑ ＦＦクロマトグラフィー作業の代表的な溶出プロファイルを図１に示す。
この特定の作業で、Ｑ ＦＦカラムに供した乳清試料をＳ／Ｄ前処理した。Ｓ／
Ｄ前処理をせずにＱ ＦＦカラムに供した乳清画分で、本質的に同様の溶出プロ
ファイルを得た。１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａで溶出した組換え
ヒト酸性αグルコシダーゼ画分に、Ｔｗｅｅｎ−８０またはＴｎＢＰは検出され
得なかった。本質的に全てのＴｗｅｅｎ−８０およびＴｎＢＰは、（結合しない
）通過した画分に検出され得る。組換えヒト酸性αグルコシダーゼの回収率（工
程４）は、約８０〜８５％であった。約１５％のαグルコシダーゼ活性が、１０
０％緩衝液Ｂで溶出した画分に存在した。 （７．Ｑ ＦＦセファロースのヒト酸性αグルコシダーゼを含む画分の、フェ
ニルセファロースハイパフォーマンス（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）へ
の結合） １容量の１Ｍ硫酸アンモニウムを、主なヒト酸性αグルコシダーゼ画分（０．
１Ｍの塩化ナトリウム、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０で得た
、実施例６を参照のこと）を含むＱ ＦＦセファロースヒト酸性αグルコシダー
ゼ溶出物に、連続的に攪拌しながら加えた。フェニルＨＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
）カラムクロマトグラフィー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＸＫ−５０カラム、ベッド
の高さ１４ｃｍ、流速１５０ｃｍ／時）を、室温で以下のプロトコールを用いて
行った。 １．カラムを０．５Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液
、ｐＨ６．０（緩衝液Ｃ）で平衡化した。 ２．０．５Ｍの硫酸アンモニウムでインキュベートしたヒト酸性αグルコシダー
ゼ溶出物を供した。動的容量（ｄｙｎａｍｉｃ ｃａｐａｃｉｔｙ）は、フェニ
ルセファロースハイパフォーマンス１ｍｌあたり約１．２ｍｇのヒト酸性αグル
コシダーゼであった。 ３．試料を供した後、カラムを２ｃｖの緩衝液Ｃで洗浄した。 ４．ほとんどのヒト酸性αグルコシダーゼを、フェニルＨＰカラムから、４ｃｖ
の緩衝液Ｄ（５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）で溶出した。 ５．最も強く結合しているタンパク質を、最初は水で、そして次いで２０％エタ
ノールで溶出した。 フェニルセファロースＨＰクロマトグラフィー作業の代表的な溶出プロファイ
ルを図２に示す。 工程４におけるヒト酸性αグルコシダーゼ活性の回収率は、一般的に８５％よ
り大きかった。 （８．フェニルＨＰカラムからのヒト酸性αグルコシダーゼ画分の、Ｓｏｕｒ
ｃｅ Ｐｈｅｎｙｌ １５における結合および溶出） ２Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０を
、フェニルＨＰカラムからのヒト酸性αグルコシダーゼ溶出物に、最終的な濃度
が０．８５Ｍの硫酸アンモニウムに達するまで加えた。溶液を連続的におよびお
だやかに攪拌した。 Ｓｏｕｒｃｅ Ｐｈｅｎｙｌ １５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）クロマトグラフィ
ー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅｌｉｎｅ １００カラム、ベッドの高さ１５
ｃｍ、流速７６ｃｍ／時）を、以下のプロトコールを用いて行った。 １．カラムを０．８５Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝
液、ｐＨ７．０（緩衝液Ｅ）で平衡化した。 ２．フェニルＨＰからの硫酸アンモニウム希釈ヒト酸性αグルコシダーゼ溶出物
をカラムに供した。動的容量はＳｏｕｒｃｅ １５ Ｐｈｅｎｙｌ １ｍｌあた
り約２ｍｇの組換えヒト酸性αグルコシダーゼであった。 ３．試料を供した後、ヒト酸性αグルコシダーゼを、Ｓｏｕｒｃｅ １５ Ｐｈ
ｅｎｙｌカラムから、１０ｃｖの、１００％緩衝液Ｅから１００％緩衝液Ｆ（緩
衝液Ｆ：５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）への直線的勾配で溶
出した。いくつかの混入タンパク質はαグルコシダーゼのすぐ後に溶出するので
、溶出画分の注意深いプールが必要である（クーマシーブリリアントブルー染色
を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるカラム画分の純度プロファイルに基づく）。 ４．残りの結合しているタンパク質を、カラムから水および／または２０％エタ
ノールで溶出した。 Ｓｏｕｒｃｅ １５ Ｐｈｅｎｙｌクロマトグラフィー作業の代表的な溶出プ
ロファイルを図３に示す。 プールした画分におけるヒト酸性αグルコシダーゼ活性の回収率（工程４）は
、一般的に７０％より大きかった。 （９．最終的な濾過工程：限外濾過、ダイア濾過、滅菌濾過、およびナノ濾過
） Ｓｏｕｒｃｅ １５ Ｐｈｅｎｙｌカラムからプールしたヒト酸性αグルコシ
ダーゼ画分を、ＴＦＦ方式で、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＰｒｏｆｌｕｘ Ｍ１２シ
ステムにつなげた０．１ｍ2のＢｉｏｍａｘ ３０膜を通した限外濾過によって 濃縮した。７倍に濃縮した後、保持物を１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐ
Ｈ７．０でダイアフィルトレートした（約６ダイアフィルトレーション容量を使
用した）。最終的に、酸性αグルコシダーゼ画分を滅菌濾過した（０．２μｍの
デッドエンドフィルター）。これらの濾過工程後の、ヒト酸性αグルコシダーゼ
の回収率は８５％より大きかった。必要に応じて、ウイルス除去工程を組み込み
得る。Ｐｌａｎｏｖａ １５および３５のようなウイルス除去フィルター（ナノ
フィルター）が適している。 （１０．精製ヒト酸性αグルコシダーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨＰ−ＳＥ
Ｃ分析） 精製ヒト酸性αグルコシダーゼを銀染色ＳＤＳ／ＰＡＧＥおよびサイズ排除Ｈ
ＰＬＣ（ＨＰ−ＳＥＣ）によって分析した。図４は精製作業中に得られた種々の
乳画分の、クーマシーブリリアントブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（４〜１２
％、ＮｕＰａｇｅ）を示す。同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを銀染色によって視覚
化した。少数の小さいバンドが存在した。酸性αグルコシダーゼに対するポリク
ローナル抗体を用いたゲルのウェスタンブロッティングは、これらの小さいバン
ドのほとんどを、前駆体酸性αグルコシダーゼの２量体および処理された形であ
ると同定した。少なくとも２つの宿主に関連した不純物が、精製した組換えヒト
酸性αグルコシダーゼ調製物に存在した。ゲルの濃度測定走査によって定量した
これらの宿主関連不純物の量は、供した全タンパク質の約１％程度であった。精
製組換えヒト酸性αグルコシダーゼを、高速液体クロマトグラフィーシステムに
つなげたサイズ排除カラム（ＨＰ−ＳＥＣ）でも分析した。結果を図５に示す。
サイズ排除カラムは、タンパク質を本質的にその分子量に基づいて分離すること
ができる。従って、原則としてこのカラムは、１１０ｋＤａの前駆体αグルコシ
ダーゼと比較して異なった分子量のタンパク質不純物を視覚化および定量するこ
とができる。予期したように、主なタンパク質のピークは、組換えヒト酸性αグ
ルコシダーゼ前駆体であり、ピーク表面分析は、このピークは全ての視覚化され
たピークの、全表面積の９９％であることを示した。１１０ｋＤａのαグルコシ
ダーゼ単量体の分子量は、このカラムでは１２７ｋＤａであると見積もられた。
ほかの小さいピークがいくつか見られた。それらの溶出プロファイルに基づいて
、それらは約２４０ｋＤａ（１１０ｋＤａのαグルコシダーゼ２量体）、約６７
ｋＤａ（血清アルブミン）、および約２０ｋＤａ（未知）の分子量を有すると考
えられた。また、いくつかのタンパク質が大きい分子量の領域に存在した。 （１１．金属キレートおよびレクチンセファロースを用いたヒト酸性αグルコ
シダーゼの精製） 種々の金属キレートセファロースを、製造会社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の推奨
に従って調製した。放射性標識したヒト前駆体酸性αグルコシダーゼを、種々の
セファロースと共に一晩インキュベートした（詳細は実施例１を参照のこと）。
洗浄によって結合していない標識を除去した後、ビーズに結合した放射活性を液
体シンチレーションカウンターで測定した。結果を図６に示す。明らかに、Ｃｕ 2+ キレートセファロースは、放射性標識したヒト前駆体酸性αグルコシダーゼに
非常に良く結合している。従って、Ｆｅ2+、Ｆｅ3+、およびＺｎ2+セファロース
と対照的に、このリガンドは乳および他の供給源から酵素を精製するのに適当で
あり得る。 放射性標識したヒト前駆体酸性αグルコシダーゼはまた、コンカナバリンＡの
ようなレクチンセファロースにも良く結合する（予期したように）。しかし予期
せずレンチルセファロースにも良く結合する（図５）。従って、レンチルセファ
ロースも乳からの酸性αグルコシダーゼの精製に適当であるようである。 （１２．種々のＨＩＣ媒体を用いたヒト酸性αグルコシダーゼの精製） 精製した酸性αグルコシダーゼおよびウサギ乳画分を、フェニルセファロース
以外のＨＩＣ媒体と共にインキュベートした。図７に、セファロース（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ）および／またはＴｏｙｏｐｅａｒｌ（ＴｏｓｏＨａａｓ）ビーズに
結合したブチル、オクチル、エーテルリガンドを含むカラムを用いたクロマトグ
ラフィー実験の結果を示す。ＨＩＣの通常の条件下では、αグルコシダーゼは種
々の媒体により強くまたは弱く結合することが見出された。 （１３．ヒドロキシアパタイトを用いたヒト酸性αグルコシダーゼの精製−実
験１） ヒドロキシアパタイトを、組換えヒト酸性αグルコシダーゼを夾雑（乳清）タ
ンパク質から分離する能力に関して試した。ヒドロキシアパタイトは、リン酸カ
ルシウムの結晶形態である。タンパク質の結合は、タンパク質のカルボキシル基
およびアミノ基、ならびにヒドロキシアパタイト結晶格子のＣａ2+およびＰＯ4 3 - 基を通じて媒介される（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏ ｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｂ．Ｍ．Ｄｕｎｎ、Ｈ．
Ｌ．Ｐｌｏｅｇｈ、Ｄ．Ｗ．Ｓｐｅｉｃｈｅｒ、Ｐ．Ｔ．Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ編
、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．（１９９５）、補遺８．６．９−
８．６．１２）。静電気的な相互作用および特異的な効果が、中性および酸性タ
ンパク質のＣａ2+部位への結合に関与する。しかし、多くのタンパク質のヒドロ
キシアパタイトとの相互作用はｐＩのみでは説明できない。ＤＮＡもまた荷電し
たリン酸骨格のためにマトリックスに結合する（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｂ
．Ｍ．Ｄｕｎｎ、Ｈ．Ｌ．Ｐｌｏｅｇｈ、Ｄ．Ｗ．Ｓｐｅｉｃｈｅｒ、Ｐ．Ｔ．
Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．（１９９５
）、補遺８．６．９−８．６．１２）。 トランスジェニックおよび非トランスジェニックウサギ乳清を、セラミックヒ
ドロキシアパタイトＩ型（ＢｉｏＲａｄ）を含むカラムに、低塩濃度で供した。
供した後、結合したタンパク質を４００ｍＭのリン酸ナトリウム（ＮａＰｉ）、
ｐＨ６．８への濃度勾配で溶出した。図８に示すクロマトグラフィープロファイ
ルは、明らかに非トランスジェニック乳清に比べてトランスジェニック乳清で通
過するものが増加したことを示す。銀染色を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図９
）は、明らかにこの画分が、ＷＡＰタンパク質と共に組換えヒト酸性αグルコシ
ダーゼを含むことを示した。ほとんど全ての他の乳清タンパク質は、カラムに結
合した（図８のｘ軸は、図９のゲルにおけるレーンの上の画分番号に対応する画
分番号を示す）。酸性αグルコシダーゼ活性のアッセイは、ほとんどの活性は通
過画分に存在し、および５％より少ないものがカラムに結合したことを示した。 これらの結果は、予期せずに、異種タンパク質（組換えヒト）酸性αグルコシ
ダーゼはヒドロキシアパタイトに結合せず、一方ほとんど全ての他の乳清タンパ
ク質は結合することを明らかに示している。これはヒドロキシアパタイトカラム
を、精製方法の一工程として、Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｐｈｅに加えるかまたはその
代わりに、または両方のＨＩＣカラムの代わりにさえ、同様に使用し得ることを
意味する。もちろんヒドロキシアパタイトを、より複雑な全体の方法の仕上げ工
程に使用し得る。ヒドロキシアパタイトをまた、最初の工程（不純物の捕獲）と
して使用し得、続いて例えばＱセファロースクロマトグラフィーまたはゲル濾過
を行い得る。ヒドロキシアパタイトでは速い流速を得ることができ、カラムは清
掃（消毒）するのが容易であり、そしてヒトに注射した場合、少量のリン酸カル
シウムの潜在的な漏れは有害ではない（例えば骨はリン酸カルシウムを含む）。
供給業者はドラッグマスターファイル（ＤＭＦ）を提供し得る。 （１４．ヒドロキシアパタイトを用いたヒト酸性αグルコシダーゼの精製−実
験２） ２０ｍＭのＮａＰｉ緩衝液、ｐＨ７．０中で、約３％（ｗ／ｗ）の組換えヒト
酸性αグルコシダーゼを含む、ウサギ由来のトランスジェニック乳清を、接線流
濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）（ＴＦＦ）に
よって作成した。トランスジェニックウサギ乳清を、水またはリン酸ナトリウム
緩衝液のいずれかで希釈し、最終的なリン酸ナトリウム（ＮａＰｉ）（Ｎａ2Ｈ ＰＯ4／ＮａＨ2ＰＯ4）緩衝液の濃度が５、１０、２０、３０、４０、または５ ０ｍＭである、一連のトランスジェニック乳清試料を作成した。 供する試料の緩衝液の強さに対応するように、５、１０、２０、３０、４０、
または５０ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ６．０でカラムを平衡化した。１ｍｌの試料（
２．５ｍｇのタンパク質を含む）を個々に２．５ｍｌのセラミックヒドロキシア
パタイト（ｃＨＴ）１型（ＢｉｏＲａｄ）カラム（ベッドの高さ１５ｃｍ）に供
した。供した後、あらゆる結合していないタンパク質を除去するために、カラム
を５ｃｖの平衡化緩衝液で洗浄した。次いで結合したタンパク質を、問題の試料
のモル濃度から４００ｍＭまで、リン酸ナトリウムの濃度勾配で溶出した。１．
９ｍｌの画分をカラム溶出物から採取し、そして次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析ま
で４℃で保存した。 図１０から１５は、５、１０、２０、３０、４０、および５０ｍＭのＮａＰｉ
緩衝液、ｐＨ７．０の乳清試料それぞれの、ヒドロキシアパタイトクロマトグラ
フィーで得たクロマトグラフィックトレースを示す。図１２、１３、および１４
では（試料＝それぞれ３０、４０、および５０ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ７．０）、
トレースの左のピークは少なくとも一部の通過した物質を表し、そしてこれらの
図におけるピークエリアは、図１０および１５（試料＝それぞれ５および６０ｍ
ＭのＮａＰｉ、ｐＨ７．０）における対応するピークから見られるものよりも有
意に大きい。 画分の銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、５、１０、および２０ｍＭのリン酸ナ
トリウムでは、大部分のαグルコシダーゼは通過したものの中に見られ、一方実
質的に全ての乳清タンパク質はｃＨＴビーズに結合したことを示した。３０、４
０、および５０ｍＭのＮａＰｉでは、αグルコシダーゼの大部分は通過したもの
の中に留まるが、還流したものの中の、乳清タンパク質の量が増加した。 本実験は、５と２０ｍＭとの間のリン酸ナトリウム緩衝液試料濃度で、トラン
スジェニック乳清からのαグルコシダーゼに関して、許容できるタンパク質回収
率のよい精製が、どのように達成し得るかを示す。より少ない回収率のよりよい
精製が必要な場合、より低い試料緩衝液濃度を使用し得る。 （１５．ヒドロキシアパタイトを用いたヒト酸性αグルコシダーゼの精製−実
験３） 上記の実験２で述べたように、約３％（ｗ／ｗ）の組換えヒト酸性αグルコシ
ダーゼを含むトランスジェニックウサギ乳清を接線フローフィルトレーション（
ＴＦＦ）によって作成した。トランスジェニック乳清を水で希釈し、最終的なリ
ン酸ナトリウム（ＮａＰｉ）緩衝液の濃度をｐＨ７．２で５ｍＭにした。約２．
５ｍｇのタンパク質を含む、５００μｌの希釈乳清を、２．５ｍｌのセラミック
ヒドロキシアパタイト（ｃＨＴ）１型（ＢｉｏＲａｄ）カラム（ベッドの高さ１
５ｃｍ）に供した。それぞれのカラムを、ｐＨ６．０、６．５、７．０、または
７．５の５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化した（図１６から１９）。試料
を供した後、カラムを５ｃｖの平衡化緩衝液で洗浄した。結合したタンパク質を
流速７２３ｃｍ／時で、それぞれｐＨ６．０、６．５、７．０、または７．５の
４００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液への濃度勾配を用いて溶出した。１．０ｍｌ
の画分を、銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質の含有量に関して分
析した。 銀染色した画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの結果をみると、ｐＨ６．０では、α
グルコシダーゼは弱くｃＨＴに結合するのみ（すなわち、いくらかは通過した）
であり、一方実質的に全ての乳清タンパク質はｃＨＴにより強く結合したことを
見ることができる。ｐＨ６．５では、約９０％のαグルコシダーゼがカラムから
通過するものの中にあり、および低分子量（ＬＭＷ）タンパク質（おそらく乳清
酸性タンパク質（ＷＡＰ））もまたαグルコシダーゼとともに通過したものの中
にあったが、カラムでいくらか遅れた。ｐＨ７．０では、全てのαグルコシダー
ゼおよびほとんどのＬＭＷタンパク質（おそらくＷＡＰ）およびＨＭＷタンパク
質（おそらく免疫グロブリン）は通過したものの中にあった。約８０ｋＤのタン
パク質（おそらくトランスフェリン）も通過したものの中にあったが、カラムで
いくらか遅れた。 これらの結果に基づいて、ｐＨ６．５がαグルコシダーゼを乳清タンパク質か
ら分離するのに最適であるようである。 （１６．ＱセファロースＦＦおよびヒドロキシアパタイトを用いたヒト酸性α
グルコシダーゼの精製） 接線フローフィルトレーションによって生成したトランスジェニック乳清（組
換えヒト酸性αグルコシダーゼを含む）を、ＱセファロースＦＦ（カラム容量２
５リットル）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に、
２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ＮａＰｉ）、ｐＨ７．０緩衝液中で供することに
よって、パイロットプラント設備で処理した（図２０）。カラムを４ｃｖの５０
ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ７．０、および次いで２ｃｖの２０ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ
７．０で平衡化した。αグルコシダーゼを含む画分を、２．７ｃｖの０．１Ｍの
ＮａＣｌ、ｐＨ７．０で溶出した。４７．３リットルの試料を採取し、そしてこ
れは２６５ｇのタンパク質を含んでいた。０．１Ｍ画分の試料を１０ｍＭのリン
酸ナトリウム（ＮａＰｉ）、ｐＨ６．５緩衝液に対して透析した（３，５００ダ
ルトンの分子量カットオフ、Ｓｐｅｃｔｒａ Ｐｏｒ）。 ６０ｍｌの透析した０．１Ｍ試料（３．９１ｍｇ／ｍｌタンパク質、１．３３
ｍＳ／ｃｍ）を、３０ｍｌのｃＨＴ１型カラム（ＸＫ１６／１５）（ＢｉｏＲａ
ｄ）に、流速１５０ｃｍ／時（５ｍｌ／分）で供した（図２１）。試料を供した
後、カラムを５ｃｖの平衡化緩衝液（１０ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ６．５）で洗浄
した。１０ｍｌの画分を回収し、そしてαグルコシダーゼは通過したものに見ら
れ、一方大部分の乳清タンパク質はｃＨＴビーズに結合した。結合したタンパク
質を、１０から４００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液の直線的な濃度勾配で溶出
した。この工程は、αグルコシダーゼを含むＱセファロースＦＦ画分において、
不純物のレベルを９０％から、ｃＨＴカラムの通過画分における＜０．５％まで
減少させた。αグルコシダーゼの回収率は８０％より多かった。図２１はｃＨＴ
における試料の実施のクロマトグラムを示す。 図２２は、ｃＨＴカラムからの通過画分（レーン１−３、５−７、および９−
１１）、分子量スタンダード（レーン４）、およびｃＨＴカラムに供したＱＦＦ
溶出物の試料（レーン１２）を示す、銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。 前述の発明は明快さと理解の目的のために、いくらか詳細に記載されているが
、本開示を読むことから、形式および詳細における種々の変更が、本発明の本来
の範囲から逸脱することなくなされ得ることが、当該業者にとって明らかである
。本出願において引用された全ての出版物および特許書類は、個々の出版物また
は特許書類は、個々にそう示されるような同じ程度で、全ての目的のためにその
全体において参考文献として援用される。
【図１】 図１。Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムにおけるウサギ乳清のクロマトグ
ラフィープロフィール。（希釈した）脱脂乳の接線流濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａ
ｌ ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）（ＴＦＦ）によって調製した、ウサギ（
系統６０）乳汁（約５５０ｍｌ）由来の乳清画分を、溶媒／界面活性剤（１％Ｔ
ｗｅｅｎ−８０、０．３％ＴｎＢＰ）と共にインキュベートし、そしてＱ Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＸＫ−５０カラム、ベット
容量（ｂｅｄ ｈｅｉｇｈｔ）１８ｃｍ；流速２５０ｃｍ／ｈｒ）にロードした
。カラムを（７）カラム容積（ｃｖ）の緩衝液Ａ（２０ｍＭのリン酸ナトリウム
緩衝液、ｐＨ７．０）で洗浄し、そしてヒト酸性αグルコシダーゼ画分を、１０
０ｍＭの塩化ナトリウムを含む３．５ｃｖの緩衝液Ａで溶出した。全ての強く結
合したタンパク質を約３ｃｖの１００％の緩衝液Ｂ（１ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭ
のリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）で溶出した。全てのカラムクロマトグ
ラフィーは、ＰｈａｒｍａｃｉａのＡＫＴＡシステムによって制御した。タンパ
ク質をオンラインで２８０ｎｍでの吸光を測定することによって検出した。伝導
性をオンラインで測定した。ｍＡＵ＝ミリ吸光度単位；ｍＳ／ｃｍ＝ミリシーメ
ンス／ｃｍ。
ラフィープロフィール。（希釈した）脱脂乳の接線流濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａ
ｌ ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）（ＴＦＦ）によって調製した、ウサギ（
系統６０）乳汁（約５５０ｍｌ）由来の乳清画分を、溶媒／界面活性剤（１％Ｔ
ｗｅｅｎ−８０、０．３％ＴｎＢＰ）と共にインキュベートし、そしてＱ Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＸＫ−５０カラム、ベット
容量（ｂｅｄ ｈｅｉｇｈｔ）１８ｃｍ；流速２５０ｃｍ／ｈｒ）にロードした
。カラムを（７）カラム容積（ｃｖ）の緩衝液Ａ（２０ｍＭのリン酸ナトリウム
緩衝液、ｐＨ７．０）で洗浄し、そしてヒト酸性αグルコシダーゼ画分を、１０
０ｍＭの塩化ナトリウムを含む３．５ｃｖの緩衝液Ａで溶出した。全ての強く結
合したタンパク質を約３ｃｖの１００％の緩衝液Ｂ（１ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭ
のリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）で溶出した。全てのカラムクロマトグ
ラフィーは、ＰｈａｒｍａｃｉａのＡＫＴＡシステムによって制御した。タンパ
ク質をオンラインで２８０ｎｍでの吸光を測定することによって検出した。伝導
性をオンラインで測定した。ｍＡＵ＝ミリ吸光度単位；ｍＳ／ｃｍ＝ミリシーメ
ンス／ｃｍ。
【図２】 図２。フェニルＨＰセファロースカラムにかけた、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
ＦＦで精製した組換えヒトαグルコシダーゼ画分のクロマトグラフィープロフィ
ール。 １容積の１Ｍ硫酸アンモニウムをＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦヒト酸性αグ
ルコシダーゼ溶出物（１００ｍＭの塩化ナトリウム、２０ｍＭのリン酸ナトリウ
ム緩衝液、ｐＨ７．０の工程で得た；図１の画分Ｆ３）に、連続的に攪拌しなが
ら添加した。このサンプルをフェニルＨＰセファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ ＸＫ−５０カラム、ベット容量１４ｃｍ；流速１５０ｃｍ／ｈｒ）に室温
でロードした（セファロース１ｍｌあたり１〜１．２ｍｇのαグルコシダーゼを
ロードした）。ロードする前に、カラムを０．５Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍ
Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０（＝緩衝液Ｃ）で平衡化した。サンプ
ルをロードした後、カラムを２ｃｖの緩衝液Ｃで洗浄して、トランスフェリンお
よび血清アルブミンのような混入タンパク質を除去した。ほとんどの組換えヒト
酸性αグルコシダーゼを、４ｃｖの緩衝液Ｄ（＝５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩
衝液、ｐＨ６．０）でフェニルＨＰカラムから溶出した。最も強く結合している
タンパク質を最初に水で、次いで２０％エタノールで溶出した。
ＦＦで精製した組換えヒトαグルコシダーゼ画分のクロマトグラフィープロフィ
ール。 １容積の１Ｍ硫酸アンモニウムをＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦヒト酸性αグ
ルコシダーゼ溶出物（１００ｍＭの塩化ナトリウム、２０ｍＭのリン酸ナトリウ
ム緩衝液、ｐＨ７．０の工程で得た；図１の画分Ｆ３）に、連続的に攪拌しなが
ら添加した。このサンプルをフェニルＨＰセファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ ＸＫ−５０カラム、ベット容量１４ｃｍ；流速１５０ｃｍ／ｈｒ）に室温
でロードした（セファロース１ｍｌあたり１〜１．２ｍｇのαグルコシダーゼを
ロードした）。ロードする前に、カラムを０．５Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍ
Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０（＝緩衝液Ｃ）で平衡化した。サンプ
ルをロードした後、カラムを２ｃｖの緩衝液Ｃで洗浄して、トランスフェリンお
よび血清アルブミンのような混入タンパク質を除去した。ほとんどの組換えヒト
酸性αグルコシダーゼを、４ｃｖの緩衝液Ｄ（＝５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩
衝液、ｐＨ６．０）でフェニルＨＰカラムから溶出した。最も強く結合している
タンパク質を最初に水で、次いで２０％エタノールで溶出した。
【図３】 図３。ソースフェニル（Ｓｏｕｒｃｅ Ｐｈｅｎｙｌ）１５カラムにかけた、
（フェニルＨＰセファロースで精製した）組換えヒトαグルコシダーゼ画分のク
ロマトグラフィープロフィール。 ２Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０を
、フェニルＨＰカラムからのヒト酸性αグルコシダーゼ溶出物（図２の画分Ｆ４
）に、最終的な濃度が０．８５Ｍの硫酸アンモニウムに達するまで添加した。溶
液を連続的に、そしてゆるやかに攪拌した。溶出物を、０．８５Ｍの硫酸アンモ
ニウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０（＝緩衝液Ｅ）で予め
平衡化した、ソースフェニル１５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅｌｉｎ
ｅ １００カラム、ベット容量１５ｃｍ；流速７６ｃｍ／ｈｒ）にロードした。
このカラムでは、ソース１５フェニル１ｍｌあたり、約２ｍｇの酸性αグルコシ
ダーゼをロードし得る。サンプルをロードした後、組換えヒト酸性αグルコシダ
ーゼを（ソース１５フェニル）カラムから、１０ｃｖの１００％の緩衝液Ｅから
１００％の緩衝液Ｆ（緩衝液Ｆ＝５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．
０）への直線的な勾配で溶出した。高度に精製された組換え酸性αグルコシダー
ゼを得るために、溶出画分を注意深くプールすることが必要とされる（クーマシ
ーブリリアントブルー染色を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるカラム画分の純度
プロフィールに基づく）。残りの結合したタンパク質を最初は水で、次いで２０
％エタノールでカラムから溶出した。
（フェニルＨＰセファロースで精製した）組換えヒトαグルコシダーゼ画分のク
ロマトグラフィープロフィール。 ２Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０を
、フェニルＨＰカラムからのヒト酸性αグルコシダーゼ溶出物（図２の画分Ｆ４
）に、最終的な濃度が０．８５Ｍの硫酸アンモニウムに達するまで添加した。溶
液を連続的に、そしてゆるやかに攪拌した。溶出物を、０．８５Ｍの硫酸アンモ
ニウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０（＝緩衝液Ｅ）で予め
平衡化した、ソースフェニル１５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅｌｉｎ
ｅ １００カラム、ベット容量１５ｃｍ；流速７６ｃｍ／ｈｒ）にロードした。
このカラムでは、ソース１５フェニル１ｍｌあたり、約２ｍｇの酸性αグルコシ
ダーゼをロードし得る。サンプルをロードした後、組換えヒト酸性αグルコシダ
ーゼを（ソース１５フェニル）カラムから、１０ｃｖの１００％の緩衝液Ｅから
１００％の緩衝液Ｆ（緩衝液Ｆ＝５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．
０）への直線的な勾配で溶出した。高度に精製された組換え酸性αグルコシダー
ゼを得るために、溶出画分を注意深くプールすることが必要とされる（クーマシ
ーブリリアントブルー染色を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるカラム画分の純度
プロフィールに基づく）。残りの結合したタンパク質を最初は水で、次いで２０
％エタノールでカラムから溶出した。
【図４】 図４。酸性αグルコシダーゼの精製手順の間の、種々の画分のＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ分析。ウサギ乳汁（系統６０）からの組換えヒト酸性αグルコシダーゼ精製の
間に得られた種々の画分を、非還元ＳＤＳサンプル緩衝液に希釈した。このサン
プルを５分間沸騰させ、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配ゲル（４〜１２％、Ｎｏｖ
ｅｘ）にロードした。 タンパク質をクーマシーブリリアントブルーで染色した。レーン１：全ウサギ
乳汁（４０μｇ）；２．脱脂乳のＴＦＦ後の乳清（４０μｇ）；３．Ｑ Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムからの酸性αグルコシダーゼ溶出画分（３０μｇ）；
４．フェニルＨＰカラムからの酸性αグルコシダーゼ溶出画分（５μｇ）；５．
ソース１５フェニルカラムからの酸性αグルコシダーゼ溶出画分（５μｇ）。 文字は、次のように同定されたタンパク質のバンドを指す：ａ．ウサギ免疫グ
ロブリン；ｂ．未知のタンパク質；ｃ．組換えヒト酸性αグルコシダーゼ前駆体
（これらのＳＤＳ−ＰＡＧＥ条件下では２重のバンド）；ｄ．ウサギトランスフ
ェリン；ｅ．ウサギ血清アルブミン；ｆ．ウサギカゼイン；ｇ．ウサギ乳清酸性
タンパク質（ＷＡＰ）、おそらく２量体；ｈ．ウサギ乳清酸性タンパク質（ＷＡ
Ｐ）、単量体；ｉ．未知のタンパク質、おそらくウサギＷＡＰの改変体またはα
ラクトアルブミン；ｊ．２量体または組換えヒト酸性αグルコシダーゼ前駆体（
これらのＳＤＳ−ＰＡＧＥ条件下では２重のバンド）；ｋ．未知のタンパク質（
ウサギトランスフェリン、またはプロセシングされた組換えヒト酸性αグルコシ
ダーゼ）。
Ｅ分析。ウサギ乳汁（系統６０）からの組換えヒト酸性αグルコシダーゼ精製の
間に得られた種々の画分を、非還元ＳＤＳサンプル緩衝液に希釈した。このサン
プルを５分間沸騰させ、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配ゲル（４〜１２％、Ｎｏｖ
ｅｘ）にロードした。 タンパク質をクーマシーブリリアントブルーで染色した。レーン１：全ウサギ
乳汁（４０μｇ）；２．脱脂乳のＴＦＦ後の乳清（４０μｇ）；３．Ｑ Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムからの酸性αグルコシダーゼ溶出画分（３０μｇ）；
４．フェニルＨＰカラムからの酸性αグルコシダーゼ溶出画分（５μｇ）；５．
ソース１５フェニルカラムからの酸性αグルコシダーゼ溶出画分（５μｇ）。 文字は、次のように同定されたタンパク質のバンドを指す：ａ．ウサギ免疫グ
ロブリン；ｂ．未知のタンパク質；ｃ．組換えヒト酸性αグルコシダーゼ前駆体
（これらのＳＤＳ−ＰＡＧＥ条件下では２重のバンド）；ｄ．ウサギトランスフ
ェリン；ｅ．ウサギ血清アルブミン；ｆ．ウサギカゼイン；ｇ．ウサギ乳清酸性
タンパク質（ＷＡＰ）、おそらく２量体；ｈ．ウサギ乳清酸性タンパク質（ＷＡ
Ｐ）、単量体；ｉ．未知のタンパク質、おそらくウサギＷＡＰの改変体またはα
ラクトアルブミン；ｊ．２量体または組換えヒト酸性αグルコシダーゼ前駆体（
これらのＳＤＳ−ＰＡＧＥ条件下では２重のバンド）；ｋ．未知のタンパク質（
ウサギトランスフェリン、またはプロセシングされた組換えヒト酸性αグルコシ
ダーゼ）。
【図５】 図５。精製された組換えヒト酸性αグルコシダーゼ前駆体のＨＰＬＣサイズ排
除プロフィール。 組換えヒト酸性αグルコシダーゼ前駆体を、トランスジェニックウサギ乳汁か
ら、乳汁の脱脂、脱脂乳のＴＦＦ、Ｑ ＦＦクロマトグラフィー、フェニルＨＰ
クロマトグラフィー、ソース１５フェニルクロマトグラフィー、そして最終的な
濾過によって精製した。サンプルを実施例１に記載したようにＨＰ−ＳＥＣクロ
マトグラフィーを行なうために調製した。
除プロフィール。 組換えヒト酸性αグルコシダーゼ前駆体を、トランスジェニックウサギ乳汁か
ら、乳汁の脱脂、脱脂乳のＴＦＦ、Ｑ ＦＦクロマトグラフィー、フェニルＨＰ
クロマトグラフィー、ソース１５フェニルクロマトグラフィー、そして最終的な
濾過によって精製した。サンプルを実施例１に記載したようにＨＰ−ＳＥＣクロ
マトグラフィーを行なうために調製した。
【図６】 図６。125Ｉヒト酸性αグルコシダーゼ前駆体の、種々の金属キレートおよび レクチンセファロースへの結合。ウサギ系統６０から精製したヒト酸性αグルコ
シダーゼ前駆体を、実施例１で記載したように125Ｉで放射性標識した。標識し た酵素の金属キレートセファロース（Ｆｅ2+、Ｆｅ3+、Ｃｕ2+、Ｚｎ2+、グリシ
ン、およびコントロール）およびレクチンセファロース（コンカナバリンＡおよ
びレンチル）への結合を、実施例１で記載したように行った。２つの洗浄手順を
試験した：ＰＢＳ、０．００２％のＴｗｅｅｎ−２０緩衝液での洗浄、またはＰ
ＢＳ、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０、０．５Ｍの塩化ナトリウム緩衝液での洗浄
のいずれか。結合のパーセンテージは試験管に添加した放射性標識の総量に関連
する。
シダーゼ前駆体を、実施例１で記載したように125Ｉで放射性標識した。標識し た酵素の金属キレートセファロース（Ｆｅ2+、Ｆｅ3+、Ｃｕ2+、Ｚｎ2+、グリシ
ン、およびコントロール）およびレクチンセファロース（コンカナバリンＡおよ
びレンチル）への結合を、実施例１で記載したように行った。２つの洗浄手順を
試験した：ＰＢＳ、０．００２％のＴｗｅｅｎ−２０緩衝液での洗浄、またはＰ
ＢＳ、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０、０．５Ｍの塩化ナトリウム緩衝液での洗浄
のいずれか。結合のパーセンテージは試験管に添加した放射性標識の総量に関連
する。
【図７Ａ】 図７。種々のＨＩＣカラムに対する酸性αグルコシダーゼを含む画分のクロマ
トグラフィー溶出プロフィール。 精製された酸性αグルコシダーゼの１１０ｋＤａの前駆体または成熟した７６
ｋＤａの酸性αグルコシダーゼ（ＡおよびＢ；どちらも５μｇ；トランスジェニ
ックマウス乳汁２５８５系統由来の組換え体）を、１ｍｌのＢｕｔｙｌ ４ Ｆ
ａｓｔ Ｆｌｏｗ ＳｅｐｈａｒｏｓｅまたはＯｃｔｙｌ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌ
ｏｗ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨｉＴｒａｐカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｓｗｅ
ｄｅｎ）で分析した。トランスジェニック（系統６０；−０−）および非トラン
スジェニック（−−）乳清画分（２０，０００ｇ、６０分の遠心分離によって調
製された）もまた、ブチルカラムで分析した（どちらも２００μｌ、２５倍希釈
；Ｃ）。またトランスジェニック（系統６０；−０−）、および非トランスジェ
ニック（−）の乳清のＱ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ画分（カラムから１００μｌの塩
で溶出；図１を参照のこと）を、エーテルカラムでロードした（どちらも２００
μｌ、２５倍希釈；２．５ｍｌ、ベット容量５ｃｍのカラム中のＴｏｙｏｐｅａ
ｒｌ Ｅｔｈｅｒ ６５０Ｍ（ＴｏｓｏＨａａｓ）；Ｃ）。結果は、ＨＩＣカラ
ムへの酸性αグルコシダーゼの強い結合を示す（ＡおよびＢ）。ほとんどの乳清
タンパク質は、結合しない（Ｃ）。Ｑ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ溶出物をエーテルカ
ラムでロードした後に、ほぼ純粋な酸性αグルコシダーゼを得た（Ｄ）。ここで
ほとんどの血清アルブミンおよびトランスフェリンのような混入タンパク質は、
結合しない（ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは示さず）。 Ａ、Ｂ、およびＣにおける結合緩衝液は、Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭの
リン酸ナトリウム、ｐＨ７．０であった。Ｄの結合緩衝液は、１．５Ｍの硫酸ア
ンモニウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０であった。流速は１ｍｌ
／分であった。結合したタンパク質を、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．
０への直線的な塩勾配で、３０分で溶出した。全てのカラムクロマトグラフィー
はＰｈａｒｍａｃｉａのＡＫＴＡシステムにより制御した。２８０ｎｍでの吸光
度を測定することによって、タンパク質をオンラインで検出した（フローセル０
．２ｃｍ）。伝導率をオンラインで測定した。ｍＡＵ＝ミリ吸光度単位、ｍＳ／
ｃｍ＝ミリシーメンス／ｃｍ。
トグラフィー溶出プロフィール。 精製された酸性αグルコシダーゼの１１０ｋＤａの前駆体または成熟した７６
ｋＤａの酸性αグルコシダーゼ（ＡおよびＢ；どちらも５μｇ；トランスジェニ
ックマウス乳汁２５８５系統由来の組換え体）を、１ｍｌのＢｕｔｙｌ ４ Ｆ
ａｓｔ Ｆｌｏｗ ＳｅｐｈａｒｏｓｅまたはＯｃｔｙｌ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌ
ｏｗ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨｉＴｒａｐカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｓｗｅ
ｄｅｎ）で分析した。トランスジェニック（系統６０；−０−）および非トラン
スジェニック（−−）乳清画分（２０，０００ｇ、６０分の遠心分離によって調
製された）もまた、ブチルカラムで分析した（どちらも２００μｌ、２５倍希釈
；Ｃ）。またトランスジェニック（系統６０；−０−）、および非トランスジェ
ニック（−）の乳清のＱ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ画分（カラムから１００μｌの塩
で溶出；図１を参照のこと）を、エーテルカラムでロードした（どちらも２００
μｌ、２５倍希釈；２．５ｍｌ、ベット容量５ｃｍのカラム中のＴｏｙｏｐｅａ
ｒｌ Ｅｔｈｅｒ ６５０Ｍ（ＴｏｓｏＨａａｓ）；Ｃ）。結果は、ＨＩＣカラ
ムへの酸性αグルコシダーゼの強い結合を示す（ＡおよびＢ）。ほとんどの乳清
タンパク質は、結合しない（Ｃ）。Ｑ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ溶出物をエーテルカ
ラムでロードした後に、ほぼ純粋な酸性αグルコシダーゼを得た（Ｄ）。ここで
ほとんどの血清アルブミンおよびトランスフェリンのような混入タンパク質は、
結合しない（ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは示さず）。 Ａ、Ｂ、およびＣにおける結合緩衝液は、Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭの
リン酸ナトリウム、ｐＨ７．０であった。Ｄの結合緩衝液は、１．５Ｍの硫酸ア
ンモニウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０であった。流速は１ｍｌ
／分であった。結合したタンパク質を、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．
０への直線的な塩勾配で、３０分で溶出した。全てのカラムクロマトグラフィー
はＰｈａｒｍａｃｉａのＡＫＴＡシステムにより制御した。２８０ｎｍでの吸光
度を測定することによって、タンパク質をオンラインで検出した（フローセル０
．２ｃｍ）。伝導率をオンラインで測定した。ｍＡＵ＝ミリ吸光度単位、ｍＳ／
ｃｍ＝ミリシーメンス／ｃｍ。
【図７Ｂ】 図７。種々のＨＩＣカラムに対する酸性αグルコシダーゼを含む画分のクロマ
トグラフィー溶出プロフィール。 精製された酸性αグルコシダーゼの１１０ｋＤａの前駆体または成熟した７６
ｋＤａの酸性αグルコシダーゼ（ＡおよびＢ；どちらも５μｇ；トランスジェニ
ックマウス乳汁２５８５系統由来の組換え体）を、１ｍｌのＢｕｔｙｌ ４ Ｆ
ａｓｔ Ｆｌｏｗ ＳｅｐｈａｒｏｓｅまたはＯｃｔｙｌ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌ
ｏｗ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨｉＴｒａｐカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｓｗｅ
ｄｅｎ）で分析した。トランスジェニック（系統６０；−０−）および非トラン
スジェニック（−−）乳清画分（２０，０００ｇ、６０分の遠心分離によって調
製された）もまた、ブチルカラムで分析した（どちらも２００μｌ、２５倍希釈
；Ｃ）。またトランスジェニック（系統６０；−０−）、および非トランスジェ
ニック（−）の乳清のＱ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ画分（カラムから１００μｌの塩
で溶出；図１を参照のこと）を、エーテルカラムでロードした（どちらも２００
μｌ、２５倍希釈；２．５ｍｌ、ベット容量５ｃｍのカラム中のＴｏｙｏｐｅａ
ｒｌ Ｅｔｈｅｒ ６５０Ｍ（ＴｏｓｏＨａａｓ）；Ｃ）。結果は、ＨＩＣカラ
ムへの酸性αグルコシダーゼの強い結合を示す（ＡおよびＢ）。ほとんどの乳清
タンパク質は、結合しない（Ｃ）。Ｑ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ溶出物をエーテルカ
ラムでロードした後に、ほぼ純粋な酸性αグルコシダーゼを得た（Ｄ）。ここで
ほとんどの血清アルブミンおよびトランスフェリンのような混入タンパク質は、
結合しない（ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは示さず）。 Ａ、Ｂ、およびＣにおける結合緩衝液は、Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭの
リン酸ナトリウム、ｐＨ７．０であった。Ｄの結合緩衝液は、１．５Ｍの硫酸ア
ンモニウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０であった。流速は１ｍｌ
／分であった。結合したタンパク質を、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．
０への直線的な塩勾配で、３０分で溶出した。全てのカラムクロマトグラフィー
はＰｈａｒｍａｃｉａのＡＫＴＡシステムにより制御した。２８０ｎｍでの吸光
度を測定することによって、タンパク質をオンラインで検出した（フローセル０
．２ｃｍ）。伝導率をオンラインで測定した。ｍＡＵ＝ミリ吸光度単位、ｍＳ／
ｃｍ＝ミリシーメンス／ｃｍ。
トグラフィー溶出プロフィール。 精製された酸性αグルコシダーゼの１１０ｋＤａの前駆体または成熟した７６
ｋＤａの酸性αグルコシダーゼ（ＡおよびＢ；どちらも５μｇ；トランスジェニ
ックマウス乳汁２５８５系統由来の組換え体）を、１ｍｌのＢｕｔｙｌ ４ Ｆ
ａｓｔ Ｆｌｏｗ ＳｅｐｈａｒｏｓｅまたはＯｃｔｙｌ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌ
ｏｗ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨｉＴｒａｐカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｓｗｅ
ｄｅｎ）で分析した。トランスジェニック（系統６０；−０−）および非トラン
スジェニック（−−）乳清画分（２０，０００ｇ、６０分の遠心分離によって調
製された）もまた、ブチルカラムで分析した（どちらも２００μｌ、２５倍希釈
；Ｃ）。またトランスジェニック（系統６０；−０−）、および非トランスジェ
ニック（−）の乳清のＱ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ画分（カラムから１００μｌの塩
で溶出；図１を参照のこと）を、エーテルカラムでロードした（どちらも２００
μｌ、２５倍希釈；２．５ｍｌ、ベット容量５ｃｍのカラム中のＴｏｙｏｐｅａ
ｒｌ Ｅｔｈｅｒ ６５０Ｍ（ＴｏｓｏＨａａｓ）；Ｃ）。結果は、ＨＩＣカラ
ムへの酸性αグルコシダーゼの強い結合を示す（ＡおよびＢ）。ほとんどの乳清
タンパク質は、結合しない（Ｃ）。Ｑ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ溶出物をエーテルカ
ラムでロードした後に、ほぼ純粋な酸性αグルコシダーゼを得た（Ｄ）。ここで
ほとんどの血清アルブミンおよびトランスフェリンのような混入タンパク質は、
結合しない（ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは示さず）。 Ａ、Ｂ、およびＣにおける結合緩衝液は、Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭの
リン酸ナトリウム、ｐＨ７．０であった。Ｄの結合緩衝液は、１．５Ｍの硫酸ア
ンモニウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０であった。流速は１ｍｌ
／分であった。結合したタンパク質を、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．
０への直線的な塩勾配で、３０分で溶出した。全てのカラムクロマトグラフィー
はＰｈａｒｍａｃｉａのＡＫＴＡシステムにより制御した。２８０ｎｍでの吸光
度を測定することによって、タンパク質をオンラインで検出した（フローセル０
．２ｃｍ）。伝導率をオンラインで測定した。ｍＡＵ＝ミリ吸光度単位、ｍＳ／
ｃｍ＝ミリシーメンス／ｃｍ。
【図７Ｃ】 図７。種々のＨＩＣカラムに対する酸性αグルコシダーゼを含む画分のクロマ
トグラフィー溶出プロフィール。 精製された酸性αグルコシダーゼの１１０ｋＤａの前駆体または成熟した７６
ｋＤａの酸性αグルコシダーゼ（ＡおよびＢ；どちらも５μｇ；トランスジェニ
ックマウス乳汁２５８５系統由来の組換え体）を、１ｍｌのＢｕｔｙｌ ４ Ｆ
ａｓｔ Ｆｌｏｗ ＳｅｐｈａｒｏｓｅまたはＯｃｔｙｌ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌ
ｏｗ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨｉＴｒａｐカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｓｗｅ
ｄｅｎ）で分析した。トランスジェニック（系統６０；−０−）および非トラン
スジェニック（−−）乳清画分（２０，０００ｇ、６０分の遠心分離によって調
製された）もまた、ブチルカラムで分析した（どちらも２００μｌ、２５倍希釈
；Ｃ）。またトランスジェニック（系統６０；−０−）、および非トランスジェ
ニック（−）の乳清のＱ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ画分（カラムから１００μｌの塩
で溶出；図１を参照のこと）を、エーテルカラムでロードした（どちらも２００
μｌ、２５倍希釈；２．５ｍｌ、ベット容量５ｃｍのカラム中のＴｏｙｏｐｅａ
ｒｌ Ｅｔｈｅｒ ６５０Ｍ（ＴｏｓｏＨａａｓ）；Ｃ）。結果は、ＨＩＣカラ
ムへの酸性αグルコシダーゼの強い結合を示す（ＡおよびＢ）。ほとんどの乳清
タンパク質は、結合しない（Ｃ）。Ｑ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ溶出物をエーテルカ
ラムでロードした後に、ほぼ純粋な酸性αグルコシダーゼを得た（Ｄ）。ここで
ほとんどの血清アルブミンおよびトランスフェリンのような混入タンパク質は、
結合しない（ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは示さず）。 Ａ、Ｂ、およびＣにおける結合緩衝液は、Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭの
リン酸ナトリウム、ｐＨ７．０であった。Ｄの結合緩衝液は、１．５Ｍの硫酸ア
ンモニウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０であった。流速は１ｍｌ
／分であった。結合したタンパク質を、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．
０への直線的な塩勾配で、３０分で溶出した。全てのカラムクロマトグラフィー
はＰｈａｒｍａｃｉａのＡＫＴＡシステムにより制御した。２８０ｎｍでの吸光
度を測定することによって、タンパク質をオンラインで検出した（フローセル０
．２ｃｍ）。伝導率をオンラインで測定した。ｍＡＵ＝ミリ吸光度単位、ｍＳ／
ｃｍ＝ミリシーメンス／ｃｍ。
トグラフィー溶出プロフィール。 精製された酸性αグルコシダーゼの１１０ｋＤａの前駆体または成熟した７６
ｋＤａの酸性αグルコシダーゼ（ＡおよびＢ；どちらも５μｇ；トランスジェニ
ックマウス乳汁２５８５系統由来の組換え体）を、１ｍｌのＢｕｔｙｌ ４ Ｆ
ａｓｔ Ｆｌｏｗ ＳｅｐｈａｒｏｓｅまたはＯｃｔｙｌ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌ
ｏｗ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨｉＴｒａｐカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｓｗｅ
ｄｅｎ）で分析した。トランスジェニック（系統６０；−０−）および非トラン
スジェニック（−−）乳清画分（２０，０００ｇ、６０分の遠心分離によって調
製された）もまた、ブチルカラムで分析した（どちらも２００μｌ、２５倍希釈
；Ｃ）。またトランスジェニック（系統６０；−０−）、および非トランスジェ
ニック（−）の乳清のＱ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ画分（カラムから１００μｌの塩
で溶出；図１を参照のこと）を、エーテルカラムでロードした（どちらも２００
μｌ、２５倍希釈；２．５ｍｌ、ベット容量５ｃｍのカラム中のＴｏｙｏｐｅａ
ｒｌ Ｅｔｈｅｒ ６５０Ｍ（ＴｏｓｏＨａａｓ）；Ｃ）。結果は、ＨＩＣカラ
ムへの酸性αグルコシダーゼの強い結合を示す（ＡおよびＢ）。ほとんどの乳清
タンパク質は、結合しない（Ｃ）。Ｑ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ溶出物をエーテルカ
ラムでロードした後に、ほぼ純粋な酸性αグルコシダーゼを得た（Ｄ）。ここで
ほとんどの血清アルブミンおよびトランスフェリンのような混入タンパク質は、
結合しない（ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは示さず）。 Ａ、Ｂ、およびＣにおける結合緩衝液は、Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭの
リン酸ナトリウム、ｐＨ７．０であった。Ｄの結合緩衝液は、１．５Ｍの硫酸ア
ンモニウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０であった。流速は１ｍｌ
／分であった。結合したタンパク質を、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．
０への直線的な塩勾配で、３０分で溶出した。全てのカラムクロマトグラフィー
はＰｈａｒｍａｃｉａのＡＫＴＡシステムにより制御した。２８０ｎｍでの吸光
度を測定することによって、タンパク質をオンラインで検出した（フローセル０
．２ｃｍ）。伝導率をオンラインで測定した。ｍＡＵ＝ミリ吸光度単位、ｍＳ／
ｃｍ＝ミリシーメンス／ｃｍ。
【図８】 図８。Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｐａｔｉｔｅカラムでのトランスジェニックおよび
非トランスジェニック乳清画分のクロマトグラフィープロフィール。 脱脂（遠心分離による）およびカゼイン除去（ＴＦＦによる）の後に得た、ト
ランスジェニック（−−−−）および非トランスジェニック（−．−．−．−）
ウサギ乳清を、Ｍａｃｒｏ−ＰｒｅｐセラミックヒドロキシルアパタイトＩ型（
４０μｍのビーズ；ＢｉｏＲａｄ）を含み、ＰｈａｒｍａｃｉａのＦＰＬＣシス
テムに連結したＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍｅカラム（４．６×１５０ｍｍ）にロード
した。ＴＦＦ後に得た乳清画分を緩衝液Ａ（１０ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ６．８）
で５倍希釈し、そして０．２ｍｌを緩衝液Ａで予め平衡化したカラムにロードし
た。流速は、２ｍｌ／分であった。ロードした後に、結合したタンパク質を、１
０カラム容積で、５００ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ６．８までの勾配を用いて溶出し
た。タンパク質は、２８０ｎｍでの吸光度を測定することによって検出した（フ
ローセルは２ｍｍ）。
非トランスジェニック乳清画分のクロマトグラフィープロフィール。 脱脂（遠心分離による）およびカゼイン除去（ＴＦＦによる）の後に得た、ト
ランスジェニック（−−−−）および非トランスジェニック（−．−．−．−）
ウサギ乳清を、Ｍａｃｒｏ−ＰｒｅｐセラミックヒドロキシルアパタイトＩ型（
４０μｍのビーズ；ＢｉｏＲａｄ）を含み、ＰｈａｒｍａｃｉａのＦＰＬＣシス
テムに連結したＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍｅカラム（４．６×１５０ｍｍ）にロード
した。ＴＦＦ後に得た乳清画分を緩衝液Ａ（１０ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ６．８）
で５倍希釈し、そして０．２ｍｌを緩衝液Ａで予め平衡化したカラムにロードし
た。流速は、２ｍｌ／分であった。ロードした後に、結合したタンパク質を、１
０カラム容積で、５００ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ６．８までの勾配を用いて溶出し
た。タンパク質は、２８０ｎｍでの吸光度を測定することによって検出した（フ
ローセルは２ｍｍ）。
【図９Ａ】 図９。ヒドロキシルアパタイトカラムからの乳清画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
。トランスジェニックおよび非トランスジェニックウサギ乳清を、図８で記載し
たようにＭａｃｒｏ−ＰｒｅｐセラミックヒドロキシルアパタイトＩ型カラムで
ロードした。フロースルー画分および溶出画分を得て、それをＳＤＳ−ＰＡＧＥ
で分析した（ゲルの詳細は図４を参照のこと）。Ａ．銀染色したヒドロキシルア
パタイトを行なったトランスジェニック乳清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。６μｇまでの
タンパク質をロードした。
。トランスジェニックおよび非トランスジェニックウサギ乳清を、図８で記載し
たようにＭａｃｒｏ−ＰｒｅｐセラミックヒドロキシルアパタイトＩ型カラムで
ロードした。フロースルー画分および溶出画分を得て、それをＳＤＳ−ＰＡＧＥ
で分析した（ゲルの詳細は図４を参照のこと）。Ａ．銀染色したヒドロキシルア
パタイトを行なったトランスジェニック乳清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。６μｇまでの
タンパク質をロードした。
【図９Ｂ】 図９。ヒドロキシルアパタイトカラムからの乳清画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
。トランスジェニックおよび非トランスジェニックウサギ乳清を、図８で記載し
たようにＭａｃｒｏ−ＰｒｅｐセラミックヒドロキシルアパタイトＩ型カラムで
ロードした。フロースルー画分および溶出画分を得て、それをＳＤＳ−ＰＡＧＥ
で分析した（ゲルの詳細は図４を参照のこと）。Ｂ．銀染色した非トランスジェ
ニック乳清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。６μｇまでのタンパク質をロードした。
。トランスジェニックおよび非トランスジェニックウサギ乳清を、図８で記載し
たようにＭａｃｒｏ−ＰｒｅｐセラミックヒドロキシルアパタイトＩ型カラムで
ロードした。フロースルー画分および溶出画分を得て、それをＳＤＳ−ＰＡＧＥ
で分析した（ゲルの詳細は図４を参照のこと）。Ｂ．銀染色した非トランスジェ
ニック乳清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。６μｇまでのタンパク質をロードした。
【図１０】 図１０は、トランスジェニック乳清サンプルのヒドロキシルアパタイトクロマ
トグラフィー分離のクロマトグラムである。ここで、このサンプルを５ｍＭの濃
度のリン酸ナトリウム緩衝液（ＮａＰｉ）でカラムにロードした。緩衝液のｐＨ
は７．０であった。クロマトグラムはリン酸ナトリウム溶出緩衝液の４００ｍＭ
までの勾配、溶出物のＡ280およびｐＨ、ならびに回収した画分を示す。
トグラフィー分離のクロマトグラムである。ここで、このサンプルを５ｍＭの濃
度のリン酸ナトリウム緩衝液（ＮａＰｉ）でカラムにロードした。緩衝液のｐＨ
は７．０であった。クロマトグラムはリン酸ナトリウム溶出緩衝液の４００ｍＭ
までの勾配、溶出物のＡ280およびｐＨ、ならびに回収した画分を示す。
【図１１】 図１１は、トランスジェニック乳清サンプルのヒドロキシルアパタイトクロマ
トグラフィー分離のクロマトグラムである。ここで、このサンプルを１０ｍＭの
濃度のリン酸ナトリウム緩衝液（ＮａＰｉ）でカラムにロードした。緩衝液のｐ
Ｈは７．０であった。クロマトグラムはリン酸ナトリウム溶出緩衝液の４００ｍ
Ｍまでの勾配、溶出物のＡ280およびｐＨ、ならびに回収した画分を示す。
トグラフィー分離のクロマトグラムである。ここで、このサンプルを１０ｍＭの
濃度のリン酸ナトリウム緩衝液（ＮａＰｉ）でカラムにロードした。緩衝液のｐ
Ｈは７．０であった。クロマトグラムはリン酸ナトリウム溶出緩衝液の４００ｍ
Ｍまでの勾配、溶出物のＡ280およびｐＨ、ならびに回収した画分を示す。
【図１２】 図１２は、トランスジェニック乳清サンプルのヒドロキシルアパタイトクロマ
トグラフィー分離のクロマトグラムである。ここで、このサンプルを２０ｍＭの
濃度のリン酸ナトリウム緩衝液（ＮａＰｉ）でカラムにロードした。緩衝液のｐ
Ｈは７．０であった。クロマトグラムはリン酸ナトリウム溶出緩衝液の４００ｍ
Ｍまでの勾配、溶出物のＡ280およびｐＨ、ならびに回収した画分を示す。
トグラフィー分離のクロマトグラムである。ここで、このサンプルを２０ｍＭの
濃度のリン酸ナトリウム緩衝液（ＮａＰｉ）でカラムにロードした。緩衝液のｐ
Ｈは７．０であった。クロマトグラムはリン酸ナトリウム溶出緩衝液の４００ｍ
Ｍまでの勾配、溶出物のＡ280およびｐＨ、ならびに回収した画分を示す。
【図１３】 図１３は、トランスジェニック乳清サンプルのヒドロキシルアパタイトクロマ
トグラフィー分離のクロマトグラムである。ここで、このサンプルを３０ｍＭの
濃度のリン酸ナトリウム緩衝液（ＮａＰｉ）でカラムにロードした。緩衝液のｐ
Ｈは７．０であった。クロマトグラムはリン酸ナトリウム溶出緩衝液の４００ｍ
Ｍまでの勾配、溶出物のＡ280およびｐＨ、ならびに回収した画分を示す。
トグラフィー分離のクロマトグラムである。ここで、このサンプルを３０ｍＭの
濃度のリン酸ナトリウム緩衝液（ＮａＰｉ）でカラムにロードした。緩衝液のｐ
Ｈは７．０であった。クロマトグラムはリン酸ナトリウム溶出緩衝液の４００ｍ
Ｍまでの勾配、溶出物のＡ280およびｐＨ、ならびに回収した画分を示す。
【図１４】 図１４は、トランスジェニック乳清サンプルのヒドロキシルアパタイトクロマ
トグラフィー分離のクロマトグラムである。ここで、このサンプルを４０ｍＭの
濃度のリン酸ナトリウム緩衝液（ＮａＰｉ）でカラムにロードした。緩衝液のｐ
Ｈは７．０であった。クロマトグラムはリン酸ナトリウム溶出緩衝液の４００ｍ
Ｍまでの勾配、溶出物のＡ280およびｐＨ、ならびに回収した画分を示す。
トグラフィー分離のクロマトグラムである。ここで、このサンプルを４０ｍＭの
濃度のリン酸ナトリウム緩衝液（ＮａＰｉ）でカラムにロードした。緩衝液のｐ
Ｈは７．０であった。クロマトグラムはリン酸ナトリウム溶出緩衝液の４００ｍ
Ｍまでの勾配、溶出物のＡ280およびｐＨ、ならびに回収した画分を示す。
【図１５】 図１５は、トランスジェニック乳清サンプルのヒドロキシルアパタイトクロマ
トグラフィー分離のクロマトグラムである。ここで、このサンプルを５０ｍＭの
濃度のリン酸ナトリウム緩衝液（ＮａＰｉ）でカラムにロードした。緩衝液のｐ
Ｈは７．０であった。クロマトグラムはリン酸ナトリウム溶出緩衝液の４００ｍ
Ｍまでの勾配、溶出物のＡ280およびｐＨ、ならびに回収した画分を示す。
トグラフィー分離のクロマトグラムである。ここで、このサンプルを５０ｍＭの
濃度のリン酸ナトリウム緩衝液（ＮａＰｉ）でカラムにロードした。緩衝液のｐ
Ｈは７．０であった。クロマトグラムはリン酸ナトリウム溶出緩衝液の４００ｍ
Ｍまでの勾配、溶出物のＡ280およびｐＨ、ならびに回収した画分を示す。
【図１６】 図１６は、サンプルのｐＨは変化したが、ＮａＰｉ緩衝液の濃度は５ｍＭのま
まであったことを除いて、上記の図１０から１５と同様のヒドロキシルアパタイ
トクロマトグラフィー分離のクロマトグラムである。分画したサンプルのｐＨは
、６．０であった。
まであったことを除いて、上記の図１０から１５と同様のヒドロキシルアパタイ
トクロマトグラフィー分離のクロマトグラムである。分画したサンプルのｐＨは
、６．０であった。
【図１７】 図１７は、サンプルのｐＨは変化したが、ＮａＰｉ緩衝液の濃度は５ｍＭのま
まであったことを除いて、上記の図１０から１５と同様のヒドロキシルアパタイ
トクロマトグラフィー分離のクロマトグラムである。分画したサンプルのｐＨは
、６．５であった。
まであったことを除いて、上記の図１０から１５と同様のヒドロキシルアパタイ
トクロマトグラフィー分離のクロマトグラムである。分画したサンプルのｐＨは
、６．５であった。
【図１８】 図１８は、サンプルのｐＨは変化したが、ＮａＰｉ緩衝液の濃度は５ｍＭのま
まであったことを除いて、上記の図１０から１５と同様のヒドロキシルアパタイ
トクロマトグラフィー分離のクロマトグラムである。分画したサンプルのｐＨは
、７．０であった。
まであったことを除いて、上記の図１０から１５と同様のヒドロキシルアパタイ
トクロマトグラフィー分離のクロマトグラムである。分画したサンプルのｐＨは
、７．０であった。
【図１９】 図１９は、サンプルのｐＨは変化したが、ＮａＰｉ緩衝液の濃度は５ｍＭのま
まであったことを除いて、上記の図１０から１５と同様のヒドロキシルアパタイ
トクロマトグラフィー分離のクロマトグラムである。分画したサンプルのｐＨは
、７．５であった。
まであったことを除いて、上記の図１０から１５と同様のヒドロキシルアパタイ
トクロマトグラフィー分離のクロマトグラムである。分画したサンプルのｐＨは
、７．５であった。
【図２０】 図２０はＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦにおけるトランスジェニック乳汁の乳
清の、産業的（試験的な）スケールの分離のクロマトグラムである。
清の、産業的（試験的な）スケールの分離のクロマトグラムである。
【図２１】 図２１は、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムからの０．１Ｍ溶出物の、ヒ
ドロキシルアパタイトカラムクロマトグラフィーのクロマトグラムである。
ドロキシルアパタイトカラムクロマトグラフィーのクロマトグラムである。
【図２２】 図２２は、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦの０．１Ｍ溶出物の、一連のヒドロ
キシルアパタイトクロマトグラフィー分離からの、フロースルー画分の銀染色し
たＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。
キシルアパタイトクロマトグラフィー分離からの、フロースルー画分の銀染色し
たＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 19/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (71)出願人 Ａｒｃｈｉｍｅｄｅｓｗｅｇ ４， 2333 ＣＮ Ｌｅｉｄｅｎ， Ｔｈｅ Ｎｅｔ ｈｅｒｌａｎｄｓ (72)発明者 ウェッヘマン， ミランダ オランダ国 エヌエル−2665 デーエム ブライスウィク， ハイドールン 19 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA12 BA80 CA02 DA02 HA03 4B050 CC03 DD11 EE10 FF03E FF05E FF09E FF11E FF12E FF13E FF14E LL01 LL03 LL05 4B064 AG01 CA10 CA19 CC01 CC24 CE09 DA01 DA13 4D017 AA09 AA11 BA04 BA07 CA13 DA03 EA01
Claims (36)
- 【請求項１】 ヒト酸性α−グルコシダーゼ精製の方法であって、以下： ａ）ヒト酸性α−グルコシダーゼおよび混入するタンパク質を含有するサンプル
を、α−グルコシダーゼがカラムに結合する条件下で陰イオン交換カラムに適用
する工程； ｂ）該陰イオン交換カラムまたはアフィニティーカラムからα−グルコシダーゼ
の濃縮された溶出液を収集する工程； ｃ）該溶出液を以下、 （ｉ）α−グルコシダーゼが該カラムに結合する条件下で疎水性相互作用カラ
ムに適用し、次いで、α−グルコシダーゼのさらに濃縮されたさらなる溶出液を
収集する工程、または （ｉｉ）α−グルコシダーゼがヒドロキシルアパタイトに結合しない条件下で
該溶出液をヒドロキシルアパタイトに接触させ、次いでα−グルコシダーゼの濃
縮された未結合の画分を収集する工程 に適用する工程、を含む方法。 - 【請求項２】 前記陰イオン交換カラムがＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅである、
請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 請求項２に記載の方法であって、ここで前記サンプルは、低
塩緩衝液中で前記Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに適用され、そしてより高い塩
濃度の溶出緩衝液で該カラムから溶出される、方法。 - 【請求項４】 前記陰イオン交換カラムが銅キレート化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
である、請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 前記アフィニティーカラムがレンチルＳｅｐｈａｒｏｓｅで
ある、請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】 前記疎水性相互作用カラムがフェニルＳｅｐｈａｒｏｓｅで
ある、請求項１に記載の方法。 - 【請求項７】 前記疎水性相互作用カラムがＳｏｕｒｃｅ Ｐｈｅｎｙｌ１
５である、請求項１に記載の方法。 - 【請求項８】 請求項７に記載の方法であって、ここで前記溶出液が約０．
５Ｍの硫酸アンモニウムの添加緩衝液中で前記疎水性相互作用カラムに適用され
、そして低塩溶出緩衝液で該カラムから溶出される、方法。 - 【請求項９】 請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法であって、該方法
は、α−グルコシダーゼが９５重量％、好ましくは９９重量％、より好ましくは
９９．９重量％の純度に精製されるまで工程（ａ）および（ｂ）および／または
（ｃ）を反復する工程をさらに含む、方法。 - 【請求項１０】 請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法であって、ここ
で前記サンプルが乳中でα−グルコシダーゼを発現するトランスジェニック哺乳
動物により産生される乳である、方法。 - 【請求項１１】 前記トランスジェニック動物が雌ウシである、請求項１０
に記載の方法。 - 【請求項１２】 前記トランスジェニック動物がウサギである、請求項１０
に記載の方法。 - 【請求項１３】 請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法であって、
前記乳を遠心分離する工程およびスキムミルクを残して脂肪を除去する工程をさ
らに含む、方法。 - 【請求項１４】 請求項１３に記載の方法であって、除去された脂肪を水溶
液で洗浄する工程、再遠心分離する工程、脂肪を除去する工程、およびスキムミ
ルクを有する上清をプールする工程をさらに含む、方法。 - 【請求項１５】 前記スキムミルクからカゼインを除去する工程をさらに含
む、請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１６】 請求項１５に記載の方法であって、ここでカゼインを除去
する前記工程は、以下： 高速の遠心分離に続く濾過； 連続的に減少するフィルターサイズを用いる濾過；および 直交流（ｃｒｏｓｓ−ｆｌｏｗ）濾過； からなる群から選択される工程を含む、方法。 - 【請求項１７】 前記サンプルが少なくとも１００リットルの容量を有する
、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１８】 少なくとも９５重量％、好ましくは少なくとも９９重量％
、より好ましくは少なくとも９９．９重量％純粋なヒト酸性α−グルコシダーゼ
。 - 【請求項１９】 実質的に他の生物学的物質を含まない、ヒト酸性α−グル
コシダーゼ。 - 【請求項２０】 実質的に混入物を含まない、ヒト酸性α−グルコシダーゼ
。 - 【請求項２１】 請求項１〜１９のいずれか１項に記載のプロセスにより生
成される請求項１８〜２０のいずれか１項に記載のヒト酸性α−グルコシダーゼ
。 - 【請求項２２】 少なくとも９５重量％、好ましくは少なくとも９９重量％
、より好ましくは少なくとも９９．９重量％純粋なヒト酸性α−グルコシダーゼ
を少なくとも５ｍｇ／ｋｇ含む単回投薬量の静脈内投与のための薬学的組成物。 - 【請求項２３】 請求項１８〜２１のいずれか１項に記載のヒト酸性α−グ
ルコシダーゼを含む薬学的組成物。 - 【請求項２４】 薬品としての使用のための請求項１８〜２１のいずれか１
項に記載のヒト酸性α−グルコシダーゼ。 - 【請求項２５】 内因性α−グルコシダーゼを欠失する患者を処置する方法
であって、該方法は、少なくとも９５重量％、好ましくは少なくとも９９重量％
、より好ましくは少なくとも９９．９重量％純粋なヒト酸性α−グルコシダーゼ
の少なくとも５ｍｇ／ｋｇの投薬量を該患者に静脈内投与する工程を包含し、こ
れにより該α−グルコシダーゼが該患者の肝臓細胞、心臓細胞および／または筋
肉細胞に取り込まれる、方法。 - 【請求項２６】 ヒト酸性α−グルコシダーゼ欠損の処置のための医薬の製
造のための、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載のヒト酸性α−グルコシダ
ーゼの使用。 - 【請求項２７】 ヒト酸性α−グルコシダーゼ欠損の処置のための静脈内投
与のための医薬の製造のための、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載のヒト
酸性α−グルコシダーゼの使用。 - 【請求項２８】 トランスジェニック動物の前記乳から異種タンパク質を精
製する方法であって、以下： ａ）異種タンパク質以外の乳タンパク質種の少なくともかなり多くがヒドロキシ
ルアパタイトに結合し、そして異種タンパク質が実質的に未結合のままである条
件下で、前記トランスジェニック乳またはトランスジェニック乳画分をヒドロキ
シルアパタイトに接触させる工程、および； ｂ）該実質的に未結合の異種タンパク質を取り出す工程、 を含む、方法。 - 【請求項２９】 請求項２８に記載の方法であって、ここで前記実質的に未
結合の異種タンパク質の取り出しがヒドロキシルアパタイトの少なくとも一部を
通じる液流を含む、方法。 - 【請求項３０】 前記液流がポンピング、吸引、重力および遠心力から選択
される１つ以上の力に起因して生じる、請求項２９に記載の方法。 - 【請求項３１】 バッチ手順である、請求項２８〜３０のいずれか１項に記
載の方法。 - 【請求項３２】 請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の方法であって、
ここで前記ヒドロキシルアパタイトがカラムの形態であり、該方法は、必要に応
じて液体カラムクロマトグラフィー手順である、方法。 - 【請求項３３】 請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の方法であって、
ここで前記異種タンパク質が、ラクトフェリン、トランスフェリン、ラクトアル
ブミン、第ＩＸ因子、成長ホルモン、α抗トリプシン、ラクトフェリン、トラン
スフェリン、ラクトアルブミン、凝集因子（第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子）
、成長ホルモン、α抗トリプシン、血漿タンパク質（例えば、血清アルブミン、
Ｃ１エステラーゼインヒビターおよびフィブリノーゲン）、コラーゲン、免疫グ
ロブリン、組織プラスミノーゲンアクチベータ、インターフェロン、インターロ
イキン、ペプチドホルモン、ならびにリソソームタンパク質（α−グルコシダー
ゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ（α−Ｌ−ｉｄｕｒｏｎｏｄａｓｅ）、硫酸イズロ
ネートスルファターゼ、ヘキソサミニダーゼＡおよびヘキソサミニダーゼＢ、ガ
ングリオシドアクチベータタンパク質、アリルスルファターゼＡおよびアリルス
ルファターゼＢ、イズロネートスルファターゼ、ヘパランＮ−スルファターゼ、
ガラクトセラミダーゼ、α−ガラクトシルセラミダーゼＡ、スフィンゴミエリナ
ーゼ、α−フコシダーゼ、α−マンノシダーゼ、アスパルチルグリコサミンアミ
ドヒドロラーゼ、酸性リパーゼ、Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グリコサミン−６−ス
ルフェートスルファターゼ、α−ガラクトシダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ
、β−グルクロニダーゼ、β−マンノシダーゼ、セラミダーゼ、ガラクトセレブ
ロシダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、および防御タンパク質）
ならびに対立遺伝子改変体、同族改変体または誘導改変体を含む他の改変体、な
らびにそれらのポリペプチドフラグメントから選択される、方法。 - 【請求項３４】 前記異種タンパク質が動物の前記乳に通常、見出されない
、請求項２８〜３３のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項３５】 ヒト酸性αグルコシダーゼを精製する方法であって、該方
法は、α−グルコシダーゼがヒドロキシルアパタイトに結合しない条件下で、ヒ
ト酸性α−グルコシダーゼおよび混入タンパク質を含むサンプルを該ヒドロキシ
ルアパタイトに接触させ、次いでα−グルコシダーゼの濃縮された未結合の画分
を収集する工程を含む、方法。 - 【請求項３６】 前記ヒドロキシルアパタイトがカラムの形態であり、そし
て前記未結合の画分がフロースルーを通じて収集される、請求項２８〜３５のい
ずれか１項に記載の方法。
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