WO2020022924A1 - Способ очистки имиглюцеразы - Google Patents

Способ очистки имиглюцеразы Download PDF

Info

Publication number
WO2020022924A1
WO2020022924A1 PCT/RU2018/000492 RU2018000492W WO2020022924A1 WO 2020022924 A1 WO2020022924 A1 WO 2020022924A1 RU 2018000492 W RU2018000492 W RU 2018000492W WO 2020022924 A1 WO2020022924 A1 WO 2020022924A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
imiglucerase
deglycosylation
sepharose
protein
purification
Prior art date
Application number
PCT/RU2018/000492
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Михаил Вадимович РАЗУМИХИН
Игорь Павлович ФАБРИЧНЫЙ
Тарас Алексеевич Горкун
Максим Александрович СМОЛОВ
Марина Семеновна ПАНТЮШЕНКО
Антон Николаевич МОРОЗОВ
Дмитрий Александрович ПОТЕРЯЕВ
Наталия Валерьевна СТРАТОНОВА
Равиль Авгатович ХАМИТОВ
Александр Михайлович ШУСТЕР
Original Assignee
Общество с ограниченной ответственностью "Международный Биотехнологический Центр "Генериум"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество с ограниченной ответственностью "Международный Биотехнологический Центр "Генериум" filed Critical Общество с ограниченной ответственностью "Международный Биотехнологический Центр "Генериум"
Priority to PCT/RU2018/000492 priority Critical patent/WO2020022924A1/ru
Publication of WO2020022924A1 publication Critical patent/WO2020022924A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/12—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)

Definitions

  • the invention relates to the field of medicine and biotechnology and can be used in the pharmaceutical industry.
  • a method for the controlled deglycosylation and purification of a recombinant glucocerebrosidase protein, which is used in long-term enzyme replacement therapy in patients with a diagnosis of Gaucher disease, is disclosed.
  • Gaucher disease is a hereditary autosomal recessive metabolic disease resulting from a deficiency of the lysosomal enzyme beta-glucocerebrosidase (GBA). This is the most common lysosomal disease. The highest prevalence is observed among Ashkenazi Jews (1 in 855 people), while among other populations it is 1 in 100 thousand.In Russia, the prevalence is 1 in 50 thousand, that is, about three thousand patients (1).
  • GBA Functional deficiency leads to the accumulation of the substrate of this enzyme, glucocerebroside, in the body, mainly in the liver, spleen and bone marrow.
  • the most common complications of Gaucher disease are osteoarticular lesions, which are the most common cause of disability and mortality in Gaucher disease.
  • There are three types of Gaucher disease. The most common type 1 is characterized by a wide range of manifestations due to cytopenia. Type 2 and type 3 are rare variants that manifest in childhood and are accompanied by neurological disorders.
  • Glucocerebrosidase replacement therapy is the most effective in this disease, which, in comparison with other drugs, brings the most significant results.
  • Alglucerase (GBA isolated from human placental material) was the first drug for enzymatic replacement therapy. The drug was produced under the name Glucerase. The next step was the creation of a recombinant protein, a mutant form of human beta-glucocerebrosidase with one amino acid substitution Arg495His (imiglucerase), expressed in a transformed CHO line (Chinese hamster ovary cells). A drug based on this protein is known as Cerezyme.
  • the main problem in obtaining imiglucerase is its complex glycosylation profile.
  • natural glucocerebrosidase is practically not able to penetrate into macrophages by the mechanism of interaction with their mannose receptors.
  • Recombinant imiglucerase has from one to nine structures Map 3 -> Map 9 and has a high affinity for mannose receptors on the surface of macrophages.
  • these mannose residues are “hidden” by other sugars and therefore, in order to obtain an active protein, CHO-expressed imiglucerase is subjected to further processing during isolation and purification using enzymes that change its glycosylation pattern.
  • the task of the claimed technical solution is to obtain pharmacopoeial quality imiglucerase by optimizing the stages of protein enzymatic processing and a multi-stage chromatographic purification scheme.
  • the problem is solved by developing a method for purification of imiglucerase, which combines the step of hydrophobic chromatography with deglycosylation of the target protein by enzymatic treatment with neuraminidase, p-1,4-galactosidase and b-N-acetylglucosaminidase, which proceeds in one stage.
  • the present invention relates to a method for deglycosylating an imiglucerase obtained in mammalian cells, characterized in that the treatment with neuraminidase, b-1, 4-galactosidase and bN-acetylglucosaminidase is carried out in one step.
  • the ratio of the enzymes of neuraminidase: b-1,4-galactosidase: bN-acetylglucosaminidase mixture is: 6 units: 1 unit: 14 units per 1 g of protein.
  • deglycosylation is carried out for 22-36 hours at room temperature.
  • deglycosylation is carried out during chromatographic purification of the target protein.
  • the present invention relates to a method for purification of imiglucerase obtained in mammalian cells, in which during the chromatographic purification is carried out deglycosylation of imiglucerase.
  • the method of purification of imiglucerase includes the following steps:
  • imiglucerase refers to a recombinant form of beta-glucocerebrosidase.
  • the term “pharmacopoeial quality protein” refers to the following criteria for its purity: not less than 99% of the basic substance (by reverse phase HPLC), not more than 4% of related impurities (by exclusion HPLC), specific activity of not less than 35 IU / mg , the residual protein content of the producer cell is not more than 50 ng / mg imiglucerase.
  • the proposed method for the isolation and purification of imiglucerase synthesized in CHO cells consists of several successive stages.
  • the culture fluid (QL) containing the target protein is applied to a Butyl Sepharose column (hydrophobic chromatography).
  • a Butyl Sepharose column hydrophobic chromatography
  • the prior art (. ANALYTICAL BIGCHEMISTRY 1986, 154, 655-663) is known to use an affinity sorbent to capture protein from the culture fluid, however, the impossibility of separating related impurities during its use, as well as the high cost of manufacturing such a sorbent, confirm the obvious advantages of using hydrophobic chromatography on the first stage of isolation.
  • cation-exchange chromatography on SP-sepharose is performed, which allows the main part of the residual impurity proteins of producer cells to be removed by salt washing and sparing elution of the target protein from the sorbent by increasing the pH.
  • the chromatographic purity of the target protein after the first two stages of purification reaches 96-98% on both reverse-phase and exclusion HPLC.
  • the fraction of the target protein from the third purification step is applied to the sorbent Pbep1-sepharose.
  • a controlled deglycosylation of the target protein is carried out using a mixture of three enzymes (neuraminidase, b-1, 4-galactosidase, bN-acetylglucosaminidase) to shorten the polysaccharide chains of the protein to the terminal mannose residues.
  • the minimum concentration of glycosidases in the reaction mixture (a decrease of more than 10 times in comparison with the known from the prior art), ensuring the completeness of the reaction and the process speed acceptable for commercial production, were selected.
  • the possibility of reuse of the optimized enzyme mixture without loss of deglycosylation efficiency has been confirmed. Due to the high cost of commercially available b glycosidases, the optimization performed can significantly reduce the cost of obtaining the target substance.
  • an additional endotoxin removal step can be introduced.
  • the target protein after deglycosylation, is washed with a buffer solution containing isopropanol before elution from the sorbent.
  • the partially deglycosylated protein obtained is then subjected to filtration through an anion-exchange sorbent ( ⁇ -sepharose to remove residual endotoxins and DNA of producer cells.
  • anion-exchange sorbent ⁇ -sepharose
  • the last stage of chromatographic purification is carried out on CM-Sepharose, performing the final purification of impurity proteins of producer cells and transferring the protein to the finished buffer.
  • the result is a substance with a chromatographic purity of at least 99% by reverse phase HPLC and a specific activity of about 40 IU / mg, which is then used to obtain the finished drug.
  • the total product yield after all stages of isolation is approximately 40%.
  • the key advantages of this method of isolation and purification of imiglucerase are the improvement and optimization of the most complex and expensive stage of protein deglycosylation due to the confirmed possibility of using a mixture of three glycosidases, which allows the protein glycosylation profile to be modified directly during chromatographic purification to activate its functional properties.
  • the developed technique makes it possible to obtain the active target protein of the highest degree of purity suitable for pharmaceutical use.
  • the ability to use the optimized enzyme mixture repeatedly allows you to significantly reduce the cost of manufacturing the final product.
  • the enzymatic activity of imiglucerase was measured using the chromogenic method using 4-nitrophenyl-B-B-glucopyranoside as a substrate.
  • the biological activity of the substance was confirmed by the ability of imiglucerase to internalize mytti in immune blood cells while maintaining the enzymatic activity detected by a more sensitive method with a fluorogenic substrate (4-methylumbelliferyl-P-0-glucopyranoside). It was shown that the target protein has the required specific activity (about 40 IU / mg) and effectively penetrates the cell, thereby confirming its full functionality.
  • the resulting protein is characterized by the following parameters: not less than 99% of the main substance (by reverse phase HPLC), not more than 4% of related impurities (by exclusion HPLC), specific activity of not less than 35 IU / mg, residual protein content of the producer cell not more than 50 ng / mg imiglucerase.
  • FIG. Figure 1 shows an HPLC analysis of the structure of glycans of imiglucerase. The three main peaks correspond to Man 3 GlcNAc 2 , Man 3 (Fucal -> 3) GlcNAc 2, and
  • GlcNAcMan 3 (Fucal—> 3) GlcNAc 2 , confirming the effectiveness of the enzymatic treatment and the presence of at least one terminal mannose in the overwhelming number of glycans of imiglucerase.
  • the gene encoding imiglucerase was synthesized using codons optimized for expression in rodent cells (Chinese hamster).
  • the amino acid sequence of the protein was taken from the base UniProt data (UniProtKB - P04062 (GLCM_HUMAN).
  • the imiglucerase gene contained a signal peptide that directs the protein molecule along the secretory pathway.
  • the signal peptide was taken from the sequence of human blood coagulation factor FVII. After passing through the endoplasmic reticulum the signal peptide is cleaved from the imiglucerase polypeptide.
  • the imiglucerase gene was cloned into plasmid vectors for expression in mammalian cells under the control of a strong promoter and expressed in CHO cells (Chinese hamster ovary cell line). Two constructed vectors contained the identical gene, but were resistant to selective antibiotic.
  • the pMS590 vector carried the puromycin resistance gene
  • the pMS59l vector carried the hygromycin resistance gene, which ensured the resistance of the transfected cell line to selective antibiotics.
  • Expression was accomplished by introducing pMS590 pMS591 expression plasmids based on the modified pUCl8 plasmid into the host cell line by transfection of cells.
  • the host cell line was a subclone of the Chinese hamster CHO-K1 ovary cell line, adapted to be grown in suspension in a nutrient medium containing no animal blood serum. Electroporation was used as a transfection method, as a result of which, the introduced sequence was stably integrated into the host genome.
  • the cell suspension was diluted and dispersed in such a way as to isolate populations grown from single cells, i.e. cell clones. After isolation, clones were grown to a state of confluence, and the content of the target protein in the supernatant was evaluated by enzyme-linked immunosorbent assay and Western blotting. Cell clones secreting high-level b-glucocerebrosidase were propagated and stored by cryopreservation.
  • Example 2 Cultivation of producer cells.
  • the cultivation of a cell clone stably producing the target protein was carried out for at least 20 days in a continuous (perfusion) mode in a disposable wave-type bioreactor with an integrated perfusion membrane.
  • SFM4CHO basic nutrient medium
  • SAFC CHOFeedBioreactorSupplement
  • the cultivation temperature was 37 ° C in the phase of exponential growth and 32 ° C in the production phase.
  • the flow rate of the nutrient medium reached one bioreactor volume per day.
  • the culture fluid separated from the cells was transferred once a day for chromatographic purification.
  • the cultivation process was completed after a decrease in cell viability below 80%.
  • Sodium chloride was added to a culture fluid containing recombinant imiglucerase to a concentration of 0.5 M.
  • the sorbent was balanced with a buffer solution of 50 MMTris-HCl, 0.5 M NaCl, 10% ethylene glycol (pH 7.2), and then the culture fluid was applied. At the end of the application, the sorbent was washed successively with several volumes of buffer solutions of the following composition:
  • the eluate from Butyl-Sepharose was diluted twice with a solution of 20 mM sodium acetate (pH 5.0) and applied to a sorbent previously equilibrated with buffer A solution of the composition of 20 mm sodium acetate, 25 mm sodium chloride, 10% ethylene glycol (pH 5.0).
  • Example 5 Chromatography on an sorbent IMAC Sepharose.
  • the sorbent was saturated with Zn 2+ nyreM ions of successive washes with water, a solution of 0.2 M zinc chloride, water, and then balanced with a buffer solution of 20 mM sodium phosphate, 0.1 M sodium chloride, 20% ethylene glycol (pH 7.0).
  • the eluate with SP-Sepharose was applied to the sorbent and at the end of the application, successive washes were performed with buffer solutions of the following composition:
  • Example 6 Chromatography on a sorbent Phenyl Sepharose and enzymatic treatment.
  • the eluate with IMAC-Sepharose was diluted 5 times with a solution of 50 mM sodium phosphate (pH 7.5) and applied to a sorbent previously equilibrated with a buffer solution of 50 mM sodium phosphate, 0.5 M sodium chloride, 5% ethylene glycol (pH 7.5) .
  • the sorbent was washed successively with buffer solutions of the following composition: • 50 mM sodium phosphate, 0.5 M sodium chloride, 5% ethylene glycol (pH 7.5);
  • the volume of the reaction mixture was 110% of the column volume; the enzyme composition of the mixture was calculated from
  • the reaction mixture for deglycosylation was passed through the sorbent in a recirculation mode with a linear speed of 90 cm / h for ⁇ 22-36 hours. After hydrolysis of the oligosaccharide chains, the reaction mixture was collected and stored at 4 ° C (stability for at least two weeks was shown) for reuse.
  • the sorbent was washed with a buffer solution of 50 mM sodium citrate, 10% isopropanol (pH 5.7).
  • the target protein with an optimized glycosylation profile was eluted with a buffer solution containing 40 mM sodium phosphate, 55% propylene glycol (pH 7.5). The eluate was collected and transferred to the next purification step.
  • Example 7 Chromatography on a sorbent Q Sepharose.
  • the Phenyl-Sepharose eluate was diluted 2 times with a solution of 100 mM sodium phosphate (pH 7.5) and applied to a sorbent previously balanced with a buffer solution of 50 mM sodium phosphate, 10% ethylene glycol (pH 7.5). This stage was carried out in the filtration mode; after application of the target protein fraction, the sorbent was washed with equilibration buffer. The filtrate was collected and transferred to the next purification step.
  • Example 8 Chromatography on a sorbent CM Sepharose.
  • the target protein was eluted with a buffer solution containing 55 mM sodium citrate, 0.01% polysorbate-80 (pH 6.3). To prepare the finished substance, the missing components of the final formulation were introduced into the resulting imiglucerase solution in dry form.
  • Example 9 Determination of the carbohydrate structure of imiglucerase.
  • a reagent for fluorescent labeling of oligosaccharides was prepared by sequentially dissolving 1 ⁇ g of 2-aminobenzoic acid and 1.25 ⁇ g of sodium cyanoborohydride in 21 ⁇ l of a mixture of dimethyl sulfoxide and acetic acid. Samples of the oligosaccharide mixture were dissolved in 3 ⁇ l of deionized water, and then 10 ⁇ l of the labeling reagent was added. The reaction mixture was incubated for 3 hours at + 45 ° C. Excess dye was removed by solid phase extraction on LudgerClean TM T1 Cartridge Kit (Ludger) columns according to the recommended protocol. Samples were evaporated to a volume of about 50 ⁇ l and used for analysis.
  • Fig. 1 Chromatographic analysis was performed on an Alliance HPLC instrument (Waters) using a high-resolution hydrophilic HPLC column TSKgel Amide-80 (Tosoh Bioscience) with TSKguardgel Amide-80 pre-column. Separation was carried out at a column temperature of 45 ° C in the gradient of the mobile phase (solution of ammonium formate with acetonitrile). The signal was detected by fluorescence at 425 nm upon excitation with light of 360 nm.
  • Example 10 Determination of the biological activity of the obtained protein and the ability of its internalization in the cell.
  • the enzymatic activity of imiglucerase was measured by the chromogenic method with 4-nitrophenyl-B-0-glucopyranoside as a substrate.
  • a four-fold volume of a 10 mM substrate solution was added to the test sample in several dilutions and incubated for 15 min at 37 ° C, after which the reaction was stopped by the addition of eight volumes of an OD M glycine solution.
  • the optical density of the solutions was measured on a spectrophotometer at the absorption maximum at a wavelength of 400 nm. The activity was determined based on the fact that one unit of activity corresponds to the hydrolysis of one ⁇ mol of substrate / min at a temperature of 37 ° C.
  • the biological functionality of imiglucerase was determined by the ability of the studied protein samples to be internalized into mouse peritoneal macrophages (monocytes) in the presence or absence of yeast mannan, followed by detection of the enzymatic activity of internalized imiglucerase in the cell lysate.
  • a pool of murine cells containing peritoneal macrophages was pelleted by centrifugation followed by resuspension of the cell pellet in DMEM / F12 culture medium with 10% bovine serum, 2 mM glutamine and penicillin-streptomycin. The resulting cells were seeded in a 6 well plate in an amount of 7 million / well. At the end of an hour and a half incubation, adherent peritoneal macrophage cells were washed twice with medium, followed by the addition of 2 ml of fresh medium to each well. Aliquots of the studied imiglucerase samples were added to the cells to a concentration of 100 ⁇ g / ml.
  • the enzyme activity of imiglucerase in the cell lysate was determined by the fluorogenic method: under the influence of imiglucerase, the synthetic substrate (4-methylumbelliferyl-R-B-glucopyranoside) is cleaved with the formation of the fluorescent substance 4-methylumbelliferone.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к медицине и биотехнологии и может быть использовано в фармацевтической промышленности. Предложенное техническое решение представляет собой способ выделения и очистки имиглюцеразы, которая применяется при длительной фермент-замещающей терапии у пациентов с диагнозом болезнь Гоше. Предложенный способ очистки включает этап дегликозилирования имиглюцеразы, который проводится в одну стадию с использованием смеси ферментов.

Description

СПОСОБ ОЧИСТКИ ИМИГЛЮЦЕРАЗЫ
Изобретение относится к области медицины и биотехнологии и может быть использовано в фармацевтической промышленности. Раскрыт способ контролируемого дегликозилирования и очистки рекомбинантного белка глюкоцереброзидазы, который применяется при длительной фермент-замещающей терапии у пациентов с диагнозом болезнь Гоше.
Болезнь Гоше — наследственное аутосомно-рецессивное метаболическое заболевание, возникающее вследствие дефицита лизосомального фермента бета- глюкоцереброзидазы (GBA). Это самое частое лизосомальное заболевание. Наибольшая распространенность отмечается среди евреев Ашкенази (1 на 855 человек), тогда как среди других популяций она составляет 1 на 100 тыс. В России распространенность составляет 1 на 50 тыс., то есть, приблизительно, около трех тысяч пациентов (1).
Функциональная недостаточность GBA приводит к накоплению субстрата этого фермента, глюкоцереброзида, в организме, преимущественно в печени, селезенке и костном мозге. Наиболее частыми осложнениями болезни Гоше являются костно-суставные поражения, которые являются наиболее частой причиной инвалидности и смертности при болезни Гоше. Существует три типа болезни Гоше. Наиболее распространенный - тип 1, характеризуется широким спектром проявлений, обусловленных цитопенией. Тип 2 и тип 3 - редкие варианты, проявляются в детском возрасте и сопровождаются неврологическими расстройствами. Наиболее эффективна при данном заболевании заместительная терапия глюкоцереброзидазой, которая, в сравнении с другими препаратами, приносит наиболее существенные результаты.
Первым препаратом для ферментативной заместительной терапии была альглюцераза (GBA, выделенная из плацентарного материала человека). Препарат выпускался под названием Глуцераза. Следующим шагом было создание рекомбинантного белка, мутантной формы бета-глюкоцереброзидазы человека с одной аминокислотной заменой Arg495His (имиглюцераза), экспрессированного в трансформированной линии СНО (клетки яичников китайского хомячка). Лекарственное средство на основе этого белка известно под названием Церезим.
Основной проблемой при получении имиглюцеразы является ее сложный профиль гликозилирования. В природной глюкоцереброзидазе имеется 4 сайта гликозилирования, при этом, боковые цепи не содержат концевых манноз. В связи с этим, природная глюкоцереброзидаза практически не способна к проникновению в макрофаги по механизму взаимодействия с их маннозными рецепторами. Рекомбинантная имиглюцераза имеет от одной до девяти структур Мап3— > Мап9 и обладает большим сродством к маннозным рецепторам на поверхности макрофагов. Однако, указанные остатки маннозы «скрыты» другими сахарами и поэтому, чтобы получить активный белок, СНО-экспрессированную имиглюцеразу подвергают в ходе выделения и очистки дальнейшему процессингу с использованием ферментов, изменяющих её паттерн гликозилирования.
Для решения этой задачи в статье Furbish с сотр. (BiochimicaetBiophysicaActa, 1981, 673, 425-434) применялась последовательная обработка белка нейраминидазой, галактозидазой и b-N-ацетилглюкозаминидазой, для удаления, соответственно, остатков сиаловой кислоты, галактозы и N-ацетилглюкозамина. Эти несколько этапов ферментативной обработки позволяют высвободить значительное число маннозных остатков таким образом, чтобы боковые цепи гликанов преимущественно оканчивались остатками маннозы. Результирующая углеводная структура имиглюцеразы отличается от таковой глюкоцереброзидазы, что- обеспечивает существенно большее время полужизни in vivo и более высокое сродство к маннозным рецепторам на поверхности человеческих клеток.
Однако такая последовательная обработка ферментами, хотя и позволяет получить активный белок, не очень эффективна, поскольку существует риск неполного гидролиза соответствующих моносахаридных звеньев одним из ферментов, что блокирует функцию последующих ферментов. Таким образом, данный подход требует продолжительного времени, больших количеств ферментов и в итоге оказывается весьма дорогостоящим, что, в конечном счете, значительно увеличивает стоимость полученного белка. Поэтому задача разработки новых, более экономичных и эффективных, способов выделения и очистки биологически активной глюкоцереброзидазы сохраняется.
Известны различные способы очистки глюкоцереброзидазы с использованием комбинаций хроматографических методов, а также стадий осаждения и экстракции. Однако, часть из них относится к очистке белка, выделенного из плаценты (например, J. Biol. Chem. 1973, 248, 5256-5261 ; Р. N. A. S.1977, 74, 3560-3563; ANALYTICAL BIGCHEMISTRY 1986, 154,655-663 ;CAN. J. BIOCHEM.1982, 60,1025-1031 и т.п.), то есть такие способы не учитывают особенностей белка, полученного рекомбинантным способом, и, как правило, имеют довольно низкие выходы (около 30%). Более современные способы очистки разработаны для глюкоцереброзидазы, в которой в силу различных причин не требуется проводить контролируемое дегликозилирование, например, для белков, содержащих мутации (как в способе, описанном в WO2011119115) или полученных в специально созданной линии клеток (например, Plant Biotechnology Journal 2007,5, 579-590).
Наиболее близким к заявленному можно считать способ выделения и очистки глюкоцереброзидазы, использованный в патенте US5549892. Способ включает очистку полученного в клетках СНО белка и последовательную обработку его ферментами, в соответствии с методикой, описанной в статье Furbish (см. выше). Однако детали способа очистки в патенте не раскрыты.
Таким образом, хотя известны различные способы очистки глюкоцереброзидазы и способ ферментативного отщепления остатков сахаров, из уровня техники не известен удобный и эффективный метод, объединяющий эти этапы и позволяющий получить продукт, пригодный далее для создания лекарственного препарата.
Задача, заявленного технического решения, получение имиглюцеразы фармакопейного качества, путем оптимизации этапов ферментативной обработки белка и многостадийной схемы хроматографической очистки.
Поставленная задача решается за счет разработки способа очистки имиглюцеразы, который совмещает этап гидрофобной хромотографии с дегликозилированием целевого белка за счет ферментативной обработки нейраминидазой, р-1,4-галактозидазой и b-N-ацетилглюкозаминидазой, проходящей в одну стадию.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу дегликозилирования имиглюцеразы, полученной в клетках млекопитающих, отличающемуся тем, что обработка нейраминидазой, b- 1 ,4-галактозидазой и b-N- ацетилглюкозаминидазой проводится в одну стадию. В предпочтительном варианте соотношение ферментов нейраминидазы: b-1,4- галактозидазы: b-N-ацетилглюкозаминидазыв смеси составляет: 6 Ед:1Ед:14 Ед в расчете на 1 г белка.
В предпочтительном варианте дегликозилирование проводится в течение 22-36 часов при комнатной температуре.
В предпочтительном варианте дегликозилирование проводится в ходе хроматографической очистки целевого белка.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу очистки имиглюцеразы, полученной в клетках млекопитающих, при котором в ходе хроматографической очистки проводится дегликозилирование имиглюцеразы.
В предпочтительном варианте способ очистки имиглюцеразы включает следующие стадии:
а) гидрофобную хроматографию на Butyl-сефарозе,
б) катионный обмен на SP-сефарозе,
в) металло-хелатную хроматографию на 1МАС-сефарозе,
г) гидрофобную хроматографию на Phenyl-сефарозе, совмещенную с дегликозилированием целевого белка по любому из пп.1-4,
д) фильтрацию через ()-сефарозу,
е) катионный обмен на СМ-сефарозе.
Используемый в настоящем документе термин «имиглюцераза» обозначает рекомбинантную форму бета-глюкоцереброзидазы.
Используемый в настоящем документе термин «белок фармакопейного качества» обозначает следующие критерии его чистоты: не менее 99% основного вещества (по обрашенно-фазовой ВЭЖХ), не более 4% родственных примесей (по эксклюзионной ВЭЖХ), удельная активность не менее 35 МЕ/мг, содержание остаточных белков клетки-продуцента не более 50 нг/мг имиглюцеразы.
Предлагаемый способ выделения и очистки имиглюцеразы, синтезируемой в клетках СНО, состоит из нескольких последовательных стадий.
После культивирования рекомбинантного клона-продуцента культуральную жидкость (КЖ), содержащую целевой белок, наносят на колонку с Butyl-сефарозой (гидрофобная хроматография). На данной стадии происходит первичный захват белка, а применение нескольких промывок, содержащих этиленгликоль, позволяет удалить основные родственные примеси имиглюцеразы. Из уровня техники (. ANALYTICAL BIGCHEMISTRY 1986, 154, 655-663 ) известно применение аффинного сорбента для захвата белка из культуральной жидкости, однако невозможность отделения родственных примесей при его использовании, а также высокая стоимость изготовления такого сорбента, подтверждают очевидные преимущества применения гидрофобной хроматографии на первой стадии выделения.
На второй стадии очистки проводится катионообменная хроматография на SP- сефарозе, позволяющая удалить основную часть Остаточных примесных белков клеток-продуцентов за счет солевой промывки и щадящей элюции целевого белка с сорбента путем увеличения pH. Хроматографическая чистота целевого белка после первых двух стадий очистки достигает 96-98 % как на обращенно-фазовой, так и на эксклюзионной ВЭЖХ.
В целях дальнейшего увеличения чистоты целевого белка до 98-99%, для его использования в качестве фармацевтической субстанции, на третьем этапе очистки используется цинк-хелатная хроматография на IMAC-сефарозе со специфической элюцией имиглюцеразы комбинированным буферным раствором с высоким содержанием хлорида натрия и этиленгликоля. В результате получается высокоочищенный белок, пригодный для дальнейшей обработки дегликозилирующими ферментами с целью увеличения его функциональной активности.
Фракция целевого белка с третьей стадии очистки наносится на сорбент РЬепу1-сефарозу. На данном этапе (гидрофобная хроматография) проводится контролируемое дегликозилирование целевого белка при помощи смеси трех ферментов (нейраминидаза, b- 1 ,4-галактозидаза, b-N-ацетилглюкозаминидаза) для укорачивания полисахаридных цепей белка до концевых маннозных остатков. Подобраны минимальные концентрации гликозидаз в реакционной смеси (снижение более чем в 10 раз по сравнению с известными из уровня техники), обеспечивающие полноту прохождения реакции и приемлемую для коммерческого производства скорость процесса. Более того, подтверждена возможность многократного использования оптимизированной ферментной смеси без потери эффективности дегликозилирования. В связи с высокой стоимостью коммерчески доступных б гликозидаз, проведенная оптимизация позволяет значительно снизить затраты на получение целевой субстанции.
При использовании в производстве коммерческих ферментов, произведенных в бактериальных клеточных линиях и не прошедших достаточной очистки, может быть введен дополнительный этап удаления эндотоксинов. В таком случае целевой белок после дегликозилирования промывается буферным раствором, содержащим изопропанол, перед элюцией с сорбента.
Полученный частично дегликозилированный белок далее подвергают фильтрации через анионообменный сорбент (^-сефарозу для удаления остаточных эндотоксинов и ДНК клеток-продуцентов.
Последнюю стадию хроматографической очистки проводят на СМ-сефарозе, осуществляя финальную доочистку от примесных белков клеток-продуцентов и перевод белка в буфер готовой формы. В результате получают субстанцию с хроматографической чистотой не менее 99% по обращенно-фазовой ВЭЖХи специфической активностью около 40 МЕ/мг, далее используемую для получения готовой формы лекарственного средства. Общий выход продукта после всех стадий выделения составляет приблизительно 40%.
Ключевые преимущества данного способа выделения и очистки имиглюцеразы состоят в усовершенствовании и оптимизации наиболее сложного и дорогостоящего этапа дегликозилирования белка за счет подтвержденной возможности использования смеси трех гликозидаз, что позволяет непосредственно в ходе хроматографической очистки модифицировать профиль гликозилирования белка для активации его функциональных свойств. Разработанная методика дает возможность получения активного целевого белка высочайшей степени чистоты пригодного для фармацевтического применения. Кроме того, возможность использовать оптимизированную ферментную смесь повторно позволяет существенно снизить затраты на производство конечного продукта.
После завершения хроматографической очистки проводили контроль углеводной структуры субстанции. Аспарагин-связанные олигосахариды извлекались путем инкубации имиглюцеразы с N-гликаназой с последующим флуоресцентным мечением и анализом полученной смеси на гидрофильной ВЭЖХ-колонке высокого разрешения (фиг. 1). Методом масс-спектрометрического анализа показано, что три основных пика олигосахаридов соответствуют Man3GlcNAc2, Man3(Fucal— >3)GlcNAc2 и GlcNAcMan3(Fucal— >3)GlcNAc2, то есть подавляющее число углеводных цепей полученного гликопротеина содержат один или два концевых маннозных остатка необходимых для его биологической активности.
Ферментативную активность имиглюцеразы измеряли при помощи хромогенного метода с использованием 4-нитрофенил-В-Б-глюкопиранозида в качестве субстрата. Биологическую активность субстанции подтверждали по способности имиглюцеразы к интернализации в иммунные клетки крови мыттти с сохранением ферментативной активности, детектируемой более чувствительным методом с флуорогенным субстратом (4-метилумбеллиферил-Р-0-глюкопиранозид). Показано, что целевой белок обладает требуемой специфической активностью (около 40 МЕ/мг) и эффективно проникает в клетку, подтверждая тем самым свою полную функциональность.
Полученный белок характеризуется следующими параметрами: не менее 99% основного вещества (по обрашенно-фазовой ВЭЖХ), не более 4% родственных примесей (по эксклюзионной ВЭЖХ), удельная активность не менее 35 МЕ/мг, содержание остаточных белков клетки-продуцента не более 50 нг/мг имиглюцеразы.
На фиг. 1 приведен ВЭЖХ анализ структуры гликанов имиглюцеразы. Три основных пика соответствуют Man3GlcNAc2, Man3(Fucal— >3)GlcNAc2 и
GlcNAcMan3(Fucal— >3)GlcNAc2, подтверждая эффективность ферментативной обработки и наличие как минимум одной концевой маннозы у подавляющего числа гликанов имиглюцеразы.
Изобретение иллюстрируется, но не ограничивается приведенными ниже примерами.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Создание продуцента имиглюцеразы.
Ген, кодирующий имиглюцеразу, был сконструирован синтетическим способом, используя кодоны, оптимизированные для экспрессии в клетках грызунов (китайского хомячка). Аминокислотная последовательность белка была взята из базы данных UniProt (UniProtKB - P04062 (GLCM_HUMAN). Для обеспечения секреции целевого белка в культуральную среду, ген имиглюцеразы содержал сигнальный пептид, обеспечивающий направление белковой молекулы по секреторному пути. Сигнальный пептид был взят из последовательности человеческого фактора свертываемости крови FVII. После прохождения через эндоплазматический ретикулум сигнальный пептид отщепляется от полипептида имиглюцеразы.
Ген имиглюцеразы был клонирован в плазмидные векторы для экспрессии в клетках млекопитающих под контролем сильного промотора и экспрессировался в клетках СНО (линия клеток яичников китайского хомячка). Два сконструированных вектора содержали идентичный ген, но отличались устойчивостью к селективному антибиотику. Вектор pMS590 нес ген устойчивости к пуромицину, а вектор pMS59l нес ген устойчивости к гигромицину, что обеспечивало устойчивость трансфецированной клеточной линии к селективным антибиотикам.
Экспрессия осуществлялась путем введения экспрессионных плазмид pMS590 pMS591, созданных на основе модифицированной плазмиды pUCl8, в клеточную линию-хозяина посредством трансфекции клеток. Клеточная линия-хозяин представляла собой субклон линии клеток яичников китайского хомячка СНО-К1, приспособленный к выращиванию в виде суспензии в питательной среде, не содержащей сыворотки крови животных. В качестве способа трансфекции применяли электропорацию, в результате чего, введенная последовательность стабильно интегрировалась в геном хозяина.
Для идентификации и выделения клеток, продуцирующих имиглюцеразу, после трансфекции и добавления селективного антибиотика в культуральную среду, суспензия клеток разбавлялась и рассевалась таким образом, чтобы изолировать популяции, выросшие из единичных клеток, то есть клеточные клоны. После выделения клоны выращивались до состояния конфлюэнтности, и содержание целевого белка в супернатанте оценивалось методом иммуноферментного анализа, а также Вестерн-блоттинга. Клеточные клоны, секретирующие b-глюкоцереброзидазу на высоком уровне, размножали и хранили с помощью криоконсервации. Пример 2. Культивирование клеток-продуцентов.
Для производства имиглюцеразы культивирование клеточного клона, стабильно продуцирующего целевой белок, проводили в течение не менее 20 суток в непрерывном (перфузионном) режиме в одноразовом биореакторе волнового типа со встроенной перфузионной мембраной. Для культивирования использовали базовую питательную среду SFM4CHO (HyClone), не содержащую сыворотки крови крупного рогатого скота и иных компонентов животного происхождения, дополненную нутриентной добавкой CHOFeedBioreactorSupplement (SAFC) в количестве 5 мл/л. Температура культивирования составляла 37°С в фазе экспоненциального роста и 32°С в продукционной фазе. Скорость протока питательной среды достигала одного объёма биореактора в сутки. Культуральная жидкость, отделённая от клеток, раз в сутки передавалась на хроматографическую очистку. Процесс культивирования завершали после снижения жизнеспособности клеток ниже 80%.
Пример 3. Хроматография на сорбенте Butyl Sepharose.
К культуральной жидкости, содержащей рекомбинантную имиглюцеразу, добавляли хлорид натрия до концентрации 0,5 М. Сорбент уравновешивали буферным раствором состава 50 MMTris-HCl, 0,5 М NaCl, 10% этиленгликоль (pH 7,2), затем наносили культуральную жидкость. По окончании нанесения сорбент последовательно промывали несколькими объемами буферных растворов следующего состава:
• 50 мМ Tris-HCl, 0,5 М хлорид натрия, 10% этиленгликоль (pH 7,2);
• 10 мМ Tris-HCl, 0,1М хлорид натрия, 10% этиленгликоль (pH 7,2);
• 10 мМ ацетат натрия, 0,1М хлорид натрия, 10% этиленгликоль (pH 5,0). Целевой белок элюировали буферным раствором, содержащим 10 мМ ацетат натрия, 0,15М хлорид натрия, 70% этиленгликоль (pH 5,0). Элюат собирали и передавали на следующую стадию очистки.
Пример 4. Хроматография на сорбенте SP Sepharose.
Элюат с Butyl-сефарозы разбавляли в два раза раствором 20 мМ ацетата натрия (pH 5,0) и наносили на сорбент, предварительно уравновешенный буферным Ю раствором состава 20 мМ ацетат натрия, 25 мМ хлорид натрия, 10% этиленгликоль (pH 5,0).
По окончании нанесения сорбент последовательно промывали буферными растворами следующего состава:
• 20 мМ ацетат натрия, 25 мМ хлорид натрия, 10% этиленгликоль (pH 5,0);
• 20 мМ ацетат натрия, 100 мМ хлорид натрия, 10% этиленгликоль(рН 5,0). Целевой белок элюировали буферным раствором, содержащим 20 мМ фосфат натрия, 100 мМ хлорид натрия, 20% этиленгликоль (pH 7,0). Элюат собирали и передавали на следующую стадию очистки.
Пример 5. Хроматография на сорбенте IMAC Sepharose.
Перед нанесением белка сорбент насыщали ионами Zn2+nyreM последовательных промывок водой, раствором 0,2М хлорида цинка, водой, а затем уравновешивали буферным раствором состава 20 мМ фосфат натрия, 0,1М хлорид натрия, 20 % этиленгликоль (pH 7,0). Элюат с SP-сефарозы наносили на сорбент и по окончании нанесения проводили последовательные промывки буферными растворами следующего состава:
• 20 мМ фосфат натрия, 0,1 М хлорид натрия, 20 % этиленгликоль (pH 7,0)
• 20 мМ фосфат натрия (pH 7,0);
• 20 мМ фосфат натрия, 1 М хлорид натрия (pH 7,0);
• 20 мМ фосфат натрия, 1 М хлорид натрия, 20% этиленгликоль (pH 7,0). Целевой белок элюировали буферным раствором, содержащим 50 мМ фосфат натрия, 2,8М хлорид натрия, 30% этиленгликоль (pH 7,0). Элюат собирали и передавали на следующую стадию очистки.
Пример 6. Хроматография на сорбенте Phenyl Sepharose и ферментативная обработка.
Элюат с IMAC-сефарозы разбавляли в 5 раз раствором 50 мМ фосфата натрия (pH 7,5) и наносили на сорбент, предварительно уравновешенный буферным раствором состава 50 мМ фосфат натрия, 0,5М хлорид натрия, 5% этиленгликоль (pH 7,5). По окончании нанесения сорбент последовательно промывали буферными растворами следующего состава: • 50 мМ фосфат натрия, 0,5М хлорид натрия, 5% этиленгликоль (pH 7,5);
• 50 мМ цитрат натрия, 10% этиленгликоль (pH 5,7).
Последний буферный раствор также применялся для приготовления
реакционной смеси ферментов для контролируемого дегликозилирования
иммобилизованной на сорбенте имиглюцеразы. Объем реакционной смеси составлял 110% от колоночного объема; ферментный состав смеси рассчитывался из
следующих соотношений: 6U нейраминидазы (Worthington), 1U b- 1 ,4-галактозидазы (Calbiochem) и 14U b-N-ацетилглюкозаминидазы (Sigma) на 1 г имиглюцеразы.
Реакционную смесь для дегликозилирования пропускали через сорбент в режиме рециркуляции с линейной скоростью 90 см/ч в течение ~22-36 часов. После гидролиза олигосахаридных цепей реакционную смесь собирали и хранили при температуре 4 °С (показана стабильность в течение минимум двух недель) для повторного использования. Сорбент промывали буферным раствором состава 50 мМ цитрат натрия, 10 % изопропанол (pH 5,7). Целевой белок с оптимизированным профилем гликозилирования элюировали буферным раствором, содержащим 40 мМ фосфат натрия, 55% пропиленгликоль (рН7,5). Элюат собирали и передавали на следующую стадию очистки.
Пример 7. Хроматография на сорбенте Q Sepharose.
Элюат с Phenyl-сефарозы разбавляли в 2 раз раствором 100 мМ фосфата натрия (pH 7,5) и наносили на сорбент, предварительно уравновешенный буферным раствором состава 50 мМ фосфат натрия, 10 % этиленгликоль (pH 7,5). Данную стадию проводили в режиме фильтрации; после нанесения фракции целевого белка сорбент промывали буфером для уравновешивания. Фильтрат собирали и передавали на следующую стадию очистки.
Пример 8. Хроматография на сорбенте CM Sepharose.
К фильтрату с Q-сефарозы добавляли раствор 1 М лимонной кислоты до значения pH 5,0 и наносили на сорбент, предварительно уравновешенный раствором 25 мМ цитрата натрия (pH 5,0). По окончании нанесения сорбент последовательно промывали буферными растворами следующего состава:
• 25 мМ цитрат натрия (pH 5,0); • 25 мМ цитрат натрия, 10% изопропанол (pH 5,0).
Затем, для удаления фракции белка с высоким содержанием остаточных белков СНО, проводили промывку линейным градиентом буфера состава 25 мМ цитрат натрия, 10% изопропанол, 200 мМ хлорид натрия (pH 5,0) с остановкой градиента при достижении проводимости 7-8 mS/cm. После этого сорбент последовательно промывали буферными растворами следующего состава:
• 25 мМ цитрат натрия, 10% изопропанол (pH 5,0)
• 25 мМ цитрат натрия, 0,01% полисорбат-80 (pH 5,0).
Целевой белок элюировали буферным раствором, содержащим 55 мМ цитрат натрия, 0.01% полисорбат-80 (pH 6,3). Для приготовления готовой субстанции в полученный раствор имиглюцеразы вносили в сухом виде недостающие компоненты финальной формуляции.
Пример 9. Определение углеводной структуры имиглюцеразы.
Аликвоту 0,5 мг субстанции имиглюцеразы переводили в 0,2 мл гликозидазного буфера (50 мМ Tris-HCl, pH 8,0) при помощи 250-кратного разбавления на микроконцентраторе Amicon-lOK (Millipore). Затем к образцу добавляли около 20 единиц активности N-glycanase (Prozyme) и термостатировали при +37°С в течение 8 ч. Олигосахариды отделяли от белка ультрафильтрацией на Amicon-lOK с дополнительными промывками деионизованной водой. Собранный проскок (99% материала) упаривали досуха на вакуумном концентраторе CentriVap (Labconco).
Реагент для флуоресцентного мечения олигосахаридов получали последовательным растворением 1 мкг 2-аминобензойной кислоты и 1,25 мкг цианоборогидрида натрия в 21 мкл смеси диметилсульфоксида с уксусной кислотой. Образцы смеси олигосахаридов растворяли в 3 мкл деионизованной воды и затем добавляли 10 мкл реагента для мечения. Реакционную смесь инкубировали в течение 3 ч при +45°С. Избыточный краситель удаляли методом твердофазной экстракции на колонках LudgerClean™ T1 Cartridge Kit (Ludger) согласно рекомендуемому протоколу. Пробы упаривали до объёма около 50 мкл и использовали для анализа.
Хроматографический анализ (фиг. 1) осуществляли на приборе Alliance HPLC (Waters) с применением гидрофильной ВЭЖХ-колонки высокого разрешения TSKgel Amide-80 (Tosoh Bioscience) с предколонкой TSKguardgel Amide-80. Разделение проводили при температуре колонки 45°С в градиенте подвижной фазы (раствор формиата аммония с ацетонитрилом). Сигнал детектировали по флуоресценции при 425 нм при возбуждении светом 360 нм.
Пример 10. Определение биологической активности полученного белка и способности его интернализации в клетку.
Ферментативную активность имиглюцеразы измеряли хромогенным методом с 4-нитрофенил-В-0-глюкопиранозидом в качестве субстрата. В исследуемый образец в нескольких разведениях вносили четырехкратный объем 10 мМ раствора субстрата и инкубировали 15 мин при 37 °С, после чего реакцию останавливали прибавлением восьми объемов ОД М раствора глицина. Измеряли оптическую плотность растворов на спектрофотометре в максимуме поглощения при длине волны 400 нм. Активность определяли, исходя из того, что одна единица активности соответствует гидролизу одного мкмоля субстрата/мин при температуре 37 °С.
Биологическую функциональность имиглюцеразы определяли по способности исследуемых образцов белка интернализироваться в перитонеальные макрофаги (моноциты) мыши в присутствии или в отсутствие дрожжевого маннана с последующей детекцией ферментативной активности интернализированной имиглюцеразы в клеточном лизате.
Пул мышиных клеток, содержащих перитонеальные макрофаги, осаждали центрифугированием с последующим ресуспендированием клеточного осадка в питательной среде DMEM/F12 с 10% бычьей сывороткой, 2 мМ глутамином и пенициллин-стрептомицином. Полученные клетки высевали в 6 луночный планшет в количестве 7 млн/лунку. По окончании полуторачасовой инкубации прикрепившиеся клетки перитонеальных макрофагов двукратно промывали средой с последующим добавлением 2 мл свежей среды в каждую лунку. К клеткам добавляли аликвоты исследуемых образцов имиглюцеразы до концентрации 100 мкг/мл. В качестве контроля использовали клетки, к которым предварительно добавляли маннан (до концентрации 800 мкг/мл), блокирующий маннозные рецепторы. После 3-х часовой инкубации при 37 °С макрофаги промывали фосфатно-солевым буфером; смывы после 4 и 5 промывок собирались для анализа. По окончании последней промывки клетки каждой лунки смывали 500 мкл лизирующего буфера. Полученные образцы клеточных лизатов и промывочных растворов были использованы для детектирования активной формы белка.
Определение ферментной активности имиглюцеразы в клеточном лизате проводили флюорогенным методом: под действием имиглюцеразы происходит расщепление синтетического субстрата (4-метилумбеллиферил-Р-Б-глюкопиранозид) с образованием флюоресцентного вещества 4-метилумбеллиферона.
К 20 мкл образцов имиглюцеразы, разведенных в фосфатном буфере, добавляли 80 мкл 4-метилумбеллиферил-Р-0-глюкопиранозида (Sigma) и инкубировали 30 мин при 37 °С. Реакцию останавливали добавлением 800 мкл 0,1 М раствора глицина, pH 10,5. Флюоресценцию испытуемых растворов и раствора сравнения, не содержащего белка, измеряли спектрофотометрически при длине волны возбуждения 365 нм и длине волны эмиссии 440 нм. Флюоресценция продукта реакции количественно оценивается с помощью калибровочной кривой, построенной для заданных концентраций 4-метилумбеллиферона (Sigma).

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ дегликозилирования имиглюцеразы, полученной в клетках млекопитающих, отличающийся тем, что обработка нейраминидазой, b-1,4- галактозидазой и b-N-ацетилглюкозаминидазой проводится в одну стадию.
2. Способ дегликозилирования имиглюцеразы по п.1, отличающийся тем, что соотношение ферментов нейраминидазы: b- 1 ,4-галактозидазы: b-N- ацетилглюкозаминидазыв смеси составляет: 6 Ед:1 Ед:14 Ед в расчете на 1 г белка.
3. Способ дегликозилирования имиглюцеразы по п. 1, отличающийся тем, что дегликозилирование проводится в течение 22-36 часов при комнатной температуре.
4. Способ дегликозилирования имиглюцеразы по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что дегликозилирование проводится в ходе хроматографической очистки.
5. Способ очистки имиглюцеразы, полученной в клетках млекопитающих, отличающийся тем, что в ходе хроматографической очистки проводится дегликозилирование имиглюцеразы по любому из пп.1-4.
6. Способ очистки имиглюцеразы по п. 5, отличающийся тем, что включает следующие стадии:
а) гидрофобную хроматографию на Butyl-сефарозе,
б) катионный обмен на SP-сефарозе,
в) металло-хелатную хроматографию на 1МАС-сефарозе,
г) гидрофобную хроматографию на Phenyl-сефарозе, совмещенную с дегликозилированием целевого белка по любому из пп.1-4,
д) фильтрацию через (^-сефарозу,
е) катионный обмен на СМ-сефарозе.
PCT/RU2018/000492 2018-07-24 2018-07-24 Способ очистки имиглюцеразы WO2020022924A1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2018/000492 WO2020022924A1 (ru) 2018-07-24 2018-07-24 Способ очистки имиглюцеразы

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2018/000492 WO2020022924A1 (ru) 2018-07-24 2018-07-24 Способ очистки имиглюцеразы

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020022924A1 true WO2020022924A1 (ru) 2020-01-30

Family

ID=69181746

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2018/000492 WO2020022924A1 (ru) 2018-07-24 2018-07-24 Способ очистки имиглюцеразы

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2020022924A1 (ru)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5549892A (en) * 1988-12-23 1996-08-27 Genzyme Corporation Enhanced in vivo uptake of glucocerebrosidase

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5549892A (en) * 1988-12-23 1996-08-27 Genzyme Corporation Enhanced in vivo uptake of glucocerebrosidase

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HE, XU ET AL.: "Production of active human glucocerebrosidase in seeds of Arabidopsis thaliana complex-glycan-deficient (cgl) plants", GLYCOBIOLOGY, vol. 22, no. 4, 2011, pages 492 - 503, XP055679547 *
HENRIKSEN A. ET AL.: "On the significance of the carbohydrate moieties of bovine prothrombin for clotting activity", BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA (BBA) - GENERAL SUBJECTS, vol. 421, no. 2, 1976, pages 348 - 352, XP025836121, DOI: 10.1016/0304-4165(76)90301-9 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108026518B (zh) 新型endos突变型酶
AU2018200374A1 (en) Modified polynucleotides for the production of biologics and proteins associated with human disease
AU2019202835A1 (en) In vivo production of proteins
CA2767054C (en) High mannose proteins and methods of making high mannose proteins
AU2008229659B2 (en) A process for concentration of a polypeptide
US20200024628A1 (en) Mutant endoglycoceramidases with enhanced synthetic activity
KR20180025969A (ko) N- 및 o-글리코실화 패턴이 변이된 당단백질을 생성하는 세포 및 그의 방법 및 용도
CZ20014383A3 (cs) Hyaluronidáza z Hirudinaria manilensis, její izolace, čiątění a rekombinantní způsoby její výroby
US20210106658A1 (en) Compositions comprising heterogeneous populations of recombinant human clotting factor xa proteins
Watson et al. Comparison of N‐linked oligosaccharides of recombinant human tissue kallikrein produced by Chinese hamster ovary cells on microcarrier beads and in serum‐free suspension culture
Meynial-Salles et al. In vitro glycosylation of proteins: an enzymatic approach
Huang et al. Site-selective sulfation of N-glycans by human GlcNAc-6-O-sulfotransferase 1 (CHST2) and chemoenzymatic synthesis of sulfated antibody glycoforms
US20210017500A1 (en) Animal cell strain and method for use in producing glycoprotein, glycoprotein and use thereof
RU2668158C1 (ru) Способ очистки имиглюцеразы
KR20160066550A (ko) 재조합 당단백질 및 이의 용도
WO2020022924A1 (ru) Способ очистки имиглюцеразы
KR102528707B1 (ko) 고순도의 히알루로니다제 정제 방법
RIVERA‐SAGREDO et al. Substrate specificity of small‐intestinal lactase: Assessment of the role of the substrate hydroxyl groups
WO2003057710A2 (en) Methods of producing high mannose glycoproteins in complex carbohydrate deficient cells
EP0565241B1 (en) Oligosaccharides
WO2003057828A2 (en) Method of producing glycoproteins having reduced complex carbohydrates in mammalian cells
Hoffmann Investigations into enzymatic transglycosylation reactions for the synthesis of glycoconjugates and glyco-functionalized polyphenols
JP4429018B2 (ja) 糖鎖合成酵素
JP4255113B2 (ja) 糖の脱硫酸化触媒
JP4377987B2 (ja) ガラクトース転移酵素及びそれをコードするｄｎａ

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18927424

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 18927424

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1