CN1759189A - 切向流过滤方法及其装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于将目标分子从包含它们的混合物中分离出来的工艺过程和设备，包含用改进的切向流过滤(TFF)方法对混合物进行处理。使用该改进的TFF可澄清、处理多种料液，以取出目标分子。根据一项优选的实施方案，使转基因乳液流稳定并且除去颗粒状物理例如脂肪和酪蛋白微球以及细菌。在本发明中使用的TFF方法利用了优化的工艺参数，包括温度、跨膜压力、交叉流速度和乳汁的浓度。还开发出了清洁和储存操作流程，以保证膜具有长的使用寿命。还开发出了无菌过滤步骤，以从澄清过的转基因乳汁料液中除去残留的任何细菌。

Description

切向流过滤方法及其装置

发明领域

本发明提供了改善的方法和系统，用于从污染物中分离特异的目标分子。更特别地，本发明涉及通过改进的切向流过滤(tangentialflow filtration)方法处理样品溶液，该改进的切向流过滤方法提高了从给定的料液中对所需分子的澄清、浓缩和分级分离。

发明背景

本发明涉及的是从给定的料液(feedstream)中过滤目标分子的改进方法。应当注意的是，生产大量较纯的、具有生物活性的分子对于节约有效地生产人和动物的药用配方、蛋白质、酶、抗体和其他特殊化学物质是非常重要的。重组DNA技术已经成为可选择的方法用于生产多种多肽、抗体和蛋白质，因为大量的外源蛋白质或者抗体可以在细菌、酵母、昆虫或者哺乳动物细胞培养物中表达。最近以来，已经通过工程操作或者其他方式的改变使转基因动物(主要是哺乳动物，但是也包括禽类)或者甚至是转基因植物大量产生外源的蛋白质、抗体或者它们的片段或融合物。通过重组DNA技术表达蛋白质用于生产作为生物催化剂起作用的细胞或者细胞部分，也是一项重要的应用。

重组蛋白的生产包括用编码该蛋白质的DNA转染宿主细胞以及在有利于重组蛋白质或者其他目标分子表达的条件下培养宿主细胞、转基因动物或者植物。原核生物大肠杆菌已经成为一个受偏爱的宿主系统，因为可以将其改造，从而生产大量重组蛋白。但是，已经开发出从大肠杆菌到牛的多种不同的表达平台，因此有众多的关于一般表达蛋白编码DNA的美国专利。

随着从生物体系中生产外源蛋白质或者其他目标分子的工作的改善，工业上面临着更大的压力，要求开发出新的技术，以提高用于这样生产出的生物制品和药物的纯化和回收工艺，并使其更为有效。那就是，随着新产品的供应增加，随之出现了对于设计出使这些治疗药剂(以商业量)迅速上市的方法的巨大兴趣。同时工业上还面临着新的挑战，即开发从各种机体流体(包括乳汁和尿)中回收转基因蛋白质和抗体的新型工艺。生产的规模越大，这些问题经常变得更为复杂。此外，工业上还面临着其他的挑战，涉及产品的纯度和安全性达标方面，主要涉及的方面是病毒安全性和残留污染物例如DNA和宿主细胞蛋白质，标准，这样的标准是许多监管生物用途药物生产的政府机构都可能要求达到的。

目前有多种可用于从混合物中分离生物学目标分子例如蛋白质的方法。这些技术中重要的一项是亲和层析，它对分子的分离是基于所需的分子与亲和介质或者凝胶的特异性、选择性结合，而不需要的分子不能结合因此可以从体系中去掉。亲和凝胶通常由固定在凝胶支持物上的配基结合部分组成。例如GB2,178,742使用了亲和层析方法将血红蛋白及其化学修饰衍生物纯化出来，其依据的原理是天然血红蛋白可与一个特殊的多聚阴离子部分家族特异结合。将这些部分固定在凝胶上，以捕获目标分子。在这一过程中，未修饰的血红蛋白被亲和凝胶保留，而被修饰的血红蛋白由于其多聚阴离子结合位点被修饰剂所共价占据而不能与凝胶结合，所以从体系中被除去。亲和层析柱是高度特异的，所以会产生非常纯的产物，但是亲和层析是一个相对较昂贵的工艺，因此很难在商用操作中运用。

通常情况下，经遗传工程操作的生物药物是从含有多种不同的宿主细胞污染物的上清中纯化出来的。可以使用反相高效液相层析(RP-HPLC)纯化蛋白质，因为它可以有效地将结构或者重量都极其相似的分子分开。使用RP-HPLC分离多种分子的技术操作已经发表。McDonald and Bidlingmeyer，″Strategies for SuccessfulPreparative Liquid Chromatograplay″，PREPARATIVE LIQUIDCHROMATOGRAPHY，Brian A.Bidlingmeyer(New York：ElsevierScience Publishing，1987)，vol.38，pp.1-104；Lee et al.，Preparative HPLC.8th Biotechnology Symposium，Pt.1，593-610(1988).

膜类在产业规模的分子产物回收工艺中的使用以及多种类型的膜和膜技术的相关使用也是为人所知的。这些方法中的基本特点是悬浮于液体料液中的颗粒根据其大小进行分离。在这一工艺的最简单形式中，用压力迫使溶液通过具有固定大小孔的过滤膜。大于过滤膜孔径大小的颗粒被截留，而较小的溶质与溶剂被一同带到膜的另一侧。根据膜的孔径大小，这种膜过滤工艺一般属于反渗透、超滤和微过滤类型。

重要的还应该提及作为分离技术的膜过滤在生物技术领域内被广泛应用。根据膜的类型，膜过滤可以分为微滤或者超滤。微滤膜的孔径大小在0.1到10微米之间，通常用于澄清、除菌和微小颗粒物的去除，或者用于细胞收获。超滤膜的孔径大小要小得多，在0.001到0.1微米之间，用于将溶解的分子(蛋白质、多肽、核酸、糖和其他生物分子)分开和浓缩，或者交换缓冲液，以及粗分级。

目前有两种主要的膜过滤方法：单向通过或者直接流过滤(DirectFlow Filtration，DFF)以及交叉流或者切向流过滤(TangentialFlow Filtration，TFF)。TFF是一种超滤系统，其被设计成控制料液的流体流动型式，以提高被截留的溶质从膜表面向料液中的回输。在这个过程中，料液高速地重复循环，方向与膜的平面相切。这样进行的效果是可以提高传质系数(mass-transfer coefficient)，允许反向扩散。流体流动的方向与滤膜的方向平行，这也使滤膜表面不断被清洁，从而防止了堵塞。

但是对于超滤中可以达到的蛋白质纯化程度存在限制。这些限制主要是由于浓度极化、淤积以及大多数膜的孔径大小分布过宽造成的。因此溶质分开的情况经常很差。参见例如Porter，ed.，HANDBOOK OFINDUSTRIAL MEMBRANE TECHNOLOGY(Noyes Publications，Park Ridge，N.J.，1990)，pp.164-173.

溶质的极化层成为额外的一层滤膜，基本上与原来的超滤膜串联作用。这一作用在过滤给定溶剂时导致了明显的阻力。随着料液中被截留溶质浓度的提高，极化程度将提高，并且在真实系统中会导致许多看起来反常的或者不可预知的情况的发生。例如，在高度极化的条件下，过滤速率随着压力的增加而只有小幅增加，这与未极化条件下的过滤速度通常与压力呈线性的关系相反。使用更加开放、更高通量的膜可能不会提高过滤速度，因为极化层仍然对过滤提供着限制性的阻力。由于截留的和洗脱的溶质之间的相互作用，这一情形将更为恶化。

浓度极化和污染过程的一个结果是不能有效利用超滤膜对大分子分级的能力用于大分子混合物例如血浆蛋白的大规模拆分中。参见Michaels，″Fifteen Years of Ultrafiltration：Problems andFuture Promises of an Adolescent Technology″，inULTRAFILTRATION MEMBRANES AND APPLICATIONS，POLYMER SCIENCEAND TECHNOLOGY，13(Plenum Press，N.Y.，1979，Anthony R.Cooper，ed.，)，pp.1-19.

因此，用其他和额外的技术分离更多种类的生物分子是很困难的。也就是说，通过凝胶渗透、吸附或者离子交换层析、选择性沉淀或者电泳这类技术进行的复杂大分子混合物大规模分离中使用膜超滤是异常困难的，且不适于商业的应用。TFF通过将混合物重复循环而解决这个堵塞的问题。

用切向流过滤分离物质的技术是已知的。Marinaccio et al.，美国专利编号4,888,115中公开了将该过程(称为“交叉流”)用于分离生物性液体(例如分离血液组分用于血浆除去法)。在该过程中，血液切向通过(即跨过)有机多聚微孔滤膜，并除去颗粒状物质。在现有技术的另一个实施例中，切向流过滤被用于啤酒溶液的过滤(Shackleton，EP 0,208,450，1987年1月14日发表)，它特别用于除去例如酵母细胞和其他悬浮固体等颗粒状物质。Kothe et al.(美国专利4,644,056，1987年2月17日颁布)公开了这一工艺用于从乳汁或者初乳中纯化免疫球蛋白，Castino(美国专利4,420,398，1983年12月13日颁布)描述了切向流过滤用于从包含抗病毒物质以及病毒颗粒和抗病毒物质所来源的细胞培养物残渣的肉汤中分离抗病毒物质，例如干扰素。

已经在从细胞残渣中分离细菌酶时使用过切向流过滤装置(Quirk et al.，1984，Enzyme Microb.Technol.，6(5)：201)。与使用传统的离心技术相比，使用这一技术，Quirk et al.能够在较短的时间内分离出更大量的酶。在制药领域中切向流过滤的多种应用在Genovesi(1983，J.Parent er.Aci.Technol.，37(3)：81)中有综述，应用包括注射用无菌水的过滤、溶剂系统的澄清以及从肉汤和细菌培养物中过滤酶。

但是对于该技术用于商业应用所需的颗粒大小的精确控制还很困难并且还未普遍获得成功。在本发明中对切向流过滤的使用进行了改良，用于在商用的高效且重要的工艺中根据大小分离颗粒。本发明公开了使用具有所选尺寸的滤膜以及依次使用或者串联叠加不同孔径大小的滤膜(即过滤系统)，以分离颗粒状物质，获得具有所需的特定大小范围的颗粒。

在本领域内还需要有高效的实验方案，用于使用一种提高产量、较为便宜以及减少变性的工艺而从其他分子中选择性地分离例如肽、多肽和非肽类物质等分子。特别地，需要有纯化技术，以便从细胞培养使用的发酵培养液中或者从转基因哺乳动物产生的乳汁料液中分离出目标分子。

可以从细胞培养液或者转基因乳汁料液中纯化出的这样一种目标分子是人白蛋白。人白蛋白是临床用作血容量扩充剂的第一种天然胶体组合物，并且它是与其他胶体分子进行比较的标准胶体试剂。其他目标分子包括，但不限于，人甲胎蛋白、抗体、抗体的Fc片段以及人白蛋白或者甲胎蛋白片段作为载体分子的融合分子。

本发明的方法还提供了滤器和过滤条件的精确组合，以便优化从给定料液中获得目标分子的产量。在这些方法中重要的过程参数包括pH和温度被精确地调控。

本发明的一个目的是提供切向流过滤工艺，用于根据大小分离物质，例如颗粒和分子，其中所述工艺对于目标物是选择性的，从而能够更高倍地纯化。

另外一个目的是提供改进的过滤工艺，包括超滤工艺，用于分离生物大分子如蛋白质，该工艺使浓度极化最小化，并且不增加通量。

另外一个目的是提供一种过滤工艺，它可以根据大小分离大小相差不到10倍的物质，并且在过滤之前不需要对混合物进行稀释。

这些以及其他目的对于本领域内的技术人员将会变得明确。本发明的其他特点和优势将会在以下本发明优选实施方案的详细描述并参考相伴随的附图而变得明确。

生物制剂产业正在越来越关注产品的安全性、纯度以及成本。根据本发明使用切向流过滤(TFF)是一种迅速且更高效的生物分子分离方法。它可以用于广泛的生物学领域，例如免疫学、蛋白质化学、分子生物学、生物化学和微生物学。

附图的简要描述

图1显示了物质从料液通过TFF到灌装和结束的流程的工艺流程图。

图2A显示了微滤的工艺和设备安装。

图2B显示了TFF的工艺和设备安装。

图3显示了在高温和低温下酪蛋白产品去除的比较。

图4显示了过滤工艺的流程。

图5显示了从DNA构建体到含有重组目标蛋白质的澄清乳汁产生的转基因动物构建过程。

图6显示了本发明的方法的工艺设备图示。

图7显示了不同TMP下人单抗#A通过微滤膜的流体动力学性质与交叉流速度的关系。当TMP从12psi上升到20psi时出现了显著的发展。

图8显示了人单抗#A通过微滤膜的温度依赖性。提供了细胞培养物抗体和转基因抗体。

图9显示了来自GTC微滤工艺中的不同级分的SDS-PAGE分析结果。其中显示，与全乳汁(#3泳道)相比，4倍澄清化的乳汁(#7泳道)中酪蛋白的含量降低。

图10显示了根据本发明的TFF工艺，质量平衡以及该工艺的整体产量。

发明概述

简而言之，本发明提供了一种用于加速处理来自多种不同料液、优选来自转基因哺乳动物乳汁的人类治疗性蛋白、蛋白质片段或者抗体的方法。因此，在本发明的一项优选实施方案中，这里开发和提供的过滤技术提供了一种工艺，用于从乳汁的天然组合物或者乳汁的污染物中对所需的重组蛋白或者其他目标分子进行澄清、浓缩和分级。产生的大量澄清中间产物是用于传统的纯化技术例如层析的适宜料液，这些传统纯化技术用于TFF工艺的下游，使产品达到其最终的配方和纯度。

本发明的一项优选实验方案使用了三种过滤单元操作，从给定的含有目标分子的转基因乳汁中对产物进行澄清、浓缩和分级。澄清步骤从产物中除去了较大的颗粒状物质例如脂肪球和酪蛋白微球。之后的浓缩和分级步骤除去了大多数小分子，包括乳糖、矿物质和水，提高了纯度且降低了所得产物组合物的体积。将TFF过程的产物适当的浓缩至能使下游纯化最适地进行并且使整体产物具有最佳稳定性的水平。然后将该浓缩的产物无菌过滤以保证最低的生物负荷并且提高产物在延长时间段内的稳定性。半成品的纯度在65％到85％之间，可能含有的组分包括山羊抗体、乳清蛋白(α乳球蛋白、β乳白蛋白以及BSA)、低水平的残留脂肪和酪蛋白。这种部分纯化的产物是常规下游层析技术的理想起始料液。

通常可以使用本发明处理的产物是免疫球蛋白分子，包括但是不限于：IgG1(例如针对关节炎的抗体-“Remicade抗体”)，IgG4、IgM、IgA、Fc部分、含有与免疫球蛋白片段相连的肽或多肽的融合分子。其他可以使用本发明处理的蛋白质包括重组蛋白质、内源蛋白质、融合蛋白或者没有生物学活性、但可以进行后续加工而恢复生物活性的蛋白。其中包括、但是不限于抗凝血酶III蛋白、人血清白蛋白、核心蛋白聚糖、人甲胎蛋白、尿激酶和催乳素。

优选实施方案的描述

在说明中以下缩略语具有指定的含义：

缩略语表：

BSA   牛血清白蛋白

CHO   中国仓鼠卵巢细胞

CV    交叉流速率

DFF   直接流过滤

DV    透滤体积

IEF   等电聚焦

GMH   质量通量(克/平方米/小时)-也称为J_M

LMH   液体通量(升/平方米/小时)-也称为J_L

1pm   升/分钟

M     摩尔浓度

MF    微滤

NMWCO 额定分子量截留

NWP   标准化的透水性

PES   多聚(醚)砜

pH    根据众所周知的科学参数，用于描述化学物质或者化合物中氢离子活性的术语

PPM   每一百万份中所占的份数

SDS-PAGE SDS(十二烷基硫酸钠)-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)

SEC   大小排阻层析

TEF   切向流过滤

PEG   聚乙二醇

TMP   跨膜压力

UF    超滤

术语的解释：

澄清：从溶液中去除颗粒状物质，使溶液能够通过0.2微米的膜。

胶体：指的是不能容易地跨过毛细管壁的大分子。这些化合物施加肿胀压力(即它们吸引液体)，给服的目的通常是恢复血管内容量，改善组织灌注。

浓缩：用膜将水和小分子除去，使截留的分子对小分子的比例提高。

浓度极化：在膜表面上截留分子的累积(凝胶层)，它是由于多个因素组合而造成的：跨膜压力、交叉流速度、样品黏度和溶质浓度。

交叉流速度：跨膜上层的流体的速度。CF＝Pi-Po，其中Pi是进口的压力，而Po是出口的压力，CF与截留物的流速有关。

透滤：通过膜洗掉较小分子的分级分离过程，使目标大分子留在截留物中。这是一种方便有效的技术，可除去或者交换盐类、除去去污剂、将自由分子与结合分子分开、除去小分子量物质或者迅速改变离子或者pH环境。该过程通常使用微滤膜，将目标产物从浆液中分离，而同时保持浆液浓度恒定。

料液：为工艺或者方法所提供的原材料或者原料液，它含有目标蛋白，还可能含有多种不同的污染物，包括微生物、病毒和细胞碎片。

滤出液通量(J)：样品的一部分通过膜的速率。

流速(V)：流体通过膜表面的速度被认为是流体的流速。由于流速的改变，需要测量产物通量。两个变量之间的关系使我们可以确定流动的最佳操作窗口。

分级分离：根据物理或者化学部分而对分子进行优先分离。

凝胶层：显微镜下观察到的分子薄层，它可以在膜的上面形成。它会通过堵塞膜表面而影响分子的截留，因而减缓滤出液的流动。

额定截留分子量(Nominal Molecular Weight Cut Off，NMWCO)：超滤膜的大小(千道尔顿)指示。截留分子量的定义是被该膜截留90％的球蛋白的分子量。

标准化的透水性(NWP)：TFF装置起始清洁时在特定的重复循环速率下建立的水滤出液流速。该数值用于计算膜回收率。

目标分子：能够从溶液或者流体(如液体)中的悬液中分离出来的颗粒或者其他种类的分子。颗粒或者目标分子从流体中分离出来，多数情况下与流体中的其他颗粒或者分子分开。将要分离的目标分子的大小将决定要使用的膜的孔径大小。优选地，目标分子是生物或者生化来源的，或者通过转基因或体外过程产生的，包括蛋白质、肽、多肽、抗体或者抗体片段。优选的料液来源实例包括哺乳动物乳汁、哺乳动物细胞培养物以及微生物细胞培养物如细菌、真菌和酵母。还应当注意的是要被滤出的物质包括不合意的多肽、蛋白质、细胞组分、DNA、胶体、支原体、内毒素、病毒、糖和其他生物学分子，不论其是否被糖基化。

切向流过滤：是指这样一个过程，其中含有将要被过滤分离的组分的流体混合物沿着膜平面切线地高速重复循环以提高反向扩散的传质系数。在这种过滤中，沿膜的长度施加压力差，使流体和可滤过的溶质流过滤器。这种过滤最适宜以分批过程和连续流过程进行。例如，可以将溶液反复通过膜，同时通过该滤器的流体被不断回收到分开的装置中，或者使溶液一次通过膜，通过滤器的流体被不间断地进行下游的处理。

跨膜压力：沿着滤膜的长度施加的不同压力梯度，使得流体和可滤过的溶质流过滤器。在切向流系统中，最高的TMP是在入口处(流动管道的开始)，最低的TMP是在出口处(流动管道的终止)。取入口、出口和滤出液出口的平均压力计算TMP。

回收率：在处理后能够回收的目标分子的量。经常表示为起始物质的百分比或者产率。

截留物：不能通过膜的样品部分，也被称为浓缩物。在TFF过程中截留物被不断地重复循环。

切向流过滤的原理

所有的切向流装置涉及了两个重要的变量：跨膜压力(transmembrane pressure，TMP)和交叉流速度(crossflowvelocity，CF)。跨膜压力是实际上推动分子通过滤器小孔的力量。交叉流速度是溶液跨膜的流速。它提供的力将能够堵塞膜而降低该过程的效率的大分子一扫而光。在实际操作中，将流体料液从样品补料容器中泵出，在滤器中跨过膜表面(交叉流)，再作为截留物回到样品补料容器中。通过夹具施加在截留物管上的返回压力建立了跨膜压力，可驱动比膜孔径小的分子通过滤器进入滤出液(或者透过物(permeate))级分中。交叉流清除了在膜表面上截留的较大分子，使其作为截留物返回到料液中。成功实施TFF实验方案的基本目标是对TMP和CF进行优化，使在不产生膜阻塞性凝胶的情况下可以过滤最大体积的样品。如果TMP沿着膜的长度发生的增加或者减少的程度一般不超过平均TMP正负约10psi，优选为不超过约5psi，则认为TMP是“基本恒定的”。就整个过滤过程中的TMP水平而言，在浓缩步骤中使TMP保持恒定或者降低，以在高浓度下保持选择性。因此“基本恒定的TMP”是指TMP沿着膜的长度而保持恒定，并不是随着过滤时间而保持恒定。

乳汁作为料液

根据本发明的一个优选实施方案，TFF过程使用了三种过滤装置操作，对来自乳汁料液的产物进行澄清、浓缩和分级分离。该乳汁可以是含有生物药物或者其他目标分子的转基因哺乳动物的产物。在一个优选的实施方案中，该系统被设计成对目标分子具有高度选择性。澄清步骤从乳汁料液中去除了较大的颗粒状物质，例如脂肪球和酪蛋白微球。浓缩/分级步骤去除了多数小分子，包括乳糖、矿物质和水，提高纯度并降低了产物的体积。此后将TFF过程的产物浓缩至适于最佳下游纯化和整体产物稳定性的水平。然后将这一含有目标分子的浓缩产物无菌过滤，以确保最低的生物负荷，提高目标分子在延长时间段内的稳定性。根据本发明的优选实施方案，半成品的纯度在65％到85％之间，可以含有的组分例如有山羊抗体、乳清蛋白(β乳球蛋白、α乳白蛋白以及BSA)以及低水平的残留脂肪和酪蛋白。这一部分纯化的产物是常规下游层析技术的理想起始料液，可以进一步选择和分离目标分子，所述目标分子可能包括、但是不限于乳汁中产生的重组蛋白、乳汁中产生的免疫球蛋白或者融合蛋白。

步骤1(澄清)

参考图1，使用分批微滤对转基因哺乳动物的乳汁、优选地来自山羊或者牛的乳汁进行澄清。将乳汁置于补料罐内，沿环路泵出，使乳汁的截留物浓缩两倍(参见图1中的流程图)。浓缩之后，对乳汁截留物进行透滤，使产物和小分子量的蛋白质、糖和矿物质通过适当大小的膜。根据本发明，目前将该操作设计为耗时2-3小时，日处理乳汁量1000升。本发明的技术和方法可以进行放大，可以生产出的产品的总体积取决于对于某种特定目标分子的商业和/或治疗需要。

步骤2(浓缩/分级)

同样参考图1，使用超滤(UF)对第一步得到的澄清后的透过物进行浓缩和分级。澄清的透过物流入超滤补料罐内，沿环路泵出，使产物浓缩两倍。一旦浓缩过程启动，就将UF的透过物置于第一步中的澄清补料罐中的乳汁截留物中。调整第一步和第二步的时间和规模，使它们同时进行。UF的透过物含有通过膜的小分子量蛋白质、糖和矿物质。一旦在UF的截留物中累积了95％的产物，则停止澄清，开始对UF物质进行浓缩/透滤。将产物浓缩为起始乳汁体积的五分之一到十分之一，向UF补料罐中加入缓冲液。这洗掉了大部分的小分子量蛋白质、糖和矿物质。本操作目前设计为耗时2.5到3.5小时，每天可以处理多达500升的澄清透过物。同上，本发明的技术和方法可以被放大，可以通过本浓缩/分级过程生产出的产品的总体积取决于对于某种特定目标分子的商业和/或治疗需要。

步骤3(无菌过滤)

根据图1，以及根据本发明，对澄清的半成品浓缩物进行无菌微滤。将得到的50-100升超滤截留物放到补料罐中，在那里通过一个盲端绝对0.2微米MF过滤系统将UF截留物泵出，目的是除去大部分的生物负荷、提高产物在延长时间段内的稳定性。将产物通过本发明的过滤系统泵出，然后可以直接灌注到最终的包装装置中。在加工目标分子的条件下，在达到清洁房间标准(例如100级条件)的GMP设施中，本操作目前被设计成耗时0.5到1小时，每天可以处理多达100升的澄清化半成品中间产物。同上，本发明的技术和方法可以被扩大规模，可以通过本浓缩/分级过程生产出的产品的总体积取决于对于某种特定目标分子的商业和/或治疗需要。

实施例1

乳汁作为料液用于生产目标分子

以下的数据提供了本发明的一项应用，它提供了基于膜的工艺，可用于对来源于乳汁粗料液中的转基因生产的IgG1抗体进行澄清、浓缩和分级。根据本发明的该实施例，提供乳汁用于处理的转基因哺乳动物是山羊，但是也可以使用其他哺乳动物，包括牛、家兔、小鼠以及绵羊和猪。使用CHO细胞产生的IgG1抗体掺入到非转基因山羊乳汁中，对工艺的起始操作参数范围进行优化。当能够产生该目标分子的转基因山羊到了哺乳期，并且开始在其乳汁中产生重组IgG1，则使用掺入到非转基因乳汁中的CHO细胞产生的重组IgG1抗体进行多次实验，然后使用转基因乳汁重复这些实验。

根据本发明，实验性策略是确定可以在大规模下控制的过滤工艺变量(CM，V，TMP，T)之间的关系，其中V是流速，产物通过、截留和质量也同样可以被控制。通过单独小规模实验矩阵确定关系，并找到操作的最佳窗口。将这些最佳参数组合成“双TFF”实验系列，对整体产率和质量平衡进行研究。根据产品的产率、澄清度和通量效率确定性能。在单独小规模实验矩阵中研究以下的过程变量。

浓缩(Cm)使用经验产物通过数据，确定最佳的乳汁浓缩因子。在固定时间内每平方米内产物通过的速率被称为产物通量(Jp)。在澄清步骤中根据浓缩因子测定产物通量(操作装置#1)。

同样参考图1，以下提供了对本发明元件的解释

图1元件

工艺流描述

液流编号描述

1a  转基因乳汁原料

1b  微滤的CIP溶液

2a  将微滤产生的截留物在透滤后排到排水道中

2b  使用后的CIP溶液排到排水道中

3   在位的微滤截留物(环)

4   微滤CIP重复循环(环)

5   微滤滤出液

6   超滤的CIP溶液

7   使用后的CIP溶液排到排水道中

8   超滤料液(微滤滤出液)

9   在位的超滤截留物(环)

10  超滤透过物(为了透滤MF截留物)

11  浓缩的澄清化乳汁

12  超滤CIP重复循环(环)

13  AF CIP溶液

14  无菌过滤料液

15  生物负荷降低后的浓缩澄清半成品

16  使用后的CIP溶液排到排水道中

以其最宽泛的方式，这里提供的本发明涵盖的高效切向流过滤过程涉及使将要被分离的物质的混合物通过一个或者更多的位于装置或者组件中的滤膜，该装置或者组件被设计成在某些特定的TMP和通量条件下进行的某种切向流过滤类型。TMP保持在通量对TMP曲线中的压力依赖区域的范围内，即不超过临界点TMP数值的压力范围。因此，过滤是在通量范围为临界点通量约5％到高达100％的通量下进行操作的。参见以下的图A和B，其中描绘出了通量对TMP曲线以及临界点。结果是膜将目标物质作为截留物选择性地截留下来，而更小的物质通过膜作为透过物流出，或者是目标物质作为透过物流过膜，而混合物中的污染物被膜截留。应当注意的是，用于超滤的目标物质优选为分子量至少为大约1000道尔顿的生物大分子，最为优选的是多肽和蛋白质。另外优选的是，目标物质的大小比将要同它分开的物质(即污染物)更大倍数小于20-300倍，或者比将要同它分开的物质更小，不到其十分之一。

正如这里所使用的，短语“在过滤室内使滤出液按与流体方向平行的方向通过滤出液室重复循环的方式”指的是一种机制或者装置，它引导来自滤出液室的流体的一部分沿着与通过相邻过滤室的流体流动的方向平行或者大体相同的方向(允许在流动中出现一些旋涡)，从过滤室的入口流到出口。优选地，该方式是泵抽吸方式。

应注意的是，随着过滤时间的增加，TMP并不增加，而且在整个过滤过程中也不一定保持恒定。TMP可以随时间保持大致恒定，或者随过滤的进行有所降低。如果所截留的物质正在进行浓缩，则最好随着浓缩步骤的进程而降低TMP。

每一个膜优选具有的孔径大小能够截留尺寸大至10微米、更优选1kDa到10微米的物质。可以通过超滤分离的物质的实例包括蛋白质、多肽、胶体、免疫球蛋白、融合蛋白、免疫球蛋白片段、支原体、内毒素、病毒、氨基酸、DNA、RNA和糖类。可以通过微滤分离的物质的实例包括哺乳动物细胞和微生物，例如细菌。

由于膜过滤器并不完美，可能存在破洞或者不规则处，它们可能比较大而能使得一些要被截留的分子通过膜溜走了，所以本文的一个优选方面是使用一个以上具有相同孔径大小的膜，使膜的放置方式互相平行，优选为一个膜置于另一个膜的上方。用于本目的的膜的优选数目为2个。

尽管在以上的过程中维持压力的适宜通量范围是大约5％到100％，但是通量越低，则所需的膜的表面积就越大。因此，为了使膜上的花费最小，操作时优选在通量处于该范围高端的压力下进行操作。通量的优选范围是临界点通量的大约50％到100％，更为优选的范围是临界点通量的大约75％到100％。

尽管TMP不需要沿着膜表面维持大体恒定，但是优选地仍使TMP维持大体恒定。一般通过在膜的滤出液一侧制造压力梯度来实现这种情况。这样，滤出液通过过滤装置的滤出液室重新循环，循环的方向与过滤装置中截留物室中混合物的流动方向相同和平行。对重新循环的物质的入口和出口压力进行调节，使跨滤出液室的压力降低值与跨截留物室的压力降低值相等。

可以使用多种实际方式获得这种滤出液压力梯度。优选实施方案的一些实施例是图2A和2B种所示的构件。根据这些构件，将要分离的溶质通过入口导管36导入到装置中，如果将要分离的产物是在发酵培养液中，则入口导管与发酵罐(未显示)连接。入口导管还可以连接容器(未显示)，该导管承载着转基因(Tg)乳汁或者细胞裂解物来源或者细胞培养系统中细胞收获之后的上清中。泵是本领域内技术人员所知的任何泵，流速可以根据本领域内技术人员所知的过滤性质进行调整。

在本发明的微滤单元30中，可选地使用压力计45测量来自抽吸装置(pumping means)40的液流的入口压力。在入口导管36内的流体进入到过滤装置50中。过滤装置50在其入口上方部分含有过滤室51，在其出口部分含有滤出液室52。这两个室由过滤膜55分开。入口的流体流向与过滤室51内的过滤膜平行。上方的过滤室51接收含有溶质的混合物(溶质中含有目标分子)。比目标分子小的分子能够通过膜55进入到滤出液中或者离开滤出液室52。浓缩的截留物经出口导管60通过过滤装置50，在那里可以收集截留物，如果需要的话用微滤膜65进一步处理，以获得所需的目标物质，包括使截留物再通过另一个膜。在这一整个过程中，以及为了质量控制的目的，本发明预计可以有一系列的样品点99，使得可以监测分子浓度、pH和污染-“B路径”。或者，截留物流回流至混合物来源的罐或者发酵罐35内“路径A”，通过入口导管36对截留物重新利用以进一步纯化。

含有经过膜55进入到滤出液室52的目标分子的溶液还可以通过出口导管70离开过滤装置，出口导管70和截留物流体离开的出口导管60位于过滤单元50的同一末端。但是，通过出口导管70流出的溶液和目标分子被送回到罐35中，由压力计测量，用于进一步的处理。

相似地，以及由图2B所描绘的，还涉及了根据本发明的双TFF系统80。

在图2A中所示的构件中，需要根据室51和52放置膜，以提供所示的流速和跨膜压力差。在本发明的工艺中有用的膜的形状一般有平板状、折叠式平板状、圆筒、同心圆筒、各种横断面的管道以及其他的构型，可以单独使用或者成组组装在一起，串联在一起或者在过滤装置内平行排列。装置的构建一般使得过滤和滤出液室的走向沿着膜的长度。

适宜的膜是可以从混合物中将所需的物质与不合意的物质分开而基本上不产生堵塞问题、并且速度足以支持系统的连续运转的那些。膜的实例包括微孔膜，其孔径大小通常是0.1到10微米，可以将其制作为截留所有大于额定大小的颗粒。优选地，它们的材质是陶瓷的，用于本发明的微滤和TFF。超滤膜具有较小孔径，并根据被截留的蛋白质的大小来表征。可以获得额定截留分子量从1000到1000000道尔顿的超滤膜。

超滤膜最适合用于本发明的工艺中。超滤膜通常是不对称的，在上游表面有一薄层或者皮层，该薄层是分离动力所需的。它们通常是从再生纤维素或者聚砜制备的。

用于切向流系统80的膜滤器根据将要处理的液体的量而可以以不同构造单元出现，孔径大小也有多种。特别适宜用于本发明的、用于相对大规模的是那些已知的市售切向流过滤装置。

在变通的优选装置中，并且由于以上列出的原因，图2A的微滤装置30包含多个(优选为2个)过滤膜，分别为膜56和57。这些膜以互相平行的构型放置。

本发明还涉及多阶段级联过程，其中来自上一个过程的滤出液在第二个切向流过滤装置中通过比第一个装置中的膜孔径小的过滤膜，来自这第二个过滤的滤出液被回收回第一装置中，然后该过程重复进行。

适宜本发明的工艺或者与微滤单元30联合使用的一种切向流系统80图示于图2B中。这里，第一容器85通过入口导管90与设置在过滤单元95内的过滤室96相连。第一输入抽吸装置100设置在第一容器85和过滤室96之间。过滤室96通过出口导管110与第一容器85相连。过滤室96被第一过滤膜115与在过滤装置95中位于其正下方的第一滤出液室97隔开。第一滤出液室97具有出口导管98，其与室97的入口相连，在导管98处设置了滤出液抽吸装置120。与出口导管98相连的导管45还与另一容器120相连。

该容器120通过入口导管125与另一过滤室127相连，过滤室127设置于第二过滤装置130中。第二输入抽吸装置133被设置于第二容器120与过滤室127之间。过滤室127被第二过滤膜128与在过滤单元130中位于其正下方的第二滤出液室129隔开。第二滤出液室129具有出口导管135与室129的入口相连，在导管135内设置了滤出液抽吸装置140。与出口导管135相连的导管125还与第三容器150相连。

该容器150通过入口导管155与第三过滤室157相连，室157被设置于第三过滤装置160中。第三输入抽吸装置165设置于第三容器150和过滤室157之间。过滤室157被第三过滤膜165与在过滤装置160中位于其正下方的第三个滤出液室159隔开。第三滤出液室159具有出口导管170与导管155相连，导管155与第一容器150相连，使滤出液重复循环到原来的罐内。还提供了样品点99以及压力计175用于监控该过程。

本发明的工艺可很好地调试成用于商业规模。该工艺可以按照分批运行或者连续运行，或者以半连续的方式运行，即在连续流的基础上，将含有所需物质的溶液通过切向流滤器，直至整个大批被过滤，在不同的过滤阶段之间插入有清洗步骤。然后就可以处理新鲜的分批溶液。这样，可以进行连续的循环过程而在相对短的时间内获得大量的纯度可以接受的所需产物。

由这里描述的切向流过滤的独特性质以及其对含有固体的溶液提供连续过滤而不会出现滤器堵塞的能力得到了一种有高度优势的工艺，它可以连续地并在商用规模上分离和纯化生物反应产物。而且，该过程可以用于大范围内的生物分子，例如转基因来源的蛋白质产物、抗体、细胞碎片和细胞培养物裂解物。

以下的实施例进一步详细举例说明了本发明，但是这些实施例的目的并不是限制性的。在这些实施例中，所有参考文献中公开的内容均明确引入作为参考。

材料和方法

对于所有使用微滤系统进行的实验(除了供给与排放实验以外)，使用以下的设备：

经过校准与泵相关的601pm泵(泵曲线)

1″OD不锈钢清洁管道系统

0.2微米孔径陶瓷膜，面积为0.2平方英寸或者1.5平方英寸

具有一个1/2″物料出口的不锈钢清洁膜支架

1/4″ID弹性透过物管线

截留物管线上的隔膜阀

两个压力计

钢制的1.2升补料贮罐

3/4″ID弹性截留物管线

对于所有的双TFF实验，将前面的设备与以下的设备联合使用：

最大输出量为800mlpm的隔膜泵

所有管线上都有1/4″弹性抗压力管材

一个压力计，用于测定补料液的压力

在截留物和透过物管线上的两个隔膜阀

30kDa额定截留分子量的PES Pall Filtron Centramate膜，面积为0.2平方英寸或者1平方英寸

不锈钢的Pall Filtron Centramate膜支架

1个不锈钢U型管与透过物出口相连

膜的选择

用于双TFF系统的膜选自一组具有不同几何形状和额定截留分子量的膜。以前的研究对多聚物材质的高截留分子量UF膜以及陶瓷材质的膜用于澄清步骤进行了考察。将乳汁浓缩两倍、然后进行双TFF对于所有的膜来讲都是挑战。然后对膜进行多次运行和清洁以分析膜的重复使用性。当膜的标准化水通量维持在未使用过的膜的80％以上，则认为该膜已经再生而可以用于下一步的过程。没有一种平板型的多聚物膜盒在三次使用后仍然能够保持目标水通量回收率，而陶瓷材质的膜可以再生利用60次以上。这是由于可以用更为苛刻的条件即更高浓度的化学物质和更高的温度来清洁陶瓷之故。30kDa超滤膜在20次循环后保持了高的水通量回收率。

用0.2微米额定截留分子量的陶瓷管状膜测试用于澄清乳汁并且使IgG1抗体通过的第一个单元。使用30kDa截留分子量的平板状超滤膜测试用于捕获IgG1抗体的第二个系统。

分析方法

对每个实验中的样品进行分析：用蛋白A HPLC分析IgG含量，用SDS-PAGE检查降解，用等电聚焦(IEF)检查修饰，用大小排阻层析(SEC)检查聚集情况。

步骤

使用0.2微米截留分子量的陶瓷微滤膜进行一系列的对照实验，期望理解工艺操作关系。测量产物通量(Jp)，其与流速(u)、跨膜压力(TMP)、温度(t)和乳汁浓度(c)有关。一旦关系建立，则确定操作的最佳窗口，并且测试集成性工艺。取样并且收集质量平衡数据，分析最初产物产率和处理量。(请参见图2A和2B)

温度实验

此目的是确定以最小的体积通过0.2微米、3毫米管道的陶瓷微滤膜、得到最佳IgG1抗体通量时的操作温度范围。为了在处理过程中用SDS-PAGE和Western印迹分析IgG1抗体的降解，在乳汁混和之前测定每个乳汁部分的pH。将乳汁混入微滤补料罐中，记录总体积。这时微滤泵控制器的频率从20赫兹升高到45赫兹(大约5L/min升高到20L)。记录每一个后继时间点的所有参数，例如温度、压力、交叉流速率、透过物流速和体积。重复循环运行该微滤环(路径A)5分钟。将跨膜压力调整为12psig，再重复循环5分钟(路径A，维持温度为20摄氏度)。使透过物管线通向排水道中，直至乳汁浓缩为原来的两倍(收集透过物)。温度维持在20摄氏度。从补料罐和透过物管线中取样品2和3。然后将透过物管线返回路径A，并重复循环10分钟。取样品4和5。使温度上升至25摄氏度。重复循环系统10分钟，然后取样品6和7。使温度上升至30摄氏度。然后重复循环系统10分钟，取样品8和9。使温度上升至35摄氏度。然后重复循环系统10分钟，取样品10和11。使温度上升至40摄氏度。然后重复循环系统10分钟，取样品12和13。关闭泵并在2-8摄氏度下储存样品，用于IgG的定量(样品1，3，5，7，9，11，13，15，17进行SDS-PAGE，检查降解和聚集；样品1和16用I EF分析；样品1，3，16，17用SEC分析)。

微滤乳汁浓缩实验

根据本发明的优选实施方案，本实验的目的是确定用最小的体积通过0.2微米、3毫米管道的陶瓷微滤膜、得到最佳IgG1抗体通量时的起始乳汁浓度的范围。

在操作中，在乳汁混和之前，测量每个乳汁部分的pH。将乳汁混入微滤补料罐中，记录总体积。这时将微滤泵控制器的频率从20赫兹升高到45赫兹(大约5L/min升高到20L)。记录每一个后续时间点的所有参数，例如温度、压力、交叉流速率、透过物流速和体积。重复循环运行该微滤环(路径A)5分钟。将跨膜压力调整为12psig，再重复循环5分钟(路径A，维持温度为20摄氏度)。将跨膜压力调整为15psig，重复循环运行(路径A)5分钟。使透过物的管线通向排水道中，直至乳汁浓缩，收集550毫升的透过物，然后将透过物管线返回路径A(重复循环10分钟)。分别从补料罐和透过物管线中取样品2和3。

将透过物管线通向路径B，并向补料罐中加600毫升乳汁。将透过物的管线通向排水道中，直至乳汁浓缩，收集500毫升的透过物，然后将透过物管线返回路径A(重复循环10分钟)。分别从补料罐和透过物管线中取样品4和5。然后将透过物管线通向路径B，并向补料罐中加入500毫升乳汁。将透过物的管线通向排水道中，直至乳汁浓缩，收集500毫升的透过物，然后将透过物管线返回路径A(重复循环10分钟)。分别从补料罐和透过物管线中取样品6和7。然后将透过物管线通向路径B，并向补料罐中加入380毫升乳汁。将透过物的管线通向排水道中，直至乳汁浓缩，收集400毫升的透过物，然后将透过物管线返回路径A(重复循环10分钟)。分别从补料罐和透过物管线中取样品8和9。关闭泵并在2-8摄氏度下储存样品，用蛋白质A分析进行IgG定量；用SDS-PAGE和Western检查降解和聚集；用SEC检查聚集；经IEF检查等电点的改变。

流速和TMP实验

为了确定跨膜压力(TMP)、交叉流速度、滤出液澄清度、膜液体通量和IgG1抗体通过0.2微米、3毫米管道的陶瓷微滤膜之间的关系，在1升非转基因乳汁中掺入3.7克IgG1抗体(2.5g/L)，将掺入后的乳汁置于1.5升的补料罐内。掺入后的乳汁在室温下一边连续搅拌一边通过微滤环被以30L/min的速率泵出，使用以下的起始参数：

膜面积：0.164平方英寸

膜孔径大小：0.20微米

起始乳汁体积：1.0升

料液压力：10psig

透过物压力：0psig

料液速率：20L/min

乳汁温度：30摄氏度

样品#1

该样品取自掺入后的乳汁。微滤的透过物管线返回补料罐内。在10分钟时，将透过物通向“路径B”(透过物通向排水道)。这将使乳汁浓缩至500毫升。当乳汁的浓度是起始浓度的两倍时，将透过物返回路径A(重复循环至补料罐内)。10分钟的重复循环后，取样品2和3，然后调整返回压力阀，使靠近泵的补料压力示数为10psi。通过调整泵速度为55赫兹，使补料流速保持在13.351/min。10分钟重复循环后，取样品4和5，然后调整返回压力阀，使靠近泵的补料压力示数为14psi。通过调整泵速度为60.66赫兹，使补料流速保持在13.351/min。10分钟重复循环后，取样品6和7，然后调整返回压力阀，使靠近泵的补料压力示数为12psi。通过调整泵速度为40赫兹，使补料流速调整至7.751/min。10分钟重复循环后，取样品8和9，然后调整返回压力阀，使靠近泵的补料压力示数为14psi。

通过调整泵速度为43.45赫兹，使补料流速保持在7.751/min。10分钟重复循环后，取样品10和11，然后调整返回压力阀使靠近泵的补料压力示数为10psi。通过调整泵速度为48赫兹，使补料流速调整至12.361/min。10分钟重复循环后，取样品12和13，然后调整返回压力阀使靠近泵的补料压力示数为14psi。通过调整泵速度为55.44赫兹，使补料流速保持在12.361/min。10分钟重复循环后，取样品14和15，然后调整返回压力阀使靠近泵的补料压力示数为20psi。通过调整泵速度为61.69赫兹，使补料流速调整至12.361/min。10分钟重复循环后，取样品16和17，然后通过调整泵速度为64.64赫兹，调整补料流速为13.351/min，调整返回压力阀使靠近泵的补料压力示数为20psi。10分钟重复循环后，取样品18和19，然后通过调整泵速度为52.65赫兹，调整补料流速为7.751/min，调整返回压力阀使靠近泵的补料压力示数为20psi。10分钟重复循环后，取样品20和21，然后关闭泵。所有的样品冷藏保存，用蛋白质A测定法确定总IgG含量。对透过物样品(3，5，7，9，11，13，15，17，19，21)目测检查澄清度。

双处理实验

为了在双TFF系统中测试在前面的实验中确定的工艺参数从非转基因乳汁中回收细胞培养物IgG1抗体的情况，用2.4克的细胞培养物IgG1抗体掺入非转基因乳汁中，总体积为1000毫升，取1号样品。将掺入后的乳汁置于微滤系统的补料罐内，以13.41/min的速度泵出并跨过膜。在每个后续时间点记录温度、压力、透过物流速和体积。调整系统至以下的起始参数：

膜面积：0.2sqft

膜孔径大小：0.20um

起始乳汁体积.：1000mL

跨膜压力：14psig

透过物压力：0psig

浓缩：1x

使微滤的透过物管线返回至补料罐。在10分钟时，将透过物导入“路径B”(引流透过物)。当乳汁浓缩至500毫升或当乳汁的浓度是起始浓度的两倍时，将透过物返回路径A(重复循环回补料罐内)。按照以下的条件启动超滤泵：

膜面积：0.2sqft

膜孔径大小：30kDa

起始体积.：500mL

跨膜压力：7.3psig

透过物压力：1.4psig

浓缩：1x

10分钟重复循环后，调整超滤截留物和透过物的压力，使超滤的透过物流速与微滤的透过物流速相等。然后将超滤的透过物管线通向微滤的补料罐内，将微滤的透过物管线通向超滤的补料罐内，开始透滤。运行该系统共326分钟，对每一透滤体积都取样。所有的样品冷藏保存，用蛋白质A测定法确定总IgG含量，用SEC检查聚集。

使用CHO细胞产生的IgG抗体的实验显示跨膜压力为14psig时的最佳流速为大约23cm/s(图表C和D)。但是含有目标蛋白质或者免疫球蛋白的料液可能来自任何能够产生这种分子的来源，包括但是不止限于产生外源重组蛋白的转基因动物。根据本发明的最适温度是30-35摄氏度之间(图表A)。非转基因乳汁显示液体通量在1.5-2X时最高(图表B)。当在双TFF系统中测试这些参数时，得到了82.3％的产率(图表H)。使用来自山羊C1017的天然转基因乳汁重复流速和跨膜压力实验，显示跨膜压力为16psig时最适流速为40-45cm/s(图表E和F)。在所发现的参数下对天然转基因乳汁使用CHO细胞表达的IgG1抗体进行的双TFF过程测试得到的产率为64％(图表G)。转基因山羊可以来自任何的哺乳动物，优选来自有蹄类动物，最优选来自山羊或者牛。

掺入研究：

                        图表A                                                 图表B

                         图表C                                                图表D

转基因乳汁：

                        图表E                                               图表F

工艺测试

                        图表G                                              图表H

尽管向非转基因乳汁中掺入CHO细胞IgG1抗体对于IgG1抗体在乳汁中的行为有了初步的观察，含有IgG1抗体的天然分泌的乳汁在使用根据本发明优选使用的0.2微米的陶瓷材质膜时，需要对参数进行不同的优化。与转基因乳汁的研究相比，掺入研究显示了较低的最适流速和非常高的产物通量。而且，使用对转基因乳汁优化的参数运行双TFF，对掺入IgG1抗体的天然非转基因乳汁得到的产物回收率更低。

切向流过滤(TFF)作为一种工艺而实施，它通过去除原料乳汁中的颗粒状物质如脂肪、酪蛋白微球和细菌而使乳汁基质中的IgG1抗体澄清和稳定。TFF广泛用于生物技术和乳制品工业中，用于除去杂质和浓缩产物。为了根据本发明有效地使用TFF，重要的是要选择适当的膜，对工艺参数(温度、跨膜压力、交叉流速度和乳汁浓度)进行优化以得到高产物通量，并开发出清洁和矩阵储存的步骤以保证膜具有较长的寿命。这里根据本发明描述了实验性矩阵，并且将其用于转基因山羊乳汁以确证前面的操作参数。对膜的清洁和储存条件也进行了研究。还开发出了一个无菌过滤步骤以除去在TFF过程完成之后仍然存在于含有目标蛋白的澄清化乳汁产物中的任何细菌。然后将工艺信息传送到中试规模的设备中，进行最初的工程运转。一些工艺设计标准包括不使用添加剂以防止对注射用水的需求、长的滤膜寿命、高产率以及短的处理时间。本发明的工艺优选地被设计为可以针对中试和生产操作而被放大。

工艺描述

为了使用0.2微米的陶瓷材质微滤膜和30kDa超滤膜进行双TFF，对来自山羊D035的转基因乳汁进行澄清和浓缩，用0.1M氢氧化钠对系统进行清洁。然后必须将乳汁混和并提高温度至15-20摄氏度。必须通过收集陶瓷膜的透过物而将乳汁在微滤系统上浓缩至其原有体积的一半。微滤必须在141pm的交叉流速率和15psi的跨膜压力下运行。温度必须保持在27摄氏度或者左右。然后必须在1.6-21pm的交叉流速率下启动超滤系统。必须调整超滤的截留物和透过物的压力，使超滤的透过物流速与微滤的透过物流速相匹配。一旦超滤的透过物流速与微滤的透过物流速相匹配，必须将两个系统相偶联以使微滤的透过物管线通向超滤的补料罐中，而超滤的透过物管线通向微滤的补料罐中。两个系统必须偶联运行5-6个透滤体积。一旦透滤完成，将两个系统分开，关闭微滤系统，排空并且清洁，将超滤的透过物通向排水道直至超滤补料罐内的半成品澄清浓缩液的体积降低一半，使总浓度提高4倍。然后排空超滤系统，对半成品澄清化浓缩物进行无菌过滤，并清洁超滤系统。两个系统都保存在0.1M氢氧化钠中。工艺示意图在图1中提供。

膜的选择

根据以前的研究，使用0.2微米标称的陶瓷管状膜，对用于澄清乳汁和通过IgG1抗体的第一个装置进行测试。使用30kDa截留分子量的平板状超滤膜对用于捕获IgG1抗体的第二个系统进行测试。对于使用D035乳汁的每个实验中的样品进行分析，分析项目包括用蛋白质AHPLC分析IgG含量，用SDS-PAGE检查降解，用等电聚焦检查修饰，用大小排阻层析(SEC)检查聚集。确定用最小的体积通过0.2微米、3毫米管道陶瓷微滤膜、得到最佳IgG1抗体通量时的起始乳汁浓度范围。在处理过程中用SDS-PAGE和Western印迹检查IgG1抗体的降解，以测定浓缩步骤对于IgG抗体产生的影响(如果有的话)。完成两个实验以研究乳汁浓度，包括一次用非转基因乳汁运行的实验和一次用转基因乳汁运行的实验。

非转基因补料与排放实验

由于可以获得非转基因乳汁的充足供应，所以使用非转基因乳汁分析在使用0.2微米陶瓷微滤膜浓缩时液体通量的衰减。用于该实验的设备与微滤实验中描述的设备相同，但是添加了第二个补料罐以及料液泵，以便将乳汁运送到微滤系统的补料罐中，运送速率与透过物

从膜流出的速率相同。设备的示意图如下：

图表1

如在图表I中看到的，用1500毫升的乳汁填充补料罐，泵开始的速率是45赫兹。在没有截留物压力的情况下重复循环系统10分钟。记录所有的参数。然后将截留物的压力提高到10psig，跨膜压力为11psig。通过调整截留物阀门而在整个实验中维持该跨膜压力恒定。将透过物导入到排水道中，启动第二个泵，将新鲜的乳汁泵入到补料罐内，泵入的速率与透过物流出的速率相同，使得补料罐内的体积保持恒定。每隔5-10分钟记录所有的参数，调整第二个泵的速度使补料罐内的乳汁水平保持恒定。实验一直进行到乳汁被浓缩5.37倍或者82％。

转基因乳汁浓度与产物通量

测量D035每一次产奶的pH和体积，并且记录于pH表格中。合并D035的RM01-001PD到RM-004PD部分的乳汁，总体积为3升。从其中取样F1，将1500升倒入补料罐内。启动泵，将速度从20赫兹增加到45赫兹(大约5LPM到大约20L)。记录温度、压力、交叉流速率、透过物流速和体积。在每个后继时间点记录所有的参数。重复循环运行该系统(路径A)5分钟。调整跨膜压力到12pisg，重复循环(路径A)5分钟。将透过物管线通向排水道直至乳汁浓缩1.5倍，收集550毫升的透过物。分别从补料罐和收集的透过物中取样F2和P1。将透过物管线返回路径A，重复循环10分钟。分别从补料罐和透过物管线中取样F3和P2。之后向补料罐内加入500毫升新鲜乳汁，将透过物通向路径B以将乳汁浓缩至2倍，收集500毫升的透过物。将透过物管线返回路径A，重复循环10分钟。分别取样F4和P3。重复上述过程，将乳汁浓缩至2.5倍和3倍，继续取样。关闭泵。将样品储存于2-8摄氏度，用于IgG定量和SDS-PAGE分析。

确定以最小的体积通过0.2微米、3毫米管道陶瓷微滤膜、得到最佳IgG1抗体通量时的操作温度范围。由于处理造成的IgG抗体的降解由SDS-PAGE分析。由IEF追踪同I型的修饰。测量山羊D035每一次产奶的pH和体积，并且记录于pH表格中。合并D035的RM01-005PD到RM01-008PD部分的乳汁，总体积为3000毫升。从混合物中取样F1。将2升倒入补料罐内。启动泵，将速度从20赫兹增加到45赫兹(大约5LPM到大约20L)。记录温度、压力、交叉流速率、透过物流速和体积。在每个后继时间点记录所有的参数。重复循环运行该系统(路径A)5分钟。调整跨膜压力到12pisg，重复循环(路径A)5分钟。保持温度为20摄氏度。将透过物管线通向排水道直至乳汁浓缩2.5倍，收集800毫升的透过物。分别从补料罐和收集的透过物中取样F2和P1。将透过物管线返回路径A，继续重复循环，降低TMP至2psi，泵的速度降低至28赫兹(17LPM)运行17分钟，使温度降低到23摄氏度。将泵的速度和TMP分别提高至45赫兹和15psi，在24摄氏度下重复循环5分钟。取样F3和P2。将温度提高至27摄氏度，乳汁重复循环5分钟，取样F4和P3。在29摄氏度和36摄氏度重复上述步骤。剩余的新鲜乳汁通过微滤膜澄清。关闭泵。样品储存于2-8摄氏度，用于IgG定量、IEF和SDS-PAGE分析。

流速和TMP与产物通量

确定通过0.2微米、3毫米管道陶瓷微滤膜、得到最佳IgG1抗体通量的跨膜压力(TMP)范围和交叉流速度范围。测量D035每一次产奶的pH和体积，并且记录于pH表格中。合并D035的RM01-009PD到RM01-0012PD部分的乳汁，总体积为3700毫升。从混合物中取样F1。将1升倒入补料罐内。启动泵，将速度从20赫兹增加到45赫兹(大约5LPM到大约20L)。记录温度、压力、交叉流速率、透过物流速和体积。在每个后继时间点记录所有的参数。重复循环运行该系统(路径A)5分钟。调整跨膜压力到12pisg，重复循环(路径A)5分钟。将透过物通向排水道直至乳汁浓缩2倍，收集500毫升的透过物。分别从补料罐和收集的透过物中取样F2和P1。将透过物管线返回路径A，继续重复循环10分钟。取样4和5。调整跨膜压力为10psig，通过提高泵速至38.81赫兹(大约14LPM)来维持补料流速。乳汁通过微滤系统重复循环10分钟，然后取样P3。根据以下的表格重复该步骤：

截留物流速(LPM)	泵速度(Hz)	跨膜压力(psig)	样品号(ID)
				14	38.81	10	P2
14	45.86	15	P3
				12	35.96	10	P4
12	47.03	15	P5
				8	30.26	10	P6
8	37.63	15	P7
				16	41.66	10	P8
16	48.37	15	P9
				16	54.19	20	P10
14	51.44	20	P11
				12	48.68	20	P12
8	43.17	20	P13

关闭泵。将样品储存于2-8摄氏度，用于通过蛋白A定量而进行IgG定量、IEF和SDS-PAGE分析。

工艺测试

为了澄清D035乳汁，使用双TFF系统，使用面积为1.5平方英寸的0.2微米陶瓷微滤膜，将微滤透过物补料30kDa、1.0平方英寸的30kDa超滤膜，在每一个透滤体积时对IgG抗体的回收进行分析。测量山羊D035每一次产奶的pH和体积，并且记录于pH表格中。合并山羊D035的1776-032601-01-B RM01-029PD-RM01-032PD部分和RM01-033PD-RM01-036PD部分的乳汁，总体积为大约4升，用于每一次实验。从混合物中取样F1。将1500毫升倒入补料罐内。启动泵，将速度从20赫兹增加到45赫兹(大约5LPM到大约20L)。记录温度、压力、交叉流速率、透过物流速和体积。在每个后续时间点记录所有的参数。重复循环运行该系统(路径A)5分钟。调整跨膜压力到15pisg，重复循环(路径A)5分钟。将透过物管线通到量筒中。随着补料罐内体积的下降，加入新鲜乳汁。收集透过物，直至乳汁浓缩3倍，收集到2700毫升。分别从微滤补料罐和收集的透过物中取样F2和P1。再次将透过物管线返回路径A。将交叉流速率和跨膜压力分别提高到14LPM和15psig。启动超滤系统，交叉流速率为0.8LPM，料液压力为11psi。每一个系统同时重复循环10分钟。将超滤透过物引到排水道中，收集800毫升的透过物。测量微滤的透过物流速。调整超滤系统上的截留物和透过物压力，使透过物流速与微滤系统的透过物流速相等。将微滤系统的透过物通向超滤系统的补料罐中，而将超滤系统的透过物通向微滤系统的补料罐中。计算透滤时间(参考计算部分)。在每一次透滤结束时取样。测量透过物流速并重新计算透滤时间。进行7个透滤体积。分开两个系统，关闭微滤系统。将超滤的透过物引入排水道中，使澄清化的乳汁浓缩到总浓缩倍数为4倍。然后关闭超滤系统。样品储存于2-8摄氏度下，用于IgG定量、IEF、SEC和SDS-PAGE分析。从系统中取出澄清过的浓缩超滤截留物，无菌过滤，2-8摄氏度储存。

膜的清洁

使用严格的清洁程序以保证每次循环都有高的水通量回收。将清洁步骤设计成模拟乳制品工业中标准的膜清洁步骤，也考虑到了生物制药实践的一些方面。对水冲洗步骤进行优化，以使用水量最小，同时将残留的化学物质冲走，达到适当的pH和电导值。在每次工艺步骤之后进行以下的清洁步骤，如以下的表1和2所示：

表1

陶瓷膜清洁步骤

	步骤	浓度	体积	时间	温度	pH
							1)2)4)5)6)7)8)＞9.59)10)	水冲洗NaOH洗涤次氯酸钠NaOH洗涤次氯酸钠水冲洗柠檬酸洗涤水冲洗次氯酸钠NaOH水冲洗NaOH储存	-0.5M400ppm0.5M400ppm-0.4M-300ppm0.05M-0.1M	16-20L1120-251161121	5分钟10分钟30分钟5分钟30分钟10分钟15分钟10分钟	60℃6060606060606020	7.0＞11.5＞11.57.0＜2.757.07.010-12

表2

30kDa PEs膜清洁步骤

	步骤	浓度	体积	时间	温度	pH
							1)2)4)5)6)＜2.757)10)	USP水冲洗NaOH冲洗次氯酸钠NaOH洗涤次氯酸钠USP水冲洗柠檬酸洗涤USP水冲洗NaOH储存	-0.5M250ppm0.5M250ppm-0.4M-0.1M	2L/sqft2L/sft2L/sqft4L/sqft2L/sqft4L/sqft	60分钟60分钟	35℃353535353535	5.0＞11.5＞11.57.07.010-12

在第一次使用膜以前，针对跨膜压力、温度和水通量制作标准化的透水性曲线。在实验中使用膜之前，要检查标准化的水渗透性使其保持最少80％的水通量回收率。在开发中，陶瓷膜保持了95-105％的回收率，而30kDa PES膜保持了80-90％的回收率。

无菌过滤

如下面的图J所示，PallGe lman Inc.制备了除菌滤器，由Supor膜制成，其中有0.8微米的前滤膜与0.2微米的滤膜组合在套盒中。这些套盒的面积为200平方厘米，这是小盒型式的用于除菌过滤的最小膜面积。进行实验以确定每个小盒的过滤容量。用双TFF澄清非转基因乳汁，制备大量的澄清化乳汁，它可以模拟无菌处理过程中的料液。将37毫米的盘状Supor膜装在不锈钢的正常流支架上，并装配数字压力传感器和蠕动泵。用USP水冲洗整个系统使膜润湿并且检查是否有渗漏。然后将澄清的非转基因乳汁以恒定的流速泵入该系统中，定时记录压力。将数据拟合成直线，在下面的图表中该直线将处理量与压力联系起来。由于在30psig压力时膜会被堵住，所以用外推法计算30psig时的处理量，以确定容量。对于37毫米的膜推算出的处理量为7343毫升，所以200平方毫米的盒，处理量估计为131升。

图表J：

膜的储存

当膜的清洁方案确定以后，就可以测定储存条件。在清洁48小时后将膜储存于水中或者0.1N氢氧化钠中。将储存溶液漂洗掉，检查NWP，并与清洁后的NWP相比较。储存之后两个NWP的变化都在储存之前NWP的10％以内。由于0.1N氢氧化钠可以抗细菌和真菌，NWP在储存中没有下降，所以选择0.1N氢氧化钠作为储存剂。

浓缩与产物通量

几乎在浓缩刚一开始时液体的通量就开始下降，在整个实验中通量持续平缓下降。最后几个点显示出由于膜污染而通量出现急剧下降。为了在处理过程中保持最适的液体通量，同时使用足够低的体积进行操作以便有合理的透滤时间，所以推荐1.5到3倍的乳汁浓缩。

图表K：

通过蛋白质A HPLC对IgG进行定量，显示IgG1抗体和液体通量随乳汁的浓缩而稳步降低。从下面的图表L可见，在运行双TFF时，1.5到2.5倍浓缩是合理的。SDS-PAGE显示没有由于乳汁浓缩而出现聚集或者降解。

图表L：

温度与产物通量

通过微滤膜的IgG1抗体质量通量在27摄氏度时达到最大，为20.3克/平方米/小时，如下面图表所示。最适的操作范围是26-29摄氏度。参考下面的图M，IEF显示未出现由于处理而造成的IgG1抗体同I型的修饰。对于乳汁样品，SDS-PAGE不能提供信息；而澄清过的乳汁样品则显示有降解条带出现。这些降解条带在D035的初始乳汁样品中存在，在经TFF的澄清后半成品材料中条带变浅。

图表M：通量与温度的关系

流速、温度与产物通量

对于每一个TMP有一个最适的流速，但是在TMP为15psi、流速为42cm/s(141pm)时，IgG1抗体通量是整体最高的。下面的图显示了在每个跨膜压力下流速的影响曲线。IEF检查未发现由于处理造成的同I型的改变，SDS-PAGE显示了与前一实验相似的结果。

图表N：

如图N所示，第一个工艺测试显示了从乳汁混合物中总的IgG1抗体回收率为81％。但是其中有20％是聚集的。在澄清结束时的IEF条带与初始乳汁混合物的IEF条带看起来相同。而且取自中间透滤体积的样品显示了非常低的IgG1抗体浓度，表明样品取自超滤补料罐内未混和的区域。重复该实验。

第二个工艺测试显示IgG1抗体的回收率为90％，只有5％±0.5％的IgG1抗体发生聚集。IEF凝胶显示未出现由于处理造成的同I型修饰。SDS-PAGE显示了轻微的聚集和降解条带，但是这些条带并不意味着聚集或者降解的蛋白占据明显的百分比，因为在最终的样品中通过大小排阻层祈测定有96.2％为单体。由于低的IgG1抗体起始浓度，用于IgG定量的蛋白质A测定使得确定回收IgG1抗体所需的透滤次数变得很困难。六次透滤后的回收率为90％，但是五次透滤后通过蛋白质A测定的回收率为170％。因此五到六次的透滤很可能对于回收IgG1抗体来讲已经足够了。

在中试厂房中使用的设备上进行了几次工程运行以澄清乳汁之后，确定需要对设备和步骤进行修改以稳定地生产澄清的乳汁。将设备从中试厂房的GMP环境中移到开发实验室中，进行大量的测试。对于系统的改变包括减少透过物的运输以及改变系统中阀门的位置，使得在清洁和消毒步骤中的漂洗更加便利。对清洁方案作少量改动，以改进清洁效率并降低耗水量。确定了工艺温度范围。最后在GMP记录中更加明确工艺的参数。

中试设备的原始设计完全使用的是不锈钢。该设计清洁起来非常麻烦，因为有许多很长的管道需要进行拆卸，从工艺处理的组装方式变为清洁阶段的组装方式。由于超滤透过物管道的长度和内径，在清洁方案中，这些管道不能被有效地清洁或漂洗。在微滤系统中加入一些部件以有助于清洁，但是这些部件的搭建会导致残渣累积的死空间。通过用1/4″内径的管道代替长的超滤透过物管道，消除了这些问题。改变清洁设置，使微滤膜上面的出口可以用于清洁膜的透过物一端，这样就不需要其他的部件了。超滤的透过物管道在清洁过程中仍然保留在超滤系统上。而且在系统的微滤部分上安装有大型的热交换器，使微滤的温度可以被更精细地控制，但是这样就不能将超滤部分的温度控制在工艺要求的正确范围内。将热交换器从系统中移走，调整冷却器的设置，以便将两个系统都冷却到正确的温度范围内。最终的设计如下。用于储存、消毒和处理而装配的设备。在本发明的一个优选实施方案中的设备配置如下面的图0和P所示。

用于清洁装配的设备

上图为图0，下图为图P

对设备还有其他简单的改动。在使用水对超滤系统进行测试以确定妨碍足够的跨超滤膜交叉流的高压产生的原因之后，发现膜向下的扭矩过大，适宜的扭矩是60英寸.磅。泵的转子和密封垫也有脱落。向超滤膜上游的管线中插入80目滤网垫片，截获大的脱落物，防止流动限制和超滤膜上压力的积聚。移动超滤截留物阀，使其与超滤补料罐相邻。在处理过程中连接微滤透过物阀门和超滤补料罐的卷筒(spool piece)被去掉，使阀门与补料罐直接相连。这些改动使设备在清洁步骤时更易清洁和漂洗，并使得整个系统在消毒和接下来的漂洗以及洁净水透水性测试中保持为工艺处理模式的连接状态。

工艺过程改变

对TFF操作SOP和处理含IgG1抗体的乳汁的批记录进行修改，使其包括交叉流速率、跨膜压力以及微滤和超滤系统温度的范围。通过一系列实验确定温度范围。研究的参数以及产生的澄清乳汁的质量在下面的表3中予以概述。HEX指的是在微滤系统上使用热交换器。比较最后三次运行(5-7)时温度范围的图表在附录B.1中。

表3工艺过程改变

运行	笔记本页码	HEX(y/n)	MF温度范围(℃)	UF温度范围(℃)	冷却器SP(℃)	质量
							1	137-151	Y	22	30	22	混浊
2	152-156	N	25-29	22-27	20，15	清澈
							3	157-160，173	N	25-30	24-28	15	清澈
4	162-162	N	20-30	23-29	15	混浊
							5	169-172	N	20-26	21-24	10	清澈
6	176-179	N	20-26	21-24	10	清澈
							7	N/A	N	20-27	21-24	10	清澈

在中试设备上进行的所有工程操作产生的都是模糊或者混浊的澄清化乳汁。在过高的温度下操作会使澄清化的乳汁看起来模糊并且颜色几乎为绿色，而不是看起来清澈且呈黄色。高温处理可能导致乳汁中一般情况下被截留的多种分子通过微滤膜，并且可能会影响IgG1抗体的稳定性。当工艺过程在合适的交叉流速率以及跨膜压力下运行时，泵并不会导致温度升高到在工程运行中所见到的无法控制的情况。澄清化乳汁中的模糊物质还可能是由于在一些运行的清洁中不正确的冲洗留下的化学物质残留，样品的pH经测定为9(正常为6.7)。通过调整设备和清洁步骤，充分地将化学物质从系统中冲走，这可以通过测定所有液流中漂洗水的pH和电导率而看出。

在过低的温度下操作会使澄清化的乳汁看起来混浊，且有白色的絮状物质均匀分布在乳汁中。在微滤系统中安装热交换器时，温度很容易控制，但是澄清化的乳汁仍然混浊。根据P.F.Fox and P.L.H.McSweeny(1998)的Dairy and Biochemistry，酪蛋白在其等电点时是不溶的，而且不溶性的范围随着温度的升高而增大。这提示在较高的温度下进行微滤比在较低的温度下进行微滤能够除去更多的酪蛋白，而且微滤操作的温度比超滤操作低会使得通过微滤的处于溶解状态的酪蛋白在更为温暖的超滤过程中变得不溶。SDS-PAGE确证了这个现象，显示与在实验规模运行(bench scale run)和成功的中试运行中制备的澄清化乳汁相比，在低温下进行的运行产生了过量的酪蛋白(下图)。因此需要在维持高度酪蛋白不溶性和最低的可能温度之间找到一个平衡。根据所进行的运行，在22摄氏度下进行微滤则温度太低，在30摄氏度下进行运行则温度又太高。在运行的大部分过程中保持微滤的运行温度在25摄氏度附近可以重复产生出清澈的澄清化乳汁。图3中提供了SDS-PAGE凝胶比较。请参考图3。泳道1是分子量标准。泳道2是细胞培养物IgG1抗体。泳道3是2001年4月17日进行的工程运行的最终澄清半成品。泳道4是中试运行6(合适温度)的最终澄清半成品，泳道5是实验性TFF得到的澄清化半成品物质。与中试运行6和实验性澄清化物质的样品相比较，工程运行样品显示出多得多的酪蛋白。

清洁和消毒的改变

进行的设备改变使清洁和消毒方案也必须改变。在上表中，每次运行之后都运行清洁方案。需要使微滤上的截留阀保持半开放，以便于每一漂洗步骤中能够恰当地漂洗，原因是在阀和补料罐之间有一段长的死端。在第4次运行之后，运行清洁方案，跟踪水的消耗(笔记本10586)。在该实验中使用的水在第5、6和7次运行后得以证实，并且推荐在GMP工艺过程中使用。正如前面所陈述的，设备的改变可以使整个系统以工艺处理模式进行消毒。对此进行了检测。也测定了将消毒剂润从漂洗系统中洗掉所需的USP水。

操作

使用双TFF进行乳汁处理所采取的实际步骤在下面的部分中予以描述。这些包括从系统消毒到工艺处理、清洁以及储存的整个过程。在开发实验室中第5-7次运行过程中在设备上使用了这些步骤，产生了清澈的澄清化乳汁。

消毒

为了使用0.2微米陶瓷微滤膜和30kDa超滤膜进行双TFF，以便对来自D035的转基因山羊乳汁进行澄清和浓缩，必须使用0.1M氢氧化钠对系统进行消毒。设备如上组装用于消毒和工艺处理。用USP水制备2升的0.1M氢氧化钠，将其泵入每个系统中，在微滤上的交叉流速率是151pm，在超滤上的交叉流速率是11pm。对于微滤不施加任何的截留物压力，而对于超滤的截留物施加5psi的压力。透过物阀门完全打开，使氢氧化钠在整个系统中反复循环。反复循环进行15分钟，然后通过罐和泵之间的排放阀使氢氧化钠溶液完全排出系统。在需要时，用USP水完全充满补料罐，漂洗整个系统。从每一个排放阀中排出1升水。微滤上的截留物阀门半关闭，将透过物阀门完全通向排废管。超滤上的截留物和透过物阀门也完全通向排废管。用12升超纯水通过微滤截留物管道进行冲洗，交叉流速率为201pm。用4升超纯水通过微滤透过物管道进行冲洗，交叉流速率为15-201pm，TMP为6-8psi。用7升超纯水通过超滤的截留物和透过物管道进行冲洗，交叉流速率为11pm，然后再用3升水冲洗透过物管道。

使用超纯水(如果需要的话加入更多)，抽吸微滤，速率为201pm，提高截留物压力直至TMP达到15psi，而不施加透过物压力，然后通过改变抽吸速度调整交叉流速率至151pm。记录温度(必须在25-28摄氏度之间)、压力和交叉流速率。测量透过物通过透过物排空阀门的流速。在超滤上使用11pm的交叉流速率和5psig的截留物压力，不施加透过物压力(TMP大约为10psig)，重复上面的过程。比较透过物速率与膜在使用前的透水性。如果流出速率小于起始值的80％，则或者重新清洁膜或者将它们换掉。

乳汁处理

乳汁必须合并并提高温度至15-20摄氏度。在微滤罐内合并乳汁，然后关闭微滤的透过物阀门，打开截留物阀门，打开泵，使交叉流速率为201pm。5分钟后取起始乳汁样品。然后提高压力至TMP达到15psig，交叉流速率为151pm。重复循环一直进行至乳汁温度达到20摄氏度。然后打开冷却器，调至10摄氏度，打开微滤的透过物阀门，通过收集陶瓷膜的透过物，在微滤系统上使乳汁浓缩至其起始体积的一半。在151pm交叉流速率和15psi跨膜压力下运行微滤。微滤的温度应该提高并且保持在26±2.0摄氏度。然后必须启动超滤系统，交叉流速率为0.8-11pm/sqft。通过透过物阀门测量每个膜的透过物流速。必须调整超滤的截留物和透过物的压力，使透过物的流速与微滤的透过物流速相匹配。当超滤的透过物流速与微滤的透过物流速相匹配时，应该在偶联状态下运行系统5-6个透滤体积。一旦透滤完成，即将系统分离，关闭微滤，排空并且清洁，将超滤的透过物排入排水管道内，直至超滤补料管内的半成品澄清化浓缩物的体积降低了一半，总的浓缩倍数为4倍。然后排空超滤，无菌过滤半成品澄清化浓缩物，并清洁超滤。

清洁和储存方案

根据本报告第14页上的图拆卸系统。用20升的热的(45-65摄氏度)软水漂洗MF，同时截留物阀门半开，将透过物管道通向排水管道。使阀门通向重复循环溶液返回补料罐内，用2升热的0.5M氢氧化钠+400ppm次氯酸钠重复循环5分钟。将溶液从系统中排空，替换为2升相同的化学物质。用新鲜的溶液重复循环30分钟，然后通过排放阀排空。用20升热的软水通过半开的截留物阀门冲洗整个系统。用4升水冲洗通过透过物管道，只是将水在膜的截留物一侧重复循环，交叉流速率为201pm，TMP为6-8psi。剩余的水通过排放阀排空。用2升热的0.5M柠檬酸溶液在整个系统中重复循环30分钟，交叉流速率为201pm，TMP为6-8psi。然后通过排放阀排空柠檬酸溶液。使用15升软水漂洗微滤的截留物一侧，用4升漂洗透过物一侧(同腐蚀性氢氧化钠之后的漂洗一样)。2升热的0.05M氢氧化钠+400ppm漂白剂在MF中重复循环15分钟，然后排空，用10升水漂洗截留物一侧，用4升水漂洗透过物一侧(同腐蚀性氢氧化钠之后的漂洗一样)。在开始的水冲洗中，通过使截留物阀门排空以及使整个透过物管道排空(不通过阀门)，将超滤的截留物和透过物管道直接通向排水管道。泵总是在11pm下运行，即如果截留物压力升高，泵的速度也必须提高以维持11pm。用4升超纯水漂洗两条管道。用超纯水配置的2升0.5M氢氧化钠+250ppm次氯酸钠冲洗两条管道。在整个系统中重复循环2升新鲜的溶液，使透过物管线与补料罐连接，使截留物阀门向补料罐打开60分钟。通过排放阀排空溶液。同初次冲洗一样，将两个管线通向排水管道。用超纯水填满补料罐，通过排放阀排空1升水。通过两个管线冲洗8升水，再用4升水通过透过物管道，截留物的压力为5psi。然后将2升0.4M柠檬酸溶液在系统中重复循环60分钟。通过排放阀排空酸性溶液，然后用超纯水填满补料罐，通过排放阀排空1升水。通过截留物和透过物两条管线冲洗8升水，再用8升水冲洗透过物管线，跨膜的交叉流速率为11pm，截留物压力为5psi。当两个系统都被清洁和漂洗后，将它们装配起来用于保存(上面的图)。将2升的0.1M氢氧化钠溶液灌入每一个料液导管，泵到整个系统中，使截留物和透过物阀门打开，进行重复循环，通向废物的阀门关闭，保持两分钟。然后覆盖管道导管并且作出状态标签，表明其是清洁的并且储存于0.1M的氢氧化钠溶液中。

已经显示工艺参数对于生产一致性的物质是重要的。用于澄清的膜是CerCor陶瓷材质的0.2微米孔径大小的膜，1.5平方英寸，30kDaNMWCO Pall Filtron PES盒式膜，2平方英寸(2个盒子)。对于最佳的IgG1抗体澄清度和通量，微滤的温度应该保持在26-29摄氏度。微滤系统应该在截留物流速为141pm(42cm/s)和跨膜压力为15psig下运行。乳汁应该浓缩至原始混合物体积的40-70％(1.5-2.5倍)。系统的超滤部分应该在截留物流速为1.6-21pm、补料压力为20-30psig下运行。应该通过调整透过物压力使透过物流速与微滤系统的透过物流速相匹配。最终的半成品澄清化浓缩物应该是原始乳汁混合物体积的四分之一(4倍浓缩)。

重组生产

目前正在开发出越来越多的重组蛋白质，用于治疗和诊断的用途。但是，这些蛋白质中有很多难于以功能形式和/或所需量经常规方法生产或者这样的生产方法比较昂贵。通常的方法包括将负责产生某种具体蛋白质的基因插入宿主细胞中，例如细菌、酵母或者哺乳动物细胞如COS或CHO细胞，然后在培养基中培养这些细胞。然后培养的细胞将合成所需的蛋白质。传统的细菌或者酵母系统可能不能以有功能的形式产生许多复杂的蛋白质。尽管哺乳动物细胞可以生产复杂的蛋白质，但是它们的培养一般比较困难和昂贵，而且蛋白质的产量通常只是毫克/升数量级。此外，由于非分泌型蛋白质不被分泌到培养基中，所以从原核或者哺乳动物细胞中纯化它们相对困难。

一般而言，转基因技术的特色是，它是一种制造和分泌一般情况下不被分泌出来的蛋白质(非分泌型蛋白质)的方法。该方法包括用核酸构建体表达蛋白质，该核酸构建体包括：(a)启动子，例如乳腺上皮细胞特异性启动子，例如乳汁蛋白启动子；(b)信号序列，它指导蛋白质的分泌，如来自乳汁特异性蛋白质的信号序列；(c)可选地编码分泌型蛋白质(例如分泌到乳汁中的蛋白质)的氨基末端编码区域足够长的部分的序列，使非分泌型蛋白分泌(例如分泌到转基因哺乳动物的乳汁中)；以及(d)编码非分泌型蛋白质的序列，其中元件(a)、(b)、(c)(可选性的)和(d)优选地以上述连接顺序可操作性连接。

在优选的实施方案中：元件a、b、c(如果有的话)和d来自同一基因；元件a、b、c(如果有的话)和d来自两个或者更多基因。

在优选的实施方案中：分泌是分泌到转基因哺乳动物的乳汁中。

在优选的实施方案中：信号序列是β-酪蛋白的信号序列；启动子是β-酪蛋白的启动子序列。

在优选的实施方案中，非分泌型蛋白质编码序列：是人源的；编码截短的细胞核或者细胞质多肽；编码人血清白蛋白或者其他所需的目标蛋白。

除非特别指明，本发明在实施中会使用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些技术是在本领域技术范围内的。这些技术在文献中都有描述。参见，例如，Molecular Cloning A Laboratory Manual，2nd Ed.，ed.by Sambrook，Fritsch and Maniatis(Cold Spring HarborLaboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glover ed.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.，1984)；Mullis et al.U.S.Patent No：4,683,195；Nucleic AcidHybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；专题论述集Methods In Enzymology(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Gene Transfer Vectors For Mamma lian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；MethodsIn Enzymology，Vols.154 and 155(Wu et al.eds.)，Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer andWalker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook OfExperimental Immunology，Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；Manipulating the Mouse Embryo，(ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。

乳汁特异性启动子

在实施本发明时有用的转录启动子是那些优先在乳腺上皮细胞中被激活的启动子，包括控制编码乳汁蛋白〔例如酪蛋白、β乳球蛋白(Clark et al.，(1989)Bio/Technology 7：487-492)、乳清酸蛋白(Gorton et al.(1987)Bio/Technology 5：1183-1187)和乳白蛋白(Soulier et al.，(1992)FEBS Letts.297：13)〕的基因的启动子。酪蛋白启动子可以来自任何哺乳动物种中的α，β，γ或者κ酪蛋白基因；优选的启动子来自山羊β酪蛋白基因(DiTullio，(1992)Bio/Technology10：74-77)。乳汁特异性蛋白质启动子或在乳腺组织中被特异激活的启动子可以来自cDNA或者基因组序列。优选地，它们来自基因组序列。

关于所有上面列举的乳腺特异性基因，已经可以获得至少一个、通常是多个生物体的DNA序列信息，参见例如Richards et al.，J.Biol.Chem.256，526-532(1981)(大鼠α乳白蛋白)；Campbell etal.，Nucleic Acids Res.12，8685-8697(1984)(大鼠WAP)；Joneset al.，J.Biol.Chem.260，7042-7050(1985)(大鼠β-酪蛋白)；Yu-Lee & Rosen，J.Biol.Chem.258，10794-10804(1983)(大鼠γ-酪蛋白)；Hall，Biochem.J.242，735-742(1987)(人α乳白蛋白)；Stewart，Nucleic Acids Res.12，389(1984)(牛αs1和κ酪蛋白cDNAs)；Gorodetsky et al.，Gene 66，87-96(1988)(牛β-酪蛋白)；Alexander et al.，Eur.J.Biochem.178，395-401(1988)(牛κ-酪蛋白)；Brignon et al.，FEBS Lett.188，48-55(1977)(牛αs2酪蛋白)；Jamieson et al.，Gene 61，85-90(1987)，Ivanov etal.，Biol.Chenet.Hoppe-Seyler 369，425-429(1988)，Alexanderet al.，Nucleic Acids Res.17，6739(1989)(牛β-乳球蛋白)；Vilotte et al.，Biochimie 69，609-620(1987)(牛α-乳白蛋白)。有关多种不同的乳汁蛋白质基因的结构和功能的综述参见Mercier &Vilotte，J.Dairy Sci.76，3079-3098(1993)(这里引用其全部内容作为参考，用于所有的目的)。如果还需要额外的序列数据，可以利用已有的序列作为探针，很容易地克隆出已经可以获得的区域的侧翼序列。来自不同生物体中的乳腺特异性调控序列也可以使用已知的同源核苷酸序列或者针对同源蛋白质的抗体作为探针，通过筛选这些生物体的文库而类似地获得。

尽管通过举例说明和实施例对上述的发明进行了描述，以便于理解，显然对于那些本领域的技术人员，可以实施一些改变和调整。因此，上述描述和实施例不应该理解为是对所附权利要求书所确定的本

发明范围的限制。

还应当注意到，尽管白蛋白与多种不同的化合物如乙醇和包括磷酸盐在内的矿物质盐类共同结晶，在文献中没有发现有使用磷酸盐结晶的工业方法。通过本发明的优选实施方案，现在已经发现，通过充分使用本发明的关键工艺参数和/或条件，使用磷酸盐可以便利地结晶人白蛋白。已在上文列出和描述了本发明的参数和一些变动。

因此，应当理解的是，本发明中有关提供改进的切向流过滤方法以便从给定的料液中以高产率生产出目标分子的实施方案只是对本发明原理的应用进行举例说明。从前面的描述中显然可见，在不偏离本发明精神或者所附权利要求的范围的情况下，可以对本发明公开内容的各要件的形式、使用方法和应用进行改变。

*作为参考文献引用的现有技术文件

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17.Marinaccio，et al.，United States Patent No# 4,888,115；Cross-Flow Filtration

Claims (70)

1.从料液中分离目标分子物质的方法，该方法包含：(a)用切向流过滤工艺通过滤膜将所述的料液过滤，所述滤膜具有的孔径大小可以将所述的目标分子物质从所述的料液中分开，同时保持通量水平在“通量-TMP曲线”的压力依赖性区域内临界点通量的大约5-100％，其中所述跨膜压力沿着膜大体保持恒定，其水平不高于过滤临界点处的跨膜压力，从而将所述的目标分子物质从所述的料液中选择性地分离出来，并使所述的目标分子物质保持其生物活性；(b)通过微滤工艺过滤所述的料液；其中所述的目标分子物质是蛋白质。

2.权利要求1的方法，还包含将所述的料液分级分离。

3.权利要求1的方法，还包含使所述的料液澄清。

4.权利要求1的方法，还包含对所述的料液进行透滤。

5.权利要求1的方法，还包含将所述的料液浓缩。

6.权利要求1的方法，其中所述目标分子物质分子量为大约1到1000kDa。

7.权利要求1的方法，其中所有的过滤阶段都是超滤。

8.权利要求1的方法，其中所述的料液是乳汁。

9.权利要求1的方法，其中所述的料液是细胞裂解物溶液。

10.权利要求1的方法，其中所述的蛋白质是生物药剂。

11.权利要求8的方法，其中所述乳汁的状态选自以下状态中的一种：a)未经处理的；b)稀释的；c)使用缓冲溶液处理过的；d)经化学处理过的；以及e)部分蒸发的。

12.权利要求2的方法，其中所述的分级分离步骤使用陶瓷材质的滤膜。

13.权利要求3的方法，其中所述的澄清步骤使用陶瓷材质的滤膜。

14.权利要求2的方法，其中所述的分级分离步骤使用聚合物滤膜。

15.权利要求3的方法，其中所述的澄清步骤使用聚合物滤膜。

16.权利要求2的方法，其中所述的分级分离步骤使用纤维素滤膜。

17.权利要求3的方法，其中所述的澄清步骤使用纤维素滤膜。

18.权利要求2的方法，还包含优化系统参数。

19.权利要求18的方法，其中所述的系统参数包括温度、料液流速、跨膜压力、料液浓度和透滤体积。

20.权利要求3的方法，还包含优化系统参数。

21.权利要求20的方法，其中所述的系统参数包括温度、料液流速、跨膜压力、料液浓度和透滤体积。

22.权利要求1的方法，其中所述的目标分子物质是选自下组中的生物实体：蛋白质、免疫球蛋白、多肽、肽、糖蛋白、RNA和DNA。

23.权利要求19的方法，其中最适温度范围是15到50摄氏度。

24.权利要求19的方法，其中最适温度范围是20到35摄氏度。

25.权利要求19的方法，其中最适温度范围是25到29摄氏度。

26.权利要求21的方法，其中最适温度范围是15到50摄氏度。

27.权利要求21的方法，其中最适温度范围是20到35摄氏度。

28.权利要求21的方法，其中最适温度范围是25到29摄氏度。

29.权利要求19的方法，其中料液流速是从10cm/sec到100cm/sec。

30.权利要求19的方法，其中料液流速是从20cm/sec到60cm/sec。

31.权利要求19的方法，其中料液流速是从25cm/sec到45cm/sec。

32.权利要求21的方法，其中料液流速是从10cm/sec到100cm/sec。

33.权利要求21的方法，其中料液流速是从20cm/sec到60cm/sec。

34.权利要求21的方法，其中料液流速是从25cm/sec到45cm/sec。

35.权利要求19的方法，其中跨膜压力范围是从2psi到40psi。

36.权利要求19的方法，其中跨膜压力范围是从5psi到30psi。

37.权利要求19的方法，其中跨膜压力范围是从10psi到20psi。

38.权利要求21的方法，其中跨膜压力范围是从2psi到40psi。

39.权利要求21的方法，其中跨膜压力范围是从5psi到30psi。

40.权利要求21的方法，其中跨膜压力范围是从10psi到20psi。

41.权利要求19的方法，其中料液浓度是天然乳汁的0.25到4倍。

42.权利要求19的方法，其中料液浓度是天然乳汁的0.5到3倍。

43.权利要求19的方法，其中料液浓是是天然乳汁的1.0到2倍。

44.权利要求21的方法，其中料液浓是是天然乳汁的0.25到4倍。

45.权利要求21的方法，其中料液浓度是天然乳汁的0.5到3倍。

46.权利要求21的方法，其中料液浓度是天然乳汁的1.0到2倍。

47.权利要求19的方法，其中透滤体积范围是浓缩的微滤截留物体积的1到20倍。

48.权利要求19的方法，其中透滤体积范围是浓缩的微滤截留物体积的3到15倍。

49.权利要求19的方法，其中透滤体积范围是浓缩的微滤截留物体积的5到10倍。

50.权利要求21的方法，其中透滤体积范围是浓缩的微滤截留物体积的1到20倍。

51.权利要求21的方法，其中透滤体积范围是浓缩的微滤截留物体积的3到15倍。

52.权利要求21的方法，其中透滤体积范围是浓缩的微滤截留物体积的5到10倍。

53.权利要求2的方法，其中超滤膜用于所有的过滤步骤。

54.权利要求5的方法，其中超滤膜用于所有的过滤步骤。

55.权利要求8的方法，其中所述的乳汁用选自下组中的溶液进行处理：a)水；b)缓冲盐水溶液；c)螯合剂；d)酸溶液；以及e)碱溶液。

56.权利要求4的方法，其中所述的透滤使用超滤透过物。

57.权利要求4的方法，其中所述的透滤使用水。

58.权利要求4的方法，其中所述的透滤使用缓冲盐溶液。

59.权利要求1的方法，其中使用的膜用温度高于20摄氏度的溶液进行清洁。

60.权利要求1的方法，其中使用的膜用温度范围在20到70摄氏度的溶液进行清洁。

61.权利要求1的方法，其中使用的膜用温度范围在40到60摄氏度的溶液进行清洁。

62.权利要求1的方法，其中使用的膜用酸溶液进行清洁。

63.权利要求1的方法，其中使用的膜用碱溶液进行清洁。

64.权利要求1的方法，其中使用的膜用次氯酸盐溶液进行清洁。

65.权利要求62、63或64的方法，还包括在使用所选的溶液之后用水漂洗。

66.权利要求1的方法，其中使用的膜在使用之前用氢氧化物溶液进行消毒。

67.权利要求1的方法，其中使用的膜在使用之前用醇溶液进行消毒。

68.权利要求1的方法，其中使用的膜在使用之前用次氯酸盐溶液进行消毒。

69.权利要求1的方法，其中使用的膜的清洁时间为20分钟到45分钟。

70.权利要求1的方法，其中还包括将第二个切向流过滤阶段的滤出液通过孔径比在第一个过滤阶段中使用的膜的孔径更小的膜进行过滤，并且将第二个过滤阶段的滤出液返回到第一个过滤阶段，如此重复该过程。

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