CN106457302B - 通过tff进行多层涂覆芯的自动化逐层构造 - Google Patents

通过tff进行多层涂覆芯的自动化逐层构造 Download PDF

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Abstract

描述了通过切向流过滤(TFF)等来逐层(LBL)地构造产品，包括用于生产多层涂覆芯的这种工艺的计算机控制自动化。

Description

通过TFF进行多层涂覆芯的自动化逐层构造
相关申请的交叉引用
本申请要求于2014年5月27日提交的美国申请No.62/003242的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开内容涉及通过切向流过滤(tangential flow filtration，TFF)等来逐层(layer by layer，“LBL”)地制造产品。特别地，本公开内容涉及这种工艺本身的自动化，并且本公开内容还涉及产品制造的可扩展性，在一些示例性实施方案中其包括微颗粒构造体例如微颗粒疫苗。
背景技术
一般而言，逐层技术是其中包括颗粒的基材(substrate)以层(例如聚电解质的交替层)涂覆的技术。例如，如美国专利号7,615,530中所述，静电逐层多层膜为用作疫苗的免疫原性组合物提供了平台。在静电逐层多层膜中，将相反电荷的聚电解质沉积到表面例如颗粒上，提供了稳定的多层结构。包括多肽表位的表位可以并入到带电聚电解质例如多肽中，从而允许将多肽表位并入膜中。含有表位的膜可用于引发免疫应答并提供针对靶标(例如病原体)的保护。
静电LBL制造的过程本质上是重复的。其涉及通过将支持物浸渍在聚电解质溶液中来涂覆固体支持物(例如微颗粒或纳米颗粒)的表面，随后通过简单的溶剂交换方法(例如透析)清除过量的可溶性聚电解质。大体而言，执行多个浸渍/清除循环，直到获得具有期望性质(例如，足够的厚度或稳定性)的逐层膜。许多技术可以用于执行重复性LBL步骤，但是大多数技术经受不期望的条件或者它们难以自动化。LBL过程的自动化是非常期望的，因为它取代了人工操作，而人工操作是公知的产品变化性的来源。另外，如果LBL产品旨在用于人或动物，则期望该过程在无菌条件下进行，以避免可损害产品的最终的灭菌步骤。因此，存在着对使用LBL技术涂覆颗粒的自动化工具和方法的需要，其可以可再现地且一致地生产适合用于人和动物的高质量产品。
发明概述
现有技术的上述和其他问题和缺点通过本发明由切向流过滤(TFF)等逐层(“LBL”)地构造产品来克服和减轻，包括用于生产微颗粒构造体的此类工艺的由计算机控制的自动化。
在一个方面，用于颗粒的自动化合成的系统，所述颗粒含有沉积在基材芯上的至少一个聚电解质层，所述系统包含：
包含TFF回路和渗透物阀的切向流过滤部件，所述渗透物阀配置成经由计算机控制选择性地执行渗透步骤，其中所述TFF回路包含用于所述基材芯的颗粒储存器(reservoir)、TFF过滤器和用于连接所述颗粒储存器和所述TFF过滤器的装置(means)；和
可溶性试剂添加歧管部件，其中所述可溶性试剂从可溶性试剂递送歧管部件到切向流过滤部件的递送由至少一个计算机控制阀控制，其中所述可溶性试剂包含所述聚电解质。
本领域技术人员可从以下详细描述和附图将认识和理解本公开内容的上述讨论和其他特征和优点。
附图说明
参考示例性附图，其中在附图中相同的元件编号相同：
图1A示出配备有TFF设备(apparatus)的示例性LBL系统的示意图；
图1B是TFF循环回路的示意图；
图2是显示在通过PierceTM 660nm蛋白质测定测量的在重复PLL添加随后渗透循环期间的示例性TFF循环回路的PLL浓度的图；
图3A显示了在用均聚物PLL和PGA涂覆LBL之后对微颗粒的逐步ζ电位测量。交替极性模式表示成功的LBL实验；
图3B显示了通过氨基酸分析(amino acid analysis，AAA)测量的示例性逐步LBL膜沉积；
图3C显示了示例性7层颗粒批量(batch)的分散体，其中所述层是均聚肽；
图4A显示了良好分散的8层颗粒的显微术图像；
图4B显示了具有5.0μm标尺插图的8层颗粒的示例性SEM图像；
图4C显示了具有2.0μm标尺插图的8层颗粒的另一示例性SEM图像；
图4D显示了在具有对于成功的LBL实验所见的交替极性模式的8层LBL微颗粒的制造期间在颗粒上收集的逐步ζ电位测量；
图4E显示了在通过AAA测量的8层LBL微颗粒批料的制造期间的示例性逐步LBL膜沉积；
图4F显示了在通过AAA测量的8层LBL微颗粒批料的制造期间的另一个示例性逐步LBL膜沉积；
图5显示了TFF系统的另一示例性LBL；
图6提供了待组装之后安装在图5所示的系统上的闭环管网(closed loop tubingnetwork)的示意图；
图7是根据本发明的一些示例性实施方案的示例性系统图示的举例说明；
图8是示例性计算机系统图示；
图9是根据本文所述的示例性实施方案的示例性计算机可用介质；
图10是通过TFF系统的另一示例性LBL，其利用单独的泵将每种试剂递送至TFF回路。“关闭”标签表示当三通夹管阀(3-way pinch valve)处于关闭位置时的向前流动路径；
图11是设计成安装到图10所示的设备的另一闭环管网；
图12显示了使用手动离心/抽吸/重悬方法或使用借助TFF的LBL方法掺入微颗粒构造体中的平均PLL、PGA和DP量；
图13是另一个示例性的借助TFF的LBL系统，其用于以100mL规模(图中未包括计算机)制备一批7均聚物层LBL微颗粒；
图14是用于以100mL规模(图中未包括计算机)制备批量7均聚物层LBL微颗粒的实际的借助TFF的LBL系统的照片。显示了可溶性试剂袋；
图15是在安装到图13和图14所示的多种夹管阀(pinch value)和夹具之前可以组装和消毒的可弃性管网的示意图；
图16A显示了在通过AAA测量的在100mL规模上制造的7层LBL微颗粒批料的制造期间的示例性逐步LBL膜沉积；和
图16B显示了在制备100mL规模的7层LBL微颗粒批料的制备期间收集的样品上测量的示例性逐步ζ电位数据。
发明详述
除了上文提供的简要描述和每个附图的相关文字细节之外，以下描述提供了本公开内容的一些示例性实施方案的另外细节。然而，应当理解，没有意图将示例性实施方案限制于所公开的特定形式和特定细节，而是相反，示例性实施方案将覆盖落入示例性实施方案和权利要求的范围内的所有修改、等同和替代。在附图的描述中，相同的数字指代相同的元件。
应当理解，虽然可以在本文中使用术语第一、第二等来描述多种步骤或计算，但是这些步骤或计算不应该受这些术语的限制。这些术语仅用于将一个步骤或计算与另一个相区分。例如，在不脱离本公开内容的范围的情况下，第一计算可以被称为第二计算，并且类似地，第二步骤可以被称为第一步骤。如本文所使用的，术语“和/或”包括一个或多个相关所列项目的任何和所有组合。
如本文所使用的，除非上下文另有明确指示，否则没有数量词修饰的词语表示一个/种或更多个/种。还将理解，当在本文中使用时，术语“包含”和/或“包括”指定所述特征、整体、步骤、操作、元件和/或部件的存在，但不排除一个或多个其他特征、整体、步骤、操作、元件、部件和/或其组的存在或添加。
还应注意，在一些作为替代的实施方式中，所记录的功能/动作可以不以附图中所记录的顺序发生。例如，取决于所涉及的功能/动作，两个连续示出的附图或任何给定附图中所示的步骤实际上可以基本上同时执行或有时可以以相反的顺序执行。
在下文中，将详细描述本发明的一些示例性实施方案。
逐层(“LBL”)构造是其中多层膜由带相反电荷的聚电解质(包括但不限于多肽)的交替层制备的过程。因此，聚电解质多层膜是由相反电荷的聚电解质的交替层构成的薄膜(例如，几纳米至微米厚)。这样的膜可以通过在合适的基材(例如平坦基材或基材芯)上逐层组装而形成。在静电逐层(LBL)自组装中，聚电解质缔合的物理基础是静电吸引。因为膜的表面电荷密度的极性在连续层的沉积时反转，所以膜的累积是可能的。含有多肽层的微颗粒构造体的LBL装配描述于例如美国公开号2012/0009254中，因其公开了含有多肽的LBL膜而将其通过引用并入本文。虽然本文的示例性方法采用带电多肽层，但是可以采用除多肽之外的带电聚电解质。
根据目前的工序，LBL组装通过将固体支持物(例如基材芯)浸渍在聚电解质溶液中而进行。固体支持物带有或正或负的净表面电荷，并且聚电解质带有与固体支持物之静电荷相反的净电荷。通过静电吸引驱动，第一聚电解质在固体支持物表面上组装。如果足够的第一聚电解质吸附到表面，则表面呈现第一聚电解质的或正或负的极性。当实现该条件时，固体支持物可以浸入第二聚电解质中，第二聚电解质的净电荷与第一聚电解质的净电荷相反。第二聚电解质通过静电吸引在固体支持物的表面上组装，并且当吸附足够的聚电解质时，固体支持体的净表面电荷将反转为其较早的极性。可以重复上述步骤，直到构造具有所需性质(例如，足够的厚度或稳定性)的LBL膜。通常称为表面电位或ζ电位的表面极性的逐步反转可以通过分析技术例如动态光散射(dynamic light scattering，DLS)来监测和测量。典型的静电LBL膜构造的逐步DLS测量的以毫伏(mV)计之电位的图示于图3A中。以下提供的大多数示例性LBL构造体具有7或8个聚电解质层，但是应当理解，构造体可以具有少至2个聚电解质层或多至50个或更多个层。
在LBL组装期间通常的实践是使用过量的可溶性聚电解质以使固体支持物的表面饱和。在可以引入下一相反电荷的聚电解质之前，应该从浸渍溶液中除去先前过量的聚电解质。有多种方法来完成该任务，包括透析、真空过滤、正压过滤、离心随后抽吸等。所有这些技术具有多种缺点，使得它们不适合用于制造方法中，尤其是如果产品旨在用于人类或动物。
在透析的情况下，在每个LBL涂覆步骤之后，LBL固体支持物(例如微颗粒或纳米颗粒)将需要被放置在透析膜袋或透析盒中。这样的过程将是麻烦的、耗时的，并且难以大规模执行。其也难以在无菌条件下完成。
在膜过滤设备(device)中的重复LBL处理已经在文献中描述。在该方法中，将基材芯混悬液，例如微颗粒混悬液在小孔径滤膜上轻轻搅拌。缓冲液和可溶性试剂被来自下方的真空压力或来自上方的压缩气体的正压驱动通过膜，同时颗粒保留在膜上。搅拌的目的是防止颗粒形成饼状物层，并且防止颗粒远离膜，这可能阻塞膜孔。可以进行该方法并具有最小的颗粒聚集，但是每个步骤是缓慢和冗长的，并且该方法在更大规模下很可能不实用。
离心随后抽吸上清液并在缓冲液中重悬是用于在基材芯上进行LBL的常用技术，特别是在研究实验室中。该方法的优点是其简单性，因为其可以在离心管中在多种常用的离心机上进行。遗憾的是，在离心期间基质芯的压实经常导致聚集。另外，离心过程的规模扩大一般将需要并行处理多个管。这种方法是麻烦的，并且产生了化学和生物污染的机会。
总而言之，在基材芯的混悬液上执行重复LBL循环的当前可用的方法遭受一种或更多种不期望的不利影响，其包括聚集倾向、耗时的缓冲液交换步骤、步骤之间的颗粒的过度处理和/或转移、以及污染的机会。此外，据我们所知，迄今为止，上述方法仅仅是手动进行的，并且难以规模扩大和/或自动化。这增加了操作者引入的变化性和操作者误差的机会。因此，需要一种用于在具有最小量的直接操作者参与的封闭系统中合成LBL颗粒的可扩展方法。
切向流过滤(TFF)，也称为横向流过滤，是用于基于尺寸差异分离流体混合物中的物质的已建立的技术。在TFF中，混合物在轻微的正压下循环通过膜表面或通过中空纤维过滤器。本文中术语TFF膜和TFF纤维过滤器可互换使用。膜含有限定尺寸范围的孔，其允许溶剂在与混合物流动相切的方向上移动通过孔。大于孔径的可溶性或悬浮物质，例如蛋白质、颗粒或细胞得到保留。通过连续补充渗透通过膜孔的溶剂，从混合物中有效地除去小于孔径的物质或溶质，而不显著改变混合物的体积。通过合理地选择孔径，可以使用TFF从蛋白质中分离低分子量溶质，从细胞分离可溶性蛋白质，或从微颗粒和纳米颗粒分离可溶性聚合物。
可以使用混合物所通过的二维膜进行TFF分离。或者，可以使用圆柱形纤维过滤器进行分离。混合物被泵送通过圆柱体的内表面。借助于压力差，溶剂将通过与混合物(其携带较小的溶质)流动相切的纤维孔，同时溶质或大于孔径的颗粒保留在圆柱体内。圆柱形纤维过滤器的优点是多根纤维可以平行地集束，增大了总过滤器表面积，以提高渗透效率或增加规模。纤维束或其等同物通常封装在壳体中，所述壳体包括入口端口，混合物可通过入口端口进入过滤器(图1中的21)；出口端口，被保留的部分可以通过出口端口从过滤器中排出(图1中的23)；以及渗透端口，渗透物可以通过渗透端口离开壳体(图1中的29)。
在TFF期间的优选实践是使经过滤的混合物通过过滤器连续再循环。实现这一点的方便方式是推进混合物通过包括过滤器的循环路径。最常见的推进方法是通过泵，例如蠕动泵。该路径可以由管、软管、管道(pipe)或类似的传送装置构成。在大多数情况下，经过滤的混合物的体积超过过滤器的体积容量，因此在任何时候将只有一部分混合物占据过滤器。该路径还可以包括提供额外体积并且起到如下面更详细描述的其他功能的容器。在本文中，该容器被称为储存器，或更具体地，称为颗粒储存器。TFF过滤器和储存器以及连接装置(例如管(tubing))可以形成为循环路径，并且这种组装在本文中被称为TFF循环回路。图1B中显示了TFF循环回路的一个实例。
TFF循环回路可以任选地用其他元件增强。例如泵、阀、多个阀、端口、路径分支点、量器(scale)、计量器(包括压力计)、以及用于特定应用所需的其他部件。其还可包括并联或串联布置的多个TFF过滤器，或多个泵，或并联或串联布置的多个储存器。TFF回路及其各种增强在本文中被称为TFF设备或任选地称为TFF部件，并且实例如图1中的项目12所示。如下文将更详细地描述的，TFF泵和控制该过程的多个方面的一个或多个阀可以在TFF循环回路外部，也就是说，它们不与通过回路的混合物直接接触。
通过TFF膜或纤维过滤器的孔并离开循环回路的溶剂部分称为渗透物。渗透物通常将溶质从循环回路中带出，条件是溶质足够小以通过TFF膜的孔。如上所述，TFF过滤器纤维通常被包裹，以使得渗透物收集在壳体内并且可以通过端口输出。通过端口的渗透物流可以用阀或夹具来限制或停止。在本文中，控制从TFF过滤器出来的渗透物流的阀被称为渗透物阀，并且一个实例示意性地展示为图1中的项目28。
除了TFF回路之外，本文所述的切向流过滤设备包括渗透物阀，其中渗透物阀配置为经由计算机控制选择性地执行渗透步骤。
渗透是通过穿过TFF膜的孔从TFF循环回路中除去溶剂的过程。渗透发生在渗透物阀打开(例如图1中的28)并且TFF膜两侧存在压力差时。膜两侧的压力差称为跨膜压力(transmembrane pressure，TMP)。通过TFF循环回路泵在过滤器的上游管腔侧产生正压，并且可足以引发渗透。然而，通常应该提高压力以产生所需的渗透速率。这可以通过在循环回路中引入收缩来实现(图1中的22)。例如，TFF过滤器(图1中的20)下游的循环管的部分夹紧将导致TMP提高和渗透速率的提高。
在一个方面，切向流过滤部件包括计量装置(metering device)，以测量在特定聚电解质沉积循环步骤期间通过过滤器的渗透物的量，并且将该数据报告回控制计算机。例如，计算机控制可以在测量到用户指定量的渗透物时自动终止聚电解质沉积循环步骤。任选地，该指示是来自电子量器的信号的形式，其连续地测量离开切向流过滤回路的渗透物的量。
当渗透物阀打开并且没有引入新的替换缓冲液时，系统体积降低了除去的渗透物的量。这通常被称为浓缩步骤。当新的缓冲液在渗透期间连续引入系统时，系统体积保持几乎恒定。这通常被称为缓冲液交换步骤或洗涤步骤。
不通过TFF膜并保留在循环回路中的溶剂、溶质和悬浮颗粒的部分称为渗余物(retentate)。渗余物可以通过端口(例如图1中的23)离开TFF过滤器，并返回到储存器，从那里其可以再循环通过TFF过滤器。
溶剂、溶质或悬浮固体通过循环回路的连续运动被称为再循环。该运动由泵驱动，例如蠕动泵(例如，图1中的18)。当溶剂含有可溶性聚电解质和悬浮的基材如微颗粒时，这也称为LBL涂覆步骤或任选地称为沉积步骤。聚电解质(例如均聚肽)对基材芯的吸附，随后清除过量的聚电解质，构成LBL循环或聚电解质沉积循环。
溶剂在本文中定义为通过各种途径携带溶质或悬浮颗粒、或细胞、或其组合的混合物的流体或流体混合物。溶剂通常是水性缓冲液，一般在或接近中性pH。本文中术语溶剂和缓冲液可互换使用。
当TFF渗透阀关闭时，混合物可以并且经常通过管再循环，从储存器，经过泵，经过TFF过滤器，并且返回到储存器，即通过TFF循环回路。在大多数应用中，循环回路还通过调节跨膜压的装置。使用接头和阀，可以以有效和良好控制的方式将试剂引入循环回路。例如，聚电解质或多肽的浓缩溶液可以以这种方式递送到循环回路。试剂溶液通过再循环的动力学快速地分散在整个TFF回路中，并且可以通过储存器的机械搅拌来辅助分散。因此，循环回路是在混合物上进行化学步骤(例如，用可溶性聚电解质涂覆微颗粒)的方便和期望的环境。
TFF的关键特征是，如果期望，循环回路内的溶质和/或颗粒保持恒定运动，并且处于受控且几乎恒定的体积。在LBL制造期间将聚电解质吸附到纳米颗粒或微颗粒的具体应用中，这是有利的，因为其有助于均匀地涂覆颗粒表面。此外，它有助于防止颗粒粘在一起和形成不希望的聚集体。任选地，切向流过滤部件包括配置成向控制计算机报告TFF循环回路体积数据的体积计量装置。在该实施方案中，该系统任选地包括控制计算机，其配置成将切向流过滤部件内的混合物的回路体积保持在设定范围内，这通过触发阀或多个阀以添加试剂增大体积或者渗透减小体积来实现。
TFF的另一个关键方面是所操纵的混合物在回路中再循环，从储器通过泵，穿过TFF过滤器，然后返回到储器。如果泵在流动流的外部并且不与回路的内容物直接接触(例如用蠕动泵的情况下)，则混合物被保护免受外部污染，例如灰尘、化学物质或生物污染物(例如病毒颗粒、真菌或细菌)。同样，如果控制混合物的方向、调节跨膜压力和释放渗透物的多种夹具和阀在流动流的外部(如夹管阀的情况)，则它们也与回路的内容物在物理上分隔并且保护混合物免受外部污染。因此，TFF循环回路储存器、TFF过滤器和连接装置可以构成其中内容物受到保护的封闭系统。如果希望在无菌条件下通过TFF进行LBL，例如，为了制备适合用于人或动物的产品，可以构建这样的闭合回路，然后通过用热、辐射或化学物质处理来灭菌。然后将无菌闭合回路安装到TFF泵和阀上。这种方法的最大优点是，为了实现无菌环境，只有回路材料需要灭菌，而外部硬件不需要灭菌。
如下面将更详细描述的，为了通过TFF进行LBL，使用至少一个计算机控制阀，将一种或更多的多种试剂从可溶性试剂添加歧管部件分配到TFF循环回路中。试剂递送由多种阀和一个或多个泵控制。再次，如果使用夹管阀和蠕动泵，它们不直接接触试剂，并且保护试剂免受外部污染。输送试剂的管网和容纳试剂的多种容器可以组装、通过适当的处理灭菌，然后安装到试剂添加歧管硬件处。本发明的主要实施方案是将试剂输送歧管连接到TFF部件处。该连接可以是简单的管或软管，其将试剂歧管的输出传送到TFF循环回路的一部分，例如TFF储存器处。
使用TFF作为执行LBL的平台似乎具有优于其他方法的另一个优点。例如，多个实验已经显示，使用TFF方法沉积到膜中的均聚肽PLL和PGA的量比使用手动离心/抽吸/再悬浮方法观察到的量高100％至250％。通过TFF的LBL的较高效率似乎是普遍现象并且在实施例4和图12中示出。由于多种原因，期望更高的效率。首先，多肽聚电解质是昂贵的。这些有价值的试剂在膜中的更高的捕获意味着损失到渗透物中并最终被丢弃的肽较少。其次，从使用非肽聚电解质的工作中已熟知膜稳定性与膜沉积的程度(有时称为膜厚度)相关。较厚的膜预期具有较长的储存寿命和其他生物相关性质。另外，更有效的LBL意味着将更快地获得所需的膜厚度，可能使得通过TFF方法的重复LBL缩短一个或数个周期。通过TFF方法的LBL的自动化通过使膜沉积更可预测和可再现而扩展了该优势的影响。
在相关部分中，本公开涉及通过切向流过滤(TFF)的LBL产品构造，切向流过滤也称为横向流过滤等。特别地，本公开涉及这种程序本身的自动化，并且涉及产品的制造的可扩展性，其在示例性实施方案中包括微颗粒和纳米颗粒构造体。
如下所述，根据计算机系统，使用计算机控制将一种或更多种各种试剂分配到TFF回路(例如图1中的储存器16)中，以提供所需的微颗粒产物。在示例性实施方案中，通过TFF方法的LBL用于制备高质量微颗粒疫苗构造体，尽管当然，这仅仅是示例性产物。
在一些示例性实施方案中，在计算机控制下执行每个LBL循环。虽然所有试剂分配都被认为是自动的，也就是说，没有直接的用户动作，但是应当注意，如果需要，可以考虑一些用户干预。例如，用户可能希望暂停该过程用于另一个目的，例如移除样品用于分析以确保在继续该过程之前已经令人满意地完成了步骤。
在本公开中，我们会将过程、方法和系统称为通过TFF的自动或半自动LBL，意味着一个或更多个步骤是计算机控制的。
在一个方面中，切向流过滤部件和所述可溶性试剂递送歧管部件被配置为执行含有多个带相反电荷的聚电解质层的多层膜的自动逐层形成，其中至少一个聚电解质沉积循环通过切向流过滤渗透步骤的计算机控制和通过来自所述可溶性试剂递送歧管部件的多种试剂之递送的计算机控制而至少部分自动化。
具体而言，在一个方面中，用于颗粒的自动化合成的系统，所述颗粒含有沉积在基材芯上的至少一个聚电解质层，所述系统包括：
包含TFF回路和阀的切向流过滤部件，所述阀配置成经由计算机控制选择性地执行渗透步骤，其中所述TFF回路包含用于所述基材芯的颗粒储存器、TFF过滤器和用于连接所述颗粒储存器和所述TFF过滤器的装置；和
可溶性试剂添加歧管部件，其中所述可溶性试剂从可溶性试剂递送歧管部件到切向流过滤部件的递送由至少一个计算机控制阀控制，其中所述可溶性试剂包含所述聚电解质。
以这种方式(尽管其不应限制本公开内容)，将该设备视为包括两个主要部件(TFF循环回路和可溶性试剂添加歧管)可能是有利的。现在参考图1，我们看到这样的分割，其中TFF环总体上以12表示，并且试剂输送歧管总体上以14表示。
在一个方面，渗透物阀和可溶性试剂添加歧管部件的计算机控制阀是完全自动化的。本文中，完全自动化的阀是电子操作的阀，其在计算机控制下并且在没有用户启动的情况下被触发，例如打开或关闭。
具体而言，参考图1，在本文所述的实施方案中，示例性TFF回路包括颗粒储存器16、TFF泵18、TFF过滤器20、TMP压力调节器22，其中回路返回到储存器16。渗透物阀28控制渗透物从TFF过滤器到废料容器26的释放。在一些示例性实施方案中，伴随TFF的计算机监测过滤器压力和渗透物体积，并可选择性地向设备发出指令。如在所示的示例性实施方案中，TMP到储存器路径可以包括样本端口24。
在一个方面，该系统提供用于合成颗粒的连续流动路径。任选地，系统中的渗透物阀、可溶性试剂添加歧管部件的计算机控制阀和任选的泵在连续流动路径的外部。也就是说，这些组分不与TFF循环回路的内容物或从添加歧管递送的任何可溶性试剂直接接触。连续流动路径包含TFF过滤器、颗粒储存器和连接装置。连续流动路径任选地包含管段和接头，包括将试剂连接到TFF循环回路的3通接头。图6、图11和图15所示的闭环管网的实例也是连续流动路径的实例。
在一些示例性实施方案中，TFF回路12装有在整个过程中保持恒定再循环模式的CaCO3颗粒混悬液。由通过回路的颗粒流产生的湍流可足以保持混悬液的良好分散。或者，可以添加颗粒储器中的混悬液的机械搅拌以确保良好的分散。
可溶性试剂从可溶性试剂递送歧管部件到切向流过滤部件的递送由至少一个计算机控制阀控制。在图1中，计算机控制阀是在(44)处的V5。在一个方面，可溶性试剂递送歧管部件包含用于递送多种试剂的多个计算机控制阀。多种可溶性试剂包括例如带相反电荷的聚电解质。在某些方面，可溶性试剂递送歧管部件包含洗涤缓冲液至废料或切向流过滤组分或者两者的计算机控制递送。
除了在LBL步骤之前可以手动地或在一些示例性实施方案中自动引入CaCO3微颗粒混悬液以外，通过可溶性试剂添加歧管部件在逐步TFF期间添加的可溶性试剂可以是例如浓缩的聚电解质储备溶液和洗涤缓冲液。
有多种方式可以将试剂从可溶性试剂歧管部件(部分或整体自动化)推进到TFF循环回路，包括泵送、重力、注射器或压缩气体。在这些方法中，蠕动泵送和重力提供了与无菌闭环系统的良好兼容性。在一个方面，可溶性试剂递送歧管部件包括至少一个泵，其被配置为通过包含一个或更多个计算机触发阀的路径将可溶性试剂推进到颗粒储存器。
当使用蠕动泵用于试剂递送时，可以对于每种试剂使用独立的泵，或者可以对于每种试剂使用具有独立的泵头或在单个泵头上具有独立的通道的单个泵。独立的泵的优点在于，每个泵可以独立于其他泵被触发，并且泵速度可以独立地变化。独立的泵的主要缺点是它们的成本、它们的尺寸和对单独电子控制的需要。具有多个头或多个通道的单个泵的主要优点在于其减少了需要添加到试剂输送歧管的独立泵的数量。这减少了设备的成本和总体尺寸、过程故障的潜在来源，以及简化电子设计和计算机控制命令。在多通道配置中，试剂可以在回路中以期望的速度再循环，并且可以通过打开一个或更多个夹管阀一段固定时间在期望的时间并以期望的量输送到TFF环路。可以理解，这两种方法是可以互换的，专业人员可以选择最适合目的的方法。
对于示例性实施方案，考虑了电触发夹管阀(electrically activated pinchvalve)，例如来自Cole Parmer，Inc.的2通和3通阀，因为它们对于不同的管尺寸和材料的简易性和适应性。此外，夹管阀不与通过管移动的溶液接触，因此不会污染管的内容物。夹管阀是用于控制约1mL至100L的体积之递送或循环的优异阀。可以以具有不同设计的较大的阀替代以用于控制约0.1L至1000L或更多的较大体积。2通阀在开和关，或者打开和关闭之间切换。按照惯例，穿过2通阀的管在关时被夹紧或关闭，在开时不被夹紧或打开。通过向阀提供直流电源来打开阀，并且这可以通过继电器板且如果需要由计算机容易地控制。对于3通阀，有一个T或Y接头，其将管分成两个方向中的任一个。当阀关闭时，一个方向被活塞夹紧关闭，另一个方向打开。当通过提供直流电源打开阀时，活塞移动，打开第一管线并关闭第二管线。
在一个方面，可溶性试剂递送歧管部件包含配置成指示递送的或未递送的可溶性试剂的体积或重量的试剂计量装置。计量装置任选地配置为将数据传输到计算机以用于记录递送的可溶性试剂的时间和量的目的。
继电器板、电源和蠕动泵可用于示例性的试剂递送歧管。对多个夹管阀的布线，可以由具有合理的电气和技术技能的人使用容易获得的电子设备(electronics supply)来组装，使得它们可以由计算机控制。运行阀所需的阀和直流电源接线到多通道继电器板，继而通过USB电缆连接到计算机。与继电器板一起出售的随时可用的软件用于写入发送到继电器板的命令序列，其以期望的时间顺序打开或关闭特定的阀。
以下描述了用于试剂递送的可能的示例性构造：
对于带相反电荷的均聚肽(HP)聚-L-谷氨酸(PGA)(图1中的32)和聚-L-赖氨酸(PLL)(图1中的34)的递送，一种选择是带有双泵头的单个蠕动泵(36)。因为泵头偶连，所以它们都以相同的速度运行，每个头以期望的流速泵送其各自的试剂(注意，这仅仅是示例性实施例)。对于每种试剂使用两个3通阀，例如PGA由阀V3和V4(图1中的31和33)控制，PLL由阀V1和V2(图1中的35和37)控制，双头泵可以在整个TFF过程中以单一速度运行。
在开始LBL循环之前，输送HP PLL和PGA的管线可以用HP储备溶液灌注(prime)。通过交替地打开和关闭3通阀V1至V5(31、33、35、37、44)的计算机指令完成引发。
在示例性情况下，大多数时间，HP储备料通过周围的短回路并通过泵头再循环。当下一个LBL步骤需要HP溶液的等分试样时，用于该泵头的2通阀切换到主歧管，并且将试剂团推动到TFF回路微颗粒储存器(图1中的16)处。参考图1，当阀V1至V4(31、33、35、37)处于关闭时，管线中的溶液通过回路再循环。当需要将PLL溶液的等分试样递送到TFF回路时，通过计算机控制触发的阀V1、V2和V5(35、37、44)，使PLL溶液重定向以流经出口和颗粒储存器。当递送正确的量时，阀关闭，PLL回到再循环模式。该方法的优点包括以下事实：以设定速度运行的单个多头泵可用于递送多达四种独立的试剂，而无需由计算机给泵指示。
确定试剂的期望量是否被递送到再循环回路的因素是泵的速度、管的直径、必要的阀打开用于递送的时间段，以及从泵到循环回路的路径长度。这最后一个因素通常被称为死体积，并且当开发试剂递送方法时必须关注和考虑。一般来说，死体积将在试剂被引导到循环回路时用洗涤缓冲液填充或灌注，并且使用V5和V6(图1中的42和44)的添加步骤期间以试剂溶液替换。该体积可以通过缓冲液驱动到回路中或者再通过缓冲液置换废料容器处。通常，死体积将被冲洗至废料，以便不会不必要地稀释再循环体积，除非它是特别有价值的试剂，例如化学合成的多肽。在这种情况下，可以通过触发适当的阀将其推入具有缓冲液的循环回路中。通过使用较短的管长度或具有小直径的管，可以使死体积最小化，这对于特定应用是实用的。在某些情况下，死体积可以仅等于小量，例如递送总量的1％至5％，并且有时可以忽略。为了确保递送准确体积的试剂，校准泵速度和阀。通常，选择这样的泵速度，使得可以在短时间内(通常小于一分钟)完成HP输送。例如，如果需要5.0mL的PLL的等分试样，则合适的泵速度可以是递送40mL/分钟(0.667mL/秒)的泵速度。在该泵速率下，打开阀V1、V2和V5(图1中的35、37、44)7.5秒将向储存器的路径递送5.0mL。当然，因为沿着该路径的死体积，到达储存器的实际量可小于5.0mL。如果测量的死体积为1.0mL，则打开阀的时间可以增加到9.0秒，并且5.0mL将达到储器，并且1.0mL将保留在死体积路径中，并且最终被冲洗至废料。或者如上所述，死体积可以最小化到与递送体积相比它们不显著的程度。
有利地，将可溶性试剂(例如聚电解质)递送至切向流过滤部件并充分混合，以使得聚电解质浓度是可预测的和可再现的。在系统测试期间，可选地测量递送的实际体积以确定其所需量，并因此调整泵速度和/或阀打开时间。一般而言，将聚电解质的递送校准到所需量的+/-20％内是直接任务。实际上，在+/-10％或甚至+/-5％内的精度也是容易实现的。如上所述，例如，以HP进行LBL涂覆基材，通常用过量的肽进行，使得基材被HP饱和。在饱和条件下，在LBL涂覆步骤期间沉积的HP的量对HP溶液的浓度的波动相对不敏感。因此，试剂递送的准确性通常对于产品的质量不是关键的，并且约+/-20％的递送精度可以是足够的。对于其他步骤，特别是那些在低于饱和浓度下进行沉积的步骤，可能需要更高水平的准确度。在某些方面，所需的聚电解质(例如多肽)浓度为约0.2至2.0mg/mL。
虽然上文描述了双头泵和再循环回路，但是本文还设想了另一些实施方案，例如用于每种试剂的单独泵，没有再循环回路等。在较大的制造规模下，这种配置可能是优选的。任一方法的关键方面是在计算机控制下，在期望的时间，以期望的量将正确的试剂递送至TFF循环回路。
将TFF循环回路(图1中的12)偶连到试剂递送歧管(14)。这种偶联可以在沿回路的任何地方发生，并且在本发明的这种形式中，偶连在TFF储存器(16)处。TFF循环回路可以由本领域技术人员从多种可用部件组装或作为整个单元从厂家购买。合适的系统由SpectrumLabs(Rancho Dominquez，CA)或Pall Corporation(Port Washington，NY)出售，并且这些系统可以在多种规模下操作。例如，Spectrum Labs销售的
Figure BDA0001162486160000152
Research II系统适用于0.002至10L规模，而
Figure BDA0001162486160000151
Pilot Plus系统适用于10至5000L规模。
参考图1，TFF设备的示例性部件是TFF泵(18)、跨膜压力装置(TMP，22)、渗透物阀(28)以及包括TFF过滤器(20)或过滤膜、渗透物出口(29)和颗粒储存器(16)的TFF循环回路。TMP装置在TFF过滤器的内表面和外表面之间产生压力差，并且增强穿过过滤器纤维或膜的渗透物的流动。TMP可以根据需要增加或减少以提高或降低渗透物流经孔的速率。渗透物流动的速率通常称为流量速率(flux rate)，并且以每单位时间每单位过滤器表面积的单位体积测量。例如，1.0升/平方米/小时(L/m2/小时)或1.0LMH的流量速率意味着具有1.0m2表面积的纤维过滤器在1.0小时内将产生1.0L的渗透物。
渗透物端口(图1中的29)和阀(28)允许渗透物离开TFF循环回路。当渗透物阀关闭时，TFF系统的内容物再循环并且体积通常保持恒定。再循环体积通常称为渗余物。它也被称为TFF回路体积。当阀打开时，允许渗透物通过TFF纤维过滤器孔(图1中的20)。当不向系统中加入另外的试剂或缓冲液时，渗余物的总体积减小了离开系统的渗透物的量。这被称为浓缩步骤，并且在LBL期间是有用的，以使由于加入HP溶液、DP溶液或缓冲液而可增大的总系统体积回到其期望水平。
TFF泵驱动渗余物通过TFF循环回路。它通常是具有可调泵送速度的蠕动泵。速度可以设定为用于所期望的效果，例如渗余物的均匀混合，或者实现一定的过滤器表面剪切速率以使结垢最小化。蠕动泵是期望的，因为它们在回路外部并且不与回路的内容物直接接触，并且因此可用于无菌处理。也可以使用注射泵或活塞泵，但是由于它们直接接触回路内容物，所以其通常需要特殊的清洁和灭菌程序以使其适于无菌处理。
TFF循环回路储存器(图1中的16)用于多种目的。首先，储存器容积可大可小，但是通常其体积大于TFF循环回路的其余部分的体积是有用的。在这种条件下，大部分渗余物将在任何特定时间占据储存器，因此它是添加试剂的方便位置，尤其是用于进行诸如LBL膜制造的化学步骤的目的。如果TFF泵的流速是足够的，则其可以在储存器中产生足够的湍流以保持其内容物充分混合，但是如果需要额外的混合，则其可以配备机械搅拌系统，例如磁力搅拌棒(例如图6中的搅拌棒76)、悬臂式机械搅拌器(overhead mechanical stirrer)、轨道式摇床(orbital shaker table)或其他装置以保持储存器的内容物充分混合。此外，由于TFF回路的其余部分用渗余物填充，所以储存器可以提供压载(ballast)并适应在处理期间发生的渗余物体积的增大或减小。可以如下所述主动处理这些体积变化。
通过TFF自动涂覆基材芯(例如LBL)的关键方面是控制和保持循环通过TFF回路的颗粒混悬液之体积的能力。通常，希望在整个过程中将该体积保持在接近恒定水平。在实践中，在总TFF循环回路容积中存在波动。将HP溶液的等分试样递送至TFF回路由于该量增加了总体积。通常不希望在整个LBL步骤中累积地增加体积，因此可以选择在浓缩步骤期间，例如在随后的渗透步骤结束之前，减去该体积。这可以通过打开示例性的渗透物阀(图1中的28)、关闭洗涤缓冲液供给阀(41)直到体积返回到其先前的体积来进行。浓缩步骤可以并入自动LBL循环中并在计算机控制下执行。
在一些示例性实验中，避免了对TFF回路体积的程序化调整，因为已经发现回路体积是自调节的。这一点的实例描述于实施例3中。向约20mL CaCO3颗粒的起始体积中加入5.0mL等分的PLL溶液。由于在渗透物阀(图1中的28)关闭时进行添加，因此总渗余物体积增加至约25mL。在再循环五分钟之后，打开渗透物阀V7(28)，并且约5mL渗透物离开过滤器至废料。用于此种渗透物之第一次推注的驱动力是由PLL添加引起的压力的轻微增加。然后打开缓冲液供给阀V5和V6(44、42)以允许缓冲液的流入。离开系统的渗透物在颗粒储存器中产生小的真空，其吸取缓冲液。只要TFF回路不排气，则回路压力的暂时波动会在每个循环发挥将TFF回路体积调节至约18至25mL的作用。
上述TFF回路体积的自调节在较高的制造规模下可能不足。在一些情况下，TFF系统体积可能需要通过浓缩或缓冲液添加步骤主动管理。渗余物体积的自动调节可能需要电子监测并向计算机控制报告渗余物体积。光学传感器或数字式量器(例如图10中的94)可以用于向计算机报告TFF回路体积信息。然后计算机实时响应，通过打开和关闭适当的阀增加或减少渗余物体积，直到达到目标体积范围。这样的控制可能需要用于传感器和计算机程序的附加布线，其可由本领域普通的电子工程师提供。
对于无菌产品的制造，有利的是所有步骤在无菌闭环系统中进行，以便排除化学和生物污染物(例如细菌)。在试剂添加步骤、混悬液浓缩步骤和其他操作期间，TFF回路中的循环体积可以增大或减小。在封闭系统条件下，这可以产生系统内部压力的波动，这可能以不期望的方式改变TFF过程的动态。这些变化在方法开发和测试期间显现，并且可以被管理。例如，可以将排气口管线(vent line)添加到切向流过滤部件和/或可溶性试剂递送歧管，并用夹管阀(图1中的46)操作。任选地，该排气口是计算机控制的排气口。排气可以通过无菌过滤膜到达外部环境，或者在内部到达隔板或可折叠袋形式的压载体积处，或者可以设计保护系统免受污染的其他方法。内部排气口的一个实例是图13中的阀V10，其允许过量的压力逸出到废料容器。当需要时，可以在预定的时间将排气步骤添加到自动化过程中。或者，压力转换器可以向控制计算机提供实时反馈，其可以通过打开或关闭排气阀来响应和保持压力在用户所限定的范围内。在其他情况下，压力的波动是期望的，并且不需要排气。例如，在上述自调节系统中，离开系统的渗透物产生轻微的真空，其将替换缓冲液吸入到颗粒储器中，而不需要泵送或计量。因此，主动管理内部回路压力是否必要将取决于方法的范围和规模。
再次参考图1，递送歧管(14)和TFF循环回路(12)作为示例性配置示出。在该示例性实施方案中，八个阀(V1至V8)是计算机控制的，并且通过简单的定制编写的代码来操作。可溶性HP PGA(32)和PLL(34)通过双头蠕动泵(36)泵送并通过短回路(38，40)再循环直到计算机请求，其触发适当的三通阀V1至V4(31、33、35和37)。在这种情况下，洗涤缓冲液通过重力穿过阀V6(42)递送到废料或者通过抽吸穿过阀V5(44)递送到颗粒储存器。如前文所讨论的，DP可在入口管线中的端口(30)处在最终LBL步骤期间经由注射器(或自动地)递送。在TFF回路中，颗粒可以在整个过程中连续再循环。渗透(洗涤)步骤可以由阀V7(28)控制。可以在示例性样品端口(24)处通过注射器收集颗粒混悬液样品，以在每个LBL步骤期间如所期望进行分析。
示例性过程如下：
实施例1用作基材芯的CaCO3微颗粒的沉淀
使用本领域已知的沉淀方法的改进版本。向20mL含有1.0mg/mL聚-L-谷氨酸钠盐(Sigma-Aldrich目录号P4636)的0.33M Na2CO3的快速搅拌溶液添加20mL 0.33M CaCl2。将沉淀的CaCO3微颗粒混合物在700rpm下搅拌40秒。在显微镜下以40×放大倍数检查颗粒，发现其主要是直径为3至4μm的球形颗粒。将混悬液转移到离心管中并在低速下离心，直到所有可见颗粒沉淀成团块。吸出上清液，将颗粒悬浮于20mL10mM pH 7的HEPES缓冲液中。再次离心颗粒，吸出上清液，然后再次悬浮于20mL HEPES缓冲液中。将所得的3％CaCO3混悬液直接用于随后的LBL实验中或在4℃下储存并在几天内使用。通过该工序制备的微颗粒含有PGA作为第一HP LBL层，这通过测量悬浮在pH 7.0缓冲液中的颗粒的ζ表面电势(图3A)和通过氨基酸分析(图3B)得到证实。在来自Malvern Instruments的Zetasizer上测量的典型ζ电位值为约-15至-30mV。
实施例2：半自动控制HP PLL递送并随后通过TFF渗透清除过量的HP
使用基本上如图1所述构造的设备。夹管阀通过继电器板连接到直流电源。分配至阀的电力(power)由连接到继电器板的计算机控制。编写代码以执行多种阀指令。TFF回路主要由配备有20cm2，500kD分子量截止值(molecular weight cut off，MWCO)
Figure BDA0001162486160000181
改性聚醚砜(modified polyethersulfone，mPES)过滤器模块(20)的
Figure BDA0001162486160000182
Research II TFF系统(Spectrum Labs)以及设定为40mL/分钟的TFF泵(18)组成。试剂递送歧管双头泵(36)设定为40mL/分钟。PLL递送步骤的持续时间设定为7.9秒或5.3mL(递送的5.0mL+死体积的0.3mL)。离线测试显示，至颗粒储存器(16)的实际输送精确到+/-3％。在这些条件下，HP到LBL膜的沉积不依赖于在1.0至2.0mg/mL范围内的HP浓度，因此这个水平的准确度对于LBL步骤是足够的。进行模型研究，其中向TFF回路中装载20mL3％CaCO3微颗粒的混悬液。将TFF泵(18)设定为40mL/分钟，并使混悬液再循环5分钟。通过用计算机控制打开阀V5、V6、V7(41、44、28)，用渗透缓冲液(10mM HEPES pH7.0)洗涤颗粒。在数字式量器上测量渗透物体积，并且当收集100g(100mL)渗透物时，通过计算机控制关闭阀。随后，计算机控制阀V1、V2、V5(35、37、44)打开7.9秒，以将12.5mg/mL PLL的5.0mL等分试样递送到TFF回路。5分钟后，渗透阀V7(28)自动打开，开始120秒的浓缩步骤，使TFF回路系统体积返回到20mL。自动打开缓冲液入口阀V5和V6(42、44)以开始渗透步骤，并且用100mL(5×混悬液体积)的缓冲液洗涤混悬液。在1mL、50mL和100mL渗透体积点收集渗透物样品(0.5mL)用于蛋白质测定。当通过关闭V5、V6、V7收集100g的渗透物时，也收集0.5mL的最终颗粒混悬液样品，离心，并吸出上清液用于蛋白质测定。
通过PierceTM 660nm蛋白质测定测量可溶性PLL，其结果示于图2中。初始渗透物[PLL]为约0.85mg/mL。在50mL渗透(2.5个混悬液体积)后，可溶性[PLL]降低约65％，并且在100mL(5.0个混悬液体积)后已除去＞95％。重复PLL递送/渗透循环给出类似的结果，证明本计算机控制的递送是可再现的，并且在5.0混悬液体积的渗透之后，过量的HP移除接近完全。
用于使用PLL的LBL完全周期的计算机控制步骤的一个示例性实例在表1中示出：
表1：用于执行通过TFF进行的自动LBL之单个周期的计算机控制操作
Figure BDA0001162486160000191
关于表1，表示了用于控制阀以添加一层PLL的计算机代码结果。在步骤1处以鼠标点击形式的用户提示开始该序列。在步骤6期间的后续用户提示在已经收集了100g的渗透物之后结束该步骤和循环。由于可变的和经常降低的TFF过滤器流量速率，渗透时间可以为约4分钟至20分钟(或者例如272秒至1172秒)不等。在一些示例性实施方案中，计算机可以配置成使用来自渗透物收集容器的反馈，以在已经收集到100g的渗透物时起动随后的循环。例如，收集容器可以搁置在具有到计算机的输入和输出连接的数字式量器上。计算机在步骤1期间指示量器自动调零。当量器输出到计算机寄存器达100g时，计算机自动执行步骤6。
上述实施例证明计算机控制的HP递送和随后的渗透步骤按照需要并以可靠的方式进行。
实施例3：7HP层LBL微颗粒的半自动制造
使用本文所述的系统和方法制备用七层LBL膜涂覆的一批CaCO3微颗粒。如实施例2所述使用和操作图1中所示的设备。以计算机鼠标点击形式的用户提示进行通过TFF的LBL循环以开始每轮。当用于该步骤的渗透物体积达到100mL，或者通过数字式量器测量为100g时，由用户发出提示。如上所述，每个渗透步骤的持续时间是可变的，因此为了示例性目的，在表2中使用571.9秒的渗透步骤。制造过程的细节如下。
参考图1，TFF回路配备有20cm2，500kD(MWCO)
Figure BDA0001162486160000201
mPES过滤器模块(20)。制备PGA钠盐(5.0mg/mL，在10mM HEPES缓冲液中，Sigma-Aldrich目录号P4636)和PLL-HBr盐(6.25mg/mL，在10mM HEPES缓冲液中，Sigma-Aldrich目录号P6516)的HP储备溶液，并将其分别放置在位于试剂递送歧管32和34上的50mL瓶中。双头泵(36)设定为40mL/分钟。通过在计算机控制下切换阀V1至V4的打开和关闭用HP溶液灌注回路(38和40)，，打开阀V5(44)至废料。将20mL的CaCO3微颗粒的3％(重量/体积)混悬液(如实施例1中所述制备的)置于颗粒储器(16)中，并以40mL/分钟在TFF回路中再循环。通过执行表2中所示的步骤来执行通过TFF的逐步自动化LBL。在从数字式量器上读取的达到100g所收集的渗透物的时间点时，操作者在步骤6和步骤12发出用户提示。执行步骤1至12三次以将六个新的HP层沉积到微颗粒上，总共提供七个HP层。
表2：用于执行通过TFF的自动LBL之两个周期的计算机控制操作
Figure BDA0001162486160000211
在每个渗透步骤之后，在样品端口(24)经由注射器收集颗粒样品用于ζ表面电位和膜沉积测量。通过DLS使用来自Malvern Instruments的Zetasizer测量表面电位，图3A中显示的结果显示预期的交替表面极性模式，表明LBL实验成功。通过以下工序对干燥颗粒样品进行氨基酸分析来测量逐步LBL膜沉积。
将约10mg的LBL颗粒在高真空下干燥并称重。在120℃下在密封瓶中将颗粒样品在0.30mL 6.0M HCl中消化16小时。在真空下蒸发HCl，并使用由Agilent Technologies提供的方法和材料将残余物溶解在硼酸盐缓冲液中用邻苯二甲醛(OPA)进行氨基酸衍生。使用定量HPLC测定测量每种氨基酸(在这种情况下为谷氨酸和赖氨酸)的量。图3B中的结果展示了稳定的膜生长，其中在每个LBL步骤中PLL和PGA平稳积累，证明半自动化过程按照期望工作。图3C中的颗粒的明视场显微术图像显示7HP层颗粒批料很好地分散并且缺乏大的聚集体。
进一步参考图3A至3C所示的实例，通过示例的方式显示了通过TFF自动化(在这种情况下是半自动化)LBL的7HP层微颗粒构建体的特征。关于图3A，逐步ζ电位测量显示交替极性的预期模式。图3B显示了通过AAA测量的逐步膜沉积，其指示通过TFF的LBL成功。图3C所示的成品颗粒的显微术图像显示颗粒以预期的球形形态良好分散。
实施例4：LBL微颗粒疫苗构造体的半自动制造
由于所有数据表明通过TFF的自动化LBL工作良好，制备了与先前在美国专利公开号US20120009254中描述的那些类似的一批微颗粒疫苗构造体。
使用无菌的20cm2500kD MWCO mPES TFF过滤器重复实施例3中使用的设备和工序。在施加第七HP(PGA)层和随后的渗透步骤之后，经由注射器端口(图1中的24)将在5.0mL缓冲液中的12.5mg DP推注添加到TFF回路。在再循环5分钟后，通过计算机控制打开渗透阀V5、V6和V7(图1中的44、42和28)，并且用100mL缓冲液洗涤颗粒。
通过显微术(图4A)和扫描电子显微术(scanning electron microscopy，SEM，图4B和4C)表征颗粒。如前所述，观察到良好分散的球形多孔颗粒(见例如图4A至C)。对在每个渗透步骤结束时收集的颗粒样品进行的逐步表面电位测量表现出交替电荷极性，表明成功的LBL(图4D)。通过在每个LBL循环后收集的样品的AAA测量的逐步膜沉积显示HP在LBL膜中的平稳积累(图4E)。从最终产物收集的AAA数据确定在该示例性批料中吸附的总DP为10.8mg，表明膜中DP的回收率为86％。
将使用本文所述的TFF方法构建的LBL膜的效率与手动离心/抽吸/再悬浮方法的效率进行比较。如上所述制备两个另外批次的这种微颗粒构造体，并且通过AAA测量吸附到膜上的HP和DP的总量。同样，使用美国公开号20120009254中描述的手动方法制备六批类似的构造体，并通过AAA测量总HP和DP吸附。计算每种组分(PLL、PGA和DP)的平均量以作为μg肽/mg干燥的CaCO3的函数，并在图12中以图表展示。结果显示，通过TFF的自动化LBL方法多沉积平均2.5至3.5倍的肽。
无菌TFF过滤器用于该批量合成，但没有采取其他预防措施来防止细菌或其他病原体的潜在污染。尽管缺乏从系统中排除细菌的主动措施，但是通过Pierce LAL生色测定(Thermo Scientific)对终产物进行的内毒素测量表明每μg抗原性DP具有0.04个内毒素单位。该水平完全在实验室动物免疫接种的可接受范围内，并且强烈地表明，采取简单的预防措施，例如使用无菌缓冲液和良好生产规范(good manufacturing practice，GMP)级原料，可将内毒素降低至人用可接受的水平。
实施例5：用蛋白质抗原鸽子细胞色素C合成LBL微颗粒
使用图1中的设备和实施例4中使用的工序，其中具有下述改变。首先，TFF回路配备有20cm2的750kD MWCO mPES TFF过滤器。其次，用5.0mL在10mM HEPES中的2.5mg/mL鸽子细胞色素C(pigeon cytochrome C，pCC，Sigma目录号C4011)溶液替换最终的DP储备溶液。进行该实验以证明完全的天然蛋白质可以有效地并入LBL膜中。没有对实施例4做出其他显著改变。在每个渗透步骤后收集颗粒混悬液的样品，并通过AAA对LBL膜定量。图4F显示了在每个LBL步骤之后HP的平稳积累以及蛋白质pCC的有效并入。AAA测定出8.1mg(66％)的可溶性pCC被捕获在膜中。
实施例6：用于自动化合成无菌疫苗微颗粒的TFF设备
参考图5，对图1所示的设备进行了若干改变。首先，四通道蠕动泵代替试剂添加歧管中的双头泵。这使得两种另外的试剂，洗涤缓冲液(52)和DP(54)待被主动泵送并递送到TFF回路或用洗涤缓冲液冲洗到废料容器。第二，添加额外的计算机控制阀以控制何时递送试剂和递送的途径。第三，将试剂溶液放置在塑料IV袋中并从量器中悬浮。量器用于记录在指定时间取出正确的试剂和正确的量。递送记录可以保存在经验证的计算机上，或由主管技术员手动记录在纸质表格上。
选择了IV袋，因为它们容易以无菌形式获得，并且与可以执行无菌管焊接的支持产品一起使得试剂可以连接到歧管而不暴露于可能的污染。只要管和TFF过滤器是无菌的，并且可溶性试剂溶液是无菌的，并且起始CaCO3微颗粒是无菌的，并且所有的部件连接正确，那么最终产物将是无菌的。
在一个方面，切向流过滤回路包含无菌闭环管网，其包括如图1B所示的切向流过滤过滤器和颗粒储存器。闭环管网包括例如TFF过滤器和颗粒储存器，其中网络与TFF泵分开组装。具有接收袋和TFF过滤器的管网任选地是一次性使用的可弃型材料。闭环管网任选地通过用γ辐射，或环氧乙烷或热处理来灭菌。在一个方面，闭环管网配置成待安装到TFF泵和至少一个计算机控制阀(例如渗透物阀)处。
在某些方面，闭环管网延伸到可溶性试剂添加歧管并安装到至少一个计算机控制阀处，以用于将试剂分配到切向流过滤回路的目的。任选地，扩展的闭环管网与试剂添加歧管分开组装、灭菌，随后安装到TFF泵、TFF循环回路阀和可溶性试剂添加歧管阀。
无菌闭环管网将由经认证为与人用生物药物的制造相容的材料构造。设计的单次使用的可弃型网状结构的一个实例在图6中显示。可以使用特定的管，例如1/16英寸内径的
Figure BDA0001162486160000241
管。管将切割成指定长度并与带倒刺的聚乙烯接头连接。夹具或电缆“拉链”结可用于紧固所有接头，以防止泄漏，并确保封闭系统的维持。可以并入无菌TFF过滤器(72)，例如20cm2，750kD MWCO，mPES过滤器，并且在灭菌之前所有管端部加盖以排除污染物。完整的单元可以包装、包裹，并提交到授权和认可的机构以通过例如γ辐射、环氧乙烷处理或热进行灭菌。这些单元的无菌保质期需要通过实验验证，但预期寿命＞12个月。
在执行LBL颗粒批量合成之前，网状结构被展开并安装到所有多种夹管阀和泵头处，如图5所示。例如PLL、PGA、洗涤缓冲液、经设计的多肽和CaCO3微颗粒的无菌储备溶液在IV袋中离线制备。这些试剂的灭菌可通过经0.2μm过滤器过滤、加热或其他技术来完成。使用市售的无菌管焊接仪器将袋接合到管网。
参考图5，多头蠕动泵(50)和TFF泵(67)两者都被设置为40mL/分钟，并且所有量器被重置为0.0g。此时，该过程的所有后续步骤可以通过计算机控制远程执行。在收集最终产品的时间之前，不需要与设备直接交互。
表3提供了在通常的微颗粒疫苗批量的合成期间执行的步骤的实例。如上所述，这里出于示例性目的呈现8层构造体，但是可以缩短或延长该过程以制备具有少至2层和多达50层或更多层的构造体。设备和用户之间的交互水平将取决于设备是否配备有如上所述的电子反馈机制，或者某些步骤是否由来自用户的连续提示启动。对可分配给计算机的控制量没有限制，但是实际上期望在阶段之间具有安排的暂停，以使得用户可以证明并记录先前的步骤已经按规范执行，并且如果需要则可以收集用于测试的样本。
表3
Figure BDA0001162486160000251
表3：计算机发出的用于执行微颗粒疫苗批量生产的指令。
实施例7：通过带有多个试剂添加歧管泵的TFF系统进行的自动化LBL
图5所示的设备被重新配置，以使得所有泵送的试剂通过如图10所示的独立的蠕动泵驱动。在该配置中，泵由系统计算机单独控制。其保持静止，直到被计算机指令递送所需的试剂。计算机控制泵的速度和每个递送步骤的持续时间。例如，为了将25mL PLL储备溶液递送到TFF回路，计算机打开阀V4和V7(图10中的95和93)。然后其指令泵4(图10中的98)以40mL/分钟泵送约38秒。然后计算机停止泵4并关闭V4和V7。然后计算机通过打开V1并打开泵1以40mL/分钟经15秒，用洗涤缓冲液将残余PLL溶液洗涤至废料。计算机还接收废料袋(97)所悬挂的电子量器(96)的输出。由于TFF纤维过滤器的流量速率变化，每个渗透步骤的长度由收集的渗透物体积的重量来限定，而不是固定时间。用于制造100mL规模批量的8层LBL微颗粒构造体的示例性命令集展示在表4中。
将具有例如如图11所示之布置的无菌闭环系统安装在图10所示的通过TFF设备的LBL上。闭环系统装配有300mL颗粒储存器、5L废料袋、500mL产品袋和无菌的115cm2750kDMWCO mPES TFF过滤器。在无菌条件下制备200mL批量的1.5％CaCO3微颗粒混悬液，并收集在300mL无菌袋(91)中。然后将袋安装到量器(90)上并在管焊接部位(92)无菌焊接到系统上。同样，制备4L pH 7.0的10mM HEPES缓冲液，通过0.2μm膜无菌过滤，并收集在4L无菌袋(85)中。将袋悬挂在量器上并在管位置(84)和(86)无菌焊接。分别制备150mL的在HEPES缓冲液中的5.0mg/mL的PGA钠盐储备溶液和150mg/mL的在HEPES缓冲液中的6.3mg/mL的PLLHBr盐储备溶液，无菌过滤到无菌袋中，安装到悬挂式量器上，并将无菌管焊接到设备的位置(88)和(89)处。最后，制备40mL在HEPES缓冲液中的2.5mg/mL的经设计多肽(designedpolypeptide，DP)的溶液，无菌过滤到100mL无菌袋中，安装到量器上，并无菌焊接在管位点(87)处。
TFF回路泵设定为40mL/分钟。将颗粒储存器安装在磁力搅拌板上并设置为以中速搅拌。然后，用户提示计算机灌注试剂递送歧管上的管线。灌注后，用户检查该线以确保适当的灌注，然后提示计算机将CaCO3颗粒递送到TFF回路。用户检查系统以确保正确递送，然后提示计算机开始浓缩和洗涤循环。系统被编程以在收集了100g(mL)渗透物时终止浓缩，然后开始对所收集的400g进行渗透。用户检查TFF回路以确保已经达到所需的100mL(+/-10mL)体积，然后提示计算机开始重复的LBL循环。缓冲液、PGA、PLL和DP的递送通过数字反馈记录到计算机，并且可以由用户经视觉验证。用户可以选择指令计算机自动继续下一个LBL步骤，或暂停以进行样品收集和记录。约2.5小时后，将最终的LBL微颗粒混悬液自动递送至500mL产品袋。到产品袋的管是无菌夹焊的(pinch welded)并且与设备断开连接以用于分析和配制。
表4
Figure BDA0001162486160000271
Figure BDA0001162486160000281
实施例8：用于以100mL批量规模自动合成无菌疫苗微颗粒的TFF设备
将图5所示的设备重新设计为图13中示意性示出和图14中经照片示出的更流水线式的系统。将与1/8英寸ID和1/4英寸OD管相容的电触发电磁夹管阀安装到所示布置上的孔板(peg board)上。阀V1、V2、V3、V4、V10、V11和V12是常闭二通电磁夹管阀。阀V5、V6、V7、V8和V9是三通夹管阀，在未通电时其一个出口打开且一个出口关闭。当静止(未通电)时，V5关闭至V7，V6关闭至V8，V7关闭至V5，V8关闭至V6，V9关闭至颗粒储存器并打开到废料袋。每个阀都连接到继电器板上的其各自的单独通道，继电器板又连接到计算机。电源还连接到继电器板使用的通道，以分配电力从而触发(打开)多个阀。计算机含有软件，所述软件使得其能够与继电器板接口并执行表5所示步骤顺序。
基本上与图15中示意性显示的管网基本相同的管网由1/8ID 1/4OD硅酮管、聚丙烯倒刺接头(polypropylene barbed junction)和三通(tee)、配备有三个端口和搅拌棒的螺旋盖250mL颗粒储存容器，和115cm2、750kD MW截止值改性聚醚砜(PES)TFF柱(SpectrumLabs)，和5L废料袋组装。如此设置管长度以使死体积保持实际最小。可溶性试剂接头位置用夹具盖住或封闭。网状结构可以照原样使用，或者如果需要无菌处理，则可以通过在合适的机构处用γ辐射处理来包装和灭菌。管段可以任选地标记以阐明该段待安装到哪个阀或泵。
组装的网状结构安装到多个夹管阀、两个蠕动泵和用于将颗粒储存容器固定在搅拌板和TFF柱上的夹具。TFF柱配备有用于连接压力传感器的端口，使得可以监测穿过TFF膜的压力梯度。传感器输出由计算机记录并连续显示在显示器上。将废料袋放置在数字式量器上。量器的输出由计算机记录并用于测量何时收集到足够的渗透体积。
编写定制软件以执行表5中的步骤。软件以表中所示的顺序触发(打开)特定夹管阀。需要固定体积递送的步骤以时间限制，并在持续时间列中以秒(秒)表示。需要一定体积的缓冲液以经由渗透物阀V11离开系统的步骤是以重量限制的并且以克(g)表示。当水性渗透物的密度为1.0g/mL时，其以克计的重量基本上等于其以毫升计的体积。在以体积限制的步骤开始时，计算机从废料袋量器读取数字输出并监测它，直到其增大了指定量。例如，在需要500mL渗透缓冲液进入和离开TFF回路的颗粒洗涤步骤期间，计算机将监测该量器直到废料袋的重量增加500g，然后进行到表中的下一步骤。
定制软件允许合成在从开始到完成一直没有用户干预的全自动模式下运行，或者在半自动模式下运行，半自动模式中在每个阶段结束时，系统暂停并且向用户发送警报或电子邮件形式的通知，告知其该阶段完成并且系统正在等待继续的提示。在这种模式下，用户可以远离设备，并且不会错过采取样品或检查部件以正确操作的机会。
添加了图13中的阀V10及其相应的管部分作为排气口，其允许颗粒储存器中的过剩空气压力被排放至废料。排气口通常是关闭的，并且仅在柱洗涤和颗粒添加/浓缩步骤期间打开。
实施例9：通过TFF以100mL规模半自动制造7HP层LBL微颗粒。
使用实施例8中所述并且如图13所示的通过TFF设备的LBL。将通过实施例1的方法制备的10mM HEPES pH 7缓冲液(5L)、在HEPES缓冲液中的PGA(100mL，5.0mg/mL)、在HEPES缓冲液中的PLL(125mL，6.25mg/mL)和在PGA盐水中的1.6％CaCO3微颗粒混悬液(200mL)的储备溶液置于适当尺寸的袋中，并且分别通过带倒刺的管连接件附接到阀V1、V2、V3和V12上游的管。将可溶性试剂袋悬挂在阀上方，以促进试剂的重力进料，如图14所示。将颗粒混悬液袋倒置以防止在管端口处的颗粒沉降和颗粒阻塞形成。对于无菌运行，首先通过0.2μm过滤器过滤将HEPES、PGA和PLL溶液灭菌，并使用无菌管焊机连接网状结构。
将试剂递送蠕动泵设定为以120mL/分钟运行，将TFF回路蠕动泵设定为以100mL/分钟运行，并且将颗粒储存器下方的搅拌盘设定为中速。将执行表5中列出的步骤的软件设置为半人工模式，意味着在每个阶段结束时，计算机将向用户发送通知电子邮件，并在该步骤暂停，直到用户提示继续。
执行表5中的灌注和柱洗涤阶段。将含有1.6％颗粒混悬液的试剂袋温和颠倒几次以分散沉降的颗粒，悬挂在正上方位置，并执行表5中的颗粒加样和浓缩程序。在这些步骤之后，TFF回路含有约100mL的约3％的颗粒混悬液。通过置于TFF回路中的管线内注射器端口手动收集颗粒样品(约0.3mL)。
开始表5中的PLL沉积步骤，并进行总共六轮自动化LBL，各自以暂停和样品收集结束。将颗粒样品在高真空下在去皮重的玻璃消化容器中干燥并经历实施例3中所述的AAA工序。图16A中的AAA数据显示了均聚物PLL和PGA以及稳定的LBL膜的平稳积聚。另外，在Malvern Instruments Zetasizer上进行了ζ表面电位测量，并且图16B中所示的数据显示了在PLL沉积步骤之后的正向或在PGA沉积步骤之后的负向上的约15mV的预期变化。通过显微术检查颗粒显示它们分散良好且是球形的。
该具体合成在7层停止。添加25mL 2.5mg/mL经设计肽溶液，然后进行表5最后阶段所示的步骤，会得到如实施例4所述的疫苗微颗粒药物。
表5
Figure BDA0001162486160000311
Figure BDA0001162486160000321
Figure BDA0001162486160000331
本文描述的实施例证明了优良的疫苗微颗粒可以使用通过TFF的自动或半自动化LBL制备。
另外考虑的方面包括在固定的垂直平台上组装和安装部件(夹管阀、线缆等)，以提供待添加的附加方面而没有纠缠。
图5展示了自动化系统的另一示例性示意图。除了HP(参见图5中的PGA 56、PLL58、CaCO3混悬液60)之外，该示例性实施方案还提供了4通道蠕动泵50以递送洗涤缓冲液52和设计的多肽54。可溶性试剂袋可以无菌焊接(见图5中的62)到歧管并悬挂式数字式量器将记录递送的时间和数量。在64处展示了计算机控制阀，例如2通或3通夹管阀。示例性TFF回路大体上在66处展示。在示例性实施方案中，设计的肽可以不需要仔细计量，因为可能全部试剂将以单次推注递送。
在一些示例性实施方案中，袋中的无菌试剂通过无菌管焊接(X)接附至封闭系统。CaCO3颗粒混悬液通过重力输送到储存容器，在那里通过机械搅拌温和地混合。颗粒在处理期间通过过滤器回路连续循环。将浓缩的HP储备溶液、设计的肽和洗涤缓冲液通过计算机控制的夹管阀以控制的量和预设的时间引入到储存器中。量器记录重量变化，以确认正确的递送。来自LBL步骤的过量可溶性试剂从TFF过滤器切向清除至废料。在最后的洗涤步骤后，将疫苗颗粒混悬液递送到产品袋用于离线释放测试和配制。
适合于图6所示的这个设计的示例性闭环管网的示意图。这一实施方案包括固定长度管段68、带倒刺的接头70、TFF过滤柱72、具有其他内部混合装置的搅拌棒76的储存器74，以及用于废料78和产品80的接收袋。可以在每个接头处包括标签，以确保正确安装到设备上以及试剂的正确焊接。在一些示例性实施方案中，闭合回路完全由管、倒刺接头、TFF过滤柱、具有搅拌棒的封闭式颗粒储存器，以及用于废料和产品的接收袋组成。
图11中显示了示例性闭环管网的示意图，该闭环管网适合于配置有用于每种试剂的独立泵的试剂递送歧管。该实施方案包括图6所示的网状结构中的所有部件，并且包括用于将无菌试剂无菌焊接到歧管的位点(图11中的84、86、87、88、89、92)。如前所述，该闭合回路可以在GMP条件下组装、包装、灭菌，然后储存直到使用。
图7示出了用于通过TFF的自动化LBL的示例性系统。系统100可以包括服务器101(或简称为本地计算机)。服务器101可以包括多个信息，包括但不限于信息和档案(profile)、算法和处理模块以及其他数据存储。服务器101可以经由通信信道110与网络106通信。
另外，系统100可以访问另外的第三方数据源或服务器103或者与其对接。第三方数据源103可以经由通信信道111与网络106通信。应注意，尽管显示为分开的，但是源103可以包括基本上类似于服务器101的服务器。服务器101或源103可以包括数据服务提供商，例如蜂窝服务提供商、商业信息提供商或任何其他合适的提供商或储存库。服务器101或源103还可以包括提供实现本文所述的任何接口/方法的应用和/或计算机可执行代码的应用服务器。服务器101或源103可以呈现多个应用默认值、选项、设置和/或配置，使得设备可以相应地接收和处理应用。服务器101或源103可以在设备的观看者界面或web浏览器上呈现任何应用，以便由设备的观看者相对容易地选择。为应用选择提供的观看者界面或网页可以是应用商店和/或应用市场的形式。
或者，另一服务器部件或本地计算机设备(例如104、105和/或106)可产生观看者接口并控制与服务器101或源103的连通性。此外，服务器101或本地计算机设备104、105和106中的一个或多个可以配置为周期性地访问源103并缓存与本发明的实施方案中使用的数据相关的数据。
网络106可以是任何合适的网络，包括因特网、广域网和/或局域网。服务器101和源103可以通过通信信道110、111与网络106通信。通信信道110、111可以是包括无线、卫星、有线或其他的任何合适的通信信道。
示例性系统100还包括通过通信信道112与网络106通信的计算机设备105。计算机设备105可以是包括个人计算机(固定位置)、笔记本电脑或便携式计算机、个人数字助理、蜂窝电话、便携式平板计算机、便携式音频播放器或其他的任何合适的计算机设备。例如，系统100可以包括分别举例为便携式蜂窝电话和平板电脑的计算机设备104和106。设备104和106可以包括显示装置141、161和/或按钮/控制器142。控制器142可以独立地操作或与上述任何控制器组合操作。
此外，设备104、105和106可以通过通信信道115、116(例如，有线、无线、蓝牙信道等)彼此通信；并且还可以通过通信信道112、113和114与网络106通信。
因此，设备104、105和106可以都与服务器101和源103中的一个或两个以及彼此通信。每个设备可以与网络106和彼此可分离地通信，使得设备104、105和106可以在没有与网络106的恒定通信(例如，使用接口的数据连接控制)的情况下操作。例如，如果没有数据可用性或者如果观看者指示设备离线工作(例如没有即时的网络连接)，则设备104、105和106中的任何一个使用的数据可以基于存储的或缓存的信息/参数。因此，设备104、105和106中的每一个均可以配置为执行在各种示例性实施方案中所描述的方法。
此外，使用任何所示的通信介质，设备104、105和106可以操纵、共享、传输和/或接收先前或当前在系统100的任一所示元件中产生的不同数据。例如，数据在服务器101和/或源103上可用。此外，设备(device)104、105和106中的任何设备的观看者可以独立地对数据操纵、传输等，例如以在给定时间独立地确定索引的当前值。
另外且如上所述，本发明的示例实施方案可以以计算机实现的过程和用于实践这些过程的设备(例如，控制通过TFF之LBL的软件)的形式来实现。因此，根据示例实施方案，上文所描述的方法可以由计算机系统或设备来实现。计算机系统或设备可以在某种程度上类似于上述移动设备和计算机设备，其可以包括如下所述的元件。
图8示出根据示例性实施方案的计算机设备。本文所描述的方法的部分或全部可以作为计算机系统200的处理器202中的指令来执行。计算机系统200包括用于存储指令和信息的存储器201、用于计算机通信的输入设备203，以及可以显示用户界面205的显示设备204。用户界面可以向用户提供动作的提示，诸如提供需要用户手动点击以启动聚电解质沉积循环的指示。计算机系统200还可以连接到网络206。或者，计算机控制包括配置为显示至少一个聚电解质沉积循环的状态的用户界面。
因此，本发明可以在软件中实现为例如与计算机系统200某种程度相似的计算机系统上的任何合适的计算机程序。例如，根据本发明的程序可以是使计算机执行本文所述的示例方法的计算机程序产品。
因此，实施方案可以以计算机所实现的过程和用于在计算机程序产品上实践这些过程的设备的形式来实现。实施方案包括在计算机可用介质302上的如图9描绘的计算机程序产品300，其中计算机程序代码逻辑304包含作为制品的有形介质中包含的指令。用于计算机可用介质302的示例性制品可以包括CD-ROM、硬盘驱动器、通用串行总线(USB)闪存驱动器或任何其他计算机可读存储介质，其中，当计算机程序代码逻辑304被加载到计算机中并由计算机执行时，计算机成为用于实施本发明的设备。实施方案包括计算机程序代码逻辑304，例如，是否存储在存储介质中，加载到计算机中和/或由计算机执行，或通过某些传输介质(例如通过电线或电缆、通过光纤或通过电磁辐射)传输，其中，当计算机程序代码逻辑304被加载到计算机中并由计算机执行时，计算机成为用于实施本发明的设备。当在通用微处理器上实现时，计算机程序代码逻辑304段配置微处理器，以创建具体的逻辑电路。
可以使用一个或多个计算机可读介质的任何组合。计算机可读介质可以是计算机可读信号介质或计算机可读存储介质。计算机可读存储介质可以是例如但不限于电子、磁、光学、电磁、红外或半导体系统，仪器或设备或前述的任何合适的组合。计算机可读存储介质的更具体的示例(非穷举列表)将包括以下：具有一条或多条线的电连接、便携式计算机磁盘、硬盘、随机存取存储器(random access memory，RAM)、只读存储器(read-onlymemory，ROM)、可擦除可编程只读存储器(erasable programmable read-only memory，EPROM或闪存)、光纤、便携式光盘只读存储器(compact disc read-only memory，CD-ROM)、光存储设备、磁存储设备或上述的任何合适的组合。在本文的上下文中，计算机可读存储介质可以是可以包含或存储由指令执行系统、设备或装置使用，或与指令执行系统、设备或装置结合使用的程序的任何有形介质。
计算机可读信号介质可以包括例如在基带中或作为载波的一部分的具有包含在其中的计算机可读程序代码的传播数据信号。这样的传播信号可以采取多种形式中的任何一种，其包括但不限于电磁、光学或其任何合适的组合。计算机可读信号介质可以是不为计算机可读存储介质的任何计算机可读介质并且其可以通信、传播或传输由指令执行系统、设备或装置使用或与指令执行系统、设备或装置结合使用的程序。
包含在计算机可读介质上的程序代码可以使用任何适当的介质传输，包括但不限于无线、有线、光纤电缆、RF等，或上述的任何合适的组合。
用于执行本发明一些方面之操作的计算机程序代码可以以一种或更多种编程语言的任意组合来编写，包括诸如Java、Smalltalk、C++等的面向对象的编程语言和诸如“C”编程语言或类似的编程语言的常规过程编程语言。程序代码可以完整地在观看者的计算机上执行、作为独立的软件包例如从联网系统部分地在观看者的计算机上执行、部分地在观看者的计算机上且部分地在远程计算机上执行，或者完全在远程计算机或服务器上执行。在后一种情况下，远程计算机可以通过任何类型的网络(包括局域网(local areanetwork，LAN)或广域网(WAN))连接到观看者的计算机，或者可以连接到外部计算机(例如，使用因特网服务提供商通过因特网)。
如上所述，示例实施方案的特征包括本领域中未发现的其他独特特征。
本文所述的方法和设备可用于将多层膜沉积到基材芯上，例如芯纳米颗粒或芯微颗粒。直径为5纳米(nm)至50微米(μm)数量级的芯尺寸是特别有用的。芯可以由许多材料制成，条件是其具有可控的尺寸分布并且具有足够的表面电荷(正或负)以结合聚电解质。由无机材料组成的示例性芯包括CaCO3微颗粒、CaCO3纳米颗粒、其他无机盐如Mg CO3、磷酸钙、二氧化硅颗粒和铁氧化物颗粒。由有机聚合物制成的芯颗粒的实例包括由聚乳酸(polylactic acid，PLA)、聚乳酸乙醇酸共聚物(polylactic acid glycolic acidcopolymer，PLGA)、聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)、壳聚糖、胶乳、透明质酸和明胶制成的纳米颗粒和微颗粒。另外，芯可以由无机和有机材料构成，例如与聚-L-谷氨酸钠盐共沉淀的CaCO3微颗粒。
LBL膜工艺的一般性和相对简单性允许将许多不同类型的聚电解质沉积到许多不同类型的表面上。多肽多层膜是聚电解质多层膜的亚类，包括至少一个包含带电荷多肽(例如设计的多肽)的层。多肽多层膜相对于由其他聚合物制成的膜的关键优点是它们的生物相容性。LBL膜也可以用于封装。多肽膜和微胶囊的应用包括例如纳米反应器、生物传感器、人造细胞、疫苗和药物递送载剂。
术语“聚电解质”包括分子量大于1,000且每分子至少5个电荷的聚阳离子和聚阴离子材料。合适的聚阳离子材料包括例如多肽和聚胺。多肽包括例如，如聚-L-赖氨酸(PLL)、聚-L-精氨酸、聚-L-鸟氨酸、聚-D-赖氨酸和聚-DL-赖氨酸的多肽。聚胺包括例如聚乙烯胺、聚(氨基苯乙烯)、聚(氨基丙烯酸酯)、聚(N-甲基氨基丙烯酸酯)、聚(N-乙基氨基丙烯酸酯)、聚(N，N-二甲基氨基丙烯酸酯)、聚(N，N-二乙基氨基丙烯酸酯)、聚(氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N-甲基氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N-乙基氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N，N-二甲基氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N，N-二乙基氨基甲基丙烯酸酯)、聚(乙烯亚胺)、聚(二烯丙基二甲基氯化铵)、聚(N，N，N-三甲基氨基丙烯酰氯化物)、聚(甲基丙烯酰胺基丙基三甲基氯化铵)、壳聚糖和包含一种或多种前述聚阳离子材料的组合。合适的聚阴离子材料包括例如，如聚-L-谷氨酸(PGA)、聚-L-天冬氨酸、聚-D-天冬氨酸、聚-L-γ-谷氨酸的多肽，核酸如DNA和RNA，藻酸盐、角叉菜胶、叉红藻胶、果胶、黄原胶、透明质酸、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸葡聚糖、聚(甲基)丙烯酸、氧化纤维素、羧甲基纤维素、酸性多糖和交联羧甲基纤维素(croscarmelose)、含有羧基侧基(pendant carboxyl group)的合成聚合物和共聚物，以及包含一种或多种前述聚阴离子材料的组合。在一个实施方案中，RSV表位和聚电解质具有相同的电荷符号。
均聚物在本文中定义为由单个重复单体亚基组成的聚合物。为了LBL制造的目的，单体亚基通常带有至少一个正电荷或负电荷。因此，对于LBL目的，均聚物通常是聚电解质。存在广泛的可用于LBL的均聚物。特别重要的是聚合氨基酸，例如聚-L-谷氨酸、聚-L-天冬氨酸、聚-L-赖氨酸和聚-L-精氨酸等。当均聚物由重复氨基酸组成时，其也可以称为均聚肽。本文中用于均聚肽(homopolypeptide)的缩写是HP。
在一个实施方案中，膜的一个或多个聚电解质层包含设计的多肽(DP)。任选地，为了方便，设计的多肽是化学合成的。在一个实施方案中，用于适合于通过静电逐层沉积的多肽的设计原理在美国专利公开号2005/0069950中阐述，由于其多肽多层膜的教导，将其通过引用并入本文。简言之，主要设计问题是多肽的长度和电荷。静电是最重要的设计问题，因为它是静电LBL的基础。没有合适的电荷性质的情况下，多肽在pH 4至10下可基本上不溶于水性溶液，并且不能容易地用于通过静电LBL制造多层膜。其他设计问题包括多肽的物理结构、由多肽形成的膜的物理稳定性、以及膜和组分多肽的生物相容性和生物活性。在一个具体方面，所设计的多肽包含病毒、细菌、寄生虫或真菌的表位，并且适合于引发免疫应答。
设计的多肽是指具有足够电荷以与带相反电荷的表面稳定结合的多肽，即可沉积到多层膜的层中的多肽，其中膜形成的驱动力是静电。短稳定膜是一旦形成，在37℃下在PBS中温育24小时后保留超过一半的组分的膜。在一些具体实施方案中，设计的多肽长度为至少15个氨基酸，并且多肽的每个残基的净电荷数量在pH 7.0下大于或等于0.1、0.2、0.3、0.4或0.5。在pH 7.0下带正电(碱性)的天然存在的氨基酸是精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、鸟氨酸(Orn)和赖氨酸(Lys)。在pH 7.0下带负电荷(酸性)的天然存在的氨基酸残基是谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)。可以采用相反电荷的氨基酸残基的混合物，只要电荷的总净比率满足规定的标准。在一个实施方案中，设计的多肽不是均聚物。在另一个实施方案中，设计的多肽是无支链的。
在一个实施方案中，设计的多肽包含单个抗原表位，其侧翼为两个表面吸附区：N末端表面吸附区和C末端表面吸附区。在另一个实施方案中，设计的多肽包含单抗原表位，侧翼为连接于表位N末端的一个表面吸附区。在另一个实施方案中，设计的多肽包含个单抗原表位，侧翼为连接于表位C末端的一个表面吸附区。
设计的多肽的每个独立区域(例如，表位和表面吸附区)可以通过溶液相肽合成、固相肽合成或合适的宿主生物体的遗传工程分别合成。溶液相肽合成是目前市场上用于生产大多数批准的肽药物的方法。溶液相和固相方法的组合可以用于合成相对长的肽，甚至小的蛋白质。肽合成公司具有以付费服务为基础合成困难肽的专业知识和经验。该合成在良好生产规范(GMP)条件下和适于临床试验和商业药物开发的规模下进行。
或者，多个独立区域可以通过溶液相肽合成、固相肽合成或合适的宿主生物体的遗传工程一起合成作为单个多肽链。在任何特定情况下，方法的选择将是方便或经济的问题。
应当强调的是，本发明的上述实施方案，特别是特定实施例的任何详细讨论仅仅是实现的可能示例，并且为了清楚地理解本发明的原理而阐述。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明的上述实施方案进行许多变化和修改。所有这些修改和变化旨在被包括在本公开内容和本发明的范围内并由所附权利要求保护。

Claims (27)

1.用于颗粒的自动化合成的系统，所述颗粒含有沉积在基材芯上的至少一个聚电解质层，所述系统包含：
计算机；
包含TFF回路和渗透物阀的切向流过滤部件，所述渗透物阀配置成经由通过计算机控制选择性地执行渗透步骤，其中所述TFF回路包含容纳所述基材芯的混悬液的颗粒储存器、TFF过滤器、连接所述颗粒储存器和所述TFF过滤器的连接装置和产品袋，其中所述TFF回路包含闭环管网，所述闭环管网包括所述TFF过滤器、所述颗粒储存器、所述连接装置和所述产品袋，并且其中所述颗粒储存器与机械搅拌装置连接以维持所述基材芯的分散；和
可溶性试剂添加歧管部件，其中可溶性试剂从所述可溶性试剂递送歧管部件到切向流过滤部件的递送由至少一个计算机控制阀控制，其中所述可溶性试剂包含所述聚电解质，并且其中所述闭环管网延伸到所述可溶性试剂添加歧管部件，并安装到至少一个阀处，以用于将试剂分配到所述TFF回路的目的，
其中所述系统提供循环回路，所述循环回路提供用于颗粒合成的连续流动路径，所述颗粒包含以无菌形式沉积在所述基材芯上的至少一个聚电解质层。
2.根据权利要求1所述的系统，其中在所述系统中所述渗透物阀、所述可溶性试剂添加歧管部件的计算机控制阀和任选的泵在所述连续流动路径的外部。
3.根据权利要求1所述的系统，其中所述可溶性试剂添加歧管部件的所述计算机控制阀和所述渗透物阀是完全自动化的。
4.根据权利要求1所述的系统，其还包含：
将限定体积的所述可溶性试剂自动递送到切向流过滤部件；
将所述可溶性试剂与所述基材芯颗粒混合限定的时间；
通过渗透消除限定体积的过量可溶性试剂；和
在所述可溶性试剂中递送限定体积的具有与所述聚电解质极性相反的第二试剂。
5.根据权利要求1所述的系统，其中所述可溶性试剂递送歧管部件包含用于递送多种试剂的多个计算机控制阀。
6.根据权利要求5所述的系统，其中所述多种试剂包括带相反电荷的聚电解质。
7.根据权利要求5所述的系统，其中所述可溶性试剂递送歧管部件包含计算机控制阀，其用于将洗涤缓冲液经计算机控制地递送至废料、切向流过滤部件或两者。
8.根据权利要求1所述的系统，其中所述可溶性试剂递送歧管部件包含至少一个泵，所述泵配置成通过包含一个或更多个计算机触发阀的路径将所述可溶性试剂推进到所述颗粒储存器。
9.根据权利要求6所述的系统，其中所述切向流过滤部件和所述可溶性试剂递送歧管部件配置成执行含有多个带相反电荷的聚电解质层的多层膜的自动逐层形成，其中至少一个聚电解质沉积循环通过切向流过滤渗透步骤的计算机控制和通过来自所述可溶性试剂递送歧管部件的多种试剂之递送的计算机控制而至少部分自动化。
10.根据权利要求9所述的系统，其中所述基材芯的直径为50nm至50μm。
11.根据权利要求1所述的系统，其中所述可溶性试剂被递送到所述切向流过滤部件并充分混合，以使得所得到的聚电解质浓度是可预测的和可再现的。
12.根据权利要求11所述的系统，其中所述聚电解质浓度在期望的聚电解质浓度的+/-20％以内。
13.根据权利要求12所述的系统，其中所述期望的聚电解质浓度为0.2至2.0mg/mL。
14.根据权利要求1所述的系统，其中所述可溶性试剂递送歧管部件配置成通过泵送、重力、注射器或压缩气体推进地递送至少一种试剂。
15.根据权利要求1所述的系统，其中所述切向流过滤部件和/或所述可溶性试剂递送歧管部件另外包含至少一个计算机控制的通气口。
16.根据权利要求1所述的系统，其中所述可溶性试剂递送歧管部件包含试剂计量装置，所述试剂计量装置配置成指示递送或未递送的可溶性试剂的体积或重量。
17.根据权利要求16所述的系统，其中所述计量装置配置成将数据传输到计算机，以用于记录递送的可溶性试剂的时间和量的目的。
18.根据权利要求1所述的系统，其中所述切向流过滤部件包含配置成向控制计算机报告TFF循环回路体积数据的体积计量装置。
19.根据权利要求18所述的系统，其中所述系统包含控制计算机，所述控制计算机配置成将所述切向流过滤部件内部的混合物的回路体积保持在设定范围内，这通过触发阀以添加试剂增大所述体积或渗透减小所述体积来实现。
20.根据权利要求1所述的系统，其中所述计算机包括用户界面，其配置成向用户提供用户动作的提示。
21.根据权利要求20所述的系统，其中所述提示包括需要用户手动点击以启动聚电解质沉积循环的指示。
22.根据权利要求1所述的系统，其中所述计算机包括用户界面，其配置成显示至少一个聚电解质沉积循环的状态。
23.根据权利要求1所述的系统，其中所述切向流过滤部件包含计量装置，以测量在特定聚电解质沉积循环步骤期间通过所述过滤器的渗透物的量，并且将该数据报告回控制计算机。
24.根据权利要求23所述的系统，其中所述计算机控制在测量到用户指定量的渗透物后自动终止聚电解质沉积循环步骤。
25.根据权利要求24所述的系统，其中指示是来自电子量器的信号的形式，所述电子量器连续地测量离开所述切向流过滤回路的渗透物的量。
26.根据权利要求21所述的系统，其中所述闭环管网通过用γ辐射或环氧乙烷或热处理而灭菌。
27.根据权利要求1所述的系统，其中所述闭环管网配置为待安装到所述TFF泵和至少一个计算机控制阀处。
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