CN102846474A - 一种制备具有内外水相梯度差囊泡的装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物制剂领域，公开一种可以快速大规模制备具有内外水相梯度差的囊泡（包括脂质体）的方法及其装置和应用。本发明是对膜分离机理和离子交换与吸附机理的巧妙组合，当所需建立梯度的囊泡的特性、离子梯度种类、制备规模不同时，可以选择不同性能的膜分离装置和离子交换装置进行组合。本发明通过膜分离方法将囊泡混悬液水化介质中的阳离子、阴离子、阴阳离子和/或荷电大分子物质分配到透析介质中；使用离子交换方法选择性地交换或清除进入透析介质中的阳离子、阴离子、阴阳离子和/或荷电大分子物质，从而使囊泡在较短时间内建立较大的内外水相梯度差。本发明可应用于脂质体凝胶、磁性脂质体、纳米粒/纳米凝胶的制备。

Description

一种制备具有内外水相梯度差囊泡的装置及方法

技术领域：

本发明属于药物制剂领域，公开一种可以快速大规模制备具有内外水相梯度差的囊泡（包括脂质体）的方法及相关装置，本发明还提供所述囊泡的应用。

背景技术：

某些两亲性分子，如许多天然的或合成的表面活性剂及不能简单缔合成胶团的磷脂，分散于水中时会自发形成一类具有封闭双层结构的分子有序组合体，称为囊泡（vesicle），也称为脂质体(liposome) 。囊泡和脂质体这两个术语的意义在文献中有些含混。一般认为，如果这些两亲分子是合成表面活性剂组成，则形成的结构称为囊泡；若由天然表面活性剂卵磷脂组成，则称为脂质体。

脂质体最早由Bangham于1965年发现，后来作为一种膜的模型广泛应用于生物学领域。20世纪60年代末Rahman等首先将脂质体作为药物载体应用。同其他药物载体相比：（1）脂质体主要成分是磷脂和胆固醇，为哺乳动物细胞膜的天然成分，生物相容性好；（2）脂质体的大小、成分、表面电荷等有很大的选择空间；（3）脂质体能包裹亲水性和亲脂性药物，将药物包封入脂质体中，可保护药物在体内不被降解，同时避免药物对受体识别配体的干扰；（4）易获得适宜的药物-载体比，制备简单。因此，以脂质体作为药物载体具有独特优势。

脂质体作为一种药物载体，为达到改变药物体内外行为的目的，需包封大量的药物，因此高包封率是要解决的首要问题之一。脂质体装载药物的方法分为主动法和被动法两大类。被动载药法工艺简单，适于装载脂溶性、与磷脂膜亲和力高的药物。但采用被动法制得的脂质体通常包封率不高，特别是包封一些两亲性弱酸或弱碱药物，由于其油水分配系数受介质的pH值和离子强度影响较大，包封条件不易掌握，制备的脂质体包封率差异较大。随之产生的低包封率及易泄漏问题在很大程度上限制了脂质体作为药物载体的推广。主动载药法（又称为离子梯度法）通过脂质体内外水相不同离子或化合物梯度进行载药，可以将某些两亲性药物（特别是弱酸、弱碱性药物）高效地装载入脂质体内，克服了早期药物突释和泄漏，为这类药物脂质体制剂的大规模工业化生产提供了基础。

主动载药法细分为：（1）pH梯度法；（2）硫酸铵梯度法；（3）醋酸钙梯度法；（4）离子梯度-细胞离子载体法。其中后面三种方法将药物主动装载如脂质体的原动力都可归结为pH梯度，即通过适当离子梯度诱导产生pH梯度。这两种方法其实是pH梯度法的特殊形式，是通过pH梯度法衍生出来的新方法。弱碱性药物可采用pH梯度法或硫酸铵梯度法，弱酸性药物则可采用醋酸钙梯度法。离子梯度法的实现取决于适宜离子梯度差的建立，如氢离子梯度，可以形成“质子池”，酸性的内部环境使扩散入脂质体内部的中性两亲性药物发生质子化作用而荷正电，阻止其再次跨膜泄露。同时，离子梯度法中还常常采用适宜的阴离子和/或大分子物质（离子化合物）（大分子物质可以只交换大分子物质一种离子，如肝素钠，可以只交换一种离子，即肝素阴离子，余下的钠离子（留在体系中）与药物在脂质体内部形成凝胶状沉淀，进一步提高包封率和稳定性。

采用主动载药法制备脂质体药物制剂一般需如下几个步骤：（1）制备空白脂质体；（2）建立适宜的离子梯度；（3）装载药物；（4）除去未包封的游离药物。在上述四个步骤中，制备空白脂质体的技术已经比较成熟，从实验室规模的制备一直到工业化大生产都有相应的技术和设备；而将药物装载入梯度脂质体的技术也易于实现，只要建立的梯度足够大，药物几乎可以100 %的包封于脂质体中而无须在载药后除去游离药物。因此，建立适宜的跨膜离子梯度是整个制备流程的重点，也是实现脂质体制剂大规模工业化生产的关键。

目前普遍采用的梯度差建立方法包括：稀释法、调节外水相pH法、透析法、超滤法、葡聚糖凝胶法即分子筛法。

稀释法即使用适合的介质对空白脂质体混悬液进行稀释以降低外水相离子浓度，从而产生内外水相离子梯度差。采用稀释法建立梯度时脂质体混悬液被稀释较多（可达1000倍），不利于直接载药及之后的生产过程。所以使用稀释法建立梯度后往往还需要一个浓缩的过程，此过程一般通过凝胶过滤法完成，从而使得生产流程复杂化，增加了制剂在生产过程中受污染的风险，带来生产成本的上升。

调节外水相pH法是通过加入pH调节剂调节脂质体外水相的pH值，以使脂质体内外水相间质子浓度不同，一般利用此方法装载弱碱性药物。采用常规pH调节方法，往往是三瓶装制剂，如在欧洲上市的阿霉素脂质体（MYOCET）、长春新碱脂质体（MARQIBO），分别为“药物”、“空白脂质体”、“pH调节剂”，在装载药物时，脂质体外水相中的枸橼酸或者其它物质不能除去，而枸橼酸的毒性较大。

使用透析法建立梯度廉价方便，但由于操作耗时长，易引起脂质体内外水相梯度差流失，也不适用于某些稳定性较差的囊泡的内外水相梯度差的建立。

超滤法耗时相对较短，但超滤中的高压和搅拌过程容易使脂质体产生泄漏、聚集和膜融合，造成脂质体内外水相梯度差流失，且影响其稳定性和均匀性。

分子筛法（常用葡聚糖凝胶法）虽然耗时相对较短，但使用此方法建立梯度时部分脂质体会被凝胶吸附或被洗脱液稀释，操作终点（脂质体乳光消失等）判断偏差导致操作重现性不佳，并且需要价格昂贵的生产设备和耗材。

因此，上述方法难以同时实现质量可控、高效、低成本和大规模的脂质体梯度建立，都难以适应大规模工业化生产的要求。

离子交换技术具有相当长的历史，某些天然物质如泡沸石和用煤经过磺化制得的磺化煤都可用作离子交换剂。随着现代有机合成工业技术的迅速发展，研究制成了许多种性能优良的离子交换树脂，并开发了多种新的应用方法，在许多行业特别是高新科技产业和科研领域中广泛应用。近年国内外生产的树脂品种达数百种，年产量数十万吨。在工业应用中，离子交换树脂的优点主要是处理能力大，交换范围广，能除去各种不同的离子，交换容量高，可以反复再生使用，工作寿命长，运行费用较低。以离子交换树脂为基础的多种新技术，如色谱分离法、离子排斥法、电渗析法等，各具独特的功能。离子交换树脂在50年代已作为药物载体用于延缓药物释放, 其控释应用主要是在胃肠道中控制药物释放, 即口服药物树脂控释装置。它是根据离子交换原理设计的, 利用胃肠道中的离子，如钠离子、钾离子，将结合于树脂上的药物交换出来，达到减少不良苦味等目的。其主要应用是制备口服药物树脂液体控释系统(简称ORCRS)。离子交换技术的开发和应用还在迅速发展之中。

离子交换树脂都是用有机合成方法制成。常用的原料为苯乙烯或丙烯酸(酯)，通过聚合反应生成具有三维空间立体网络结构的骨架，再在骨架上导入不同类型的化学活性基团(通常为酸性或碱性基团)而制成。大多数离子交换树脂制成颗粒状，也有一些制成纤维状或粉状。树脂颗粒的尺寸一般在0.3～1.2 mm范围内，大部分在0.4～0.6 mm之间。它们有较高的机械强度(坚牢性)，化学性质也很稳定，在正常情况下有较长的使用寿命。离子交换树脂的品种很多，因化学组成和结构不同而具有不同的功能和特性，适应于不同的用途。应用树脂要根据工艺要求和物料的性质选用适当的类型和品种。

离子交换树脂中化学活性基团的种类决定了树脂的主要性质和类别。首先区分为阳离子树脂和阴离子树脂两大类，它们可分别与溶液中的阳离子和阴离子进行离子交换。混合树脂中，由于阳、阴树脂是均匀混合的，所以阳、阴离子交换反应几乎同时进行，交换过程所产生的H⁺和OH^-都不能积累起来，基本上消除了反离子对交换反应的影响，这就避免了逆反应，使交换反应进行得很彻底。

膜分离技术是以选择性多孔薄膜为分离介质，使分离的溶液借助某种推动力（如：压力差、浓度差、电位差等）通过膜，低分子溶质透过膜，大分子溶质被截留，以此来分离溶液中不同分子量的物质，从而达到分离、浓缩、纯化目的。

膜分离技术具有分离效率高，分离条件温和，操作方便，设备紧凑，安全节能，纯物理过程，产品品质稳定性好，连续化操作，灵活性强，投资少，便于自身集成或与其它技术集成等优点。此技术已经在海水淡化、污水处理、石油化工、清洁技术、生化、医药、食品、医疗卫生、环保、电子、纺织、冶金、能源、航天等行业领域得到了广泛的应用。

膜分离技术实现的主要途径即膜过滤，膜过滤方式包括：⑴终端过滤(dead end filtration )即以压力作为推动力，料液流动方向与滤膜表面垂直，并且透过液方向与料液一致。⑵错流过滤（cross flow filtration）即透过液方向垂直于进料的方向，而料液流动方向与滤膜表面平行，进料以一定流速冲刷膜表面,减小浓差极化效应。

错流过滤过程中，流体平行于过滤表面流动，产生的表面剪切力带走膜表面的沉积物，防止污染层积累，从而有效地改善液体分离过程，使过滤操作可以在较长的时间内连续进行；错流过滤所产生的流体剪切力和惯性举力能促进膜表面的溶质向流体主体的反向运动，提高了过滤速度。 

常有的膜过滤技术有微滤(micro-filtration, MF)，超滤(untra-filtration, UF)，反渗透(reverse osmosis, RO)，透析(Dialysis, DS)，电透析(electro-dialysis, ED)，纳滤(nano-filtration, NF)，亲和过滤(affinity filtration, AF)，渗透气化(pervaporation, PV)等，这些技术都已经非常成熟，并从实验室研究阶段走向了实用化。

发明内容：

针对目前脂质体内外水相梯度建立过程中存在的质量控制难、耗时长、梯度低、成本高、难以实现规模化大生产等问题，本发明设计了一种可以快速大规模制备具有内外水相梯度差的囊泡/脂质体的方法及相应装置。该方法使用膜分离技术，通过透析/超滤的方法使囊泡/脂质体水化介质中的阳离子、阴离子、阴阳离子和/或荷电大分子物质跨过膜分离装置中的膜进入到透析介质中，再通过离子交换的方法选择性地交换或清除进入透析介质中的阳离子、阴离子、阴阳离子和/或荷电大分子物质，因此能够选择性地快速降低透析介质中欲除去的阳离子、阴离子、阴阳离子和/或荷电大分子物质的浓度并维持这种低浓度，从而能使囊泡/脂质体在较短时间内建立可控的内外水相梯度差。

专利（一种具内外水相梯度差的囊泡及其制备方法和应用，申请号200910013063.X）公开了一种使用离子交换法制备具有内外水相梯度差的囊泡或脂质体的方法，其方法具有梯度建立快，可以对囊泡/脂质体外水相的离子进行选择性的调节以及成本较低的优点。但采用此方法建立梯度时，脂质体或囊泡与离子交换剂直接接触，离子交换剂对脂质体特别是非PEG化脂质体可能会产生一定程度的吸附和破坏，导致回收率下降以及梯度的流失；若要提高回收率则需要一个洗脱的过程，会对囊泡或脂质体体系产生稀释；再者，离子交换剂可能会对荷电脂质体产生死吸附，使得此方法的应用受到一定限制。

本发明使用透析介质作为一种传输介质，将脂质体/囊泡外水相中的阳离子、阴离子、阴阳离子和/或荷电大分子物质递送到离子交换装置，避免了囊泡/脂质体与离子交换剂（如离子交换树脂）的直接接触，减少了离子交换剂对脂质体可能的吸附和破坏，可用于荷电脂质体的梯度建立。由于透析介质的传输作用，还使得离子交换剂的选择范围得以大大扩展，可以选择吸附作用较强的大孔型离子交换树脂和交换速度更快的离子交换纤维，甚至使用电渗析装置（EDI）对透析介质中的阳离子、阴离子、阴阳离子和/或荷电大分子物质进行交换或吸附，而不会导致囊泡或脂质体的梯度流失及回收率的下降。使用本发明所述的方法建立梯度时，脂质体几乎没有损失。

专利（脂质体悬浮液制造方法及含该法所制脂质体悬浮液的产物，申请号03178458.5）使用中空纤维膜组件对脂质体混悬液进行透析以建立脂质体内外水相梯度，其所用透析介质仅为脂质体混悬液体积的10倍，难以建立完全的内外水相梯度差。常规的透析法建立脂质体内外水相梯度时依靠的是离子的被动扩散，扩散的动力在于透析膜两侧离子的浓度差，为了维持此浓度差以便在较短时间内完成透析，需要非常频繁地跟换透析介质或使用非常大量的透析介质。尽管如此，透析仍然耗时较长，在此过程中脂质体的梯度可能流失。发明者意外的发现，使用本专利所述方法和装置对100 mL脂质体建立硫酸铵梯度时，仅需1 h的时间即可将外水相99.9 %以上的硫酸铵除尽，载药后包封率可以达到100 %。

另外，发明人发现更为重要的一点，即现有的梯度建立方法，如透析、超滤、葡聚糖凝胶柱色谱等方法均不能选择性的控制囊泡或外水相的离子的种类和浓度。本发明所述方法是指采用适宜的离子交换剂去除囊泡外水相中的阴离子、阳离子、荷电大分子物质，或者阴阳离子同时除去，而内水相中的阴阳离子、大分子物质未被除去或者除去很少，从而建立囊泡膜内外梯度。除去囊泡外水相中离子的方法包括单独使用阴离子或阳离子交换剂或者混合使用阴阳离子交换剂，在单独使用阳离子或者阴离子交换剂时，可以有目的除去相应的阳离子或者阴离子，如果合理选择/搭配离子交换剂与离子的作用力大小，亦可实现建立有目的除去某一离子或者两种离子或者两种以上离子的目的。本发明可以单独除去某类离子，甚至从几种离子中选择性地除去某种离子，例如，可以利用氢型阳离子交换树脂的交换能力顺序，强酸性：Fe³⁺＞Fe ²⁺＞Mn²⁺＞Ca²⁺＞Mg²⁺＞K⁺＞NH₄ ⁺＞Na⁺＞H⁺ ；弱酸性：H⁺＞Fe³⁺＞Fe²⁺＞Mn²⁺＞Ca²⁺＞Mg²⁺＞K⁺＞NH₄ ⁺＞Na⁺ ，来有目的地除去水化介质中多种离子中的某一或者某多种离子，留下无需除去的离子。在采用混合离子交换剂时，阳、阴离子交换反应几乎同时进行，即阳离子交换和阴离子交换多次交错进行，交换过程所产生的H⁺/Na⁺和OH^-/Cl^-都不能积累起来，基本上消除了反离子对交换反应的影响，避免了逆反应，使交换反应进行得很彻底，于是可以保证制剂pH值保持稳定。

更为让人惊喜的是，本方法适用于膜材料浓度大于10%（g/g或g/mL）的高浓度囊泡的内外水相梯度差的建立，这是目前其他主动载药技术/方法均不能实现的。使用本发明所述方法建立囊泡内外水相梯度的过程中，可以通过对膜两侧所流动液体（一侧为囊泡混悬液，另一侧为透析介质）的压力和/或流量的调节而对囊泡混悬液进行可控的浓缩和稀释，这样可以简单快速的制备膜材料浓度较高的囊泡。

本方法也可以利用大分子的渗透压特性，制造囊泡内外水相的大渗透压差，获得囊泡内部渗透压远大于外水相的渗透压，从而提高内水相体积、提高包封率、缩短包封时间，并可以增加被包封药物泄漏的阻力，大大延长囊泡的药物滞留稳定性！

本发明所述方法，所需透析介质的体积仅为空白囊泡的1-150倍时即可在短时间内完成梯度的建立，相比于常规透析（透析介质体积为空白脂质体的1000倍或更多）非常显著的降低了透析介质用量，有利于紧凑型设备的开发并降低成本。

最为关键的是：本发明所述的制备具有内外水相梯度差囊泡的方法是对膜分离机理和离子交换与吸附机理的巧妙组合，当所需建立梯度的囊泡的特性、离子梯度种类、制备规模不同时，可以选择不同性能的膜分离装置和离子交换装置进行组合。即在本发明所述的制备具有内外水相梯度差囊泡的装置中，其膜分离装置和离子交换装置可以通过模块化设计而根据实际需求选择不同的型号、数量和连接方式，既可以用于实验室研究，也很容易实现工业化大生产。

为了实现上述目的，本发明使用的技术方案是：一种制备具有内外水相梯度差囊泡的方法，其特征在于：通过膜分离方法将囊泡混悬液水化介质中的阳离子、阴离子、阴阳离子和/或荷电大分子物质分配到透析介质中；使用离子交换方法选择性地交换或清除进入透析介质中的阳离子、阴离子、阴阳离子和/或荷电大分子物质，从而使囊泡在较短时间内建立较大的内外水相梯度差。

所述膜分离方法通过膜分离装置实现，膜分离装置采用切向流（错流）过滤或透析的方式；所选用膜的孔径为所需建立梯度的囊泡的粒径的0.01-1.00倍；膜两侧压力差为0-0.70 Mpa；膜两侧透析介质与囊泡混悬液的流量比为1-100：1；膜分离装置的工作温度设定为0-60 ℃间的任意温度，或在0-60 ℃中的某个温度区间内变化。膜分离装置的工作温度优选为20-40℃间的任意温度，或在0-40 ℃中的某个温度区间内变化。

所述透析介质包括但不限于：水、木糖醇水溶液、蔗糖水溶液、海藻糖水溶液、乳糖水溶液、甘露醇水溶液、葡萄糖水溶液、氯化钠水溶液或蛋白质水溶液，透析介质的体积是囊泡混悬液体积的1-200倍。

所述水化介质中的阳离子包括Ca²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、NH₄ ⁺、K⁺、Fe²⁺、C₂H₄(NH₃ ⁺)₂、(CH₃CH₂)₃NH⁺、HOC₂H₄NH₃ ⁺、(HOC₂H₄)₃NH⁺、(HOCH₂)₆CH₃NH₂ ⁺或三羟甲基氨基甲烷；水化介质中的阴离子包括SO₄ ^2-、PO₄ ^3-、HPO₄ ^2-、H₂PO₄ ^-、Cl^-、枸橼酸根、醋酸根、EDTA^4-、六偏磷酸根、三聚磷酸根、焦磷酸根、甘油磷酸根、果糖二磷酸根、三磷酸腺苷根、植酸根、邻苯二甲酸根、间苯二甲酸根、对苯二甲酸根、苯甲酸根、间苯二甲酸根、间苯三甲酸根、乳糖酸根、二巯基丁二酸根、二乙三胺五乙酸根、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸根或氨基三乙酸根；水化介质中的荷电大分子物质包括蛋白质、肽类、酶类，以及这些物质或其他大分子物质的硫酸酯、磺酸酯或磷酸酯衍生物，如磷酸化蛋白质，肝素、右旋糖酐硫酸酯、壳聚糖及其衍生物、明胶及其衍生物、琥珀酰明胶及其衍生物、多糖硫酸酯、低聚岩藻聚糖硫酸酯、木聚糖硫酸酯、海藻酸及其衍生物、透明质酸及其衍生物。

所述离子交换装置具有的离子交换容量为完全交换水化介质中阳离子、阴离子、阴阳离子和/或荷电大分子物质所需交换容量的1-200倍，并且离子交换装置的交换容量可以通过再生而恢复。

所述的离子交换装置的工作温度可以设定在0-80 ℃间的任意温度，或在0-80 ℃中的某个温度区间内变化。

实现上述技术方案所使用的制备具有内外水相梯度差囊泡的装置，其特点是，该装置包括：

一膜分离装置（1），膜分离装置（1）内部由膜分隔为两个空间，一个空间流通透析介质，另一个空间流通囊泡混悬液，囊泡混悬液可进入或循环通过此腔室，囊泡水化介质中的阳离子、阴离子、阴阳离子和/或荷电大分子物质可以通过膜进入透析介质中，而囊泡却不能或几乎不能通过膜进入透析介质。

一离子交换装置（2），透析介质可进入或循环通过离子交换装置（2），离子交换装置（2）可以选择性地交换或吸附透析介质中的阳离子、阴离子、阴阳离子和/或荷电大分子物质。

所用的膜分离装置（1）选自：透析袋、中空纤维膜组件、切向流过滤组件、膜超滤柱组件，以及它们的组合，或其他符合本发明原理可用的膜组件及它们的组合。优选中空纤维膜组件和切向流（错流）过滤组件。

所用的膜分离装置（1）中膜的材质为：聚醚砜（PES）、三醋酸纤维素（CTA）、聚四氟乙烯（PTFE）、聚砜（PS）。其他可以选择的膜的材质为：二醋酸纤维素（CA）、硝酸纤维素(CN)、二醋酸纤维素/硝酸纤维素共混物、纤维素、聚丙烯腈（PAN）、聚酰胺（芳香类和脂肪类）、聚碳酸酯（PC）、聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）、聚酰亚胺（PI）、聚乙烯（PE）、聚丙烯（PP）、聚偏氟乙烯（PVDF）、聚氯乙烯（PVC）、聚砜酰胺、氧化铝、二氧化锆、二氧化钛、二氧化硅、陶瓷、碳化硅、不锈钢、高分子金属络和物、分子筛复合物、沸石、玻璃，优选聚醚砜（PES）、聚砜（PS）、三醋酸纤维素（CTA）和聚碳酸酯（PC）。

离子交换装置（2）选自：电渗析装置（EDI）、微孔离子交换膜、装填有离子交换剂的离子交换层析柱、装填有离子交换剂的离子交换槽、装填有离子交换剂的离子交换流化床，以及它们的组合。优选装填有离子交换剂的离子交换层析柱和装填有离子交换剂的离子交换槽。

离子交换装置中的离子交换剂包括固体离子交换剂、液体离子交换剂、离子交换膜、离子交换纤维；阳离子交换树脂、阴离子交换树脂、两性离子交换树脂、螯合型和氧化还原型离子交换树脂、特种树脂；无机离子交换剂、有机离子交换剂。以及它们的组合。

膜分离装置（1）和离子交换装置（2）的工作温度可以通过恒温装置调节。

所述离子交换膜包括阳离子交换膜、阴离子交换膜、两性交换膜、镶嵌离子交换膜、聚电解质复合膜；均相膜和非均相膜。离子交换纤维包括：聚丙烯( 丙纶) 离子交换纤维、聚丙烯腈( 腈纶) 离子交换纤维、聚乙烯醇离子交换纤维。离子交换剂包括以DEAE-纤维素(二乙基氨基纤维素)和CM-纤维素 (羧甲基纤维素)为代表的纤维素、球状纤维素、葡聚糖、琼脂糖为基质的离子交换剂。

所述离子交换剂为特种树脂时，其选自下列物质：WA—2氨基酸专用树脂、催化剂树脂、WDX— 3果汁脱色专用树脂、WD—6脱色树脂、WL—XF核用树脂、WTT脱铁树脂、 IND90变色树脂、D208脱色专用树脂、D209饮用水除硝酸根树脂、D309脱色专用树脂或XDA-7均孔脱色树脂。

所述离子交换剂为阳离子交换树脂时，其选自下列物质中至少一种：001强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂、111弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂、112弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂、122弱酸性酚醛系阳离子交换树脂、D001大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂、D111大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂、D390盐酸除铁专用树脂、D401大孔苯乙烯系螯合型离子交换树脂、CAT600大孔苯乙烯系强酸催化树脂大孔强酸氢型阳离子交换树脂、CAT601大孔强酸催化树脂苯乙烯系大孔强酸氢型阳离子交换树脂、C005催化专用树脂苯乙烯系凝胶强酸阳离子交换树脂、D002-II型耐高温树脂、C004生物碱提取专用树脂苯乙烯系凝胶强酸阳离子交换树脂、C008生物碱提取专用树脂苯乙烯系大孔强酸阳离子交换树脂、B108氨基酸提取专用树脂苯乙烯系大孔强酸阳离子交换树脂、C610硫脲树脂、C620巯基树脂、C700硼选择性树脂、C800氨基羧酸树脂或C900氨基膦酸树脂。

所述离子交换剂为阴离子交换树脂时，其选自下列物质中至少一种：201强碱性季胺Ⅰ型阴离子交换树脂、301弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂、303弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂、331弱碱性环氧系阴离子交换树脂、401螯合性胺羧基离子交换树脂、D201大孔强碱性季胺Ⅰ型阴离子交换树脂、D202大孔强碱性季胺Ⅱ型阴离子交换树脂、D301大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂、D302大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂、D311大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂、D206耐高温阴离子交换树脂、D215大孔丙烯酸系强碱阴离子交换树脂、D363大孔弱碱阴离子交换树脂或D204 大孔苯乙烯系强碱性阴离子交换树脂。

所述离子交换剂为阳离子交换纤维时，其选自下列物质中至少一种：ZB-1强酸性阳离子交换纤维、ZB-5弱酸性阳离子交换纤维。

所述离子交换剂为阴离子交换纤维时，其选自下列物质中至少一种：ZB-2强碱性阴离子交换纤维、ZB-6若碱性阴离子交换纤维，。

实际应用中，凡是符合离子交换、吸附原理的离子交换剂都可以应用在本发明中。具体地，本领域的技术人员可根据实际需要选择采用上述阳离子交换树脂的钠型或氢型，阴离子交换剂的氯型或氢氧型形式。

制备空白囊泡的膜材包括适宜的表面活性剂、大分子物质，如各种磷脂及其衍生物，还可选甾醇类及其衍生物，以及其它必要膜材。

其中表面活性剂包括HLB8~20的表面活性剂，如磷脂可选自下列的至少一种：天然磷脂、半合成磷脂、合成磷脂，如大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、磷脂酰甘油、EPG、磷脂酸、心肌磷脂、鞘磷脂、磷脂酸丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、氢化大豆卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二癸酰磷脂酰胆碱、二辛酰磷脂酰胆碱、二己酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油及其盐，二棕榈酰磷脂酰甘油及其盐，L-α-二肉豆蔻酰磷脂酰甘油及其盐，二月桂酰磷脂酰甘油、二癸酰磷脂酰甘油、二辛酰磷脂酰甘油、二己酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺，二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二月桂酰磷脂酰乙醇胺、双二硬脂酰磷脂酰甘油及其盐、双二棕榈酰磷脂酰甘油及其盐、双二肉豆蔻酰磷脂酰甘油及其盐、双二月桂酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰肌醇、二棕榈酰磷脂酰肌醇、二油酰磷脂酰肌醇、二肉豆蔻酰磷脂酰肌醇、二月桂酰磷脂酰肌醇、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、棕榈酰亚油酰磷脂酰胆碱、硬脂酰亚油酰磷脂酰胆碱、硬脂酰油酰磷脂酰胆碱、硬脂酰花生四烯酰磷脂酰胆碱或各种磷脂PEG衍生物，如DSPE-PEG、DPPE-PEG、DMPE-PEG、DLPE-PEG，其中PEG的分子量为100～100000。

上述PEG衍生物包括但不限于各种磷脂PEG衍生物，如DSPE-PEG、DPPE-PEG、DMPE-PEG、DLPE-PEG，其中PEG的分子量为100～100000；也包括其他各种PEG脂质衍生物，如PEG甾醇类衍生物、PEG脂肪酸衍生物、PEG脂肪醇类衍生物，具体讲如胆固醇半琥珀酸酯PEG衍生物、Solulan C-24(PEG-24 cholesterol ether)、吐温类、Brij（苄泽）、维生素类的PEG衍生物（如TPGS）、PEG脂肪酸酯衍生物（卖泽），聚甘油脂质衍生物，如聚甘油磷脂衍生物、聚甘油单（双）油酸酯、硬脂酸酯等；聚丙二醇脂质衍生物；聚氨基酸脂质衍生物；甾醇类衍生物；蔗糖脂质衍生物；氧乙烯-氧丙烯共聚物（HO(C₂ H₄ O)_a (C₃ H₆ O)_b (C₂ H₄ O)_a H），如F68；聚乙二醇-二酸甘油脂(或者单酯)等等。

本发明方法提供的囊泡适用于所有可采用离子梯度法进行包封的药物。

如蒽环类抗肿瘤抗生素，包括盐酸阿霉素、盐酸表阿霉素和吡柔比星；长春花属生物碱，包括长春瑞滨、长春新碱、长春花碱和长春地辛；喹诺酮类抗生素，如环丙沙星、氟哌酸、氧氟沙星、依诺沙星、甲氟沙星、恩诺沙星、洛美沙星、氟罗沙星、加替沙星、司帕沙星、莫西沙星、克林沙星和吉米沙星等。如各种氨基酸、罗丹明 B或其类似物、依沙吖啶(利凡诺) 或其类似物、吖啶橙（碱性橙 14、3,6-双(二甲基氨基)吖啶氯化锌盐酸盐）或其类似物；5-羟色胺受体拮抗剂，包括昂丹司琼、托烷司琼、格拉司琼、帕洛诺司琼、雷莫司琼等。

如局部麻醉药包括盐酸阿替卡因、普鲁卡因（procaine）、可卡因（cocaine）、利多卡因（lidocaine）、麻卡因（marcaine）、卡波卡因（carbocaine）、丙胺卡因（prilocaine）等；大环内酯类药物，如阿奇霉素及其盐。

如噻吗洛尔及其盐、美托洛尔及其盐、比索洛尔及其盐、普萘洛尔及其盐、索他洛尔及其盐、伏立康唑及其盐等。 

如荷电大分子物质，RNA干扰，即核苷酸、DNA脱氧核糖核酸、siRNA、蛋白质、酶、荷电多糖、甲壳胺、阿拉伯胶、海藻酸、羧甲基纤维素、琥珀明胶；荷电大分子聚合物，如树枝状物质中的PAMAM。

其它药物：如曲马多及其盐、芬太尼及其盐、舒芬太尼及其盐、氨溴索及其盐、氯诺昔康及其盐、甲磺酸二氢麦角碱、盐酸川丁特罗（特罗类）、多巴酚丁胺、盐酸洛哌丁胺、阿替洛尔酒石酸美托洛尔、氯苯丁胺、麦角胺、PEI（聚乙胺）、表皮生长因子（FGF）、蜂毒肽等。

如生物碱，包括植物、海洋生物、微生物、真菌及昆虫来源。这类物质常常可以采用梯度载药技术提高包封率。 

生物碱一般按化合物结构类型或生物合成途径进行分类。 一些常见的生物碱结构类型如下：

1、异喹啉类生物碱

 异喹啉类生物碱是生物碱中最大的一类，以异喹啉或四氢异喹啉为母核，根据连接基团的不同，又可分为九类：（1）单异喹啉类生物碱，如鹿尾草中的降血压成分鹿尾草碱；

（2）苄基异喹啉类生物碱，异喹啉核的1位接有苄基，如阿片中的解痉成分罂粟碱；

（3）双苄基异喹啉类生物碱，两个苄基异喹啉在酚羟基位置以醚键方式相连，如莲子芯中的莲心碱；

（4）阿扑芬类生物碱，苄基异喹啉类生物碱的两个苯环相连组成的四环化合物，如千金藤碱；

（5）原小蘖碱类生物碱，为两个异喹啉的稠合，如黄连中所含的抗菌成分黄连素；

（6）普鲁托品类生物碱，含羰基的小蘖碱开环化合物，如延胡索中的普鲁托品；

（7）吐根碱类生物碱，异喹啉环带苯骈喹啉啶环，如吐根中治疗阿米巴痢疾的有效成分吐根碱；

（8）α-萘菲啶类生物碱，如搏落回中的血根碱；

（9）吗啡类生物碱。

2、喹啉类生物碱

 喹啉类生物碱的母核是喹啉环，其中最重要的一类是金鸡纳生物碱。

3、吡咯烷类生物碱

（1）简单的吡咯烷生物碱，如古柯叶中分离出的液体生物碱古豆碱、新疆党参中的党参碱；

（2）双稠吡咯烷类生物碱，由叔氮稠合两个吡咯烷而成，如阔叶千里光中分得的阔叶千里光碱；

（3）吲哚里西定类生物碱，以叔氮稠合吡咯烷与哌啶环而组成的吲哚里西定环，如白牵牛碱；

（4）莨菪烷类生物碱，由吡咯烷与哌啶骈合而成的杂环，常见的是与有机酸成酯的阿托品类生物碱；

（5）百部生物碱，百部根中分离得到的生物碱大多含有吡咯环，因此也纳入吡咯烷类生物碱。

4、吲哚生物碱

以吲哚环为母核的生物碱，如治疗白血病的高效药物长春新碱等。

相对明确的生物碱包括“马钱子碱”、“麦角胺和麦角毒”、“左金总生物碱”、“雷公藤总生物碱”、“草乌甲素及其类似生物碱”、“含双喹诺里西啶结构生物碱”、“八氢吲嗪二醇生物碱卤化物盐”、“吡啶并吖啶类生物碱”、“双苄基异喹啉类生物碱及其盐”、“咔唑生物碱类”、“异喹啉生物碱”、“伊贝总生物碱”、“海绵分离的细胞毒性生物碱衍生物”、“咔唑类生物碱衍生物及其”、“石蒜属植物中提取活性生物碱的方法”、“苯并[C]菲啶和原托品类生物碱”、“吴茱萸生物碱”、“马齿苋酰胺类生物碱”、“金不换总生物碱”、“异喹啉生物碱”、“夏天无总生物碱”、“辛可宁类生物碱配体”、“钩吻总生物碱”、“喹诺里西啶类生物碱”、“蚕沙总生物碱”、”吡咯杂环生物碱aldisin的溴代衍生物”、“雪上一枝蒿总生物碱”、“季胺白屈菜生物碱硫代磷酸衍生物”、“乌药生物碱”、“黄杨宁”、“环维黄杨星D”、“黄杨生物碱”、“粉防己生物碱”、“双苄基异喹啉类生物碱”、“紫金龙总生物碱”、“罂粟壳生物碱”、“小檗碱型生物碱”、“两面针总生物碱”、“赫替新型二萜生物碱”、“百部生物碱”、“荷叶总生物碱”、“麦角生物碱”、“胡椒碱”、“槟榔碱”、“槟榔碱次”、“利血平”、“青藤碱”、“马钱子碱”、“骆驼蓬总碱及其单体与衍生物”、“去氢骆驼蓬碱衍生物类化合物”、“贝母素乙素”、“贝母素甲素”、“延胡索乙素”、“海洋生物碱类物质”。

多粘菌素B、E、盐酸鱼精蛋白、血红蛋白、各种细胞因子，如白细胞介素、干扰素、表皮生长因子、神经生长因子、胸腺五肽、促红细胞生成素、糖尿病治疗药物，如瑞格列奈、磷酸西他列汀、那格列奈、二甲双胍、唾液酸、溶菌酶（等电点碱性）、鱼精蛋白、玻璃酸、蜂毒素、蜂毒肽（Melittin）、各种膦酸类药物（衍生物）及其盐类，如噻唑磷、替鲁膦酸 、氯屈膦酸二钠、磷霉素氨基丁三醇、乙二胺四甲叉膦酸、依替膦酸钠;、二亚乙基三胺五亚甲基膦酸七钠盐、2-膦酸基丁烷-1,2,4-三羧酸四钠、氨基三亚甲基膦酸、帕米膦酸钠、(3-氨基苯基)膦酸、己二胺四亚甲基膦酸钾盐、苯膦酸钠、阿仑膦酸及其盐类、甲基膦酸 (5-乙基-2-甲基-2-氧代-1,3,2-二氧磷杂环己-5-基)甲基甲基酯、帕米膦酸、2-膦酸丁烷-1,2,4-三羧酸钠盐、己二胺四甲叉膦酸六钾盐、2-膦酸丁烷-1,2,4-三羧酸、羟基亚乙基二膦酸四钠、二己烯三胺五甲叉膦酸、利塞膦酸、氨甲基膦酸、伊班膦酸、利赛膦酸钠、唑来膦酸、帕米膦酸钠、西多福韦; (1-(4-氨基-2-氧代嘧啶-1-基)-3-羟基丙烷-2-基)氧甲基膦酸、(R)-((1-(((甲基磺酰)氧)甲基)-2-苄氧基乙氧基)甲基)膦酸二乙酯、替鲁膦酸二钠、乙烯基膦酸、(3-((羟甲基)氨基)-3-羰基丙基)-膦酸二甲酯、2-氨基乙基膦酸、氨基三甲叉膦酸钠、福沙吡坦; (3-(((2R,3S)-2-((1R)-1-(3,5-双(三氟甲基)苯基)乙氧基)-3-(4-氟苯基)-4-吗啉基)甲基)-2,5-二氢-5-氧代-1H-1,2,4-三唑-1-基)膦酸。

综合之，即本发明适合于各种单、双、多阴离子衍生物，如磷酸、硫酸（如SOS）、磺酸、羧酸衍生物，分子中含有其中一种，或者任意两种或者两种以上基团；也适合于各种单、双、多阳离子衍生物，分子中含有其中一种，或者任意两种或者两种以上基团；两性离子化合物。

上述药物并不成为限制本发明的条件，正如本领域的任何技术人员所知，可采用某种离子梯度法进行包封的药物都在本发明保护范围内。

其中上述离子梯度法包括但不限于pH梯度法、铵梯度法、醋酸钙梯度法和细胞离子载体离子梯度法，所述的细胞离子载体包括：尼日利亚菌素、二价阳离子质子交换剂A23187、离子霉素和拉沙里菌素。所述离子梯度法原理为：通过建立脂质体内外水相质子浓度差，或建立某种离子梯度差，促使弱酸性或弱碱性药物跨膜至内水相，进而滞留其中，维持高包封率。正如本领域任何技术人员所知的，凡是符合上述原理的离子梯度方法都可采用本发明的方法除去外水相的缓冲盐建立离子梯度。

本发明还提供上述具内外水相梯度差的囊泡在制备脂质体凝胶上的应用。

本发明还提供上述具内外水相梯度差的囊泡在制备磁性脂质体上的应用。

本发明还提供上述具内外水相梯度差的囊泡在制备纳米粒/纳米凝胶上的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1.      可在短时间内建立脂质体内外水相梯度差，避免常规梯度建立技术/方法因操作时间长而导致的梯度差流失，实现更高的包封。

2.      使用本方法建立内外水相梯度差时囊泡/脂质体回收率高，可以达到100 %。

3.      适合于膜材浓度较高的囊泡的内外水相梯度的建立。

4.      可在建立梯度的过程中对囊泡进行精确的浓缩或稀释，通过调节囊泡内外水相渗透压梯度，促进水进入囊泡内水相，扩大内水相体积，提高包封率和载药量。

5.      由于外水相的物质可以很快被除去，甚至可以定量地被除去，因此无需担忧调节过头，从而可以通过外加法来随意调整为所需pH，如pH8、pH9等，增大跨膜内外梯度，提高包封率。

6.      本发明中所用的膜分离技术（透析、超滤等）和离子交换技术均比较成熟，商业化生产的膜组件和膜种类丰富，离子交换剂质量稳定、价格便宜、易于获得且可以再生利用（如果在交换容量以下，可以反复多次使用，无需再生）。

7.      本发明中所述的膜分离装置和离子交换与吸附装置采用模块化设计，可以根据制备对象和规模选择不同的组件进行组合，从而满足从实验室研究到工业化大生产的需求。

附图说明

图1是本发明的原理图

图2是本专利的第一个实施例的流程图

图1及图2中：1.膜分离装置，2.离子交换装置，3. 透析介质储存罐，4. 囊泡混悬液储存罐，5. 囊泡混悬液泵，6. 透析介质泵，7. 囊泡混悬液压力控制阀，8. 透析介质压力控制阀，9. 囊泡混悬液压力表，10. 囊泡混悬液流量计，11. 透析介质压力表，12. 透析介质流量计，13.梯度囊泡存储罐，14.阀门。

具体实施方式：

为了更清楚的理解本发明，以下结合发明人给出的依本发明的技术方案所完成的实施例对本发明做进一步的详细说明。本发明并不局限于这些实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

本发明所述的制备具有内外水相梯度的囊泡的方法，以下称为滤过离子交换法。

所用各成分的简称如下：

HSPC:氢化大豆磷脂酰胆碱

CH:胆固醇

PEG-CHS: 聚乙二醇胆固醇琥珀酸酯

EPC:蛋磷脂酰胆碱

SPC:大豆卵磷脂

DPPC:二棕榈酰磷脂酰胆碱

PEG2000-CHEMS:聚乙二醇2000-胆固醇半琥珀酸酯

DOPE:二油酰磷脂酰乙醇胺

HEPC:氢化蛋磷脂酰胆碱

PS:磷脂酰丝氨酸

DSPC: 二硬脂酰基卵磷脂

F68:嵌段式聚醚F68

DLPC: 二月桂酰基卵磷脂

TPGS: 聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯

Span 60: 山梨糖醇酐单硬脂酸酯

NH₄SGP: 甘油磷酸铵

NH₄ATP: 三磷酸腺苷铵盐

NH₄P₂ : 二聚磷酸铵

NH₄P₆: 六聚磷酸铵

实施例1 分别使用透析法和滤过离子交换法对脂质体建立硫酸铵梯度并载药

处方  HSPC        4.5g

CH          1.5g

PEG-CHS     1.5g

水化介质： 200 mmol硫酸铵溶液150 mL。

制备空白脂质体：称取处方量的HSPC 、CH、PEG-CHS（PEG分子量为2000），55 ℃，用12 mL乙醇溶解膜材，得脂质相；将预热至55℃的水化介质注入脂质相，孵育10 min，制得脂质体初品，再经20000 psi高压均质处理，降低脂质体粒径至100 nm，依次通过0.8、0.45、0.22 μm的微孔滤膜，即得空白脂质体。

透析法建立梯度：取1.0 mL空白脂质体，以250 mL 5%（w/v）木糖醇溶液为透析介质（1:250，v/v），磁力搅拌以达平衡。每2 h更换一次透析介质，共更换4次。

滤过离子交换法建立梯度：附图2给出根据本发明的一种实施方式：膜分离装置（1）在本实施例中为带有水浴控温装置的中空纤维膜组件（聚醚砜，截留分子量100K Da，膜面积1.5 m²）；离子交换装置（2）在本实施例中为带有恒温装置的层析柱；层析柱内的离子交换剂为的S 100型阳离子交换树脂和M 800型阴离子交换树脂的混合物（v/v=1/1，视湿体积），所用混合离子交换树脂的交换容量为理论所需交换容量的12倍；透析介质为5 %（w/v）木糖醇溶液，透析介质与空白脂质体的体积比为10:1；所用囊泡混悬液泵（5）和透析介质泵（6）为医用蠕动泵。

步骤：

a)            取100 mL空白脂质体混悬液加入到囊泡混悬液储存罐（4）中，将透析介质加入到透析介质储存罐（3）；

b)            开动囊泡混悬液泵（5）和透析介质泵（6）；脂质体混悬液经过中空纤维柱（1）后进入梯度囊泡存储罐（13），当囊泡混悬液储存罐（4）中的脂质体混悬液全部进入到梯度囊泡存储罐（13）中时，可以打开阀门（14）将脂质体混悬液从梯度囊泡存储罐（13）转移至囊泡混悬液储存罐（4），以使脂质体反复经过膜分离装置（1）以建立梯度；

c)            使用囊泡混悬液流量计（10）和透析介质流量计（11）对脂质体混悬液和透析介质的流量进行监控；通过对囊泡混悬液泵（5）和透析介质泵（6）的流速及囊泡混悬液压力控制阀（7）和透析介质压力控制阀（8）的开放大小进行调节，使脂质体混悬液和透析介质的流量比为1 :2；使用囊泡混悬液压力表（9）和透析介质压力表（10）对中空纤维膜组件（1）的中空纤维两侧的压力进行监测；中空纤维膜组件（1）脂质体流动侧压力比透析介质流动侧压力大0.1 MPa；

d)            设定中空纤维膜组件（1）的温度为30 ℃，设定离子交换层析柱（2）的温度为45 ℃，透析时间1 h。

透析结束后脂质体混悬液体积减少，用5 %（w/v）木糖醇溶液定容至100 mL。

主动载药：将通过透析法和滤过离子交换法得到的梯度脂质体直接载药，表阿霉素与HSPC的重量比为1：10。试验结果见表1

表1   不同方法建立梯度比较

梯度建立方法	透析法	滤过离子交换法
			脂质体量（mL）	1	100
建立梯度时间（h）	8	1
			透析介质用量（mL）	1000	1000
载药包封率	88.1%	99.7%

由结果可知，滤过离子交换法建立梯度的速度明显快于透析法，如果以制备100 mL梯度脂质体为例，前者所用透析介质的量仅为后者的1 %，且使用滤过离子交换法所制备的梯度脂质体包封率明显高于使用透析法所制备的梯度脂质体。

使用本实施例中滤过离子交换法制备的梯度脂质体转载阿霉素、米托蒽醌、伊利替康（药物与HSPC重量比为1：10）时包封率均达到95%以上。

在所得的梯度脂质体混悬液中直接加入阿霉素粉末进行孵育（药物与HSPC重量比为1：10），所得脂质体包封率大于96%。

实施例2

取“实施例1”空白脂质体50 mL，以ZB-1型阳离子交换纤维和ZB-2型阴离子交换纤维的混合物（v/v=1/1，视湿体积）为混合离子交换剂，所用混合离子交换纤维的交换容量为理论所需交换容量的3倍；透析介质为等渗蔗糖溶液，透析介质与空白脂质体的体积比为15:1；建立梯度装置及操作步骤同“实施例1”。所得梯度脂质体装载表阿霉素、阿霉素和米托蒽醌（药物与HSPC重量比为1：10），包封率均高于95%。

实施例3 

处方 EPC        3 g

CH         1 g 

水化介质为250 mmol/L的硫酸铵溶液60 mL。

脂质体制备方法、梯度建立装置及梯度建立步骤与“实施例1”相同，透析介质为9%（w/v）蔗糖溶液，离子交换剂为732阳离子交换树脂与717阴离子交换树脂，其混合比例为湿视体积1：1 v/v，主动装载石杉碱甲，包封率大于90 %。所得制剂可以鼻腔给药实现脑靶向，提高疗效，减少对外周胆碱能装置的毒附作用。

实施例4使用滤过离子交换法建立不同梯度脂质体

处方1   SPC         3 g

CH          1 g

PEG-CHS    1 g

水化介质： 分别使用200 mmol 的NH₄SGP（甘油磷酸铵、磷酸根）、NH₄ATP（三磷酸腺苷铵盐、含有氮原子的阴离子化合物）、NH₄P₂（二聚磷酸铵、磷酸根）及NH₄P₆（六聚磷酸铵、磷酸根）溶液各100 mL。

脂质体制备方法、梯度建立方法与“实施例1”相同，得到的4种梯度脂质体与阿霉素溶液（药脂比，1:10，w/w）混匀，于60 ℃孵育20 min，得到不同水化介质制备的阿霉素脂质体。试验结果见表2。

表2  不同水化介质脂质体包封率

水化介质	NH4SGP	NH4ATP	NH4P2	NH4P6
					包封率	92%	99%	96%	94%

实施例5 采用不同方法对PEG化脂质体建立梯度的回收率及包封率比较

处方  DPPC        3g

CH          1g

PEG-DSPE    1g

水化介质： 200 mmol硫酸铵溶液100 mL。

制备空白脂质体：称取处方量的DPPC 、CH、PEG-DSPE（PEG分子量为2000）55 ℃下用10 mL乙醇溶解膜材，得脂质相；将预热至55℃的水化介质注入脂质相，孵育15 min，制得脂质体初品，再经20000 psi高压均质处理，降低脂质体粒径至110 nm，依次通过0.8、0.45、0.22 μm的微孔滤膜，即得空白脂质体。

建立梯度脂质体，分别采用透析法、超滤法、葡聚糖凝胶过滤法和滤过离子交换法。使用透析法时透析介质为10%（w/v）甘露醇水溶液，其体积为脂质体混悬液体积的250倍，2 h换液一次，共透析8 h。葡聚糖凝胶法采用Sephadex G-50除去外水相硫酸铵。离子交换法采用混合离子交换树脂制备离子交换树脂柱，处理空白脂质体。滤过离子交换法所用透析介质为10 %（w/v）甘露醇水溶液，其体积为脂质体混悬液体积的15倍，所用离子交换剂为混合离子交换树脂（201强碱性阴离子交换树脂和001强酸性阳离子交换树脂，用量为水化介质中阴阳离子所需交换容量的5倍，201强碱性阴离子交换树脂:001强酸性阳离子交换树脂=2:1，湿视体积比），滤过离子交换法所用装置及操作条件与“实施例1”的相同。

主动载药：得到的梯度脂质体60 ℃直接载药。表阿霉素与DPPC的重量比为1：5，不同梯度建立方法脂质体回收率及载药包封率见表3。

表3  不同梯度建立方法脂质体回收率及载药包封率

建立梯度方法	透析法	超滤法	葡聚糖凝胶法	离子交换树脂柱法	滤过离子交换法
						包封率	83%	82%	88%	95%	100%
回收率	95%	90%	82%	68%	98%

使用超滤法建立梯度时机械搅拌可能对脂质体造成一定的损伤而导致梯度的流失，从而包封率不高，而部分脂质体黏附在滤膜和超滤装置内部导致脂质体回收率下降。

使用离子交换树脂法时树脂颗粒对脂质体有一定的截留和吸附作用，导致脂质体回收率仅有78 %，若要提高回收率，可进行多次洗脱，但是梯度脂质体会因此被稀释。

透析法用对2 mL脂质体建立梯度耗时约8 h，而采用滤过离子交换法对90 mL脂质体建立梯度用时仅为1 h。用混合离子交换树脂直接处理脂质体混悬液建立梯度用时约0.2 h，但是脂质体回收率偏低。超滤法用时约和葡聚糖凝胶过滤法用时皆在1 h以上。

实施例6采用不同方法对非PEG化脂质体建立梯度的回收率及包封率比较

处方  DPPC        3g

CH          1g

水化介质： 200 mmol硫酸铵溶液100 mL。

制备空白脂质体：称取处方量的DPPC 及CH（胆固醇）55 ℃下用10 ml乙醇溶解膜材，得脂质相；将预热至55℃的水化介质注入脂质相，孵育10 min，制得脂质体初品，再经20000 psi高压均质处理，降低脂质体粒径至100 nm，依次通过0.8、0.45、0.22 μm的微孔滤膜，即得空白脂质体。

分别使用透析法、超滤法、葡聚糖凝胶法、离子交换树脂法和滤过离子交换法对空白脂质体建立梯度，梯度建立的方法同“实施例5”。

主动载药：得到的梯度脂质体60 ℃直接载药，表阿霉素与DPPC的重量比为1：5。不同的梯度建立方法制备的脂质体回收率及载药包封率见表4。

表4 不同梯度建立方法脂质体回收率及载药包封率

建立梯度方法	透析法	超滤法	葡聚糖凝胶法	离子交换树脂柱法	滤过离子交换法
						包封率	82%	71%	90%	91%	100%
回收率	95%	81%	72%	41%	98%

结论：对非PEG化脂质体建立梯度时，滤过离子交换法的回收率明显高于离子交换树脂法、葡聚糖凝胶法和超滤法。

 

实施例7使用不同孔径的中空纤维膜组件建立脂质体内外水相梯度

处方

HEPC        10 g

CH           3 g

PEG-CHS      3 g

水化介质： 200 mmol乙二胺四乙酸铵200 mL

制备空白脂质体：称取处方量的HEPC 、CH、PEG-CHS（PEG分子量为2000），55 ℃，用20 mL乙醇溶解膜材，得脂质相；将预热至55℃的水化介质注入脂质相，孵育10 min，制得脂质体初品，再经20000 psi高压均质处理，降低脂质体粒径至100 nm，即得空白脂质体。

建立梯度脂质体：取100 mL空白脂质体建立梯度，梯度建立所用装置连接方式与“实施例1”相同，其中膜分离装置（1）在本实施例中的具体实现形式为不同孔径的聚砜中空纤维膜组件（孔径分别为0.001μm、0.005 μm、0.01 μm、0.05 μm和0.10 μm，膜面积1.5 m²），中空纤维膜组件控温为25 ℃；透析介质为等渗蔗糖水溶液；脂质体混悬液压力比透析介质大0.1 MPa，透析介质与空白脂质体的体积比为10:1；离子交换剂采用ZB-1阳离子交换纤维、732型阳离子交换树脂、ZB-2阴离子交换纤维和717型阴离子交换树脂的混合物，其混合比例为1:1:1:1 v/v，视湿体积，混合交换剂用量为水化介质中阴阳离子所需所需交换容量的30倍；层析柱温度设定为30 ℃；整个滤过离子交换法耗时1.5 h。以建立梯度后的脂质体混悬液中磷脂浓度计算脂质体回收率，结果见表5。

主动载药：将阿霉素溶液与已建立梯度的空白脂质体（药脂比1:10，w/w）混匀，孵育20 min。测得包封率，结果见表5。

表5 不同孔径中空纤维制备梯度脂质体的回收率及载药包封率

膜孔径	0.001μm	0.005μm	0.01μm	0.05μm	0.10μm
						脂质体回收率	98%	98%	96%	92%	82%
包封率	78%	88%	95%	100%	100%

结论：由于脂质体有一定的变形性能，当其粒径与膜孔径接近或稍大时，会有部分脂质体穿过膜进入透析介质中，导致脂质体回收率下降；膜表面对脂质体的吸附也导致脂质体回收率的轻微下降（约2%）。较大的膜孔也有利于脂质体外水相中的盐被快速除去，产生较大的梯度，更有利于主动载药。

实施例8

空白脂质体制备方法、梯度建立装置及方法同“实施例7”， 取100 mL空白脂质体建立梯度，本实施例中膜分离装置（1）的具体实现形式为不同孔径的聚醚砜中空纤维膜组件（孔径分别为0.001μm、0.005 μm、0.01 μm、0.05 μm和0.10 μm）。所建立梯度脂质体的回收率及载药包封率同“实施例7”相比没有显著差异。

实施例9

处方    DPPC               3.0 g

        CH                 1.0 g

        TPGS               0.4 g

        PEG -DSPE          0.4 g

水化介质为200 mmol乙二胺四乙酸铵100 mL

制备空白脂质体：称取处方量的HSPC、CH、TPGS、PEG –DSPE（PEG分子量为2000），55 ℃，用10mL乙醇溶解膜材，得脂质相；将预热至55 ℃的水化介质注入脂质相，孵育30 min，制得脂质体初品，再经20000 psi高压均质处理，降低脂质体粒径至100 nm，依次通过0.8、0.45、0.22 μm的微孔滤膜，即得空白脂质体。

脂质体梯度建立装置及操作步骤同“实施例1”， 取25 mL空白脂质体建立梯度，本实施例中膜分离装置（1）的具体实现形式为切向流过滤组件，其中安装不同孔径的聚醚砜膜（孔径分别为0.001μm、0.005 μm、0.01 μm、0.05 μm和0.10 μm，膜面积0.2 m²），透析介质为5 %（w/v）乳糖水溶液；透析介质体积为脂质体混悬液体积的10倍；透析介质流量为脂质体混悬液流量的2倍；切向流过滤组件使用水浴控温为20℃；离子交换装置（2）在本实施例中为3根串联的离子交换层析柱，其中所用离子交换剂为（ZB-1阳离子交换纤维、 ZB-2阴离子交换纤维，其混合比例为湿视体积1：1 v/v）交换容量为理论交换容量的15倍。

主动载药：于2 h取出脂质体与阿霉素溶液（药脂比1:10，w/w）混匀，60℃孵育20 min。脂质体回收率及包封率结果见表6

表6 不同孔径切向流过滤膜制备梯度脂质体的回收率及载药包封率

膜孔径	0.001μm	0.005μm	0.01μm	0.05μm	0.10μm
						脂质体回收率	99%	96%	96%	94%	90%
包封率1	90%	92%	100%	100%	100%

实施例10 滤过离子交换法减少离子交换剂用量

处方

DPPC                  3 g

CH                    1 g

PEG-DSPE              1 g

水化介质：200 mmol/L的硫酸铵溶液60 mL。

空白脂质体的制备：称取处方量的DPPC、CH、PEG-DSPE(PEG分子量为2000)，于60 ℃用5 %乙醇（v/v）溶解，以中速注入预热至相同温度的水化介质，孵育20 min，制得脂质体初品，经微射流处理（压力为16000 psi)，将粒径减小至100 nm，依次通过0.8、0.45和0.22 μm的微孔滤膜，即得空白脂质体。

离子交换法建立梯度：取0.2 mL空白脂质体上样于3 mL混合树脂（S100阳离子交换树脂、 M800阴离子交换树脂，其混合比例为湿视体积1：1 v/v）柱顶端，停留4 min后，在2000 rpm下离心4min，得到梯度脂质体。离子交换剂用量为理论所需用量的30倍。

滤过离子交换法建立梯度：所用装置见附图2，膜分离装置（1）在本实施例中为孔径为0.01 μm的聚偏氟乙烯中空纤维组件；透析介质为5 %（w/v）乳糖水溶液；透析介质体积为脂质体混悬液体积的20倍；透析介质流量为脂质体混悬液流量的2倍；中空纤维组件中脂质体混悬液流动空间的压强与透析介质流动空间的压强相等；中空纤维组件使用水浴控温为20℃；离子交换装置（2）在本实施例中为带有搅拌装置的离子交换槽，其中所用离子交换剂为（S 100阳离子交换树脂、 M 800阴离子交换树脂，其混合比例为湿视体积1：1 v/v）交换容量为理论交换容量的3倍。

将得到的梯度脂质体与拓扑替康溶液混合（拓扑替康与DPPC的质量比为1:10），60℃孵育20 min载药。试验结果见表7。

表7 不同方法试验结果

梯度建立方法	离子交换柱	滤过离子交换法
			树脂过量程度	30倍	3倍
包封率	72%	94%
			脂质体回收率	65%	100%

从本实施例可知，使用滤过离子交换法建立脂质体内外水相梯度时，由于透析介质的离子传导作用，使得离子交换剂的使用较为充分。

实施例11使用滤过离子交换法对高浓度脂质体建立梯度

处方 HSPC        20 g

CH           6 g

PEG-CHS      2 g

水化介质： 200 mmol乙二胺四乙酸铵80 mL

制备空白脂质体：称取处方量的HEPC 、CH（胆固醇）、PEG-CHS（PEG分子量为2000），55 ℃，用10 mL乙醇溶解膜材，得脂质相；将预热至55℃的水化介质注入脂质相，孵育10 min，制得脂质体初品，再经14000 psi高压均质处理，降低脂质体粒径至80 nm，即得空白脂质体。

建立梯度脂质体：所用装置如附图2所示，膜分离装置（1）在本实施例中的具体形式为切向流过滤组件，使用孔径为0.01 μm的聚醚砜膜，组件控温为30 ℃；透析介质为蔗糖水溶液，透析介质与空白脂质体的体积比为10:1；离子交换剂采用ZB-1阳离子交换纤维、732型阳离子交换树脂、ZB-2阴离子交换纤维和717型阴离子交换树脂的混合物，其混合比例为1:1:1:1 v/v，视湿体积，混合交换剂用量为水化介质中阴阳离子所需所需交换容量的20倍；离子交换装置（2）在本实施例中的具体形式是具有控温功能的层析柱，其温度设定为45 ℃；整个滤过离子交换法耗时2 h。

主动载药：将阿霉素溶液与已建立梯度的空白脂质体（药脂比1:10，w/w）混匀，孵育20 min。测得包封率为92.5%；将已建立梯度的空白脂质体用等体积的9 %（w/v）蔗糖溶液稀释后，与阿霉素溶液（药脂比1:6，w/w）混匀，孵育20 min。载药，测得包封率为99.7%。

使用本方法可以制备高浓度膜材的梯度脂质体混悬液，而其他梯度建立方法（离心、透析、超滤、葡聚糖凝胶过滤）普遍存在不能适用于膜材料浓度大于10%（g/g或g/mL）的高浓度囊泡（包括脂质体）来建立梯度差的缺点。当对高浓度梯度脂质体进行适当稀释后可以增加其内外水相梯度差，同时还由于渗透压的原因导致内水相体积增加，两个因素使得脂质体载药量上升、包封率更高。

本发明所述的滤过离子交换法同样可以制备其他药物脂质体，如长春新碱、长春瑞滨、阿克拉霉素、米托蒽醌、枸橼酸舒芬太尼脂质体，特别是制备高浓度脂质体（脂质浓度大于10%（g/mL）），可以实现肌肉注射缓释，降低刺激性。

实施例12 可以简化外水相成分

处方  HSPC                  1.5 g

      CH                    0.5 g

      PEG2000-DSPE         0.5 g

水化介质：200 mmol/L的乙二胺四乙酸铵溶液90 mL

空白脂质体的制备：称取处方量的HSPC、CH、PEG2000-DSPE，于60 ℃用5 %乙醇（v/v）溶解，以中速注入预热至相同温度的水化介质，孵育20 min，制得脂质体初品，经微射流处理（压力为14000 psi)，将粒径减小至100 nm，依次通过0.8、0.45和0.22 μm的微孔滤膜，即得空白脂质体。 

梯度脂质体的制备：所用装置见附图2，其中膜分离装置（1）在本实施例中的具体形式为切向流过滤组件，其中使用孔径为0.002 μm的聚砜膜；透析介质为5 %（w/v）海藻糖水溶液；透析介质体积为脂质体混悬液体积的10倍；透析介质流量为脂质体混悬液流量的10倍；切向流过滤器中脂质体混悬液流动空间的压强比透析介质流动空间的压强大0.7 MPa；切向流装置使用水浴控温为20℃；离子交换装置（2）在本实施例中的具体形式为带有搅拌装置的离子交换槽，其中所用离子交换剂为732阳离子交换树脂（H⁺型）和717阴离子交换树脂（OH^-型）（v/v=1/2混合，视湿体积），交换容量为理论交换容量的50倍。

1 h后结束此透析过程，梯度脂质体体积变为30 mL ，使用5 %（w/v）海藻糖水溶液将此梯度脂质体混悬液稀释至60 mL。

载药：将阿霉素溶液与稀释后的梯度脂质体（药脂比1:10，w/w）混匀，孵育20 min。测得包封率为99.5%。

使用滤过离子交换法建立脂质体内外水相梯度的同时还可以对外水相成分进行置换。

实施例 13 对荷电脂质体建立梯度

处方 DSPC        1.5 g

PS           1.5 g

CH           1 g

水化介质：200 mmol/L的柠檬酸铵溶液60 mL。

制备空白脂质体：称取处方量的DSPC、PS 、CH，55 ℃，用5 mL乙醇溶解膜材，得脂质相；将预热至55℃的水化介质注入脂质相，孵育30 min，制得脂质体初品，再经20000 psi高压均质处理，降低脂质体粒径至80 nm，依次通过0.8、0.45、0.22 μm的微孔滤膜，即得空白脂质体。

使用滤过离子交换法建立梯度：所用装置示意图见附图2，其中膜分离装置（1）在本实施例中的具体形式为切向流过滤组件，其中使用孔径为0.01 μm的聚偏氟乙烯膜；透析介质为5 %（w/v）木糖醇水溶液；透析介质体积为脂质体混悬液体积的5倍；透析介质流量为脂质体混悬液流量的2倍；切向流装置使用水浴控温为20℃；离子交换装置（2）在本实施例中的具体形式为离子交换层析柱，其中所用离子交换剂为D001阳离子交换树脂、D201阴离子交换树脂、ZB-1阳离子交换纤维和ZB-2阴离子交换纤维的混合物，其混合比例为湿视体积1：2：1：2 v/v，用量为水化介质中阴阳离子所需交换容量的10倍；离子交换层析柱温度设定为40℃。建立梯度耗时1 h。

使用离子交换树脂柱建立梯度：取空白脂质体上样于混合树脂（D001阳离子交换树脂、D201阴离子交换树脂、ZB-1阳离子交换纤维和ZB-2阴离子交换纤维的混合物，其混合比例为湿视体积1：2：1：2 v/v，）柱顶端，停留2 min后，在2000 rpm下离心4 min，得到梯度脂质体。离子交换剂用量为理论所需用量的10倍。 

测定梯度建立前后脂质体回收率，滤过离子交换法为97%，离子交换树脂柱法为19%。

使用滤过离子交换法建立梯度时脂质体没有损失，而离子交换树脂柱却对荷电脂质体产生了显著的吸附。

实施例 14 透析法和滤过离子交换法制备梯度脂质体载药后稳定性

处方   EPC                3 g

       CH                 1 g

       PEG-DSPE           1 g

水化介质：含有10 mg/mL低分子肝素的 150 mmol/L NH₄EDTA 溶液100 mL。

空白脂质体的制备：称取处方量的EPC、CH、PEG-DSPE（PEG分子量为2000），于60 ℃用5 %乙醇（v/v）溶解，以中速注入预热至相同温度的水化介质，孵育20 min，制得脂质体初品，经微射流处理（压力为14000 psi)，将粒径减小至100 nm，依次通过0.8、0.45和0.22 μm的微孔滤膜，即得空白脂质体。

制备梯度脂质体：

滤过离子交换法：取空白脂质体装于截留分子量为10万的透析袋中，透析介质为等渗蔗糖溶液，透析介质用量为脂质体混悬液体积的200倍，透析介质中加入混合离子交换剂（采用四种离子交换剂，732阳离子交换树脂 、CM-纤维素、 717阴离子交换树脂、DEAE-纤维素，其混合比例为湿视体积1：1：1：2 v/v），透析袋、透析介质和离子交换剂置于同一烧杯内，离子交换剂在磁力搅拌的作用下在透析介质中均匀分布，离子交换剂用量为水化介质中阴阳离子所需交换容量的6倍，透析1.5 h，得到梯度脂质体。

透析方法：取空白脂质体，以截留分子量为10万的透析膜，透析介质为等渗蔗糖溶液，透析介质用量为脂质体混悬液体积的250倍，透析6小时；更换透析介质，透析3小时；再次更换透析介质，透析2小时。建立梯度，得到梯度脂质体。

载药：将梯度脂质体与4 mg/mL 阿霉素溶液按照药脂比1：10（w/w）混合，60℃下载药20 min，得到阿霉素脂质体。测定包封率，结果表明，两种方法的包封率均大于90%，但“透析方法”建立梯度的脂质体，放置12小时即有沉淀；而采用滤过离子交换法建立梯度的脂质体，放置72小时也未见沉淀。即本发明的梯度建立方法优于常规的透析方法。

离子交换剂还可以采用磷酸纤维素、磷酸葡聚糖；（B-DEAE）-纤维素、（B-DEAE）-葡聚糖、大孔离子交换剂等。

低分子肝素可以更换为琥珀酸明胶、肌红蛋白、血红蛋白、细胞色素、胰岛素、bFGF、硫酸葡聚糖、aFGF 、鱼精蛋白、聚赖氨酸等。

实施例 15

处方  DOPE                4.0 g

      CH                   4.0 g

      PEG2000-CHEMS       1.0 g

    水化介质：200 mmol/L的枸橼酸铵溶液（pH=6.5）100 mL

空白脂质体的制备：称取处方量的DOPE、CH、PEG2000-CHEMS（聚乙二醇2000-胆固醇半琥珀酸酯），于55 ℃用氯仿溶解，旋转蒸发挥除氯仿，以中速注入预热至相同温度的水化介质，孵育20 min，制得脂质体初品，经微射流处理，依次通过0.8、0.45和0.22 μm的微孔滤膜，即得空白脂质体。 

梯度脂质体的制备：所用装置结构见附图2，其中膜分离装置（1）的具体实现形式为切向流过滤组件，所用聚四氟乙烯膜孔径为0.01 μm；离子交换装置（2）的具体实现形式为3根离子交换层析柱串联；透析介质为5 %（w/w）葡萄糖水溶液；透析介质与空白脂质体的体积比为15:1；脂质体混悬液和透析介质的流量比为1:1。离子交换剂为：DAEA-纤维素类阴离子交换剂和CM -纤维素类阳离子交换剂，用量为水化介质中阴阳离子所需交换容量的5倍，阴离子交换剂:阳离子交换剂=1:1，湿视体积比。

载药：将得到的梯度脂质体与长春瑞滨溶液混合（长春瑞滨与DOPE的质量比为1:5），载药。包封率可达98%以上。

说明：本实施例中采用了可断裂PEG脂质衍生物即PEG2000-CHEMS，由于其在体内酯酶的作用下可使PEG逐渐脱落，从而重建酸敏脂质体对肿瘤部位低pH值的敏感性。

实施例 16 温度对滤过离子交换法建立梯度的速度的影响

处方  EPC          1.5 g

      CH           0.5 g

      PEG-CHS      0.5 g

水化介质：300 mmol/L 硫酸铵溶液50 mL。

空白脂质体的制备：称取处方量的EPC、CH、PEG-CHS（其中PEG分子量为2000），于60 ℃用10 % 乙醇（v/v）溶解，注入预热至相同温度的水化介质，孵育20 min，制得脂质体初品，经微射流处理（压力为14000 psi)，将粒径减小至140 nm，即得空白脂质体。

滤过离子交换法建立梯度：所用装置如附图2 所示，其中膜分离装置（1）的具体实现形式为切向流过滤组件，所用聚丙烯腈膜孔径为0.02μm，膜面积1.2 m²；离子交换装置（2）的具体实现形式为具有控温功能的离子交换槽；

脂质体用量为50 mL，透析介质为5 %（w/v）葡萄糖水溶液；透析介质与空白脂质体的体积比为15:1；脂质体混悬液和透析介质的流量比为1:1。离子交换剂离子交换剂采用732阳离子树脂、717阴离子树脂、ZB-1阳离子交换纤维和ZB-2阴离子交换纤维的混合物，其混合比例为1:1:1:1 v/v，视湿体积，混合交换剂用量为水化介质中阴阳离子所需所需交换容量的5倍。

离子交换槽的温度分别设定为20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃。同时使用冰水浴冷却透析介质存储罐，以确保切向流过滤组件的温度能控制在20℃。以脂质体外水相硫酸铵浓度降低至0.2 mmol/L表示梯度建立时间，所用时间见表8。

表8 离子交换装置温度与建立梯度所用时间

离子交换槽温度（℃）	0	30	40	50	60	80
							梯度建立时间（min）	360	180	165	130	120	95

对离子交换装置的温度进行独立控制，既能加快脂质体梯度建立速度，又能防止过高的温度影响脂质体的稳定性。

实施例 17 脂质体凝胶

处方  SPC     2.00 g

      F68      0.04 g

水化介质：150 mmol／L醋酸钙溶液(pH7.3)100 mL。

脂质体制备方法：取SPC、F68（Pluronic F-68），以5 mL乙醇溶解，得到脂质溶液。加入水化介质溶液至脂质溶液中，并18000 psi高压均质处理，制备空白脂质体（172 nm）。

滤过离子交换法建立梯度：所用装置如附图2所示，其中膜分离装置（1）在本实施例中的具体实现形式是孔径为0.02 μm的聚偏氟乙烯中空纤维组件；离子交换装置（2）的具体实现形式是离子交换柱；中空纤维膜组件控温为25 ℃；透析介质等渗的蔗糖水溶液，透析介质与空白脂质体的体积比为5:1；离子交换剂采用D111大孔阳离子树脂、D202阴离子树脂、ZB-1阳离子交换纤维和ZB-2阴离子交换纤维的混合物，其混合比例为1:1:1:1 v/v，视湿体积，混合交换剂用量为水化介质中阴阳离子所需所需交换容量的5倍；层析柱温度设定为25 ℃；整个滤过离子交换法耗时1.5 h。建立醋酸钙梯度。以注射用水配制0.2%双氯酚酸钠溶液，加入上述空白脂质体中，55℃孵育20 min，主动装载双氯酚酸钠入脂质体内水相。配制2%卡波姆934溶液，三乙醇胺调节pH至7.0，并研匀。将双氯酚酸钠脂质体加入卡波姆凝胶基质中，搅拌并研匀，即得双氯酚酸钠脂质体凝胶。该凝胶用于风湿和内风湿性关节炎的局部治疗，有利于药物透皮进入病变组织，并避免口服双氯酚酸钠对消化道的刺激问题和中枢神经系统的毒性反应，更易于为患者接受。

实施例 18 囊泡

处方  Span 60             4.5 g

      CH                 4.5 g

      PEG-CHS           1.0 g

水化介质：200 mmol/L 枸橼酸缓冲溶液（pH 3.7）100 mL。

空白囊泡的制备：称取处方量的Span 60、CH、PEG-CHS（其中PEG分子量为2000），于60 ℃用10 % 乙醇（v/v）溶解，向其中注入预热至相同温度的水化介质，孵育20 min，制得空白囊泡。

滤过离子交换法建立梯度：其中膜分离装置（1）的具体实现形式为切向流过滤组件，所用三醋酸纤维素膜孔径为0.01μm；离子交换装置（2）的具体实现形式为2根离子交换层析柱串联；透析介质为10 %（w/v）蔗糖水溶液；透析介质与空白脂质体的体积比为15:1；脂质体混悬液和透析介质的流量比为1:1。离子交换剂为：弱碱羟型树脂（330-OH型树脂），树脂用量为理论交换容量的1倍。1.5 h后测定脂质体外水相pH值为6.6。 

载药：将所得到的梯度囊泡与盐酸小檗碱溶液孵育（盐酸小檗碱与Span 60的质量比为1：10），60 ℃水浴下孵育10 min。使用葡聚糖凝胶柱测得包封率为86%。

使用羟基型弱碱性离子交换树脂调节脂质体外水相pH值。盐酸小檗碱口服吸收差，且水溶性差，将其制备为囊泡后可通过注射或口服给药，改善其生物利用度低的问题。

将所得盐酸小檗碱囊泡与卡波姆凝胶基质研匀，得到盐酸小檗碱囊泡凝胶，可用于烧伤、烫伤的局部外用。

实施例19 使用滤过离子交换法建立脂质体内外水相多聚阴离子梯度

处方 HSPC        3.0 g

CH          1.0 g 

PEG-CHS     0.5 g

水化介质中含有200 mmol/L的硫酸铵和5 mg/mL的低分子量肝素（分子量3000-8000），水化介质用量60 mL。

采用改良乙醇注入法制备空白脂质体，并18000 psi高压均质处理，制备空白脂质体（152 nm）。分别通过透析法、葡聚糖凝胶法、超滤法、滤过离子交换法建立离子梯度。

其中滤过离子梯度法建立梯度方法如下：

使用装置如附图2所示，其中，膜分离装置（1）在本实施例中的具体形式是孔径为0.01μm聚砜中空纤维膜组件；透析介质为10 %（w/v）木糖醇水溶液；离子交换装置（2）的具体实现形式是带有控温装置的离子交换槽，温度设定为55℃；离子交换剂为732阳离子交换树脂、717阴离子交换树脂、D204阴离子交换树脂，其混合比例为1:2:2 v/v，视湿体积，混合交换剂用量为水化介质中阴阳离子所需所需交换容量的10倍。本实施例中操作步骤如下：

a)            取50 mL空白脂质体混悬液加入到囊泡混悬液储存罐（4）中，将500 mL透析介质加入到透析介质储存罐（3）；

b)            开动囊泡混悬液泵（5）和透析介质泵（6）；脂质体混悬液经过膜分离装置（1）后进入梯度囊泡存储罐（13），当囊泡混悬液储存罐（4）中的脂质体混悬液全部进入到梯度囊泡存储罐（13）中时，可以打开阀门（14）将脂质体混悬液从梯度囊泡存储罐（13）转移至囊泡混悬液储存罐（4），以使脂质体反复经过膜分离装置（1）以建立梯度；

c)            通过调节囊泡混悬液泵（5）和透析介质泵（6）的流速及囊泡混悬液压力控制阀（7）和透析介质压力控制阀（8）的开放大小，对脂质体混悬液及透析介质的流量和中空纤维内外侧压力进行调节。使用囊泡混悬液流量计（10）和透析介质流量计（11）对脂质体混悬液和透析介质的流量进行监控；使脂质体混悬液和透析介质的流量比为1 :2。使用囊泡混悬液压力表（9）和透析介质压力表（10）对膜分离装置（1）的中空纤维两侧的压力进行监测；脂质体混悬液侧的压强比透析介质侧压强大0.7 MPa；

d)            设定膜分离装置（1）的温度为30 ℃，设定离子交换装置（2）的温度为55 ℃。

e)            随着滤过过程的不断进行，由于有较大跨膜压力的存在，脂质体混悬液的体积会逐渐减小，当脂质体混悬液体积降至25 mL时向其中补加10 %（w/v）木糖醇水溶液至50 mL。

f)            重复步骤e）4次，共补加10 %（w/v）木糖醇水溶液100 mL。

以上滤过过程耗时1.5 h，透析结束时透析介质变为约600 mL。

透析法建立梯度：取空白脂质体，以截留分子量为10万的透析膜，透析介质为10%（w/v）木糖醇水溶液，透析介质用量为脂质体混悬液体积的250倍，透析6小时；更换透析介质，透析3小时；再次更换透析介质，透析2小时。建立梯度，得到梯度脂质体。

在60 ℃，将阿霉素溶液与已建立梯度的空白脂质体（药脂比1:10，w/w）混匀，孵育20 min。测得包封率如表9

表9 不同方法建立梯度脂质体载药

梯度建立方法	滤过离子交换法	透析法	葡聚糖凝胶法	超滤法
					包封率	95%	药物沉淀	56%	33%

以透析法制备的梯度脂质体载药时出现药物沉淀、葡聚糖凝胶法和超滤法制备的梯度脂质体载药后放置24 h后出现沉淀。以滤过离子交换法制备的梯度脂质体载药后包封率高，且放置1个月也未出现沉淀。

此方法同样可用于建立其他多聚阴离子在脂质体内外水相的梯度，如苏拉明、蔗糖八硫酸酯铵盐等，多聚阴离子化合物可以和包封入脂质体内的药物形成稳定的复合物，减慢药物释放，提高脂质体的靶向治疗效果。

实施例20 

空白脂质体制备方法同“实施例18”。

梯度建立方法：使用装置如附图2所示，其中，膜分离装置（1）在本实施例中的具体形式是孔径为0.01μm聚砜中空纤维膜组件；透析介质为10 %（w/v）木糖醇水溶液；离子交换装置（2）的具体实现形式是带有控温装置的离子交换槽，在本实施例中离子交换槽中不加入任何离子交换剂，操作步骤如下：

a)            取50 mL空白脂质体混悬液加入到囊泡混悬液储存罐（4）中，将500 mL透析介质加入到透析介质储存罐（3）；

b)            开动囊泡混悬液泵（5）和透析介质泵（6）；脂质体混悬液经过中空纤维膜组件（1）后进入梯度囊泡存储罐（13），当囊泡混悬液储存罐（4）中的脂质体混悬液全部进入到梯度囊泡存储罐（13）中时，可以打开阀门（14）将脂质体混悬液从梯度囊泡存储罐（13）转移至囊泡混悬液储存罐（4），以使脂质体反复经过中空纤维膜组件（1）以建立梯度；

c)            通过调节囊泡混悬液泵（5）和透析介质泵（6）的流速及囊泡混悬液压力控制阀（7）和透析介质压力控制阀（8）的开放大小，对脂质体混悬液及透析介质的流量和中空纤维内外侧压力进行调节。使用囊泡混悬液流量计（10）和透析介质流量计（11）对脂质体混悬液和透析介质的流量进行监控；使脂质体混悬液和透析介质的流量比为1 :2。使用囊泡混悬液压力表（9）和透析介质压力表（10）对中空纤维膜组件（1）的中空纤维两侧的压力进行监测；脂质体混悬液侧的压强比透析介质侧压强大0.7 MPa；

d)            设定中空纤维膜组件（1）的温度为30 ℃，设定离子交换槽（2）的温度为30 ℃。

e)            随着滤过过程的不断进行，由于有较大跨膜压力的存在，脂质体混悬液的体积会逐渐减小，当脂质体混悬液体积降至25 mL时向其中补加10 %（w/v）木糖醇水溶液至50 mL。

f)            重复步骤e）10次，共补加10 %（w/v）木糖醇水溶液250 mL。

以上滤过过程耗时2.5 h，透析结束时透析介质变为约750 mL。

载药：将阿霉素溶液与已建立梯度的空白脂质体（药脂比1:10，w/w）混匀，60 ℃下孵育20 min，测得包封率为55%，制剂放置24 h后出现沉淀。

对比“实施例18”和“实施例19”可知，使用滤过离子交换法除去脂质体外水相的大分子物质时，离子交换剂对于这些大分子物质的交换及吸附作用是提高梯度差和加快梯度建立速度的关键。

实施例21 流量对梯度建立时间的影响

处方   EPC                3 g

       CH                 1 g

       PEG-DSPE           0.5 g

PEG-CHS            0.5 g

水化介质：300 mmol/L 硫酸铵溶液100 mL。

空白脂质体的制备：称取处方量的EPC、CH、PEG- DSPE（其中PEG分子量为2000）和PEG-CHS（其中PEG分子量为2000），于60 ℃用10 % 乙醇（v/v）溶解，注入预热至相同温度的水化介质，孵育20 min，制得脂质体初品，经微射流处理（压力为16000 psi)，将粒径减小至150 nm，即得空白脂质体。

滤过离子交换法建立梯度：所用装置如附图2所示，其中膜分离装置（1）在本实施例中的具体实现形式是切向流过滤组件，使用孔径为0.01μm的聚偏氟乙烯膜；离子交换装置（2）的在本实施例中的具体实现形式是带有控温装置的离子交换层析柱；切向流过滤组件控温为25 ℃；透析介质为等渗的蔗糖水溶液，透析介质与空白脂质体的体积比为15:1；离子交换剂采用D111大孔阳离子树脂、D202阴离子树脂、ZB-1阳离子交换纤维和ZB-2阴离子交换纤维的混合物，其混合比例为1:1:1:1 v/v，视湿体积，混合交换剂用量为水化介质中阴阳离子所需所需交换容量的200倍；离子交换槽设定为25 ℃。

对50 mL空白脂质体建立梯度，以脂质体外水相硫酸铵浓度下降到3 mmol/L为梯度建立标准，使用囊泡混悬液流量计（10）和透析介质流量计（11）对脂质体混悬液和透析介质的流量进行监控；通过对囊泡混悬液泵（5）和透析介质泵（6）的流速及囊泡混悬液压力控制阀（7）和透析介质压力控制阀（8）的开放大小进行调节，使透析介质与脂质体混悬液的流量比分别为1 、10、50和100；使用囊泡混悬液压力表（9）和透析介质压力表（10）对切向流组件中膜两侧的压力进行监测，调节压力差为0 MPa；梯度建立所需时间如表10。

表10不同流量比建立梯度所需时间

流量比	1	10	50	100
					时间（min）	105	70	65	60

实施例22 

处方 DSPC        0.30 g

CH          0.10g 

PEG-CHS     0.08 g

PEG-DSPE    0.02 g

水化介质中为200 mmol/L的硫酸铵溶液8 mL。

制备空白脂质体：称取处方量的DSPC 、CH、PEG-CHS（PEG分子量为2000）、PEG-DSPE（PEG分子量为2000），55 ℃，用0.6 ml乙醇溶解膜材，得脂质相；将预热至55℃的水化介质注入脂质相，孵育10 min，制得脂质体初品，探头超声降低脂质体粒径至110 nm，依次通过0.8、0.45、0.22 μm的微孔滤膜，即得空白脂质体。

滤过离子交换法建立梯度：取空白脂质体1 mL装于截留分子量为10万的透析袋中，透析介质为等渗蔗糖溶液，透析介质用量为脂质体混悬液体积的50倍；透析介质中加入混合离子交换剂（采用四种离子交换剂，732阳离子交换树脂 、ZB-1阳离子交换纤维、 717阴离子交换树脂和ZB-2阴离子交换纤维，其混合比例为湿视体积1：1：1：1 v/v）；透析袋、透析介质和离子交换剂置于同一烧杯内，离子交换剂在磁力搅拌的作用下在透析介质中均匀分布，离子交换剂用量为水化介质中阴阳离子所需交换容量的30倍。脂质体外水相硫酸铵浓度降至2 mmol/L所用时间与此体系温度的关系见表11。

表11 不同温度建立梯度所用时间

温度（℃）	0	20	30	40	50	60
							用时（min）	300	100	85	60	40	30

实施例23 磁靶向脂质体

处方： DLPC             0.3g

CH               0.1g

TPGS              0.1g

取处方量DLPC、CH、TPGS，加入0.5ml乙醇溶解，得脂质相。以0.2mol/L三氯化铁溶液（内含0.1g聚乙二醇）5 ml水化脂质相，制备脂质体，探头超声降低粒径至约50 nm。取空白脂质体1 mL装于截留分子量为10万的透析袋中，透析介质为等渗蔗糖溶液，透析介质用量为脂质体混悬液体积的50倍；透析介质中加入混合离子交换剂（采用混合离子交换剂，732阳离子交换树脂、 717阴离子交换树脂，其混合比例为湿视体积1：1 v/v）；透析袋、透析介质和离子交换剂置于同一烧杯内，离子交换剂在磁力搅拌的作用下在透析介质中均匀分布，离子交换剂用量为水化介质中阴阳离子所需交换容量的6倍。除去未包入脂质体的外水相三氯化铁（氯离子与铁离子），移入反应器中，通N₂，滴加氨水， 50℃下反应6h。除去残余的氨水，即得纳米磁性脂质体。以曲拉通X-100破坏双分子膜，并除去脂质材料，即得纳米四氧化三铁，即磁流体。

而同样处方，不采用离子交换树脂柱除去外水相四氧化三铁，无法制备成功纳米磁性脂质体与纳米四氧化三铁。

实施例24 主动靶向脂质体

处方 EPC                 0.15 g

CH                   0.05g 

DSPE-PEG2000-EGF    0.01 g

DSPE-PEG2000         0.04 g

水化介质中为200 mmol/L的硫酸铵溶液5 mL

制备空白脂质体：称取处方量的EPC 、CH、DSPE-PEG2000-EGF（EGF为表皮生长因子） 、DSPE-PEG2000，45 ℃，用0.5 ml乙醇溶解膜材，得脂质相；将预热至45℃的水化介质注入脂质相，孵育10 min，制得脂质体初品，探头超声降低脂质体粒径至110 nm，依次通过0.8、0.45、0.22 μm的微孔滤膜，即得空白脂质体。

滤过离子交换法建立梯度：取空白脂质体1 mL装于截留分子量为10万的透析袋中，透析介质为等渗木糖醇溶液，透析介质用量为脂质体混悬液体积的150倍；透析介质中加入混合离子交换剂（采用四种离子交换剂，732阳离子交换树脂 、ZB-1阳离子交换纤维、 717阴离子交换树脂和ZB-2阴离子交换纤维，其混合比例为湿视体积1：1：1：1 v/v）；透析袋、透析介质和离子交换剂置于同一烧杯内，离子交换剂在磁力搅拌的作用下在透析介质中均匀分布，离子交换剂用量为水化介质中阴阳离子所需交换容量的30倍，所用时间为1 h。

在50 ℃，将阿霉素溶液与已建立梯度的空白脂质体（药脂比1:10，w/w）混匀，孵育20 min，测得包封率89%。载药脂质体冻干保存。

使用离子交换柱建立梯度时脂质体发生吸附，难以洗脱。

用透析法建立梯度时由于时间较长（30℃，10 h），再此过程中脂质体表面的EGF结构可能产生变化，导致进入体内后靶向性下降。

Claims (16)

1.一种制备具有内外水相梯度差囊泡的方法，其特征在于：通过膜分离方法将囊泡混悬液水化介质中的阳离子、阴离子、阴阳离子和/或荷电大分子物质分配到透析介质中；使用离子交换方法选择性地交换或清除进入透析介质中的阳离子、阴离子、阴阳离子和/或荷电大分子物质，从而使囊泡在较短时间内建立较大的内外水相梯度差。

2.如权利要求1所述的制备具有内外水相梯度差囊泡的方法，其特征在于：所述膜分离方法通过膜分离装置实现，膜分离装置采用切向流过滤或透析的方式；所选用膜的孔径为所需建立梯度的囊泡的粒径的0.01-1.00倍；膜两侧压力差为0-0.70 Mpa；膜两侧透析介质与囊泡混悬液的流量比为1-100:1；膜分离装置的工作温度为0-60 ℃间的任意温度，或在0-60 ℃中的某个温度区间内变化。

3.如权利要求1所述的制备具有内外水相梯度差囊泡的方法，其特征在于：所述透析介质的体积是囊泡混悬液体积的1-200倍。

4.如权利要求1所述的制备具有内外水相梯度差囊泡的方法，其特征在于：所述离子交换方法通过离子交换装置实现，离子交换装置具有的离子交换容量为完全交换水化介质中阳离子、阴离子、阴阳离子和/或荷电大分子物质所需交换容量的1-200倍，并且离子交换装置的交换容量可以通过再生而恢复；所述的离子交换装置的工作温度为0-80 ℃间的任意温度，或在0-80 ℃中的某个温度区间内变化。

5.一种实现权利要求1所述方法的制备具有内外水相梯度差囊泡的装置，其特征在于：该装置包括：

膜分离装置（1）和离子交换装置（2），所述的膜分离装置（1）具有由膜分隔为两个空间，一个空间流通透析介质，另一个空间流通囊泡混悬液，囊泡水化介质中的阳离子、阴离子、阴阳离子和/或荷电大分子物质可以从囊泡混悬液流动的空间透过膜进入透析介质中，而囊泡却不能或几乎不能透过膜；透析介质可进入或循环通过所述的离子交换装置（2），离子交换装置（2）可以选择性地交换或吸附透析介质中的阳离子、阴离子、阴阳离子和/或荷电大分子物质。

6.如权利要求5所述装置，其特征在于：透析介质可以在膜分离装置（1）和离子交换装置（2）间循环流动。

7.如权利要求5所述装置，其特征在于：所用的膜分离装置（1）选自：透析袋、中空纤维膜组件、切向流过滤膜组件、膜超滤柱组件，以及它们的组合。

8.如权利要求5所述装置，其特征在于：所用的膜分离装置（1）中膜的材质为：聚醚砜、三醋酸纤维素、聚四氟乙烯、聚砜；二醋酸纤维素、硝酸纤维素、二醋酸纤维素/硝酸纤维素共混物、纤维素、聚丙烯腈、芳香类和脂肪类的聚酰胺、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚酰亚胺、聚乙烯、聚丙烯、聚偏氟乙烯、聚氯乙烯、聚砜酰胺、氧化铝、二氧化锆、二氧化钛、二氧化硅、陶瓷、碳化硅、不锈钢、高分子金属络和物、分子筛复合物、沸石或玻璃。

9.如权利要求5所述装置，其特征在于：离子交换装置（2）选自：装填有离子交换剂的离子交换层析柱、装填有离子交换剂的离子交换槽、装填有离子交换剂的离子交换流化床、电渗析装置、微孔离子交换膜，以及它们的组合。

10.如权利要求9所述装置，其特征在于：所述的离子交换装置（2）中所用离子交换剂包括固体离子交换剂、液体离子交换剂、离子交换膜、离子交换纤维；阳离子交换树脂、阴离子交换树脂、两性离子交换树脂、螯合型和氧化还原型离子交换树脂、特种树脂；无机离子交换剂、有机离子交换剂以及它们的组合。

11.如权利要求5所述装置，其特征在于：膜分离装置（1）和离子交换装置（2）的工作温度可以调节。

12.权利要求1-5任一所述囊泡制备药物上的应用，其特征在于，所述应用包括：将制备的具内外水相梯度差的囊泡与药物或药物溶液混合，实现主动载药后即可获得药物制剂。

13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述药物为能采用pH梯度法、铵梯度法、醋酸钙梯度法和离子梯度-细胞离子载体法进行包封的药物。

14.权利要求1-5及12-13任一所述囊泡在制备脂质体凝胶上的应用。

15.权利要求1-5及12-13任一所述囊泡在制备磁性脂质体上的应用。

16.权利要求1-5及12-13任一所述囊泡在制备纳米粒/纳米凝胶上的应用。

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