CN103830182B - 一种长循环伊立替康脂质体组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物制剂领域，具体是涉及一种长循环伊立替康脂质体组合物包括伊立替康、氢化大豆磷脂酰胆碱或二硬酯酰磷脂酰胆碱、胆固醇、培化磷脂酰乙醇胺、金属螯合剂，其用重量组成分别为伊立替康1份，氢化大豆磷脂酰胆碱或二硬脂酰磷脂酰胆碱2~4份，胆固醇0.5～1.5份，培化磷脂酰乙醇胺0.4～1.2份，金属螯合剂0.0104～0.051份。本发明还公开了所述脂质体组合物的制备方法，及其制备伊立替康脂质体组合物注射剂的应用。本发明提供的伊立替康脂质体组合物及其制备方法，大大提高了伊立替康的载药率，包封率大于99.5%，可明显减少未包裹药物的毒副作用；有关物质低于0.5%，各毒性杂质限度低于0.1%，明显提高了该制剂的安全性，并且产品粒度分布均匀，稳定性良好。
Description
技术领域
本发明属于药物化学领域，具体是涉及一种长循环伊立替康脂质体组合物及其制备方法和应用。
背景技术
伊立替康（IrinotecanHydrochloride），化学名称为：(S)-4,11-二乙基-3,4,12,14-四氢-4-羟基-3,14-二氧代-1H-吡喃并[3',4':6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉-9-基1,4'-联哌啶-1'-羧酸酯，化学结构式为：
伊立替康的药理作用显示：在体外实验中，并未发现伊立替康或其代谢产物SN-38可被P-糖蛋白MDR有效识别，且显示出对阿霉素和长春花碱耐药的细胞系仍有细胞毒作用。另外，在体内实验中，伊立替康对鼠肿瘤模型显示了广谱的抗瘤活性(PO3胰导管腺癌，MA-16/C乳腺癌，C38和C51结肠腺癌)，并有抗人异种移植肿瘤的活性(Co-4结肠腺癌，MX-1乳腺癌，St-5和SC-6胃腺癌)。伊立替康对表达P-糖蛋白MDR的肿瘤(长春新碱和阿霉素耐药的P388白血病)也有抗瘤活性。
伊立替康是喜树碱的半合成衍生物。伊立替康为抑制细胞生长的拓扑异构酶I抑制剂(L-抗肿瘤和免疫抑制剂)。它在大多数组织中被羧酸酯酶代谢为SN-38，而后者作用于提纯的拓扑异构酶I的活性比伊立替康更强，且对几种鼠和人肿瘤细胞系的细胞毒性也强于伊立替康。SN-38或伊立替康可诱导单链DNA损伤，从而阻断DNA复制，由此产生细胞毒性。这种细胞毒性是时间依赖性的，并特异性作用于S期。现有研究提示，伊立替康的细胞毒作用归因于DNA合成过程中，复制酶与拓扑异构酶I-DNA-伊立替康（或SN-38）三联复合物相互作用，从而引起DNA双键断裂。哺乳动物细胞不能有效地修复这种DNA双键断裂。
伊立替康化学结构中存在饱和内酯环具有pH依赖性，在生理条件下会可逆的转变为其羧酸盐形式，而使抗瘤活性明显降低。国内现上市有伊立替康注射液及其冻干粉针制剂，临床上经静脉给药后，游离药物直接处于正常的生理环境下（pH值为7.35～7.45），其结构中的内酯环易发生水解反应转变为羧酸盐形式的开环杂质，从而使抗肿瘤活性大大降低。而且，伊立替康普通制剂胃肠道毒性大，主要表现为中性粒细胞减少和迟发性腹泻。
脂质体（liposomes）最初是由英国学者Bangham和Standish将磷脂分散进行电镜观察时发现的。脂质体作为一种药剂新技术，近年来的研究表明它具有如下优点：①水溶性及脂溶性两种类型药物都可包裹在同一脂质体中，药物包封率主要与药物本身的脂水相分配系数及膜材性状有关；②脂质体本身对人体无毒和免疫抑制作用；③脂质体在体内使药物具有定向分布的靶向性特性；④药物包裹在脂质体中是非共价键结合，而其他药物载体一般是以共价键与药物结合，进体内后与共价键结合的药物不易与载体脱落，影响疗效，而脂质体中的药物进入体内可在指定部位完全释放出来；⑤脂质体静脉给药时，离开血管进入细胞间质的机会很小，因为脂质体的粒径控制在50～200nm，正常内皮细胞间隙小于10nm，只有增生的肿瘤细胞间隙较大（＞200nm），200nm以下的脂质体容易通过发育不完善的血管壁进入癌组织，同时由于增生过快的肿瘤组织没有完善的淋巴体液回流系统，细胞外液的回流受限制，使得主药更容易储留于肿瘤组织，增加了在癌组织中的浓度，即癌组织血管的渗透储留效应（EPR效应），此现象存在于多种实体癌中，EPR效应促进了脂质体在肿瘤组织的选择性分布，可以增加药效并减少系统副作用；⑥药物被包封于脂质体中后，能够降低药物毒性作用，增强药理作用；⑦PEG化脂质体制剂能够降低药物的消除速度，延长药物作用时间。
专利申请CN200580017600.8公开了一种伊立替康制剂，其通过离子梯度法深度包埋伊立替康，制成脂质双层膜中只有外表面被含有亲水性高分子的表面修饰剂所修饰的脂质体。专利申请CN200610105371.1公开了一种pH梯度法制备长循环伊立替康脂质体的方法。专利申请CN200980154026.9公开了一种盐酸伊立替康脂质体及其制备方法，其中公开了离子梯度法制备含盐酸伊立替康、氢化大豆卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000的伊立替康脂质体，及包含该脂质体的注射剂。
虽然上述专利文献中记载的处方和方法已经基本上可以制备出包封率较好的脂质体，但都需要采用梯度法，或者说梯度溶液对伊立替康进行包埋，因此伊立替康脂质体的工艺及配方研究仍需要进一步优化，从而进一步提高伊立替康原料的利用率。
发明内容
为了提高伊立替康的生物利用度，更好地保障伊立替康的安全有效、质量可控性降低其毒副作用，增强其靶向性，发明人对伊立替康及其脂质体注射剂进行相关研究。本发明的目的之一是提供一种粒度分布合理、质量稳定的长循环伊立替康脂质体组合物，所提供的产品平均粒度在200nm以下，粒度分布（多相分散系数）在0.20以下，包封率在99.5%以上，有关物质在0.5%以下；同时还要其包封率、粒度及其分布、有关物质等关键质量属性长期稳定。
本发明提供一种长循环伊立替康脂质体组合物，其包含如下重量份的组分：
优选地，所述伊立替康脂质体组合物包含如下重量份的组分：
上述所述伊立替康脂质体组合物，其中：
所述伊立替康主药为伊立替康单体、其药学上可接受的盐或其药效上非劣性的衍生物。
所述培化磷脂酰乙醇胺，为聚乙二醇1000化磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇2000化磷脂酰乙醇胺或聚乙二醇5000化磷脂酰乙醇胺。
所述金属螯合剂优选为依地酸钙钠或依地酸二钠。
本发明还提供一种含上述长循环伊立替康脂质体组合物的注射制剂，其任选地还包含渗透压调节剂、抗氧剂等注射制剂辅料。
所述渗透压调节剂选自葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、山梨醇、甘露醇和右旋糖酐中的一种或几种；所述渗透压调节剂优选为4～10%的葡萄糖溶液。其用量以重量份计，为10～15份，优选为10～13份。
优选地，所述抗氧剂为α-生育酚；其用量以重量份计，优选为0.01～0.02份。
本发明还提供了一种上述组合物的制备方法，包括将氢化大豆磷脂酰胆碱或二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇和培化磷脂酰乙醇胺混合，加入有机溶剂溶解，冷冻干燥得冻干粉；将冻干粉加入硫酸铵溶液和金属螯合剂，乳化，均质，过中空纤维膜过滤系统去除未包裹的硫酸铵，得空白脂质体；加入伊立替康水溶液，充分孵化，过中空纤维膜过滤系统去除未包裹的伊立替康，除菌过滤，制得伊立替康脂质体。
本发明提供一种所述伊立替康脂质体组合物的制备方法的优选实施方案中，包括如下步骤：
（1）将氢化大豆磷脂酰胆碱或二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、培化磷脂酰乙醇胺和任选包含的抗氧剂加入有机溶剂中，搅拌分散均匀，冷冻干燥，得冻干粉；
（2）将冻干粉加入含金属螯合剂的硫酸铵溶液，经高剪切乳化机充分乳化，在45℃～60℃的条件下，通过均质机、纳米挤出机制备成空白脂质体，过中空纤维膜过滤系统去除未包裹的硫酸铵，得空白脂质体；
（3）将伊立替康在55℃～60℃下溶解于碱性物质溶液中得伊立替康溶液，pH值为6.5～7.0，加入步骤（2）制得的空白脂质体，充分孵化，孵化后样品继续过中空纤维膜过滤系统去除未包裹的伊立替康，浓缩样品，加入任选包含的渗透压调节剂至伊立替康浓度为4～6mg/ml，经除菌过滤，即得伊立替康脂质体组合物。
优选地，所述伊立替康脂质体组合物的制备方法中：
步骤（1）中所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、叔丁醇、异丙醇或二氯甲烷的一种或几种，优选叔丁醇、乙醇或其混合物。
步骤（1）中所述的冷冻干燥，去除有机溶剂包括预冻和升华干燥，其中预冻过程包括：冻干机的前箱的预冻温度为-35℃～-40℃，保温，保温期间冻干机的后箱的温度降至-40℃～-50℃；升华干燥过程中包括：在抽真空条件下，开机以每小时2℃～5℃升温升华干燥，当制品温度达18℃～25℃时，保持2～6小时，除去剩余有机溶剂及水分。
步骤（2）中所述的硫酸铵溶液优选为0.25mol/L的硫酸铵溶液。
步骤（3）中所述伊立替康溶液中伊立替康浓度优选为10mg/ml。
步骤（3）中所述的除菌过滤步骤优选为经0.22μm滤膜过滤。
步骤（3）中所述碱性物质优选为磷酸氢二钠、三乙胺、氢氧化钠、L-赖氨酸。
在本发明中还公开了另一伊立替康脂质体组合物的制备方法，具体包括如下步骤：
（1）将氢化大豆磷脂酰胆碱、胆固醇加入有机溶剂中，搅拌分散均匀，冷冻干燥，得冻干粉；
（2）将冻干粉加入含金属螯合剂的硫酸铵溶液，经乳化、均质，在45℃～60℃的条件下，通过纳米挤出机制备成粒度空白脂质体，过中空纤维膜过滤系统去除未包裹的硫酸铵，得空白脂质体；
（3）在50℃～60℃的温度下，加入培化磷脂酰乙醇胺溶液充分孵化，孵化时间为0.4～1h；
（4）将伊立替康在55℃～60℃下溶解于碱性物质溶液中得伊立替康溶液，pH值为6.5～7.0，加入步骤（2）制得的空白脂质体充分孵化，孵化后样品继续过中空纤维膜过滤系统去除未包裹的伊立替康，浓缩样品，加入任选包含的渗透压调节剂至伊立替康浓度为4～6mg/ml，经除菌过滤，即得伊立替康脂质体组合物。
优选地，所述的制备方法中，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、叔丁醇、异丙醇或二氯甲烷的一种或几种，优选叔丁醇、乙醇或其混合物。
步骤（1）中所述的冷冻干燥步骤，包括预冻和升华干燥，其中预冻过程包括：冻干机的前箱的预冻温度为-35℃～-40℃，保温，保温期间冻干机的后箱的温度降至-40℃～-50℃；升华干燥过程包括：在抽真空条件下，以每小时2℃～5℃升温升华干燥，当制品温度达18℃～25℃时，保持2～6小时，除去剩余有机溶剂及水分。
步骤（2）中所述的硫酸铵溶液优选为0.25mol/L的硫酸铵溶液。
步骤（4）中所述伊立替康溶液中伊立替康浓度优选为10mg/ml。
步骤（4）中所述碱性物质优选为磷酸氢二钠、三乙胺、氢氧化钠、L-赖氨酸。
步骤（4）中所述的除菌过滤步骤优选为经0.22μm滤膜过滤。
同时，针对含有本发明前述公开伊立替康脂质体组合物的伊立替康注射剂，本发明进一步公开了伊立替康注射剂的制备方法中，包括如下步骤：
（1）将氢化大豆磷脂酰胆碱或二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、培化磷脂酰乙醇胺和任选包含的抗氧剂加入有机溶剂中，搅拌分散均匀冷冻干燥，得冻干粉；
（2）将冻干粉加入含金属螯合剂的硫酸铵溶液，，充分乳化、均质，在45℃～60℃的条件下，通过纳米挤出机制备成空白脂质体，过中空纤维膜过滤系统去除未包裹的硫酸铵，得空白脂质体；
（3）将伊立替康在55℃～60℃下溶解于碱性物质溶液中得伊立替康溶液，pH值为6.5～7.0，加入步骤（2）制得的空白脂质体，充分孵化，孵化后样品继续过中空纤维膜过滤系统去除未包裹的伊立替康，浓缩样品，加入任选包含的渗透压调节剂至伊立替康浓度为4～6mg/ml；
（4）除菌过滤，滤液分装至西林瓶中，半加塞，冷冻干燥，充氮，压塞，即得伊立替康脂质体组合物。
优选地，所述的制备方法中，步骤（1）中所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、叔丁醇、异丙醇或二氯甲烷的一种或几种，优选叔丁醇、乙醇或其混合物。
步骤（1）中所述的冷冻干燥，去除有机溶剂包括预冻和升华干燥，其中预冻过程包括：冻干机的前箱的预冻温度为-35℃～-40℃，保温，保温期间冻干机的后箱的温度降至-40℃～-50℃；升华干燥过程中包括：在抽真空条件下，开机以每小时2℃～5℃升温升华干燥，当制品温度达18℃～25℃时，保持2～6小时，除去剩余有机溶剂及水分。
步骤（2）中所述的硫酸铵溶液优选为0.25mol/L的硫酸铵溶液。步骤（3）中所述伊立替康溶液中伊立替康浓度优选为10mg/ml。
步骤（3）中所述的除菌过滤步骤优选为经0.22μm滤膜过滤。
步骤（4）中所述冷冻干燥步骤的冻干曲线为：预冻温度-45～-40℃，预冻时间为2～6h；升华干燥过程中包括：-20～-15℃保温5h，0～5℃保温6～8h，18～22℃保温6～9h，24～26℃保温3～8h。冻干粉中水分含量控制在2%～10%，优选4%～6%。
步骤（4）中所述充氮步骤优选为充氮至压力为0.5×105Pa。
步骤（3）中所述碱性物质优选为磷酸氢二钠、三乙胺、氢氧化钠、L-赖氨酸。
同时，在本发明对伊立替康脂质体组合物进行研究的过程中，还意外地获得了一种药效优选的伊立替康衍生物，所述伊立替康衍生物为5-氟嘧啶化的伊立替康，其结构如下式所示：
本发明的另一方面还提供了一种上述5-氟嘧啶化的伊立替康的制备方法，包括将伊立替康和2-氯-5-氟嘧啶在有机溶液中，在氢化钠存在下反应制备得到。
本发明所提供的伊立替康脂质体组合物，通过磷脂双分子层膜包裹伊立替康，两层膜之间嵌入胆固醇，两层膜表面结合了培化磷脂酰乙醇胺，制备成脂质体。
发明人研究过程中发现，先将伊立替康溶于碱性物质溶液，然后与空白脂质体进行孵化包埋，意外地可以显著提高伊立替康跨膜进入脂质体内相的比例，大大提高载药率。
本发明中所述载药率与药学领域的载药率定义相同，是指包裹在脂质体内的药物与制备脂质体所使用的药物原料总量的百分比。
本发明制备的伊立替康脂质体组合物包封率大于99.5%，可明显减少未包裹药物的毒副作用；有关物质低于0.5%，各毒性杂质限度低于0.1%，明显提高了该制剂的安全性。
另一方面，发明人研究过程中发现，伊立替康脂质体制备工艺中的过滤，目前常用的是，通过切向流是把药液通过一定压力垂直打向超滤膜，该方法反向对脂质体溶液产生巨大冲击力，易导致脂质体产生蓄积及凝聚现象，导致脂质体有大粒径存在，大粒径脂质容易堵塞毛细血管，给制剂带来安全性隐患。本发明在优选的制备工艺中避免了切向流的使用，采用更缓和的乳化方式，脂质体在超滤纯化时不会产生强反作用力，在制备过程中能够保证稳定均一的状态。
同时，采用本发明得到的伊立替康脂质体，可以进一步提高制剂的稳定性，伊立替康长期稳定性放置12个月稳定性结果表明，脂质体粒径与包封率均基本未发生变化，有关物质含量也基本稳定。
动物试验结果表明，本发明的伊立替康脂质体组合物与市售普通注射剂比较，伊立替康呈缓慢释放状态，具有长循环功效，对肿瘤抑制率显著提高，毒性显著降低，其中高剂量组脂质体有九成以上的动物肿瘤完全消退，中剂量组有八成以上的动物肿瘤完全消退，普通伊立替康即便是达到动物的最大耐受剂量（该剂量远高于高剂量脂质体组）也是达不到如此好的抑制肿瘤效果的。
附图说明
图1是本发明伊立替康脂质体组合物与市售普通注射剂模拟人体血液环境（PBS，pH=7.4,37℃）开环杂质变化趋势图。
图2是本发明伊立替康脂质体组合物与市售普通注射剂模拟人体血液环境（PBS，pH=7.4,37℃）伊立替康变化趋势图。
图3是本发明伊立替康脂质体组合物粒度及粒度分布图。
图4是本发明伊立替康脂质体组合物形态图。
图5是本发明伊立替康脂质体组合物体内抗肿瘤药效试验结果。
具体实施方式
下面参照实施例进一步详细阐述本发明，但是本领域技术人员应当能够理解，本发明并不限于这些实施例以及使用的制备方法。而且，本领域技术人员根据本发明的描述可以对本发明进行对其等同的替换、组合、改进和修饰，但这些都将包括在本发明的范围内。
制备例
在0℃下，将60%的氢化钠（130mg，3.3mmol）加入到伊立替康（2.03g，3mmol）在DMF（20ml）的溶液中，室温下搅拌1h，然后加入2-氯-5-氟-嘧啶（440mg，3.3mmol），室温下继续搅拌1h。用TLC（10%甲醇的DCM溶液）监测反应。将反应后混合物用冷水淬灭并用乙酸乙酯萃取。将有机层用盐水溶液洗涤，用Na2SO4干燥并浓缩。用硅胶柱色谱法（4%甲醇的DCM溶液）纯化，得到353mg产物。
1HNMR(300MHz,CDCl3):δ1.03(t,J=7.3Hz,3H),1.37-1.49(m,J=7.3Hz,3H),1.49-1.70(m,2H),1.73-1.92(m,8H),2.05-2.30(m,2H),2.85-3.20(m,7H),3.20-3.48(m,2H),4.39-4.61(m,2H),5.26(s,2H),5.31(d,J=16.4Hz,1H),5.74(d,J=16.4Hz,1H),7.56(dd,J1=9.2Hz,J2=2.4Hz,1H)7.63(s,1H),7.82(d,J=2.4Hz,1H)8.21(d,J=9.2Hz,1H),8.35(s,1H),8.36(s,1H);
药效实施例
5-氟嘧啶化伊立替康，按制备例制备；
盐酸伊立替康注射液，市售辉瑞制药公司的开普拓。
配制方法：稀释剂全部选择5％葡萄糖注射液。
试验动物：BALB/cA裸小鼠，雌性，4-5周龄，体重18±2g，由中国科学院上海药物研究所提供，生产合格证编号：SCXK（沪）2008-0017。每组动物数：阴性对照组6只，给药组6只。
试验方法：取生长旺盛期的瘤组织剪切成1.5mm3左右，在无菌条件下，接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠皮下移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100～200mm3后将动物随机分组。5-氟嘧啶化伊立替康40mg/kg组每周静脉给药一次，连续给药三周。阳性对照药物CPT-1140mg/kg组，每周静脉给药一次，连续给药三周。溶剂对照组则给等量5％葡萄糖注射液。整个实验过程中，每周2次测量移植瘤直径，同时称量小鼠体重。肿瘤体积(tumorvolume,TV)的计算公式为：TV=1/2×a×b2，其中a、b分别表示长、宽。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积（relativetumorvolume，RTV），计算公式为：RTV=Vt/V0。其中V0为分笼给药时(即d0)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为1）相对肿瘤增殖率T/C(%)，计算公式如下：T/C(%)=(TRTV/CRTV)×100%，TRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV。检测结果见表1。
表1
试验结果：选择人胰腺癌Capan-1裸小鼠皮下移植瘤模型，评价5-氟嘧啶化伊立替康对其生长抑制作用。实验结果显示：5-氟嘧啶化伊立替康组对人胰腺癌Capan-1裸小鼠皮下移植瘤的生长具有非常显著的抑制作用，远优于同样给药剂量和方式的伊立替康注射液。实验过程中，5-氟嘧啶化伊立替康组与市售盐酸伊立替康注射液裸小鼠体重均有下降，但两者下降无显著差异，无小鼠死亡。鉴于此，为了进一步降低5-氟嘧啶化伊立替康毒性，将其制备成脂质体制剂具有很好的临床意义。
实施例1
处方：见表2
表2
制备工艺：
（1）将处方量的氢化大豆磷脂酰胆碱（HSPC）、胆固醇（CHOL）、α-生育酚、培化磷脂酰胆碱（DSPE-PEG2000）溶于10倍量（ml/g）的叔丁醇：乙醇＝（5：1）混合溶剂中，冷冻干燥，得冻干粉。
冷冻干燥步骤包括预冻和升华干燥，其中预冻过程中冻干机的前箱的预冻温度为-35℃～-40℃，保温，保温期间冻干机的后箱的温度降至-40℃～-50℃；升华干燥过程中，在抽真空条件下，开机以每小时2℃～5℃升温升华干燥，当制品温度达18℃～25℃时，保持2～6小时，除去剩余有机溶剂及水分。
（2）将上述冻干粉加入20倍体积的0.25mol/L硫酸铵溶液（溶解有处方量的依地酸钙钠），高剪切机剪切，充分乳化，之后采用均质机进一步控制其粒度及其分布（挤出器铺2张0.08μm聚碳酸酯膜，挤出3次）。采用中空纤维膜过滤系统透析空白脂质体，中间不断加入等渗的葡萄糖缓冲液，当渗出液约为原体积5倍时，停止透析，浓缩样品，即得空白脂质体。
（3）将盐酸伊立替康溶解于50℃～60℃的磷酸氢二钠的注射用水溶液中，调节pH为7.00，盐酸伊立替康浓度为10mg/ml，除菌过滤后，加入上述步骤（2）空白脂质体，边加边搅拌，搅拌速度为150rpm，充分孵化30min。
（4）将上述步骤（3）孵化好的药液再次过中空纤维膜过滤系统，去除未包裹的伊立替康，当渗出液约为原体积5倍时，停止透析，浓缩样品，即得盐酸伊立替康脂质体组合物（浓溶液）。
（5）将上述步骤（4）制得盐酸伊立替康脂质体组合物（浓溶液）通过加入葡萄糖缓冲液调整主药含量为5mg/ml，即得盐酸伊立替康脂质体组合物。
对照例1
处方：
制备工艺：
同实施例1，区别之处在于：依地酸钙钠在步骤（5）中加入。
将实施例1和对照例1所制得产品置于40℃条件下放置10天（D），测定其有关物质及溶血磷脂。结果见表3：
表3
根据实施例1和对照例1的考察，通过本发明实施例1中公开的制备工艺获得的长循环伊立替康脂质体组合物可以较好地维持盐酸伊立替康的稳定，同时，金属螯合剂与硫酸铵溶液在制备空白脂质体时加入可获得明显更加优异的稳定性效果。
实施例2
处方：
制备工艺：
同实施例1，其中步骤（3）中伊立替康溶液的选择见表3。
不同组别产品及性质见表4：
表4
| 伊立替康溶液 | 溶液pH值 | 载药率（%） |
| 水溶液 | 6.27 | 85.43 |
| 5%葡萄糖溶液 | 6.22 | 84.67 |
| 水溶液，磷酸氢二钠调节pH | 6.52 | 94.95 |
| 水溶液，磷酸氢二钠调节pH | 6.99 | 96.95 |
| 水溶液，三乙胺调节pH | 7.00 | 93.79 |
| 水溶液，L-赖氨酸调节pH | 7.00 | 94.43 |
| 水溶液，氢氧化钠调节pH | 7.50 | 92.37 |
实施例3超滤方法对产品影响的考察
处方：同实施例2处方；
制备工艺：同时实施例1，以磷酸氢二钠调节伊立替康溶液pH为7.0，过滤分别采用以下工艺，
工艺1：步骤（2）和（4）中的过滤步骤分别过中空纤维膜过滤系统，制得3批产品，分别为样品1、样品2、样品3；
工艺2：步骤（2）和（4）中的过滤步骤分别过切向流超滤装置，制得3批产品，分别为样品4、样品5、样品6；
所制得样品的粒度及分布见表5：
表5
| 样品名称 | 过滤压力（kgf/cm2） | 平均粒度（nm） | 粒度分布 |
| 样品1 | 2.5 | 101 | 0.02 |
| 样品2 | 2.5 | 103 | 0.03 |
| 样品3 | 2.5 | 100 | 0.02 |
| 样品4 | 4.5 | 117 | 0.11 |
| 样品5 | 5.0 | 119 | 0.13 |
| 样品6 | 4.5 | 116 | 0.09 |
根据表5数据可知，中空纤维膜过滤系统可以明显使得产品的粒度更均一，动态光散射显示为窄的单一峰；使用切向流制备的样品粒径分布广，动态光散射显示有两个峰，其中有大粒径峰存在，故使用中空纤维过滤系统所制得的产品用于临床更安全。
实施例4
制备工艺：
（1）将处方量的氢化大豆磷脂酰胆碱（HSPC）、胆固醇（CHOL）、α-生育酚、培化磷脂酰胆碱（DSPE-PEG2000）溶于10倍量（ml/g）的叔丁醇溶剂中，冷冻干燥，得冻干粉。
冷冻干燥去除有机溶剂包括预冻和升华干燥，其中预冻过程中冻干机的前箱的预冻温度为-25℃～-30℃，保温，保温期间冻干机的后箱的温度降至-25℃～-30℃；升华干燥过程中，在抽真空条件下，开机以每小时3℃～5℃升温升华干燥，当制品温度达20℃～25℃时，保持3～6小时，除去剩余有机溶剂及水分。（2）将上述冻干粉加入25倍体积的0.25mol/L硫酸铵溶液（溶解有处方量的依地酸钙钠），高剪切机剪切，充分乳化，之后采用均质机进一步控制其粒度及其分布（挤出器铺2张0.08μm聚碳酸酯膜，挤出3次）。采用中空纤维膜过滤系统透析空白脂质体，中间不断加入等渗的葡萄糖缓冲液，当渗出液约为原体积5倍时，停止透析，浓缩样品，即得空白脂质体。
（3）将盐酸伊立替康溶解于50℃～60℃的磷酸氢二钠的注射用水溶液中，调节pH为7.00，盐酸伊立替康浓度为10mg/ml，除菌过滤后，加入上述步骤（2）空白脂质体，边加边搅拌，搅拌速度为150rpm，充分孵化30min，在孵化过程中不断加入磷酸氢二钠调节pH值为7.00。
（4）将上述步骤（3）孵化好的药液再次过中空纤维膜过滤系统，去除未包裹的伊立替康，当渗出液约为原体积5倍时，停止透析，浓缩样品，即得盐酸伊立替康脂质体组合物（浓溶液）。
（5）将上述步骤（4）制得盐酸伊立替康脂质体组合物（浓溶液）通过加入葡萄糖缓冲液调整主药含量为5mg/ml，即得盐酸伊立替康脂质体组合物（溶液型），经0.22μm滤膜除菌过滤，滤液分装至西林瓶中，半加塞，冷冻干燥。
冷冻干燥步骤的冻干曲线为预冻温度-45～-40℃，预冻时间为2～6h；-20～-15℃保温5h；0～5℃保温6～8h；18～22℃保温6～9h；24～26℃保温3～8h。（6）冲氮至压力为0.5×105Pa，压塞，包装，制备成注射用冻干粉，即得盐酸伊立替康脂质体组合物。
实施例5
处方：
制备工艺：
（1）将处方量的氢化大豆磷脂酰胆碱（HSPC）、胆固醇（CHOL）、α-生育酚、溶于10倍量（ml/g）的叔丁醇溶剂中，冷冻干燥，得冻干粉。
冷冻干燥去除有机溶剂包括预冻和升华干燥，其中预冻过程中冻干机的前箱的预冻温度为-35℃～-40℃，保温，保温期间冻干机的后箱的温度降至-40℃～-50℃；升华干燥过程中，在抽真空条件下，开机以每小时2℃～5℃升温升华干燥，当制品温度达18℃～25℃时，保持2～6小时，除去剩余有机溶剂及水分。（2）将上述冻干粉加入20倍体积的0.25mol/L硫酸铵溶液（溶解有处方量的依地酸钙钠），高剪切机剪切，充分乳化，之后采用均质机进一步控制其粒度及其分布（挤出器铺2张0.08μm聚碳酸酯膜，挤出3次）。采用中空纤维膜过滤系统透析空白脂质体，中间不断加入等渗的葡萄糖缓冲液，当渗出液约为原体积5倍时，停止透析，浓缩样品。
（3）在空白脂质体中加入配制好的DSPE-PEG2000水溶液，搅拌孵化10min，过中空纤维过滤系统浓缩样品，即得空白脂质体。
（4）将5-氟嘧啶化伊立替康溶解于50℃～60℃的磷酸氢二钠的注射用水溶液中，调节pH为7.00，盐酸伊立替康浓度为10mg/ml，除菌过滤后，加入上述步骤（3）空白脂质体，边加边搅拌，搅拌速度为150rpm，充分孵化30min，在孵化过程中不断加入磷酸氢二钠调节pH值为7.00。
（5）将上述步骤（4）孵化好的药液再次过中空纤维膜过滤系统，去除未包裹的伊立替康，当渗出液约为原体积5倍时，停止透析，浓缩样品，即得5-氟嘧啶化伊立替康脂质体组合物（浓溶液）。
（6）将上述步骤（5）制得5-氟嘧啶化伊立替康脂质体组合物（浓溶液）通过加入葡萄糖缓冲液调整主药含量为5mg/ml，即得5-氟嘧啶化伊立替康脂质体组合物。
对照例2
处方：同实施例5
制备工艺：
（1）将处方量的氢化大豆磷脂酰胆碱（HSPC）、胆固醇（CHOL）、α-生育酚、溶于10倍量（ml/g）的叔丁醇溶剂中，冷冻干燥，得冻干粉。
冷冻干燥去除有机溶剂包括预冻和升华干燥，其中预冻过程中冻干机的前箱的预冻温度为-35℃～-40℃，保温，保温期间冻干机的后箱的温度降至-40℃～-50℃；升华干燥过程中，在抽真空条件下，开机以每小时2℃～5℃升温升华干燥，当制品温度达18℃～25℃时，保持2～6小时，除去剩余有机溶剂及水分。（2）将上述冻干粉加入20倍体积的0.25mol/L硫酸铵溶液（溶解有处方量的依地酸钙钠），高剪切机剪切，充分乳化，之后采用均质机进一步控制其粒度及其分布（挤出器铺2张0.08μm聚碳酸酯膜，挤出3次）。采用切向流超滤系统透析空白脂质体，中间不断加入等渗的葡萄糖缓冲液，当渗出液约为原体积5倍时，停止透析，浓缩样品。
（3）在空白脂质体中加入配制好的DSPE-PEG2000水溶液，搅拌孵化10min，过中空纤维过滤系统浓缩样品，即得空白脂质体。
（4）将盐酸伊立替康溶解于50℃～60℃的注射用水中，使其浓度为10mg/ml，除菌过滤后，加入上述步骤（3）空白脂质体，边加边搅拌，搅拌速度为150rpm，充分孵化30min。
（5）将上述步骤（4）孵化好的药液再次过切向流超滤系统，去除未包裹的伊立替康，当渗出液约为原体积5倍时，停止透析，浓缩样品，即得盐酸伊立替康脂质体组合物（浓溶液）。
（6）将上述步骤（5）制得盐酸伊立替康脂质体组合物（浓溶液）加入依地酸钙钠，通过加入葡萄糖缓冲液调整主药含量为5mg/ml，即得盐酸伊立替康脂质体组合物。
对照例3
处方：同实施例5
制备工艺：
（1）将处方量的氢化大豆磷脂酰胆碱（HSPC）、胆固醇（CHOL）、α-生育酚、溶于10倍量（ml/g）的叔丁醇溶剂中，冷冻干燥，得冻干粉。
冷冻干燥去除有机溶剂包括预冻和升华干燥，其中预冻过程中冻干机的前箱的预冻温度为-35℃～-40℃，保温，保温期间冻干机的后箱的温度降至-40℃～-50℃；升华干燥过程中，在抽真空条件下，开机以每小时2℃～5℃升温升华干燥，当制品温度达18℃～25℃时，保持2～6小时，除去剩余有机溶剂及水分。
（2）将上述冻干粉加入20倍体积的0.25mol/L硫酸铵溶液，高剪切机剪切，充分乳化，之后采用均质机进一步控制其粒度及其分布（挤出器铺2张0.08μm聚碳酸酯膜，挤出3次）。采用切向流超滤系统透析空白脂质体，中间不断加入等渗的葡萄糖缓冲液，当渗出液约为原体积5倍时，停止透析，浓缩样品。
（3）在空白脂质体中加入配制好的DSPE-PEG2000水溶液，搅拌孵化10min，过中空纤维过滤系统浓缩样品，即得空白脂质体。
（4）将盐酸伊立替康溶解于50℃～60℃的注射用水中，使其浓度为10mg/ml，除菌过滤后，加入上述步骤（3）空白脂质体，边加边搅拌，搅拌速度为150rpm，充分孵化30min，在孵化过程中不断加入磷酸氢二钠调节pH值为7.00。
（5）将上述步骤（4）孵化好的药液再次过切向流超滤系统，去除未包裹的伊立替康，当渗出液约为原体积5倍时，停止透析，浓缩样品，即得盐酸伊立替康脂质体组合物（浓溶液）。
（6）将上述步骤（5）制得盐酸伊立替康脂质体组合物（浓溶液）加入依地酸钙钠，通过加入葡萄糖缓冲液调整主药含量为5mg/ml，即得盐酸伊立替康脂质体组合物。
试验例1伊立替康脂质体与普通制剂在模拟人血环境体外释放度测试
将按实施例4制备得到的盐酸伊立替康脂质体组合物，与原料药（未制备成任何制剂形式）、普通制剂（采用市售盐酸伊立替康注射液）在模拟人血环境条件下比较主药及开环杂质的变化趋势。
配制浓度计算：人的体重为60kg，体表面积为1.62m2，一个正常人的血量约相当于体重7%～8%，计算血量为4800ml。盐酸伊立替康脂质体按120mg/m2给药，给药量为120*1.62=194.4mg。盐酸伊立替康脂质体在人血中的浓度为C=194.4/4800*1000=40.5μg/ml。因此，模拟人血环境下进行测试时，盐酸伊立替康原料药、盐酸伊立替康脂质体及普通制剂（即市售盐酸伊立替康注射液）的配置浓度均为40.5μg/ml。
采用PBS缓冲液模拟人体血液环境（pH=7.4，37℃），将原料药、盐酸伊立替康脂质体组合物、普通制剂（即市售盐酸伊立替康注射液）3个药物形式分别加入PBS缓冲液中，置于溶出仪的溶出杯中，调节温度为37℃±0.5℃，密闭，于100rpm条件下搅拌48h，于不同时间点取样，检测盐酸伊立替康的含量及其开环杂质的含量。3个药物形式分别加入PBS缓冲液中，置于溶出仪的溶出杯中，调节温度为37℃±0.5℃，密闭，于100rpm条件下搅拌，于不同时间点取样，检测盐酸伊立替康的含量及其开环杂质的含量。
HPLC检测方法：
柱温：40℃；
流速：1.5mL/min；
进样量：15μL；
UV检测器：检测波长255nm。
流动相：磷酸二氢钠缓冲液（2.8g/L的磷酸二氢钠一水合物）：甲醇：乙腈=590:240:170；
运行时间：20min。
三种药物形式的有效成分及开环杂质变化情况见表6，开环杂质及主成分的变化趋势分别见图1与图2.。
表6盐酸伊立替康脂质体及原料药、普通制剂在模拟人血环境活性成分变化趋势
试验例2产品质量测定
（1）粒度及其分布的测定
25℃条件下，取实施例4、5和对照例2、3的长循环伊立替康脂质体组合物，测定前继续对样品进行稀释（稀释倍数为20倍至100倍），稀释剂选择临床配伍用稀释溶液（5%葡萄糖），置于Nano-ZS（Marlvern）粒度测定仪的样品管中，测定粒度及其分布，实验结果见图3。
（2）形态学测定
磷钨酸负染法是透射电镜（TEM）观察制剂粒度分布和形态结构的常用方法之一。具体操作方法：取实施例4的长循环盐酸伊立替康脂质体组合物，测定前继续对样品进行稀释（稀释倍数为2000倍至10000倍），滴加在火棉胶作为支持膜的铜网上，用滤纸吸去多余样品，然后浸泡于2%磷钨酸溶液（用0.1M氢氧化钠调节pH到7.0）中染色3min。染色后的铜网自然晾干，用透射电镜观察脂质体的结构和粒度分布。脂质体粒子形态结果见图4。
（3）包封率和载药率的测定
将实施例4、5和对照例2、3制备的伊立替康脂质体组合物用葡萄糖磷酸盐缓冲液（pH＝6.5）稀释10倍。取脂质体溶液1ml于离心管中，加pH为6.5葡萄糖磷酸盐缓冲溶液至10ml，混匀，置于超速离心机下离心，离心速度为60000r·min-1，离心温度为10℃，离心时间为30min。取出上清液，置HPLC色谱仪下测定样品中含有伊立替康的量。HPLC法测定伊立替康脂质体组合物未包封的药物含量与总药物含量。包封率的测定采用下面的公式计算：
包封率（%）=脂质体所包封的伊立替康的量（mg）/脂质体溶液中伊立替康的总量（mg）×100%
载药率（%）=脂质体所包封的伊立替康的量（mg）/脂质体制备总所使用的伊立替康的总量（mg）×100%
（4）5-氟嘧啶化伊立替康含量及有关物质测定：
伊立替康脂质体注射剂含量测定方法采用HPLC法：
柱温：40℃；
流速：1.5mL/min；
进样量：15μL；
UV检测器：检测波长255nm。
流动相：磷酸二氢钠缓冲液（2.8g/L的磷酸二氢钠一水合物）：甲醇：乙腈=590:240:170；
运行时间：20min。
（5）影响因素试验
将实施例4、5和对照例2、3样品置于40℃条件下放置10D，测定其粒度及其分布、含量、有关物质、包封率、过氧化值及溶血磷脂。结果见表6：
表7
试验例3体内抑瘤试验
本发明所公开的含伊立替康脂质体组合物的伊立替康脂质体注射剂，按实施
例4制备；
盐酸伊立替康注射液，市售辉瑞制药公司的开普拓。
配制方法：稀释剂全部选择5％葡萄糖注射液。
试验动物：BALB/cA裸小鼠，雌性，4-5周龄，体重18±2g，由中国科学院上海药物研究所提供，生产合格证编号：SCXK（沪）2008-0017。每组动物数：阴性对照组12只，给药组6只。
试验方法：取生长旺盛期的瘤组织剪切成1.5mm3左右，在无菌条件下，接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠皮下移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100～200mm3后将动物随机分组。本发明所公开的含伊立替康脂质体组合物的伊立替康脂质体注射剂40mg/kg、20mg/kg、10mg/kg三个剂量组每周静脉给药一次，连续给药四周。阳性对照药物CPT-1140mg/kg组，每周静脉给药一次，连续给药四周。溶剂对照组则给等量空白脂质体注射液。整个实验过程中，每周2次测量移植瘤直径，同时称量小鼠体重。肿瘤体积(tumorvolume,TV)的计算公式为：TV=1/2×a×b2，其中a、b分别表示长、宽。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积（relativetumorvolume，RTV），计算公式为：RTV=Vt/V0。其中V0为分笼给药时(即d0)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为1）相对肿瘤增殖率T/C(%)，计算公式如下：T/C(%)=(TRTV/CRTV)×100%，TRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV。
试验结果：选择人胰腺癌Capan-1裸小鼠皮下移植瘤模型，评价伊立替康脂质体对其生长抑制作用。实验结果参考图5，结果显示：本发明所公开的含伊立替康脂质体组合物的伊立替康脂质体注射剂高、中、低（40、20、10mg/kg）三个剂量，每周静脉注射给药1次，连续4周，对人胰腺癌Capan-1裸小鼠皮下移植瘤的生长具有非常显著的抑制作用。高剂量伊立替康脂质体注射剂效果尤为显著，全部荷瘤小鼠的移植瘤完全消退，远优于同样给药方式的伊立替康注射液。实验过程中，裸小鼠体重改变与对照组无显著差异，无小鼠死亡。
Claims (10)
1.一种长循环伊立替康脂质体组合物，其特征在于，包含如下重量份的组分：
其中所述伊立替康主药为伊立替康单体、其药学上可接受的盐或其药效上非劣性的衍生物；
其中所述组合物的制备方法包括如下步骤：将氢化大豆磷脂酰胆碱或二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇和培化磷脂酰乙醇胺混合，加入有机溶剂溶解，冷冻干燥得冻干粉；将冻干粉加入硫酸铵溶液和金属螯合剂，乳化，均质，过中空纤维膜过滤系统去除未包裹的硫酸铵，得空白脂质体；加入伊立替康水溶液，充分孵化，过中空纤维膜过滤系统去除未包裹的伊立替康，除菌过滤，制得伊立替康脂质体；
所述伊立替康药效上非劣性的衍生物为5-氟嘧啶化伊立替康，所述5-氟嘧啶化伊立替康为下式化合物：
2.根据权利要求1所述的长循环伊立替康脂质体组合物，其特征在于，包含如下重量份的组分：
其中所述伊立替康为伊立替康单体、其药学上可接受的盐或其药效上非劣性的衍生物。
3.根据权利要求1所述的长循环伊立替康脂质体组合物，其特征在于，
所述培化磷脂酰乙醇胺为聚乙二醇1000化磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇2000化磷脂酰乙醇胺或聚乙二醇5000化磷脂酰乙醇胺；
所述金属螯合剂为依地酸钙钠或依地酸二钠。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的长循环伊立替康脂质体组合物，其特征在于，所述组合物的制备方法包括如下步骤：
(1)将氢化大豆磷脂酰胆碱或二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、培化磷脂酰乙醇胺和任选包含的抗氧剂加入有机溶剂中，搅拌分散均匀，冷冻干燥，得冻干粉；
(2)将冻干粉加入含金属螯合剂的硫酸铵溶液，经高剪切乳化机充分乳化，在45℃～60℃的条件下，通过均质机、纳米挤出机制备成空白脂质体，过中空纤维膜过滤系统去除未包裹的硫酸铵，得空白脂质体；
(3)将伊立替康在55℃～60℃下溶解于碱性物质溶液中得伊立替康溶液，pH值为6.5～7.0，加入步骤(2)制得的空白脂质体，充分孵化，孵化后样品继续过中空纤维膜过滤系统去除未包裹的伊立替康，浓缩样品，加入任选包含的渗透压调节剂至伊立替康浓度为4～6mg/ml，经除菌过滤，即得伊立替康脂质体组合物。
5.含有权利要求1～3中任意一项所述的长循环伊立替康脂质体组合物的脂质体注射剂。
6.根据权利要求5所述的长循环伊立替康脂质体注射剂，其特征在于：还包含渗透压调节剂、抗氧剂；所述渗透压调节剂选自葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、山梨醇、甘露醇和右旋糖酐中的一种或几种；其用量以重量份计为10～15份；所述抗氧剂为α-生育酚；其用量以重量份计为0.01～0.02份。
7.根据权利要求6所述的长循环伊立替康脂质体注射剂，其特征在于：所述渗透压调节剂为4～10％的葡萄糖溶液。
8.根据权利要求6所述的长循环伊立替康脂质体注射剂，其特征在于：所述渗透压调节剂的用量以重量份计为10-13份。
9.根据权利要求5中所述的长循环伊立替康脂质体注射剂，其特征在于，所述注射剂的制备方法包括如下步骤：
(1)将氢化大豆磷脂酰胆碱或二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、培化磷脂酰乙醇胺和任选包含的抗氧剂加入有机溶剂中，搅拌分散均匀冷冻干燥，得冻干粉；
(2)将冻干粉加入含金属螯合剂的硫酸铵溶液，充分乳化、均质，在45℃～60℃的条件下，通过纳米挤出机制备成空白脂质体，过中空纤维膜过滤系统去除未包裹的硫酸铵，得空白脂质体；
(3)将伊立替康在55℃～60℃下溶解于碱性物质溶液中得伊立替康溶液，pH值为6.5～7.0，加入步骤(2)制得的空白脂质体，充分孵化，孵化后样品继续过中空纤维膜过滤系统去除未包裹的伊立替康，浓缩样品，加入任选包含的渗透压调节剂至伊立替康浓度为4～6mg/ml；
(4)除菌过滤，滤液分装至西林瓶中，半加塞，冷冻干燥，充氮，压塞，即得伊立替康脂质体组合物。
10.根据权利要求1-3中任意一项所述的长循环伊立替康脂质体组合物，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将氢化大豆磷脂酰胆碱、胆固醇加入有机溶剂中，搅拌分散均匀，冷冻干燥，得冻干粉；
(2)将冻干粉加入含金属螯合剂的硫酸铵溶液，经乳化、均质，在45℃～60℃的条件下，通过纳米挤出机制备成粒度空白脂质体，过中空纤维膜过滤系统去除未包裹的硫酸铵，得空白脂质体；
(3)在50℃～60℃的温度下，加入培化磷脂酰乙醇胺溶液充分孵化，孵化时间为0.4～1h；
(4)将伊立替康在55℃～60℃下溶解于碱性物质溶液中得伊立替康溶液，pH值为6.5～7.0，加入步骤(2)制得的空白脂质体充分孵化，孵化后样品继续过中空纤维膜过滤系统去除未包裹的伊立替康，浓缩样品，加入任选包含的渗透压调节剂至伊立替康浓度为4～6mg/ml，经除菌过滤，即得伊立替康脂质体组合物。
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