CN101879144B - 吡柔比星或盐酸吡柔比星脂质体冻干剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了吡柔比星或盐酸吡柔比星脂质体冻干剂及其制备方法。该方法包括以下步骤：1)将下述组合物A或B的有机溶液与水混合，制备均相溶液；组合物A：由吡柔比星、磷脂和固醇组成；组合物B：由盐酸吡柔比星、磷脂和固醇组成；2)除去步骤1)中均相溶液中的有机溶剂，得到脂质体混悬液；3)将步骤2)的脂质体混悬液进行微射流处理，然后加入冻干支持剂，反复冻融后，冻干得到吡柔比星或盐酸吡柔比星脂质体冻干剂。采用本发明方法制备的吡柔比星或盐酸吡柔比星脂质体冻干剂的平均粒径小于300nm，包封率为90％以上，对血管的刺激性较小，对心脏等组织的毒副作用也较小，生物利用度较高。

Description

吡柔比星或盐酸吡柔比星脂质体冻干剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及吡柔比星或盐酸吡柔比星脂质体冻干剂及其制备方法。

背景技术

吡柔比星(THP)，别名吡喃阿霉素，属于蒽环类抗生素。吡柔比星抗癌作用的机理为：在细胞核迅速嵌入DNA核酸碱基对间，干扰转录过程，阻止mRNA的合成，抑制DNA聚合酶的活性，从而干扰DNA的合成。

目前，吡柔比星主要用于恶性淋巴瘤和急性白血病的治疗，还用于乳腺癌、头部颈癌、胃癌、泌尿系统等恶性肿瘤和卵巢癌、子宫内膜癌、子宫颈癌的治疗。单独使用吡柔比星的治疗有效率为20％-70％，吡柔比星与多种化合物如Ara-C、CTX、6-MP、MTX、5-FU、DDP等联合应用的抗癌作用会增加，但仍然存在严重不良反应，主要表现为：白细胞减少、血小板减少、轻度至中度的贫血、恶心和呕吐等。

在解决抗肿瘤药物的毒副作用方面，纳米脂质体载药系统是较好的选择。公开号为CN1931178A的专利中首次公开了“吡柔比星脂质体及其制备方法”，该制剂可以降低药物的毒副作用，并提高其抗肿瘤靶向性，初步体现了脂质体载药系统的优势；但其采用的薄膜挤压法制备工艺则无法满足工业化大规模生产的要求，因而限制了其大规模的应用。公开号为CN101181280A的专利中公开了一种“吡柔比星冻干制剂及其制备方法”，提供了吡柔比星长循环脂质体冻干制剂的制备方法，该制剂的稳定性好，抗肿瘤活性高，可以显著提高药物在肿瘤组织内的浓度，并能以较高的药物浓度在肿瘤组织中维持较长时间，然而其制备工艺也是采用薄膜挤压法，不能满足产业化的要求。

目前脂质体的制备方法主要有以下三大类：薄膜蒸发法，通过人为成膜将药物包埋进脂质体，因此限制了其大规模工业化生产的可行性；逆相蒸发法，需要制备混匀的油水两相体系，从而引入大量的有机溶剂，如氯仿、甲醇或乙醚等，不仅严重限制了其工业可操作性，另外残留溶剂对人体产生的隐患也是工业化不得不考虑的因素；单相溶液冻干法：即将药物和辅料混匀后直接冻干，该方法因其制备工艺简单在国内曾盛行一时，然而其中引入的有机溶剂叔丁醇也存在一定的安全隐患，并且该方法局限于利用沸点较低的药物制备脂质体，且倾向于制备亚微米级的脂质体。另外还有交叉流注入技术，该方法为澳大利亚Polymun Science公司的专利，国外很常用，但其需要特殊的仪器设备，且制备的是脂质体混悬液，相对于冻干剂而言，存在稳定性差、不易储存和运输等缺点。

发明内容

本发明的目的是提供吡柔比星或盐酸吡柔比星脂质体冻干剂及其制备方法。

本发明所提供的吡柔比星或盐酸吡柔比星脂质体冻干剂的制备方法，包括以下步骤：

1)将下述组合物A或B的有机溶液与水混合，制备均相溶液；

组合物A：由吡柔比星、磷脂和固醇组成；

组合物B：由盐酸吡柔比星、磷脂和固醇组成；

2)除去步骤1)中均相溶液中的有机溶剂，得到脂质体混悬液；

3)将步骤2)的脂质体混悬液进行微射流处理，然后加入冻干支持剂，反复冻融后，冻干得到吡柔比星或盐酸吡柔比星脂质体冻干剂。

上述方法中，所述吡柔比星或盐酸吡柔比星与磷脂、固醇的质量比为(8-9)∶(59-61)∶(20-21)，具体可为1∶7.5∶2.5。

上述方法中，所述磷脂为下述组合物a、b或c中的任意一种：

组合物a：由二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)和二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)组成；

组合物b：由二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和二棕榈酸磷脂酰甘油(DPPG)组成；

组合物c：由二肉豆蔻酰磷酯酰胆碱(DMPC)和二肉豆蔻酰磷酯酰甘油(DMPG)组成。

上述方法中，所述固醇为胆固醇、豆固醇、谷固醇或麦角固醇。

上述方法中，所述步骤1)中，所述组合物A或B的有机溶液是将组合物A或B分别溶于无水乙醇或叔丁醇中得到的有机溶液。

所述步骤1)中，所述组合物A或B的有机溶液与水的体积比为1∶(2-8)，具体可为1∶4。

所述步骤1)中，采用微射流或高压乳匀方法制备均相溶液。

所述微射流处理的条件为：25～30psig，6次循环。

上述方法中，所述步骤2)中，采用旋蒸法除去所述均相溶液中的有机溶剂。

上述方法中，所述步骤3)中，所述微射流处理的条件为：先将所述步骤2)的脂质体混悬液在60℃预热2-5分钟，然后95～100psig，5次循环；再65～70psig，6次循环；最后30～35psig，6次循环。

所述步骤3)中，所述冻干支持剂为乳糖或海藻糖，所述乳糖和所述磷脂的质量比至少为5∶1。

所述步骤3)中，所述冻融条件为-80℃冷冻12小时，再60℃融解；所述冻融的次数至少为5次。

采用上述方法制备的吡柔比星或盐酸吡柔比星脂质体冻干剂也属于本发明的保护范围。

本发明制备的吡柔比星或盐酸吡柔比星脂质体为冻干粉，用注射用水复溶后得到的脂质体混悬液为粉红色的澄清透明液体，平均粒径小于300nm，包封率为90％以上。本发明的吡柔比星或盐酸吡柔比星脂质体冻干剂可以大大降低其对血管的刺激性，减少对心脏等组织的毒副作用，并提高生物利用度。

本发明的制备吡柔比星或盐酸吡柔比星脂质体冻干剂的主要机理为：首先将吡柔比星或盐酸吡柔比星分别与磷脂、固醇溶解在醇水溶液中，借助微射流的高剪切作用，使磷脂、固醇和吡柔比星或盐酸吡柔比星混合的更加均匀，形成均相溶液；然后在氮气保护下减压旋蒸去除乙醇，在去除乙醇的同时，磷脂分子的疏水尾端重新排列，将吡柔比星或盐酸吡柔比星包裹入脂质体中，从而形成亚微米级的脂质体；随后的微射流可以对亚微米脂质体进行整核和重组；最后加入冻干保护剂，反复冻融后冻干得到吡柔比星或盐酸吡柔比星脂质体冻干剂。本发明的制备方法具有以下优点：工艺简单、工业可操作性强、安全性高、重现性较好、所有的制备条件均有固定的参数控制。

附图说明

图1为盐酸吡柔比星脂质体的冰冻蚀刻电镜图片(×19000)

图2为盐酸吡柔比星脂质体的粒径分布图

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1、盐酸吡柔比星脂质体冻干剂的制备

1)准确称取40mg盐酸吡柔比星、270mg二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、30mg二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)和100mg胆固醇溶于20ml无水乙醇中，超声溶解；然后在上述溶液中加入80ml水，采用微射流处理使之充分混合，得到均相溶液；微射流处理的条件为：25～30psig，6次循环。

2)将上述步骤1)的均相溶液在40℃进行减压旋蒸，除去无水乙醇，得到20ml的脂质体混悬液。

3)将上述步骤2)的脂质体混悬液进行微射流处理，处理前先将上述步骤2)的脂质体混悬液在60℃预热2-5分钟，然后95～100psig，5次循环；再65～70psig，6次循环；最后30～35psig，6次循环。

4)在上述步骤3)的溶液中加入2g乳糖，60℃搅拌使之混合均匀。

5)将上述步骤4)的混合溶液置于-80℃条件下冷冻12小时，然后在60℃条件下迅速融化并混匀，如此反复操作5次。最后置于冷冻干燥机中冻干，得到粉红色的盐酸吡柔比星脂质体冻干粉。冻干条件为：-60～-55℃、0.1～0.3psi、冻干24小时。

实施例2、盐酸吡柔比星脂质体冻干剂的制备

1)准确称取45mg盐酸吡柔比星、270mg二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、30mg二棕榈酸磷脂酰甘油(DPPG)和100mg胆固醇溶于20ml无水乙醇中，超声溶解；然后在上述溶液中加入40ml水，采用微射流处理使之充分混合，得到均相溶液；微射流处理的条件为：25～30psig，6次循环。

2)将上述步骤1)的均相溶液在40℃进行减压旋蒸，除去无水乙醇，得到20ml的脂质体混悬液。

3)将上述步骤2)的脂质体混悬液进行微射流处理，处理前先将上述步骤2)的脂质体混悬液在60℃预热2-5分钟，然后95～100psig，5次循环；再65～70psig，6次循环；最后30～35psig，6次循环。

4)在上述步骤3)的溶液中加入2g乳糖，60℃搅拌使之混合均匀。

5)将上述步骤4)的混合溶液置于-80℃条件下冷冻12小时，然后在60℃条件下迅速融化并混匀，如此反复操作5次。最后置于冷冻干燥机中冻干，得到粉红色的盐酸吡柔比星脂质体冻干粉。冻干条件为：-60～-55℃、0.1～0.3psi、冻干24小时。

实施例3、盐酸吡柔比星脂质体冻干剂的制备

1)准确称取40mg盐酸吡柔比星、275mg二肉豆蔻酰磷酯酰胆碱(DMPC)、25mg二肉豆蔻酰磷酯酰甘油(DMPG)和100mg胆固醇溶于20ml无水乙醇中，超声溶解；然后在上述溶液中加入160ml水，采用微射流处理使之充分混合，得到均相溶液；微射流处理的条件为：25～30psig，6次循环。

2)将上述步骤1)的均相溶液在40℃进行减压旋蒸，除去无水乙醇，得到20ml的脂质体混悬液。

3)将上述步骤2)的脂质体混悬液进行微射流处理，处理前先将上述步骤2)的脂质体混悬液在60℃预热2-5分钟，然后95～100psig，5次循环；再65～70psig，6次循环；最后30～35psig，6次循环。

4)在上述步骤3)的溶液中加入2g乳糖，60℃搅拌使之混合均匀。

5)将上述步骤4)的混合溶液置于-80℃条件下冷冻12小时，然后在60℃条件下迅速融化并混匀，如此反复操作5次。最后置于冷冻干燥机中冻干，得到粉红色的盐酸吡柔比星脂质体冻干粉。冻干条件为：-60～-55℃、0.1～0.3psi、冻干24小时。

实施例4、盐酸吡柔比星脂质体冻干剂的制备

1)准确称取45mg盐酸吡柔比星、270mg二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、30mg二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)和100mg豆固醇溶于20ml无水乙醇中，超声溶解；然后在上述溶液中加入60ml水，采用微射流处理使之充分混合，得到均相溶液；微射流处理的条件为：25～30psig，6次循环。

2)将上述步骤1)的均相溶液在40℃进行减压旋蒸，除去无水乙醇，得到20ml的脂质体混悬液。

3)将上述步骤2)的脂质体混悬液进行微射流处理，处理前先将上述步骤2)的脂质体混悬液在60℃预热2-5分钟，然后95～100psig，5次循环；再65～70psig，6次循环；最后30～35psig，6次循环。

4)在上述步骤3)的溶液中加入2g乳糖，60℃搅拌使之混合均匀。

5)将上述步骤4)的混合溶液置于-80℃条件下冷冻12小时，然后在60℃条件下迅速融化并混匀，如此反复操作5次。最后置于冷冻干燥机中冻干，得到粉红色的盐酸吡柔比星脂质体冻干粉。冻干条件为：-60～-55℃、0.1～0.3psi、冻干24小时。

实施例5、盐酸吡柔比星脂质体冻干剂的制备

1)准确称取45mg盐酸吡柔比星、275mg二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、30mg二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)和100mg豆固醇溶于20ml无水乙醇中，超声溶解；然后在上述溶液中加入100ml水，采用微射流处理使之充分混合，得到均相溶液；微射流处理的条件为：25～30psig，6次循环。

2)将上述步骤1)的均相溶液在40℃进行减压旋蒸，除去无水乙醇，得到20ml的脂质体混悬液。

3)将上述步骤2)的脂质体混悬液进行微射流处理，处理前先将上述步骤2)的脂质体混悬液在60℃预热2-5分钟，然后95～100psig，5次循环；再65～70psig，6次循环；最后30～35psig，6次循环。

4)在上述步骤3)的溶液中加入2g海藻糖，60℃搅拌使之混合均匀。

5)将上述步骤4)的混合溶液置于-80℃条件下冷冻12小时，然后在60℃条件下迅速融化并混匀，如此反复操作5次。最后置于冷冻干燥机中冻干，得到粉红色的盐酸吡柔比星脂质体冻干粉。冻干条件为：-60～-55℃、0.1～0.3psi、冻干24小时。

实施例6、盐酸吡柔比星脂质体冻干剂的制备

1)准确称取40mg盐酸吡柔比星、270mg二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、25mg二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)和100mg豆固醇溶于20ml叔丁醇中，超声溶解；然后在上述溶液中加入120ml水，采用微射流处理使之充分混合，得到均相溶液；微射流处理的条件为：25～30psig，6次循环。

2)将上述步骤1)的均相溶液在40℃进行减压旋蒸，除去叔丁醇，得到20ml的脂质体混悬液。

3)将上述步骤2)的脂质体混悬液进行微射流处理，处理前先将上述步骤2)的脂质体混悬液在60℃预热2-5分钟，然后95～100psig，5次循环；再65～70psig，6次循环；最后30～35psig，6次循环。

4)在上述步骤3)的溶液中加入2g乳糖，60℃搅拌使之混合均匀。

5)将上述步骤4)的混合溶液置于-80℃条件下冷冻12小时，然后在60℃条件下迅速融化并混匀，如此反复操作5次。最后置于冷冻干燥机中冻干，得到粉红色的盐酸吡柔比星脂质体冻干粉。冻干条件为：-60～-55℃、0.1～0.3psi、冻干24小时。

实施例7、吡柔比星或盐酸吡柔比星脂质体冻干粉的效果实验

观察上述实施例1制备的盐酸吡柔比星脂质体冻干粉的形态、分别测定其粒径及分布、测定包封率、稳定性、生物利用度、动物耐受性、潜在毒性、刺激性、过敏性和溶血性，具体的实验如下：

1、形态观察

将上述实施例1制备的盐酸吡柔比星脂质体冻干粉置于容器中，用液氮迅速冷冻，将冷冻后的盐酸吡柔比星脂质体冻干粉转移至冷冻蚀刻仪中，在3×10^-7mbar的高真空和-120℃条件下蚀刻样品；一分钟后，于45℃条件下喷Pt，然后再90℃条件下喷C；取出样品，放入水中，用铜网捞膜，晾干，置于电镜上观察并照相。

结果表明，电镜下，上述实施例1制备的盐酸吡柔比星脂质体冻干粉呈分散均匀的椭球形粒子，19000倍放大倍数下的冷冻蚀刻电镜图片如图1所示。

2、粒径及其分布测定

将上述实施例1制备的盐酸吡柔比星脂质体冻干粉溶于适量的注射用水中，用激光粒度散射仪测定其粒径及分布。盐酸吡柔比星脂质体的粒径分布图如图2所示。

实验设三次重复，结果表明，上述实施例1制备的盐酸吡柔比星脂质体的粒径分布均匀，平均粒径为128.6nm，多分散系数0.128，呈Gauss分布，符合脂质体的粒径要求。

3、稳定性测定

1)影响因素实验

将上述实施例1制备的盐酸吡柔比星脂质体冻干粉分别置于60℃烘箱和4℃冰箱中放置，分别于第0天、第5天和第10天末取样，用注射用水复溶，进行热循环实验。热循环实验的具体方法为：分别将60℃烘箱和4℃冰箱中放置0天、5天和10天的样品置于-20℃条件下放置2天，然后再加热到40℃放置两天。考察样品的外观性状、粒径分布、包封率和含量等。

实验设三次重复，结果表明，上述实施例1制备的盐酸吡柔比星脂质体冻干粉的各项指标均无明显变化，平均包封率大于90％。

2)加速实验

将上述实施例1制备的盐酸吡柔比星脂质体冻干粉置于隔水式电热恒温培养箱中，40℃放置6个月，分别于第0、1、2、3、6月的月末取样进行测定。考察样品的外观性状、粒径分布、包封率和含量等，同时于第6个月的月末进行无菌检查和热原检查。

实验设三次重复，结果表明，上述实施例1制备的盐酸吡柔比星脂质体冻干粉的粒径分布、包封率和含量等均无明显的变化。

4、生物利用度和靶向性试验

取昆明种雄性小鼠(体重为18～22g)，给药前12小时禁食，自由饮水，按小鼠体重折合计算给药剂量，约为0.4mg/20g体重。其中10组小鼠(每组10只)尾静脉注射上述实施例1制备的盐酸吡柔比星脂质体冻干粉，另外10组小鼠(每组10只)尾静脉注射相同剂量的市售注射用盐酸吡柔比星冻干粉做为对照组。实验组和对照组小鼠分别于给药后2min、5min、7min、10min、15min、30min、45min、60min、90min、120min摘眼球取血，取血后立即将小鼠断颈处死，并迅速取心脏、肝、脾、肺、肾等组织样品。参照生物样品处理方法处理样品，采用内标法计算心脏、肝、脾、肺和肾中盐酸吡柔比星的浓度，采用HPLC法测定小鼠血浆中盐酸吡柔比星的血药浓度，以此评价上诉实施例1制备的盐酸吡柔比星脂质体冻干粉的生物利用度和靶向性。

色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，检测波长为254nm，以乙腈-0.4％的醋酸氨缓冲盐(35∶65)为流动相，流速为0.8ml/min。

实验设三次重复，结果表明，实验组小鼠的肺和脾组织中盐酸吡柔比星脂质体的浓度较高，而心脏、肾和肝组织中盐酸吡柔比星脂质体的浓度很低；而对照组小鼠的肺、心脏和肾组织的盐酸吡柔比星脂质体的浓度均较高。说明上述实施例1制备的盐酸吡柔比星脂质体比市售注射用盐酸吡柔比星冻干粉的生物利用度高，但无显著性差异(P＞0.05)，总的而言，盐酸吡柔比星脂质体在小鼠体内的生物分布发生了改变，相对于市售注射用盐酸吡柔比星冻干粉而言，上述实施例1制备的盐酸吡柔比星脂质体冻干粉的毒副作用更小，安全性更高、利用度更高。

5、动物的耐受性和潜在毒性试验

选择健康的昆明种雌性小鼠(体重为18～22克)，随机分为两组(实验组和对照组)，每组4只小鼠，按小鼠体重折合计算给药剂量，约为30mg/kg体重。实验组小鼠尾静脉注射上述实施例1制备的盐酸吡柔比星脂质体冻干粉，对照组小组尾静脉注射相同剂量的市售注射用盐酸吡柔比星冻干粉(购自深圳万乐药业有限公司，规格：10mg)。给药后25天内观察药物的潜在毒性和耐受性，包括体重的改变。

实验设三次重复，结果表明，从体重的减少以及给药时小鼠的生理反应来看，尾静脉注射市售注射用盐酸吡柔比星冻干粉(购自深圳万乐药业有限公司，规格：10mg)后，小鼠尾巴通红，体温明显降低(小鼠打寒战)，50％的小鼠抽搐而死，而存活的小鼠部分皮毛脏乱、不柔顺、无生气、萎靡不振，实验结束时体重显著减轻，体重减少最高可达23％；而尾静脉注射上述实施例1制备的盐酸吡柔比星脂质体冻干粉的小鼠100％能存活下来，个别小鼠出现短暂的抽搐，但很快能恢复过来，实验前期小鼠体重略微减轻，但基本上能恢复过来，并有所增加，体重增加最高可达4％。说明相对于市售注射用盐酸吡柔比星冻干粉(购自深圳万乐药业有限公司，规格：10mg)而言，上述实施例1制备的盐酸吡柔比星脂质体冻干粉更为安全。

6、刺激性、过敏性和溶血性试验

选取豚鼠，体重250-300g，雌雄各半；选取大耳家兔，体重2.5-2.8kg，雄性。

1)血管刺激性试验

取家兔6只，雄性、体重2.5-2.8kg，随机分为两组，每组三只。实验组家兔每天于耳缘静脉缓慢注射上述实施例1制备的盐酸吡柔比星脂质体5.0ml，对照组家兔注射相同剂量的质量百分含量为0.9％的氯化钠溶液，每天注射一次，连续注射三天，于末次给药后30分钟处死家兔，剪取注射部位耳，标记后放入体积百分含量为10％的甲醛溶液中固定，石蜡包埋、切片、HE染色，光镜下观察血管有无变形和组织坏死。

实验设三次重复，结果表明，光镜下观察，实验组家兔的血管无变形和坏死，说明上述实施例1制备的盐酸吡柔比星脂质体对血管无明显刺激性。

2)过敏性试验

取豚鼠18只，体重250-300g，雌雄各半，随机分为实验组、阴性对照组和阳性对照组，每组6只豚鼠。实验组豚鼠每两天腹腔注射上述实施例1制备的盐酸吡柔比星脂质体，约1.4ml/只；阴性对照组豚鼠每两天腹腔注射质量百分含量为0.9％的氯化钠溶液，约1.4ml/只；阳性对照组豚鼠每两天腹腔注射质量百分含量为5％的卵蛋白溶液，约1.4ml/只。连续注射三次，然后再将实验组、阴性对照组和阳性对照组豚鼠分别随机分成两小组，每小组3只豚鼠，第一小组于注射后第14天、第二小组于注射后第21天，分别由耳缘静脉注射上述实施例1制备的盐酸吡柔比星脂质体1ml，注射上述实施例1制备的盐酸吡柔比星脂质体后15分钟内豚鼠有竖毛、呼吸困难、喷嚏、干咳或咳嗽3声等现象中的两种或两种以上者，或者有罗音、抽搐、虚脱或死亡现象之一者，判断为有过敏现象。

实验设三次重复，结果表明，实验组豚鼠于首次注射后第14d，再由耳缘静脉注射上述实施例1制备的盐酸吡柔比星脂质体1ml，15分内3只豚鼠均未出现明显的颤抖、竖毛、咳嗽、呼吸困难、痉挛、抽搐乃至死亡现象；实验组豚鼠于首次注射后第21d，再由耳缘静脉注射上述实施例1制备的盐酸吡柔比星脂质体1ml，15分内3只豚鼠仍未出现明显的颤抖、竖毛、咳嗽、呼吸困难、抽搐乃至死亡现象；说明上述实施例1制备的盐酸吡柔比星脂质体对豚鼠没有致敏性。

3)溶血性试验

取家兔血10ml，放入洁净的盛有玻璃球的三角烧杯中振摇10min，除去纤维蛋白原，然后加入约10倍体积的质量百分含量为0.9％的氯化钠溶液，摇匀，3000r/min离心，弃去上清液，得到红细胞沉淀；将红细胞沉淀再用0.9％的氯化钠溶液反复洗涤至无红色为止；量取血球，用0.9％的氯化钠溶液配制成2％红细胞悬液。

取洁净试管7支，按表1的配比量加入上述制备的2％红细胞悬液和0.9％的氯化钠溶液；混匀后，于37℃恒温水浴中放置30min，然后再分别加入不同量的上述实施例1制备的盐酸吡柔比星脂质体，第6支试管不加盐酸吡柔比星脂质体作为阴性对照，第7支试管也不加盐酸吡柔比星脂质体，而将0.9％的氯化钠溶液改为蒸馏水，做阳性对照；各试管均摇匀后，置于37℃恒温水浴中，观察放入后15min、30min、45min、1h、2h、3h、4h内有无溶血和红细胞凝集现象。

实验设三次重复，结果表明，在观察时间内，实验组和对照组均未无溶血和红细胞凝集现象。

表1红细胞悬液和氯化钠溶液的配比量

试管编号	1	2	3	4	5	6	7
								2％红细胞悬液(ml)	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5
0.9％的氯化钠溶液(ml)	2.0	2.1	2.2	2.3	2.4	2.5	-
								盐酸吡柔比星脂质体(ml)	0.5	0.4	0.3	0.2	0.1	-	-
蒸馏水(ml)	-	-	-	-	-	-	2.5

同时还对上述实施例2-6制备的盐酸吡柔比星脂质体冻干剂进行了形态观察、稳定性、生物利用度和靶向性、动物耐受性和潜在毒性、刺激性、过敏性和溶血性实验，结果表明，实施例2-6制备的盐酸吡柔比星脂质体冻干剂与实施例1制备的盐酸吡柔比星脂质体冻干剂的效果无明显差异。

Claims (55)

1.吡柔比星或盐酸吡柔比星脂质体冻干剂的制备方法，包括以下步骤：

1)将下述组合物A或B的有机溶液与水混合，制备均相溶液；

组合物A：由吡柔比星、磷脂和固醇组成；

组合物B：由盐酸吡柔比星、磷脂和固醇组成；

2)除去步骤1)中均相溶液中的有机溶剂，得到脂质体混悬液；

3)将步骤2)的脂质体混悬液进行微射流处理，然后加入冻干支持剂，反复冻融后，冻干得到吡柔比星或盐酸吡柔比星脂质体冻干剂；

所述步骤1)中，采用微射流方法制备均相溶液；所述微射流处理的条件为：25～30psig，6次循环；

所述步骤3)中，所述微射流处理的条件为：先将所述步骤2)的脂质体混悬液在60℃预热2-5分钟，然后95～100psig，5次循环；再65～70psig，6次循环；最后30～35psig，6次循环。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述吡柔比星或盐酸吡柔比星与磷脂、固醇的质量比为(8-9)∶(59-61)∶(20-21)。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述吡柔比星或盐酸吡柔比星与磷脂、固醇的质量比为1∶7.5∶2.5。

4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：所述磷脂为下述组合物a、b或c中的任意一种：

组合物a：由二硬脂酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰磷脂酰甘油组成；

组合物b：由二棕榈酰磷脂酰胆碱和二棕榈酰磷脂酰甘油组成；

组合物c：由二肉豆蔻酰磷酯酰胆碱和二肉豆蔻酰磷酯酰甘油组成。

5.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：所述固醇为胆固醇、豆固醇、谷固醇或麦角固醇。

6.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述组合物A或B的有机溶液是将组合物A或B分别溶于无水乙醇或叔丁醇中得到的有机溶液。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述组合物A或B的有机溶液是将组合物A或B分别溶于无水乙醇或叔丁醇中得到的有机溶液。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述组合物A或B的有机溶液是将组合物A或B分别溶于无水乙醇或叔丁醇中得到的有机溶液。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述组合物A或B的有机溶液与水的体积比为1∶(2-8)。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述组合物A或B的有机溶液与水的体积比为1∶4。

11.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述组合物A或B的有机溶液与水的体积比为1∶(2-8)。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述组合物A或B的有机溶液与水的体积比为1∶4。

13.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述组合物A或B的有机溶液与水的体积比为1∶(2-8)。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：所述组合物A或B的有机溶液与水的体积比为1∶4。

15.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，采用旋蒸法除去所述均相溶液中的有机溶剂。

16.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述冻干支持剂为乳糖或海藻糖；所述乳糖和所述磷脂的质量比至少为5∶1。

17.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述冻干支持剂为乳糖或海藻糖；所述乳糖和所述磷脂的质量比至少为5∶1。

18.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述冻干支持剂为乳糖或海藻糖；所述乳糖和所述磷脂的质量比至少为5∶1。

19.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述冻干支持剂为乳糖或海藻糖；所述乳糖和所述磷脂的质量比至少为5∶1。

20.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述冻干支持剂为乳糖或海藻糖；所述乳糖和所述磷脂的质量比至少为5∶1。

21.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述冻干支持剂为乳糖或海藻糖；所述乳糖和所述磷脂的质量比至少为5∶1。

22.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述冻干支持剂为乳糖或海藻糖；所述乳糖和所述磷脂的质量比至少为5∶1。

23.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述冻干支持剂为乳糖或海藻糖；所述乳糖和所述磷脂的质量比至少为5∶1。

24.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述冻干支持剂为乳糖或海藻糖；所述乳糖和所述磷脂的质量比至少为5∶1。

25.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述冻干支持剂为乳糖或海藻糖；所述乳糖和所述磷脂的质量比至少为5∶1。

26.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述冻干支持剂为乳糖或海藻糖；所述乳糖和所述磷脂的质量比至少为5∶1。

27.根据权利要求14所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述冻干支持剂为乳糖或海藻糖；所述乳糖和所述磷脂的质量比至少为5∶1。

28.根据权利要求15所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述冻干支持剂为乳糖或海藻糖；所述乳糖和所述磷脂的质量比至少为5∶1。

29.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述冻融条件为-80℃冷冻12小时，再60℃融解；所述冻融的次数至少为5次。

30.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述冻融条件为-80℃冷冻12小时，再60℃融解；所述冻融的次数至少为5次。

31.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述冻融条件为-80℃冷冻12小时，再60℃融解；所述冻融的次数至少为5次。

32.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述冻融条件为-80℃冷冻12小时，再60℃融解；所述冻融的次数至少为5次。

33.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述冻融条件为-80℃冷冻12小时，再60℃融解；所述冻融的次数至少为5次。

34.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述冻融条件为-80℃冷冻12小时，再60℃融解；所述冻融的次数至少为5次。

35.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述冻融条件为-80℃冷冻12小时，再60℃融解；所述冻融的次数至少为5次。

36.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述冻融条件为-80℃冷冻12小时，再60℃融解；所述冻融的次数至少为5次。

37.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述冻融条件为-80℃冷冻12小时，再60℃融解；所述冻融的次数至少为5次。

38.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述冻融条件为-80℃冷冻12小时，再60℃融解；所述冻融的次数至少为5次。

39.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述冻融条件为-80℃冷冻12小时，再60℃融解；所述冻融的次数至少为5次。

40.根据权利要求14所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述冻融条件为-80℃冷冻12小时，再60℃融解；所述冻融的次数至少为5次。

41.根据权利要求15所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述冻融条件为-80℃冷冻12小时，再60℃融解；所述冻融的次数至少为5次。

42.根据权利要求16所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述冻融条件为-80℃冷冻12小时，再60℃融解；所述冻融的次数至少为5次。

43.根据权利要求17所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述冻融条件为-80℃冷冻12小时，再60℃融解；所述冻融的次数至少为5次。

44.根据权利要求18所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述冻融条件为-80℃冷冻12小时，再60℃融解；所述冻融的次数至少为5次。

45.根据权利要求19所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述冻融条件为-80℃冷冻12小时，再60℃融解；所述冻融的次数至少为5次。

46.根据权利要求20所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述冻融条件为-80℃冷冻12小时，再60℃融解；所述冻融的次数至少为5次。

47.根据权利要求21所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述冻融条件为-80℃冷冻12小时，再60℃融解；所述冻融的次数至少为5次。

48.根据权利要求22所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述冻融条件为-80℃冷冻12小时，再60℃融解；所述冻融的次数至少为5次。

49.根据权利要求23所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述冻融条件为-80℃冷冻12小时，再60℃融解；所述冻融的次数至少为5次。

50.根据权利要求24所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述冻融条件为-80℃冷冻12小时，再60℃融解；所述冻融的次数至少为5次。

51.根据权利要求25所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述冻融条件为-80℃冷冻12小时，再60℃融解；所述冻融的次数至少为5次。

52.根据权利要求26所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述冻融条件为-80℃冷冻12小时，再60℃融解；所述冻融的次数至少为5次。

53.根据权利要求27所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述冻融条件为-80℃冷冻12小时，再60℃融解；所述冻融的次数至少为5次。

54.根据权利要求28所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述冻融条件为-80℃冷冻12小时，再60℃融解；所述冻融的次数至少为5次。

55.按照权利要求1-54中任一所述的方法制备的吡柔比星或盐酸吡柔比星脂质体冻干剂。

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