CN101601642A - 一种囊泡类给药系统及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物制剂领域，公开一种囊泡类给药系统，其采用下述方法制备，所述方法依次包括(1)以表面活性物质为基本膜材、以含氮原子的多阴离子化合物溶液为水化介质制备获得空白囊泡；(2)空白囊泡建立跨膜梯度即可，其中，所述含氮原子的多阴离子化合物为一类分子结构中含有氮原子及下述两个以上阴离子的化合物：羧基、硫酸基、磺酸基、磷酸基、枸橼酸基或膦酸基。本发明方法建立的给药系统具有载药范围广、药物包封率高及稳定性好的特点，并可降低药物毒性。

Description

一种囊泡类给药系统及其应用

技术领域

本发明涉及药物制剂领域，具体涉及一种囊泡类给药系统及其应用。

背景技术

某些两亲性分子，如许多天然的或合成的表面活性物质，可以在一定条件下制备成为具有内室的囊泡(vesicle)(如脂质体(liposome)、类脂质体(niosome)等)。如果所采用的表面活性物质为磷脂类物质，则形成一类具有封闭双层结构的分子有序组合体，称为脂质体(liposome)。由于囊泡的独特封闭结构，可以采用适当方法在内室与外水相之间建立梯度，从而主动装载(active loading)化合物，提高该化合物的包封率与稳定性。下面以脂质体与阿霉素为例做进一步阐释和说明。

脂质体是由单个或多个脂质双层包裹亲水内核组成的。与其他的药物载体系统相比，脂质体具有独特的优势：(1)脂质体的主要成分是磷脂和胆固醇，为哺乳动物细胞膜的天然成分，具有生物相容性，可生物降解、无毒性和无免疫原性；(2)脂质体的大小、成分、表面电荷等有很大的选择空间；(3)脂质体能包裹亲水性和亲脂性药物，将药物包封入脂质体中，可保护药物在体内不被降解，同时避免药物对受体识别配体的干扰；(4)易获得适宜的药物-载体比，制备简单。

脂质体作为药物载体临床应用较早，发展较为完善。目前已有产品上市，如阿霉素脂质体(

及

)、柔红霉素脂质体

和阿糖胞苷脂质体

等。

盐酸阿霉素(Doxorubicin Hydrochloride，以下简称DOX)是蒽环类广谱抗肿瘤药，由Farmitilia Resear Laboratories从一种链霉(Strepto-myces peucetius var.Caesius)的发酵液中提炼出来的。DOX对机体可产生广泛的生物化学效应，具有强烈的细胞毒性。临床上用于急性白血病(淋巴细胞性和粒细胞性)、霍奇金病及恶性淋巴瘤、乳腺癌、支气管肺癌、卵巢癌、软组织肉瘤、成骨肉瘤、横纹肌肉瘤、尤文肉瘤、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、膀胱癌、甲状腺癌、前列腺癌、头颈部鳞癌、睾丸癌、胃癌、肝癌等，是肝癌化疗的一线药物。一般认为，DOX的抗肿瘤机理是DOX能直接嵌入DNA核碱对之间，干扰转录过程，阻止mRNA的形成，起到抗肿瘤作用。DOX既能抑制DNA的合成又抑制RNA的合成，对S期作用最强，对M、G1和G2期也有作用，为细胞周期非特异性药物。此外，DOX还可导致自由基的生成，诱导DNA和细胞膜破坏，还能抑制拓扑异构酶II，使得DNA的复制效率低。对乏氧细胞也有作用。

DOX对肿瘤细胞具有强烈细胞毒性，对全身其他组织也可以造成严重损伤。目前临床上使用的DOX主要不良反应是常见脱发、骨髓抑制(白细胞约于用药后10～14日下降至最低点)和心肌毒性(发生率6～30％，可导致各种心律失常、心肌不可逆损伤乃至充血性心衰)。并且心肌毒性的发生率和严重程度与阿霉素累积量成正比，迟发的严重喷射性心力衰竭大多在用药半年后或总剂量逾700mg时发生。常见恶心、呕吐、口腔炎、食道炎、注射位点的毒性(Cancer Investigation，19(4)：424-436(2001))及白细胞减少、脱发，并应警惕充血性心力衰竭的可能，有时可发生猝死。亦可出现胃痛、腹泻或全胃肠炎、高尿酸血症和肾脏损害等。静脉外溢可出现疼痛、组织坏死甚至蜂窝组织炎。严重的不良反应，尤其是心脏毒性严重制约了DOX的临床应用和剂量提高。

多年来药学工作者一直致力于寻找降低DOX毒性的有效方法，如调整给药方案，研发减轻DOX心脏毒性的药物，研制心脏毒性较低的DOX类似物(如表阿霉素)，通过合并用药来减轻其心脏毒性及研制DOX新剂型(例如脂质体、微球、磁性微球、毫微粒、乳剂)等，其中最为成功的是DOX脂质体的研制成功。上世纪70年代末开始研究用脂质体作为蒽环类抗癌药载体，脂质体主要分布于网状内皮系统，可以有效减少药物在心脏中的分布，降低毒性。80年代末期开始进行临床试验，初步结果表明DOX经脂质体包封后，剂量可以加大，毒性作用减少，半衰期明显延长。

由于DOX属水溶性，传统的脂质体制备方法包封率很低，因而无法达到降低毒性的目的。采用建立pH梯度、(NH₄)₂SO₄梯度等方法来制备DOX脂质体，可以提高DOX的包封率。“质子池”是经典(NH₄)₂SO₄梯度法主动装载DOX进入脂质体的机理之一，要求阳离子与阴离子有足够的跨膜速率差异，例如，NH₃跨膜速率远远大于SO₄ ^2-，且NH₃和SO₄ ^2-的渗透系数(P)也有很大的差异(SO₄ ^2-：P＜0.01cm·s^-1；NH₃：P＝0.13cm·s^-1)，这样才能制造质子足够丰富的酸性脂质体内部环境，为DOX质子化提供条件。另外，DOX可以与阴离子在脂质体内部形成低溶解性的复合物也是保证药物有效包封的必要条件之一。

发明内容

针对现有技术中的(NH₄)₂SO₄梯度法等存在的诸如载药范围不广，需要(NH₄)₂SO₄的浓度与梯度大，药物的包封率与稳定性均有待改善等问题，本发明的目的是提供一种囊泡类给药系统的制备方法，能快速建立囊泡跨膜梯度，实现主动载药，并有效提高药物的包封率和稳定性。

本发明是通过如下技术方案实现的：

发明概述

本发明所述的囊泡类给药系统是通过如下方法的制备的，该方法依次包括下述步骤：

(1)以表面活性物质为基本膜材、以含氮原子的多阴离子化合物溶液为水相(即水化介质)制备获得空白囊泡；

(2)空白囊泡建立跨膜梯度即可，

其中，所述含氮原子的多阴离子化合物为一类分子结构中含有氮原子及下述两个以上阴离子的化合物：羧基、硫酸基、磺酸基、磷酸基、枸橼酸基或膦酸基。

上述的囊泡类是指具有内室囊状结构的物质，如囊泡、脂质体等等。

本发明囊泡膜材以表面活性物质为基本膜材，包括适宜的离子型与非离子型表面活性剂、大分子物质，如各种磷脂及其衍生物，脱水山梨醇脂肪酸酯类、聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯类、还可选甾醇类及其衍生物，以及其它必要膜材。

上述跨膜梯度为本专业领域中概念，即囊泡内外水相的成分、浓度梯度；空白囊泡水化介质中含有可交换的各种阳离子或者阴离子或者阴阳两种离子，离子种类可以是一种或者两种或者两种以上，以任意比例混合的任意浓度。建立跨膜梯度的方法可按照现有的常规方法操作，如透析法、葡聚糖凝胶分子筛法、大孔树脂法或高速离心法等等。也可按照离子交换法建立跨膜梯度，所谓离子交换法即采用适宜的离子交换剂去除囊泡外水相中的阴离子、阳离子，或者阴阳离子同时除去，而内水相中的阴阳离子未被除去/或者除去很少，从而建立膜内外梯度，实现主动载药。

本发明的方法中，在囊泡建立跨膜梯度之前根据需要可以做均质化处理，以获得粒径适宜的囊泡，比如粒径在50-200nm之间的囊泡，更有利于载药。

作为优选，根据本发明所述的制备方法，其中所述含氮原子多阴离子化合物为氨基酸及其衍生物、氨基羧酸螯合剂、氨基膦酸衍生物、氨基酸聚合物及可快速跨膜运转的碱与跨膜速度慢的酸生成的盐等等。

作为优选，根据本发明所述的制备方法，其中所述含氮原子的多阴离子化合物溶液浓度为100-400mM。

作为更优选，所述含氮原子的多阴离子化合物溶液浓度为120-250mM。

作为最优选，所述含氮原子的多阴离子化合物溶液浓度为150-200mM。

令人欣喜的发现是，本发明的含氮原子的多阴离子化合物与其他多阴离子化合物(如肝素)或与硫酸铵梯度等方法联合用于制备脂质体时，所述含氮原子的多阴离子化合物溶液浓度为可低至30mM或更低。

作为优选，根据本发明所述的制备方法，其中所述含氮原子的多阴离子化合物溶液的pH值在3.0-9.0之间。

作为更优选，所述含氮原子的多阴离子化合物溶液的pH值在5-8之间。

作为优选，根据本发明所述的制备方法，其中所述氨基酸及其衍生物选自下列物质：赖氨酸衍生物、天冬氨酸及其衍生物、精氨酸衍生物、谷氨酸及其衍生物、聚谷氨酸、丙氨酸衍生物、甘氨酸衍生物、S-羧甲基-L-半胱氨酸及其衍生物、精氨酰琥珀酸或鸟氨酸及其衍生物等。

作为优选，根据本发明所述的制备方法，其中所述氨基羧酸螯合剂选自下列物质：EDTA及其盐、HEDTA及其盐、NTA及其盐、DTPA及其盐、DTPA-BMA及其盐或乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸及其盐。

作为优选，根据本发明所述的制备方法，其中所述氨基膦酸衍生物选自下列物质：乙二胺四亚甲基膦酸及其盐类、DETPMP及其盐类、DTPMPA及其盐类、己二胺四亚甲基膦酸及其盐类、氨基三亚甲基膦酸及其盐类、PAPEMP及其盐类或二己烯三胺五亚甲基膦酸及其盐类。

作为优选，根据本发明所述的制备方法，其中所述可快速跨膜运转的碱选自下列物质中的至少一种：氨水、三乙胺、乙二胺、乙醇胺、三乙醇胺、葡甲胺或三羟甲基氨基甲烷。

作为更优选，所述可快速跨膜运转的碱选自下列物质中的至少一种：氨水、三乙胺、乙二胺、乙醇胺、三乙醇胺或三羟甲基氨基甲烷。

作为优选，根据本发明所述的制备方法，其中所述跨膜速度慢的酸选自下列物质中的至少一种：乙二胺四乙酸、六偏磷酸、三聚磷酸、六偏磷酸、三偏磷酸、焦磷酸、甘油磷酸、果糖二磷酸或三磷酸腺苷。

作为更优选，所述跨膜速度慢的酸为乙二胺四乙酸。

本发明的基本膜材选用两亲性分子，即能够形成囊泡/或者泡囊的表面活性物质，如适宜的离子型表面活性物质、非离子型表面活性物质、大分子物质，包括各种磷脂及其衍生物，脱水山梨醇脂肪酸酯类、聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯类、还可选甾醇类及其衍生物，一般选用磷脂。

作为优选，根据本发明所述的制备方法，其中所述膜材选用磷脂与胆固醇为基本膜材时，磷脂与胆固醇的质量比为2-10∶1。

作为更优选，其中所述基本膜材中磷脂与胆固醇质量比为2-6∶1。

作为最优选，其中所述基本膜材中磷脂与胆固醇质量比为3-5∶1。

作为优选，根据本发明所述的制备方法，其中所述膜材中磷脂可选自下列物质中的至少一种：天然磷脂、半合成磷脂、合成磷脂，如大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酸、心肌磷脂、鞘磷脂、磷脂酸丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、氢化大豆卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二癸酰磷脂酰胆碱、二辛酰磷脂酰胆碱、二己酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油及其盐，二棕榈酰磷脂酰甘油及其盐，L-α-二肉豆蔻酰磷脂酰甘油及其盐，二月桂酰磷脂酰甘油、二癸酰磷脂酰甘油、二辛酰磷脂酰甘油、二己酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺，二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二月桂酰磷脂酰乙醇胺、双二硬脂酰磷脂酰甘油及其盐、双二棕榈酰磷脂酰甘油及其盐、双二肉豆蔻酰磷脂酰甘油及其盐、双二月桂酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰肌醇、二棕榈酰磷脂酰肌醇、二油酰磷脂酰肌醇、二肉豆蔻酰磷脂酰肌醇、二月桂酰磷脂酰肌醇、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、棕榈酰亚油酰磷脂酰胆碱、硬脂酰亚油酰磷脂酰胆碱、硬脂酰油酰磷脂酰胆碱、硬脂酰花生四烯酰磷脂酰胆碱或各种磷脂PEG衍生物，如DSPE-PEG、DPPE-PEG、DMPE-PEG、DLPE-PEG，其中PEG的分子量为100～100000。

作为优选，根据本发明所述的制备方法，其中所述膜材还包括加入PEG衍生物，其用量≤脂质相原料总质量的50％且不为0。作为更优选，膜材中加入的PEG衍生物占脂质相原料总质量的2-50％。

作为更更优选，膜材中加入的PEG衍生物占脂质相原料总质量的5-40％。

作为最优选，膜材中加入的PEG衍生物占脂质相原料总质量的5-20％。

其中，上述PEG衍生物包括但不限于各种磷脂PEG衍生物，如DSPE-PEG、DPPE-PEG、DMPE-PEG、DLPE-PEG，其中PEG的分子量为100～100000；也包括其他各种PEG脂质衍生物，如PEG甾醇类衍生物、PFG脂肪酸衍生物、PEG脂肪醇类衍生物，具体讲如胆固醇半琥珀酸酯PEG衍生物、Solulan C-24(PEG-24 cholesterol ether)、吐温类、Brij(苄泽)、维生素类的PEG衍生物(如TPGS)、PEG脂肪酸酯衍生物(卖泽)，聚甘油脂质衍生物，如聚甘油磷脂衍生物、聚甘油单(双)油酸酯、硬脂酸酯等；聚丙二醇脂质衍生物；聚氨基酸脂质衍生物；甾醇类衍生物；蔗糖脂质衍生物；氧乙烯-氧丙烯共聚物(HO(C₂H₄O)_a(C₃H₆O)_b(C₂H₄O)_aH)，如F68；聚乙二醇-二酸甘油脂(或者单酯)等等。

空白囊泡中各种膜材之间的比例可根据具体实验结果和实际需要有技术人员确定。

作为优选，根据本发明所述的制备方法，其中所述膜材还包括酸敏、温敏、光敏或靶向性物质。具体如何添加可根据载药的种类和需要来确定，按照本领域行业的常用技术手段操作即可。

作为优选，根据本发明所述的制备方法，其中所述给药系统用于包括但并不限于下述药物：

蒽环类/蒽二酮类抗肿瘤抗生素、长春花属生物碱、喜树碱类药物、喹诺酮类抗生素、罗丹明B或其类似物、依沙吖啶或其类似物、吖啶橙或其类似物；5-羟色胺受体拮抗剂、茶碱类物质、局部麻醉药、噻吗洛尔及其盐、美托洛尔及其盐、比索洛尔及其盐、普萘洛尔及其盐、索他洛尔及其盐、伏立康唑及其盐、曲马多及其盐、芬太尼及其盐、舒芬太尼及其盐、氨溴索及其盐、氯诺昔康及其盐、甲磺酸二氢麦角碱、盐酸川丁特罗(特罗类)、多巴酚丁胺、盐酸洛哌丁胺、阿替洛尔酒石酸美托洛尔、氯苯丁胺、麦角胺、蜂毒肽和生物碱。

上述给药系统可按下述方法进行载药：

将已建立梯度的空白囊泡(包括各种脂质体)与药物溶液混匀，在20-70℃下孵育，即可制得载药囊泡。

发明详述

发明人研究发现，由于氨基酸分子中含有氮原子，可以利用该氮原子进行结构衍生化，制备衍生物，如与氯乙酸反应，与各种酸酐反应，从而获得“含氮原子多阴离子化合物”。以赖氨酸为例说明，赖氨酸为碱性氨基酸，分子结构中仅有一个羧基，不属于多阴离子化合物(分子中含有两个或者两个以上的阴离子才属于“多阴离子化合物”)，但赖氨酸可以与琥珀酸酐反应制备“含氮原子多阴离子化合物”。赖氨酸与琥珀酸酐的反应属于常规反应，其方法为，在吡啶环境中，充氮气，按照不同摩尔比例投料，进行反应，可以获得如下三种结构式的衍生物：

以此三种衍生物中的任意一种化合物进行梯度载药，均可获得满意的结果。

其他氨基酸包括天冬氨酸及其衍生物、精氨酸衍生物、谷氨酸及其衍生物、聚谷氨酸、丙氨酸衍生物、甘氨酸衍生物、S-羧甲基-L-半胱氨酸及其衍生物、精氨酰琥珀酸、鸟氨酸及其衍生物等，均可以制备各种铵盐梯度，如氨水、三乙胺、三乙醇胺、TRIS等，从而实现主动载药。

含氮原子的多阴离子类化合物有许多，对于本发明来说下述的含氮原子的多阴离子化合物皆是适宜的。

一、氨基羧酸螯合剂类，如

EDTA及其盐，其中EDTA的结构式如下：

HEDTA及其盐，其中HEDTA的结构式如下：

氨基三乙酸(又称次氮基三乙酸，NTA)及其盐，其中NTA结构式如下：

DTPA及其盐，其中DTPA的结构式如下：

DTPA-BMA及其盐，其中DTPA-BMA的结构式如下：

乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(即3，6-二氧杂-1，8-辛二胺四乙酸)及其盐，乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸的结构式如下：

二、氨基膦酸衍生物类，如

乙二胺四亚甲基膦酸及其各种盐类，乙二胺四亚甲基膦酸的结构式如下：

二乙烯三胺五亚甲基膦酸(DETPMP)及其各种盐类，DETPMP结构式如下：

二乙烯三胺五甲叉膦酸(DTPMPA)及其各种盐类，DTPMPA结构式如下：

己二胺四亚甲基膦酸及其各种盐类，己二胺四亚甲基膦酸的结构式如下：

氨基三亚甲基膦酸及其各种盐类，氨基三亚甲基膦酸的结构式如下：

PAPEMP及其盐类，PAPEMP的结构式：

二己烯三胺五亚甲基膦酸及其盐类，结构式如下：

三、氨基酸聚合物，如聚天冬氨酸，其结构式为：

另外，“含氮原子的多阴离子化合物”尚可以与其他阴离子及其盐组合应用，如硫酸铵盐、柠檬酸铵盐、磷酸及其铵盐、多元醇磷酸酯及其铵盐、膦酰基羟基乙酸及其铵盐、羟基亚乙基二膦酸及其铵盐、聚马来酸及其铵盐、聚丙烯酸及其铵盐、水解聚马来酸酐及其铵盐、马来酸-丙烯酸共聚物及其铵盐、丙烯酸-2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸及其铵盐、丙烯酸-丙烯酸酯-膦酸-磺酸及其铵盐、膦酰基羧酸共聚物及其铵盐、聚环氧琥珀酸及其铵盐、聚羧酸系及其铵盐、八硫酸基蔗糖(Sucrose Octasulfate；SOS)及其铵盐、肝素及其铵盐、蛋白及其铵盐、植酸及其铵盐、二巯基丁二酸及其铵盐或2，3-二巯基丙磺酸及其铵盐等，也包括其他阴离子，如HPO₄ ^2-、H₂PO₄ ^-、Cl^-、节果酸根、酒石酸根、醋酸根、六偏磷酸根、三聚磷酸根、焦磷酸根、甘油磷酸根、果糖二磷酸根、三磷酸腺苷根、植酸根、邻苯二甲酸根、间苯二甲酸根、对苯二甲酸根、磺酸基、对苯二甲酸、苯甲酸、间苯二甲酸、间苯三甲酸、乳糖酸、2，5-二羟基苯磺酸、羟基苯磺酸、DNA、RNA、siRNA，RNAi、蛋白质、琥珀明胶、酶、荷电多糖或琥珀酰甲壳胺等。也可以与各种膦酸类药物(衍生物)及其盐类组合，如噻唑磷、替鲁膦酸、氯屈膦酸二钠、磷霉素氨基丁三醇、乙二胺四甲叉膦酸、依替膦酸钠；二亚乙基三胺五亚甲基膦酸七钠盐、2-膦酸基丁烷-1，2，4-三羧酸四钠、氨基三亚甲基膦酸、帕米膦酸钠、(3-氨基苯基)膦酸、己二胺四亚甲基膦酸钾盐、苯膦酸钠、阿仑膦酸及其盐类、甲基膦酸(5-乙基-2-甲基-2-氧代-1，3，2-二氧磷杂环己-5-基)甲基甲基酯、帕米膦酸、2-膦酸丁烷-1，2，4-三羧酸钠盐、己二胺四甲叉膦酸六钾盐、2-膦酸丁烷-1，2，4-三羧酸、羟基亚乙基二膦酸四钠、二己烯三胺五甲叉膦酸、利塞膦酸、氨甲基膦酸、伊班膦酸、利赛膦酸钠、唑来膦酸、帕米膦酸钠、西多福韦；(1-(4-氨基-2-氧代嘧啶-1-基)-3-羟基丙烷-2-基)氧甲基膦酸、(R)-((1-(((甲基磺酰)氧)甲基)-2-苄氧基乙氧基)甲基)膦酸二乙酯、替鲁膦酸二钠、乙烯基膦酸、(3-((羟甲基)氨基)-3-羰基丙基)-膦酸二甲酯、2-氨基乙基膦酸、氨基三甲叉膦酸钠、福沙吡坦；(3-(((2R，3S)-2-((1R)-1-(3，5-双(三氟甲基)苯基)乙氧基)-3-(4-氟苯基)-4-吗啉基)甲基)-2，5-二氢-5-氧代-1H-1，2，4-三唑-1-基)膦酸。

上述化合物在建立梯度时，可以是酸梯度，也可以是其他离子梯度，在说铵盐梯度时，主要为氨水、三乙胺、乙二胺、乙醇胺、三乙醇胺、三羟甲基氨基甲烷或葡甲胺的铵盐。

对本发明来说，可以是上述一种或者两种以上物质组合建立梯度。

发明人以EDTA铵盐为例，脂质体为代表，做了一系列如下的考察。

实验例1  对不同水化介质的考察

所考察的不同水化介质的结构式如下：

上述结构式所示物质分别为A，(NH₄)₂SO₄(硫酸铵、硫酸根)；B，NH₄BS(2，5-二羟基苯磺酸铵、磺酸根)；C，NH₄NCTD(去甲斑蝥酸铵、羧酸根)；D，NH₄CA(柠檬酸铵、羧酸根)；E，NH₄EDTA(含有氮原子的阴离子化合物)；F，NH₄SGP(甘油磷酸铵、磷酸根)；G，NH₄ATP(三磷酸腺苷铵盐、含有氮原子的阴离子化合物)；H，NH₄PA(植酸铵、磷酸根)；I，NH₄P₂(二聚磷酸铵、磷酸根)；J，NH₄P₃(三聚磷酸铵、磷酸根)；K，NH₄P₆(六聚磷酸铵、磷酸根)。

将上述不同的水化介质用于阿霉素脂质体制备，其原料的基本处方见表1。制备方法如下：65℃下，用10％乙醇(v/v)溶解处方量膜材，挥去大部分乙醇后即得脂质相；然后将预热至相同温度的水相(即水化介质)，按照常规的方法注入脂质相，孵育30min，制得脂质体初品，经200W超声初步混合2min后，400W超声分散6min(工作3s，间歇3s)，依次通过0.8、0.45、0.22μm的微孔滤膜，即得空白脂质体。采用透析法建立脂质体跨膜梯度，得到的梯度脂质体与药物溶液(药脂比，1∶10，w/w)混匀，于60℃孵育20min，得到不同水化介质制备的阿霉素脂质体。

表1  脂质体膜材料组成

注：水化介质的浓度均为200mmol·L^-1(HSPC为氢化大豆卵磷脂；CH为胆固醇；PEG-CHS为分子量2000的PEG单甲醚与胆固醇半琥珀酸酯反应所得产物，即胆固醇半琥珀酸酯PEG酯)。

测定不同阿霉素脂质体的平均粒径、包封率，同时亦考察其在4℃放置稳定性，结果见表2。

表2  不同水化介质对阿霉素脂质体包封率的影响

水化介质	官能团	包封率/％
			(NH4)2SO4	SO4 2-	91.1
NH4BS	-SO3-	28.5
			(NH4)2NCTD	-COOH	4.5
(NH4)3CA	-COOH	94.8
			(NH4)4EDTA	-COOH	94.5
(NH4)2SGP	-PO2(OH)2	89.0
			NH4ATP	-PO2(OH)2	97.9
(NH4)12PA	-PO2(OH)2	34.7
			(NH4)4P2	-PO2(OH)2	90.6
(NH4)5P3	-PO2(OH)2	76.5
			(NH4)6P6	-PO2(OH)2	84.2

由表2可知，含有氮原子的阴离子化合物，EDTA与ATP铵盐脂质体包封率均大于90％，其他的脂质体包封率最低者仅有4.5％，虽然柠檬酸铵的包封率高，但制得脂质体4℃放置稳定性均不及含有氮原子阴离子化合物水化介质。

实验例2  pH调节剂的选择

采用“实验例1”的脂质体膜材料、配比及工艺，选择EDTA进行pH调节剂考察。分别以氨水、乙二胺、三乙胺、乙醇胺、Tris、葡甲胺配制不同的EDTA盐溶液(pH7.0)。制备阿霉素脂质体，即建立不同的跨膜梯度主动装载DOX，考察了制剂的粒径、包封率，结果见表3。

表3  不同铵盐对阿霉素脂质体的影响

铵盐种类	平均粒径/nm	包封率/％
			氨水	76.9	97.39
乙二胺	89.0	94.21
			三乙胺	78.8	95.79
乙醇胺	126.5	96.06
			Tris	127.7	98.71

由表3可知，以氨水、乙二胺、三乙胺、乙醇胺、三羟甲基氨基甲烷(Tris)制备不同的EDTA盐溶液，均可以获得较高的包封率，大于90％。

实验例3  pH值的影响

组方组成同“实验例1”。以氨水调节pH至5.03、6.00、7.01，配制200mmol·L^-1EDTA铵盐溶液作为水化介质，制备阿霉素脂质体，考察了包封率，结果见表4。

表4  不同pH对阿霉素脂质体包封率的影响

pH	5.03	6.00	7.01
				包封率/％	97.21	97.66	97.39

由表4可知，pH在5-7范围内，阿霉素脂质体包封率无明显变化，均大于90％。发明人发现，对于本发明所述的含氮原子的多阴离子化合物而言，并非必须所有的阴离子都成盐，可以是部分成盐，剩余部分阴离子不成盐，为游离酸形式，同样也可以获得高包封率。

实验例4  水化介质浓度的影响

组方及工艺同“实施例1”。配制浓度分别为100、120、150、200、300mmol·L^-1EDTA铵盐溶液作为水化介质，制备阿霉素脂质体，结果见表5。

表5  不同浓度EDTA铵盐对阿霉素脂质体包封率的影响

浓度/mmol·L-1	平均粒径/nm	包封率/％
			100	71.5	75.05
120	85.4	96.69
			150	85.6	96.86
200	76.9	97.39
			300	86.8	97.22

由表5可知，水化介质浓度，即(NH₄)₄EDTA浓度，达到120mmol·L^-1时，包封率即可超过95％。

而采用现有技术中常规的硫酸铵、磷酸铵、柠檬酸铵作水化介质时，当其浓度为120mmol·L^-1时，包封率均小于70％。

实验例5  磷脂种类

组方组成：磷脂/胆固醇/DSPE-PEG的重量比例为3∶1∶1，工艺同“实验例1”。磷脂种类为HSPC、EPC和S100(Lipoid大豆磷脂)，主动装载阿霉素，制得阿霉素脂质体，结果见表6。

表6  不同磷脂对阿霉素脂质体包封率的影响

磷脂种类	HSPC	EPC	S100
				平均粒径/nm	76.9	85.2	88.7

包封率/％

97.39

94.13

98.51

上述表6的实验结果表明，相同工艺条件下，采用不同磷脂，阿霉素脂质体包封率均大于90％。

同样，发明人发现采用鞘磷脂、磷脂酰甘油、心肌磷脂、PEG磷脂衍生物、PEG胆固醇衍生物、多聚甘油脂质衍生物(包括磷脂衍生物)、各种表面活性剂，如吐温、司盘、PEG脂肪酸酯、PEG脂肪酸醚、双子(Gemini)表面活性剂等等，制备囊泡，建立梯度，均可以获得良好包封率。

实验例6  PEG脂质衍生物PEG-CHS加入量对包封率的影响

PEG水化层不仅影响脂质体的体内行为，还会影响制剂稳定性和包封效率。在“实验例1”基础上考察PEG-CHS加入量，分别为0％、0.5％、1.0％、1.5％，制备阿霉素脂质体，考察了制剂的粒径、包封率及4℃放置稳定性，结果见表7。

表7  不同PEG-CHS加入量对DOX脂质体的影响

PEG-CHS(w/v)	平均粒径/nm	包封率/％
			0％	165.4	92.95
0.5％	92.4	95.73
			1.0％	76.9	97.39
1.5％	88.9	97.85

由表7可知，采用EDTA梯度，无论是否加入PEG-CHS，其包封率均大于90％。

同样采用本发明的方法，可以建立其它各种囊泡(如，胆固醇半琥珀酸酯三羟甲基氨基甲烷、生育酚半琥珀酸酯三羟甲基氨基甲烷、吐温20/胆固醇囊泡、吐温80/胆固醇囊泡、SOULAN及聚硼酸酯表面活性剂囊泡)梯度，实现主动装载盐酸拓扑替康或其它药物。

本发明方法提供的囊泡类给药系统适用于包封难度大的水溶性药物，包括但不局限于蒽环类/蒽二酮类抗肿瘤抗生素(如盐酸阿霉素、阿霉素、盐酸表阿霉素、表阿霉素、盐酸吡柔比星、吡柔比星、柔红霉素、伊达比星或盐酸米托蒽醌)，长春花属生物碱(如长春瑞滨、长春新碱、长春花碱或长春地辛)，喹诺酮类抗生素(如环丙沙星、氟哌酸、氧氟沙星、依诺沙星、甲氟沙星、恩诺沙星、洛美沙星、氟罗沙星、加替沙星、司帕沙星、莫西沙星、克林沙星和吉米沙星)，喜树碱类药物(如羟基喜树碱钠盐、托泊替康、依立替康、9-氨基喜树碱、10，11-亚甲二氧基喜树碱、9-硝基喜树碱、TAS 103、7-(4-甲基-哌嗪基-亚甲基)-10，11-亚甲二氧基-20(S)喜树碱或7-(2-N-异丙胺基)乙基-20(S)喜树碱)。

本发明方法提供的给药系统适用于所有可采用离子梯度法进行包封的药物。

如罗丹明B或其类似物、依沙吖啶(利凡诺)或其类似物、吖啶橙(碱性橙14、3，6-双(二甲基氨基)吖啶氯化锌盐酸盐)或其类似物；5-羟色胺受体拮抗剂，包括昂丹司琼、托烷司琼、格拉司琼、帕洛诺司琼、雷莫司琼等。

如茶碱类物质；儿茶酚胺等。

如局部麻醉药包括盐酸阿替卡因、普鲁卡因(procaine)、可卡因(cocaine)、利多卡因(lidocaine)、麻卡因(marcaine)、卡波卡因(carbocaine)、丙胺卡因(prilocaine)等；大环内酯类药物，如阿奇霉素及其盐。

如噻吗洛尔及其盐、美托洛尔及其盐、比索洛尔及其盐、普萘洛尔及其盐、索他洛尔及其盐、伏立康唑及其盐等。

其它药物：如曲马多及其盐、芬太尼及其盐、舒芬太尼及其盐、氨溴索及其盐、氯诺昔康及其盐、甲磺酸二氢麦角碱、盐酸川丁特罗(特罗类)、多巴酚丁胺、盐酸洛哌丁胺、阿替洛尔酒石酸美托洛尔、氯苯丁胺、麦角胺、蜂毒肽等。

如生物碱，包括植物、海洋生物、微生物、真菌及昆虫来源。这类物质常常可以采用梯度载药技术提高包封率。

生物碱一般按化合物结构类型或生物合成途径进行分类。一些常见的生物碱结构类型如下：

1、异喹啉类生物碱

异喹啉类生物碱是生物碱中最大的一类，以异喹啉或四氢异喹啉为母核，根据连接基团的不同，又可分为九类：(1)单异喹啉类生物碱，如鹿尾草中的降血压成分鹿尾草碱；

(2)苄基异喹啉类生物碱，异喹啉核的1位接有苄基，如阿片中的解痉成分罂粟碱；

(3)双苄基异喹啉类生物碱，两个苄基异喹啉在酚羟基位置以醚键方式相连，如莲子芯中的莲心碱；

(4)阿扑芬类生物碱，苄基异喹啉类生物碱的两个苯环相连组成的四环化合物，如千金藤碱；

(5)原小蘖碱类生物碱，为两个异喹啉的稠合，如黄连中所含的抗菌成分黄连素；

(6)普鲁托品类生物碱，含羰基的小蘖碱开环化合物，如延胡索中的普鲁托品；

(7)吐根碱类生物碱，异喹啉环带苯骈喹啉啶环，如吐根中治疗阿米巴痢疾的有效成分吐根碱；

(8)α-萘菲啶类生物碱，如搏落回中的血根碱；

(9)吗啡类生物碱。

2、喹啉类生物碱

喹啉类生物碱的母核是喹啉环，其中最重要的一类是金鸡纳生物碱。

3、吡咯烷类生物碱

(1)简单的吡咯烷生物碱，如古柯叶中分离出的液体生物碱古豆碱、新疆党参中的党参碱；

(2)双稠吡咯烷类生物碱，由叔氮稠合两个吡咯烷而成，如阔叶千里光中分得的阔叶千里光碱；

(3)吲哚里西定类生物碱，以叔氮稠合吡咯烷与哌啶环而组成的吲哚里西定环，如白牵牛碱；

(4)莨菪烷类生物碱，由吡咯烷与哌啶骈合而成的杂环，常见的是与有机酸成酯的阿托品类生物碱；

(5)百部生物碱，百部根中分离得到的生物碱大多含有吡咯环，因此也纳入吡咯烷类生物碱。

4、吲哚生物碱

以吲哚环为母核的生物碱，如治疗白血病的高效药物长春新碱等。

相对明确的生物碱包括“马钱子碱”、“麦角胺和麦角毒”、“左金总生物碱”、“雷公藤总生物碱”、“草乌甲素及其类似生物碱”、“含双喹诺里西啶结构生物碱”、“八氢吲嗪二醇生物碱卤化物盐”、“吡啶并吖啶类生物碱”、“双苄基异喹啉类生物碱及其盐”、“咔唑生物碱类”、“异喹啉生物碱”、“伊贝总生物碱”、“海绵分离的细胞毒性生物碱衍生物”、“咔唑类生物碱衍生物及其”、“石蒜属植物中提取活性生物碱的方法”、“苯并[C]菲啶和原托品类生物碱”、“吴茱萸生物碱”、“马齿苋酰胺类生物碱”、“金不换总生物碱”、“异喹啉生物碱”、“夏天无总生物碱”、“辛可宁类生物碱配体”、“钩吻总生物碱”、“喹诺里西啶类生物碱”、“蚕沙总生物碱”、”吡咯杂环生物碱aldisin的溴代衍生物”、“雪上一枝蒿总生物碱”、“季胺白屈菜生物碱硫代磷酸衍生物”、“乌药生物碱”、“黄杨宁”、“环维黄杨星D”、“黄杨生物碱”、“粉防己生物碱”、“双苄基异喹啉类生物碱”、“紫金龙总生物碱”、“罂粟壳生物碱”、“小檗碱型生物碱”、“两面针总生物碱”、“赫替新型二萜生物碱”、“百部生物碱”、“荷叶总生物碱”、“麦角生物碱”、“胡椒碱”、“槟榔碱”、“槟榔碱次”、“利血平”、“青藤碱”、“马钱子碱”、“骆驼蓬总碱及其单体与衍生物”、“去氢骆驼蓬碱衍生物类化合物”、“贝母素乙素”、“贝母素甲素”、“延胡索乙素”、“海洋生物碱类物质”。

上述药物并不成为限制本发明的条件，正如本领域的任何技术人员所知，可采用某种离子梯度法进行包封的药物都在本发明保护范围内。

本发明优选实施例通常按照下述步骤进行操作：

a)以磷脂：胆固醇比例为2～10∶1(w/w)的混合物为基本膜材；

b)加入PEG衍生物以增加脂质体稳定性，延长体内循环时间；

c)采用适当的水化介质(如适当pH的乙二胺四乙酸(EDTA)的铵盐或胺盐)，制备脂质体初品，均质化处理得到的空白脂质体，通过适当方法建立脂质体跨膜梯度；

d)将已建立梯度的空白脂质体与药物(如盐酸阿霉素)溶液混匀，在20～70℃下孵育，制得包封率≥95％的载药脂质体。

进一步，加入海藻糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、葡萄糖、氯化钠或蛋白质等物质后的载药脂质体可进行冻干处理，得到可以室温储存的前体脂质体，加水复溶后，包封率大于80％。

与现有技术相比，本发明申请具有以下优点：

现有的梯度载药技术，主要是pH梯度(柠檬酸)、硫酸铵、磷酸铵、金属离子梯度、pH梯度、肌醇六磷酸酯及蔗糖磷酸酯等。与现有的梯度载药技术相比，本发明采用含有氮原子的多阴离子化合物梯度载药，具有的特点包括，1)、在囊泡内的滞留性好，从而可以长期保留所建立梯度；2)、载药范围广，对于采用常规梯度，如硫酸铵梯度，不易获得高包封率的药物，本发明技术可以大大提高包封率，大于90％；3)、所制备的载药制剂的储存稳定性高，药物泄漏少，可以长期贮存；4)、不易长菌；5)、制备工艺简单，在采用离子交换树脂建立梯度时，仅需阴离子交换树脂或者阳离子交换树脂即可；也可以通过简单的稀释建立梯度，获得高包封率；6)、主动载药时所需梯度值小，如内外水相的梯度大于5即可，而硫酸铵梯度需要大于500；7)、所制备的制剂毒性降低；8)、肿瘤中药物保留时间长，提高疗效。

附图说明

图1是实施例3阿霉素脂质体的体外释放度曲线图，

表示pH＝7.4；

表示pH＝6.5；

图2是实施例4阿霉素脂质体稀释后包封率曲线图，

是5％葡萄糖注射液；是0.9％NaCl注射液。

具体实施方式

下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

实施例1  阿霉素脂质体

其原料的基本处方见表1。制备方法如下：65℃下，用10％乙醇(v/v)溶解处方量膜材，挥去大部分乙醇后即得脂质相；然后将预热至相同温度的水相(即水化介质)，以现有技术中常规的方法注入脂质相，孵育30min，制得脂质体初品，经200W超声初步混合2min后，400W超声分散6min(工作3s，间歇3s)，依次通过0.8、0.45、0.22μm的微孔滤膜，即得空白脂质体。采用透析法建立脂质体跨膜梯度，得到的梯度脂质体与药物溶液(药脂比，1∶10，w/w)混匀，于60℃孵育20min，即得阿霉素脂质体。

表8  脂质体膜材料组成

水化介质：浓度均为200mmol·L^-1。

实施例2  释放度试验

采用“实施例1”制备的阿霉素脂质体。精密移取脂质体2.0mL，加至预处理过的透析袋(截留分子量为0.8-1.4万)中，两端夹紧后置于盛有198mL释放介质的溶出杯内，溶出仪避光处理，于37±1℃条件下以75rpm恒速搅拌，进行体外释放试验。取透析液测定荧光强度，计算透析液中的药物浓度和累计释放率。

实验结果表明，(NH₄)₄EDTA梯度装载阿霉素脂质体在24h内的释放百分率为15.1％，而经典的(NH₄)₂SO₄梯度法所制备的阿霉素脂质体，如参考Andreas Fritze、Felicitas Hens等在《Remote loading of doxorubicin intoliposomes driven by a transmembrane phosphate gradient》一文中报道的方法(参见Biochimica et Biophysica Acta[J]，2006，(1758)：1633-1640)所制备的阿霉素脂质体在24h内释放百分率为21.6％，即EDTA梯度载药体现了良好的药物滞留能力。

本实施例释放介质组成为：80mmol·L^-1氯化铵、10mmol·L^-1组氨酸盐酸盐为缓冲盐，以盐酸调节释放介质pH至7.4。同时加入100μg·mL^-1青霉素、链霉素作为防腐剂。

实施例3  不同pH的释放介质对DOX脂质体释放行为的影响

按照实施例2的方法，pH值分别取7.4、6.5进行释放度测定，测定结果见图1。

由图1可知，实施例1制备的DOX脂质体不存在突释现象，符合药典要求。不同pH的释放介质对DOX脂质体的释放行为无显著影响。

实施例4  阿霉素脂质体稀释稳定性

本实验以包封率为指标，分别考察“实施例1”阿霉素脂质体在5％(w/v)葡萄糖注射液和0.9％(w/v)氯化钠注射液中的稀释稳定性。设定稀释倍数为5倍。

方法：取3批阿霉素脂质体，精密移取2.0mL至10.0mL容量瓶内，分别以0.9％(w/v)氯化钠注射液和5％(w/v)葡萄糖注射液稀释至刻度，分别于0、0.5、1、4、8、24h取上述各溶液进行包封率测定。以包封率对时间作图，结果见图2。

由图2可见，采用0.9％(w/v)氯化钠注射液、5％(w/v)葡萄糖注射液作为稀释介质，24h内DOX脂质体包封率无显著差异(P＞0.05)，说明DOX脂质体稀释稳定性良好，能够确保临床应用的安全性。

实施例5  阿霉素脂质体长期稳定性试验

取3批实施例1阿霉素脂质体液体分装于西林瓶中，充氮、密封，在4±2℃条件下，避光放置，分别于0、30、60、90d取样，考察制剂外观、粒度、包封率变化，结果见表9。

表9  长期稳定性试验结果

其中+：樱桃红色、均匀、无沉淀、无相分离、未长菌。

表9结果表明，实施例1的DOX脂质体在4±2℃，即冷藏条件下，在90d内平均粒径保持稳定，包封率无明显变化。

实施例6  加速试验

根据药物稳定性试验指导原则，在25±2℃下进行加速试验。取3批实施例1阿霉素脂质体，分装于西林瓶中，充氮、密封，在25±2℃条件下，避光放置，分别于0、30、45、60d取样，考察制剂外观、粒度、包封率变化，结果见表10。

表10  加速试验结果

其中+：樱桃红色、均匀、无沉淀、无相分离、未长菌

由表10可知，实施例1的DOX脂质体在25±2℃下，在60天内平均粒径保持稳定，包封率无明显变化。

实施例7  40℃加速试验

按实施例1的方法制的建立梯度的空白脂质体液体和阿霉素脂质体。取已建立梯度的空白脂质体液体与阿霉素脂质体，分装于西林瓶中，充氮、密封，在40±2℃条件下，避光放置，分别于0、1、4、7、14d取样，空白脂质体溶液主动装载DOX，考察制剂外观、粒度、包封率变化，结果见表11。

表11  40℃加速试验结果

注：包封率*---空白脂质体主动装载阿霉素的包封率

由表11可知，优化的阿霉素脂质体在40±2℃条件下，避光放置14d内，平均粒径和包封率无明显变化。

实施例8  空白脂质体跨膜梯度稳定性试验

考察4±2℃下长期稳定性试验。分别以200mmol·L^-1(NH₄)EDTA、(NH₄)₂SO₄为水化介质，处方为“实施例1”脂质组成，制得已建立梯度的空白脂质体。取上述空白脂质体分装于西林瓶中，充氮、密封，4±2℃条件下，避光放置。分别于0、15、30、60、90、210、240、270d(天)取样，55℃孵育20分钟主动装载阿霉素，考察制剂外观、粒度、包封率变化，结果见表12。

表12  跨膜梯度长期试验结果

由表12可以看出，很显然，(NH₄)₂SO₄梯度不稳定，而(NH₄)₄EDTA梯度稳定。

实施例9  抗肿瘤试验

将60只接种H22肿瘤的小鼠随机分为6组，即生理盐水对照组(NS)、阿霉素溶液组(DOX溶液，5mg·kg^-1)、NH₄EDTA-DOX脂质体组(NH₄EDTA-L，低剂量组(2.5mg·kg^-1)、中剂量组(5mg·kg^-1)、高剂量组(10mg·kg^-1))、(NH₄)₂SO₄-DOX脂质体组((NH₄)₂SO₄-L)(5mg·kg^-1)，每组10只动物。第0天接种，接种后分别于第6、9、12、15天尾静脉注射给药。给药后动物正常饲养，每日称量小鼠体重，同时观察小鼠的生长状态。接种后第16天，处死动物，完整剥离皮下肿瘤，同时取出小鼠脏器，包括心、肝、脾、肺、肾、脑(用于测定阿霉素浓度)。取肿瘤称重，按下述公式计算抑瘤率。

平均瘤重及抑瘤率见表13。

表13  不同DOX脂质体抑瘤效果

组/用药剂量	死亡动物数	肿瘤重量/g	抑瘤率/％
				NS	0	2.150
DOX溶液/5mg·kg-1	4	1.013	52.9
				NH4EDTA-L/低剂量2.5mg·kg-1	0	0.883	58.9
NH4EDTA-L/中剂量5mg·kg-1	0	0.751	65.1
				NH4EDTA-L/高剂量10mg·kg-1	3	0.601	72.1

(NH4)2SO4-L/5mg·kg-1

2

0.740

65.6

由此可知，DOX的各种剂型均有极显著的抑瘤效果，NH₄EDTA-L低利量组(2.5mg·kg^-1)的抑瘤效果达到(NH₄)₂SO₄-L中剂量组(5mg·kg^-1)的抑瘤效果。

另外从小鼠的生存状态发现，第二次给药后第3天(H22肿瘤接种后第12天)，DOX溶液组出现4只小鼠死亡，NH₄EDTA-L高剂量组出现3只小鼠死亡，(NH₄)₂SO₄-L组出现2只小鼠死亡，即同等剂量下，EDTA脂质体梯度组的毒性低于(NH₄)₂SO₄脂质体梯度组。

实施例10  多次给药的组织发布研究

由于临床用药过程中，脂质体往往需要多次给药，因此本实验对阿霉素脂质体多次给药后在荷瘤小鼠体内组织分布情况进行了考察，可以更确切地描述阿霉素脂质体在靶组织内维持较高药物浓度的能力，同时阿霉素在非靶组织内的累积也可更贴切地反映DOX脂质体的毒性。

将“实施例9”(即本实施例中的各组织是“实施例9”的小鼠组织)的在多次给药结束后的各组织取出，测定各组织脏器内分布浓度，发现阿霉素溶液组织的血浆浓度为负值，即完全被代谢；而脂质体组队血浆浓度还很高。最重要的是心脏与肿瘤组织中药物浓度，结果表明，在相同剂量下，(NH₄)₂SO₄-L(5mg·kg^-1)(硫酸铵梯度)心组织中的阿霉素浓度是NH₄EDTA-L(EDTA铵盐梯度)中剂量组(5mg·kg^-1)的近2倍，与NH₄EDTA-L高剂量组(10mg·kg^-1)相近，说明NH₄EDTA-L心毒性作用更小。更为重要的是，在肿瘤中，与溶液组相比，所有脂质体组的分布量均超过20倍，且同等剂量下，NH₄EDTA-L是(NH₄)₂SO₄-L组队2倍，(NH₄)₂SO₄-L(5mg·kg^-1)与NH₄EDTA-L低剂量组(2.5mg·kg^-1)相近，说明NH₄EDTA跨膜梯度制得的阿霉素脂质体缓释效果更佳，可以较长时间在肿瘤组织内维持更高的药物浓度，从而增加抗肿瘤效果。

实施例11  简单稀释方法制备阿霉素脂质体

膜材处方：HSPC        2500mg

          CH          833mg

          CHS-PEG     833mg

水相1：200mM NH₄EDTA(pH7.0)

水相2：200mM(NH₄)₂SO₄

制备方法：65℃下，用10％乙醇(v/v)溶解处方量膜材得到脂质相，将预热至相同温度的水相按现有技术的常规方法注入脂质相，孵育30min，制得脂质体初品，高压均质处理，降低粒径，依次通过0.8、0.45、0.22μm的微孔滤膜，即得空白脂质体(50ml)。

将采用“水相1”制备的空白脂质体记为“脂质体1”；采用“水相2”制备的空白脂质体记为“脂质体2”。

将空白脂质体分别用蒸馏水稀释0、4、10、20倍，并立即取适量稀释后的脂质体与阿霉素溶液(4mg/mL)按药脂比1∶10(w/w)混合，于60℃孵育20min。测定包封率，检测结果见表14、表15。

表14  脂质体1稀释倍数及其装载阿霉素的能力

脂质体稀释倍数	加入阿霉素溶液后有无沉淀	载药后制剂状态	包封率(％)
				0	有	仍存在絮状及凝胶状沉淀	--(4.3)*
4	有	无明显沉淀，但制剂并不透明	91.1
				10	有	制剂半透明乳光	91.0
20	无	制剂半透明乳光	89.4

*--表示一次测定的包封率为4.3％。

表15  脂质体2稀释倍数及其装载阿霉素的能力

脂质体稀释倍数	加入阿霉素溶液后有无沉淀	载药后制剂状态	包封率(％)
				0	有	有沉淀	--
4	有	有沉淀	--
				10	有	有沉淀	--
100	有	有沉淀	--
				200	有	少量沉淀	--
500	无	无沉淀	67.6

通过表14和15可以看出，很显然，采用硫酸铵梯度法时，需要稀释500倍以上才具有可载药性，且包封率不高。而采用EDTA铵盐载药，仅需要稀释10倍即可获得质量稳定，包封率高度脂质体。

实施例12-14

采用HEDTA、NTA或DTPA铵盐来载药，其他操作同实施例11。结果显示，其都能达到与EDTA铵盐载药的相同效果。

实施例15

膜材处方  HSPC       250mg

          CH         83.3mg

          CHS-PEG    83.3mg

水相1：150mM NH₄EDTA

水相2：150mM(NH₄)₂SO₄

制备方法：65℃下，用10％乙醇(v/v)溶解处方量膜材，挥去大部分乙醇后得到脂质相，将预热至相同温度的水相按现有技术的常规方法注入脂质相，孵育30min，制得脂质体初品，经200W超声初步混合2min后，400W超声分散6min(工作3s，间歇3s)，依次通过0.8、0.45、0.22μm的微孔滤膜，即得空白脂质体。

采用“水相1”制备的空白脂质体记为“脂质体1”；采用“水相2”制备的空白脂质体记为“脂质体2”。采用离子交换树脂建立梯度(即按照离子交换树脂的交换容量的20％上样/或者混合处理，除去离子交换树脂，所得脂质体的外水相中离子被交换，从而建立脂质体内外水相梯度，得到梯度脂质体。)，梯度脂质体与阿霉素溶液(4mg/mL)按药脂比1∶10(w/w)混合，于60℃孵育20min。包封率测定结果见表16。

表16  离子交换树脂处理的差异比较

	阳离子交换树脂	阴离子交换树脂	阴阳混合交换树脂
				脂质体1	97.8％	94.6％	96.9％
脂质体2	沉淀，不能测定包封率	沉淀，不能测定包封率	46.6％

很显然，采用EDTA铵盐所制备脂质体，完全可以采用单一离子交换树脂，如阳离子、阴离子，也可以采用混合树脂，且包封率均大于90％。如果以经典的硫酸铵梯度，单纯除去外水相的阳离子(铵离子)，或者阴离子(硫酸根离子)，均不可能进行载药，即使采用混合树脂，包封率也低于50％。

实施例16-18

采用HEDTA、NTA或DTPA铵盐来载药，采用聚甘油酯(甘油聚合度大于等于2)或者其它PEG脂质衍生物代替PEG-CHS。其他操作同实施例15。结果显示，其都能达到与EDTA铵盐载药的相同效果。

实施例19  快速建立梯度

处方、工艺同实施例15。EDTA铵盐为水化介质。

采用单一阳离子交换树脂处理，可以建立内外水相EDTA梯度为25倍。

采用单一阴离子交换树脂处理，可以建立内外水相EDTA梯度为45倍。

发明人发现，由于含氮多阴离子化合物分子中含有氮原子“N”，即使采用单一的阳离子树脂，也能够部分除去此化合物，建立梯度，如实施例15所示。而硫酸铵、磷酸铵、柠檬酸铵等化合物，必须采用混合树脂，即阴、阳离子交换树脂混合使用，才能除去外水相的盐，建立装载阿霉素等药物的有效梯度。

实施例20  长春瑞滨脂质体

膜材处方制备工艺同实施例1来制备空白脂质体。水相分别选用硫酸铵，EDTA铵盐来载药。

以200mM硫酸铵梯度载药时，其包封率为56.3％，即使采用300mM硫酸铵梯度载药，其包封率也小于70％。而采用200mM EDTA铵盐梯度载药，包封率可以达到93.63％，大于90％。

实施例21

制备200mM EDTA2Na溶液，以氨水调节pH至7.8，制备脂质体，采用“实施例15”方法建立梯度，阿霉素包封率大于95％。

实施例22  EDTA铵盐与硫酸铵的组合

水化介质分别为EDTA铵盐与硫酸铵的不同组合，组合比如下：

处方1、0mM EDTA铵盐与200mM硫酸铵组合；处方2、50mM EDTA铵盐与150mM硫酸铵组合；处方3、100mM EDTA铵盐与100mM硫酸铵组合；处方4、200mMEDTA铵盐与0mM硫酸铵组合。

按照实施例1方法制备阿霉素脂质体，包封率均大于95％，但放置60天后，“处方1”产生沉淀，而“处方2”、“处方3”、“处方4”均未产生沉淀。

实施例23  拓扑替康脂质体

1000ml含有：

盐酸拓扑替康        0.5g

HEPC                20g

胆固醇              1g

吐温20              2g

甘油                10g

制备方法：

1、脂质体制备

取处方量的HEPC(氢化蛋黄卵磷脂)、胆固醇、吐温20，以适量乙醇溶解，加入200mM EDTA铵溶液，水化，并进行均质处理，获得小于500nm的脂质体。将此脂质体用阳离子交换树脂进行交换，除去外水相的EDTA铵，建立梯度。

2、载药

将处方量的盐酸拓扑替康以适量水溶解，加入上述梯度脂质体中，50℃孵育30分钟，得包封率大于90％的脂质体。加入余下的物料，混匀，制备得到1000ml的拓扑替康脂质体。可以根据实际情况加入防腐剂、甜味剂等。也可以加入适当的保护剂如海藻糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、葡萄糖、氯化钠、蛋白质等物质，进行冷冻干燥或者喷雾干燥后，将获得的前体脂质体于室温下储存(也可以在冰箱中储存)，加水复溶后，测得包封率大于80％。

实验结果显示，该脂质体小鼠灌胃吸收优于拓扑替康水溶液剂。

实施例24-25

将实施例23的吐温20换成TPGS(聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯)，或者吐温20与TPGS组合物，其他操作同实施例23，结果显示能达到同样目的。

实施例26  脂质囊泡凝胶(VPG)的制备

采用150mM的EDTA铵盐水化DLPC(二月桂酰磷脂酰胆碱)，制备50％DLPC(g/ml)的囊泡凝胶(VPG)，以“实施例11”的稀释法，将VPG稀释10～100倍，即可以装载各种生物碱、阿霉素、博安霉素、米托蒽醌、拓扑替康、长春瑞滨、长春新碱、酒石酸卡巴拉汀、马来酸噻吗洛尔、利多卡因等化合物。其包封率均大于80％。所得脂质体可以胃肠道给药、粘膜给药、注射给药、呼吸系统给药、皮肤给药等。

加入海藻糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、葡萄糖、氯化钠、蛋白质等物质进行冻干，得到可以室温储存的前体脂质体，加水复溶后，包封率大于80％。

实施例27  柔红霉素脂质体

处方  DPPC(二棕榈酸磷脂酰胆碱)    3g

      200mM(NH₄)EDTA(pH7)         加至100ml

制备方法如下：取处方量的DPPC，以适量氯仿溶解，制备DPPC氯仿溶液。减压除去氯仿，制备脂质膜；于60℃加入水化介质(NH₄)EDTA溶液，搅拌分散30min，制得脂质体初品，高压均质处理，并依次通过0.8、0.45、0.22μm的微孔滤膜，即得空白脂质体。以10％蔗糖为透析介质，采用透析法建立脂质体跨膜梯度(内水相的EDTA浓度为外水相的46倍)。将所得梯度脂质体与柔红霉素药物溶液(10mg/ml)按照药脂比1∶10(w/w)混匀，于60℃孵育20min，即得柔红霉素脂质体。包封率大于90％。

实施例28  与肝素联合

处方  HSPC                  2.5g

      胆固醇                0.5g

      PEG₅₀₀₀-DPPE          1g

      低分子量肝素          100mg

      30mM(NH4)EDTA(pH7)    加至100ml

制备方法如下：取处方量的HSPC、胆固醇、PEG₅₀₀₀-DPPE，55℃下，用10％乙醇(v/v)溶解，得到脂质相；处方量的低分子量肝素溶于30mM(NH₄)EDTA(pH7)溶液中，得到水相。将预热至55℃的水相(即水化介质)加入至脂质相，搅拌分散30min，制得脂质体初品。在20000psi压力下均质处理脂质体，降低粒径至50nm，通过0.22μm微孔滤膜过滤，即得空白脂质体。采用阴阳离子混合交换树脂除去外水相的低分子量肝素与(NH4)EDTA，建立梯度。将所得梯度脂质体与阿霉素药物溶液(药脂比，1∶10，w/w)混匀，于60℃孵育20min，即得阿霉素脂质体。包封率大于90％。而单独采用30mM(NH4)EDTA(pH7)为水化介质时，包封率小于30％。

也可以将肝素替换为：DNA、RNA、siRNA，RNAi、蛋白质、琥珀明胶、酶、荷电多糖或琥珀酰甲壳胺等。

实施例29  昆合磷脂脂质体

处方  DSPG                 0.5g

      DPPC                 2.5g

      吐温20               0.1g

      蔗糖                 10g

      八硫酸基蔗糖铵盐     1g

200mMDTPA铵盐(pH6)    加至100ml

制备方法如下：取处方量的DSPG、DPPC、吐温20，60℃下，用叔丁醇溶解，冻干，得到脂质相；将蔗糖、八硫酸基蔗糖铵盐与DTPA铵盐溶解于注射用水中，配置含有蔗糖与八硫酸基蔗糖铵的200mMDTPA铵盐溶液，预热至60℃，得到水相(即水化介质)，加入至脂质相，搅拌分散30min，制得脂质体初品。在30000psi压力下均质处理脂质体，降低粒径至56nm，通过0.22μm微孔滤膜过滤，即得空白脂质体。采用阴阳离子混合交换树脂(732阳离子交换树脂/717阴离子交换树脂)除去外水相的MDTPA铵盐，建立梯度。将所得梯度脂质体与硫酸长春新碱和盐酸米托蒽醌药物溶液混匀，于55℃孵育10min，即得装载两种药物脂质体。两种药物的包封率均大于90％。

同样可以采用DTPA-BMA铵盐、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸铵盐代替MDTPA铵盐，获得包封率大于90％的脂质体。

也可以将八硫酸基蔗糖铵盐替换为植酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、三聚磷酸盐、甘油磷酸盐、果糖二磷酸盐、噻唑磷盐、乙二胺四甲叉膦酸盐、依替膦酸盐、氨基三亚甲基膦酸盐、阿仑膦酸盐等。

实施例30  以氨基膦酸衍生物类或者氨基酸聚合物制备脂质体

空白脂质体处方  HSPC        3g

                CH          0.5g

                PEG-DSPE    1.5g

水化介质为200mmol·L-1乙二胺四亚甲基膦酸铵盐，总体积为100ml。

制备：取处方量的HSPC、CH(胆固醇)、PEG-DSPE，加入8ml乙醇，50℃溶解得到脂质乙醇溶液，即脂质相；将200mmol·L-1乙二胺四亚甲基膦酸铵预热至50℃，加入至脂质相，搅拌分散20min，制得脂质体初品。在20000psi压力下均质处理脂质体，降低粒径至80nm，通过0.22μm微孔滤膜过滤，即得空白脂质体。采用阴阳离子混合交换树脂(732阳离子交换树脂/717阴离子交换树脂)除去外水相的乙二胺四亚甲基膦酸铵盐，建立梯度。得到的梯度脂质体与药物溶液(药脂比，1∶10，w/w)混匀，于60℃孵育10min，即得阿霉素脂质体。包封率大于90％。

同样可以采用二乙烯三胺五亚甲基膦酸(DETPMP)铵盐、二乙烯三胺五甲叉膦酸(DTPMPA)铵盐、己二胺四亚甲基膦酸铵盐、氨基三亚甲基膦酸铵盐、PAPEMP铵盐、二己烯三胺五亚甲基膦酸铵盐代替乙二胺四亚甲基膦酸铵盐，获得包封率大于90％的脂质体。

以聚天冬氨酸铵盐代替乙二胺四亚甲基膦酸铵盐，也可获得包封率大于90％的脂质体。

Claims (12)

1、一种囊泡类给药系统，其特征在于：其通过如下方法制备，所述方法依次包括下述步骤：

(1)以表面活性物质为基本膜材、以含氮原子的多阴离子化合物溶液为水化介质制备获得空白囊泡；

(2)空白囊泡建立跨膜梯度即可；

其中，所述含氮原子的多阴离子化合物为一类分子结构中含有氮原子及下述两个以上阴离子的化合物：羧基、硫酸基、磺酸基、磷酸基、枸橼酸基或膦酸基。

2、如权利要求1所述的囊泡类给药系统，其特征在于，所述含氮原子的多阴离子化合物为氨基酸及其衍生物、氨基羧酸螯合剂、氨基膦酸衍生物、氨基酸聚合物及可快速跨膜运转的碱与跨膜速度慢的酸形成的盐。

3、如权利要求2所述的囊泡类给药系统，其特征在于，所述氨基酸及其衍生物选自下列物质：赖氨酸衍生物、天冬氨酸及其衍生物、精氨酸衍生物、谷氨酸及其衍生物、聚谷氨酸、丙氨酸衍生物、甘氨酸衍生物、S-羧甲基-L-半胱氨酸及其衍生物、精氨酰琥珀酸或鸟氨酸及其衍生物。

4、如权利要求2所述的囊泡类给药系统，其特征在于，所述氨基羧酸螯合剂选自下列物质：EDTA及其盐、HEDTA及其盐、NTA及其盐、DTPA及其盐、DTPA-BMA及其盐或乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸及其盐。

5、如权利要求2所述的囊泡类给药系统，其特征在于，所述氨基膦酸衍生物选自下列物质：乙二胺四亚甲基膦酸及其盐类、DETPMP及其盐类、DTPMPA及其盐类、己二胺四亚甲基膦酸及其盐类、氨基三亚甲基膦酸及其盐类、PAPEMP及其盐类或二己烯三胺五亚甲基膦酸及其盐类。

6、如权利要求2所述的囊泡类给药系统，，其特征在于，所述可快速跨膜运转的碱选自下列物质中的至少一种：氨水、三乙胺、乙二胺、乙醇胺、三乙醇胺、葡甲胺或三羟甲基氨基甲烷；所述跨膜速度慢的酸选自下列物质中的至少一种：乙二胺四乙酸、六偏磷酸、三聚磷酸、六偏磷酸、三偏磷酸、焦磷酸、甘油磷酸、果糖二磷酸或三磷酸腺苷。

7、如权利要求1所述的囊泡类给药系统，其特征在于，所述含氮原子的多阴离子化合物溶液浓度为100-400mM。

8、如权利要求1所述的囊泡类给药系统，其特征在于，所述含氮原子的多阴离子化合物溶液的pH值在3.0-9.0之间。

9、如权利要求1所述的囊泡类给药系统，其特征在于，基本膜材选用能够形成囊泡/或者泡囊的两亲性分子，也可以在膜材中加入酸敏、温敏、光敏或靶向性物质。

10、如权利要求1所述的囊泡类给药系统，其特征在于，所述基本膜材选用磷脂和胆固醇时，磷脂与胆固醇质量比为2-10∶1。

11、如权利要求1所述的囊泡类给药系统，其特征在于，所述膜材还加入PEG衍生物时，其用量≤脂质相原料总质量的50％且不等于0。

12、权利要求1所述的囊泡类给药系统在制备药物制剂中的应用，其特征在于，所述药物包括下列物质中的一种：

蒽环类/蒽二酮类抗肿瘤抗生素、长春花属生物碱、喜树碱类药物、喹诺酮类抗生素、罗丹明B或其类似物、依沙吖啶或其类似物、吖啶橙或其类似物；5-羟色胺受体拮抗剂、茶碱类物质、局部麻醉药、噻吗洛尔及其盐、美托洛尔及其盐、比索洛尔及其盐、普萘洛尔及其盐、索他洛尔及其盐、伏立康唑及其盐、曲马多及其盐、芬太尼及其盐、舒芬太尼及其盐、氨溴索及其盐、氯诺昔康及其盐、甲磺酸二氢麦角碱、盐酸川丁特罗(特罗类)、多巴酚丁胺、盐酸洛哌丁胺、阿替洛尔酒石酸美托洛尔、氯苯丁胺、麦角胺、蜂毒肽和生物碱。

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