CN101991536A - 一种具内外水相梯度差的囊泡及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物制剂领域，首先公开一种具内外水相梯度差的囊泡，所述囊泡采用离子交换方法或与透析法或超滤法结合处理空白囊泡获得，本发明还提供所述囊泡的制备方法和应用，即先制备空白囊泡，然后将得到的空白囊泡用离子交换剂处理，最后洗脱处理即可得到具内外水相梯度差的囊泡。本发明所制备的囊泡可与药物溶液混合，实现主动载药后即可获得药物制剂。所得的制剂可进一步进行离子交换处理或冻干处理。本发明提供的囊泡具备更高的内外水相梯度差，能实现囊泡离子梯度载药，并获得更高包封率；制备方法简单，成本低。并能较好在应用于脂质体凝胶、磁性脂质体、纳米粒/纳米凝胶的制备。

Description

一种具内外水相梯度差的囊泡及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及药物制剂领域，具体涉及一种具内外水相梯度差的囊泡及其制备方法和应用。

背景技术

某些两亲性分子，如许多天然的或合成的表面活性剂及不能简单缔合成胶团的磷脂，分散于水中时会自发形成一类具有封闭双层结构的分子有序组合体，称为囊泡(vesicle)，也称为脂质体(liposome)。囊泡和脂质体这两个术语的意义在文献中有些含混。一般认为，如果这些两亲分子是天然表面活性剂卵磷脂，则形成的结构就称为脂质体；若由合成表面活性剂组成，则称为囊泡。因此，脂质体特指由磷脂形成的一类特殊的囊泡，它是人类最先发现的囊泡体系。

自20世纪60年代初脂质体作为药物载体应用以来，受到了广泛关注和研究。但是，传统的被动载药法制得的脂质体通常包封率不高，特别是包封一些两亲性弱酸或弱碱药物，由于其油水分配系数受介质的pH值和离子强度影响较大，包封条件不易掌握，制备的脂质体包封率差异较大。因此，包封率低及易渗透问题在很大程度上限制了脂质体作为药物载体的推广。离子梯度法可以将某些两亲性药物高效地装载入脂质体内，克服了早期药物突释和泄漏，在一定程度上解决了这些药物脂质体制剂的大规模工业化生产难题。离子梯度法的实现取决于适宜离子梯度差的建立，如氢离子梯度，可以形成“质子池”，酸性的内部环境使扩散入脂质体内部的中性两亲性药物发生质子化作用而荷正电，阻止其再次跨膜泄露。同时，离子梯度法中还常常采用适宜的阴离子和/或大分子物质(离子化合物)(大分子物质可以只交换大分子物质一种离子，如肝素钠，可以只交换一种离子，即肝素阴离子，余下的钠离子(留在体系中)与药物在脂质体内部形成凝胶状沉淀，进一步提高包封率和稳定性。目前普遍采用的梯度差建立方法包括：透析法、超滤法、葡聚糖凝胶法即分子筛法。透析法廉价方便，但操作耗时长，易引起内外水相梯度差流失；超滤法耗时相对较短，但超滤中的高压和搅拌过程容易对脂质体的稳定性、均匀性造成影响，造成内外水相梯度差流失；葡聚糖凝胶法耗时短，但相对成本较高。

离子交换技术具有相当长的历史，某些天然物质如泡沸石和用煤经过磺化制得的磺化煤都可用作离子交换剂。随着现代有机合成工业技术的迅速发展，研究制成了许多种性能优良的离子交换树脂，并开发了多种新的应用方法，离子交换技术迅速发展，在许多行业特别是高新科技产业和科研领域中广泛应用。近年国内外生产的树脂品种达数百种，年产量数十万吨。在工业应用中，离子交换树脂的优点主要是处理能力大，交换范围广，能除去各种不同的离子，交换容量高，可以反复再生使用，工作寿命长，运行费用较低。以离子交换树脂为基础的多种新技术，如色谱分离法、离子排斥法、电渗析法等，各具独特的功能。离子交换树脂在50年代已作为药物载体用于延缓药物释放，其控释应用主要是在胃肠道中控制药物释放，即口服药物树脂控释系统。它是根据离子交换原理设计的，利用胃肠道中的离子，如钠离子、钾离子，将结合于树脂上的药物交换出来，达到减少不良苦味等目的。其主要应用是制备口服药物树脂液体控释系统(简称ORCRS)。离子交换技术的开发和应用还在迅速发展之中。

离子交换树脂都是用有机合成方法制成。常用的原料为苯乙烯或丙烯酸(酯)，通过聚合反应生成具有三维空间立体网络结构的骨架，再在骨架上导入不同类型的化学活性基团(通常为酸性或碱性基团)而制成。大多数离子交换树脂制成颗粒状，也有一些制成纤维状或粉状。树脂颗粒的尺寸一般在0.3～1.2mm范围内，大部分在0.4～0.6mm之间。它们有较高的机械强度(坚牢性)，化学性质也很稳定，在正常情况下有较长的使用寿命。离子交换树脂的品种很多，因化学组成和结构不同而具有不同的功能和特性，适应于不同的用途。应用树脂要根据工艺要求和物料的性质选用适当的类型和品种。

离子交换树脂中化学活性基团的种类决定了树脂的主要性质和类别。首先区分为阳离子树脂和阴离子树脂两大类，它们可分别与溶液中的阳离子和阴离子进行离子交换。混合树脂中，由于阳、阴树脂是均匀混合的，所以阳、阴离子交换反应几乎同时进行，即水的阳离子交换和阴离子交换多次交错进行，交换过程所产生的H⁺和OH^-都不能积累起来，基本上消除了反离子对交换反应的影响，这就避免了逆反应，使交换反应进行得很彻底。

发明内容

针对目前脂质体/囊泡作为药物载体及其离子梯度差建立方法存在的上述缺点，如载药范围不广、药物包封率低、耗时长、成本高、梯度小等等，本发明第一个发明目的是提供一种具内外水相梯度差的囊泡，第二个发明目的是提供所述囊泡的制备方法，第三个发明目的是提供所述囊泡的应用。

为实现本发明的第一个发明目的，发明人提供如下技术方案：

一种具内外水相梯度差的囊泡(包括脂质体)，其是通过采用包括离子交换方法除去空白囊泡水化介质中的阴离子、阳离子、阴阳离子和/或离子大分子物质(即荷电大分子物质)后获得。

发明人研究发现，采用离子交换方法处理空白囊泡可以快速建立囊泡内外水相渗透压梯度差，而且离子交换方法所建立的梯度大于常规方法，如透析法、超滤法、葡聚糖凝胶法即分子筛法建立的梯度差。本发明所述的离子交换方法是指采用适宜的离子交换剂去除囊泡外水相中的阴离子、阳离子、荷电大分子物质，或者阴阳离子同时除去，而内水相中的阴阳离子、大分子物质未被除去或者除去很少，从而建立囊泡膜内外梯度。除去囊泡外水相中离子的方法包括单独使用阴离子或阳离子交换剂或者混合使用阴阳离子交换剂，在单独使用阳离子或者阴离子交换剂时，可以有目的除去相应的阳离子或者阴离子，这是现有的超滤、分子筛色谱、高速离心等方法所不能达到的，如果合理选择/搭配离子交换剂与离子的作用力大小，亦可实现建立有目的除去某一离子或者两种离子或者两种以上离子的目的。本发明可以单独除去某类离子，甚至从几种离子中选择性地除去某种离子，例如，可以利用氢型阳离子交换树脂的交换能力顺序，强酸性：Fe³⁺＞Fe²⁺＞Mn²⁺＞Ca²⁺＞Mg²⁺＞K⁺＞NH⁴⁺＞Na⁺＞H⁺；弱酸性：H⁺＞Fe³⁺＞Fe²⁺＞Mn²⁺＞Ca²⁺＞Mg²⁺＞K⁺＞NH⁴⁺＞Na⁺，来有目的地除去水化介质中多种离子中的某一或者某多种离子，留下无需除去的离子。在采用混合离子交换剂时，阳、阴离子交换反应几乎同时进行，即阳离子交换和阴离子交换多次交错进行，交换过程所产生的H⁺/Na⁺和OH^-/Cl^-都不能积累起来，基本上消除了反离子对交换反应的影响，避免了逆反应，使交换反应进行得很彻底，于是可以保证制剂pH值保持稳定。

用于交换的离子交换剂用量优选为水化介质中离子所需交换容量的1～1000倍，更优选为所需交换容量的2～20倍，最优选为所需交换容量的3～10倍。空白囊泡的洗脱方式包括，但并不限于淋洗、离心、通过离子交换膜等方法。通过本发明的方法将空白囊泡与离子交换剂交换除去水化介质中阴阳离子、荷电大分子物质后即建立相应的离子梯度差。

另外，发明人也发现非常重要的一点，即现有的pH梯度，是加入碱性物质获得梯度，往往会大大降低脂质体浓度，如阿霉素脂质体MYOCET，大约稀释2.5倍。而采用离子交换方法除去外水相物质建立的梯度不会引发稀释/或者很少稀释，同时在配制药物溶液时提高其浓度(如阿霉素溶液)，可以达到最终产品的阿霉素浓度为4mg/ml～8mg/ml(而现有的MYOCET是2mg/ml)，这样可减少产品1～2倍的体积，为原产品体积的1/2～1/4，利于大剂量药物来实现制备脂质体。

更为重要的是，采用常规pH调节方法，往往是三瓶装制剂，如在欧洲上市的阿霉素脂质体(MYOCET)、长春新碱脂质体(MARQIBO)，分别为“药物”、“空白脂质体”、“pH调节剂”，在装载药物时，脂质体外水相中的枸橼酸或者其它物质不能除去，而枸橼酸的毒性较大，因此限制了此种技术的应用。本发明人采用离子交换方法，可以除去外水相枸橼酸，从而可以极大地减少枸橼酸等物质的毒性，大大提高脂质体给药量，利于临床应用。另外，可以单独采用微孔离子交换膜或离子交换树脂，或者将微孔离子交换膜与离子交换树脂结合，组装成一个装置，在临床应用时，将空白脂质体(如枸橼酸为水化介质)通过此装置，则可以在位除去脂质体外水相物质，建立脂质体/囊泡梯度，实现主动装载药物。本发明的方法可以将原来的药物制剂三瓶装(“药物”、“空白脂质体”、“pH调节剂”)减少为两瓶装(“药物”、“空白脂质体”)，降低成本的同时，亦会达到缩短生产时间、简化操作、减少污染机会的效果。

现有的所有主动载药技术/方法，普遍存在不能适用于膜材料浓度大于10％(g/g或g/ml)的高浓度囊泡(包括脂质体)来建立梯度差的缺点；另外，由于大分子存在选择性吸附、质点大(可以达到几十纳米，甚至100纳米)等特点，用常规的透析、超速离心、分子筛等方法存在难以除尽，甚至根本与囊泡(包括脂质体)不能分离的缺点，我们意外地发现，采用离子交换方法，可以非常简单、快速地建立膜材料浓度大于10％(g/g或g/ml)的高浓度囊泡(包括脂质体)梯度，可高达60％(g/g或g/ml)，用于主动载药；离子交换方法也能非常有效地将大分子与囊泡(包括脂质体)分离，提高包封率与稳定性，如在采用肝素-硫酸铵梯度装载阿霉素，制备阿霉素脂质体时，用透析方法，包封率小于50％，且稳定性差，放置一天后，有沉淀产生；而采用离子交换树脂，包封率大于90％，放置60天亦未产生沉淀，包封率未变；也可以利用大分子的渗透压特性，制造囊泡内外水相的大渗透压差，获得囊泡(包括脂质体)内部渗透压远大于外水相的渗透压，从而提高内水相体积、提高包封率、缩短包封时间，并可以增加被包封药物泄漏的阻力，大大延长囊泡(包括脂质体)稳定性！

更令人惊喜的是，发明人研究发现，本发明所述的囊泡可通过采用离子交换方法和透析法或超滤法相结合除去空白囊泡水化介质中阴离子、阳离子、阴阳离子和/或荷电大分子物质后获得。用于交换的离子交换剂用量可小于水化介质中离子所需交换容量的1倍。如先采用透析法或超滤法或离心法除去外水相中待除去离子的50％～90％，余下的离子仅需要起始离子所需交换容量的0.5～0.1倍，如此可以大大降低树脂量，特别是减少昂贵的离子交换膜用量。

本发明离子交换方法中采用的离子交换剂包括固体离子交换剂、液体离子交换剂、离子交换膜；阳离子交换剂、阴离子交换剂、两性离子交换树脂、螯合树脂和氧化还原树脂等；无机质离子交换剂、有机质离子交换剂；大孔离子交换树脂和特种离子交换树脂。

其中，上述离子交换膜包括阳离子交换膜、阴离子交换膜、两性交换膜、镶嵌离子交换膜、聚电解质复合膜；均相膜和非均相膜。离子交换剂包括以DEAE-纤维素(二乙基氨基纤维素)和CM-纤维素(羧甲基纤维素)为代表的纤维素、球状纤维素、葡聚糖、琼脂糖为基质的离子交换剂。

作为优选方案，根据本发明所述的囊泡，其中，所述离子交换方法中采用的离子交换剂为特种树脂时，其选自下列物质：WA 2氨基酸专用树脂、催化剂树脂、WDX-3果汁脱色专用树脂、WD-6脱色树脂、WL-XF核用树脂、WTT脱铁树脂、IND90变色树脂、D208脱色专用树脂、D209饮用水除硝酸根树脂、D309脱色专用树脂或XDA-7均孔脱色树脂。

作为优选方案，根据本发明所述的囊泡，其中，所述离子交换方法中采用的离子交换剂为阳离子交换树脂时，其选自下列物质中至少一种：001强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂、111弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂、112弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂、122弱酸性酚醛系阳离子交换树脂、D001大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂、D111大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂、D390盐酸除铁专用树脂、D401大孔苯乙烯系螯合型离子交换树脂、CAT600大孔苯乙烯系强酸催化树脂大孔强酸氢型阳离子交换树脂、CAT601大孔强酸催化树脂苯乙烯系大孔强酸氢型阳离子交换树脂、C005催化专用树脂苯乙烯系凝胶强酸阳离子交换树脂、D002-II型耐高温树脂、C004生物碱提取专用树脂苯乙烯系凝胶强酸阳离子交换树脂、C008生物碱提取专用树脂苯乙烯系大孔强酸阳离子交换树脂、B108氨基酸提取专用树脂苯乙烯系大孔强酸阳离子交换树脂、C610硫脲树脂、C620巯基树脂、C700硼选择性树脂、C800氨基羧酸树脂或C900氨基膦酸树脂，其用量为水化介质中阳离子所需交换容量的1-1000倍。作为更优选，阳离子交换树脂用量为水化介质中阳离子所需交换容量的2-20倍。作为最优选，阳离子交换树脂用量为水化介质中阳离子所需交换容量的3-10倍。

作为优选方案，根据本发明所述的囊泡，其中，所述离子交换方法中采用的离子交换剂为阴离子交换树脂时，其选自下列物质中至少一种：201强碱性季胺I型阴离子交换树脂、301弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂、303弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂、331弱碱性环氧系阴离子交换树脂、401螯合性胺羧基离子交换树脂、D201大孔强碱性季胺I型阴离子交换树脂、D202大孔强碱性季胺II型阴离子交换树脂、D301大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂、D302大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂、D311大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂、D206耐高温阴离子交换树脂、D215大孔丙烯酸系强碱阴离子交换树脂、D363大孔弱碱阴离子交换树脂或D204大孔苯乙烯系强碱性阴离子交换树脂，其用量为水化介质中阴离子所需交换容量的1-1000倍。作为更优选，阴离子交换树脂用量为水化介质中阴离子所需交换容量的2-20倍。作为最优选，阴离子交换树脂用量为水化介质中阴离子所需交换容量的3～10倍。

实际应用中，凡是符合离子交换、吸附原理的离子交换剂都可以应用在本发明中。具体地，本领域的技术人员可根据实际需要选择采用上述阳离子交换树脂的钠型或氢型，阴离子交换剂的氯型或氢氧型形式。

根据本发明所述的囊泡，其中：所述空白囊泡水化介质中含有可交换的各种阳离子或者阴离子或者阴阳两种离子，离子种类可以是一种或者两种以上，可以是以任意比例混合的任意浓度。

作为优选方案，根据本发明所述的囊泡，其中，所述水化介质中阴阳离子为：阳离子包括Ca²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、NH₄ ⁺、K⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、C₂H₄(NH₃ ⁺)₂、(CH₃CH₂)₃NH⁺、HOC₂H₄NH₃ ⁺、(HOC₂H₄)₃NH⁺、(HOCH₂)₆CH₃NH₂ ⁺或三羟甲基氨基甲烷；阴离子包括SO₄ ^2-、PO₄ ^3-、HPO₄ ^2-、H₂PO₄ ^-、Cl^-、枸橼酸根、醋酸根、EDTA^4-、六偏磷酸根、三聚磷酸根、焦磷酸根、甘油磷酸根、果糖二磷酸根、三磷酸腺苷根、植酸根、邻苯二甲酸根、间苯二甲酸根、对苯二甲酸根、苯甲酸根、间苯二甲酸根、间苯三甲酸根、乳糖酸根、二巯基丁二酸根、二乙三胺五乙酸根、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸根或氨基三乙酸根。所述的大分子物质是指荷电大分子物质，如蛋白质、肽类、酶类，更广泛的含义包括这些物质及其他大分子物质的硫酸酯、磺酸酯或磷酸酯衍生物，如磷酸化蛋白质，肝素、右旋糖酐硫酸酯、壳聚糖及其衍生物、明胶及其衍生物、琥珀酰明胶及其衍生物、多糖硫酸酯、低聚岩藻聚糖硫酸酯、木聚糖硫酸酯、海藻酸及其衍生物、透明质酸及其衍生物。

为实现本发明的第二个发明目的，发明人提供如下技术方案：

一种上述具内外水相梯度差的囊泡(包括脂质体)的制备方法，所述制备方法包括下述步骤：

(1)制备空白囊泡；

(2)将(1)得到的空白囊泡用离子交换剂处理，然后洗脱处理即可得到具内外水相梯度差的囊泡。

制备空白囊泡的膜材包括适宜的表面活性剂、大分子物质，如各种磷脂及其衍生物，还可选甾醇类及其衍生物，以及其它必要膜材。

其中表面活性剂包括HLB8～20的表面活性剂，如磷脂可选自下列的至少一种：天然磷脂、半合成磷脂、合成磷脂，如大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、磷脂酰甘油、EPG、磷脂酸、心肌磷脂、鞘磷脂、磷脂酸丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、氢化大豆卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二癸酰磷脂酰胆碱、二辛酰磷脂酰胆碱、二己酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油及其盐，二棕榈酰磷脂酰甘油及其盐，L-α-二肉豆蔻酰磷脂酰甘油及其盐，二月桂酰磷脂酰甘油、二癸酰磷脂酰甘油、二辛酰磷脂酰甘油、二己酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺，二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二月桂酰磷脂酰乙醇胺、双二硬脂酰磷脂酰甘油及其盐、双二棕榈酰磷脂酰甘油及其盐、双二肉豆蔻酰磷脂酰甘油及其盐、双二月桂酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰肌醇、二棕榈酰磷脂酰肌醇、二油酰磷脂酰肌醇、二肉豆蔻酰磷脂酰肌醇、二月桂酰磷脂酰肌醇、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、棕榈酰亚油酰磷脂酰胆碱、硬脂酰亚油酰磷脂酰胆碱、硬脂酰油酰磷脂酰胆碱、硬脂酰花生四烯酰磷脂酰胆碱或各种磷脂PEG衍生物，如DSPE-PEG、DPPE-PEG、DMPE-PEG、DLPE-PEG，其中PEG的分子量为100～100000。

上述PEG衍生物包括但不限于各种磷脂PEG衍生物，如DSPE-PEG、DPPE-PEG、DMPE-PEG、DLPE-PEG，其中PEG的分子量为100～100000；也包括其他各种PEG脂质衍生物，如PEG甾醇类衍生物、PEG脂肪酸衍生物、PEG脂肪醇类衍生物，具体讲如胆固醇半琥珀酸酯PEG衍生物、Solulan C-24(PEG-24 cholesterol ether)、吐温类、Brij(苄泽)、维生素类的PEG衍生物(如TPGS)、PEG脂肪酸酯衍生物(卖泽)，聚甘油脂质衍生物，如聚甘油磷脂衍生物、聚甘油单(双)油酸酯、硬脂酸酯等；聚丙二醇脂质衍生物；聚氨基酸脂质衍生物；甾醇类衍生物；蔗糖脂质衍生物；氧乙烯-氧丙烯共聚物(HO(C₂H₄O)_a(C₃H₆O)_b(C₂H₄O)_a H)，如F68；聚乙二醇-二酸甘油脂(或者单酯)等等。

本发明离子交换方法中采用的离子交换剂包括固体离子交换剂、液体离子交换剂、离子交换膜；阳离子交换剂、阴离子交换剂、两性离子交换树脂、螯合树脂和氧化还原树脂等；无机质离子交换剂、有机质离子交换剂。

上述离子交换膜包括阳离子交换膜、阴离子交换膜、两性交换膜、镶嵌离子交换膜、聚电解质复合膜；均相膜和非均相膜。上述离子交换剂包括以DEAE-纤维素(二乙基氨基纤维素)和CM-纤维素(羧甲基纤维素)为代表的纤维素、球状纤维素、葡聚糖、琼脂糖为基质的离子交换剂，如葡聚糖凝胶DEAE-A25、葡聚糖凝胶DEAE-A50、葡聚糖凝胶CM-C25、葡聚糖凝胶CM-C50、葡聚糖凝胶QAE-A25、葡聚糖凝胶SP-C25、琼脂糖凝胶DEAE-CL-6B、琼脂糖凝胶CM-CL-6B、琼脂糖凝胶DEAE-FF、琼脂糖凝胶CM-FF、磷酸纤维素、磷酸葡聚糖；(B-DEAE)-纤维素、(B-DEAE)-葡聚糖。

上述的离子交换剂包括阳离子交换树脂、阴离子交换树脂、螯合树脂、大孔树脂和特种树脂。

作为优选方案，根据本发明所述的囊泡的制备方法，其中，所述离子交换方法中采用的离子交换剂为特种树脂时，其选自下列物质：WA-2氨基酸专用树脂、催化剂树脂、WDX-3果汁脱色专用树脂、WD-6脱色树脂、WL-XF核用树脂、WTT脱铁树脂、IND90变色树脂、D208脱色专用树脂、D209饮用水除硝酸根树脂、D309脱色专用树脂或XDA-7均孔脱色树脂。

作为优选方案，根据本发明所述的囊泡的制备方法，其中，所述离子交换方法中采用的离子交换剂为阳离子交换树脂时，其选自下列物质中至少一种：001强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂、111弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂、112弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂、122弱酸性酚醛系阳离子交换树脂、D001大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂、D111大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂、D390盐酸除铁专用树脂、D401大孔苯乙烯系螯合型离子交换树脂、CAT600大孔苯乙烯系强酸催化树脂大孔强酸氢型阳离子交换树脂、CAT601大孔强酸催化树脂苯乙烯系大孔强酸氢型阳离子交换树脂、C005催化专用树脂苯乙烯系凝胶强酸阳离子交换树脂、D002-II型耐高温树脂、C004生物碱提取专用树脂苯乙烯系凝胶强酸阳离子交换树脂、C008生物碱提取专用树脂苯乙烯系大孔强酸阳离子交换树脂、B108氨基酸提取专用树脂苯乙烯系大孔强酸阳离子交换树脂、C610硫脲树脂、C620巯基树脂、C700硼选择性树脂、C800氨基羧酸树脂或C900氨基膦酸树脂，其用量为水化介质中阳离子所需交换容量的1-1000倍。作为更优选，阳离子交换树脂用量为水化介质中阳离子所需交换容量的2-20倍。作为最优选，阳离子交换树脂用量为水化介质中阳离子所需交换容量的3-10倍。

作为优选方案，根据本发明所述的囊泡的制备方法，其中，所述离子交换方法中采用的离子交换剂为阴离子交换树脂时，其选自下列物质中至少一种：201强碱性季胺I型阴离子交换树脂、301弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂、303弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂、331弱碱性环氧系阴离子交换树脂、401螯合性胺羧基离子交换树脂、D201大孔强碱性季胺I型阴离子交换树脂、D202大孔强碱性季胺II型阴离子交换树脂、D301大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂、D302大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂、D311大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂、D206耐高温阴离子交换树脂、D215大孔丙烯酸系强碱阴离子交换树脂、D363大孔弱碱阴离子交换树脂或D204大孔苯乙烯系强碱性阴离子交换树脂，其用量为水化介质中阴离子所需交换容量的1-1000倍。作为更优选，阴离子交换树脂用量为水化介质中阴离子所需交换容量的2-20倍。作为最优选，阴离子交换树脂用量为水化介质中阴离子所需交换容量的3-10倍。

根据本发明所述的囊泡的制备方法，其中：所述空白囊泡水化介质中含有可交换的各种阳离子或者阴离子或者阴阳两种离子，离子种类可以是一种或者两种以上，可以是以任意比例混合的任意浓度。

作为优选方案，根据本发明所述的囊泡的制备方法，其中，所述水化介质中阴阳离子为：阳离子包括Ca²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、NH₄ ⁺、K⁺、Fe²⁺、C₂H₄(NH₃ ⁺)₂、(CH₃CH₂)₃NH⁺、HOC₂H₄NH₃ ⁺、(HOC₂H₄)₃NH⁺、(HOCH₂)₆CH₃NH₂ ⁺或三羟甲基氨基甲烷；阴离子包括SO₄ ^2-、PO₄ ^3-、HPO₄ ^2-、H₂PO₄ ^-、Cl^-、枸橼酸根、醋酸根、EDTA^4-、六偏磷酸根、三聚磷酸根、焦磷酸根、甘油磷酸根、果糖二磷酸根、三磷酸腺苷根、植酸根、邻苯二甲酸根、间苯二甲酸根、对苯二甲酸根、苯甲酸根、间苯二甲酸根、间苯三甲酸根、乳糖酸根、二巯基丁二酸根、二乙三胺五乙酸根、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸根或氨基三乙酸根。所述的大分子物质是指荷电大分子物质，如蛋白质、肽类、酶类，更广泛的含义包括这些物质及其他大分子物质的硫酸酯、磺酸酯或磷酸酯衍生物，如磷酸化蛋白质，肝素、右旋糖酐硫酸酯、壳聚糖及其衍生物、明胶及其衍生物、琥珀酰明胶及其衍生物、多糖硫酸酯、低聚岩藻聚糖硫酸酯、木聚糖硫酸酯、海藻酸及其衍生物、透明质酸及其衍生物。

上述囊泡的制备方法中，空白囊泡的洗脱方式包括淋洗、离心或通过离子交换膜等方式。

作为优选，根据本发明所述的制备方法，其中，所述步骤(1)中制备空白囊泡时加入酸敏、温敏、光敏或靶向性物质。

本发明所述的制备方法中，所述步骤(2)中的囊泡用离子交换剂处理，如将囊泡通过离子交换树脂、离子交换膜等即可。

为实现本发明的第三个发明目的，发明人提供如下技术方案：

本发明首先提供上述具内外水相梯度差的囊泡在制备药物上的应用，其中，所述应用包括：将具内外水相梯度差的囊泡与药物溶液混合，实现主动载药后即可获得药物制剂。

作为优选，根据本发明上述的应用，其中上述药物制剂可再用离子交换剂处理。以除去外水相的游离药物与缓冲液，如长春瑞滨脂质体，枸橼酸毒性大，主动装载后，再用离子交换树脂处理，可以除去游离药物与枸橼酸等，包封率达到100％(从而可以随意加入药物，调节外水相浓度，调节外水相与内水相的药物比例、包封率等)，枸橼酸的毒性降为0。

作为优选，根据本发明上述的应用，其中上述的药物制剂加入海藻糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、葡萄糖、氯化钠或蛋白质后作冻干处理。所述药物制剂包括长春新碱、米托蒽醌等药物脂质体，加入海藻糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、葡萄糖、氯化钠、蛋白质等物质进行冻干，得到可以室温储存的前体脂质体，加水复溶后，包封率大于80％。

本发明方法提供的囊泡适用于所有可采用离子梯度法进行包封的药物。

如蒽环类抗肿瘤抗生素，包括盐酸阿霉素、盐酸表阿霉素和吡柔比星；长春花属生物碱，包括长春瑞滨、长春新碱、长春花碱和长春地辛；喹诺酮类抗生素，如环丙沙星、氟哌酸、氧氟沙星、依诺沙星、甲氟沙星、恩诺沙星、洛美沙星、氟罗沙星、加替沙星、司帕沙星、莫西沙星、克林沙星和吉米沙星等。如各种氨基酸、罗丹明B或其类似物、依沙吖啶(利凡诺)或其类似物、吖啶橙(碱性橙14、3，6-双(二甲基氨基)吖啶氯化锌盐酸盐)或其类似物；5-羟色胺受体拮抗剂，包括昂丹司琼、托烷司琼、格拉司琼、帕洛诺司琼、雷莫司琼等。

如局部麻醉药包括盐酸阿替卡因、普鲁卡因(procaine)可卡因(cocaine)、利多卡因(lidocaine)、麻卡因(marcaine)、卡波卡因(carbocaine)、丙胺卡因(prilocaine)等；大环内酯类药物，如阿奇霉素及其盐。

如噻吗洛尔及其盐、美托洛尔及其盐、比索洛尔及其盐、普萘洛尔及其盐、索他洛尔及其盐、伏立康唑及其盐等。

如荷电大分子物质，RNA干扰，即核苷酸、DNA脱氧核糖核酸、siRNA、蛋白质、酶、荷电多糖、甲壳胺、阿拉伯胶、海藻酸、羧甲基纤维素、琥珀明胶；荷电大分子聚合物，如树枝状物质中的PAMAM。

其它药物：如曲马多及其盐、芬太尼及其盐、舒芬太尼及其盐、氨溴索及其盐、氯诺昔康及其盐、甲磺酸二氢麦角碱、盐酸川丁特罗(特罗类)、多巴酚丁胺、盐酸洛哌丁胺、阿替洛尔酒石酸美托洛尔、氯苯丁胺、麦角胺、PEI(聚乙胺)、表皮生长因子(FGF)、蜂毒肽等。

如生物碱，包括植物、海洋生物、微生物、真菌及昆虫来源。这类物质常常可以采用梯度载药技术提高包封率。

生物碱一般按化合物结构类型或生物合成途径进行分类。一些常见的生物碱结构类型如下：

1、异喹啉类生物碱

异喹啉类生物碱是生物碱中最大的一类，以异喹啉或四氢异喹啉为母核，根据连接基团的不同，又可分为九类：(1)单异喹啉类生物碱，如鹿尾草中的降血压成分鹿尾草碱；

(2)苄基异喹啉类生物碱，异喹啉核的1位接有苄基，如阿片中的解痉成分罂粟碱；

(3)双苄基异喹啉类生物碱，两个苄基异喹啉在酚羟基位置以醚键方式相连，如莲子芯中的莲心碱；

(4)阿扑芬类生物碱，苄基异喹啉类生物碱的两个苯环相连组成的四环化合物，如千金藤碱；

(5)原小蘖碱类生物碱，为两个异喹啉的稠合，如黄连中所含的抗菌成分黄连素；

(6)普鲁托品类生物碱，含羰基的小蘖碱开环化合物，如延胡索中的普鲁托品；

(7)吐根碱类生物碱，异喹啉环带苯骈喹啉啶环，如吐根中治疗阿米巴痢疾的有效成分吐根碱；

(8)α-萘菲啶类生物碱，如搏落回中的血根碱；

(9)吗啡类生物碱。

2、喹啉类生物碱

喹啉类生物碱的母核是喹啉环，其中最重要的一类是金鸡纳生物碱。

3、吡咯烷类生物碱

(1)简单的吡咯烷生物碱，如古柯叶中分离出的液体生物碱古豆碱、新疆党参中的党参碱；

(2)双稠吡咯烷类生物碱，由叔氮稠合两个吡咯烷而成，如阔叶千里光中分得的阔叶千里光碱；

(3)吲哚里西定类生物碱，以叔氮稠合吡咯烷与哌啶环而组成的吲哚里西定环，如白牵牛碱；

(4)莨菪烷类生物碱，由吡咯烷与哌啶骈合而成的杂环，常见的是与有机酸成酯的阿托品类生物碱；

(5)百部生物碱，百部根中分离得到的生物碱大多含有吡咯环，因此也纳入吡咯烷类生物碱。

4、吲哚生物碱

以吲哚环为母核的生物碱，如治疗白血病的高效药物长春新碱等。

相对明确的生物碱包括“马钱子碱”、“麦角胺和麦角毒”、“左金总生物碱”、“雷公藤总生物碱”、“草乌甲素及其类似生物碱”、“含双喹诺里西啶结构生物碱”、“八氢吲嗪二醇生物碱卤化物盐”、“吡啶并吖啶类生物碱”、“双苄基异喹啉类生物碱及其盐”、“咔唑生物碱类”、“异喹啉生物碱”、“伊贝总生物碱”、“海绵分离的细胞毒性生物碱衍生物”、“咔唑类生物碱衍生物及其”、“石蒜属植物中提取活性生物碱的方法”、“苯并[C]菲啶和原托品类生物碱”、“吴茱萸生物碱”、“马齿苋酰胺类生物碱”、“金不换总生物碱”、“异喹啉生物碱”、“夏天无总生物碱”、“辛可宁类生物碱配体”、“钩吻总生物碱”、“喹诺里西啶类生物碱”、“蚕沙总生物碱”、”吡咯杂环生物碱aldisin的溴代衍生物”、“雪上一枝蒿总生物碱”、“季胺白屈菜生物碱硫代磷酸衍生物”、“乌药生物碱”、“黄杨宁”、“环维黄杨星D”、“黄杨生物碱”、“粉防己生物碱”、“双苄基异喹啉类生物碱”、“紫金龙总生物碱”、“罂粟壳生物碱”、“小檗碱型生物碱”、“两面针总生物碱”、“赫替新型二萜生物碱”、“百部生物碱”、“荷叶总生物碱”、“麦角生物碱”、“胡椒碱”、“槟榔碱”、“槟榔碱次”、“利血平”、“青藤碱”、“马钱子碱”、“骆驼蓬总碱及其单体与衍生物”、“去氢骆驼蓬碱衍生物类化合物”、“贝母素乙素”、“贝母素甲素”、“延胡索乙素”、“海洋生物碱类物质”。

多粘菌素B、E、盐酸鱼精蛋白、血红蛋白、各种细胞因子，如白细胞介素、干扰素、表皮生长因子、神经生长因子、胸腺五肽、促红细胞生成素、糖尿病治疗药物，如瑞格列奈、磷酸西他列汀、那格列奈、二甲双胍、唾液酸、溶菌酶(等电点碱性)、鱼精蛋白、玻璃酸、蜂毒素、蜂毒肽(Melittin)、各种膦酸类药物(衍生物)及其盐类，如噻唑磷、替鲁膦酸、氯屈膦酸二钠、磷霉素氨基丁三醇、乙二胺四甲叉膦酸、依替膦酸钠；、二亚乙基三胺五亚甲基膦酸七钠盐、2-膦酸基丁烷-1，2，4-三羧酸四钠、氨基三亚甲基膦酸、帕米膦酸钠、(3-氨基苯基)膦酸、己二胺四亚甲基膦酸钾盐、苯膦酸钠、阿仑膦酸及其盐类、甲基膦酸(5-乙基-2-甲基-2-氧代-1，3，2-二氧磷杂环己-5-基)甲基甲基酯、帕米膦酸、2-膦酸丁烷-1，2，4-三羧酸钠盐、己二胺四甲叉膦酸六钾盐、2-膦酸丁烷-1，2，4-三羧酸、羟基亚乙基二膦酸四钠、二己烯三胺五甲叉膦酸、利塞膦酸、氨甲基膦酸、伊班膦酸、利赛膦酸钠、唑来膦酸、帕米膦酸钠、西多福韦；(1-(4-氨基-2-氧代嘧啶-1-基)-3-羟基丙烷-2-基)氧甲基膦酸、(R)-((1-(((甲基磺酰)氧)甲基)-2-苄氧基乙氧基)甲基)膦酸二乙酯、替鲁膦酸二钠、乙烯基膦酸、(3-((羟甲基)氨基)-3-羰基丙基)-膦酸二甲酯、2-氨基乙基膦酸、氨基三甲叉膦酸钠、福沙吡坦；(3-(((2R，3S)-2-((1R)-1-(3，5-双(三氟甲基)苯基)乙氧基)-3-(4-氟苯基)-4-吗啉基)甲基)-2，5-二氢-5-氧代-1H-1，2，4-三唑-1-基)膦酸。

综合之，即本发明适合于各种单、双、多阴离子衍生物，如磷酸、硫酸(如SOS)、磺酸、羧酸衍生物，分子中含有其中一种，或者任意两种或者两种以上基团；也适合于各种单、双、多阳离子衍生物，分子中含有其中一种，或者任意两种或者两种以上基团；两性离子化合物。

上述药物并不成为限制本发明的条件，正如本领域的任何技术人员所知，可采用某种离子梯度法进行包封的药物都在本发明保护范围内。

其中上述离子梯度法包括但不限于pH梯度法、铵梯度法、醋酸钙梯度法和细胞离子载体离子梯度法，所述的细胞离子载体包括：尼日利亚菌素、二价阳离子质子交换剂A23187、离子霉素和拉沙里菌素。所述离子梯度法原理为：通过建立脂质体内外水相质子浓度差，或建立某种离子梯度差，促使弱酸性或弱碱性药物跨膜至内水相，进而滞留其中，维持高包封率。正如本领域任何技术人员所知的，凡是符合上述原理的离子梯度方法都可采用本发明的方法除去外水相的缓冲盐建立离子梯度。

本发明还提供上述具内外水相梯度差的囊泡在制备脂质体凝胶上的应用。

本发明还提供上述具内外水相梯度差的囊泡在制备磁性脂质体上的应用。

本发明还提供上述具内外水相梯度差的囊泡在制备纳米粒/纳米凝胶上的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、离子交换剂质量稳定、价格便宜，易于获得。

2、离子交换剂可再生重复利用(如果在交换容量以下，可以反复多次使用，无需再生)，工业化大生产条件成熟。

3、本方法具有适用性广泛(可以选择不同离子交换剂)，操作方便快捷，易于实现，耗时短的特点。

4、可建立更高的脂质体内外水相梯度差，避免常规梯度建立技术/方法因操作时间长而导致的梯度差流失，实现更高的包封。

5、针对大分子的离子化合物，该方法的除去能力远远大于常规透析、超滤、离心等方法。

6、特别适合于高浓度磷脂脂质体。

7、快速建立脂质体内外渗透压梯度，促进水进入脂质体内水相，扩大内水相体积，提高包封率。

8、由于外水相的物质可以很快被除去，甚至可以定量地被除去，因此无需担忧调节过头，从而可以通过外加法来随意调整为所需pH，如pH8、pH9等，增大跨膜内外梯度，提高包封率。

9、将现有的三瓶装(“药物”、“空白脂质体”、“pH调节剂”)脂质体，如MYOCET(阿霉素脂质体)，减少为两瓶装(“药物”、“空白脂质体”)，降低成本的同时，亦会达到缩短生产时间、简化操作、减少污染机会的效果。

具体实施方式

下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

实施例1

处方HSPC    3g

CH          1g

PEG-CHS     1g

水化介质：300mmol枸橼酸溶液(pH 4.00)100ml。

制备空白脂质体：称取处方量的HSPC、CH(胆固醇)、PEG-CHS(PEG分子量为2000)，55℃，用10ml乙醇溶解膜材，得脂质相；将预热至55℃的水化介质注入脂质相，孵育10min，制得脂质体初品，再经20000psi高压均质处理，降低脂质体粒径至90nm，依次通过0.8、0.45、0.22μm的微孔滤膜，即得空白脂质体。

建立梯度脂质体：根据交换容量计算，1.2ml(湿视体积)阴离子树脂(OH-)(717型阴离子树脂)即可以完全交换300mmol/L枸橼酸溶液1ml。本实施例采用1ml(湿视体积)阴离子树脂(OH-)(717型阴离子树脂)处理1ml空白脂质体，其pH值为6.8。

主动载药：将得到的梯度脂质体分为二份，一份直接载药，另外一份用pH＝8.1的10mMPBS(磷酸盐缓冲液)稀释一倍后进行载药。长春新碱与HSPC的重量比为1∶6。

结果，直接载药的包封率为81.6％，而以pH＝8.1的10mM磷酸盐缓冲液(PBS)稀释一倍后的梯度脂质体载药的包封率为95.2％，即通过增大跨膜内外梯度来提高包封率。

本实施例仅需两瓶，即一瓶“药物”与一瓶“空白脂质体”，外加一支离子交换树脂柱；而欧盟已获准上市的阿霉素脂质体(MYOCET)为三瓶装(“药物”、“空白脂质体”、“pH调节剂”)，很显然，本发明降低了生产成本，同时亦缩短生产时间、简化操作、减少污染机会。

实施例2

处方DSPC            5g

300mM枸橼酸缓冲液   100ml

(1)、取适量氯仿溶解DSPC(二硬脂酰磷脂酰胆碱)，旋转蒸发除去氯仿，制备DSPC膜。以100ml 300mM枸橼酸缓冲液为水化介质，水化磷脂薄，制备DSPC大单室脂质体(约610nm)，分别采用氢氧化钠溶液(常规方法)或氢氧型阴离子交换树脂(OH-)调节外水相pH至7，建立pH梯度。氢氧化钠溶液建立梯度的脂质体记为A，氢氧型阴离子交换树脂建立梯度的脂质体记为B。显微镜观察发现，B的粒径大于A的粒径，PSS(Particle Sizing Systems)测定结果表明，A与B的粒径分别为596nm与681nm。

(2)、分别在A或B中加入乙醇，室温密闭搅拌1小时，确保乙醇跨膜平衡。然后超速离心分离外水相，GC测定，计算包封率。以包封率大小表示内水相体积大小。

结果A或B的包封率分别为5.11％与8.26％，即阴离子交换树脂建立梯度的脂质体，其内水相体积大。内水相体积大的好处是可以获得更高的包封率和更大的载药量。

实施例3

处方：DSPC      3g

DSPE-PEG₂₀₀₀    1g

水化介质：200mMEDTA铵盐与10mg/ml透明质酸铵溶液100ml。

制备空白脂质体：称取处方量的DSPC、DSPE-PEG₂₀₀₀，55℃，用10ml乙醇溶解膜材，得脂质相；将预热至55℃的水化介质注入脂质相，孵育10min，制得脂质体初品，再经20000psi高压均质处理，降低脂质体粒径至100nm，依次通过0.8、0.45、0.22μm的微孔滤膜，即得空白脂质体。

建立梯度脂质体：

采用三种离子交换剂组成的混合离子交换剂：331弱碱性环氧系阴离子交换树脂、122弱酸性酚醛系阳离子交换树脂及DEAE-纤维素。331弱碱性环氧系阴离子交换树脂与122弱酸性酚醛系阳离子交换树脂的湿视体积比＝2∶1(v/v)，混合树脂的用量为水化介质中阴阳离子所需交换容量的5倍，DEAE-纤维素与混合树脂的湿视体积比为1∶1。

将所得的空白脂质体与混合离子交换剂混合放置1min后，2000rpm离心4min，得到梯度脂质体。

该梯度脂质体可以主动装载各种含有氮原子的碱性化合物，如阿霉素、长春新碱(生物碱)、庆大霉素等，其包封率大于80％，甚至可达100％。而采用超滤法获得的离子梯度进行载药，其包封率小于60％。

实施例4

处方DSPC        3g

DSPE-PEG₂₀₀₀    0.5g

水化介质：含有10mg/ml低分子肝素钠的200mM硫酸铵溶液100ml。

空白脂质体制备方法同实施例3。

建立梯度脂质体：

方法同实施例3，除去外水相的低分子肝素钠与硫酸铵，建立梯度，得到梯度脂质体。离子交换剂可以采用阴阳离子混合柱，具体配比如下。001强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂/201强碱性季胺I型阴离子交换树脂/D202大孔强碱性季胺II型阴离子交换树脂/DEAE-纤维素，湿视体积比＝1∶2∶1∶1(v/v/v/v)；或者采用001强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂/111弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂/301弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂/D201大孔强碱性季胺I型阴离子交换树脂，湿视体积比＝1∶0.5∶1∶1(v/v/v/v)；或者采用D001大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂/201强碱性季胺I型阴离子交换树脂/D215大孔丙烯酸系强碱阴离子交换树脂，湿视体积比＝1∶1∶1(v/v/v/v)。其用量为水化介质中所需交换容量的2-20倍均可。

载药：

将柔红霉素溶液(3mg/ml)加入上述空白脂质体中，60℃孵育30分钟，主动装载药物，得到包封率大于90％的柔红霉素脂质体(记为A)，4℃冰箱放置。

另外，以常规透析法建立梯度脂质体，取空白脂质体，以截留分子量为10万的透析膜、透析介质为等渗蔗糖溶液透析5小时；更换透析介质，透析2小时；再次更换透析介质，透析2小时，建立梯度，得到梯度脂质体。载药同法操作，包封率为39.2％(记为B)，4℃冰箱放置。

结果A放置10天未产生沉淀，包封率仍大于90％；而B的稳定性很差，放置1天后产生沉淀产生，包封率为38.6％。

同理可以将海藻酸铵与磷酸铵组合包入囊泡/脂质体中；或者可以将其它多离子化合物与小分子硫酸铵(二乙胺、三乙胺等铵盐)、磷酸铵(二乙胺、三乙胺等铵盐)、柠檬酸胺(二乙胺、三乙胺等铵盐)、琥珀酸铵(二乙胺、三乙胺等铵盐)、谷氨酸铵(二乙胺、三乙胺等铵盐)(DNA、RNA、siRNA，RNAi、蛋白质、羧甲基纤维素、琥珀明胶、酶、荷电多糖、甲壳胺、阿拉伯胶、透明质酸等物质中两种或者两种以上物质包入囊泡内，建立复合型梯度囊泡，主动载药，包封率均大于80％。装载的药物可以是各种生物碱等物质。

实施例5离子交换树脂除去外水相枸橼酸可以降低毒性

处方阿霉素 0.5g

EPC        3g

胆固醇     1g

以适量乙醇溶解EPC与胆固醇，300mM枸橼酸缓冲液(pH4.0)100ml水化，微射流处理，制备空白脂质体。

比较两种调节pH方法。A组：常规方法(三瓶装，已经获准上市的MYOCET)，采用碳酸钠调节pH至7装载阿霉素；B组：本发明方法(两瓶装)，采用阴离子交换树脂(氢氧型)除去外水相枸橼酸，同时调节pH＝7.0。

两种方法的包封率均大于90％。

毒性试验：随机将20只小鼠分为2组，每组10只，按照6mg/kg剂量静脉注射A组与B组，连续注射3次，观察15天内生存情况。结果A组死亡6只，B组仅死亡2只。

同样可以制备其他药物脂质体，如长春新碱、长春瑞滨、阿克拉霉素、米托蒽醌、枸橼酸舒芬太尼脂质体，特别是制备高浓度脂质体(脂质浓度大于10％(g/ml))，可以实现肌肉注射缓释，降低刺激性。

实施例6

处方DPPC        3g

CH              1g

DSPE-PEG₅₀₀₀    0.1g

DSPE-PEG₂₀₀₀    0.3g

DSPE-PEG₁₀₀₀    0.2g

水化介质：含有不同浓度右旋糖酐硫酸酯的100mmol/LNH₄EDTA溶液100ml。

制备空白脂质体：称取处方量的HSPC、CH(胆固醇)、DSPE-PEG₅₀₀₀、DSPE-PEG₂₀₀₀、DSPE-PEG₁₀₀₀，55℃，用10ml乙醇溶解膜材，得脂质相；将预热至55℃的水化介质注入脂质相，孵育30min，制得脂质体初品，再经20000psi高压均质处理，降低脂质体粒径至100nm，依次通过0.8、0.45、0.22μm的微孔滤膜，即得空白脂质体。

离子交换方法建立梯度：取空白脂质体，与混合树脂(采用四种离子交换剂，732阳离子交换树脂、CM-纤维素、717阴离子交换树脂、DEAE-纤维素，其混合比例为湿视体积1∶1∶1∶2v/v)混合放置5min后，在2000rpm下离心4min，建立梯度，得到梯度脂质体(记为B组)。

单独采用732型阳离子树脂除去外水相铵离子，不除去右旋糖酐硫酸酯(记为A组)。

载药：将梯度脂质体与4mg/ml盐酸伊立替康(Irinotecanhydrochloride，CPT-11)溶液按照药脂比1∶5(w/w)混合，于60℃下载药10min，得到盐酸伊立替康脂质体，包封率均大于90％。

体外释放：将脂质体装入截留分子量为10万的透析袋中，以10mMPBS(pH5.3)为释放介质，考察30分钟释放包封率。结果见表1。

表1体外释放结果

注：A组-未除去外水相右旋糖酐硫酸酯；B组-除去外水相右旋糖酐硫酸酯

由表1可以看出，在不同浓度右旋糖酐硫酸酯存在下，对于盐酸伊利替康(CPT-11)脂质体制剂来说，将外水相中的大分子物质右旋糖酐硫酸酯去除后，其30分钟释放百分比分别为53、46、41、33％；未除去组，其其30分钟释放百分比分别为55、56、58、68％。很明显，未除去组，20mg/ml右旋糖酐硫酸酯脂质体组反而增加释放；除去外水相中的右旋糖酐硫酸酯，体外释放稳定性明显增加，且随着浓度的提高而增加，释放百分率逐步下降。

离子交换剂还可以采用磷酸纤维素、磷酸葡聚糖；(B-DEAE)-纤维素、(B-DEAE)-葡聚糖、大孔离子交换剂等。

右旋糖酐硫酸酯可以更换为低分子肝素、琥珀酸明胶、肌红蛋白、血红蛋白、细胞色素、胰岛素、bFGF、硫酸葡聚糖、aFGF、鱼精蛋白、聚赖氨酸等。

实施例7

透析法建立柠檬酸铵梯度：取“实施例5”空白脂质体2.0mL，以500mL5％(g/ml)糖溶液为透析介质，磁力搅拌以达平衡。分别于0.5、1.0、1.5、2.0小时取一定体积透析介质，HPLC测定柠檬酸，发现2小时后透析介质内柠檬酸铵浓度趋于稳定，透析达平衡。更换500mL透析介质，再次透析2小时；重复一次。以超滤法分离脂质体外水相的柠檬酸铵，HPLC测定外水相与脂质体中总柠檬酸铵，计算脂质体柠檬酸铵梯度，结果以透析法建立的梯度约为893倍，耗时约6小时。

采用混合离子交换树脂法建立的梯度，即采用732阳离子交换树脂/717阴离子交换树脂按照1∶1组成混合离子交换树脂柱，按照待交换离子所需交换容量的5倍取用混合离子交换树脂，并将空白脂质体通过此柱，建立梯度的约为1162倍，耗时约0.1小时。

很显然，采用离子交换法建立梯度远优于透析法。

实施例8

处方HSPC        5g

CH              1g

PEG1000-DSPE    1g

水化介质：200mM硫酸铵或者200mM枸橼酸铵或者200mM乙二胺四乙酸铵100ml。

制备：取处方量的HSPC、CH(胆固醇)、PEG1000-DSPE，加入10ml乙醇，50℃溶解得到脂质乙醇溶液，即脂质相；将水化介质预热至50℃，加入至脂质相，搅拌分散20min，制得脂质体初品(此法称为“改良乙醇注入法”)。将采用改良乙醇注入法制备得到的空白脂质体，分别通过透析法、葡聚糖凝胶法、超滤法、混合离子交换树脂法(201强碱性阴离子交换树脂和001强酸性阳离子交换树脂，用量为水化介质中阴阳离子所需交换容量的10倍，201强碱性阴离子交换树脂∶001强酸性阳离子交换树脂＝2∶1，湿视体积比)建立离子梯度。在60℃，将表阿霉素溶液(3mg/ml)与已建立梯度的空白脂质体(药脂比1∶10，w/w)混匀，孵育20min。测得包封率结果见表2。

表2不同水化介质脂质体包封率

结论：对于不同的水化介质，采用离子交换树脂法可以获得更稳定的高包封率，特别是水化介质为硫酸铵、枸橼酸铵时，建立梯度的方法对包封率影响较大。更为重要的是，离子交换树脂法建立梯度仅需要约10分钟，其他方法均超过60分钟。

也可以将乙二胺四乙酸铵换为乙二胺四亚甲基膦酸铵，取得同样结果。

采用301弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂和122弱酸性酚醛系阳离子交换树脂，用量为水化介质中阴阳离子所需交换容量的20倍，301弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂∶122弱酸性酚醛系阳离子交换树脂湿视体积比＝2∶1，也可以获得大于90％的包封率。

采用001强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂、111弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂、112弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂、122弱酸性酚醛系阳离子交换树脂、D001大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂、D111大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂、D390盐酸除铁专用树脂、D401大孔苯乙烯系螯合型离子交换树脂、CAT600大孔苯乙烯系强酸催化树脂大孔强酸氢型阳离子交换树脂、CAT601大孔强酸催化树脂苯乙烯系大孔强酸氢型阳离子交换树脂、C005催化专用树脂苯乙烯系凝胶强酸阳离子交换树脂、D002-II型耐高温树脂、C004生物碱提取专用树脂苯乙烯系凝胶强酸阳离子交换树脂、C008生物碱提取专用树脂苯乙烯系大孔强酸阳离子交换树脂、B108氨基酸提取专用树脂苯乙烯系大孔强酸阳离子交换树脂、C610硫脲树脂、C620巯基树脂、C700硼选择性树脂、C800氨基羧酸树脂或C900氨基膦酸树脂，也可以获得包封率大于90％的脂质体。

同法可以制备长春新碱、米托蒽醌等药物脂质体，加入海藻糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、葡萄糖、氯化钠、蛋白质等物质进行冻干，得到可以室温储存的前体脂质体，加水复溶后，包封率大于80％。

实施例9

根据处方DPPC∶CH∶PEG-CHS＝3∶1∶0.3(w/w)，采用改良乙醇注入法制备空白脂质体，探头超声法减小粒径，分别通过透析法、葡聚糖凝胶法、超滤法、混合离子交换树脂法(331弱碱性环氧系阴离子交换树脂和112弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂，用量为水化介质中阴阳离子所需交换容量的50倍，331弱碱性环氧系阴离子交换树脂∶112弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂＝2∶1，湿视体积比)建立离子梯度。在60℃，将阿霉素溶液与已建立梯度的空白脂质体(药脂比1∶10，w/w)混匀，孵育20min。测得包封率如表3：

表3不同水化介质脂质体包封率

	透析法	葡聚糖凝胶法	超滤法	离子交换法
					200mM硫酸铵	95％	93％	89％	96％
200mM枸橼酸铵	93％	91％	78％	95％
					200mM SOS	52％	56％	38％	98％

注：SOS--蔗糖八硫酸酯铵盐

说明离子交换树脂法可以获得更高的包封率，更为重要的是，离子交换树脂法建立梯度仅需要约5分钟，其他方法均超过60分钟。

可以采用聚甘油酯(甘油聚合度大于等于2)，或者其它PEG脂质衍生物代替PEG-CHS。

实施例10

采用改良乙醇注入法，将脂质膜材(DSPC∶CH∶DSPE-PEG＝3∶1∶1(w/w/w))加入200mM乙二胺四乙酸铵溶液(含有5mg/ml海藻酸钠)中制备空白脂质体(总脂质浓度为5％，g/ml)，探头超声法减小粒径至30nm，以混合离子交换树脂法(DAEA-纤维素类阴离子交换剂和CM-纤维素类阳离子交换剂，用量为水化介质中阴阳离子所需交换容量的5倍，阴离子交换剂∶阳离子交换剂＝1∶1，湿视体积比)建立离子梯度。在60℃，将博安霉素溶液与已建立梯度的空白脂质体(药脂比1∶10，w/w)混匀，孵育20min。测得包封率，结果见表4。

表4不同方法试验结果

	透析法	葡聚糖凝胶法	超滤法	离子交换法
					包封率	63.2％	71.6％	82.3％	93.1％
建立梯度耗时	16小时	1.7小时	2.9小时	0.1小时

结论：说明离子交换树脂法可以获得更高的包封率，建立梯度快，从而缩短整体包封时间。

实施例11

根据处方EPC∶CH∶PEG-CHS＝3∶0.1∶1(w/w)，采用改良乙醇注入法制备空白脂质体，探头超声法减小粒径，分别通过透析、葡聚糖凝胶法、超滤法、混合离子交换树脂法(201强碱性阴离子交换树脂和001强酸性阳离子交换树脂，用量为水化介质中阴阳离子所需交换容量的5倍，201强碱性阴离子交换树脂∶001强酸性阳离子交换树脂＝2∶1，湿视体积比)建立离子梯度。在60℃，将长春瑞滨溶液与已建立梯度的空白脂质体(药脂比1∶20，w/w)混匀，孵育20min。测得包封率，结果见表5。

表5不同水化介质脂质体包封率

	透析	葡聚糖凝胶法	超滤法	离子交换法
					200mM硫酸铵	73％	68％	57％	89％
200mM枸橼酸铵	86％	53％	38％	96％
					200mM乙二胺四乙酸铵	93％	91％	87％	95％

结论：说明离子交换树脂法可以获得更高的包封率。

可以采用聚甘油酯(甘油聚合度大于等于2)，或者其它PEG脂质衍生物代替PEG-CHS。

实施例12

处方HSPC        3g

CH              1g

DSPE-PEG₁₀₀₀    0.1g

DSPE-PEG₂₀₀₀    0.6g

DSPE-PEG₅₀₀₀    0.3g

水化介质：含有10mg/ml低分子肝素的100mmol/L NH4EDTA溶液100ml。

制备空白脂质体：称取处方量的HSPC、CH(胆固醇)、DSPE-PEG₅₀₀₀、DSPE-PEG₁₀₀₀、DSPE-PEG₂₀₀₀，55℃，用10ml乙醇溶解膜材，得脂质相；将预热至55℃的水化介质注入脂质相，孵育30min，制得脂质体初品，再经20000psi高压均质处理，降低脂质体粒径至100nm，依次通过0.8、0.45、0.22μm的微孔滤膜，即得空白脂质体。

制备梯度脂质体：

1、离子交换方法：取空白脂质体，与混合树脂(采用四种离子交换剂，732阳离子交换树脂、CM-纤维素、717阴离子交换树脂、DEAE-纤维素，其混合比例为湿视体积1∶1∶1∶2v/v)混合放置5min后，在2000rpm下离心2min，建立梯度，得到梯度脂质体。

2、透析方法：取空白脂质体，以截留分子量为10万的透析膜，透析介质为等渗蔗糖溶液，透析6小时；更换透析介质，透析3小时；再次更换透析介质，透析2小时。建立梯度，得到梯度脂质体。

载药：将梯度脂质体与4mg/ml阿霉素溶液按照药脂比1∶10(w/w)混合，60℃下载药20min，得到阿霉素脂质体。测定包封率，结果表明，两种方法的包封率均大于90％，但“透析方法”建立梯度的脂质体，放置12小时即有沉淀；而采用离子交换方法建立梯度的脂质体，放置72小时也未见沉淀。即本发明的梯度建立方法优于常规的透析方法。

离子交换剂还可以采用磷酸纤维素、磷酸葡聚糖；(B-DEAE)-纤维素、(B-DEAE)-葡聚糖、大孔离子交换剂等。

低分子肝素可以更换为琥珀酸明胶、肌红蛋白、血红蛋白、细胞色素、胰岛素、bFGF、硫酸葡聚糖、aFGF、鱼精蛋白、聚赖氨酸等。

实施例13

处方马来酸噻吗洛尔        0.5g

四肉豆蔻心磷脂(CL)        0.1g

二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)  15g

胆固醇(CH)                1g

氯化钠                    0.5g

注射用水                  适量

1)、取处方量的CL、DPPC、CH，以适量乙醇溶解，加200mM马来酸铵溶液80ml水化，均质处理，降低脂质体粒径至约100nm，备用。

2)、将上述脂质体通过阴阳混合型离子交换树脂柱(732阳离子交换树脂与717阴离子交换树脂，其混合比例为湿视体积1∶1v/v)处理2分钟后，除去外水相的马来酸铵，建立梯度备用。

3)、处方量的马来酸噻吗洛尔和氯化钠用15ml注射用水溶解，配制马来酸噻吗洛尔氯化钠溶液，加入至上述空白梯度脂质体中，于50-60℃孵育30分钟，注射用水补加至100ml，混匀，得马来酸噻吗洛尔脂质体滴眼液。可以根据具体情况加入适量的防腐剂，如羟苯乙酯。

进一步可加入凝胶基质制成凝胶剂。

实施例14

1000ml含有：

盐酸拓扑替康    0.5g

HEPC            20g

胆固醇          1g

吐温20          2g

制备方法：

1、制备脂质体

取处方量的HEPC(氢化蛋黄卵磷脂)、胆固醇、吐温20，以适量叔丁醇溶解，加200mM EDTA铵溶液(内含有10％蔗糖)980ml，水化，并进行均质处理，获得小于500nm的脂质体。将此脂质体用001强酸性阳离子交换树脂(钠盐)(交换树脂用量为水化介质中阴阳离子所需交换容量的2倍)进行交换处理，除去外水相的EDTA铵，建立梯度。

2、载药

将处方量的盐酸拓扑替康以适量水溶解，加入上述梯度脂质体中，50℃孵育30分钟，得包封率大于90％的脂质体。加入10％明胶溶液20ml(含有羟苯乙酯10mg)，混匀，制备得到1000ml的拓扑替康脂质体。将脂质体分装于片型模具中(1ml与2ml两种规格)，冷冻干燥得到冻干口服脂质体。

口服每日早餐前至少30分钟空腹用200ml温开水送服，一次1mg，一日1次(脂质体冻干片，用前水复溶、稀释)。

同样我们可以建立其它各种囊泡(如，胆固醇半琥珀酸酯三羟甲基氨基甲烷(CHST)、生育酚半琥珀酸酯三羟甲基氨基甲烷(TST)、Tween20/胆固醇囊泡、Tween80/胆固醇囊泡、SOULAN、聚硼酸酯表面活性剂囊泡)梯度，也可以适用于其它具有内室的囊状结构，如微囊、纳米囊，建立囊内外梯度，实现主动装载盐酸拓扑替康或其它药物。

实施例15

处方HSPC    2g

F68         0.02g

水化介质：150mmol/L醋酸钙溶液(pH7.3)100ml。

脂质体制备方法：取HSPC、F68(Pluronic F-68)，以5ml乙醇溶解，得到脂质溶液。加入水化介质溶液至脂质溶液中，并18000psi高压均质处理，制备空白脂质体(186nm)。混合型离子交换树脂柱(732阳离子交换树脂与717阴离子交换树脂，其混合比例为湿视体积1∶0.5v/v)除去外水相的醋酸钙，建立醋酸钙梯度。以注射用水配制0.2％双氯酚酸钠溶液，加入上述空白脂质体中，55℃孵育20分钟，主动装载双氯酚酸钠入脂质体内水相。最后以10％葡萄糖稀释脂质体，得到0.1％双氯酚酸钠脂质体滴眼液。该滴眼液解决了现有双氯酚酸钠眼液的轻度刺痛问题，更易于为患者接受。

同法可以制备那格列奈脂质体，口服、舌下给药，或者口腔黏膜给药。

实施例16

组方：氯屈膦酸二钠    0.2g

EPC                   2g

胆固醇                0.5g

卖泽                  0.2g

称取处方量的EPC、胆固醇、卖泽，以乙醇溶解，加入20mL的0.1M醋酸钙溶液，水化脂质材料，并用均质机处理，降低粒度至约为30nm。以离子交换树脂(732阳离子交换树脂与717阴离子交换树脂、大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂(D151/D152(IRC-76/86))的混合比例为湿视体积1∶1∶0.1v/v/v)除去外水相的醋酸钙，建立醋酸钙梯度。将加入至上述空白脂质体中，50℃孵育20分钟，再用离子交换微孔膜过滤，得到氯屈膦酸二钠脂质体，其包封率大于60％。而常规的方法所制备脂质体的包封率小于20％。

实施例17

处方DLPC          2g

水化介质：100mM聚谷氨酸铵溶液100ml。

脂质体制备方法：取DLPC(二月桂酰胆碱)，用乙醇溶解，挥除乙醇，得到磷脂膜。以聚谷氨酸铵(聚谷氨酸的铵盐，以氨水调节聚谷氨酸溶液的pH值至7.0而得)溶液水化脂质膜，20000psi微射流分散方法制备粒径为100nm的脂质体，混合离子交换树脂(732阳离子交换树脂、D001大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂与D201大孔强碱性季胺I型阴离子交换树脂、717阴离子交换树脂，其混合比例为湿视体积1∶1∶1∶1v/v)除去外水相的聚谷氨酸铵，建立梯度。以0.9％氯化钠配制1％左布比卡因溶液，加入至上述空白脂质体中，30℃孵育30分钟，调节体积，得0.5％(g/ml)左布比卡因脂质体。包封率大于80％。

根据需要，可在处方中加入适量防腐剂，如羟苯乙酯。

本实施例获得的左布比卡因脂质体可以外用、注射、喷鼻等。

同理，可以制备盐酸奥布卡因脂质体(粒度可以控制为1000nm)滴眼液。

实施例18

处方SPC  50g

制备方法：以50ml 200mM磷酸铵水化磷脂，30000psi分散制备50％(g/g)SPC脂质体，采用混合离子交换树脂(732阳离子交换树脂与717阴离子交换树脂，其混合比例为湿视体积1∶1v/v)建立梯度，主动装载丙胺卡因(终浓度2.5％g/ml)与利多卡因(终浓度2.5％g/ml)，皮肤给药，可提高疗效。

同理可以制备盐酸利多卡因高浓度利多卡因脂质囊泡凝胶(VPG)，用于局部麻醉，减轻小儿注射部位疼痛，表面麻醉(包括在胸腔镜检查或腹腔手术时作粘膜麻醉用)等。

采用WA-2氨基酸专用树脂、WDX-3果汁脱色专用树脂、WD-6脱色树脂、WL-XF核用树脂、WTT脱铁树脂、IND90变色树脂、D208脱色专用树脂、D209饮用水除硝酸根树脂、D309脱色专用树脂或XDA-7均孔脱色树脂也能获得同样结果。

实施例19

处方EPC    20g

制备方法同实施例18。以300mM酒石酸铵制备20％(g/ml)EPC脂质体，采用混合离子交换树脂(732阳离子交换树脂与717阴离子交换树脂，其混合比例为湿视体积1∶1v/v)建立梯度，主动装载酒石酸卡巴拉汀(Rivastigmine tartrate)，包封率大于80％。所得制剂可以鼻腔给药实现脑靶向，提高疗效。

实施例20

处方HSPC        3g

谷固醇          1g

DSPE-PG8G       0.1g

DSPE-PEG₂₀₀₀    0.2g

水化介质        300mM柠檬酸缓冲液100mL

取处方量的HSPC、谷固醇、DSPE-PG8G(DSPE-8聚甘油)、DSPE-PEG₂₀₀₀，以10ml乙醇于60℃水浴搅拌溶解，得到脂质乙醇溶液。将300mM柠檬酸缓冲液(300mmol·L-1，pH3.6)加入至上述脂质乙醇溶液中，60℃水浴水化20min，得到空白脂质体初品，再经18000psi微射流均质处理，降低脂质体粒径至100nm，依次通过0.45、0.22μm微孔滤膜，即得空白脂质体混悬液(记为“脂质体1”)。

将上述空白脂质体(即“脂质体1”)20mL通过717阴离子交换树脂(待被交换除去的柠檬酸量为所采用的阴离子交换树脂的交换容量10％)，得到外水相除去柠檬酸的梯度脂质体，内外水相的pH梯度值约为3.5，即ΔpH＝3.5。取此梯度脂质体5mL与重酒石酸长春瑞滨(4mg·mL^-1)溶液3mL混合，45℃保温10min，制得重酒石酸长春瑞滨脂质体。将所得脂质体再次通过732阳离子交换树脂，除去外水相的游离药，测定所得脂质体的包封率约为100％。记为“脂质体A”。

另外“脂质体1”5mL与重酒石酸长春瑞滨(4mg·mL^-1)溶液3mL混合，加入0.5M磷酸钠溶液调节外水相pH值至7.1，即ΔpH＝3.5，45℃保温10min，制得重酒石酸长春瑞滨脂质体。测定所得脂质体的包封率约为93.6％。记为“脂质体B”(未除去外水相柠檬酸)。

毒性试验：取健康小鼠50只，雌雄混用，随机分为5组，分别记为“生理盐水组”、“柠檬酸组”、“重酒石酸长春瑞滨组”、“脂质体A组”和“脂质体B组”。单次尾静脉注射对应试验样品，观察3天，记录死亡情况。给药情况见表6，小鼠生存情况见表7。

表6给药方案

表7小鼠生存情况

很显然，“脂质体B”(未除去外水相柠檬酸)组中，小鼠死亡的原因与柠檬酸有关；而“脂质体A”(除去外水相柠檬酸)组，由于采用离子交换树脂处理后，除去了游离药物与枸橼酸，排除了枸橼酸对毒性的贡献，脂质体制剂的总体毒性降低。

实施例21

取16g蛋黄卵磷脂Lipoid E80分散于45ml含有3％TPGS(w/v)的枸橼酸铵缓冲液(200mM枸橼酸铵)中，搅拌。将得到的高黏度分散体转移到微射流中。1600psi分散2分钟，直至形成均匀的粘稠流体，即VPG(vesicular phospholipid gels，囊泡型磷脂凝胶)。

在上述VPG中加入阴/阳离子交换树脂(732阳离子交换树脂与717阴离子交换树脂，其混合比例为湿视体积1∶1v/v)，搅拌5分钟，过滤，分离除去树脂，即得建立梯度的高浓度脂质体。此梯度脂质体可以装载各种常规采用梯度载药的药物，如阿霉素、利多卡因、环丙沙星、长春新碱等等，包封率均大于80％，甚至可以达到100％。

由于VPG中磷脂浓度高，外水相物质运动/扩散极为缓慢，采用常规透析法，我们持续进行交换7天，也无法建立合适的梯度。

实施例22

处方盐酸左布比卡因      0.5g

HSPC                    3g

胆固醇                  0.3g

吐温80                  0.3g

卡波姆940               0.5g

甘油                    5g

三乙醇胺                适量

1、脂质体制备

取处方量的HSPC、胆固醇、吐温80，以适量乙醇，于55℃溶解，加入200mM硫酸铵溶液100ml水化，并进行均质处理，获得小于200nm的脂质体。将此脂质体用阴阳混合离子交换树脂(732阳离子交换树脂与717阴离子交换树脂，其混合比例为湿视体积1∶1v/v；使用量是待除去离子的2倍；或者SA-2氨基酸专用树脂；或者JK008均孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂；或者DOO1大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂)进行交换，除去外水相的硫酸铵，建立硫酸铵梯度。

2、载药

将处方量的盐酸左布比卡因以适量水溶解，加入上述梯度脂质体中，60℃孵育30分钟，得包封率大于80％的脂质体。

3、凝胶剂的制备

将处方量的卡波姆940与甘油用适量水溶解/分散，加入适量三乙醇胺调节pH至5～6，与上述脂质体混合，水补加100g，搅拌均匀即可获得盐酸左布比卡因脂质体凝胶。必要时可以加入防腐剂。

实施例23

处方盐酸左布比卡因    0.5g

HEPC                  30g

胆固醇                1g

吐温80                1g

甘油                  10g

1、脂质体制备

取处方量的HEPC、胆固醇、吐温80，以适量乙醇溶解，加入200mM枸橼酸铵溶液100ml，水化，并进行均质处理，获得小于500nm的脂质体。将此脂质体用阴阳混合离子交换树脂(同实施例22)进行交换，除去外水相的枸橼酸铵，建立枸橼酸铵梯度。

2、载药

将处方量的盐酸左布比卡因以适量水溶解，加入上述梯度脂质体中，65℃孵育30分钟，得包封率大于80％的脂质体。

常规方法无法建立梯度。

实施例24

处方组成：盐酸左旋氧氟沙星    200mg

二月桂酰磷脂酰肌醇            1000mg

二己酰磷脂酰甘油              200mg

二月桂酰磷脂酰胆碱            1000mg

DLPE-PEG₁₀₀                   3mg

水化介质：400mM硫酸铵溶液(含有5％蔗糖g/ml)50ml

取处方量的二月桂酰磷脂酰肌醇、二己酰磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰胆碱、DLPE-PEG₁₀₀，5ml乙醇，于35℃溶解，得脂质相。加入水化介质，搅拌，得到脂质体初品。均质处理，获得小于50nm的脂质体。将此脂质体用阴阳混合离子交换树脂(Dowex 50阳离子交换树脂与AmberliteIRA-400阴离子交换树脂，其混合比例为湿视体积1∶1v/v；使用量是待除去离子的2倍(按照交换容量计算))进行交换，除去外水相的硫酸铵，建立硫酸铵梯度。

载药：将盐酸左旋氧氟沙星加入至上述梯度脂质体中，30℃搅拌60分钟，得包封率大于80％的脂质体。此脂质体可以通过雾化给药，治疗肺部感染。

可以在处方中加入适量葡萄糖脂质衍生物靶向性物质，进行肺部靶向治疗。

实施例25

处方：DLPC    3g

胆固醇        1g

TPGS          1g

取处方量DLPC、胆固醇、TPGS，加入5ml乙醇溶解，得脂质相。以0.2mol/L三氯化铁溶液(内含1g聚乙二醇)50ml水化脂质相，制备脂质体，均质处理，降低粒径至约50nm。将脂质体通过阴阳离子混合型离子交换树脂柱(732阳离子交换树脂与717阴离子交换树脂)或者D390除铁专用树脂，除去未包入脂质体的外水相三氯化铁(氯离子与铁离子)，移入反应器中，通N2，滴加氨水，50℃下反应6h。除去残余的氨水，即得纳米磁性脂质体。以曲拉通X-100破坏双分子膜，并除去脂质材料，即得纳米四氧化三铁，即磁流体。

而同样处方，不采用离子交换树脂柱除去外水相四氧化三铁，无法制备成功纳米磁性脂质体与纳米四氧化三铁。

实施例26

处方：SPC    5g

      DSPC   0.5g

取处方量的SPCD与SPC，以适量二氯甲烷溶解，得脂质相。采用逆相蒸发法制备含有1％(g/ml)海藻酸钠的囊泡，超声或者均质机等手段处理，降低囊泡粒度至60～100nm，DEAE-葡聚糖凝胶(也可以采用大孔离子交换树脂)除去外水相的海藻酸根离子，加入醋酸钙溶液，40℃孵育3小时。然后采用混合离子交换树脂(732阳离子交换树脂/717阴离子交换树脂)除去外水相的醋酸钙，加入乙醇溶解膜材料，除去囊泡膜材料，得到纳米凝胶。

其它阴离子物质可以采用类似方法制备纳米凝胶。

另外，对于含有氮原子的化合物，如甲壳胺，可以制备甲壳胺囊泡，以适当方法减少粒径至所需粒径，如60nm，然后以阳离子交换剂，如DEAE-葡聚糖凝胶，除去外水相甲壳胺，即得。尚可以用甲醛、戊二醛等物质进行固化得到粒度均匀的纳米粒或者纳米凝胶。而用常规方法，如离心、超滤、葡聚糖分子筛等技术难以获得满意结果。

实施例27

处方HSPC    3g

CH          1g

CHS-PEG     1g

水化介质的配制：取5ml 20mg/ml的低分子肝素和4ml 250mmol的EDTA铵盐溶液，将两者加入到10ml容量瓶内，水加至刻度，混匀，得到水化介质。

脂质体制备方法：65℃，用10％乙醇(v/v)溶解处方量膜材，挥去乙醇得脂质相；将预热至65℃的水化介质注入脂质相，孵育30min，制得脂质体初品，再经200W超声初步混合2min后，400W超声分散6min(工作3s，间歇3s)，依次通过0.8、0.45、0.22μm的微孔滤膜，即得空白脂质体。

梯度建立：取空白脂质体，与混合树脂(732阳离子交换树脂与717阴离子交换树脂的混合比例为湿视体积1∶2v/v)混合放置0min、5min、10min、15min后，在2000rpm下离心4min，建立梯度。

载药：将除盐后的空白脂质体(梯度脂质体)与4mg/ml阿霉素溶液按照药脂比1∶10(w/w)混合，60℃下载药20min，得到阿霉素脂质体。

包封率的测定：精密移取0.2mL阿霉素脂质体于10.0mL容量瓶中，加入1.6mL蒸馏水，以90％异丙醇(含0.75mol·L^-1HCl)破乳并稀释至刻度，摇匀，480nm波长下测定吸光度A0(药物总吸收度)。另精密移取0.2mL阿霉素脂质体，置于阳离子交换树脂柱顶端表面中央，2000rpm离心4min，再于柱顶端加入0.4mL蒸馏水，2000rpm离心4min，重复3次，合并洗脱液。洗脱液转移至10.0mL容量瓶中，用90％异丙醇(含0.75mol·L^-1HCl)破乳并稀释至刻度，摇匀，测定吸光度A₁(被包封药物的吸收度)。包封率计算公式如下：

$\mathrm{EntrapmentEfficiency}/\%=\frac{A_1}{A_0}\×100$

包封率，结果见表8。

表8不同除盐时间对包封率的影响

除盐时间	0min	5min	10min	15min
					包封率％	95.5％	97.3％	98.9％	96.2％

实验结论：从表8可知，在15分钟内，包封率与吸附除盐时间无关。

实施例28

处方：HSPC    300mg

CH            100mg

PEG-CHS       100mg

水化介质：0.3M的硫酸锰溶液10ml。

制备方法：将处方中HSPC、CH、PEG-CHS在65℃下溶于1ml乙醇，将脂类混合物溶液用0.3M的硫酸锰溶液水化30min。探头超声分散(200W，2min；400W，8min)，依次通过0.8μm、0.45μm、0.22μm微孔滤膜各5次。以混合树脂柱(D111大孔阳离子树脂∶D202阴离子树脂＝1∶2)处理除去外水相硫酸锰，建立硫酸锰梯度。

载药：在梯度脂质体中加入钙离子载体A23187，按照药脂比为1∶10加入阿霉素，60℃孵育30min，得到阿霉素脂质体。包封率大于95％。

Claims (15)

1.一种具内外水相梯度差的囊泡，其特征在于，所述囊泡通过采用离子交换方法单独或与其它方法结合除去空白囊泡水化介质中的阳离子、阴离子、阴阳离子和/或荷电大分子物质后获得。

2.如权利要求1所述的囊泡，其特征在于，所述其它方法包括透析法、超滤法。

3.如权利要求1所述的囊泡，其特征在于，所述离子交换方法中采用的离子交换剂为特种树脂时，其选自下列物质中一种：WA-2氨基酸专用树脂、催化剂树脂、WDX-3果汁脱色专用树脂、WD-6脱色树脂、WL-XF核用树脂、WTT脱铁树脂、IND90变色树脂、D208脱色专用树脂、D209饮用水除硝酸根树脂、D309脱色专用树脂或XDA-7均孔脱色树脂。

4.如权利要求1所述的囊泡，其特征在于，所述离子交换方法中所采用的离子交换剂为阳离子交换树脂或离子交换膜，当离子交换剂为阳离子交换树脂时，其选自下列物质中至少一种：001强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂、111弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂、112弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂、122弱酸性酚醛系阳离子交换树脂、D001大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂、D111大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂、D390盐酸除铁专用树脂、D401大孔苯乙烯系螯合型离子交换树脂、CAT600大孔苯乙烯系强酸催化树脂大孔强酸氢型阳离子交换树脂、CAT601大孔强酸催化树脂苯乙烯系大孔强酸氢型阳离子交换树脂、C005催化专用树脂苯乙烯系凝胶强酸阳离子交换树脂、D002-II型耐高温树脂、C004生物碱提取专用树脂苯乙烯系凝胶强酸阳离子交换树脂、C008生物碱提取专用树脂苯乙烯系大孔强酸阳离子交换树脂、B108氨基酸提取专用树脂苯乙烯系大孔强酸阳离子交换树脂、C610硫脲树脂、C620巯基树脂、C700硼选择性树脂、C800氨基羧酸树脂或C900氨基膦酸树脂，其用量为水化介质中阳离子所需交换容量的1-1000倍。

5.如权利要求1所述的囊泡，其特征在于，所述离子交换方法中采用的离子交换剂为阴离子交换树脂时，其选自下列物质中至少一种：201强碱性季胺I型阴离子交换树脂、301弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂、303弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂、331弱碱性环氧系阴离子交换树脂、401螯合性胺羧基离子交换树脂、D201大孔强碱性季胺I型阴离子交换树脂、D202大孔强碱性季胺II型阴离子交换树脂、D301大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂、D302大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂、D311大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂、D206耐高温阴离子交换树脂、D215大孔丙烯酸系强碱阴离子交换树脂、D363大孔弱碱阴离子交换树脂或D204大孔苯乙烯系强碱性阴离子交换树脂，其用量为水化介质中阴离子所需交换容量的1-1000倍。

6.如权利要求1所述的囊泡，其特征在于，所述水化介质中：阳离子包括Ca²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、NH₄ ⁺、K⁺、Fe²⁺、C₂H₄(NH₃ ⁺)₂、(CH₃CH₂)₃NH⁺、HOC₂H₄NH₃ ⁺、(HOC₂H₄)₃NH⁺、(HOCH₂)₆CH₃NH₂ ⁺或三羟甲基氨基甲烷；阴离子包括SO₄ ^2-、PO₄ ^3-、HPO₄ ^2-、H₂PO₄ ^-、Cl^-、枸橼酸根、醋酸根、EDTA^4-、六偏磷酸根、三聚磷酸根、焦磷酸根、甘油磷酸根、果糖二磷酸根、三磷酸腺苷根、植酸根、邻苯二甲酸根、间苯二甲酸根、对苯二甲酸根、苯甲酸根、间苯二甲酸根、间苯三甲酸根、乳糖酸根、二巯基丁二酸根、二乙三胺五乙酸根、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸根或氨基三乙酸根；荷电大分子物质包括蛋白质、肽类、酶类，以及这些物质或其他大分子物质的硫酸酯、磺酸酯或磷酸酯衍生物，如磷酸化蛋白质，肝素、右旋糖酐硫酸酯、壳聚糖及其衍生物、明胶及其衍生物、琥珀酰明胶及其衍生物、多糖硫酸酯、低聚岩藻聚糖硫酸酯、木聚糖硫酸酯、海藻酸及其衍生物、透明质酸及其衍生物。

7.权利要求1-6任何一项所述囊泡的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：

(1)制备空白囊泡；

(2)将(1)得到的空白囊泡用离子交换剂处理，然后洗脱处理即可得到具内外水相梯度差的囊泡。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中制备空白囊泡时加入酸敏、温敏、光敏或靶向性物质。

9.权利要求1-6任一所述囊泡在制备药物上的应用，其特征在于，所述应用包括：将具内外水相梯度差的囊泡与药物溶液混合，实现主动载药后即可获得药物制剂。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物制剂再用离子交换剂处理。

11.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的药物制剂加入海藻糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、葡萄糖、氯化钠或蛋白质后作冻干处理。

12.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物为能采用离子梯度法进行包封的药物，其中所述离子梯度法包括pH梯度法、铵梯度法、醋酸钙梯度法和细胞离子载体离子梯度法。

13.权利要求1-6任一所述囊泡在制备脂质体凝胶上的应用。

14.权利要求1-6任一所述囊泡在制备磁性脂质体上的应用。

15.权利要求1-6任一所述囊泡在制备纳米粒/纳米凝胶上的应用。