CN103156871A - 避免连续多次注射盐酸表阿霉素peg化脂质体加速血液清除现象的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及避免连续多次注射PEG化脂质体的加速血液清除现象的方法，具体涉及首次注射空白脂质体及PEG化盐酸表阿霉素脂质体对二次注射PEG化盐酸表阿霉素脂质体中盐酸表阿霉素药动学行为的影响，以及连续多次注射PEG化脂质体的加速血液清除现象。在此基础上提供减轻或避免加速血液清除PEG化盐酸表阿霉素脂质体的给药剂量。本发明是通过改变首次或连续注射时盐酸表阿霉素的剂量，达到避免药物从脂质体内释放同时减轻或消除加速血液清除现象的目的。

Description

避免连续多次注射盐酸表阿霉素PEG化脂质体加速血液清除现象的方法

技术领域：

本发明属于医药技术领域，具体涉及首次注射空白脂质体及盐酸表阿霉素脂质体对二次注射盐酸表阿霉素脂质体中盐酸表阿霉素药动学行为的影响，以及连续多次注射PEG化脂质体的加速血液清除（Accelerated Blood Clearance，ABC）现象，并提供减轻或避免ABC现象的盐酸表阿霉素脂质体的给药剂量。

背景技术：

常规的普通（经典/传统）静脉给药系统，如普通脂质体，易被单核巨噬细胞系统（MPS）吞噬，静脉注射后迅速分布至肝、脾等器官，导致脂质体血液循环时间短、靶向性差。为了解决此类问题，研究人员利用聚乙二醇（PEG）类脂质衍生物对脂质体表面进行修饰，利用PEG兼有亲水性、柔顺性的特点，延长脂质体体内循环时间，减少MPS器官/组织的分布量，增加靶向性，也大大提高了载体及药物的物理、化学和生物学稳定性。此项技术被称为PEG化，利用该技术制备的脂质体为PEG化脂质体，亦称为空间稳定脂质体（Sterically Stabilized Liposomes）。以PEG化技术制备的阿霉素脂质体，极大地延长了阿霉素在血液中的循环时间，降低了心脏毒性，并增加其在肿瘤中的分布量，提高抑瘤率。该项研究成果在Nature杂志上发表（Lasic DD. Doxorubicin in sterically stabilized liposomes [J]. Nature, 1996, 380: 561–562），由此掀起PEG化脂质体研究的热潮，并取得了较好的成果，如PEG化阿霉素脂质体（Doxil）获得FDA批准用于卡波氏肉瘤、卵巢癌等疾病的治疗；PEG化顺铂脂质体的半衰期由原来普通脂质体的20分钟延长至5天等，目前尚有多种PEG化脂质体制剂在临床试验中。鉴于PEG化给药系统具有独特的长循环性与靶向性，研究者们尝试各种方法/手段，在PEG化载体表面上连接配体（如RGD 肽、APRPG肽、半乳糖配体、甘露糖配体、葡萄糖、低密度脂蛋白、转铁蛋白、叶酸、血管活性肠收缩肽、细胞膜穿透肽等）和/或抗体，达到主动靶向递药目的，在治疗、诊断（量子点、纳米金、纳米铁、磁流体、同位素、荧光、光化疗和放疗）、预防等领域中前景广阔。

基于临床需要多次给药的考虑，Dams等（Dams ETM, Laverman P, Oyen WJG, et al. Accelerated blood clearance and altered biodistribution of repeated injections of sterically stabilized liposomes [J]. J Pharmacol exp Ther, 2000, 292: 1071–1079）以^99mTc标记脂质体，研究大鼠重复注射PEG化脂质体后的药动学参数和组织分布变化情况，结果发现第二次注射的脂质体血浆水平表现出极大降低（20分钟时的浓度约为首次注射的10%），且肝摄取量从8.1±0.8%骤升至46.2±9.8%，此即为ABC现象。

2005年，Wang等正式提出ABC现象的定义，即“同一大鼠，以一定的时间间隔两次注射PEG化脂质体，二次注射的PEG化脂质体被快速清除的现象”（ Wang XY, Ishida T, Ichihara M, et al. Influence of the physicochemical properties of liposomes on the accelerated blood clearance phenomenon in rats [J]. J Control Release, 2005, 104: 91–102），此定义仅局限于大鼠。2008年，Ishida等将此定义修正为“当同一动物以一定时间间隔两次注射PEG化脂质体，二次注射的PEG化脂质体丧失长循环特性的现象”（ Ishida T, Kashima S, Kiwada H. The contribution of phagocytic activity of liver macrophages to the accelerated blood clearance (ABC) phenomenon of PEGylated liposomes in rats [J]. J Control Release, 2008, 126(2): 162–165）。

脂质体作为药物载体具有增加药物稳定性、延缓药物释放、降低药物毒性、增强药物靶向性以及提高药物疗效等优势。近年来，将细胞毒药物装载入脂质体以增加药物抗肿瘤效果，降低药物毒性的相关研究越来越多。2006年，Ishida等（Ishida T, Atobe K, et al. Accelerated blood clearance of PEGylated liposomes upon repeated injections: Effect of doxorubicin-encapsulation and high-dose first injection[J]. J Control Release, 2006, 115: 251–258）以³H标记的胆固醇十六烷基醚作为二次注射脂质体的脂质相标记物，研究了首次注射PEG化盐酸阿霉素脂质体对二次注射PEG化空白脂质体ABC现象的影响。结果发现当首次注射PEG化盐酸阿霉素脂质体中阿霉素的剂量达到0.16 mg/kg时（相应磷脂剂量为1 μmol/kg），即可消除二次注射PEG化空白脂质体的ABC现象。目前认为该现象的出现主要是首次注射的盐酸阿霉素脂质体对脾脏边缘区B细胞具有一定的杀伤作用，影响了抗PEG的IgM的产生。该实验仅仅采用放射性标记研究了首次注射盐酸表阿霉素脂质体对二次注射空白脂质体ABC现象的影响，并没有对重复注射盐酸阿霉素脂质体的ABC现象进行研究。2001年，Laverman等（Laverman P, Myrra G, et al. Factors Affecting the Accelerated Blood Clearance of Polyethylene Glycol-Liposomes upon Repeated Injection[J]. J Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2001, 298(2): 607–612）以¹¹¹In标记盐酸阿霉素脂质体楷莱（Caelyx），首次分别给予5 μmol磷脂/kg的空白脂质体和未进行放射性标记的楷莱（相应阿霉素的给药剂量为0.7 mg/kg），二次给予¹¹¹In标记的楷莱。结果发现重复注射楷莱并没有引起ABC现象，值得注意的是该研究中并没有对二次注射楷莱后盐酸阿霉素的药动学行为进行研究。

目前，对于ABC现象的研究主要是通过对载体进行放射性标记，以考察二次或多次注射后载体的药动学行为及组织分布的改变。2008年，Cui等（Cui JX , Li CL, et al. Repeated injection of pegylated liposomal antitumour drugs induces the disappearance of the rapid distribution phase [J]. J Pharmacy and Pharmacology, 2008, 60: 1651–1657）以小鼠为实验动物对重复注射盐酸表阿霉素脂质体和盐酸米托蒽醌脂质体的ABC现象进行了研究。与上述以放射性元素标记载体不同的是该实验主要对二次注射后盐酸阿霉素和盐酸米托蒽醌药动学和组织分布的改变进行了研究。实验过程中盐阿霉素和盐酸米托蒽醌的给药剂量分别为8 mg/kg和4 mg/kg，相应的磷脂剂量约为80 μmol磷脂/kg。实验发现在此给药剂量下并未引起二次注射脂质体的ABC现象，这一结果的出现可能有以下两个原因：首次注射的高剂量药物抑制了脾脏边缘区B细胞的增殖；同时首次注射的高剂量磷脂也会使免疫系统产生耐受。遗憾的是该实验并未对首次注射空白以及载药脂质体的剂量（磷脂剂量以及药物剂量）对二次注射载药脂质体后药物药动学和组织分布的变化进行研究。低剂量连续给药具有降低药物毒性，避免肿瘤细胞产生的多药耐药性等优势，近些年来得到了较广泛的应用。值得注意的是，脂质体的连续低剂量注射可能会导致ABC现象的产生。因此，我们在国家自然科学基金资助下（No 81072602）对首次注射空白脂质体的磷脂剂量以及首次注射盐酸表阿霉素脂质体中盐酸表阿霉素的剂量对二次注射盐酸表阿霉素脂质体中盐酸表阿霉素药动学行为的影响，以及连续多次注射PEG化脂质体的加速血液清除现象进行了研究。本发明还提供了解决连续多次注射低剂量PEG化脂质体时产生ABC现象的方法。

发明内容

本发明的目的是以盐酸表阿霉素脂质体为模型，研究首次注射空白脂质体及盐酸表阿霉素脂质体对二次注射盐酸表阿霉素脂质体中盐酸表阿霉素药动学行为的影响，并对连续多次注射PEG化脂质体的加速血液清除现象进行了考察，在此基础上提供减轻或避免加速血液清除盐酸表阿霉素脂质体时可能产生ABC现象的方法。

脂质体、纳米粒、纳米乳等作为一类常用的纳米给药载体，其主要作用是将药物被动或者主动转运至病变部位，如炎症部位和肿瘤组织。在药物传递系统中，载体仅仅作为一种运输工具，药物作为治疗疾病的主体，在这一工具的协助下而发生的自身体内药动学行为的改变应该作为我们研究的重点。虽然本发明仅以盐酸表阿霉素为药物，以脂质体为载体来研究二次注射后药物体内药动学行为的变化，但是该发明并不仅仅局限于此。

本发明的研究结果同样可用于指导脂质体以外的其它载体（纳米粒、纳米乳、碳纳米管等）中药物代谢动力学的研究。其中上述载体中装载的药物包括但不限于下列药物：

如蒽环类抗肿瘤抗生素，包括盐酸表阿霉素、盐酸表阿霉素和吡柔比星；长春花属生物碱，包括长春瑞滨、长春新碱、长春花碱和长春地辛；喹诺酮类抗生素，如环丙沙星、氟哌酸、氧氟沙星、依诺沙星、甲氟沙星、恩诺沙星、洛美沙星、氟罗沙星、加替沙星、司帕沙星、莫西沙星、克林沙星和吉米沙星等。如各种氨基酸、罗丹明B或其类似物、依沙吖啶(利凡诺) 或其类似物、吖啶橙（碱性橙 14、3,6-双(二甲基氨基)吖啶氯化锌盐酸盐）或其类似物；5-羟色胺受体拮抗剂，包括昂丹司琼、托烷司琼、格拉司琼、帕洛诺司琼、雷莫司琼等。

如局部麻醉药包括盐酸阿替卡因、普鲁卡因、可卡因、利多卡因、麻卡因、卡波卡因、丙胺卡因等；大环内酯类药物，如阿奇霉素及其盐。

如噻吗洛尔及其盐、美托洛尔及其盐、比索洛尔及其盐、普萘洛尔及其盐、索他洛尔及其盐、伏立康唑及其盐等。 

如荷电大分子物质，RNA干扰，即核苷酸、DNA脱氧核糖核酸、siRNA、蛋白质、酶、荷电多糖、甲壳胺、阿拉伯胶、海藻酸、羧甲基纤维素、琥珀明胶；荷电大分子聚合物，如树枝状物质中的PAMAM。

其它药物：如曲马多及其盐、芬太尼及其盐、舒芬太尼及其盐、氨溴索及其盐、氯诺昔康及其盐、甲磺酸二氢麦角碱、盐酸川丁特罗（特罗类）、多巴酚丁胺、盐酸洛哌丁胺、阿替洛尔酒石酸美托洛尔、氯苯丁胺、麦角胺、PEI（聚乙胺）、表皮生长因子（FGF）、蜂毒肽等。

如生物碱，包括植物、海洋生物、微生物、真菌及昆虫来源。

生物碱一般按化合物结构类型或生物合成途径进行分类。 一些常见的生物碱结构类型如下：

1、异喹啉类生物碱

 异喹啉类生物碱是生物碱中最大的一类，以异喹啉或四氢异喹啉为母核，根据连接基团的不同，又可分为九类：（1）单异喹啉类生物碱，如鹿尾草中的降血压成分鹿尾草碱；

（2）苄基异喹啉类生物碱，异喹啉核的1位接有苄基，如阿片中的解痉成分罂粟碱；

（3）双苄基异喹啉类生物碱，两个苄基异喹啉在酚羟基位置以醚键方式相连，如莲子芯中的莲心碱；

（4）阿扑芬类生物碱，苄基异喹啉类生物碱的两个苯环相连组成的四环化合物，如千金藤碱；

（5）原小蘖碱类生物碱，为两个异喹啉的稠合，如黄连中所含的抗菌成分黄连素；

（6）普鲁托品类生物碱，含羰基的小蘖碱开环化合物，如延胡索中的普鲁托品；

（7）吐根碱类生物碱，异喹啉环带苯骈喹啉啶环，如吐根中治疗阿米巴痢疾的有效成分吐根碱；

（8）α-萘菲啶类生物碱，如搏落回中的血根碱；

（9）吗啡类生物碱。

2、喹啉类生物碱

 喹啉类生物碱的母核是喹啉环，其中最重要的一类是金鸡纳生物碱。

3、吡咯烷类生物碱

（1）简单的吡咯烷生物碱，如古柯叶中分离出的液体生物碱古豆碱、新疆党参中的党参碱；

（2）双稠吡咯烷类生物碱，由叔氮稠合两个吡咯烷而成，如阔叶千里光中分得的阔叶千里光碱；

（3）吲哚里西定类生物碱，以叔氮稠合吡咯烷与哌啶环而组成的吲哚里西定环，如白牵牛碱；

（4）莨菪烷类生物碱，由吡咯烷与哌啶骈合而成的杂环，常见的是与有机酸成酯的阿托品类生物碱；

（5）百部生物碱，百部根中分离得到的生物碱大多含有吡咯环，因此也纳入吡咯烷类生物碱。

4、吲哚生物碱

以吲哚环为母核的生物碱，如治疗白血病的高效药物长春新碱等。

本发明的目的之一是阐明首次注射空白脂质体和盐酸表阿霉素脂质体对二次注射盐酸表阿霉素脂质体后盐酸表阿霉素药动学行为改变的关系。为实现该目的，发明人提供如下技术方案。

以大鼠为实验动物，首次注射不同磷脂剂量的PEG化空白脂质体和盐酸表阿霉素脂质体，第7天眼眶静脉丛取血，分离血清。将盐酸表阿霉素脂质体与血清进行孵育，以考察不同时间盐酸表阿霉素从脂质体中的释放率。

本发明的目的之二是提供首次注射时盐酸表阿霉素的剂量范围，以达到减轻或消除重复注射盐酸表阿霉素脂质体的ABC现象。为实现该目的，发明人提供如下技术方案。

一种盐酸表阿霉素脂质体，在所述的给药剂量下能够减轻或完全消除重复注射盐酸表阿霉素脂质体而产生的ABC现象。

作为优选方案，其中所述的盐酸表阿霉素给药剂量范围为大于0.1 mg/kg。

作为更优选方案，其中所述的盐酸表阿霉素给药剂量范围为0.2-5.0 mg/kg。

作为最优选方案，其中所述的盐酸表阿霉素给药剂量范围为0.3-2.0 mg/kg。

其中所述的盐酸表阿霉素脂质体中盐酸表阿霉素与磷脂的质量比为0.025:1~1:1，优选为0.05:1~0.5:1，更优选为0.1:1~0.25:1。

本发明的目的之三是对PEG化脂质体连续给药时的ABC现象进行研究，同时提供解决连续多次注射PEG化脂质体的加速血液清除现象的方法。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、以药物本身药动学和组织分布的改变研究重复注射脂质体的ABC现象，为指导临床用药提供更加合理的依据。

2、对ABC现象中伴随的药物从载体释放情况的阐明，为ABC现象的研究开辟了新的思路。

附图说明

图1为实施例2中首次注射空白脂质体与盐酸表阿霉素脂质体后二次注射盐酸表阿霉素脂质体的药时曲线。

其中“                                                ”、“

”、“

”、“

”、“

”、“

”、“

”、“”、“

”和“

”分别代表首次注射5%葡萄糖溶液、1 μmol磷脂/kg 空白脂质体、5 μmol磷脂/kg 空白脂质体、10 μmol磷脂/kg 空白脂质体、15 μmol磷脂/kg 空白脂质体、50 μmol磷脂/kg 空白脂质体、1 μmol磷脂/kg盐酸表阿霉素脂质体、5 μmol磷脂/kg盐酸表阿霉素脂质体、10 μmol磷脂/kg盐酸表阿霉素脂质体和15 μmol磷脂/kg盐酸表阿霉素脂质体。

图2为实施例2首次注射空白脂质体与盐酸表阿霉素脂质体后二次注射盐酸表阿霉素脂质体的肝脾分布情况。

图3为实施例3中首次注射空白脂质体与盐酸表阿霉素脂质体后第7天血清中抗PEG的IgM含量。

图4为实施例4中首次注射空白脂质体与盐酸表阿霉素脂质体后第7天的血清与盐酸表阿霉素脂质体孵育的药物释放曲线。

其中“

”、“

”、“

”、“

”、“”、“

”、“

”、“

”、“

”和“

”分别代表首次注射5%葡萄糖溶液、1 μmol磷脂/kg 空白脂质体、5 μmol磷脂/kg 空白脂质体、10 μmol磷脂/kg 空白脂质体、15 μmol磷脂/kg 空白脂质体、50 μmol磷脂/kg 空白脂质体、1 μmol磷脂/kg盐酸表阿霉素脂质体、5 μmol磷脂/kg盐酸表阿霉素脂质体、10 μmol磷脂/kg盐酸表阿霉素脂质体和15 μmol磷脂/kg盐酸表阿霉素脂质体。

图5为实施例5中首次注射不同磷脂剂量盐酸表阿霉素脂质体，二次注射5 μmol磷脂/kg的盐酸表阿霉素脂质体的药时曲线。

其中“

”、“

”、“

”、“

”、“

”和“”分别代表首次注射5%葡萄糖溶液、以及药脂比为0.2、0.1、0.05、0.02和0.01的盐酸表阿霉素脂质体。

图6为实施例6中连续注射低剂量盐酸表阿霉素脂质体中最后一次注射盐酸表阿霉素脂质体的药时曲线。

其中“

”、“

”、“

”、“

”、“

”、“

”、“

”、“

”、“

”和“

”分别代表连续1、2、3、4、5、6、7、8、9和10天注射盐酸表阿霉素脂质体。

图7为实施例7中连续注射不同剂量的盐酸表阿霉素脂质体，第7次注射盐酸表阿霉素脂质体的药时曲线。

其中“”、“

”和“

”分别代表连续7天注射0.75、1.0和1.25 mg/kg的盐酸表阿霉素脂质体。

具体实施方式

下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若非特指，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例1  盐酸表阿霉素脂质体的制备

处方为：

HSPC            3.0 g

CH              1.0 g

MPEG₂₀₀₀-DSPE   1.0 g

制备工艺为：

65 ℃下，用5%乙醇（v/v）溶解处方量膜材，注入60 mL预热至相同温度的水化介质（200 mmol·L^-1(NH₄)₂SO₄溶液），孵育20 min，制得脂质体初品，经微射流处理（压力为14000 psi)，将粒径减小至100 nm，依次通过0.8、0.45和0.22 μm的微孔滤膜，即得空白脂质体。

梯度建立：取空白脂质体，与混合树脂（732钠型阳离子交换树脂与 717氯型阴离子交换树脂的混合比例为湿视体积1：2）混合放置5 min后，在2000 rpm下离心4 min，建立梯度。

载药：按照药脂比1：10（w/w）向梯度脂质体中加入盐酸表阿霉素溶液，60 ℃下载药20 min，得盐酸表阿霉素脂质体，包封率大于95%。

实施例2  首次注射空白脂质体和盐酸表阿霉素脂质体对二次注射盐酸表阿霉素脂质体ABC现象的影响

1 血浆及组织样品的处理

1.1 血浆样品的处理：取大鼠血浆0.1 mL，置7 mLEp管中，加入含0.3 mol·L^-1 HCl的甲醇-水（50:50，v/v）溶液4.9 mL，涡旋30 s混匀。混悬液10000 rpm离心10 min，取上清液测定荧光值。

1.2 组织样品的处理：取0.5 g组织于7 mLEp管中，加入1 mL生理盐水高速分散匀浆，精密移取组织匀浆液0.2 mL，加入含0.3 mol·L^-1 HCl的甲醇-水（50:50，v/v）溶液4.8 mL，涡旋30 s混匀。混悬液10000 rpm离心10 min，取上清液测定荧光值。

2 荧光分光光度体内分析方法的建立

用灭菌注射用水分别配制浓度为1.0、2.0、4.0、8.0、16、32、64 μg·mL^-1的系列盐酸表阿霉素贮备溶液，分别取0.1 mL加入大鼠血浆和组织匀浆液，按“1”的方法处理，配制得浓度为0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28 μg·mL^-1的盐酸表阿霉素标准溶液。用荧光分光光度计（E_x = 502 nm，E_m = 562 nm）测定荧光强度F，样品F值减去空白血浆及组织样品F值，得到ΔF值，并以此ΔF值对盐酸表阿霉素浓度C（μg·mL^-1）进行线性回归，结果见表1。

表1 标准曲线方程 (ΔF-C)

	标准曲线方程	线性范围 (μg·mL-1)	R2
				血浆	ΔF=700.17C+8.08	0.02~1.28	0.9997
肝	ΔF=685.23C-12.16	0.02~1.28	0.9989
				脾	ΔF=674.651C-7.84	0.02~1.28	0.9991

方法回收率、精密度均符合要求。

3 给药方案

取雄性Wistar大鼠，体重210~240 g，随机分组，每组三只动物，尾静脉注射给药，按表2进行实验，间隔7天以5 μmol 磷脂/kg的剂量二次注射盐酸表阿霉素脂质体，并于二次注射前一天经眼眶静脉丛取血，分离血清。二次给药后分别于0.083、0.25、0.5、1、2、4 h经眼眶静脉丛取血，4000 rpm离心10 min获取血浆，4 h取血后将大鼠脱颈处死，取出肝脾，生理盐水洗去残留血液后以滤纸吸干水分。按“1”的方法处理，于荧光分光光度计上测定F值，样品F值减去空白血浆及组织F值得△F值，由标准曲线计算各时间点血浆及组织中药物浓度，结果见图1和图2。

由图1可知，首次注射葡萄糖溶液，二次注射盐酸表阿霉素脂质体呈现出长循环特性。与对照组相比，首次注射空白脂质体剂量为1 μmol磷脂/kg时ABC现象最严重，二次给药后5 min，盐酸表阿霉素含量已降至注射剂量的10%以下。随着首次注射空白脂质体磷脂剂量的增加ABC现象逐渐减弱，当注射剂量达到 50 μmol磷脂/kg时ABC现象完全消失。首次注射盐酸表阿霉素脂质体中盐酸表阿霉素剂量达到1.2 mg/kg时ABC现象才完全消失。这一结果与文献关于阿霉素脂质体ABC现象（Ishida T, Atobe K, et al. Accelerated blood clearance of PEGylated liposomes upon repeated injections: Effect of doxorubicin-encapsulation and high-dose first injection[J]. J Control Release, 2006, 115: 251–258）的报道不符，于是我们对载有阿霉素脂质体的制剂进行了ABC现象研究，得到的结果与盐酸阿霉素脂质体几乎一致（数据未给出）。

为了进一步验证盐酸表阿霉素脂质体的ABC现象，我们对二次给药后的肝脾聚集量进行了测定，结果发现对于ABC现象最为强烈的一组即首次注射空白脂质体剂量为1 μmol磷脂/kg，其肝脏的药物聚集量仅仅为对照组的2倍，这与文献报道的5倍相差较大。上述实验结果给我们一个很重要的提示：我们的实验结果与文献不符的一个可能原因是我们采用药物作为标记，文献则直接对载体进行放射性标记。也就是说我们是在考察首次注射不同剂量空白及载药PEG化脂质体对二次注射脂质体中药物药动学行为的影响，文献则是在考察首次注射不同剂量空白及载药PEG化脂质体对二次注射脂质体载体药动学行为的影响。如果二次注射的脂质体与首次注射脂质体产生的IgM结合导致药物的释放，那么实验过程中出现与文献报道不一致的现象也就不足为奇了。

表2 首次注射空白脂质体和盐酸表阿霉素脂质体给药方案 

分组	首次注射
		A	5%葡萄糖溶液
B	1 μmol磷脂/kg 空白脂质体
		C	5 μmol磷脂/kg 空白脂质体
D	10 μmol磷脂/kg 空白脂质体
		E	15 μmol磷脂/kg 空白脂质体
F	50 μmol磷脂/kg 空白脂质体
		G	1 μmol磷脂/kg盐酸表阿霉素脂质体
H	5 μmol磷脂/kg盐酸表阿霉素脂质体
		I	10 μmol磷脂/kg盐酸表阿霉素脂质体
J	15 μmol磷脂/kg盐酸表阿霉素脂质体

实施例3  血清中抗PEG的IgM含量测定

参考Ichihara等（Ichihara M, Shimizu T, et al. Anti-PEG IgM Response against PEGylated Liposomes in Mice and Rats[J]. Pharmaceutics, 2011, 3: 1–11）的方法，测定血清中抗PEG的IgM含量测定。具体过程如下：将MPEG₂₀₀₀-DSPE用无水乙醇配制成浓度为0.2 mmol·L^-1的溶液，取50 μL加入96孔板中，室温状态下待96孔板完全干燥后，加入含有1%BSA的Tris缓冲液（50 mmol·L^-1的Tris，0.14 mmol·L^-1的NaCl，pH8.0）100μL封闭1 h，然后用含有0.05%Tween20的Tris缓冲液连续清洗三次。将血清样品稀释100倍，每孔中加入100μL，室温孵育1 h，用含有0.05%Tween20的Tris缓冲液连续清洗五次，每孔中加入1μg/mL的辣根过氧化物酶连接的羊抗大鼠IgM，室温孵育1 h，同样清洗五次。加入1 mg/mL的苯二胺100μL显色5-10 min，最后加入2 mol·L^-1的硫酸100μL，终止反应，采用酶标仪于490 nm处测定吸光度，结果见图3。由图3可知，随着首次注射脂质体中磷脂剂量和药物剂量的增加，抗PEG的IgM含量逐渐降低。这主要与脾脏边缘区B细胞的免疫耐受以及盐酸表阿霉素对该细胞的杀伤作用相关。

实施例4  体外血清孵育实验

从A-J组分别取二次注射前一天分离得到的血清0.6 mL，加入磷脂浓度为2.5 μmol/kg的盐酸表阿霉素脂质体0.05 mL，37 ℃水浴搅拌，分别于0.083、0.25、0.5、1、2和4 h取出0.04 mL各两份，其中一份加至阳离子交换纤维柱表面中央，立即2000 rpm离心4 min，加入灭菌注射用水0.3 mL，2000 rpm离心4 min，重复上述操作两次，收集洗脱液转移至1.5 mLEP管中。另一份置1.5 mLEP管中，加入灭菌注射用水0.9 mL，混匀。从上述EP管中各取0.4 mL，置7 mL Ep管中，加入含0.3 mol·L^-1 HCl的甲醇-水（50:50，v/v）溶液2.6 mL，涡旋10 s混匀。混悬液10000 rpm离心10 min，取上清液测定荧光值，结果见图4。由图4可知，脂质体与不同给药组血清孵育后其体外释放速度差异较大。结合图3的IgM含量测定结果可以发现药物从脂质体内的释放速度基本上随着抗PEG的IgM含量的增加而加快，即首次注射的空白或载药脂质体进入体内后刺激脾脏边缘区B细胞产生了抗PEG的IgM，该免疫球蛋白与二次注射的脂质体相结合，这可能会导致脂质体的快速聚集，在短时间内引起药物的释放。

实施例5  首次注射磷脂剂量对盐酸表阿霉素脂质体ABC现象的影响

1不同药脂比盐酸表阿霉素脂质体的制备

按照实施例1的方法制备空白脂质体和梯度脂质体，按药物与磷脂质量比分别为0.01、0.02、0.05、0.1和0.2加入盐酸表阿霉素溶液，60 ℃下载药20 min，得盐酸表阿霉素脂质体。

2首次注射低剂量盐酸表阿霉素脂质体ABC现象研究

给药方案：取雄性Wistar大鼠，体重210~240 g，随机分组，每组三只动物，尾静脉注射给药，给药剂量按照盐酸表阿霉素计为0.5 mg/kg。按表3进行实验，间隔7天以5 μmol 磷脂/kg的剂量二次注射药脂比为0.1的盐酸表阿霉素脂质体。二次给药后分别于0.083、0.25、0.5、1、2、4 h经眼眶静脉丛取血，4000 rpm离心10 min获取血浆，按“1”的方法处理，于荧光分光光度计上测定F值，样品F值减去空白血浆F值得△F值，由标准曲线计算各时间点血浆中药物浓度，结果见图5。由图5可知，在盐酸表阿霉素剂量相同的情况下，首次给予不同药脂比的盐酸表阿霉素脂质体，会引起二次注射盐酸表阿霉素脂质体产生不同程度的ABC现象，且随着药脂比的降低ABC现象逐渐减弱，当药脂比达到0.01时，ABC现象完全消失。

表3 首次注射低剂量盐酸表阿霉素脂质体给药方案 

分组	首次注射
		K	5%葡萄糖溶液
L	药脂比为0.01的盐酸表阿霉素脂质体
		M	药脂比为0.02的盐酸表阿霉素脂质体
N	药脂比为0.05的盐酸表阿霉素脂质体
		O	药脂比为0.1的盐酸表阿霉素脂质体
P	药脂比为0.2的盐酸表阿霉素脂质体

实施例6  连续注射低剂量盐酸表阿霉素脂质体的ABC现象

取雄性Wistar大鼠，体重210~240 g，随机分组，每组三只动物，共10组。其中1-10组分别连续给予实施例1中的盐酸表阿霉素脂质体，给药剂量以盐酸表阿霉素计为0.5 mg/kg各组大鼠最后一次给药后分别于0.083、0.25、0.5、1、2、4 h经眼眶静脉丛取血，4000 rpm离心10 min获取血浆，按“1”的方法处理，于荧光分光光度计上测定F值，样品F值减去空白血浆F值得△F值，由标准曲线计算各时间点血浆中药物浓度，结果见图6。由图6可知，经过3-4天的连续注射开始产生ABC现象，第6-10天ABC现象最为严重，注射后30 min，血药浓度已降至注射剂量的10%以下。

实施例7  连续注射不同剂量盐酸表阿霉素脂质体ABC现象

取雄性Wistar大鼠，体重210~240 g，随机分组，每组三只动物，分别连续给予实施例1中的盐酸表阿霉素脂质体，给药剂量以盐酸表阿霉素计为0.75、1.0和1.25 mg/kg，每天给药一次，第七次给药后分别于0.083、0.25、0.5、1、2、4 h经眼眶静脉丛取血，4000 rpm离心10 min获取血浆，按“1”的方法处理，于荧光分光光度计上测定F值，样品F值减去空白血浆F值得△F值，由标准曲线计算各时间点血浆中药物浓度，结果见图7。由图7可知，随着连续注射剂量的增加，ABC现象逐渐减弱，当连续注射剂量达到1.25 mg/kg时，ABC现象完全消失。

Claims (9)

1.避免连续多次注射盐酸表阿霉素PEG化脂质体产生加速血液清除现象的方法，其特征在于，所述的盐酸表阿霉素给药剂量大于0.1 mg/kg。

2.如权利要求1所述的避免连续多次注射盐酸表阿霉素PEG化脂质体产生加速血液清除现象的方法，其特征在于，所述的盐酸表阿霉素给药剂量为0.2-5.0 mg/kg。

3.如权利要求1所述的避免连续多次注射盐酸表阿霉素PEG化脂质体产生加速血液清除现象的方法，其特征在于，所述的盐酸表阿霉素给药剂量为0.3-2.0 mg/kg。

4.如权利要求1-3任何一项所述的避免连续多次注射盐酸表阿霉素PEG化脂质体产生加速血液清除现象的方法，其特征在于，所述的盐酸表阿霉素脂质体中盐酸表阿霉素与磷脂的质量比为0.025:1~1:1。

5.如权利要求4所述的避免连续多次注射盐酸表阿霉素PEG化脂质体产生加速血液清除现象的方法，其特征在于，所述的盐酸表阿霉素脂质体中盐酸表阿霉素与磷脂的质量比为0.05:1~0.5:1。

6.如权利要求4所述的避免连续多次注射盐酸表阿霉素PEG化脂质体产生加速血液清除现象的方法，其特征在于，所述的盐酸表阿霉素脂质体中盐酸表阿霉素与磷脂的质量比为0.1:1~0.25:1。

7.如权利要求1所述的避免连续多次注射盐酸表阿霉素PEG化脂质体产生加速血液清除现象的方法，其特征在于，通过提高首次或连续注射脂质体的磷脂剂量减轻或消除抗肿瘤药物脂质体与其它药物联合化疗时的加速血液清除现象。

8.如权利要求7所述的避免连续多次注射盐酸表阿霉素PEG化脂质体产生加速血液清除现象的方法，其特征在于，所述的首次注射脂质体的磷脂剂量范围为大于5 μmol磷脂/kg。

9.如权利要求7所述的避免连续多次注射盐酸表阿霉素PEG化脂质体产生加速血液清除现象的方法，其特征在于，所述的首次注射脂质体的磷脂剂量优选10-50 μmol磷脂/kg。

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