CN103585106B - 一种pH敏感性修饰脂质体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种pH敏感性修饰脂质体。该pH敏感性修饰脂质体由聚天冬氨酸或脂肪胺接枝聚天冬氨酸为脂质体修饰剂制成，其粒径分布均匀、性质稳定，具有显著的pH敏感特性及很好的靶向性。本发明还涉及一种用于制备上述pH敏感性修饰脂质体的制备方法。该方法充分利用修饰剂与脂质体表面的静电吸附作用，可以在脂质体制备的同时完成修饰剂对脂质体的修饰，即以“一步法”制备脂质体，节省了大量的制备时间。该方法操作简单、快速、成本低廉，制备效率高。

Description

一种pH敏感性修饰脂质体及其制备方法

技术领域

本发明涉及药物制剂领域，具体涉及pH敏感性修饰脂质体的制备方法。

背景技术

肿瘤是一种严重威胁人类健康的疾病，而目前治疗肿瘤的有效且常见的手段之一是药物治疗。然而，多数抗代谢类抗肿瘤药物缺乏对细胞的选择性，在抑制肿瘤细胞的DNA复制的同时亦会抑制正常细胞的DNA复制，毒性较大。目前临床使用的多数传统剂型的抗肿瘤药物生物利用度低，有些具有致敏性和严重的毒副作用，难以发挥治疗效果的同时给患者造成痛苦。

脂质体是一种与生物膜结构类似的双层磷脂分子，可以使药物的体内分布发生改变，降低抗肿瘤药物的毒性。

肿瘤组织间质液会出现异常酸化现象，pH低于正常组织，其pH值约为5.0。利用此特性，制备有特定pH响应修饰剂修饰的脂质体，可以实现脂质体的pH敏感性，从而实现抗肿瘤药的靶向给药。

中国专利CN101049504A提供了一种简便的脂质体制备方法，以聚乙二醇甘油双酯为主要成分，可自动形成脂质体并且性质稳定，增加了脂质体的包封率。但这种脂质体缺乏良好的靶向性，无法实现在特定靶向部位定向给药，限制了它的应用范围。

中国专利CN101264057A记述了一种pH敏感长循环脂质体组合物的制备方法，以羧甲基壳聚糖为修饰剂，利用羧甲基壳聚糖响应pH产生构象变化的性质实现pH敏感性，所得pH敏感长循环脂质体组合物粒径均一并可实现长效释放。然而，这种pH敏感长循环脂质体组合物的制备过程仍然遵循先制备再修饰的策略，工艺耗时较长，不利于实际应用。

修饰脂质体的制备方法一般遵循“脂质体制备—修饰剂水合修饰”两步完成，目前尚无一步法制备修饰脂质体的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种pH敏感性修饰脂质体。该pH敏感性修饰脂质体由聚天冬氨酸和/或脂肪胺接枝聚天冬氨酸为脂质体修饰剂制成，其粒径分布均匀、性质稳定，具有显著的pH敏感特性及很好的靶向性。

本发明还提供了一种上述pH敏感性修饰脂质体的“一步法制备方法”，该方法充分利用修饰剂与脂质体表面的静电吸附作用，可以在脂质体制备的同时完成修饰剂对脂质体的修饰，即以“一步法”制备脂质体，节省了大量的制备时间。该方法操作简单、快速、成本低廉，制备效率高。

为此，本发明一方面提供了一种pH敏感性修饰脂质体，其包括治疗药物、磷脂、表面活性剂、脂质体修饰剂，其中所述脂质体修饰剂为聚天冬氨酸和/或改性聚天冬氨酸。

据本发明人研究发现，聚天冬氨酸（PASP）是一种生物亲和性极佳的大分子，可以响应外界pH的变化发生构象改变，将PASP及其衍生物修饰于脂质体可以获得pH敏感性的修饰脂质体。

根据本发明，所述的聚天冬氨酸或改性聚天冬氨酸的分子量为1.0×10⁴～10.0×10⁴。据本发明人研究发现，在聚天冬氨酸和/或改性聚天冬氨酸作为脂质体修饰剂制备pH敏感性修饰脂质体时，当聚天冬氨酸和改性聚天冬氨酸的分子量低于1.0×10⁴时，所制得的pH敏感性修饰脂质体无法发生显著的pH响应性；而当聚天冬氨酸和改性聚天冬氨酸的分子量高于10.0×10⁴时，所制得的pH敏感性修饰脂质体粒径过大，极易发生聚沉。

根据本发明，所述改性聚天冬氨酸为脂肪胺接枝聚天冬氨酸。

在本发明的一个实施例中，所述脂肪胺接枝聚天冬氨酸所接枝的脂肪胺碳链长度为2～18。

在本发明的另一个实施例中，为保证改性后的聚天冬氨酸保持其pH敏感性，所述脂肪胺接枝聚天冬氨酸的接枝率不超过40%。

聚天冬氨酸（PASP）及其衍生物脂肪胺接枝聚天冬氨酸是一种可降解的阴离子型聚合物，富含-COO-具有响应pH发生构象变化的性质。

带负电的PASP以及脂肪胺接枝聚天冬氨酸可以通过静电吸附作用连接到带正电的脂质体表面。当脂质体处于偏酸性介质的时候，修饰剂会发生构象变化而使脂质体双分子层结构被破坏，药物释出。而脂肪胺接枝聚天冬氨酸由于分子中含有脂肪链段，可以嵌入磷脂双分子层中，增加脂质体稳定性。

根据本发明，在所述pH敏感性修饰脂质体内，各组分按质量份计含量为：

在本发明的一个实施例中，所述的治疗药物为治疗各种肿瘤性疾病的治疗药物，包括，例如阿糖胞苷、阿霉素、柔红霉素、表阿霉素、长春碱、紫杉类、抗叶酸制剂、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、顺铂、单克隆抗体药物和基因治疗药物中的一种或几种。优选所述的治疗药物选自盐酸阿糖胞苷、盐酸柔红霉素、盐酸表阿霉素和紫杉醇中的一种或几种。

在本发明的另一个实施例中，所述磷脂选自甘油磷脂,包括蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、二磷脂酰甘油中的一种或几种。

在本发明的又一实施例中，所述表面活性剂包括但不限于胆固醇。

根据本发明，所述pH敏感性修饰脂质体粒径为0.1～10μm。其可制成注射液、冻干粉针剂等。

本发明另一方面提供了一种如上所述的pH敏感性修饰脂质体的制备方法，包括：

步骤A，脂类的分散：将磷脂、表面活性剂溶于有机溶剂中混合均匀，制成脂类混合溶液；

步骤B，药物加载：将药物配制成水溶液加入脂类混合溶液中，超声乳化制得药物乳液；

步骤C，脂质体形成与修饰：将脂质体修饰剂溶于水中，调节pH之后加入药物乳液中，减压蒸馏制得pH敏感性修饰脂质体乳液。

根据本发明方法，在步骤C中调节pH至7.4～10.0。

本发明中，保证修饰剂溶液的弱碱性可以使聚天冬氨酸和脂肪胺接枝聚天冬氨酸中大量存在的-COOH充分电离，保证修饰剂与磷脂带正电头部有效结合，完成对脂质体的修饰。而若pH大于10，则过高的碱性反而会破坏脂质体的结构。

根据本发明方法，在步骤B中，所述药物乳液为W/O型乳液。

在本发明的一个实施方式中，所述的有机溶剂包括乙醚、二氯甲烷、氯仿或其混合物。所述超声乳化的时间为1～10分钟。优选所述超声乳化的时间为1～6分钟。

如前文所述，由于生物大分子的性质多样，人们常选择不同理化性质的分子作为脂质体修饰剂，从而制备出不同功能的脂质体。目前已有的技术仍在沿用薄膜分散法、乙醇蒸发法、复乳法等传统的脂质体制备方法。即以去离子水或缓冲液作为脂质体乳液的水相，减压蒸馏得到普通脂质体后再加入所需修饰剂对脂质体进行孵育，最后得到修饰脂质体。

而本发明提供了一种可以省略“修饰剂孵育脂质体”步骤，从而“一步”得到修饰脂质的方法。本发明方法是即将修饰剂溶液直接作为水相加入到载药后的磷脂体系中，在整个体系减压蒸馏的过程中直接得到修饰脂质体，不需再经过孵育过程，大大提高了生产效率。

本发明中修饰剂辛胺接枝聚天冬氨酸实际接枝率的测定方法如下：

称取约40mg辛胺接枝聚天冬氨酸，充分溶解于氘代水中，于Bruker AV600核磁共振波谱仪中检测，根据核磁共振谱图中的侧链与主链峰面积的比值计算接枝率。

本发明所提供的pH敏感性修饰脂质体由聚天冬氨酸和/或脂肪胺接枝聚天冬氨酸为脂质体修饰剂制成，其粒径分布均匀、性质稳定，具有显著的pH敏感特性及很好的靶向性。

用于制备上述pH敏感性修饰脂质体的本发明的制备方法充分利用修饰剂与脂质体表面的静电吸附作用，可以在脂质体制备的同时完成修饰剂对脂质体的修饰，即以“一步法”制备脂质体，节省了大量的制备时间。该方法操作简单、快速、成本低廉，制备效率高。

附图说明

下面结合附图来对本发明作进一步详细说明：

图1是实施例1中的PASP修饰pH敏感性脂质体的透射电子显微镜照片。

图2是实施例1中辛胺接枝聚天冬氨酸修饰pH敏感性脂质体的粒径分布图。

图3是实施例3中辛胺接枝聚天冬氨酸阿糖胞苷修饰pH敏感性阿糖胞苷脂质体在不同pH介质中的药物释放曲线。

图4是实施例4中辛胺接枝聚天冬氨酸修饰pH敏感性紫杉醇脂质体在不同pH介质中的药物释放曲线。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面将结合附图和实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

实施例

实施例1：

精密称取卵磷脂48mg，胆固醇12mg，加入2.5ml乙醚充分溶解。注入12mg/ml的阿糖胞苷水溶液1ml。超声2min形成W/O型乳液。加入修饰剂—质量分数2.5%的pH8.8的聚天冬氨酸水溶液充分摇匀，置于旋转蒸发仪（RE-52AA型，上海亚荣生化仪器厂）0.02MPa、25℃旋蒸30min即得。用透射电子显微镜（JEM-3010高分辨型透射电子显微镜，日本电子公司）分析pH敏感性修饰脂质体粒子的表面结构，结果见图1。利用激光粒度分析仪（Mastersizer2000型，英国马尔文公司）测得聚天冬氨酸修饰阿糖胞苷脂质体平均粒径为183nm，见图2。

实施例2：

精密称取卵磷脂48mg，胆固醇12mg，加入2.5ml乙醚充分溶解。注入12mg/ml的阿糖胞苷水溶液1ml。超声2min形成W/O型乳液。加入外水相—质量分数2.5%、接枝率8%的pH8.8的辛胺接枝聚天冬氨酸水溶液充分摇匀，置于旋转蒸发仪0.02MPa、25℃减压旋转蒸发30min即得。采用与实施例1相同的方法测得辛胺接枝聚天冬氨酸修饰阿糖胞苷脂质体平均粒径为332nm。

对比实施例1和实施例2的结果可以发现，选用带有疏水脂肪链段的修饰剂—辛胺接枝聚天冬氨酸可以得到粒径更大的脂质体，这是因为疏水段的存在增加了修饰剂与磷脂的疏水段的亲和性，使得更多的修饰剂分子结合与脂质体表面。实施例3：

按实施例1的方法制备以接枝率8%的辛胺接枝聚天冬氨酸修饰的阿糖胞苷脂质体，并测定pH敏感修饰脂质体在pH5.0和pH7.4的介质中的药物释放曲线。药物释放以反透析法测定，具体过程为配制pH5.0和pH7.4的磷酸缓冲液，量取200ml缓冲液作为外液，同种溶液10ml置于截留分子量3500的透析袋（D6066-25EA，Sigma）内作为内液，取2ml刚制备好的脂质体乳液于外液，每隔一定时间从内液中取样2ml，置于全波长酶标仪中测定吸光度，并依据标准曲线换算为浓度计算渗漏量。即得pH敏感脂质体药物释放曲线，如图3所示。

实施例4：

精密称取卵磷脂48mg，胆固醇16mg，紫杉醇12mg加入2.5ml乙醚充分溶解。注入1ml pH7.4的磷酸缓冲液，超声2min形成W/O型乳液。加入修饰剂—质量分数2.5%、接枝率12%的pH8.8的辛胺接枝聚天冬氨酸水溶液充分摇匀，置于旋转蒸发仪0.02MPa、25℃减压旋转蒸发30min即得。按实施例3的方法进行药物释放测定，结果见图4。

实施例3、4表明，脂肪胺接枝聚天冬氨酸可用于制备pH敏感性的修饰脂质体，且无论包埋药物的亲疏水性，都可以实现在偏酸环境下的快速、靶向释放。

从上述实施例可以看出：利用本发明叙述的“一步法制备方法”和修饰剂，可以得到粒径均一、在偏酸环境下靶向释放、用途广范、工艺简便的修饰脂质体。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种pH敏感性修饰脂质体，其包括治疗药物、磷脂、表面活性剂、脂质体修饰剂，其中所述脂质体修饰剂为聚天冬氨酸和/或改性聚天冬氨酸；所述的聚天冬氨酸或改性聚天冬氨酸的分子量为1.0×10⁴～10.0×10⁴；所述改性聚天冬氨酸为脂肪胺接枝聚天冬氨酸；所述脂肪胺接枝聚天冬氨酸的接枝率不超过40％；所述pH敏感性修饰脂质体粒径为0.1～10μm。

2.根据权利要求1所述的pH敏感性修饰脂质体，其特征在于，所述脂肪胺接枝聚天冬氨酸所接枝的脂肪胺碳链长度为2～18。

3.根据权利要求1或2所述的pH敏感修饰脂质体，其特征在于：在所述pH敏感性修饰脂质体内，各组分按质量份计含量为：

4.一种根据权利要求1到3中任意一项所述的pH敏感性修饰脂质体的制备方法，包括：

步骤A，脂类的分散：将磷脂、表面活性剂溶于有机溶剂中混合均匀，制成脂类混合溶液；

步骤B，药物加载：将药物配制成水溶液加入脂类混合溶液中，超声乳化制得药物乳液；

步骤C，脂质体形成与修饰：将脂质体修饰剂溶于水中，调节pH之后加入药物乳液中，减压蒸馏制得pH敏感性修饰脂质体乳液。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在步骤C中调节pH至7.4～10.0。

6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述的有机溶剂包括乙醚、二氯甲烷、氯仿或其混合物；所述超声乳化的时间为1～10分钟。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述超声乳化的时间为1～6分钟。