CN107022516B

CN107022516B - 一种在细胞微囊泡表面修饰配体的方法

Info

Publication number: CN107022516B
Application number: CN201710252548.9A
Authority: CN
Inventors: 田田; 高隽; 王静; 王梅; 张卉馨; 寇晓林
Original assignee: Nanjing Medical University
Current assignee: Nanjing Medical University
Priority date: 2017-04-18
Filing date: 2017-04-18
Publication date: 2020-08-21
Anticipated expiration: 2037-04-18
Also published as: CN107022516A

Abstract

本发明一种在细胞微囊泡表面修饰配体的方法，包括如下步骤：(a)在细胞微囊泡表面连接二苯基环辛炔；(b)去除游离的二苯基环辛炔；(c)在细胞微囊泡表面的二苯基环辛炔上连接叠氮基修饰的配体；(d)对修饰好的细胞微囊泡进行提纯。与现有技术相比，本方法节省时间，过程简便，反应效率高，对配体的类型较少限制，同时能最大限度保持细胞微囊泡的生理活性。有利于增强细胞微囊泡的治疗效果。

Description

一种在细胞微囊泡表面修饰配体的方法

技术领域

本发明涉及在细胞微囊泡表面修饰配体的方法，属于生物技术领域。

背景技术

细胞微囊泡是人、动物、植物或微生物的细胞自动分泌释放的或破碎后获得的，具有脂质膜结构的，直径从几十纳米到几微米不等的囊泡。包括细胞外囊泡(Extracellularvesicle)、微囊泡(Microvesicle)、外泌体(Exosome)、调亡小体(Apoptotic body)、脱落囊泡(Shedding vesicle)、微粒(Microparticle)。细胞微囊泡携带有生物活性的蛋白质、脂质、信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)、非编码RNA(ncRNA)以及DNA片段。并且能够将这些活性分子传递给受体细胞，调节靶细胞、组织和器官的生物功能。某些类型的细胞，如间充质干细胞，产生的细胞微囊泡含有多种能够保护受损组织，促进生长和修复，以及调节免疫功能的活性生物分子。注射入体内之后可以减少损伤、抑制炎症、促进组织再生和功能恢复。同时，利用电穿孔、化学穿孔、超声等方法还能够将人工合成的小干扰RNA(siRNA)、miRNA、化疗药物装载入细胞微囊泡，使其成为一种药物载体。因此细胞微囊泡是一种新型的生物治疗方法和递送载体。现已在动物模型上验证细胞微囊泡能够促进血管生成、降低炎症反应、促进神经再生、减少心肌和大脑缺血损伤、保护急性肾损伤和肺损伤、治疗糖尿病和神经退行性疾病。然而，静脉注射的细胞微囊泡很快被肝、脾等网状内皮系统(RES)所吞噬和清除，较少到达靶器官。因此，通过表面修饰配体的方法增强其靶向性、体内稳定性和组织穿透性，以及降低血浆清除率具有重要意义。

目前的方法包括工程化供体细胞和膜插入两大类方法，都具有较多步骤，操作复杂、费时。其中，工程化供体细胞的方法需要专门的生物学技术对细胞进行处理，无法修饰任意类型的配体，也不能对体液来源的细胞微囊泡进行修饰。膜插入的方法可能对细胞微囊泡原本的膜结构和理化性质产生较大影响，插入效率较难控制，游离的配体较难去除。因此，相关方面的研究和应用进展受到很大限制。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种在细胞微囊泡表面修饰配体的快速、高效的方法。本发明在细胞微囊泡表面修饰各种配体，有利于对其治疗作用进行进一步研究，有利于加速临床应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种在细胞微囊泡表面修饰配体的方法，包括如下步骤：

(a)在细胞微囊泡表面连接二苯基环辛炔(Dibenzocyclooctyl，DBCO)；

(b)去除游离的二苯基环辛炔；

(c)在细胞微囊泡表面的二苯基环辛炔上连接叠氮基修饰的配体；

(d)对修饰好的细胞微囊泡进行提纯。

其中，所述细胞微囊泡为人、动物、植物或微生物的细胞所分泌或破碎后获得的，具有脂质膜结构的，直径从几十纳米到几微米不等的囊泡。

其中，所述细胞微囊泡为细胞外囊泡(Extracellular vesicle)、微囊泡(Microvesicle)、外泌体(Exosome)、调亡小体(Apoptotic body)、脱落囊泡(Sheddingvesicle)或微粒(Microparticle)。

步骤(a)中，利用双功能化分子将二苯基环辛炔共价偶联到细胞微囊泡表面天然存在的氨基末端上；其中，所述的双功能化分子为同时带有二苯基环辛炔和N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide，NHS)的分子；优选为DBCO-sulfo-NHS(Dibenzocyclooctyne-sulfo-N-hydroxysuccinimidyl ester，分子式C₂₅H₂₁N₂NaO₈S，分子量532.50)、或DBCO-NHS(Dibenzocyclooctyne-N-hydroxysuccinimidyl ester，分子式C₂₃H₁₈N₂O₅，分子量402.40)、或DBCO-PEG4-NHS(Dibenzocyclooctyne-PEG4-N-hydroxysuccinimidyl ester，分子式C₃₄H₃₉N₃O₁₀，分子量649.69)。

步骤(a)中，PBS(pH7.4)缓冲液重悬细胞微囊泡，与双功能化分子混合，按照每10¹²细胞微囊泡数量加入1nmol～20nmol(优选3nmol)双功能化分子的比例混合，在室温下反应2～12小时(优选4小时)。

步骤(b)中，通过超滤去除没有偶联在细胞微囊泡上的双功能化分子。优选，将步骤(1)得到的产物用100～300kD(最优选100kD)超滤管在8000～12000g(最优选10000g)离心5～10分钟(最优选10分钟)，弃滤液，重复3～6次(最优选3次)。

步骤(c)中，所述配体为肽、蛋白质(包括抗体)、核酸或高分子化合物。

步骤(c)中，利用叠氮化的配体与细胞微囊泡表面的二苯基环辛炔进行无铜点击化学(Copper-free click chemistry)反应，从而将配体共价偶联在细胞微囊泡表面。

步骤(c)中，步骤(b)的产物与叠氮化的配体在PBS(pH7.4)缓冲液中混匀，如果有其他要修饰的配体可在上述摩尔比范围内同时加入，在4℃下反应4～24小时(优选12小时)，其中，每10¹²囊泡微粒数加入0.1nmol～5nmol(优选0.3nmol)叠氮化的配体。

其中，所述的叠氮化的配体优选是将Azide-NHS(分子式C₆H₆N₄O₄，分子量198.14)与配体按照摩尔比10∶1混合，在室温下反应2～12小时(优选4小时)，获得叠氮化的配体。Azide-NHS可以用Azide-sulfo-NHS(分子式C₈H₉N₄NaO₇S，分子量328.23)或Azide-PEG4-NHS(分子式C₁₅H₂₄N₄O₈，分子量388.37)替代。

步骤(d)中，使用超速离心的方法对修饰好的细胞微囊泡进行提纯。优选将步骤(c)得到的产物用PBS(pH7.4)缓冲液稀释至25mL，100000～200000g(最优选150000g)离心70～120分钟(最优选90分钟)，弃去全部上清液。用0.5mL PBS(pH7.4)重悬沉淀，得到最终修饰好的细胞微囊泡，冻存于-80℃。

与现有技术相比，本发明有益效果体现在：

1.节省时间，全部过程可在24h内完成；

2.过程简便，易操作，不需要专门的生物学技术；

3.反应效率高，节约配体用量，从而降低成本；

4.全部过程在pH7.4PBS溶液的温和环境下完成，不需要添加催化剂，有利于最大限度保持细胞微囊泡的生理活性；

5.对配体的类型较少限制，各种类型的肽、蛋白质、糖、脂质、核酸、高分子化合物都可以共价偶联到细胞微囊泡的表面。

利用本发明在细胞微囊泡表面修饰配体的方法，可以在细胞微囊泡表面修饰各种靶向性分子。使细胞微囊泡获得靶向特定的器官、组织或细胞的能力，从而增强其治疗效果。

利用本发明在细胞微囊泡表面修饰配体的方法，可以在细胞微囊泡表面修饰各种功能性分子。能提高细胞微囊泡的体内稳定性，增加组织穿透性，增强跨血脑屏障的能力，减少被吞噬细胞摄取，以及延长血浆清除时间，从而增强其治疗效果。

利用本发明所得修饰配体的细胞微囊泡可用于静脉注射或局部给药，治疗脑缺血、脑外伤、心肌缺血、糖尿病、神经退行性疾病、恶性肿瘤、关节炎、肝肺肾损伤或纤维化，也可用于美容或延缓衰老。

附图说明

图1是本发明在细胞微囊泡表面修饰配体方法的工艺流程图；

图2是修饰了配体的细胞微囊泡的原子力显微镜形态鉴定图；

图3是修饰了配体的细胞微囊泡的直径分布测量结果图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

以下实施例所用试剂和材料均可以通过市场购买渠道获得。

实施例1，外泌体表面修饰RGD多肽。

如图1所示。

步骤(a)，将1×10¹²外泌体重悬于1mL pH7.4PBS中，加入1.5mL离心管中。再加入3μM DBCO-sulfo-NHS。外泌体与DBCO-sulfo-NHS的微粒数/摩尔数比为10¹²：3nmol，将离心管固定在旋转混匀仪上，室温下反应4小时。

步骤(b)，将步骤(a)所得溶液加入两个超滤管(孔径100kD，容量0.5mL)上层，10000g离心10分钟。弃掉下层滤液，在上层补充pH7.4PBS至体积达到0.5mL。按照同样步骤再重复超滤两次，得到1mL修饰了DBCO的外泌体。

步骤(c)，将步骤(b)所得溶液置于1.5mL离心管中。加入0.3μM叠氮基修饰的RGD多肽(所述的叠氮基修饰的多肽分子是将Azide-NHS与RGD多肽分子反应获得)。步骤(b)的产物中囊泡微粒数与叠氮化RGD的摩尔数比为10¹²：0.3nmol，同时加入0.3μM Cy5.5-azide用于荧光标记外泌体。将离心管固定在旋转混匀仪上，置于4℃冰箱中，反应12小时。

步骤(d)，将步骤(c)所得溶液用pH7.4PBS稀释至25mL，移入超速离心管中。150000g离心90分钟，弃去全部上清液。用0.5mL pH7.4PBS重悬沉淀，得到最终修饰好的外泌体。取其中小部分用于分析和鉴定，其余冻存于-80℃冰箱。经高效液相色谱分析，参与反应的配体有85％～90％成功偶联在外泌体上。

鉴定方法：使用原子力显微镜观察所得外泌体的形态(如图2)；使用纳米粒子追踪分析(Nanoparticle tracking analysis，NTA)设备测量所得外泌体的直径分布(如图3)。

实施例2，微囊泡表面修饰EGFR抗体。

步骤(a)，将1×10¹³微囊泡重悬于10mLpH7.4PBS中，加入15mL离心管中。再加入8μMDBCO-NHS。微囊泡与DBCO-NHS的微粒数/摩尔数比为10¹²：8nmol，将离心管固定在旋转混匀仪上，室温下反应6小时。

步骤(b)，将步骤(a)所得溶液加入两个超滤管(孔径300kD，容量5mL)上层，12000g离心10分钟。弃掉下层滤液，在上层补充pH7.4PBS至体积达到5mL。按照同样步骤再重复超滤两次，得到10mL修饰了DBCO的微囊泡。

步骤(c)，将步骤(b)所得溶液置于15mL离心管中。加入2μM叠氮基修饰的EGFR抗体(所述的叠氮基修饰的抗体分子是将Azide-sulfo-NHS与EGFR抗体分子反应获得)。步骤(b)的产物中囊泡微粒数与叠氮化EGFR抗体的摩尔数比为10¹²：2nmol，同时加入2μM FITC-azide用于荧光标记外泌体。将离心管固定在旋转混匀仪上，置于4℃冰箱中，反应24小时。

步骤(d)，将步骤(c)所得溶液用pH7.4PBS稀释至25mL，移入超速离心管中。200000g离心120分钟，弃去全部上清液。用10mL pH7.4PBS重悬沉淀，得到最终修饰好的外泌体。取其中小部分用于分析和鉴定，其余冻存于-80℃冰箱。经高效液相色谱分析，参与反应的EGFR抗体有80％～85％成功偶联在微囊泡上。

鉴定方法：使用原子力显微镜观察所得微囊泡的形态；使用纳米粒子追踪分析设备测量所得微囊泡的直径分布。

实施例3，细胞外囊泡表面修饰siRNA。

步骤(a)，将1×10¹⁴细胞外囊泡重悬于1mL pH7.4PBS中，加入1mL离心管中。再加入1mM DBCO-PEG4-NHS。细胞外囊泡与DBCO-PEG4-NHS的微粒数/摩尔数比为10¹²：10nmol，将离心管固定在旋转混匀仪上，室温下反应12小时。

步骤(b)，将步骤(a)所得溶液加入两个超滤管(孔径100kD，容量0.5mL)上层，12000g离心8分钟。弃掉下层滤液，在上层补充pH7.4PBS至体积达到0.5mL。按照同样步骤再重复超滤三次，得到1mL修饰了DBCO的细胞外囊泡。

步骤(c)，将步骤(b)所得溶液置于1mL离心管中。加入0.5mM叠氮基修饰的siRNA(所述的叠氮基修饰的siRNA是将Azide-PEG4-NHS与氨基siRNA分子反应获得，氨基siRNA购自上海吉玛生物技术公司)。步骤(b)的产物中囊泡微粒数与叠氮化siRNA的摩尔数比为10¹²：5nmol，同时加入0.5mM Rhodamine-azide用于荧光标记外泌体。将离心管固定在旋转混匀仪上，置于4℃冰箱中，反应12小时。

步骤(d)，将步骤(c)所得溶液用pH7.4PBS稀释至25mL，移入超速离心管中。100000g离心70分钟，弃去全部上清液。用1mL pH7.4PBS重悬沉淀，得到最终修饰好的外泌体。取其中小部分用于分析和鉴定，其余冻存于-80℃冰箱。经高效液相色谱分析，参与反应的siRNA有80％～85％成功偶联在细胞外囊泡上。

鉴定方法：使用电子显微镜观察所得细胞外囊泡的形态；使用纳米粒子追踪分析设备测量所得细胞外囊泡的直径分布。

实施例4，微粒表面修饰PEG2000。

步骤(a)，将1×10¹³微粒重悬于4mLpH7.4PBS中，加入8mL离心管中。再加入5μMDBCO-sulfo-NHS。微粒与DBCO-sulfo-NHS的微粒数/摩尔数比为10¹²：2nmol，将离心管固定在旋转混匀仪上，室温下反应8小时。

步骤(b)，将步骤(a)所得溶液加入8个超滤管(孔径300kD，容量0.5mL)上层，9000g离心8分钟。弃掉下层滤液，在上层补充pH7.4PBS至体积达到0.5mL。按照同样步骤再重复超滤三次，得到4mL修饰了DBCO的微粒。

步骤(c)，将步骤(b)所得溶液置于8mL离心管中。加入1μM叠氮基修饰的PEG2000(所述的叠氮基修饰的PEG2000是将Azide-sulfo-NHS与NH2-PEG2000分子反应获得，NH2-PEG2000购自北京键凯科技有限公司)。步骤(b)的产物中囊泡微粒数与叠氮化PEG2000的摩尔数比为10¹²：0.4nmol，同时加入1μM Cy3-azide用于荧光标记外泌体。将离心管固定在旋转混匀仪上，置于4℃冰箱中，反应18小时。

步骤(d)，将步骤(c)所得溶液用pH7.4PBS稀释至25mL，移入超速离心管中。100000g离心90分钟，弃去全部上清液。用4mL pH7.4PBS重悬沉淀，得到最终修饰好的外泌体。取其中小部分用于分析和鉴定，其余冻存于-80℃冰箱。经高效液相色谱分析，参与反应的PEG2000有80％～85％成功偶联在微粒上。

鉴定方法：使用电子显微镜观察所得微粒的形态；使用纳米粒子追踪分析设备测量所得微粒的直径分布。

Claims

1.一种在细胞微囊泡表面修饰配体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(a)在细胞微囊泡表面连接二苯基环辛炔；

(b)去除游离的二苯基环辛炔；

(d)对修饰好的细胞微囊泡进行提纯；

步骤(a)中，利用双功能化分子将二苯基环辛炔共价偶联到细胞微囊泡表面天然存在的氨基末端上；其中，所述的双功能化分子为同时带有二苯基环辛炔和N-羟基琥珀酰亚胺的分子；

步骤(a)中，PBS缓冲液重悬细胞微囊泡，按照每10¹²细胞微囊泡数量加入1nmol～20nmol双功能化分子的比例混合，在室温下反应2～12小时；

步骤(c)中，利用叠氮化的配体与细胞微囊泡表面的二苯基环辛炔进行无铜点击化学反应，从而将配体共价偶联在细胞微囊泡表面；

步骤(c)中，步骤(b)的产物与叠氮化的配体在PBS缓冲液中混匀，在4℃下反应4～24小时，其中，每10¹²囊泡微粒数加入0.1nmol～5nmol叠氮化的配体。

2.根据权利要求1所述的在细胞微囊泡表面修饰配体的方法，其特征在于，所述细胞微囊泡为人、动物、植物或微生物的细胞所分泌或破碎后获得的，具有脂质膜结构的囊泡。

3.根据权利要求1或2所述的在细胞微囊泡表面修饰配体的方法，其特征在于，所述细胞微囊泡为细胞外囊泡、微囊泡、外泌体、调亡小体、脱落囊泡或微粒。

4.根据权利要求1所述的在细胞微囊泡表面修饰配体的方法，其特征在于，所述的双功能化分子为DBCO-sulfo-NHS、或DBCO-NHS、或DBCO-PEG4-NHS。

5.根据权利要求1所述的在细胞微囊泡表面修饰配体的方法，其特征在于，步骤(b)中，通过超滤去除没有偶联在细胞微囊泡上的双功能化分子。

6.根据权利要求1所述的在细胞微囊泡表面修饰配体的方法，其特征在于，步骤(c)中，所述配体为肽、蛋白质、核酸或高分子化合物。

7.根据权利要求1所述的在细胞微囊泡表面修饰配体的方法，其特征在于，所述的叠氮化的配体是将Azide-sulfo-NHS、或Azide-NHS、或Azide-PEG4-NHS与配体按照摩尔比10：1混合，在室温下反应2～12小时，获得叠氮化的配体。

8.根据权利要求1所述的在细胞微囊泡表面修饰配体的方法，其特征在于，步骤(d)中，使用超速离心的方法对修饰好的细胞微囊泡进行提纯。