CN109288794B - 一种蜂毒素脂质体纳米制剂及其制备方法与应用 - Google Patents

一种蜂毒素脂质体纳米制剂及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于新型纳米药物制剂技术领域，具体涉及一种蜂毒素脂质体纳米制剂及其制备方法与应用。本发明所述蜂毒素脂质体纳米制剂，含有蜂毒素脂质体，所述蜂毒素脂质体至少包括：蜂毒素，阴离子聚合物和阳离子脂质载体。具有材料安全易得、制备操作简单、可重复性强的特点；脂质体制剂粒径大小和均一性理想、载药量大、制剂稳定、易于保存、蜂毒素泄漏少、无溶血作用、毒性低、具有生物可降解特性、可功能化修饰、具有在循环系统中的长循环和肿瘤的主被动靶向分布功能等特点，可进行规模化生产。

Description

一种蜂毒素脂质体纳米制剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于新型纳米药物制剂技术领域，具体涉及一种蜂毒素脂质体纳米制剂及其制备方法与应用。
背景技术
蜂毒素(Melittin)是蜂毒(Vonem)中的主要活性物质，约占蜂毒干重的40％，是一个由26个氨基酸组成的多肽分子(NH2-GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-CONH2)，蜂毒素的分子量为2846Dal，具有两亲性，易溶于水，在生理条件下带有6个正电荷。蜂毒素单体的二级结构中有2个α-螺旋结构，中间由铰链结构相连，C末端为正电荷区域。蜂毒素在水中存在两种形式，即在低浓度、低离子强度时为单体的自由结构，而在高浓度、高离子强度时则形成四聚体形式。蜂毒素本身具有很强的药理活性，在抗菌、抗病毒、抗炎症、抗肿瘤和免疫调节等方面发挥着巨大的作用。如蜂毒素可通过破坏细胞线粒体膜，参与抗肿瘤免疫应答或通过如作用于Caspases途径、Bcl-2和BaX蛋白表达等诱导肿瘤细胞的凋亡，在黑色素瘤、肝癌、肺癌、乳腺癌等治疗中具有很好的功效，在肿瘤等疾病的临床治疗方面显示出非常大的潜力。
目前，蜂毒素在发展和用于炎症、肿瘤和细菌及病毒感染等疾病的临床治疗过程中还存在许多问题，如：蜂毒素分子本身特殊的α-螺旋结构使其与磷脂膜具有很强的亲和力，极易插入脂质双分子膜并在细胞膜上致孔，因此游离的蜂毒素具有很强的溶血效应和组织毒性，而这种溶血副作用和组织毒性是其走向临床的最主要障碍之一；另外，蜂毒素作为一种多肽药物，极易在给药后在循环系统或组织中被降解代谢，或因所带电荷被其他蛋白或分子等吸附结合，从而导致低生物利用度及潜在的毒性。
基于上述问题，开发并利用蜂毒素用于临床疾病治疗急需开发出具有载荷效率高、稳定性好、毒性低、循环时间长、生物利用度高等特点的制剂。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种适用于蜂毒素临床应用的脂质体纳米制剂及其制备方法与应用。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种蜂毒素脂质体纳米制剂，含有蜂毒素脂质体，所述蜂毒素脂质体至少包括：蜂毒素，阴离子聚合物和阳离子脂质载体。
在一种实施方式中，所述蜂毒素和阴离子聚合物结合形成蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒，所述阳离子脂质载体可形成脂质双分子膜，所述蜂毒素脂质体包括外层结构和内核结构，所述外层结构包括脂质双分子膜，所述内核结构包括蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒。
在一种实施方式中，所述蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒中，所述阴离子聚合物与所述蜂毒素的质量比为0.1:1～4:1。可选的，为0.8:1～3:1。
在一种实施方式中，所述蜂毒素脂质体中，所述阳离子脂质载体与所述蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒的质量比为2:1～10:1。
在一种实施方式中，所述阴离子聚合物为所含净电荷为负的聚合物分子。
在一种实施方式中，所述阴离子聚合物可为通过化学合成或生物分离获得的聚合物分子。
在一种实施方式中，所述阴离子聚合物可以是由相同单体或不同单体缩聚而成的，具有相同或不同聚合度的分子。
在一种实施方式中，所述阴离子聚合物选自生物可降解的阴离子聚合物。
在一种实施方式中，所述阴离子聚合物选自聚谷氨酸(PGA)、聚天冬氨酸、透明质酸、脱氧核糖核酸和核糖核酸中的一种或多种。
在一种实施方式中，所述蜂毒素可选自生物提取纯化或合成的蜂毒素多肽及其修饰产物。
在一种实施方式中，所述阳离子脂质载体至少包含一种阳离子脂质。
在一种实施方式中，所述阳离子脂质载体由至少一种阳离子脂质，或阳离子脂质与辅助脂质制备而成。
可选的，所述阳离子脂质可以为：
DOTMA氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵；
DOTAP溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵；
DOSPA三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵；
DTAB溴化三甲基十二烷基铵；
TTAB溴化三甲基十四烷基铵；
CTAB溴化三甲基十六烷基铵；
DDAB溴化二甲基双十八烷基铵；
DORI溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油酰氧基丙基铵；
DORIE溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油烯氧基丙基铵；
DORIE-HP溴化二甲基-3-羟丙基-2,3-二油烯氧基丙基铵；
DORIE-HB溴化二甲基-4-羟丁基-2,3-二油烯氧基丙基铵；
DORIE-HPc溴化二甲基-5-羟戊基-2,3-二油烯氧基丙基铵；
DPRIE溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十六烷氧基丙基铵；
DSRIE溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十八烷氧基丙基铵；
DMRIE溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十四烷氧基丙基铵；
DOGS N-(2-精胺甲酰基)-N’,N’-双十八烷基甘氨酰胺；
DOSC 1，2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯；
DC-Chol 3β-[N-(N’，N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇；
LPLL脂质多聚-L-赖氨酸；
SA硬脂胺。
可选的，所述阳离子脂质可以为溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵(DOTAP)、氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵(DOTMA)、(3β-[N-N’，N’-二甲基胺乙基]胺基甲酰基)胆固醇(DC-Chol)和溴化二甲基双十八烷基铵(DDAB)中的一种或多种。
可选的，所述阳离子脂质可以为溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵(DOTAP)；
在一种实施方式中，所述的辅助脂质可以为二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、胆固醇(Chol)中的一种或多种。
可选的，所述的辅助脂质可以是二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)。
在一种实施方式中，所述蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒粒径范围是60nm～150nm。
在一种实施方式中，所述蜂毒素与所述阴离子聚合物相结合，形成表面电位为负的蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒，阳离子脂质载体中的阳离子脂质与该负电性纳米颗粒的结合并驱动阳离子脂质载体形成的脂质双分子膜在该负电性纳米颗粒表面的自组装，从而得到所述蜂毒素脂质体制剂。
蜂毒素与阴离子聚合物通过静电力作用结合。
在一种实施方式中，所述外层结构中修饰有脂质-聚乙二醇(PEG)或脂质-聚乙二醇-功能分子。
在一种实施方式中，所述脂质-PEG中，脂质可以为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)。
在一种实施方式中，脂质-PEG-功能分子中，脂质可以为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)，功能分子可以为精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(ARG-GLY-ASP,RGD肽)。
在一种实施方式中，所述蜂毒素脂质体中，脂质体总脂质与脂质-PEG的摩尔比为95：5。
在一种实施方式中，所述蜂毒素脂质体中，脂质体总脂质与脂质-PEG-功能分子的摩尔比为95：5。
本发明的第二方面，提供了一种蜂毒素脂质体纳米制剂的制备方法，至少包括如下步骤：
将蜂毒素和阴离子聚合物混合孵育，得到蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒；
将所述蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒与阳离子脂质载体混合孵育，得到蜂毒素脂质体纳米制剂。
在一种实施方式中，所述蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒中，所述阴离子聚合物与所述蜂毒素的质量比为0.1:1～4:1。可选的，为0.8:1～3:1。
在一种实施方式中，所述阳离子脂质载体与所述蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒质量比为2:1～10:1。
在一种实施方式中，所述阴离子聚合物为所含净电荷为负的聚合物分子。
在一种实施方式中，所述阴离子聚合物可为通过化学合成或生物分离获得的聚合物分子。
在一种实施方式中，所述阴离子聚合物可以是由相同单体或不同单体缩聚而成的，具有相同或不同聚合度的分子。
在一种实施方式中，所述阴离子聚合物选自生物可降解的阴离子聚合物。
在一种实施方式中，所述阴离子聚合物选自聚谷氨酸(PGA)、聚天冬氨酸、透明质酸、脱氧核糖核酸和核糖核酸中的一种或多种。
在一种实施方式中，所述蜂毒素可选自生物提取纯化或合成的蜂毒素多肽及其修饰产物。
在一种实施方式中，所述阳离子脂质载体至少包含一种阳离子脂质。
在一种实施方式中，所述阳离子脂质载体由至少一种阳离子脂质，或阳离子脂质与辅助脂质制备而成。
可选的，所述阳离子脂质可以为：
DOTMA氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵；
DOTAP溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵；
DOSPA三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵；
DTAB溴化三甲基十二烷基铵；
TTAB溴化三甲基十四烷基铵；
CTAB溴化三甲基十六烷基铵；
DDAB溴化二甲基双十八烷基铵；
DORI溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油酰氧基丙基铵；
DORIE溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油烯氧基丙基铵；
DORIE-HP溴化二甲基-3-羟丙基-2,3-二油烯氧基丙基铵；
DORIE-HB溴化二甲基-4-羟丁基-2,3-二油烯氧基丙基铵；
DORIE-HPc溴化二甲基-5-羟戊基-2,3-二油烯氧基丙基铵；
DPRIE溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十六烷氧基丙基铵；
DSRIE溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十八烷氧基丙基铵；
DMRIE溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十四烷氧基丙基铵；
DOGS N-(2-精胺甲酰基)-N’,N’-双十八烷基甘氨酰胺；
DOSC 1，2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯；
DC-Chol 3β-[N-(N’，N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇；
LPLL脂质多聚-L-赖氨酸；
SA硬脂胺。
可选的，所述阳离子脂质可以为溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵(DOTAP)、氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵(DOTMA)、(3β-[N-N’，N’-二甲基胺乙基]胺基甲酰基)胆固醇(DC-Chol)和溴化二甲基双十八烷基铵(DDAB)中的一种或多种。
可选的，所述阳离子脂质可以为溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵(DOTAP)；
在一种实施方式中，所述的辅助脂质可以为二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二油酰磷脂酰胆碱DOPC、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、胆固醇(Chol)中的一种或多种。
可选的，所述的辅助脂质可以是二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)。
在一种实施方式中，所述蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒粒径范围是60nm～150nm。
在一种实施方式中，所述蜂毒素与所述阴离子聚合物相结合，形成表面电位为负的蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒，阳离子脂质载体中的阳离子脂质与该负电性纳米颗粒的结合并驱动阳离子脂质载体形成的脂质双分子膜在该负电性纳米颗粒表面的自组装，从而得到所述蜂毒素脂质体制剂。
蜂毒素与阴离子聚合物通过静电力作用结合。
在一种实施方式中，所述蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒由以下方法制备：
(1)分别将蜂毒素和阴离子聚合物溶于溶剂，配制成蜂毒素溶液和阴离子聚合物溶液；
(2)将步骤(1)得到蜂毒素溶液和阴离子聚合物溶液混匀孵育，获得蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒；
进一步的，所述蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒中，所述阴离子聚合物与所述蜂毒素的质量比为0.1:1～4:1。可选的，为0.8:1～3:1。
进一步的，步骤(1)中，所述溶剂可以是去离子水、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES)、生理盐水和葡萄糖注射液中的一种或多种。可选的，为去离子水。
在一种实施方式中，步骤(2)之后，还包括以下步骤：
(3)除去溶液中游离蜂毒素和阴离子聚合物。
进一步的，步骤(3)中，可通过超滤或透析的方法除去游离蜂毒素和阴离子聚合物；
进一步的，步骤(3)中，获得的蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒可以重新分散在溶剂中，所述溶剂可以为去离子水、生理盐水、葡萄糖注射液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES)中的一种或多种。
在一种实施方式中，所述阳离子脂质载体可以为空白阳离子脂质体，空白阳离子脂质体可采用薄膜分散法、乙醇注入法或逆向蒸发法中的一种或多种制备。
具体的，所述薄膜分散法，具体操作方法为，将阳离子脂质或阳离子脂质和辅助脂质按照一定比例溶解于氯仿或其他有机溶剂中，通过减压旋蒸使溶剂挥发，脂质在容器壁上形成薄膜；再加入相应的溶剂进行水合，获得空白阳离子脂质体。所述相应的溶剂是指溶解蜂毒素和阴离子聚合物所用的溶剂。
具体的，所述乙醇注入法，具体操作方法为，阳离子脂质或阳离子脂质和辅助脂质按照一定比例溶解于无水乙醇中，65℃水浴加热混合溶解；之后将其缓慢滴加入相应溶剂中，水浴加热，获得脂质体制剂或空白脂质体。所述相应溶剂是指溶解蜂毒素和阴离子聚合物所用的溶剂。
具体的，所述逆向蒸发法，具体操作方法为，阳离子脂质或阳离子脂质和辅助脂质按照一定比例溶解于氯仿或其他有机溶剂中并混匀，再将其加入制备好的纳米颗粒溶液或相应溶剂中，形成乳剂；通过减压旋转蒸发挥干有机溶剂，得到脂质体制剂或空白脂质体。
在一种实施方式中，所述阳离子脂质可以为含阳离子脂质的脂质胶束溶液中的阳离子脂质。
进一步的，所述脂质胶束溶液的溶剂选自去离子水、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES)、生理盐水和葡萄糖注射液中的一种或多种。可选的，为去离子水。
在一种实施方式中，获得蜂毒素脂质体纳米制剂后，除去游离的蜂毒素和脂质组分，去除方法可以为超滤或透析。
按照前述制备方法获得的蜂毒素脂质体纳米制剂，还可在制备过程中加入脂质-聚乙二醇(PEG)或脂质-聚乙二醇(PEG)-功能分子。
具体的，可以采用后插法，具体包括以下步骤：将蜂毒素和阴离子聚合物混合孵育，得到蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒；将所述蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒与阳离子脂质载体孵育，得到蜂毒素脂质体纳米制剂；分别将脂质-PEG或脂质-PEG-功能分子加入到所述蜂毒素脂质体纳米制剂中，孵育，得到PEG修饰的或功能分子修饰的蜂毒素脂质体纳米制剂。
在一种实施方式中，所述脂质-PEG中，脂质可以为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)。
在一种实施方式中，脂质-PEG-功能分子中，脂质可以为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)，功能分子可以为精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(ARG-GLY-ASP,RGD肽)。
在一种实施方式中，所述蜂毒素脂质体中，脂质体总脂质与脂质-PEG的摩尔比为95：5。
在一种实施方式中，所述蜂毒素脂质体中，脂质体总脂质与脂质-PEG-功能分子的摩尔比为95：5。
本发明的第三方面提供了一种由前述制备方法获得的蜂毒素脂质体纳米制剂。
本发明的第四方面提供了前述蜂毒素脂质体纳米制剂在制备抗肿瘤、抗菌或抗炎症药物中的用途。
本发明具有以下有益效果：
本发明具有材料安全易得、制备操作简单、可重复性强的特点；脂质体制剂粒径大小和均一性理想、载药量大、制剂稳定、易于保存、蜂毒素泄漏少、无溶血作用、毒性低、具有生物可降解特性、可功能化修饰、具有在循环系统中的长循环和肿瘤的主被动靶向分布功能等特点，可进行规模化生产。同时亦可对相似性质的多肽、蛋白类药物的制剂研究提供参考。
附图说明
图1A：实施例1所得蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒的粒径分布图。
图1B：实施例1所得蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒的电势分布图。
图2：实施例1中蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒的原子力显微镜(AFM)的形貌观测图。
图3：实施例1中蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒的透射电子显微镜(TEM)形貌观测图(右图为左图的局部放大图)。
图4A：为实施例1所得蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂的粒径分布图。
图4B：为实施例1所得蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂的电势分布图。
图5A：实施例2中蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒的稳定性情况考察结果。
图5B：实施例2中蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂的稳定性情况考察结果。
图6：实施例3中不同蜂毒素制剂的溶血性实验结果。
图7A：实施例4所得蜂毒素-DNA纳米颗粒的粒径分布图。
图7B：实施例4所得蜂毒素-DNA纳米颗粒的电势分布图。
图8：实施例4中蜂毒素-DNA纳米颗粒的原子力显微镜(AFM)形貌观测图。
图9A：实施例4中蜂毒素-DNA脂质体纳米制剂的粒径分布图。
图9B：实施例4中蜂毒素-DNA脂质体纳米制剂的电势分布图。
图10A：实施例5所得蜂毒素-透明质酸纳米颗粒的粒径分布图。
图10B：实施例5所得蜂毒素-透明质酸纳米颗粒的电势分布图。
图11A：实施例5蜂毒素-透明质酸脂质体纳米制剂的粒径分布图。
图11B：实施例5蜂毒素-透明质酸脂质体纳米制剂的电势分布图。
图12A：实施例6中RGD修饰的蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂的粒径分布图。
图12B：实施例6中RGD修饰的蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂的电势分布图。
图13：实施例7中RGD修饰的蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂的A549细胞特异性结合分析(A549细胞对RGD靶向肽修饰的蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂(RGD-LNP-)的结合。RGD&FAM-LNPM/PGA为RGD修饰的蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂组；RGD+RGD&FAM-LNPM /PGA为预先加入DSPE-PEG2000-RGD的竞争抑制组；PEG&FAM-LNPM/PGA为PEG2000修饰的蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂组)。
图14：实施例8中RGD修饰的蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂诱导A549细胞凋亡的形态学图像(RGD修饰的蜂毒素/聚谷氨酸纳米颗粒作用于A549细胞48小时后的图像。其中，A.RGD-LNPM/PGA为RGD修饰的蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂组；B.PEG-LNPM/PGA为PEG2000修饰的蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂组。箭头所示为凋亡细胞)。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。
实施例1蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂的制备和表征
制备方法：
(1)将蜂毒素和不同分子量的聚谷氨酸(PGA50-100KD，500KD，700KD)分别溶解于去离子水中，使得其水溶液的最终浓度均为0.5mg/mL；将蜂毒素溶液加入聚谷氨酸溶液中，涡旋震荡10s后，在室温条件下孵育30min，得到蜂毒素与聚谷氨酸质量比为2:1的蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒；使用100KD超滤管，超滤除去游离蜂毒素，并将纳米颗粒重新分散于去离子水中。
(2)将DOTAP、DOPE脂质溶解于氯仿，使用薄膜分散法制备脂质体，经过去离子水水合后获得1mg/mL的空白阳离子脂质体。在涡旋状态下，按空白脂质体与蜂毒素-聚谷氨酸(700KD)纳米颗粒的质量比为4：1将之前获得的纳米颗粒加入空白脂质体溶液中，涡旋震荡15s，室温孵育12h，获得蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂。
将步骤(1)中获得的蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒和步骤(2)中获得的蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂经过动态光散射纳米粒度分析仪(DLS)测定粒径、粒径多分散系数(PDI)以及zeta电位；利用原子力显微镜(AFM)和透射电子显微镜(TEM)进行形貌观测；蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂经100KD超滤管超滤，并使用10％Triton和1％NaOH溶液进行处理后，使用HPLC对包封率进行检测(蜂毒素的特征吸收波长为280nm)。
其中，如图1A、图1B，步骤(1)获得的蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒的水合粒径为96.46nm(DLS检测)，多分散系数(PDI)为0.235，zeta电位为-35.6mV；如图2，AFM中观测到的纳米颗粒粒径为70nm；如图3，TEM中观测到的纳米颗粒粒径为60nm。
其中，如图4A、图4B，步骤(2)获得的蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂的水合粒径为104.7nm(DLS检测)，多分散系数(PDI)为0.167，zeta电位为9.41mV，制剂的蜂毒素包封率为57.07％。
不同分子量PGA与蜂毒素形成蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒的水合粒径和电位如下表：
PGA分子量 50,000-100,000D 500,000D 700,000D
Size(nm) 91.95 91.35 96.46
PDI 0.213 0.211 0.235
Zeta(mV) -34.8 -33.2 -35.6
实施例2蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂稳定性研究
制备方法：
将实施例1中制备好的蜂毒素-聚谷氨酸(700KD)纳米颗粒重新分散在去离子水和4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES)中，将实施例1中制备好的蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂重新分别分散于去离子水，4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES)，5％葡萄糖注射液和生理盐水中。在不同时间点使用动态光散射纳米粒度分析仪(DLS)测定粒径、粒径多分散系数(PDI)以及zeta电位，考察其稳定性。通过透析后用HPLC检测透析液中的蜂毒素分析蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂的蜂毒素泄漏情况。
其中，如图5A，蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒的粒径在去离子水和HEPES中均在没有明显变化，且在5天内其形貌、PDI和zeta电位一直保持稳定。
其中，如图5B，蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂的粒径在去离子水、HEPES、生理盐水和5％葡萄糖注射液中均没有明显变化，且在5天内其形貌、PDI和zeta电位一直保持稳定。蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂没有明显的蜂毒素泄漏。
实施例3蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂的溶血性检测
小鼠进行眼眶取血并用肝素钠抗凝，使用血细胞计数器计数后，分装到EP管中，使每管含有5x10^6个血细胞；2000rpm，离心5min去上清，加入等体积生理盐水。将实施例1中获得的蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒和蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂及游离蜂毒素药物分散于HEPES中，获得不同浓度(按所含蜂毒素量计)的溶液并加入EP管中，37℃孵育6小时。
之后重新进行离心，收集上清加入96孔板中，设置三组平行样本；使用酶标仪进行检测，检测波长525nm。
溶血率(％)＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]x 100％，其中As:实验组Ac:Triton Ab:PBS。
如图6，实验结果显示游离蜂毒素在较低浓度即引起明显的溶血效应，在浓度为6μg/mL(约2.2mM)时达到50％的溶血，在浓度为24μg/mL(约8.8mM)时溶血达到90％以上。蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒的溶血效应与游离蜂毒素溶液差不多，这与该纳米颗粒在血液中稳定性有关。而蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂在各个蜂毒素浓度下都没有明显的溶血，即便在蜂毒素浓度达到24μg/mL时也只有0.2％的溶血。
实施例4蜂毒素-质粒DNA脂质体纳米制剂的制备与表征
制备方法：
(1)将蜂毒素和质粒DNA(pGL3质粒)分别溶解于去离子水中，使得其水溶液的最终浓度为0.5mg/mL；将蜂毒素溶液加入质粒DNA溶液中，涡旋震荡10s后，在室温条件下孵育30min，得到蜂毒素与质粒DNA质量比为2:1的蜂毒素-质粒DNA纳米颗粒溶液。使用100KD超滤管超滤除去游离蜂毒素，并将纳米颗粒重新分散于去离子水中。
(2)将DOTAP、DOPE脂质溶解于氯仿，使用薄膜分散法制备脂质体，去离子水水合后获得1mg/mL的空白阳离子脂质体。在涡旋状态下，将之前获得的蜂毒素-质粒DNA纳米颗粒加入空白阳离子脂质体溶液中，涡旋震荡15s，室温孵育12h，得到空白脂质体和纳米颗粒的质量比为4：1的蜂毒素-质粒DNA脂质体纳米制剂。
将步骤(1)中获得的蜂毒素-质粒DNA复合物纳米颗粒和步骤(2)中获得的蜂毒素-质粒DNA脂质体纳米制剂经过动态光散射纳米粒度分析仪(DLS)测定水合粒径、粒径多分散系数(PDI)以及zeta电位；利用原子力显微镜(AFM)和透射电子显微镜(TEM)进行形貌观测；蜂毒素-质粒DNA脂质体纳米制剂经100KD超滤管超滤，并使用10％Triton和1％NaOH溶液处理后，使用HPLC对包封率进行检测。
其中，如图7A、图7B，步骤(1)获得的蜂毒素-质粒DNA纳米颗粒的水合粒径为83.26nm(DLS检测)，多分散系数(PDI)为0.263，zeta电位为-32.5mV，如图8，AFM中观测到的纳米颗粒粒径为70nm。
其中，如图9A、图9B，步骤(2)获得的蜂毒素-质粒DNA脂质体纳米制剂的水合粒径为111.2nm(DLS检测)，多分散系数(PDI)为0.325，zeta电位为4.71mV；如图8，AFM中观测到的蜂毒素-质粒DNA脂质体纳米颗粒粒径为84nm。制剂的蜂毒素包封率为57.9％。
实施例5蜂毒素-透明质酸脂质体纳米制剂的制备与表征
制备方法：
(1)将蜂毒素和透明质酸分别溶解于去离子水中，使得其水溶液的最终浓度为0.5mg/mL；将蜂毒素溶液加入透明质酸溶液中，涡旋震荡10s在室温条件下孵育30min，获得蜂毒素与透明质酸质量比为1:1的蜂毒素-透明质酸纳米颗粒。使用100KD超滤管超滤除去游离蜂毒素，并将纳米颗粒重新分散于去离子水中。
(2)将DOTAP、DOPE脂质溶解于氯仿，使用薄膜分散法制备脂质体，去离子水水合后获得1mg/mL的空白阳离子脂质体。在涡旋状态下，将之前获得的纳米颗粒加入空白脂质体溶液中，涡旋震荡15s，室温孵育12h，得到空白脂质体与纳米颗粒质量比为2：1的蜂毒素-透明质酸脂质体纳米制剂。
步骤(1)中获得的蜂毒素-透明质酸纳米颗粒和步骤(2)中获得的蜂毒素-透明质酸脂质体纳米制剂经过动态光散射纳米粒度分析仪(DLS)测定水合粒径、粒径多分散系数(PDI)以及zeta电位；利用原子力显微镜(AFM)和透射电子显微镜(TEM)进行形貌观测；蜂毒素-透明质酸脂质体纳米制剂经100KD超滤管超滤，并使用10％Triton和1％NaOH溶液处理后，使用HPLC对包封率进行检测。
其中，如图10A、图10B，步骤(1)获得的蜂毒素/透明质酸纳米颗粒的水合粒径为85.51nm(DLS检测)，多分散系数(PDI)为0.181，zeta电位为-13.9mV。
其中，如图11A、图11B，步骤(2)获得的蜂毒素-透明质酸脂质体纳米制剂的水合粒径为116.5m(DLS检测)，多分散系数(PDI)为0.249，zeta电位为3.92mV。制剂的蜂毒素包封率为58.7％。
实施例6RGD靶向肽修饰蜂毒素脂质体纳米制剂的制备
利用后插法制备RGD靶向肽修饰蜂毒素脂质体纳米制剂：合成DSPE-PEG2000-RGD并在纯化后溶于去离子水，并加入至按照实施例1中方法制备的蜂毒素脂质体纳米制剂中；混合完成后于37℃避光震荡过夜，得到脂质体总脂质与DSPE-PEG2000-RGD的摩尔比为95:5的RGD靶向肽修饰蜂毒素脂质体纳米制剂。反应完成后透析除去游离的DSPE-PEG2000-RGD。
将获得的RGD修饰的蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂(RGD-LNPM/PGA)经过动态光散射纳米粒度分析仪(DLS)测定粒径、粒径多分散系数(PDI)以及zeta电位。
如图12A、12B，结果显示RGD修饰蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂的水合粒径为106.8nm，多分散系数(PDI)为0.207，zeta电位为3.60mV。
实施例7RGD靶向肽修饰的蜂毒素脂质体纳米制剂对肿瘤细胞A549的特异性结合作用RGD靶向肽修饰的蜂毒素脂质体纳米制剂制备：
(1)将合成的5-FAM荧光标记蜂毒素和聚谷氨酸分别溶解于去离子水中，使得其水溶液的最终浓度为1mg/mL；将蜂毒素溶液加入聚谷氨酸溶液中，涡旋震荡10s后，在室温条件下孵育30min，获得蜂毒素与聚谷氨酸质量比为2:1的荧光标记的蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒(FAM-NPM/PGA)。使用100KD超滤管超滤除去游离蜂毒素，并将纳米颗粒重新分散于去离子水中。
(2)将DOTAP、DOPE脂质溶解于氯仿，使用薄膜分散法制备脂质体，去离子水水合后获得1mg/mL的空白阳离子脂质体。在涡旋状态下，将之前获得的纳米颗粒加入空白阳离子脂质体溶液中，涡旋震荡15s，室温孵育12h，得到空白脂质体和纳米颗粒的质量比为4：1的荧光标记的蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂(FAM-LNPM/PGA)。
(3)将DSPE-PEG2000-RGD溶于去离子水，并插入步骤(2)制备的蜂毒素脂质体纳米制剂中，混合完成后于37℃避光震荡过夜，得到脂质体总脂质与DSPE-PEG2000-RGD的摩尔比为95:5的荧光标记的RGD修饰的蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂(RGD&FAM-LNPM/PGA)，透析除去游离的DSPE-PEG2000-RGD。
(4)将制备好的RGD修饰的蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂分散至不含血清的1640培养基中。
采用与实施例7(1)～(4)所述方法制作荧光标记的PEG修饰蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂(PEG&FAM-LNPM/PGA)，制作方法与上述的区别在于，步骤(3)中，将DSPE-PEG2000溶于水，其余皆相同。
对肿瘤细胞A549的特异性结合作用实验：
(1)取对数生长期的人非小细胞肺癌细胞A549，胰酶消化后计数；调整细胞浓度，接种于24孔板中；每孔5x10^4个细胞，1mL含10％FBS的1640细胞培养液；在37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养过夜。
(2)弃去细胞培养液，使用PBS冲洗细胞后，每孔加入200μl的PEG修饰蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂(PEG&FAM-LNPM/PGA)溶液或RGD&FAM-LNPM/PGA溶液,37℃培养20min；竞争抑制组则是先加入DSPE-PEG2K-RGD胶束37℃孵育20min，用PBS清洗三次后再加入RGD&FAM-LNPM/PGA溶液制剂，4℃培养20min。
(3)弃去细胞培养液，用PBS冲洗细胞三次后，对细胞进行固定，使用DAPI溶液染色；制片后使用激光共聚焦显微镜，在激发波长/发射波长为494/522和358/461条件下观测蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂对细胞的结合情况。
根据图13可以看到，37℃时细胞生理状态正常，PEG&FAM-LNPM/PGA组细胞的细胞膜上无绿色荧光信号，而RGD&FAM-LNPM/PGA组细胞的细胞膜上有明显的绿色荧光信号,说明该制剂可以有效的通过RGD与整合素的作用结合到细胞上；当使用DSPE-PEG2000-RGD胶束作为竞争抑制剂，占据细胞表面RGD结合的靶点后，再次加入RGD修饰蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂，A549细胞膜上无绿色荧光信号，进一步说明该制剂是通过RGD与细胞膜上的整合素特异性识别并结合到细胞上的。
实施例8RGD靶向肽修饰蜂毒素脂质体纳米制剂诱导肿瘤细胞凋亡
RGD靶向肽修饰蜂毒素脂质体纳米制剂制备：
(1)将蜂毒素和聚谷氨酸溶解于去离子水中，使得其水溶液的最终浓度为1mg/mL；将蜂毒素溶液加入聚谷氨酸溶液中，涡旋震荡10s,在室温条件下孵育30min，获得蜂毒素与聚谷氨酸质量比为2:1的蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒。使用100KD超滤管超滤除去游离蜂毒素，并将纳米颗粒重新分散于去离子水中。
(2)将DOTAP、DOPE脂质溶解于氯仿，使用薄膜分散法制备脂质体，去离子水水合后获得1mg/mL的空白阳离子脂质体。在涡旋状态下，将之前获得的纳米颗粒加入空白阳离子脂质体溶液中，涡旋震荡15s，室温孵育12h，获得空白脂质体和纳米颗粒的质量比为4：1的蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂。
(3)将DSPE-PEG2000-RGD加入步骤(2)制备的蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂中，混合完成后于37℃避光震荡过夜，获得脂质体总脂质与DSPE-PEG2000-RGD的摩尔比为95:5的RGD修饰蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂(RGD-LNPM/PGA)，透析除去游离DSPE-PEG2000-RGD。
(4)将制备好的RGD修饰蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂(RGD-LNPM/PGA)分散至不含血清的1640培养基中。
采用与实施例8(1)～(4)所述方法制作PEG修饰蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂(PEG-LNPM/PGA)，制作方法与上述的区别在于，步骤(3)中，将DSPE-PEG2000溶于水，其余皆相同。
诱导肿瘤细胞凋亡实验：
(1)取对数生长期的A549人非小细胞肺癌细胞，胰酶消化后计数；调整细胞浓度，接种于24孔板中；每孔5x10^4个细胞，1mL含10％FBS的1640细胞培养液；在37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养过夜。
(2)弃去细胞培养液，使用PBS冲洗细胞后，每孔加入15μM的PEG或RGD修饰蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂溶液200μl，在37℃条件下培养6小时；之后弃去溶液，用PBS清洗3次，换上1mL新鲜培养基，继续培养48小时。
(3)弃去细胞培养液，用PBS冲洗细胞三次后，对细胞进行固定，使用DAPI溶液染色；制片后使用激光共聚焦显微镜，在激发波长/发射波长为494/522条件下观测RGD修饰蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂引起的细胞和细胞核形貌状态的改变。
其中，根据图14可以看到，RGD-LNPM/PGA组的部分细胞细胞核浓缩或核碎裂成大小不等的圆形小体(凋亡小体)，符合凋亡的形态学特征，而PEG-LNPM/PGA组中大部分细胞核染色均一，形态正常；说明RGD修饰蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂能够诱导肿瘤细胞的凋亡。
实施例9
本发明还参照实施例1制备了其他类型的蜂毒素脂质体纳米制剂，并进行表征。
类型1、与实施例1中的蜂毒素脂质体纳米制剂制备方法的不同之处在于，步骤(1)中，将蜂毒素和聚谷氨酸(PGA)分别溶解于去离子水中，使得其水溶液的最终浓度均为0.05mg/mL，将蜂毒素溶液加入聚谷氨酸溶液中，得到蜂毒素与聚谷氨酸质量比为0.1:1的蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒；步骤(2)中，将之前获得的纳米颗粒加入空白脂质体溶液中，得到空白脂质体和纳米颗粒的质量比为10：1的蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂，其余皆相同。
类型2、与实施例1中的蜂毒素脂质体纳米制剂制备方法的不同之处在于，步骤(1)中，将蜂毒素和聚谷氨酸(PGA)分别溶解于去离子水中，使得其水溶液的最终浓度均为1mg/mL，将蜂毒素溶液加入聚谷氨酸溶液中，得到蜂毒素与聚谷氨酸质量比为0.8:1的蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒；步骤(2)中，将之前获得的纳米颗粒加入空白脂质体溶液中，得到空白脂质体和纳米颗粒的质量比为8：1的蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂，其余皆相同。
类型3、与实施例1中的蜂毒素脂质体纳米制剂制备方法的不同之处在于，步骤(1)中，将蜂毒素和聚谷氨酸(PGA)分别溶解于去离子水中，使得其水溶液的最终浓度均为5mg/mL，将蜂毒素溶液加入聚谷氨酸溶液中，得到蜂毒素与聚谷氨酸质量比为1：1的蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒；步骤(2)中，将之前获得的纳米颗粒加入空白脂质体溶液中，空白脂质体和纳米颗粒的质量比为6：1的蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂，其余皆相同。
类型4、与实施例1中的蜂毒素脂质体纳米制剂制备方法的不同之处在于，步骤(1)中，将蜂毒素和聚谷氨酸(PGA)分别溶解于去离子水中，使得其水溶液的最终浓度均为5mg/mL，将蜂毒素溶液加入聚谷氨酸溶液中，得到蜂毒素与聚谷氨酸质量比为2:1的蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒；步骤(2)中，将之前获得的纳米颗粒加入空白脂质体溶液中，得到空白脂质体和纳米颗粒的质量比为5：1的蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂，其余皆相同。
类型5、与实施例1中的蜂毒素脂质体纳米制剂制备方法的不同之处在于，步骤(1)中，将蜂毒素和聚谷氨酸(PGA)分别溶解于去离子水中，使得其水溶液的最终浓度均为8mg/mL，将蜂毒素溶液加入聚谷氨酸溶液中，得到蜂毒素与聚谷氨酸质量比为3:1的蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒；步骤(2)中，将之前获得的纳米颗粒加入空白脂质体溶液中，得到空白脂质体和纳米颗粒的质量比为4：1的蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂，其余皆相同。
类型6、与实施例1中的蜂毒素脂质体纳米制剂制备方法的不同之处在于，步骤(1)中，将蜂毒素和聚谷氨酸(PGA)分别溶解于去离子水中，使得其水溶液的最终浓度均为3mg/mL，将蜂毒素溶液加入聚谷氨酸溶液中，得到蜂毒素与聚谷氨酸质量比为4:1的蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒；步骤(2)中，将之前获得的纳米颗粒加入空白脂质体溶液中，得到空白脂质体和纳米颗粒的质量比为2：1的蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂，其余皆相同。
将各类型的脂质体纳米制剂和相应的蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒经过动态光散射纳米粒度分析仪(DLS)测定粒径、粒径多分散系数(PDI)以及zeta电位；利用原子力显微镜(AFM)和透射电子显微镜(TEM)进行形貌观测；蜂毒素-透明质酸脂质体纳米制剂经100KD超滤管超滤，并使用10％Triton和1％NaOH溶液处理阴离子聚合物纳米颗粒，使用HPLC对包封率进行检测。(蜂毒素的特征吸收波长为280nm)。
不同比例蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒的包封率如下表：
类型 1 2 3 4 5 6
蜂毒素/PGA质量比 0.1：1 0.8：1 1：1 2：1 3：1 4：1
包封率 93.74％ 88.4％ 81.63％ 87.2％ 80.46％ 67.0％
经验证，类型1-6的脂质体制剂均具有稳定结构，没有明显蜂毒素泄漏。
经验证，类型1-6的制剂通过RGD修饰后可与整合素特异性识别并结合到细胞上。
经验证，RGD修饰的类型1-6的蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂能够诱导肿瘤细胞的凋亡。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种蜂毒素脂质体纳米制剂，含有蜂毒素脂质体，所述蜂毒素脂质体至少包括：蜂毒素，阴离子聚合物和阳离子脂质载体，所述阴离子聚合物选自聚谷氨酸、聚天冬氨酸、透明质酸、脱氧核糖核酸和核糖核酸中的一种或多种；所述蜂毒素和阴离子聚合物结合形成蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的蜂毒素脂质体纳米制剂，其特征在于，所述阳离子脂质载体可形成脂质双分子膜，所述蜂毒素脂质体包括外层结构和内核结构，所述外层结构包括脂质双分子膜，所述内核结构包括蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒。
3.根据权利要求1所述的蜂毒素脂质体纳米制剂，其特征在于，所述制剂还包括以下特征中的一项或多项：
a.所述阴离子聚合物为通过化学合成或生物分离获得的聚合物分子；
b.所述蜂毒素为蜂毒中提取或化学合成的蜂毒素。
4.根据权利要求1所述的蜂毒素脂质体纳米制剂，其特征在于，所述阳离子脂质载体至少包含一种阳离子脂质。
5.根据权利要求2所述的蜂毒素脂质体纳米制剂，其特征在于，所述外层结构修饰有脂质-聚乙二醇或脂质-聚乙二醇-功能分子。
6.一种蜂毒素脂质体纳米制剂的制备方法，至少包括以下步骤：
将蜂毒素和阴离子聚合物混合孵育，得到蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒，所述阴离子聚合物选自聚谷氨酸、聚天冬氨酸、透明质酸、脱氧核糖核酸和核糖核酸中的一种或多种；
将所述蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒与阳离子脂质载体混合孵育，得到蜂毒素脂质体纳米制剂。
7.如权利要求6所述的蜂毒素脂质体纳米制剂的制备方法，其特征在于，所述蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒由以下方法制备：
(1)分别将蜂毒素和阴离子聚合物溶于溶剂，配制成蜂毒素溶液和阴离子聚合物溶液；
(2)将步骤(1)得到蜂毒素溶液和阴离子聚合物溶液混匀孵育，获得蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒。
8.如权利要求6所述的蜂毒素脂质体纳米制剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下特征中的一项或多项：
a.所述阳离子脂质载体由阳离子脂质或阳离子脂质与辅助脂质进行制备；
b.所述阳离子脂质载体由薄膜分散法、乙醇注入和逆向蒸发法中的一种或多种方法进行制备；
c.在制备过程中加入脂质-聚乙二醇或脂质-聚乙二醇-功能分子，得到聚乙二醇修饰的或功能分子修饰的蜂毒素脂质体纳米制剂。
9.一种蜂毒素脂质体纳米制剂，由权利要求6-8任一所述方法获得。
10.一种如权利要求1-5任一所述或权利要求9所述的蜂毒素脂质体纳米制剂在制备抗肿瘤、抗菌或抗炎症药物中的用途。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110585419B (zh) * 2019-09-30 2023-08-29 中南大学湘雅医院 Pkm2调控剂及其制备方法和应用
CN112180079B (zh) * 2020-09-25 2024-04-19 上海睿康生物科技有限公司 一种稳定的脂质体颗粒及其在免疫比浊检测中的应用
CN112791192B (zh) * 2020-12-31 2023-04-07 上海交通大学 炎性细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂及其制备方法和应用
CN114540416A (zh) * 2022-02-18 2022-05-27 上海交通大学 一种表达载体、脂质纳米粒、抗肿瘤药物及其制备方法和用途
CN117045619B (zh) * 2023-07-14 2024-03-29 上海中医药大学 一种共载蜂毒溶瘤肽和腺苷a2ar受体抑制剂的脂质体-聚合物纳米粒及制备和应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5851818A (en) * 1996-05-31 1998-12-22 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Condensed plasmid-liposome complex for transfection
US6133026A (en) * 1996-05-31 2000-10-17 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Condensed plasmid-liposome complex for transfection
CN101391098A (zh) * 2008-11-11 2009-03-25 中国药科大学 一种蜂毒素脂质体制剂及其制备方法
CN101601642A (zh) * 2009-06-30 2009-12-16 沈阳药科大学 一种囊泡类给药系统及其应用
CN103769018A (zh) * 2012-10-25 2014-05-07 上海市肿瘤研究所 改性凝集素包裹的磁性大分子脂质体纳米微球、制备方法及应用
CN104341488A (zh) * 2013-08-02 2015-02-11 复旦大学 c(LyP-1)多肽及其构建的纳米递药系统和应用
CN107446016A (zh) * 2016-05-30 2017-12-08 上海交通大学 一种硬脂酸修饰的细胞穿膜肽及其制备与应用
CN108210883A (zh) * 2018-01-19 2018-06-29 东南大学 一种基于蜂毒肽的纳米试剂及其制备方法和应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7208314B2 (en) * 2002-02-26 2007-04-24 Mirus Bio Corporation Compositions and methods for drug delivery using pH sensitive molecules

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5851818A (en) * 1996-05-31 1998-12-22 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Condensed plasmid-liposome complex for transfection
US6133026A (en) * 1996-05-31 2000-10-17 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Condensed plasmid-liposome complex for transfection
CN101391098A (zh) * 2008-11-11 2009-03-25 中国药科大学 一种蜂毒素脂质体制剂及其制备方法
CN101601642A (zh) * 2009-06-30 2009-12-16 沈阳药科大学 一种囊泡类给药系统及其应用
CN103769018A (zh) * 2012-10-25 2014-05-07 上海市肿瘤研究所 改性凝集素包裹的磁性大分子脂质体纳米微球、制备方法及应用
CN104341488A (zh) * 2013-08-02 2015-02-11 复旦大学 c(LyP-1)多肽及其构建的纳米递药系统和应用
CN107446016A (zh) * 2016-05-30 2017-12-08 上海交通大学 一种硬脂酸修饰的细胞穿膜肽及其制备与应用
CN108210883A (zh) * 2018-01-19 2018-06-29 东南大学 一种基于蜂毒肽的纳米试剂及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Helix formation of melittin on poly(L-glutamic acid) and poly(D-glutamic acid);Takeda 等;《Journal of the American Chemical Society》;19911231;第113卷(第3期);第1040-1041页 *
蜂毒素脂质体质量评价方法的研究;王长江，等;《中国药科大学学报》;20081231;第39卷(第3期);第218-222页 *

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