CN101391098A - 一种蜂毒素脂质体制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物制剂领域，具体涉及一种蜂毒素的脂质体制剂，其特征是由蜂毒素1份、磷脂5～40份、胆固醇1.3～10份、泊洛沙姆10～140份组成，本发明还公开了这种蜂毒素脂质体制剂的制备方法。本发明的蜂毒素脂质体不仅可延缓脂质体中的药物释放，延长其在血液中的循环时间，提高药物的生物利用度，同时可显著性地降低药物自身的毒副作用，提高病人的顺应性。

Description

一种蜂毒素脂质体制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及药物制剂领域，具体涉及一种蜂毒素的脂质体制剂，本发明还公开了这种蜂毒素脂质体制剂的制备方法。

背景技术

蜂毒(bee venom)是工蜂毒腺分泌出来的一种具有芳香气味的透明毒液，它是一种成分复杂的混合物，主要含有蛋白质多肽类、酶类、生物胺类和其它物质，其中肽类、酶类和非肽类构成蜂毒的主要活性成分。肽类包括蜂毒素、阿帕敏反应的主要物质。酶类主要包括多达55种以上的酶类物质，其中磷脂酶A2是受蜂蛰之后产生过敏反应的主要物质。非肽类包括组胺、各种生物胺类物质，与受蜂蛰之后产生疼痛有关。

蜂毒中研究较多的是蜂毒溶血肽，又称蜂毒素，占蜂毒干重的50％，是蜂毒的主要组成成分及活性成分。蜂毒素是由26个氨基酸组成的小分子肽，其相对分子量为2849，氨基酸的排列顺序为：甘-异亮-甘-丙-缬-亮-赖-缬-亮-苏-苏-甘-亮-脯-丙-亮-异亮-丝-色-异亮-赖-精-赖-精-谷-谷，强碱性，溶于水，其二级结构为α-螺旋结构。详见(王关林，邢卓.蜂毒肽的研究及展望，辽宁师范大学学报(自然科学版)，2005，28(1)：87)

蜂毒肽通过多途径影响细胞的信号蜂毒传导系统，并可诱发神经酰胺合成及细胞凋亡，具有抗菌、抗病毒、消炎等功效。最近研究表明其具有抗癌和抗HIV的作用。近20年来，先后发现其对多种肿瘤具有强烈的杀灭作用，这引起人们的高度关注。有研究报道，其抗肿瘤作用优于去甲斑蝥素、大蒜素、华蟾素、丝裂霉素、长春新碱等常用抗癌药物，是一个十分具有应用前景的抗肿瘤天然药物。详见(顾桂秋，钱鹤声.蜂毒肽生物学活性和药理作用的研究进展，中国蜂业，2006，57(8)：33)(王硕丰，杨本明，李立标等.蜂毒素的药理作用研究及展望，天津药学，2003，15(4)：53)

在我国，有关蜂毒医疗应用已有数千年的历史，近年关于蜂毒肽基础研究也十分活跃。但至今国内仍无蜂毒素相关制剂上市。曾有人研究注射用蜂毒冻干粉但因其对血管的刺激性未能应用于临床。蜂毒素自身的溶血作用和血管内皮细胞坏死等毒副作用极大的限制了其临床应用。

脂质体是解决上述问题首选的一类药物传递系统，因其可将蛋白多肽类药物包封在内，减缓药物的释放，从而避免由于溶液剂中全部剂量的药物快速和血管内皮细胞的接触产生的刺激性问题。但在实验过程中发现：蜂毒素普通脂质体仍不能完全消除蜂毒素的血管刺激性。

发明内容

本发明公开了一种临床适用的蜂毒素脂质体及其注射用冻干粉针，该蜂毒素脂质体冻干粉针在加入注射用生理盐水后能重新分散，本发明的蜂毒素脂质体不仅可延缓脂质体中的药物释放，延长其在血液中的循环时间，提高药物的生物利用度，同时可显著性地降低药物自身的毒副作用，提高病人的顺应性。

本发明的蜂毒素脂质体制剂，含下列组分及重量比：

蜂毒素                  1

磷脂                    5～40

胆固醇                  1.3～10

泊洛沙姆                10～140。

本发明的蜂毒素脂质体制剂，各组分优选的重量比为：

蜂毒素                     1

磷脂                       10～20

胆固醇                     1.7～5

泊洛沙姆                   40～100。

本发明中，蜂毒素与磷脂、胆固醇、泊洛沙姆(poloxamer)的的配比直接影响到脂质体的质量。

所述磷脂优选大豆磷脂。

本发明所涉及的比例均为重量比。

当胆固醇和泊洛沙姆取一个固定值，磷脂取不同的重量时，蜂毒素脂质体的平均粒径和包封率也不同。结果见表1。

表1.药物和磷脂的比例对脂质体粒径和包封率的影响(n＝3)

从表可以看出，当蜂毒素和磷脂重量比小于1:5时，粒径较大，包封率过低；当蜂毒素和磷脂重量比大于1:40时，尽管包封率和粒径适宜，但脂质体溶液粘稠，且放置越久越粘稠；当蜂毒素和磷脂重量比在1:5～40范围内，包封率较高，粒径符合要求；当蜂毒素和磷脂重量比在1:10～20范围内，包封率高于90％，粒径符合要求，因此本发明中药物/磷脂的比例优选为1:10～20。

当磷脂和泊洛沙姆取一个固定值，胆固醇取不同的重量时，蜂毒素脂质体的平均粒径和包封率也不同。结果见表2。

表2.药物和胆固醇的比例对脂质体粒径和包封率的影响(n＝3)

从表中可以看出，药物和胆固醇的重量比例在1：0～20范围内，当药物和胆固醇的重量比小于1:10时，粒径过大，包封率较低；当药物和胆固醇的重量比大于1:1.3时，包封率较低，且放置片刻即絮凝，当药物和胆固醇的重量比例在1：1.3～10范围内，包封率和粒径均较好，且比例在1：1.7～5范围内包封率和粒径最佳，因此本发明中药物/胆固醇的比例优选在1：1.7～5。

试验发现：当在蜂毒素脂质体中加入泊洛沙姆后，蜂毒素脂质体对血管无刺激作用。

一、血管刺激性实验

实验材料：受试制剂为蜂毒素溶液组、蜂毒素脂质体A组(不含泊洛沙姆)、蜂毒素脂质体B组(2％泊洛沙姆修饰，相当于药物：泊洛沙姆的比例为1：40)、蜂毒素脂质体C组(5％泊洛沙姆修饰，相当于药物：泊洛沙姆为1：100)。其中蜂毒素溶液为蜂毒素在生理盐水中溶解而制成。对照制剂为注射用生理盐水。动物选用大白兔，体重2.0kg～2.5kg，雌雄兼用，正常饲养3d后供试。

实验方法：取家兔15只，随机分成5组，每组3只，兔右耳耳缘静脉滴注浓度为0.05mg/ml的上述各组蜂毒素制剂(采用生理盐水稀释)，滴速为1mL/min，给药体积为10mL/kg；左耳耳缘静脉滴注等量生理盐水为对照，隔天给药一次，连续给药3次。每次注射后观察静脉滴注局部有无异常变化。末次给药后48h后，处死动物，并将每只动物左、右耳静脉滴注部位取组织标本，立即浸泡在10％福尔马林液中固定48h后，石蜡切片，HE染色，光镜下进行耳静脉滴注处向心侧不同部位(近段、中段、远段)进行组织学检查，观察有无组织变形或坏死等显著性刺激反应，并将给药侧与空白对照侧进行比较。

实验结果：

自身阴性对照组(生理盐水组)镜下见注射点近端静脉纵断面血管腔内充满红细胞，血管内皮扁平，内膜面光滑，内皮完整，无损伤表现，无血栓形成；中段检材可见静脉内皮完整，腔内充满红色血浆；远段切片见静脉内皮细胞完整，腔内有少量红细胞。

兔耳缘静脉滴注蜂毒素溶液，肉眼观察可见家兔耳缘静脉血管颜色发紫，表明蜂毒素有强烈的血管刺激性。

兔耳缘静脉滴注蜂毒素脂质体A组，血管刺激性有所降低，但镜检仍发现有炎症等血管刺激性表现。

兔耳缘静脉滴注蜂毒素脂质体B、C组后24hr，肉眼未见兔耳缘静脉有明显异常。经兔耳缘静脉组织切片观察，镜下见注射点近端静脉管壁内皮细胞完整无损，有的管腔内见有红细胞；中段可见血管内皮完整，未见损伤及血栓形成；注射点远端可见血管内皮细胞完整，管腔内有红细胞及白细胞，管腔无损伤，未见血栓形成。结果表明，兔耳缘静脉内皮细胞完整，内膜无损伤及血栓形成，管壁亦无炎症反应。

上述试验结果表明采用蜂毒素溶液有强烈的血管刺激性，将蜂毒素包封于脂质体后，血管刺激性虽有所降低，但仍然不能消失；而经泊洛沙姆修饰的蜂毒素脂质体对家兔无血管刺激性反应。

体内动力学试验研究显示，加入泊洛沙姆的蜂毒素脂质体显著延长蜂毒素在体内的作用时间。

二、以大鼠体内药动学实验研究

实验方法：取雄性SD大鼠18只，禁食不禁水16h后，随机分为3组，以0.42mg/ml剂量股静脉注射，分别给予蜂毒素溶液(记为：MLT-I)、蜂毒素脂质体2％188MLT-LIPO(即：2％泊洛沙姆修饰，相当于药物：泊洛沙姆为1：40)、蜂毒素脂质体5％188MLT-LIPO(即：5％泊洛沙姆修饰，相当于药物：泊洛沙姆为1：100)。给药前和给药后在设定时间点于大鼠眼眶后静脉丛取血约300μL，置于离心管中，以8000rpm离心5min，分离血清。取血清100μL，采用间接ELISA法测定药物浓度，绘制血药浓度经时曲线，利用kinetica4.4程序计算药动学参数。

实验结果：血药浓度经时曲线如图1所示。

由图1可见，溶液组在大鼠血清中150min药物浓度已基本接近检测下限，而2％188MLT-LIPO组在大鼠血清中360min仍可检测到微量药物；5％188MLT-LIPO组在大鼠血清中480min仍可检测到微量药物。说明本发明的蜂毒素脂质体，其在大鼠体内释放明显变慢。

药动学数据拟合结果见表3。

表3 大鼠静注0.42mg·kg^-1蜂毒素后药代动力学参数(n＝6)

^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001MLT-LIPO vs　MLT-I；_▲p<0.05，_▲▲p<0.01，_▲▲▲p<0.001MLT-LIPO-5％　vs MLT-LIPO-2％

大鼠体内药代动力学数据表明，与溶液剂相比，静注2％及5％poloxamer修饰的蜂毒素脂质体后，血药浓度均能够维持更稳定的水平，分别给药6h及8h后，血中仍保持一定的浓度，平均滞留时间(MRT)分别增加了1.49倍及2.43倍，血药浓度曲线下面积(AUC)是溶液剂的2.06倍及2.75倍。可以看出，本发明的蜂毒素脂质体，可延长在大鼠体内的滞留时间，提高生物利用度。

另外，对比2％188MLT-LIPO及5％188MLT-LIPO的药动学数据，可以看出，随着泊洛沙姆188用量的增加(从2％增加到5％)，其消除相半衰期T_1/2，β增大27.83％；平均滞留时间MRT延长37.7％；体内清除率Cl降低25.5％；AUC增加33.6％，表明随着脂质体修饰剂泊洛沙姆用量的增加，其聚氧乙烯亲水长链对脂质体的保护作用增加，进一步避免了体内血浆蛋白的调理作用，增加了生物利用度。初步研究表明，其长循环作用与所用共聚物的用量呈一定正相关。但泊洛沙姆用量会对脂质体的平均粒径和包封率有所影响。

当磷脂和胆固醇取一个固定值，泊洛沙姆取不同的重量时，观察蜂毒素脂质体的平均粒径和包封率。结果见表4。

表4 泊洛沙姆对脂质体粒径和包封率的影响结果(n＝3)

从表中可以看出，随着泊洛沙姆用量的增加，脂质体粒径逐渐增大，包封率逐渐下降，当泊洛沙姆的用量超过1：100后，脂质体的粒径和包封率都有较大幅度的改变，且溶液粘稠度增加；当泊洛沙姆的用量达到1：200时，虽然脂质体的粒径和包封率仍满足要求，但溶液的粘稠度高，稳定性差，在放置过程中，逐渐出现絮状物，因此不宜选用过高浓度的泊落沙姆。虽然不含泊洛沙姆的脂质体的粒径和包封率符合要求，但仍表现出血管刺激性，综合上述实验结果，本发明中药物/泊洛沙姆的比例在1：10～140范围内，优选在1：40～100。

本发明的蜂毒素脂质体还可添加冻干保护剂制备成冻干脂质体制剂。试验发现不同的冻干保护剂对蜂毒素脂质体的质量影响也不同，先制备本发明的蜂毒素脂质体，然后在其中添加不同的冻干保护剂，冷冻干燥，结果见表5：

表5 冻干保护剂对脂质体包封率和粒径的影响(n＝3)

“+”general“++”good“+++”excellent

从表5中可以看出，在各种常见的冻干保护剂中，蔗糖、乳糖、葡萄糖、海藻糖的效果较好，脂质体的各项指标满足要求；而甘露醇、山梨醇作为冻干保护剂，虽然其外观较佳，但包封率有较显著降低，且其对脂质体粒径的控制欠佳。因此作为蜂毒素脂质体的冻干保护剂优选蔗糖、乳糖、葡萄糖、海藻糖中的一种或几种。

本发明的蜂毒素脂质体的制备方法包括：将磷脂胆固醇溶于有机溶剂，减压蒸发去除有机溶剂，加入载制剂量蜂毒素的水合介质水合形成混悬液，匀化，即得，所述有机溶剂选自氯仿、二氯甲烷、甲醇、乙醇、乙醚、丙酮中的一种或几种。优选氯仿、甲醇、二氯甲烷或乙醇。制备成冻干粉针剂时，将冻干保护剂溶解于脂质体混悬液中中，冷冻干燥即可。

本发明的蜂毒素脂质体还可以用以下方法制备：采用现有技术中的方法制备得到空白脂质体，将制剂量的蜂毒素与空白脂质体混合均匀，冷冻干燥制备得到冻干脂质体制剂。

本发明的蜂毒素脂质体还可以采用以下方法制备：采用现有技术中的方法制备得到空白脂质体，将制剂量的蜂毒素与空白脂质体混合均匀，经数次反复冻融后，冷冻干燥得到冻干脂质体制剂。

本发明的蜂毒素脂质体的既可使脂质体达到高包封率，又有良好的稳定性，包封率在80～100％，粒径为100～600nm。在优化处方范围内本发明的蜂毒素脂质体包封率大于90％，粒径在100～250nm范围内。本发明的优点是，所提供的脂质体制备工艺易于工业化大生产，且不影响蜂毒素的原有生物活性，其冻干脂质体为白色细腻、疏松不塌陷粘连、稳定性好、易于水化。本发明制备的蜂毒素脂质体可显著延长药物在大鼠体内的驻留时间，提高药物的生物利用度，消除药物的血管刺激性。

附图说明

图1是大鼠静脉注射蜂毒素后血药浓度-时间图

图2是本发明的蜂毒素脂质体粒径分布图

图3是本发明的蜂毒素脂质体透射电镜照片

具体实施方式

实施例1

称取1.2g大豆磷脂(纯度大于92％磷脂酰胆碱)、150mg胆固醇溶于50ml乙醇中，超声，溶解；在50℃、400rpm磁力搅拌条件下，将上述溶液缓慢注入90ml等渗生理盐水(含5％泊洛沙姆188，为重量百分比，下同)，二者混合继续搅拌2h后至乙醇完全挥干，得到脂质体粗混悬液，高压均质以减少粒径(5000psi，3次)，即得。后将60mg蜂毒素溶于30ml等渗生理盐水(含5％泊洛沙姆188)，再与上述溶液混合，并加入12g乳糖溶解于混合溶液中，无菌过滤后(膜滤器孔径0.2μm)，将续滤液分散无分装于西林瓶中，冷冻干燥即可。

将冻干脂质体在4℃环境贮存3个月后，蜂毒素含量为96.8％，加入注射级生理盐水重组得到的脂质体包封率为91.45％，粒径为217nm，以5％葡萄糖溶液或0.9％生理盐水稀释8h后包封率基本保持不变。

成品性状：本品为白色细腻、疏松不塌陷粘连的固态。

复水分散性：本品在注射用溶剂如生理盐水中经轻微震荡，10s内即可迅速形成均一稳定的半透明白色混悬溶液。

粒径测定：本品用生理盐水作为稀释溶剂，稀释数倍后用PCS法测定粒径(MalvernZetasizer3000HS)，粒径分布图见图2所示，平均粒径为201nm，多分散系数为0.178。

形态学观察：本品用等渗生理盐水作为稀释溶剂，稀释数十倍后在透射电镜下观察。如图3所示，脂质体为规则的球体，外观圆整度良好，指纹结构明显，脂质双分子膜规则均一。

实施例2

称取1g大豆磷脂(纯度大于93％)、200mg胆固醇溶解于二氯甲烷中，将该溶液置于磨口茄形瓶中，于25℃恒温水浴上旋转蒸发仪在100rpm条件下减压蒸发除去有机溶剂，使磷脂、胆固醇在瓶底形成均匀膜，后置于真空干燥器中抽真空过夜，备用。另将100mg蜂毒素溶解于200ml等渗5％葡萄糖溶液(含2％泊洛沙姆188)中，将此溶液加入上述茄形瓶中，在37℃条件下转动洗膜，直至形成乳白色脂质体悬液，高压均化，减小粒径(5000psi，3次)，即得。将20g海藻糖溶解于脂质体中，无菌过滤后(膜滤器孔径0.2μm)，将续滤液分装于西林瓶中，冷冻干燥即可。

将冷冻干燥的脂质体于4℃环境下贮存3个月后，蜂毒素含量为97.1％，加入适量注射级等渗葡萄糖溶液后脂质体包封率为91.0％，粒径为242nm，以5％葡萄糖溶液或0.9％生理盐水稀释8h后包封率基本保持不变。

实施例3

将实施例1中无菌过滤后的续滤液分装于西林瓶后，经反复冻融(冷冻温度为-50℃，冷冻时间为3h，溶融温度为4℃，溶融时间为30min，反复冻融次数为2次)后，冷冻干燥得到冻干粉针剂。

将冷冻干燥的脂质体于4℃环境下贮存3个月后，蜂毒素含量为95.9％，加入适量注射级等渗葡萄糖溶液后脂质体包封率为96.8％，粒径为214nm，以5％葡萄糖溶液或0.9％生理盐水稀释8h后包封率基本保持不变。

实施例4

与实施例1基本相同，但有以下改变：前期制备空白脂质体时，操作流程为：称取1.2g大豆磷脂(纯度大于92％磷脂酰胆碱)、150mg胆固醇溶于适量乙醚中，将该溶液置于磨口茄形瓶中，超声，溶解，后注入90ml等渗生理盐水(含5％泊洛沙姆188)，水浴超声60min，得到脂质体粗混悬液，高压均质以减少粒径(5000psi，3次)，即得空白脂质体悬液。

将冷冻干燥的脂质体于4℃环境下贮存3个月后，蜂毒素含量为97.9％，加入适量注射级等渗生理盐水溶液后脂质体包封率为90.8％，粒径为192nm，以5％葡萄糖溶液或0.9％生理盐水稀释8h后包封率基本保持不变。

实施例5

考察蜂毒素对小鼠移植Heps瘤的抑制作用，对实施例1的产品进行体内抗肿瘤初步药效学实验研究。

试验材料

受试制剂：蜂毒素溶液组及实施例1产品。

阳性药：注射用环磷酰胺(CTX)

        动  物：ICR小鼠，18-22g，雌雄各半

瘤株：Heps

实验方法

取ICR小鼠60只，按移植性肿瘤研究法，接种Heps实体型瘤(在无菌操作下取瘤块，称重，用玻璃组织匀浆器研磨，磨匀后放人无菌容器内，加生理盐水稀释成1:3的细胞悬液，容器置冰块上，用空针抽吸，每次抽吸前将细胞混匀，每只小鼠右前肢腋窝皮下接种0.2ml)，接种后24小时称鼠重，并随机分为6组，空白对照组、CTX组(20mg/kg)分别为阴、阳性对照组，本发明的蜂毒素脂质体组(0.6、0.3、0.15mg/kg)组及蜂毒素溶液组(0.6mg/kg)。于接种24小时后尾静脉注射给药，每天一次，共给药6次，于停药后第2天处死荷瘤小鼠称重，并分离瘤块称重，所得数据进行统计学处理(t检验)。

实验结果

实验研究结果表明，如表6所示，与空白对照组相比，溶液组(0.6mg/kg)、本发明脂质体组(0.6mg/kg、0.3mg/kg)、环磷酰胺(3mg/kg)组的抑瘤率分别为38.98％、46.49％，34.46％，54.33％，皆有显著抑制Heps肿瘤生长的作用(P<0.01)。与高浓度溶液组相比，本发明脂质体组(0.6mg/kg)的抑瘤率相比有较显著增加，经t检验显示出显著性差异(P<0.05)。

表6 对小鼠移植瘤Heps的抑制作用(X±SD)(n＝10)

^*P<0.05，^**P<0.01与空白组比较

Claims (5)

1、一种蜂毒素脂质体制剂，其特征是含下列组分及重量比：

蜂毒素        1

磷脂          5～40

胆固醇        1.3～10

泊洛沙姆      10～140。

2、权利要求1的蜂毒素脂质体制剂，其特征是各组分的重量比为：

蜂毒素        1

磷脂          10～20

胆固醇        1.7～5

泊洛沙姆      40～100。

3、权利要求1或2的蜂毒素脂质体制剂，其中磷脂是大豆磷脂。

4、权利要求1或2的蜂毒素脂质体制剂，还含有冻干保护剂。

5、权利要求4的蜂毒素脂质体制剂，其中冻干保护剂选自蔗糖、乳糖、葡萄糖、海藻糖中的一种或几种。

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